捕集デバイス、及びそれを用いる分析システム
【課題】ATP法による空中浮遊菌の計測において、捕集担体からの生菌の回収が煩雑で回収率が低い、などの課題があった。
【解決手段】捕集担体として相転移温度が40℃以下の温度感受性樹脂を用い、菌捕集時と菌回収時の温度を制御することにより捕集担体をそれぞれゲル状、ゾル状とした。菌捕集時は捕集担体の変形が少なく菌の捕集効率が高く、菌回収時は菌を懸濁液として取り扱うことが可能でろ過濃縮などの後処理が容易である。本発明による捕集担体は、穏和な温度制御という非接触かつ簡便な手段と組み合わせることにより、上記捕集効率と取扱簡便性の両立を達成した。
【解決手段】捕集担体として相転移温度が40℃以下の温度感受性樹脂を用い、菌捕集時と菌回収時の温度を制御することにより捕集担体をそれぞれゲル状、ゾル状とした。菌捕集時は捕集担体の変形が少なく菌の捕集効率が高く、菌回収時は菌を懸濁液として取り扱うことが可能でろ過濃縮などの後処理が容易である。本発明による捕集担体は、穏和な温度制御という非接触かつ簡便な手段と組み合わせることにより、上記捕集効率と取扱簡便性の両立を達成した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、捕集デバイス、及びそれを用いる分析システムに関し、例えば、大気中に浮遊する微生物を捕集するための捕集デバイス、及びそれを用いる分析システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
空中に浮遊する細菌などの微生物数の検査法として、集塵機を用いてゲル状の寒天培地表面に捕集した微生物を培養し、生じたコロニー数を計数する方法が実用に供されている。
【０００３】
しかし、培養法は数日間に及ぶ長い時間がかかり、また自動化が困難で手間がかかるという課題がある。また微生物検査は医薬品工場やセルプロセッシングセンター、食品工場など、高清浄度が要求される環境の微生物的清浄度（無菌性）の検証のために用いられるケースが多い。上記環境におけるオンサイトの微生物検査に培養法を適用する場合、検査工程の産物である大量に増幅した微生物が万一サイトに混入すると環境の清浄度確保の目的を破壊しかねないため、オンサイトの検査が行いにくく、検査室の設置、試料の搬送、産物の厳重な管理が必要である、という課題があった。
【０００４】
この改善策として培養無しに、即ち迅速簡便かつ生物的汚染のリスクなしに微生物数を検査する方法が各種考案されている。第１の方法として試料中の微生物を２種類の蛍光試薬を用いて染色し、蛍光顕微画像解析などにより生菌と死菌を判別、計数する方法（蛍光法）がある。第２の方法として試料中の微生物からＡＴＰを抽出し、ＡＴＰの生物発光反応を、ルミノメータを用いて計測することによりＡＴＰ量を定量し、生菌数に換算する方法（ＡＴＰ法）がある。
【０００５】
ところが、第１の方法は原理的に１細菌の計測が可能であるが、蛍光性の夾雑物質が試料中に混在すると誤差の原因となる。また生菌と死菌の判別は必ずしも容易ではない。例えば死菌を選択的に染色するとされるプロピジウムアイオダイド（ＰＩ）の死菌に対する平均蛍光強度は生菌に対するそれよりむしろ低い場合があり（非特許文献１、図１Ｃ、縦軸がＰＩの蛍光強度）、単純な解釈を行うと正反対の結論を導く恐れが高い。
【０００６】
一方、第２の方法はＡＴＰに選択的に応答する生物発光反応に基づくため、蛍光性の夾雑物質の影響は原理的に受けない。また、生菌の菌体外に含まれるＡＴＰを事前に消去するＡＴＰ消去剤、生菌からＡＴＰを抽出するＡＴＰ抽出試薬、生菌中のＡＴＰを生物発光反応により発光させて計測するための発光試薬を備えた試薬キット（製品名「ルシフェールＨＳセット」）もキッコーマン社から発売されている（非特許文献２）。このキットをルミノメータと組み合わせて用いれば死菌などの影響を排除し、生菌のみに由来するＡＴＰ量を選択的に測定可能であるとされている。
【０００７】
ただし、第２の方法の検査対象試料は水溶液中に分散された微生物であり、空中浮遊菌の検査に適用することは想定されていない。空中浮遊菌の培養法による検査のためにはインパクタ方式の集塵機構を備え、ゲル状の寒天（糖類）培地からなる捕集担体を収納した培地カセットを内蔵可能な製品（例えばミリポア社製のM Air T型エアーサンプラー）として入手出来るのに対し、ＡＴＰ法に適用可能なエアーサンプラーは市販されていない。空中浮遊菌の検査にＡＴＰ法を適用する場合、培養法向けのインパクタ方式のエアーサンプラーを用いて捕集担体に菌を捕集し、捕集担体から菌を取り出して菌懸濁液とし、ルシフェールＨＳセットなどの生物発光法に基づく試薬キットを用いてＡＴＰ法により計測を行う方法が考えられる。この従来のエアーサンプラーとＡＴＰ法との単純な組合せを本明細書では以下従来法と記すこととする。
【０００８】
【非特許文献１】製品技術情報 「ライブ／デッド バックライトＴＭ バクテリアル バイアビリティー アンド カウンティング キット（Ｌ３４８５６）」モレキュラープローブス社 ２００４年２月２日改訂版
【非特許文献２】村上成治ほか「ホタルルシフェラーゼの応用開発」日本農芸化学会誌、７８巻、７号、ｐ．６３０−６３５（２００４年）
【非特許文献３】古澤邦夫監修「新しい分散・乳化の科学と応用技術の新展開」ＩＳＢＮ４−９２４７２８−５０−０、テクノシステム社、ｐ．３７０（２００６年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかるに、従来法におけるエアーサンプラーで用いられるゲル状の寒天培地からなる捕集担体は捕集した菌をその捕集担体上で培養することを目的としている。このため、従来法では捕集担体から菌を取り出す工程（以降取出し工程）が考慮されていない。取出し工程には次のような課題がある。即ち、捕集担体はゲル状であるため菌をよく捕捉できるものの、逆に取出すことは困難であり菌の回収効率が低い。寒天ゲルを加熱すれば実質的に菌懸濁液同様に取扱うことが可能なゾル状とすることができる。
【００１０】
しかし、寒天ゲルのゾル化には８０℃以上の高温を必要とするため、生菌のほとんどが損傷あるいは死滅してしまい、生菌の回収効率が低く、生菌と死菌を判別できない課題がある。よって、生菌の回収効率を高めるためには寒天ゲルをゾル化せず、室温付近の温度の溶液をゲル上に添加して溶液に移行した菌を菌懸濁液として回収する操作を繰り返すなどの穏和な条件が必要である。ただし、これには熟練作業者による時間がかかる繊細な手作業を必要とし、自動化が困難であり、再現性が低く、また作業者由来の汚染による偽陽性のリスクがある。
【００１１】
一方、回収に用いる溶液を多くして作業を簡略化する方法も考えられるが、菌懸濁液の液量が多いと単位液量当たりの菌数（濃度）が低く、結果的に計測工程における菌の利用効率が低い。例えばＡＴＰ法の代表的な製品であるキッコーマン社のルシフェールＨＳセットにおけるプロトコル（従来プロトコル）によると試料液量は０．１ｍＬである。
【００１２】
従って、計測工程における縣濁液の利用効率は菌懸濁液の体積が１ｍＬなら１０％、１０ｍＬなら１％と、菌懸濁液の量が多いほど縣濁液の利用効率が低い。よって、この方法には簡便性と利用効率が相反するという課題がある。
【００１３】
さらに、従来プロトコルによれば試料液のうち実際に発光計測に用いられるのは１／１０であるため、総合的な利用効率は菌の回収効率のさらに１０％にすぎないという課題もある。また、クリーンルーム等の清浄度の高い環境における数個ないし数十個程度の極微量の空中浮遊菌の検査を目的とする場合は、回収効率や利用効率が低いと菌の計測漏れを起こす、すなわち偽陰性の課題がある。計測漏れを回避するために空気試料のサンプリング体積を増加するなどの対策が必要になり、サンプリング時間が長く、結果が迅速に得られない、という課題がある。
【００１４】
このように、以上の手法をそのまま自動化するとシステム構成が複雑であり、裕度確保のために回収に用いる溶液をさらに過剰に用いる必要があり、利用効率がさらに低い、という課題がある。また、本法を実試料に適用した場合、集塵した試料中には微生物以外の夾雑物が多量に混入するが、従来法は夾雑物がＡＴＰ消去反応やＡＴＰ抽出反応、ＡＴＰ発光反応に影響を及ぼし、測定精度が低い、という課題があった。
【００１５】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、空中浮遊菌の検査にＡＴＰ法を適用する場合における問題点、即ち、捕集担体からの菌の取出し工程が考慮されていないこと、回収効率や利用効率が低いこと、極微量の菌数測定における信頼性が低いこと、自動化が困難で複雑な構成を要すること、夾雑物混入の影響を受けて測定精度が低いこと、等の問題点のうち少なくとも１つを解決する、微生物の捕集デバイス及びそれを備えた分析システムを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記課題を解決するために、本発明による微生物の捕集デバイスが保持する高分子は、 温度が１５度以上３７度以下の範囲でゲル‐ゾル間の相転移を行うものである。また、高分子の他に、殺菌作用を有しないアルコール類を含むようにしてもよい。このアルコール類としては、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール等が挙げられる。また、高分子は、ゼラチン又はＮＡＧＡｍ／ＭＢＰＤＡのいずれかであることが好ましい。
【００１７】
なお、アルコールがグリセロールの場合、このグリセロールは、捕集デバイスが保持する部材（物質）に対する重量比３０％以上６０％以下であることが好ましい。また、高分子がゼラチンである場合、このゼラチンは、捕集デバイスが保持する部材（物質）に対する重量比５％以上１０％以下であることが好ましい。さらに、高分子がＮＡＧＡｍ／ＭＢＰＤＡである場合、このＮＡＧＡｍ／ＭＢＰＤＡは上記部材（物質）に対する重量比１％以上１０％以下であることが好ましい。
【００１８】
さらに、捕集デバイスは、その底面がフィルターで構成されるようにしてもよい。
【００１９】
また、本発明による自動測定装置は、温度依存的にゾル‐ゲル間の相転移を行う温度感受性樹脂、好ましくは４０度以下の温度においてゾル‐ゲル間の相転移を行う温度感受性樹脂からなる捕集担体を備えたデバイスと、温度制御機構、また好ましくはろ過機構、さらに必要に応じて希釈機構を備えている。本発明では、第１に、温度制御機構を用いて温度感受性樹脂からなる捕集担体をゲル状として空中浮遊菌を集菌し、第２にこの捕集担体を温度制御機構を用いてゾル状に相転移させ、或いはさらに希釈溶液により希釈することにより、菌懸濁液とする。
【００２０】
本発明における温度感受性樹脂材料の相転移温度は４０℃以下であるため、穏和な温度条件において菌の捕集と回収を行う。菌懸濁液に対して従来のＡＴＰ法を適用して菌のＡＴＰ計測を行うか、あるいは好ましくは菌懸濁液をろ過することにより菌懸濁液中の菌をフィルター上に捕捉し、改良したＡＴＰ法の計測プロトコルによりＡＴＰ計測を行い、空中浮遊菌の検査を行う。
【００２１】
さらなる本発明の特徴は、以下本発明を実施するための最良の形態および添付図面によって明らかになるものである。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の捕集デバイスによれば、捕集担体からの菌の取出しが容易になる、回収効率や利用効率が高くなる、極微量の菌数測定における信頼性を高められる、自動化が簡単な構成で容易に実現できる、夾雑物混入の影響を受けても測定精度を高くすることができる、等の効果のうち少なくとも１つの効果を期待することができるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は、温度感受性樹脂からなる捕集担体を用い、温度制御により捕集時は捕集担体をゲル状に、回収時は捕集担体をゾル状にし、また４０℃以下の穏和な温度条件でゲル及びゾルの相転移を行うものである。そして、このようにすることにより、菌の熱による損傷や死滅などの問題を回避し、捕集担体からの菌の回収効率を高め、菌懸濁液の体積を小さくして利用効率を高め、空中浮遊菌の高感度な検査を簡便迅速に実現する。
【００２４】
なお、様々なサイトで問題となる菌は人間がそのサイトに持ち込むケースが多い。そのため、人間の体温に近い温度で生存する菌を捕集して分析する必要があり、４０℃以下という温度設定としているのである。
【００２５】
以下、添付図面を参照して本発明の実施形態について説明する。ただし、本実施形態は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明の技術的範囲を限定するものではないことに注意すべきである。また、各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている。
【００２６】
＜第１の実施形態＞
（１）捕集デバイスについて
まず、本発明の第１の実施形態による捕集デバイス１の構成概要について説明する。 図１は、本発明による第１の実施形態による捕集デバイス１の概略構成を示す断面図である。捕集デバイス１は、容器３とそれに収容された捕集担体２とを備えている。
【００２７】
本実施形態では、捕集担体２の材料として下記組成の樹脂を用いている。グリセロール５０重量％、温度感受性樹脂材料（本実施形態ではゼラチン（たんぱく質加水分解物）、詳細後述）７．５重量％、ＡＴＰ消去剤０．０３％とし、残りは生理食塩水によりバランスする。また、容器３として直径４０ｍｍ、深さ５ｍｍの円柱状の凹みを有するポリスチレン製のシャーレを用いる。
【００２８】
次に、本発明による捕集担体２の形成法について説明する。上述の捕集担体２の材料を必要に応じて加温しつつ混合することにより均一な原料ゾルとする。以降の操作は無菌環境下で行う。原料ゾルを加温しつつ孔径０．２２ミクロンのシリンジフィルターによりろ過滅菌する。得られた滅菌ゾル１ｍＬを分取して滅菌済の容器３の底面に均一に注入し、４℃で１週間以上冷却することにより均一なゲルとする。従って捕集担体２の形状も概ね円柱状であり、その直径は容器３の凹みのそれと同じ４０ｍｍ、厚みは約０．８ｍｍとなる。捕集担体２は室温（２５℃）ではゲル状であるが、昇温すると相転移温度においてゲルからゾルに相転移し、３７℃ではゾル状である。従って捕集担体２は上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ：当該温度未満ではゲル状）を有する温度感受性樹脂として機能し、その上限臨界溶液温度は２５℃より高く３７℃より低い。この捕集担体２の温度依存的なゾル、ゲル相転移は可逆的である。なお、捕集担体として下限臨界溶液温度（当該温度より高い温度ではゲル状）を有する担体（後述）を用いても良く、この場合は菌の捕集時と回収時において（反転した温度条件を採用することにより）ゾル、ゲルの条件を一致させて用いる。
【００２９】
（２）捕集装置について
図２を用いて本発明による捕集装置１１の構成概要について説明する。図２は、本発明の第１の実施形態による捕集装置１１の概略構成図である。捕集装置１１は、上部部材１１ａと、下部部材１１ｂと、吸気ノズル１２と、ホルダ１３と、温度調節機構１４と、ポンプ１６と、排気ダクト１７と、排気フィルター１８と、を備え、装置内部には空隙（空間）１５が形成されている。この捕集装置１１において、上部部材１１ａは下部部材１１ｂから着脱可能である。上部部材１１ａを下部部材１１ｂに装着して捕集装置１１を形成すると両者の接合部は気密となり、この捕集装置１１の外部開口部は、上部部材１１ａにおける吸気ノズル１２、ならびに下部部材１１ｂにおける排気フィルター１８である。また、下部部材１１ｂ内部にはホルダ１３、ポンプ１６、排気フィルター１８がそれぞれ固定される。なお、図示を省略したがポンプ１６や温度調節機構１４のための制御系や電源などを内蔵し、操作ボタンや取っ手などを外面に有する。また、ホルダ１３は温度調節機構１４を収納し、捕集デバイス１を着脱可能に収納し、捕集デバイス１を収納した際は温度調節機構１４の上面が捕集デバイス１の下面と接触する。捕集装置１１内部には吸気ノズル１２出口から捕集デバイス１を経由してポンプ１６の入り口までを連絡する空隙１５が設けられ、またポンプ１６の出口から排気フィルター１８までは排気ダクト１７が気密に連絡する。本実施形態のごときいわゆるインパクタ型の捕集装置は試料空気の流量が高いため、所定量の試料を短時間で吸引して空中浮遊菌を捕集できるという利点を有する。なお図２において吸気ノズル１２として1穴型の構成を例示したが、本発明で利用可能な吸気ノズル１２はこの構成に限定されず、より小さな穴を多く有する多穴型など各種の吸気ノズルを採用可能である。
【００３０】
（３）菌の計測手順について
（ｉ）まず、図３を用いて本発明による菌の計測手順の概要について説明する。この菌の計測手順は、菌捕集工程（ａ）と、菌回収工程（ｂ）と、ＡＴＰ消去工程（ｃ）と、ろ過工程（ｄ）と、ＡＴＰ抽出工程（ｅ）と、ＡＴＰ回収工程（ｆ）と、ＡＴＰ計測工程（ｇ）とを備えている。
【００３１】
菌捕集工程（ａ）において、捕集装置１１を用いて、空中浮遊菌を捕集デバイス１の捕集担体２（ここではゲル状）に捕集する。
【００３２】
菌回収工程（ｂ）において、捕集担体２をゲル状からゾル状に相転移し、菌懸濁液（試料）とする。
【００３３】
ＡＴＰ消去工程（ｃ）において、試料中の菌以外のＡＴＰ、即ち菌外ＡＴＰや死菌内のＡＴＰを消去する。
【００３４】
ろ過工程（ｄ）において、試料をろ過することにより、水溶性成分や菌より粒径の小さい固形成分などの夾雑物をろ別し、試料中の生菌をフィルター上に捕捉する。
【００３５】
ＡＴＰ抽出工程（ｅ）において、菌の細胞壁を溶解し、生菌の細胞質に含まれるＡＴＰを試料溶液中に抽出する。
【００３６】
ＡＴＰ回収工程（ｆ）において、菌から抽出したＡＴＰを含む試料溶液を得る。
【００３７】
ＡＴＰ計測工程（ｇ）において試料溶液中のＡＴＰをもとに生物発光反応を行い、ルミノメータを用いて発光量を計測することにより試料中のＡＴＰ含量を求め、単位体積当たりの空中浮遊菌数として検査結果を提供する。
【００３８】
（ii）次に、本発明による各構成要素の動作を計測手順に沿って詳細に説明する。菌捕集工程（ａ）に先立ち、前述通りの方法により捕集デバイス１を調製する。捕集装置１１の上部部材１１ａをオートクレーブにより滅菌し、下部部材１１ｂや前述の通り調製した捕集デバイス１とともに、計測対象である空気を捕集する場所（以下捕集場所）近傍に設置したクリーンベンチに搬入する。以下クリーンベンチ内の操作は無菌的に行う。下部部材１１ｂにおけるホルダ１３や空隙１５、外面などを、消毒用エタノールなどを用いて除菌した後、捕集デバイス１をホルダ１３に設置し、滅菌した上部部材１１ａを装着し、捕集装置１１を形成する。捕集装置１１の吸気ノズル１２を菌による汚染から保護するキャップ（図示しない）を装着し、捕集装置１１をクリーンベンチから搬出し、捕集場所に設置して準備を完了する。この際捕集場所ならびにクリーンベンチは空調により室温が約２５℃に制御されており、各部材の温度も約２５℃である。また温度調節機構１４を動作させ、その温度を２５℃とする。捕集デバイス１の捕集担体２は２５℃より高く３７℃より低い上限臨界溶液温度を有する温度感受性樹脂材料であるため、この温度においてゲル状である。
【００３９】
菌捕集工程（ａ）においては、捕集装置１１を動作させ、捕集場所における空中浮遊菌を吸入し、捕集デバイス１に捕集する。具体的にはポンプ１６を回転することにより捕集装置１１の外の空気を吸気ノズル１２及び空隙（空間）１５を経由してポンプ１６に吸入し、さらに排気ダクト１７と排気フィルター１８を経由して捕集装置１１の外部に排出する。この際空気中の浮遊菌は吸気ノズル１２を通して捕集デバイス１に概ね垂直に当たる気流に沿って運ばれ、慣性によりゲル状の捕集担体２に衝突して捕集される。空気や、菌より質量の小さな微粒子は捕集担体２と衝突後、捕集担体２の表面と平行な方向に向きを変え、空隙１５、ポンプ１６、排気ダクト１７、排気フィルター１８へと運ばれる。菌より質量の小さな微粒子は排気フィルター１８に捕捉され、微粒子を含まない清浄な空気が排気フィルター１８を介して捕集装置１１の外部に排出される。本実施形態においてポンプ１６は２００Ｌ／分の一定流量を示し、捕集時間を１５分とすることにより３立方メートルの一定量の空気を吸引する。この工程の結果、３立方メートルの空気中の浮遊菌がゲル状の捕集担体２に捕集される。
【００４０】
菌回収工程（ｂ）においては、温度調節機構１４を動作させ、その温度を２５℃から３７℃まで上昇させる。温度調節機構１４の上面から捕集デバイス１の下面、即ち容器３、さらには捕集担体２へと熱が伝導し、捕集担体２の温度も速やかに３７℃に上昇する。本実施形態で採用した捕集担体２は２５℃から３７℃に温度を上昇することによりゲル状からゾル状へと相転移を行う、即ち２５℃より高く３７℃より低い上限臨界溶液温度を有する温度感受性樹脂として機能する。捕集担体２に捕集された生菌などの微粒子は、このゾルに分散され、菌縣濁液状となる。また、捕集担体２に捕集された生菌以外の成分のうち、水溶性成分はこのゾルに溶解する。この工程の結果、菌縣濁液状試料１ｍＬが容器３の中に回収される。
【００４１】
ＡＴＰ消去工程（ｃ）において、ルシフェールＨＳセットに含まれるＡＴＰ消去剤を上記菌縣濁液状試料に３０μＬ添加混合し、３０分間室温で静置する。この工程により、試料中の生菌以外のＡＴＰ、即ち菌外ＡＴＰや死菌内のＡＴＰ、ならびに捕集担体２に残存していたごく微量のＡＴＰが消去される。この工程の結果、生菌以外のＡＴＰが消去された反応液１．０３ｍＬが容器３の中に得られる。
【００４２】
ろ過工程（ｄ）に先立ち、メンブレンフィルター（ミリポア社ＨＡＷＰ０２５００型、直径２５ｍｍ、膜材質はＭＦ−ミリポア、公称孔径０．４５ミクロン）を目皿上に収納したろ過デバイス（図示しない）をオートクレーブ滅菌したものを予め準備する。
【００４３】
ろ過工程（ｄ）においては、上記反応液をフィルター上面に滴下し、下面（目皿面）を減圧して吸引することによりろ過する。ろ過完了後フィルター下面を大気圧に戻す。この工程の結果、反応液中の水溶性成分や粒径が０．４５ミクロンより小さい菌以外の固形成分などの夾雑物がろ別され、（０．４５ミクロンより大きい）生菌を捕捉したフィルターを収納したろ過デバイスが得られる。
【００４４】
ＡＴＰ抽出工程（ｅ）においては、ルシフェールＨＳセットに含まれるＡＴＰ抽出試薬を上記ろ過デバイスのフィルター上面に１００μＬ添加し、２０秒間室温で混合する。フィルターは例えばシリコンゴムで形成されたＯリング上に載置され、またフィルター下面は大気圧であるため、ろ過は行われず、添加された試薬液は表面張力によりフィルター上に留まる。この工程の結果、生菌の細胞壁が溶解され、菌の細胞質に含まれていたＡＴＰが抽出され、このＡＴＰを溶解した試料溶液１００μＬがフィルター上に得られる。
【００４５】
ＡＴＰ回収工程（ｆ）においては、上記試料溶液をピペットにより３０μＬ吸引する。この工程の結果、生菌に含まれていたＡＴＰを溶解した試料溶液１００μＬのうち、３０μＬが回収液としてピペット内に得られる。捕集した試料中に存在した生菌中のＡＴＰの３０％が回収液中に回収されるため、回収液の利用効率はこの場合０．３である。
【００４６】
ＡＴＰ計測工程（ｇ）に先立ち、ＡＴＰ発光試薬０．２ｍＬをルミノメータ用のポリプロピレン製の試験管に注入し、ルミノメータ（Berthold Detection Systems社ＦＢ１２型）に設置して発光量を測定する（ベースライン）。ベースラインの発光量は概ね４０〜６０ｃｐｓ（count per second）である。次に２００ａｍｏｌの標準試料（濃度２０ｐｍｏｌ／ＬのＡＴＰ標準液１０μＬ）を、上記ＡＴＰ発光試薬０．２ｍＬを含む試験管に追加注入し、混合後、発光量を測定する（標準試料）。標準試料の発光量は概ね２０００ｃｐｓとなる。標準試料の実効発光量は、標準試料の発光量からベースラインの発光量を減算して求める。標準試料の実効発光量をそのＡＴＰ量で除することにより、感度、即ち単位ＡＴＰ量当たりの実効発光量を求める。感度は概ね１０〜２０ｃｐｓ／ａｍｏｌである。
【００４７】
ＡＴＰ計測工程（ｇ）においては、上記回収液３０μＬを、上記ＡＴＰ発光液を含む試験管に追加注入し、混合後、同様に発光量を測定する（サンプル）。サンプルの実効発光量は、サンプルの発光量からベースラインの発光量を減算して求める。サンプルの実効発光量を感度で除算することにより、回収液中のＡＴＰ量を求める。この値を回収液の利用効率０．３で除算することにより、試料中の生菌に含まれるＡＴＰ量を求める。この試料中のＡＴＰ量を一生菌当たりのＡＴＰ含有量の平均値（約２ａｍｏｌ）で除算することにより試料中の平均生菌数を求める。試料中の平均生菌数を捕集した気体試料の体積である３立方メートルで除算することにより、単位体積の気体試料に含まれる平均生菌数を求める。この工程の結果、試料溶液中のＡＴＰ含量が計測され、単位体積当たりの空中浮遊菌数として検査結果が得られる。
【００４８】
（４）捕集担体の予備検討について
以上のように、第１の実施形態の特徴的な構成要素として捕集担体２が挙げられる。そこで、捕集担体２の組成について予備検討をすると次のようになる。
【００４９】
（ｉ）第１に、本実施形態では吸入する空気の体積を３立方メートル、ポンプ１６の流量を２００Ｌ／分、吸気ノズル１２の直径を０．４８ｃｍとする。この動作条件において吸気ノズル１２における空気の線速度は平均１８１ｍ／ｓに及び、また捕集する空気の体積が３立方メートルと大きいため、従来の寒天ゲルなどから成る捕集担体を用いると水分が蒸発してゲルの体積が激減し、ゲルの表面が乾燥して固体状に変化し、菌を効率良く捕集できない課題がある。そこで本実施形態においてはグリセロールを５０％含有する捕集担体２を用いることにより、捕集担体２の変形や乾燥を防止し、空中浮遊菌の捕集担体２への捕集において高い捕集効率を実現する。捕集担体２の変形や乾燥を防止するための材料としては本実施形態で採用したグリセロールの他、エチレングリコール、プロピレングリコールなどの各種アルコール類（乾燥防止）が使用できる。なお、アルコールの種類は、殺菌作用がないアルコールである必要がある。捕集担体２に捉えられた菌を死滅させないようにするためである。よって、例えばエタノールは不適である。
【００５０】
（ii）捕集担体２に関する第２の予備検討として、グリセロールとゼラチンと生理食塩水とから調製した捕集担体について検討する。この場合例えろ過を行っても、菌を含まないブランク試料の計測結果が１０〜２０ａｍｏｌ程度の異常高値を示す課題が確認される。捕集担体の材料のうち特にゼラチンは測定すべき極微量（数ａｍｏｌ）のＡＴＰと比較して多量のＡＴＰを含有するため、それが残留して異常高値の原因となると考えられる。
【００５１】
そこで、本実施形態の実施に先立ち、下記モデル実験を行い、捕集担体に含まれるＡＴＰを事前に除去してブランク計測値を低減する方法を検討する。つまり、ゼラチン由来のＡＴＰを除去するための前処理である。
【００５２】
具体的にはゼラチン５重量％とグリセロール５０重量％を生理食塩水に溶解した材料をベースに、ルシフェールＨＳセットに含まれるＡＴＰ消去剤を各種割合で添加したモデル捕集担体を調製する。このモデル捕集担体を３７℃加温によりゾル状とし、それを直接あるいは純水で希釈した液１０μＬを分取し、ＡＴＰ発光試薬０．２ｍＬに添加して発光量を計測し、その結果の一例を図４に示す。ＡＴＰ消去剤を添加しない場合は７１７８ｃｐｓと極めて高いブランク信号を生じる。
【００５３】
一方、ＡＴＰ消去剤を容量比でそれぞれ０．０３、０．１％添加したモデル捕集担体のブランク信号はそれぞれ１０３、５７ｃｐｓと、添加しない系と比較して激減する。ＡＴＰを含まない純水を試料としたベースライン計測値（この実験では５６ｃｐｓ）との差分である実効発光量はＡＴＰ消去剤０、０．０３、０．１％の系に対しそれぞれ７１２２（＝７１７８−５６）、４７（＝１０３−５６）、１（＝５７−５６）ｃｐｓであり、感度約１１．２ｃｐｓ／ａｍｏｌを用いて求めたそれぞれのＡＴＰ含量は約６３６、４．２、０．１ａｍｏｌである。
【００５４】
従ってＡＴＰ消去剤を０．０３％以上捕集担体へ添加することにより、ゼラチン等に由来するＡＴＰを効果的に分解除去した捕集担体を調製することが可能であり、そのＡＴＰによる計測結果への影響を１／１００以下に抑制でき、ろ過と組み合わせることにより前記の異常高値を回避し実質的に影響が無い水準まで抑制できることがわかる。
【００５５】
以上の検討結果に基づいて、ゼラチンを含有する捕集担体２としてＡＴＰ消去剤を含有する組成が好適であることを見出し、またその必要組成はルシフェールＨＳセットに付属するＡＴＰ消去剤を用いる場合０．０３％以上であることがわかる。この必要組成の下限値である０．０３％を本実施形態のＡＴＰ消去剤組成として採用することにより、主としてゼラチンに由来するＡＴＰ汚染を捕集担体２から排除する。
【００５６】
（iii）捕集担体２に関する第３の予備検討として、捕集担体のＡＴＰ消去剤含有比率を０．０３％に固定した上で、温度感受性樹脂材料として用いたゼラチン組成について検討する。
【００５７】
図５は、ＡＴＰ消去剤含有比率０．０３％、グリセロール濃度５０重量％、生理食塩水バランスにより調製したモデル捕集担体において、ゼラチン濃度を５、７．５、１０重量％と変化させた場合におけるモデル捕集担体の温度特性ならびにろ過特性を示している。図５に示されるように、いずれの組成の場合もモデル捕集担体は２５℃から３７℃にステップ昇温した場合において５分以内にゾル状となり、回収工程に好適に適用可能である。ゼラチン濃度が７．５重量％以上の場合は２５℃におけるゲル強度が高く、捕集担体として使用可能である。しかしゼラチン濃度が５重量％の場合は２５℃におけるゲル強度がやや低い。
【００５８】
従って、ゼラチン濃度を７．５重量％以上とすることにより、２５℃でゲル状、３７℃でゾル状、即ち２５℃より高く３７℃より低い上限臨界溶液温度を有する温度感受性樹脂材料が得られる。
【００５９】
一方、前述のろ過工程の条件下におけるろ過特性についてはゼラチン濃度が７．５重量％以下の場合は長くても４０秒あれば１ｍＬのゾルのろ過が可能であり、前述のろ過工程に良好に適用可能である。
【００６０】
しかし、ゼラチン濃度が１０重量％の場合は粘性が高くろ過が困難で、一部ろ過されない成分がフィルター上に残留する場合がある。
【００６１】
以上により、２５℃より高く３７℃より低い上限臨界溶液温度を有し、かつ良好なろ過特性を示す捕集担体材料のゼラチン濃度は５ないし１０重量％が好適であり、またその最適濃度条件は７．５重量％であることがわかる。この最適濃度条件である７．５重量％を本実施形態のゼラチン濃度条件として採用する。
【００６２】
（iv）捕集担体２に関する第４の予備検討として、捕集担体のＡＴＰ消去剤含有比率を０．０３％に固定した上で、グリセロール組成について検討する。
【００６３】
図６は、ＡＴＰ消去剤含有比率０．０３％、ゼラチン濃度を５、７．５、１０重量％、生理食塩水バランスにより調製したモデル捕集担体において、グリセロール濃度を３０、４０、５０、６０重量％、と変化させた場合におけるモデル捕集担体の温度特性ならびにろ過特性を示している。
【００６４】
図６に示されるように、いずれの組成の場合もモデル捕集担体は３７℃においてゾル状となり、回収工程に好適に適用可能である。グリセロール濃度が５０重量％以上の場合は２５℃におけるゲル強度が高く、捕集担体として使用可能である。
【００６５】
しかし、グリセロール濃度が４０重量％以下の場合は２５℃におけるゲル強度がやや低い。従って、グリセロール濃度を５０重量％以上とすることにより、２５℃より高く３７℃より低い上限臨界溶液温度を有する温度感受性樹脂材料が得られる。
【００６６】
一方、ろ過特性についてはグリセロール濃度が５０重量％以下の場合は長くても４０秒あれば１ｍＬのゾルのろ過が可能であり、前述のろ過工程に良好に適用可能である。しかしグリセロール濃度が６０重量％の場合は粘性が高くろ過が困難で、一部ろ過されない成分がフィルター上に残留する場合がある。
【００６７】
以上により２５℃より高く３７℃より低い上限臨界溶液温度を有し、かつ良好なろ過特性を示す捕集担体材料のグリセロール濃度は３０ないし６０重量％が好適であり、またその最適濃度条件は５０重量％であることが見出される。この最適濃度条件である５０重量％を本実施形態のグリセロール濃度条件として採用することができる。
【００６８】
（５）回収特性の評価について
本実施形態の回収特性を以下の方法により評価する。空中浮遊菌のモデル試料として、標準菌株（日水製薬社のEasy QA Ball大腸菌１０，０００ｃｆｕ）を純水で希釈した懸濁液を調製する。菌捕集工程（ａ）における気体試料からの捕集装置１１による捕集デバイス１への浮遊細菌の捕集工程を、一定量のモデル試料を捕集担体２へ点着することにより代用する。以降の工程は本実施例通りに評価実験を行う。比較のために従来法、即ち菌捕集工程（ａ）における捕集担体２として寒天ゲルを用い、菌回収工程（ｂ）における菌の回収方法として生理食塩水１ｍＬを２回に分けて寒天ゲル表面に分注ならびに表面から再吸引して回収する方法、また菌捕集工程（ａ）は本実施例同様にモデル試料点着で代用する方法と比較検討する。従来法の捕集担体２としては市販の寒天培地（Tryptic Soy Agar）を使用する。
【００６９】
図７は、５００ＣＦＵのモデル試料を用いた場合の両方法による２連の計測結果の一例を示している。従来法による結果はＡＴＰ量、平均生菌数、回収率が極めて低く、２連の内片方は菌が全く回収されない結果となる。
【００７０】
一方、本実施形態による結果は、ＡＴＰ量として平均約５４０ａｍｏｌ、平均生菌数として約２７０ＣＦＵ、回収率として平均約５５％（＝（４４＋６５）／２）である。この結果は、従来法と比較して、平均約４（＝５５／１３）倍所定値に近い（即ち、回収率１００％により近くなっている）。
【００７１】
以上の通り、本実施形態は、従来法と比較して高精度な測定結果が得られる。本発明と従来例の最大の相違点は捕集デバイス１ならびにそれから菌を回収する工程にある。本発明の方が従来法より高精度だったのは、菌回収工程（ｂ）において捕集デバイス１から菌を効率よく回収できたためと考えられる。実際、参考実験として従来法に使用した捕集担体２（菌回収を行った残り）を３５℃で２日間培養したところ、何れの捕集担体も多数のコロニーを呈した。
【００７２】
従って、従来法が所定値から隔絶した結果を示したのは菌回収工程（ｂ）における回収効率が低いことが原因と考えられる。
【００７３】
一方、本実施形態の方法、即ち４０℃以下の温度変化という穏和かつ非接触的な手段によりコンタミネーションなしに捕集担体そのものをゲル‐ゾル相転移させ、菌懸濁液として取り扱うことを可能にする新規な方法を採用することにより、捕集担体に回収した菌を効率よく次の工程に提供できる。
【００７４】
（６）総合特性の評価について
本実施形態の総合特性を以下の方法により評価する。空中浮遊菌のモデル試料として、実験室における大気に含まれる菌を用いる。即ちこの実験室大気を試料として本実施例に基づく菌の計測手順に従って菌の検査を行う。比較のために培養法の結果と比較検討する。培養法はミリポア社のエアーサンプラー（M Air T型）と寒天培地（Tryptic Soy Agar）を用い、添付の取扱説明書通りの手順で大気１立方メートルを捕集し、得られた捕集担体を３５℃で２日間培養しコロニーを計数する。本実施形態及び当該培養法による結果は、それぞれ９５０ＣＦＵ／ｍ３、１１００ＣＦＵ／ｍ３であり、両者による結果は極めてよく一致する。なお、計測にかかる時間は捕集を含めてそれぞれ約１時間、５０時間である。従って、本発明による本実施例は培養法同等の高精度な検査結果を約１／５０の極めて短い時間で提供することができる、という効果がある。
【００７５】
以上の通り本実施形態によれば、捕集担体からの菌回収効率が高いため、信頼性の高い菌数計測が行える。さらに本実施形態を適用することにより、高精度な生菌測定を極めて短時間に実施できる効果がある。
【００７６】
＜第２の実施形態＞
（１）捕集デバイスについて
図８は、本発明第２の実施形態による捕集デバイス１’の概略構成を示す断面図である。捕集デバイス１’は、捕集担体２と、容器壁３’と、フィルター４を備えている。捕集デバイス１’は、中空状の容器壁３’の底部に第１の実施形態で用いたものと同じフィルター４を接着し、第１の実施形態と同様の方法により調製した捕集担体２の原料を冷却したフィルター４の上に流し込むことにより形成されている。
【００７７】
（２）自動測定装置について
図９は、本発明の第２の実施形態による自動測定装置２１の概略構成を示す図である。自動測定装置２１は、捕集デバイスホルダ２２と、目皿ホルダ２３と、ＡＴＰ消去剤用分注器２４と、ＡＴＰ抽出試薬用分注器２５と、ＡＴＰ回収用ピペッタ２６と、発光試薬用分注器２７と、試験管ホルダ２８と、制御装置２９と、温度調節機構３０と、滅菌清浄機構３１と、電磁弁４１と、廃液トラップ４２と、吸引ポンプ４３と、光子計数器４４と、を備えている。捕集デバイスホルダ２２、目皿ホルダ２３、及び試験管ホルダ２８はそれぞれ捕集デバイス１’、目皿、試験管（図示省略）が設置可能となっており、またそれぞれ搬送機構を備え、各ホルダを所定の位置に搬送することができるようになっている。
【００７８】
また、ＡＴＰ消去剤用分注器２４、ＡＴＰ抽出試薬用分注器２５、ＡＴＰ回収用ピペッタ２６、及び発光試薬用分注器２７は、それぞれ制御装置２９からの制御信号により図示しない各種試薬の分注やピペッティング動作を自動的に行う機構を備えている。
【００７９】
目皿ホルダ２３、電磁弁４１、廃液トラップ４２、及び吸引ポンプ４３は、図示しない目皿とともにろ過のための吸引機構を構成し、さらに捕集デバイス１’の底部のフィルター４と組合せてろ過機構を構成する。
【００８０】
電磁弁４１と吸引ポンプは、制御装置２９により制御される。温度調節機構３０は、制御装置２９の制御の下、装置内部の各所、特に捕集デバイスホルダ２２の温度を３７℃以上４０℃以下に制御する。光子計数器４４は、試験管ホルダ２８に設置した図示しない試験管で生じた発光の強度を光子数として計測し、光子数を制御装置２９へ出力する。
【００８１】
（３）測定動作について
続いて、本発明による捕集デバイス１’と捕集装置１１（図２）、自動測定装置２１を用いた場合の動作について説明する。本実施形態の動作は基本的に第１の実施形態と同様であるが、図３における菌回収工程（ｂ）からＡＴＰ計測工程（ｇ）までを自動測定装置２１を用いて自動的に行う点が主に相違する。なお、本実施形態の主体は捕集デバイス上に捕集した菌の回収方法にあるので、電気系、制御系、遮光を含む光学系、機構系の詳細な説明は省略する。
【００８２】
本実施形態では、自動測定装置２１の使用開始に先立ち、滅菌清浄機構３１を用いて自動測定装置２１の内部を滅菌し、またオゾンガス（紫外線滅菌法を用いた場合）や微粒子を除去する。また自動測定装置２１の使用中も滅菌清浄機構３１を用いてオゾンガスや微粒子を除去しつつ使用する。
【００８３】
本実施形態の菌捕集工程（ａ）では、第１の実施形態と同様に、室温（２５℃）において捕集デバイス１’の捕集担体２（ゲル状）の上に大気試料中の微粒子を、捕集装置１１を用いて捕集する。
【００８４】
菌回収工程（ｂ）に先立ち、温度調節機構３０を動作させ、捕集デバイスホルダ２２の温度を３７℃以上４０℃以下に維持する。菌回収工程（ｂ）において、捕集デバイス１’を自動測定装置２１の捕集デバイスホルダ２２に無菌的に設置する。以降の菌回収工程（ｂ）からのＡＴＰ計測工程（ｇ）までを制御装置２９の制御のもと自動的かつ無菌的に行う。温度調節機構３０の作用により捕集デバイスホルダ２２から捕集デバイス１’さらに捕集担体２へと熱が伝導し、捕集担体２の温度も速やかに３７℃に上昇する。第２の実施形態で採用した捕集担体２も２５℃より高く３７℃より低い上限臨界溶液温度を有する温度感受性樹脂材料であるため、２５℃から３７℃に温度を上昇することによりゲル状からゾル状へと相転移する。この工程の結果、菌縣濁液状の試料１ｍＬが捕集デバイス１’の中、換言すると容器壁３’とフィルター４とにより形成される空間内に回収される。
【００８５】
ＡＴＰ消去工程（ｃ）においては、捕集デバイス１’を設置した捕集デバイスホルダ２２をＡＴＰ消去剤用分注器２４の下方の位置に搬送し、ＡＴＰ消去剤を上記菌縣濁液に３０μＬ添加混合する（以下分注器による試薬添加動作は同様に行うが搬送などの詳細動作は省略して分注とのみ記す）。捕集デバイス１’を設置した捕集デバイスホルダ２２を目皿ホルダ２３の上方の位置に搬送し、また図示しない滅菌済みの目皿を設置した目皿ホルダ２３を上方の位置に搬送し、捕集デバイス１’の下面のフィルター４と目皿とを嵌合させてろ過機構を形成する。この状態で３０分間静置することにより、生菌以外のＡＴＰが消去される。この工程の結果、生菌以外のＡＴＰが消去された反応液１．０３ｍＬが捕集デバイス１’の中に得られる。
【００８６】
ろ過工程（ｄ）においては、吸引機構を動作してフィルター下面を減圧することによりフィルター４の目皿で、電磁弁４１を経由して反応液を廃液トラップ４２まで吸引ろ過する。ろ過完了後吸引機構を停止してフィルター下面を大気圧に戻す。この工程の結果、反応液中の生菌を捕捉したフィルター４を収納した捕集デバイス１’が得られる。
【００８７】
ＡＴＰ抽出工程（ｅ）に先立ち、目皿ホルダ２３を下方の位置に搬送し、捕集デバイス１’の下面のフィルター４を目皿から切り離してろ過機構の構成を解除する。
【００８８】
ＡＴＰ抽出工程（ｅ）においては、ＡＴＰ抽出試薬用分注器２５を用いてＡＴＰ抽出試薬を上記のフィルター４上面に１００μＬ添加し、２０秒間室温で混合する。フィルター４下面は大気圧であるためろ過は行われず、またフィルター下面は目皿と接触していないため、液は表面張力によりフィルター４の上に留まる。この工程の結果、生菌に含まれていたＡＴＰを溶解した試料溶液１００μＬがフィルター上に得られる。
【００８９】
ＡＴＰ回収工程（ｆ）においては、ＡＴＰ回収用ピペッタ２６を用いて上記試料溶液を３０μＬ吸引する。この工程の結果、生菌に含まれていたＡＴＰを溶解した試料溶液１００μＬのうち、３０μＬが回収液としてピペット内に得られる。回収液の利用効率は０．３である。
【００９０】
ＡＴＰ計測工程（ｇ）に先立ち、試験管ホルダ２８に設置した試験管に発光試薬用分注器２７を用いてＡＴＰ発光試薬０．２ｍＬを注入し、ベースライン発光量を測定する。次に２００ａｍｏｌのＡＴＰ標準試料を用いて、同様に標準試料発光量を測定する。以下第１の実施形態と同様の手順により標準試料の実効発光量と感度を求める。
【００９１】
ＡＴＰ計測工程（ｇ）においては、上記ＡＴＰ発光試薬を含む試験管に、ＡＴＰ回収用ピペッタ２６を用いて前記回収液３０μＬを追加注入し、同様にサンプル発光量を測定する。以下、第１の実施形態と同様の手順により、サンプルの実効発光量、回収液中のＡＴＰ量、試料中の生菌に含まれるＡＴＰ量、試料中の平均生菌数、単位体積の気体試料に含まれる平均生菌数を求める。この工程の結果、試料溶液中のＡＴＰ含量が計測され、単位体積当たりの空中浮遊菌数として検査結果が得られる。
【００９２】
本実施形態と第１の実施形態の最大の相違点は、菌回収工程（ｂ）からＡＴＰ計測工程（ｇ）までの自動化の有無にある。よって、第２の実施形態によれば、第１の実施形態と同様の効果に加えて、自動化を行うことにより、高感度化、簡便化、省力化、人為ミスの防止、再現性の向上、などの特有の効果を期待することができる。
【００９３】
＜第３の実施形態＞
本発明の第３の実施形態は、第１及び第２の実施形態と基本的に同様であるが、捕集デバイス１における捕集担体２の温度感受性樹脂材料として合成高分子を用いた点が異なる。
【００９４】
本実施形態で使用した温度感受性樹脂材料は、室温付近においてゲル‐ゾル相転移を行う合成高分子であり、下記の２種類の材料について比較検討を行う。
（Ａ）メビオール社製メビオールジェルＭＢ−１０、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）約２０℃。
（Ｂ）Ｎ−アクリロイルグリシンアミド（ＮＡＧＡｍ）とＮ−メタクロイル−Ｎ’−ビオチニルプロピレンジアミン（ＭＢＰＤＡ）の１０：１の共重合ポリマー（以下ＮＡＧＡｍ／ＭＢＰＤＡと略す）、上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）約２２℃。
【００９５】
なお、ＮＡＧＡｍ／ＭＢＰＤＡは非特許文献３に記載の方法に従って合成したものを使用する。
【００９６】
上記２種の合成高分子を４重量％含む捕集担体２を調製し、１２０℃２０分間のオートクレーブ滅菌ならびにＡＴＰ分解を行った後、特性評価を行った結果を図１０に示す。温度特性は１晩以上図１０の（１）の条件を維持した後、条件（２）、（３）の順番で温度を変化してゲル／ゾルの状態変化を観察する。つまり、１５℃から３７℃に条件を変えて変化した合成高分子が、再度１５℃の条件にしたときに最初の１５℃のときの状態に戻るかどうか検討している。図１０に示されるように、ＭＢ−１０は（２）、（３）の条件下でそれぞれゲル、ゾル状でありこの過程についてはＬＣＳＴの定義通り（転移温度以下でゾル、転移温度以上でゲル）の相転移を示す。
【００９７】
しかし、図１０の（１）の条件下で軟らかいゲル状であり、ヒステリシスまたは時間依存的なＬＣＳＴからの逸脱がある課題が確認される。
【００９８】
一方、ＮＡＧＡｍ／ＭＢＰＤＡは図１０の（１）と（３）、（２）の条件下でそれぞれゲル、ゾル状でありＵＣＳＴの定義通り（転移温度以下でゲル、転移温度以上でゾル）の相転移を示す。
【００９９】
従って、温度特性の観点からＮＡＧＡｍ／ＭＢＰＤＡがＭＢ−１０より優れていると判断できる。同様の結果はＮＡＧＡｍ／ＭＢＰＤＡの濃度が重量比１％以上１０％以下である場合に観察される。
【０１００】
次に、ＮＡＧＡｍ／ＭＢＰＤＡについてろ過特性を評価する。ろ過特性は捕集担体２を３７℃に加温してゾル状態とし、孔径０．４５μｍのシリンジフィルターによる加圧ろ過、並びに孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターによる減圧ろ過を行う。その結果、ＮＡＧＡｍ／ＭＢＰＤＡについて加圧ろ過は可能であったものの、そのまま（４重量％のゾル）では減圧ろ過を行ってもフィルターを通過しない。
【０１０１】
そこで、ゾルを純水で希釈して減圧ろ過の可能性を検討した結果、１／２希釈（２重量％）では通過せず、１／３希釈（１．３重量％）を行うことによって減圧ろ過が可能であることがわかる。なお、希釈倍率を上げて試料液の粘性を下げることにより、吸引ろ過の代わりに、フィルター背面に設けた吸水パッドなどによる受動的なろ過も採用可能である。
【０１０２】
以上の検討の結果、捕集デバイス１の捕集担体２として合成高分子に基づく温度感受性樹脂が本発明に適用可能であり、特にＮＡＧＡｍ／ＭＢＰＤＡを１ないし１０重量％、特に好ましくは約４重量％含有する捕集担体２は１５℃以上３７℃以下の上限臨界溶液温度を示し、好適に使用できることがわかる。
【０１０３】
第３の実施形態と第１の実施形態との主要な相違点は、菌捕集工程（ａ）において温度を１５℃に設定する機構を用い、捕集担体２の温度を１５℃としてゲル状にした上で菌を捕集する点、並びにろ過工程（ｄ）においてゾル化した捕集担体２を予め希釈してからろ過を行うか、あるいは希釈せずに加圧ろ過を行うことである。
【０１０４】
本実施形態によれば、温度感受性樹脂材料として用いた合成高分子は安定性が高く、均質な特性を再現性良く得ることができ、量産による低コスト化が可能となる。また、オートクレーブにより材料由来の生菌の滅菌が可能となり、オートクレーブにより材料由来ＡＴＰを（ＡＴＰ消去剤を用いずに）除去可能となる。
【０１０５】
＜実施形態のまとめ＞
捕集デバイスは、捕集担体をゲル状として空中浮遊菌を集菌することにより、従来技術における捕集担体と同等の捕集性能を発揮できる効果がある。また、捕集担体をゾル状に相転移させ、そのままあるいは必要に応じて希釈することにより、捕集担体を実質的に菌縣濁液同様に取り扱うことができる。このため、捕集担体からの菌の取出し工程を省略することができる。よって、取出し工程における菌の取りこぼしや菌の損傷などによる損失が無くなる。
【０１０６】
また、菌の捕集と回収における温度条件が穏和（１５℃〜３７℃）であるため、菌の熱による損傷や死滅などの問題が生じない。そのため、極めて高い回収効率が達成される、という効果も期待できる。
【０１０７】
さらに、煩雑な取出し工程を温度変化だけ、あるいは温度変化と希釈の組み合わせという単純な工程に置きかえることが可能となり、自動化、システム構成の簡略化、迅速化、再現性向上、汚染リスク低減などの効果がある。
【０１０８】
また、菌懸濁液は液量が少ないため、菌の濃度が高く、菌の利用効率も高い。そして、菌懸濁液をろ過等して菌懸濁液中の菌をフィルター上に捕捉することにより、液量を実質的にゼロとし、菌の濃度や利用効率が飛躍的に高い効果がある。
【０１０９】
水溶性や粒径の小さい夾雑物の影響を排除でき、信頼性が高い効果がある。従って、菌の計測を高感度、高精度かつ自動的に行える利点がある。また、空中浮遊菌の検査における測定精度と感度が高く、簡便迅速に結果が得られる、という効果が期待できる。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明による捕集デバイスは、生菌の捕集効率が高く、菌の損傷や死滅を回避でき、また生菌の回収効率が高い捕集担体を提供できるため、高感度、高信頼性、簡便、迅速な生菌数計測に適用可能である。また本デバイスを用いることにより捕集担体からの生菌の回収とろ過濃縮を簡便かつ効率的に行うことができるため、生菌数の自動計測にも好適に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】本発明の第１の実施形態による捕集デバイス１の概略構成を示す断面図である。
【図２】第１の実施形態による捕集装置１１の概略構成図である。
【図３】第１の実施形態による菌の計測手順を示すフローチャートである。
【図４】第１の実施形態による、モデル捕集担体のＡＴＰ消去剤組成による発光計測値を示す図である。
【図５】第１の実施形態による、モデル捕集担体のゼラチン組成による温度並びにろ過特性である。
【図６】第１の実施形態による、モデル捕集担体のグリセロール組成による温度並びにろ過特性である。
【図７】第1の実施形態と従来例による回収特性の比較を示す図である。
【図８】第２の実施形態による捕集デバイス１’の概略構成を示す断面図である。
【図９】第２の実施形態による自動測定装置２１の概略構成を示す図である。
【図１０】第３の実施形態による、合成高分子による捕集担体の特性比較である。
【符号の説明】
【０１１２】
１，１’ 捕集デバイス
２ 捕集担体
３ 容器
３’ 容器壁
４ フィルター
１１ 捕集装置
１１ａ 上部部材
１１ｂ 下部部材
１２ 吸気ノズル
１３ ホルダ
１４ 温度調節機構
１５ 空隙
１６ ポンプ
１７ 排気ダクト
１８ 排気フィルター
２１ 自動測定装置
２２ 捕集デバイスホルダ
２３ 目皿ホルダ
２４ ＡＴＰ消去剤用分注器
２５ ＡＴＰ抽出試薬用分注器
２６ ＡＴＰ回収用ピペッタ
２７ 発光試薬用分注器
２８ 試験管ホルダ
２９ 制御装置
３０ 温度調節機構
３１ 滅菌清浄機構
４１ 電磁弁
４２ 廃液トラップ
４３ 吸引ポンプ
４４ 光子計数器
（ａ） 菌捕集工程
（ｂ） 菌回収工程
（ｃ） ＡＴＰ消去工程
（ｄ） ろ過工程
（ｅ） ＡＴＰ抽出工程
（ｆ） ＡＴＰ回収工程
（ｇ） ＡＴＰ計測工程
【技術分野】
【０００１】
本発明は、捕集デバイス、及びそれを用いる分析システムに関し、例えば、大気中に浮遊する微生物を捕集するための捕集デバイス、及びそれを用いる分析システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
空中に浮遊する細菌などの微生物数の検査法として、集塵機を用いてゲル状の寒天培地表面に捕集した微生物を培養し、生じたコロニー数を計数する方法が実用に供されている。
【０００３】
しかし、培養法は数日間に及ぶ長い時間がかかり、また自動化が困難で手間がかかるという課題がある。また微生物検査は医薬品工場やセルプロセッシングセンター、食品工場など、高清浄度が要求される環境の微生物的清浄度（無菌性）の検証のために用いられるケースが多い。上記環境におけるオンサイトの微生物検査に培養法を適用する場合、検査工程の産物である大量に増幅した微生物が万一サイトに混入すると環境の清浄度確保の目的を破壊しかねないため、オンサイトの検査が行いにくく、検査室の設置、試料の搬送、産物の厳重な管理が必要である、という課題があった。
【０００４】
この改善策として培養無しに、即ち迅速簡便かつ生物的汚染のリスクなしに微生物数を検査する方法が各種考案されている。第１の方法として試料中の微生物を２種類の蛍光試薬を用いて染色し、蛍光顕微画像解析などにより生菌と死菌を判別、計数する方法（蛍光法）がある。第２の方法として試料中の微生物からＡＴＰを抽出し、ＡＴＰの生物発光反応を、ルミノメータを用いて計測することによりＡＴＰ量を定量し、生菌数に換算する方法（ＡＴＰ法）がある。
【０００５】
ところが、第１の方法は原理的に１細菌の計測が可能であるが、蛍光性の夾雑物質が試料中に混在すると誤差の原因となる。また生菌と死菌の判別は必ずしも容易ではない。例えば死菌を選択的に染色するとされるプロピジウムアイオダイド（ＰＩ）の死菌に対する平均蛍光強度は生菌に対するそれよりむしろ低い場合があり（非特許文献１、図１Ｃ、縦軸がＰＩの蛍光強度）、単純な解釈を行うと正反対の結論を導く恐れが高い。
【０００６】
一方、第２の方法はＡＴＰに選択的に応答する生物発光反応に基づくため、蛍光性の夾雑物質の影響は原理的に受けない。また、生菌の菌体外に含まれるＡＴＰを事前に消去するＡＴＰ消去剤、生菌からＡＴＰを抽出するＡＴＰ抽出試薬、生菌中のＡＴＰを生物発光反応により発光させて計測するための発光試薬を備えた試薬キット（製品名「ルシフェールＨＳセット」）もキッコーマン社から発売されている（非特許文献２）。このキットをルミノメータと組み合わせて用いれば死菌などの影響を排除し、生菌のみに由来するＡＴＰ量を選択的に測定可能であるとされている。
【０００７】
ただし、第２の方法の検査対象試料は水溶液中に分散された微生物であり、空中浮遊菌の検査に適用することは想定されていない。空中浮遊菌の培養法による検査のためにはインパクタ方式の集塵機構を備え、ゲル状の寒天（糖類）培地からなる捕集担体を収納した培地カセットを内蔵可能な製品（例えばミリポア社製のM Air T型エアーサンプラー）として入手出来るのに対し、ＡＴＰ法に適用可能なエアーサンプラーは市販されていない。空中浮遊菌の検査にＡＴＰ法を適用する場合、培養法向けのインパクタ方式のエアーサンプラーを用いて捕集担体に菌を捕集し、捕集担体から菌を取り出して菌懸濁液とし、ルシフェールＨＳセットなどの生物発光法に基づく試薬キットを用いてＡＴＰ法により計測を行う方法が考えられる。この従来のエアーサンプラーとＡＴＰ法との単純な組合せを本明細書では以下従来法と記すこととする。
【０００８】
【非特許文献１】製品技術情報 「ライブ／デッド バックライトＴＭ バクテリアル バイアビリティー アンド カウンティング キット（Ｌ３４８５６）」モレキュラープローブス社 ２００４年２月２日改訂版
【非特許文献２】村上成治ほか「ホタルルシフェラーゼの応用開発」日本農芸化学会誌、７８巻、７号、ｐ．６３０−６３５（２００４年）
【非特許文献３】古澤邦夫監修「新しい分散・乳化の科学と応用技術の新展開」ＩＳＢＮ４−９２４７２８−５０−０、テクノシステム社、ｐ．３７０（２００６年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかるに、従来法におけるエアーサンプラーで用いられるゲル状の寒天培地からなる捕集担体は捕集した菌をその捕集担体上で培養することを目的としている。このため、従来法では捕集担体から菌を取り出す工程（以降取出し工程）が考慮されていない。取出し工程には次のような課題がある。即ち、捕集担体はゲル状であるため菌をよく捕捉できるものの、逆に取出すことは困難であり菌の回収効率が低い。寒天ゲルを加熱すれば実質的に菌懸濁液同様に取扱うことが可能なゾル状とすることができる。
【００１０】
しかし、寒天ゲルのゾル化には８０℃以上の高温を必要とするため、生菌のほとんどが損傷あるいは死滅してしまい、生菌の回収効率が低く、生菌と死菌を判別できない課題がある。よって、生菌の回収効率を高めるためには寒天ゲルをゾル化せず、室温付近の温度の溶液をゲル上に添加して溶液に移行した菌を菌懸濁液として回収する操作を繰り返すなどの穏和な条件が必要である。ただし、これには熟練作業者による時間がかかる繊細な手作業を必要とし、自動化が困難であり、再現性が低く、また作業者由来の汚染による偽陽性のリスクがある。
【００１１】
一方、回収に用いる溶液を多くして作業を簡略化する方法も考えられるが、菌懸濁液の液量が多いと単位液量当たりの菌数（濃度）が低く、結果的に計測工程における菌の利用効率が低い。例えばＡＴＰ法の代表的な製品であるキッコーマン社のルシフェールＨＳセットにおけるプロトコル（従来プロトコル）によると試料液量は０．１ｍＬである。
【００１２】
従って、計測工程における縣濁液の利用効率は菌懸濁液の体積が１ｍＬなら１０％、１０ｍＬなら１％と、菌懸濁液の量が多いほど縣濁液の利用効率が低い。よって、この方法には簡便性と利用効率が相反するという課題がある。
【００１３】
さらに、従来プロトコルによれば試料液のうち実際に発光計測に用いられるのは１／１０であるため、総合的な利用効率は菌の回収効率のさらに１０％にすぎないという課題もある。また、クリーンルーム等の清浄度の高い環境における数個ないし数十個程度の極微量の空中浮遊菌の検査を目的とする場合は、回収効率や利用効率が低いと菌の計測漏れを起こす、すなわち偽陰性の課題がある。計測漏れを回避するために空気試料のサンプリング体積を増加するなどの対策が必要になり、サンプリング時間が長く、結果が迅速に得られない、という課題がある。
【００１４】
このように、以上の手法をそのまま自動化するとシステム構成が複雑であり、裕度確保のために回収に用いる溶液をさらに過剰に用いる必要があり、利用効率がさらに低い、という課題がある。また、本法を実試料に適用した場合、集塵した試料中には微生物以外の夾雑物が多量に混入するが、従来法は夾雑物がＡＴＰ消去反応やＡＴＰ抽出反応、ＡＴＰ発光反応に影響を及ぼし、測定精度が低い、という課題があった。
【００１５】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、空中浮遊菌の検査にＡＴＰ法を適用する場合における問題点、即ち、捕集担体からの菌の取出し工程が考慮されていないこと、回収効率や利用効率が低いこと、極微量の菌数測定における信頼性が低いこと、自動化が困難で複雑な構成を要すること、夾雑物混入の影響を受けて測定精度が低いこと、等の問題点のうち少なくとも１つを解決する、微生物の捕集デバイス及びそれを備えた分析システムを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記課題を解決するために、本発明による微生物の捕集デバイスが保持する高分子は、 温度が１５度以上３７度以下の範囲でゲル‐ゾル間の相転移を行うものである。また、高分子の他に、殺菌作用を有しないアルコール類を含むようにしてもよい。このアルコール類としては、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール等が挙げられる。また、高分子は、ゼラチン又はＮＡＧＡｍ／ＭＢＰＤＡのいずれかであることが好ましい。
【００１７】
なお、アルコールがグリセロールの場合、このグリセロールは、捕集デバイスが保持する部材（物質）に対する重量比３０％以上６０％以下であることが好ましい。また、高分子がゼラチンである場合、このゼラチンは、捕集デバイスが保持する部材（物質）に対する重量比５％以上１０％以下であることが好ましい。さらに、高分子がＮＡＧＡｍ／ＭＢＰＤＡである場合、このＮＡＧＡｍ／ＭＢＰＤＡは上記部材（物質）に対する重量比１％以上１０％以下であることが好ましい。
【００１８】
さらに、捕集デバイスは、その底面がフィルターで構成されるようにしてもよい。
【００１９】
また、本発明による自動測定装置は、温度依存的にゾル‐ゲル間の相転移を行う温度感受性樹脂、好ましくは４０度以下の温度においてゾル‐ゲル間の相転移を行う温度感受性樹脂からなる捕集担体を備えたデバイスと、温度制御機構、また好ましくはろ過機構、さらに必要に応じて希釈機構を備えている。本発明では、第１に、温度制御機構を用いて温度感受性樹脂からなる捕集担体をゲル状として空中浮遊菌を集菌し、第２にこの捕集担体を温度制御機構を用いてゾル状に相転移させ、或いはさらに希釈溶液により希釈することにより、菌懸濁液とする。
【００２０】
本発明における温度感受性樹脂材料の相転移温度は４０℃以下であるため、穏和な温度条件において菌の捕集と回収を行う。菌懸濁液に対して従来のＡＴＰ法を適用して菌のＡＴＰ計測を行うか、あるいは好ましくは菌懸濁液をろ過することにより菌懸濁液中の菌をフィルター上に捕捉し、改良したＡＴＰ法の計測プロトコルによりＡＴＰ計測を行い、空中浮遊菌の検査を行う。
【００２１】
さらなる本発明の特徴は、以下本発明を実施するための最良の形態および添付図面によって明らかになるものである。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の捕集デバイスによれば、捕集担体からの菌の取出しが容易になる、回収効率や利用効率が高くなる、極微量の菌数測定における信頼性を高められる、自動化が簡単な構成で容易に実現できる、夾雑物混入の影響を受けても測定精度を高くすることができる、等の効果のうち少なくとも１つの効果を期待することができるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は、温度感受性樹脂からなる捕集担体を用い、温度制御により捕集時は捕集担体をゲル状に、回収時は捕集担体をゾル状にし、また４０℃以下の穏和な温度条件でゲル及びゾルの相転移を行うものである。そして、このようにすることにより、菌の熱による損傷や死滅などの問題を回避し、捕集担体からの菌の回収効率を高め、菌懸濁液の体積を小さくして利用効率を高め、空中浮遊菌の高感度な検査を簡便迅速に実現する。
【００２４】
なお、様々なサイトで問題となる菌は人間がそのサイトに持ち込むケースが多い。そのため、人間の体温に近い温度で生存する菌を捕集して分析する必要があり、４０℃以下という温度設定としているのである。
【００２５】
以下、添付図面を参照して本発明の実施形態について説明する。ただし、本実施形態は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明の技術的範囲を限定するものではないことに注意すべきである。また、各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている。
【００２６】
＜第１の実施形態＞
（１）捕集デバイスについて
まず、本発明の第１の実施形態による捕集デバイス１の構成概要について説明する。 図１は、本発明による第１の実施形態による捕集デバイス１の概略構成を示す断面図である。捕集デバイス１は、容器３とそれに収容された捕集担体２とを備えている。
【００２７】
本実施形態では、捕集担体２の材料として下記組成の樹脂を用いている。グリセロール５０重量％、温度感受性樹脂材料（本実施形態ではゼラチン（たんぱく質加水分解物）、詳細後述）７．５重量％、ＡＴＰ消去剤０．０３％とし、残りは生理食塩水によりバランスする。また、容器３として直径４０ｍｍ、深さ５ｍｍの円柱状の凹みを有するポリスチレン製のシャーレを用いる。
【００２８】
次に、本発明による捕集担体２の形成法について説明する。上述の捕集担体２の材料を必要に応じて加温しつつ混合することにより均一な原料ゾルとする。以降の操作は無菌環境下で行う。原料ゾルを加温しつつ孔径０．２２ミクロンのシリンジフィルターによりろ過滅菌する。得られた滅菌ゾル１ｍＬを分取して滅菌済の容器３の底面に均一に注入し、４℃で１週間以上冷却することにより均一なゲルとする。従って捕集担体２の形状も概ね円柱状であり、その直径は容器３の凹みのそれと同じ４０ｍｍ、厚みは約０．８ｍｍとなる。捕集担体２は室温（２５℃）ではゲル状であるが、昇温すると相転移温度においてゲルからゾルに相転移し、３７℃ではゾル状である。従って捕集担体２は上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ：当該温度未満ではゲル状）を有する温度感受性樹脂として機能し、その上限臨界溶液温度は２５℃より高く３７℃より低い。この捕集担体２の温度依存的なゾル、ゲル相転移は可逆的である。なお、捕集担体として下限臨界溶液温度（当該温度より高い温度ではゲル状）を有する担体（後述）を用いても良く、この場合は菌の捕集時と回収時において（反転した温度条件を採用することにより）ゾル、ゲルの条件を一致させて用いる。
【００２９】
（２）捕集装置について
図２を用いて本発明による捕集装置１１の構成概要について説明する。図２は、本発明の第１の実施形態による捕集装置１１の概略構成図である。捕集装置１１は、上部部材１１ａと、下部部材１１ｂと、吸気ノズル１２と、ホルダ１３と、温度調節機構１４と、ポンプ１６と、排気ダクト１７と、排気フィルター１８と、を備え、装置内部には空隙（空間）１５が形成されている。この捕集装置１１において、上部部材１１ａは下部部材１１ｂから着脱可能である。上部部材１１ａを下部部材１１ｂに装着して捕集装置１１を形成すると両者の接合部は気密となり、この捕集装置１１の外部開口部は、上部部材１１ａにおける吸気ノズル１２、ならびに下部部材１１ｂにおける排気フィルター１８である。また、下部部材１１ｂ内部にはホルダ１３、ポンプ１６、排気フィルター１８がそれぞれ固定される。なお、図示を省略したがポンプ１６や温度調節機構１４のための制御系や電源などを内蔵し、操作ボタンや取っ手などを外面に有する。また、ホルダ１３は温度調節機構１４を収納し、捕集デバイス１を着脱可能に収納し、捕集デバイス１を収納した際は温度調節機構１４の上面が捕集デバイス１の下面と接触する。捕集装置１１内部には吸気ノズル１２出口から捕集デバイス１を経由してポンプ１６の入り口までを連絡する空隙１５が設けられ、またポンプ１６の出口から排気フィルター１８までは排気ダクト１７が気密に連絡する。本実施形態のごときいわゆるインパクタ型の捕集装置は試料空気の流量が高いため、所定量の試料を短時間で吸引して空中浮遊菌を捕集できるという利点を有する。なお図２において吸気ノズル１２として1穴型の構成を例示したが、本発明で利用可能な吸気ノズル１２はこの構成に限定されず、より小さな穴を多く有する多穴型など各種の吸気ノズルを採用可能である。
【００３０】
（３）菌の計測手順について
（ｉ）まず、図３を用いて本発明による菌の計測手順の概要について説明する。この菌の計測手順は、菌捕集工程（ａ）と、菌回収工程（ｂ）と、ＡＴＰ消去工程（ｃ）と、ろ過工程（ｄ）と、ＡＴＰ抽出工程（ｅ）と、ＡＴＰ回収工程（ｆ）と、ＡＴＰ計測工程（ｇ）とを備えている。
【００３１】
菌捕集工程（ａ）において、捕集装置１１を用いて、空中浮遊菌を捕集デバイス１の捕集担体２（ここではゲル状）に捕集する。
【００３２】
菌回収工程（ｂ）において、捕集担体２をゲル状からゾル状に相転移し、菌懸濁液（試料）とする。
【００３３】
ＡＴＰ消去工程（ｃ）において、試料中の菌以外のＡＴＰ、即ち菌外ＡＴＰや死菌内のＡＴＰを消去する。
【００３４】
ろ過工程（ｄ）において、試料をろ過することにより、水溶性成分や菌より粒径の小さい固形成分などの夾雑物をろ別し、試料中の生菌をフィルター上に捕捉する。
【００３５】
ＡＴＰ抽出工程（ｅ）において、菌の細胞壁を溶解し、生菌の細胞質に含まれるＡＴＰを試料溶液中に抽出する。
【００３６】
ＡＴＰ回収工程（ｆ）において、菌から抽出したＡＴＰを含む試料溶液を得る。
【００３７】
ＡＴＰ計測工程（ｇ）において試料溶液中のＡＴＰをもとに生物発光反応を行い、ルミノメータを用いて発光量を計測することにより試料中のＡＴＰ含量を求め、単位体積当たりの空中浮遊菌数として検査結果を提供する。
【００３８】
（ii）次に、本発明による各構成要素の動作を計測手順に沿って詳細に説明する。菌捕集工程（ａ）に先立ち、前述通りの方法により捕集デバイス１を調製する。捕集装置１１の上部部材１１ａをオートクレーブにより滅菌し、下部部材１１ｂや前述の通り調製した捕集デバイス１とともに、計測対象である空気を捕集する場所（以下捕集場所）近傍に設置したクリーンベンチに搬入する。以下クリーンベンチ内の操作は無菌的に行う。下部部材１１ｂにおけるホルダ１３や空隙１５、外面などを、消毒用エタノールなどを用いて除菌した後、捕集デバイス１をホルダ１３に設置し、滅菌した上部部材１１ａを装着し、捕集装置１１を形成する。捕集装置１１の吸気ノズル１２を菌による汚染から保護するキャップ（図示しない）を装着し、捕集装置１１をクリーンベンチから搬出し、捕集場所に設置して準備を完了する。この際捕集場所ならびにクリーンベンチは空調により室温が約２５℃に制御されており、各部材の温度も約２５℃である。また温度調節機構１４を動作させ、その温度を２５℃とする。捕集デバイス１の捕集担体２は２５℃より高く３７℃より低い上限臨界溶液温度を有する温度感受性樹脂材料であるため、この温度においてゲル状である。
【００３９】
菌捕集工程（ａ）においては、捕集装置１１を動作させ、捕集場所における空中浮遊菌を吸入し、捕集デバイス１に捕集する。具体的にはポンプ１６を回転することにより捕集装置１１の外の空気を吸気ノズル１２及び空隙（空間）１５を経由してポンプ１６に吸入し、さらに排気ダクト１７と排気フィルター１８を経由して捕集装置１１の外部に排出する。この際空気中の浮遊菌は吸気ノズル１２を通して捕集デバイス１に概ね垂直に当たる気流に沿って運ばれ、慣性によりゲル状の捕集担体２に衝突して捕集される。空気や、菌より質量の小さな微粒子は捕集担体２と衝突後、捕集担体２の表面と平行な方向に向きを変え、空隙１５、ポンプ１６、排気ダクト１７、排気フィルター１８へと運ばれる。菌より質量の小さな微粒子は排気フィルター１８に捕捉され、微粒子を含まない清浄な空気が排気フィルター１８を介して捕集装置１１の外部に排出される。本実施形態においてポンプ１６は２００Ｌ／分の一定流量を示し、捕集時間を１５分とすることにより３立方メートルの一定量の空気を吸引する。この工程の結果、３立方メートルの空気中の浮遊菌がゲル状の捕集担体２に捕集される。
【００４０】
菌回収工程（ｂ）においては、温度調節機構１４を動作させ、その温度を２５℃から３７℃まで上昇させる。温度調節機構１４の上面から捕集デバイス１の下面、即ち容器３、さらには捕集担体２へと熱が伝導し、捕集担体２の温度も速やかに３７℃に上昇する。本実施形態で採用した捕集担体２は２５℃から３７℃に温度を上昇することによりゲル状からゾル状へと相転移を行う、即ち２５℃より高く３７℃より低い上限臨界溶液温度を有する温度感受性樹脂として機能する。捕集担体２に捕集された生菌などの微粒子は、このゾルに分散され、菌縣濁液状となる。また、捕集担体２に捕集された生菌以外の成分のうち、水溶性成分はこのゾルに溶解する。この工程の結果、菌縣濁液状試料１ｍＬが容器３の中に回収される。
【００４１】
ＡＴＰ消去工程（ｃ）において、ルシフェールＨＳセットに含まれるＡＴＰ消去剤を上記菌縣濁液状試料に３０μＬ添加混合し、３０分間室温で静置する。この工程により、試料中の生菌以外のＡＴＰ、即ち菌外ＡＴＰや死菌内のＡＴＰ、ならびに捕集担体２に残存していたごく微量のＡＴＰが消去される。この工程の結果、生菌以外のＡＴＰが消去された反応液１．０３ｍＬが容器３の中に得られる。
【００４２】
ろ過工程（ｄ）に先立ち、メンブレンフィルター（ミリポア社ＨＡＷＰ０２５００型、直径２５ｍｍ、膜材質はＭＦ−ミリポア、公称孔径０．４５ミクロン）を目皿上に収納したろ過デバイス（図示しない）をオートクレーブ滅菌したものを予め準備する。
【００４３】
ろ過工程（ｄ）においては、上記反応液をフィルター上面に滴下し、下面（目皿面）を減圧して吸引することによりろ過する。ろ過完了後フィルター下面を大気圧に戻す。この工程の結果、反応液中の水溶性成分や粒径が０．４５ミクロンより小さい菌以外の固形成分などの夾雑物がろ別され、（０．４５ミクロンより大きい）生菌を捕捉したフィルターを収納したろ過デバイスが得られる。
【００４４】
ＡＴＰ抽出工程（ｅ）においては、ルシフェールＨＳセットに含まれるＡＴＰ抽出試薬を上記ろ過デバイスのフィルター上面に１００μＬ添加し、２０秒間室温で混合する。フィルターは例えばシリコンゴムで形成されたＯリング上に載置され、またフィルター下面は大気圧であるため、ろ過は行われず、添加された試薬液は表面張力によりフィルター上に留まる。この工程の結果、生菌の細胞壁が溶解され、菌の細胞質に含まれていたＡＴＰが抽出され、このＡＴＰを溶解した試料溶液１００μＬがフィルター上に得られる。
【００４５】
ＡＴＰ回収工程（ｆ）においては、上記試料溶液をピペットにより３０μＬ吸引する。この工程の結果、生菌に含まれていたＡＴＰを溶解した試料溶液１００μＬのうち、３０μＬが回収液としてピペット内に得られる。捕集した試料中に存在した生菌中のＡＴＰの３０％が回収液中に回収されるため、回収液の利用効率はこの場合０．３である。
【００４６】
ＡＴＰ計測工程（ｇ）に先立ち、ＡＴＰ発光試薬０．２ｍＬをルミノメータ用のポリプロピレン製の試験管に注入し、ルミノメータ（Berthold Detection Systems社ＦＢ１２型）に設置して発光量を測定する（ベースライン）。ベースラインの発光量は概ね４０〜６０ｃｐｓ（count per second）である。次に２００ａｍｏｌの標準試料（濃度２０ｐｍｏｌ／ＬのＡＴＰ標準液１０μＬ）を、上記ＡＴＰ発光試薬０．２ｍＬを含む試験管に追加注入し、混合後、発光量を測定する（標準試料）。標準試料の発光量は概ね２０００ｃｐｓとなる。標準試料の実効発光量は、標準試料の発光量からベースラインの発光量を減算して求める。標準試料の実効発光量をそのＡＴＰ量で除することにより、感度、即ち単位ＡＴＰ量当たりの実効発光量を求める。感度は概ね１０〜２０ｃｐｓ／ａｍｏｌである。
【００４７】
ＡＴＰ計測工程（ｇ）においては、上記回収液３０μＬを、上記ＡＴＰ発光液を含む試験管に追加注入し、混合後、同様に発光量を測定する（サンプル）。サンプルの実効発光量は、サンプルの発光量からベースラインの発光量を減算して求める。サンプルの実効発光量を感度で除算することにより、回収液中のＡＴＰ量を求める。この値を回収液の利用効率０．３で除算することにより、試料中の生菌に含まれるＡＴＰ量を求める。この試料中のＡＴＰ量を一生菌当たりのＡＴＰ含有量の平均値（約２ａｍｏｌ）で除算することにより試料中の平均生菌数を求める。試料中の平均生菌数を捕集した気体試料の体積である３立方メートルで除算することにより、単位体積の気体試料に含まれる平均生菌数を求める。この工程の結果、試料溶液中のＡＴＰ含量が計測され、単位体積当たりの空中浮遊菌数として検査結果が得られる。
【００４８】
（４）捕集担体の予備検討について
以上のように、第１の実施形態の特徴的な構成要素として捕集担体２が挙げられる。そこで、捕集担体２の組成について予備検討をすると次のようになる。
【００４９】
（ｉ）第１に、本実施形態では吸入する空気の体積を３立方メートル、ポンプ１６の流量を２００Ｌ／分、吸気ノズル１２の直径を０．４８ｃｍとする。この動作条件において吸気ノズル１２における空気の線速度は平均１８１ｍ／ｓに及び、また捕集する空気の体積が３立方メートルと大きいため、従来の寒天ゲルなどから成る捕集担体を用いると水分が蒸発してゲルの体積が激減し、ゲルの表面が乾燥して固体状に変化し、菌を効率良く捕集できない課題がある。そこで本実施形態においてはグリセロールを５０％含有する捕集担体２を用いることにより、捕集担体２の変形や乾燥を防止し、空中浮遊菌の捕集担体２への捕集において高い捕集効率を実現する。捕集担体２の変形や乾燥を防止するための材料としては本実施形態で採用したグリセロールの他、エチレングリコール、プロピレングリコールなどの各種アルコール類（乾燥防止）が使用できる。なお、アルコールの種類は、殺菌作用がないアルコールである必要がある。捕集担体２に捉えられた菌を死滅させないようにするためである。よって、例えばエタノールは不適である。
【００５０】
（ii）捕集担体２に関する第２の予備検討として、グリセロールとゼラチンと生理食塩水とから調製した捕集担体について検討する。この場合例えろ過を行っても、菌を含まないブランク試料の計測結果が１０〜２０ａｍｏｌ程度の異常高値を示す課題が確認される。捕集担体の材料のうち特にゼラチンは測定すべき極微量（数ａｍｏｌ）のＡＴＰと比較して多量のＡＴＰを含有するため、それが残留して異常高値の原因となると考えられる。
【００５１】
そこで、本実施形態の実施に先立ち、下記モデル実験を行い、捕集担体に含まれるＡＴＰを事前に除去してブランク計測値を低減する方法を検討する。つまり、ゼラチン由来のＡＴＰを除去するための前処理である。
【００５２】
具体的にはゼラチン５重量％とグリセロール５０重量％を生理食塩水に溶解した材料をベースに、ルシフェールＨＳセットに含まれるＡＴＰ消去剤を各種割合で添加したモデル捕集担体を調製する。このモデル捕集担体を３７℃加温によりゾル状とし、それを直接あるいは純水で希釈した液１０μＬを分取し、ＡＴＰ発光試薬０．２ｍＬに添加して発光量を計測し、その結果の一例を図４に示す。ＡＴＰ消去剤を添加しない場合は７１７８ｃｐｓと極めて高いブランク信号を生じる。
【００５３】
一方、ＡＴＰ消去剤を容量比でそれぞれ０．０３、０．１％添加したモデル捕集担体のブランク信号はそれぞれ１０３、５７ｃｐｓと、添加しない系と比較して激減する。ＡＴＰを含まない純水を試料としたベースライン計測値（この実験では５６ｃｐｓ）との差分である実効発光量はＡＴＰ消去剤０、０．０３、０．１％の系に対しそれぞれ７１２２（＝７１７８−５６）、４７（＝１０３−５６）、１（＝５７−５６）ｃｐｓであり、感度約１１．２ｃｐｓ／ａｍｏｌを用いて求めたそれぞれのＡＴＰ含量は約６３６、４．２、０．１ａｍｏｌである。
【００５４】
従ってＡＴＰ消去剤を０．０３％以上捕集担体へ添加することにより、ゼラチン等に由来するＡＴＰを効果的に分解除去した捕集担体を調製することが可能であり、そのＡＴＰによる計測結果への影響を１／１００以下に抑制でき、ろ過と組み合わせることにより前記の異常高値を回避し実質的に影響が無い水準まで抑制できることがわかる。
【００５５】
以上の検討結果に基づいて、ゼラチンを含有する捕集担体２としてＡＴＰ消去剤を含有する組成が好適であることを見出し、またその必要組成はルシフェールＨＳセットに付属するＡＴＰ消去剤を用いる場合０．０３％以上であることがわかる。この必要組成の下限値である０．０３％を本実施形態のＡＴＰ消去剤組成として採用することにより、主としてゼラチンに由来するＡＴＰ汚染を捕集担体２から排除する。
【００５６】
（iii）捕集担体２に関する第３の予備検討として、捕集担体のＡＴＰ消去剤含有比率を０．０３％に固定した上で、温度感受性樹脂材料として用いたゼラチン組成について検討する。
【００５７】
図５は、ＡＴＰ消去剤含有比率０．０３％、グリセロール濃度５０重量％、生理食塩水バランスにより調製したモデル捕集担体において、ゼラチン濃度を５、７．５、１０重量％と変化させた場合におけるモデル捕集担体の温度特性ならびにろ過特性を示している。図５に示されるように、いずれの組成の場合もモデル捕集担体は２５℃から３７℃にステップ昇温した場合において５分以内にゾル状となり、回収工程に好適に適用可能である。ゼラチン濃度が７．５重量％以上の場合は２５℃におけるゲル強度が高く、捕集担体として使用可能である。しかしゼラチン濃度が５重量％の場合は２５℃におけるゲル強度がやや低い。
【００５８】
従って、ゼラチン濃度を７．５重量％以上とすることにより、２５℃でゲル状、３７℃でゾル状、即ち２５℃より高く３７℃より低い上限臨界溶液温度を有する温度感受性樹脂材料が得られる。
【００５９】
一方、前述のろ過工程の条件下におけるろ過特性についてはゼラチン濃度が７．５重量％以下の場合は長くても４０秒あれば１ｍＬのゾルのろ過が可能であり、前述のろ過工程に良好に適用可能である。
【００６０】
しかし、ゼラチン濃度が１０重量％の場合は粘性が高くろ過が困難で、一部ろ過されない成分がフィルター上に残留する場合がある。
【００６１】
以上により、２５℃より高く３７℃より低い上限臨界溶液温度を有し、かつ良好なろ過特性を示す捕集担体材料のゼラチン濃度は５ないし１０重量％が好適であり、またその最適濃度条件は７．５重量％であることがわかる。この最適濃度条件である７．５重量％を本実施形態のゼラチン濃度条件として採用する。
【００６２】
（iv）捕集担体２に関する第４の予備検討として、捕集担体のＡＴＰ消去剤含有比率を０．０３％に固定した上で、グリセロール組成について検討する。
【００６３】
図６は、ＡＴＰ消去剤含有比率０．０３％、ゼラチン濃度を５、７．５、１０重量％、生理食塩水バランスにより調製したモデル捕集担体において、グリセロール濃度を３０、４０、５０、６０重量％、と変化させた場合におけるモデル捕集担体の温度特性ならびにろ過特性を示している。
【００６４】
図６に示されるように、いずれの組成の場合もモデル捕集担体は３７℃においてゾル状となり、回収工程に好適に適用可能である。グリセロール濃度が５０重量％以上の場合は２５℃におけるゲル強度が高く、捕集担体として使用可能である。
【００６５】
しかし、グリセロール濃度が４０重量％以下の場合は２５℃におけるゲル強度がやや低い。従って、グリセロール濃度を５０重量％以上とすることにより、２５℃より高く３７℃より低い上限臨界溶液温度を有する温度感受性樹脂材料が得られる。
【００６６】
一方、ろ過特性についてはグリセロール濃度が５０重量％以下の場合は長くても４０秒あれば１ｍＬのゾルのろ過が可能であり、前述のろ過工程に良好に適用可能である。しかしグリセロール濃度が６０重量％の場合は粘性が高くろ過が困難で、一部ろ過されない成分がフィルター上に残留する場合がある。
【００６７】
以上により２５℃より高く３７℃より低い上限臨界溶液温度を有し、かつ良好なろ過特性を示す捕集担体材料のグリセロール濃度は３０ないし６０重量％が好適であり、またその最適濃度条件は５０重量％であることが見出される。この最適濃度条件である５０重量％を本実施形態のグリセロール濃度条件として採用することができる。
【００６８】
（５）回収特性の評価について
本実施形態の回収特性を以下の方法により評価する。空中浮遊菌のモデル試料として、標準菌株（日水製薬社のEasy QA Ball大腸菌１０，０００ｃｆｕ）を純水で希釈した懸濁液を調製する。菌捕集工程（ａ）における気体試料からの捕集装置１１による捕集デバイス１への浮遊細菌の捕集工程を、一定量のモデル試料を捕集担体２へ点着することにより代用する。以降の工程は本実施例通りに評価実験を行う。比較のために従来法、即ち菌捕集工程（ａ）における捕集担体２として寒天ゲルを用い、菌回収工程（ｂ）における菌の回収方法として生理食塩水１ｍＬを２回に分けて寒天ゲル表面に分注ならびに表面から再吸引して回収する方法、また菌捕集工程（ａ）は本実施例同様にモデル試料点着で代用する方法と比較検討する。従来法の捕集担体２としては市販の寒天培地（Tryptic Soy Agar）を使用する。
【００６９】
図７は、５００ＣＦＵのモデル試料を用いた場合の両方法による２連の計測結果の一例を示している。従来法による結果はＡＴＰ量、平均生菌数、回収率が極めて低く、２連の内片方は菌が全く回収されない結果となる。
【００７０】
一方、本実施形態による結果は、ＡＴＰ量として平均約５４０ａｍｏｌ、平均生菌数として約２７０ＣＦＵ、回収率として平均約５５％（＝（４４＋６５）／２）である。この結果は、従来法と比較して、平均約４（＝５５／１３）倍所定値に近い（即ち、回収率１００％により近くなっている）。
【００７１】
以上の通り、本実施形態は、従来法と比較して高精度な測定結果が得られる。本発明と従来例の最大の相違点は捕集デバイス１ならびにそれから菌を回収する工程にある。本発明の方が従来法より高精度だったのは、菌回収工程（ｂ）において捕集デバイス１から菌を効率よく回収できたためと考えられる。実際、参考実験として従来法に使用した捕集担体２（菌回収を行った残り）を３５℃で２日間培養したところ、何れの捕集担体も多数のコロニーを呈した。
【００７２】
従って、従来法が所定値から隔絶した結果を示したのは菌回収工程（ｂ）における回収効率が低いことが原因と考えられる。
【００７３】
一方、本実施形態の方法、即ち４０℃以下の温度変化という穏和かつ非接触的な手段によりコンタミネーションなしに捕集担体そのものをゲル‐ゾル相転移させ、菌懸濁液として取り扱うことを可能にする新規な方法を採用することにより、捕集担体に回収した菌を効率よく次の工程に提供できる。
【００７４】
（６）総合特性の評価について
本実施形態の総合特性を以下の方法により評価する。空中浮遊菌のモデル試料として、実験室における大気に含まれる菌を用いる。即ちこの実験室大気を試料として本実施例に基づく菌の計測手順に従って菌の検査を行う。比較のために培養法の結果と比較検討する。培養法はミリポア社のエアーサンプラー（M Air T型）と寒天培地（Tryptic Soy Agar）を用い、添付の取扱説明書通りの手順で大気１立方メートルを捕集し、得られた捕集担体を３５℃で２日間培養しコロニーを計数する。本実施形態及び当該培養法による結果は、それぞれ９５０ＣＦＵ／ｍ３、１１００ＣＦＵ／ｍ３であり、両者による結果は極めてよく一致する。なお、計測にかかる時間は捕集を含めてそれぞれ約１時間、５０時間である。従って、本発明による本実施例は培養法同等の高精度な検査結果を約１／５０の極めて短い時間で提供することができる、という効果がある。
【００７５】
以上の通り本実施形態によれば、捕集担体からの菌回収効率が高いため、信頼性の高い菌数計測が行える。さらに本実施形態を適用することにより、高精度な生菌測定を極めて短時間に実施できる効果がある。
【００７６】
＜第２の実施形態＞
（１）捕集デバイスについて
図８は、本発明第２の実施形態による捕集デバイス１’の概略構成を示す断面図である。捕集デバイス１’は、捕集担体２と、容器壁３’と、フィルター４を備えている。捕集デバイス１’は、中空状の容器壁３’の底部に第１の実施形態で用いたものと同じフィルター４を接着し、第１の実施形態と同様の方法により調製した捕集担体２の原料を冷却したフィルター４の上に流し込むことにより形成されている。
【００７７】
（２）自動測定装置について
図９は、本発明の第２の実施形態による自動測定装置２１の概略構成を示す図である。自動測定装置２１は、捕集デバイスホルダ２２と、目皿ホルダ２３と、ＡＴＰ消去剤用分注器２４と、ＡＴＰ抽出試薬用分注器２５と、ＡＴＰ回収用ピペッタ２６と、発光試薬用分注器２７と、試験管ホルダ２８と、制御装置２９と、温度調節機構３０と、滅菌清浄機構３１と、電磁弁４１と、廃液トラップ４２と、吸引ポンプ４３と、光子計数器４４と、を備えている。捕集デバイスホルダ２２、目皿ホルダ２３、及び試験管ホルダ２８はそれぞれ捕集デバイス１’、目皿、試験管（図示省略）が設置可能となっており、またそれぞれ搬送機構を備え、各ホルダを所定の位置に搬送することができるようになっている。
【００７８】
また、ＡＴＰ消去剤用分注器２４、ＡＴＰ抽出試薬用分注器２５、ＡＴＰ回収用ピペッタ２６、及び発光試薬用分注器２７は、それぞれ制御装置２９からの制御信号により図示しない各種試薬の分注やピペッティング動作を自動的に行う機構を備えている。
【００７９】
目皿ホルダ２３、電磁弁４１、廃液トラップ４２、及び吸引ポンプ４３は、図示しない目皿とともにろ過のための吸引機構を構成し、さらに捕集デバイス１’の底部のフィルター４と組合せてろ過機構を構成する。
【００８０】
電磁弁４１と吸引ポンプは、制御装置２９により制御される。温度調節機構３０は、制御装置２９の制御の下、装置内部の各所、特に捕集デバイスホルダ２２の温度を３７℃以上４０℃以下に制御する。光子計数器４４は、試験管ホルダ２８に設置した図示しない試験管で生じた発光の強度を光子数として計測し、光子数を制御装置２９へ出力する。
【００８１】
（３）測定動作について
続いて、本発明による捕集デバイス１’と捕集装置１１（図２）、自動測定装置２１を用いた場合の動作について説明する。本実施形態の動作は基本的に第１の実施形態と同様であるが、図３における菌回収工程（ｂ）からＡＴＰ計測工程（ｇ）までを自動測定装置２１を用いて自動的に行う点が主に相違する。なお、本実施形態の主体は捕集デバイス上に捕集した菌の回収方法にあるので、電気系、制御系、遮光を含む光学系、機構系の詳細な説明は省略する。
【００８２】
本実施形態では、自動測定装置２１の使用開始に先立ち、滅菌清浄機構３１を用いて自動測定装置２１の内部を滅菌し、またオゾンガス（紫外線滅菌法を用いた場合）や微粒子を除去する。また自動測定装置２１の使用中も滅菌清浄機構３１を用いてオゾンガスや微粒子を除去しつつ使用する。
【００８３】
本実施形態の菌捕集工程（ａ）では、第１の実施形態と同様に、室温（２５℃）において捕集デバイス１’の捕集担体２（ゲル状）の上に大気試料中の微粒子を、捕集装置１１を用いて捕集する。
【００８４】
菌回収工程（ｂ）に先立ち、温度調節機構３０を動作させ、捕集デバイスホルダ２２の温度を３７℃以上４０℃以下に維持する。菌回収工程（ｂ）において、捕集デバイス１’を自動測定装置２１の捕集デバイスホルダ２２に無菌的に設置する。以降の菌回収工程（ｂ）からのＡＴＰ計測工程（ｇ）までを制御装置２９の制御のもと自動的かつ無菌的に行う。温度調節機構３０の作用により捕集デバイスホルダ２２から捕集デバイス１’さらに捕集担体２へと熱が伝導し、捕集担体２の温度も速やかに３７℃に上昇する。第２の実施形態で採用した捕集担体２も２５℃より高く３７℃より低い上限臨界溶液温度を有する温度感受性樹脂材料であるため、２５℃から３７℃に温度を上昇することによりゲル状からゾル状へと相転移する。この工程の結果、菌縣濁液状の試料１ｍＬが捕集デバイス１’の中、換言すると容器壁３’とフィルター４とにより形成される空間内に回収される。
【００８５】
ＡＴＰ消去工程（ｃ）においては、捕集デバイス１’を設置した捕集デバイスホルダ２２をＡＴＰ消去剤用分注器２４の下方の位置に搬送し、ＡＴＰ消去剤を上記菌縣濁液に３０μＬ添加混合する（以下分注器による試薬添加動作は同様に行うが搬送などの詳細動作は省略して分注とのみ記す）。捕集デバイス１’を設置した捕集デバイスホルダ２２を目皿ホルダ２３の上方の位置に搬送し、また図示しない滅菌済みの目皿を設置した目皿ホルダ２３を上方の位置に搬送し、捕集デバイス１’の下面のフィルター４と目皿とを嵌合させてろ過機構を形成する。この状態で３０分間静置することにより、生菌以外のＡＴＰが消去される。この工程の結果、生菌以外のＡＴＰが消去された反応液１．０３ｍＬが捕集デバイス１’の中に得られる。
【００８６】
ろ過工程（ｄ）においては、吸引機構を動作してフィルター下面を減圧することによりフィルター４の目皿で、電磁弁４１を経由して反応液を廃液トラップ４２まで吸引ろ過する。ろ過完了後吸引機構を停止してフィルター下面を大気圧に戻す。この工程の結果、反応液中の生菌を捕捉したフィルター４を収納した捕集デバイス１’が得られる。
【００８７】
ＡＴＰ抽出工程（ｅ）に先立ち、目皿ホルダ２３を下方の位置に搬送し、捕集デバイス１’の下面のフィルター４を目皿から切り離してろ過機構の構成を解除する。
【００８８】
ＡＴＰ抽出工程（ｅ）においては、ＡＴＰ抽出試薬用分注器２５を用いてＡＴＰ抽出試薬を上記のフィルター４上面に１００μＬ添加し、２０秒間室温で混合する。フィルター４下面は大気圧であるためろ過は行われず、またフィルター下面は目皿と接触していないため、液は表面張力によりフィルター４の上に留まる。この工程の結果、生菌に含まれていたＡＴＰを溶解した試料溶液１００μＬがフィルター上に得られる。
【００８９】
ＡＴＰ回収工程（ｆ）においては、ＡＴＰ回収用ピペッタ２６を用いて上記試料溶液を３０μＬ吸引する。この工程の結果、生菌に含まれていたＡＴＰを溶解した試料溶液１００μＬのうち、３０μＬが回収液としてピペット内に得られる。回収液の利用効率は０．３である。
【００９０】
ＡＴＰ計測工程（ｇ）に先立ち、試験管ホルダ２８に設置した試験管に発光試薬用分注器２７を用いてＡＴＰ発光試薬０．２ｍＬを注入し、ベースライン発光量を測定する。次に２００ａｍｏｌのＡＴＰ標準試料を用いて、同様に標準試料発光量を測定する。以下第１の実施形態と同様の手順により標準試料の実効発光量と感度を求める。
【００９１】
ＡＴＰ計測工程（ｇ）においては、上記ＡＴＰ発光試薬を含む試験管に、ＡＴＰ回収用ピペッタ２６を用いて前記回収液３０μＬを追加注入し、同様にサンプル発光量を測定する。以下、第１の実施形態と同様の手順により、サンプルの実効発光量、回収液中のＡＴＰ量、試料中の生菌に含まれるＡＴＰ量、試料中の平均生菌数、単位体積の気体試料に含まれる平均生菌数を求める。この工程の結果、試料溶液中のＡＴＰ含量が計測され、単位体積当たりの空中浮遊菌数として検査結果が得られる。
【００９２】
本実施形態と第１の実施形態の最大の相違点は、菌回収工程（ｂ）からＡＴＰ計測工程（ｇ）までの自動化の有無にある。よって、第２の実施形態によれば、第１の実施形態と同様の効果に加えて、自動化を行うことにより、高感度化、簡便化、省力化、人為ミスの防止、再現性の向上、などの特有の効果を期待することができる。
【００９３】
＜第３の実施形態＞
本発明の第３の実施形態は、第１及び第２の実施形態と基本的に同様であるが、捕集デバイス１における捕集担体２の温度感受性樹脂材料として合成高分子を用いた点が異なる。
【００９４】
本実施形態で使用した温度感受性樹脂材料は、室温付近においてゲル‐ゾル相転移を行う合成高分子であり、下記の２種類の材料について比較検討を行う。
（Ａ）メビオール社製メビオールジェルＭＢ−１０、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）約２０℃。
（Ｂ）Ｎ−アクリロイルグリシンアミド（ＮＡＧＡｍ）とＮ−メタクロイル−Ｎ’−ビオチニルプロピレンジアミン（ＭＢＰＤＡ）の１０：１の共重合ポリマー（以下ＮＡＧＡｍ／ＭＢＰＤＡと略す）、上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）約２２℃。
【００９５】
なお、ＮＡＧＡｍ／ＭＢＰＤＡは非特許文献３に記載の方法に従って合成したものを使用する。
【００９６】
上記２種の合成高分子を４重量％含む捕集担体２を調製し、１２０℃２０分間のオートクレーブ滅菌ならびにＡＴＰ分解を行った後、特性評価を行った結果を図１０に示す。温度特性は１晩以上図１０の（１）の条件を維持した後、条件（２）、（３）の順番で温度を変化してゲル／ゾルの状態変化を観察する。つまり、１５℃から３７℃に条件を変えて変化した合成高分子が、再度１５℃の条件にしたときに最初の１５℃のときの状態に戻るかどうか検討している。図１０に示されるように、ＭＢ−１０は（２）、（３）の条件下でそれぞれゲル、ゾル状でありこの過程についてはＬＣＳＴの定義通り（転移温度以下でゾル、転移温度以上でゲル）の相転移を示す。
【００９７】
しかし、図１０の（１）の条件下で軟らかいゲル状であり、ヒステリシスまたは時間依存的なＬＣＳＴからの逸脱がある課題が確認される。
【００９８】
一方、ＮＡＧＡｍ／ＭＢＰＤＡは図１０の（１）と（３）、（２）の条件下でそれぞれゲル、ゾル状でありＵＣＳＴの定義通り（転移温度以下でゲル、転移温度以上でゾル）の相転移を示す。
【００９９】
従って、温度特性の観点からＮＡＧＡｍ／ＭＢＰＤＡがＭＢ−１０より優れていると判断できる。同様の結果はＮＡＧＡｍ／ＭＢＰＤＡの濃度が重量比１％以上１０％以下である場合に観察される。
【０１００】
次に、ＮＡＧＡｍ／ＭＢＰＤＡについてろ過特性を評価する。ろ過特性は捕集担体２を３７℃に加温してゾル状態とし、孔径０．４５μｍのシリンジフィルターによる加圧ろ過、並びに孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターによる減圧ろ過を行う。その結果、ＮＡＧＡｍ／ＭＢＰＤＡについて加圧ろ過は可能であったものの、そのまま（４重量％のゾル）では減圧ろ過を行ってもフィルターを通過しない。
【０１０１】
そこで、ゾルを純水で希釈して減圧ろ過の可能性を検討した結果、１／２希釈（２重量％）では通過せず、１／３希釈（１．３重量％）を行うことによって減圧ろ過が可能であることがわかる。なお、希釈倍率を上げて試料液の粘性を下げることにより、吸引ろ過の代わりに、フィルター背面に設けた吸水パッドなどによる受動的なろ過も採用可能である。
【０１０２】
以上の検討の結果、捕集デバイス１の捕集担体２として合成高分子に基づく温度感受性樹脂が本発明に適用可能であり、特にＮＡＧＡｍ／ＭＢＰＤＡを１ないし１０重量％、特に好ましくは約４重量％含有する捕集担体２は１５℃以上３７℃以下の上限臨界溶液温度を示し、好適に使用できることがわかる。
【０１０３】
第３の実施形態と第１の実施形態との主要な相違点は、菌捕集工程（ａ）において温度を１５℃に設定する機構を用い、捕集担体２の温度を１５℃としてゲル状にした上で菌を捕集する点、並びにろ過工程（ｄ）においてゾル化した捕集担体２を予め希釈してからろ過を行うか、あるいは希釈せずに加圧ろ過を行うことである。
【０１０４】
本実施形態によれば、温度感受性樹脂材料として用いた合成高分子は安定性が高く、均質な特性を再現性良く得ることができ、量産による低コスト化が可能となる。また、オートクレーブにより材料由来の生菌の滅菌が可能となり、オートクレーブにより材料由来ＡＴＰを（ＡＴＰ消去剤を用いずに）除去可能となる。
【０１０５】
＜実施形態のまとめ＞
捕集デバイスは、捕集担体をゲル状として空中浮遊菌を集菌することにより、従来技術における捕集担体と同等の捕集性能を発揮できる効果がある。また、捕集担体をゾル状に相転移させ、そのままあるいは必要に応じて希釈することにより、捕集担体を実質的に菌縣濁液同様に取り扱うことができる。このため、捕集担体からの菌の取出し工程を省略することができる。よって、取出し工程における菌の取りこぼしや菌の損傷などによる損失が無くなる。
【０１０６】
また、菌の捕集と回収における温度条件が穏和（１５℃〜３７℃）であるため、菌の熱による損傷や死滅などの問題が生じない。そのため、極めて高い回収効率が達成される、という効果も期待できる。
【０１０７】
さらに、煩雑な取出し工程を温度変化だけ、あるいは温度変化と希釈の組み合わせという単純な工程に置きかえることが可能となり、自動化、システム構成の簡略化、迅速化、再現性向上、汚染リスク低減などの効果がある。
【０１０８】
また、菌懸濁液は液量が少ないため、菌の濃度が高く、菌の利用効率も高い。そして、菌懸濁液をろ過等して菌懸濁液中の菌をフィルター上に捕捉することにより、液量を実質的にゼロとし、菌の濃度や利用効率が飛躍的に高い効果がある。
【０１０９】
水溶性や粒径の小さい夾雑物の影響を排除でき、信頼性が高い効果がある。従って、菌の計測を高感度、高精度かつ自動的に行える利点がある。また、空中浮遊菌の検査における測定精度と感度が高く、簡便迅速に結果が得られる、という効果が期待できる。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明による捕集デバイスは、生菌の捕集効率が高く、菌の損傷や死滅を回避でき、また生菌の回収効率が高い捕集担体を提供できるため、高感度、高信頼性、簡便、迅速な生菌数計測に適用可能である。また本デバイスを用いることにより捕集担体からの生菌の回収とろ過濃縮を簡便かつ効率的に行うことができるため、生菌数の自動計測にも好適に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】本発明の第１の実施形態による捕集デバイス１の概略構成を示す断面図である。
【図２】第１の実施形態による捕集装置１１の概略構成図である。
【図３】第１の実施形態による菌の計測手順を示すフローチャートである。
【図４】第１の実施形態による、モデル捕集担体のＡＴＰ消去剤組成による発光計測値を示す図である。
【図５】第１の実施形態による、モデル捕集担体のゼラチン組成による温度並びにろ過特性である。
【図６】第１の実施形態による、モデル捕集担体のグリセロール組成による温度並びにろ過特性である。
【図７】第1の実施形態と従来例による回収特性の比較を示す図である。
【図８】第２の実施形態による捕集デバイス１’の概略構成を示す断面図である。
【図９】第２の実施形態による自動測定装置２１の概略構成を示す図である。
【図１０】第３の実施形態による、合成高分子による捕集担体の特性比較である。
【符号の説明】
【０１１２】
１，１’ 捕集デバイス
２ 捕集担体
３ 容器
３’ 容器壁
４ フィルター
１１ 捕集装置
１１ａ 上部部材
１１ｂ 下部部材
１２ 吸気ノズル
１３ ホルダ
１４ 温度調節機構
１５ 空隙
１６ ポンプ
１７ 排気ダクト
１８ 排気フィルター
２１ 自動測定装置
２２ 捕集デバイスホルダ
２３ 目皿ホルダ
２４ ＡＴＰ消去剤用分注器
２５ ＡＴＰ抽出試薬用分注器
２６ ＡＴＰ回収用ピペッタ
２７ 発光試薬用分注器
２８ 試験管ホルダ
２９ 制御装置
３０ 温度調節機構
３１ 滅菌清浄機構
４１ 電磁弁
４２ 廃液トラップ
４３ 吸引ポンプ
４４ 光子計数器
（ａ） 菌捕集工程
（ｂ） 菌回収工程
（ｃ） ＡＴＰ消去工程
（ｄ） ろ過工程
（ｅ） ＡＴＰ抽出工程
（ｆ） ＡＴＰ回収工程
（ｇ） ＡＴＰ計測工程
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大気中の微生物を捕集するための捕集デバイスであって、
温度が１５度以上３７度以下の範囲でゲル‐ゾル間の相転移をする高分子を含む第１部材と、
前記第１部材を収容するための容器と、
を備えることを特徴とする捕集デバイス。
【請求項２】
前記第１部材は、殺菌作用を有しないアルコール類を含むことを特徴とする請求項１に記載の捕集デバイス。
【請求項３】
前記アルコール類は、グリセロール、エチレングリコール及びプロピレングリコールのいずれかであることを特徴とする請求項２に記載の捕集デバイス。
【請求項４】
前記高分子は、ゼラチン若しくはＮＡＧＡｍ／ＭＢＰＤＡのいずれかであることを特徴とする請求項１に記載の捕集デバイス。
【請求項５】
前記アルコールはグリセロールであり、前記グリセロールは、前記第１の部材に対する重量比３０％以上６０％以下で前記第１部材に含まれることを特徴とする請求項２に記載の捕集デバイス。
【請求項６】
前記高分子はゼラチンであり、前記ゼラチンは、前記第１部材に対する重量比５％以上１０％以下で前記第１部材に含まれることを特徴とする請求項１に記載の捕集デバイス。
【請求項７】
前記高分子はＮＡＧＡｍ／ＭＢＰＤＡであり、前記ＮＡＧＡｍ／ＭＢＰＤＡは前記第１部材に対する重量比１％以上１０％以下で前記第１部材に含まれることを特徴とする請求項１に記載の捕集デバイス。
【請求項８】
前記容器は、その底面にフィルターを有することを特徴とする請求項１に記載の捕集デバイス。
【請求項９】
温度が１５度以上３７度以下の範囲でゲル‐ゾル間の相転移をする高分子を含む第１部材を保持する保持部材と、
前記第１部材の温度を制御する温度制御部と、
前記第１部材に対して空気を流す空気流制御部と、
を備えることを特徴とする分析システム。
【請求項１０】
前記温度制御部は、前記空気流制御部が前記第１部材に空気を流す前と後において、前記第１部材の加熱と冷却を切り替えることを特徴とする請求項９に記載の分析システム。
【請求項１１】
前記第１の部材では、ゾルをろ過するためのフィルター上にゲル状の前記高分子が載置され、
さらに、前記フィルターと組み合わされてろ過機構を構成する目皿を保持する目皿保持部を備え、
前記ろ過機構は、前記温度制御部によってゾル化した前記高分子をろ過することを特徴とする請求項９に記載の分析システム。
【請求項１】
大気中の微生物を捕集するための捕集デバイスであって、
温度が１５度以上３７度以下の範囲でゲル‐ゾル間の相転移をする高分子を含む第１部材と、
前記第１部材を収容するための容器と、
を備えることを特徴とする捕集デバイス。
【請求項２】
前記第１部材は、殺菌作用を有しないアルコール類を含むことを特徴とする請求項１に記載の捕集デバイス。
【請求項３】
前記アルコール類は、グリセロール、エチレングリコール及びプロピレングリコールのいずれかであることを特徴とする請求項２に記載の捕集デバイス。
【請求項４】
前記高分子は、ゼラチン若しくはＮＡＧＡｍ／ＭＢＰＤＡのいずれかであることを特徴とする請求項１に記載の捕集デバイス。
【請求項５】
前記アルコールはグリセロールであり、前記グリセロールは、前記第１の部材に対する重量比３０％以上６０％以下で前記第１部材に含まれることを特徴とする請求項２に記載の捕集デバイス。
【請求項６】
前記高分子はゼラチンであり、前記ゼラチンは、前記第１部材に対する重量比５％以上１０％以下で前記第１部材に含まれることを特徴とする請求項１に記載の捕集デバイス。
【請求項７】
前記高分子はＮＡＧＡｍ／ＭＢＰＤＡであり、前記ＮＡＧＡｍ／ＭＢＰＤＡは前記第１部材に対する重量比１％以上１０％以下で前記第１部材に含まれることを特徴とする請求項１に記載の捕集デバイス。
【請求項８】
前記容器は、その底面にフィルターを有することを特徴とする請求項１に記載の捕集デバイス。
【請求項９】
温度が１５度以上３７度以下の範囲でゲル‐ゾル間の相転移をする高分子を含む第１部材を保持する保持部材と、
前記第１部材の温度を制御する温度制御部と、
前記第１部材に対して空気を流す空気流制御部と、
を備えることを特徴とする分析システム。
【請求項１０】
前記温度制御部は、前記空気流制御部が前記第１部材に空気を流す前と後において、前記第１部材の加熱と冷却を切り替えることを特徴とする請求項９に記載の分析システム。
【請求項１１】
前記第１の部材では、ゾルをろ過するためのフィルター上にゲル状の前記高分子が載置され、
さらに、前記フィルターと組み合わされてろ過機構を構成する目皿を保持する目皿保持部を備え、
前記ろ過機構は、前記温度制御部によってゾル化した前記高分子をろ過することを特徴とする請求項９に記載の分析システム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００９−１３９１１５（Ｐ２００９−１３９１１５Ａ）
【公開日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３１３０６６（Ｐ２００７−３１３０６６）
【出願日】平成１９年１２月４日（２００７．１２．４）
【出願人】（０００００５４５２）株式会社日立プラントテクノロジー (1,767)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月４日（２００７．１２．４）
【出願人】（０００００５４５２）株式会社日立プラントテクノロジー (1,767)
【Ｆターム（参考）】
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