新規なハイプロクレアジェコリーナＣＢＨ１セルラーゼ
H.ジェコリーナ CBH I、Cel7酵素の変異体はここに説明される。
本発明は、耐熱性と可逆性を改善した新規なセロビオハイドラーゼを提供する。
本発明は、耐熱性と可逆性を改善した新規なセロビオハイドラーゼを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
出願に関するクロスリファレンス
本出願は、2002年8月16日に提出されたU.S.仮出願 No.60/404,063（Attorney Docket No.GC772-2P）、2003年3月27日に提出されたU.S.仮出願 No.60/458,853（Attorney Docket No.GC772-2P）、2003年3月21日に提出されたU.S.仮出願 No.60/456,368（Attorney Docket No.GC793P）及び2003年3月27日に提出されたU.S.仮出願 No.60/458,696（Attorney Docket No.GC772-2P）に対し優先権を主張する。これらの全ては、参照によりここに組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による委託研究の下でなされた発明に対する権利の記述
この研究の一部はU. S.エネルギー省の請負契約No. DE-AC 36-99GO010337下の国立リニュウアブルエネルギー研究所の下請契約No. ZCO-0-30017-01により資金援助された。それに応じて、米国政府はこの発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、セロビオース加水分解活性を持っているポリペプチドをエンコードする異なったセロビオース加水分解酵素および単離された核酸配列と関連する。本発明はまた、組換え体の変異体のCBHポリペプチドを生み出すための方法だけでなく核酸配列を含む核酸構成物、ベクター、および宿主細胞と関連している。
【０００４】
参考文献
1. Sheehan and Himmel Biotechnology Progress 15, pp 817-827 (1999)
2. Matti Linko Proceedings of the Second TRICEL Symposium on Trichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolases pp 9-11 (1993)
3. Tuula T. Teeri Trends in Biotechnology 15, pp 160-167 (1997)
4. T. T. Teeri et al. Spec. Publ.-R. Soc. Chem. , 246 (Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering), pp 302-308. (1999)
5. PDB reference 20VW: Sulzenbacher, G., Schulen, M., Davies, G. J. Biochemistry 36 pp. 5902 (1997)
6. PDB reference 1A39: Davies, G. J., Ducros, V., Lewis, R. J., Borchert, T. V., Schulen, M. Joumal of Biotechnology 57 pp. 91 (1997)
7. PDB reference 6CEL: Divne, C., Stahlberg, J., Teeri, T. T., Jones, T. A. Journal of Molecular Biology 275 pp. 309 (1998)
8. PDB reference 1 EG1: Kleywegt, G. J., Zou, J. Y., Divne, C., Davies, G. J., Sinning, I., Stahlberg, J., Reinikainen, T., Srisodsuk, M., Teeri, T. T., Jones, T. A. Joumal of Molecular Biology 272 pp. 383 (1997)
9. PDB reference 1DY4 (8CEL): J. Stahlberg, H. Henriksson, C. Divne, R. Isaksson, G. Pettersson, G. Johansson, T. A. Jones
【背景技術】
【０００５】
セルロース及びヘミセルロースは光合成により生産される最も豊富な植物資源である。それらは、加水分解によりポリマ基質を単体糖類にすることができる細胞外酵素を作り出すバクテリア、イーストと真菌を含む、たくさんの微生物によって分解され、エネルギー源として使われることができる。 (Aro et al., J. Biol. Chem., vol. 276, no. 26, pp. 24309-24314, June 29,2001) 再生不可能な資源の限界が近づくにつれ、主要な再生可能資源となるセルロースの可能性は重要となる。(Krishna et al., Bioresource Tech. 77: 193-196,2001) 生物学的過程をへたセルロースの効果的な利用は、食料、飼料及び燃料の貯蔵量を増やすためのアプローチの一つである(Ohmiya et al., Biotechnol. Gen. Engineer. Rev. vol.14, pp. 365-414,1997)。
【０００６】
セルラーゼはセルロース（ベータ-1,4-グルカン又はベータ D-グルコシド結合）を加水分解して、グルコース、セロビオース、セロオリゴサッカライド及び同種のものを生成する酵素である。セルロースは伝統的に３つの型に分類されている：エンドグルカナーゼ (EC3.2.1.4)(“EG”)、エキソグルカナーゼ又はセロビオハイドラーゼ (EC3.2.1.91)(“CBH”) 及びベータグルコシダーゼ(［ベータ］-D-グルコシドグルハイドラーゼ；EC3.2.1.21)（”BG”） (Knowles et al., TIBTECH 5,255-261, 1987; Shulein, Methods Enzymol., 160,25, pp. 234-243, 1988) エンドグルカナーゼは主に、セルロース繊維の無定形の部分に作用するのに対して、セロビオハイドラーゼもまた、結晶セルロースを分解することができる。(Nevalainen and Penttila, Mycota, 303-319,1995) 従って、セルラーゼシステムの中のセロビオハイドラーゼの存在は結晶セルロースの効率的な可溶化のために必要とされている。(Suurnakki, et al. Cellulose 7: 189-209, 2000) ベータグルコシダーゼはD-グルコース単位をセロビオース、セロオリゴ糖、および他のグルコシドから遊離するために作用する(Freer, J. Biol. Chem. vol. 268, no. 13, pp. 9337-9342,1993)。
【０００７】
セルラーゼは多くのバクテリア（菌類及び酵母菌）から生産されることが知られている。ある種の菌類は、セルロースの結晶構造を分解することができる完全なセルラーゼ系を生産することができる。多くの酵母由来の糸状菌、は特有の活性を有し、例えば、サッカロマイセス・セレヴィシエ（出芽酵母）は、セルロースの加水分解活性を欠いている。Aro ら、 2001; Aubert ら、 1988; Wood ら、 (Methods in Enzymology, vol. 160, no. 9, pp. 87- 116,1988)、 及び Coughlan ら、("Comparative Biochemistry of Fungal and Bacterial Cellulolytic Enzyme Systems" Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, pp. 11-30 1988)を参照のこと。
【０００８】
CBH、EG及びBGの真菌セルラーゼ区分は、各区分内で倍数体があることにより、それぞれの区分内に異なる組成物を含む。例えば、多数のCBHs、EGs及びBGsは、2のCBHs、すなわちCBH I 及びCBH II、少なくとも８のEGs、すなわち、EG I、EG II、EG III、EG IV、EG V、EG VI、EG VII、およびEG VIII及び少なくとも5のBGs 、すなわち、BG 1、BG 2、BG 3、BG 4、およびBG 5に対する遺伝子を含むことで知られているトリコデルマレーシ（Tricoderma reesei）を含む様々な糸状菌源から単離されてきた。
【０００９】
結晶化セルロースをグルコースへ転換する目的のために、結晶化セルロースの加水分解能力を失わずに単離されたGBH、EG及びBGそれぞれの区分からの組成物を含むシステムが必要とされる。(Filho et al., Can. J. Microbiol. 42: 1-5,1996)異なる区分間のセルラーゼ成分の相互作用が見られる。具体的には、EGタイプセルラーゼ及びCBHタイプセルラーゼはより効果的にセルラーゼを分解するために相互作用している。例えば、Wood, Biochemical Society Transactions, 611th Meeting, Galway, vol. 13, pp. 407-410,1985参照のこと。
【００１０】
セルラーゼは当該技術分野において、布製品に対する洗剤成分の洗浄効果を高め、柔軟成分として綿布又は類似のものに対する風合い、外観を改善するのに有用であることが知られている(Kumar et al., Textile Chemist and Colorist, 29: 37-42,1997)。
【００１１】
洗浄効果が向上されたセルラーゼ含有洗剤組成物(US Pat. No. 4,435,307; GB App. Nos. 2,095,275 及び 2,094,826)及び布製品に対して風合い及び外観を改善するために使用すること(US Pat. Nos. 5,648,263, 5,691,178, 及び 5,776,757; GB App. No. 1,358,599; The Shizuoka Prefectural Hammamatsu Textile Industrial Research Institute Report, Vol. 24, pp. 54-61,1986)が開示されている。
【００１２】
従って、菌類及びバクテリア由来のセルロースは注目されている。具体的には、トリコデルマspp.（例えばトリコデルマロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）あるいはトリコデルマレーシ）はセルラーゼの結晶構造を分解する完全なセルロースシステムを有する。セルラーゼ組成物はこれまで開示されてきているけれども、一般家庭用の洗剤、ストーンウォシュ用組成物又は洗濯用洗剤等に用いるための新しく改良されたセルラーゼ組成物の必要性がいまだ存在する。性能が改良されたセルラーゼについて特別な関心が集まるであろう。
【発明の開示】
【００１３】
発明の概要
本発明はセルラーゼタンパク質の単離、ここでは、変異体CBH I及び変異体CBH Iをエンコードする核酸に関係する。 第1の実施態様では本発明は、ハイポクレアジェコリーナ(ESQ ID NO:2)において、1以上の対応する残査S8, Q17, G22, T41, N49, S57, N64, A68, A77, N89, S92, N103, A112, S113, E193, S196, M213, L225, T226, P227, T246, D249, R251, Y252, T255, D257, D259, S278, S279, K286, L288, E295, T296, S297, A299, N301, E325, T332, F338, S342, F352, T356, Y371, T380, Y381, V393, R394, S398, V403, S411, G430, G440, T445, T462, T484, Q487, 及びP491において置換または欠失から成る変異体CBH Iセルラーゼに関する。第1の側面において、本発明は単離されたセロビオハイドラーゼ活性能を有するポリペプチドをエンコードする核酸を含み、このポリペプチドは、前記核酸によりエンコードされたファミリー7のグリコシルハイドラーゼの変異体であり、前記核酸は、このポリペプチド中の熱ストレスに反応する部分の残基の置換をエンコードしており、前記変異セロビオハイドラーゼはH.ジェコリーナセロビオハイドラーゼ由来のものである。第2の側面において、本発明は単離されたセロビオハイドラーゼ活性能を有するポリペプチドをエンコードしている核酸を含む。このポリペプチドは、前記核酸によりエンコードされたファミリー7のグリコシルハイドラーゼの変異体であり、前記核酸は、このポリペプチド中の酵素機能に作用する残基の置換をエンコードしており、前記変異セロビオハイドラーゼはH.ジェコリーナセロビオハイドラーゼ由来のものである。第3の側面において、本発明は単離されたセロビオハイドラーゼ活性能を有するポリペプチドをエンコードしている核酸を含む。このポリペプチドは、前記核酸によりエンコードされたファミリー7のグリコシルハイドラーゼの変異体であり、前記核酸は、このポリペプチド中の生産物障害に作用する残基における置換をエンコードしており、前記変異セロビオハイドラーゼはH.ジェコリーナセロビオハイドラーゼ由来のものである。
【００１４】
第2の実施態様では、本発明は、ハイポクレアジェコリーナ(ESQ ID NO:2)の、1以上の対応する残基S8, Q17, G22, T41, N49, S57, N64, A68, A77, N89, S92, N103, A112, S113, E193, S196, M213, L225, T226, P227, T246, D249, R251, Y252, T255, D257, D259, S278, S279, K286, L288, E295, T296, S297, A299, N301, E325, T332, F338, S342, F352, T356, Y371, T380, Y381, V393, R394, S398, V403, S411, G430, G440, T445, T462, T484, Q487, 及びP491において置換から成る変異体CBH Iセルラーゼに関する。この変異は、この実施態様の第1の側面においては、変異体CBHIセルラーゼはさらにハイポクレアジェコリーナ(ESQ ID NO:2)由来のCBH IのT445に対応する部分の欠損を有する。この実施態様の第2の側面においては、変異体CBHIセルラーゼはさらにハイポクレアジェコリーナ(ESQ ID NO:2)由来のCBH Iの382-393残基に対応する部分の残基の欠損を有する。
【００１５】
第3の実施態様では、本発明は、変異体CBH Iセルラーゼに関する。ここで、前記変異体は、ハイポクレアジェコリーナ(ESQ ID NO:2)由来のCBH IのS8P, N49S, A68T, A77D, N89D, S92T, S113 (N/D), L225F, P227 (A/L/T), D249K, T255P, D257E, S279N, L288F, E295K, S297T, A299E, N301K, T332 (K/Y/H), F338Y, T356L, V393G, G430Fから成る群から選択される残基に対応する部分の置き換えを有している。
【００１６】
第4の実施態様では本発明は、ハイポクレアジェコリーナ(ESQ ID NO:2)由来のCBH I中の以下の部分より成る群から選択される部分について突然変異を有する変異体CBH Iセルラーゼに関する。
【００１７】
i. A112E/T226A ;
ii. S196T/S411F ;
iii. E295K/S398T;
iv. T246C/Y371C ;
v. T41I plus deletion at T445
vi. A68T/G440R/P491L ;
vii. G22D/S278P/T296P;
viii. T246A/R251A/Y252A ;
ix. T380G/Y381D/R394A ;
x. T380G/Y381 D/R394A plus deletion of 382-393, inclusive;
xi. Y252Q/D259W/S342Y ;
xii. S113T/T255P/K286M ;
xiii. P227L/E325K/Q487L;
xiv. P227T/T484S/F352L;
xv. Q17L/E193V/M213I/F352L ;
xvi. S8P/N49S/A68T/S113N ;
xvii. S8P/N49S/A68T/S113N/P227L;
xviii. T41I/A112E/P227L/S278P/T296P;
xix. S8P/N49S/A68T/A112E/T226A ;
xx. S8P/N49S/A68T/A112E/P227L;
xxi. S8P/T41I/N49S/A68T/A112E/P227L ;
xxii. G22D/N49S/A68T/P227L/S278P/T296P;
xxiii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P;
xxiv. G22D/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P;
xxv. G22D/N49S/A68T/N103I/A112E/P227L/S278P/T296P ;
xxvi. G22D/N49S/N64D/A68T/N103I/S113N/S278P/T296P;
xxvii. S8P/G22D/T41I /N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/D249K/S278P/T2
96P;
xxviii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P/N301R ;
xxix. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/D249K/S278P/T2
96P/N301R
xxx. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/N
301R;
xxxi. S8P/T41I /N49S/S57N/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/N
301R;
xxxii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/N301R;
xxxiii. S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/V403D/T462I ;
xxxiv. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/V403D/
T462I;
xxxv. S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/S411F;
xxxvi. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/S411F;
xxxvii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T25
5P/S278P/T296P/N301R/E325K/S411F;
xxxviii. S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P/S2
78P/T296P/N301R/E325K/V403D/S411F/T462I;
xxxix. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T25
5P/S278P/T296P/N301R/E325K/V403D/S411F/T462I;
第5の実施態様では、本発明は、CBH Iをエンコードする核酸から成るベクターに関する。他の側面においては、調整シーケンスを実行可能なようにリンクされた変異体CBH Iをエンコードする核酸を含む構造が存在する。
【００１８】
第6の実施態様では、本発明はCBH I変異体をエンコードしている核酸から成っているベクターと変換した宿主細胞に関する。
【００１９】
第7の実施態様では本発明は、CBH I変異体を生産する方法であって以下の過程を含むものに関する。
【００２０】
(a) CBH I変異体を生み出すために適当な条件の下で適当な培地の中でCBH I変異体をエンコードしている核酸を含むベクターと、宿主細胞を培養すること。
【００２１】
(b)上記生産されたCBHI変異体を得ること。
【００２２】
第8の実施態様では本発明は、界面活性物質とCBH I変異体を含む洗浄剤組成物に関係する。この実施態様の１の側面においては、洗剤は洗濯用洗剤である。第２の側面においては、洗剤は食器用洗剤である。第３の側面においては、この変異体CBH Iセルラーゼは、セルロースを含む布地、具体的にはストーンウォッシュ又はインディゴダイデニムの処理に用いられる。
【００２３】
第9の実施態様では、本発明はCBH I変異体を含む食品添加物の関係する。
【００２４】
第10の実施態様では、本発明はCBH I変異体と木製パルプを含む、木製パルプの処理方法に関係する。
【００２５】
第11の実施態様では、本発明は、CBH I変異体とバイオマス（生物資源）を含む。バイオマスを糖に転換する方法に関する。
【００２６】
ある実施態様では、本発明のセルラーゼは、細菌、バクテリア、放線菌から生産される。他の実施態様では、このセルラーゼは細菌由来である。最も好ましい実施態様では、この細菌は糸状菌である。この糸状菌は、Euascomycete属のものであって、具体的には、Aspergillus spp., Gliocladium spp., Fusarium spp., Acremonium spp., Myceliophtora spp., Verticillium spp., Myrothecium spp., 又は Penicillium spp.である。この実施態様のさらなる側面においては、このセルラーゼはセロビオハイドラーゼである。
【００２７】
本発明に関する上述以外の対象物、特徴点及び利点は以下の詳細な説明に開示してある。
【００２８】
詳細な説明や特定の例においては、本発明の好適な実施態様を示しているが、これらは例示するためのものであって、本発明の範囲および基本的な考え方から外れることなく、ここで述べる詳細な説明に基づいて、種々の変形や改良を行うことが可能であることは当該技術の分野のものにとっては明らかな事項であると理解しなければならない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
実施例の詳細な説明
本発明は、ここで以下の定義と実施例を用いることで、参照により詳細に説明されるであろう。明確に参照されているすべての配列を含むすべての特許と出版物は、参照によりここに含まれる。
【００３０】
ここに違った形で定義されない限り、そしてここに使ったすべての技術用語、科学用語はは、一般的に、この発明の属する分野の当業者によって理解されているのと同じ意味を持っている。Singleton, et al、DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994), 及び Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) は本発明で用いられる全般的な用語の多くについての一般的な辞書である。ここに説明されたそれらに類似しているか、等しいどのような方法と原料でも本発明の実行またはテストに用いることができるけれども、好適な方法と原料は説明される。数値の範囲は定義している数を含めるものである。違った形で示されない限り、塩基配列は左から右に向かって5’末端から3’末端を表す；アミノ酸配列は、左から右に向かって、アミノ末端からカルボキシ末端を表す。専門家は特に本分野の定義と用語についてSambrook et al., MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL (Second Edition), Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., 1989, and Ausubel FMet al., Current Protocols in Molecular Biology, JohnWiley & Sons, New York, NY, 1993,を参考にすることができる。本発明は、説明された特定の方法、手段、試薬等が変更されるときに、これらに限定されないことは理解される。
【００３１】
ここに提供された見出しは、明細書を全体として理解し得る本発明の実施態様の様々の態様を限定するものではない。従って、すぐ下で定義された用語はこの明細書によってより完全に定義される。
【００３２】
ここに引用されたすべての出版物は、発明に関連して使われる組成物と方法を説明し、これらを明確にするためのりものであり、ここに参照することによって本明細書の取り込まれる。
【００３３】
I. 定義
ここにおいて用いられる、「ポリペプタイド」という語は、ペプチド結合による一本鎖アミノ酸残基による組成物を言う。「タンパク質」という語は、ここで用いられる「ポリペプタイド」と同義であり、また、2以上のポリペプタイドの錯体をも意味する。
【００３４】
「変異体」は、前駆物質タンパク質（例えば、天然タンパク質）から生産されるプロテインであって、1以上のアミノ酸がC末端かN末端のどちらか又は両方に添加されること、アミノ酸配列中の1以上の異なる部位にけるアミノ酸の置換又はタンパク質の両端またはどちらか又は、アミノ酸配列中の1以上の部位における1以上のアミノ酸の欠失をいう。酵素変異体の調製は、好ましくは天然タンパクをエンコードしたDNA配列の変更、適切な宿主細胞内でのDNA配列の形質転換及び生産酵素を形成するような修飾されたDNA配列の発現によって達成できる。本発明のCBH I酵素の変異体は、前駆体アミノ酸配列と比較して変更されたアミノ酸配列を含むペプタイドを含む。ここで、変異体CBH酵素は、前駆体酵素が有していたセルロース分解能を有しており、いくつかの特定の様相においては変更された性質を示す。例えば、変異体CBH酵素は、至適pHが高くなり、温度又は酸化安定性が増えるが、セルロース分解能は保持したままである。発現されたセルラーゼ誘導体の機能的な活性が保持されている本発明に応じた変異体は、セルラーゼ変異体CBH酵素をエンコードしているDNA断片から引き出されることが予想される。例えば、セルラーゼをエンコードしているDNA断片は、さらに、セルラーゼ領域の機能的な活性が保持されている5'または3'末端のどちらかで、このセルラーゼDNA配列に接続したヒンジ部またはリンカーをエンコードしているDNA配列または部分を含む。
【００３５】
「等しい残基」とは、三次構造がエックス線結晶解析によって決定されている前駆物質セルラーゼに対する三次構造のレベルで相同を決定することによって定義される。等しい残基は、セルラーゼ及びハイポクレアジェコリーナCBHの特定アミノ酸残基の主鎖原子のうちの2つ以上の原子座標（NのN、CAのCA、CのC及びOのO）が、位置あわせをしたときに、0.13nm及び、好ましくは0.1nm内にあるものと定義される。最良モデルが、問題となるCBHIのセルラーゼの非水素タンパク質原子の原子座標の最大オーバーラップを与えるように、方向付けられて置かれた後に、位置あわせは達成される。この最良モデルは、利用しうる高解像度での実験的回析データに対して最も低い解離因子（R）を与える結晶モデルである。
【式１】
【００３６】
H. jecorina CBH Iの特定の残基と機能的に似ている当量の残基は、H. ジェコリーナ CBH Iの特定の残基に定義され、特徴付けられている、タンパク質構造、基質結合 、または触媒現象を変更し、修正し、あるいは、これらに寄与している構造を採用するセルラーゼのアミノ酸と定義される。さらに、それらは、与えられた残基の主鎖原子が、相同の位置を占めることに基づいて等価の基準を満たさないかもしれないけれども、残基の側鎖原子の少なくとも2つの原子の座標はH. ジェコリーナ CBHの対応する側鎖原子の0.13nmのところにあるように、相似の位置を占める、セルラーゼ(三次構造はエックス線結晶解析によって得られている)のそれらの残基である。H. ジェコリーナCBH Iの結晶構造を図2に示す。
【００３７】
「核酸分子」は、RNA、DNA及びcDNA分子を含む。遺伝暗号の退縮の結果として、CBHIのような与えられたタンパクをエンコードしている塩基配列の多様性が生まれる。本発明は、遺伝暗号の退縮を、与えられたすべてのCBHIをコードしているできる限り多くの変異塩基配列を予測するものである。
【００３８】
「非相同の」核酸構築物または配列は、それが発現する細胞固有のものではない配列の一部を有している。制御配列に関する非相同とは、発現を現在調節している同じ遺伝子を調節するために事実上機能しない制御配列（すなわちプロモーター又はエンハンサー）をいう。一般的に、非相同な塩基配列はそれらのもともとの細胞又は遺伝子の一部には存在しないのもであり、感染、トランスフェクション、形質転換、顕微注入、エレクトロポーション又は同様の方法により細胞へ添加されたものである。「非相同な」核酸構築物は、ネイティブの細胞の中で発見された制御シーケンス/DNAコーディングシーケンスの組み合わせと同じであるか、異なる制御シーケンス/DNAコーディングシーケンスを組み合わせたものを含む。
【００３９】
ここで用いる「ベクター」という語は、異なる宿主細胞間を輸送することを目的とする核酸構築物である。発現ベクターとは、異質細胞内で、相同なDNA断片を取り込み、発現させる能力があるベクターをいう。多くの原核又は真核細胞のベクターは市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当該技術分野においてよく知られている。
【００４０】
「発現カセット」又は「発現ベクター」は、目的細胞内のある特定の核酸を転写させる一連の特定の核酸要素と共に用いる組み換え処理により、または合成的に生産された核酸構築物である。組み換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアDNA、色素体DNA、ウイルス又は核酸断片に取り込むことができる。典型的には、多くの塩基配列中の発現ベクターが取り込まれた組み換えカセット部分は、転写され、プロモーターになる。
【００４１】
ここで用いる「プラスミド」という語は、クローニングベクターとして用いられる環状2本鎖DNA（duble-stranded(ds)）構築体であり、染色体外にある自己複製する遺伝子要素を形成するものである。
【００４２】
ここで用いる“選択マーカー−エンコードヌクレオチド配列”の語は宿主細胞において発現できるヌクレオチド配列をいい、選択マーカーの発現により対応する選択因子の存在下、または必須栄養素の不存在下で発現遺伝子を含む細胞は成長できるようになる。
【００４３】
ここで用いられる「プロモーター」という語は、下流遺伝子転写に直接作用する核酸配列をいう。このプロモーターは一般的に目的遺伝子が発現される宿主細胞内に用いられる。このプロモーターは、他の転写又は翻訳調節核酸配列（「制御配列」ともいう）と共に、与えられる遺伝子の発現に必要である。一般的には、この転写又は翻訳調節配列には、プロモーター塩基配列、リボゾーム結合部位、転写開始又は終了塩基配列を含むがそれらに限られない。
【００４４】
「キメラ遺伝子」又は「非相同核酸構造」は、調節領域を含む、異なる遺伝子の形質転換部分を構成する非野生型遺伝子（すなわち、宿主内に導入されたもの）をいう。宿主細胞の形質転換をするためのキメラ遺伝子構築物は、一般的に異種のタンパク質コーディング配列、または選択マーカーのキメラ遺伝子の中に、形質転換細胞に抗生物質抵抗性を与えているタンパク質をエンコードしている選択マーカー遺伝子と操作可能に接続した転写の規制の部分(促進因子)から構成されている。
【００４５】
核酸は他の核酸配列と機能的な関係に位置する場合、「操作可能に結合」しているといえる。例えば、DNAが、ポリペプチドの分泌に関与するプレ蛋白質として発現されるならば、分泌性のリーダーをエンコードしているDNAはポリペプチドのためにDNAと操作可能に結び付く。それが配列の転写に影響するならば、促進因子またはエンハンサーはコーディングシーケンスと操作可能に結び付く；または、それが、翻訳を容易にするように置かれるならば、リボゾーム結合部はコーディングシーケンスと操作可能に結び付く。一般に、「操作可能に結びつく」とは、結合するDNA配列が隣接していて、分泌性のリーダーの場合に隣接していて、読取り枠の中であることを意味している。しかし、エンハンサーは、隣接している必要がない。結合は適宜の制限酵素認識部位で連結反応によって遂行される。そのようなサイトが存在していないならば、PCRのための合成のオリゴヌクレオチドアダプター、リンカー、またはプライマーが従来的に用いられている。
【００４６】
ここで用いる、“遺伝子”の語はポリぺプチド鎖の生成に関するＤＮＡの染色体断片を意味し、コード領域（例えば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）またはリーダー配列及び３’非翻訳（３’ＵＴＲ）またはトレーラー配列）に先行または後に続く領域、及び個々のコード断片（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含んでも含まなくてもよい。
【００４７】
一般に、SEQ ID NO.1としてここに提供された野生型配列に対する中から高ストリンジェンシー条件下で、変異体CBH Iをエンコードする核酸分子はハイブリダイズする。しかし、場合によっては、実質的に異なるコドン使用頻度を有するCBH Iエンコーディング核酸配列の使用が、CBH Iエンコーディング核酸配列によってエンコードされたタンパク質は天然タンパク質と同じか、又は実質的に同じアミノ酸配列を有する。例えば、コーディング配列は、宿主によって利用される特定コドンの頻度に従い、特定の原核生物又は真核生物の発現システムにおいて、CBH Iの発現を早くするために修飾される。Te'o et al. (FEMS Microbiology Letters 190: 13-19,2000)、は、例えば、糸状菌の発現についの遺伝子の最適化について記載している。
【００４８】
核酸配列は、２つの配列が中〜高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件下でお互いに特異的にハイブリダイズする場合、対照核酸配列に “選択的にハイブリダイズ可能”であると考えられる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合体又はプローブの融点（Tm）に基づいている。例えば、「最大ストリンジェンシー」は典型的にTm-5℃（プローブのTmより5℃低い）で起こる；「高ストリンジェンシー」はTmより約5-10℃低い温度で起こる；「ゆるやかな」又は「中間ストリンジェンシー」はプローブのTmより約10-20℃低い温度で起こる；及び「低ストリンジェンシー」はTmより約20-25℃低い温度で起こる。機能的に、最大のストリンジェンシー条件は、ハイブリダーゼーションプローブと厳密な同一性またはほぼ厳密な同一性を有する配列を同定するために使われることができ；一方、高いストリンジェンシーは、プローブと約80%以上同一性を有する配列を同定するために使われる。
【００４９】
中間ストリンジェンシー又は高ストリンジェンシー条件は、本技術分野でよく知られている（例えば、Sambrook, et al., 1989, Chapters 9 及び 11, 及び in Ausubel, F. M., et al., 1993を参照のこと。これらは参照によりここに組み込まれる。）高ストリンジェンシー条件の例としては、50％ホルムアミド、5ＸSSC、5Ｘデンハード溶液、0.5%SDS及び100μg/ml変性キャリアDNA中、約42℃でのハイブリダイゼーションを行い、続いて2ＸSSC及び0.5％SDS中で、室温で2回洗浄し、0.1ＸSSC及び0.5％SDS中で、更に42℃で2回洗浄する。
【００５０】
ここで用いる「組換え体」は、非相同核酸配列の導入により修飾され、または修飾された細胞に由来する細胞またはベクターに関するものが含まれる。従って、例えば組換え細胞は、意図的にヒトが介入した結果として発現されまたは発現されない条件下で、当該細胞の天然型（非組換え体）の中に同一の形態として見られない遺伝子を発現し、または異常発現される天然遺伝子を発現する。
【００５１】
ここに用いる「形質転換」「安定な形質転換」「遺伝子組み換え」の語は、細胞に関して、ゲノムに組み込まれ、または複数の世代を通して維持されているエピゾームプラスミドとして非天然(非相同)核酸配列を有する細胞を意味している。
【００５２】
ここで用いられる、「発現」という語は、ポリペプチドが、遺伝子の核酸シーケンスに基づいて生み出される過程を言う。この過程は転写と翻訳の両方を含む。
【００５３】
核酸配列を細胞のなかに挿入するという文意の中で用いられている「導入」の語は、「トランスフェクション」、又は「形質転換」又は「形質導入」を意味し、核酸配列を真核又は原核細胞に組み込むことを含み、核酸配列が細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体又はミトコンドリアDNA）に組み込まれ、自己複製子へ転換されるか、一時的に発現される。（例えば、トランスフェクトmRNA）
「CBHI発現」という語は、cbhI遺伝子の転写及び翻訳をいう、この生産物はRMA前駆体、mRNA、ポリペプチド、翻訳後調節過程のポリペプチド及びトリコデルマコニンギ, ハイポクレアジェコリーナ(トリコデルマロンギブラキアタム、トリコデルマレーシ またはトリコデルマビリデとして知られている) 及びハイポクレアスキエイニチ（Hypocrea schweinitzii）のような近縁種由来のCBH Iを含むそれらの誘導体である。実施例で示す方法であるが、CBHＩ発現を測定する方法は、CBHIタンパクについてのウエスタンブロット、CBHIのmRNAに対してのノザンブロット測定、及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応測定法（RT-PCR）及びShoemaker S. P. 及び Brown R. D. Jr. (Biochim. Biophys. Acta, 1978,523 : 133-146) 及び Schulen (Methods Enzymol., 160,25, pp. 234-243,1988)に記載されているエンドグルカナーゼ活性測定の各方法がある。
【００５４】
「選択的スプライシング」という語は、複数のイソ型ポリペプタイドが単一遺伝子から生成され、この遺伝子のすべてではないがくつかの転写過程の間に、非連続的なエクソンをつなげる工程を含む。したがって、特定のエクソンはいくつかの選択エクソンと結合し、メッセンジャーRNAを形成する。この選択的スプライスmRNAのは、いくつかの部分が共通で他の部分が異なるポリペプチド（スプライス変異体）を作る。
【００５５】
「シグナル配列」という語は、細胞外への成熟型タンパクの分泌を促進するN末端部分アミノ酸配列である。細胞外タンパク質成熟型は、分泌過程の中で分裂するシグナル配列を欠いている。
【００５６】
「宿主細胞」という語は、ベクターを含み、発現構築物の複製、及び/又は転写又は、転写及び翻訳（発現）を支える細胞である。本発明で用いられる宿主細胞は、大腸菌のような原核生物の細胞又は、酵母菌、植物、昆虫、両生類又は哺乳類のような真核細胞である。一般的には、宿主細胞は糸状菌である。
【００５７】
「糸状菌」という語は、当該技術分野において糸状菌であると認められる任意の又は全ての糸状菌を意味する。好ましい、細菌は、アルペルギウス（Aspergillus）、トリコデルマ（Trichoderma）、フサリウム（Fusarium）、クリソスポリウム（Chrysosporium）, ペニシリウム（Penicillium）、フミコーラ（Humicola）、ニューロスポラ（Neurospora）又は エメリセラ（Emericella）、ハイポクレア（Hypocrea）などそれらの別の有性型からなる群より選択される。無性の工業用菌類であるトリコデルマレーシは子嚢菌類のハイポクレアジェコリーナのクローンの誘導体であることは明らかである。
【００５８】
「セロオリゴ糖」という語は、2-8のグルコース単位を含み、β-1,4結合を有するオリゴ糖グループのことを言い、例えばセロビオースである。
【００５９】
「セルラーゼ」という語は、セルロースポリマーをより短いセロオリゴ糖オリゴマー、セロビオース、及び/又はグルコースに分解する能力を有する酵素の分類をいう。エキソグルカナーゼ、エキソセロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ、及びグルコシダーゼノのようなセルラーゼの多くの例は、細菌、植物及びバクテリアを含むセルロース分解能を有する有機体から得られる。
【００６０】
ハイポクレアジェコリーナ由来CBH Iは、グルコース化加水分解酵素ファミリー７（以下Cel7）のメンバーであり、特にハイポクレアジェコリーナにおいて確立されたグルコース化加水分解酵素ファミリー７の第一のメンバーである（以下Cel 7A）。グルコース化加水分解酵素ファミリー７はエンドグルカナーゼ及びセロビオハイドラーゼ/エキソグルカナーゼを含んでおり、CBH Iは後者である。したがって、CBH I、CBH I型タンパク質及びCel 7という語は、ここにおいて互換的に使用される。
【００６１】
「セルロース結合領域」という語は、ここにおいて、セルラーゼ又はそれらの誘導体のセルロース結合活性が含まれるセルロースのアミノ酸配列の部位又は酵素の領域を言う。セルロース結合領域は、一般的にセルロースとセルロース、セルロース誘導体またはそれらのその他の多糖類同等物を非共有結合にすることにより機能する。セルロース結合領域は触媒中心に起因する著しい触媒活性を示さない。他言すれば、セルロース活性部位は、触媒活性を有する構造成分とは区別されるセルロース酵素タンパク質の三次構造の構造成分である。セルロース結合部位とセルロース結合構成要素という語はここでは同義に使用される。
【００６２】
ここにおいて、「界面活性剤」という語は、表面活性特性を有すると当該技術分野で認められている任意の化合物をいう。従って、例えば、界面活性剤は、一般的に洗剤中入っている陰イオン性、陽イオン性及び非イオン性の界面活性剤から成る。陰イオン性界面活性剤は直鎖又は分岐のアルキル・ベンゼン・スルホン酸塩；直鎖又は分岐アルキル基又はアルケニル基を有するアルキル又はアルケニルエーテル硫酸塩；アルキル又はアルケニル硫酸塩；オレフィンスルフォン酸塩；及びアルカンスルフォン酸塩を含む。両性界面活性剤は、4級アンモニウム塩スルフォンサン塩、及びベタイン型両性界面活性剤を含む。そのような両性界面活性剤は同一分子内にプラス及びマイナスに帯電した部分を有している。非イオン性界面活性剤は高級脂肪酸アルカノールアミド又はそれらのアルキレン酸化物の付加物、脂肪酸グリセリンモノエステル及び同種のものだけでなく、ポリオキシアルキレンエーテルも同様に含まれる。
【００６３】
ここで用いる「セルロース含有繊維」とは、天然セルロース物質及び人工セルロース物質（例えば、ジュート、麻、ラミー、レーヨン及びライオセル）を含む綿または非綿含有セルロース含有物から作成されるいかなる縫合又は非縫合織物、毛糸又は繊維をいう。
【００６４】
ここで用いられる「綿を含む布地」とは、純粋な綿又は、綿織布、綿ニット、綿デニム、綿毛糸、原綿（綿花）及び同種のものを含んだ綿混合物をいう。
【００６５】
ここで用いる「ストーンウォシュ組成物」とは、セルロース含有織物のストーンウォシュに用いる製剤を言う。ストーンウォシュ組成物はセルロース含有布地を販売するに先立って加工するために用いられる、すなわち、製造過程において用いられる。対照的に、洗浄組成物は汚れた衣類の洗浄することを対象としており、工業的生産過程においては使用されない。
【００６６】
ここで用いられる「洗浄組成物」は、セルロースを含んだ汚れた布地の洗濯に対する洗浄手段に用いることを意図された混合物である。本発明の文脈中、そのような組成物生物は、セルラーゼ及び界面活性剤に加えて、さらに加水分解酵素、原材料、漂白剤、漂白活性剤、青味剤、蛍光染料、ケーキング抑制剤、マスキング剤、セルラーゼ活性剤、抗酸化剤、及び可溶化剤を含む。
【００６７】
ここで用いる「cbh1遺伝子の発現の減少又は排除」とは、cbh1遺伝子が遺伝子から削除されているために、組み換え宿主微生物によって発現できないこと；又は機能的なCBH1酵素が宿主の微生物によって生み出されないように、cbh1遺伝子が修飾されていることのどちらかを意味する。
【００６８】
ここで用いる「変異体cbh1遺伝子」又は「変異体CBH1」は、それぞれ、H. ジェコリーナ由来のcbh1遺伝子の核酸シーケンスが、コーディングシーケンスを取り除き、追加し、および／または処理することによって変更されたか、発現されたタンパク質のアミノ酸配列がここに説明された発明と一致するように修正されていることを意味する。
【００６９】
ここで用いる、「精製する」という語は、一般に、細胞を含む遺伝子組換された核酸またはタンパク質を生化学的精製、および／またはカラムクロマトグラフィーにかけることを意味する。
【００７０】
ここで用いる「活性の」又は「生物学的に活性の」とは、ある特定のタンパク質と関係のある生物学的活性を言い、ここでは、互換的に使用される。例えば、プロテアーゼと関係する酵素活性はタンパク質分解であり、実際に、活性を有するプロテアーゼはタンパク質分解活性を有している。このことは、与えられたタンパク質の生物活性は一般に当業者によってそのタンパク質に帰属するどのような生物活性でも言うと理解される。
【００７１】
ここで用いる「濃縮する」という語は、CBHが入手できる、野生型又は自然発生する細菌性のセルラーゼ組成物に見られるCBH濃度よりも相対的に高い濃度である。この濃縮する、高める、促進されたという語は、互換的に用いられる。
【００７２】
野生型細菌性セルラーゼ組成物は、天然に自生している細菌源によって生産されるのもであり、1以上のBGL、CBH及びEG成分を含んでいる。そしてこれらの成分のそれぞれは細菌源によって生産される比率で発見される。従ってCBHを高めた組成物は他のセルラーゼ組成物（すなわち、EGs、ベータグルコシダーゼ及び他のエンドグルカナーゼ）に対するCBHの割合が高められた、変更された割合のCBHを有する。
【００７３】
従って、図示するように、自然発生的なセルラーゼシステムは、至適pHにおけるイオンクロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、分子ふるい及び同種のものを含むものであり、出版された文献中に記載の分離技術により、大幅に精製された組成物に精製される。例えば、イオン交換クロマトグラフィー（たいていは陰イオン交換クロマトグラフィー）において、pH勾配又は塩勾配又はｐH及び塩の両者の勾配を用いた溶出により、セルラーゼ組成物を分離することは可能である。精製されたCBHは、最終的にCBH濃度の高い溶液となる酵素溶液に添加される。可能であれば、他のセルラーゼをエンコードしている1以上の遺伝子の欠損部分と関連して、CBHをエンコードした遺伝子の過剰発現させる分子遺伝学的方法を用いて、微生物により生産されるCBHIの量を多くすることは可能である。
【００７４】
細菌のセルラーゼは1以上のCBH成分を含んでいる。この異なる成分は、イオン交換クロマトグラフィー及び同種のものを介して分離することが可能な、遺伝的に異なった等電点を有しいる。単一CBH成分又はCBH成分の組み合わせのどちらか一方が、酵素溶液中に用いられる。
【００７５】
酵素溶液中に用いる場合、CHBIの相同体又は変異体成分は遺伝的にバイオマスから可溶糖の放出を高めるのに十分な量が添加されている。追加された同族体または変異体のCBH1成分の量は、糖化される生物量のタイプに依存しており、熟練した者によって直ちに決定することができる。しかしながら、（酵素溶液中に）用いられたときに、セルラーゼ組成物中の、あるEGタイプの成分に対する相同又は変異CBH成分の重量パーセントは、好ましくは約1、好ましくは約5、好ましくは約10、好ましくは約15、又は好ましくは約20重量パーセントから、好ましくは約25、好ましくは約30、好ましくは約35、好ましくは約40、又は好ましくは約50重量パーセントまでである。さらに、好ましい範囲は、約0.5から15重量パーセント、約0.5から20重量パーセント、約1から約10重量パーセント、約1から約15重量パーセント、約1から約20重量パーセント、約1から約25重量パーセント、約5から約20重量パーセント、約5から約25重量パーセント、約5から約30重量パーセント、約5から約35重量パーセント、約5から約40重量パーセント、約5から約45重量パーセント、約5から約50重量パーセント、約10から約20重量パーセント、約10から約25重量パーセント、約10から約30重量パーセント、約10から約35重量パーセント、約10から約40重量パーセント、約10から約45重量パーセント、約10から約50重量パーセント、約15から約20重量パーセント、約15から約25重量パーセント、約15から約30重量パーセント、約15から約35重量パーセント、約15から約30（40？）重量パーセント、約15から約45重量パーセント、約15から約50重量パーセントである。
【００７６】
II．宿主有機体
糸状菌はすべて真菌類及び卵菌類に再分類される。糸状菌は、菌糸の伸長と偏好気性である炭素代謝による栄養生長を伴う、キチン、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複合多糖類から構成されている細胞壁を持っている栄養菌糸によって特徴付けられている。
【００７７】
本発明では、糸状菌親細胞はトリコデルマ種の細胞、例えば、Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Trichoderma harzianum ; Penicillium sp.; Humicola sp. , including Humicola insolens and Humicola grisea ; Chrysosporium sp., including C. lucknowense ; Gliocladium sp.; Aspergillus sp.; Fusarium sp., Neurospora sp., Hypocrea sp., and Emericella spであるがこれらに限られない。ここで用いる「トリコデルマ」又は「トリコデルマ種」という語は、以前にトリコデルマとして分類されているか、トリコデルマとして現在分類されているどのような細菌系統をも言う。
【００７８】
１の実施態様では、糸状菌親細胞は、Aspergillus niger、 Aspergillus awamori、Aspergillus aculeatus、 Aspergillus nidulans 細胞である。
【００７９】
他の実施態様では、糸状菌親細胞は、Trichoderma reesei細胞である。
【００８０】
III．セルラーゼ
セルラーゼは、当該技術分野において、セルロース（ベータ-1,4グルカン又はベータD-グルコシド結合）を加水分解し、グルコース、セロビオース、セロビオオリゴサッカライド及び同種のものを生産する酵素として知られている。上記のように、セルラーゼは伝統的に3つの主クラスに分類される：エンドグルカナーゼ（EC3.2.1.4）（“EG”）、エキソグルカナーゼ又はセロビオハイドラーゼ（EC3.2.1.91）（“CBH”）及びベータグルコシダーゼ（EC3.2.1.21）（“BG”）（Knowlesら、 TIBTECH 5,255-261, 1987; Schulen, 1988）である。
【００８１】
ある特定の細菌は、エキソセロビオハイドラーゼ又はCBH型セルラーゼ及びベータグルコシダーゼ又はBG型セルラーゼを含む複合的なセルラーゼシステムを生産する（Schulein, 1988）。しかしながら、ときどきこれらのシステムは、CBH型セルラーゼを含むが、或るときにはこれらのシステムはCBHタイプセルラーゼを欠き、一般にほとんどまたは全くCBHタイプセルラーゼを含まない細菌性セルラーゼを含む場合がある。加えて、EG成分及びCBH成分は、セルロースをより効果的に分解するために相乗的に相互作用をすることが示されている。例えば、Wood, （1985）を参照のこと。この異なった成分、すなわち、複合成分又は完全なセルラーゼシステムの中のさまざまなエンドグルカナーゼ及びエキソセロビオハイドラーゼは、等電点、分子量、グリコシル化度、基質特異性及び酵素活性パターンなどにおいて、一般的に異なる性質を有する。
【００８２】
エンドグルカナーゼ型セルラーゼは、セルロースの結晶化度の低い部分の内部ベータ-1,4グルコシド結合を加水分解し、エキソセロビオハイドラーゼ型セルラーゼは、セルロースの還元又は非還元末端からセロビオースを加水分解する。それは、エンドグルカナーゼ成分の作用はエキソエロビオハイドラーゼ成分によると認められる新しい鎖端を作ることによるエキソセロビオハイドラーゼの作用を大いに促進することができるということになる。さらに、ベータグルコシダーゼタイプのセルラーゼは、セロビオースのような糖質残基を含むグルコシドだけでなく、メチル-β-Dグルコシド及びp-ニトロフェニルグルコシドのようなアルキル及び/又はアリールβ-D-グルコシダーゼの加水分解に触媒作用をすることが示されている。このことは、微生物のための唯一の生産物として、グルコースを生産し、セロビオハイドラーゼ及びエンドグルカナーゼを抑制するセロビオースを減らすか又は排除する。
【００８３】
セルラーゼは、洗浄能力を高めるために、柔軟成分として、及び綿布製品の風合いを改善するために、洗剤組成物中に多くの使用例が見られる（Hemmpel, ITB Dyeing/Printing/Finishing 3: 5-14,1991 ; Tyndall, Textile Chemist and Colorist 24: 23-26, 1992 ; Kumar ら、 Textile Chemist and Colorist, 29: 37-42,1997）。一方その作用機能は、本発明の一部ではないが、セルラーゼの柔軟性及び色の回復特性はセルラーゼ組成物中のアルカリ性エンドグルカナーゼ成分に起因するものである。実証例として、U. S. Patent Nos. 5,648, 263,5, 691,178, 及び 5,776, 757がある。これらは、特定のアルカリ性エンドグルカナーゼ成分が豊富なセルラーゼ組成物を含んでいる洗剤成分は、アルカリ性エンドグルカナーゼ成分が豊富でないセルラーゼ組成物と比較すると、処理した衣類に対して色の回復及び柔軟性の改善を与えることができる。更に、そのようなアルカリ性エンドグルカナーゼ成分を洗剤成分へ用いることは、洗剤組成物のpH要件を補完していることを示している。（すなわち、U. S. Patent Nos. 5,648, 263,5, 691,178, 及び 5,776, 757に開示されているように、7.5から10のアルカリ性のpHにおいて最大活性を示すことによる）
セルラーゼ組成物は、綿を含む布製品を分解し、最終的にこの布製品において強度が低くなることが示唆され（U. S. Patent No. 4,822, 516）、セルラーゼ組成物を市販の洗剤成分に使用することをためらう原因となっている。エンドヌクレアーゼ成分から成っているセルラーゼ組成物は、完全なセルラーゼシステムから成っている組成物に比べて綿を含んだ布に対して低い強度損失を示すことが示唆されている。
【００８４】
セルラーゼは、セルラーゼバイオマスをエタノールに分解すること（ここにおいて、セルラーゼがセルラースをグルコースに分解し、酵母又は他の微生物がさらにグルコースをエタノールに発酵させる）において、機械パルプ(Pere ら、 1996)の処理、飼料添加物(WO 91/04673)としての使用のために、そして粒子湿式粉砕において有益であることが明らかにされている。
【００８５】
大部分のCBHs及びEGsは、リンカーペプタイド（Suurnakki ら、 2000）による、セルロース結合ドメイン（CBD）から分離されたコアドメインを含む多重ドメイン構造を有する。コアドメインは、酵素がセルロースに結合することによりセルロースとCBDの相互作用が起きる活性部位を含んでいる。（van Tilbeurgh et aL., 1986 ; Tomme et al., Eur. J. Biochem. 170: 575-581,1988）このCBDsは、結晶セルロースの加水分解に重量である。セロビオハイドラーゼが結晶セルラースを加水分解する能力は、CBDが存在しないときには明らかに減少することが示されている。（Linder and Teeri, J.Biotechnol. 57: 15-28, 1997）しかしながら、CBDsの確かな役割及び作用機能はいまだ憶測の範疇にある。CBDは、セルロース表面での有効な酵素の濃度を増加することにより（Stahlberget al., Bio/Technol. 9: 286-290,1991）、及び/又はセルロース表面から、１本鎖セルロースを分離することにより（Tormo et al., EMBO J. vol. 15, no. 21, pp. 5739-5751, 1996）、酵素活性を高めるということが示唆されてきた。異なる基質上におけるセルラーゼドメインの効果に関する研究の多くは、コアプロテインがパパインを用いた有効なタンパク質分解により生産することができたので（Tommeet al., 1988）、セロビオハイドラーゼのコアプロテインを用いて実施することができた。数多くのセルラーゼは特定の文献に開示されており、(その例は以下のものに含まれる)：Trichoderma reeseiの例：Shoemaker, S.et al., Bio/Technology, 1: 691-696,1983, この文献は CBHIを開示する ; Teeri, T. et al., Gene, 51: 43-52,1987, この文献はCBHIIを開示する。 Trichoderma以外の主由来のセルラーゼも説明されている、例えば、Ooi et al., Nucleic Acids Research, vol. 18, no. 19,1990, この文献は、Aspergillus aculeatus由来のエンドグルカナーゼ F1-CMCのシークエンスをコードしている cDNAを開示している ;Kawaguchi Tet al., Gene 173 (2): 287-8,1996, この文献はAspergillus aculeatus由来のベータグルコシダーゼ 1 をエンコードしている cDNAのクローニング及び配列決定を開示している; Sakamotoet al., Curr. Genet. 27: 435-439, 1995, この文献はAspergillus kawachii IFO 4308由来のエンドグルカナーゼCMCase-1 をエンコードしている cDNA の塩基配列を開示している;Saarilahti et al., Gene 90: 9-14,1990, この文献はErwinia carotovara由来のエンドグルカナーゼを開示している;Spilliaert R, et al., Eur J Biochem. 224 (3): 923-30, 1994この文献は Rhodothermus marinu由来の熱耐性ベータグルカナーゼをコードしているbglAのクローニング及び配列決定を開示している;Haildorsdottir et al., Appl Microbiol Biotechnol. 49 (3): 277-84,1998, これはグリコシルハイドラーゼ ファミリー 12の熱耐性セルラーゼをエンコードしているRhodothermus marinus 遺伝子のクローニング、配列決定及び過剰発現を開示している。熱ストレス条件下又は界面活性剤の存在中での性能の改善、高められた特異的活性、基質開裂パターンを変更すること、及び/又はvitorにおける高レベルでの発現のような改善された性質を有する新規セルラーゼを確立し、特徴づけることが求められている。
【００８６】
さまざまな量のCBH型、EG型及びBG型セルラーゼからなる新しく改良されたセルラーゼ組成物生物は：（１）高められた洗浄能力（柔軟成分として機能し、及び/又は綿布の風合いを改善する）を示す洗剤組成物中への使用（例えば、“ストーンウォッシュ”又は“生物研磨”）；（２）低品質な木製パルプ又は他のバイオマスから糖を生産する組成物中への使用（例えば、バイオエタノール生産）及び/又は（３）食品組成物へ使用することにより重要な意味を持つ。
【００８７】
IV.分子生物学
1つの実施態様において、本発明は糸状菌の中で機能的するプロモータのコントロール下で変異体のCBH）遺伝子の発現を提供するものである。これらについて本発明は、組み換え遺伝子の分野の定型技術を用いている。本発明に用いる一般的方法が開示されている基本テキストには、Sambrook etal., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989);Kriegler, Gene Transfer and Expression : A Laboratory Manual (1990); 及びAusubel etal., eds. , Current Protocols in Molecular Biology(1994)がある。
【００８８】
A. 相同BCH1遺伝子の確立方法
野生型H.ジェコリーナ（H. jecorina）の核酸配列を図1に示す。本発明は、1の側面において、ここで述べるCBH1相同体をエンコードしている核酸分子を含む。この核酸はDNA分子である。
【００８９】
CBH1をエンコードしているDNA配列を単離するために用いる方法は、相同なDNAプローブを用いたcDNA及び/又はゲノムライブラリーのスクリーニング及びCBH1に対する活性測定又は抗体を用いた発現のスクリーニングを含め、この技術分野においてよく知られているが、これらに限られない。これらの方法のいくつかは、Sambrook, et al. or in CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, F. Ausubel, et al., ed. Greene Publishing and Wiley- Interscience, New York (1987) ("Ausubel")に記載されている。
【００９０】
B. CBH I核酸を変異させる方法
突然変異を導入することができる本技術分野で知られているどのような方法でも本発明にいて意図されたものである。
【００９１】
本発明は変異体CBHIの発現、精製及び/又は使用に関連する。これらの酵素はH.ジェコリーナ（H. jecorina）由来のcbhを用い遺伝子組み換え法により調製される。
【００９２】
H.ジェコリーナ（H. jecorina）由来cbh1の単離及びクローニングの後、本分野で知られている特定部位の突然変異誘発のような、いくつかの他の方法は、CBHI発現変異体の中の置換したアミノ酸に相当する部分の転換、付加又は欠損をさせるために用いられる。さらに、特定部位の突然変異誘発及びDNAレベルでタンパク質発現を変更するアミノ酸の取り込むような他の方法はSambrook, et al. 及び Ausubel, et alの文献に記載されている。
【００９３】
H.ジェコリーナ（H. jecorina）CBHIの変異体のアミノ酸配列をエンコードしているDNAは本分野で知られている様々な方法により調製される。これらの方法は、H.ジェコリーナ（H. jecorina）CBHIをエンコードしている初期に調製されたDNAの特定部位（又はオリゴヌクレオチド伝達）突然変異誘発、PCR突然変異誘発及びカセット突然変異誘発を含むがこれらに限定されない。
【００９４】
特定部位突然変異誘発は、置換変異体を調製するのに好ましい方法である。この技術は本分野でよく知られている。（例えば、Carter et al. Nucleic Acids Res. 13: 4431- 4443 (1985) 及びKunkel et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1987)参照のこと。 ）単に、DNAの特定部位の突然変異誘発を実行することにおいて、出発DNAは、最初にそのような出発DNAの1本鎖へと改変するように意図された突然変異をエンコードしているオリゴヌクレオチドを交雑することによって変更される。ハイブリダイゼーションの後、DNAポリメラーゼは、プライマーとして交雑オリゴヌクレオチドを用いて、出発DNAの１本鎖を鋳型として、完全な二本鎖を合成するのに用いられる。したがって、意図する変異をエンコードしたオリゴヌクレオチドはこの2本鎖DNAに取り込まれる。
【００９５】
PCR変異誘発は出発ポリペプチドのアミノ酸配列変異体すなわちH.ジェコリーナ（H. jecorina）CBHIを作るのにも適している。Higuchi, in PCR Protocols, pp. 177-183 (Academic Press, 1990); 及び Vallette et al., Nuc. Acids Res. 17: 723-733 (1989)参照のこと。Cadwell et al., PCR Methods and Applications, Vol 2,28-33 (1992)も例として参照のこと。単に、少量のDNAが開始物としてPCRに用いられるとき、鋳型DNAの対応する領域からのシークエンスにおいてわずかしか異ならないプライマーは、相対的に大量の特定のDNA断片を作成するために用いられる。この特定のDNA断片は、プライマーがDNA断片から異なる部位のみ、鋳型DNAとは異なったものとなっている。
【００９６】
変異体を調製するたの方法、カセット突然変異誘発は、Wells et al., Gene 34: 315-323 (1985)の技術に基づいている。この出発物質は、変異させようとする出発ポリペプチドDNAを含むプラスミド（又は他のベクター）である。変異させようとする出発DNA中のコドンは確認されている。特異な制限エンドヌクレアーゼサイトが認識された突然変異サイト各側の上になければならない。もし、そのような制限サイトがなければ、そのようなサイトは、出発ポリペプタイド中の適切な位置に前記サイトを挿入するために、上記オリゴヌクレオチドを介した方法を用いて生産される。プラスミドDNAは直線にするために、それらのサイトで切断される。制限サイト間のDNA配列をエンコードしているけれども意図する変異を含まないオリゴヌクレオチドの二本鎖は、離れて合成され、通常の技術を用いて一緒に交雑されるという一般的な方法を用いて合成される。この２本鎖オリゴヌクレオチドは、カセットといわれる。このカセットは、直接的にこのプラスミドと結合することができるような、直線になったプラスミドの末端と互換性のある5’末端及び3’末端を有するように作られている。このプラスミドは今や変異DNAを含む。
【００９７】
もう一つの方法として、又は加えて、変異体CBHIをエンコードしている意図されたアミノ酸配列が決定されることができ、そのようなアミノ変異をエンコードしているアミノ酸配列は合成的に生産することができる。
【００９８】
そのようにして調製された変異体CBHIは、たいていの場合セルラーゼの目的とする使用に応じて、さらに変更がなされる。そのような変更は、アミノ酸配列の更なる変更、非相同ポリペプチドへの融合、及び/又は共有結合修飾を含む。
【００９９】
V. cbh1核酸及びCBH1ポリペプチド
A. 変異体cbh型核酸
野生型H.ジェコリーナ（H. jecorina）の核酸配列を図1に示す。本発明はここで述べる変異体セルラーゼをエンコードする核酸分子を包含する。この核酸は、DNA分子である。
【０１００】
CBHIの単離及びクローニングの後、特定部位の突然変異誘発などのこの分野で知られている他の方法は、発現したCBHI変異体中の置換されたアミノ酸に対応する転換、付加、又は欠損を作るために用いられる。さらに、特定部位の突然変異誘発及びDNAレベルでタンパク質発現を変更するアミノ酸を取り込むような他の方法はSambrook, et al. 及び Ausubel, et al.の文献に記載されている。
【０１０１】
変異CBHIをエンコードしてるDNA配列がDNA構造の中へクローン化された後、このDNAは微生物の形質転換に用いられる。本発明に関する変異CBHIの発現の目的とするこの微生物には、Trichoderma sp.由来の種を含めることが好ましいであろう。実際、本発明に関する変異CBHIセルラーゼの調製のための好ましいモデルは、すくなくとも変異BCHIの一部又は全てをエンコードしているDNA断片からなるDNA構造を有する形質転換されたTrichoderma sp.宿主細胞である。このDNA構造は一般的にはプロモーターに機能的に付加される。この形質転換させた宿主細胞は意図したタンパク質を発現するような条件下で成長させられる。その後、目的のタンパク質生成物は実質的に均質に精製させる。
【０１０２】
しかしながら、変異CBHIをエンコードする与えられたDNAを最もよく発現する媒介はH.ジェコリーナ（H. jecorina）とは違うものであるということは事実であるようだ。従って、変異体CBH1のために根源生物と、系統発生的な類似性を持つ形質転換宿主の中で、タンパク質を発現することはとても有利になるであろう。別の実施態様において、Aspergillus nigerが発現媒体として用いられた。A.nigerを用いた形質転換技術についてはWO 98/31821参照のこと。この記載は参照により本発明に組み込まれる。
【０１０３】
従って、Trichoderma sp.発現システムは、説明に役立つという目的だけのために、そして本発明の変異体CBH1を表現するための1つのオプションとして提供される。当業者においては、しかしながら、変異体CBH1の根源は、最適な表現宿主を決定することにおいて考慮されるべきであるということが適切であると考えうるならば、変異CBHIをエンコードしているDNA発現を含むだろう。さらに、当業者は、入手可能なツールを利用しているルーチン的な手法を通して特定の遺伝子のために最もよい表現システムを選ぶことが可能になるであろう。
【０１０４】
B. 変異CBHIポリペプチド
野生型H.ジェコリーナ（H. jecorina）のアミノ酸配列を図1に示す。変異CBHIポリペプタイドは、H.ジェコリーナ（H. jecorina）由来CBHIのS8,Q17, G22, T41, N49, S57, N64, A68, A77, N89, S92,N103, A112, S113, E193, S196, M213, L225, T226, P227, T246, D249, R251, Y252, T255, D257, D259, S278, S279, K286, L288, E295, T296, S297, A299, N301, E325, T332, F338, S342, F352, T356,Y371, T380,Y381, V393, R394, S398, V403,S411, G430, G440, T445, T462, T484, Q487, 及びP491 残基の1以上の対応する部位の置換又は欠損からなる。さらに、この変異体は、H.ジェコリーナ（H. jecorina）由来CBHIの残査382-393に対応する残査が欠損を含む。
【０１０５】
本発明の変異CBHI’sはCBHI前駆体のアミノ酸配列由来のアミノ酸配列を有する。この変異CBHIのアミノ酸配列は、この前駆体アミノ酸配列の1以上のアミノ酸の置換、欠損、又は挿入によって、前駆体アミノ酸配列とは異なっている。 好ましい実施態様においては、前駆体CBHIはハイポクレアジェコリーナCBHI（Hypocrea jecorina CBHI）である。 H.ジェコリーナCBHI（H. jecorina CBHI）の成熟アミノ酸配列を図1に示す。 従って、本発明はH.ジェコリーナCBHI（H. jecorina CBHI ）中に明らかに見られる残査と同じ位置にアミノ酸残査を含むCBHI変異体に関するものである。CBHI相同体の残査（アミノ酸）は、もしそれが、相同であるか（すなわち、全体の1次又は3次構造の位置について対応が見られる）、または特定の残基又はハイポクレアジェコリーナCBHI（Hypocrea jecorina CBHI）中の残基の一部と機能的に類似している（すなわち、化学的又は構造的に結合、同じか似通った反応又は相互作用する機能的能力を有すること）ならば、ハイポクレアジェコリーナCBHI（Hypocrea jecorinaCBHI）の残査と等しいことになる。ここで用いるように、番号を付すことは、図1に示すように成熟CBHIアミノ酸配列のものに対応させることを意図している。CBHI前駆体内の位置に加えて、前駆体CBHI中の前駆体CBHIが熱ストレス下に置かれたときの不安程度に関係するアミノ酸の位置に対応している特定残基は、ここでは置換又は欠損として確認されている。このアミノ酸の位置番号（例えば+51）は、図1に示した成熟ハイポクレアジェコリーナCBHI（Hypocrea jecorinaCBHI）の配列に割り当てられた番号を言う。
【０１０６】
本発明の変異CBHI’sはCBHI前駆体のアミノ酸配列由来のアミノ酸配列を有する。この変異CBHIのアミノ酸配列は、この前駆体アミノ酸配列の1以上のアミノ酸の置換、欠損、又は挿入によって、前駆体アミノ酸配列とは異なっている。H.ジェコリーナCBHI（H. jecorina CBHI）の成熟アミノ酸配列を図1に示す。従って、本発明はH.ジェコリーナCBHI（H. jecorina CBHI ）中に明らかに見られる残査と同じ位置にアミノ酸残査を含むCBHI変異体に関するものである。CBHI相同体の残査（アミノ酸）は、もしそれが、相同であるか（すなわち、全体の1次又は3次構造の位置について対応が見られる）、または特定の残基又はハイポクレアジェコリーナCBHI（Hypocrea jecorina CBHI）中の残基の一部と機能的に類似している（すなわち、化学的又は構造的に結合、同じか似通った反応又は相互作用する機能的能力を有すること）ならば、ハイポクレアジェコリーナCBHI（Hypocrea jecorinaCBHI）の残査と等しいことになる。ここで用いるように、番号を付すことは、図1に示すように成熟CBHIアミノ酸配列のものに対応させることを意図している。CBHI前駆体内の位置に加えて、前駆体CBHI中の前駆体CBHIが熱ストレス下に置かれたときの不安程度に関係するアミノ酸の位置に対応している特定残基は、ここでは置換又は欠損として確認されている。このアミノ酸の位置番号（例えば+51）は、図1に示した成熟ハイポクレアジェコリーナCBHI（Hypocrea jecorinaCBHI）の配列に割り当てられた番号を言う。
【０１０７】
相同性を同定するためのアミノ酸配列の位置合わせは、好ましくは「配列比較アルゴリズム」を用いることで同定することができる。比較のための配列の最適な位置合わせは、例えばSmith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)の局所的相同性アルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)の相同性整列アルゴリズム、Pearson & Lipman, Proc. Nat'lAcad. Sci. USA 85: 2444 (1988)の類似性の調査法、それらアルゴリズムのコンピューターによる実施(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)、目視検査又はカナダのケミカルコンピュータグループMontreal によるMOE によって実施することができる。
【０１０８】
配列類似性を特定するのに適切であるアルゴリズムの１ つの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３−４１０ （１９９０）に記載のＢＬＡＳＴ アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ 解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターから公的に利用できる。(<www.ncbi.nim.nih.gov>)そのアルゴリズムは、データベース中の長さＷ のワードと共に並べた場合にポジティブ評価の閾値Ｔ に適合し、または充足させる照会配列中の長さＷ の短いワードを同定することによって、高得点配列対（ｈｉｇｈ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐａｉｒｓ（ＨＳＰｓ）） をまず同定することを含む。 それら最初の隣接ワードのヒットは、それらを含む長いＨＳＰｓ を見出すための開始点として働く。累積整列得点（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｃｏｒｅ） ができるだけ増えるように、比較する２つの配列のそれぞれに沿って両方向にワードヒットを展開する。ワードヒットの延長は：累積整列得点が最大達成値より定めた定数Ｘ から遠ざかる；累積得点がゼロまたはそれ以下に下がる；または何れかの配列の末端に達する：場合に止まる。ＢＬＡＳＴ アルゴリズムパラメーターＷ 、Ｔ 、およびＸ は、整列の感度および速さを特定する。ＢＬＡＳＴ プログラムは、初期設定として、ワード長（Ｗ） が１１ 、ＢＬＯＳＵＭ６２ スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｇ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： １０９１５ （１９８９）） 整列（Ｂ） が５０ 、期待値（Ｅ） が１０ 、Ｍ’５ 、Ｎ’−４ 、および両鎖の比較を用いる。
【０１０９】
さらに、ＢＬＡＳＴ アルゴリズムは、２ つの配列間の類似性の統計解析を実施する（例えばＫａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ５８７３−５７８７ （１９９３） を参照）。ＢＬＡＳＴ アルゴリズムによってもたらされる類似性の１ つの指標は、２ つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の指標を提供する最小総確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ） （Ｐ（Ｎ） ）である。例えば、評価核酸とセルラーゼ核酸との比較における最小総確率が、約０．１ より小さく、より好ましくは約０．０１ より小さく、さらに最も好ましくは約０．００１ よりも小さい場合に、最も好ましくは0.001よりも小さい場合に、ある核酸が本発明のセルラーゼ核酸に類似するとみなされる。
【０１１０】
CBH1セルラーゼの安定性を修正するための追加の特定方法は下に提供される。
【０１１１】
（1）主鎖伸張（unfolding）のエントロピーを低くすることは酵素に安定性をもたらす。例えば、プロリン残基の導入は伸張（unfolding）のエントロピーを低くすることによってタンパク質を安定にする。（Watanabe, et al., Eur. J. Biochem. 226: 277-283 (1994)参照のこと。）同様に、グリシン残基はβ-炭素を有しておらず、それから、かなり、多くの他の残基より大きな中心立体配座の自由を持っている。好ましくはアラニンとのグリシンの置き換えは、伸張（unfolding）のエントロピーを減らし、安定性を改善する。（Matthews,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84; 6663- 6667(1987)参照のこと。）加えて、外部ループの短縮により、安定性を改善することが可能である。超好熱菌が生産したタンパク質はそれらの中温の相同体より短い外部ループを持っていることが観察されている。（Russel, et al., Current Opinions in Biotechnology 6: 370-374 (1995)参照のこと）ジスルフィド結合の導入は、また、互いに関連して別個の三次構造を安定させるために効果的である。従って、既存のシステインにアクセス可能な残基のシステインの導入またはジスルフィド結合を成形することができるシステインの対の導入はCBH1変異体の安定性を変更するであろう。
【０１１２】
（2）側鎖疎水性を増大させることによって内部腔を減少させることは酵素の安定性を変更する。内部腔の数及び容量を減らすことは疎水相互作用を最大化し、詰込み欠損（packing defects）を減らすことによって酵素の安定性を増やす。(Matthews, Ann. Rev. Biochem. 62: 139-160 (1993); Burley, et al., Science 229: 23-29 (1985); Zuber, Biophys. Chem. 29: 171-179 (1988); Kellis, eta/., Nature 333: 784-786 (1988)参照のこと)高温菌からの多重結合のタンパク質がしばしばそれらの中温の対応するものより大きな表面相補性によってより多くの疎水性のサブ・ユニット・インタフェースを持っていることは知られている。（Russel, et al.上記）この原理は、単遺伝子性のタンパク質の領域インタフェースに適用可能であると信じられている。疎水性を増大させることによって安定性を改善することができる特定の置換はアルギニンへのリジン、アラニンへのセリン、およびアラニンへのトレオニンを含む。（Russel, et al.上記）アラニンまたはプロリンへの置換による変更は、結果としてくぼみを縮小し、内部を充填し、疎水性を増大すると伴に側鎖サイズを増やす。くぼみのサイズを減らし、疎水性を高め、CBH1の領域の間のインタフェースの相補性を改善するための置換は酵素の安定性を改善する。特に、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、およびイソロイシンから選ばれた異なる残基を持つ、これらの位置の特定の残基の変更は性能を改善する。
【０１１３】
（3）剛性2次構造内（すなわち、α-へリックス及びβ-ターン）の電荷を平衡にすることは安定性を改善する。例えば、アスパラギン酸の上の負電荷によってへリックスN-末端の上の部分的な陽電荷を中和することは構造の安定性を改善する。（Eriksson, et al., Science 255: 178-183 (1992)参照のこと）同様に、陽電荷によってへリックスC末端の上の部分的な負電荷を中和することは安定性を改善する。β-ターンにおけるペプチドN末端との相互作用から陽電荷を取り除くことは、三次構造安定性を与えることにおいて効果的であるはずである。非正帯電残基との置換は、好ましくない陽電荷を、ターン内にあるアミド窒素との相互作用から取り除くことができた。
【０１１４】
（4）三次構造を安定させるために塩橋と水素結合を導入することは効果的である。例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸とリジン、アルギニンまたはヒスチジンの間のイオン対相互作用は強い安定効果を導入し、その結果生じる耐熱性の改善を伴う、違う三次構造要素を付加するのに用いられる。さらに、チャージされた残基/チャージされなかった残基水素結合の数と水素結合の数の増加は耐熱性を改善することができる。（Tanner, et al., Biochemistry 35: 2597-2609 (1996)を参照のこと）アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、またはグルタミンの置換はバックボーンアミド(a backbone amide)に水素結合を導入することができる。アルギニンの置換は塩橋を改善し、水素結合をバックボーンカルボニル(a backbone carbonyl)に導入することができる。
【０１１５】
（5）不耐熱性残基を減らすことは、一般的に熱安定性を増す。例えば、アスパラギンとグルタミンはアミド分解に影響され易く、システインは高温で酸化に影響され易い。感受性の高い位置にあるこれらの残基の数を減らすことは結果として耐熱性を改善する。(Russel, etal.上記)グルタミンまたはシステイン以外のどのような残基による置換または欠失でも不耐熱性残基を減らすことによって安定性を増大させることができる。
【０１１６】
与えられたリガンドの結合を安定化又は不安定化することは、CBHI変異体へ安定性を修正する。例えば、この発明のCBH1変異体が使われる基質の成分はCBH1変異体の特定の界面活性物質/熱感受性部位に結合する。置換によりこの部位を修正することによって、この変異体への成分の結合は強化されるか、減少するかもしれない。例えば、CBH1の結合凹部の中の非芳香族残基は、セルロース基質の相互作用が、CBH1変異体の安定性を増大させて、好ましくはベンジル輪と相互作用する芳香族側鎖の安定化を導入するためにフェニルアラニンまたはチロシンによって置換される。
【０１１７】
（７）任意の界面活性物質/熱感受性リガンドの電気陰性度を増大させることは界面活性物質または温熱ストレス下で安定性を改善する。例えば、フェニルアラニンまたはチロシンをの置換は、溶媒から遮へい性を改善することによりD(アスパラギン酸塩)残基の電気陰性度を増大させることができる。
【０１１８】
C.抗-CBH抗体
本発明はさらに抗-CBH抗体を提供する。この抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、または異対抗体である。
【０１１９】
ポリクローナル抗体の調製方法は本技術分野で知られている。免疫を作る因子はCBHポリペプチドまたはその融着タンパク質である。免疫性を与えられた哺乳類の中の免疫原であると知られているタンパク質に抗原を接合させることは有益である。免疫化方法は標準的な方法又は定型的実験に基づいて当業者によって決定される。
【０１２０】
または、この抗-CBH抗体はモノクローナル抗体であるかもしれない。モノクローナル抗体は免疫を与えられた動物の細胞、又は組み換えDNA方法を用いた細胞によって作り出される（Kohler et al., Nature, vol. 256, pp. 495-499, August 7,1975 ; U. S. Patent No. 4,816, 567）参照のこと）。
【０１２１】
本発明の抗-CBH抗体は、さらにヒト化又はヒト抗体からなる。“ヒト化抗体”という語は、キメラ抗体、免疫グロブリンチェーン、または非ヒト抗体由来配列によるタンパク質を含むそれらの断片（Fv、Fab、Fab'、F(ab')2または抗体の他の抗原結合部配列などの非ヒト(例えば、ネズミ)抗体のヒト化されたもの言う。非ヒト抗体をヒト化する方法は本技術分野においてよく知られており、このことに関するさらなる詳細な記載は、Jones et al., Nature 321: 522-525,1986 ; Riechmann etal., Nature, vol. 332, pp. 323-327,1988 ; 及び Verhoeyen et al., Science, vol. 239, pp. 1534-1536,1988にある。ヒト抗体を生産する方法も本技術分野において知られている。例えば、Jakobovits, A, et al., Annals New York Academy of Sciences, 764: 525-535,1995 and Jakobovits, A, Curr Opin Biotechnol 6 (5): 561-6,1995を参照のこと。
【０１２２】
VI. 組み換えCBH1変異体の発現
必要とするCBH I発現の特定の方法を使用しないで変異体のCBH Iを表現するために、本発明に係る方法においては使用細胞に依存している。
【０１２３】
本発明は変異体CBHをエンコードしている核酸配列からなる発現ベクターであって、形質を変換、転換、又は移入された宿主細胞を提供する。温度、pHのような培養条件は形質変換、形質転換又は形質移入していない親宿主細胞に対して用いているものと同じであり、それらは本技術分野でよく知られている。
【０１２４】
1のアプローチにおいて、糸状菌細胞又は酵母細胞は宿主細胞株の中で機能する。つまりこの細胞株の中で発現されるCBHをエンコードするDNAセグメントに結合可能であるプロモーター又は、生物学的活性を有するプロモータ断片又は1以上の（例えば、一続きの）エンハンサーにより形質転換される。
【０１２５】
A. 核酸構成物/発現ベクター
CBHIをエンコードする天然のまたは合成のポリヌクレオチド断片（「CBHIエンコード核酸配列」）は、糸状菌又は酵母菌細胞に導入されることが可能で、複製することができる非相同核酸構成物又はベクターに組み込まれる。ここで開示しているこのベクターと方法は、CBHIを発現する宿主細胞に用いることに適している。それが、導入される細胞の中で複製され、育成できる限り、どのようなベクターでも使用される。数多くの適したベクター及びプロモーターは本技術分野において知られており、商業的に入手可能である。クローニング及び発現ベクターはSambrook et al., 1989, Ausubel FM et al., 1989, and Strathernet al., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1981において開示されており、それらは明示的に参照によってここに組み込まれる。細菌（糸状菌）に対する適切な発現ベクターは、van den Hondel, C. A. M. J.J.et al. (1991) In : Bennett, J. W. and Lasure, L. L.(eds.) More Gene Manipulations in Fungi. Academic Press, pp. 396-428に記載されている。適切なDNAシーケンスは、さまざまな処置によって、プラスミドまたはベクター(「ベクター」としてここに集合的に参照される)に挿入される。一般的に、DNAシーケンスは標準的な操作法によって適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。そのような処置と関連したサブクローニング処置は、当業者の知識の範囲の中にあると考えられる。
【０１２６】
変異体CBH Iのためにコーディング配列から成っている組換型糸状菌は、糸状菌の選ばれた系統の細胞の中に変異体CBH Iコーディング配列から成っている異種の核酸構成物を導入することによって作り出される。
【０１２７】
一旦変異体cbh核酸配列の好ましい形質が得られると、それは様々な方法により変更される。この配列が非コーディングフランキング領域を含む所で、フランキング領域は切除、変異誘発などを受ける。従って、転位、転換、欠失、および挿入が自然に存在する配列上で起こる。
【０１２８】
選ばれた変異体のcbhコーディングシーケンスは、よく知られた組換技術に従って適当なベクターに挿入され、CBH I発現が可能な糸状菌を変換するために使われる。遺伝コード固有の縮退のため、実質的に同じかまたは機能的に同じアミノ酸配列をエンコードする他の核酸配列は、変異体のCBH Iをクローンし、発現するために使われる。従って、コード領域の中のそのような置換が本発明によってカバーされた配列変異体に入ることは高く評価される。いくつかの及び全てのこれらの配列変異体は、親CBH lエンコーディング核酸配列についてここに記述されるのと同じ方法で利用することができる。
【０１２９】
上で説明したように、本発明はまた変異体のCBHI-エンコーディング核酸配列の1以上から成る組換型の核酸構成物を含む。この構成物は本発明の配列へ前に向けて又は逆向きに挿入されているプラスミド又はウイルスのベクターのようなベクターから成る。
【０１３０】
非相同核酸構成物は変異体cbhコード配列を：(i)分離して；(ii) 融合タンパク質又はcbhコード配列が優性形質コード配列である所のシグナルペプチドコード配列のような付加的コード配列との組み合わせで；(iii) 適切な宿主中のコーディング配列の発現のために効果的なプロモーター及びターミネーターエレメント、または5’及び/又は3’の非翻訳領域のような、イントロン及び制御エレメントのような非コード配列との組み合わせで、及び/又は(iv) cbhコーディング配列が非相同遺伝子であるベクターまたは宿主の環境の中に含まれる。
【０１３１】
本発明の1の態様において、非相同核酸構成物は確立された糸状菌及び酵母菌の系統が好む状態で、in vitroにおいて変異体CBHIエンコーディング核酸配列を細胞内へ運搬するのに用いる。長期の変異体CBH Iの生産の間の安定した発現が好まれる。安定した形質転換体を生成する効果的などのような方法でも、本発明を行うことにおいて使われることになる。
【０１３２】
適切なベクターは典型的には、選択可能マーカーをエンコードしている核酸配列、挿入部位及び適した制御エレメント、すなわち、プロモーター及びターミネーター配列を有している。このベクターは、例えば、イントロン及び制御エレメントのような非コード配列を含む調節領域、すなわち、コード配列と操作可能に結合する宿主細胞（及び/又は修正された可溶性のタンパク質抗原コード配列が正常に表現されないベクター又は宿主細胞環境）内でコード配列を発現するのに効果的なプロモーター及びターミネーターエレメント又は、5’及び/又は3’非翻訳領域からなる。数多くの適切なベクター及びプロモーターは本技術分野においてよく知られており、多くは商業的に入手可能である。そして/又は、Sambrook,et al.、(上記)に記載されている。
【０１３３】
典型的なプロモーターは構成性プロモーター及び誘発性プロモーターの両方を含み、その例は、CMVプロモーター、SV40初期プロモーター、RSVプロモーター、EF-1αプロモーター、説明される(ClonTechとBASF)ようにtet-onまたはtet-offシステムの中にtet応答エレメント(TRE)を含んでいるプロモーター、ベータアクチンプロモーター、および特定の金属塩の添加によって上向き調節されるメタロチオニンプロモーターを含む。プロモーター配列は、表現目的に対して特定の糸状菌によって認識されるDNA配列である。それは変異体CBH IポリペプチドをエンコードしているDNA配列と操作可能に結び付く。そのような結合は、開示された発現ベクターの中で変異体CBH IポリペプチドをエンコードしているDNAシーケンスの開始コドンに対するプロモーターの位置合わせから成っている。このプロモーター配列は、変異体CBH Iポリペプチドの表現を伝達する転写と翻訳制御シーケンスを含んでいる。このプロモーターの例として、アスペルギウス ニガー（Aspergillus niger）A.アワモリ（A awamori）又は A.オリゼア（A. oryzae）由来の グルコアミラーゼ, アルファ-アミラーゼ, 又は アルファ-グルコシダーゼ をエンコードしている遺伝子；A.ニドゥランス（A.nidulans）のgpdA 又はtrpC 遺伝子；ニューロスポラ クラッサ（Neurospora crassa）のcbh1 又はtrp1 遺伝子；A. ニガー（A.niger） 又は リゾムコア ミエヘイ（Rhizomucor miehei）のアスパラギン酸 プロテイナーゼ エンコード遺伝子；H. ジェコリーナ（H. jecorina）（T.レーシ(T. reesei)）のcbh1, cbh2,egl1, egl2, 又は他のセルラーゼをエンコードしている遺伝子を含む。
【０１３４】
適切な選択マーカーの選択は宿主細胞に依存し、異なる宿主に対する適切なマーカーは本技術分野においてよく知られている。典型的な選択マーカーの遺伝子は、A.ニドゥランス（A.nidulans）又は T.レーシ(T. reesei)由来のargB A.ニドゥランス（A. nidulans）由来のamdS、ニューロスポラ クラッサ（Neurospora crassa）あるいはT.レーシ(T. reesei)由来のpyr4、 アスペルギウス ニガー（Aspergillus niger）又は A.ニドゥランス（A.nidulans）由来のpyrGを含む。さらに典型的な選択マーカーは、非相同核酸構成物の中でtrp-、pyr-、leu-および同類のものなどの突然変異系統の変換に使われた非相同核酸構成物に含まれているtrpc、trp1、oliC31、 niaD 又は leu2を含むけれどそれらに限定されない。
【０１３５】
そのような選択マーカーは、糸状菌によって通常新陳代謝させられない代謝産物を利用する能力を転換体に与える。例えば、アセトアミダーゼ酵素をエンコードしているH. ジェコリーナ（H. jecorina）由来のamdS遺伝子は転換体細胞が窒素源としてアセトアミドを利用することを可能にする。この選択マーカー(例えば、pyrG)は、選択最小培地の上で成長する栄養要求変異体系統の能力を復元し、あるいは、選択マーカー(例えば olic31)は、抑制薬または抗生物質があると成長する能力を転換体に与えるかもしれない。
【０１３６】
配列をコードしている選択マーカーは、本分野で一般的に用いられている方法を用いて任意の適切なプラスミド内へクローンされる。典型的なプラスミドはpUC18、pBR322、pRAX 及びpUC100を含む。このpRAX プラスミドはA. ニガー（A.niger）内でも複製することができるA.ニドゥランス（A.nidulans）由来の AMA1 配列を含んでいる。
【０１３７】
本発明の実行に関しては、違った形で示されない限り、分子生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の分野において知られている従来の技術を使用する。そのような技術は文献において十分に説明される。例えば Sambrook et al., 1989; Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Ausubel, et al., 1993; and Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991を参照のこと。
【０１３８】
B. CBH1生産のための宿主細胞と培養条件
(i)糸状菌
本発明は、結果的に対応する形質変換されていない親真菌との関連において、CBH1変異体の生産又は発現に効果的な方法で変換され、選択され、培養される細胞からなる糸状菌を提供する。
【０１３９】
変異体CBH1に発現をさせ及び/又は変換させる親糸状菌種の例は、トリコデルマ（Trichoderma）を含むがそれらに限られない。例えば、トリコデル マレーシ（Trichoderma reesei）、トリコデルマ ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ ビリデ（Trichoderma viride）、トリコデルマ コニンギ（Trichoderma koningii）；ペニシリウム種（Penicillium sp.）、フミコーラ インソレンス（Humicola insolens）を含むフミコーラ種（Humicola sp.）、アスペルギウス種（Aspergillus sp.）、クリソスポリウム属（Chrysosporium sp.）、フサリウム属（ Fusarium sp. ）ハイポクレア属（Hypocrea sp.）及び エメリセラ属（Emericella sp.）である。
【０１４０】
CBHIを発現している細胞は、通常、親糸状菌の培養に用いる条件のもとで培養される。一般的に細胞はPourquie, J. et al., Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, eds. Aubert, J. P. et al., Academic Press, pp. 71- 86, 1988 and Omen, M. et al., Appl. Environ. Microbiol. 63: 1298-1306,1997において開示されているような生理的塩と栄養素を含む標準培地内で培養される。培養条件もまたほぼ決まっており、培養はCBH I表現が要求されるレベルが達成するまで、振盪培養機または発酵槽内において28℃で培養される。
【０１４１】
与えられた糸状菌のための好ましい培養条件は科学文献において、および／または米国菌培養収集所(ATCC；「http://www. atcc.org/」)などの真菌についての情報源に見出される。細菌の発育が確立された後に、細胞は、変異体のCBH1の表現を引き起こし又は可能にするのに効果的な条件下に置かれる。
【０１４２】
CBH Iコード配列が誘導性のプロモーターの制御下にある場合、誘発因子、例えば、糖、金属塩または抗生物質は、CBH I表現を引き起こすために効果的な濃縮で培地に添加される。
【０１４３】
1の実施態様においては、この系統はタンパク質の過剰発現に有用であるアスペルギルス ニガーから成る。例えば、A.ニガー（A.niger）の1種であるアワモリ（awamori） dgr246は、多量の分泌性セルラーゼを分泌することが知られている。GCDAP3、 GCDAP4 およびGAP3-4のような A.ニガー（A.niger）の1種であるアワモリ（awamori）の他の系統は、known Ward et al (Ward, M, Wilson, L. J. and Kodama, K. H., 1993, Appl. Microbiol. Biotechnol. 39: 738-743)で知られている。
【０１４４】
他の実施態様においては、この系統はタンパク質の過剰発現に有用であるトリコデルマ レーシ（Trichoderma reesei）からなる。例えば、Sheir- Neiss, et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 20: 46-53 (1984)に記載のRL-P37は多量のセルラーゼ酵素を分泌することが知られている。RL-P37と機能的に同等な種はトリコデルマ レーシ（Trichoderma reesei）系統RUT-C30(ATCC No.56765)及びQM9414(ATCC No.26921)を含む。これらの系統もまた、変異体のCBH1を過剰発現することについて有用であるということが予測それる。
【０１４５】
潜在的に有害なネイティブセルロース分解活性を欠いた変異体CBH Iを得ることが要求される場合、変異体CBH IをエンコードしているDNA断片を含むDNA構成物又はプラスミドの導入に先駆けて1つ以上のセルラーゼ遺伝子を削除させたトリコデルマ宿主細胞を得ることは有用である。そのような系統は、U. S. Patent No. 5,246, 853 及び WO 92/06209に開示されている方法により調製される。これらの内容は引用によりここに組み込まれる。1以上のセルラーゼ遺伝子を欠いている宿主微生物の中で変異体CBH Iセルラーゼを発現することによって、識別とその後の精製処置は簡素化することができる。クローン技術で生産されたトリコデルマ種からのどのような遺伝子、例えば、cbh1、cbh2、egl1、及びegl2 遺伝子だけでなく、 それらをエンコードしているEGIII 及び/又は EGV タンパク質 (U. S. Patent No. 5,475,101 及びWO 94/28117をそれぞれ参照のこと)でも欠失させることができる。
【０１４６】
遺伝子欠失は、欠失又は崩壊させるために要求される遺伝子の形を本技術分野で知られている方法によりプラスミドに挿入することによって行われる。この欠失プラスミドは、適切な制限酵素サイト、即ち要求される遺伝子コード領域の内部で切断され、遺伝子コーディングシーケンスまたはその部分は選択マーカーと取り替えられる。欠失又は崩壊される遺伝子の位置からのフランキングDNA配列は、好ましくは約0.5から2.0 kbであり、選択マーカー遺伝子のどちらかの側にある。適切な欠失プラスミドは、欠失された遺伝子を含み、フランキングDNAシーケンスを含む断片と、選択可能なマーカー遺伝子を1つの線形の断片として取り除かれることを可能にするために、その中に存在するユニークな制限酵素サイトを持つ。
【０１４７】
選択マーカーは、形質転換された微生物の検出を可能にするように選ばれなければならない。選ばれた微生物の中で発現するどのような選択マーカー遺伝子でも適切である。例えば、アスペルギウス種（Aspergillus sp.）用いるときには、選択マーカーは転換体の中の選択マーカーの存在がその特性に有意に影響しないように選ばれる。そのような選択マーカーは、分析可能な生産物をエンコードする遺伝子である。例えば、アスペルギルス種（Aspergillus sp.）遺伝子の機能的なコピーは宿主系統の中の欠失がその栄養素要求株の表現型を結果として生じているならば使われうる。同様に、選択マーカーはトリコデルマ種についても存在している。
【０１４８】
１の実施態様においては、アスペルギルス種（Aspergillus sp.）のpyrG-誘導株は実際に、それは転換のために選択マーカーを提供する機能的なpyrG-遺伝子によって変換される。pyrG-誘導株はフルオロオロチン酸(FOA)に抵抗力があるアスペルギルス種（Aspergillus sp.）系統の選択によって得られる。このpyrG遺伝子はウリジンの生合成のために必要とされている酵素であるオロチジン-5'-モノリン酸デカルボキシラーゼをエンコードしている。インタクトpyrG遺伝子の株はウリジンを欠く培地中で成長するけれども、フルオロオロチン酸に敏感である。FOA耐性の選択により、機能的なオロチジンモノリン酸塩脱炭酸酵素を欠き、成長のためにウリジンを必要としているpyrG誘導株を選ぶことは可能である。このFOA選択を用いて、機能的なオロチンピロフォスフォリボシル（ortate pyrophosphoribosyl）転移酵素を欠くウリジン要求株を得ることも可能である。この酵素をエンコードしている遺伝子の機能的なコピーによってこれらの細胞を形質変換することは可能である（Berges & Barreau, Curr. Genet. 19: 359-365 (1991), 及び van Hartingsveldte et al., (1986) Development of a homologous transformation system for Aspergillus niger based on the pyrG gene. Mol. Gen. Genet. 206: 71-75）。誘導株の選択は、上で述べたFOA耐性技術を用いて容易に行うことができ、実際、tpyrG遺伝子を選択マーカーとして用いることが好ましい。
【０１４９】
第二の実施態様においては、ハイポクレア属(Hyprocrea sp. (Trichoderma sp.))の pyr4-誘導株は、実際に、転換のために選択マーカーを提供する機能的なpyr4 遺伝子を用いて形質転換される。pyr4-誘導株はフルオロオロチン酸(FOA)に抵抗力があるハイポクレア属（Hyprocrea sp.） (Trichoderma sp.)株の選択によって得られる。このpyr4-遺伝子はウリジンの生合成のために必要とされている酵素であるオロチジン-5'-モノリン酸デカルボキシラーゼをエンコードしている。インタクトpyr4-遺伝子の株はウリジンを欠く培地中で成長するけれども、フルオロオロチン酸に敏感である。FOA耐性の選択により、機能的なオロチジンモノリン酸塩脱炭酸酵素を欠き、成長のためにウリジンを必要としているpyr4-誘導株を選ぶことは可能である。このFOA選択を用いて、機能的なオロチンピロフォスフォリボシル（ortate pyrophosphoribosyl）転移酵素を欠くウリジン要求株を得ることも可能である。この酵素をエンコードしている遺伝子の機能的なコピーによってこれらの細胞を形質変換することは可能である。（Berges & Barreau, Curr. Genet. 19: 359-365 (1991)） 誘導株の選択は、上で述べたFOA耐性技術を用いて容易に行うことができ、実際、pyr4-遺伝子を選択マーカーとして用いることが好ましい。
【０１５０】
アスペルギルス種（Aspergillus sp.）のpyrG又はハイポクレア属（Hyprocrea sp. (Trichoderma sp.)）のpyr4の 1以上のセルラーゼ遺伝子を発現する能力を欠くように形質転換するために、崩壊されたか、欠失されたセルラーゼ遺伝子から成る1つのDNA断片は欠失プラスミドから単離され、形質転換のためにpyr- アスペルギウス（Aspergillus） 又は pyr-トリコデルマ（Trichoderma） 宿主に用いられる。形質転換体は、pyrGまたはpyr4のそれぞれの遺伝子産物を表現するそれらの能力に基づいて、識別され、選ばれる。従って形質転換体は宿主株のウリジン栄養要求性を好む。サザンブロット法分析は、部分またはすべての適切なpyr-選択マーカーによって欠失される遺伝子のゲノムのコピーのコドン領域を置換する2倍体交叉組み込みイベントを識別し、それを確認するために、結果として生じる転換体に対し行われる。
【０１５１】
上で説明した特定のプラスミドベクターはpyr転換体のプレパラートと関連しているが、本発明はこれらのベクターに制限されない。上記の技術を用いて、様々な遺伝子が、アスペルギルス種（Aspergillus sp.）またはハイポクレア属（Hyprocrea sp. ）トリコデルマ種(Trichoderma sp.)の株において欠失されて、置換することができる。 さらに、上で議論したように、どのような入手可能な選択マーカーでも使うことができる。実のところ、クローン技術で生み出され、それから識別されているどのような宿主、例えばアスペルギルス属、またはハイポクレア属でも、あるいは遺伝子でも、上記で説明された方法を使って、ゲノムから削除することができる。
【０１５２】
上に述べたように、選ばれた選択マーカーと一致している1の又は複数の機能しない遺伝子を欠くか、または有している宿主の系統はハイポクレア属（Hyprocrea sp. ）(トリコデルマ属(Trichoderma sp.))の誘導株であるかもしれない。例えば、pyrGの選択マーカーがアスペルギルス種（Aspergillus sp.）に選ばれるならば、特定のpyrG誘導体株は形質転換処置の中の受容体として使われる。また、例えば、pyr4の選択マーカーがハイポクレア属（Hyprocrea sp. ）に選ばれるならば、特定のpyr4誘導体株は形質転換処置の中の受容体として使われる。同様に、アスペルギルス-ニデュランス（Aspergillus nidulans）遺伝子amdS、argB、trpC、niaDと等しいハイポクレア属（Hyprocrea sp.）(トリコデルマ属(Trichoderma sp.))から成る選択マーカー遺伝子が使われるかもしれない。従って、対応する受容株は、それぞれasargy-、trpC-、 niaD-のような誘導株でなければならない。
【０１５３】
CBH I変異体をエンコードしているDNAは適切な微生物へ挿入するために準備される。本発明によると、CBH I変異体をエンコードしているDNAは、機能的なセルロース分解活性を有するタンパク質のためにエンコードするのに必要なDNAから成る。CBH I変異体をエンコードしているDNA断片は細菌のプロモータ配列、例えば、アスペルギルス種（Aspergillus sp.）の中のglaA遺伝子のプロモーターまたはトリコデルマ属(Trichoderma sp.)の中のcbh1またはegl1遺伝子のプロモーターに機能的に付着する。
【０１５４】
CBH I変異体をエンコードしているDNAの複数のコピーが、過剰発現を容易にするためにこの株の中に組替えられることもまた予測される。CBH I変異体をエンコードするDNAは、変異体をエンコードするこのDNAを運ぶ発現ベクターの構成物によって調製される。CBH I変異体をエンコードする挿入されたDNA断片を運んでいる発現ベクターは与えられた宿主の生物の中で自律的に複製し、または宿主のDNAの中に融合することが可能であるようなベクターでもあり、一般的にはプラスミドである。好ましい実施例の中で、遺伝子の表現を得るための2タイプの発現ベクターが考えられる。一番目は、発現するためにすべてこの遺伝子に由来するプロモーター、遺伝子コドン領域、およびターミネーター配列のDNA配列である。それ自身の転写及び翻訳調節配列の制御下で、表現するためにその領域を取り除く必要から、望まれていないDNA配列（例えば、要求されていない領域のコード）を削除することによって、必要な位置で遺伝子を切断することができる。選択マーカーは、また新規な遺伝子配列の複数のコピーされた宿主の中へ組み込むために、選択を受け入れるベクター上に含まれている。
【０１５５】
2番目のタイプの発現ベクターはあらかじめ集められ、ハイレベルの転写と、選択マーカーに必要とされる配列を含んでいる。それが表現カセットプロモーターと重合停止剤配列の転写調節されるように、その遺伝子または遺伝子の部分のコドン領域が、この汎用ベクターに挿入することができるものと考えられる。
【０１５６】
例えば、アスペルギルス属の中で、pRAXはそのような汎用発現ベクターである。その遺伝子または部分は強いglaAプロモーターの下流に挿入することができる。
【０１５７】
例えば、ハイポクレア属の中で、pTEXはそのような汎用発現ベクターである。その遺伝子または部分は強いcbh1プロモーターの下流に挿入することができる。
【０１５８】
ベクター内で、本発明のCBH I変異体をエンコードしているDNAシーケンスは転写及び翻訳配列、すなわち構造遺伝子への読み枠の中の適当なプロモータ配列とシグナル配列と操作可能に結び付く。このプロモーターは宿主細胞の中で転写活性を示し、相同の、または非相同の蛋白質をエンコードしている遺伝子から宿主細胞に届けられるどのようなDNAシーケンスである可能性がある。任意的なシグナルペプチドはこのCBH I変異体の細胞外生産を提供する。
【０１５９】
シグナルシーケンスをエンコードするDNAは、好適には、おのずから発現すべき遺伝子に関係するものであるが、適切なソース、例えばトリコデルマ属のエクソ-セロビオハイドラーゼあるいはエンドグルカナーゼであるが、から得られるシグナルシーケンスが本発明から予測することができる。
【０１６０】
プロモーターとともに本発明の変異体CBH IをコードするDNA配列を結合し、そして適切なベクターへ挿入するために用いる方法は本技術分野でよく知られている。
【０１６１】
上で説明したDNAベクターまたは構成物は形質転換、形質移入、顕微注射、マイクロポレーション（microporation）遺伝子銃攻撃法及び同種の既知の技術によって宿主細胞の中で取り込まれる。
【０１６２】
好ましい形質転換技術において、ハイポクレア属（Hyprocrea sp. ）(トリコデルマ属(Trichoderma sp.))におけるDNAへの細胞壁の透過性は非常に低いうことを考慮しておかなければならない。そのため、目的とするDNAシーケンス、遺伝子、または遺伝子断片の取り込みは最小化される。形質転換処理に先立って、誘導株内で（すなわち、使われた選択マーカーと一致する機能的な遺伝子を欠いている誘導株）でハイポクレア属（Hyprocrea sp. ）(トリコデルマ属(Trichoderma sp.))の細胞壁の浸透性を高めるための数多くの方法がある。
【０１６３】
形質転換のためにアスペルギルス属spまたはHyprocrea sp(トリコデルマsp)を調製する、本発明における好適な方法は、細菌の菌糸体からプロトプラストを調製する方法に関係する。Campbell et al. Improved transformation efficiency of A. niger using homologous niaD gene for nitrate reductase. Curr. Genet. 16: 53-56; 1989を参照のこと。菌糸体は発芽した栄養胞子から得ることができる。菌糸体は、原形質を消化する酵素を用いて処理され、最終的にプロトプラストになる。原形質体は、懸濁培地の中の浸透圧安定剤によって保護される。このような安定剤はソルビトール、マンニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、およびそれに類したものを含む。通常、これらの安定剤の濃度は0.8Mと1.2Mの間で変動する。使用するのに望ましいものは、懸濁培地の中のソルビトールの濃度が1.2Mの溶液である。
【０１６４】
宿主株(（アスペルギルス属またはハイポクレア属（トリコデルマ属））の中へDNAを取込むことは、カルシウムイオン濃縮に依存している。一般に、約10mMのCaCl2から約50mMのCaCl2が取込むための溶液に用いられる。取込み溶液の中にはカルシウムイオンが必要であるが、この他に、一般に含まれる他のアイテムとしてはTE緩衝液(10 mMトリス、pH7.4;1 mM EDTA)または10mM MOPS、pH6.0の緩衝液(モルホニルプロパンスルホン酸(morpholine propane sulfonic acid))とポリエチレン・グリコール(PEG))と、ポリエチレン・グリコール(PEG)などの緩衝システムである。培地の内容物が宿主細胞、例えば、アスペルギルス属またはハイポクレア属系統のどちらかの細胞質の中に送られることを許容している細胞膜を溶融させるために、ポリエチレン・グリコールが機能することが知られており、この結果プラスミドDNAは核に転送される。この融合により、宿主の染色体の中に柔軟に組み込まれたプラスミドDNAの複数のコピが頻繁に取られる。
【０１６５】
通常、105 から106/mLの密度で、好ましくは2x108/mLの密度で透過処理をされたアスペルギルス属の原形質体または細胞を含んでいる懸濁液は、形質変換に用いられる。同様に、108 から109/mLの密度で、好ましくは2x105/mLの密度で透過処理されたハイポクレア属（トリコデルマ属）の原形質体または細胞を含んでいる懸濁液は、形質変換に用いられる。適切な溶液(例えば1.2Mのソルビトール;50 mM CaC12)中の、これらの原形質体または細胞の体積100 μL液中の細胞は、目的とするDNAに混合される。一般に、高濃度のPEGが取込み溶液に添加される。25%PEG4000の0.1から1容量は原形質体懸濁液に添加することができる。ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウム、及び同種のものの添加物もまた取込み溶液に添加され、形質転換を促進する。
【０１６６】
一般に、混合物は約0℃で10から30分の間培養される。PEGの添加は、それから、さらに目的とする遺伝子またはDNAシーケンスの取り込みを強化するためにこの混合物に添加される。形質転換混合物の5から15倍の体積の25%PEG4000が一般的に添加される。；しかし、これより大きい、または小さい体積だあってるよい。25%PEG4000は好ましくは形質転換混合の体積の約10倍である。PEGが添加された後、ソルビトール及びCaCl2溶液の添加の前に形質転換混合物は室温でまたは氷の上で培養される。原形質体懸濁液はそれから、溶解した一定分量の増殖培地にさらに添加される。この増殖培地は転換体の成長だけを促進する。目的とする転換体を成長させるために適当な、いかなる増殖培地でも、本発明のにおいて用いることができる。しかしながら、Pyr+転換体が選択している場合、ウリジンを含まない増殖培地を使うことが好ましい。その後、コロニーはウリジンを使い果たした増殖培地の上で形質転換され、精製される。
【０１６７】
この段階において、安定した転換体は、ウリジンを欠いた固形培養媒質上の不完全な外形よりも、転換体のより速い生長率とスムーズな丸いコロニーの形成によって、不安定な転換体と区別できる。さらに、ある場合には、安定性のさらなる試験は、選択的でない固形培地(すなわち ウリジンを含む培地)上での転換体の成長によって行われる。そして、この試験は、ウリジンを欠いている選択培地の上で発芽し、成長した芽胞を収穫し、これらの芽胞のパーセンテージを決定することにより行われる。
【０１６８】
上記の方法に関する特定の実施例において、CBH I変異体(s)は、CBH I変異体の適切な翻訳過程の結果として、液体培地の中で成長した後に、宿主細胞から活性型として回収される。
【０１６９】
(ii)酵母菌
本発明はまたCBH I生産のために、宿主細胞として酵母を使用する場合もある。加水分解酵素をエンコードしているいくつかの他の遺伝子は、酵母菌S. cerevisiaeの様々な系統の中で発現されている。これらは、Trichoderma reesei(Cummings and Fowler, Curr. Genet. 29: 227-233,1996) 由来の2のエンドゴルカナーゼ(Penttila et al., Yeast vol. 3, pp 175-185,1987)、 2のセロビオハイドラーゼ(Penttila et al, Gene, 63: 103-112,1988) 及び1のベータ-グルコシダーゼ、Aureobasidlium pullulans (Li and Ljungdahl,Appl. Environ.Microbiol. 62, no. 1, pp. 209- 213,1996)由来の1のキシラナーゼ小麦(Rothstein et al., Gene 55: 353-356,1987)由来の1のアルファ-アミラーゼ等をエンコードしている配列を含んでいる。 さらに、ブチリビブリオ-フィブリソルベンスエンドー[ベータ]-1、4グルカナーゼ(END1)、Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase(CBH1)、Ruminococcus flavefaciens cellodextrinase(CEL1)、およびEndomyces fibrilizercellobiase(Bgl1)をエンコードしているセルラーゼ遺伝子カセットはS. cerevisiaeの実験室株の中での発現には成功している。(Van Rensburgeta/., Yeast, vol. 14, pp. 67-76,1998)
C. 宿主細胞へのCBH Iエンコーディング核酸配列の導入
本発明は、さらに外部発生的に提供される変異体CBH Iエンコーディング核酸シーケンスから成る、遺伝的に変性させられた細胞と細胞組成を提供する。親細胞または細胞系は、クローニングベクターまたは発現ベクターを用いて遺伝子組み替え（すなわち、形質導入、形質変換、又は移入）が行われた。ベクターは、上で開示したように、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどという形であるかもしれない。
【０１７０】
本発明の形質転換の方法は、糸状菌ゲノムの中へ形質転換ベクターのすべてまたは一部分が安定した組込みが行われた結果として行われる。結果として、自己再生する染色体外形質転換ベクターの維持をしている形質転換もまた、考慮される。
【０１７１】
多くの標準的な移入方法は、大量の 非相同タンパク質 を表現するトリコデルマレーシ細胞系を生産するために用いることができる。トリコデルマのセルラーゼ産出系統へ、DNA構成物を導入するために出版された方法のいくつかは、以下に記載されている。Lorito, Hayes, DiPietro and Harman, 1993, Curr. Genet. 24: 349-356; Goldman, VanMontagu and Herrera-Estrella, 1990, Curr. Genet. 17: 169-174; Penttila,Nevalainen, Ratto, Salminen and Knowles, 1987, Gene 6: 155-164。アスペルギルス属エルトンに係る方法はHamer and Timberlake, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1470-1474に記載され、フザリウム属バジャーに係る方法はPodila and Kolattukudy, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8202-8212に記載され、ストレプトマイシン属に係る方法はHopwood etal., 1985, The John Innes Foundation, Norwich, UKに記載され、バチルス ブリジディに係る方法はDeRossi, Bertarini, Riccardi and Matteuzzi, 1990, FEMS Microbiol. Lett. 55: 135-138)に記載されている。
【０１７２】
非相同核酸構成物（発現ベクター）を糸状菌（例えばH.ジェコリーナ）へ導入する他の方法としては、粒子または遺伝子銃の使用、形質転換処理に先立つ糸状菌細胞の透過化処理（例えば、高濃度のアルカリ例えば、0.05Mから0.4M CaCl2またはリチウム酢酸塩の使用）、プロトプラストの融合、またはアグロバクターを介した形質転換を含むが、これらに限られない。ポリエチレン・グリコールとCaC12によるプロトプラストまたはスフェロプラストの処理による糸状菌の模範的な転換法は、Campbell, E. I. et al., Curr. Genet. 16: 53-56, 1989 及び Penttila,M. etal., Gene, 63: 11-22,1988に開示されている。
【０１７３】
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための有名な処理のどれでも使うことができる。それらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラストの融合、電気穿孔法、微粒子銃、リポソーム、顕微注射、プラズマベクター、ウイルスベクター、およびクローンゲノムDNA、cDNA、合成DNA又は外来遺伝物質を宿主細胞に導入するようなほかによく知られている方法の使用をも含まれる。
【０１７４】
加えて、変異体CBH Iエンコーディング核酸シーケンスから成る非相同核酸構成物はin vivo及び例えば注入法などのよく知られた方法によって宿主細胞に導入され、その結果として生じるRNAで転写することができる。
【０１７５】
本発明はさらに、細菌セルラーゼ組成物を生産するためのA.ニガー及びH ジェコリナのような糸状菌であって、新規で、有益な転換体を含む。本発明は糸状菌、特に変異体CBH1をコード配列から、又は内因性cbhをコード配列から欠失させた菌類の転換体を含む。
【０１７６】
変異体のcbh1に対するコーディングシーケンスから成っている異種の核酸構成物に関する紹介によれば、遺伝子組み替えの細胞はプロモーターを活性化し、形質転換体を選定し、変異体のCBH Iエンコーディング核酸シーケンスの表現を増幅するのに適切となるように修正された栄養培地の中で培養されている。温度、pH等の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞のためにあらかじめ使われたものであり、本技術分野において明らかである。
【０１７７】
かかる非相同核酸構成物が導入された細胞の子孫は、一般に、非相同核酸構成物の中で見られる変異体CBH Iエンコーディング核酸シーケンスから成ると考えられる。
【０１７８】
本発明はさらに細菌セルラーゼ組成物生産における使用のためのH.ジェコリーナのような糸状菌であって、斬新で、有益な転換体を含む。本発明は糸状菌、特に変異体cbh1をコード配列又はcbhをコード配列から欠失させた菌類の転換体を含む。
【０１７９】
糸状菌の安定した転換体は、固形培養媒質上の不完全な外形よりはむしろ、それらのより速い生長率とスムーズな丸いコロニーの形成によって、不安定な転換体と区別することができる。加えて、ある場合には、固形の非選択的培地上の転換体を成長させ、この培地から、選択培地上で発芽し成長する芽胞を収穫し、そして、これらの芽胞のパーセンテージを決定することによって、安定性のさらなる試験を行うことができる。
【０１８０】
VII. CBH1核酸コーディング配列のための分析、および／またはタンパク質発現
変異体CBH Iエンコーディング核酸構成物によって変換している細胞系による変異体CBH Iの表現を評価するための検定が、タンパク質レベル、RNAレベルで、またはセロビオハイドラーゼの活性、および／または生産に対する機能的な生物検定を利用することにより行うことができる。
【０１８１】
ここに説明された変異体cbh 1の核酸と蛋白質配列の1つの典型的な用途において、糸状菌の遺伝子組み替え系統、例えば、トリコデルマレーシは、CBH Iの量を増加させるように設計することができる。かかる遺伝子組み替え糸状菌は、より大きなセルロースを分解する能力を有するセルラーゼ組成物を生産するために有益である。このことは、cbh 1のためのコーディングシーケンスを適当な宿主、例えばアスペルギウスニガーのような糸状菌に導入することによって行われる。
【０１８２】
従って、本発明は、糸状菌または他の適当な宿主の細胞の中にDNA配列エンコーディング変異体CBH Iを含む発現ベクターを導入することにより、糸状菌または他の適当な宿主の中で変異体CBH Iを発現するための方法を提供する。
【０１８３】
別の側面において本発明は、糸状菌または他の適当な宿主の中でCBH Iの発現を変更させる方法をも提供する。かかる変異は内因性CBHの発現の減少または消失を含むものである。
【０１８４】
一般に、変異体CBHIの発現の解析に用いられる分析法には、ノザンブロット法、ドットブロット法（DNAまたはRNA解析の用いる）、RT-PCR法（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）、又はインサイチュハイブリダイゼーション、適切なラベルプローブの使用（核酸配列に基ずく）及び従来のサザンブロット法及びオートラジオグラフィーがある。
【０１８５】
加えて、変異体CBHIの生産及び/又は発現は、例えばセロビオハイドラーゼ活性、発現、および／または生産にかかる分析法によって試料から直接測定することができる。かかる分析法は、Becker et al., Biochem J. (2001) 356: 19-30 and Mitsuishi et al., FEBS (1990) 275: 135-138に開示されており、参照によりここに組み込まれる。CBHIの分離された可溶性又は不溶性基質を加水分解する能力は、Srisodsuk et al., J. Biotech. (1997) 57: 49-57 及び Nidetzky and Claeyssens Biotech. Bioeng. (1994) 44: 961-966.に開示された分析法により測定することができる。セロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ又はβ-グルコシダーゼ活性の分析法に有用な基質には、結晶セルロース、濾紙、リン酸増加セルロース、セロオリゴサッカライド、メチルウンベリフェリル ラクトシド、メチルウンベリフェリルセロビオシド、オーソニトロフェニルorthonitrophenyl ラクトシド、パラニトロフェニル ラクトシド、オーソニトロフェニル セロビオシド、パラニトロフェニル セロビオシドがある。
【０１８６】
更に、タンパク質の発現は、細胞、組織切片の免疫組織学的染色又は組織培養培地のようなイムノアッセイ(免疫測定法)のような免疫学的方法を用いて行うことができる。（例えば、ウエスタンブロット又はELISA）かかるイムノアッセイは、質的及び量的にCBH I変異体の発現を評価するために用いることができる。かかる方法の詳細は当業者によく知られており、この方法を行うための多くの試薬が市販されている。
【０１８７】
変異体CBH Iの精製物を、様々なイムノアッセイの中で使用される発現されたタンパク質に反応するモノクローナルまたはポリクロナール抗体のいずれかを生産するためにも使用される。（Hu et al., Mol Cell Biol. vol. 11, no. 11, pp. 5792-5799,1991参照のこと）。典型的な分析法としては、エリサ(ELISA)、競合イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット法、間接免疫螢光測定法、およびそれに類したものがある。一般に、市販されている抗体、および／またはキットは、セロビオハイドラーゼ タンパク質の発現レベルの多くのイムノアッセイのために使われる。
【０１８８】
VIII. 組換体CBH1タンパク質の単離と精製
細胞培養中に生産された変異体CBH Iタンパク質は培地の中に分泌され、そして精製され、又は単離される。しかし、場合によっては、変異体のCBH Iタンパク質は細胞溶解産物から回復することが必要となる細胞の品種によって生み出される場合もある。かかる場合にには、変異体CBHIタンパク質は、当業者によって通常用いられている技術を利用して、かかる細胞から精製される。例えば、アフィニティークロマトグラフィー (Tilbeurghetal., FEBS Lett. 16: 215,1984), 高い分解パワーを有する原料を使ったイオン交換をも含めた、イオン交換クロマトグラフ法 (Goyal et al., Bioresource Technol. 36: 37-50,1991 ; Fliess et al., Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 17: 314-318,1983 ; Bhikhabhai et al., J. Appl. Biochem. 6: 336-345,1984 ; Ellouz et al., J. Chromatography 396: 307-317,1987), (Medve et al., J. Chromatography A 808: 153-165,1998), 疎水性相互作用クロマトグラフィー(Tomaz and Queiroz, J. Chromatography A 865: 123-128,1999), 及び二相仕切り(two-phase partitioning)(Brumbauer,et al., Bioseparation 7: 287-295,1999)などかあるが、これらに限定されるものではない。
【０１８９】
変異体CBH Iタンパク質は、特定の結合因子に対する結合親和性（例えば、抗体又は受容体）などの特定の特性を有するタンパク質を分離するために細分化される。これらの抗体又は受容体は選択された分子量の範囲、又は等電点の範囲を有する。
【０１９０】
一度、与えられた変異体CBHIの発現が達成されると、その後、生産されたCBH Iタンパク質は細胞または細胞培養から精製される。係る精製に適した典型的な処理方法としては、抗体アフィニティカラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ法；エタノール沈殿；逆相HPLC；シリカ上またはDEAEなどの陽イオン交換樹脂によるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング； SDS-PAGE；硫酸アンモニュウム沈殿法；そして、例えば、Sephadex G-75を用いたゲルろ過、などがある。さまざまなタンパク質精製の方法が用いられており、係る方法は本分野において知られたものであり、例えば、Deutscher, Methods in Enzymology, vol. 182, no. 57, pp. 779,1990 ; Scopes, Methods Enzymol. 90: 479-91,1982に記載されている。精製手段の選択は、それが用いられる製造工程と生産された特定のタンパク質の性質に依存する。
【０１９１】
IX. cbh1とCBH1の使用
変異体cbh核酸、変異体CBH Iタンパク質、および変異体CBH Iタンパク質活性から成る組成物の広範囲にわたる用途を発見することは高く評価される(このような用途のいくつかについて以下に説明する。)。
【０１９２】
新規で改良された、さまざまな量のBGタイプ、EGタイプ及び変異体CBHタイプのセルラーゼから成るセルラーゼ組成物は、柔軟剤として作用し、および／または、綿織物の感触を高める（例えば、「ストーンウォッシュ」又は「バイオポリッシュ」）ことができる高い洗浄能力有する洗浄剤組成物や、木材パルプを糖へ分解する組成物（例えば、バイオエタノールの生産）や、及び/又は食品組成物へ適用する用途がある。各タイプのセルラーゼの単離及びその特徴によって、係る組成物の特徴をコントロールすることができる。
【０１９３】
大きな耐熱性を持つ変異体(または突然変異体)CBHsは、高温おいても活性を維持することができるため、上記の全ての分野において用いることができる。
【０１９４】
わずかな耐熱性を持つ変異体(または突然変異体)CBHsは、例えば、存在する他の酵素が影響を受けるこがないように、ある酵素活性がより低温で中立化されることが必要となる分野で用いられる。更に、酵素は、例えば結晶化度またはセルロース系材料の鎖長をコントロールすることにより、セルロース系材料をある程度改質するという用途もある。この改質が要求されたレベルに達した後、糖化温度を非熱安定性CBH Iの生存温度以上にあげることができる。CBH I活性が結晶セルロースの加水分解に必須なので、結晶セルロースの改質は高温では停止してしまう。
【０１９５】
増大した可逆性（すなわち、活性のリホールディング（refolding）又は保持（retention）が高いめられていること）を有する変異体(または突然変異体)CBHsもまた同様な領域で用いられる。熱失活の条件に依存して、可逆的変性は、不可逆的過程と競合し、又は不可逆的過程を支配することができる。増大した可逆性を持つ変異体は、これらの条件のもとで、熱失活に対して増大した抵抗性を持っている。増大した可逆性はまた、非不活性化状態における処理によって不活性化イベントが行われる過程において潜在的利益をもっている。例えば、生物資源をエタノールへ変換するための加水分解と発光の組み合わせ（HHF）において、生物資源は最初に高温(50℃より高い温度を示す)でセルラーゼによって不完全に糖化される。 そして、その後温度は、発酵微生物が、糖をエタノールに変換することを可能ならしめるため下げられる。(例えば30℃まで)もし、経過温度を低下させると、熱的に不活性化したセルラーゼが可逆的に活性を停止し、低温発酵工程の間、糖化はその転換を高いレベルで継続される。
【０１９６】
1のアプローチにおいて、本発明のセルラーゼは感触と外観をよくするために、洗浄剤組成物に使用され、または布の処理にも用いられる。
【０１９７】
ゲノムに挿入されたcbh遺伝子の少なくとも1つの追加コピーを持っている転換体を使うことによって、セルロースでできた物質製品の加水分解反応速度を増大させることができるかもしれないので、セルロースまたはヘテログリカンを含む製品を、より速い速度で、かつより大きな範囲にわたって分解することができる。紙、綿、セルロース系の紙おむつ、およびそれに類したものであって、セルロースから作られる製品はごみ処理場でより効率的に処理することができる。1の転換体または複数の転換体から得ることができる発酵生成物は、詰ったごみ処理場へ投入される各種セルロース製品を液化することによって、これを分解するために使うことができる。
【０１９８】
別々に起こる糖化及び発酵のプロセスは、生物資源の中に存在するセルロース（例えば、トウモロコシの茎葉）がグルコースに転換され、続いて酵母菌がグルコースをエタノールに転換するプロセスである。同時に起こる糖化及び発酵のプロセスは、生物資源の中に存在するセルロース（例えば、トウモロコシの茎葉）がグルコースに転換され、同時に同じ反応で酵母菌がグルコースをエタノールに転換するプロセスである。したがって、他のアプローチにおいて、本発明の変異体CBHタイプのセルラーゼを、生物資源のエタノールへの分解処理に用いることができる。セルロースのようなすぐに入手可能である原材料からエタノールを生産することは安定的に行え、再生可能な燃料源を提供することができる。
【０１９９】
セルロースベースの原料は農業廃棄物、草、および木材と都市廃棄物のような他の低価値生物資源（例えば、再生紙、ヤードクリッピング（yard clippings）などから成る。エタノールはこれらのセルロースでできた物質原料を発酵させて生産することができる。しかし、エタノールへ変換される前に、セルロースを最初に糖に変換しなければならない。
【０２００】
多種多様な原料に対して、本発明の変異体CBHを使える可能性があり、使用するための選択基準は、この転化作業が行われる地域に依存している。例えば、米国中西部においては、小麦、わら、トウモロコシ茎葉及びバガスのような、農業廃棄物が主要なものである一方、カリフォルニアでは、稲ワラが農業廃物の主要なものである。しかし、入手可能ないかなるセルロース質バイオマスは、いかなる地域においても使われものであるということを理解する必要がある。
【０２０１】
セロビオハイドラーゼの量を増やしたセルラーゼ組成物は、エタノール生産に用いられる。このプロセスによるエタノールは、オクタンエンハンサーとして、たは直接燃料源として利用でき、このエタノールは、石油由来生成物よりも環境にやさしいので、ガソリンの代替燃料としても、有効に活用することができる。エタノールを使用することにより大気の浄化に役立ち、場合によっては、部分的なオゾンレベル及びスモッグを減らことが可能となることが知られている。さらに、ガソリンの代わりにエタノールを利用することは、再生不能なエネルギー源のである石油化学製品の供給の変動を緩衝することにおいて戦略的に重要である。
【０２０２】
エタノールは木、草本、都市の固形廃棄物、および農業と林業の残留物などから糖化と発酵過程を経て、生産することができる。しかし、微生物由来の自然発生するセルラーゼ混合物の中の個々のセルラーゼ酵素の割合は、バイオマスをグルコースに転換するのには効果的ではない。エンドグルカナーゼは、それ自身がセロビオハイドラーゼの作用のための基質であり、従って全体のセルラーゼシステムの加水分解の効率を改善する新しいセルロースチェーン端を生産することができる機能を持っていることが知られている。従って、強化され、あるいは最適化されたセロビオハイドラーゼ活性を利用することによってエタノールの生産量を増加することができる。
【０２０３】
従って、本発明のセロビオハイドラーゼは、そのもの自体を糖に変換するセルロースの加水分解に使用される。1の態様では、変異体セロビオハイドラーゼは発酵微生物の添加に先がけてバイオマスに添加される。2番目の態様では、変異体セロビオハイドラーゼは、バイオマスに対して発酵微生物と同時に添加される。更に、いずれかの態様に存在する他のセルラーゼ成分もある。
【０２０４】
他の態様において、セルロース系物質原料は前処置される。前処理は高温と希酸、濃酸、または薄めのアルカリ溶液のいずれかの添加による。前処理溶液は、少なくとも部分的にヘミセルロース成分を加水分解するのに十分な時間の期間添加されており、その後中和される。
【０２０５】
セルロースにCBHIを作用させた際の主産物は、BG活性(例えば細菌のセルラーゼ生成物中の)により、グルコースへ変換するために利用されるセロビオースである。セルロース系バイオマスの前処理によって、またはバイオマス上の酵素作用によって、グルコースとセロビオースを含む他の糖類はバイオマスから入手可能である。このバイオマスのヘミセルロース内容物は(ヘミセルラーゼによって)、キシロース、ガラクトース、マンノース、およびアラビノースなどの糖類に、変換することができる。従って、バイオマス変換過程の中で、酵素糖化法は、他の中間体または最終生成物への生物的または化学的変換に利用可能な糖類を作り出すことができる。従って、バイオマスから発生した糖はエタノールの生成に加えていろいろな過程中において使用される。そのような転化の例はグルコースからエタノールへの発酵 (M. E. Himmel et al. pp2-45, in"Fuels and Chemicals from Biomass", ACS Symposium Series 666, ed B. C. Saha and J. Woodward, 1997による論評) 、及び グルコースから2, 5-ジケト-D-グルコネイト (US Patent No. 6,599, 722), 酪酸 (R. Datta and S-P. Tsaipp224-236, ibid), サッシネイト (R. R. Gokarn, M. A. Eiteman and J. Sridhar pp237-263, ibid), 1, 3-プロパンジオール (A-P. Zheng, H.Biebl and W-D. Deckwer pp264-279, ibid), 2, 3-ブタンジオールへの生物的転換(. C. S. Gong, N. Cao and G. T. sao pp280-293, ibid)、及びキシロースからキシリトールへの化学的及び生物的転化(B. C. Saha and R. J. Bothast pp307-319, ibid)などがある。例としてWO 98/21339も参照のこと。
【０２０６】
本発明の洗剤組成物は、セルラーゼ組成物（セロビオハイドラーゼ内容物とは関係なく、すなわち、セロビオハイドラーゼ無添加、セロビオハイドラーゼが実質的に無添加、セロビオハイドラーゼを多く含むものがある。）のほかに、陰イオン性、非イオン性、および両性の界面活性物質を含む界面活性物質、加水分解酵素、造形剤、漂白剤、青味剤、および蛍光色素、固化抑制剤、可溶化剤、陽イオン界面活性剤、およびそれに類したものが含まれる。これらの全ての成分は、洗剤の分野においてよく知られている。上記のセルラーゼ組成物は、液体の希釈液の中、顆粒の中、エマルジョンの中、ゲルの中、ペーストの中のいずれかまたは同種のものの洗浄剤組成物中に添加することができる。係る製品は当業者によく知られている。固形洗浄剤組成物が使用される時、セルラーゼ組成物は顆粒として製剤化することが好ましい。また好ましくは、この顆粒は、セルラーゼ保護因子を含むように製剤化することができる。更に理解を深めるために、ここに参照により取り込まれている、題名"Detergent compositions containing cellulase compositions deficient inCBH I type components, " U.S. Patent Number 6,162, 782を参照のこと。
【０２０７】
好ましくは、セルラーゼ組成物は洗浄剤組成物の総量に対して、約0.00005重量%から約5重量%添加される。より好ましくは、セルラーゼ組成物は洗浄剤組成物の総量に対して、約0.0002重量%から約2重量%添加される。
【０２０８】
更に、変異体cbhI核酸配列は、関連する核酸配列の同定及び特徴付けに使用することができる。遺伝子又は遺伝子生産物に関する機能の決定（予測又は確認）に有用である数多くの技術は、A.（1） 過剰発現、異所性発現、および他種内発現；（2）黙している逆ゲノム多型法、ターゲットノックアウト、ウイルス誘発性遺伝子サイレンシング（VIGS）、（Baulcombe, 100 Years of Virology, Calisher and Horzinek eds., Springer-Verlag, New York, NY 15: 189-201,1999参照のこと）; （3）メチル化状態の分析、特にフランキング調節領域；（4）in situ ハイブリダイゼーション；のようなDNA/RNA解析；B.（1）組み換えタンパク質発現；（2）抗血清生産； (3)免疫学的局在決定； (4) 触媒または他の活性に対する生化的検定；（5）リン酸化状態；及び（6）酵母 2-ハイブリッド法(Two-Hybrid法)を介したタンパク間の相互作用などの遺伝子生産物解析；C. 過剰発現した発現型に基づいた、または関連する遺伝子の配列相同性による特定の生化学的又はシグナル経路内における遺伝子又は遺伝子生産物の位置などの経路分析及び D. 特定の代謝又は伝達経路内における単離された遺伝子及びその生産物の関与を決定又は確認し、遺伝子の機能決定を助けるためのその他の解析が含まれるが、これらに限られない。
【０２０９】
ここに言及されたすべての特許、特許出願、記事、および出版物はここに参照することによって明確に取り込まれる。
【０２１０】
実施例
本発明は、さらに以下の実施例により詳細に説明される。しかしながら、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。添付の図は本発明の明細書の一部である。ここで引用された全ての参考文献の内容は参照により、本発明出願に組み込まれる。
【０２１１】
実施例1
Cel7セルラーゼの配列
いくつかの変異体は、構造の情報及び調節機構を用いたハイポクレアジェコリーナCel7の一次配列（first aligning）により41のファミリーメンバーから選択された。42ファミリーメンバーについての1次アミノ酸配列を図8に示す。
【０２１２】
4つのメンバー（すなわち、20VW.1、1A39、6CEL及び1EG1.1）は、その結晶構造が明確に決定されている。発表された構造を有する4つの位置合わせされたタンパク質は、バックボーン原子が特定のRMS偏差内（2.0A以下）である全ての残査に対してこの配列は固定されている。4つのシーケンスの第3位の構造的不整はカナダ モントリオールの化学計算グループが作成したMOEバージョン2001.01を利用して計算することができる。オーバーラップした構造要素は4つのシーケンスの凍結された主構造に対して使用された。残っている38の配列は、二次構造予測及びデフォルト設定した他のパラメータと共にMOEを用いて、凍結された4による位置合わせされた一次性のアミノ酸構造を持っていた。
【０２１３】
この位置あわせに基づいて、様々な単一の及び複数のアミノ酸突然変異体がタンパク質の中におけるサイト変異誘発によって作られた。
【０２１４】
単一のアミノ酸突然変異は、以下の原理に基づいている。(表1を参照のこと)：相同体の間でアミノ酸の保存状態を試験した後、サイトはH.ジェコリーナ(H. jecorina)シーケンス内の別のアミノ酸において、統計的選択によって、他の41の配列で見られた所に配置された。（例えば、H.ジェコリーナ及び及び3の他の相同体に存在する77番目のAlaは他の22の相同体に存在するAspに変更された）。構造への各置換の効果はその時形成された。
【表１】
複数のアミノ酸突然変異は、酵素の安定性、進化性、および生産物阻害に影響するように作成された。H. ジェコリーナシーケンスの以下の複数のサイト変化が構築された：
1) Thr 246 Cys + Tyr 371 Cys
2) Thr 246 Ala + Arg 251 Ala + Tyr 252 Ala
3) Thr 380 Gly + Tyr 381 Asp + Arg 394 Ala + 残基 382 から 393の欠失を含む
4) Thr 380 Gly + Tyr 381 Asp + Arg 394 Ala
5) Tyr 252 Gln + Asp 259 Trp + Ser 342 Tyr
T246A/R251A/Y252Aと他の三倍の数+欠失変異体は、両方とも酵素の生産物抑制効果を減少させると予測される。Thr246Cys +Tyr371 Cysは、酵素の安定性及びプロセシング能力を増大させると予測される。TheD259W/Y252Q/S342Y変異体は、酵素生産物の抑制に影響すると予測される。
【０２１５】
単一の及び複数の突然変異は、本技術分野でよく知られている方法を用いて構築される。これらを表2に示す。
【表２】
実施例2
H.ジェコリーナCBHI変異体のクローニング及び発現
A. プラスミドRTEXのH.ジェコリーナ目的発現
このプラスミド、PTXは、以下のSambrook et al. (1989)、（上記）の方法を用いて構築されるものであり、図7に図示した。このプラスミドは、糸状菌トリコデルマロンギアタムに用いる多目的発現ベクターとして作られたものである。この発現カセットは、この機能を有益にするいくつかのユニークな特徴を有する。転写は、トリコデルマロンギアタムに対する強力なCBHI遺伝子プロモータ及びターミネーター配列を用いて調節される。このCBHプロモーター及びターミネーター配列の間には、表現遺伝子を挿入するために使われるユニークなPmelとSstl制限サイトがある。ロンギブランチアタム(T. longibrachiatum) pyr4選択可能標識遺伝子はCBHI終了暗号に挿入されていて、全体表現カセット(CBHIプロモーター挿入部位-CBHIターミネーター-pyr4遺伝子-CBHIターミネーター)は、ユニークなNotl制限サイトまたはユニークなNotl及びNhel制限サイトを利用して、削除することができる。
【０２１６】
このベクターは、細菌ベクター、拡張された複数のクローニングサイトを持つPUCタイプのベクターであるpSL1180（Pharmacia Inc., Piscataway, N. J.）に基づくものである。当業者は、図7中で説明されたフローダイアグラムに基づいてこのベクターを構築することができるであろう。
【０２１７】
ベクターpTrex2LはpTrex2、pTEXの誘導体から構成された。pTrex2のための配列を図6中に示す。
【０２１８】
変異体タンパク質が有用なレベルで発現される限り、用いるプラスミドを厳格に限定することは重要ではない。しかし、cbh1座で組込みを強制することにより発現レベルを最大化することは有益である。
【０２１９】
B．クローニング
本技術分野で知られる方法を使って、当業者は適切なベクターの中に目的とするCBH I変異体をクローン技術により生産することができる。上で述べたように、変異体タンパク質が有用なレベルで発現される限り、用いるプラスミドを厳格に限定することは重要ではない。本発明の変異体CBH I酵素の1の調製についての以下の記載は、ここに説明された本発明の変異体のいずれかを調製するために利用することができる。
【０２２０】
この変異体cbh1遺伝子はこのpTre2Lベクターでクローン化された。
【０２２１】
プラスミドpTrex2Lの構築は以下の通り行われた： pTrex2のユニークなSacIIとAsc Iサイトの間の6つのヌクレオチドは、プラスミドTrex2Lを生産するためにBstE IIとBamH Iサイトを含んでいる合成リンカーと置き換えられた。 この補完的な合成リンカー、21-マー合成オリゴCBHリンカー1+：GGTTTGGATCCGGTCACCAGと、27-マー合成オリゴCBHリンカー：CGCGCCTGGTGACCGGATCCAAACCGC は、アニーリングされた。
【０２２２】
pTrex2はSacIIとAsc Iによって消化された。アニールされたリンカーは、pTrex2Lを作成するためにpTrex2の中でその後に結紮された。プラスミドは適切な制限酵素によってその時消化され、野生型CBH I遺伝子はプラスミドの中に結紮された。
【０２２３】
プライマーは、目的とする突然変異を野生型の遺伝子に導入するために使われた。遺伝子の目的とする変質作用または突然変異の導入を結果として生じさせる、どのような方法でも用いることができる。合成DNAプライマーは突然変異体の構築のためにPCRの鋳型として使われた。目的とする突然変異に基づいたプライマーを、導入することができるようにデザインすることは当業者の知識の範囲内である。
【０２２４】
この変異性の鋳型は、伸張されて合成DNAオリゴヌクレオチドを用いて、PCRによってダブルストランドに形成された。25回のPCRサイクルの後の最終生成物は、目的とする突然変異から成る58塩基対のダブルストランドの生成物であった。
【０２２５】
C.形質転換及び発現
目的とする変異体のために調製されたベクターは、2、又は4欠失トリコデルマ系統のウリジン栄養要求株バージョン（Table 3参照のこと； U. S. Patent Nos. 5,861, 271 及び 5,650, 322も参照のこと）の中で形質転換され、安定した転換体が確認された。
【表３】
どの転換体が、変異体CBH I を発現したかを確認するために、DNAは、Vogels+1%のグルコースで成長させた系統から、変異体CBH Iのみを含む単離DNA断片を用いて実行されたサザンブロット法実験から分離された。宿主細胞の遺伝子内へ組み込まれたこの変異体CBHI発現カセットの複製を有する変異体が単離された。総mRNAはVogels+1%ラクトース上で1日成長させた菌株から分離された。mRNAは、プローブとして変異体のCBHIコドン領域を使って、ノザン分析された。変異体CBH I mRNAを表現している転換体は識別された。
【０２２６】
上で説明した方法を使用することによって、他の新規変異体のCBH Iセルラーゼまたはそれらの誘導体を得ることができる。
【０２２７】
実施例3
A. ニガーニおけるCBHI変異体の発現
PCR断片は、以下のプライマーと方法を使って得られた。
【０２２８】
以下のDNAプライマーは、様々な微生物から分離されたゲノムDNA由来のCBH1相同遺伝子を増幅に使用するために構成された。タンパク質とDNA配列のためにここに使われたすべての記号はIUPAC IUB Biochemical Nomenclature Commissionコード一致している。
【０２２９】
相同である5‘(FRG192)及び3’(FRG193)プライマーは、トリコデルマレーシからCBH1の配列に基づいて、開発された。両方のプライマーはプライマーの5’にインビトロゲンからゲートウェイクローニング配列を含んでいた。プライマーFRG192はattB1シーケンスを含んでいて、プライマーFRG193はattB2シーケンスを含んでいた。
【０２３０】
attB1のないFRG192の配列 :
ATGTATCGGAAGTTGGCCG (CBH1 H. ジェコリーナシグナル配列) (SEQ ID NO: 3)
attB2のないFRG193の配列：
TTACAGGCACTGAGAGTAG (CBH1 H. jecorinaのセルロース結合モジュール) (SEQ ID NO: 4)
H.ジェコリーナ CBH I cDNAクローンは鋳型として用いられた。
【０２３１】
PCR条件は次の通りであった：10 μL の 10X 反応緩衝液 (10X 反応緩衝液 は100 mM Tris HCI, pH 8-8.5 ; 250 mM KCI ; 50 mM (NH4) 2SO4 ; 20 mM MgSO4から成る) ; 0.2 mM の dATP, dTTP, dGTP, dCTP (最終濃度), 1μL の 100 ng/μL ゲノム DNA, 0. 5μL の 1unit/μL（活性単位）PWO ポリメラーゼ(Boehringer Mannheim, Cat # ; 1644-947), 0.2μM の個々のプライマー、すなわち、FRG192 及びFRG193, (最終濃度), 4μL DMSO及び 水を加え 100 μLとする。
【０２３２】
H. jecorina CBH1における様々なサイトは変異体の耐熱性に関係しており、従って、H. jecorina CBH1遺伝子は変異誘発を受けた。
【０２３３】
変異体をエンコードしている断片は、Qiagenゲル抽出KITを使って、アガロースゲルから精製された。この精製断片は、Gatway(登録商標) 技術使用説明書（バージョンC）により（参照によりここに含むものである）、 Invitorogen(登録商標)のpDONRTM201ベクターを用いたクロナーゼ反応の実施に用いられた。そして、遺伝子は、発現ベクターpRAXCBH1を得るためにこの導入ベクター（ENTRYベクター）から目的ベクター(pRAXdes2)に移された。
【０２３４】
細胞は変異体CBH Iセルラーゼをエンコーディングしている核酸から成る発現ベクターにより形質転換された。Cao et al (Cao Q-N, Stubbs M, Ngo KQP, Ward M, Cunningham A, Pai EF, Tu G-C and Hofmann T (2000) Penicillopepsin-JT2 a recombinant enzyme from Penicillium janthinellum and contribution of a hydrogen bond in subsite S3 to kcat Protein Science 9: 991-1001)により説明された方法に従って、この構築物はA.ニガー種.アワモリ内で形質転換された。
【０２３５】
転換体は最少培地プレート(Ballance DJ, Buxton FP, and Turner G (1983) Transformation of Aspergillus nidulans by the orotidine-5'-phosphate decarboxylase gene of Neurospora crassa Biochem Biophys Res Commun 112: 284-289)の上で線画培養され、30℃で4日間育成された。芽胞は、本技術分野においてよく知られている方法< http://www.fgsc.net/fgn48/Kaminskyj.htm>参照のこと)を用いて収集された。A.ニドランス分生子は、（芽胞を取り除くために滅菌済の曲折ガラス棒を用いて調製培地の表面をこすることにより）水の中で収穫されて、生存率の大幅なロスなしで4℃において数週間から数ヶ月の間保存することができる。しかし、新しく収穫された芽胞はより再生可能的に発芽する。長期間保存するためには、芽胞は-20℃において50%グリセロール内で、または-80℃において15-20%グリセロール内で蓄えることができる。グリセロールは80%水溶液中においてもピペット操作が容易に行える。200μLの80%のグリセロールを添加した水溶性分生子懸濁液800μL (4℃の貯蔵用として作成された)は、-80℃の貯蔵に用いられ、；600μLの80%グリセロールが添加された400μL懸濁液は、-20℃の貯蔵に用いられる。凍結の前にはボルテックスミキサーで攪拌をする。突然変異体の収集のために、分生子が存在する培地の小片は切り取られ、20%グリセロール溶液内に入れ、ボルテックスミキサーで攪拌され、-80℃で凍結保存することができる。本ケースにおいては、我々はそれらを-80℃で50％グリセロール溶液内で保存した。
【０２３６】
A.ニガー種アワモリ形質変換体は、ウリジンを欠いている最少培地の上で成長した。(Ballance et al. 1983)転換体は、Cao et al. (2000)により説明されるように、セルラーゼ活性をみるために、胞子形成した成長寒天プレートからの胞子懸濁液の1cm2を100mlの振動フラスコの中で、37℃3日間植菌することによりスクリーニングされた。
【０２３７】
CBHI活性検定は、非蛍光性4-メチルウンベリフェリル-β-ラクトシダーゼがラクトース及び7-オキシ4-メチルクマリンを生成する加水分解に基づいている。後者の生成物は、蛍光シグナルに反応する。ピペット操作で170μL 50 mM NaAc buffer pH 4.5を、96ウェルマイクロタイタープレート（MTP）(Greiner, Fluotrac 200, art. nr. 655076)に分注することは蛍光発光に適切である。10μLの上澄を添加し、その後、10μLのMUL（ミリQ水中の1mM4-メチルウンベリフェリル-β-ラクトシダーゼ）を添加し、そしてこのMTPをFluoster Galaxy（BMG Labtecnologies；D-77656 Offenburg）内に置く。50℃における16分間（各120秒8サイクル）の動態を、λ320nm(励起)及びλ460nm(発光)を用いて測定する。CBH活性を有している上澄は、その後、疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけられた。
【０２３８】
実施例4
CBH1の安定性
CBHIセルラーゼ変異体は上記の要領（例2及び3参照のこと）で、クローン及び発現した。野生型Cel7A及び変異体は、その後、カラムクロマトグラフィーによりこれらの培地の細胞のない上澄みから生成された。タンパク質は疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて精製された。カラムは、Applied Biosystems社によるPoros(登録商標) 20 HP2樹脂を用いた BioCAD(登録商標) Sprint Perfusion Chromatography Systemに取り付けられた。
【０２３９】
HLCカラムは、5カラム容積の0.020 Mのリン酸ナトリウム、0.5M硫酸アンモニウム、pH6.8で平衡化した。硫酸アンモニウムは最終濃度が約0.5Mになるように上澄液に添加され、pHは6.8に調製された。濾過の後に、上澄み液はカラムに取り込まれた。取り込みの後、カラムは10カラム容積の平衡化緩衝液で洗浄され、それから0.02Mのリン酸ナトリウムpH6.8において、0.5M硫酸アンモニウムから0の硫酸アンモニウムまでの10のカラム体積勾配によって溶離された。Cel7Aは中間勾配あたりで溶離された。分画液は、還元SDS-PAGEゲル解析法に基づいて収集、貯蔵された。
【０２４０】
融解点は、Luo, et al., Biochemistry 34: 10669 及び Gloss, et al., Biochemistry 36: 5612の方法により決定された。 Sandgren at al. (2003) Protein Science 12 (4) pp848も参照のこと。
【０２４１】
データはAviv 215円偏光二色性分光光度計について収集された。210と260ナノメートルの間の変異体のネイティブのスペクトルは25℃で取られた。緩衝液条件はpH5.5の50mMビストリスプロパン/50mM酢酸アンモニウム/氷酢酸であった。タンパク質濃度は0.25と0.5のmgs/mLの間に保持された。モニターするための最適波長を決定した後、サンプルは、同じ緩衝液条件の下で25℃から75℃までに温度傾斜により熱変性された。データは2℃間隔で5秒間収集された。部分的な不可逆的変性は0.1センチメートルの軌道セルの中の230ナノメートル波長でモニターされた。一方,75℃では、上で説明したように、折りたたまれた状態のスペクトルが収集された。このサンプルは、その後再び折りたたまれた状態のスペクトルを収集するために、25℃に冷やされた。230nmの3つのスペクトルの違いは、変異体可逆性を評価するために使われた。
【０２４２】
野性型CBH I及び様々な変異体CBHIsの熱変性の概要を、図9Aと9Bに示す。また、表４も参照のこと。
【表４】
【０２４３】
【０２４４】
以上言及した本発明の方法及びシステムに関し、本発明の範囲及び精神を逸脱することなく種々の改良や改変を行うはことは、当業者にとって自明のことである。本発明の特定の好ましい実施態様に関連して本発明を説明してきたが、本発明は当該特定の実施態様に過度に限定されるものではないことは当然のことである。従って、分子生物学の分野及び関連分野の当業者に明らかであるような本発明を実施するための前述の方法に関する種々の変更は本発明の範囲内に含まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【０２４５】
【図１】図1は、H.ジェコリーナ由来野生型Cel7A（CBH I）の核酸配列（下列；SEQ ID NO: 1）及びアミノ酸配列（上列；SEQ ID NO: 2）である。
【図２】図2は、H.ジェコリーナCBH Iの三次構造である。
【図３Ａ】図3Aは、入手可能な結晶構造があるセル7ファミリーメンバーのアミノ酸配列を示す。配列は以下の通りである：20VW-Fusarium oxysporum Cel7B, 1A39-Humicola insolens Cel7B, 6CEL-Hypocrea jecorina Cel7A, 1 EG1- Hypocrea jecorina Cel7B。
【図３Ｂ】図3Bは、入手可能な結晶構造があるセル7ファミリーメンバーのアミノ酸配列を示す。配列は以下の通りである：20VW-Fusarium oxysporum Cel7B, 1A39-Humicola insolens Cel7B, 6CEL-Hypocrea jecorina Cel7A, 1 EG1- Hypocrea jecorina Cel7B。
【図４】図４は、ここで説明された配列が重層された4のCel7相同体の触媒領域からなる結晶構造である。
【図５Ａ】図5Aは、8の単残基変異、及び5の重複変異の変異体についての核酸配列及び予想されるアミノ酸配列である。
【図５Ｂ】図5Bは、8の単残基変異、及び5の重複変異の変異体についての核酸配列及び予想されるアミノ酸配列である。
【図５Ｃ】図5Cは、8の単残基変異、及び5の重複変異の変異体についての核酸配列及び予想されるアミノ酸配列である。
【図５Ｄ】図5Dは、8の単残基変異、及び5の重複変異の変異体についての核酸配列及び予想されるアミノ酸配列である。
【図５Ｅ】図5Eは、8の単残基変異、及び5の重複変異の変異体についての核酸配列及び予想されるアミノ酸配列である。
【図５Ｆ】図5Fは、8の単残基変異、及び5の重複変異の変異体についての核酸配列及び予想されるアミノ酸配列である。
【図５Ｇ】図5Gは、8の単残基変異、及び5の重複変異の変異体についての核酸配列及び予想されるアミノ酸配列である。
【図５Ｈ】図5Hは、8の単残基変異、及び5の重複変異の変異体についての核酸配列及び予想されるアミノ酸配列である。
【図５Ｉ】図5Iは、8の単残基変異、及び5の重複変異の変異体についての核酸配列及び予想されるアミノ酸配列である。
【図５Ｊ】図5Jは、8の単残基変異、及び5の重複変異の変異体についての核酸配列及び予想されるアミノ酸配列である。
【図５Ｋ】図5Kは、8の単残基変異、及び5の重複変異の変異体についての核酸配列及び予想されるアミノ酸配列である。
【図５Ｌ】図5Lは、8の単残基変異、及び5の重複変異の変異体についての核酸配列及び予想されるアミノ酸配列である。
【図５Ｍ】図5Mは、8の単残基変異、及び5の重複変異の変異体についての核酸配列及び予想されるアミノ酸配列である。
【図６Ａ】図6Aは、pTEXの核酸配列である。
【図６Ｂ】図6Bは、pTEXの核酸配列である。
【図６Ｃ】図6Cは、pTEXの核酸配列である。
【図６Ｄ】図6Dは、pTEXの核酸配列である。
【図７Ａ】図7Aは、プラスミドpTEX発現の構造を表している。
【図７Ｂ】図7Bは、プラスミドpTEX発現の構造を表している。
【図８Ａ−１】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ａ−２】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｂ−１】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｂ−２】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｃ−１】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｃ−２】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｄ−１】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｄ−２】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｅ−１】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｅ−２】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｆ−１】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｆ−２】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｇ−１】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｇ−２】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｈ−１】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｈ−２】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｉ−１】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｉ−２】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｊ−１】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｊ−２】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｋ−１】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｋ−２】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図９Ａ】図9Aは、野生型、8の単一残査変異体の熱特性を示している。
【図９Ｂ】図9Bは、野生型及び5つの変異体の熱特性を示している。図9-Bの凡例において、Cel7A は wild-type H. jecorina CBH I ; N301 K は N301 K 変異体; 334 はP227L 変異体; 340 は S8P/N49S/A68T/S113N 変異体;350 はS8P/N49S/A68T/S113N/P227L 変異体; 及び 363 はS8P/G22D/T41 I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P 変異体を示す。
【図１０】図10はpRAX1ベクターである。このベクターは、2Aspergillus nidulans ゲノム DNA 断片であるAMA1 配列 (Molecular Microbiology 1996 19: 565-574)の5259bpのHind III断片を除いたpGAPTプラスミドが挿入されている。1-1134塩基はAspergillus nigerのグルコアミラーゼ遺伝子プロモーターである。3098-3356塩基及び4950-4971塩基はAspergillus nigerのグルコアミラーゼターミネーター（終了配列）である。Aspergillus niger pyrG遺伝子は3357-4949に形質転換のマーカーとして挿入された。（この部位には）遺伝子に挿入される多重クローニング部位がある。
【図１１】図11は、pRAXdes2ベクターの構成である。このベクターはプラスミドベクターpRAX1に基づくものである。ゲートウェイカセットがpRAX1ベクターに挿入されている（環状プラスミドの内部矢印により示される）。このカセットは組み替え配列attR1 及び attR2 と 選択マーカー catH 及び ccdBを含んでいる。このベクターはGatewayTM Cloning Technology: version 1 page 34-38に記載の方法により作成され、インビトロジェン（Invitrogen）により供給されるE.Coli DB3.1内でのみ複製することができる。；他のE.Coli内においては、ccbB遺伝子は致死する。最初のPCRフラグメントは、attB1/2組み変え配列を含むプライマーを用いて作成された。このフラグメントはpDONR201(インビトロジェンから市販されている)と組み換えられ；このベクターはattB1/2組み変え配列とcatH、ccbBを組み替え部位内に含む。インビトロゲンからのBP clonase酵素は、このいわゆるENTRYベクターの中でPCR破片を組み換えさせるために使われ、ccdBを表現しているクローンが生き残らないので、挿入されたPCR破片を持つクローンは50pg/mlカナマイシンで選択することができる。 att配列は変更されて、attL1とattL2と呼ばれる。 第二段階は、このクローンをpRAXdes2ベクター(組み換え部位の間のcontaining attR1とattR2 catHとccdB)と組み替えさせることである。窒素からのLR clonase酵素は、目的とするベクターの中でENTRYベクターからのインサートを組み換えさせるために使われる。窒素からのLR clonase酵素は、ベクターの中でENTRYベクターからの挿入を組み替えさせるために使われる。ccdBが致死なので、OnlypRAXCBH1ベクターは100、ug/mlアンピシリンを用いて選択され、ENTRYベクターはアンピシリンに敏感である。この方法によって、発現ベクターは調製され、形質転換されたA. niger を使用することができる。
【図１２】図12は、アスペルギルス属の中でCBH 1変異体をエンコードしている核酸の表現のために使われたpRAXdes2cbh1ベクターの説明を提供する。CBH1酵素相同体または変異体をエンコードしている核酸はベクターの中にatt配列の相同的組み換えによってクローン技術で生み出された。
【技術分野】
【０００１】
出願に関するクロスリファレンス
本出願は、2002年8月16日に提出されたU.S.仮出願 No.60/404,063（Attorney Docket No.GC772-2P）、2003年3月27日に提出されたU.S.仮出願 No.60/458,853（Attorney Docket No.GC772-2P）、2003年3月21日に提出されたU.S.仮出願 No.60/456,368（Attorney Docket No.GC793P）及び2003年3月27日に提出されたU.S.仮出願 No.60/458,696（Attorney Docket No.GC772-2P）に対し優先権を主張する。これらの全ては、参照によりここに組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による委託研究の下でなされた発明に対する権利の記述
この研究の一部はU. S.エネルギー省の請負契約No. DE-AC 36-99GO010337下の国立リニュウアブルエネルギー研究所の下請契約No. ZCO-0-30017-01により資金援助された。それに応じて、米国政府はこの発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、セロビオース加水分解活性を持っているポリペプチドをエンコードする異なったセロビオース加水分解酵素および単離された核酸配列と関連する。本発明はまた、組換え体の変異体のCBHポリペプチドを生み出すための方法だけでなく核酸配列を含む核酸構成物、ベクター、および宿主細胞と関連している。
【０００４】
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6. PDB reference 1A39: Davies, G. J., Ducros, V., Lewis, R. J., Borchert, T. V., Schulen, M. Joumal of Biotechnology 57 pp. 91 (1997)
7. PDB reference 6CEL: Divne, C., Stahlberg, J., Teeri, T. T., Jones, T. A. Journal of Molecular Biology 275 pp. 309 (1998)
8. PDB reference 1 EG1: Kleywegt, G. J., Zou, J. Y., Divne, C., Davies, G. J., Sinning, I., Stahlberg, J., Reinikainen, T., Srisodsuk, M., Teeri, T. T., Jones, T. A. Joumal of Molecular Biology 272 pp. 383 (1997)
9. PDB reference 1DY4 (8CEL): J. Stahlberg, H. Henriksson, C. Divne, R. Isaksson, G. Pettersson, G. Johansson, T. A. Jones
【背景技術】
【０００５】
セルロース及びヘミセルロースは光合成により生産される最も豊富な植物資源である。それらは、加水分解によりポリマ基質を単体糖類にすることができる細胞外酵素を作り出すバクテリア、イーストと真菌を含む、たくさんの微生物によって分解され、エネルギー源として使われることができる。 (Aro et al., J. Biol. Chem., vol. 276, no. 26, pp. 24309-24314, June 29,2001) 再生不可能な資源の限界が近づくにつれ、主要な再生可能資源となるセルロースの可能性は重要となる。(Krishna et al., Bioresource Tech. 77: 193-196,2001) 生物学的過程をへたセルロースの効果的な利用は、食料、飼料及び燃料の貯蔵量を増やすためのアプローチの一つである(Ohmiya et al., Biotechnol. Gen. Engineer. Rev. vol.14, pp. 365-414,1997)。
【０００６】
セルラーゼはセルロース（ベータ-1,4-グルカン又はベータ D-グルコシド結合）を加水分解して、グルコース、セロビオース、セロオリゴサッカライド及び同種のものを生成する酵素である。セルロースは伝統的に３つの型に分類されている：エンドグルカナーゼ (EC3.2.1.4)(“EG”)、エキソグルカナーゼ又はセロビオハイドラーゼ (EC3.2.1.91)(“CBH”) 及びベータグルコシダーゼ(［ベータ］-D-グルコシドグルハイドラーゼ；EC3.2.1.21)（”BG”） (Knowles et al., TIBTECH 5,255-261, 1987; Shulein, Methods Enzymol., 160,25, pp. 234-243, 1988) エンドグルカナーゼは主に、セルロース繊維の無定形の部分に作用するのに対して、セロビオハイドラーゼもまた、結晶セルロースを分解することができる。(Nevalainen and Penttila, Mycota, 303-319,1995) 従って、セルラーゼシステムの中のセロビオハイドラーゼの存在は結晶セルロースの効率的な可溶化のために必要とされている。(Suurnakki, et al. Cellulose 7: 189-209, 2000) ベータグルコシダーゼはD-グルコース単位をセロビオース、セロオリゴ糖、および他のグルコシドから遊離するために作用する(Freer, J. Biol. Chem. vol. 268, no. 13, pp. 9337-9342,1993)。
【０００７】
セルラーゼは多くのバクテリア（菌類及び酵母菌）から生産されることが知られている。ある種の菌類は、セルロースの結晶構造を分解することができる完全なセルラーゼ系を生産することができる。多くの酵母由来の糸状菌、は特有の活性を有し、例えば、サッカロマイセス・セレヴィシエ（出芽酵母）は、セルロースの加水分解活性を欠いている。Aro ら、 2001; Aubert ら、 1988; Wood ら、 (Methods in Enzymology, vol. 160, no. 9, pp. 87- 116,1988)、 及び Coughlan ら、("Comparative Biochemistry of Fungal and Bacterial Cellulolytic Enzyme Systems" Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, pp. 11-30 1988)を参照のこと。
【０００８】
CBH、EG及びBGの真菌セルラーゼ区分は、各区分内で倍数体があることにより、それぞれの区分内に異なる組成物を含む。例えば、多数のCBHs、EGs及びBGsは、2のCBHs、すなわちCBH I 及びCBH II、少なくとも８のEGs、すなわち、EG I、EG II、EG III、EG IV、EG V、EG VI、EG VII、およびEG VIII及び少なくとも5のBGs 、すなわち、BG 1、BG 2、BG 3、BG 4、およびBG 5に対する遺伝子を含むことで知られているトリコデルマレーシ（Tricoderma reesei）を含む様々な糸状菌源から単離されてきた。
【０００９】
結晶化セルロースをグルコースへ転換する目的のために、結晶化セルロースの加水分解能力を失わずに単離されたGBH、EG及びBGそれぞれの区分からの組成物を含むシステムが必要とされる。(Filho et al., Can. J. Microbiol. 42: 1-5,1996)異なる区分間のセルラーゼ成分の相互作用が見られる。具体的には、EGタイプセルラーゼ及びCBHタイプセルラーゼはより効果的にセルラーゼを分解するために相互作用している。例えば、Wood, Biochemical Society Transactions, 611th Meeting, Galway, vol. 13, pp. 407-410,1985参照のこと。
【００１０】
セルラーゼは当該技術分野において、布製品に対する洗剤成分の洗浄効果を高め、柔軟成分として綿布又は類似のものに対する風合い、外観を改善するのに有用であることが知られている(Kumar et al., Textile Chemist and Colorist, 29: 37-42,1997)。
【００１１】
洗浄効果が向上されたセルラーゼ含有洗剤組成物(US Pat. No. 4,435,307; GB App. Nos. 2,095,275 及び 2,094,826)及び布製品に対して風合い及び外観を改善するために使用すること(US Pat. Nos. 5,648,263, 5,691,178, 及び 5,776,757; GB App. No. 1,358,599; The Shizuoka Prefectural Hammamatsu Textile Industrial Research Institute Report, Vol. 24, pp. 54-61,1986)が開示されている。
【００１２】
従って、菌類及びバクテリア由来のセルロースは注目されている。具体的には、トリコデルマspp.（例えばトリコデルマロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）あるいはトリコデルマレーシ）はセルラーゼの結晶構造を分解する完全なセルロースシステムを有する。セルラーゼ組成物はこれまで開示されてきているけれども、一般家庭用の洗剤、ストーンウォシュ用組成物又は洗濯用洗剤等に用いるための新しく改良されたセルラーゼ組成物の必要性がいまだ存在する。性能が改良されたセルラーゼについて特別な関心が集まるであろう。
【発明の開示】
【００１３】
発明の概要
本発明はセルラーゼタンパク質の単離、ここでは、変異体CBH I及び変異体CBH Iをエンコードする核酸に関係する。 第1の実施態様では本発明は、ハイポクレアジェコリーナ(ESQ ID NO:2)において、1以上の対応する残査S8, Q17, G22, T41, N49, S57, N64, A68, A77, N89, S92, N103, A112, S113, E193, S196, M213, L225, T226, P227, T246, D249, R251, Y252, T255, D257, D259, S278, S279, K286, L288, E295, T296, S297, A299, N301, E325, T332, F338, S342, F352, T356, Y371, T380, Y381, V393, R394, S398, V403, S411, G430, G440, T445, T462, T484, Q487, 及びP491において置換または欠失から成る変異体CBH Iセルラーゼに関する。第1の側面において、本発明は単離されたセロビオハイドラーゼ活性能を有するポリペプチドをエンコードする核酸を含み、このポリペプチドは、前記核酸によりエンコードされたファミリー7のグリコシルハイドラーゼの変異体であり、前記核酸は、このポリペプチド中の熱ストレスに反応する部分の残基の置換をエンコードしており、前記変異セロビオハイドラーゼはH.ジェコリーナセロビオハイドラーゼ由来のものである。第2の側面において、本発明は単離されたセロビオハイドラーゼ活性能を有するポリペプチドをエンコードしている核酸を含む。このポリペプチドは、前記核酸によりエンコードされたファミリー7のグリコシルハイドラーゼの変異体であり、前記核酸は、このポリペプチド中の酵素機能に作用する残基の置換をエンコードしており、前記変異セロビオハイドラーゼはH.ジェコリーナセロビオハイドラーゼ由来のものである。第3の側面において、本発明は単離されたセロビオハイドラーゼ活性能を有するポリペプチドをエンコードしている核酸を含む。このポリペプチドは、前記核酸によりエンコードされたファミリー7のグリコシルハイドラーゼの変異体であり、前記核酸は、このポリペプチド中の生産物障害に作用する残基における置換をエンコードしており、前記変異セロビオハイドラーゼはH.ジェコリーナセロビオハイドラーゼ由来のものである。
【００１４】
第2の実施態様では、本発明は、ハイポクレアジェコリーナ(ESQ ID NO:2)の、1以上の対応する残基S8, Q17, G22, T41, N49, S57, N64, A68, A77, N89, S92, N103, A112, S113, E193, S196, M213, L225, T226, P227, T246, D249, R251, Y252, T255, D257, D259, S278, S279, K286, L288, E295, T296, S297, A299, N301, E325, T332, F338, S342, F352, T356, Y371, T380, Y381, V393, R394, S398, V403, S411, G430, G440, T445, T462, T484, Q487, 及びP491において置換から成る変異体CBH Iセルラーゼに関する。この変異は、この実施態様の第1の側面においては、変異体CBHIセルラーゼはさらにハイポクレアジェコリーナ(ESQ ID NO:2)由来のCBH IのT445に対応する部分の欠損を有する。この実施態様の第2の側面においては、変異体CBHIセルラーゼはさらにハイポクレアジェコリーナ(ESQ ID NO:2)由来のCBH Iの382-393残基に対応する部分の残基の欠損を有する。
【００１５】
第3の実施態様では、本発明は、変異体CBH Iセルラーゼに関する。ここで、前記変異体は、ハイポクレアジェコリーナ(ESQ ID NO:2)由来のCBH IのS8P, N49S, A68T, A77D, N89D, S92T, S113 (N/D), L225F, P227 (A/L/T), D249K, T255P, D257E, S279N, L288F, E295K, S297T, A299E, N301K, T332 (K/Y/H), F338Y, T356L, V393G, G430Fから成る群から選択される残基に対応する部分の置き換えを有している。
【００１６】
第4の実施態様では本発明は、ハイポクレアジェコリーナ(ESQ ID NO:2)由来のCBH I中の以下の部分より成る群から選択される部分について突然変異を有する変異体CBH Iセルラーゼに関する。
【００１７】
i. A112E/T226A ;
ii. S196T/S411F ;
iii. E295K/S398T;
iv. T246C/Y371C ;
v. T41I plus deletion at T445
vi. A68T/G440R/P491L ;
vii. G22D/S278P/T296P;
viii. T246A/R251A/Y252A ;
ix. T380G/Y381D/R394A ;
x. T380G/Y381 D/R394A plus deletion of 382-393, inclusive;
xi. Y252Q/D259W/S342Y ;
xii. S113T/T255P/K286M ;
xiii. P227L/E325K/Q487L;
xiv. P227T/T484S/F352L;
xv. Q17L/E193V/M213I/F352L ;
xvi. S8P/N49S/A68T/S113N ;
xvii. S8P/N49S/A68T/S113N/P227L;
xviii. T41I/A112E/P227L/S278P/T296P;
xix. S8P/N49S/A68T/A112E/T226A ;
xx. S8P/N49S/A68T/A112E/P227L;
xxi. S8P/T41I/N49S/A68T/A112E/P227L ;
xxii. G22D/N49S/A68T/P227L/S278P/T296P;
xxiii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P;
xxiv. G22D/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P;
xxv. G22D/N49S/A68T/N103I/A112E/P227L/S278P/T296P ;
xxvi. G22D/N49S/N64D/A68T/N103I/S113N/S278P/T296P;
xxvii. S8P/G22D/T41I /N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/D249K/S278P/T2
96P;
xxviii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P/N301R ;
xxix. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/D249K/S278P/T2
96P/N301R
xxx. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/N
301R;
xxxi. S8P/T41I /N49S/S57N/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/N
301R;
xxxii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/N301R;
xxxiii. S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/V403D/T462I ;
xxxiv. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/V403D/
T462I;
xxxv. S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/S411F;
xxxvi. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/S411F;
xxxvii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T25
5P/S278P/T296P/N301R/E325K/S411F;
xxxviii. S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P/S2
78P/T296P/N301R/E325K/V403D/S411F/T462I;
xxxix. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T25
5P/S278P/T296P/N301R/E325K/V403D/S411F/T462I;
第5の実施態様では、本発明は、CBH Iをエンコードする核酸から成るベクターに関する。他の側面においては、調整シーケンスを実行可能なようにリンクされた変異体CBH Iをエンコードする核酸を含む構造が存在する。
【００１８】
第6の実施態様では、本発明はCBH I変異体をエンコードしている核酸から成っているベクターと変換した宿主細胞に関する。
【００１９】
第7の実施態様では本発明は、CBH I変異体を生産する方法であって以下の過程を含むものに関する。
【００２０】
(a) CBH I変異体を生み出すために適当な条件の下で適当な培地の中でCBH I変異体をエンコードしている核酸を含むベクターと、宿主細胞を培養すること。
【００２１】
(b)上記生産されたCBHI変異体を得ること。
【００２２】
第8の実施態様では本発明は、界面活性物質とCBH I変異体を含む洗浄剤組成物に関係する。この実施態様の１の側面においては、洗剤は洗濯用洗剤である。第２の側面においては、洗剤は食器用洗剤である。第３の側面においては、この変異体CBH Iセルラーゼは、セルロースを含む布地、具体的にはストーンウォッシュ又はインディゴダイデニムの処理に用いられる。
【００２３】
第9の実施態様では、本発明はCBH I変異体を含む食品添加物の関係する。
【００２４】
第10の実施態様では、本発明はCBH I変異体と木製パルプを含む、木製パルプの処理方法に関係する。
【００２５】
第11の実施態様では、本発明は、CBH I変異体とバイオマス（生物資源）を含む。バイオマスを糖に転換する方法に関する。
【００２６】
ある実施態様では、本発明のセルラーゼは、細菌、バクテリア、放線菌から生産される。他の実施態様では、このセルラーゼは細菌由来である。最も好ましい実施態様では、この細菌は糸状菌である。この糸状菌は、Euascomycete属のものであって、具体的には、Aspergillus spp., Gliocladium spp., Fusarium spp., Acremonium spp., Myceliophtora spp., Verticillium spp., Myrothecium spp., 又は Penicillium spp.である。この実施態様のさらなる側面においては、このセルラーゼはセロビオハイドラーゼである。
【００２７】
本発明に関する上述以外の対象物、特徴点及び利点は以下の詳細な説明に開示してある。
【００２８】
詳細な説明や特定の例においては、本発明の好適な実施態様を示しているが、これらは例示するためのものであって、本発明の範囲および基本的な考え方から外れることなく、ここで述べる詳細な説明に基づいて、種々の変形や改良を行うことが可能であることは当該技術の分野のものにとっては明らかな事項であると理解しなければならない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
実施例の詳細な説明
本発明は、ここで以下の定義と実施例を用いることで、参照により詳細に説明されるであろう。明確に参照されているすべての配列を含むすべての特許と出版物は、参照によりここに含まれる。
【００３０】
ここに違った形で定義されない限り、そしてここに使ったすべての技術用語、科学用語はは、一般的に、この発明の属する分野の当業者によって理解されているのと同じ意味を持っている。Singleton, et al、DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994), 及び Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) は本発明で用いられる全般的な用語の多くについての一般的な辞書である。ここに説明されたそれらに類似しているか、等しいどのような方法と原料でも本発明の実行またはテストに用いることができるけれども、好適な方法と原料は説明される。数値の範囲は定義している数を含めるものである。違った形で示されない限り、塩基配列は左から右に向かって5’末端から3’末端を表す；アミノ酸配列は、左から右に向かって、アミノ末端からカルボキシ末端を表す。専門家は特に本分野の定義と用語についてSambrook et al., MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL (Second Edition), Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., 1989, and Ausubel FMet al., Current Protocols in Molecular Biology, JohnWiley & Sons, New York, NY, 1993,を参考にすることができる。本発明は、説明された特定の方法、手段、試薬等が変更されるときに、これらに限定されないことは理解される。
【００３１】
ここに提供された見出しは、明細書を全体として理解し得る本発明の実施態様の様々の態様を限定するものではない。従って、すぐ下で定義された用語はこの明細書によってより完全に定義される。
【００３２】
ここに引用されたすべての出版物は、発明に関連して使われる組成物と方法を説明し、これらを明確にするためのりものであり、ここに参照することによって本明細書の取り込まれる。
【００３３】
I. 定義
ここにおいて用いられる、「ポリペプタイド」という語は、ペプチド結合による一本鎖アミノ酸残基による組成物を言う。「タンパク質」という語は、ここで用いられる「ポリペプタイド」と同義であり、また、2以上のポリペプタイドの錯体をも意味する。
【００３４】
「変異体」は、前駆物質タンパク質（例えば、天然タンパク質）から生産されるプロテインであって、1以上のアミノ酸がC末端かN末端のどちらか又は両方に添加されること、アミノ酸配列中の1以上の異なる部位にけるアミノ酸の置換又はタンパク質の両端またはどちらか又は、アミノ酸配列中の1以上の部位における1以上のアミノ酸の欠失をいう。酵素変異体の調製は、好ましくは天然タンパクをエンコードしたDNA配列の変更、適切な宿主細胞内でのDNA配列の形質転換及び生産酵素を形成するような修飾されたDNA配列の発現によって達成できる。本発明のCBH I酵素の変異体は、前駆体アミノ酸配列と比較して変更されたアミノ酸配列を含むペプタイドを含む。ここで、変異体CBH酵素は、前駆体酵素が有していたセルロース分解能を有しており、いくつかの特定の様相においては変更された性質を示す。例えば、変異体CBH酵素は、至適pHが高くなり、温度又は酸化安定性が増えるが、セルロース分解能は保持したままである。発現されたセルラーゼ誘導体の機能的な活性が保持されている本発明に応じた変異体は、セルラーゼ変異体CBH酵素をエンコードしているDNA断片から引き出されることが予想される。例えば、セルラーゼをエンコードしているDNA断片は、さらに、セルラーゼ領域の機能的な活性が保持されている5'または3'末端のどちらかで、このセルラーゼDNA配列に接続したヒンジ部またはリンカーをエンコードしているDNA配列または部分を含む。
【００３５】
「等しい残基」とは、三次構造がエックス線結晶解析によって決定されている前駆物質セルラーゼに対する三次構造のレベルで相同を決定することによって定義される。等しい残基は、セルラーゼ及びハイポクレアジェコリーナCBHの特定アミノ酸残基の主鎖原子のうちの2つ以上の原子座標（NのN、CAのCA、CのC及びOのO）が、位置あわせをしたときに、0.13nm及び、好ましくは0.1nm内にあるものと定義される。最良モデルが、問題となるCBHIのセルラーゼの非水素タンパク質原子の原子座標の最大オーバーラップを与えるように、方向付けられて置かれた後に、位置あわせは達成される。この最良モデルは、利用しうる高解像度での実験的回析データに対して最も低い解離因子（R）を与える結晶モデルである。
【式１】
【００３６】
H. jecorina CBH Iの特定の残基と機能的に似ている当量の残基は、H. ジェコリーナ CBH Iの特定の残基に定義され、特徴付けられている、タンパク質構造、基質結合 、または触媒現象を変更し、修正し、あるいは、これらに寄与している構造を採用するセルラーゼのアミノ酸と定義される。さらに、それらは、与えられた残基の主鎖原子が、相同の位置を占めることに基づいて等価の基準を満たさないかもしれないけれども、残基の側鎖原子の少なくとも2つの原子の座標はH. ジェコリーナ CBHの対応する側鎖原子の0.13nmのところにあるように、相似の位置を占める、セルラーゼ(三次構造はエックス線結晶解析によって得られている)のそれらの残基である。H. ジェコリーナCBH Iの結晶構造を図2に示す。
【００３７】
「核酸分子」は、RNA、DNA及びcDNA分子を含む。遺伝暗号の退縮の結果として、CBHIのような与えられたタンパクをエンコードしている塩基配列の多様性が生まれる。本発明は、遺伝暗号の退縮を、与えられたすべてのCBHIをコードしているできる限り多くの変異塩基配列を予測するものである。
【００３８】
「非相同の」核酸構築物または配列は、それが発現する細胞固有のものではない配列の一部を有している。制御配列に関する非相同とは、発現を現在調節している同じ遺伝子を調節するために事実上機能しない制御配列（すなわちプロモーター又はエンハンサー）をいう。一般的に、非相同な塩基配列はそれらのもともとの細胞又は遺伝子の一部には存在しないのもであり、感染、トランスフェクション、形質転換、顕微注入、エレクトロポーション又は同様の方法により細胞へ添加されたものである。「非相同な」核酸構築物は、ネイティブの細胞の中で発見された制御シーケンス/DNAコーディングシーケンスの組み合わせと同じであるか、異なる制御シーケンス/DNAコーディングシーケンスを組み合わせたものを含む。
【００３９】
ここで用いる「ベクター」という語は、異なる宿主細胞間を輸送することを目的とする核酸構築物である。発現ベクターとは、異質細胞内で、相同なDNA断片を取り込み、発現させる能力があるベクターをいう。多くの原核又は真核細胞のベクターは市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当該技術分野においてよく知られている。
【００４０】
「発現カセット」又は「発現ベクター」は、目的細胞内のある特定の核酸を転写させる一連の特定の核酸要素と共に用いる組み換え処理により、または合成的に生産された核酸構築物である。組み換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアDNA、色素体DNA、ウイルス又は核酸断片に取り込むことができる。典型的には、多くの塩基配列中の発現ベクターが取り込まれた組み換えカセット部分は、転写され、プロモーターになる。
【００４１】
ここで用いる「プラスミド」という語は、クローニングベクターとして用いられる環状2本鎖DNA（duble-stranded(ds)）構築体であり、染色体外にある自己複製する遺伝子要素を形成するものである。
【００４２】
ここで用いる“選択マーカー−エンコードヌクレオチド配列”の語は宿主細胞において発現できるヌクレオチド配列をいい、選択マーカーの発現により対応する選択因子の存在下、または必須栄養素の不存在下で発現遺伝子を含む細胞は成長できるようになる。
【００４３】
ここで用いられる「プロモーター」という語は、下流遺伝子転写に直接作用する核酸配列をいう。このプロモーターは一般的に目的遺伝子が発現される宿主細胞内に用いられる。このプロモーターは、他の転写又は翻訳調節核酸配列（「制御配列」ともいう）と共に、与えられる遺伝子の発現に必要である。一般的には、この転写又は翻訳調節配列には、プロモーター塩基配列、リボゾーム結合部位、転写開始又は終了塩基配列を含むがそれらに限られない。
【００４４】
「キメラ遺伝子」又は「非相同核酸構造」は、調節領域を含む、異なる遺伝子の形質転換部分を構成する非野生型遺伝子（すなわち、宿主内に導入されたもの）をいう。宿主細胞の形質転換をするためのキメラ遺伝子構築物は、一般的に異種のタンパク質コーディング配列、または選択マーカーのキメラ遺伝子の中に、形質転換細胞に抗生物質抵抗性を与えているタンパク質をエンコードしている選択マーカー遺伝子と操作可能に接続した転写の規制の部分(促進因子)から構成されている。
【００４５】
核酸は他の核酸配列と機能的な関係に位置する場合、「操作可能に結合」しているといえる。例えば、DNAが、ポリペプチドの分泌に関与するプレ蛋白質として発現されるならば、分泌性のリーダーをエンコードしているDNAはポリペプチドのためにDNAと操作可能に結び付く。それが配列の転写に影響するならば、促進因子またはエンハンサーはコーディングシーケンスと操作可能に結び付く；または、それが、翻訳を容易にするように置かれるならば、リボゾーム結合部はコーディングシーケンスと操作可能に結び付く。一般に、「操作可能に結びつく」とは、結合するDNA配列が隣接していて、分泌性のリーダーの場合に隣接していて、読取り枠の中であることを意味している。しかし、エンハンサーは、隣接している必要がない。結合は適宜の制限酵素認識部位で連結反応によって遂行される。そのようなサイトが存在していないならば、PCRのための合成のオリゴヌクレオチドアダプター、リンカー、またはプライマーが従来的に用いられている。
【００４６】
ここで用いる、“遺伝子”の語はポリぺプチド鎖の生成に関するＤＮＡの染色体断片を意味し、コード領域（例えば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）またはリーダー配列及び３’非翻訳（３’ＵＴＲ）またはトレーラー配列）に先行または後に続く領域、及び個々のコード断片（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含んでも含まなくてもよい。
【００４７】
一般に、SEQ ID NO.1としてここに提供された野生型配列に対する中から高ストリンジェンシー条件下で、変異体CBH Iをエンコードする核酸分子はハイブリダイズする。しかし、場合によっては、実質的に異なるコドン使用頻度を有するCBH Iエンコーディング核酸配列の使用が、CBH Iエンコーディング核酸配列によってエンコードされたタンパク質は天然タンパク質と同じか、又は実質的に同じアミノ酸配列を有する。例えば、コーディング配列は、宿主によって利用される特定コドンの頻度に従い、特定の原核生物又は真核生物の発現システムにおいて、CBH Iの発現を早くするために修飾される。Te'o et al. (FEMS Microbiology Letters 190: 13-19,2000)、は、例えば、糸状菌の発現についの遺伝子の最適化について記載している。
【００４８】
核酸配列は、２つの配列が中〜高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件下でお互いに特異的にハイブリダイズする場合、対照核酸配列に “選択的にハイブリダイズ可能”であると考えられる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合体又はプローブの融点（Tm）に基づいている。例えば、「最大ストリンジェンシー」は典型的にTm-5℃（プローブのTmより5℃低い）で起こる；「高ストリンジェンシー」はTmより約5-10℃低い温度で起こる；「ゆるやかな」又は「中間ストリンジェンシー」はプローブのTmより約10-20℃低い温度で起こる；及び「低ストリンジェンシー」はTmより約20-25℃低い温度で起こる。機能的に、最大のストリンジェンシー条件は、ハイブリダーゼーションプローブと厳密な同一性またはほぼ厳密な同一性を有する配列を同定するために使われることができ；一方、高いストリンジェンシーは、プローブと約80%以上同一性を有する配列を同定するために使われる。
【００４９】
中間ストリンジェンシー又は高ストリンジェンシー条件は、本技術分野でよく知られている（例えば、Sambrook, et al., 1989, Chapters 9 及び 11, 及び in Ausubel, F. M., et al., 1993を参照のこと。これらは参照によりここに組み込まれる。）高ストリンジェンシー条件の例としては、50％ホルムアミド、5ＸSSC、5Ｘデンハード溶液、0.5%SDS及び100μg/ml変性キャリアDNA中、約42℃でのハイブリダイゼーションを行い、続いて2ＸSSC及び0.5％SDS中で、室温で2回洗浄し、0.1ＸSSC及び0.5％SDS中で、更に42℃で2回洗浄する。
【００５０】
ここで用いる「組換え体」は、非相同核酸配列の導入により修飾され、または修飾された細胞に由来する細胞またはベクターに関するものが含まれる。従って、例えば組換え細胞は、意図的にヒトが介入した結果として発現されまたは発現されない条件下で、当該細胞の天然型（非組換え体）の中に同一の形態として見られない遺伝子を発現し、または異常発現される天然遺伝子を発現する。
【００５１】
ここに用いる「形質転換」「安定な形質転換」「遺伝子組み換え」の語は、細胞に関して、ゲノムに組み込まれ、または複数の世代を通して維持されているエピゾームプラスミドとして非天然(非相同)核酸配列を有する細胞を意味している。
【００５２】
ここで用いられる、「発現」という語は、ポリペプチドが、遺伝子の核酸シーケンスに基づいて生み出される過程を言う。この過程は転写と翻訳の両方を含む。
【００５３】
核酸配列を細胞のなかに挿入するという文意の中で用いられている「導入」の語は、「トランスフェクション」、又は「形質転換」又は「形質導入」を意味し、核酸配列を真核又は原核細胞に組み込むことを含み、核酸配列が細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体又はミトコンドリアDNA）に組み込まれ、自己複製子へ転換されるか、一時的に発現される。（例えば、トランスフェクトmRNA）
「CBHI発現」という語は、cbhI遺伝子の転写及び翻訳をいう、この生産物はRMA前駆体、mRNA、ポリペプチド、翻訳後調節過程のポリペプチド及びトリコデルマコニンギ, ハイポクレアジェコリーナ(トリコデルマロンギブラキアタム、トリコデルマレーシ またはトリコデルマビリデとして知られている) 及びハイポクレアスキエイニチ（Hypocrea schweinitzii）のような近縁種由来のCBH Iを含むそれらの誘導体である。実施例で示す方法であるが、CBHＩ発現を測定する方法は、CBHIタンパクについてのウエスタンブロット、CBHIのmRNAに対してのノザンブロット測定、及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応測定法（RT-PCR）及びShoemaker S. P. 及び Brown R. D. Jr. (Biochim. Biophys. Acta, 1978,523 : 133-146) 及び Schulen (Methods Enzymol., 160,25, pp. 234-243,1988)に記載されているエンドグルカナーゼ活性測定の各方法がある。
【００５４】
「選択的スプライシング」という語は、複数のイソ型ポリペプタイドが単一遺伝子から生成され、この遺伝子のすべてではないがくつかの転写過程の間に、非連続的なエクソンをつなげる工程を含む。したがって、特定のエクソンはいくつかの選択エクソンと結合し、メッセンジャーRNAを形成する。この選択的スプライスmRNAのは、いくつかの部分が共通で他の部分が異なるポリペプチド（スプライス変異体）を作る。
【００５５】
「シグナル配列」という語は、細胞外への成熟型タンパクの分泌を促進するN末端部分アミノ酸配列である。細胞外タンパク質成熟型は、分泌過程の中で分裂するシグナル配列を欠いている。
【００５６】
「宿主細胞」という語は、ベクターを含み、発現構築物の複製、及び/又は転写又は、転写及び翻訳（発現）を支える細胞である。本発明で用いられる宿主細胞は、大腸菌のような原核生物の細胞又は、酵母菌、植物、昆虫、両生類又は哺乳類のような真核細胞である。一般的には、宿主細胞は糸状菌である。
【００５７】
「糸状菌」という語は、当該技術分野において糸状菌であると認められる任意の又は全ての糸状菌を意味する。好ましい、細菌は、アルペルギウス（Aspergillus）、トリコデルマ（Trichoderma）、フサリウム（Fusarium）、クリソスポリウム（Chrysosporium）, ペニシリウム（Penicillium）、フミコーラ（Humicola）、ニューロスポラ（Neurospora）又は エメリセラ（Emericella）、ハイポクレア（Hypocrea）などそれらの別の有性型からなる群より選択される。無性の工業用菌類であるトリコデルマレーシは子嚢菌類のハイポクレアジェコリーナのクローンの誘導体であることは明らかである。
【００５８】
「セロオリゴ糖」という語は、2-8のグルコース単位を含み、β-1,4結合を有するオリゴ糖グループのことを言い、例えばセロビオースである。
【００５９】
「セルラーゼ」という語は、セルロースポリマーをより短いセロオリゴ糖オリゴマー、セロビオース、及び/又はグルコースに分解する能力を有する酵素の分類をいう。エキソグルカナーゼ、エキソセロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ、及びグルコシダーゼノのようなセルラーゼの多くの例は、細菌、植物及びバクテリアを含むセルロース分解能を有する有機体から得られる。
【００６０】
ハイポクレアジェコリーナ由来CBH Iは、グルコース化加水分解酵素ファミリー７（以下Cel7）のメンバーであり、特にハイポクレアジェコリーナにおいて確立されたグルコース化加水分解酵素ファミリー７の第一のメンバーである（以下Cel 7A）。グルコース化加水分解酵素ファミリー７はエンドグルカナーゼ及びセロビオハイドラーゼ/エキソグルカナーゼを含んでおり、CBH Iは後者である。したがって、CBH I、CBH I型タンパク質及びCel 7という語は、ここにおいて互換的に使用される。
【００６１】
「セルロース結合領域」という語は、ここにおいて、セルラーゼ又はそれらの誘導体のセルロース結合活性が含まれるセルロースのアミノ酸配列の部位又は酵素の領域を言う。セルロース結合領域は、一般的にセルロースとセルロース、セルロース誘導体またはそれらのその他の多糖類同等物を非共有結合にすることにより機能する。セルロース結合領域は触媒中心に起因する著しい触媒活性を示さない。他言すれば、セルロース活性部位は、触媒活性を有する構造成分とは区別されるセルロース酵素タンパク質の三次構造の構造成分である。セルロース結合部位とセルロース結合構成要素という語はここでは同義に使用される。
【００６２】
ここにおいて、「界面活性剤」という語は、表面活性特性を有すると当該技術分野で認められている任意の化合物をいう。従って、例えば、界面活性剤は、一般的に洗剤中入っている陰イオン性、陽イオン性及び非イオン性の界面活性剤から成る。陰イオン性界面活性剤は直鎖又は分岐のアルキル・ベンゼン・スルホン酸塩；直鎖又は分岐アルキル基又はアルケニル基を有するアルキル又はアルケニルエーテル硫酸塩；アルキル又はアルケニル硫酸塩；オレフィンスルフォン酸塩；及びアルカンスルフォン酸塩を含む。両性界面活性剤は、4級アンモニウム塩スルフォンサン塩、及びベタイン型両性界面活性剤を含む。そのような両性界面活性剤は同一分子内にプラス及びマイナスに帯電した部分を有している。非イオン性界面活性剤は高級脂肪酸アルカノールアミド又はそれらのアルキレン酸化物の付加物、脂肪酸グリセリンモノエステル及び同種のものだけでなく、ポリオキシアルキレンエーテルも同様に含まれる。
【００６３】
ここで用いる「セルロース含有繊維」とは、天然セルロース物質及び人工セルロース物質（例えば、ジュート、麻、ラミー、レーヨン及びライオセル）を含む綿または非綿含有セルロース含有物から作成されるいかなる縫合又は非縫合織物、毛糸又は繊維をいう。
【００６４】
ここで用いられる「綿を含む布地」とは、純粋な綿又は、綿織布、綿ニット、綿デニム、綿毛糸、原綿（綿花）及び同種のものを含んだ綿混合物をいう。
【００６５】
ここで用いる「ストーンウォシュ組成物」とは、セルロース含有織物のストーンウォシュに用いる製剤を言う。ストーンウォシュ組成物はセルロース含有布地を販売するに先立って加工するために用いられる、すなわち、製造過程において用いられる。対照的に、洗浄組成物は汚れた衣類の洗浄することを対象としており、工業的生産過程においては使用されない。
【００６６】
ここで用いられる「洗浄組成物」は、セルロースを含んだ汚れた布地の洗濯に対する洗浄手段に用いることを意図された混合物である。本発明の文脈中、そのような組成物生物は、セルラーゼ及び界面活性剤に加えて、さらに加水分解酵素、原材料、漂白剤、漂白活性剤、青味剤、蛍光染料、ケーキング抑制剤、マスキング剤、セルラーゼ活性剤、抗酸化剤、及び可溶化剤を含む。
【００６７】
ここで用いる「cbh1遺伝子の発現の減少又は排除」とは、cbh1遺伝子が遺伝子から削除されているために、組み換え宿主微生物によって発現できないこと；又は機能的なCBH1酵素が宿主の微生物によって生み出されないように、cbh1遺伝子が修飾されていることのどちらかを意味する。
【００６８】
ここで用いる「変異体cbh1遺伝子」又は「変異体CBH1」は、それぞれ、H. ジェコリーナ由来のcbh1遺伝子の核酸シーケンスが、コーディングシーケンスを取り除き、追加し、および／または処理することによって変更されたか、発現されたタンパク質のアミノ酸配列がここに説明された発明と一致するように修正されていることを意味する。
【００６９】
ここで用いる、「精製する」という語は、一般に、細胞を含む遺伝子組換された核酸またはタンパク質を生化学的精製、および／またはカラムクロマトグラフィーにかけることを意味する。
【００７０】
ここで用いる「活性の」又は「生物学的に活性の」とは、ある特定のタンパク質と関係のある生物学的活性を言い、ここでは、互換的に使用される。例えば、プロテアーゼと関係する酵素活性はタンパク質分解であり、実際に、活性を有するプロテアーゼはタンパク質分解活性を有している。このことは、与えられたタンパク質の生物活性は一般に当業者によってそのタンパク質に帰属するどのような生物活性でも言うと理解される。
【００７１】
ここで用いる「濃縮する」という語は、CBHが入手できる、野生型又は自然発生する細菌性のセルラーゼ組成物に見られるCBH濃度よりも相対的に高い濃度である。この濃縮する、高める、促進されたという語は、互換的に用いられる。
【００７２】
野生型細菌性セルラーゼ組成物は、天然に自生している細菌源によって生産されるのもであり、1以上のBGL、CBH及びEG成分を含んでいる。そしてこれらの成分のそれぞれは細菌源によって生産される比率で発見される。従ってCBHを高めた組成物は他のセルラーゼ組成物（すなわち、EGs、ベータグルコシダーゼ及び他のエンドグルカナーゼ）に対するCBHの割合が高められた、変更された割合のCBHを有する。
【００７３】
従って、図示するように、自然発生的なセルラーゼシステムは、至適pHにおけるイオンクロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、分子ふるい及び同種のものを含むものであり、出版された文献中に記載の分離技術により、大幅に精製された組成物に精製される。例えば、イオン交換クロマトグラフィー（たいていは陰イオン交換クロマトグラフィー）において、pH勾配又は塩勾配又はｐH及び塩の両者の勾配を用いた溶出により、セルラーゼ組成物を分離することは可能である。精製されたCBHは、最終的にCBH濃度の高い溶液となる酵素溶液に添加される。可能であれば、他のセルラーゼをエンコードしている1以上の遺伝子の欠損部分と関連して、CBHをエンコードした遺伝子の過剰発現させる分子遺伝学的方法を用いて、微生物により生産されるCBHIの量を多くすることは可能である。
【００７４】
細菌のセルラーゼは1以上のCBH成分を含んでいる。この異なる成分は、イオン交換クロマトグラフィー及び同種のものを介して分離することが可能な、遺伝的に異なった等電点を有しいる。単一CBH成分又はCBH成分の組み合わせのどちらか一方が、酵素溶液中に用いられる。
【００７５】
酵素溶液中に用いる場合、CHBIの相同体又は変異体成分は遺伝的にバイオマスから可溶糖の放出を高めるのに十分な量が添加されている。追加された同族体または変異体のCBH1成分の量は、糖化される生物量のタイプに依存しており、熟練した者によって直ちに決定することができる。しかしながら、（酵素溶液中に）用いられたときに、セルラーゼ組成物中の、あるEGタイプの成分に対する相同又は変異CBH成分の重量パーセントは、好ましくは約1、好ましくは約5、好ましくは約10、好ましくは約15、又は好ましくは約20重量パーセントから、好ましくは約25、好ましくは約30、好ましくは約35、好ましくは約40、又は好ましくは約50重量パーセントまでである。さらに、好ましい範囲は、約0.5から15重量パーセント、約0.5から20重量パーセント、約1から約10重量パーセント、約1から約15重量パーセント、約1から約20重量パーセント、約1から約25重量パーセント、約5から約20重量パーセント、約5から約25重量パーセント、約5から約30重量パーセント、約5から約35重量パーセント、約5から約40重量パーセント、約5から約45重量パーセント、約5から約50重量パーセント、約10から約20重量パーセント、約10から約25重量パーセント、約10から約30重量パーセント、約10から約35重量パーセント、約10から約40重量パーセント、約10から約45重量パーセント、約10から約50重量パーセント、約15から約20重量パーセント、約15から約25重量パーセント、約15から約30重量パーセント、約15から約35重量パーセント、約15から約30（40？）重量パーセント、約15から約45重量パーセント、約15から約50重量パーセントである。
【００７６】
II．宿主有機体
糸状菌はすべて真菌類及び卵菌類に再分類される。糸状菌は、菌糸の伸長と偏好気性である炭素代謝による栄養生長を伴う、キチン、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複合多糖類から構成されている細胞壁を持っている栄養菌糸によって特徴付けられている。
【００７７】
本発明では、糸状菌親細胞はトリコデルマ種の細胞、例えば、Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Trichoderma harzianum ; Penicillium sp.; Humicola sp. , including Humicola insolens and Humicola grisea ; Chrysosporium sp., including C. lucknowense ; Gliocladium sp.; Aspergillus sp.; Fusarium sp., Neurospora sp., Hypocrea sp., and Emericella spであるがこれらに限られない。ここで用いる「トリコデルマ」又は「トリコデルマ種」という語は、以前にトリコデルマとして分類されているか、トリコデルマとして現在分類されているどのような細菌系統をも言う。
【００７８】
１の実施態様では、糸状菌親細胞は、Aspergillus niger、 Aspergillus awamori、Aspergillus aculeatus、 Aspergillus nidulans 細胞である。
【００７９】
他の実施態様では、糸状菌親細胞は、Trichoderma reesei細胞である。
【００８０】
III．セルラーゼ
セルラーゼは、当該技術分野において、セルロース（ベータ-1,4グルカン又はベータD-グルコシド結合）を加水分解し、グルコース、セロビオース、セロビオオリゴサッカライド及び同種のものを生産する酵素として知られている。上記のように、セルラーゼは伝統的に3つの主クラスに分類される：エンドグルカナーゼ（EC3.2.1.4）（“EG”）、エキソグルカナーゼ又はセロビオハイドラーゼ（EC3.2.1.91）（“CBH”）及びベータグルコシダーゼ（EC3.2.1.21）（“BG”）（Knowlesら、 TIBTECH 5,255-261, 1987; Schulen, 1988）である。
【００８１】
ある特定の細菌は、エキソセロビオハイドラーゼ又はCBH型セルラーゼ及びベータグルコシダーゼ又はBG型セルラーゼを含む複合的なセルラーゼシステムを生産する（Schulein, 1988）。しかしながら、ときどきこれらのシステムは、CBH型セルラーゼを含むが、或るときにはこれらのシステムはCBHタイプセルラーゼを欠き、一般にほとんどまたは全くCBHタイプセルラーゼを含まない細菌性セルラーゼを含む場合がある。加えて、EG成分及びCBH成分は、セルロースをより効果的に分解するために相乗的に相互作用をすることが示されている。例えば、Wood, （1985）を参照のこと。この異なった成分、すなわち、複合成分又は完全なセルラーゼシステムの中のさまざまなエンドグルカナーゼ及びエキソセロビオハイドラーゼは、等電点、分子量、グリコシル化度、基質特異性及び酵素活性パターンなどにおいて、一般的に異なる性質を有する。
【００８２】
エンドグルカナーゼ型セルラーゼは、セルロースの結晶化度の低い部分の内部ベータ-1,4グルコシド結合を加水分解し、エキソセロビオハイドラーゼ型セルラーゼは、セルロースの還元又は非還元末端からセロビオースを加水分解する。それは、エンドグルカナーゼ成分の作用はエキソエロビオハイドラーゼ成分によると認められる新しい鎖端を作ることによるエキソセロビオハイドラーゼの作用を大いに促進することができるということになる。さらに、ベータグルコシダーゼタイプのセルラーゼは、セロビオースのような糖質残基を含むグルコシドだけでなく、メチル-β-Dグルコシド及びp-ニトロフェニルグルコシドのようなアルキル及び/又はアリールβ-D-グルコシダーゼの加水分解に触媒作用をすることが示されている。このことは、微生物のための唯一の生産物として、グルコースを生産し、セロビオハイドラーゼ及びエンドグルカナーゼを抑制するセロビオースを減らすか又は排除する。
【００８３】
セルラーゼは、洗浄能力を高めるために、柔軟成分として、及び綿布製品の風合いを改善するために、洗剤組成物中に多くの使用例が見られる（Hemmpel, ITB Dyeing/Printing/Finishing 3: 5-14,1991 ; Tyndall, Textile Chemist and Colorist 24: 23-26, 1992 ; Kumar ら、 Textile Chemist and Colorist, 29: 37-42,1997）。一方その作用機能は、本発明の一部ではないが、セルラーゼの柔軟性及び色の回復特性はセルラーゼ組成物中のアルカリ性エンドグルカナーゼ成分に起因するものである。実証例として、U. S. Patent Nos. 5,648, 263,5, 691,178, 及び 5,776, 757がある。これらは、特定のアルカリ性エンドグルカナーゼ成分が豊富なセルラーゼ組成物を含んでいる洗剤成分は、アルカリ性エンドグルカナーゼ成分が豊富でないセルラーゼ組成物と比較すると、処理した衣類に対して色の回復及び柔軟性の改善を与えることができる。更に、そのようなアルカリ性エンドグルカナーゼ成分を洗剤成分へ用いることは、洗剤組成物のpH要件を補完していることを示している。（すなわち、U. S. Patent Nos. 5,648, 263,5, 691,178, 及び 5,776, 757に開示されているように、7.5から10のアルカリ性のpHにおいて最大活性を示すことによる）
セルラーゼ組成物は、綿を含む布製品を分解し、最終的にこの布製品において強度が低くなることが示唆され（U. S. Patent No. 4,822, 516）、セルラーゼ組成物を市販の洗剤成分に使用することをためらう原因となっている。エンドヌクレアーゼ成分から成っているセルラーゼ組成物は、完全なセルラーゼシステムから成っている組成物に比べて綿を含んだ布に対して低い強度損失を示すことが示唆されている。
【００８４】
セルラーゼは、セルラーゼバイオマスをエタノールに分解すること（ここにおいて、セルラーゼがセルラースをグルコースに分解し、酵母又は他の微生物がさらにグルコースをエタノールに発酵させる）において、機械パルプ(Pere ら、 1996)の処理、飼料添加物(WO 91/04673)としての使用のために、そして粒子湿式粉砕において有益であることが明らかにされている。
【００８５】
大部分のCBHs及びEGsは、リンカーペプタイド（Suurnakki ら、 2000）による、セルロース結合ドメイン（CBD）から分離されたコアドメインを含む多重ドメイン構造を有する。コアドメインは、酵素がセルロースに結合することによりセルロースとCBDの相互作用が起きる活性部位を含んでいる。（van Tilbeurgh et aL., 1986 ; Tomme et al., Eur. J. Biochem. 170: 575-581,1988）このCBDsは、結晶セルロースの加水分解に重量である。セロビオハイドラーゼが結晶セルラースを加水分解する能力は、CBDが存在しないときには明らかに減少することが示されている。（Linder and Teeri, J.Biotechnol. 57: 15-28, 1997）しかしながら、CBDsの確かな役割及び作用機能はいまだ憶測の範疇にある。CBDは、セルロース表面での有効な酵素の濃度を増加することにより（Stahlberget al., Bio/Technol. 9: 286-290,1991）、及び/又はセルロース表面から、１本鎖セルロースを分離することにより（Tormo et al., EMBO J. vol. 15, no. 21, pp. 5739-5751, 1996）、酵素活性を高めるということが示唆されてきた。異なる基質上におけるセルラーゼドメインの効果に関する研究の多くは、コアプロテインがパパインを用いた有効なタンパク質分解により生産することができたので（Tommeet al., 1988）、セロビオハイドラーゼのコアプロテインを用いて実施することができた。数多くのセルラーゼは特定の文献に開示されており、(その例は以下のものに含まれる)：Trichoderma reeseiの例：Shoemaker, S.et al., Bio/Technology, 1: 691-696,1983, この文献は CBHIを開示する ; Teeri, T. et al., Gene, 51: 43-52,1987, この文献はCBHIIを開示する。 Trichoderma以外の主由来のセルラーゼも説明されている、例えば、Ooi et al., Nucleic Acids Research, vol. 18, no. 19,1990, この文献は、Aspergillus aculeatus由来のエンドグルカナーゼ F1-CMCのシークエンスをコードしている cDNAを開示している ;Kawaguchi Tet al., Gene 173 (2): 287-8,1996, この文献はAspergillus aculeatus由来のベータグルコシダーゼ 1 をエンコードしている cDNAのクローニング及び配列決定を開示している; Sakamotoet al., Curr. Genet. 27: 435-439, 1995, この文献はAspergillus kawachii IFO 4308由来のエンドグルカナーゼCMCase-1 をエンコードしている cDNA の塩基配列を開示している;Saarilahti et al., Gene 90: 9-14,1990, この文献はErwinia carotovara由来のエンドグルカナーゼを開示している;Spilliaert R, et al., Eur J Biochem. 224 (3): 923-30, 1994この文献は Rhodothermus marinu由来の熱耐性ベータグルカナーゼをコードしているbglAのクローニング及び配列決定を開示している;Haildorsdottir et al., Appl Microbiol Biotechnol. 49 (3): 277-84,1998, これはグリコシルハイドラーゼ ファミリー 12の熱耐性セルラーゼをエンコードしているRhodothermus marinus 遺伝子のクローニング、配列決定及び過剰発現を開示している。熱ストレス条件下又は界面活性剤の存在中での性能の改善、高められた特異的活性、基質開裂パターンを変更すること、及び/又はvitorにおける高レベルでの発現のような改善された性質を有する新規セルラーゼを確立し、特徴づけることが求められている。
【００８６】
さまざまな量のCBH型、EG型及びBG型セルラーゼからなる新しく改良されたセルラーゼ組成物生物は：（１）高められた洗浄能力（柔軟成分として機能し、及び/又は綿布の風合いを改善する）を示す洗剤組成物中への使用（例えば、“ストーンウォッシュ”又は“生物研磨”）；（２）低品質な木製パルプ又は他のバイオマスから糖を生産する組成物中への使用（例えば、バイオエタノール生産）及び/又は（３）食品組成物へ使用することにより重要な意味を持つ。
【００８７】
IV.分子生物学
1つの実施態様において、本発明は糸状菌の中で機能的するプロモータのコントロール下で変異体のCBH）遺伝子の発現を提供するものである。これらについて本発明は、組み換え遺伝子の分野の定型技術を用いている。本発明に用いる一般的方法が開示されている基本テキストには、Sambrook etal., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989);Kriegler, Gene Transfer and Expression : A Laboratory Manual (1990); 及びAusubel etal., eds. , Current Protocols in Molecular Biology(1994)がある。
【００８８】
A. 相同BCH1遺伝子の確立方法
野生型H.ジェコリーナ（H. jecorina）の核酸配列を図1に示す。本発明は、1の側面において、ここで述べるCBH1相同体をエンコードしている核酸分子を含む。この核酸はDNA分子である。
【００８９】
CBH1をエンコードしているDNA配列を単離するために用いる方法は、相同なDNAプローブを用いたcDNA及び/又はゲノムライブラリーのスクリーニング及びCBH1に対する活性測定又は抗体を用いた発現のスクリーニングを含め、この技術分野においてよく知られているが、これらに限られない。これらの方法のいくつかは、Sambrook, et al. or in CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, F. Ausubel, et al., ed. Greene Publishing and Wiley- Interscience, New York (1987) ("Ausubel")に記載されている。
【００９０】
B. CBH I核酸を変異させる方法
突然変異を導入することができる本技術分野で知られているどのような方法でも本発明にいて意図されたものである。
【００９１】
本発明は変異体CBHIの発現、精製及び/又は使用に関連する。これらの酵素はH.ジェコリーナ（H. jecorina）由来のcbhを用い遺伝子組み換え法により調製される。
【００９２】
H.ジェコリーナ（H. jecorina）由来cbh1の単離及びクローニングの後、本分野で知られている特定部位の突然変異誘発のような、いくつかの他の方法は、CBHI発現変異体の中の置換したアミノ酸に相当する部分の転換、付加又は欠損をさせるために用いられる。さらに、特定部位の突然変異誘発及びDNAレベルでタンパク質発現を変更するアミノ酸の取り込むような他の方法はSambrook, et al. 及び Ausubel, et alの文献に記載されている。
【００９３】
H.ジェコリーナ（H. jecorina）CBHIの変異体のアミノ酸配列をエンコードしているDNAは本分野で知られている様々な方法により調製される。これらの方法は、H.ジェコリーナ（H. jecorina）CBHIをエンコードしている初期に調製されたDNAの特定部位（又はオリゴヌクレオチド伝達）突然変異誘発、PCR突然変異誘発及びカセット突然変異誘発を含むがこれらに限定されない。
【００９４】
特定部位突然変異誘発は、置換変異体を調製するのに好ましい方法である。この技術は本分野でよく知られている。（例えば、Carter et al. Nucleic Acids Res. 13: 4431- 4443 (1985) 及びKunkel et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1987)参照のこと。 ）単に、DNAの特定部位の突然変異誘発を実行することにおいて、出発DNAは、最初にそのような出発DNAの1本鎖へと改変するように意図された突然変異をエンコードしているオリゴヌクレオチドを交雑することによって変更される。ハイブリダイゼーションの後、DNAポリメラーゼは、プライマーとして交雑オリゴヌクレオチドを用いて、出発DNAの１本鎖を鋳型として、完全な二本鎖を合成するのに用いられる。したがって、意図する変異をエンコードしたオリゴヌクレオチドはこの2本鎖DNAに取り込まれる。
【００９５】
PCR変異誘発は出発ポリペプチドのアミノ酸配列変異体すなわちH.ジェコリーナ（H. jecorina）CBHIを作るのにも適している。Higuchi, in PCR Protocols, pp. 177-183 (Academic Press, 1990); 及び Vallette et al., Nuc. Acids Res. 17: 723-733 (1989)参照のこと。Cadwell et al., PCR Methods and Applications, Vol 2,28-33 (1992)も例として参照のこと。単に、少量のDNAが開始物としてPCRに用いられるとき、鋳型DNAの対応する領域からのシークエンスにおいてわずかしか異ならないプライマーは、相対的に大量の特定のDNA断片を作成するために用いられる。この特定のDNA断片は、プライマーがDNA断片から異なる部位のみ、鋳型DNAとは異なったものとなっている。
【００９６】
変異体を調製するたの方法、カセット突然変異誘発は、Wells et al., Gene 34: 315-323 (1985)の技術に基づいている。この出発物質は、変異させようとする出発ポリペプチドDNAを含むプラスミド（又は他のベクター）である。変異させようとする出発DNA中のコドンは確認されている。特異な制限エンドヌクレアーゼサイトが認識された突然変異サイト各側の上になければならない。もし、そのような制限サイトがなければ、そのようなサイトは、出発ポリペプタイド中の適切な位置に前記サイトを挿入するために、上記オリゴヌクレオチドを介した方法を用いて生産される。プラスミドDNAは直線にするために、それらのサイトで切断される。制限サイト間のDNA配列をエンコードしているけれども意図する変異を含まないオリゴヌクレオチドの二本鎖は、離れて合成され、通常の技術を用いて一緒に交雑されるという一般的な方法を用いて合成される。この２本鎖オリゴヌクレオチドは、カセットといわれる。このカセットは、直接的にこのプラスミドと結合することができるような、直線になったプラスミドの末端と互換性のある5’末端及び3’末端を有するように作られている。このプラスミドは今や変異DNAを含む。
【００９７】
もう一つの方法として、又は加えて、変異体CBHIをエンコードしている意図されたアミノ酸配列が決定されることができ、そのようなアミノ変異をエンコードしているアミノ酸配列は合成的に生産することができる。
【００９８】
そのようにして調製された変異体CBHIは、たいていの場合セルラーゼの目的とする使用に応じて、さらに変更がなされる。そのような変更は、アミノ酸配列の更なる変更、非相同ポリペプチドへの融合、及び/又は共有結合修飾を含む。
【００９９】
V. cbh1核酸及びCBH1ポリペプチド
A. 変異体cbh型核酸
野生型H.ジェコリーナ（H. jecorina）の核酸配列を図1に示す。本発明はここで述べる変異体セルラーゼをエンコードする核酸分子を包含する。この核酸は、DNA分子である。
【０１００】
CBHIの単離及びクローニングの後、特定部位の突然変異誘発などのこの分野で知られている他の方法は、発現したCBHI変異体中の置換されたアミノ酸に対応する転換、付加、又は欠損を作るために用いられる。さらに、特定部位の突然変異誘発及びDNAレベルでタンパク質発現を変更するアミノ酸を取り込むような他の方法はSambrook, et al. 及び Ausubel, et al.の文献に記載されている。
【０１０１】
変異CBHIをエンコードしてるDNA配列がDNA構造の中へクローン化された後、このDNAは微生物の形質転換に用いられる。本発明に関する変異CBHIの発現の目的とするこの微生物には、Trichoderma sp.由来の種を含めることが好ましいであろう。実際、本発明に関する変異CBHIセルラーゼの調製のための好ましいモデルは、すくなくとも変異BCHIの一部又は全てをエンコードしているDNA断片からなるDNA構造を有する形質転換されたTrichoderma sp.宿主細胞である。このDNA構造は一般的にはプロモーターに機能的に付加される。この形質転換させた宿主細胞は意図したタンパク質を発現するような条件下で成長させられる。その後、目的のタンパク質生成物は実質的に均質に精製させる。
【０１０２】
しかしながら、変異CBHIをエンコードする与えられたDNAを最もよく発現する媒介はH.ジェコリーナ（H. jecorina）とは違うものであるということは事実であるようだ。従って、変異体CBH1のために根源生物と、系統発生的な類似性を持つ形質転換宿主の中で、タンパク質を発現することはとても有利になるであろう。別の実施態様において、Aspergillus nigerが発現媒体として用いられた。A.nigerを用いた形質転換技術についてはWO 98/31821参照のこと。この記載は参照により本発明に組み込まれる。
【０１０３】
従って、Trichoderma sp.発現システムは、説明に役立つという目的だけのために、そして本発明の変異体CBH1を表現するための1つのオプションとして提供される。当業者においては、しかしながら、変異体CBH1の根源は、最適な表現宿主を決定することにおいて考慮されるべきであるということが適切であると考えうるならば、変異CBHIをエンコードしているDNA発現を含むだろう。さらに、当業者は、入手可能なツールを利用しているルーチン的な手法を通して特定の遺伝子のために最もよい表現システムを選ぶことが可能になるであろう。
【０１０４】
B. 変異CBHIポリペプチド
野生型H.ジェコリーナ（H. jecorina）のアミノ酸配列を図1に示す。変異CBHIポリペプタイドは、H.ジェコリーナ（H. jecorina）由来CBHIのS8,Q17, G22, T41, N49, S57, N64, A68, A77, N89, S92,N103, A112, S113, E193, S196, M213, L225, T226, P227, T246, D249, R251, Y252, T255, D257, D259, S278, S279, K286, L288, E295, T296, S297, A299, N301, E325, T332, F338, S342, F352, T356,Y371, T380,Y381, V393, R394, S398, V403,S411, G430, G440, T445, T462, T484, Q487, 及びP491 残基の1以上の対応する部位の置換又は欠損からなる。さらに、この変異体は、H.ジェコリーナ（H. jecorina）由来CBHIの残査382-393に対応する残査が欠損を含む。
【０１０５】
本発明の変異CBHI’sはCBHI前駆体のアミノ酸配列由来のアミノ酸配列を有する。この変異CBHIのアミノ酸配列は、この前駆体アミノ酸配列の1以上のアミノ酸の置換、欠損、又は挿入によって、前駆体アミノ酸配列とは異なっている。 好ましい実施態様においては、前駆体CBHIはハイポクレアジェコリーナCBHI（Hypocrea jecorina CBHI）である。 H.ジェコリーナCBHI（H. jecorina CBHI）の成熟アミノ酸配列を図1に示す。 従って、本発明はH.ジェコリーナCBHI（H. jecorina CBHI ）中に明らかに見られる残査と同じ位置にアミノ酸残査を含むCBHI変異体に関するものである。CBHI相同体の残査（アミノ酸）は、もしそれが、相同であるか（すなわち、全体の1次又は3次構造の位置について対応が見られる）、または特定の残基又はハイポクレアジェコリーナCBHI（Hypocrea jecorina CBHI）中の残基の一部と機能的に類似している（すなわち、化学的又は構造的に結合、同じか似通った反応又は相互作用する機能的能力を有すること）ならば、ハイポクレアジェコリーナCBHI（Hypocrea jecorinaCBHI）の残査と等しいことになる。ここで用いるように、番号を付すことは、図1に示すように成熟CBHIアミノ酸配列のものに対応させることを意図している。CBHI前駆体内の位置に加えて、前駆体CBHI中の前駆体CBHIが熱ストレス下に置かれたときの不安程度に関係するアミノ酸の位置に対応している特定残基は、ここでは置換又は欠損として確認されている。このアミノ酸の位置番号（例えば+51）は、図1に示した成熟ハイポクレアジェコリーナCBHI（Hypocrea jecorinaCBHI）の配列に割り当てられた番号を言う。
【０１０６】
本発明の変異CBHI’sはCBHI前駆体のアミノ酸配列由来のアミノ酸配列を有する。この変異CBHIのアミノ酸配列は、この前駆体アミノ酸配列の1以上のアミノ酸の置換、欠損、又は挿入によって、前駆体アミノ酸配列とは異なっている。H.ジェコリーナCBHI（H. jecorina CBHI）の成熟アミノ酸配列を図1に示す。従って、本発明はH.ジェコリーナCBHI（H. jecorina CBHI ）中に明らかに見られる残査と同じ位置にアミノ酸残査を含むCBHI変異体に関するものである。CBHI相同体の残査（アミノ酸）は、もしそれが、相同であるか（すなわち、全体の1次又は3次構造の位置について対応が見られる）、または特定の残基又はハイポクレアジェコリーナCBHI（Hypocrea jecorina CBHI）中の残基の一部と機能的に類似している（すなわち、化学的又は構造的に結合、同じか似通った反応又は相互作用する機能的能力を有すること）ならば、ハイポクレアジェコリーナCBHI（Hypocrea jecorinaCBHI）の残査と等しいことになる。ここで用いるように、番号を付すことは、図1に示すように成熟CBHIアミノ酸配列のものに対応させることを意図している。CBHI前駆体内の位置に加えて、前駆体CBHI中の前駆体CBHIが熱ストレス下に置かれたときの不安程度に関係するアミノ酸の位置に対応している特定残基は、ここでは置換又は欠損として確認されている。このアミノ酸の位置番号（例えば+51）は、図1に示した成熟ハイポクレアジェコリーナCBHI（Hypocrea jecorinaCBHI）の配列に割り当てられた番号を言う。
【０１０７】
相同性を同定するためのアミノ酸配列の位置合わせは、好ましくは「配列比較アルゴリズム」を用いることで同定することができる。比較のための配列の最適な位置合わせは、例えばSmith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)の局所的相同性アルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)の相同性整列アルゴリズム、Pearson & Lipman, Proc. Nat'lAcad. Sci. USA 85: 2444 (1988)の類似性の調査法、それらアルゴリズムのコンピューターによる実施(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)、目視検査又はカナダのケミカルコンピュータグループMontreal によるMOE によって実施することができる。
【０１０８】
配列類似性を特定するのに適切であるアルゴリズムの１ つの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３−４１０ （１９９０）に記載のＢＬＡＳＴ アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ 解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターから公的に利用できる。(<www.ncbi.nim.nih.gov>)そのアルゴリズムは、データベース中の長さＷ のワードと共に並べた場合にポジティブ評価の閾値Ｔ に適合し、または充足させる照会配列中の長さＷ の短いワードを同定することによって、高得点配列対（ｈｉｇｈ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐａｉｒｓ（ＨＳＰｓ）） をまず同定することを含む。 それら最初の隣接ワードのヒットは、それらを含む長いＨＳＰｓ を見出すための開始点として働く。累積整列得点（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｃｏｒｅ） ができるだけ増えるように、比較する２つの配列のそれぞれに沿って両方向にワードヒットを展開する。ワードヒットの延長は：累積整列得点が最大達成値より定めた定数Ｘ から遠ざかる；累積得点がゼロまたはそれ以下に下がる；または何れかの配列の末端に達する：場合に止まる。ＢＬＡＳＴ アルゴリズムパラメーターＷ 、Ｔ 、およびＸ は、整列の感度および速さを特定する。ＢＬＡＳＴ プログラムは、初期設定として、ワード長（Ｗ） が１１ 、ＢＬＯＳＵＭ６２ スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｇ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： １０９１５ （１９８９）） 整列（Ｂ） が５０ 、期待値（Ｅ） が１０ 、Ｍ’５ 、Ｎ’−４ 、および両鎖の比較を用いる。
【０１０９】
さらに、ＢＬＡＳＴ アルゴリズムは、２ つの配列間の類似性の統計解析を実施する（例えばＫａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ５８７３−５７８７ （１９９３） を参照）。ＢＬＡＳＴ アルゴリズムによってもたらされる類似性の１ つの指標は、２ つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の指標を提供する最小総確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ） （Ｐ（Ｎ） ）である。例えば、評価核酸とセルラーゼ核酸との比較における最小総確率が、約０．１ より小さく、より好ましくは約０．０１ より小さく、さらに最も好ましくは約０．００１ よりも小さい場合に、最も好ましくは0.001よりも小さい場合に、ある核酸が本発明のセルラーゼ核酸に類似するとみなされる。
【０１１０】
CBH1セルラーゼの安定性を修正するための追加の特定方法は下に提供される。
【０１１１】
（1）主鎖伸張（unfolding）のエントロピーを低くすることは酵素に安定性をもたらす。例えば、プロリン残基の導入は伸張（unfolding）のエントロピーを低くすることによってタンパク質を安定にする。（Watanabe, et al., Eur. J. Biochem. 226: 277-283 (1994)参照のこと。）同様に、グリシン残基はβ-炭素を有しておらず、それから、かなり、多くの他の残基より大きな中心立体配座の自由を持っている。好ましくはアラニンとのグリシンの置き換えは、伸張（unfolding）のエントロピーを減らし、安定性を改善する。（Matthews,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84; 6663- 6667(1987)参照のこと。）加えて、外部ループの短縮により、安定性を改善することが可能である。超好熱菌が生産したタンパク質はそれらの中温の相同体より短い外部ループを持っていることが観察されている。（Russel, et al., Current Opinions in Biotechnology 6: 370-374 (1995)参照のこと）ジスルフィド結合の導入は、また、互いに関連して別個の三次構造を安定させるために効果的である。従って、既存のシステインにアクセス可能な残基のシステインの導入またはジスルフィド結合を成形することができるシステインの対の導入はCBH1変異体の安定性を変更するであろう。
【０１１２】
（2）側鎖疎水性を増大させることによって内部腔を減少させることは酵素の安定性を変更する。内部腔の数及び容量を減らすことは疎水相互作用を最大化し、詰込み欠損（packing defects）を減らすことによって酵素の安定性を増やす。(Matthews, Ann. Rev. Biochem. 62: 139-160 (1993); Burley, et al., Science 229: 23-29 (1985); Zuber, Biophys. Chem. 29: 171-179 (1988); Kellis, eta/., Nature 333: 784-786 (1988)参照のこと)高温菌からの多重結合のタンパク質がしばしばそれらの中温の対応するものより大きな表面相補性によってより多くの疎水性のサブ・ユニット・インタフェースを持っていることは知られている。（Russel, et al.上記）この原理は、単遺伝子性のタンパク質の領域インタフェースに適用可能であると信じられている。疎水性を増大させることによって安定性を改善することができる特定の置換はアルギニンへのリジン、アラニンへのセリン、およびアラニンへのトレオニンを含む。（Russel, et al.上記）アラニンまたはプロリンへの置換による変更は、結果としてくぼみを縮小し、内部を充填し、疎水性を増大すると伴に側鎖サイズを増やす。くぼみのサイズを減らし、疎水性を高め、CBH1の領域の間のインタフェースの相補性を改善するための置換は酵素の安定性を改善する。特に、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、およびイソロイシンから選ばれた異なる残基を持つ、これらの位置の特定の残基の変更は性能を改善する。
【０１１３】
（3）剛性2次構造内（すなわち、α-へリックス及びβ-ターン）の電荷を平衡にすることは安定性を改善する。例えば、アスパラギン酸の上の負電荷によってへリックスN-末端の上の部分的な陽電荷を中和することは構造の安定性を改善する。（Eriksson, et al., Science 255: 178-183 (1992)参照のこと）同様に、陽電荷によってへリックスC末端の上の部分的な負電荷を中和することは安定性を改善する。β-ターンにおけるペプチドN末端との相互作用から陽電荷を取り除くことは、三次構造安定性を与えることにおいて効果的であるはずである。非正帯電残基との置換は、好ましくない陽電荷を、ターン内にあるアミド窒素との相互作用から取り除くことができた。
【０１１４】
（4）三次構造を安定させるために塩橋と水素結合を導入することは効果的である。例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸とリジン、アルギニンまたはヒスチジンの間のイオン対相互作用は強い安定効果を導入し、その結果生じる耐熱性の改善を伴う、違う三次構造要素を付加するのに用いられる。さらに、チャージされた残基/チャージされなかった残基水素結合の数と水素結合の数の増加は耐熱性を改善することができる。（Tanner, et al., Biochemistry 35: 2597-2609 (1996)を参照のこと）アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、またはグルタミンの置換はバックボーンアミド(a backbone amide)に水素結合を導入することができる。アルギニンの置換は塩橋を改善し、水素結合をバックボーンカルボニル(a backbone carbonyl)に導入することができる。
【０１１５】
（5）不耐熱性残基を減らすことは、一般的に熱安定性を増す。例えば、アスパラギンとグルタミンはアミド分解に影響され易く、システインは高温で酸化に影響され易い。感受性の高い位置にあるこれらの残基の数を減らすことは結果として耐熱性を改善する。(Russel, etal.上記)グルタミンまたはシステイン以外のどのような残基による置換または欠失でも不耐熱性残基を減らすことによって安定性を増大させることができる。
【０１１６】
与えられたリガンドの結合を安定化又は不安定化することは、CBHI変異体へ安定性を修正する。例えば、この発明のCBH1変異体が使われる基質の成分はCBH1変異体の特定の界面活性物質/熱感受性部位に結合する。置換によりこの部位を修正することによって、この変異体への成分の結合は強化されるか、減少するかもしれない。例えば、CBH1の結合凹部の中の非芳香族残基は、セルロース基質の相互作用が、CBH1変異体の安定性を増大させて、好ましくはベンジル輪と相互作用する芳香族側鎖の安定化を導入するためにフェニルアラニンまたはチロシンによって置換される。
【０１１７】
（７）任意の界面活性物質/熱感受性リガンドの電気陰性度を増大させることは界面活性物質または温熱ストレス下で安定性を改善する。例えば、フェニルアラニンまたはチロシンをの置換は、溶媒から遮へい性を改善することによりD(アスパラギン酸塩)残基の電気陰性度を増大させることができる。
【０１１８】
C.抗-CBH抗体
本発明はさらに抗-CBH抗体を提供する。この抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、または異対抗体である。
【０１１９】
ポリクローナル抗体の調製方法は本技術分野で知られている。免疫を作る因子はCBHポリペプチドまたはその融着タンパク質である。免疫性を与えられた哺乳類の中の免疫原であると知られているタンパク質に抗原を接合させることは有益である。免疫化方法は標準的な方法又は定型的実験に基づいて当業者によって決定される。
【０１２０】
または、この抗-CBH抗体はモノクローナル抗体であるかもしれない。モノクローナル抗体は免疫を与えられた動物の細胞、又は組み換えDNA方法を用いた細胞によって作り出される（Kohler et al., Nature, vol. 256, pp. 495-499, August 7,1975 ; U. S. Patent No. 4,816, 567）参照のこと）。
【０１２１】
本発明の抗-CBH抗体は、さらにヒト化又はヒト抗体からなる。“ヒト化抗体”という語は、キメラ抗体、免疫グロブリンチェーン、または非ヒト抗体由来配列によるタンパク質を含むそれらの断片（Fv、Fab、Fab'、F(ab')2または抗体の他の抗原結合部配列などの非ヒト(例えば、ネズミ)抗体のヒト化されたもの言う。非ヒト抗体をヒト化する方法は本技術分野においてよく知られており、このことに関するさらなる詳細な記載は、Jones et al., Nature 321: 522-525,1986 ; Riechmann etal., Nature, vol. 332, pp. 323-327,1988 ; 及び Verhoeyen et al., Science, vol. 239, pp. 1534-1536,1988にある。ヒト抗体を生産する方法も本技術分野において知られている。例えば、Jakobovits, A, et al., Annals New York Academy of Sciences, 764: 525-535,1995 and Jakobovits, A, Curr Opin Biotechnol 6 (5): 561-6,1995を参照のこと。
【０１２２】
VI. 組み換えCBH1変異体の発現
必要とするCBH I発現の特定の方法を使用しないで変異体のCBH Iを表現するために、本発明に係る方法においては使用細胞に依存している。
【０１２３】
本発明は変異体CBHをエンコードしている核酸配列からなる発現ベクターであって、形質を変換、転換、又は移入された宿主細胞を提供する。温度、pHのような培養条件は形質変換、形質転換又は形質移入していない親宿主細胞に対して用いているものと同じであり、それらは本技術分野でよく知られている。
【０１２４】
1のアプローチにおいて、糸状菌細胞又は酵母細胞は宿主細胞株の中で機能する。つまりこの細胞株の中で発現されるCBHをエンコードするDNAセグメントに結合可能であるプロモーター又は、生物学的活性を有するプロモータ断片又は1以上の（例えば、一続きの）エンハンサーにより形質転換される。
【０１２５】
A. 核酸構成物/発現ベクター
CBHIをエンコードする天然のまたは合成のポリヌクレオチド断片（「CBHIエンコード核酸配列」）は、糸状菌又は酵母菌細胞に導入されることが可能で、複製することができる非相同核酸構成物又はベクターに組み込まれる。ここで開示しているこのベクターと方法は、CBHIを発現する宿主細胞に用いることに適している。それが、導入される細胞の中で複製され、育成できる限り、どのようなベクターでも使用される。数多くの適したベクター及びプロモーターは本技術分野において知られており、商業的に入手可能である。クローニング及び発現ベクターはSambrook et al., 1989, Ausubel FM et al., 1989, and Strathernet al., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1981において開示されており、それらは明示的に参照によってここに組み込まれる。細菌（糸状菌）に対する適切な発現ベクターは、van den Hondel, C. A. M. J.J.et al. (1991) In : Bennett, J. W. and Lasure, L. L.(eds.) More Gene Manipulations in Fungi. Academic Press, pp. 396-428に記載されている。適切なDNAシーケンスは、さまざまな処置によって、プラスミドまたはベクター(「ベクター」としてここに集合的に参照される)に挿入される。一般的に、DNAシーケンスは標準的な操作法によって適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。そのような処置と関連したサブクローニング処置は、当業者の知識の範囲の中にあると考えられる。
【０１２６】
変異体CBH Iのためにコーディング配列から成っている組換型糸状菌は、糸状菌の選ばれた系統の細胞の中に変異体CBH Iコーディング配列から成っている異種の核酸構成物を導入することによって作り出される。
【０１２７】
一旦変異体cbh核酸配列の好ましい形質が得られると、それは様々な方法により変更される。この配列が非コーディングフランキング領域を含む所で、フランキング領域は切除、変異誘発などを受ける。従って、転位、転換、欠失、および挿入が自然に存在する配列上で起こる。
【０１２８】
選ばれた変異体のcbhコーディングシーケンスは、よく知られた組換技術に従って適当なベクターに挿入され、CBH I発現が可能な糸状菌を変換するために使われる。遺伝コード固有の縮退のため、実質的に同じかまたは機能的に同じアミノ酸配列をエンコードする他の核酸配列は、変異体のCBH Iをクローンし、発現するために使われる。従って、コード領域の中のそのような置換が本発明によってカバーされた配列変異体に入ることは高く評価される。いくつかの及び全てのこれらの配列変異体は、親CBH lエンコーディング核酸配列についてここに記述されるのと同じ方法で利用することができる。
【０１２９】
上で説明したように、本発明はまた変異体のCBHI-エンコーディング核酸配列の1以上から成る組換型の核酸構成物を含む。この構成物は本発明の配列へ前に向けて又は逆向きに挿入されているプラスミド又はウイルスのベクターのようなベクターから成る。
【０１３０】
非相同核酸構成物は変異体cbhコード配列を：(i)分離して；(ii) 融合タンパク質又はcbhコード配列が優性形質コード配列である所のシグナルペプチドコード配列のような付加的コード配列との組み合わせで；(iii) 適切な宿主中のコーディング配列の発現のために効果的なプロモーター及びターミネーターエレメント、または5’及び/又は3’の非翻訳領域のような、イントロン及び制御エレメントのような非コード配列との組み合わせで、及び/又は(iv) cbhコーディング配列が非相同遺伝子であるベクターまたは宿主の環境の中に含まれる。
【０１３１】
本発明の1の態様において、非相同核酸構成物は確立された糸状菌及び酵母菌の系統が好む状態で、in vitroにおいて変異体CBHIエンコーディング核酸配列を細胞内へ運搬するのに用いる。長期の変異体CBH Iの生産の間の安定した発現が好まれる。安定した形質転換体を生成する効果的などのような方法でも、本発明を行うことにおいて使われることになる。
【０１３２】
適切なベクターは典型的には、選択可能マーカーをエンコードしている核酸配列、挿入部位及び適した制御エレメント、すなわち、プロモーター及びターミネーター配列を有している。このベクターは、例えば、イントロン及び制御エレメントのような非コード配列を含む調節領域、すなわち、コード配列と操作可能に結合する宿主細胞（及び/又は修正された可溶性のタンパク質抗原コード配列が正常に表現されないベクター又は宿主細胞環境）内でコード配列を発現するのに効果的なプロモーター及びターミネーターエレメント又は、5’及び/又は3’非翻訳領域からなる。数多くの適切なベクター及びプロモーターは本技術分野においてよく知られており、多くは商業的に入手可能である。そして/又は、Sambrook,et al.、(上記)に記載されている。
【０１３３】
典型的なプロモーターは構成性プロモーター及び誘発性プロモーターの両方を含み、その例は、CMVプロモーター、SV40初期プロモーター、RSVプロモーター、EF-1αプロモーター、説明される(ClonTechとBASF)ようにtet-onまたはtet-offシステムの中にtet応答エレメント(TRE)を含んでいるプロモーター、ベータアクチンプロモーター、および特定の金属塩の添加によって上向き調節されるメタロチオニンプロモーターを含む。プロモーター配列は、表現目的に対して特定の糸状菌によって認識されるDNA配列である。それは変異体CBH IポリペプチドをエンコードしているDNA配列と操作可能に結び付く。そのような結合は、開示された発現ベクターの中で変異体CBH IポリペプチドをエンコードしているDNAシーケンスの開始コドンに対するプロモーターの位置合わせから成っている。このプロモーター配列は、変異体CBH Iポリペプチドの表現を伝達する転写と翻訳制御シーケンスを含んでいる。このプロモーターの例として、アスペルギウス ニガー（Aspergillus niger）A.アワモリ（A awamori）又は A.オリゼア（A. oryzae）由来の グルコアミラーゼ, アルファ-アミラーゼ, 又は アルファ-グルコシダーゼ をエンコードしている遺伝子；A.ニドゥランス（A.nidulans）のgpdA 又はtrpC 遺伝子；ニューロスポラ クラッサ（Neurospora crassa）のcbh1 又はtrp1 遺伝子；A. ニガー（A.niger） 又は リゾムコア ミエヘイ（Rhizomucor miehei）のアスパラギン酸 プロテイナーゼ エンコード遺伝子；H. ジェコリーナ（H. jecorina）（T.レーシ(T. reesei)）のcbh1, cbh2,egl1, egl2, 又は他のセルラーゼをエンコードしている遺伝子を含む。
【０１３４】
適切な選択マーカーの選択は宿主細胞に依存し、異なる宿主に対する適切なマーカーは本技術分野においてよく知られている。典型的な選択マーカーの遺伝子は、A.ニドゥランス（A.nidulans）又は T.レーシ(T. reesei)由来のargB A.ニドゥランス（A. nidulans）由来のamdS、ニューロスポラ クラッサ（Neurospora crassa）あるいはT.レーシ(T. reesei)由来のpyr4、 アスペルギウス ニガー（Aspergillus niger）又は A.ニドゥランス（A.nidulans）由来のpyrGを含む。さらに典型的な選択マーカーは、非相同核酸構成物の中でtrp-、pyr-、leu-および同類のものなどの突然変異系統の変換に使われた非相同核酸構成物に含まれているtrpc、trp1、oliC31、 niaD 又は leu2を含むけれどそれらに限定されない。
【０１３５】
そのような選択マーカーは、糸状菌によって通常新陳代謝させられない代謝産物を利用する能力を転換体に与える。例えば、アセトアミダーゼ酵素をエンコードしているH. ジェコリーナ（H. jecorina）由来のamdS遺伝子は転換体細胞が窒素源としてアセトアミドを利用することを可能にする。この選択マーカー(例えば、pyrG)は、選択最小培地の上で成長する栄養要求変異体系統の能力を復元し、あるいは、選択マーカー(例えば olic31)は、抑制薬または抗生物質があると成長する能力を転換体に与えるかもしれない。
【０１３６】
配列をコードしている選択マーカーは、本分野で一般的に用いられている方法を用いて任意の適切なプラスミド内へクローンされる。典型的なプラスミドはpUC18、pBR322、pRAX 及びpUC100を含む。このpRAX プラスミドはA. ニガー（A.niger）内でも複製することができるA.ニドゥランス（A.nidulans）由来の AMA1 配列を含んでいる。
【０１３７】
本発明の実行に関しては、違った形で示されない限り、分子生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の分野において知られている従来の技術を使用する。そのような技術は文献において十分に説明される。例えば Sambrook et al., 1989; Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Ausubel, et al., 1993; and Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991を参照のこと。
【０１３８】
B. CBH1生産のための宿主細胞と培養条件
(i)糸状菌
本発明は、結果的に対応する形質変換されていない親真菌との関連において、CBH1変異体の生産又は発現に効果的な方法で変換され、選択され、培養される細胞からなる糸状菌を提供する。
【０１３９】
変異体CBH1に発現をさせ及び/又は変換させる親糸状菌種の例は、トリコデルマ（Trichoderma）を含むがそれらに限られない。例えば、トリコデル マレーシ（Trichoderma reesei）、トリコデルマ ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ ビリデ（Trichoderma viride）、トリコデルマ コニンギ（Trichoderma koningii）；ペニシリウム種（Penicillium sp.）、フミコーラ インソレンス（Humicola insolens）を含むフミコーラ種（Humicola sp.）、アスペルギウス種（Aspergillus sp.）、クリソスポリウム属（Chrysosporium sp.）、フサリウム属（ Fusarium sp. ）ハイポクレア属（Hypocrea sp.）及び エメリセラ属（Emericella sp.）である。
【０１４０】
CBHIを発現している細胞は、通常、親糸状菌の培養に用いる条件のもとで培養される。一般的に細胞はPourquie, J. et al., Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, eds. Aubert, J. P. et al., Academic Press, pp. 71- 86, 1988 and Omen, M. et al., Appl. Environ. Microbiol. 63: 1298-1306,1997において開示されているような生理的塩と栄養素を含む標準培地内で培養される。培養条件もまたほぼ決まっており、培養はCBH I表現が要求されるレベルが達成するまで、振盪培養機または発酵槽内において28℃で培養される。
【０１４１】
与えられた糸状菌のための好ましい培養条件は科学文献において、および／または米国菌培養収集所(ATCC；「http://www. atcc.org/」)などの真菌についての情報源に見出される。細菌の発育が確立された後に、細胞は、変異体のCBH1の表現を引き起こし又は可能にするのに効果的な条件下に置かれる。
【０１４２】
CBH Iコード配列が誘導性のプロモーターの制御下にある場合、誘発因子、例えば、糖、金属塩または抗生物質は、CBH I表現を引き起こすために効果的な濃縮で培地に添加される。
【０１４３】
1の実施態様においては、この系統はタンパク質の過剰発現に有用であるアスペルギルス ニガーから成る。例えば、A.ニガー（A.niger）の1種であるアワモリ（awamori） dgr246は、多量の分泌性セルラーゼを分泌することが知られている。GCDAP3、 GCDAP4 およびGAP3-4のような A.ニガー（A.niger）の1種であるアワモリ（awamori）の他の系統は、known Ward et al (Ward, M, Wilson, L. J. and Kodama, K. H., 1993, Appl. Microbiol. Biotechnol. 39: 738-743)で知られている。
【０１４４】
他の実施態様においては、この系統はタンパク質の過剰発現に有用であるトリコデルマ レーシ（Trichoderma reesei）からなる。例えば、Sheir- Neiss, et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 20: 46-53 (1984)に記載のRL-P37は多量のセルラーゼ酵素を分泌することが知られている。RL-P37と機能的に同等な種はトリコデルマ レーシ（Trichoderma reesei）系統RUT-C30(ATCC No.56765)及びQM9414(ATCC No.26921)を含む。これらの系統もまた、変異体のCBH1を過剰発現することについて有用であるということが予測それる。
【０１４５】
潜在的に有害なネイティブセルロース分解活性を欠いた変異体CBH Iを得ることが要求される場合、変異体CBH IをエンコードしているDNA断片を含むDNA構成物又はプラスミドの導入に先駆けて1つ以上のセルラーゼ遺伝子を削除させたトリコデルマ宿主細胞を得ることは有用である。そのような系統は、U. S. Patent No. 5,246, 853 及び WO 92/06209に開示されている方法により調製される。これらの内容は引用によりここに組み込まれる。1以上のセルラーゼ遺伝子を欠いている宿主微生物の中で変異体CBH Iセルラーゼを発現することによって、識別とその後の精製処置は簡素化することができる。クローン技術で生産されたトリコデルマ種からのどのような遺伝子、例えば、cbh1、cbh2、egl1、及びegl2 遺伝子だけでなく、 それらをエンコードしているEGIII 及び/又は EGV タンパク質 (U. S. Patent No. 5,475,101 及びWO 94/28117をそれぞれ参照のこと)でも欠失させることができる。
【０１４６】
遺伝子欠失は、欠失又は崩壊させるために要求される遺伝子の形を本技術分野で知られている方法によりプラスミドに挿入することによって行われる。この欠失プラスミドは、適切な制限酵素サイト、即ち要求される遺伝子コード領域の内部で切断され、遺伝子コーディングシーケンスまたはその部分は選択マーカーと取り替えられる。欠失又は崩壊される遺伝子の位置からのフランキングDNA配列は、好ましくは約0.5から2.0 kbであり、選択マーカー遺伝子のどちらかの側にある。適切な欠失プラスミドは、欠失された遺伝子を含み、フランキングDNAシーケンスを含む断片と、選択可能なマーカー遺伝子を1つの線形の断片として取り除かれることを可能にするために、その中に存在するユニークな制限酵素サイトを持つ。
【０１４７】
選択マーカーは、形質転換された微生物の検出を可能にするように選ばれなければならない。選ばれた微生物の中で発現するどのような選択マーカー遺伝子でも適切である。例えば、アスペルギウス種（Aspergillus sp.）用いるときには、選択マーカーは転換体の中の選択マーカーの存在がその特性に有意に影響しないように選ばれる。そのような選択マーカーは、分析可能な生産物をエンコードする遺伝子である。例えば、アスペルギルス種（Aspergillus sp.）遺伝子の機能的なコピーは宿主系統の中の欠失がその栄養素要求株の表現型を結果として生じているならば使われうる。同様に、選択マーカーはトリコデルマ種についても存在している。
【０１４８】
１の実施態様においては、アスペルギルス種（Aspergillus sp.）のpyrG-誘導株は実際に、それは転換のために選択マーカーを提供する機能的なpyrG-遺伝子によって変換される。pyrG-誘導株はフルオロオロチン酸(FOA)に抵抗力があるアスペルギルス種（Aspergillus sp.）系統の選択によって得られる。このpyrG遺伝子はウリジンの生合成のために必要とされている酵素であるオロチジン-5'-モノリン酸デカルボキシラーゼをエンコードしている。インタクトpyrG遺伝子の株はウリジンを欠く培地中で成長するけれども、フルオロオロチン酸に敏感である。FOA耐性の選択により、機能的なオロチジンモノリン酸塩脱炭酸酵素を欠き、成長のためにウリジンを必要としているpyrG誘導株を選ぶことは可能である。このFOA選択を用いて、機能的なオロチンピロフォスフォリボシル（ortate pyrophosphoribosyl）転移酵素を欠くウリジン要求株を得ることも可能である。この酵素をエンコードしている遺伝子の機能的なコピーによってこれらの細胞を形質変換することは可能である（Berges & Barreau, Curr. Genet. 19: 359-365 (1991), 及び van Hartingsveldte et al., (1986) Development of a homologous transformation system for Aspergillus niger based on the pyrG gene. Mol. Gen. Genet. 206: 71-75）。誘導株の選択は、上で述べたFOA耐性技術を用いて容易に行うことができ、実際、tpyrG遺伝子を選択マーカーとして用いることが好ましい。
【０１４９】
第二の実施態様においては、ハイポクレア属(Hyprocrea sp. (Trichoderma sp.))の pyr4-誘導株は、実際に、転換のために選択マーカーを提供する機能的なpyr4 遺伝子を用いて形質転換される。pyr4-誘導株はフルオロオロチン酸(FOA)に抵抗力があるハイポクレア属（Hyprocrea sp.） (Trichoderma sp.)株の選択によって得られる。このpyr4-遺伝子はウリジンの生合成のために必要とされている酵素であるオロチジン-5'-モノリン酸デカルボキシラーゼをエンコードしている。インタクトpyr4-遺伝子の株はウリジンを欠く培地中で成長するけれども、フルオロオロチン酸に敏感である。FOA耐性の選択により、機能的なオロチジンモノリン酸塩脱炭酸酵素を欠き、成長のためにウリジンを必要としているpyr4-誘導株を選ぶことは可能である。このFOA選択を用いて、機能的なオロチンピロフォスフォリボシル（ortate pyrophosphoribosyl）転移酵素を欠くウリジン要求株を得ることも可能である。この酵素をエンコードしている遺伝子の機能的なコピーによってこれらの細胞を形質変換することは可能である。（Berges & Barreau, Curr. Genet. 19: 359-365 (1991)） 誘導株の選択は、上で述べたFOA耐性技術を用いて容易に行うことができ、実際、pyr4-遺伝子を選択マーカーとして用いることが好ましい。
【０１５０】
アスペルギルス種（Aspergillus sp.）のpyrG又はハイポクレア属（Hyprocrea sp. (Trichoderma sp.)）のpyr4の 1以上のセルラーゼ遺伝子を発現する能力を欠くように形質転換するために、崩壊されたか、欠失されたセルラーゼ遺伝子から成る1つのDNA断片は欠失プラスミドから単離され、形質転換のためにpyr- アスペルギウス（Aspergillus） 又は pyr-トリコデルマ（Trichoderma） 宿主に用いられる。形質転換体は、pyrGまたはpyr4のそれぞれの遺伝子産物を表現するそれらの能力に基づいて、識別され、選ばれる。従って形質転換体は宿主株のウリジン栄養要求性を好む。サザンブロット法分析は、部分またはすべての適切なpyr-選択マーカーによって欠失される遺伝子のゲノムのコピーのコドン領域を置換する2倍体交叉組み込みイベントを識別し、それを確認するために、結果として生じる転換体に対し行われる。
【０１５１】
上で説明した特定のプラスミドベクターはpyr転換体のプレパラートと関連しているが、本発明はこれらのベクターに制限されない。上記の技術を用いて、様々な遺伝子が、アスペルギルス種（Aspergillus sp.）またはハイポクレア属（Hyprocrea sp. ）トリコデルマ種(Trichoderma sp.)の株において欠失されて、置換することができる。 さらに、上で議論したように、どのような入手可能な選択マーカーでも使うことができる。実のところ、クローン技術で生み出され、それから識別されているどのような宿主、例えばアスペルギルス属、またはハイポクレア属でも、あるいは遺伝子でも、上記で説明された方法を使って、ゲノムから削除することができる。
【０１５２】
上に述べたように、選ばれた選択マーカーと一致している1の又は複数の機能しない遺伝子を欠くか、または有している宿主の系統はハイポクレア属（Hyprocrea sp. ）(トリコデルマ属(Trichoderma sp.))の誘導株であるかもしれない。例えば、pyrGの選択マーカーがアスペルギルス種（Aspergillus sp.）に選ばれるならば、特定のpyrG誘導体株は形質転換処置の中の受容体として使われる。また、例えば、pyr4の選択マーカーがハイポクレア属（Hyprocrea sp. ）に選ばれるならば、特定のpyr4誘導体株は形質転換処置の中の受容体として使われる。同様に、アスペルギルス-ニデュランス（Aspergillus nidulans）遺伝子amdS、argB、trpC、niaDと等しいハイポクレア属（Hyprocrea sp.）(トリコデルマ属(Trichoderma sp.))から成る選択マーカー遺伝子が使われるかもしれない。従って、対応する受容株は、それぞれasargy-、trpC-、 niaD-のような誘導株でなければならない。
【０１５３】
CBH I変異体をエンコードしているDNAは適切な微生物へ挿入するために準備される。本発明によると、CBH I変異体をエンコードしているDNAは、機能的なセルロース分解活性を有するタンパク質のためにエンコードするのに必要なDNAから成る。CBH I変異体をエンコードしているDNA断片は細菌のプロモータ配列、例えば、アスペルギルス種（Aspergillus sp.）の中のglaA遺伝子のプロモーターまたはトリコデルマ属(Trichoderma sp.)の中のcbh1またはegl1遺伝子のプロモーターに機能的に付着する。
【０１５４】
CBH I変異体をエンコードしているDNAの複数のコピーが、過剰発現を容易にするためにこの株の中に組替えられることもまた予測される。CBH I変異体をエンコードするDNAは、変異体をエンコードするこのDNAを運ぶ発現ベクターの構成物によって調製される。CBH I変異体をエンコードする挿入されたDNA断片を運んでいる発現ベクターは与えられた宿主の生物の中で自律的に複製し、または宿主のDNAの中に融合することが可能であるようなベクターでもあり、一般的にはプラスミドである。好ましい実施例の中で、遺伝子の表現を得るための2タイプの発現ベクターが考えられる。一番目は、発現するためにすべてこの遺伝子に由来するプロモーター、遺伝子コドン領域、およびターミネーター配列のDNA配列である。それ自身の転写及び翻訳調節配列の制御下で、表現するためにその領域を取り除く必要から、望まれていないDNA配列（例えば、要求されていない領域のコード）を削除することによって、必要な位置で遺伝子を切断することができる。選択マーカーは、また新規な遺伝子配列の複数のコピーされた宿主の中へ組み込むために、選択を受け入れるベクター上に含まれている。
【０１５５】
2番目のタイプの発現ベクターはあらかじめ集められ、ハイレベルの転写と、選択マーカーに必要とされる配列を含んでいる。それが表現カセットプロモーターと重合停止剤配列の転写調節されるように、その遺伝子または遺伝子の部分のコドン領域が、この汎用ベクターに挿入することができるものと考えられる。
【０１５６】
例えば、アスペルギルス属の中で、pRAXはそのような汎用発現ベクターである。その遺伝子または部分は強いglaAプロモーターの下流に挿入することができる。
【０１５７】
例えば、ハイポクレア属の中で、pTEXはそのような汎用発現ベクターである。その遺伝子または部分は強いcbh1プロモーターの下流に挿入することができる。
【０１５８】
ベクター内で、本発明のCBH I変異体をエンコードしているDNAシーケンスは転写及び翻訳配列、すなわち構造遺伝子への読み枠の中の適当なプロモータ配列とシグナル配列と操作可能に結び付く。このプロモーターは宿主細胞の中で転写活性を示し、相同の、または非相同の蛋白質をエンコードしている遺伝子から宿主細胞に届けられるどのようなDNAシーケンスである可能性がある。任意的なシグナルペプチドはこのCBH I変異体の細胞外生産を提供する。
【０１５９】
シグナルシーケンスをエンコードするDNAは、好適には、おのずから発現すべき遺伝子に関係するものであるが、適切なソース、例えばトリコデルマ属のエクソ-セロビオハイドラーゼあるいはエンドグルカナーゼであるが、から得られるシグナルシーケンスが本発明から予測することができる。
【０１６０】
プロモーターとともに本発明の変異体CBH IをコードするDNA配列を結合し、そして適切なベクターへ挿入するために用いる方法は本技術分野でよく知られている。
【０１６１】
上で説明したDNAベクターまたは構成物は形質転換、形質移入、顕微注射、マイクロポレーション（microporation）遺伝子銃攻撃法及び同種の既知の技術によって宿主細胞の中で取り込まれる。
【０１６２】
好ましい形質転換技術において、ハイポクレア属（Hyprocrea sp. ）(トリコデルマ属(Trichoderma sp.))におけるDNAへの細胞壁の透過性は非常に低いうことを考慮しておかなければならない。そのため、目的とするDNAシーケンス、遺伝子、または遺伝子断片の取り込みは最小化される。形質転換処理に先立って、誘導株内で（すなわち、使われた選択マーカーと一致する機能的な遺伝子を欠いている誘導株）でハイポクレア属（Hyprocrea sp. ）(トリコデルマ属(Trichoderma sp.))の細胞壁の浸透性を高めるための数多くの方法がある。
【０１６３】
形質転換のためにアスペルギルス属spまたはHyprocrea sp(トリコデルマsp)を調製する、本発明における好適な方法は、細菌の菌糸体からプロトプラストを調製する方法に関係する。Campbell et al. Improved transformation efficiency of A. niger using homologous niaD gene for nitrate reductase. Curr. Genet. 16: 53-56; 1989を参照のこと。菌糸体は発芽した栄養胞子から得ることができる。菌糸体は、原形質を消化する酵素を用いて処理され、最終的にプロトプラストになる。原形質体は、懸濁培地の中の浸透圧安定剤によって保護される。このような安定剤はソルビトール、マンニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、およびそれに類したものを含む。通常、これらの安定剤の濃度は0.8Mと1.2Mの間で変動する。使用するのに望ましいものは、懸濁培地の中のソルビトールの濃度が1.2Mの溶液である。
【０１６４】
宿主株(（アスペルギルス属またはハイポクレア属（トリコデルマ属））の中へDNAを取込むことは、カルシウムイオン濃縮に依存している。一般に、約10mMのCaCl2から約50mMのCaCl2が取込むための溶液に用いられる。取込み溶液の中にはカルシウムイオンが必要であるが、この他に、一般に含まれる他のアイテムとしてはTE緩衝液(10 mMトリス、pH7.4;1 mM EDTA)または10mM MOPS、pH6.0の緩衝液(モルホニルプロパンスルホン酸(morpholine propane sulfonic acid))とポリエチレン・グリコール(PEG))と、ポリエチレン・グリコール(PEG)などの緩衝システムである。培地の内容物が宿主細胞、例えば、アスペルギルス属またはハイポクレア属系統のどちらかの細胞質の中に送られることを許容している細胞膜を溶融させるために、ポリエチレン・グリコールが機能することが知られており、この結果プラスミドDNAは核に転送される。この融合により、宿主の染色体の中に柔軟に組み込まれたプラスミドDNAの複数のコピが頻繁に取られる。
【０１６５】
通常、105 から106/mLの密度で、好ましくは2x108/mLの密度で透過処理をされたアスペルギルス属の原形質体または細胞を含んでいる懸濁液は、形質変換に用いられる。同様に、108 から109/mLの密度で、好ましくは2x105/mLの密度で透過処理されたハイポクレア属（トリコデルマ属）の原形質体または細胞を含んでいる懸濁液は、形質変換に用いられる。適切な溶液(例えば1.2Mのソルビトール;50 mM CaC12)中の、これらの原形質体または細胞の体積100 μL液中の細胞は、目的とするDNAに混合される。一般に、高濃度のPEGが取込み溶液に添加される。25%PEG4000の0.1から1容量は原形質体懸濁液に添加することができる。ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウム、及び同種のものの添加物もまた取込み溶液に添加され、形質転換を促進する。
【０１６６】
一般に、混合物は約0℃で10から30分の間培養される。PEGの添加は、それから、さらに目的とする遺伝子またはDNAシーケンスの取り込みを強化するためにこの混合物に添加される。形質転換混合物の5から15倍の体積の25%PEG4000が一般的に添加される。；しかし、これより大きい、または小さい体積だあってるよい。25%PEG4000は好ましくは形質転換混合の体積の約10倍である。PEGが添加された後、ソルビトール及びCaCl2溶液の添加の前に形質転換混合物は室温でまたは氷の上で培養される。原形質体懸濁液はそれから、溶解した一定分量の増殖培地にさらに添加される。この増殖培地は転換体の成長だけを促進する。目的とする転換体を成長させるために適当な、いかなる増殖培地でも、本発明のにおいて用いることができる。しかしながら、Pyr+転換体が選択している場合、ウリジンを含まない増殖培地を使うことが好ましい。その後、コロニーはウリジンを使い果たした増殖培地の上で形質転換され、精製される。
【０１６７】
この段階において、安定した転換体は、ウリジンを欠いた固形培養媒質上の不完全な外形よりも、転換体のより速い生長率とスムーズな丸いコロニーの形成によって、不安定な転換体と区別できる。さらに、ある場合には、安定性のさらなる試験は、選択的でない固形培地(すなわち ウリジンを含む培地)上での転換体の成長によって行われる。そして、この試験は、ウリジンを欠いている選択培地の上で発芽し、成長した芽胞を収穫し、これらの芽胞のパーセンテージを決定することにより行われる。
【０１６８】
上記の方法に関する特定の実施例において、CBH I変異体(s)は、CBH I変異体の適切な翻訳過程の結果として、液体培地の中で成長した後に、宿主細胞から活性型として回収される。
【０１６９】
(ii)酵母菌
本発明はまたCBH I生産のために、宿主細胞として酵母を使用する場合もある。加水分解酵素をエンコードしているいくつかの他の遺伝子は、酵母菌S. cerevisiaeの様々な系統の中で発現されている。これらは、Trichoderma reesei(Cummings and Fowler, Curr. Genet. 29: 227-233,1996) 由来の2のエンドゴルカナーゼ(Penttila et al., Yeast vol. 3, pp 175-185,1987)、 2のセロビオハイドラーゼ(Penttila et al, Gene, 63: 103-112,1988) 及び1のベータ-グルコシダーゼ、Aureobasidlium pullulans (Li and Ljungdahl,Appl. Environ.Microbiol. 62, no. 1, pp. 209- 213,1996)由来の1のキシラナーゼ小麦(Rothstein et al., Gene 55: 353-356,1987)由来の1のアルファ-アミラーゼ等をエンコードしている配列を含んでいる。 さらに、ブチリビブリオ-フィブリソルベンスエンドー[ベータ]-1、4グルカナーゼ(END1)、Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase(CBH1)、Ruminococcus flavefaciens cellodextrinase(CEL1)、およびEndomyces fibrilizercellobiase(Bgl1)をエンコードしているセルラーゼ遺伝子カセットはS. cerevisiaeの実験室株の中での発現には成功している。(Van Rensburgeta/., Yeast, vol. 14, pp. 67-76,1998)
C. 宿主細胞へのCBH Iエンコーディング核酸配列の導入
本発明は、さらに外部発生的に提供される変異体CBH Iエンコーディング核酸シーケンスから成る、遺伝的に変性させられた細胞と細胞組成を提供する。親細胞または細胞系は、クローニングベクターまたは発現ベクターを用いて遺伝子組み替え（すなわち、形質導入、形質変換、又は移入）が行われた。ベクターは、上で開示したように、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどという形であるかもしれない。
【０１７０】
本発明の形質転換の方法は、糸状菌ゲノムの中へ形質転換ベクターのすべてまたは一部分が安定した組込みが行われた結果として行われる。結果として、自己再生する染色体外形質転換ベクターの維持をしている形質転換もまた、考慮される。
【０１７１】
多くの標準的な移入方法は、大量の 非相同タンパク質 を表現するトリコデルマレーシ細胞系を生産するために用いることができる。トリコデルマのセルラーゼ産出系統へ、DNA構成物を導入するために出版された方法のいくつかは、以下に記載されている。Lorito, Hayes, DiPietro and Harman, 1993, Curr. Genet. 24: 349-356; Goldman, VanMontagu and Herrera-Estrella, 1990, Curr. Genet. 17: 169-174; Penttila,Nevalainen, Ratto, Salminen and Knowles, 1987, Gene 6: 155-164。アスペルギルス属エルトンに係る方法はHamer and Timberlake, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1470-1474に記載され、フザリウム属バジャーに係る方法はPodila and Kolattukudy, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8202-8212に記載され、ストレプトマイシン属に係る方法はHopwood etal., 1985, The John Innes Foundation, Norwich, UKに記載され、バチルス ブリジディに係る方法はDeRossi, Bertarini, Riccardi and Matteuzzi, 1990, FEMS Microbiol. Lett. 55: 135-138)に記載されている。
【０１７２】
非相同核酸構成物（発現ベクター）を糸状菌（例えばH.ジェコリーナ）へ導入する他の方法としては、粒子または遺伝子銃の使用、形質転換処理に先立つ糸状菌細胞の透過化処理（例えば、高濃度のアルカリ例えば、0.05Mから0.4M CaCl2またはリチウム酢酸塩の使用）、プロトプラストの融合、またはアグロバクターを介した形質転換を含むが、これらに限られない。ポリエチレン・グリコールとCaC12によるプロトプラストまたはスフェロプラストの処理による糸状菌の模範的な転換法は、Campbell, E. I. et al., Curr. Genet. 16: 53-56, 1989 及び Penttila,M. etal., Gene, 63: 11-22,1988に開示されている。
【０１７３】
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための有名な処理のどれでも使うことができる。それらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラストの融合、電気穿孔法、微粒子銃、リポソーム、顕微注射、プラズマベクター、ウイルスベクター、およびクローンゲノムDNA、cDNA、合成DNA又は外来遺伝物質を宿主細胞に導入するようなほかによく知られている方法の使用をも含まれる。
【０１７４】
加えて、変異体CBH Iエンコーディング核酸シーケンスから成る非相同核酸構成物はin vivo及び例えば注入法などのよく知られた方法によって宿主細胞に導入され、その結果として生じるRNAで転写することができる。
【０１７５】
本発明はさらに、細菌セルラーゼ組成物を生産するためのA.ニガー及びH ジェコリナのような糸状菌であって、新規で、有益な転換体を含む。本発明は糸状菌、特に変異体CBH1をコード配列から、又は内因性cbhをコード配列から欠失させた菌類の転換体を含む。
【０１７６】
変異体のcbh1に対するコーディングシーケンスから成っている異種の核酸構成物に関する紹介によれば、遺伝子組み替えの細胞はプロモーターを活性化し、形質転換体を選定し、変異体のCBH Iエンコーディング核酸シーケンスの表現を増幅するのに適切となるように修正された栄養培地の中で培養されている。温度、pH等の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞のためにあらかじめ使われたものであり、本技術分野において明らかである。
【０１７７】
かかる非相同核酸構成物が導入された細胞の子孫は、一般に、非相同核酸構成物の中で見られる変異体CBH Iエンコーディング核酸シーケンスから成ると考えられる。
【０１７８】
本発明はさらに細菌セルラーゼ組成物生産における使用のためのH.ジェコリーナのような糸状菌であって、斬新で、有益な転換体を含む。本発明は糸状菌、特に変異体cbh1をコード配列又はcbhをコード配列から欠失させた菌類の転換体を含む。
【０１７９】
糸状菌の安定した転換体は、固形培養媒質上の不完全な外形よりはむしろ、それらのより速い生長率とスムーズな丸いコロニーの形成によって、不安定な転換体と区別することができる。加えて、ある場合には、固形の非選択的培地上の転換体を成長させ、この培地から、選択培地上で発芽し成長する芽胞を収穫し、そして、これらの芽胞のパーセンテージを決定することによって、安定性のさらなる試験を行うことができる。
【０１８０】
VII. CBH1核酸コーディング配列のための分析、および／またはタンパク質発現
変異体CBH Iエンコーディング核酸構成物によって変換している細胞系による変異体CBH Iの表現を評価するための検定が、タンパク質レベル、RNAレベルで、またはセロビオハイドラーゼの活性、および／または生産に対する機能的な生物検定を利用することにより行うことができる。
【０１８１】
ここに説明された変異体cbh 1の核酸と蛋白質配列の1つの典型的な用途において、糸状菌の遺伝子組み替え系統、例えば、トリコデルマレーシは、CBH Iの量を増加させるように設計することができる。かかる遺伝子組み替え糸状菌は、より大きなセルロースを分解する能力を有するセルラーゼ組成物を生産するために有益である。このことは、cbh 1のためのコーディングシーケンスを適当な宿主、例えばアスペルギウスニガーのような糸状菌に導入することによって行われる。
【０１８２】
従って、本発明は、糸状菌または他の適当な宿主の細胞の中にDNA配列エンコーディング変異体CBH Iを含む発現ベクターを導入することにより、糸状菌または他の適当な宿主の中で変異体CBH Iを発現するための方法を提供する。
【０１８３】
別の側面において本発明は、糸状菌または他の適当な宿主の中でCBH Iの発現を変更させる方法をも提供する。かかる変異は内因性CBHの発現の減少または消失を含むものである。
【０１８４】
一般に、変異体CBHIの発現の解析に用いられる分析法には、ノザンブロット法、ドットブロット法（DNAまたはRNA解析の用いる）、RT-PCR法（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）、又はインサイチュハイブリダイゼーション、適切なラベルプローブの使用（核酸配列に基ずく）及び従来のサザンブロット法及びオートラジオグラフィーがある。
【０１８５】
加えて、変異体CBHIの生産及び/又は発現は、例えばセロビオハイドラーゼ活性、発現、および／または生産にかかる分析法によって試料から直接測定することができる。かかる分析法は、Becker et al., Biochem J. (2001) 356: 19-30 and Mitsuishi et al., FEBS (1990) 275: 135-138に開示されており、参照によりここに組み込まれる。CBHIの分離された可溶性又は不溶性基質を加水分解する能力は、Srisodsuk et al., J. Biotech. (1997) 57: 49-57 及び Nidetzky and Claeyssens Biotech. Bioeng. (1994) 44: 961-966.に開示された分析法により測定することができる。セロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ又はβ-グルコシダーゼ活性の分析法に有用な基質には、結晶セルロース、濾紙、リン酸増加セルロース、セロオリゴサッカライド、メチルウンベリフェリル ラクトシド、メチルウンベリフェリルセロビオシド、オーソニトロフェニルorthonitrophenyl ラクトシド、パラニトロフェニル ラクトシド、オーソニトロフェニル セロビオシド、パラニトロフェニル セロビオシドがある。
【０１８６】
更に、タンパク質の発現は、細胞、組織切片の免疫組織学的染色又は組織培養培地のようなイムノアッセイ(免疫測定法)のような免疫学的方法を用いて行うことができる。（例えば、ウエスタンブロット又はELISA）かかるイムノアッセイは、質的及び量的にCBH I変異体の発現を評価するために用いることができる。かかる方法の詳細は当業者によく知られており、この方法を行うための多くの試薬が市販されている。
【０１８７】
変異体CBH Iの精製物を、様々なイムノアッセイの中で使用される発現されたタンパク質に反応するモノクローナルまたはポリクロナール抗体のいずれかを生産するためにも使用される。（Hu et al., Mol Cell Biol. vol. 11, no. 11, pp. 5792-5799,1991参照のこと）。典型的な分析法としては、エリサ(ELISA)、競合イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット法、間接免疫螢光測定法、およびそれに類したものがある。一般に、市販されている抗体、および／またはキットは、セロビオハイドラーゼ タンパク質の発現レベルの多くのイムノアッセイのために使われる。
【０１８８】
VIII. 組換体CBH1タンパク質の単離と精製
細胞培養中に生産された変異体CBH Iタンパク質は培地の中に分泌され、そして精製され、又は単離される。しかし、場合によっては、変異体のCBH Iタンパク質は細胞溶解産物から回復することが必要となる細胞の品種によって生み出される場合もある。かかる場合にには、変異体CBHIタンパク質は、当業者によって通常用いられている技術を利用して、かかる細胞から精製される。例えば、アフィニティークロマトグラフィー (Tilbeurghetal., FEBS Lett. 16: 215,1984), 高い分解パワーを有する原料を使ったイオン交換をも含めた、イオン交換クロマトグラフ法 (Goyal et al., Bioresource Technol. 36: 37-50,1991 ; Fliess et al., Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 17: 314-318,1983 ; Bhikhabhai et al., J. Appl. Biochem. 6: 336-345,1984 ; Ellouz et al., J. Chromatography 396: 307-317,1987), (Medve et al., J. Chromatography A 808: 153-165,1998), 疎水性相互作用クロマトグラフィー(Tomaz and Queiroz, J. Chromatography A 865: 123-128,1999), 及び二相仕切り(two-phase partitioning)(Brumbauer,et al., Bioseparation 7: 287-295,1999)などかあるが、これらに限定されるものではない。
【０１８９】
変異体CBH Iタンパク質は、特定の結合因子に対する結合親和性（例えば、抗体又は受容体）などの特定の特性を有するタンパク質を分離するために細分化される。これらの抗体又は受容体は選択された分子量の範囲、又は等電点の範囲を有する。
【０１９０】
一度、与えられた変異体CBHIの発現が達成されると、その後、生産されたCBH Iタンパク質は細胞または細胞培養から精製される。係る精製に適した典型的な処理方法としては、抗体アフィニティカラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ法；エタノール沈殿；逆相HPLC；シリカ上またはDEAEなどの陽イオン交換樹脂によるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング； SDS-PAGE；硫酸アンモニュウム沈殿法；そして、例えば、Sephadex G-75を用いたゲルろ過、などがある。さまざまなタンパク質精製の方法が用いられており、係る方法は本分野において知られたものであり、例えば、Deutscher, Methods in Enzymology, vol. 182, no. 57, pp. 779,1990 ; Scopes, Methods Enzymol. 90: 479-91,1982に記載されている。精製手段の選択は、それが用いられる製造工程と生産された特定のタンパク質の性質に依存する。
【０１９１】
IX. cbh1とCBH1の使用
変異体cbh核酸、変異体CBH Iタンパク質、および変異体CBH Iタンパク質活性から成る組成物の広範囲にわたる用途を発見することは高く評価される(このような用途のいくつかについて以下に説明する。)。
【０１９２】
新規で改良された、さまざまな量のBGタイプ、EGタイプ及び変異体CBHタイプのセルラーゼから成るセルラーゼ組成物は、柔軟剤として作用し、および／または、綿織物の感触を高める（例えば、「ストーンウォッシュ」又は「バイオポリッシュ」）ことができる高い洗浄能力有する洗浄剤組成物や、木材パルプを糖へ分解する組成物（例えば、バイオエタノールの生産）や、及び/又は食品組成物へ適用する用途がある。各タイプのセルラーゼの単離及びその特徴によって、係る組成物の特徴をコントロールすることができる。
【０１９３】
大きな耐熱性を持つ変異体(または突然変異体)CBHsは、高温おいても活性を維持することができるため、上記の全ての分野において用いることができる。
【０１９４】
わずかな耐熱性を持つ変異体(または突然変異体)CBHsは、例えば、存在する他の酵素が影響を受けるこがないように、ある酵素活性がより低温で中立化されることが必要となる分野で用いられる。更に、酵素は、例えば結晶化度またはセルロース系材料の鎖長をコントロールすることにより、セルロース系材料をある程度改質するという用途もある。この改質が要求されたレベルに達した後、糖化温度を非熱安定性CBH Iの生存温度以上にあげることができる。CBH I活性が結晶セルロースの加水分解に必須なので、結晶セルロースの改質は高温では停止してしまう。
【０１９５】
増大した可逆性（すなわち、活性のリホールディング（refolding）又は保持（retention）が高いめられていること）を有する変異体(または突然変異体)CBHsもまた同様な領域で用いられる。熱失活の条件に依存して、可逆的変性は、不可逆的過程と競合し、又は不可逆的過程を支配することができる。増大した可逆性を持つ変異体は、これらの条件のもとで、熱失活に対して増大した抵抗性を持っている。増大した可逆性はまた、非不活性化状態における処理によって不活性化イベントが行われる過程において潜在的利益をもっている。例えば、生物資源をエタノールへ変換するための加水分解と発光の組み合わせ（HHF）において、生物資源は最初に高温(50℃より高い温度を示す)でセルラーゼによって不完全に糖化される。 そして、その後温度は、発酵微生物が、糖をエタノールに変換することを可能ならしめるため下げられる。(例えば30℃まで)もし、経過温度を低下させると、熱的に不活性化したセルラーゼが可逆的に活性を停止し、低温発酵工程の間、糖化はその転換を高いレベルで継続される。
【０１９６】
1のアプローチにおいて、本発明のセルラーゼは感触と外観をよくするために、洗浄剤組成物に使用され、または布の処理にも用いられる。
【０１９７】
ゲノムに挿入されたcbh遺伝子の少なくとも1つの追加コピーを持っている転換体を使うことによって、セルロースでできた物質製品の加水分解反応速度を増大させることができるかもしれないので、セルロースまたはヘテログリカンを含む製品を、より速い速度で、かつより大きな範囲にわたって分解することができる。紙、綿、セルロース系の紙おむつ、およびそれに類したものであって、セルロースから作られる製品はごみ処理場でより効率的に処理することができる。1の転換体または複数の転換体から得ることができる発酵生成物は、詰ったごみ処理場へ投入される各種セルロース製品を液化することによって、これを分解するために使うことができる。
【０１９８】
別々に起こる糖化及び発酵のプロセスは、生物資源の中に存在するセルロース（例えば、トウモロコシの茎葉）がグルコースに転換され、続いて酵母菌がグルコースをエタノールに転換するプロセスである。同時に起こる糖化及び発酵のプロセスは、生物資源の中に存在するセルロース（例えば、トウモロコシの茎葉）がグルコースに転換され、同時に同じ反応で酵母菌がグルコースをエタノールに転換するプロセスである。したがって、他のアプローチにおいて、本発明の変異体CBHタイプのセルラーゼを、生物資源のエタノールへの分解処理に用いることができる。セルロースのようなすぐに入手可能である原材料からエタノールを生産することは安定的に行え、再生可能な燃料源を提供することができる。
【０１９９】
セルロースベースの原料は農業廃棄物、草、および木材と都市廃棄物のような他の低価値生物資源（例えば、再生紙、ヤードクリッピング（yard clippings）などから成る。エタノールはこれらのセルロースでできた物質原料を発酵させて生産することができる。しかし、エタノールへ変換される前に、セルロースを最初に糖に変換しなければならない。
【０２００】
多種多様な原料に対して、本発明の変異体CBHを使える可能性があり、使用するための選択基準は、この転化作業が行われる地域に依存している。例えば、米国中西部においては、小麦、わら、トウモロコシ茎葉及びバガスのような、農業廃棄物が主要なものである一方、カリフォルニアでは、稲ワラが農業廃物の主要なものである。しかし、入手可能ないかなるセルロース質バイオマスは、いかなる地域においても使われものであるということを理解する必要がある。
【０２０１】
セロビオハイドラーゼの量を増やしたセルラーゼ組成物は、エタノール生産に用いられる。このプロセスによるエタノールは、オクタンエンハンサーとして、たは直接燃料源として利用でき、このエタノールは、石油由来生成物よりも環境にやさしいので、ガソリンの代替燃料としても、有効に活用することができる。エタノールを使用することにより大気の浄化に役立ち、場合によっては、部分的なオゾンレベル及びスモッグを減らことが可能となることが知られている。さらに、ガソリンの代わりにエタノールを利用することは、再生不能なエネルギー源のである石油化学製品の供給の変動を緩衝することにおいて戦略的に重要である。
【０２０２】
エタノールは木、草本、都市の固形廃棄物、および農業と林業の残留物などから糖化と発酵過程を経て、生産することができる。しかし、微生物由来の自然発生するセルラーゼ混合物の中の個々のセルラーゼ酵素の割合は、バイオマスをグルコースに転換するのには効果的ではない。エンドグルカナーゼは、それ自身がセロビオハイドラーゼの作用のための基質であり、従って全体のセルラーゼシステムの加水分解の効率を改善する新しいセルロースチェーン端を生産することができる機能を持っていることが知られている。従って、強化され、あるいは最適化されたセロビオハイドラーゼ活性を利用することによってエタノールの生産量を増加することができる。
【０２０３】
従って、本発明のセロビオハイドラーゼは、そのもの自体を糖に変換するセルロースの加水分解に使用される。1の態様では、変異体セロビオハイドラーゼは発酵微生物の添加に先がけてバイオマスに添加される。2番目の態様では、変異体セロビオハイドラーゼは、バイオマスに対して発酵微生物と同時に添加される。更に、いずれかの態様に存在する他のセルラーゼ成分もある。
【０２０４】
他の態様において、セルロース系物質原料は前処置される。前処理は高温と希酸、濃酸、または薄めのアルカリ溶液のいずれかの添加による。前処理溶液は、少なくとも部分的にヘミセルロース成分を加水分解するのに十分な時間の期間添加されており、その後中和される。
【０２０５】
セルロースにCBHIを作用させた際の主産物は、BG活性(例えば細菌のセルラーゼ生成物中の)により、グルコースへ変換するために利用されるセロビオースである。セルロース系バイオマスの前処理によって、またはバイオマス上の酵素作用によって、グルコースとセロビオースを含む他の糖類はバイオマスから入手可能である。このバイオマスのヘミセルロース内容物は(ヘミセルラーゼによって)、キシロース、ガラクトース、マンノース、およびアラビノースなどの糖類に、変換することができる。従って、バイオマス変換過程の中で、酵素糖化法は、他の中間体または最終生成物への生物的または化学的変換に利用可能な糖類を作り出すことができる。従って、バイオマスから発生した糖はエタノールの生成に加えていろいろな過程中において使用される。そのような転化の例はグルコースからエタノールへの発酵 (M. E. Himmel et al. pp2-45, in"Fuels and Chemicals from Biomass", ACS Symposium Series 666, ed B. C. Saha and J. Woodward, 1997による論評) 、及び グルコースから2, 5-ジケト-D-グルコネイト (US Patent No. 6,599, 722), 酪酸 (R. Datta and S-P. Tsaipp224-236, ibid), サッシネイト (R. R. Gokarn, M. A. Eiteman and J. Sridhar pp237-263, ibid), 1, 3-プロパンジオール (A-P. Zheng, H.Biebl and W-D. Deckwer pp264-279, ibid), 2, 3-ブタンジオールへの生物的転換(. C. S. Gong, N. Cao and G. T. sao pp280-293, ibid)、及びキシロースからキシリトールへの化学的及び生物的転化(B. C. Saha and R. J. Bothast pp307-319, ibid)などがある。例としてWO 98/21339も参照のこと。
【０２０６】
本発明の洗剤組成物は、セルラーゼ組成物（セロビオハイドラーゼ内容物とは関係なく、すなわち、セロビオハイドラーゼ無添加、セロビオハイドラーゼが実質的に無添加、セロビオハイドラーゼを多く含むものがある。）のほかに、陰イオン性、非イオン性、および両性の界面活性物質を含む界面活性物質、加水分解酵素、造形剤、漂白剤、青味剤、および蛍光色素、固化抑制剤、可溶化剤、陽イオン界面活性剤、およびそれに類したものが含まれる。これらの全ての成分は、洗剤の分野においてよく知られている。上記のセルラーゼ組成物は、液体の希釈液の中、顆粒の中、エマルジョンの中、ゲルの中、ペーストの中のいずれかまたは同種のものの洗浄剤組成物中に添加することができる。係る製品は当業者によく知られている。固形洗浄剤組成物が使用される時、セルラーゼ組成物は顆粒として製剤化することが好ましい。また好ましくは、この顆粒は、セルラーゼ保護因子を含むように製剤化することができる。更に理解を深めるために、ここに参照により取り込まれている、題名"Detergent compositions containing cellulase compositions deficient inCBH I type components, " U.S. Patent Number 6,162, 782を参照のこと。
【０２０７】
好ましくは、セルラーゼ組成物は洗浄剤組成物の総量に対して、約0.00005重量%から約5重量%添加される。より好ましくは、セルラーゼ組成物は洗浄剤組成物の総量に対して、約0.0002重量%から約2重量%添加される。
【０２０８】
更に、変異体cbhI核酸配列は、関連する核酸配列の同定及び特徴付けに使用することができる。遺伝子又は遺伝子生産物に関する機能の決定（予測又は確認）に有用である数多くの技術は、A.（1） 過剰発現、異所性発現、および他種内発現；（2）黙している逆ゲノム多型法、ターゲットノックアウト、ウイルス誘発性遺伝子サイレンシング（VIGS）、（Baulcombe, 100 Years of Virology, Calisher and Horzinek eds., Springer-Verlag, New York, NY 15: 189-201,1999参照のこと）; （3）メチル化状態の分析、特にフランキング調節領域；（4）in situ ハイブリダイゼーション；のようなDNA/RNA解析；B.（1）組み換えタンパク質発現；（2）抗血清生産； (3)免疫学的局在決定； (4) 触媒または他の活性に対する生化的検定；（5）リン酸化状態；及び（6）酵母 2-ハイブリッド法(Two-Hybrid法)を介したタンパク間の相互作用などの遺伝子生産物解析；C. 過剰発現した発現型に基づいた、または関連する遺伝子の配列相同性による特定の生化学的又はシグナル経路内における遺伝子又は遺伝子生産物の位置などの経路分析及び D. 特定の代謝又は伝達経路内における単離された遺伝子及びその生産物の関与を決定又は確認し、遺伝子の機能決定を助けるためのその他の解析が含まれるが、これらに限られない。
【０２０９】
ここに言及されたすべての特許、特許出願、記事、および出版物はここに参照することによって明確に取り込まれる。
【０２１０】
実施例
本発明は、さらに以下の実施例により詳細に説明される。しかしながら、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。添付の図は本発明の明細書の一部である。ここで引用された全ての参考文献の内容は参照により、本発明出願に組み込まれる。
【０２１１】
実施例1
Cel7セルラーゼの配列
いくつかの変異体は、構造の情報及び調節機構を用いたハイポクレアジェコリーナCel7の一次配列（first aligning）により41のファミリーメンバーから選択された。42ファミリーメンバーについての1次アミノ酸配列を図8に示す。
【０２１２】
4つのメンバー（すなわち、20VW.1、1A39、6CEL及び1EG1.1）は、その結晶構造が明確に決定されている。発表された構造を有する4つの位置合わせされたタンパク質は、バックボーン原子が特定のRMS偏差内（2.0A以下）である全ての残査に対してこの配列は固定されている。4つのシーケンスの第3位の構造的不整はカナダ モントリオールの化学計算グループが作成したMOEバージョン2001.01を利用して計算することができる。オーバーラップした構造要素は4つのシーケンスの凍結された主構造に対して使用された。残っている38の配列は、二次構造予測及びデフォルト設定した他のパラメータと共にMOEを用いて、凍結された4による位置合わせされた一次性のアミノ酸構造を持っていた。
【０２１３】
この位置あわせに基づいて、様々な単一の及び複数のアミノ酸突然変異体がタンパク質の中におけるサイト変異誘発によって作られた。
【０２１４】
単一のアミノ酸突然変異は、以下の原理に基づいている。(表1を参照のこと)：相同体の間でアミノ酸の保存状態を試験した後、サイトはH.ジェコリーナ(H. jecorina)シーケンス内の別のアミノ酸において、統計的選択によって、他の41の配列で見られた所に配置された。（例えば、H.ジェコリーナ及び及び3の他の相同体に存在する77番目のAlaは他の22の相同体に存在するAspに変更された）。構造への各置換の効果はその時形成された。
【表１】
複数のアミノ酸突然変異は、酵素の安定性、進化性、および生産物阻害に影響するように作成された。H. ジェコリーナシーケンスの以下の複数のサイト変化が構築された：
1) Thr 246 Cys + Tyr 371 Cys
2) Thr 246 Ala + Arg 251 Ala + Tyr 252 Ala
3) Thr 380 Gly + Tyr 381 Asp + Arg 394 Ala + 残基 382 から 393の欠失を含む
4) Thr 380 Gly + Tyr 381 Asp + Arg 394 Ala
5) Tyr 252 Gln + Asp 259 Trp + Ser 342 Tyr
T246A/R251A/Y252Aと他の三倍の数+欠失変異体は、両方とも酵素の生産物抑制効果を減少させると予測される。Thr246Cys +Tyr371 Cysは、酵素の安定性及びプロセシング能力を増大させると予測される。TheD259W/Y252Q/S342Y変異体は、酵素生産物の抑制に影響すると予測される。
【０２１５】
単一の及び複数の突然変異は、本技術分野でよく知られている方法を用いて構築される。これらを表2に示す。
【表２】
実施例2
H.ジェコリーナCBHI変異体のクローニング及び発現
A. プラスミドRTEXのH.ジェコリーナ目的発現
このプラスミド、PTXは、以下のSambrook et al. (1989)、（上記）の方法を用いて構築されるものであり、図7に図示した。このプラスミドは、糸状菌トリコデルマロンギアタムに用いる多目的発現ベクターとして作られたものである。この発現カセットは、この機能を有益にするいくつかのユニークな特徴を有する。転写は、トリコデルマロンギアタムに対する強力なCBHI遺伝子プロモータ及びターミネーター配列を用いて調節される。このCBHプロモーター及びターミネーター配列の間には、表現遺伝子を挿入するために使われるユニークなPmelとSstl制限サイトがある。ロンギブランチアタム(T. longibrachiatum) pyr4選択可能標識遺伝子はCBHI終了暗号に挿入されていて、全体表現カセット(CBHIプロモーター挿入部位-CBHIターミネーター-pyr4遺伝子-CBHIターミネーター)は、ユニークなNotl制限サイトまたはユニークなNotl及びNhel制限サイトを利用して、削除することができる。
【０２１６】
このベクターは、細菌ベクター、拡張された複数のクローニングサイトを持つPUCタイプのベクターであるpSL1180（Pharmacia Inc., Piscataway, N. J.）に基づくものである。当業者は、図7中で説明されたフローダイアグラムに基づいてこのベクターを構築することができるであろう。
【０２１７】
ベクターpTrex2LはpTrex2、pTEXの誘導体から構成された。pTrex2のための配列を図6中に示す。
【０２１８】
変異体タンパク質が有用なレベルで発現される限り、用いるプラスミドを厳格に限定することは重要ではない。しかし、cbh1座で組込みを強制することにより発現レベルを最大化することは有益である。
【０２１９】
B．クローニング
本技術分野で知られる方法を使って、当業者は適切なベクターの中に目的とするCBH I変異体をクローン技術により生産することができる。上で述べたように、変異体タンパク質が有用なレベルで発現される限り、用いるプラスミドを厳格に限定することは重要ではない。本発明の変異体CBH I酵素の1の調製についての以下の記載は、ここに説明された本発明の変異体のいずれかを調製するために利用することができる。
【０２２０】
この変異体cbh1遺伝子はこのpTre2Lベクターでクローン化された。
【０２２１】
プラスミドpTrex2Lの構築は以下の通り行われた： pTrex2のユニークなSacIIとAsc Iサイトの間の6つのヌクレオチドは、プラスミドTrex2Lを生産するためにBstE IIとBamH Iサイトを含んでいる合成リンカーと置き換えられた。 この補完的な合成リンカー、21-マー合成オリゴCBHリンカー1+：GGTTTGGATCCGGTCACCAGと、27-マー合成オリゴCBHリンカー：CGCGCCTGGTGACCGGATCCAAACCGC は、アニーリングされた。
【０２２２】
pTrex2はSacIIとAsc Iによって消化された。アニールされたリンカーは、pTrex2Lを作成するためにpTrex2の中でその後に結紮された。プラスミドは適切な制限酵素によってその時消化され、野生型CBH I遺伝子はプラスミドの中に結紮された。
【０２２３】
プライマーは、目的とする突然変異を野生型の遺伝子に導入するために使われた。遺伝子の目的とする変質作用または突然変異の導入を結果として生じさせる、どのような方法でも用いることができる。合成DNAプライマーは突然変異体の構築のためにPCRの鋳型として使われた。目的とする突然変異に基づいたプライマーを、導入することができるようにデザインすることは当業者の知識の範囲内である。
【０２２４】
この変異性の鋳型は、伸張されて合成DNAオリゴヌクレオチドを用いて、PCRによってダブルストランドに形成された。25回のPCRサイクルの後の最終生成物は、目的とする突然変異から成る58塩基対のダブルストランドの生成物であった。
【０２２５】
C.形質転換及び発現
目的とする変異体のために調製されたベクターは、2、又は4欠失トリコデルマ系統のウリジン栄養要求株バージョン（Table 3参照のこと； U. S. Patent Nos. 5,861, 271 及び 5,650, 322も参照のこと）の中で形質転換され、安定した転換体が確認された。
【表３】
どの転換体が、変異体CBH I を発現したかを確認するために、DNAは、Vogels+1%のグルコースで成長させた系統から、変異体CBH Iのみを含む単離DNA断片を用いて実行されたサザンブロット法実験から分離された。宿主細胞の遺伝子内へ組み込まれたこの変異体CBHI発現カセットの複製を有する変異体が単離された。総mRNAはVogels+1%ラクトース上で1日成長させた菌株から分離された。mRNAは、プローブとして変異体のCBHIコドン領域を使って、ノザン分析された。変異体CBH I mRNAを表現している転換体は識別された。
【０２２６】
上で説明した方法を使用することによって、他の新規変異体のCBH Iセルラーゼまたはそれらの誘導体を得ることができる。
【０２２７】
実施例3
A. ニガーニおけるCBHI変異体の発現
PCR断片は、以下のプライマーと方法を使って得られた。
【０２２８】
以下のDNAプライマーは、様々な微生物から分離されたゲノムDNA由来のCBH1相同遺伝子を増幅に使用するために構成された。タンパク質とDNA配列のためにここに使われたすべての記号はIUPAC IUB Biochemical Nomenclature Commissionコード一致している。
【０２２９】
相同である5‘(FRG192)及び3’(FRG193)プライマーは、トリコデルマレーシからCBH1の配列に基づいて、開発された。両方のプライマーはプライマーの5’にインビトロゲンからゲートウェイクローニング配列を含んでいた。プライマーFRG192はattB1シーケンスを含んでいて、プライマーFRG193はattB2シーケンスを含んでいた。
【０２３０】
attB1のないFRG192の配列 :
ATGTATCGGAAGTTGGCCG (CBH1 H. ジェコリーナシグナル配列) (SEQ ID NO: 3)
attB2のないFRG193の配列：
TTACAGGCACTGAGAGTAG (CBH1 H. jecorinaのセルロース結合モジュール) (SEQ ID NO: 4)
H.ジェコリーナ CBH I cDNAクローンは鋳型として用いられた。
【０２３１】
PCR条件は次の通りであった：10 μL の 10X 反応緩衝液 (10X 反応緩衝液 は100 mM Tris HCI, pH 8-8.5 ; 250 mM KCI ; 50 mM (NH4) 2SO4 ; 20 mM MgSO4から成る) ; 0.2 mM の dATP, dTTP, dGTP, dCTP (最終濃度), 1μL の 100 ng/μL ゲノム DNA, 0. 5μL の 1unit/μL（活性単位）PWO ポリメラーゼ(Boehringer Mannheim, Cat # ; 1644-947), 0.2μM の個々のプライマー、すなわち、FRG192 及びFRG193, (最終濃度), 4μL DMSO及び 水を加え 100 μLとする。
【０２３２】
H. jecorina CBH1における様々なサイトは変異体の耐熱性に関係しており、従って、H. jecorina CBH1遺伝子は変異誘発を受けた。
【０２３３】
変異体をエンコードしている断片は、Qiagenゲル抽出KITを使って、アガロースゲルから精製された。この精製断片は、Gatway(登録商標) 技術使用説明書（バージョンC）により（参照によりここに含むものである）、 Invitorogen(登録商標)のpDONRTM201ベクターを用いたクロナーゼ反応の実施に用いられた。そして、遺伝子は、発現ベクターpRAXCBH1を得るためにこの導入ベクター（ENTRYベクター）から目的ベクター(pRAXdes2)に移された。
【０２３４】
細胞は変異体CBH Iセルラーゼをエンコーディングしている核酸から成る発現ベクターにより形質転換された。Cao et al (Cao Q-N, Stubbs M, Ngo KQP, Ward M, Cunningham A, Pai EF, Tu G-C and Hofmann T (2000) Penicillopepsin-JT2 a recombinant enzyme from Penicillium janthinellum and contribution of a hydrogen bond in subsite S3 to kcat Protein Science 9: 991-1001)により説明された方法に従って、この構築物はA.ニガー種.アワモリ内で形質転換された。
【０２３５】
転換体は最少培地プレート(Ballance DJ, Buxton FP, and Turner G (1983) Transformation of Aspergillus nidulans by the orotidine-5'-phosphate decarboxylase gene of Neurospora crassa Biochem Biophys Res Commun 112: 284-289)の上で線画培養され、30℃で4日間育成された。芽胞は、本技術分野においてよく知られている方法< http://www.fgsc.net/fgn48/Kaminskyj.htm>参照のこと)を用いて収集された。A.ニドランス分生子は、（芽胞を取り除くために滅菌済の曲折ガラス棒を用いて調製培地の表面をこすることにより）水の中で収穫されて、生存率の大幅なロスなしで4℃において数週間から数ヶ月の間保存することができる。しかし、新しく収穫された芽胞はより再生可能的に発芽する。長期間保存するためには、芽胞は-20℃において50%グリセロール内で、または-80℃において15-20%グリセロール内で蓄えることができる。グリセロールは80%水溶液中においてもピペット操作が容易に行える。200μLの80%のグリセロールを添加した水溶性分生子懸濁液800μL (4℃の貯蔵用として作成された)は、-80℃の貯蔵に用いられ、；600μLの80%グリセロールが添加された400μL懸濁液は、-20℃の貯蔵に用いられる。凍結の前にはボルテックスミキサーで攪拌をする。突然変異体の収集のために、分生子が存在する培地の小片は切り取られ、20%グリセロール溶液内に入れ、ボルテックスミキサーで攪拌され、-80℃で凍結保存することができる。本ケースにおいては、我々はそれらを-80℃で50％グリセロール溶液内で保存した。
【０２３６】
A.ニガー種アワモリ形質変換体は、ウリジンを欠いている最少培地の上で成長した。(Ballance et al. 1983)転換体は、Cao et al. (2000)により説明されるように、セルラーゼ活性をみるために、胞子形成した成長寒天プレートからの胞子懸濁液の1cm2を100mlの振動フラスコの中で、37℃3日間植菌することによりスクリーニングされた。
【０２３７】
CBHI活性検定は、非蛍光性4-メチルウンベリフェリル-β-ラクトシダーゼがラクトース及び7-オキシ4-メチルクマリンを生成する加水分解に基づいている。後者の生成物は、蛍光シグナルに反応する。ピペット操作で170μL 50 mM NaAc buffer pH 4.5を、96ウェルマイクロタイタープレート（MTP）(Greiner, Fluotrac 200, art. nr. 655076)に分注することは蛍光発光に適切である。10μLの上澄を添加し、その後、10μLのMUL（ミリQ水中の1mM4-メチルウンベリフェリル-β-ラクトシダーゼ）を添加し、そしてこのMTPをFluoster Galaxy（BMG Labtecnologies；D-77656 Offenburg）内に置く。50℃における16分間（各120秒8サイクル）の動態を、λ320nm(励起)及びλ460nm(発光)を用いて測定する。CBH活性を有している上澄は、その後、疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけられた。
【０２３８】
実施例4
CBH1の安定性
CBHIセルラーゼ変異体は上記の要領（例2及び3参照のこと）で、クローン及び発現した。野生型Cel7A及び変異体は、その後、カラムクロマトグラフィーによりこれらの培地の細胞のない上澄みから生成された。タンパク質は疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて精製された。カラムは、Applied Biosystems社によるPoros(登録商標) 20 HP2樹脂を用いた BioCAD(登録商標) Sprint Perfusion Chromatography Systemに取り付けられた。
【０２３９】
HLCカラムは、5カラム容積の0.020 Mのリン酸ナトリウム、0.5M硫酸アンモニウム、pH6.8で平衡化した。硫酸アンモニウムは最終濃度が約0.5Mになるように上澄液に添加され、pHは6.8に調製された。濾過の後に、上澄み液はカラムに取り込まれた。取り込みの後、カラムは10カラム容積の平衡化緩衝液で洗浄され、それから0.02Mのリン酸ナトリウムpH6.8において、0.5M硫酸アンモニウムから0の硫酸アンモニウムまでの10のカラム体積勾配によって溶離された。Cel7Aは中間勾配あたりで溶離された。分画液は、還元SDS-PAGEゲル解析法に基づいて収集、貯蔵された。
【０２４０】
融解点は、Luo, et al., Biochemistry 34: 10669 及び Gloss, et al., Biochemistry 36: 5612の方法により決定された。 Sandgren at al. (2003) Protein Science 12 (4) pp848も参照のこと。
【０２４１】
データはAviv 215円偏光二色性分光光度計について収集された。210と260ナノメートルの間の変異体のネイティブのスペクトルは25℃で取られた。緩衝液条件はpH5.5の50mMビストリスプロパン/50mM酢酸アンモニウム/氷酢酸であった。タンパク質濃度は0.25と0.5のmgs/mLの間に保持された。モニターするための最適波長を決定した後、サンプルは、同じ緩衝液条件の下で25℃から75℃までに温度傾斜により熱変性された。データは2℃間隔で5秒間収集された。部分的な不可逆的変性は0.1センチメートルの軌道セルの中の230ナノメートル波長でモニターされた。一方,75℃では、上で説明したように、折りたたまれた状態のスペクトルが収集された。このサンプルは、その後再び折りたたまれた状態のスペクトルを収集するために、25℃に冷やされた。230nmの3つのスペクトルの違いは、変異体可逆性を評価するために使われた。
【０２４２】
野性型CBH I及び様々な変異体CBHIsの熱変性の概要を、図9Aと9Bに示す。また、表４も参照のこと。
【表４】
【０２４３】
【０２４４】
以上言及した本発明の方法及びシステムに関し、本発明の範囲及び精神を逸脱することなく種々の改良や改変を行うはことは、当業者にとって自明のことである。本発明の特定の好ましい実施態様に関連して本発明を説明してきたが、本発明は当該特定の実施態様に過度に限定されるものではないことは当然のことである。従って、分子生物学の分野及び関連分野の当業者に明らかであるような本発明を実施するための前述の方法に関する種々の変更は本発明の範囲内に含まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【０２４５】
【図１】図1は、H.ジェコリーナ由来野生型Cel7A（CBH I）の核酸配列（下列；SEQ ID NO: 1）及びアミノ酸配列（上列；SEQ ID NO: 2）である。
【図２】図2は、H.ジェコリーナCBH Iの三次構造である。
【図３Ａ】図3Aは、入手可能な結晶構造があるセル7ファミリーメンバーのアミノ酸配列を示す。配列は以下の通りである：20VW-Fusarium oxysporum Cel7B, 1A39-Humicola insolens Cel7B, 6CEL-Hypocrea jecorina Cel7A, 1 EG1- Hypocrea jecorina Cel7B。
【図３Ｂ】図3Bは、入手可能な結晶構造があるセル7ファミリーメンバーのアミノ酸配列を示す。配列は以下の通りである：20VW-Fusarium oxysporum Cel7B, 1A39-Humicola insolens Cel7B, 6CEL-Hypocrea jecorina Cel7A, 1 EG1- Hypocrea jecorina Cel7B。
【図４】図４は、ここで説明された配列が重層された4のCel7相同体の触媒領域からなる結晶構造である。
【図５Ａ】図5Aは、8の単残基変異、及び5の重複変異の変異体についての核酸配列及び予想されるアミノ酸配列である。
【図５Ｂ】図5Bは、8の単残基変異、及び5の重複変異の変異体についての核酸配列及び予想されるアミノ酸配列である。
【図５Ｃ】図5Cは、8の単残基変異、及び5の重複変異の変異体についての核酸配列及び予想されるアミノ酸配列である。
【図５Ｄ】図5Dは、8の単残基変異、及び5の重複変異の変異体についての核酸配列及び予想されるアミノ酸配列である。
【図５Ｅ】図5Eは、8の単残基変異、及び5の重複変異の変異体についての核酸配列及び予想されるアミノ酸配列である。
【図５Ｆ】図5Fは、8の単残基変異、及び5の重複変異の変異体についての核酸配列及び予想されるアミノ酸配列である。
【図５Ｇ】図5Gは、8の単残基変異、及び5の重複変異の変異体についての核酸配列及び予想されるアミノ酸配列である。
【図５Ｈ】図5Hは、8の単残基変異、及び5の重複変異の変異体についての核酸配列及び予想されるアミノ酸配列である。
【図５Ｉ】図5Iは、8の単残基変異、及び5の重複変異の変異体についての核酸配列及び予想されるアミノ酸配列である。
【図５Ｊ】図5Jは、8の単残基変異、及び5の重複変異の変異体についての核酸配列及び予想されるアミノ酸配列である。
【図５Ｋ】図5Kは、8の単残基変異、及び5の重複変異の変異体についての核酸配列及び予想されるアミノ酸配列である。
【図５Ｌ】図5Lは、8の単残基変異、及び5の重複変異の変異体についての核酸配列及び予想されるアミノ酸配列である。
【図５Ｍ】図5Mは、8の単残基変異、及び5の重複変異の変異体についての核酸配列及び予想されるアミノ酸配列である。
【図６Ａ】図6Aは、pTEXの核酸配列である。
【図６Ｂ】図6Bは、pTEXの核酸配列である。
【図６Ｃ】図6Cは、pTEXの核酸配列である。
【図６Ｄ】図6Dは、pTEXの核酸配列である。
【図７Ａ】図7Aは、プラスミドpTEX発現の構造を表している。
【図７Ｂ】図7Bは、プラスミドpTEX発現の構造を表している。
【図８Ａ−１】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ａ−２】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｂ−１】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｂ−２】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｃ−１】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｃ−２】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｄ−１】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｄ−２】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｅ−１】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｅ−２】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｆ−１】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｆ−２】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｇ−１】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｇ−２】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｈ−１】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｈ−２】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｉ−１】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｉ−２】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｊ−１】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｊ−２】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｋ−１】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図８Ｋ−２】図8は、Cel7ファミリーの42メンバー全てのアミノ酸配列である。
【図９Ａ】図9Aは、野生型、8の単一残査変異体の熱特性を示している。
【図９Ｂ】図9Bは、野生型及び5つの変異体の熱特性を示している。図9-Bの凡例において、Cel7A は wild-type H. jecorina CBH I ; N301 K は N301 K 変異体; 334 はP227L 変異体; 340 は S8P/N49S/A68T/S113N 変異体;350 はS8P/N49S/A68T/S113N/P227L 変異体; 及び 363 はS8P/G22D/T41 I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P 変異体を示す。
【図１０】図10はpRAX1ベクターである。このベクターは、2Aspergillus nidulans ゲノム DNA 断片であるAMA1 配列 (Molecular Microbiology 1996 19: 565-574)の5259bpのHind III断片を除いたpGAPTプラスミドが挿入されている。1-1134塩基はAspergillus nigerのグルコアミラーゼ遺伝子プロモーターである。3098-3356塩基及び4950-4971塩基はAspergillus nigerのグルコアミラーゼターミネーター（終了配列）である。Aspergillus niger pyrG遺伝子は3357-4949に形質転換のマーカーとして挿入された。（この部位には）遺伝子に挿入される多重クローニング部位がある。
【図１１】図11は、pRAXdes2ベクターの構成である。このベクターはプラスミドベクターpRAX1に基づくものである。ゲートウェイカセットがpRAX1ベクターに挿入されている（環状プラスミドの内部矢印により示される）。このカセットは組み替え配列attR1 及び attR2 と 選択マーカー catH 及び ccdBを含んでいる。このベクターはGatewayTM Cloning Technology: version 1 page 34-38に記載の方法により作成され、インビトロジェン（Invitrogen）により供給されるE.Coli DB3.1内でのみ複製することができる。；他のE.Coli内においては、ccbB遺伝子は致死する。最初のPCRフラグメントは、attB1/2組み変え配列を含むプライマーを用いて作成された。このフラグメントはpDONR201(インビトロジェンから市販されている)と組み換えられ；このベクターはattB1/2組み変え配列とcatH、ccbBを組み替え部位内に含む。インビトロゲンからのBP clonase酵素は、このいわゆるENTRYベクターの中でPCR破片を組み換えさせるために使われ、ccdBを表現しているクローンが生き残らないので、挿入されたPCR破片を持つクローンは50pg/mlカナマイシンで選択することができる。 att配列は変更されて、attL1とattL2と呼ばれる。 第二段階は、このクローンをpRAXdes2ベクター(組み換え部位の間のcontaining attR1とattR2 catHとccdB)と組み替えさせることである。窒素からのLR clonase酵素は、目的とするベクターの中でENTRYベクターからのインサートを組み換えさせるために使われる。窒素からのLR clonase酵素は、ベクターの中でENTRYベクターからの挿入を組み替えさせるために使われる。ccdBが致死なので、OnlypRAXCBH1ベクターは100、ug/mlアンピシリンを用いて選択され、ENTRYベクターはアンピシリンに敏感である。この方法によって、発現ベクターは調製され、形質転換されたA. niger を使用することができる。
【図１２】図12は、アスペルギルス属の中でCBH 1変異体をエンコードしている核酸の表現のために使われたpRAXdes2cbh1ベクターの説明を提供する。CBH1酵素相同体または変異体をエンコードしている核酸はベクターの中にatt配列の相同的組み換えによってクローン技術で生み出された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイポクレアジェコリーナ(SEQ ID NO: 2)由来CBH Iにおける残基S8, Q17, G22, T41, N49, S57, N64, A68, A77, N89, S92, N103, A112, S113, E193, S196, M213, L225, T226, P227, T246, D249, R251, Y252, T255, D257, D259, S278, S279, K286, L288, E295, T296, S297, A299, N301, E325, T332, F338, S342, F352, T356, Y371, T380, Y381, V393, R394, S398, V403,S411, G430, G440, T445, T462, T484, Q487, and P491の1以上の対応する位置における置換又は欠失から成るCBH Iセルラーゼ変異体。
【請求項２】
ハイポクレアジェコリーナ由来(SEQ ID NO: 2) CBH Iにおける残基S8P, Q17L, G22D,T411, N49S, S57N, N64D, A68T, A77D, N89D, S92T, N1031, A112E, S113 (T/N/D), E193V, S196T, M2131, L225F, T226A, P227(L/T/A), T246 (C/A), D249K, R251A, Y252 (A/Q), T255P, D257E, D259W, S278P, S279N, K286M, L288F, E295K, T296P, S297T, A299E, N301(R/K), E325K, T332 (K/Y/H), F338Y, S342Y, F352L, T356L, Y371C, T380G, Y381D, V393G, R394A, S398T, V403D, S411F, G430F, G440R, T4621, T484S, Q487L及び/又は P491の1以上の対応する位置における置換から成る請求項1のCBH Iセルラーゼ変異体。
【請求項３】
ハイポクレアジェコリーナ由来(SEQ ID NO: 2)CBH Iにおける残基T445の対応する位置における1の欠失をさらに構成する請求項2のCBH Iセルラーゼ変異体。
【請求項４】
ハイポクレアジェコリーナ由来(SEQ ID NO: 2)CBH Iにおける残基S8P, N49S, A68T, A77D, N89D, S92T, S113 (N/D), L225F, P227 (A/L/T), D249K, T255P, D257E, S279N, L288F, E295K, S297T, A299E, N301 (R/K), T332 (K/Y/H), F338Y, T356L, V393G, G430Fからなる群より選択される残基に対応する位置における1の置換から成るCBH Iセルラーゼ変異体。
【請求項５】
ハイポクレアジェコリーナ由来(SEQ ID NO: 2)CBH Iにおける
xl. A112E/T226A;
xli. S196T/S411F;
xlii. E295K/S398T;
xliii. T246C/Y371C;
xliv. V403D/T462I
xlv. T41I plus deletion at T445
xlvi. A68T/G440R/P491L;
xlvii. G22D/S278P/T296P;
xlviii. T246A/R251A/Y252A;
xlix. T380G/Y381D/R394A;
l. Y252Q/D259W/S342Y;
li. S113T/T255P/K286M;
lii. P227L/E325K/Q487L;
liii. P227T/T484S/F352L;
liv. Q17L/E193V/M213I/F352L;
Iv. S8P/N49S/A68T/S113N;
Ivi. S8P/N49S/A68T/S113N/P227L;
Ivii. T41I/A112E/P227L/S278P/T296P;
Iviii. S8P/N49S/A68T/A112E/T226A;
lix. S8P/N49S/A68T/A112E/P227L;
lx. S8P/T41I/N49S/A68T/A112E/P227L;
Ixi. G22D/N49S/A68T/P227L/S278P/T296P;
lxii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P;
lxiii. G22D/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P;
lxiv. G22D/N49S/A68T/N103I/A112E/P227L/S278P/T296P;
Ixv. G22D/N49S/N64D/A68T/N103I/S113N/S278P/T296P;
lxvi. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P;
Ixvii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P/N301R;
Ixviii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P
/N301R;
lxix. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/N301
R;
lxx. S8P/T41I/N49S/S57N/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/N301
R;
Ixxi. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/N301R;
lxxii. S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/V403D/T462I;
lxxiii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/V403D/T462I;
lxxiv. S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/S411F;
lxxv. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/S411F;
lxxvi. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P/
S278P/T296P/N301R/E325K/S411F;
Ixxvii. S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P/S278P
/T296P/N301R/E325K/V403D/S411F/T462I;
Ixxviii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P/
S278P/T296P/N301R/E325K/V403D/S411F/T462I;
から成る群より選択された突然変異体から本質的に成るCBH Iセルラーゼ変異体。
【請求項６】
請求項1に記載した変異体CBH Iをエンコードしている核酸。
【請求項７】
請求項4に記載した変異体CBH Iをエンコードしている核酸。
【請求項８】
請求項5に記載した変異体CBH Iをエンコードしている核酸。
【請求項９】
請求項6の変異体CBH Iをエンコードしている核酸からなるベクター。
【請求項１０】
請求項7の変異体CBH Iをエンコードしている核酸からなるベクター。
【請求項１１】
請求項8の変異体CBH Iをエンコードしている核酸からなるベクター。
【請求項１２】
請求項9のベクターにより形質転換させられた宿主細胞。
【請求項１３】
請求項10のベクターにより形質転換させられた宿主細胞。
【請求項１４】
請求項11のベクターにより形質転換させられた宿主細胞。
【請求項１５】
（a）CBH Iを生産するために適切な条件下で適切な培養培地内において請求項12に記載した宿主細胞を培養するステップと、
（b）前記生産されたCBH I変異体を獲得するステップと、
から成る変異体CBH Iの生産方法。
【請求項１６】
（a）CBH Iを生産するために適切な条件下で適切な培養培地内において請求項13に記載した宿主細胞を培養するステップと、
(b) 前記生産されたCBH I変異体を獲得するステップと、
から成る変異体CBH Iの生産方法。
【請求項１７】
（a）CBH Iを生産するために適切な条件下で適切な培養培地内において請求項14に記載した宿主細胞を培養するステップと、
(b) 前記生産されたCBH I変異体を獲得するステップと、
から成る変異体CBH Iの生産方法。
【請求項１８】
請求項1に記載したCBH I変異体から成るCBH I変異体及び界面活性剤から構成される洗浄剤組成物。
【請求項１９】
前記洗浄剤が洗濯用洗浄剤である請求項18の洗浄剤組成物。
【請求項２０】
前記洗浄剤が食器用洗浄剤である請求項18の洗浄剤組成物。
【請求項２１】
請求項1に記載したCBH Iから成る食品添加物。
【請求項２２】
木材パルプと請求項1のCBH I変異体を接触させることを含む木材パルプの処理方法。
【請求項２３】
バイオマスと請求項1のCBH I変異体を接触させることを含むバイオマスを糖へ転化する方法。
【請求項１】
ハイポクレアジェコリーナ(SEQ ID NO: 2)由来CBH Iにおける残基S8, Q17, G22, T41, N49, S57, N64, A68, A77, N89, S92, N103, A112, S113, E193, S196, M213, L225, T226, P227, T246, D249, R251, Y252, T255, D257, D259, S278, S279, K286, L288, E295, T296, S297, A299, N301, E325, T332, F338, S342, F352, T356, Y371, T380, Y381, V393, R394, S398, V403,S411, G430, G440, T445, T462, T484, Q487, and P491の1以上の対応する位置における置換又は欠失から成るCBH Iセルラーゼ変異体。
【請求項２】
ハイポクレアジェコリーナ由来(SEQ ID NO: 2) CBH Iにおける残基S8P, Q17L, G22D,T411, N49S, S57N, N64D, A68T, A77D, N89D, S92T, N1031, A112E, S113 (T/N/D), E193V, S196T, M2131, L225F, T226A, P227(L/T/A), T246 (C/A), D249K, R251A, Y252 (A/Q), T255P, D257E, D259W, S278P, S279N, K286M, L288F, E295K, T296P, S297T, A299E, N301(R/K), E325K, T332 (K/Y/H), F338Y, S342Y, F352L, T356L, Y371C, T380G, Y381D, V393G, R394A, S398T, V403D, S411F, G430F, G440R, T4621, T484S, Q487L及び/又は P491の1以上の対応する位置における置換から成る請求項1のCBH Iセルラーゼ変異体。
【請求項３】
ハイポクレアジェコリーナ由来(SEQ ID NO: 2)CBH Iにおける残基T445の対応する位置における1の欠失をさらに構成する請求項2のCBH Iセルラーゼ変異体。
【請求項４】
ハイポクレアジェコリーナ由来(SEQ ID NO: 2)CBH Iにおける残基S8P, N49S, A68T, A77D, N89D, S92T, S113 (N/D), L225F, P227 (A/L/T), D249K, T255P, D257E, S279N, L288F, E295K, S297T, A299E, N301 (R/K), T332 (K/Y/H), F338Y, T356L, V393G, G430Fからなる群より選択される残基に対応する位置における1の置換から成るCBH Iセルラーゼ変異体。
【請求項５】
ハイポクレアジェコリーナ由来(SEQ ID NO: 2)CBH Iにおける
xl. A112E/T226A;
xli. S196T/S411F;
xlii. E295K/S398T;
xliii. T246C/Y371C;
xliv. V403D/T462I
xlv. T41I plus deletion at T445
xlvi. A68T/G440R/P491L;
xlvii. G22D/S278P/T296P;
xlviii. T246A/R251A/Y252A;
xlix. T380G/Y381D/R394A;
l. Y252Q/D259W/S342Y;
li. S113T/T255P/K286M;
lii. P227L/E325K/Q487L;
liii. P227T/T484S/F352L;
liv. Q17L/E193V/M213I/F352L;
Iv. S8P/N49S/A68T/S113N;
Ivi. S8P/N49S/A68T/S113N/P227L;
Ivii. T41I/A112E/P227L/S278P/T296P;
Iviii. S8P/N49S/A68T/A112E/T226A;
lix. S8P/N49S/A68T/A112E/P227L;
lx. S8P/T41I/N49S/A68T/A112E/P227L;
Ixi. G22D/N49S/A68T/P227L/S278P/T296P;
lxii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P;
lxiii. G22D/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P;
lxiv. G22D/N49S/A68T/N103I/A112E/P227L/S278P/T296P;
Ixv. G22D/N49S/N64D/A68T/N103I/S113N/S278P/T296P;
lxvi. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P;
Ixvii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P/N301R;
Ixviii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P
/N301R;
lxix. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/N301
R;
lxx. S8P/T41I/N49S/S57N/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/N301
R;
Ixxi. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/N301R;
lxxii. S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/V403D/T462I;
lxxiii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/V403D/T462I;
lxxiv. S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/S411F;
lxxv. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/S411F;
lxxvi. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P/
S278P/T296P/N301R/E325K/S411F;
Ixxvii. S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P/S278P
/T296P/N301R/E325K/V403D/S411F/T462I;
Ixxviii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P/
S278P/T296P/N301R/E325K/V403D/S411F/T462I;
から成る群より選択された突然変異体から本質的に成るCBH Iセルラーゼ変異体。
【請求項６】
請求項1に記載した変異体CBH Iをエンコードしている核酸。
【請求項７】
請求項4に記載した変異体CBH Iをエンコードしている核酸。
【請求項８】
請求項5に記載した変異体CBH Iをエンコードしている核酸。
【請求項９】
請求項6の変異体CBH Iをエンコードしている核酸からなるベクター。
【請求項１０】
請求項7の変異体CBH Iをエンコードしている核酸からなるベクター。
【請求項１１】
請求項8の変異体CBH Iをエンコードしている核酸からなるベクター。
【請求項１２】
請求項9のベクターにより形質転換させられた宿主細胞。
【請求項１３】
請求項10のベクターにより形質転換させられた宿主細胞。
【請求項１４】
請求項11のベクターにより形質転換させられた宿主細胞。
【請求項１５】
（a）CBH Iを生産するために適切な条件下で適切な培養培地内において請求項12に記載した宿主細胞を培養するステップと、
（b）前記生産されたCBH I変異体を獲得するステップと、
から成る変異体CBH Iの生産方法。
【請求項１６】
（a）CBH Iを生産するために適切な条件下で適切な培養培地内において請求項13に記載した宿主細胞を培養するステップと、
(b) 前記生産されたCBH I変異体を獲得するステップと、
から成る変異体CBH Iの生産方法。
【請求項１７】
（a）CBH Iを生産するために適切な条件下で適切な培養培地内において請求項14に記載した宿主細胞を培養するステップと、
(b) 前記生産されたCBH I変異体を獲得するステップと、
から成る変異体CBH Iの生産方法。
【請求項１８】
請求項1に記載したCBH I変異体から成るCBH I変異体及び界面活性剤から構成される洗浄剤組成物。
【請求項１９】
前記洗浄剤が洗濯用洗浄剤である請求項18の洗浄剤組成物。
【請求項２０】
前記洗浄剤が食器用洗浄剤である請求項18の洗浄剤組成物。
【請求項２１】
請求項1に記載したCBH Iから成る食品添加物。
【請求項２２】
木材パルプと請求項1のCBH I変異体を接触させることを含む木材パルプの処理方法。
【請求項２３】
バイオマスと請求項1のCBH I変異体を接触させることを含むバイオマスを糖へ転化する方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図５Ｇ】
【図５Ｈ】
【図５Ｉ】
【図５Ｊ】
【図５Ｋ】
【図５Ｌ】
【図５Ｍ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ−１】
【図８Ａ−２】
【図８Ｂ−１】
【図８Ｂ−２】
【図８Ｃ−１】
【図８Ｃ−２】
【図８Ｄ−１】
【図８Ｄ−２】
【図８Ｅ−１】
【図８Ｅ−２】
【図８Ｆ−１】
【図８Ｆ−２】
【図８Ｇ−１】
【図８Ｇ−２】
【図８Ｈ−１】
【図８Ｈ−２】
【図８Ｉ−１】
【図８Ｉ−２】
【図８Ｊ−１】
【図８Ｊ−２】
【図８Ｋ−１】
【図８Ｋ−２】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図５Ｇ】
【図５Ｈ】
【図５Ｉ】
【図５Ｊ】
【図５Ｋ】
【図５Ｌ】
【図５Ｍ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ−１】
【図８Ａ−２】
【図８Ｂ−１】
【図８Ｂ−２】
【図８Ｃ−１】
【図８Ｃ−２】
【図８Ｄ−１】
【図８Ｄ−２】
【図８Ｅ−１】
【図８Ｅ−２】
【図８Ｆ−１】
【図８Ｆ−２】
【図８Ｇ−１】
【図８Ｇ−２】
【図８Ｈ−１】
【図８Ｈ−２】
【図８Ｉ−１】
【図８Ｉ−２】
【図８Ｊ−１】
【図８Ｊ−２】
【図８Ｋ−１】
【図８Ｋ−２】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２００６−５１５５０６（Ｐ２００６−５１５５０６Ａ）
【公表日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５２９４７０（Ｐ２００４−５２９４７０）
【出願日】平成１５年８月１５日（２００３．８．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２５６２５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０１６７６０
【国際公開日】平成１６年２月２６日（２００４．２．２６）
【出願人】（５００２８４５８０）ジェネンコー・インターナショナル・インク (67)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年８月１５日（２００３．８．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２５６２５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０１６７６０
【国際公開日】平成１６年２月２６日（２００４．２．２６）
【出願人】（５００２８４５８０）ジェネンコー・インターナショナル・インク (67)
【Ｆターム（参考）】
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