新規なヘクサペプチドおよび活性化酸素阻害剤
【課題】活性化酸素阻害作用を有する新規なヘクサペプチド及びそのヘクサペプチドを有効成分として含有し、毒性がきわめて低く、安全性がきわめて高い、新規な活性化酸素阻害剤を提供することを課題とする。
【解決手段】次式；Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ
で示されるＬ体のアミノ酸配列によるペプチド構造を有する新規なヘクサペプチド、及びそのヘクサペプチドを有効成分として含有する活性化酸素阻害剤。このヘクサペプチドは鰻骨のタンパク質分解酵素の分解液から精製分離するか又は合成法によって製することができる。
【解決手段】次式；Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ
で示されるＬ体のアミノ酸配列によるペプチド構造を有する新規なヘクサペプチド、及びそのヘクサペプチドを有効成分として含有する活性化酸素阻害剤。このヘクサペプチドは鰻骨のタンパク質分解酵素の分解液から精製分離するか又は合成法によって製することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品としての有用性を有し、新規なアミノ酸配列によるペプチド構造を有するヘクサペプチドを有効成分とする活性化酸素阻害剤に関する。本発明に係るヘクサペプチドは、鰻骨のタンパク質分解酵素の分解液から分離精製することができ、又、合成法によって製することも可能である。
【背景技術】
【０００２】
一般に、食品由来のペプチドは、活性化酸素阻害剤としての利点を有する。すなわち、従来、天然物又は天然物由来の活性化酸素阻害剤に関しては、以下の文献に開示されている。
【特許文献１】 特開平０６−１２８１６８号公報
【特許文献２】 特開平０８−００９８９２号公報
【特許文献３】 特開平０９−０５９２９７号公報
【特許文献４】 特開平０９−１５７２９１号公報
【特許文献５】 特開平０９−１５７２９２号公報
【特許文献６】 特開平１１−０３５５９８号公報
【特許文献７】 特開平１１−０３５５９９号公報
【特許文献８】 特開平１１−２９２８９７号公報
【非特許文献１】ＭｃＣｏｒｄ，Ｊ．Ｍ．＆Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ，Ｉ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４４，６０４９（１９６９）
【非特許文献２】山口等、ニューフードインダストリー、３１巻、１８−２２頁（１９８９年）
【非特許文献３】拓殖等、日本農芸化学会誌，６５巻，１６３５頁（１９９１年）
【非特許文献４】陳等、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，４６卷，４９頁（１９９８年）
【非特許文献５】工藤等、日本食品科学工学会誌，４８巻，４４頁（２００１年）
【非特許文献６】受田等、日本農芸化学会誌，７２巻，１１８１頁（１９９８年）
【０００３】
活性化酸素が関与する疾病は、火傷、関節炎などの炎症、再環流障害、抗癌剤の副作用、放射線障害、消化性潰瘍、細菌性ショック、悪液質、自己免疫疾患など幅広く存在する。好中球やマクロファージなどの活性化によって、発生する大量の活性化酸素が引き起こす疾患は、すべて対象となる。一般に、酸素には動物に必須の酸素（三重項酸素分子：３Ｏ２）と、特定の条件あるいは体の不調時に生じるラジカル（活性化酸素）とが存在する。ラジカルは直接又は間接的（過酸化反応という形で）に細胞膜、細胞内顆粒膜、あるいはＤＮＡをはじめ種々の細胞成分を変質、損傷させたりする。このラジカルは体内で生産され、その種類はスーパーオキシドアニオン（−Ｏ２・）、一重項酸素（１Ｏ２・）、水酸化ラジカル（・ＯＨ）等が存在する。このうちスーパーオキシドアニオン（−Ｏ２・）は細胞膜の不飽和脂肪酸等に作用して過酸化反応を引き起こし、脂質に対する酸化力は動物に必須な酸素の数千倍も高いといわれている。活性化酸素阻害剤としてのスーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯＤ、酵素番号ＥＣ１．１５．１．１）は、１９６９年マクコルドら［非特許文献１］によってその作用が発見された酵素であり、酸素分子が一電子還元されて生じるスーパーオキシドアニオン（−Ｏ２・）を不均化する
２−Ｏ２・＋２Ｈ＋→ Ｈ２Ｏ２＋Ｏ２
を触媒する。人体が正常なときにはＳＯＤが働いてスーパーオキシドアニオンの発生を抑えている。このＳＯＤ活性は加齢と共に低下し、即ち壮年期から老年期になると活性が低下し、ＳＯＤ活性の増減は生体の老化、癌化のバロメーターともいわれている。このようなＳＯＤ活性が低下するとラジカルの発生は抑えにくくなりＳＯＤを摂取補強するか、又はラジカルを捕捉除去する活性化酸素阻害剤の摂取が必要となってくる。
【０００４】
一方、水溶性の抗酸化剤としてのアミノ酸から蛋白質にいたるポリペプチドの活性化酸素阻害作用は、油脂をペプチド類が包み込むことにより酸素分子と不飽和脂肪酸の接触を阻害し、脂質ペルオキシラジカル（ＬＯＯ・）の発生を抑制すると考えられており、ＢＨＡ（ブチルヒドロキシルアニソール）及びＢＨＴ（ジブチルヒドロキシトルエン）の抗酸化作用のように、油脂（Ｌ）の酸化の際に生じるラジカル（ＬＯＯ・）に作用して、酸化の連鎖反応を停止させるラジカル捕捉作用とは区別している。
ＬＯＯ・＋ＡＨ２ →ＬＯＯＨ＋ＡＨ・
２ＡＨ・→２ＡＨ２＋Ａ 又は ＬＯＯ・＋ＡＨ・→ＬＯＯＨ＋Ａ
（ＡＨ２；抗酸化剤）
【０００５】
今日、抗癌、老化防止に対する特効薬がない状況で、環境中からＤＮＡ損傷因子、突然変異因子、発癌因子、老化因子等を取り除き不活性化し、活性化酸素フリーラジカル消去作用並びに抗酸化作用を示す活性化酸素阻害剤に関する研究や検討が進められている。一方、水溶性の抗酸化剤として、アミノ酸から蛋白質に至るポリペプチドのアミノ酸配列と抗酸化力に関する知見は極めて少なく、山口ら［非特許文献２］は、ジペプチドがアミノ酸や蛋白質よりも抗酸化力が強いことを示しており、又、最近、拓殖ら［非特許文献３］がＡｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ，ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ，Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎを、陳ら［非特許文献４］がＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ他５種類の抗酸化ペプチドを，工藤ら［非特許文献５］がＡｌａ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔを報告している。これに対し、発明者らはカテキン類［特許文献１］及び活性化酸素消去ペプチド（抗酸化ペプチド）［特許文献２〜８］等を数多く報告してきているが、これら活性化酸素フリーラジカル消去作用並びに抗酸化作用等を有する活性化酸素阻害剤が、未だ医薬品として開発が進んでいるとの報告はない。
【０００６】
これまで、活性化酸素阻害剤としてのＳＯＤはその製造が困難であり又原料の入手に制限があり、ビタミンＥ、ビタミンＣ、カテキン・フラボノイド及びペプチド類等は、生体を用いた実験では活性化酸素阻害作用が十分でない等の難点があり、又、活性化酸素フリーラジカル消去作用並びに抗酸化作用を示す活性化酸素阻害剤の多くは、その殆どが化学合成で製造されたものであり、たとえ植物や動物からの材料を用いた天然物由来のものであっても、その製造過程で人体に害を及ぼす化学物質を用い、生成物の一部を化学物質と反応させて作られたものが多い。このような背景のもと、更に強力な作用を有する活性化酸素阻害剤が要望されている。
【０００７】
上記の状況に鑑み、本発明者は、活性化酸素阻害作用を有すると共に、安全で、実用に供し得る新規ペプチドについて鋭意研究した結果、鰻骨のタンパク質分解酵素の分解液から得られた特定アミノ酸配列構造のヘクサペプチドが活性化酸素阻害作用を奏することを見いだした。又、この鰻骨由来のヘクサペプチドと同じアミノ酸配列のヘクサペプチドを合成法によって製したところ、鰻骨由来のヘクサペプチドと同様、活性化酸素阻害作用を有することが解明されたので、これを有効成分とする活性化酸素阻害剤を開発することができ、本発明を完成するに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、活性化酸素阻害剤を有する新規なヘクサペプチド及びそのヘクサペプチドを有効成分として含有し、毒性がきわめて低く、安全性がきわめて高い、新規な活性化酸素阻害剤を提供することを課題とする。
【問題が解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するための発明のうち、請求項１に記載する発明は、
次式；Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なヘクサペプチドである。（式中、アミノ酸残基を表す各記号は、アミノ酸化学において慣用の表示法によるものである。）
又、本発明のうち、請求項２に記載する発明は、
次式；Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有するヘクサペプチドを有効成分として含有することを特徴とする活性化酸素阻害剤である。である。（式中、アミノ酸残基を表す各記号は、アミノ酸化学において慣用の表示法によるものである。）
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る請求項１に記載のヘクサペプチド（以下「本発明のヘクサペプチド」という。）は、優れた活性化酸素フリーラジカル消去作用並びに抗酸化作用を有し、活性化酸素阻害作用を示す。従って、本発明に係る請求項２に記載の活性化酸素阻害剤（以下「本発明の活性化酸素阻害剤」という。）は、これら組織障害を引き起こす過剰な活性酸素を分解して組織を守る作用を持つことから、例えば抗炎症剤として、関節炎やリュウマチなどに有効であるほか、ベーチュット病、心筋梗塞等に対しても有用である。
尚、この新規なヘクサペプチドは、構造的にそのアミノ酸配列を部分構造とするペプチドにおいて、構造中に採用することもできる。
【００１１】
又、本発明のヘクサペプチドは、静脈内への繰り返し投与を行った場合、抗体産生を惹起せず、アナフィラキシーショックを起こさない。更に、本発明のヘクサペプチドは、Ｌ−アミノ酸のみの配列構造からなり、投与後、生体内のプロテアーゼにより徐々に分解される為、毒性は極めて低く、安全性は極めて高い（ＬＤ５０＞５０００ｍｇ／ｋｇ：ラット経口投与）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のヘクサペプチドは、次式；Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎで示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なヘクサペプチドであり、常温における性状は、白色の粉末である。
本発明のヘクサペプチドは、化学的に合成する方法または魚介類の骨、特に鰻骨のタンパク質分解酵素の分解液から分離精製する方法によって得ることができる。
【００１３】
本発明のヘクサペプチドを化学的に合成する場合には、液相法又は固相法等の通常のペプチド合成法によって行なうことができるが、好ましくは、固相法によってポリマー性の固相支持体へ前記ヘクサペプチドのカルボキシル末端側（グルタミン）からそのアミノ酸残基に対応したＬ体のアミノ酸を、順次ペプチド結合によって結合していくのがよい。そして、そのようにして得られた合成ヘクサペプチドは、トリフルオロメタンスルホン酸、フッ化水素等を用いてポリマー性の固相支持体から切断した後、アミノ酸側鎖の保護基を除去し、逆相系のカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（以下「ＨＰＬＣ」と略記する。）等を用いた通常の方法で精製することができる。
【００１４】
又、本発明のヘクサペプチドは、上記のとおり、鰻骨のタンパク質分解酵素の分解液から分離精製することができるが、その場合には、例えば、以下のようにして行うことができる。まず、鰻骨を用いて加水分解する。加水分解は常法に従って行うことでよい。例えば、ペプシン等のタンパク質分解酵素で加水分解する場合は、鰻骨のホモジネイトを必要に応じて更に加水分解した後、酵素の至適温度まで加温し、ｐＨを至摘値に調整し、酵素を加えてインキュベートする。次いで必要に応じて中和した後、酵素を失活させて加水分解液を得る。その加水分解液を濾紙及び／又はセライト等を用いて濾過することによって不溶性成分を除去し、得られた濾液をセロファン等の半透膜を用いて適当な溶媒（例えば、水、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液の中性の緩衝液等）中で充分に透析し、その濾液中の成分で半透膜を通過した成分を含む溶液を強酸性陽イオン交換樹脂（例えば、ダウケミカル社製のＤｏｗｅｘ ５０Ｗ、アンバーライト社製のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ−１２０等）にかけ、その吸着溶出画分から活性化酸素阻害活性を有する成分を含有する画分を得、その得られた活性化酸素阻害活性画分をゲルろ過（例えば、ファルマシア社製のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、バイオラッド社製のＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−６等）によって分画し、その得られた活性化酸素阻害活性画分を陽イオン交換ゲル濾過（例えば、ファルマシア社製のＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５等）によって分画し、最終的に得られた活性化酸素阻害活性画分を更に逆相ＨＰＬＣによって分画することによって単離精製を行うことができる。
【００１５】
本発明のヘクサペプチドの製法においては、魚介類骨としては、本発明の課題を達成できる限り、いかなる魚介類の骨を用いてもよいが、好ましくは鰻骨を用いるのがよい。
【００１６】
本発明の活性化酸素阻害剤は、通常用いられる賦形剤等の添加物を用いて注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤又は散剤等に調製することができる。これらの各種製剤において用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤又は潤沢剤の種類は、特に限定されず、通常の注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤又は散剤に用いられるものを使用することができる。賦形剤としては、結晶セルロース等の糖類、マンニトール等の糖アルコール類、でんぷん類、無水リン酸カルシウム等、結合剤としては、でんぷん類、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等を、崩壊剤としては、カルボキシメチルセルロース及びそのカリウム塩類を、潤沢剤としては、ステアリン酸及びその塩類、タルク、ワックス類をあげることができる。又、製剤の調整にあたっては、必要に応じ、メントール、クエン酸及びその塩類、香料等の矯臭剤を用いることができる。注射用の無菌組成物は、常法により、本発明のヘクサペプチドを、注射用水、生理食塩水及びキシリトールやマンニトール等の糖アルコール注射液、プロピレングリコールやポリエチレングリコール等のグリコールに溶解又は懸濁させて注射剤とすることができる。この際、緩衝液、防腐剤、酸化防止剤等を必要に応じて添加することができる。本発明のヘクサペプチドを含有する製剤は、凍結乾燥品又は乾燥粉末の形とし、用時、通常の溶解剤、例えば水又は生理食塩水に溶解して用いることもできる。
【００１７】
本発明の活性化酸素阻害剤の投与方法としては、通常は、ＳＯＤが欠乏している哺乳類（例えば、ヒト、イヌ、ラット等）に注射すること、あるいは経口投与することがあげられる。投与量は、例えば、動物体重１ｋｇ当たり 本発明の活性化酸素阻害剤０．０１〜１０ｍｇの量が適当である。投与回数は、通常、１日１〜４回程度であるが、投与経路によって、適宜調整することができる。
【００１８】
以下、実施例及び試験例をもって本発明を更に説明する。
【実施例１】
【００１９】
＜本発明のヘクサペプチドの鰻骨からの製造例＞
鰻骨５００ｇに２規定の酢酸水５Ｌを加え、ホモジナイズ後、室温で１週間撹拌しながら、鰻骨由来のタンパク質、所謂、鰻骨コラーゲンの抽出を行った。１週間後、ホモジネイト液を濾過助剤；ラジオライト♯１００による珪藻土濾過を行い、得られた清澄濾液を透柝チューブ（３６ｉｎｃｈ、和光純薬工業製）に詰め、流水に対して３日間透析を行い、透析内液を得た。この透析内液を凍結乾燥して、９３ｇの鰻骨コラーゲンを得た。この鰻骨コラーゲン粉末に脱イオン水６００ｍＬを加えて溶解し、１規定の塩酸にてｐＨを２．０に調整した後、ペプシン（メルク社製、酵素番号ＥＣ３．４．２３．１）２．７９ｇを添加し、３７℃で２４時間撹拌しながら酵素分解を行った。反応後、分解液を直ちに限外濾過膜（アミコン社製、ＹＭ１０型、¢７６ｍｍ）に通過させ、通過液をＤｏｗｅｘ ５０Ｗ Ｘ４［Ｈ＋］カラム（¢４．５×２０ｃｍ）に負荷した。そのカラムを脱イオン水で十分洗浄した後、２規定のアンモニア水８００ｍＬを用いて溶出した。減圧濃縮操作によりアンモニアを除去して濃縮液６０ｍＬを得た。この濃縮液４ｍＬを予め脱イオン水で緩衝化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（¢２．３×１４０ｃｍ）に負荷し、流速２０ｍＬ／ｈｒ、各分画量１０ｍＬでゲル濾過を行った。ゲル濾過を繰り返し、大量分取した活性化酸素阻害活性の高いペプチド画分を集めて凍結乾燥し、鰻骨コラーゲン由来のペプチド粉末（以下「鰻骨ペプチド」と略記する。）とした。この鰻骨ペプチド粉末４ｇを脱イオン水３０ｍＬに溶解後、予め脱イオン水で緩衝化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５〔Ｈ＋〕カラム（¢１．５×４７．２ｃｍ）に負荷し、脱イオン水１０００ｍＬから３％塩化ナトリウム水１０００ｍＬの濃度勾配を行い、溶出した。流速８０ｍＬ／ｈｒ、各分画量１０ｍＬでカラムクロマトグラフィーを行った。ＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５クロマトグラフ中の活性化酸素阻害活性画分を集めて凍結乾燥し、精製鰻骨ペプチド粉末を得た。この精製鰻骨ペプチド粉末２０ｍｇを６０μＬの脱イオン水に溶解した後、逆相ＨＰＬＣを行った。カラムとしては野村化学社製Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−５（４．５ｍｍＩＤ Ｘ ２５ｃｍＬ）を使用し、移動相としては０．０５％トリフルオロ酢酸（以下「ＴＦＡ」と略記する。）から２５％アセトニトリル／０．０５％ＴＦＡの濃度勾配法を行い、流速１．０ｍＬ／分、波長２２０ｎｍでＨＰＬＣを行った結果、溶出時間；４７分に活性化酸素阻害活性の高いペプチドフラグメントのピークを得た。
この逆相ＨＰＬＣ分析の結果は図１に示す。
【００２０】
再度、逆相ＨＰＬＣリクロマトグラフィーして得たペプチドフラグメントのアミン酸分析を行ったところ、Ｌｙｓ；０．９２、Ｇｌｙ；１．０４、Ｔｈｒ；０．８９、Ｐｒｏ；０９５、Ａｌａ；１．０７及びＧｌｎ；０．８７であった。このようにして得られた活性化酸素阻害作用を有するペプチドフラグメントのアミノ酸配列は、アプライドバイオシステム（ＡＢＩ）社製のプロティンシークエンサー４７７Ａ型を用いて決定された。その結果、本実施例に係る新規なペプチドは、次式、
Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ
で示されるＬ体のアミノ酸配列で表されるヘクサペプチドであることが確認された。
この新規なヘクサペプチドの常温における性状は、白色の粉末である。
【００２１】
本実施例に係る新規なヘクサペプチドを活性化酸素阻害剤として、例えば錠剤に製剤する場合には、常法にしたがって、例えば次のように処理すればよい。（１）ペプチド１３ｇ、（２）乳糖９５ｇ、（３）コーンスターチ３３ｇ、（４）ステアリン酸マグネシウム１．１ｇを原料とし、まず（１）、（２）及び１３ｇのコーンスターチを混和し、７ｇのコーンスターチから作ったペーストと共に顆粒化し、この顆粒に４．２ｇのコーンスターチと（４）とを加え、得られた混合物を圧縮錠剤機で打錠し、錠剤１０００個を製造する。
【実施例２】
【００２２】
＜本発明のヘクサペプチドの合成法による製造例＞
アプライドバイオシステム（ＡＢＩ）社製のペプチド自動合成装置４３０Ａ型を用いた固相法によって、本発明のペプチドを合成した。固相担体としては、スチレンジビニルベンゼン共重合体（ポリスチレン樹脂）をクロロメチル化した樹脂を使用した。まず、本発明のヘクサペプチドのアミノ酸配列にしたがって、常法どおり、そのＣ末端側のグルタミンからクロロメチル樹脂に反応させ、ペプチド結合樹脂を得た。このときのアミノ酸は、ｔ−ブトキシカルボニル（以下「ｔ−Ｂｏｃ」と略記する。）基で保護されたｔ−Ｂｏｃアミノ酸を使用した。次に、このペプチド結合樹脂をエタンジチオールとチオアニソールからなる混合液に懸濁し、室温で１０分間撹拌後、水冷下でトリフルオロ酢酸を加え、さらに１０分間撹拌した。この混合液にトリフルオロメタンスルホン酸を滴下し、室温で３０分間撹拌した後、無水エーテルを加えてその生成物を沈殿させて分離し、その沈殿物を無水エーテルで数回洗浄した後、減圧下で乾燥した。このようにして得られた未精製の合成ペプチドは蒸留水に溶解した後、逆相系のカラムＣ１８（５μｍ）を用いたＨＰＬＣにより精製した。移動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使用し、（Ａ）液が８６分間で７１％→２２％の濃度勾配により流速１．５ｍＬ／ｍｉｎでクロマトグラフィーを行った。紫外部波長２１８ｎｍで検出し、最大の吸収を示した溶出画分を分取し、これを凍結乾燥することによって目的とする合成ヘクサペプチドを得た。
【００２３】
この合成ヘクサペプチドをマススペクトル分析により分析した結果、アミノ酸配列が前記で示したアミノ酸配列構造を有するヘクサペプチドであることが確認された。このマススペクトル分析の結果は、図２に示す。
上記の合成によって得られた本発明のヘクサペプチドは、以下に示す試験によって、抗酸化作用並びに活性化酸素フリーラジカル消去作用等の活性化酸素阻害作用が確認された。
【試験例１】
【００２４】
＜抗酸化作用の測定＞
抗酸化作用の測定として、反応液はリノール酸５１．１ｍｇ、エタノール４．０５２ｍＬ、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４．０ｍＬ、脱イオン水１．９４８ｍＬの混合液に、抗酸化作用を有するペプチド１〜３ｍｇ添加し、全量が１０ｍＬとなるように調製した。この溶液をネジ付き試験管で密封し５０℃の恒温器中に放置し、２４時間毎にリノール酸の過酸化物価をロダン鉄法で測定した。即ち反応液０．１ｍＬ、７５％エタノール液９．７ｍＬ、３０％ロダンアンモニウム液０．１ｍＬ、０．０２Ｍ塩化第二鉄を含む３．５％塩酸溶液０．１ｍＬを添加し、３分間反応させた後、吸光度５００ｎｍを測定した。その際、５００ｎｍの吸光値が０．３００に達するまでの日数を誘導期間（日）とした。本発明のヘクサペプチド０．１ｍｇの抗酸化活性（誘導日数）は、０．１ｍｇ：２３日、０．２ｍｇ：２５日、０．３ｍｇ：２８日であった。
【試験例２】
【００２５】
＜活性化酸素フリーラジカル消去作用の測定＞
受田らの方法［農化誌，７２巻，１１８１頁（１９９８年）］に従って測定した。即ち、２．５ｍＬの緩衝液（５０ｍＭ）が入った試験管に３ｍＭキサンチン、３ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＸＴＴ及び試料溶液をそれぞれ０．１ｍＬ加え、直ちにトリガーとして５７ｍＵ／ｍＬ ＸＯＤを０．１ｍＬ加えた。２５℃で正確に２０分間反応させた後，４７０ｎｍにおける吸光度を測定した。活性化酸素フリーラジカル（スーパーオキシドアニオン）によるＸＴＴの還元を５０％阻害する濃度をＩＣ５０値とした。本発明のヘクサペプチドの活性化酸素フリーラジカル消去活性すなわち活性化酸素阻害活性（ＩＣ５０値）は、２．７３μＭであった。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明のヘクサペプチド及びそれを有効成分とする活性化酸素阻害剤は、抗酸化作用並びに活性化酸素フリーラジカル消去作用等の活性化酸素阻害作用を有することが確認された。従って、本発明のヘクサペプチドは活性化酸素阻害剤の対象となる虚血性心疾患者、慢性関節リュウマチ及び重症火傷患者の治療又は予防薬として大いに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明のヘクサペプチドの逆相ＨＰＬＣによる分離精製の結果を示すグラフ（実施例１）
【図２】本発明のヘクサペプチドのマススペクトルを示すグラフ（実施例２）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品としての有用性を有し、新規なアミノ酸配列によるペプチド構造を有するヘクサペプチドを有効成分とする活性化酸素阻害剤に関する。本発明に係るヘクサペプチドは、鰻骨のタンパク質分解酵素の分解液から分離精製することができ、又、合成法によって製することも可能である。
【背景技術】
【０００２】
一般に、食品由来のペプチドは、活性化酸素阻害剤としての利点を有する。すなわち、従来、天然物又は天然物由来の活性化酸素阻害剤に関しては、以下の文献に開示されている。
【特許文献１】 特開平０６−１２８１６８号公報
【特許文献２】 特開平０８−００９８９２号公報
【特許文献３】 特開平０９−０５９２９７号公報
【特許文献４】 特開平０９−１５７２９１号公報
【特許文献５】 特開平０９−１５７２９２号公報
【特許文献６】 特開平１１−０３５５９８号公報
【特許文献７】 特開平１１−０３５５９９号公報
【特許文献８】 特開平１１−２９２８９７号公報
【非特許文献１】ＭｃＣｏｒｄ，Ｊ．Ｍ．＆Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ，Ｉ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４４，６０４９（１９６９）
【非特許文献２】山口等、ニューフードインダストリー、３１巻、１８−２２頁（１９８９年）
【非特許文献３】拓殖等、日本農芸化学会誌，６５巻，１６３５頁（１９９１年）
【非特許文献４】陳等、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，４６卷，４９頁（１９９８年）
【非特許文献５】工藤等、日本食品科学工学会誌，４８巻，４４頁（２００１年）
【非特許文献６】受田等、日本農芸化学会誌，７２巻，１１８１頁（１９９８年）
【０００３】
活性化酸素が関与する疾病は、火傷、関節炎などの炎症、再環流障害、抗癌剤の副作用、放射線障害、消化性潰瘍、細菌性ショック、悪液質、自己免疫疾患など幅広く存在する。好中球やマクロファージなどの活性化によって、発生する大量の活性化酸素が引き起こす疾患は、すべて対象となる。一般に、酸素には動物に必須の酸素（三重項酸素分子：３Ｏ２）と、特定の条件あるいは体の不調時に生じるラジカル（活性化酸素）とが存在する。ラジカルは直接又は間接的（過酸化反応という形で）に細胞膜、細胞内顆粒膜、あるいはＤＮＡをはじめ種々の細胞成分を変質、損傷させたりする。このラジカルは体内で生産され、その種類はスーパーオキシドアニオン（−Ｏ２・）、一重項酸素（１Ｏ２・）、水酸化ラジカル（・ＯＨ）等が存在する。このうちスーパーオキシドアニオン（−Ｏ２・）は細胞膜の不飽和脂肪酸等に作用して過酸化反応を引き起こし、脂質に対する酸化力は動物に必須な酸素の数千倍も高いといわれている。活性化酸素阻害剤としてのスーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯＤ、酵素番号ＥＣ１．１５．１．１）は、１９６９年マクコルドら［非特許文献１］によってその作用が発見された酵素であり、酸素分子が一電子還元されて生じるスーパーオキシドアニオン（−Ｏ２・）を不均化する
２−Ｏ２・＋２Ｈ＋→ Ｈ２Ｏ２＋Ｏ２
を触媒する。人体が正常なときにはＳＯＤが働いてスーパーオキシドアニオンの発生を抑えている。このＳＯＤ活性は加齢と共に低下し、即ち壮年期から老年期になると活性が低下し、ＳＯＤ活性の増減は生体の老化、癌化のバロメーターともいわれている。このようなＳＯＤ活性が低下するとラジカルの発生は抑えにくくなりＳＯＤを摂取補強するか、又はラジカルを捕捉除去する活性化酸素阻害剤の摂取が必要となってくる。
【０００４】
一方、水溶性の抗酸化剤としてのアミノ酸から蛋白質にいたるポリペプチドの活性化酸素阻害作用は、油脂をペプチド類が包み込むことにより酸素分子と不飽和脂肪酸の接触を阻害し、脂質ペルオキシラジカル（ＬＯＯ・）の発生を抑制すると考えられており、ＢＨＡ（ブチルヒドロキシルアニソール）及びＢＨＴ（ジブチルヒドロキシトルエン）の抗酸化作用のように、油脂（Ｌ）の酸化の際に生じるラジカル（ＬＯＯ・）に作用して、酸化の連鎖反応を停止させるラジカル捕捉作用とは区別している。
ＬＯＯ・＋ＡＨ２ →ＬＯＯＨ＋ＡＨ・
２ＡＨ・→２ＡＨ２＋Ａ 又は ＬＯＯ・＋ＡＨ・→ＬＯＯＨ＋Ａ
（ＡＨ２；抗酸化剤）
【０００５】
今日、抗癌、老化防止に対する特効薬がない状況で、環境中からＤＮＡ損傷因子、突然変異因子、発癌因子、老化因子等を取り除き不活性化し、活性化酸素フリーラジカル消去作用並びに抗酸化作用を示す活性化酸素阻害剤に関する研究や検討が進められている。一方、水溶性の抗酸化剤として、アミノ酸から蛋白質に至るポリペプチドのアミノ酸配列と抗酸化力に関する知見は極めて少なく、山口ら［非特許文献２］は、ジペプチドがアミノ酸や蛋白質よりも抗酸化力が強いことを示しており、又、最近、拓殖ら［非特許文献３］がＡｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ，ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ，Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎを、陳ら［非特許文献４］がＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ他５種類の抗酸化ペプチドを，工藤ら［非特許文献５］がＡｌａ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔを報告している。これに対し、発明者らはカテキン類［特許文献１］及び活性化酸素消去ペプチド（抗酸化ペプチド）［特許文献２〜８］等を数多く報告してきているが、これら活性化酸素フリーラジカル消去作用並びに抗酸化作用等を有する活性化酸素阻害剤が、未だ医薬品として開発が進んでいるとの報告はない。
【０００６】
これまで、活性化酸素阻害剤としてのＳＯＤはその製造が困難であり又原料の入手に制限があり、ビタミンＥ、ビタミンＣ、カテキン・フラボノイド及びペプチド類等は、生体を用いた実験では活性化酸素阻害作用が十分でない等の難点があり、又、活性化酸素フリーラジカル消去作用並びに抗酸化作用を示す活性化酸素阻害剤の多くは、その殆どが化学合成で製造されたものであり、たとえ植物や動物からの材料を用いた天然物由来のものであっても、その製造過程で人体に害を及ぼす化学物質を用い、生成物の一部を化学物質と反応させて作られたものが多い。このような背景のもと、更に強力な作用を有する活性化酸素阻害剤が要望されている。
【０００７】
上記の状況に鑑み、本発明者は、活性化酸素阻害作用を有すると共に、安全で、実用に供し得る新規ペプチドについて鋭意研究した結果、鰻骨のタンパク質分解酵素の分解液から得られた特定アミノ酸配列構造のヘクサペプチドが活性化酸素阻害作用を奏することを見いだした。又、この鰻骨由来のヘクサペプチドと同じアミノ酸配列のヘクサペプチドを合成法によって製したところ、鰻骨由来のヘクサペプチドと同様、活性化酸素阻害作用を有することが解明されたので、これを有効成分とする活性化酸素阻害剤を開発することができ、本発明を完成するに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、活性化酸素阻害剤を有する新規なヘクサペプチド及びそのヘクサペプチドを有効成分として含有し、毒性がきわめて低く、安全性がきわめて高い、新規な活性化酸素阻害剤を提供することを課題とする。
【問題が解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するための発明のうち、請求項１に記載する発明は、
次式；Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なヘクサペプチドである。（式中、アミノ酸残基を表す各記号は、アミノ酸化学において慣用の表示法によるものである。）
又、本発明のうち、請求項２に記載する発明は、
次式；Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有するヘクサペプチドを有効成分として含有することを特徴とする活性化酸素阻害剤である。である。（式中、アミノ酸残基を表す各記号は、アミノ酸化学において慣用の表示法によるものである。）
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る請求項１に記載のヘクサペプチド（以下「本発明のヘクサペプチド」という。）は、優れた活性化酸素フリーラジカル消去作用並びに抗酸化作用を有し、活性化酸素阻害作用を示す。従って、本発明に係る請求項２に記載の活性化酸素阻害剤（以下「本発明の活性化酸素阻害剤」という。）は、これら組織障害を引き起こす過剰な活性酸素を分解して組織を守る作用を持つことから、例えば抗炎症剤として、関節炎やリュウマチなどに有効であるほか、ベーチュット病、心筋梗塞等に対しても有用である。
尚、この新規なヘクサペプチドは、構造的にそのアミノ酸配列を部分構造とするペプチドにおいて、構造中に採用することもできる。
【００１１】
又、本発明のヘクサペプチドは、静脈内への繰り返し投与を行った場合、抗体産生を惹起せず、アナフィラキシーショックを起こさない。更に、本発明のヘクサペプチドは、Ｌ−アミノ酸のみの配列構造からなり、投与後、生体内のプロテアーゼにより徐々に分解される為、毒性は極めて低く、安全性は極めて高い（ＬＤ５０＞５０００ｍｇ／ｋｇ：ラット経口投与）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のヘクサペプチドは、次式；Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎで示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なヘクサペプチドであり、常温における性状は、白色の粉末である。
本発明のヘクサペプチドは、化学的に合成する方法または魚介類の骨、特に鰻骨のタンパク質分解酵素の分解液から分離精製する方法によって得ることができる。
【００１３】
本発明のヘクサペプチドを化学的に合成する場合には、液相法又は固相法等の通常のペプチド合成法によって行なうことができるが、好ましくは、固相法によってポリマー性の固相支持体へ前記ヘクサペプチドのカルボキシル末端側（グルタミン）からそのアミノ酸残基に対応したＬ体のアミノ酸を、順次ペプチド結合によって結合していくのがよい。そして、そのようにして得られた合成ヘクサペプチドは、トリフルオロメタンスルホン酸、フッ化水素等を用いてポリマー性の固相支持体から切断した後、アミノ酸側鎖の保護基を除去し、逆相系のカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（以下「ＨＰＬＣ」と略記する。）等を用いた通常の方法で精製することができる。
【００１４】
又、本発明のヘクサペプチドは、上記のとおり、鰻骨のタンパク質分解酵素の分解液から分離精製することができるが、その場合には、例えば、以下のようにして行うことができる。まず、鰻骨を用いて加水分解する。加水分解は常法に従って行うことでよい。例えば、ペプシン等のタンパク質分解酵素で加水分解する場合は、鰻骨のホモジネイトを必要に応じて更に加水分解した後、酵素の至適温度まで加温し、ｐＨを至摘値に調整し、酵素を加えてインキュベートする。次いで必要に応じて中和した後、酵素を失活させて加水分解液を得る。その加水分解液を濾紙及び／又はセライト等を用いて濾過することによって不溶性成分を除去し、得られた濾液をセロファン等の半透膜を用いて適当な溶媒（例えば、水、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液の中性の緩衝液等）中で充分に透析し、その濾液中の成分で半透膜を通過した成分を含む溶液を強酸性陽イオン交換樹脂（例えば、ダウケミカル社製のＤｏｗｅｘ ５０Ｗ、アンバーライト社製のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ−１２０等）にかけ、その吸着溶出画分から活性化酸素阻害活性を有する成分を含有する画分を得、その得られた活性化酸素阻害活性画分をゲルろ過（例えば、ファルマシア社製のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、バイオラッド社製のＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−６等）によって分画し、その得られた活性化酸素阻害活性画分を陽イオン交換ゲル濾過（例えば、ファルマシア社製のＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５等）によって分画し、最終的に得られた活性化酸素阻害活性画分を更に逆相ＨＰＬＣによって分画することによって単離精製を行うことができる。
【００１５】
本発明のヘクサペプチドの製法においては、魚介類骨としては、本発明の課題を達成できる限り、いかなる魚介類の骨を用いてもよいが、好ましくは鰻骨を用いるのがよい。
【００１６】
本発明の活性化酸素阻害剤は、通常用いられる賦形剤等の添加物を用いて注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤又は散剤等に調製することができる。これらの各種製剤において用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤又は潤沢剤の種類は、特に限定されず、通常の注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤又は散剤に用いられるものを使用することができる。賦形剤としては、結晶セルロース等の糖類、マンニトール等の糖アルコール類、でんぷん類、無水リン酸カルシウム等、結合剤としては、でんぷん類、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等を、崩壊剤としては、カルボキシメチルセルロース及びそのカリウム塩類を、潤沢剤としては、ステアリン酸及びその塩類、タルク、ワックス類をあげることができる。又、製剤の調整にあたっては、必要に応じ、メントール、クエン酸及びその塩類、香料等の矯臭剤を用いることができる。注射用の無菌組成物は、常法により、本発明のヘクサペプチドを、注射用水、生理食塩水及びキシリトールやマンニトール等の糖アルコール注射液、プロピレングリコールやポリエチレングリコール等のグリコールに溶解又は懸濁させて注射剤とすることができる。この際、緩衝液、防腐剤、酸化防止剤等を必要に応じて添加することができる。本発明のヘクサペプチドを含有する製剤は、凍結乾燥品又は乾燥粉末の形とし、用時、通常の溶解剤、例えば水又は生理食塩水に溶解して用いることもできる。
【００１７】
本発明の活性化酸素阻害剤の投与方法としては、通常は、ＳＯＤが欠乏している哺乳類（例えば、ヒト、イヌ、ラット等）に注射すること、あるいは経口投与することがあげられる。投与量は、例えば、動物体重１ｋｇ当たり 本発明の活性化酸素阻害剤０．０１〜１０ｍｇの量が適当である。投与回数は、通常、１日１〜４回程度であるが、投与経路によって、適宜調整することができる。
【００１８】
以下、実施例及び試験例をもって本発明を更に説明する。
【実施例１】
【００１９】
＜本発明のヘクサペプチドの鰻骨からの製造例＞
鰻骨５００ｇに２規定の酢酸水５Ｌを加え、ホモジナイズ後、室温で１週間撹拌しながら、鰻骨由来のタンパク質、所謂、鰻骨コラーゲンの抽出を行った。１週間後、ホモジネイト液を濾過助剤；ラジオライト♯１００による珪藻土濾過を行い、得られた清澄濾液を透柝チューブ（３６ｉｎｃｈ、和光純薬工業製）に詰め、流水に対して３日間透析を行い、透析内液を得た。この透析内液を凍結乾燥して、９３ｇの鰻骨コラーゲンを得た。この鰻骨コラーゲン粉末に脱イオン水６００ｍＬを加えて溶解し、１規定の塩酸にてｐＨを２．０に調整した後、ペプシン（メルク社製、酵素番号ＥＣ３．４．２３．１）２．７９ｇを添加し、３７℃で２４時間撹拌しながら酵素分解を行った。反応後、分解液を直ちに限外濾過膜（アミコン社製、ＹＭ１０型、¢７６ｍｍ）に通過させ、通過液をＤｏｗｅｘ ５０Ｗ Ｘ４［Ｈ＋］カラム（¢４．５×２０ｃｍ）に負荷した。そのカラムを脱イオン水で十分洗浄した後、２規定のアンモニア水８００ｍＬを用いて溶出した。減圧濃縮操作によりアンモニアを除去して濃縮液６０ｍＬを得た。この濃縮液４ｍＬを予め脱イオン水で緩衝化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（¢２．３×１４０ｃｍ）に負荷し、流速２０ｍＬ／ｈｒ、各分画量１０ｍＬでゲル濾過を行った。ゲル濾過を繰り返し、大量分取した活性化酸素阻害活性の高いペプチド画分を集めて凍結乾燥し、鰻骨コラーゲン由来のペプチド粉末（以下「鰻骨ペプチド」と略記する。）とした。この鰻骨ペプチド粉末４ｇを脱イオン水３０ｍＬに溶解後、予め脱イオン水で緩衝化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５〔Ｈ＋〕カラム（¢１．５×４７．２ｃｍ）に負荷し、脱イオン水１０００ｍＬから３％塩化ナトリウム水１０００ｍＬの濃度勾配を行い、溶出した。流速８０ｍＬ／ｈｒ、各分画量１０ｍＬでカラムクロマトグラフィーを行った。ＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５クロマトグラフ中の活性化酸素阻害活性画分を集めて凍結乾燥し、精製鰻骨ペプチド粉末を得た。この精製鰻骨ペプチド粉末２０ｍｇを６０μＬの脱イオン水に溶解した後、逆相ＨＰＬＣを行った。カラムとしては野村化学社製Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−５（４．５ｍｍＩＤ Ｘ ２５ｃｍＬ）を使用し、移動相としては０．０５％トリフルオロ酢酸（以下「ＴＦＡ」と略記する。）から２５％アセトニトリル／０．０５％ＴＦＡの濃度勾配法を行い、流速１．０ｍＬ／分、波長２２０ｎｍでＨＰＬＣを行った結果、溶出時間；４７分に活性化酸素阻害活性の高いペプチドフラグメントのピークを得た。
この逆相ＨＰＬＣ分析の結果は図１に示す。
【００２０】
再度、逆相ＨＰＬＣリクロマトグラフィーして得たペプチドフラグメントのアミン酸分析を行ったところ、Ｌｙｓ；０．９２、Ｇｌｙ；１．０４、Ｔｈｒ；０．８９、Ｐｒｏ；０９５、Ａｌａ；１．０７及びＧｌｎ；０．８７であった。このようにして得られた活性化酸素阻害作用を有するペプチドフラグメントのアミノ酸配列は、アプライドバイオシステム（ＡＢＩ）社製のプロティンシークエンサー４７７Ａ型を用いて決定された。その結果、本実施例に係る新規なペプチドは、次式、
Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ
で示されるＬ体のアミノ酸配列で表されるヘクサペプチドであることが確認された。
この新規なヘクサペプチドの常温における性状は、白色の粉末である。
【００２１】
本実施例に係る新規なヘクサペプチドを活性化酸素阻害剤として、例えば錠剤に製剤する場合には、常法にしたがって、例えば次のように処理すればよい。（１）ペプチド１３ｇ、（２）乳糖９５ｇ、（３）コーンスターチ３３ｇ、（４）ステアリン酸マグネシウム１．１ｇを原料とし、まず（１）、（２）及び１３ｇのコーンスターチを混和し、７ｇのコーンスターチから作ったペーストと共に顆粒化し、この顆粒に４．２ｇのコーンスターチと（４）とを加え、得られた混合物を圧縮錠剤機で打錠し、錠剤１０００個を製造する。
【実施例２】
【００２２】
＜本発明のヘクサペプチドの合成法による製造例＞
アプライドバイオシステム（ＡＢＩ）社製のペプチド自動合成装置４３０Ａ型を用いた固相法によって、本発明のペプチドを合成した。固相担体としては、スチレンジビニルベンゼン共重合体（ポリスチレン樹脂）をクロロメチル化した樹脂を使用した。まず、本発明のヘクサペプチドのアミノ酸配列にしたがって、常法どおり、そのＣ末端側のグルタミンからクロロメチル樹脂に反応させ、ペプチド結合樹脂を得た。このときのアミノ酸は、ｔ−ブトキシカルボニル（以下「ｔ−Ｂｏｃ」と略記する。）基で保護されたｔ−Ｂｏｃアミノ酸を使用した。次に、このペプチド結合樹脂をエタンジチオールとチオアニソールからなる混合液に懸濁し、室温で１０分間撹拌後、水冷下でトリフルオロ酢酸を加え、さらに１０分間撹拌した。この混合液にトリフルオロメタンスルホン酸を滴下し、室温で３０分間撹拌した後、無水エーテルを加えてその生成物を沈殿させて分離し、その沈殿物を無水エーテルで数回洗浄した後、減圧下で乾燥した。このようにして得られた未精製の合成ペプチドは蒸留水に溶解した後、逆相系のカラムＣ１８（５μｍ）を用いたＨＰＬＣにより精製した。移動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使用し、（Ａ）液が８６分間で７１％→２２％の濃度勾配により流速１．５ｍＬ／ｍｉｎでクロマトグラフィーを行った。紫外部波長２１８ｎｍで検出し、最大の吸収を示した溶出画分を分取し、これを凍結乾燥することによって目的とする合成ヘクサペプチドを得た。
【００２３】
この合成ヘクサペプチドをマススペクトル分析により分析した結果、アミノ酸配列が前記で示したアミノ酸配列構造を有するヘクサペプチドであることが確認された。このマススペクトル分析の結果は、図２に示す。
上記の合成によって得られた本発明のヘクサペプチドは、以下に示す試験によって、抗酸化作用並びに活性化酸素フリーラジカル消去作用等の活性化酸素阻害作用が確認された。
【試験例１】
【００２４】
＜抗酸化作用の測定＞
抗酸化作用の測定として、反応液はリノール酸５１．１ｍｇ、エタノール４．０５２ｍＬ、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４．０ｍＬ、脱イオン水１．９４８ｍＬの混合液に、抗酸化作用を有するペプチド１〜３ｍｇ添加し、全量が１０ｍＬとなるように調製した。この溶液をネジ付き試験管で密封し５０℃の恒温器中に放置し、２４時間毎にリノール酸の過酸化物価をロダン鉄法で測定した。即ち反応液０．１ｍＬ、７５％エタノール液９．７ｍＬ、３０％ロダンアンモニウム液０．１ｍＬ、０．０２Ｍ塩化第二鉄を含む３．５％塩酸溶液０．１ｍＬを添加し、３分間反応させた後、吸光度５００ｎｍを測定した。その際、５００ｎｍの吸光値が０．３００に達するまでの日数を誘導期間（日）とした。本発明のヘクサペプチド０．１ｍｇの抗酸化活性（誘導日数）は、０．１ｍｇ：２３日、０．２ｍｇ：２５日、０．３ｍｇ：２８日であった。
【試験例２】
【００２５】
＜活性化酸素フリーラジカル消去作用の測定＞
受田らの方法［農化誌，７２巻，１１８１頁（１９９８年）］に従って測定した。即ち、２．５ｍＬの緩衝液（５０ｍＭ）が入った試験管に３ｍＭキサンチン、３ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＸＴＴ及び試料溶液をそれぞれ０．１ｍＬ加え、直ちにトリガーとして５７ｍＵ／ｍＬ ＸＯＤを０．１ｍＬ加えた。２５℃で正確に２０分間反応させた後，４７０ｎｍにおける吸光度を測定した。活性化酸素フリーラジカル（スーパーオキシドアニオン）によるＸＴＴの還元を５０％阻害する濃度をＩＣ５０値とした。本発明のヘクサペプチドの活性化酸素フリーラジカル消去活性すなわち活性化酸素阻害活性（ＩＣ５０値）は、２．７３μＭであった。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明のヘクサペプチド及びそれを有効成分とする活性化酸素阻害剤は、抗酸化作用並びに活性化酸素フリーラジカル消去作用等の活性化酸素阻害作用を有することが確認された。従って、本発明のヘクサペプチドは活性化酸素阻害剤の対象となる虚血性心疾患者、慢性関節リュウマチ及び重症火傷患者の治療又は予防薬として大いに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明のヘクサペプチドの逆相ＨＰＬＣによる分離精製の結果を示すグラフ（実施例１）
【図２】本発明のヘクサペプチドのマススペクトルを示すグラフ（実施例２）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式；Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ
で示されるＬ体のアミノ酸配列で表わされる新規なヘクサペプチド。
【請求項２】
次式；Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ
で示されるＬ体のアミノ酸配列で表わされる新規なヘクサペプチドを有効成分として含有することを特徴とする活性化酸素阻害剤。
【請求項１】
次式；Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ
で示されるＬ体のアミノ酸配列で表わされる新規なヘクサペプチド。
【請求項２】
次式；Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ
で示されるＬ体のアミノ酸配列で表わされる新規なヘクサペプチドを有効成分として含有することを特徴とする活性化酸素阻害剤。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−１９９６７１（Ｐ２００６−１９９６７１Ａ）
【公開日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−４１２６７（Ｐ２００５−４１２６７）
【出願日】平成１７年１月１９日（２００５．１．１９）
【出願人】（５９１１６７１１９）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１月１９日（２００５．１．１９）
【出願人】（５９１１６７１１９）
【Ｆターム（参考）】
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