新規がん遺伝子ＮＲＦ２
【課題】
ｍＴＯＲ関連抗癌剤奏効性予測又は予後予測の指標となるマーカーを提供すること、及び、新規抗癌剤を提供すること。
【解決手段】
本発明は、癌治療薬の奏効性評価の方法を提供するものであり、具体的には、ＮＲＦ２の異常を検出することによるｍＴＯＲ関連癌治療薬の奏効性の予測方法を提供するものである。また、本発明は、癌の予後予測方法を提供するものであり、具体的には、ＮＲＦ２の異常を検出することによる癌の予後の予測方法を提供するものである。更に、本発明はＮＲＦ２を標的とした新規抗癌剤を提供するものである。
ｍＴＯＲ関連抗癌剤奏効性予測又は予後予測の指標となるマーカーを提供すること、及び、新規抗癌剤を提供すること。
【解決手段】
本発明は、癌治療薬の奏効性評価の方法を提供するものであり、具体的には、ＮＲＦ２の異常を検出することによるｍＴＯＲ関連癌治療薬の奏効性の予測方法を提供するものである。また、本発明は、癌の予後予測方法を提供するものであり、具体的には、ＮＲＦ２の異常を検出することによる癌の予後の予測方法を提供するものである。更に、本発明はＮＲＦ２を標的とした新規抗癌剤を提供するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌治療薬の奏効性予測、癌の予後予測、及び癌治療の分野に関するものである。より具体的には、本発明は、ＮＲＦ２の異常を検出することによるｍＴＯＲ関連癌治療薬の奏効性予測方法、ＮＲＦ２の異常を検出することによる癌の予後の予測方法、及びＮＲＦ２遺伝子又はタンパク質を阻害することを特徴とする癌治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの発生や進展においては、喫煙、放射線、ウイルス感染などによる慢性炎症及び有害な化学物質への暴露のような環境因子が影響を与えていることが知られている。中でもそのような因子によって惹起される酸化ストレスは、ＤＮＡやタンパク質に異常を与えることから、がんの発生に深く関わっていることがこれまでの研究から明らかになっている。
【０００３】
生体にはそのような酸化ストレスに対する生理的な防御機構が備わっている。該生理的防御機構の分子機構を担う重要な分子の一つとして、Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ２−ｒｅｌａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２（ＮＲＦ２）という転写因子が知られている。ＮＲＦ２は非常に強い転写誘導能力を持つＤＮＡ結合分子であり、細胞が酸化ストレスに暴露されると活性化され、グルタチオン還元酵素などの酸化ストレスを解除するような多くの酵素群の発現を誘導し、細胞をストレスによる障害から守る。
【０００４】
例えば、ＮＲＦ２は、発癌物質、酸化剤やその他の毒性化合物に対し細胞を保護する遺伝子産物の転写を制御するＤＮＡ調整エレメントである、抗酸化反応エレメント（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ：ＡＲＥ）成分に促進シグナルを伝える重要な転写因子であることが知られている。癌阻害活性を有するＡＲＥを介する促進剤が核のＮＲＦ２レベルを上昇させることが報告されている（非特許文献１参照）。また、ＮＲＦ２のノックアウトマウスにおける、ベンゾ（α）ピランの経口投与モデルにおいては、ワイルドタイプと比較して癌の数が増加していることが示されている（非特許文献２参照）。また、同文献において、抗癌剤オルチプラズがＮＲＦ２の発現を増強すること、及び、ＮＲＦ２のノックアウトマウスにおいてはオルチプラズによる抗癌作用が発揮されないことから、ＮＲＦ２の発現増強が抗癌効果を示すことが示唆されている。
【０００５】
また、ＮＲＦ２は、Ｋｅｌｃｈ−ｌｉｋｅ ＥＣＨ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＫＥＡＰ１）タンパク質によるネガティブフィードバックを受けて、生体内において存在量が調節されていること、及び、ＫＥＡＰ１に対する阻害剤が抗癌剤として開発されていることが報告されている（非特許文献３参照）。このように、ＮＲＦ２又はＫＥＡＰ１を標的として、ＮＲＦ２の発現を増強させる薬剤が抗癌剤として利用されることが期待されている。
【０００６】
一方で、肺癌においてはＫＥＡＰ１遺伝子変異による活性低下により、ＮＲＦ２の恒常的な活性化が見られること、及び、活性化したＮＲＦ２により抗酸化作用を備えるタンパク質の恒常的発現が誘導されることが報告されている。ＮＲＦ２の発現亢進は、癌細胞のシスプラチンへの抵抗性の原因の一つではないかと報告されている（非特許文献４、及び、特許文献１参照）。アルキル化剤であるシスプラチン、メファラン（ｍｅｐｈａｌａｎ）、クロラムブシル及びＢＣＮＵ等の薬剤投与が、ＮＲＦ２等のＡＲＥに制御される遺伝子発現を増加させることが報告されている。ＡＲＥに制御される遺伝子発現産物の増加が癌細胞の抗癌剤への抵抗性に関与している可能性が示唆されている。また、ＮＲＦ２との結合活性を備えるオールトランスレチノイン酸（ａｌｌ ｔｒａｎｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ：ＡＴＲＡ）に化学療法剤の効果を強化する作用がある可能性が示唆されている（特許文献２参照）。
【０００７】
このように、アルキル化剤系抗癌剤の投与によりＮＲＦ２が活性化されることや、アルキル化剤系抗癌剤に対する抵抗性にＮＲＦ２が役割を果たしている可能性が示唆されている。アルキル化剤系抗癌剤は、癌細胞のＤＮＡの塩基同士を架橋することで増殖を停止させるものであるが、アルキル化剤の投与によるＮＲＦ２の活性化のメカニズムについては未だ解明されていない。アルキル化剤系抗癌剤の作用に対するＮＲＦ２による抵抗性獲得のメカニズムの一部は、ＮＲＦ２の細胞保護的な作用から予測されるものの、その全体像については十分解明されていない。また、アルキル化剤系抗癌剤以外の抗癌剤とＮＲＦ２との関係については未だ報告されていない。
【０００８】
上述の通り、癌細胞において見られるＮＲＦ２の活性化は、主にＫＥＡＰ１遺伝子の変異による活性低下に基づくものと考えられている。癌細胞におけるＮＲＦ２の変異と活性化との関係、及び、ＮＲＦ２の変異による活性化と癌の悪性化との関係は知られていなかった。特に、ＮＲＦ２は、酸化ストレス等による癌の発生においては抗癌作用を備えるものと考えられていることから、むしろ癌の悪性化を抑制すると考えられていた。また、化学療法剤との関係においては、ＮＲＦ２がアルキル化剤の投与に応答性があり、少なくともオールトランスレチノイン酸にアルキル化剤の効果を増強させる作用があることが示唆されている。しかし、当該オールトランスレチノイン酸の作用がＮＲＦ２抑制作用に基づくものであるのか、また、そうであればどのようなメカニズムにより抑制するのかは知られていなかった。従って、ＮＲＦ２の抑制とアルキル化剤系抗癌剤以外の抗癌剤との関係は全く未知であった。
【０００９】
ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ（ｍＴＯＲ）は、マクロライド系抗生物質であるラパマイシンの標的分子として同定されたセリン・スレオニンキナーゼであり、細胞成長、細胞増殖、細胞死、細胞の生存、タンパク質合成、及び、転写における調節因子としての役割をはたしている。ラパマイシンがｐ５３の機能を欠く癌細胞のアポトーシスを誘導することから、ｍＴＯＲ阻害剤は抗癌作用があると考えられている（非特許文献５参照）。また、ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、腎癌、膵管癌などの抗癌剤として開発されている。
【００１０】
ｍＴＯＲは、インスリンレセプターチロシンキナーゼとしても知られている。高血糖患者における脳血管内皮細胞のアポトーシスに関する研究において、ｍＴＯＲ阻害剤は、インスリン誘導性のＮＲＦ２を介したグルタミン−Ｌ−システイン リガーゼ触媒サブユニット（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎ ｌｉｇａｓｅ−ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｓｕｂｕｎｉｔ：ＧＣＬｃ）の発現、酸化還元バランス、及びヒト脳血管内皮細胞の生存を損なわせることが報告されている（非特許文献６）。しかし、特に癌治療の分野において、ｍＴＯＲ阻害剤の作用に対するＮＲＦ２の発現の影響については未だ報告されていない。
【特許文献１】国際出願公開パンフレットＷＯ２００６／１２８０４１
【特許文献２】国際出願公開パンフレットＷＯ２００８／０１２５３４
【非特許文献１】Ｙｕｅｓｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ３ （７） ８８５−８９３， ２００４
【非特許文献２】Ｒａｍｏｓ−Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９８， ３４１０−３４１５， ２００１
【非特許文献３】Ｅｗａｎ， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ， １０ （１４） ９５０−９５１， ２００５
【非特許文献４】Ｏｈｔａ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ６８， １３０３−１３０９， ２００８
【非特許文献５】Ｓｈｉｌｅ Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ， １１， １４９１−１５０１， ２００３
【非特許文献６】Ｏｋｏｕｃｈｉ， Ｍａｓａｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｎｅｕｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ３ （４） ２４９−２６１， ２００６
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、ＮＲＦ２遺伝子の変異を検出することによる、癌の予測方法に関する。特に、本発明は、ＮＲＦ２遺伝子の変異を検出することによる、ｍＴＯＲ関連癌治療薬の奏効性を予測する方法、奏効性のある患者の選択方法、又は、癌の予後の予測方法に関する。また、本発明は、ＮＲＦ２遺伝子又はＮＲＦ２タンパク質を阻害することによる癌の治療方法、あるいは、ＮＲＦ２遺伝子又はＮＲＦ２タンパク質阻害剤を有効成分とする癌治療剤に関する。
【００１２】
具体的態様としては、本発明は、ＮＲＦ２遺伝子又はタンパク質の変異を検出することによるｍＴＯＲ関連癌治療薬の奏効性予測又は奏効性のある患者の選択方法に関する情報を提供することに関する。また、本発明は、ＮＲＦ２遺伝子又はタンパク質の変異を検出することによる、ｍＴＯＲ関連癌治療薬の奏効性を予測する方法、又は、奏効性のある患者を選択する方法に関する。具体的には、ＮＲＦ２遺伝子又はタンパク質に変異がある場合、ｍＴＯＲ関連癌治療薬が効果を奏すると予測する方法に関する。また、本発明は、ｍＴＯＲ関連癌治療薬の奏効性を予測するための、ＮＲＦ２の変異を検出可能なキットに関する。例えば、本発明は、ＮＲＦ２遺伝子の変異を検出可能な、ＮＲＦ２遺伝子と結合可能な核酸又はＮＲＦ２タンパク質と結合可能な物質（例えば、抗体等）を備えるキットである。または、本発明は、変異によるＮＲＦ２の機能変化を測定することが可能なキットである。例えば、ＫＥＡＰ１によるＮＲＦ２の分解を検出するキットも本発明の対象である。
【００１３】
別の態様において、本発明は、癌患者の癌組織細胞中におけるＮＲＦ２の変異を検出することによる、癌の悪性度又は予後の良否に関する情報を提供する方法に関する。また、本発明は、癌患者の癌組織細胞中におけるＮＲＦ２の変異を検出し、ＮＲＦ２に変異がある患者について、癌が悪性であると診断し又は予後が不良であると予測する、癌患者の癌組織細胞中におけるＮＲＦ２の変異を検出することによる、癌の悪性度の診断方法又は予後予測方法に関する。また、本発明は、癌の診断又は予後を予測するための、ＮＲＦ２の変異を検出可能なキットに関する。例えば、本発明は、ＮＲＦ２遺伝子の変異を検出可能な、ＮＲＦ２遺伝子と結合する核酸又はＮＲＦ２タンパクと結合可能な物質（例えば、抗体等）を備えるキットに関する。また、本発明は、ＰＣＲ等の遺伝子増幅技術を用いることにより変異を測定可能なキットに関する。更に、本発明は、インベーダープローブ、アレルプローブ、三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素、及び、消光プローブを備える蛍光標識ユニバーサルプローブを備えるキット（例えば、インベーダー（登録商標）アッセイキット等）に関する。また、本発明は、変異によるＮＲＦ２の機能変化を測定することが可能なキットが含まれる。例えば、本発明は、ＫＥＡＰ１によるＮＲＦ２の分解を検出するキットに関する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、ＮＲＦ２遺伝子又はＮＲＦ２タンパク質を阻害することによる癌の治療方法に関する。本発明は、ＮＲＦ２遺伝子の発現を抑制することによる癌の治療方法を含む。また、本発明は、ＮＲＦ２タンパク質の発現又は活性を抑制することによる癌の治療方法に関する。また、本発明は、ＮＲＦ２遺伝子又はＮＲＦ２タンパク質の阻害剤を含有する癌治療薬に関する。具体的には、本発明は、ＮＲＦ２に対する、アンチセンス、ｄｓＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、ＮＲＦ２結合タンパク質断片、又は、抗体若しくはその断片を有効成分として含有する癌の治療剤に関する。
【００１５】
より具体的には、本発明は以下の発明に関する。
（１） 癌患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応を予測するための情報を得る方法であって：
（ａ）該患者由来の試料中の、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質を検出すること；及び、
（ｂ）測定された変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルと該患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応との関連付けをすることを含む方法。
（２） 患者由来の腫瘍サンプルから、患者の癌のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応を予測するための情報を得る方法であって：
（ａ）該患者由来の試料中の変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質を検出すること；
（ｂ）変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質の発現レベルから、癌反応クラスのうち一つのクラスに分類すること、ここで、当該分類結果は変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質の発現レベルにより決定されるものである；及び
（ｃ）当該癌反応クラスの一つに属する癌に特異的な既知の性質から当該患者の当該癌の癌治療薬への反応を予測することを含む方法。
（３） 変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２のタンパク質の発現レベルが高い場合、該患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性が高いことを示す、（２）に記載の方法。
（４） 以下の（ｉ）〜（ｉｖ）に記載の物質のうち少なくとも１つを備える、癌患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性予測キット；
（ｉ）ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡと結合し、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡと結合しない物質、
（ｉｉ）ＮＲＦ２遺伝子と結合せず、変異型ＮＲＦ２遺伝子と結合する物質、
（ｉｉｉ）ＮＲＦ２タンパク質と結合し、変異型ＮＲＦ２タンパク質と結合しない物質、
（ｉｖ）ＮＲＦ２タンパク質と結合せず、変異型ＮＲＦ２タンパク質と結合する物質。
（５） 癌患者の予後を予測するための情報を得る方法であって：
（ａ）該患者由来の試料中の変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質を検出すること；及び、
（ｂ）測定された変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルと該患者の予後との関連付けをすることを含む方法。
（６） 変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルが高い場合、該患者の予後が不良であることを示す、（５）に記載の方法。
（７） ＮＲＦ２阻害剤を有効成分として含有する癌治療薬。
（８） ＮＲＦ２阻害剤が、アンチセンス、ｄｓＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、ＮＲＦ２結合タンパク質断片、又は、抗体若しくはその断片である、（６）に記載の癌治療薬。
【００１６】
本発明の奏効性予測方法は、癌患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への応答性又はｍＴＯＲ関連癌治療薬が当該癌患者に対して効果を奏するか否かを投与前に予測することができる。よって、本発明は、癌患者に対して奏効性の期待される治療薬を選択することを可能とすると共に、奏効性の期待されない患者への不要な癌治療薬投与を避けることにより、これらの患者を不要な副作用の苦痛等から解放することができる。本発明の方法は、癌治療薬選択のための情報を提供することができる。また、本発明は、癌患者の予後を予測することにより、当該患者への治療レジメン戦略の策定に重要な情報を与えることができる。更に、本発明のＮＲＦ２遺伝子又はＮＲＦ２タンパク質を阻害する方法又はＮＲＦ２遺伝子又はＮＲＦ２タンパク質阻害剤を備える治療薬は、新しい癌の治療方法又は治療薬として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ｍＴＯＲに関連する経路を示す図である。
【図２】食道がんの臨床検体及び食道がん細胞株（ＫＹＳＥ−５０、ＫＹＳＥ−７０、ＫＹＳＥ−１８０）におけるＮＲＦ２遺伝子変異の場所及びそれによって起こるアミノ酸置換を示す図である。
【図３】正常食道（Ａ及びＢ）並びに食道がん（Ｃ）におけるＮＲＦ２の発現をＮＲＦ２に対する抗体を用いた免疫組織化学染色法により検出した結果を示す。図中、矢印はＮＲＦ２を発現している細胞を示す。図３Ｂは、図３Ａの一部の拡大図を表す。
【図４】ＮＲＦ２遺伝子変異を検索した食道がん症例について、手術後の生存日数と遺伝子変異の有無との関係について統計的解析（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ解析）を行なった結果を示す。図中、縦軸は累積生存率を示し、横軸は、手術日からの経過日数を示す。
【図５】ＮＲＦ２遺伝子変異を示す食道癌細胞株（ＫＹＳＥ−５０及びＫＹＳＥ−１８０）に対する、ｄｓＲＮＡ投与／非投与における細胞増殖変化を示す図である。図中、縦軸は、コントロールｄｓＲＮＡを投与された細胞の細胞数に対するＮＲＦ２ ｄｓＲＮＡを投与された細胞の細胞数の比を示す。
【図６】ＮＲＦ２遺伝子に異常のない癌細胞株（ＫＹＳＥ−３０、ＫＹＳＥ−１４０、ＫＹＳＥ−１７０、ＫＹＳＥ−２７０）と異常のある細胞株（ＫＹＳＥ−５０、ＫＹＳＥ−７０、ＫＹＳＥ−１８０）について、ラパマイシン処理による増殖変化を示す図である。図中、縦軸は、０ｎＭ（薬剤なし）を１００％としたときの、各細胞株の細胞数の割合を示す。図中、横軸はラパマイシンの投与量を示す。
【図７】ＮＲＦ２遺伝子に異常のない癌細胞株（ＳＱ−５、ＱＧ−５６）と異常のある細胞株（ＫＹＳＥ−５０、ＫＹＳＥ−７０、ＫＹＳＥ−１８０）について、ラパマイシン処理による増殖変化を示す図である。図中、縦軸は、０ｎＭ（薬剤なし）を１００％としたときの、それぞれの濃度における、各細胞株の細胞数の割合の変化を示す。また、図中、横軸はラパマイシンの投与量を示す。
【図８】ＮＲＦ２遺伝子に異常のない癌細胞株（ＨＯ−１−Ｎ−１、ＨＳＣ２）と異常のある細胞株（ＬＫ−２、ＥＢＣ−１）について、ラパマイシン処理による増殖変化を示す図である。図中、縦軸は、０ｎＭ（薬剤なし）を１００％としたときの、それぞれの濃度における、各細胞株の細胞数の割合の変化を示す。また、図中、横軸はラパマイシンの投与量を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
Ａ．ｍＴＯＲ関連癌治療薬の予測
一の態様において、本発明は癌患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測する方法又はキットに関し、又は癌患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測するための情報を得る方法に関する。
本明細書において、「ｍＴＯＲ関連癌治療薬」とは、ｍＴＯＲ又はその上流若しくは下流の経路に関与する物質の発現又は活性を阻害し、癌治療の効果を奏する物質であれば特に限定されるものではない。ｍＴＯＲ関連癌治療薬は、ｍＴＯＲを直接阻害する物質（ｍＴＯＲ阻害剤）、例えば、シロリムス（ラパマイシンとしも呼ばれる）、エベロリムス、テムシロリムス、及びデフェロリムス等の化学療法剤；抗体等のタンパク質；抗体断片等のペプチド；アプタマー、アンチセンス、ｄｓＲＮＡ等の核酸を含む。また、ＮＲＦ２阻害剤はｍＴＯＲ経路を阻害することから、本発明のＮＲＦ２阻害剤もｍＴＯＲ阻害剤に含まれ得る。また、ｍＴＯＲ経路は、図１に示すとおり複数の経路に関与することが知られているが、本明細書におけるｍＴＯＲ関連癌治療薬が標的とするｍＴＯＲ経路に関与する物質の中で特に好ましい物質としては、例えば、Ｉ型ホスホイノシチド３−キナーゼ（以下、「ＰＩ３Ｋ」という）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ１（以下、「ＰＤＫ１」という）、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２）、Ａｋｔ（プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）とも呼ばれる）、ｐ７０リボソーマルプロテインＳ６キナーゼ１（以下、「Ｓ６Ｋ１」という）、ｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（以下、「ＪＮＫ」という）及び低酸素誘導因子１α（以下、「ＨＩＦ１α」という）を挙げることができる。よって、ＴＧ１００１１５、ＴＣＮ−Ｐ、ＬＹ２９４００２、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ、ＢＦＺ２３５及びＳＦ１１２６等のＰＩ３Ｋ阻害剤；ＵＣＮ−０１、ＢＸ９１２、Ｂ−３０１２及びＯＳＵ０３０３１３等のＰＤＫ１阻害剤；ＡＰ１９０３及びタクロリムス等のＦＫＢＰ１２阻害剤；ＸＬ４１８、ＬＹ２９４００２、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ、ＴＣＮ−Ｐ、ＢＶ−１７０１−１、ＦＰＡ−１２４、ＫＰ３７２−１、ＧＳＫ６９０６９３等のＡｋｔ阻害剤；ＸＬ４１８及びＨ−８９等のＳ６Ｋ１阻害剤；ＡＭ１１１、ＳＰ６００１２５、米国特許第７１９９１２４号記載の化合物及びＡＳ６０１２４５等のＪＮＫ阻害剤；並びに、ＰＸ４７８及びＳＦ１１２６等のＨＩＦ１α阻害剤も、本明細書におけるｍＴＯＲ関連癌治療薬に含まれる。
【００１９】
本明細書において、「ｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性」とは、癌患者がｍＴＯＲ関連癌治療薬の投与を受けた場合に、当該ｍＴＯＲ関連癌治療薬の投与により癌患者の病状を表す指標のうち少なくとも１の指標が受ける影響のことである。このような指標としては、例えば、腫瘍の縮小、腫瘍増殖の抑制、転移、予後の良否、回帰、又は、再発等を含む。本明細書において、「ｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性が良い」とは、ｍＴＯＲ関連癌治療薬の投与を受けた癌患者の病状を表す該指標のうち少なくとも１の指標が、ｍＴＯＲ関連癌治療薬の投与を受けない場合と比較して効果を示すことを意味し、例えば、腫瘍が縮小し、腫瘍増殖が抑制され、転移が抑制され又は転移せず、予後が改善され、回帰せず、又は、再発しないこと等を含む。
【００２０】
本明細書において、「変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ」とは、正常なＮＲＦ２をコードするヌクレオチド又はリボヌクレオチド配列の一部に変異のあるＤＮＡ又はＲＮＡのことであり、例えば、配列番号１の配列の一部に変異のあるＤＮＡである。本明細書において「変異型ＮＲＦ２タンパク質」とは、正常なＮＲＦ２を構成するアミノ酸配列（配列番号２）の一部に変異のあるタンパク質のことである。特には、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又は変異型ＮＲＦ２タンパク質は、当該変異によりＮＲＦ２タンパク質の発現レベルが亢進されるような変異を備える変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はタンパク質である。より具体的な態様において、変異型ＮＲＦ２タンパク質は、ＮＲＦ２タンパク質の２４番目のトリプトファンがシステイン又はリシンに変換され、２６番目のグルタミンがグルタミン酸に変換され、２８番目のイソロイシンがグリシンに変換され、３０番目のロイシンがフェニルアラニンに変換され、３１番目のグリシンがアラニンに変換され、７５番目のグルタミンがヒスチジンに変換され、７７番目のアスパラギン酸がバリン又はグリシンに変換され、７９番目のグルタミン酸がリシンに変換され、８０番目のトレオニンがリシン又はプロリンに変換され、並びに／あるいは、８２番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に変換されたタンパク質を含む。また、変異型ＮＲＦ２遺伝子は、ＮＲＦ２タンパク質の２４番目のトリプトファンがシステイン又はリシンに変換され、２６番目のグルタミンがグルタミン酸に変換され、２８番目のイソロイシンがグリシンに変換され、３０番目のロイシンがフェニルアラニンに変換され、３１番目のグリシンがアラニンに変換され、７５番目のグルタミンがヒスチジンに変換され、７７番目のアスパラギン酸がバリン又はグリシンに変換され、７９番目のグルタミン酸がリシンに変換され、８０番目のトレオニンがリシン又はプロリンに変換され、並びに／あるいは、８２番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に変換されたタンパク質をコードする遺伝子を含む。変異型ＮＲＦをコードするＤＮＡ又はＲＮＡのレベルとは、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡレベルを測定可能な手法により測定されたレベルのことであり、例えば、サザンブロット法、ノーザンブロット法、ＡＳＯ法等のハイブリダイゼーションを利用した方法、又は、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＡＲＭＳ法及びダイレクトゲルアッセイ法等のＰＣＲを利用した方法により測定されたレベル、あるいは、各測定方法に適したソフトウェアにより計算された値として与えられるレベルを含む。
【００２１】
本明細書において、患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を判定するために、測定された変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質の発現レベルと患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性との関係において用いられる「関連付けをする」という用語は、被験者における変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質の存在又はレベルを、ｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性が不良であった患者又はｍＴＯＲ抗癌剤への反応性が不良であろうことが知られている患者、あるいは、ｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性が不良ではなかった患者又はｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性が不良ではないと信じられている患者における変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質の発現レベルと比較することを意味する。比較対象となる患者における変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルは、例えば、本発明の開示により、又は、既にｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性が判明している患者由来の試料における変異型ＮＲＦ２遺伝子又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルを測定することにより、あるいは、他のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性指標による評価と組み合わせて評価することにより知ることができる。変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルを利用して、患者がｍＴＯＲ関連癌治療薬に反応する可能性を判定することができる。変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルとｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性との関連付けは、統計的分析により行うことができる。統計学的有意性は、２以上の集団を比較し、信頼区間及び／又はｐ値を決定することにより決定される（Ｄｏｗｄｙ ａｎｄ Ｗｅａｒｄｅｎ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｅｌｙ＆Ｓｏｎｓ， ＮｅｗＹｏｒｄ，１９８３）。本発明の信頼区間は、例えば、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又は９９．９９％であってもよい。また、本発明のｐ値は、例えば、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００２又は０．０００１であってもよい。
【００２２】
好ましくは、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質は、その存在／不存在により患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性と関連付けることができる。また、別の例として、患者由来の試料における変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルは、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質についてｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性の指標として設定した閾値レベルと比較することにより、該患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性と関連付けてもよい。このような閾値レベルは、例えば、感度が、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は、９８％以上となるように設定することができる。また、閾値レベルは、特異度が、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は、９８％以上となるように設定することができる。
【００２３】
ｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性の判定は、それによりｍＴＯＲ関連癌治療薬投与による患者の状態の経過又は転帰を予測する方法を意味し、当該投与による患者の状態の経過又は転帰を１００％の正確さで予測可能であることを意味するものではない。ｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性の判定は、当該抗癌剤の投与により、ある経過又は転帰が起こる可能性が増大しているか否かを意味するものであり、当該経過又は転帰が起こらない場合を基準として起こりやすいことを意味するものではない。即ち、ｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性の判定結果は、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルが上昇又は減少している患者において、そのような特徴を示さない患者に比較して、ｍＴＯＲ関連癌治療薬投与より特定の経過又は転帰がより生じやすいということを意味する。
【００２４】
本明細書において、「癌反応クラス」とは、類似した性質を備える癌のグループのことであり、特には、特定の遺伝子発現において類似した発現パターンを示すか、又は、類似した臨床上の症状を示す癌のグループのことである。ある癌反応クラスに属するメンバーは、ｍＴＯＲ関連癌治療薬に対して同等の又は類似した反応性を示す。当該反応クラスに属するメンバーの遺伝子発現又は臨床上の症状は、当該反応クラスに属さないメンバーの遺伝子発現又は臨床上の症状と異なっており、それらが区別可能であることが好ましい。このような遺伝子発現としては、好ましくは変異型ＮＲＦ２遺伝子の発現である。癌反応クラスは、「ｍＴＯＲへの反応性が高い」及び「ｍＴＯＲへの反応性が低い」の少なくとも２のクラスを含むことができ、また、それ以上の数のクラスを含んでいてもよい。
【００２５】
本明細書において、「癌反応クラスのうち一つのクラスに分類する」とは、癌患者由来の試料における変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルに応じて当該癌患者をグループ分けすることを意味する。レベルは通常、発現量などのＤＮＡ，ＲＮＡ又はタンパク質の量を意味するが、変異の数または程度などの変異のレベルを意味してもよい。当該グループ分けは、絶対的又は相対的な指標により振り分けることができる。例えば、対象患者の変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルから、当該患者を予め決められた変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルのグループに振り分けることにより行ってもよい。あるいは、対象患者を含む不特定の患者群における変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質の発現レベルを測定した上で、相対的なレベルの差から、患者を２以上のグループに分けてもよい。また、クラス分けは、健常人における変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルとの差の程度を指標として行ってもよい。好ましくは、比較した場合に変異型ＮＲＦをコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルが高いほどｍＴＯＲへの反応性が高いクラスに分類される。
【００２６】
一の態様において、本発明のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測するための方法又はキットは、核酸分子を用いた公知の方法に基づくことができる。このような方法としては、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットハイブリダイゼーション、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ＤＮＡマイクロアレイ、ＡＳＯ法等を挙げることができる。本予測キットによる分析は、定性的、定量的または半定量的に行うことができる。
【００２７】
具体的には、本発明のｍＴＯＲ関連癌治療薬への癌患者の反応性予測方法は、例えば、以下の工程により行うことができる：
（ａ）患者由来の試料を調整する工程；
（ｂ）少なくとも１つの核酸に該試料を接触させる工程、ここで、該核酸は、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）から選択される：
（ｉ）正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡに特異的に結合し、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡに結合しない核酸、及び、正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ及び変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡに結合する核酸、
（ｉｉ）正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡに結合せず、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡに特異的に結合する核酸；
（ｃ）該ＤＮＡ又は該ＲＮＡの該核酸への結合を検出して変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのレベルを測定する工程；並びに、
（ｄ）変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのレベルから癌患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測する工程、ここで、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡの存在若しくは増加が該患者のｍＴＯＲへの反応性が高いことを示す。
【００２８】
一の態様において、本発明のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測するためのキットは、特定の遺伝子（例えば、正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ、あるいはその両方）と特異的に結合する核酸を含む核酸分子を使用する公知の方法に基づくことができる。具体的には本発明のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測するためのキットは、（ｉ）〜（ｉｖ）から選択される少なくとも一つの物質を含む。
（ｉ）ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡと結合し、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡと結合しない物質、
（ｉｉ）ＮＲＦ２遺伝子とは結合せず、変異型ＮＲＦ２遺伝子と結合する物質
（ｉｉｉ）ＮＲＦ２タンパク質と結合し、変異型ＮＲＦ２タンパク質と結合しない物質、及び、
（ｉｖ）ＮＲＦ２タンパク質と結合せず、変異型ＮＲＦ２タンパク質と結合する物質。
当該キットに使用する核酸は、化学合成により、又は、所望の核酸を含む遺伝子を生体材料から調整し、所望の核酸を増幅するよう設計したプライマーを用いて増幅することにより、得ることができる。
【００２９】
一の態様において、本発明の方法又はキットは、ＰＣＲを用いた公知の方法に基づくことができる。このような方法としては、例えば、ＡＲＭＳ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）法、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰＣＲ）法、Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法を挙げることができる。また、増幅された核酸は、ドット・ブロット・ハイブリダイゼーション法、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、Ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＴ−ＰＣＲ法、ＰＣＲ−ＳＳＯ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）法、ＰＣＲ−ＳＳＰ法、ＡＭＰＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、ＭＶＲ−ＰＣＲ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法により］検出してもよい。本予測キットによる分析は、定性的、定量的または半定量的に行うことができる。
【００３０】
具体的には、本発明のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測するための方法は、例えば、以下の工程により行うことができる：
（ａ）患者由来の試料を調整する工程；
（ｂ）正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ、及び変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡから選択される少なくとも１の核酸を増幅させる工程：
（ｃ）核酸の増幅量を検出し、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのレベルを測定する工程；並びに、
（ｄ）変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのレベルから癌患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測する工程、ここで、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡの存在若しくは増加は、該患者のｍＴＯＲへの反応性が高いことを示す。
【００３１】
ＰＣＲを使用する公知の方法に基づく本発明のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測するためのキットは、特定の遺伝子（例えば、ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ、あるいはその両方）の一部と特異的に結合するプライマーを含む。本キットに使用するプライマーは、本明細書の開示及び公知の情報を基に、当業者周知の方法により適宜設計し、化学合成により得ることができる。
【００３２】
更に、別の態様において、本発明のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測する方法は、例えば、インベーダー（登録商標）法として知られる方法（例えば、Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．：“Ｃｌｉｎｉｃａｌ，ｇｅｎｅｔｉｃ，ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｖａｄｅｒ ａｓｓａｙ．”Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．４：３５３−３６４，１９９９参照）を用いて行うことができる。
例えば、本発明のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測する方法は、本明細書の記載によれば、以下の工程により行うことができる：
（ａ）患者由来の試料を調整する工程；
（ｂ）以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載の核酸に該試料を接触させて、アレルプローブと相補的なＤＮＡに三重鎖を形成させる工程：
（ｉ）正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡの一部と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列（フラップ）を備えるアレル特異的プローブ、並びに／又は、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡの一部と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列（フラップ）を備えるアレル特異的プローブ、
（ｉｉ）正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡ及び／又は変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡの一部と相補的な配列を備えるインベーダープローブ；
（ｃ）（ｂ）により得られた核酸試料に、三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素を接触させて三重鎖を形成した核酸からフラップを遊離させる工程；
（ｄ）遊離されたフラップを、それぞれ当該フラップと相補的な配列及び消光プローブを備える蛍光標識ユニバーサルプローブと接触させる工程；
（ｅ）（ｄ）により得られた核酸試料に、三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素を接触させて蛍光標識を遊離させ、蛍光を発色させる工程；並びに、
（ｆ）発色した蛍光を検出することにより、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡのレベルを測定する工程、ここで、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡの存在若しくは増加が該患者のｍＴＯＲへの反応性が高いことを示す。
【００３３】
一の態様において、本明細書のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測するためのキットは、上記インベーダー（登録商標）法に適したキットとすることができる。たとえば、本発明のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測するためのキットは、正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡの一部と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列（フラップ）を備えるアレル特異的プローブ、及び／又は、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡの一部と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列（フラップ）を備えるアレル特異的プローブ、正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又は／及び変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡの一部と相補的な配列を備えるインベーダープローブ、三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素、及び、消光プローブを備える蛍光標識ユニバーサルプローブを備えることができる。上記フラップは、各アレル特異的プローブ間で異なっていることが好ましい。上記蛍光標識は、当業者周知のプローブを適宜選択することができ、各蛍光標識ユニバーサルプローブ間で異なっていることが好ましい。例えば、蛍光標識として、ＦＡＭ及びＶＩＣを使用することができる。
【００３４】
上述の本発明のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測するためのキットに含まれるプローブは、本明細書の開示及び公知の情報を基に、当業者周知の方法により適宜設計し、化学合成により、又は、所望の核酸を含む遺伝子を生体材料から調整し、所望の核酸を増幅するよう設計したプライマーを用いて増幅することにより、得ることができる。また、本明細書に記載の予測キットに含まれる三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素は、市販のもの（例えば、Ｃｌｅａｖａｓｅ、株式会社サードウェーブジャパン）を使用することができる。
【００３５】
別の態様において、ｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測するための方法又はキットは、抗体分子を用いた公知の方法に基づくことができる。このような方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｃａｔｔｙ， Ｒａｙｋｕｎｄａｌｉａ， １９８９）、ラジオイムノアッセイ（Ｃａｔｔｙ， Ｍｕｒｐｈｙ， １９８９）、免疫組織化学的方法（Ｈｅｉｄｅｒら、１９９３）、または、ウエスタンブロット等を挙げることができる。
【００３６】
また、別の態様において、 本発明のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測するための方法は、以下の工程を含むことができる：
（ａ）該患者由来の試料を調整する工程；
（ｂ）少なくとも１つの抗体に該試料を接触させる工程、ここで、該抗体は、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）から選択される：
（ｉ）ＮＲＦ２タンパク質に特異的に結合し、変異型ＮＲＦ２タンパク質に結合しない抗体、及び、ＮＲＦ２タンパク質及び変異型ＮＲＦ２タンパク質に結合する抗体、
（ｉｉ）ＮＲＦ２タンパク質に結合せず、変異型ＮＲＦ２タンパク質に特異的に結合する抗体；
（ｃ）該タンパク質の該抗体への結合を検出して変異型ＮＲＦ２タンパク質の発現レベルを測定する工程；
（ｄ）変異型ＮＲＦ２タンパク質の発現レベルから癌患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測する工程、ここで、変異型ＮＲＦ２タンパク質の発現若しくは発現上昇が患者のｍＴＯＲへの反応性が高いことを示す。
【００３７】
本発明のキットは、特定のタンパク質（例えば、ＮＲＦ２タンパク質、変異型ＮＲＦ２タンパク質、又は、その両方）と特異的に結合する抗体又はその断片を含む。目的のタンパク質と結合する限りその構造、当該抗体又はその断片の大きさ、イムノグロブリンクラス、由来等は問わない。また、本発明のキットが包含する抗体又はその断片は、モノクローナルであってもよいし、ポリクローナルであってもよい。抗体の断片とは、抗体の一部分（部分断片）又は抗体の一部分を含むペプチドであって、抗体の抗原への結合作用を保持するもののことである。このような抗体の断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）若しくはこれらの重合体、二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、又は、ＣＤＲを含むペプチドを挙げることができる。ここで、ＣＤＲとは、Ｋａｂａｔら（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”， Ｋａｂａｔ， Ｅ．ら， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ ｓｅｒｖｉｃｅｓ， １９８３）又はＣｈｏｔｈｉａら（Ｃｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９６， ９０１−９１７， １９８７）の定義によるものである。また、本発明のキットは、包含する抗体又はその断片のアミノ酸配列をコードする単離された核酸、当該核酸を包含するベクター、当該ベクターを保有する細胞を含んでいてもよい。
【００３８】
抗体は、当業者によく知られた方法により得ることができる。例えば、目的のタンパク質の全部若しくはその一部を有するポリペプチド、又は、それらをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクター等を調製しこれを抗原とする。この抗原を用いて動物を免疫後、免疫した動物から得られた免疫細胞と、ミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物から抗体を採取する。最後に採取した抗体を、抗原として用いたＮＲＦ２タンパク質又は変異型ＮＲＦ２タンパク質あるいはその一部に一致するポリペプチドを利用した抗原特異精製を行うことによりＮＲＦ２タンパク質又は変異型ＮＲＦ２タンパク質に対するモノクローナル抗体を得ることができる。また、ポリクローナル抗体を作成する場合、上記と同様の抗原を動物に免疫し、免疫した動物から血液を採取し、この血液から血清を分離し、この血清に対して上記抗原を利用した抗原特異精製を行うことにより得ることができる。得られた抗体を酵素処理又は得られた抗体の配列情報を利用することにより、抗体の断片を得ることができる。
【００３９】
抗体又はその断片への標識の結合は当分野において一般的な方法により行うことができる。例えば、タンパク質又はペプチドを蛍光標識する場合、タンパク質又はペプチドをリン酸緩衝液で洗浄した後、ＤＭＳＯ、緩衝液等で調整した色素を加え、混合した後室温で１０分間静置することにより結合させることができる。また、市販の標識キットとして、ビオチン標識キット（Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、アルカリフォスファターゼ標識用キット（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、ペルオキシダーゼ標識キット（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｒｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｒｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２：株式会社同仁化学研究所）、フィコビリプロテイン標識キット（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ、Ｂ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｂ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ、Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、蛍光標識キット（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ５５５ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２：株式会社同仁化学研究所）、ＤｙＬｉｇｈｔ５４７、ＤｙＬｉｇｈｔ６４７（テクノケミカル株式会社）、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）抗体標識キット、Ｑｄｏｔ（登録商標）抗体標識キット（インビトロゲン社）、ＥＺ−Ｌａｂｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（フナコシ株式会社）等を用いて標識することもできる。また、標識した抗体又はその断片の検出は、適宜標識に適した機器を使用することにより行うことができる。
【００４０】
本明細書に記載の予測方法及び予測キットに使用する検体としては、例えば、生検として被験者から採取した組織試料または液体を使用することができる。使用される生検は、本発明の免疫学的測定の対象となるものであれば特に限定はなく、例えば、組織、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、漿液、髄液、関節液、眼房水、涙液、唾液またはそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができ、好ましくは組織（特には癌組織）である。本発明のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測する方法において、対象となる癌の種類は特に限定されないが、好ましくは固形癌であり、例えば、肺癌、頭頚部癌、食道癌、子宮頚癌、胆道癌、乳癌、悪性黒色腫を挙げることができる。本予測キットによる分析は、定性的、定量的または半定量的に行うことができる。
【００４１】
Ｂ．癌の予後予測
別の態様において、本発明は癌患者の予後予測のための方法又はキット、あるいは癌患者の予後を予測する情報を得る方法に関する。本発明において、予後の予測は、癌の結末として、再発、転移又は特に患者が死亡するリスクを決定することであってもよい。
本明細書において、「予後」とは、癌患者が外科的治療等による腫瘍増殖の抑制、軽減後に辿る経過又は結末（例えば、転移の有無、生死等）を意味する。本明細書において、予後とは、例えば、外科的治療による腫瘍増殖の抑制、軽減後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０年あるいはそれ以上の時点における生死であってもよい。予後は、バイオマーカーである変異型ＮＲＦ２タンパク質又は変異型ＮＲＦ２タンパク質をコードする遺伝子を調べることにより予測される。予後の予測は、バイオマーカーの存在／不存在又は上昇／減少により患者の予後が良好又は不良であるか否か又は予後が良好であるか又は不良である確率を判定することにより行うことができる。本明細書において、「予後の判定」及び「予後の評価」の文言は、予後の予測と同意義語として用いられる。
【００４２】
本明細書において「予後良好」とは、患者の外科的治療等による腫瘍増殖の抑制、軽減後の容態が長期間（例えば、３、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０年間あるいはそれ以上）致命的とならないことを意味する。あるいは、予後良好とは、そのような長期間の生存、非転移、非回帰、又は、非再発を意味していてもよい。例えば、予後良好とは、好ましくは、転移又は再発を伴うことなく、少なくとも３年間、特には少なくとも５年間生存することを意味してもよい。また、予後良好の状態として、最も好ましい状態は長期の無疾患の生存である。本発明において、予後良好とは、転移等何らかの疾患が確認されていてもその悪性度が低く、生存可能な状態を含むこともできる。
【００４３】
本明細書において「予後不良」とは、患者の外科的治療等による腫瘍増殖の抑制、軽減後の容態が短期間（例えば、１、２、３、４、５年間あるいはそれ以下）で致命的となることを意味する。あるいは、予後不良は、そのような短期間に死亡、転移、回帰、又は、再発することを意味していてもよい。例えば、予後不良とは、少なくとも３年、特には少なくとも５年の間に再発、転移又は死亡することを意味してもよい。
【００４４】
本明細書において、患者の予後を判定するために、測定された変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質の発現レベルと患者の予後と関係において用いられる「関連付けをする」という用語は、被験者における変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質の存在又はレベルを、予後が不良であった患者又は予後が不良であろうことが知られている患者、あるいは、予後が不良ではなかった患者又は予後が不良ではないと信じられている患者における変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルと比較することを意味する。または、関連付けは、被験者における変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質の存在又はレベルを、癌を発症していない健常人における変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質の発現レベルと比較することであってもよい。比較対象となる患者における変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルは、例えば、本発明の開示により、又は、既に予後が判明している患者由来の試料における変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルを測定することにより、あるいは、他の予後指標による評価と組み合わせて評価することにより知ることができる。本発明の変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルを利用して、患者が死亡、再発又は転移する可能性を予測することができる。予後因子と予後との関連付けは、統計的分析により行うことができる。統計学的有意性は、２以上の集団を比較し、信頼区間及び／又はｐ値を決定することにより決定される（Ｄｏｗｄｙ ａｎｄ Ｗｅａｒｄｅｎ， Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｅｌｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮｅｗＹｏｒｄ， １９８３）。本発明の信頼区間は、例えば、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又は９９．９９％であってもよい。また、本発明のｐ値は、例えば、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００２又は０．０００１であってもよい。
【００４５】
例えば、本発明の変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質は、その存在／不存在により患者の予後と関連付けることができる。また、別の例として、本発明の変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質について予後指標としての閾値レベルを設定し、患者由来の試料におけるバイオマーカーのレベルは、閾値レベルと比較することにより関連付けてもよい。このような閾値レベルは、例えば、感度が、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は、９８％以上となるように設定することができる。また、閾値レベルは、特異度が、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は、９８％以上となるように設定することができる。
【００４６】
予後の判定は、それにより患者の状態の経過又は転帰を予測する方法を意味し、状態の経過又は転帰を１００％の正確さで予測可能であることを意味するものではない。予後の判定は、ある経過又は転帰が起こる可能性が増大しているか否かを意味するものであり、当該経過又は転帰が起こらない場合を基準として起こりやすいことを意味するものではない。即ち、予後の判定結果は、本発明の変異型ＮＲＦ２遺伝子又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルが上昇又は減少している患者において、そのような特徴を示さない患者に比較して、ある特定の経過又は転帰がより生じやすいということを意味する。
【００４７】
一の態様において、本発明の予後予測キットは、核酸分子を用いた公知の方法に基づくことができる。このような方法としては、例えば、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットハイブリダイゼーション、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ＤＮＡマイクロアレイ等を挙げることができる。本明細書に記載の予測方法及び予測キットに使用する検体としては、例えば、生検として被験者から採取した組織試料または液体を使用することができる。使用される生検は、本発明の免疫学的測定の対象となるものであれば特に限定はなく、例えば、組織、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、漿液、髄液、関節液、眼房水、涙液、唾液またはそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができ、好ましくは組織（特には癌組織）である。本発明のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測する方法において、対象となる癌の種類は特に限定されないが、好ましくは固形癌であり、例えば、肺癌、頭頚部癌、食道癌、子宮頚癌、胆道癌、乳癌、悪性黒色腫を挙げることができる。本予測キットによる分析は、定性的、定量的または半定量的に行うことができる。
【００４８】
本発明の予後予測方法は、例えば、以下の工程により行うことができる：
（ａ）該患者由来の試料を調整する工程；
（ｂ）少なくとも１つの核酸に該試料を接触させる工程、ここで、該核酸は、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）から選択される：
（ｉ）正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡに特異的に結合し、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡに結合しない核酸、及び、正常なＮＲＦ２遺伝子及び変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡに結合する核酸、
（ｉｉ）正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡに結合せず、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡに特異的に結合する核酸；
（ｃ）核酸の該ＤＮＡ若しくはＲＮＡへの結合を検出して変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡのレベルを測定する工程；
（ｄ）変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡの発現レベルから癌患者の予後を予測する工程、ここで、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡの発現若しくは発現上昇が癌患者の予後不良を示す。
【００４９】
本発明の癌患者の予後予測のためのキットは、特定のＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はその両方）と特異的に結合する核酸を含む。特に、本発明の癌患者の予後予測のためのキットは、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）から選択される少なくとも１つの物質を含む
（ｉ）ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡと結合し、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡと結合しない物質、
（ｉｉ）ＮＲＦ２遺伝子とは結合せず、変異型ＮＲＦ２遺伝子と結合する物質
（ｉｉｉ）ＮＲＦ２タンパク質と結合し、変異型ＮＲＦ２タンパク質と結合しない物質、及び、
（ｉｖ）ＮＲＦ２タンパク質と結合せず、変異型ＮＲＦ２タンパク質と結合する物質。
使用する核酸は、化学合成により、又は、所望の核酸を含む遺伝子を生体材料から調整し、所望の核酸を増幅するよう設計したプライマーを用いて増幅することにより、得ることができる。
【００５０】
一の態様において、本発明の癌患者の予後予測方法は、例えば、インベーダー（登録商標）法として知られる方法（例えば、Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．：“Ｃｌｉｎｉｃａｌ，ｇｅｎｅｔｉｃ，ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｖａｄｅｒ ａｓｓａｙ．”Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．４：３５３−３６４，１９９９参照）を用いて行うことができる。
例えば、本発明の癌患者の予後予測方法は、以下の工程により行うことができる：
（ａ）患者由来の試料を調整する工程；
（ｂ）以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載の核酸に該試料を接触させて、アレルプローブと相補的なＤＮＡに三重鎖を形成させる工程：
（ｉ）正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡの一部と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列（フラップ）を備えるアレル特異的プローブ、並びに／又は、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡの一部と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列（フラップ）を備えるアレル特異的プローブ、
（ｉｉ）正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡ及び／又は変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡの一部と相補的な配列を備えるインベーダープローブ；
（ｃ）（ｂ）により得られた核酸試料に、三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素を接触させて三重鎖を形成した核酸からフラップを遊離させる工程；
（ｄ）遊離されたフラップを、それぞれ当該フラップと相補的な配列及び消光プローブを備える蛍光標識ユニバーサルプローブと接触させる工程；
（ｅ）（ｄ）により得られた核酸試料に、三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素を接触させて蛍光標識を遊離させ、蛍光を発色させる工程；並びに、
（ｆ）発色した蛍光を検出することにより、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡのレベルを測定する工程、ここで、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡの存在若しくは増加が該患者の予後が悪いことを示す。
【００５１】
一の態様において、本明細書の癌患者の予後を予測するためのキットは、上記インベーダー（登録商標）法に適したキットとすることができる。たとえば、本発明の癌患者の予後を予測するためのキットは、正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡの一部と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列（フラップ）を備えるアレル特異的プローブ、及び／又は、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡの一部と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列（フラップ）を備えるアレル特異的プローブ、正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又は／及び変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡの一部と相補的な配列を備えるインベーダープローブ、三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素、及び、消光プローブを備える蛍光標識ユニバーサルプローブを備えることができる。上記フラップは、各アレル特異的プローブ間で異なっていることが好ましい。上記蛍光標識は、当業者周知のプローブを適宜選択することができ、各蛍光標識ユニバーサルプローブ間で異なっていることが好ましい。例えば、蛍光標識として、ＦＡＭ及びＶＩＣを使用することができる。
【００５２】
上述の本発明の癌患者の予後を予測するためのキットに含まれるプローブは、本明細書の開示及び公知の情報を基に、当業者周知の方法により適宜設計し、化学合成により、又は、所望の核酸を含む遺伝子を生体材料から調整し、所望の核酸を増幅するよう設計したプライマーを用いて増幅することにより、得ることができる。また、本明細書に記載の予測キットに含まれる三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素は、市販のもの（例えば、Ｃｌｅａｖａｓｅ、株式会社サードウェーブジャパン）を使用することができる。
【００５３】
一の態様において、本発明の癌患者の予後を予測するための方法又はキットは、抗体分子を用いた公知の方法に基づくことができる。このような方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｃａｔｔｙ， Ｒａｙｋｕｎｄａｌｉａ， １９８９）、ラジオイムノアッセイ（Ｃａｔｔｙ， Ｍｕｒｐｈｙ， １９８９）、免疫組織化学的方法（Ｈｅｉｄｅｒら、１９９３）、または、ウエスタンブロット等を挙げることができる。
【００５４】
一の態様において、本発明の癌患者の予後予測方法は、例えば、以下の工程
（ａ）該患者由来の試料を調整する工程；
（ｂ）少なくとも１つの抗体に該試料を接触させる工程、ここで、該抗体は、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）から選択される：
（ｉ）ＮＲＦ２タンパク質に特異的に結合し、変異型ＮＲＦ２タンパク質に結合しない抗体、及び、ＮＲＦ２タンパク質及び変異型ＮＲＦ２タンパク質に結合する抗体、
（ｉｉ）ＮＲＦ２タンパク質に結合せず、変異型ＮＲＦ２タンパク質に特異的に結合する抗体；
（ｃ）該タンパク質の該抗体への結合を検出して変異型ＮＲＦ２タンパク質の発現レベルを測定する工程；
（ｄ）変異型ＮＲＦ２タンパク質の発現レベルから癌患者の予後を予測する工程、ここで、変異型ＮＲＦ２タンパク質の発現若しくは発現上昇が癌患者の予後不良を示す、により行うことができる。
【００５５】
一の態様において、本発明の癌患者の予後予測のためのキットは、特定のタンパク質（例えば、ＮＲＦ２タンパク質、変異型ＮＲＦ２タンパク質、又は、その両方）と結合する抗体又はその断片を備える。当該抗体は、目的のタンパク質と結合する限りその構造、大きさ、イムノグロブリンクラス、由来等を問わない。また、本発明のキットが包含する抗体又はその断片は、モノクローナルであってもよいし、ポリクローナルであってもよい。抗体の断片とは、抗体の一部分（部分断片）又は抗体の一部分を含むペプチドであって、抗体の抗原への結合作用を保持するもののことである。このような抗体の断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）若しくはこれらの重合体、二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、又は、ＣＤＲを含むペプチドを挙げることができる。ここで、ＣＤＲとは、Ｋａｂａｔら（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”， Ｋａｂａｔ， Ｅ．ら， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ ｓｅｒｖｉｃｅｓ， １９８３）又はＣｈｏｔｈｉａら（Ｃｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９６， ９０１−９１７， １９８７）の定義によるものである。また、本発明のキットは、本発明のキットが包含する抗体又はその断片のアミノ酸配列をコードする単離された核酸、当該核酸を包含するベクター、当該ベクターを保有する細胞も包含する。
【００５６】
本発明の癌患者の予後予測のためのキットに使用される抗体は、上述の方法により得ることができる。また、抗体又はその断片への標識の結合も上述の方法により行うことができる。また、標識には上述の市販の標識キットを使用してもよい。また、標識した抗体又はその断片の検出は、適宜標識に適した機器を使用することにより行うことができる。
【００５７】
本明細書に記載の癌患者の予後測キットに使用する検体としては、例えば、生検として被験者から採取した組織試料または液体を使用することができる。使用される生検は、本発明の免疫学的測定の対象となるものであれば特に限定はなく、例えば、組織、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、漿液、髄液、関節液、眼房水、涙液、唾液またはそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができ、好ましくは組織（特には癌組織）である。本予測キットによる分析は、定性的、定量的または半定量的に行うことができる。本発明の予後予測方法において、対象となる癌の種類は特に限定されないが、好ましくは固形癌であり、例えば、肺癌、頭頚部癌、食道癌、子宮頚癌、胆道癌、乳癌、悪性黒色腫を挙げることができる。
【００５８】
Ｃ．癌治療薬のスクリーニング
一の態様において、本発明は癌治療薬のスクリーニング方法に関する。変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質は、患者の予後の指標となることから、癌治療薬のスクリーニングにおいて変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質を患者の予後の改善の指標として用いることができる。例えば、癌細胞に被験薬を添加し、又は、癌モデル動物に被験薬を投与し、一定時間後の変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルを測定することにより、当該治療薬が癌の予後を改善するものであるか否かを判定することができる。より具体的には、添加又は投与により、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルが減少しているか若しくは確認できない被験薬を、癌の予後を改善する治療薬として選別することができる。
【００５９】
Ｄ．癌治療薬
また、別に態様において、本発明はＮＲＦ２阻害剤を有効成分として含有する癌治療薬に関する。本明細書において、「ＮＲＦ２阻害剤」とは、ＮＲＦ２タンパク質の機能又は発現を阻害し、あるいは、ＮＲＦ２遺伝子発現を阻害する物質であれば特に限定されず、例えば、アンチセンス、ｄｓＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、ＮＲＦ２結合タンパク質断片、ＮＲＦ２抗体又は抗体の断片、又は、結合性蛋白質を挙げることができる。
【００６０】
「アンチセンス」とは、ＮＲＦ２をコードするｍＲＮＡに相補的な配列を有する核酸のことであり、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。また、アンチセンスは標的とするＮＲＦ２のｍＲＮＡと１００％相補的である必要はなく、ストリンジェントな条件下（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９）で特異的にハイブリダイズすることができれば、相補的でない塩基を含んでいてもよい。アンチセンスは、細胞に導入されると、標的ポリヌクレオチドに結合し、転写、ＲＮＡのプロセッシング、翻訳又は安定性を阻害する。また、アンチセンスは、アンチセンスポリヌクレオチドの他に、ポリヌクレオチドミメティックス、変異された骨格（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂａｃｋ ｂｏｎｅ）を備えるもの、並びに、３’及び５’末端部分を含む。このようなアンチセンスは、ＮＲＦ２の配列情報を基に、当業者周知に方法を利用して適宜設計及び製造（例えば、化学合成）することができる。
【００６１】
「ｄｓＲＮＡ」とは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により、遺伝子発現を抑制する二本鎖ＲＮＡ構造を含むＲＮＡのことであり、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）及びｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）を含む。ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子発現を抑制する限り、標的遺伝子配列と１００％の相同性を備える必要はない。また、ｄｓＲＮＡは、安定化その他の目的で、その一部がＤＮＡに置換されていてもよい。ｓｉＲＮＡとして、好ましくは、２１〜２３塩基を備える二本鎖ＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、当業者周知の方法、例えば、化学合成又は自然発生ＲＮＡのアナログとして得ることができる。ｓｈＲＮＡは、ヘアピンターン構造をとるＲＮＡ短鎖である。ｓｈＲＮＡは当業者周知の方法、例えば、化学合成又はｓｈＲＮＡをコードする遺伝子を細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。
【００６２】
「リボザイム」は、触媒活性を備えるＲＮＡのことであり、ＲＮＡを切断、貼り付け、挿入、移動等することができる。リボザイムの構造としては、ハンマーヘッド型、ヘアピン型等が含まれる。
【００６３】
「アプタマー」とはタンパク質等の物質と結合する核酸である。アプタマーはＲＮＡであってもＤＮＡであってもよい。核酸の形態は二本鎖であっても一本鎖であってもよい。アプタマーの長さは標的分子に特異的に結合することができれば特に限定されないが、例えば、１０〜２００ヌクレオチド、好ましくは、１０〜１００ヌクレオチド、より好ましくは１５〜８０ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜５０ヌクレオチドのものである。アプタマーは、当業者において周知の方法を用いて選択することができ、例えば、ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）（Ｔｕｅｒｋ， Ｃ． ａｎｄ Ｇｏｌｄ， Ｌ．， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９： ５０５−５１０）を用いることができる。
【００６４】
「ＮＲＦ２結合タンパク質断片」とは、ＮＲＦ２と結合するタンパク質の断片であって、当該断片と結合することにより、ＮＲＦ２が本来の機能を奏することができない断片のことである。ＮＲＦ２が結合するタンパク質としては、例えば、ｆｅｒｒｉｔｉｎ，ｌｉｇｈｔ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＦＴＬ）、ｊｕｎ オンコジーン（ＪＵＮ）、カテプシン Ｌ１（ＣＴＳＬ１）、インターロイキン エンハンサー バインディング ファクター３（ＩＬＦ３）、ＫＥＡＰ１、ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｏｍａｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＰＨＩＰ）、ヌクレアー ファクター エリスロイド デライブド２（ＮＦＥ２）、ｖ−ｍａｆ マスクロアポニューロティック ファイブロサルコーマ オンコジーン ホモログ Ｇ（Ｖ−ｍａｆ ｍｕｓｃｕｌｏａｐｏｎｅｕｒｏｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇ Ｇ）（ＭＡＦＧ）、及び、ｖ−ｍａｆ マスクロニューロティック ファイブロサルコーマ オンコジーンファミリー プロテイン Ｋ（ｖ−ｍａｆ ｍｕｓｃｕｌｏａｐｏｎｅｕｒｏｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ，ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋ）（ＭＡＦＫ）が挙げられる。例えば、これらのタンパク質の部分ペプチドを作成し、ＮＲＦ２と結合するペプチドを選択することにより、ＮＲＦ２と結合するタンパク質断片を得ることができる。また、これらのペプチドは、安定性の向上や阻害活性を促進させるため、適宜、修飾されていてもよく、また、一部にアミノ酸の変異が導入されていてもよい。
【００６５】
本発明の予測用キット又は治療薬に使用する抗ＮＲＦ２抗体またはその断片が認識するアミノ酸の数は、抗体がＮＲＦ２に結合することができる数であれば、特に限定はない。抗体を治療薬として使用する場合には、ＮＲＦ２の機能を阻害することが可能な数のアミノ酸を認識することが好ましい。抗体またはその断片が認識するアミノ酸の数は、好ましくは、少なくとも１個であり、より好ましくは、少なくとも３個である。また、本発明の抗体のイムノグロブリンクラスは特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＹのいずれのイムノグロブリンクラスであってもよく、好ましくはＩｇＧである。また、本発明の抗体はいずれのアイソタイプの抗体をも包含するものである。
【００６６】
本明細書において、「抗体の断片」とは、抗体の一部分（部分断片）または抗体の一部分を含むペプチドであって、抗体の抗原への作用を保持するもののことである。このような抗体の断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（以下、「ｓｃＦｖ」という）、ジスルフィド結合Ｆｖ（以下、「ｄｓＦｖ」という）若しくはこれらの重合体、二量体化Ｖ領域（以下、「Ｄｉａｂｏｄｙ」という）、またはＣＤＲを含むペプチドを挙げることができる。
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧをタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。Ｆａｂ’は、該Ｆ（ａｂ’）のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。ｓｄＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬがペプチドリンカーで連結された抗原結合活性を有するポリペプチドである。ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のシステイン残基に置換されたアミノ酸残基がジスルフィド結合を介して結合している抗原結合活性を有する断片である。Ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した断片である。本発明のＤｉａｂｏｄｙは、モノスペシフィックでもよいし、バイスペシフィック（多重特異性抗体）でもよい。二量体化しているｓｃＦｖは、同一であっても良いし、異なっていても良い。ＣＤＲを含むペプチドは、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び、ＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲのアミノ酸配列を含むペプチドのことである。
【００６７】
本発明の抗体は、例えば、ＮＲＦ２又はＮＲＦ２の一部を有するペプチドを、必要に応じて免疫賦活剤（例えば、鉱油若しくはアルミニウム沈殿物と加熱死菌若しくはリポ多糖体、フロインドの完全アジュバント、または、フロインドの不完全アジュバント等）とともに、非ヒト哺乳動物または鳥類に免疫することにより作製することができる。
【００６８】
免疫原として使用するＮＲＦ２は、マウス、ウサギ、ヒト等の哺乳動物のＮＲＦ２であれば、特に限定は無いが、好ましくは、ヒトＮＲＦ２である。従って、本発明の抗体の作製に使用する免疫原は、ＮＲＦ２をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入し、発現させることにより得ることができる。免疫原として、ＮＲＦ２の一部を有するペプチドを使用する場合には、これらのペプチドをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入し、発現させることにより免疫原を得ることができる。免疫原として、ＮＲＦ２の一部を有するペプチドを使用する場合には、ＮＲＦ２の一部を有するペプチドをそのまま使用することもできるし、１種類または２種類以上のＮＲＦ２の一部を有するペプチドをリンカーを介して結合させて使用することもできる。
【００６９】
ＮＲＦ２またはＮＲＦ２の一部を有するペプチドは、Ｆｍｏｃ法またはＢｏｃ法等を用いて化学合成により作製できることができる。例えば、ＮＲＦ２またはＮＲＦ２の一部を有するペプチドのＣ末端のアミノ酸をポリスチレン担体に固定化し、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）またはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）で保護されたアミノ酸を、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）等の縮合剤を用いて反応させることにより結合させ、洗浄、脱保護の工程を繰り返すことにより、所望のアミノ酸配列を有するペプチドを得ることができる。
【００７０】
また、ＮＲＦ２またはＮＲＦ２の一部を有するペプチドは、自動ペプチド合成機を用いて合成することもできる。このようなペプチド合成機としては、例えば、ＰＳＳＭ−８（島津製作所）；モデル４３３Ａペプチドシンセサイザ（アプライドバイオシステムズ社）；ＡＣＴ３９６Ａｐｅｘ（アドバンストケムテック社）等が挙げられる。
【００７１】
免疫動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット、ニワトリ、アヒル等ハイブリドーマを作製することが可能な動物であれば特に限定はないが、好ましくは、マウスまたはラットであり、より好ましくは、マウスであり、最も好ましくは、ＮＲＦ２ノックアウトマウスである。動物への免疫原の投与は、例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射または足蹠注射により行うことができるが、好ましくは、皮下注射または腹腔内注射である。使用する免疫原の量は、抗体を産生できる量であれば特に限定は無いが、好ましくは、０．１〜１０００μｇであり、より好ましくは、１〜５００μｇであり、より更に好ましくは、１０〜１００μｇである。免疫は、１回または適当な間隔をあけて数回行うことができる。好ましくは、１〜５週間に１回の免疫を合計２〜５回行い、より好ましくは、３週間に１回の免疫を合計３回行う。最後の免疫から１〜２週間後に、免疫した動物の眼窩または尾静脈から採血を行い、その血清を用いて抗体価の測定を行う。抗体価の測定は、当業者周知の方法で行うことができる。例えば、放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）、固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法を挙げることができ、好ましくは、ＥＬＩＳＡ法である。本発明の抗体は、十分な抗体価を示す動物の血清から精製することにより得ることができる。
【００７２】
本発明のモノクローナル抗体は、上記方法により免疫した免疫感作動物から得た抗体産生細胞と、骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）を融合することにより得られるハイブリドーマを培養することにより得ることができる。当該融合方法としては、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ， Ｇ． ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６，１９８１）を挙げることができる。使用する抗体産生細胞は、上記方法により免疫し血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラットの脾臓、膵臓、リンパ節、末梢血より採取することができ、好ましくは、脾臓より採取する。使用する骨髄腫系細胞は、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ラビットまたはヒト等の哺乳動物に由来する細胞であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ で増殖可能な細胞であれば特に限定はない。このような細胞としては、例えば、Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ， ２５６， ４９５， １９７５）、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１（ＮＳ１）（Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ６， ２９２， １９７６）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ８１， １， １９７８）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（６５３）（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １２３， １５４８， １９７９）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／Ｏ）（Ｎａｔｕｒｅ， ２７６， ２６９， １９７８）、Ｓｐ２／Ｏ／ＦＯ−２（ＦＯ−２）（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ３５， １， １９８０）等を挙げることができ、好ましくは、Ｐ３Ｕ１である。
【００７３】
上述の方法に従って得られた抗体産生細胞及び骨髄腫細胞は、培地、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）等で洗浄後、ポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」という）等の細胞凝集性媒体を加え、細胞を融合させる（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， １９８８）。融合させる際の抗体産生細胞及び骨髄腫細胞の比率は、例えば、２：１〜１：２である。細胞融合を行った後、ＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）培地等の培地で培養することにより、ハイブリドーマを選択的に増殖させる。培養後、培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡ等により、抗原タンパク質に結合し、非抗原タンパク質に結合しないサンプルを選択する。当該サンプルを限界希釈法により単一細胞化を行い、安定して高い抗体価を示す細胞を選択する。
【００７４】
モノクローナル抗体は、上述の方法により得られたハイブリドーマをｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、培養液を精製することによって得ることができる。また、本発明のモノクローナル抗体は、予めプリスタンを腹腔内に投与した同系動物または免疫不全動物にハイブリドーマを移植した後、腹水化させ、採取した腹水を精製することによっても得ることができる。モノクローナル抗体の精製は、遠心分離後、プロテインＡカラム、プロテインＧカラム等を用いてＩｇＧ画分を回収することにより得ることができる。抗体のクラスが、ＩｇＹ及びＩｇＭの場合には、メルカプトピリジンをリガンドとしたカラムで精製することができる。また、抗体のクラスによらず、ＮＲＦ２固相化カラム、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー等を用いて精製することもできる。
【００７５】
抗体を治療薬として使用する場合、当該抗体は、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体とすることが好ましい。
ヒト型キメラ抗体は、ＮＲＦ２と結合し、ＮＲＦ２の機能を阻害する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡを調製し、これをヒト由来免疫グロブリンの定常領域ｃＤＮＡと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１， ６８５１−６８５５， １９８４）。
【００７６】
ヒト化抗体は、ＮＲＦ２と結合し、ＮＲＦ２の細胞遊走活性を阻害する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードするアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに移植したＶ領域をコードするＤＮＡを構築し、構築したＤＮＡをヒト由来免疫グロブリンの定常領域ｃＤＮＡと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる（Ｌ． Ｒｉｅｏｈｍａｎｎら， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２， ３２３， １９８８； Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ， Ｃ． Ａ．ら， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．， ４， ７７３−７８３， １９９１； Ｃｌａｒｋ Ｍ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ．， ２１， ３９７−４０２， ２０００参照）。
【００７７】
ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体ファージライブラリーまたはヒト抗体産生トランスジェニックマウスを利用することにより得ることができる（富塚ら， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．， １５， １４６−１５６（１９９７））。ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞由来の様々な配列をもつ抗体遺伝子プールからＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子をファージ遺伝子に導入することにより、ヒト抗体のＦａｂまたはｓｃＦｖ等を融合タンパク質として表面に提示させたファージのライブラリーである。このようなヒト抗体ファージライブラリーとしては、正常なヒトの持つ抗体のＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子を末梢血リンパ球などからＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、ライブラリー化することにより得られたナイーブ・非免疫ライブラリー（ケンブリッジアンチボディテクノロジー社；メディカルリサーチカウンセル；ダイアックス社等）、ヒトＢ細胞内の機能的な特定の抗体遺伝子を選び、Ｖ遺伝子断片のＣＤＲ３領域などの抗原結合領域の部分を適当な長さのランダムなアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドによって置換し、ライブラリー化した合成ライブラリー（バイオインベント社；クルーセル社；モルホシス社）、及び、癌、自己免疫疾患または感染症患者、あるいは、対象抗原をワクチンとして接種した人のリンパ球から作製したライブラリーである、免疫ライブラリーを挙げることができる。
【００７８】
抗体の断片（Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ若しくはこれらの重合体、Ｄｉａｂｏｄｙ、または、ＣＤＲを含むペプチド）は、以下の方法により作製することができる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、本発明のＮＲＦ２に結合するＩｇＧ抗体をタンパク質分解酵素ペプシンで処理し、Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断することにより、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片として得ることができる。また、本発明のＦ（ａｂ’）２断片は、後述のＦａｂ’をチオエーテル結合またはジスルフィド結合させることにより得ることができる。本発明のＦａｂ’断片は、上述の方法により得られた本発明のＮＲＦ２に結合するＦ（ａｂ’）２を還元剤であるジチオスレイトール処理して得ることができる。また、本発明のＦａｂ’断片は、本発明のＮＲＦ２に結合する抗体のＦａｂ’をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。Ｆａｂ断片は、本発明のＮＲＦ２に結合する抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理し、Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断することにより、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分の領域とＬ鎖の全領域がジスルフィド結合により結合された分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片として得ることができる。また、本発明のＦａｂ断片は、本発明のＮＲＦ２に結合する抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。ｓｃＦｖは、本発明のＮＲＦ２に結合する抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、これらの遺伝子の間にリンカー配列をコードするＤＮＡを挿入し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、当該ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。リンカーの長さは、ＶＨとＶＬが会合することができる長さであれば特に限定は無いが、好ましくは１０〜２０残基であり、より好ましくは１５残基である。また、リンカーの配列は、ＶＨとＶＬの二つのドメインのポリペプチド鎖の折りたたみを阻害しないものであれば特に限定は無いが、好ましくは、グリシン及び／またはセリンからなるリンカーであり、より好ましくは、ＧＧＧＧＳ（Ｇ：グリシン、Ｓ：セリン）またはその繰り返し配列である。ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基を部位特異的突然変異によりシステイン残基に置換し、ＶＨ及びＶＬを当該システイン残基間のジスルフィド結合で結合させることにより得ることができる。置換するアミノ酸は、立体構造に基づき抗原結合に影響の無いアミノ酸残基であれば特に限定はない。Ｄｉａｂｏｄｙは、上述のｓｃＦｖをコードするＤＮＡにおいて、リンカーのアミノ酸配列が８残基以下（好ましくは５残基）となるように構築し、当該ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。バイスペシフィックなＤｉａｂｏｄｙは、異なる２種類のｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬのＤＮＡを組み合わせてｓｃＦｖを作製することにより得ることができる。ＣＤＲを含むペプチドは、本発明のＮＲＦ２に結合する抗体のＶＨまたはＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを構築し、当該ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。
【００７９】
本発明の薬剤を医薬として使用する場合、単独で投与しても良いし、他の薬剤と共に投与してもよい。本発明の薬剤と共に使用することができる他の薬剤としては、本発明の治療薬又は予防薬の効果を失わせることの無い薬剤であれば特に限定は無く、好ましくは、癌の治療薬若しくは予防薬であり、例えば、イホスファミド、シクロホスファミド、ダカルバジン、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン、プロカルバジン、メルファラン、ラニムスチン等のアルキル化剤；エノシタビン、カペシタビン、カルモフール、クラドリビン、ゲムシタビン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、テガフール、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、メルカプトプリン、メトトレキサート等の代謝拮抗剤；イリノテカン、エトポシド、ソブゾキサン、ドセタキセル、ノギテカン、パクリタキセル、ビノレルビン、ビンデシン、ビンブラスチン等の植物アルカロイド；アクチノマイシンＤ、アクラルビシン、アムルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ジノスタチンスチマラマー、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ブレオマイシン、ペプロマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン等の抗癌性抗生物質；オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチン等のプラチナ製剤；アナストロゾール、エキセメスタン、エストラムスチン、エチニルエストラジオール、クロルマジノン、ゴセレリン、タモキシフェン、デキサメタゾン、トレミフィン、ビカルタミド、フルタミド、プレドニゾロン、ホスフェストロール、ミトタン、メチルテストステロン、メドロキシプロゲステロン、メピチオスタン、リュープロレリン、レトロゾール等のホルモン剤；インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン、ウベニメクス、乾燥ＢＣＧ、レンチナン等の生物学的応答調節剤；及び、イマチニブ、ゲフィチニブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、タミバロテン、トラスツズマブ、トレチノイン、ボルテゾミブ、リツキシマブ等の分子標的薬等を挙げることができる。
【００８０】
本発明の薬剤の製剤は、患者に投与することができる製剤であれば特に限定は無く、好ましくは、注射剤である。本発明の薬剤の剤形は、例えば、液剤又は凍結乾燥製剤を挙げることができる。本発明の薬剤を注射剤として使用する場合、必要に応じて、プロピレングリコール、エチレンジアミン等の溶解補助剤、リン酸塩等の緩衝材、塩化ナトリウム、グリセリン等の等張化剤、亜硫酸塩等の安定剤、フェノール等の保存剤、リドカイン等の無痛化剤等の添加物（「医薬品添加物事典」薬事日報社、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ」ＡＰｈＡ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ社参照）を加えることができる。また、本発明の治療薬又は予防薬を注射剤として使用する場合、保存容器としては、アンプル、バイアル、プレフィルドシリンジ、ペン型注射器用カートリッジ、及び、点滴用バッグ等を挙げることができる。
【００８１】
本発明の薬剤の投与方法は、所望の治療効果又は予防効果が得られる方法であれば特に限定はなく、好ましくは、血中に投与する。具体的には、例えば、静脈内、冠動脈内等の血管内に投与することができる。本発明の薬剤の投与方法としては、注射又は静脈点滴注射による静脈内投与、筋肉注射による筋肉内投与を挙げることができる。また、本発明の薬剤は、一時的に投与してもよいし、持続的又は断続的に投与してもよい。例えば、本発明の薬剤の投与は、１分間〜２週間の持続投与することもできる。本発明の薬剤の投与方法として、好ましくは、５分間〜１時間の持続投与であり、より好ましくは、５分間〜１５分間の持続投与である。
【００８２】
本発明の薬剤の投与量は、所望の治療効果又は予防効果が得られる投与量であれば特に限定は無く、症状、性別、年齢等により適宜決定することができる。本発明の治療薬又は予防薬の投与量は、例えば、癌の治療効果又は予防効果を指標として決定することができる。本発明の治療薬又は予防薬の投与量として、好ましくは、１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは、１０ｎｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇであり、更に好ましくは、５０ｎｇ／ｋｇ〜５００μｇ／ｋｇであり、より更に好ましくは、５０ｎｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇであり、より更に好ましくは、５０ｎｇ／ｋｇ〜５０μｇ／ｋｇであり、最も好ましくは、５０ｎｇ／ｋｇ〜５μｇ／ｋｇである。
【００８３】
以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００８４】
実施例１．食道癌におけるＮＲＦ２遺伝子変異
食道がんの臨床検体（手術によって切除された標本）及び食道がん細胞株（ＫＹＳＥ−５０、ＫＹＳＥ−７０、ＫＹＳＥ−１８０）からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによってＮＲＦ２遺伝子を増幅した後、シークエンス解析によって配列を決定した。用いたプライマーの配列を表１に示す。各エクソンをＰＣＲにて増幅後、同じプライマーを用いてシークエンス反応を行ない、全自動キャピラリーシークエンサー（ＡＢＩ ３１３０）にてシークエンスを解読した。ＰＣＲの条件は、９４度３０秒、（９４度３０秒、５５度３０秒、７２度９０秒）を３０サイクル、７２度５分間で行った。
【００８５】
【表１】
【００８６】
食道がんの臨床検体及び食道がん細胞株（ＫＹＳＥ−５０、ＫＹＳＥ−７０、ＫＹＳＥ−１８０）におけるＮＲＦ２遺伝子変異の場所及びそれによって起こるアミノ酸置換を図２に示す。本件等の結果、進行した癌（１８／８２、２２％）において、変異が検出され、初期癌においては変異が検出されなかった（０／３６）。
【００８７】
実施例２．正常食道上皮並びに食道がんにおけるＮＲＦ２の発現
正常食道（Ａ及びＢ）並びに食道がん（Ｃ）におけるＮＲＦ２の発現をＮＲＦ２に対する抗体を用いた免疫組織化学染色法により検出した。ホルマリン固定パラフィン包埋した食道がん検体から、３μｍの厚さの標本を作製し、ポリクローナル抗ＮＲＦ２抗体（Ｃ−２０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１００倍希釈）と反応させた後、免疫組織学的手法を用いて発現を可視化した（茶色の染色）。
結果を図３に示す。図中、矢印は発現している細胞を示す。図３Ｂは、図３Ａの一部の拡大図を表す。正常食道上皮では、最下層の基底細胞に限局したＮＲＦ２の発現が認められ、食道がん細胞ではＮＲＦ２の発現上昇が認められた。
【００８８】
実施例３．ＮＲＦ２遺伝子異常と癌患者の生命予後との相関
ＮＲＦ２遺伝子変異を検索した食道がん症例について、手術後の生存日数と遺伝子変異の有無との関係について統計的解析（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ解析）を行なった。
【００８９】
結果を図４に示す。統計値０．００５で、両者の間に有意な相関関係を認めた。すなわち、ＮＲＦ２遺伝子に異常のある癌を有する患者は、遺伝子異常をもたない癌を有する患者に比べて生命予後が悪かった。当該結果は、ＮＲＦ２遺伝子に異常がある患者には手術後の治療を積極的に行なう必要があることを示していると考えられる。
【００９０】
実施例４．ＮＲＦ２に対するｄｓＲＮＡによる癌細胞の増殖抑制効果
ＮＲＦ２遺伝子変異を示す食道癌細胞株（ＫＹＳＥ−５０及びＫＹＳＥ−１８０）に対して、ｄｓＲＮＡによるＮＲＦ２遺伝子発現抑制を行なった。食道がん細胞株を９６ｗｅｌｌプレートに５０００細胞／ｗｅｌｌでまき、コントロールｄｓＲＮＡ（ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ ｐｌｕｓ Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｐｏｏｌ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｄ−００１８１０−１０）又はＮＲＦ２に対するｄｓＲＮＡ（ＮＲＦ２ ｄｓＲＮＡ）（５’−ＵＡＡＡＧＵＧＧＣＵＧＣＵＣＡＧＡＡＵＵＵ−３’（配列番号２０）及び５’−ｐＡＵＵＣＵＧＡＧＣＡＧＣＣＡＣＵＵＵＡＵＵ−３’（配列番号２１））をリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて導入した後、３７度にて培養を行ない、７２時間後に生存細胞数をＮＡＤＨの活性ＭＴＳアッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ）により測定した。
【００９１】
結果を図５に示す。図中、コントロールｄｓＲＮＡの細胞数に対するＮＲＦ２ ｄｓＲＮＡの細胞数の比を示す。ＮＲＦ２遺伝子変異を持つ食道がん細胞株（ＫＹＳＥ−５０及びＫＹＳＥ−１８０）に対して、ｄｓＲＮＡによるＮＲＦ２遺伝子発現抑制を行なうと、コントロールと比較して２６％（ＫＹＳＥ５０）又は３８％（ＫＹＳＥ１８０）の増殖抑制効果を認めた。
【００９２】
実施例５．生物統計解析によるＮＲＦ２活性化と関連する分子経路の同定
ＮＲＦ２の変異による遺伝子発現の変化を調べるため、変異ＮＲＦ２遺伝子を導入した細胞とコントロール細胞との間で発現する遺伝子について発現量を比較し、ＮＲＦ２の変異により変化する遺伝子セットを解析した。具体的には、２種類の変異ＮＲＦ２遺伝子（ＮＲＦ２−ＴＫとＮＲＦ２−ＬＦ）を２９３細胞に導入し、恒常的に変異ＮＲＦ２を発現するクローンを樹立した。樹立細胞とコントロール細胞（ベクターのみを導入した細胞）からＲＮＡを抽出した。０．５ｍｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡをＣｙ３−ＣＴＰで標識後、Ａｇｉｌｅｎｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙを用いて、約３万個の遺伝子について発現量を測定した。
【００９３】
ＮＲＦ２変異株２枚とコントロール細胞２枚のマイクロアレイにおける遺伝子発現をＩＢＭＴ法（Ｓａｒｔｏｒ Ｍ．Ａ， Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ Ｃ．Ｒ．， Ｗｅｓｓｅｌｋａｍｐｅｒ Ｓ．Ｃ．， Ｓｉｖａｇａｎｅｓａｎ Ｓ．， Ｌｅｉｋａｕｆ Ｇ．Ｄ．， Ｍｅｄｖｅｄｏｖｉｃ． Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ−ｂａｓｅｄ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ｂａｙｅｓ ｍｅｔｈｏｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ７：５３８−５４， ２００６）を用いて比較した。同解析により各遺伝子の発現差の有意性を表すｐ値が得られた。得られたｐ値をＢｅｎｊａｍｉｎｉ＆Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ， Ｙ．， ａｎｄ Ｈｏｃｈｂｅｒｇ， Ｙ． （１９９５）． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｎｄ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｅｓｔｉｎｇ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ， ５７， ２８９−３００）を用いて補正し、補正後のｐ値とした。ｐ値が０．０５未満の遺伝子を統計的に有意な遺伝子とし、該当する遺伝子を２２９０個得た。２２９０遺伝子が特定のパスウェイに集中しているかどうかを調べるため、ＢＲＯＡＤ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより公開されている遺伝子セットデータベース（ＭｓｉｇＤＢ，Ｃ２）（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ Ａ， Ｔａｍａｙｏ Ｐ， Ｍｏｏｔｈａ ＶＫ， Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ Ｓ， Ｅｂｅｒｔ ＢＬ， Ｇｉｌｌｅｔｔｅ ＭＡ， Ｐａｕｌｏｖｉｃｈ Ａ， Ｐｏｍｅｒｏｙ ＳＬ， Ｇｏｌｕｂ ＴＲ， Ｌａｎｄｅｒ ＥＳ， Ｍｅｓｉｒｏｖ ＪＰ （２００５）． “Ｇｅｎｅ ｓｅｔ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ： ａ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ”． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １０２ （４３）： １５５４５−５０）に対して、超幾何分布による統計検定を行い（Ｂｏｙｌｅ， Ｅ．Ｉ．， Ｗｅｎｇ， Ｓ．， Ｇｏｌｌｕｂ， Ｊ．， Ｊｉｎ， Ｈ．， Ｂｏｔｓｔｅｉｎ， Ｄ．， Ｃｈｅｒｒｙ， Ｊ．Ｍ．， Ｓｈｅｒｌｏｃｋ， Ｇ． （２００４） ＧＯ：：ＴｅｒｍＦｉｎｄｅｒ−ｏｐｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ａｃｃｅｓｓｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｉｎｄｉｎｇ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｅｎｒｉｃｈｅｄ Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ ｔｅｒｍｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｌｉｓｔ ｏｆ ｇｅｎｅｓ， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０， ３７１０−３７１５）、得られたｐ値を上述のＢｅｎｊａｍｉｎｉ＆Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法で補正した。ｐ値が０．０５を下回る遺伝子セットを統計的有意な遺伝子セットとした。
【００９４】
本実験の結果、統計的有意な遺伝子セットの中からＰＥＮＧ＿ＲＡＰＡＭＹＣＩＮ＿ＤＮを見出した。生物統計学的手法を用いて、ＮＲＦ２遺伝子の活性化によって有意に活性化される分子経路として同定されたもののうち、ＰＥＮＧ＿ＲＡＰＡＭＹＣＩＮ＿ＤＮについてのｐ値を表１に示す。ＰＥＮＧ＿ＲＡＰＡＭＹＣＩＮ＿ＤＮは、ｍＴＯＲ経路の阻害剤であるラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）処理によって発現が減少する分子経路であり、すなわちｍＴＯＲ経路の活性化の指標となる経路である（Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２００２ Ａｕｇ； ２２ （１５）： ５５７５−５５８４）。
【００９５】
【表２】
【００９６】
実施例６．ＮＲＦ２遺伝子異常のある癌細胞の、ｍＴＯＲ阻害剤（ラパマイシン）への反応性
ＮＲＦ２遺伝子に異常のない食道癌細胞株（ＫＹＳＥ−３０、ＫＹＳＥ−１４０、ＫＹＳＥ−１７０、ＫＹＳＥ−２７０）と異常のある食道癌細胞株（ＫＹＳＥ−５０、ＫＹＳＥ−７０、ＫＹＳＥ−１８０）について、ラパマイシン処理による増殖抑制について検討した。７つの食道癌細胞株を、９６ｗｅｌｌプレートに５０００細胞／ｗｅｌｌで播種し、０、１、５、１０ｎＭのラパマイシンを添加して、３７℃で培養を行ない、７２時間後に生存細胞数をＮＡＤＨの活性（ＭＴＳアッセイ， ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ）により測定した。
加えて、ＮＲＦ２遺伝子に異常のない肺癌細胞株（ＳＱ−５、ＱＧ−５６）と異常のある肺癌細胞株（ＬＫ−２、ＥＢＣ−１）、並びにＮＲＦ２遺伝子に異常のない頭頚部癌細胞株（ＨＯ−１−Ｎ−１、ＨＳＣ２）と異常のある頭頚部癌細胞株（ＨＯ−１−ｕ−１）について、ラパマイシン投与による増殖抑制効果を上述の食道癌細胞株と同様の方法により測定した。
【００９７】
結果を図６、７及び８に示す。グラフは、０ｎＭ（薬剤なし）を１００％としたときの、それぞれの濃度における、各細胞株の細胞数の割合の変化を示す。図６に示す通り、ＮＲＦ２遺伝子に異常のあるがん細胞株では有意にラパマイシン処理によって細胞増殖が抑制（コントロールの約７０％に減少）されていた。同様に、図７及び図８に示す通り、ＮＲＦ２遺伝子に異常のある肺癌細胞株及び頭頚部癌細胞株の増殖は、ラパマイシン処理によって、それぞれ、コントロールの６２−７０％及び７０％に抑制されていた。
【００９８】
本出願が優先権を主張する日本国特許庁に２００８年７月２５日に出願された特願２００８−１９２１８６の内容の全てが参照により本願に組み込まれる。同様に、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明の奏効性予測方法は、癌患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への応答性又はｍＴＯＲ関連癌治療薬が当該癌患者に対して効果を奏するか否かを投与前に予測する方法として利用可能である。また、本発明の予後予測方法は、癌患者の予後を予測することにより、当該患者への治療レジメン戦略の策定に重要な情報を与えることができる。更に、本発明のＮＲＦ２遺伝子又はＮＲＦ２タンパク質を阻害する方法又はＮＲＦ２遺伝子又はＮＲＦ２タンパク質阻害剤を備える治療薬は、癌の治療方法又は治療薬として利用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌治療薬の奏効性予測、癌の予後予測、及び癌治療の分野に関するものである。より具体的には、本発明は、ＮＲＦ２の異常を検出することによるｍＴＯＲ関連癌治療薬の奏効性予測方法、ＮＲＦ２の異常を検出することによる癌の予後の予測方法、及びＮＲＦ２遺伝子又はタンパク質を阻害することを特徴とする癌治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの発生や進展においては、喫煙、放射線、ウイルス感染などによる慢性炎症及び有害な化学物質への暴露のような環境因子が影響を与えていることが知られている。中でもそのような因子によって惹起される酸化ストレスは、ＤＮＡやタンパク質に異常を与えることから、がんの発生に深く関わっていることがこれまでの研究から明らかになっている。
【０００３】
生体にはそのような酸化ストレスに対する生理的な防御機構が備わっている。該生理的防御機構の分子機構を担う重要な分子の一つとして、Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ２−ｒｅｌａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２（ＮＲＦ２）という転写因子が知られている。ＮＲＦ２は非常に強い転写誘導能力を持つＤＮＡ結合分子であり、細胞が酸化ストレスに暴露されると活性化され、グルタチオン還元酵素などの酸化ストレスを解除するような多くの酵素群の発現を誘導し、細胞をストレスによる障害から守る。
【０００４】
例えば、ＮＲＦ２は、発癌物質、酸化剤やその他の毒性化合物に対し細胞を保護する遺伝子産物の転写を制御するＤＮＡ調整エレメントである、抗酸化反応エレメント（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ：ＡＲＥ）成分に促進シグナルを伝える重要な転写因子であることが知られている。癌阻害活性を有するＡＲＥを介する促進剤が核のＮＲＦ２レベルを上昇させることが報告されている（非特許文献１参照）。また、ＮＲＦ２のノックアウトマウスにおける、ベンゾ（α）ピランの経口投与モデルにおいては、ワイルドタイプと比較して癌の数が増加していることが示されている（非特許文献２参照）。また、同文献において、抗癌剤オルチプラズがＮＲＦ２の発現を増強すること、及び、ＮＲＦ２のノックアウトマウスにおいてはオルチプラズによる抗癌作用が発揮されないことから、ＮＲＦ２の発現増強が抗癌効果を示すことが示唆されている。
【０００５】
また、ＮＲＦ２は、Ｋｅｌｃｈ−ｌｉｋｅ ＥＣＨ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＫＥＡＰ１）タンパク質によるネガティブフィードバックを受けて、生体内において存在量が調節されていること、及び、ＫＥＡＰ１に対する阻害剤が抗癌剤として開発されていることが報告されている（非特許文献３参照）。このように、ＮＲＦ２又はＫＥＡＰ１を標的として、ＮＲＦ２の発現を増強させる薬剤が抗癌剤として利用されることが期待されている。
【０００６】
一方で、肺癌においてはＫＥＡＰ１遺伝子変異による活性低下により、ＮＲＦ２の恒常的な活性化が見られること、及び、活性化したＮＲＦ２により抗酸化作用を備えるタンパク質の恒常的発現が誘導されることが報告されている。ＮＲＦ２の発現亢進は、癌細胞のシスプラチンへの抵抗性の原因の一つではないかと報告されている（非特許文献４、及び、特許文献１参照）。アルキル化剤であるシスプラチン、メファラン（ｍｅｐｈａｌａｎ）、クロラムブシル及びＢＣＮＵ等の薬剤投与が、ＮＲＦ２等のＡＲＥに制御される遺伝子発現を増加させることが報告されている。ＡＲＥに制御される遺伝子発現産物の増加が癌細胞の抗癌剤への抵抗性に関与している可能性が示唆されている。また、ＮＲＦ２との結合活性を備えるオールトランスレチノイン酸（ａｌｌ ｔｒａｎｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ：ＡＴＲＡ）に化学療法剤の効果を強化する作用がある可能性が示唆されている（特許文献２参照）。
【０００７】
このように、アルキル化剤系抗癌剤の投与によりＮＲＦ２が活性化されることや、アルキル化剤系抗癌剤に対する抵抗性にＮＲＦ２が役割を果たしている可能性が示唆されている。アルキル化剤系抗癌剤は、癌細胞のＤＮＡの塩基同士を架橋することで増殖を停止させるものであるが、アルキル化剤の投与によるＮＲＦ２の活性化のメカニズムについては未だ解明されていない。アルキル化剤系抗癌剤の作用に対するＮＲＦ２による抵抗性獲得のメカニズムの一部は、ＮＲＦ２の細胞保護的な作用から予測されるものの、その全体像については十分解明されていない。また、アルキル化剤系抗癌剤以外の抗癌剤とＮＲＦ２との関係については未だ報告されていない。
【０００８】
上述の通り、癌細胞において見られるＮＲＦ２の活性化は、主にＫＥＡＰ１遺伝子の変異による活性低下に基づくものと考えられている。癌細胞におけるＮＲＦ２の変異と活性化との関係、及び、ＮＲＦ２の変異による活性化と癌の悪性化との関係は知られていなかった。特に、ＮＲＦ２は、酸化ストレス等による癌の発生においては抗癌作用を備えるものと考えられていることから、むしろ癌の悪性化を抑制すると考えられていた。また、化学療法剤との関係においては、ＮＲＦ２がアルキル化剤の投与に応答性があり、少なくともオールトランスレチノイン酸にアルキル化剤の効果を増強させる作用があることが示唆されている。しかし、当該オールトランスレチノイン酸の作用がＮＲＦ２抑制作用に基づくものであるのか、また、そうであればどのようなメカニズムにより抑制するのかは知られていなかった。従って、ＮＲＦ２の抑制とアルキル化剤系抗癌剤以外の抗癌剤との関係は全く未知であった。
【０００９】
ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ（ｍＴＯＲ）は、マクロライド系抗生物質であるラパマイシンの標的分子として同定されたセリン・スレオニンキナーゼであり、細胞成長、細胞増殖、細胞死、細胞の生存、タンパク質合成、及び、転写における調節因子としての役割をはたしている。ラパマイシンがｐ５３の機能を欠く癌細胞のアポトーシスを誘導することから、ｍＴＯＲ阻害剤は抗癌作用があると考えられている（非特許文献５参照）。また、ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、腎癌、膵管癌などの抗癌剤として開発されている。
【００１０】
ｍＴＯＲは、インスリンレセプターチロシンキナーゼとしても知られている。高血糖患者における脳血管内皮細胞のアポトーシスに関する研究において、ｍＴＯＲ阻害剤は、インスリン誘導性のＮＲＦ２を介したグルタミン−Ｌ−システイン リガーゼ触媒サブユニット（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎ ｌｉｇａｓｅ−ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｓｕｂｕｎｉｔ：ＧＣＬｃ）の発現、酸化還元バランス、及びヒト脳血管内皮細胞の生存を損なわせることが報告されている（非特許文献６）。しかし、特に癌治療の分野において、ｍＴＯＲ阻害剤の作用に対するＮＲＦ２の発現の影響については未だ報告されていない。
【特許文献１】国際出願公開パンフレットＷＯ２００６／１２８０４１
【特許文献２】国際出願公開パンフレットＷＯ２００８／０１２５３４
【非特許文献１】Ｙｕｅｓｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ３ （７） ８８５−８９３， ２００４
【非特許文献２】Ｒａｍｏｓ−Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９８， ３４１０−３４１５， ２００１
【非特許文献３】Ｅｗａｎ， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ， １０ （１４） ９５０−９５１， ２００５
【非特許文献４】Ｏｈｔａ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ６８， １３０３−１３０９， ２００８
【非特許文献５】Ｓｈｉｌｅ Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ， １１， １４９１−１５０１， ２００３
【非特許文献６】Ｏｋｏｕｃｈｉ， Ｍａｓａｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｎｅｕｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ３ （４） ２４９−２６１， ２００６
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、ＮＲＦ２遺伝子の変異を検出することによる、癌の予測方法に関する。特に、本発明は、ＮＲＦ２遺伝子の変異を検出することによる、ｍＴＯＲ関連癌治療薬の奏効性を予測する方法、奏効性のある患者の選択方法、又は、癌の予後の予測方法に関する。また、本発明は、ＮＲＦ２遺伝子又はＮＲＦ２タンパク質を阻害することによる癌の治療方法、あるいは、ＮＲＦ２遺伝子又はＮＲＦ２タンパク質阻害剤を有効成分とする癌治療剤に関する。
【００１２】
具体的態様としては、本発明は、ＮＲＦ２遺伝子又はタンパク質の変異を検出することによるｍＴＯＲ関連癌治療薬の奏効性予測又は奏効性のある患者の選択方法に関する情報を提供することに関する。また、本発明は、ＮＲＦ２遺伝子又はタンパク質の変異を検出することによる、ｍＴＯＲ関連癌治療薬の奏効性を予測する方法、又は、奏効性のある患者を選択する方法に関する。具体的には、ＮＲＦ２遺伝子又はタンパク質に変異がある場合、ｍＴＯＲ関連癌治療薬が効果を奏すると予測する方法に関する。また、本発明は、ｍＴＯＲ関連癌治療薬の奏効性を予測するための、ＮＲＦ２の変異を検出可能なキットに関する。例えば、本発明は、ＮＲＦ２遺伝子の変異を検出可能な、ＮＲＦ２遺伝子と結合可能な核酸又はＮＲＦ２タンパク質と結合可能な物質（例えば、抗体等）を備えるキットである。または、本発明は、変異によるＮＲＦ２の機能変化を測定することが可能なキットである。例えば、ＫＥＡＰ１によるＮＲＦ２の分解を検出するキットも本発明の対象である。
【００１３】
別の態様において、本発明は、癌患者の癌組織細胞中におけるＮＲＦ２の変異を検出することによる、癌の悪性度又は予後の良否に関する情報を提供する方法に関する。また、本発明は、癌患者の癌組織細胞中におけるＮＲＦ２の変異を検出し、ＮＲＦ２に変異がある患者について、癌が悪性であると診断し又は予後が不良であると予測する、癌患者の癌組織細胞中におけるＮＲＦ２の変異を検出することによる、癌の悪性度の診断方法又は予後予測方法に関する。また、本発明は、癌の診断又は予後を予測するための、ＮＲＦ２の変異を検出可能なキットに関する。例えば、本発明は、ＮＲＦ２遺伝子の変異を検出可能な、ＮＲＦ２遺伝子と結合する核酸又はＮＲＦ２タンパクと結合可能な物質（例えば、抗体等）を備えるキットに関する。また、本発明は、ＰＣＲ等の遺伝子増幅技術を用いることにより変異を測定可能なキットに関する。更に、本発明は、インベーダープローブ、アレルプローブ、三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素、及び、消光プローブを備える蛍光標識ユニバーサルプローブを備えるキット（例えば、インベーダー（登録商標）アッセイキット等）に関する。また、本発明は、変異によるＮＲＦ２の機能変化を測定することが可能なキットが含まれる。例えば、本発明は、ＫＥＡＰ１によるＮＲＦ２の分解を検出するキットに関する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、ＮＲＦ２遺伝子又はＮＲＦ２タンパク質を阻害することによる癌の治療方法に関する。本発明は、ＮＲＦ２遺伝子の発現を抑制することによる癌の治療方法を含む。また、本発明は、ＮＲＦ２タンパク質の発現又は活性を抑制することによる癌の治療方法に関する。また、本発明は、ＮＲＦ２遺伝子又はＮＲＦ２タンパク質の阻害剤を含有する癌治療薬に関する。具体的には、本発明は、ＮＲＦ２に対する、アンチセンス、ｄｓＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、ＮＲＦ２結合タンパク質断片、又は、抗体若しくはその断片を有効成分として含有する癌の治療剤に関する。
【００１５】
より具体的には、本発明は以下の発明に関する。
（１） 癌患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応を予測するための情報を得る方法であって：
（ａ）該患者由来の試料中の、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質を検出すること；及び、
（ｂ）測定された変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルと該患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応との関連付けをすることを含む方法。
（２） 患者由来の腫瘍サンプルから、患者の癌のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応を予測するための情報を得る方法であって：
（ａ）該患者由来の試料中の変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質を検出すること；
（ｂ）変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質の発現レベルから、癌反応クラスのうち一つのクラスに分類すること、ここで、当該分類結果は変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質の発現レベルにより決定されるものである；及び
（ｃ）当該癌反応クラスの一つに属する癌に特異的な既知の性質から当該患者の当該癌の癌治療薬への反応を予測することを含む方法。
（３） 変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２のタンパク質の発現レベルが高い場合、該患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性が高いことを示す、（２）に記載の方法。
（４） 以下の（ｉ）〜（ｉｖ）に記載の物質のうち少なくとも１つを備える、癌患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性予測キット；
（ｉ）ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡと結合し、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡと結合しない物質、
（ｉｉ）ＮＲＦ２遺伝子と結合せず、変異型ＮＲＦ２遺伝子と結合する物質、
（ｉｉｉ）ＮＲＦ２タンパク質と結合し、変異型ＮＲＦ２タンパク質と結合しない物質、
（ｉｖ）ＮＲＦ２タンパク質と結合せず、変異型ＮＲＦ２タンパク質と結合する物質。
（５） 癌患者の予後を予測するための情報を得る方法であって：
（ａ）該患者由来の試料中の変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質を検出すること；及び、
（ｂ）測定された変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルと該患者の予後との関連付けをすることを含む方法。
（６） 変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルが高い場合、該患者の予後が不良であることを示す、（５）に記載の方法。
（７） ＮＲＦ２阻害剤を有効成分として含有する癌治療薬。
（８） ＮＲＦ２阻害剤が、アンチセンス、ｄｓＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、ＮＲＦ２結合タンパク質断片、又は、抗体若しくはその断片である、（６）に記載の癌治療薬。
【００１６】
本発明の奏効性予測方法は、癌患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への応答性又はｍＴＯＲ関連癌治療薬が当該癌患者に対して効果を奏するか否かを投与前に予測することができる。よって、本発明は、癌患者に対して奏効性の期待される治療薬を選択することを可能とすると共に、奏効性の期待されない患者への不要な癌治療薬投与を避けることにより、これらの患者を不要な副作用の苦痛等から解放することができる。本発明の方法は、癌治療薬選択のための情報を提供することができる。また、本発明は、癌患者の予後を予測することにより、当該患者への治療レジメン戦略の策定に重要な情報を与えることができる。更に、本発明のＮＲＦ２遺伝子又はＮＲＦ２タンパク質を阻害する方法又はＮＲＦ２遺伝子又はＮＲＦ２タンパク質阻害剤を備える治療薬は、新しい癌の治療方法又は治療薬として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ｍＴＯＲに関連する経路を示す図である。
【図２】食道がんの臨床検体及び食道がん細胞株（ＫＹＳＥ−５０、ＫＹＳＥ−７０、ＫＹＳＥ−１８０）におけるＮＲＦ２遺伝子変異の場所及びそれによって起こるアミノ酸置換を示す図である。
【図３】正常食道（Ａ及びＢ）並びに食道がん（Ｃ）におけるＮＲＦ２の発現をＮＲＦ２に対する抗体を用いた免疫組織化学染色法により検出した結果を示す。図中、矢印はＮＲＦ２を発現している細胞を示す。図３Ｂは、図３Ａの一部の拡大図を表す。
【図４】ＮＲＦ２遺伝子変異を検索した食道がん症例について、手術後の生存日数と遺伝子変異の有無との関係について統計的解析（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ解析）を行なった結果を示す。図中、縦軸は累積生存率を示し、横軸は、手術日からの経過日数を示す。
【図５】ＮＲＦ２遺伝子変異を示す食道癌細胞株（ＫＹＳＥ−５０及びＫＹＳＥ−１８０）に対する、ｄｓＲＮＡ投与／非投与における細胞増殖変化を示す図である。図中、縦軸は、コントロールｄｓＲＮＡを投与された細胞の細胞数に対するＮＲＦ２ ｄｓＲＮＡを投与された細胞の細胞数の比を示す。
【図６】ＮＲＦ２遺伝子に異常のない癌細胞株（ＫＹＳＥ−３０、ＫＹＳＥ−１４０、ＫＹＳＥ−１７０、ＫＹＳＥ−２７０）と異常のある細胞株（ＫＹＳＥ−５０、ＫＹＳＥ−７０、ＫＹＳＥ−１８０）について、ラパマイシン処理による増殖変化を示す図である。図中、縦軸は、０ｎＭ（薬剤なし）を１００％としたときの、各細胞株の細胞数の割合を示す。図中、横軸はラパマイシンの投与量を示す。
【図７】ＮＲＦ２遺伝子に異常のない癌細胞株（ＳＱ−５、ＱＧ−５６）と異常のある細胞株（ＫＹＳＥ−５０、ＫＹＳＥ−７０、ＫＹＳＥ−１８０）について、ラパマイシン処理による増殖変化を示す図である。図中、縦軸は、０ｎＭ（薬剤なし）を１００％としたときの、それぞれの濃度における、各細胞株の細胞数の割合の変化を示す。また、図中、横軸はラパマイシンの投与量を示す。
【図８】ＮＲＦ２遺伝子に異常のない癌細胞株（ＨＯ−１−Ｎ−１、ＨＳＣ２）と異常のある細胞株（ＬＫ−２、ＥＢＣ−１）について、ラパマイシン処理による増殖変化を示す図である。図中、縦軸は、０ｎＭ（薬剤なし）を１００％としたときの、それぞれの濃度における、各細胞株の細胞数の割合の変化を示す。また、図中、横軸はラパマイシンの投与量を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
Ａ．ｍＴＯＲ関連癌治療薬の予測
一の態様において、本発明は癌患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測する方法又はキットに関し、又は癌患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測するための情報を得る方法に関する。
本明細書において、「ｍＴＯＲ関連癌治療薬」とは、ｍＴＯＲ又はその上流若しくは下流の経路に関与する物質の発現又は活性を阻害し、癌治療の効果を奏する物質であれば特に限定されるものではない。ｍＴＯＲ関連癌治療薬は、ｍＴＯＲを直接阻害する物質（ｍＴＯＲ阻害剤）、例えば、シロリムス（ラパマイシンとしも呼ばれる）、エベロリムス、テムシロリムス、及びデフェロリムス等の化学療法剤；抗体等のタンパク質；抗体断片等のペプチド；アプタマー、アンチセンス、ｄｓＲＮＡ等の核酸を含む。また、ＮＲＦ２阻害剤はｍＴＯＲ経路を阻害することから、本発明のＮＲＦ２阻害剤もｍＴＯＲ阻害剤に含まれ得る。また、ｍＴＯＲ経路は、図１に示すとおり複数の経路に関与することが知られているが、本明細書におけるｍＴＯＲ関連癌治療薬が標的とするｍＴＯＲ経路に関与する物質の中で特に好ましい物質としては、例えば、Ｉ型ホスホイノシチド３−キナーゼ（以下、「ＰＩ３Ｋ」という）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ１（以下、「ＰＤＫ１」という）、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２）、Ａｋｔ（プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）とも呼ばれる）、ｐ７０リボソーマルプロテインＳ６キナーゼ１（以下、「Ｓ６Ｋ１」という）、ｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（以下、「ＪＮＫ」という）及び低酸素誘導因子１α（以下、「ＨＩＦ１α」という）を挙げることができる。よって、ＴＧ１００１１５、ＴＣＮ−Ｐ、ＬＹ２９４００２、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ、ＢＦＺ２３５及びＳＦ１１２６等のＰＩ３Ｋ阻害剤；ＵＣＮ−０１、ＢＸ９１２、Ｂ−３０１２及びＯＳＵ０３０３１３等のＰＤＫ１阻害剤；ＡＰ１９０３及びタクロリムス等のＦＫＢＰ１２阻害剤；ＸＬ４１８、ＬＹ２９４００２、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ、ＴＣＮ−Ｐ、ＢＶ−１７０１−１、ＦＰＡ−１２４、ＫＰ３７２−１、ＧＳＫ６９０６９３等のＡｋｔ阻害剤；ＸＬ４１８及びＨ−８９等のＳ６Ｋ１阻害剤；ＡＭ１１１、ＳＰ６００１２５、米国特許第７１９９１２４号記載の化合物及びＡＳ６０１２４５等のＪＮＫ阻害剤；並びに、ＰＸ４７８及びＳＦ１１２６等のＨＩＦ１α阻害剤も、本明細書におけるｍＴＯＲ関連癌治療薬に含まれる。
【００１９】
本明細書において、「ｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性」とは、癌患者がｍＴＯＲ関連癌治療薬の投与を受けた場合に、当該ｍＴＯＲ関連癌治療薬の投与により癌患者の病状を表す指標のうち少なくとも１の指標が受ける影響のことである。このような指標としては、例えば、腫瘍の縮小、腫瘍増殖の抑制、転移、予後の良否、回帰、又は、再発等を含む。本明細書において、「ｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性が良い」とは、ｍＴＯＲ関連癌治療薬の投与を受けた癌患者の病状を表す該指標のうち少なくとも１の指標が、ｍＴＯＲ関連癌治療薬の投与を受けない場合と比較して効果を示すことを意味し、例えば、腫瘍が縮小し、腫瘍増殖が抑制され、転移が抑制され又は転移せず、予後が改善され、回帰せず、又は、再発しないこと等を含む。
【００２０】
本明細書において、「変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ」とは、正常なＮＲＦ２をコードするヌクレオチド又はリボヌクレオチド配列の一部に変異のあるＤＮＡ又はＲＮＡのことであり、例えば、配列番号１の配列の一部に変異のあるＤＮＡである。本明細書において「変異型ＮＲＦ２タンパク質」とは、正常なＮＲＦ２を構成するアミノ酸配列（配列番号２）の一部に変異のあるタンパク質のことである。特には、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又は変異型ＮＲＦ２タンパク質は、当該変異によりＮＲＦ２タンパク質の発現レベルが亢進されるような変異を備える変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はタンパク質である。より具体的な態様において、変異型ＮＲＦ２タンパク質は、ＮＲＦ２タンパク質の２４番目のトリプトファンがシステイン又はリシンに変換され、２６番目のグルタミンがグルタミン酸に変換され、２８番目のイソロイシンがグリシンに変換され、３０番目のロイシンがフェニルアラニンに変換され、３１番目のグリシンがアラニンに変換され、７５番目のグルタミンがヒスチジンに変換され、７７番目のアスパラギン酸がバリン又はグリシンに変換され、７９番目のグルタミン酸がリシンに変換され、８０番目のトレオニンがリシン又はプロリンに変換され、並びに／あるいは、８２番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に変換されたタンパク質を含む。また、変異型ＮＲＦ２遺伝子は、ＮＲＦ２タンパク質の２４番目のトリプトファンがシステイン又はリシンに変換され、２６番目のグルタミンがグルタミン酸に変換され、２８番目のイソロイシンがグリシンに変換され、３０番目のロイシンがフェニルアラニンに変換され、３１番目のグリシンがアラニンに変換され、７５番目のグルタミンがヒスチジンに変換され、７７番目のアスパラギン酸がバリン又はグリシンに変換され、７９番目のグルタミン酸がリシンに変換され、８０番目のトレオニンがリシン又はプロリンに変換され、並びに／あるいは、８２番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に変換されたタンパク質をコードする遺伝子を含む。変異型ＮＲＦをコードするＤＮＡ又はＲＮＡのレベルとは、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡレベルを測定可能な手法により測定されたレベルのことであり、例えば、サザンブロット法、ノーザンブロット法、ＡＳＯ法等のハイブリダイゼーションを利用した方法、又は、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＡＲＭＳ法及びダイレクトゲルアッセイ法等のＰＣＲを利用した方法により測定されたレベル、あるいは、各測定方法に適したソフトウェアにより計算された値として与えられるレベルを含む。
【００２１】
本明細書において、患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を判定するために、測定された変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質の発現レベルと患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性との関係において用いられる「関連付けをする」という用語は、被験者における変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質の存在又はレベルを、ｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性が不良であった患者又はｍＴＯＲ抗癌剤への反応性が不良であろうことが知られている患者、あるいは、ｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性が不良ではなかった患者又はｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性が不良ではないと信じられている患者における変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質の発現レベルと比較することを意味する。比較対象となる患者における変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルは、例えば、本発明の開示により、又は、既にｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性が判明している患者由来の試料における変異型ＮＲＦ２遺伝子又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルを測定することにより、あるいは、他のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性指標による評価と組み合わせて評価することにより知ることができる。変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルを利用して、患者がｍＴＯＲ関連癌治療薬に反応する可能性を判定することができる。変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルとｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性との関連付けは、統計的分析により行うことができる。統計学的有意性は、２以上の集団を比較し、信頼区間及び／又はｐ値を決定することにより決定される（Ｄｏｗｄｙ ａｎｄ Ｗｅａｒｄｅｎ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｅｌｙ＆Ｓｏｎｓ， ＮｅｗＹｏｒｄ，１９８３）。本発明の信頼区間は、例えば、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又は９９．９９％であってもよい。また、本発明のｐ値は、例えば、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００２又は０．０００１であってもよい。
【００２２】
好ましくは、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質は、その存在／不存在により患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性と関連付けることができる。また、別の例として、患者由来の試料における変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルは、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質についてｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性の指標として設定した閾値レベルと比較することにより、該患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性と関連付けてもよい。このような閾値レベルは、例えば、感度が、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は、９８％以上となるように設定することができる。また、閾値レベルは、特異度が、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は、９８％以上となるように設定することができる。
【００２３】
ｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性の判定は、それによりｍＴＯＲ関連癌治療薬投与による患者の状態の経過又は転帰を予測する方法を意味し、当該投与による患者の状態の経過又は転帰を１００％の正確さで予測可能であることを意味するものではない。ｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性の判定は、当該抗癌剤の投与により、ある経過又は転帰が起こる可能性が増大しているか否かを意味するものであり、当該経過又は転帰が起こらない場合を基準として起こりやすいことを意味するものではない。即ち、ｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性の判定結果は、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルが上昇又は減少している患者において、そのような特徴を示さない患者に比較して、ｍＴＯＲ関連癌治療薬投与より特定の経過又は転帰がより生じやすいということを意味する。
【００２４】
本明細書において、「癌反応クラス」とは、類似した性質を備える癌のグループのことであり、特には、特定の遺伝子発現において類似した発現パターンを示すか、又は、類似した臨床上の症状を示す癌のグループのことである。ある癌反応クラスに属するメンバーは、ｍＴＯＲ関連癌治療薬に対して同等の又は類似した反応性を示す。当該反応クラスに属するメンバーの遺伝子発現又は臨床上の症状は、当該反応クラスに属さないメンバーの遺伝子発現又は臨床上の症状と異なっており、それらが区別可能であることが好ましい。このような遺伝子発現としては、好ましくは変異型ＮＲＦ２遺伝子の発現である。癌反応クラスは、「ｍＴＯＲへの反応性が高い」及び「ｍＴＯＲへの反応性が低い」の少なくとも２のクラスを含むことができ、また、それ以上の数のクラスを含んでいてもよい。
【００２５】
本明細書において、「癌反応クラスのうち一つのクラスに分類する」とは、癌患者由来の試料における変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルに応じて当該癌患者をグループ分けすることを意味する。レベルは通常、発現量などのＤＮＡ，ＲＮＡ又はタンパク質の量を意味するが、変異の数または程度などの変異のレベルを意味してもよい。当該グループ分けは、絶対的又は相対的な指標により振り分けることができる。例えば、対象患者の変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルから、当該患者を予め決められた変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルのグループに振り分けることにより行ってもよい。あるいは、対象患者を含む不特定の患者群における変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質の発現レベルを測定した上で、相対的なレベルの差から、患者を２以上のグループに分けてもよい。また、クラス分けは、健常人における変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルとの差の程度を指標として行ってもよい。好ましくは、比較した場合に変異型ＮＲＦをコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルが高いほどｍＴＯＲへの反応性が高いクラスに分類される。
【００２６】
一の態様において、本発明のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測するための方法又はキットは、核酸分子を用いた公知の方法に基づくことができる。このような方法としては、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットハイブリダイゼーション、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ＤＮＡマイクロアレイ、ＡＳＯ法等を挙げることができる。本予測キットによる分析は、定性的、定量的または半定量的に行うことができる。
【００２７】
具体的には、本発明のｍＴＯＲ関連癌治療薬への癌患者の反応性予測方法は、例えば、以下の工程により行うことができる：
（ａ）患者由来の試料を調整する工程；
（ｂ）少なくとも１つの核酸に該試料を接触させる工程、ここで、該核酸は、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）から選択される：
（ｉ）正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡに特異的に結合し、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡに結合しない核酸、及び、正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ及び変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡに結合する核酸、
（ｉｉ）正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡに結合せず、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡに特異的に結合する核酸；
（ｃ）該ＤＮＡ又は該ＲＮＡの該核酸への結合を検出して変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのレベルを測定する工程；並びに、
（ｄ）変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのレベルから癌患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測する工程、ここで、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡの存在若しくは増加が該患者のｍＴＯＲへの反応性が高いことを示す。
【００２８】
一の態様において、本発明のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測するためのキットは、特定の遺伝子（例えば、正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ、あるいはその両方）と特異的に結合する核酸を含む核酸分子を使用する公知の方法に基づくことができる。具体的には本発明のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測するためのキットは、（ｉ）〜（ｉｖ）から選択される少なくとも一つの物質を含む。
（ｉ）ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡと結合し、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡと結合しない物質、
（ｉｉ）ＮＲＦ２遺伝子とは結合せず、変異型ＮＲＦ２遺伝子と結合する物質
（ｉｉｉ）ＮＲＦ２タンパク質と結合し、変異型ＮＲＦ２タンパク質と結合しない物質、及び、
（ｉｖ）ＮＲＦ２タンパク質と結合せず、変異型ＮＲＦ２タンパク質と結合する物質。
当該キットに使用する核酸は、化学合成により、又は、所望の核酸を含む遺伝子を生体材料から調整し、所望の核酸を増幅するよう設計したプライマーを用いて増幅することにより、得ることができる。
【００２９】
一の態様において、本発明の方法又はキットは、ＰＣＲを用いた公知の方法に基づくことができる。このような方法としては、例えば、ＡＲＭＳ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）法、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰＣＲ）法、Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法を挙げることができる。また、増幅された核酸は、ドット・ブロット・ハイブリダイゼーション法、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、Ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＴ−ＰＣＲ法、ＰＣＲ−ＳＳＯ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）法、ＰＣＲ−ＳＳＰ法、ＡＭＰＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、ＭＶＲ−ＰＣＲ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法により］検出してもよい。本予測キットによる分析は、定性的、定量的または半定量的に行うことができる。
【００３０】
具体的には、本発明のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測するための方法は、例えば、以下の工程により行うことができる：
（ａ）患者由来の試料を調整する工程；
（ｂ）正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ、及び変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡから選択される少なくとも１の核酸を増幅させる工程：
（ｃ）核酸の増幅量を検出し、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのレベルを測定する工程；並びに、
（ｄ）変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのレベルから癌患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測する工程、ここで、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡの存在若しくは増加は、該患者のｍＴＯＲへの反応性が高いことを示す。
【００３１】
ＰＣＲを使用する公知の方法に基づく本発明のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測するためのキットは、特定の遺伝子（例えば、ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ、あるいはその両方）の一部と特異的に結合するプライマーを含む。本キットに使用するプライマーは、本明細書の開示及び公知の情報を基に、当業者周知の方法により適宜設計し、化学合成により得ることができる。
【００３２】
更に、別の態様において、本発明のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測する方法は、例えば、インベーダー（登録商標）法として知られる方法（例えば、Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．：“Ｃｌｉｎｉｃａｌ，ｇｅｎｅｔｉｃ，ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｖａｄｅｒ ａｓｓａｙ．”Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．４：３５３−３６４，１９９９参照）を用いて行うことができる。
例えば、本発明のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測する方法は、本明細書の記載によれば、以下の工程により行うことができる：
（ａ）患者由来の試料を調整する工程；
（ｂ）以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載の核酸に該試料を接触させて、アレルプローブと相補的なＤＮＡに三重鎖を形成させる工程：
（ｉ）正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡの一部と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列（フラップ）を備えるアレル特異的プローブ、並びに／又は、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡの一部と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列（フラップ）を備えるアレル特異的プローブ、
（ｉｉ）正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡ及び／又は変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡの一部と相補的な配列を備えるインベーダープローブ；
（ｃ）（ｂ）により得られた核酸試料に、三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素を接触させて三重鎖を形成した核酸からフラップを遊離させる工程；
（ｄ）遊離されたフラップを、それぞれ当該フラップと相補的な配列及び消光プローブを備える蛍光標識ユニバーサルプローブと接触させる工程；
（ｅ）（ｄ）により得られた核酸試料に、三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素を接触させて蛍光標識を遊離させ、蛍光を発色させる工程；並びに、
（ｆ）発色した蛍光を検出することにより、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡのレベルを測定する工程、ここで、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡの存在若しくは増加が該患者のｍＴＯＲへの反応性が高いことを示す。
【００３３】
一の態様において、本明細書のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測するためのキットは、上記インベーダー（登録商標）法に適したキットとすることができる。たとえば、本発明のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測するためのキットは、正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡの一部と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列（フラップ）を備えるアレル特異的プローブ、及び／又は、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡの一部と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列（フラップ）を備えるアレル特異的プローブ、正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又は／及び変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡの一部と相補的な配列を備えるインベーダープローブ、三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素、及び、消光プローブを備える蛍光標識ユニバーサルプローブを備えることができる。上記フラップは、各アレル特異的プローブ間で異なっていることが好ましい。上記蛍光標識は、当業者周知のプローブを適宜選択することができ、各蛍光標識ユニバーサルプローブ間で異なっていることが好ましい。例えば、蛍光標識として、ＦＡＭ及びＶＩＣを使用することができる。
【００３４】
上述の本発明のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測するためのキットに含まれるプローブは、本明細書の開示及び公知の情報を基に、当業者周知の方法により適宜設計し、化学合成により、又は、所望の核酸を含む遺伝子を生体材料から調整し、所望の核酸を増幅するよう設計したプライマーを用いて増幅することにより、得ることができる。また、本明細書に記載の予測キットに含まれる三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素は、市販のもの（例えば、Ｃｌｅａｖａｓｅ、株式会社サードウェーブジャパン）を使用することができる。
【００３５】
別の態様において、ｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測するための方法又はキットは、抗体分子を用いた公知の方法に基づくことができる。このような方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｃａｔｔｙ， Ｒａｙｋｕｎｄａｌｉａ， １９８９）、ラジオイムノアッセイ（Ｃａｔｔｙ， Ｍｕｒｐｈｙ， １９８９）、免疫組織化学的方法（Ｈｅｉｄｅｒら、１９９３）、または、ウエスタンブロット等を挙げることができる。
【００３６】
また、別の態様において、 本発明のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測するための方法は、以下の工程を含むことができる：
（ａ）該患者由来の試料を調整する工程；
（ｂ）少なくとも１つの抗体に該試料を接触させる工程、ここで、該抗体は、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）から選択される：
（ｉ）ＮＲＦ２タンパク質に特異的に結合し、変異型ＮＲＦ２タンパク質に結合しない抗体、及び、ＮＲＦ２タンパク質及び変異型ＮＲＦ２タンパク質に結合する抗体、
（ｉｉ）ＮＲＦ２タンパク質に結合せず、変異型ＮＲＦ２タンパク質に特異的に結合する抗体；
（ｃ）該タンパク質の該抗体への結合を検出して変異型ＮＲＦ２タンパク質の発現レベルを測定する工程；
（ｄ）変異型ＮＲＦ２タンパク質の発現レベルから癌患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測する工程、ここで、変異型ＮＲＦ２タンパク質の発現若しくは発現上昇が患者のｍＴＯＲへの反応性が高いことを示す。
【００３７】
本発明のキットは、特定のタンパク質（例えば、ＮＲＦ２タンパク質、変異型ＮＲＦ２タンパク質、又は、その両方）と特異的に結合する抗体又はその断片を含む。目的のタンパク質と結合する限りその構造、当該抗体又はその断片の大きさ、イムノグロブリンクラス、由来等は問わない。また、本発明のキットが包含する抗体又はその断片は、モノクローナルであってもよいし、ポリクローナルであってもよい。抗体の断片とは、抗体の一部分（部分断片）又は抗体の一部分を含むペプチドであって、抗体の抗原への結合作用を保持するもののことである。このような抗体の断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）若しくはこれらの重合体、二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、又は、ＣＤＲを含むペプチドを挙げることができる。ここで、ＣＤＲとは、Ｋａｂａｔら（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”， Ｋａｂａｔ， Ｅ．ら， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ ｓｅｒｖｉｃｅｓ， １９８３）又はＣｈｏｔｈｉａら（Ｃｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９６， ９０１−９１７， １９８７）の定義によるものである。また、本発明のキットは、包含する抗体又はその断片のアミノ酸配列をコードする単離された核酸、当該核酸を包含するベクター、当該ベクターを保有する細胞を含んでいてもよい。
【００３８】
抗体は、当業者によく知られた方法により得ることができる。例えば、目的のタンパク質の全部若しくはその一部を有するポリペプチド、又は、それらをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクター等を調製しこれを抗原とする。この抗原を用いて動物を免疫後、免疫した動物から得られた免疫細胞と、ミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物から抗体を採取する。最後に採取した抗体を、抗原として用いたＮＲＦ２タンパク質又は変異型ＮＲＦ２タンパク質あるいはその一部に一致するポリペプチドを利用した抗原特異精製を行うことによりＮＲＦ２タンパク質又は変異型ＮＲＦ２タンパク質に対するモノクローナル抗体を得ることができる。また、ポリクローナル抗体を作成する場合、上記と同様の抗原を動物に免疫し、免疫した動物から血液を採取し、この血液から血清を分離し、この血清に対して上記抗原を利用した抗原特異精製を行うことにより得ることができる。得られた抗体を酵素処理又は得られた抗体の配列情報を利用することにより、抗体の断片を得ることができる。
【００３９】
抗体又はその断片への標識の結合は当分野において一般的な方法により行うことができる。例えば、タンパク質又はペプチドを蛍光標識する場合、タンパク質又はペプチドをリン酸緩衝液で洗浄した後、ＤＭＳＯ、緩衝液等で調整した色素を加え、混合した後室温で１０分間静置することにより結合させることができる。また、市販の標識キットとして、ビオチン標識キット（Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、アルカリフォスファターゼ標識用キット（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、ペルオキシダーゼ標識キット（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｒｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｒｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２：株式会社同仁化学研究所）、フィコビリプロテイン標識キット（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ、Ｂ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｂ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ、Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、蛍光標識キット（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ５５５ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２：株式会社同仁化学研究所）、ＤｙＬｉｇｈｔ５４７、ＤｙＬｉｇｈｔ６４７（テクノケミカル株式会社）、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）抗体標識キット、Ｑｄｏｔ（登録商標）抗体標識キット（インビトロゲン社）、ＥＺ−Ｌａｂｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（フナコシ株式会社）等を用いて標識することもできる。また、標識した抗体又はその断片の検出は、適宜標識に適した機器を使用することにより行うことができる。
【００４０】
本明細書に記載の予測方法及び予測キットに使用する検体としては、例えば、生検として被験者から採取した組織試料または液体を使用することができる。使用される生検は、本発明の免疫学的測定の対象となるものであれば特に限定はなく、例えば、組織、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、漿液、髄液、関節液、眼房水、涙液、唾液またはそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができ、好ましくは組織（特には癌組織）である。本発明のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測する方法において、対象となる癌の種類は特に限定されないが、好ましくは固形癌であり、例えば、肺癌、頭頚部癌、食道癌、子宮頚癌、胆道癌、乳癌、悪性黒色腫を挙げることができる。本予測キットによる分析は、定性的、定量的または半定量的に行うことができる。
【００４１】
Ｂ．癌の予後予測
別の態様において、本発明は癌患者の予後予測のための方法又はキット、あるいは癌患者の予後を予測する情報を得る方法に関する。本発明において、予後の予測は、癌の結末として、再発、転移又は特に患者が死亡するリスクを決定することであってもよい。
本明細書において、「予後」とは、癌患者が外科的治療等による腫瘍増殖の抑制、軽減後に辿る経過又は結末（例えば、転移の有無、生死等）を意味する。本明細書において、予後とは、例えば、外科的治療による腫瘍増殖の抑制、軽減後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０年あるいはそれ以上の時点における生死であってもよい。予後は、バイオマーカーである変異型ＮＲＦ２タンパク質又は変異型ＮＲＦ２タンパク質をコードする遺伝子を調べることにより予測される。予後の予測は、バイオマーカーの存在／不存在又は上昇／減少により患者の予後が良好又は不良であるか否か又は予後が良好であるか又は不良である確率を判定することにより行うことができる。本明細書において、「予後の判定」及び「予後の評価」の文言は、予後の予測と同意義語として用いられる。
【００４２】
本明細書において「予後良好」とは、患者の外科的治療等による腫瘍増殖の抑制、軽減後の容態が長期間（例えば、３、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０年間あるいはそれ以上）致命的とならないことを意味する。あるいは、予後良好とは、そのような長期間の生存、非転移、非回帰、又は、非再発を意味していてもよい。例えば、予後良好とは、好ましくは、転移又は再発を伴うことなく、少なくとも３年間、特には少なくとも５年間生存することを意味してもよい。また、予後良好の状態として、最も好ましい状態は長期の無疾患の生存である。本発明において、予後良好とは、転移等何らかの疾患が確認されていてもその悪性度が低く、生存可能な状態を含むこともできる。
【００４３】
本明細書において「予後不良」とは、患者の外科的治療等による腫瘍増殖の抑制、軽減後の容態が短期間（例えば、１、２、３、４、５年間あるいはそれ以下）で致命的となることを意味する。あるいは、予後不良は、そのような短期間に死亡、転移、回帰、又は、再発することを意味していてもよい。例えば、予後不良とは、少なくとも３年、特には少なくとも５年の間に再発、転移又は死亡することを意味してもよい。
【００４４】
本明細書において、患者の予後を判定するために、測定された変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質の発現レベルと患者の予後と関係において用いられる「関連付けをする」という用語は、被験者における変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質の存在又はレベルを、予後が不良であった患者又は予後が不良であろうことが知られている患者、あるいは、予後が不良ではなかった患者又は予後が不良ではないと信じられている患者における変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルと比較することを意味する。または、関連付けは、被験者における変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質の存在又はレベルを、癌を発症していない健常人における変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質の発現レベルと比較することであってもよい。比較対象となる患者における変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルは、例えば、本発明の開示により、又は、既に予後が判明している患者由来の試料における変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルを測定することにより、あるいは、他の予後指標による評価と組み合わせて評価することにより知ることができる。本発明の変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルを利用して、患者が死亡、再発又は転移する可能性を予測することができる。予後因子と予後との関連付けは、統計的分析により行うことができる。統計学的有意性は、２以上の集団を比較し、信頼区間及び／又はｐ値を決定することにより決定される（Ｄｏｗｄｙ ａｎｄ Ｗｅａｒｄｅｎ， Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｅｌｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮｅｗＹｏｒｄ， １９８３）。本発明の信頼区間は、例えば、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又は９９．９９％であってもよい。また、本発明のｐ値は、例えば、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００２又は０．０００１であってもよい。
【００４５】
例えば、本発明の変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質は、その存在／不存在により患者の予後と関連付けることができる。また、別の例として、本発明の変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質について予後指標としての閾値レベルを設定し、患者由来の試料におけるバイオマーカーのレベルは、閾値レベルと比較することにより関連付けてもよい。このような閾値レベルは、例えば、感度が、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は、９８％以上となるように設定することができる。また、閾値レベルは、特異度が、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は、９８％以上となるように設定することができる。
【００４６】
予後の判定は、それにより患者の状態の経過又は転帰を予測する方法を意味し、状態の経過又は転帰を１００％の正確さで予測可能であることを意味するものではない。予後の判定は、ある経過又は転帰が起こる可能性が増大しているか否かを意味するものであり、当該経過又は転帰が起こらない場合を基準として起こりやすいことを意味するものではない。即ち、予後の判定結果は、本発明の変異型ＮＲＦ２遺伝子又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルが上昇又は減少している患者において、そのような特徴を示さない患者に比較して、ある特定の経過又は転帰がより生じやすいということを意味する。
【００４７】
一の態様において、本発明の予後予測キットは、核酸分子を用いた公知の方法に基づくことができる。このような方法としては、例えば、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットハイブリダイゼーション、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ＤＮＡマイクロアレイ等を挙げることができる。本明細書に記載の予測方法及び予測キットに使用する検体としては、例えば、生検として被験者から採取した組織試料または液体を使用することができる。使用される生検は、本発明の免疫学的測定の対象となるものであれば特に限定はなく、例えば、組織、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、漿液、髄液、関節液、眼房水、涙液、唾液またはそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができ、好ましくは組織（特には癌組織）である。本発明のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性を予測する方法において、対象となる癌の種類は特に限定されないが、好ましくは固形癌であり、例えば、肺癌、頭頚部癌、食道癌、子宮頚癌、胆道癌、乳癌、悪性黒色腫を挙げることができる。本予測キットによる分析は、定性的、定量的または半定量的に行うことができる。
【００４８】
本発明の予後予測方法は、例えば、以下の工程により行うことができる：
（ａ）該患者由来の試料を調整する工程；
（ｂ）少なくとも１つの核酸に該試料を接触させる工程、ここで、該核酸は、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）から選択される：
（ｉ）正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡに特異的に結合し、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡに結合しない核酸、及び、正常なＮＲＦ２遺伝子及び変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡに結合する核酸、
（ｉｉ）正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡに結合せず、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡに特異的に結合する核酸；
（ｃ）核酸の該ＤＮＡ若しくはＲＮＡへの結合を検出して変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡのレベルを測定する工程；
（ｄ）変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡの発現レベルから癌患者の予後を予測する工程、ここで、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡの発現若しくは発現上昇が癌患者の予後不良を示す。
【００４９】
本発明の癌患者の予後予測のためのキットは、特定のＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はその両方）と特異的に結合する核酸を含む。特に、本発明の癌患者の予後予測のためのキットは、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）から選択される少なくとも１つの物質を含む
（ｉ）ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡと結合し、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又はＲＮＡと結合しない物質、
（ｉｉ）ＮＲＦ２遺伝子とは結合せず、変異型ＮＲＦ２遺伝子と結合する物質
（ｉｉｉ）ＮＲＦ２タンパク質と結合し、変異型ＮＲＦ２タンパク質と結合しない物質、及び、
（ｉｖ）ＮＲＦ２タンパク質と結合せず、変異型ＮＲＦ２タンパク質と結合する物質。
使用する核酸は、化学合成により、又は、所望の核酸を含む遺伝子を生体材料から調整し、所望の核酸を増幅するよう設計したプライマーを用いて増幅することにより、得ることができる。
【００５０】
一の態様において、本発明の癌患者の予後予測方法は、例えば、インベーダー（登録商標）法として知られる方法（例えば、Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．：“Ｃｌｉｎｉｃａｌ，ｇｅｎｅｔｉｃ，ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｖａｄｅｒ ａｓｓａｙ．”Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．４：３５３−３６４，１９９９参照）を用いて行うことができる。
例えば、本発明の癌患者の予後予測方法は、以下の工程により行うことができる：
（ａ）患者由来の試料を調整する工程；
（ｂ）以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載の核酸に該試料を接触させて、アレルプローブと相補的なＤＮＡに三重鎖を形成させる工程：
（ｉ）正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡの一部と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列（フラップ）を備えるアレル特異的プローブ、並びに／又は、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡの一部と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列（フラップ）を備えるアレル特異的プローブ、
（ｉｉ）正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡ及び／又は変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡの一部と相補的な配列を備えるインベーダープローブ；
（ｃ）（ｂ）により得られた核酸試料に、三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素を接触させて三重鎖を形成した核酸からフラップを遊離させる工程；
（ｄ）遊離されたフラップを、それぞれ当該フラップと相補的な配列及び消光プローブを備える蛍光標識ユニバーサルプローブと接触させる工程；
（ｅ）（ｄ）により得られた核酸試料に、三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素を接触させて蛍光標識を遊離させ、蛍光を発色させる工程；並びに、
（ｆ）発色した蛍光を検出することにより、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡのレベルを測定する工程、ここで、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡの存在若しくは増加が該患者の予後が悪いことを示す。
【００５１】
一の態様において、本明細書の癌患者の予後を予測するためのキットは、上記インベーダー（登録商標）法に適したキットとすることができる。たとえば、本発明の癌患者の予後を予測するためのキットは、正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡの一部と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列（フラップ）を備えるアレル特異的プローブ、及び／又は、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡの一部と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列（フラップ）を備えるアレル特異的プローブ、正常なＮＲＦ２をコードするＤＮＡ又は／及び変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡの一部と相補的な配列を備えるインベーダープローブ、三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素、及び、消光プローブを備える蛍光標識ユニバーサルプローブを備えることができる。上記フラップは、各アレル特異的プローブ間で異なっていることが好ましい。上記蛍光標識は、当業者周知のプローブを適宜選択することができ、各蛍光標識ユニバーサルプローブ間で異なっていることが好ましい。例えば、蛍光標識として、ＦＡＭ及びＶＩＣを使用することができる。
【００５２】
上述の本発明の癌患者の予後を予測するためのキットに含まれるプローブは、本明細書の開示及び公知の情報を基に、当業者周知の方法により適宜設計し、化学合成により、又は、所望の核酸を含む遺伝子を生体材料から調整し、所望の核酸を増幅するよう設計したプライマーを用いて増幅することにより、得ることができる。また、本明細書に記載の予測キットに含まれる三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素は、市販のもの（例えば、Ｃｌｅａｖａｓｅ、株式会社サードウェーブジャパン）を使用することができる。
【００５３】
一の態様において、本発明の癌患者の予後を予測するための方法又はキットは、抗体分子を用いた公知の方法に基づくことができる。このような方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｃａｔｔｙ， Ｒａｙｋｕｎｄａｌｉａ， １９８９）、ラジオイムノアッセイ（Ｃａｔｔｙ， Ｍｕｒｐｈｙ， １９８９）、免疫組織化学的方法（Ｈｅｉｄｅｒら、１９９３）、または、ウエスタンブロット等を挙げることができる。
【００５４】
一の態様において、本発明の癌患者の予後予測方法は、例えば、以下の工程
（ａ）該患者由来の試料を調整する工程；
（ｂ）少なくとも１つの抗体に該試料を接触させる工程、ここで、該抗体は、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）から選択される：
（ｉ）ＮＲＦ２タンパク質に特異的に結合し、変異型ＮＲＦ２タンパク質に結合しない抗体、及び、ＮＲＦ２タンパク質及び変異型ＮＲＦ２タンパク質に結合する抗体、
（ｉｉ）ＮＲＦ２タンパク質に結合せず、変異型ＮＲＦ２タンパク質に特異的に結合する抗体；
（ｃ）該タンパク質の該抗体への結合を検出して変異型ＮＲＦ２タンパク質の発現レベルを測定する工程；
（ｄ）変異型ＮＲＦ２タンパク質の発現レベルから癌患者の予後を予測する工程、ここで、変異型ＮＲＦ２タンパク質の発現若しくは発現上昇が癌患者の予後不良を示す、により行うことができる。
【００５５】
一の態様において、本発明の癌患者の予後予測のためのキットは、特定のタンパク質（例えば、ＮＲＦ２タンパク質、変異型ＮＲＦ２タンパク質、又は、その両方）と結合する抗体又はその断片を備える。当該抗体は、目的のタンパク質と結合する限りその構造、大きさ、イムノグロブリンクラス、由来等を問わない。また、本発明のキットが包含する抗体又はその断片は、モノクローナルであってもよいし、ポリクローナルであってもよい。抗体の断片とは、抗体の一部分（部分断片）又は抗体の一部分を含むペプチドであって、抗体の抗原への結合作用を保持するもののことである。このような抗体の断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）若しくはこれらの重合体、二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、又は、ＣＤＲを含むペプチドを挙げることができる。ここで、ＣＤＲとは、Ｋａｂａｔら（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”， Ｋａｂａｔ， Ｅ．ら， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ ｓｅｒｖｉｃｅｓ， １９８３）又はＣｈｏｔｈｉａら（Ｃｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９６， ９０１−９１７， １９８７）の定義によるものである。また、本発明のキットは、本発明のキットが包含する抗体又はその断片のアミノ酸配列をコードする単離された核酸、当該核酸を包含するベクター、当該ベクターを保有する細胞も包含する。
【００５６】
本発明の癌患者の予後予測のためのキットに使用される抗体は、上述の方法により得ることができる。また、抗体又はその断片への標識の結合も上述の方法により行うことができる。また、標識には上述の市販の標識キットを使用してもよい。また、標識した抗体又はその断片の検出は、適宜標識に適した機器を使用することにより行うことができる。
【００５７】
本明細書に記載の癌患者の予後測キットに使用する検体としては、例えば、生検として被験者から採取した組織試料または液体を使用することができる。使用される生検は、本発明の免疫学的測定の対象となるものであれば特に限定はなく、例えば、組織、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、漿液、髄液、関節液、眼房水、涙液、唾液またはそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができ、好ましくは組織（特には癌組織）である。本予測キットによる分析は、定性的、定量的または半定量的に行うことができる。本発明の予後予測方法において、対象となる癌の種類は特に限定されないが、好ましくは固形癌であり、例えば、肺癌、頭頚部癌、食道癌、子宮頚癌、胆道癌、乳癌、悪性黒色腫を挙げることができる。
【００５８】
Ｃ．癌治療薬のスクリーニング
一の態様において、本発明は癌治療薬のスクリーニング方法に関する。変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質は、患者の予後の指標となることから、癌治療薬のスクリーニングにおいて変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質を患者の予後の改善の指標として用いることができる。例えば、癌細胞に被験薬を添加し、又は、癌モデル動物に被験薬を投与し、一定時間後の変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルを測定することにより、当該治療薬が癌の予後を改善するものであるか否かを判定することができる。より具体的には、添加又は投与により、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルが減少しているか若しくは確認できない被験薬を、癌の予後を改善する治療薬として選別することができる。
【００５９】
Ｄ．癌治療薬
また、別に態様において、本発明はＮＲＦ２阻害剤を有効成分として含有する癌治療薬に関する。本明細書において、「ＮＲＦ２阻害剤」とは、ＮＲＦ２タンパク質の機能又は発現を阻害し、あるいは、ＮＲＦ２遺伝子発現を阻害する物質であれば特に限定されず、例えば、アンチセンス、ｄｓＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、ＮＲＦ２結合タンパク質断片、ＮＲＦ２抗体又は抗体の断片、又は、結合性蛋白質を挙げることができる。
【００６０】
「アンチセンス」とは、ＮＲＦ２をコードするｍＲＮＡに相補的な配列を有する核酸のことであり、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。また、アンチセンスは標的とするＮＲＦ２のｍＲＮＡと１００％相補的である必要はなく、ストリンジェントな条件下（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９）で特異的にハイブリダイズすることができれば、相補的でない塩基を含んでいてもよい。アンチセンスは、細胞に導入されると、標的ポリヌクレオチドに結合し、転写、ＲＮＡのプロセッシング、翻訳又は安定性を阻害する。また、アンチセンスは、アンチセンスポリヌクレオチドの他に、ポリヌクレオチドミメティックス、変異された骨格（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂａｃｋ ｂｏｎｅ）を備えるもの、並びに、３’及び５’末端部分を含む。このようなアンチセンスは、ＮＲＦ２の配列情報を基に、当業者周知に方法を利用して適宜設計及び製造（例えば、化学合成）することができる。
【００６１】
「ｄｓＲＮＡ」とは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により、遺伝子発現を抑制する二本鎖ＲＮＡ構造を含むＲＮＡのことであり、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）及びｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）を含む。ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子発現を抑制する限り、標的遺伝子配列と１００％の相同性を備える必要はない。また、ｄｓＲＮＡは、安定化その他の目的で、その一部がＤＮＡに置換されていてもよい。ｓｉＲＮＡとして、好ましくは、２１〜２３塩基を備える二本鎖ＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、当業者周知の方法、例えば、化学合成又は自然発生ＲＮＡのアナログとして得ることができる。ｓｈＲＮＡは、ヘアピンターン構造をとるＲＮＡ短鎖である。ｓｈＲＮＡは当業者周知の方法、例えば、化学合成又はｓｈＲＮＡをコードする遺伝子を細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。
【００６２】
「リボザイム」は、触媒活性を備えるＲＮＡのことであり、ＲＮＡを切断、貼り付け、挿入、移動等することができる。リボザイムの構造としては、ハンマーヘッド型、ヘアピン型等が含まれる。
【００６３】
「アプタマー」とはタンパク質等の物質と結合する核酸である。アプタマーはＲＮＡであってもＤＮＡであってもよい。核酸の形態は二本鎖であっても一本鎖であってもよい。アプタマーの長さは標的分子に特異的に結合することができれば特に限定されないが、例えば、１０〜２００ヌクレオチド、好ましくは、１０〜１００ヌクレオチド、より好ましくは１５〜８０ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜５０ヌクレオチドのものである。アプタマーは、当業者において周知の方法を用いて選択することができ、例えば、ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）（Ｔｕｅｒｋ， Ｃ． ａｎｄ Ｇｏｌｄ， Ｌ．， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９： ５０５−５１０）を用いることができる。
【００６４】
「ＮＲＦ２結合タンパク質断片」とは、ＮＲＦ２と結合するタンパク質の断片であって、当該断片と結合することにより、ＮＲＦ２が本来の機能を奏することができない断片のことである。ＮＲＦ２が結合するタンパク質としては、例えば、ｆｅｒｒｉｔｉｎ，ｌｉｇｈｔ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＦＴＬ）、ｊｕｎ オンコジーン（ＪＵＮ）、カテプシン Ｌ１（ＣＴＳＬ１）、インターロイキン エンハンサー バインディング ファクター３（ＩＬＦ３）、ＫＥＡＰ１、ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｏｍａｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＰＨＩＰ）、ヌクレアー ファクター エリスロイド デライブド２（ＮＦＥ２）、ｖ−ｍａｆ マスクロアポニューロティック ファイブロサルコーマ オンコジーン ホモログ Ｇ（Ｖ−ｍａｆ ｍｕｓｃｕｌｏａｐｏｎｅｕｒｏｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇ Ｇ）（ＭＡＦＧ）、及び、ｖ−ｍａｆ マスクロニューロティック ファイブロサルコーマ オンコジーンファミリー プロテイン Ｋ（ｖ−ｍａｆ ｍｕｓｃｕｌｏａｐｏｎｅｕｒｏｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ，ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋ）（ＭＡＦＫ）が挙げられる。例えば、これらのタンパク質の部分ペプチドを作成し、ＮＲＦ２と結合するペプチドを選択することにより、ＮＲＦ２と結合するタンパク質断片を得ることができる。また、これらのペプチドは、安定性の向上や阻害活性を促進させるため、適宜、修飾されていてもよく、また、一部にアミノ酸の変異が導入されていてもよい。
【００６５】
本発明の予測用キット又は治療薬に使用する抗ＮＲＦ２抗体またはその断片が認識するアミノ酸の数は、抗体がＮＲＦ２に結合することができる数であれば、特に限定はない。抗体を治療薬として使用する場合には、ＮＲＦ２の機能を阻害することが可能な数のアミノ酸を認識することが好ましい。抗体またはその断片が認識するアミノ酸の数は、好ましくは、少なくとも１個であり、より好ましくは、少なくとも３個である。また、本発明の抗体のイムノグロブリンクラスは特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＹのいずれのイムノグロブリンクラスであってもよく、好ましくはＩｇＧである。また、本発明の抗体はいずれのアイソタイプの抗体をも包含するものである。
【００６６】
本明細書において、「抗体の断片」とは、抗体の一部分（部分断片）または抗体の一部分を含むペプチドであって、抗体の抗原への作用を保持するもののことである。このような抗体の断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（以下、「ｓｃＦｖ」という）、ジスルフィド結合Ｆｖ（以下、「ｄｓＦｖ」という）若しくはこれらの重合体、二量体化Ｖ領域（以下、「Ｄｉａｂｏｄｙ」という）、またはＣＤＲを含むペプチドを挙げることができる。
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧをタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。Ｆａｂ’は、該Ｆ（ａｂ’）のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。ｓｄＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬがペプチドリンカーで連結された抗原結合活性を有するポリペプチドである。ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のシステイン残基に置換されたアミノ酸残基がジスルフィド結合を介して結合している抗原結合活性を有する断片である。Ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した断片である。本発明のＤｉａｂｏｄｙは、モノスペシフィックでもよいし、バイスペシフィック（多重特異性抗体）でもよい。二量体化しているｓｃＦｖは、同一であっても良いし、異なっていても良い。ＣＤＲを含むペプチドは、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び、ＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲのアミノ酸配列を含むペプチドのことである。
【００６７】
本発明の抗体は、例えば、ＮＲＦ２又はＮＲＦ２の一部を有するペプチドを、必要に応じて免疫賦活剤（例えば、鉱油若しくはアルミニウム沈殿物と加熱死菌若しくはリポ多糖体、フロインドの完全アジュバント、または、フロインドの不完全アジュバント等）とともに、非ヒト哺乳動物または鳥類に免疫することにより作製することができる。
【００６８】
免疫原として使用するＮＲＦ２は、マウス、ウサギ、ヒト等の哺乳動物のＮＲＦ２であれば、特に限定は無いが、好ましくは、ヒトＮＲＦ２である。従って、本発明の抗体の作製に使用する免疫原は、ＮＲＦ２をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入し、発現させることにより得ることができる。免疫原として、ＮＲＦ２の一部を有するペプチドを使用する場合には、これらのペプチドをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入し、発現させることにより免疫原を得ることができる。免疫原として、ＮＲＦ２の一部を有するペプチドを使用する場合には、ＮＲＦ２の一部を有するペプチドをそのまま使用することもできるし、１種類または２種類以上のＮＲＦ２の一部を有するペプチドをリンカーを介して結合させて使用することもできる。
【００６９】
ＮＲＦ２またはＮＲＦ２の一部を有するペプチドは、Ｆｍｏｃ法またはＢｏｃ法等を用いて化学合成により作製できることができる。例えば、ＮＲＦ２またはＮＲＦ２の一部を有するペプチドのＣ末端のアミノ酸をポリスチレン担体に固定化し、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）またはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）で保護されたアミノ酸を、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）等の縮合剤を用いて反応させることにより結合させ、洗浄、脱保護の工程を繰り返すことにより、所望のアミノ酸配列を有するペプチドを得ることができる。
【００７０】
また、ＮＲＦ２またはＮＲＦ２の一部を有するペプチドは、自動ペプチド合成機を用いて合成することもできる。このようなペプチド合成機としては、例えば、ＰＳＳＭ−８（島津製作所）；モデル４３３Ａペプチドシンセサイザ（アプライドバイオシステムズ社）；ＡＣＴ３９６Ａｐｅｘ（アドバンストケムテック社）等が挙げられる。
【００７１】
免疫動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット、ニワトリ、アヒル等ハイブリドーマを作製することが可能な動物であれば特に限定はないが、好ましくは、マウスまたはラットであり、より好ましくは、マウスであり、最も好ましくは、ＮＲＦ２ノックアウトマウスである。動物への免疫原の投与は、例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射または足蹠注射により行うことができるが、好ましくは、皮下注射または腹腔内注射である。使用する免疫原の量は、抗体を産生できる量であれば特に限定は無いが、好ましくは、０．１〜１０００μｇであり、より好ましくは、１〜５００μｇであり、より更に好ましくは、１０〜１００μｇである。免疫は、１回または適当な間隔をあけて数回行うことができる。好ましくは、１〜５週間に１回の免疫を合計２〜５回行い、より好ましくは、３週間に１回の免疫を合計３回行う。最後の免疫から１〜２週間後に、免疫した動物の眼窩または尾静脈から採血を行い、その血清を用いて抗体価の測定を行う。抗体価の測定は、当業者周知の方法で行うことができる。例えば、放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）、固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法を挙げることができ、好ましくは、ＥＬＩＳＡ法である。本発明の抗体は、十分な抗体価を示す動物の血清から精製することにより得ることができる。
【００７２】
本発明のモノクローナル抗体は、上記方法により免疫した免疫感作動物から得た抗体産生細胞と、骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）を融合することにより得られるハイブリドーマを培養することにより得ることができる。当該融合方法としては、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ， Ｇ． ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６，１９８１）を挙げることができる。使用する抗体産生細胞は、上記方法により免疫し血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラットの脾臓、膵臓、リンパ節、末梢血より採取することができ、好ましくは、脾臓より採取する。使用する骨髄腫系細胞は、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ラビットまたはヒト等の哺乳動物に由来する細胞であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ で増殖可能な細胞であれば特に限定はない。このような細胞としては、例えば、Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ， ２５６， ４９５， １９７５）、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１（ＮＳ１）（Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ６， ２９２， １９７６）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ８１， １， １９７８）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（６５３）（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １２３， １５４８， １９７９）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／Ｏ）（Ｎａｔｕｒｅ， ２７６， ２６９， １９７８）、Ｓｐ２／Ｏ／ＦＯ−２（ＦＯ−２）（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ３５， １， １９８０）等を挙げることができ、好ましくは、Ｐ３Ｕ１である。
【００７３】
上述の方法に従って得られた抗体産生細胞及び骨髄腫細胞は、培地、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）等で洗浄後、ポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」という）等の細胞凝集性媒体を加え、細胞を融合させる（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， １９８８）。融合させる際の抗体産生細胞及び骨髄腫細胞の比率は、例えば、２：１〜１：２である。細胞融合を行った後、ＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）培地等の培地で培養することにより、ハイブリドーマを選択的に増殖させる。培養後、培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡ等により、抗原タンパク質に結合し、非抗原タンパク質に結合しないサンプルを選択する。当該サンプルを限界希釈法により単一細胞化を行い、安定して高い抗体価を示す細胞を選択する。
【００７４】
モノクローナル抗体は、上述の方法により得られたハイブリドーマをｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、培養液を精製することによって得ることができる。また、本発明のモノクローナル抗体は、予めプリスタンを腹腔内に投与した同系動物または免疫不全動物にハイブリドーマを移植した後、腹水化させ、採取した腹水を精製することによっても得ることができる。モノクローナル抗体の精製は、遠心分離後、プロテインＡカラム、プロテインＧカラム等を用いてＩｇＧ画分を回収することにより得ることができる。抗体のクラスが、ＩｇＹ及びＩｇＭの場合には、メルカプトピリジンをリガンドとしたカラムで精製することができる。また、抗体のクラスによらず、ＮＲＦ２固相化カラム、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー等を用いて精製することもできる。
【００７５】
抗体を治療薬として使用する場合、当該抗体は、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体とすることが好ましい。
ヒト型キメラ抗体は、ＮＲＦ２と結合し、ＮＲＦ２の機能を阻害する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡを調製し、これをヒト由来免疫グロブリンの定常領域ｃＤＮＡと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１， ６８５１−６８５５， １９８４）。
【００７６】
ヒト化抗体は、ＮＲＦ２と結合し、ＮＲＦ２の細胞遊走活性を阻害する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードするアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに移植したＶ領域をコードするＤＮＡを構築し、構築したＤＮＡをヒト由来免疫グロブリンの定常領域ｃＤＮＡと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる（Ｌ． Ｒｉｅｏｈｍａｎｎら， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２， ３２３， １９８８； Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ， Ｃ． Ａ．ら， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．， ４， ７７３−７８３， １９９１； Ｃｌａｒｋ Ｍ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ．， ２１， ３９７−４０２， ２０００参照）。
【００７７】
ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体ファージライブラリーまたはヒト抗体産生トランスジェニックマウスを利用することにより得ることができる（富塚ら， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．， １５， １４６−１５６（１９９７））。ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞由来の様々な配列をもつ抗体遺伝子プールからＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子をファージ遺伝子に導入することにより、ヒト抗体のＦａｂまたはｓｃＦｖ等を融合タンパク質として表面に提示させたファージのライブラリーである。このようなヒト抗体ファージライブラリーとしては、正常なヒトの持つ抗体のＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子を末梢血リンパ球などからＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、ライブラリー化することにより得られたナイーブ・非免疫ライブラリー（ケンブリッジアンチボディテクノロジー社；メディカルリサーチカウンセル；ダイアックス社等）、ヒトＢ細胞内の機能的な特定の抗体遺伝子を選び、Ｖ遺伝子断片のＣＤＲ３領域などの抗原結合領域の部分を適当な長さのランダムなアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドによって置換し、ライブラリー化した合成ライブラリー（バイオインベント社；クルーセル社；モルホシス社）、及び、癌、自己免疫疾患または感染症患者、あるいは、対象抗原をワクチンとして接種した人のリンパ球から作製したライブラリーである、免疫ライブラリーを挙げることができる。
【００７８】
抗体の断片（Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ若しくはこれらの重合体、Ｄｉａｂｏｄｙ、または、ＣＤＲを含むペプチド）は、以下の方法により作製することができる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、本発明のＮＲＦ２に結合するＩｇＧ抗体をタンパク質分解酵素ペプシンで処理し、Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断することにより、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片として得ることができる。また、本発明のＦ（ａｂ’）２断片は、後述のＦａｂ’をチオエーテル結合またはジスルフィド結合させることにより得ることができる。本発明のＦａｂ’断片は、上述の方法により得られた本発明のＮＲＦ２に結合するＦ（ａｂ’）２を還元剤であるジチオスレイトール処理して得ることができる。また、本発明のＦａｂ’断片は、本発明のＮＲＦ２に結合する抗体のＦａｂ’をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。Ｆａｂ断片は、本発明のＮＲＦ２に結合する抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理し、Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断することにより、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分の領域とＬ鎖の全領域がジスルフィド結合により結合された分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片として得ることができる。また、本発明のＦａｂ断片は、本発明のＮＲＦ２に結合する抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。ｓｃＦｖは、本発明のＮＲＦ２に結合する抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、これらの遺伝子の間にリンカー配列をコードするＤＮＡを挿入し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、当該ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。リンカーの長さは、ＶＨとＶＬが会合することができる長さであれば特に限定は無いが、好ましくは１０〜２０残基であり、より好ましくは１５残基である。また、リンカーの配列は、ＶＨとＶＬの二つのドメインのポリペプチド鎖の折りたたみを阻害しないものであれば特に限定は無いが、好ましくは、グリシン及び／またはセリンからなるリンカーであり、より好ましくは、ＧＧＧＧＳ（Ｇ：グリシン、Ｓ：セリン）またはその繰り返し配列である。ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基を部位特異的突然変異によりシステイン残基に置換し、ＶＨ及びＶＬを当該システイン残基間のジスルフィド結合で結合させることにより得ることができる。置換するアミノ酸は、立体構造に基づき抗原結合に影響の無いアミノ酸残基であれば特に限定はない。Ｄｉａｂｏｄｙは、上述のｓｃＦｖをコードするＤＮＡにおいて、リンカーのアミノ酸配列が８残基以下（好ましくは５残基）となるように構築し、当該ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。バイスペシフィックなＤｉａｂｏｄｙは、異なる２種類のｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬのＤＮＡを組み合わせてｓｃＦｖを作製することにより得ることができる。ＣＤＲを含むペプチドは、本発明のＮＲＦ２に結合する抗体のＶＨまたはＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを構築し、当該ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。
【００７９】
本発明の薬剤を医薬として使用する場合、単独で投与しても良いし、他の薬剤と共に投与してもよい。本発明の薬剤と共に使用することができる他の薬剤としては、本発明の治療薬又は予防薬の効果を失わせることの無い薬剤であれば特に限定は無く、好ましくは、癌の治療薬若しくは予防薬であり、例えば、イホスファミド、シクロホスファミド、ダカルバジン、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン、プロカルバジン、メルファラン、ラニムスチン等のアルキル化剤；エノシタビン、カペシタビン、カルモフール、クラドリビン、ゲムシタビン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、テガフール、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、メルカプトプリン、メトトレキサート等の代謝拮抗剤；イリノテカン、エトポシド、ソブゾキサン、ドセタキセル、ノギテカン、パクリタキセル、ビノレルビン、ビンデシン、ビンブラスチン等の植物アルカロイド；アクチノマイシンＤ、アクラルビシン、アムルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ジノスタチンスチマラマー、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ブレオマイシン、ペプロマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン等の抗癌性抗生物質；オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチン等のプラチナ製剤；アナストロゾール、エキセメスタン、エストラムスチン、エチニルエストラジオール、クロルマジノン、ゴセレリン、タモキシフェン、デキサメタゾン、トレミフィン、ビカルタミド、フルタミド、プレドニゾロン、ホスフェストロール、ミトタン、メチルテストステロン、メドロキシプロゲステロン、メピチオスタン、リュープロレリン、レトロゾール等のホルモン剤；インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン、ウベニメクス、乾燥ＢＣＧ、レンチナン等の生物学的応答調節剤；及び、イマチニブ、ゲフィチニブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、タミバロテン、トラスツズマブ、トレチノイン、ボルテゾミブ、リツキシマブ等の分子標的薬等を挙げることができる。
【００８０】
本発明の薬剤の製剤は、患者に投与することができる製剤であれば特に限定は無く、好ましくは、注射剤である。本発明の薬剤の剤形は、例えば、液剤又は凍結乾燥製剤を挙げることができる。本発明の薬剤を注射剤として使用する場合、必要に応じて、プロピレングリコール、エチレンジアミン等の溶解補助剤、リン酸塩等の緩衝材、塩化ナトリウム、グリセリン等の等張化剤、亜硫酸塩等の安定剤、フェノール等の保存剤、リドカイン等の無痛化剤等の添加物（「医薬品添加物事典」薬事日報社、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ」ＡＰｈＡ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ社参照）を加えることができる。また、本発明の治療薬又は予防薬を注射剤として使用する場合、保存容器としては、アンプル、バイアル、プレフィルドシリンジ、ペン型注射器用カートリッジ、及び、点滴用バッグ等を挙げることができる。
【００８１】
本発明の薬剤の投与方法は、所望の治療効果又は予防効果が得られる方法であれば特に限定はなく、好ましくは、血中に投与する。具体的には、例えば、静脈内、冠動脈内等の血管内に投与することができる。本発明の薬剤の投与方法としては、注射又は静脈点滴注射による静脈内投与、筋肉注射による筋肉内投与を挙げることができる。また、本発明の薬剤は、一時的に投与してもよいし、持続的又は断続的に投与してもよい。例えば、本発明の薬剤の投与は、１分間〜２週間の持続投与することもできる。本発明の薬剤の投与方法として、好ましくは、５分間〜１時間の持続投与であり、より好ましくは、５分間〜１５分間の持続投与である。
【００８２】
本発明の薬剤の投与量は、所望の治療効果又は予防効果が得られる投与量であれば特に限定は無く、症状、性別、年齢等により適宜決定することができる。本発明の治療薬又は予防薬の投与量は、例えば、癌の治療効果又は予防効果を指標として決定することができる。本発明の治療薬又は予防薬の投与量として、好ましくは、１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは、１０ｎｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇであり、更に好ましくは、５０ｎｇ／ｋｇ〜５００μｇ／ｋｇであり、より更に好ましくは、５０ｎｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇであり、より更に好ましくは、５０ｎｇ／ｋｇ〜５０μｇ／ｋｇであり、最も好ましくは、５０ｎｇ／ｋｇ〜５μｇ／ｋｇである。
【００８３】
以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００８４】
実施例１．食道癌におけるＮＲＦ２遺伝子変異
食道がんの臨床検体（手術によって切除された標本）及び食道がん細胞株（ＫＹＳＥ−５０、ＫＹＳＥ−７０、ＫＹＳＥ−１８０）からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによってＮＲＦ２遺伝子を増幅した後、シークエンス解析によって配列を決定した。用いたプライマーの配列を表１に示す。各エクソンをＰＣＲにて増幅後、同じプライマーを用いてシークエンス反応を行ない、全自動キャピラリーシークエンサー（ＡＢＩ ３１３０）にてシークエンスを解読した。ＰＣＲの条件は、９４度３０秒、（９４度３０秒、５５度３０秒、７２度９０秒）を３０サイクル、７２度５分間で行った。
【００８５】
【表１】
【００８６】
食道がんの臨床検体及び食道がん細胞株（ＫＹＳＥ−５０、ＫＹＳＥ−７０、ＫＹＳＥ−１８０）におけるＮＲＦ２遺伝子変異の場所及びそれによって起こるアミノ酸置換を図２に示す。本件等の結果、進行した癌（１８／８２、２２％）において、変異が検出され、初期癌においては変異が検出されなかった（０／３６）。
【００８７】
実施例２．正常食道上皮並びに食道がんにおけるＮＲＦ２の発現
正常食道（Ａ及びＢ）並びに食道がん（Ｃ）におけるＮＲＦ２の発現をＮＲＦ２に対する抗体を用いた免疫組織化学染色法により検出した。ホルマリン固定パラフィン包埋した食道がん検体から、３μｍの厚さの標本を作製し、ポリクローナル抗ＮＲＦ２抗体（Ｃ−２０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１００倍希釈）と反応させた後、免疫組織学的手法を用いて発現を可視化した（茶色の染色）。
結果を図３に示す。図中、矢印は発現している細胞を示す。図３Ｂは、図３Ａの一部の拡大図を表す。正常食道上皮では、最下層の基底細胞に限局したＮＲＦ２の発現が認められ、食道がん細胞ではＮＲＦ２の発現上昇が認められた。
【００８８】
実施例３．ＮＲＦ２遺伝子異常と癌患者の生命予後との相関
ＮＲＦ２遺伝子変異を検索した食道がん症例について、手術後の生存日数と遺伝子変異の有無との関係について統計的解析（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ解析）を行なった。
【００８９】
結果を図４に示す。統計値０．００５で、両者の間に有意な相関関係を認めた。すなわち、ＮＲＦ２遺伝子に異常のある癌を有する患者は、遺伝子異常をもたない癌を有する患者に比べて生命予後が悪かった。当該結果は、ＮＲＦ２遺伝子に異常がある患者には手術後の治療を積極的に行なう必要があることを示していると考えられる。
【００９０】
実施例４．ＮＲＦ２に対するｄｓＲＮＡによる癌細胞の増殖抑制効果
ＮＲＦ２遺伝子変異を示す食道癌細胞株（ＫＹＳＥ−５０及びＫＹＳＥ−１８０）に対して、ｄｓＲＮＡによるＮＲＦ２遺伝子発現抑制を行なった。食道がん細胞株を９６ｗｅｌｌプレートに５０００細胞／ｗｅｌｌでまき、コントロールｄｓＲＮＡ（ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ ｐｌｕｓ Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｐｏｏｌ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｄ−００１８１０−１０）又はＮＲＦ２に対するｄｓＲＮＡ（ＮＲＦ２ ｄｓＲＮＡ）（５’−ＵＡＡＡＧＵＧＧＣＵＧＣＵＣＡＧＡＡＵＵＵ−３’（配列番号２０）及び５’−ｐＡＵＵＣＵＧＡＧＣＡＧＣＣＡＣＵＵＵＡＵＵ−３’（配列番号２１））をリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて導入した後、３７度にて培養を行ない、７２時間後に生存細胞数をＮＡＤＨの活性ＭＴＳアッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ）により測定した。
【００９１】
結果を図５に示す。図中、コントロールｄｓＲＮＡの細胞数に対するＮＲＦ２ ｄｓＲＮＡの細胞数の比を示す。ＮＲＦ２遺伝子変異を持つ食道がん細胞株（ＫＹＳＥ−５０及びＫＹＳＥ−１８０）に対して、ｄｓＲＮＡによるＮＲＦ２遺伝子発現抑制を行なうと、コントロールと比較して２６％（ＫＹＳＥ５０）又は３８％（ＫＹＳＥ１８０）の増殖抑制効果を認めた。
【００９２】
実施例５．生物統計解析によるＮＲＦ２活性化と関連する分子経路の同定
ＮＲＦ２の変異による遺伝子発現の変化を調べるため、変異ＮＲＦ２遺伝子を導入した細胞とコントロール細胞との間で発現する遺伝子について発現量を比較し、ＮＲＦ２の変異により変化する遺伝子セットを解析した。具体的には、２種類の変異ＮＲＦ２遺伝子（ＮＲＦ２−ＴＫとＮＲＦ２−ＬＦ）を２９３細胞に導入し、恒常的に変異ＮＲＦ２を発現するクローンを樹立した。樹立細胞とコントロール細胞（ベクターのみを導入した細胞）からＲＮＡを抽出した。０．５ｍｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡをＣｙ３−ＣＴＰで標識後、Ａｇｉｌｅｎｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙを用いて、約３万個の遺伝子について発現量を測定した。
【００９３】
ＮＲＦ２変異株２枚とコントロール細胞２枚のマイクロアレイにおける遺伝子発現をＩＢＭＴ法（Ｓａｒｔｏｒ Ｍ．Ａ， Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ Ｃ．Ｒ．， Ｗｅｓｓｅｌｋａｍｐｅｒ Ｓ．Ｃ．， Ｓｉｖａｇａｎｅｓａｎ Ｓ．， Ｌｅｉｋａｕｆ Ｇ．Ｄ．， Ｍｅｄｖｅｄｏｖｉｃ． Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ−ｂａｓｅｄ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ｂａｙｅｓ ｍｅｔｈｏｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ７：５３８−５４， ２００６）を用いて比較した。同解析により各遺伝子の発現差の有意性を表すｐ値が得られた。得られたｐ値をＢｅｎｊａｍｉｎｉ＆Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ， Ｙ．， ａｎｄ Ｈｏｃｈｂｅｒｇ， Ｙ． （１９９５）． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｎｄ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｅｓｔｉｎｇ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ， ５７， ２８９−３００）を用いて補正し、補正後のｐ値とした。ｐ値が０．０５未満の遺伝子を統計的に有意な遺伝子とし、該当する遺伝子を２２９０個得た。２２９０遺伝子が特定のパスウェイに集中しているかどうかを調べるため、ＢＲＯＡＤ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより公開されている遺伝子セットデータベース（ＭｓｉｇＤＢ，Ｃ２）（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ Ａ， Ｔａｍａｙｏ Ｐ， Ｍｏｏｔｈａ ＶＫ， Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ Ｓ， Ｅｂｅｒｔ ＢＬ， Ｇｉｌｌｅｔｔｅ ＭＡ， Ｐａｕｌｏｖｉｃｈ Ａ， Ｐｏｍｅｒｏｙ ＳＬ， Ｇｏｌｕｂ ＴＲ， Ｌａｎｄｅｒ ＥＳ， Ｍｅｓｉｒｏｖ ＪＰ （２００５）． “Ｇｅｎｅ ｓｅｔ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ： ａ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ”． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １０２ （４３）： １５５４５−５０）に対して、超幾何分布による統計検定を行い（Ｂｏｙｌｅ， Ｅ．Ｉ．， Ｗｅｎｇ， Ｓ．， Ｇｏｌｌｕｂ， Ｊ．， Ｊｉｎ， Ｈ．， Ｂｏｔｓｔｅｉｎ， Ｄ．， Ｃｈｅｒｒｙ， Ｊ．Ｍ．， Ｓｈｅｒｌｏｃｋ， Ｇ． （２００４） ＧＯ：：ＴｅｒｍＦｉｎｄｅｒ−ｏｐｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ａｃｃｅｓｓｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｉｎｄｉｎｇ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｅｎｒｉｃｈｅｄ Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ ｔｅｒｍｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｌｉｓｔ ｏｆ ｇｅｎｅｓ， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０， ３７１０−３７１５）、得られたｐ値を上述のＢｅｎｊａｍｉｎｉ＆Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法で補正した。ｐ値が０．０５を下回る遺伝子セットを統計的有意な遺伝子セットとした。
【００９４】
本実験の結果、統計的有意な遺伝子セットの中からＰＥＮＧ＿ＲＡＰＡＭＹＣＩＮ＿ＤＮを見出した。生物統計学的手法を用いて、ＮＲＦ２遺伝子の活性化によって有意に活性化される分子経路として同定されたもののうち、ＰＥＮＧ＿ＲＡＰＡＭＹＣＩＮ＿ＤＮについてのｐ値を表１に示す。ＰＥＮＧ＿ＲＡＰＡＭＹＣＩＮ＿ＤＮは、ｍＴＯＲ経路の阻害剤であるラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）処理によって発現が減少する分子経路であり、すなわちｍＴＯＲ経路の活性化の指標となる経路である（Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２００２ Ａｕｇ； ２２ （１５）： ５５７５−５５８４）。
【００９５】
【表２】
【００９６】
実施例６．ＮＲＦ２遺伝子異常のある癌細胞の、ｍＴＯＲ阻害剤（ラパマイシン）への反応性
ＮＲＦ２遺伝子に異常のない食道癌細胞株（ＫＹＳＥ−３０、ＫＹＳＥ−１４０、ＫＹＳＥ−１７０、ＫＹＳＥ−２７０）と異常のある食道癌細胞株（ＫＹＳＥ−５０、ＫＹＳＥ−７０、ＫＹＳＥ−１８０）について、ラパマイシン処理による増殖抑制について検討した。７つの食道癌細胞株を、９６ｗｅｌｌプレートに５０００細胞／ｗｅｌｌで播種し、０、１、５、１０ｎＭのラパマイシンを添加して、３７℃で培養を行ない、７２時間後に生存細胞数をＮＡＤＨの活性（ＭＴＳアッセイ， ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ）により測定した。
加えて、ＮＲＦ２遺伝子に異常のない肺癌細胞株（ＳＱ−５、ＱＧ−５６）と異常のある肺癌細胞株（ＬＫ−２、ＥＢＣ−１）、並びにＮＲＦ２遺伝子に異常のない頭頚部癌細胞株（ＨＯ−１−Ｎ−１、ＨＳＣ２）と異常のある頭頚部癌細胞株（ＨＯ−１−ｕ−１）について、ラパマイシン投与による増殖抑制効果を上述の食道癌細胞株と同様の方法により測定した。
【００９７】
結果を図６、７及び８に示す。グラフは、０ｎＭ（薬剤なし）を１００％としたときの、それぞれの濃度における、各細胞株の細胞数の割合の変化を示す。図６に示す通り、ＮＲＦ２遺伝子に異常のあるがん細胞株では有意にラパマイシン処理によって細胞増殖が抑制（コントロールの約７０％に減少）されていた。同様に、図７及び図８に示す通り、ＮＲＦ２遺伝子に異常のある肺癌細胞株及び頭頚部癌細胞株の増殖は、ラパマイシン処理によって、それぞれ、コントロールの６２−７０％及び７０％に抑制されていた。
【００９８】
本出願が優先権を主張する日本国特許庁に２００８年７月２５日に出願された特願２００８−１９２１８６の内容の全てが参照により本願に組み込まれる。同様に、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明の奏効性予測方法は、癌患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への応答性又はｍＴＯＲ関連癌治療薬が当該癌患者に対して効果を奏するか否かを投与前に予測する方法として利用可能である。また、本発明の予後予測方法は、癌患者の予後を予測することにより、当該患者への治療レジメン戦略の策定に重要な情報を与えることができる。更に、本発明のＮＲＦ２遺伝子又はＮＲＦ２タンパク質を阻害する方法又はＮＲＦ２遺伝子又はＮＲＦ２タンパク質阻害剤を備える治療薬は、癌の治療方法又は治療薬として利用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応を予測するための情報を得る方法であって：
（ａ）該患者由来の試料中の変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質を検出すること；及び、
（ｂ）測定された変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルと該患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応との関連付けをすることを含む方法。
【請求項２】
患者由来の腫瘍サンプルから、患者の癌のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応を予測するための情報を得る方法であって：
（ａ）該患者由来の試料中の変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質を検出すること；
（ｂ）変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質の発現レベルから、癌反応クラスのうち一つのクラスに分類すること、ここで、当該分類結果は変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質の発現レベルに依存している；及び
（ｃ）当該癌反応クラスの一つに属する癌に特異的な既知の性質から当該患者の当該癌の癌治療薬への反応を予測することを含む方法。
【請求項３】
変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２のタンパク質の発現レベルが高い場合、該患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性が高いことを示す、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
以下の（ｉ）〜（ｉｖ）に記載の物質のうち少なくとも１つを備える、癌患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性予測キット；
（ｉ）ＮＲＦ２遺伝子と結合し、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡと結合しない物質、
（ｉｉ）ＮＲＦ２遺伝子と結合せず、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡと結合する物質、
（ｉｉｉ）ＮＲＦ２タンパク質と結合し、変異型ＮＲＦ２タンパク質と結合しない物質、
（ｉｖ）ＮＲＦ２タンパク質と結合せず、変異型ＮＲＦ２タンパク質と結合する物質。
【請求項５】
癌患者の予後を予測するための情報を得る方法であって：
（ａ）該患者由来の試料中の変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質を検出すること；及び、
（ｂ）測定された変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルと該患者の予後との関連付けをすることを含む方法。
【請求項６】
変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルが高い場合、該患者の予後が不良であることを示す、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＮＲＦ２阻害剤を有効成分として含有する癌治療薬。
【請求項８】
アンチセンス、ｄｓＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、ＮＲＦ２結合タンパク質断片、又は、抗体若しくはその断片である、請求項６に記載の癌治療薬。
【請求項１】
癌患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応を予測するための情報を得る方法であって：
（ａ）該患者由来の試料中の変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質を検出すること；及び、
（ｂ）測定された変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルと該患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応との関連付けをすることを含む方法。
【請求項２】
患者由来の腫瘍サンプルから、患者の癌のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応を予測するための情報を得る方法であって：
（ａ）該患者由来の試料中の変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質を検出すること；
（ｂ）変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質の発現レベルから、癌反応クラスのうち一つのクラスに分類すること、ここで、当該分類結果は変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質の発現レベルに依存している；及び
（ｃ）当該癌反応クラスの一つに属する癌に特異的な既知の性質から当該患者の当該癌の癌治療薬への反応を予測することを含む方法。
【請求項３】
変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２のタンパク質の発現レベルが高い場合、該患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性が高いことを示す、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
以下の（ｉ）〜（ｉｖ）に記載の物質のうち少なくとも１つを備える、癌患者のｍＴＯＲ関連癌治療薬への反応性予測キット；
（ｉ）ＮＲＦ２遺伝子と結合し、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡと結合しない物質、
（ｉｉ）ＮＲＦ２遺伝子と結合せず、変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡと結合する物質、
（ｉｉｉ）ＮＲＦ２タンパク質と結合し、変異型ＮＲＦ２タンパク質と結合しない物質、
（ｉｖ）ＮＲＦ２タンパク質と結合せず、変異型ＮＲＦ２タンパク質と結合する物質。
【請求項５】
癌患者の予後を予測するための情報を得る方法であって：
（ａ）該患者由来の試料中の変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質を検出すること；及び、
（ｂ）測定された変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルと該患者の予後との関連付けをすることを含む方法。
【請求項６】
変異型ＮＲＦ２をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は変異型ＮＲＦ２タンパク質のレベルが高い場合、該患者の予後が不良であることを示す、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＮＲＦ２阻害剤を有効成分として含有する癌治療薬。
【請求項８】
アンチセンス、ｄｓＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、ＮＲＦ２結合タンパク質断片、又は、抗体若しくはその断片である、請求項６に記載の癌治療薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１１−５２８８９４（Ｐ２０１１−５２８８９４Ａ）
【公表日】平成２３年１２月１日（２０１１．１２．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０２５７４（Ｐ２０１１−５０２５７４）
【出願日】平成２１年７月１５日（２００９．７．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００９／００３３３５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１０６７２
【国際公開日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【出願人】（３９９０８１２１３）インフォコム株式会社 (19)
【出願人】（５１００９７７４７）独立行政法人国立がん研究センター (35)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１２月１日（２０１１．１２．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月１５日（２００９．７．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００９／００３３３５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１０６７２
【国際公開日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【出願人】（３９９０８１２１３）インフォコム株式会社 (19)
【出願人】（５１００９７７４７）独立行政法人国立がん研究センター (35)
【Ｆターム（参考）】
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