抗酸化剤、ならびにこれを含む食品、薬品および化粧料
【課題】新規な抗酸化剤を提供する。
【解決手段】渦鞭毛藻類由来の抗酸化剤。
【解決手段】渦鞭毛藻類由来の抗酸化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、渦鞭毛藻類によって産生される抗酸化剤、特に、スーパーオキシド消去剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に天然物由来の抗酸化剤としては、例えば、アスコルビン酸（ビタミンＣ）やトコフェロール類（ビタミンＥ）などの抗酸化ビタミン類、アントシアニンのような抗酸化ポリフェノールがよく知られており、現在、医薬品、食品、化粧品またはこれらの添加物として広く利用されている。
また、我々の生活の中における、喫煙・飲酒、ストレス、アンバランスな食生活等は、生活習慣病の要因となるといわれているが、その予防手段または治療手段として、抗酸化剤の摂取が提案されている。
【０００３】
ここで、抗酸化剤には水溶性のものと脂溶性のものがあり、上記のような生活習慣病の予防等のためには、その両方を摂取することが望ましいとされている。
しかしながら、例えば代表的な水溶性抗酸化剤であるアスコルビン酸は、熱に対して不安定であるという問題点を有する。
【０００４】
一方、赤潮プランクトン由来の抗酸化剤として、ラフィド藻類や緑藻類で報告されている（非特許文献１）。しかしながら、これらのプランクトン由来の抗酸化剤は熱によって該抗酸化作用が失活してしまうという問題がある。
【０００５】
【非特許文献１】赤潮原因プランクトン、Chattonella marina に存在する活性酸素消去物質に関する研究 長崎大学水産学部研究報告 第82号93-97,2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記課題を解決することを目的としたものであって、新規な抗酸化剤を提供することを目的とする。さらには、熱に安定および／または水に可溶な抗酸化剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
かかる状況のもと、発明者が鋭意検討した結果、渦鞭毛藻類より抽出した抗酸化剤が、上記課題を解決しうることを見出した。
これまで、抗酸化活性は、その大半が1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl（ＤＰＰＨ法）または化学発光法で測定されていた。しかしながら、本願発明者が鋭意検討した結果、赤潮プランクトン由来の抗酸化活性は、その赤潮プランクトンの種類によっては、ＤＰＰＨ法や化学発光法等では、鉄複合体のような妨害物質などが存在するために、抗酸化活性が検出されない場合があることを見出した。
そこで、本願発明者らは、赤潮プランクトン由来の抗酸化活性を、電子スピン共鳴（ＥＳＲ法）で測定を試みた。
すなわち、本願発明者らが、赤潮プランクトン由来の抗酸化活性について、従来とは異なる方法で抗酸化活性を測定することにより、従来測定できなかった種類の赤潮プランクトンについても抗酸化活性の測定に成功し、本発明を完成するに至ったものである。
【０００８】
具体的には、以下の手段により達成された。
（１）渦鞭毛藻類由来の抗酸化剤。
（２）前記抗酸化剤は、スーパーオキシドを消去するものである、（１）に記載の抗酸化剤。
（３）前記渦鞭毛藻類は、Gymnodinium属に属する、（１）または（２）に記載の抗酸化剤。
（４）前記渦鞭毛藻類は、Gymnodinium impudicumである、（１）または（２）に記載の抗酸化剤。
（５）前記抗酸化剤は、水溶性である、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の抗酸化剤。
（６）前記抗酸化剤は、１００℃で３０分以上熱処理しても、抗酸化活性が低下しない、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の抗酸化剤。
（７）（１）〜（６）のいずれか１項に記載の抗酸化剤を含む食品。
（８）（１）〜（６）のいずれか１項に記載の抗酸化剤を含む薬品。
（９）（１）〜（６）のいずれか１項に記載の抗酸化剤を含む化粧料。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下において、本発明の内容について詳細に説明する。尚、本願明細書において「〜」とはその前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む意味で使用される。
【００１０】
本発明の抗酸化剤は、渦鞭毛藻類由来のものであり、好ましくは、Scrippsiella属、Gymnodinium属、Alexandrium属、Karenia属、Heterocapsa属、Akashiwo属由来のものであり、より好ましくは、Gymnodinium 属由来のものである。Gymnodinium 属由来の渦鞭毛藻類としては、Gymnodinium impudicum、Gymnodium catenatum等が挙げられ、本発明では、Gymnodinium impudicum由来のものが特に好ましい。
【００１１】
本発明の抗酸化剤は、特に、水溶性を有するものであることが好ましい。すなわち、本発明の抗酸化剤は、水によって抽出することも可能となり、また、水溶性の食品等にも添加することも可能になる。
さらに、本発明の抗酸化剤は、熱安定性を有するものであることが好ましい。特に、１００℃で３０分以上熱処理しても、抗酸化活性が低下しない、すなわち、活性比が１以上であることが好ましい。より好ましくは、２００℃で３０分以上熱処理しても、抗酸化活性が低下しないものが好ましい。
さらに、本発明の抗酸化剤は、乾燥状態でも、抗酸化活性が低下しないものとすることができる。
【００１２】
以下、本発明の抗酸化剤の分取方法の一例を説明する。まず、渦鞭毛藻類を大量培養する。このときの培地は、海産微細藻類を培養する場合に用いられているものであれば格別の制限はなく、例えばGuillard氏のｆ／２培地や岩崎氏のＳＷII培地などを用いることができる。しかしながら、渦鞭毛藻類については高濃度の栄養物質に曝されるとむしろ増殖が悪くなることもあり、また既存の培養液にはＣｕなど微細藻類の増殖を阻害する成分も含まれるため、その組成については培養条件や用いる種類に応じて若干の改変を行っても良い。
また、培養液の調製は蒸留水から行う必要はなく、ガラスフィルターなどで予めろ過され、暗所で数ヶ月程度エイジングされた天然ろ過海水に必要な栄養素を栄養強化したものが簡便でかつ好ましい結果が得られる。
得られた渦鞭毛藻類は、必要により、超音波処理を行ってもよい。
そして、培養、採取された本発明の渦鞭毛藻類は、死滅させ又は死滅させずにそのまま又は乾燥物の形で、あるいは、水もしくは水性溶媒による抽出物、又はメタノール、エタノールその他比較的極性の高い有機溶媒による抽出の形で、抗酸化物として利用できる。
本発明の渦鞭毛藻類由来の抗酸化剤は、水溶液の形でも熱に対して安定であり、また、高熱条件で乾燥末にしても活性を失わないものとすることができる。
【００１３】
さらに、本発明の抗酸化剤は安全で食用可能なものとすることができ、液体・粉末の形態を問わず安定な抗酸化剤として極めて利用価値が高いもので、医薬品、医薬部外品、化粧料、飲食品などとして有用である。
【００１４】
医薬品若しくは医薬部外品としての抗酸化剤として利用する場合、本発明の抗酸化剤をそれ自体で投与してもよいが、好ましくは、当業者に周知の方法によって製造可能な医薬組成物として投与することができる。医薬組成物としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、及びシロップ剤等をあげることができる。上記の医薬組成物は、薬理学的、製剤学的に許容し得る添加物を加えて製造することができる。薬理学的、製剤学的に許容し得る添加物の例としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等をあげることができる。上記の医薬組成物には、本発明の趣旨を逸脱しない範囲内で、他の抗酸化剤を１種又は２種以上配合してもよい。本発明の抗酸化剤の投与方法は特に限定されず、内用剤および外用剤のいずれでもよく、内用剤が好ましい。内用剤は、注射剤、輸液剤等として、静脈注射により投与してもよいし、経口的に投与してもよい。また、本発明の医薬の投与量は特に限定されず、有効成分の種類などに応じて適宜選択することができ、さらに患者の体重や年齢、疾患の種類や症状、投与経路など通常考慮すべき種々の要因に応じて、適宜増減することができる。一般的には、内用剤として用いる場合、成人一日あたり０．０５〜５０ｇ、好ましくは０．５〜５ｇの範囲で用いることができる。また、外用剤として用いる場合、成人一日あたり０．０１〜１００ｇ、好ましくは０．１〜１０ｇの範囲で用いることができる。
【００１５】
また、抗酸化剤を含む化粧料としては、化粧水、美容液、水系ファンデーション、水系チーク、水系アイシャドー、水系マスカラ、水系リップ、クレンジング、洗顔料、シャンプー、メイクアップリムーバ、乳液、マッサージ剤およびパック剤等を好ましい例として挙げることができる。
【００１６】
抗酸化剤を含む飲食品としては、健康食品、ダイエット食品、即席食品類、嗜好飲料類、小麦粉製品、菓子類、基礎調味料、複合調味料、乳製品、冷凍食品、水産加工品、畜産加工品および農産加工品その他の市販食品などが好ましい例として挙げられる。
【００１７】
さらに、本発明の抗酸化剤は、一般に、医薬品又は医薬部外品、飲食品等に用いられる各種担体や添加剤を含んでいてもよい。各種担体としては、各種キャリアー担体、イクステンダー剤、希釈剤、増量剤、分散剤、賦形剤、結合剤溶媒、溶解補助剤、緩衝剤、溶解促進剤、ゲル化剤、懸濁化剤、小麦粉、米粉、でん粉、コーンスターチ、プリサッカライド、ミルクタンパク質、コラーゲン、米油、レシチンなどが挙げられる。添加剤としては、例えば、ビタミン類、甘味料、有機酸、着色剤、香料、湿化防止剤、ファイバー、電解質、ミネラル、栄養素、抗酸化剤、保存剤、芳香剤、湿潤剤、天然の植物抽出物、飼料添加物、コーヒー抽出物、ココア抽出物、フルーツ抽出物、野菜抽出物などが挙げられる。
【実施例】
【００１８】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り、適宜、変更することができる。従って、本発明の範囲は以下に示す具体例に限定されるものではない。
【００１９】
実施例１
各種赤潮プランクトン由来の水溶性抽出物の抗酸化活性を測定した。
【００２０】
試料
下記に示す赤潮プランクトン（水産総合研究センター瀬戸内海区水産研究所より取得）について、抗酸化活性を測定した。
【００２１】
採用した赤潮プランクトンの詳細は以下の通りである。
【表１】
【００２２】
下記の培地を用いて培養を行った。
（１）Sample １、２、５、６
（培地）
天然ろ過海水１０００ｍＬにＮａＮＯ3 ４５ｍｇ、ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ ４ｍｇ、Ｆｅ−ＥＤＴＡ ０．２１ｍｇ、Ｍｎ−ＥＤＴＡ ０．１７ｍｇ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．１２ｍｇ、Ｈ2ＳｅＯ3 ０．５μｇ、ＥＤＴＡ・２Ｎａを０．５ｍｇと、ビタミン混合溶液１ｍＬ（ただし１０００ｍＬ中にThiamine-HCl ０．１ｍｇ、Ca-pantothenate ０．１ｍｇ、p-Aminobenzoic acid １０μｇ、Biotine １μｇ、Inositol ５ｍｇ、Thymine ３ｍｇ、Vitamine Ｂ12 １μｇ、Folic acid ２μｇを含有する）を添加した後に、ｐＨを調製することなく７５℃で２時間の加熱もしくは紫外線照射等により制菌を行ったものを用いた。
【００２３】
（培養方法）
予め１３５℃で１時間程度乾熱滅菌された１リットルの容器に培養液を３５０ｍＬ分注し、１０００ｍＬにストレプトマイシンを２０ｇ含有する溶液を１ｍＬ添加し、細胞密度が３万ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度まで増殖したストック培養液を２５ｍＬ分取して新鮮な培養液にただちに接種した。
通気や攪拌は行わなかった。光の照射は、白色蛍光灯を光源として用い、照度は１２０μｍｏｌ／ｍ2／ｓ（光合成有効光量子束密度）に設定し、１６時間明：８時間暗の明暗周期を与え、培養温度２２℃で培養を行うことにより、８日間で最大細胞密度に達して集藻可能となった。
【００２４】
（集藻方法）
培養された藻類は、スイング式の遠心分離器を用い、２２００ｒｐｍで２分間の穏やかな条件下で藻体を回収した。
【００２５】
（２）Ｓａｍｐｌｅ３、４
（培地）
天然ろ過海水１０００ｍＬに対して、ＮａＮＯ3 １７０ｍｇ、ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ １５．６ｍｇ、Ｆｅ−ＥＤＴＡ ０．８４ｍｇ、Ｍｎ−ＥＤＴＡ ０．６９ｍｇ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．２４ｍｇ、Ｈ2ＳｅＯ3 １μｇ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ ２ｍｇ、ビタミン混合溶液１ｍＬ（ただし１０００ｍＬ中にThiamine-HCl ０．1mg、Ca-pantothenate ０．１ｍｇ、p-Aminobenzoic acid １０μｇ、 Biotine １μｇ、Inositol ５ｍｇ、Thymine ３ｍｇ、Vitamine Ｂ12 １μｇ、Folic acid ２μｇを含有する）を添加した後に、ｐＨを調製することなく７５℃で２時間の加熱もしくは紫外線照射等により制菌を行ったものを用いた。
【００２６】
（培養方法）
予め１３５℃で１時間程度乾熱滅菌された１リットルの容器に培養液を３５０ｍＬ分注し、１０００ｍＬにストレプトマイシンを２０ｇ含有する溶液を１ｍＬ添加し、細胞密度が５万ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度まで増殖したストック培養液を２５ｍＬ分取して新鮮な培養液にただちに接種した。
通気や攪拌は行わなかった。光の照射は、白色蛍光灯を光源として用い、照度は１２０μｍｏｌ／ｍ2／ｓ（光合成有効光量子束密度）に設定し、１６時間明：８時間暗の明暗周期を与え、培養温度２４℃で培養を行うことにより、６日間で最大細胞密度に達して集藻可能となった。
【００２７】
（集藻方法）
培養された藻類は、スイング式の遠心分離器を用い、２０００ｒｐｍで２分間の穏やかな条件下で藻体を回収した。
【００２８】
（３）Ｓａｍｐｌｅ７
（培地）
天然ろ過海水１０００ｍＬに対して、ＮａＮＯ3 １７０ｍｇ、ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ １５．６ｍｇ、Ｆｅ−ＥＤＴＡ ０．８４ｍｇ、Ｍｎ−ＥＤＴＡ ０．６９ｍｇ、ＮａＳｉＯ3 １２２ｍｇ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．２４ｍｇ、Ｈ2ＳｅＯ3 １μｇ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ ２ｍｇと、ビタミン混合溶液１ｍＬ（ただし１０００ｍＬ中にThiamine-HCl ０．１ｍｇ、Ca-pantothenate ０．１ｍｇ、p-Aminobenzoic acid １０μｇ、Biotine １μｇ、Inositol ５ｍｇ、Thymine ３ｍｇ、Vitamine Ｂ12 １μｇ、Folic acid ２μｇを含有する）を添加した後に、ｐＨを調製することなく７５℃で２時間の加熱もしくは紫外線照射等により制菌を行ったものを用いた。
【００２９】
（培養方法）
予め１３５℃で１時間程度乾熱滅菌された１リットルの容器に培養液を３５０ｍＬ分注し、１０００ｍＬにストレプトマイシンを２０ｇ含有する溶液を１ｍＬ添加し、細胞密度が５０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度まで増殖したストック培養液を２５ｍＬ分取して新鮮な培養液にただちに接種した。
通気や攪拌は行わなかった。光の照射は、白色蛍光灯を光源として用い、照度は１２０μｍｏｌ／ｍ2／ｓ（光合成有効光量子束密度）に設定し、１６時間明：８時間暗の明暗周期を与え、培養温度２２℃で培養を行うことにより、５日間で最大細胞密度に達して集藻可能となった。
【００３０】
（集藻方法）
培養された藻類は、スイング式の遠心分離器を用い、２０００ｒｐｍで２分間の穏やかな条件下で藻体を回収した。
【００３１】
（水溶性画分の調製方法）
上記方法により得られた各種赤潮プランクトンは、以下の方法により、水溶性画分を調整した。
各種赤潮プランクトンは調製時まで−３０℃で冷凍保存した。各種赤潮プランクトンのクロロフィル含量を確認し最終濃度が６０μｇ／ｍＬになるように純水を添加し、ピペッティング後細胞を完全に破壊するため超音波処理を行った。超音波処理は１分間を目処に約１０回繰り返して細胞が完全に壊れるまで実施した。すべての処理は４℃の低温で行った。超音波処理後のプランクトン懸濁液を遠心（１５０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）し、上清を水溶性画分のSampleとした。
【００３２】
（各種Sample中のクロロフィルの定量方法）
赤潮プランクトンの現存量を把握するために、通常湿重量、乾燥重要及び炭素量などの数字が用いられる。ところが赤潮プランクトンの多くは粘質性の多糖類を細胞外に多量に分泌し、その量は遠心分離など物理的な刺激が加わることで更に増加する。このため如何に巧妙に培養した赤潮プランクトンを得たとしても、水溶性の多糖類に包合された液体培地の持ち込みは避けられず、それらの量は真に赤潮プランクトンが含有する体積の２倍にも達することがある。また液体培地が塩分を多量に含む海水を基本とするために、乾燥重量についてもミネラル分の重量が持ち込まれるために正確な量を把握することができない。このように、赤潮プランクトンには種類により多糖類の分泌量にバラツキがあるため、培養した赤潮プランクトンを一律に生物量として把握するには、炭素量で把握することが望ましい。ただし液体培地中には空気中の２４倍もの二酸化炭素が含まれているために、その測定には精密な酸処理などを行う必要があり、煩雑でしかも測定結果の誤差が大きい。赤潮プランクトンは陸上植物と同じように細胞の中に葉緑体を有しており、それが細胞容積あたりに占める量は種類を超えてほぼ一定であることが既に知られている。このため、種類の異なる赤潮プランクトンの現存量を正確に把握するためには、広く一律に含まれるクロロフィル量を指標として評価することが望ましい。
よって、本実施例では、クロロフィル量を測定した。クロロフィル量は、ろ過や遠心分離などにより液体培地を可能な限り取り除かれたSampleに対して、冷却された９８％ジメチルホルムアミドを適宜添加し、超音波でSampleを破砕してクロロフィルの抽出を行った。ジメチルホルムアミドは抽出力が高いため、溶媒を添加後一晩冷蔵庫で保存するだけでも十分な量のクロロフィルを抽出できた。得られた色素はクロロフィルの測定を目的とした蛍光光度計（励起波長：４６０ｎｍ、放射波長：６６５ｎｍ）を用いて定量化した。検量線は市販の精製クロロフィル粉末を同様に有機溶媒で適宜希釈したもので作成した。
【００３３】
（抗酸化活性試験−化学発光法によるスーパーオキシド消去活性（ＳＯＤ様活性））
従来から、抗酸化活性試験に用いられている化学発光法によって測定した。具体的には、以下の方法により行った。
＜０．６ｍＭ ＥＤＴＡ含Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液の作製＞
Tris (hydoroxymetyhl) aminomethane（トリス）４８．４ｇを１０００ｍＬの純水で溶解し、０．４Ｍトリス水溶液を作製した。２００ｍＬの２Ｎ塩酸を８００ｍＬの蒸留水で希釈し、０．４Ｎ塩酸水溶液を作製した。０．２Ｍトリス水溶液５００ｍＬと０．２Ｎ塩酸水溶液３８４ｍＬを混ぜ合わせ、さらに蒸留水１１６ｍＬを加えて、全量で１０００ｍＬにした。ｐＨを測定して０．４Ｍトリス水溶液または０．４Ｎ塩酸水溶液にて調整した（０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．６）。２２．３ｍｇ（６０ｍＭ）のＥＤＴＡを１０ ｍＬの蒸留水に溶かし、１００ｍＬのTris-HCl緩衝液にその１ｍＬを添加した。
【００３４】
＜２μＭ Ｌ−０１２水溶液（Ｍｗ：３１０．６７）の作製＞
蒸留水で２００μＭ（６．２ ｍｇ／ｍＬ（２０ ｍＭ）を１００倍希釈）に調整し、試験開始時に１００倍に希釈した。使用まで氷冷した。
＜１ｍＭ ヒポキサンチン水溶液（ＨＰＸ）（Ｍｗ：１３６．１１）の作製＞
蒸留水で１ｍＭ（１００ｍＭ １３．６ｍｇ／ｍＬ（完全に解けない懸濁状態）を１００倍希釈）に調整した。
＜キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）（１０Ｕ）の作製＞
０．６ｍＭ ＥＤＴＡで希釈し、２０ｍＵ／ｍＬに調整した（終濃度：５ｍＵ／ｍＬ）。使用時まで氷冷した。
【００３５】
＜操作手順＞
まず、５０μＬのＬ−０１２、１０μＬのTris-HCl緩衝液、２０μＬのＸＯＤ、１０μＬの精製水を含む溶液を９６ｗｅｌｌプレートに分注し、２５℃で１分間インキュベートした。そして、このときＬ−０１２の自動酸化による試料で抑制されない非特異的発光を測定した。発光が安定したところでＨＰＸ（１００μＬ）をインジェクターを用い添加した。５分間の化学発光の積算値を求めた。化学発光法の消去活性をＳＯＤ活性検量線を用いてＳＯＤ様活性値に換算した。
【００３６】
（抗酸化活性試験−電子スピン共鳴（ＥＳＲ）法によるＳＯＤ様活性）
使用材料
〈試薬〉
０．１Ｍリン酸緩衝液（Ｐ．Ｂ．）（ｐＨ７．４）：市販品のリン酸（和光純薬製、Ｎｏ．１６７−１４４９）を精製水に溶解して作製した。
２ｍＭのＨｙｐ（Ｆ．Ｗ．：１３６．１）：ＨＰＸ（Ｓｉｇｍａ製、Ｈ−９３７７）１３．６ ｍｇを上記Ｐ．Ｂ．５０ｍＬに溶解した。溶解しにくいので温めながら一晩攪拌しながら溶解させた。
０．４Ｕ／ｍＬのＸＯＤ：ＸＯＤ（ラボテック製、Ｃｏｗ ｍｉｌｋ由来、Ｅ．Ｃ． １．１．３．２２） ２０μＬ（２０ Ｕ／ｍＬ）に上記Ｐ．Ｂ．９８０μＬを添加した（５０倍希釈）。
ＤＭＰＯ(5,5-Dimethyl-Prroloine-N-oxide)：ＤＭＰＯ（ラボテック製）を精製水と、割合（重量比）が１：１となるように混合した。
ＤＭＳＯ(Dimethyl sulfoxide)：ＤＭＳＯ（関東化学製、Ｎｏ．１０３７８−００）を用いた。
ＳＯＤ(Superoxide dismutase)：ＳＯＤ（Ｓｉｇｍａ製、ｓ−５３９５、Ｅ．Ｃ． １．１５．１．１） （Ｓｉｇｍａ、ｓ−５３９５）を５０００ Ｕ／ｍＬに調整したＳＯＤ溶液を５０、２５、 １２．５、６．２５、３．１２５ Ｕ／ｍＬに希釈して使用した。
【００３７】
〈機器〉
電子スピン共鳴装置 ＪＥＳ−ＦＡ１００（日本電子）
〈方法〉
各種プランクトン水溶性抽出物のＳＯＤ様活性を、ＤＭＰＯを用いたＥＳＲスピントラッピング法により測定し、ＳＯＤ様活性濃度に換算した。
すべてのSampleを０．１ＭのＰ．Ｂ．で２倍希釈して使用した。スーパーオキシドはＨＰＸ／ＸＯＤ系で生成させた。
また消去活性のマーカーとしてEpigallocatechin 3-gallate（ＥＧＣＧ、ロッシュビタミン社（現ＤＳＭ社）製）１ｍｇ／ｍＬを１００倍希釈（８．１５ｎＭ）したものを用いた。
【００３８】
〈手順〉
以下の試薬を下記の順に直径１５ｍｍのテストチューブに加えた。
ＨＰＸ ５０μＬ
ＤＭＳＯ ３０μＬ
Sample ５０μＬ
ＤＭＰＯ ２０μＬ
ＸＯＤ ５０μＬ
ＸＯＤ添加後に１０秒間Ｖｏｒｔｅｘによって攪拌し、水溶液用セルに吸入した。ＸＯＤ添加から６０秒後にＥＳＲ測定を開始した。
【００３９】
ＥＳＲ測定条件
共鳴周波数： ９．４２ＧＨｚ
出力：４ｍＷ
磁場変調： １００ｋＨｚ
観測磁場： ３３５．５± ５ｍＴ
測定時間： ２ｍｉｎ
変調幅： ０．０７ｍＴ
増幅率： ２００
【００４０】
ＳＯＤ様活性を求める場合に使用する検量線作成の際には、Sampleの代わりに活性既知のＳＯＤを添加した。０．１Ｍ Ｐ．Ｂ．添加時（コントロール）のスペクトルのＭｎマーカーに対する相対強度をＩ0、ＳＯＤ添加時に観測されたスペクトルのＭｎマーカーに対する相対強度をＩと表した場合、
Ｘ軸：ＳＯＤ活性
Ｙ軸：（Ｉ0／Ｉ）−１
とし、検量線を作成した。
測定は、各試料につき２回行った。抗酸化活性は、ＳＯＤ活性検量線を用いてＳＯＤ様活性濃度に換算することにより求めた。
【００４１】
化学発光法によるＳＯＤ様活性および電子スピン共鳴（ＥＳＲ）法によるＳＯＤ様活性の結果をそれぞれ図１および図２に示した。
この結果、渦鞭毛藻類において、抗酸化活性があることが認められた。
特に、Sample４、６では、化学発光法およびＥＳＲ法において相関関係が認められた。しかしながら、渦鞭毛藻類（特に、Gymnodinium属）については、化学発光法ＳＯＤ様活性が全く認められないか、極めて低いＳＯＤ様活性であったものについて、ＥＳＲ法でＳＯＤ様活性を測定することにより、高いＳＯＤ様活性が認められた。すなわち、ＥＳＲ法でＳＯＤ様活性を測定することにより、渦鞭毛藻類（特に、Gymnodinium属）も抗酸化性物質を産生することが明らかになった。
【００４２】
実施例２
上記のうち、Sample１、Sample３および、Chattonella ovata（ＣＯ）の抽出物（いずれも６０μｇクロロフィル当量／ｍＬ）、アスコルビン酸（ＡＳＡ）６９．８μＭ（１２．３μｇ／ｍＬ）の熱安定性を調べた。
【００４３】
上記Sampleを、１６．５ｍｍ×４５ｍｍのバイアル瓶に３００μＬずつ分注し、乾熱滅菌器（ＳＡＮＹＯ製、ＭＯＶ−１１２Ｓ）で３０、６０、９０、１２０分間１００℃および３０、６０分間２００℃で加熱処理をし、室温に戻した後、ＳＯＤ様活性を測定した。このときの状態は、乾燥した状態であった。加熱処理をしない試料のＳＯＤ様活性を１とし、それぞれ加熱処理した後のＳＯＤ様活性を、ＳＯＤ様活性の比（％）として求めた。その結果を図３および図４に示した。
図３に示すように、Sample１（Gymnodinium属）は加熱３０分でＳＯＤ様活性が１．４倍になり、１００分で約２倍のＳＯＤ様活性を示した。Sample１以外のＣＯ、Sample３、ＡＳＡは加熱３０分でＳＯＤ様活性が半分以下となった。
図４においても、Sample１は１００℃の加熱処理と同様に、加熱することで活性が４倍まで高くなった。
【００４４】
また、他のGymnodinium属由来のSampleについても同様に行ったところ、図３および４と同様に熱処理することにより、活性がより高くなる傾向にある。
すなわち、Gymnodinium属については、熱処理／乾燥処理をしても、高いＳＯＤ様活性を示すことが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】各種赤潮プランクトンのＳＯＤ様活性を化学発光法で測定した結果を棒グラフで示したものである。
【図２】各種赤潮プランクトンのＳＯＤ様活性を電子スピン共鳴（ＥＳＲ）法で測定した結果を棒グラフで示したものである。
【図３】赤潮プランクトンのＳＯＤ様活性の１００℃に対する熱安定性を折れ線グラフで示したものである。
【図４】赤潮プランクトンのＳＯＤ様活性の２００℃に対する熱安定性を折れ線グラフで示したものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、渦鞭毛藻類によって産生される抗酸化剤、特に、スーパーオキシド消去剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に天然物由来の抗酸化剤としては、例えば、アスコルビン酸（ビタミンＣ）やトコフェロール類（ビタミンＥ）などの抗酸化ビタミン類、アントシアニンのような抗酸化ポリフェノールがよく知られており、現在、医薬品、食品、化粧品またはこれらの添加物として広く利用されている。
また、我々の生活の中における、喫煙・飲酒、ストレス、アンバランスな食生活等は、生活習慣病の要因となるといわれているが、その予防手段または治療手段として、抗酸化剤の摂取が提案されている。
【０００３】
ここで、抗酸化剤には水溶性のものと脂溶性のものがあり、上記のような生活習慣病の予防等のためには、その両方を摂取することが望ましいとされている。
しかしながら、例えば代表的な水溶性抗酸化剤であるアスコルビン酸は、熱に対して不安定であるという問題点を有する。
【０００４】
一方、赤潮プランクトン由来の抗酸化剤として、ラフィド藻類や緑藻類で報告されている（非特許文献１）。しかしながら、これらのプランクトン由来の抗酸化剤は熱によって該抗酸化作用が失活してしまうという問題がある。
【０００５】
【非特許文献１】赤潮原因プランクトン、Chattonella marina に存在する活性酸素消去物質に関する研究 長崎大学水産学部研究報告 第82号93-97,2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記課題を解決することを目的としたものであって、新規な抗酸化剤を提供することを目的とする。さらには、熱に安定および／または水に可溶な抗酸化剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
かかる状況のもと、発明者が鋭意検討した結果、渦鞭毛藻類より抽出した抗酸化剤が、上記課題を解決しうることを見出した。
これまで、抗酸化活性は、その大半が1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl（ＤＰＰＨ法）または化学発光法で測定されていた。しかしながら、本願発明者が鋭意検討した結果、赤潮プランクトン由来の抗酸化活性は、その赤潮プランクトンの種類によっては、ＤＰＰＨ法や化学発光法等では、鉄複合体のような妨害物質などが存在するために、抗酸化活性が検出されない場合があることを見出した。
そこで、本願発明者らは、赤潮プランクトン由来の抗酸化活性を、電子スピン共鳴（ＥＳＲ法）で測定を試みた。
すなわち、本願発明者らが、赤潮プランクトン由来の抗酸化活性について、従来とは異なる方法で抗酸化活性を測定することにより、従来測定できなかった種類の赤潮プランクトンについても抗酸化活性の測定に成功し、本発明を完成するに至ったものである。
【０００８】
具体的には、以下の手段により達成された。
（１）渦鞭毛藻類由来の抗酸化剤。
（２）前記抗酸化剤は、スーパーオキシドを消去するものである、（１）に記載の抗酸化剤。
（３）前記渦鞭毛藻類は、Gymnodinium属に属する、（１）または（２）に記載の抗酸化剤。
（４）前記渦鞭毛藻類は、Gymnodinium impudicumである、（１）または（２）に記載の抗酸化剤。
（５）前記抗酸化剤は、水溶性である、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の抗酸化剤。
（６）前記抗酸化剤は、１００℃で３０分以上熱処理しても、抗酸化活性が低下しない、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の抗酸化剤。
（７）（１）〜（６）のいずれか１項に記載の抗酸化剤を含む食品。
（８）（１）〜（６）のいずれか１項に記載の抗酸化剤を含む薬品。
（９）（１）〜（６）のいずれか１項に記載の抗酸化剤を含む化粧料。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下において、本発明の内容について詳細に説明する。尚、本願明細書において「〜」とはその前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む意味で使用される。
【００１０】
本発明の抗酸化剤は、渦鞭毛藻類由来のものであり、好ましくは、Scrippsiella属、Gymnodinium属、Alexandrium属、Karenia属、Heterocapsa属、Akashiwo属由来のものであり、より好ましくは、Gymnodinium 属由来のものである。Gymnodinium 属由来の渦鞭毛藻類としては、Gymnodinium impudicum、Gymnodium catenatum等が挙げられ、本発明では、Gymnodinium impudicum由来のものが特に好ましい。
【００１１】
本発明の抗酸化剤は、特に、水溶性を有するものであることが好ましい。すなわち、本発明の抗酸化剤は、水によって抽出することも可能となり、また、水溶性の食品等にも添加することも可能になる。
さらに、本発明の抗酸化剤は、熱安定性を有するものであることが好ましい。特に、１００℃で３０分以上熱処理しても、抗酸化活性が低下しない、すなわち、活性比が１以上であることが好ましい。より好ましくは、２００℃で３０分以上熱処理しても、抗酸化活性が低下しないものが好ましい。
さらに、本発明の抗酸化剤は、乾燥状態でも、抗酸化活性が低下しないものとすることができる。
【００１２】
以下、本発明の抗酸化剤の分取方法の一例を説明する。まず、渦鞭毛藻類を大量培養する。このときの培地は、海産微細藻類を培養する場合に用いられているものであれば格別の制限はなく、例えばGuillard氏のｆ／２培地や岩崎氏のＳＷII培地などを用いることができる。しかしながら、渦鞭毛藻類については高濃度の栄養物質に曝されるとむしろ増殖が悪くなることもあり、また既存の培養液にはＣｕなど微細藻類の増殖を阻害する成分も含まれるため、その組成については培養条件や用いる種類に応じて若干の改変を行っても良い。
また、培養液の調製は蒸留水から行う必要はなく、ガラスフィルターなどで予めろ過され、暗所で数ヶ月程度エイジングされた天然ろ過海水に必要な栄養素を栄養強化したものが簡便でかつ好ましい結果が得られる。
得られた渦鞭毛藻類は、必要により、超音波処理を行ってもよい。
そして、培養、採取された本発明の渦鞭毛藻類は、死滅させ又は死滅させずにそのまま又は乾燥物の形で、あるいは、水もしくは水性溶媒による抽出物、又はメタノール、エタノールその他比較的極性の高い有機溶媒による抽出の形で、抗酸化物として利用できる。
本発明の渦鞭毛藻類由来の抗酸化剤は、水溶液の形でも熱に対して安定であり、また、高熱条件で乾燥末にしても活性を失わないものとすることができる。
【００１３】
さらに、本発明の抗酸化剤は安全で食用可能なものとすることができ、液体・粉末の形態を問わず安定な抗酸化剤として極めて利用価値が高いもので、医薬品、医薬部外品、化粧料、飲食品などとして有用である。
【００１４】
医薬品若しくは医薬部外品としての抗酸化剤として利用する場合、本発明の抗酸化剤をそれ自体で投与してもよいが、好ましくは、当業者に周知の方法によって製造可能な医薬組成物として投与することができる。医薬組成物としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、及びシロップ剤等をあげることができる。上記の医薬組成物は、薬理学的、製剤学的に許容し得る添加物を加えて製造することができる。薬理学的、製剤学的に許容し得る添加物の例としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等をあげることができる。上記の医薬組成物には、本発明の趣旨を逸脱しない範囲内で、他の抗酸化剤を１種又は２種以上配合してもよい。本発明の抗酸化剤の投与方法は特に限定されず、内用剤および外用剤のいずれでもよく、内用剤が好ましい。内用剤は、注射剤、輸液剤等として、静脈注射により投与してもよいし、経口的に投与してもよい。また、本発明の医薬の投与量は特に限定されず、有効成分の種類などに応じて適宜選択することができ、さらに患者の体重や年齢、疾患の種類や症状、投与経路など通常考慮すべき種々の要因に応じて、適宜増減することができる。一般的には、内用剤として用いる場合、成人一日あたり０．０５〜５０ｇ、好ましくは０．５〜５ｇの範囲で用いることができる。また、外用剤として用いる場合、成人一日あたり０．０１〜１００ｇ、好ましくは０．１〜１０ｇの範囲で用いることができる。
【００１５】
また、抗酸化剤を含む化粧料としては、化粧水、美容液、水系ファンデーション、水系チーク、水系アイシャドー、水系マスカラ、水系リップ、クレンジング、洗顔料、シャンプー、メイクアップリムーバ、乳液、マッサージ剤およびパック剤等を好ましい例として挙げることができる。
【００１６】
抗酸化剤を含む飲食品としては、健康食品、ダイエット食品、即席食品類、嗜好飲料類、小麦粉製品、菓子類、基礎調味料、複合調味料、乳製品、冷凍食品、水産加工品、畜産加工品および農産加工品その他の市販食品などが好ましい例として挙げられる。
【００１７】
さらに、本発明の抗酸化剤は、一般に、医薬品又は医薬部外品、飲食品等に用いられる各種担体や添加剤を含んでいてもよい。各種担体としては、各種キャリアー担体、イクステンダー剤、希釈剤、増量剤、分散剤、賦形剤、結合剤溶媒、溶解補助剤、緩衝剤、溶解促進剤、ゲル化剤、懸濁化剤、小麦粉、米粉、でん粉、コーンスターチ、プリサッカライド、ミルクタンパク質、コラーゲン、米油、レシチンなどが挙げられる。添加剤としては、例えば、ビタミン類、甘味料、有機酸、着色剤、香料、湿化防止剤、ファイバー、電解質、ミネラル、栄養素、抗酸化剤、保存剤、芳香剤、湿潤剤、天然の植物抽出物、飼料添加物、コーヒー抽出物、ココア抽出物、フルーツ抽出物、野菜抽出物などが挙げられる。
【実施例】
【００１８】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り、適宜、変更することができる。従って、本発明の範囲は以下に示す具体例に限定されるものではない。
【００１９】
実施例１
各種赤潮プランクトン由来の水溶性抽出物の抗酸化活性を測定した。
【００２０】
試料
下記に示す赤潮プランクトン（水産総合研究センター瀬戸内海区水産研究所より取得）について、抗酸化活性を測定した。
【００２１】
採用した赤潮プランクトンの詳細は以下の通りである。
【表１】
【００２２】
下記の培地を用いて培養を行った。
（１）Sample １、２、５、６
（培地）
天然ろ過海水１０００ｍＬにＮａＮＯ3 ４５ｍｇ、ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ ４ｍｇ、Ｆｅ−ＥＤＴＡ ０．２１ｍｇ、Ｍｎ−ＥＤＴＡ ０．１７ｍｇ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．１２ｍｇ、Ｈ2ＳｅＯ3 ０．５μｇ、ＥＤＴＡ・２Ｎａを０．５ｍｇと、ビタミン混合溶液１ｍＬ（ただし１０００ｍＬ中にThiamine-HCl ０．１ｍｇ、Ca-pantothenate ０．１ｍｇ、p-Aminobenzoic acid １０μｇ、Biotine １μｇ、Inositol ５ｍｇ、Thymine ３ｍｇ、Vitamine Ｂ12 １μｇ、Folic acid ２μｇを含有する）を添加した後に、ｐＨを調製することなく７５℃で２時間の加熱もしくは紫外線照射等により制菌を行ったものを用いた。
【００２３】
（培養方法）
予め１３５℃で１時間程度乾熱滅菌された１リットルの容器に培養液を３５０ｍＬ分注し、１０００ｍＬにストレプトマイシンを２０ｇ含有する溶液を１ｍＬ添加し、細胞密度が３万ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度まで増殖したストック培養液を２５ｍＬ分取して新鮮な培養液にただちに接種した。
通気や攪拌は行わなかった。光の照射は、白色蛍光灯を光源として用い、照度は１２０μｍｏｌ／ｍ2／ｓ（光合成有効光量子束密度）に設定し、１６時間明：８時間暗の明暗周期を与え、培養温度２２℃で培養を行うことにより、８日間で最大細胞密度に達して集藻可能となった。
【００２４】
（集藻方法）
培養された藻類は、スイング式の遠心分離器を用い、２２００ｒｐｍで２分間の穏やかな条件下で藻体を回収した。
【００２５】
（２）Ｓａｍｐｌｅ３、４
（培地）
天然ろ過海水１０００ｍＬに対して、ＮａＮＯ3 １７０ｍｇ、ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ １５．６ｍｇ、Ｆｅ−ＥＤＴＡ ０．８４ｍｇ、Ｍｎ−ＥＤＴＡ ０．６９ｍｇ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．２４ｍｇ、Ｈ2ＳｅＯ3 １μｇ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ ２ｍｇ、ビタミン混合溶液１ｍＬ（ただし１０００ｍＬ中にThiamine-HCl ０．1mg、Ca-pantothenate ０．１ｍｇ、p-Aminobenzoic acid １０μｇ、 Biotine １μｇ、Inositol ５ｍｇ、Thymine ３ｍｇ、Vitamine Ｂ12 １μｇ、Folic acid ２μｇを含有する）を添加した後に、ｐＨを調製することなく７５℃で２時間の加熱もしくは紫外線照射等により制菌を行ったものを用いた。
【００２６】
（培養方法）
予め１３５℃で１時間程度乾熱滅菌された１リットルの容器に培養液を３５０ｍＬ分注し、１０００ｍＬにストレプトマイシンを２０ｇ含有する溶液を１ｍＬ添加し、細胞密度が５万ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度まで増殖したストック培養液を２５ｍＬ分取して新鮮な培養液にただちに接種した。
通気や攪拌は行わなかった。光の照射は、白色蛍光灯を光源として用い、照度は１２０μｍｏｌ／ｍ2／ｓ（光合成有効光量子束密度）に設定し、１６時間明：８時間暗の明暗周期を与え、培養温度２４℃で培養を行うことにより、６日間で最大細胞密度に達して集藻可能となった。
【００２７】
（集藻方法）
培養された藻類は、スイング式の遠心分離器を用い、２０００ｒｐｍで２分間の穏やかな条件下で藻体を回収した。
【００２８】
（３）Ｓａｍｐｌｅ７
（培地）
天然ろ過海水１０００ｍＬに対して、ＮａＮＯ3 １７０ｍｇ、ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ １５．６ｍｇ、Ｆｅ−ＥＤＴＡ ０．８４ｍｇ、Ｍｎ−ＥＤＴＡ ０．６９ｍｇ、ＮａＳｉＯ3 １２２ｍｇ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．２４ｍｇ、Ｈ2ＳｅＯ3 １μｇ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ ２ｍｇと、ビタミン混合溶液１ｍＬ（ただし１０００ｍＬ中にThiamine-HCl ０．１ｍｇ、Ca-pantothenate ０．１ｍｇ、p-Aminobenzoic acid １０μｇ、Biotine １μｇ、Inositol ５ｍｇ、Thymine ３ｍｇ、Vitamine Ｂ12 １μｇ、Folic acid ２μｇを含有する）を添加した後に、ｐＨを調製することなく７５℃で２時間の加熱もしくは紫外線照射等により制菌を行ったものを用いた。
【００２９】
（培養方法）
予め１３５℃で１時間程度乾熱滅菌された１リットルの容器に培養液を３５０ｍＬ分注し、１０００ｍＬにストレプトマイシンを２０ｇ含有する溶液を１ｍＬ添加し、細胞密度が５０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度まで増殖したストック培養液を２５ｍＬ分取して新鮮な培養液にただちに接種した。
通気や攪拌は行わなかった。光の照射は、白色蛍光灯を光源として用い、照度は１２０μｍｏｌ／ｍ2／ｓ（光合成有効光量子束密度）に設定し、１６時間明：８時間暗の明暗周期を与え、培養温度２２℃で培養を行うことにより、５日間で最大細胞密度に達して集藻可能となった。
【００３０】
（集藻方法）
培養された藻類は、スイング式の遠心分離器を用い、２０００ｒｐｍで２分間の穏やかな条件下で藻体を回収した。
【００３１】
（水溶性画分の調製方法）
上記方法により得られた各種赤潮プランクトンは、以下の方法により、水溶性画分を調整した。
各種赤潮プランクトンは調製時まで−３０℃で冷凍保存した。各種赤潮プランクトンのクロロフィル含量を確認し最終濃度が６０μｇ／ｍＬになるように純水を添加し、ピペッティング後細胞を完全に破壊するため超音波処理を行った。超音波処理は１分間を目処に約１０回繰り返して細胞が完全に壊れるまで実施した。すべての処理は４℃の低温で行った。超音波処理後のプランクトン懸濁液を遠心（１５０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）し、上清を水溶性画分のSampleとした。
【００３２】
（各種Sample中のクロロフィルの定量方法）
赤潮プランクトンの現存量を把握するために、通常湿重量、乾燥重要及び炭素量などの数字が用いられる。ところが赤潮プランクトンの多くは粘質性の多糖類を細胞外に多量に分泌し、その量は遠心分離など物理的な刺激が加わることで更に増加する。このため如何に巧妙に培養した赤潮プランクトンを得たとしても、水溶性の多糖類に包合された液体培地の持ち込みは避けられず、それらの量は真に赤潮プランクトンが含有する体積の２倍にも達することがある。また液体培地が塩分を多量に含む海水を基本とするために、乾燥重量についてもミネラル分の重量が持ち込まれるために正確な量を把握することができない。このように、赤潮プランクトンには種類により多糖類の分泌量にバラツキがあるため、培養した赤潮プランクトンを一律に生物量として把握するには、炭素量で把握することが望ましい。ただし液体培地中には空気中の２４倍もの二酸化炭素が含まれているために、その測定には精密な酸処理などを行う必要があり、煩雑でしかも測定結果の誤差が大きい。赤潮プランクトンは陸上植物と同じように細胞の中に葉緑体を有しており、それが細胞容積あたりに占める量は種類を超えてほぼ一定であることが既に知られている。このため、種類の異なる赤潮プランクトンの現存量を正確に把握するためには、広く一律に含まれるクロロフィル量を指標として評価することが望ましい。
よって、本実施例では、クロロフィル量を測定した。クロロフィル量は、ろ過や遠心分離などにより液体培地を可能な限り取り除かれたSampleに対して、冷却された９８％ジメチルホルムアミドを適宜添加し、超音波でSampleを破砕してクロロフィルの抽出を行った。ジメチルホルムアミドは抽出力が高いため、溶媒を添加後一晩冷蔵庫で保存するだけでも十分な量のクロロフィルを抽出できた。得られた色素はクロロフィルの測定を目的とした蛍光光度計（励起波長：４６０ｎｍ、放射波長：６６５ｎｍ）を用いて定量化した。検量線は市販の精製クロロフィル粉末を同様に有機溶媒で適宜希釈したもので作成した。
【００３３】
（抗酸化活性試験−化学発光法によるスーパーオキシド消去活性（ＳＯＤ様活性））
従来から、抗酸化活性試験に用いられている化学発光法によって測定した。具体的には、以下の方法により行った。
＜０．６ｍＭ ＥＤＴＡ含Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液の作製＞
Tris (hydoroxymetyhl) aminomethane（トリス）４８．４ｇを１０００ｍＬの純水で溶解し、０．４Ｍトリス水溶液を作製した。２００ｍＬの２Ｎ塩酸を８００ｍＬの蒸留水で希釈し、０．４Ｎ塩酸水溶液を作製した。０．２Ｍトリス水溶液５００ｍＬと０．２Ｎ塩酸水溶液３８４ｍＬを混ぜ合わせ、さらに蒸留水１１６ｍＬを加えて、全量で１０００ｍＬにした。ｐＨを測定して０．４Ｍトリス水溶液または０．４Ｎ塩酸水溶液にて調整した（０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．６）。２２．３ｍｇ（６０ｍＭ）のＥＤＴＡを１０ ｍＬの蒸留水に溶かし、１００ｍＬのTris-HCl緩衝液にその１ｍＬを添加した。
【００３４】
＜２μＭ Ｌ−０１２水溶液（Ｍｗ：３１０．６７）の作製＞
蒸留水で２００μＭ（６．２ ｍｇ／ｍＬ（２０ ｍＭ）を１００倍希釈）に調整し、試験開始時に１００倍に希釈した。使用まで氷冷した。
＜１ｍＭ ヒポキサンチン水溶液（ＨＰＸ）（Ｍｗ：１３６．１１）の作製＞
蒸留水で１ｍＭ（１００ｍＭ １３．６ｍｇ／ｍＬ（完全に解けない懸濁状態）を１００倍希釈）に調整した。
＜キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）（１０Ｕ）の作製＞
０．６ｍＭ ＥＤＴＡで希釈し、２０ｍＵ／ｍＬに調整した（終濃度：５ｍＵ／ｍＬ）。使用時まで氷冷した。
【００３５】
＜操作手順＞
まず、５０μＬのＬ−０１２、１０μＬのTris-HCl緩衝液、２０μＬのＸＯＤ、１０μＬの精製水を含む溶液を９６ｗｅｌｌプレートに分注し、２５℃で１分間インキュベートした。そして、このときＬ−０１２の自動酸化による試料で抑制されない非特異的発光を測定した。発光が安定したところでＨＰＸ（１００μＬ）をインジェクターを用い添加した。５分間の化学発光の積算値を求めた。化学発光法の消去活性をＳＯＤ活性検量線を用いてＳＯＤ様活性値に換算した。
【００３６】
（抗酸化活性試験−電子スピン共鳴（ＥＳＲ）法によるＳＯＤ様活性）
使用材料
〈試薬〉
０．１Ｍリン酸緩衝液（Ｐ．Ｂ．）（ｐＨ７．４）：市販品のリン酸（和光純薬製、Ｎｏ．１６７−１４４９）を精製水に溶解して作製した。
２ｍＭのＨｙｐ（Ｆ．Ｗ．：１３６．１）：ＨＰＸ（Ｓｉｇｍａ製、Ｈ−９３７７）１３．６ ｍｇを上記Ｐ．Ｂ．５０ｍＬに溶解した。溶解しにくいので温めながら一晩攪拌しながら溶解させた。
０．４Ｕ／ｍＬのＸＯＤ：ＸＯＤ（ラボテック製、Ｃｏｗ ｍｉｌｋ由来、Ｅ．Ｃ． １．１．３．２２） ２０μＬ（２０ Ｕ／ｍＬ）に上記Ｐ．Ｂ．９８０μＬを添加した（５０倍希釈）。
ＤＭＰＯ(5,5-Dimethyl-Prroloine-N-oxide)：ＤＭＰＯ（ラボテック製）を精製水と、割合（重量比）が１：１となるように混合した。
ＤＭＳＯ(Dimethyl sulfoxide)：ＤＭＳＯ（関東化学製、Ｎｏ．１０３７８−００）を用いた。
ＳＯＤ(Superoxide dismutase)：ＳＯＤ（Ｓｉｇｍａ製、ｓ−５３９５、Ｅ．Ｃ． １．１５．１．１） （Ｓｉｇｍａ、ｓ−５３９５）を５０００ Ｕ／ｍＬに調整したＳＯＤ溶液を５０、２５、 １２．５、６．２５、３．１２５ Ｕ／ｍＬに希釈して使用した。
【００３７】
〈機器〉
電子スピン共鳴装置 ＪＥＳ−ＦＡ１００（日本電子）
〈方法〉
各種プランクトン水溶性抽出物のＳＯＤ様活性を、ＤＭＰＯを用いたＥＳＲスピントラッピング法により測定し、ＳＯＤ様活性濃度に換算した。
すべてのSampleを０．１ＭのＰ．Ｂ．で２倍希釈して使用した。スーパーオキシドはＨＰＸ／ＸＯＤ系で生成させた。
また消去活性のマーカーとしてEpigallocatechin 3-gallate（ＥＧＣＧ、ロッシュビタミン社（現ＤＳＭ社）製）１ｍｇ／ｍＬを１００倍希釈（８．１５ｎＭ）したものを用いた。
【００３８】
〈手順〉
以下の試薬を下記の順に直径１５ｍｍのテストチューブに加えた。
ＨＰＸ ５０μＬ
ＤＭＳＯ ３０μＬ
Sample ５０μＬ
ＤＭＰＯ ２０μＬ
ＸＯＤ ５０μＬ
ＸＯＤ添加後に１０秒間Ｖｏｒｔｅｘによって攪拌し、水溶液用セルに吸入した。ＸＯＤ添加から６０秒後にＥＳＲ測定を開始した。
【００３９】
ＥＳＲ測定条件
共鳴周波数： ９．４２ＧＨｚ
出力：４ｍＷ
磁場変調： １００ｋＨｚ
観測磁場： ３３５．５± ５ｍＴ
測定時間： ２ｍｉｎ
変調幅： ０．０７ｍＴ
増幅率： ２００
【００４０】
ＳＯＤ様活性を求める場合に使用する検量線作成の際には、Sampleの代わりに活性既知のＳＯＤを添加した。０．１Ｍ Ｐ．Ｂ．添加時（コントロール）のスペクトルのＭｎマーカーに対する相対強度をＩ0、ＳＯＤ添加時に観測されたスペクトルのＭｎマーカーに対する相対強度をＩと表した場合、
Ｘ軸：ＳＯＤ活性
Ｙ軸：（Ｉ0／Ｉ）−１
とし、検量線を作成した。
測定は、各試料につき２回行った。抗酸化活性は、ＳＯＤ活性検量線を用いてＳＯＤ様活性濃度に換算することにより求めた。
【００４１】
化学発光法によるＳＯＤ様活性および電子スピン共鳴（ＥＳＲ）法によるＳＯＤ様活性の結果をそれぞれ図１および図２に示した。
この結果、渦鞭毛藻類において、抗酸化活性があることが認められた。
特に、Sample４、６では、化学発光法およびＥＳＲ法において相関関係が認められた。しかしながら、渦鞭毛藻類（特に、Gymnodinium属）については、化学発光法ＳＯＤ様活性が全く認められないか、極めて低いＳＯＤ様活性であったものについて、ＥＳＲ法でＳＯＤ様活性を測定することにより、高いＳＯＤ様活性が認められた。すなわち、ＥＳＲ法でＳＯＤ様活性を測定することにより、渦鞭毛藻類（特に、Gymnodinium属）も抗酸化性物質を産生することが明らかになった。
【００４２】
実施例２
上記のうち、Sample１、Sample３および、Chattonella ovata（ＣＯ）の抽出物（いずれも６０μｇクロロフィル当量／ｍＬ）、アスコルビン酸（ＡＳＡ）６９．８μＭ（１２．３μｇ／ｍＬ）の熱安定性を調べた。
【００４３】
上記Sampleを、１６．５ｍｍ×４５ｍｍのバイアル瓶に３００μＬずつ分注し、乾熱滅菌器（ＳＡＮＹＯ製、ＭＯＶ−１１２Ｓ）で３０、６０、９０、１２０分間１００℃および３０、６０分間２００℃で加熱処理をし、室温に戻した後、ＳＯＤ様活性を測定した。このときの状態は、乾燥した状態であった。加熱処理をしない試料のＳＯＤ様活性を１とし、それぞれ加熱処理した後のＳＯＤ様活性を、ＳＯＤ様活性の比（％）として求めた。その結果を図３および図４に示した。
図３に示すように、Sample１（Gymnodinium属）は加熱３０分でＳＯＤ様活性が１．４倍になり、１００分で約２倍のＳＯＤ様活性を示した。Sample１以外のＣＯ、Sample３、ＡＳＡは加熱３０分でＳＯＤ様活性が半分以下となった。
図４においても、Sample１は１００℃の加熱処理と同様に、加熱することで活性が４倍まで高くなった。
【００４４】
また、他のGymnodinium属由来のSampleについても同様に行ったところ、図３および４と同様に熱処理することにより、活性がより高くなる傾向にある。
すなわち、Gymnodinium属については、熱処理／乾燥処理をしても、高いＳＯＤ様活性を示すことが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】各種赤潮プランクトンのＳＯＤ様活性を化学発光法で測定した結果を棒グラフで示したものである。
【図２】各種赤潮プランクトンのＳＯＤ様活性を電子スピン共鳴（ＥＳＲ）法で測定した結果を棒グラフで示したものである。
【図３】赤潮プランクトンのＳＯＤ様活性の１００℃に対する熱安定性を折れ線グラフで示したものである。
【図４】赤潮プランクトンのＳＯＤ様活性の２００℃に対する熱安定性を折れ線グラフで示したものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
渦鞭毛藻類由来の抗酸化剤。
【請求項２】
前記抗酸化剤は、スーパーオキシドを消去するものである、請求項１に記載の抗酸化剤。
【請求項３】
前記渦鞭毛藻類は、Gymnodinium属に属する、請求項１または２に記載の抗酸化剤。
【請求項４】
前記渦鞭毛藻類は、Gymnodinium impudicumである、請求項１または２に記載の抗酸化剤。
【請求項５】
前記抗酸化剤は、水溶性である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗酸化剤。
【請求項６】
前記抗酸化剤は、１００℃で３０分以上熱処理しても、抗酸化活性が低下しない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗酸化剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗酸化剤を含む食品。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗酸化剤を含む薬品。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗酸化剤を含む化粧料。
【請求項１】
渦鞭毛藻類由来の抗酸化剤。
【請求項２】
前記抗酸化剤は、スーパーオキシドを消去するものである、請求項１に記載の抗酸化剤。
【請求項３】
前記渦鞭毛藻類は、Gymnodinium属に属する、請求項１または２に記載の抗酸化剤。
【請求項４】
前記渦鞭毛藻類は、Gymnodinium impudicumである、請求項１または２に記載の抗酸化剤。
【請求項５】
前記抗酸化剤は、水溶性である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗酸化剤。
【請求項６】
前記抗酸化剤は、１００℃で３０分以上熱処理しても、抗酸化活性が低下しない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗酸化剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗酸化剤を含む食品。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗酸化剤を含む薬品。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗酸化剤を含む化粧料。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００８−７４８３０（Ｐ２００８−７４８３０Ａ）
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１０６９１３（Ｐ２００７−１０６９１３）
【出願日】平成１９年４月１６日（２００７．４．１６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１６〜１８年度 農林水産省、委託プロジェクト研究、産業再生法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（３９７００８６３８）サニーヘルス株式会社 (10)
【出願人】（５０１１６８８１４）独立行政法人水産総合研究センター (103)
【出願人】（５０４２０５５２１）国立大学法人 長崎大学 (226)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月１６日（２００７．４．１６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１６〜１８年度 農林水産省、委託プロジェクト研究、産業再生法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（３９７００８６３８）サニーヘルス株式会社 (10)
【出願人】（５０１１６８８１４）独立行政法人水産総合研究センター (103)
【出願人】（５０４２０５５２１）国立大学法人 長崎大学 (226)
【Ｆターム（参考）】
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