新規な活性化ポリ（エチレングリコール）及び関連ポリマー並びにそれらの適用
ペプチド、オリゴヌクレオチド、タンパク質又は非ペプチド分子などの薬学的又は診断上活性な物質への結合に適する、開示される化学的に活性なポリ（エチレングリコール）及び他の親水性ポリマーが開示される。化合物は、式Ｐｏｌｙ−（Ｘ−ＮＨ−ＣＯ−Ａ）ｎによって表され、式中、Ｐｏｌｙは、約３００から１０００００ダルトンの分子量を有する親水性ポリマーであり、Ａは、−ＮＨ−ＣＯ−と一緒になって反応性基を形成しており、Ｘは、スペーサー部分又は結合であり、ｎは、１から５０までを含む整数である。開示する化合物に結合させることができる問題の活性な物質は、ヘモグロビン、インスリン、ウロキナーゼ、αインターフェロン、Ｇ−ＣＳＦ、ｈＧＨ、アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ及びカタラーゼから選択することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な活性化ポリ（エチレングリコール）及び他の親水性ポリマーの調製並びに生体材料を改良するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）としても知られているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、広範囲の分子量のものが入手可能である柔軟な直鎖ポリマーであり、主として多くの医薬製剤、例えば、非経口、局所、眼、経口及び直腸経路により投与される製剤に用いられることが知られている。それらは、一般式ＨＯＣＨ２（ＣＨ２ＯＣＨ２）ｍＣＨ２ＯＨに対応するか、又はメトキシ化形ＣＨ３ＯＣＨ２（ＣＨ２ＯＣＨ２）ｍＣＨ２ＯＨであり、式中、ｍはポリオキシエチレン部分の平均数を表す。ＰＥＧは、安定であり、組織及び粘膜との良好な適合性を示す。それらは、それらの分子量に応じて、いくつかの形で存在することができる。このように、２００ダルトン（Ｄａ）から６００ＤａまでのＰＥＧは液体であり、１０００ダルトンより高い分子量を有するＰＥＧはワックスタイプの固体であるが、６０００Ｄａ及びそれ以上を有するものは易流動性粉末である。
【０００３】
ＰＥＧは、経口、非経口及び局所適用で低い毒性を有する。ヒトにおける静脈内投与後に、１０００Ｄａから１００００Ｄａまでの分子量を有するＰＥＧは、主として腎経路により速やかに排泄され、より高い分子量を有するものは、分子量が増加するにつれて速度が低下する。
【０００４】
ＰＥＧは、水溶液に、粘度及びそれらの粘稠度を個々に調整するための物質として用いられている。約３０％に及ぶ濃度で、それらは非経口溶液用にも用いられている。固体の医薬剤形中では、高い分子量を有するＰＥＧは、結合剤の効率を増加させ、それにより、粒子に可塑性を付与することができる。高い分子量を有するものは、とりわけ滑沢剤としても用いられている（非特許文献１参照）。
【０００５】
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）及びその誘導体は、両親媒性挙動、水性及び有機溶媒における溶解性、高純度、低多分散性、生物学的適合性などのそれらの有用な特性のため、化学、生物医学及び他の産業適用分野においてますます多くの関心を集めつつある。それらは、他の化合物に結合した場合に活性化することができるので、そのようなポリマーは、例えば、薬物担体、液相ペプチド又はポリヌクレオチド合成用のマトリックス、表面改質剤として、並びにペプチド及びタンパク質との複合体を製造するために用いられている（例えば、非特許文献２及び非特許文献３参照）。
【０００６】
実際、タンパク質及びペプチドに対するＰＥＧの結合は、それらの溶解度の他に、安定性及びタンパク質分解性不活性化に対する抵抗性、薬物動態特性を改善することができ、さらに免疫原性及び抗原性を減弱させるためのものである（例えば、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７参照）。
【０００７】
言及した効果は、遮蔽効果により結合分子を覆い、保護し、それにより、タンパク質分解酵素の接近、免疫系細胞、受容体及び他の組織構成要素の接触を妨げるＰＥＧ及びその厳密に結合した水分子に起因することが示唆された。さらに、分子量の増加により、糸球体ろ過が減少し、結果として血漿半減期の延長及び複合体の薬物動態の改善が伴う。ＰＥＧに結合したタンパク質は、腎クリアランス及び免疫原性の低下のため、延長されたｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有することが開示されている（例えば、特許文献１（Ｄａｖｉｓら）参照）。さらに、文献に、遺伝子工学によっても得られる、興味深い生物学的特性を有するタンパク質性化合物のいくつかの例が記載されている。前記化合物のうち、ヘモグロビン、インスリン、ウロキナーゼ、αインターフェロン、Ｇ−ＣＳＦ、ｈＧＨ、アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ(過酸化水素及び分子状酸素中のスーパーオキシドラジカルの不均一化反応を触媒する金属酵素、以後ＳＯＤ)、カタラーゼ等を言及することができる（例えば、非特許文献８参照）。例えば、抗酸化酵素ＳＯＤ及びカタラーゼは、一般的に慢性関節リウマチ、靭帯変性疾患、虚血及び血管損傷の治療に用いることができた。しかし、未変性のタンパク質の治療効力は、それらの短い半減期及び起こり得るアレルギー副反応によって高度に制限される。これらの問題は、前記タンパク質をＰＥＧと結合させること（ＰＥＧ化として最もよく知られている方法により）で克服することができ、実際に、いくつかのＰＥＧ化タンパク質、特に、ＰＥＧ−アデノシンデアミナーゼ、ＰＥＧ−インターフェロン、ＰＥＧ−アスパラギナーゼ及びＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦがＦＤＡにより承認された。オリゴヌクレオチドもＰＥＧ化され、そのような生成物の１つがマキュゲン（Ｍａｃｕｇｅｎ）の商品名のもとに既に市販されている。
【０００８】
ＰＥＧを分子に結合させるためには、該ポリマーが該受容分子上の基との反応に適する末端の「活性基」を有することが必要である。医学研究における新発見及びナノテクノロジーツールの開発により、使用者の要求を満たすために適応させることができる種々の特性を有する新規かつ改良されたＰＥＧ誘導体に対する需要がますます多くなりつつある。
【０００９】
いくつかのものは、化学的方法又は酵素による法によりＰＥＧ化させることができるタンパク質中のアミノ酸残基であるが、アミンは、タンパク質中に一般的に存在し、溶媒に暴露されるという主な理由のため、さらにアミノアシル化又はアルキル化反応が文献（例えば、非特許文献９参照）により周知であるため、研究者の注意を最も引くものである。
【００１０】
例えば、Ｃｌａｒｋ Ｒ．は、１０から３０までのＰＥＧ／タンパク質モル比を用いたポリ（エチレングリコール）５０００Ｄａ（ｍＰＥＧ−ＣＯ−ＮＨＳ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルによるヒト成長ホルモンのＰＥＧ化を提案し（非特許文献１０参照）、マルチＰＥＧ化複合体から主として構成される異性体の広範囲にわたる混合物を得、それにより、活性化ＰＥＧ−脂肪酸（すなわち、ｍＰＥＧ−ＣＯ−ＮＨＳ）のような高反応性ＰＥＧを用いる場合、多くのポリマー鎖がタンパク質に結合し、モノＰＥＧ化種を得ることが困難になることを証明した。
【００１１】
炭酸スクシンイミジルＰＥＧ（ＳＣ−ＰＥＧ）の調製並びにタンパク質及びポリペプチドへのその結合が開示されている（例えば、特許文献２（１９９０年）（Ｚａｌｉｐｓｋｙ Ｓ．による）参照）。「活性化ＰＥＧ誘導体」はポリペプチドのアミノ基と速やかに反応するが、ｉｎ ｖｉｖｏで加水分解される能力を有し、出発の未変性タンパク質を生じさせる結合である、αインターフェロンのヒツチジンへのＰＥＧの結合（結合した総ＰＥＧの少なくとも３０％）を優先的に誘導する方法が開示されている（例えば、特許文献３（１９９９年）参照）。
【００１２】
しかし、ＳＣ−ＰＥＧ誘導体は依然タンパク質中の求核基とあまりにも速やかに反応し、それにより、ＰＥＧ誘導体がタンパク質中の異なる反応性アミノ酸残基を識別する可能性が減少し、したがって、ＰＥＧ化タンパク質異性体の複雑な混合物がもたらされる（例えば、非特許文献１１参照）。モノＰＥＧ−インターフェロン複合体混合物中に、ポリマーが不安定な結合によりヒスチジン３４に結合している異性体（異性体の総量の約４０％）が存在し、十分に活性なタンパク質の復元が望まれるにもかかわらず、それが他方で、安定なポリマー結合により達成された血液中の複合体の延長された半減期の十分な活用を妨げ得る。実際、加水分解後に未変性のタンパク質は速やかな腎クリアランスを受ける。したがって、このアミノ酸に対するより高い程度の結合、ひいては、複合体の延長された半減期と未変性のタンパク質のより高い活性という２つの対照的な因子のより良好な結びつけに加えて、なおも未変性のタンパク質をより遅い速度で放出することができるヒスチジンのレベルでのより安定なＰＥＧ−タンパク質結合が望まれる。
【００１３】
【特許文献１】米国特許第４，１７９，３３７号明細書
【特許文献２】国際公開第９０／１３５４０号パンフレット
【特許文献３】米国特許第５，９５１，９７４号明細書
【特許文献４】米国特許第６，２１４，９６６号明細書
【非特許文献１】Handbook of excipients 2000, 392-398）
【非特許文献２】Roberts M. J. et al., Adv. Drug Del. Rev., 54: 459-476, 2002
【非特許文献３】Veronese F. M., Biomaterials, 22: 405-417, 2001
【非特許文献４】Delgado C. et al., Critical Rev Ther Drug Carrier Syst 1992, 9, 249-304
【非特許文献５】Adv. Drug reviews 2002, 54, 453-606
【非特許文献６】Harris JM, Chess RB: Effect of PEGylation on Pharmaceuticals. Nature Reviews Drug Discoveries 2003, 2, 214-221
【非特許文献７】Veronese F. M., Pasut G., Drug Disc Today 2005, 10, 1451-1458
【非特許文献８】Pasut G. et al. Expert Op Ther Patents 2004, 14, 859-894
【非特許文献９】Harris JM, Chess RB, Nature Reviews Drug Discoveries 2003, 2, 214
【非特許文献１０】Clark R. J Biol Chem 1996, 271(36), 21969-21977
【非特許文献１１】Wang Y., et al. Adv Drug Del Rev 2002, 54, 547-570
【非特許文献１２】Greenwald RB, et al. Bioconjugate Chem 2003, 14:395-403
【非特許文献１３】Greenwald RB, et al. J Med Chem 2000, 43:475-487
【非特許文献１４】Tsubery H, et al. J Biol Chem 2004, 279(37):38118-38124
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
最近、複合ポリマーからのタンパク質の放出のためのいくつかのシステムが提案された（例えば、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４参照）が、それらのすべてがタンパク質への結合の後に免疫原性の問題を生じさせる可能性がある芳香族スペーサーを含んでいる。さらに、それらの大部分において、タンパク質の放出は酵素制御切断によって実現されており、酵素濃度は各人で異なっているため、これが異なるタンパク質放出速度、すなわち、異なる治療反応につながる可能性がある。結合した薬物がポリマーの活性基に近い不安定な結合の水加水分解により放出される複合体を形成する、タンパク質又は他の薬剤に対する結合に有用なＰＥＧ及び関連ポリマー誘導体が開示されており（例えば、特許文献４（２００１年）参照（Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ））、放出により、薬物に結合したポリマーに属する前の小部分が残り、それにより、特にタンパク質の修飾のための免疫原性の問題が生ずる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
したがって、あらかじめ決定され、かつ一般的な加水分解による開裂の制御のもとで未変性の形の複合薬物を放出することができる脂肪族スペーサーが歓迎される。
【００１６】
本発明は、水溶性複合体を得るためのタンパク質、酵素、小分子及びその他を含む薬物への結合に適する化学的に活性なポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）及び関連ポリマーを提供する。
【００１７】
本発明のＰＥＧ及び関連ポリマー誘導体は、タンパク質としての薬物中の利用可能な基のすべての識別ができる弱い活性基を含み、例えば、一般的なＰＥＧアシル化誘導体によるアミノ修飾は通常、異性体の広範囲の混合物をもたらす。これらの誘導体は、ＰＥＧ−薬物複合体に十分な循環時間を与え、ＰＥＧがイミダゾール残基（例えば、ヒスチジンの）に結合している場合、結合した薬物はあらかじめ決定された速度での加水分解による分解により周囲環境中に放出される。この新規な活性ＰＥＧ及び関連ポリマーを製造する方法、及びＰＥＧ複合体を製造する方法も本発明に含まれる。
【００１８】
これらの活性化ＰＥＧ及び関連ポリマー誘導体の薬物への結合により、水溶解性、サイズの増加、腎クリアランスの減少、安定性及び複合体に対する免疫原性の低下を付与することが可能である。イミダゾール残基若しくは同様な分子又はアルコールを介してこれらの活性誘導体を結合させることにより、結合の適切な設計による水性環境中への結合薬物の制御可能な加水分解による放出をもたらすことも可能である。本発明の活性化誘導体は、それらの低い反応性により、それらが選択される薬物の反応性が最も高く、及び／又は露出した基と優先的に反応することを可能にするため、例えば、限定的でないが、これらのＰＥＧ誘導体はタンパク質の反応性が最も高いアミノ基に主として結合することができるため、薬物におけるすべての反応性基を識別するのに用いることができる。本発明の誘導体は、タンパク質、ペプチド及び非タンパク質薬物の溶解度を増加させ、血中半減期を延長させ、最終的にポリマーからの薬物の放出を制御するのに用いることができる。本発明によれば、ポリマーに永久的に結合させたとき、以前には低い生物活性を有していた薬物は、上記の放出できる方法（例えば、限定的でないが、イミダゾール結合）によりこれらのＰＥＧ及びポリマー誘導体に結合させた場合に今や高い活性を有することができる。
【００１９】
一般的な形では、本発明の活性化誘導体は、以下の式によって記述することができる。
【００２０】
【化１】
【００２１】
上式において、
「Ｐｏｌｙ」は、約３００から１０００００ダルトンの分子量を有する親水性ポリマーであり、
「Ａ」は、−ＮＨ−ＣＯ−と一緒になって反応性基を形成しており、
「Ｘ」は、スペーサー部分又は結合であり、
「ｎ」は、Ｐｏｌｙに存在する化学的に活性な末端基の数を表す、１から５０まで、好ましくは１から１０まで、より好ましくは１から５まで、さらにより好ましくは１を含む整数である。
（Ｂ−Ｐ）ｎは、Ｐｏｌｙへの結合のための分子であり、Ｐは活性薬物であり、Ｂは、Ａと反応性であり、例えば、Ｂがヒスチジンのイミダゾール残基又はアミノ基であるタンパク質ＰなどのＰ中に本来に含まれるか、又はそれに意図的に結合させることができる同じ薬物の反応性基である。
「Ｗ」は、ＡとＢとの反応により形成される新規な結合を表し、Ｂがアミノ基であるとき、水中で適度に安定であることができるか、或いはＢがヒスチジンのイミダゾール残基の第二級アミン又は同様な構造を有する分子又はアルコールであるとき、水中で加水分解性である。
【００２２】
Ｐの例は、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド及び他の薬剤である。Ａは、例えば、Ｂに対して反応性の基であってよく、いくつかの例において、Ａは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール又はｐ−ニトロフェノールであるが、Ｂは、アミン又はアルコールによって表される。Ｗの例としては、活性カルバミン酸エステルとアミンの反応により生成した尿素又は活性カルバミン酸エステルとヒドロキシル基との反応によるウレタンなどがある。Ｗは、水中で加水分解性であることができ、例えば、活性カルバミン酸エステルとヒスチジンのイミダゾール残基アミンとの反応により生成した尿素である（スキームＡ）か、又はアミノ基の場合に適度に安定である（スキームＢ）。いずれの場合にも、これらの新規なＰＥＧ及びポリマー誘導体の結合は、本発明のポリマー物の反応性がより低いため、選択される薬物における最も反応性が高い又は露出している基に限定されるか、又は優先的に向けられる。
【００２３】
【化２】
【００２４】
スキーム１ 加水分解性複合体を得る本発明の例で、メトキシ−ＰＥＧを、この薬物のイミダゾール残基へのカップリングによる薬物への結合に用いることがこの式によって示されている。
【００２５】
【化３】
【００２６】
スキーム２ 適度に安定な複合体を得る本発明の例で、メトキシ−ＰＥＧを、この薬物のアミノ基へのカップリングによる薬物への結合に用いることがこの式によって示されている。
【００２７】
タンパク質は、加水分解による分解によりその未変性の形で放出され、それに結合した別の分子はない。
【００２８】
本発明は、弱反応性カルバミン酸エステルがタンパク質などの多官能性薬物における利用可能な異なる基のすべてのより十分な識別を可能にし、薬物の結合の部位がイミダゾール（すなわち、ヒスチジン）のアミンである場合、得られる複合体が加水分解の後に未変性の薬物を放出することができる、活性化ＰＥＧ及び関連ポリマーを提供する。さらに、加水分解の速度は、ポリマーの活性基に近い適切な化学部分により調整することができる。
【００２９】
本発明の前述及び他の目的、利点、特徴並びに同一のものを達成する方法を、本発明の以下の詳細な説明においてさらに説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明の目的は、式：
Ｐｏｌｙ−（Ｘ−ＮＨ−ＣＯ−Ａ）ｎ
の化合物によって表される。
式中、
Ｐｏｌｙは、約３００から１０００００ダルトンの分子量を有する親水性ポリマーであり、
Ａは、−ＮＨ−ＣＯ−と一緒になって反応性基を形成しており、好ましい実施形態において、Ａは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール又はｐ−ニトロフェノールから選択され、
Ｘは、スペーサー部分又は結合であり、
ｎは、Ｐｏｌｙに存在する化学的に活性な末端基の数を表す、１から５０まで、好ましくは１から１０まで、より好ましくは１から５までを含む、さらにより好ましくはｎは１に等しい整数である。
【００３１】
本発明の実施形態によれば、Ｘは、
ａ）−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ１）−ＣＨ（Ｒ２）−
［式中、Ｒ１及びＲ２は、互いに独立に、Ｈ、場合によって置換されたアルキル基、場合によって置換されたアリール基、場合によって置換されたアリールアルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基及び／又はカルボキシ基から選択される］、
ｂ）ヒドロキシ、アミノ又はカルボキシ基から好ましくは選択される１つ又は複数の基により場合によって置換されたアルキル基、
ｃ）アリール基、
から選択される。
【００３２】
他の実施形態によれば、ＸはＣ２〜Ｃ１０アルキル基であってもよく、Ｒ１及び／又はＲ２はＨ又はＣ２〜Ｃ１０アルキル基であってもよい。Ｘはまた、ペプチド又はオリゴヌクレオチドとしての分子であることができる。Ｐｏｌｙは、直鎖若しくは分枝ポリ（エチレングリコール）又はその誘導体であってもよく、好ましくはメトキシ−ポリ（エチレングリコール）若しくはジオール−ポリ（エチレングリコール）から選択され、特に、ポリ（エチレングリコール）は、約１００００から６００００ダルトン、好ましくは５０００から４００００ダルトンの分子量を有していてよい。
【００３３】
他の実施形態は、薬学的又は診断上活性な物質と本発明による化合物との複合体の調製の方法によって表され、当該方法は、以下を含む。
・薬学的又は診断上活性な物質と本発明による化合物とを混合すること、
・最終複合体を分離すること。
【００３４】
好ましくは、混合は、水又は緩衝溶液中で３〜４０℃の温度で１〜３時間行い、次に、分離は、好ましくは沈殿、又はイオン交換、ゲルろ過若しくは逆相クロマトグラフィーなどのクロマトグラフ法により行う。
【００３５】
以下の詳細な説明では、概要において示した以下の一般式によって表されるような本発明において開示した誘導体のいくつかの例を述べる。
【００３６】
【化４】
【００３７】
以下の記述において、Ｐｏｌｙは、便宜上しばしばＰＥＧと呼ぶ。しかし、同様な特性の他の親水性ポリマーも本発明の実施における使用に適しており、ＰＥＧという用語の使用は、この点で、包含的であって、排他的ではないことを意図する。
【００３８】
ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）としても知られているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、本発明の実施において有用である。ＰＥＧは、主として多くの医薬製剤、例えば、非経口、局所、眼、経口及び直腸経路により投与される製剤に用いられる。ＰＥＧは、安定であり、組織及び粘膜との良好な適合性を示す。ＰＥＧは、一般的に透明、無色、無臭、水に可溶で、熱に対して安定、多くの化学物質に対して不活性であり、加水分解又は変質せず、無毒性である。ポリ（エチレングリコール）及びその誘導体は、両親媒性挙動、水性及び有機溶媒における溶解性、高純度、低多分散性、生物学的適合性などのそれらの有用な特性のため、化学、生物医学及び他の産業用途においてますます多くの関心を集めつつあり、それらは他の化合物に結合する場合に活性化することができるので、そのようなポリマーは、例えば、薬物担体、液相ペプチド又はポリヌクレオチド合成用のマトリックス、表面改質剤として、並びにペプチド及びタンパク質との複合体を製造するために用いられている。ＰＥＧは、体内である種の望ましい機能を有する部分に結合させた場合、薬物のサイズを増加させて、腎クリアランスを低下させ、薬物表面を遮蔽する傾向があり、生物体が、より低いクリアランスのためその機能をより長く明らかにすることができる薬物の存在に耐えることができるように、免疫反応を低減又は無くすことができる。したがって、本発明の活性化ＰＥＧは、実質的に無毒性であるはずであり、免疫反応又は他の望ましくない作用をもたらす傾向はないはずである。
【００３９】
ＰＥＧ以外の他の水溶性ポリマー、例えば、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（オキシエチル化ソルビトール）等、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（アクリロイルモルホリン）（ＰＡｃＭ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）は、同様な用途に適している。ポリマーは、リンカーへの結合に利用可能な単一活性部位を有するｍＰＥＧ及び他のキャップされた単官能ＰＥＧと同様な直鎖若しくは分枝した構造を有する、又は置換若しくは非置換ホモポリマー又はランダム若しくはブロックコポリマーであることができる。
【００４０】
「薬物」という用語は、ヒト及び他の動物における疾患の診断、治療、緩和、治癒若しくは予防に有用な、又は他の点では身体的若しくは精神的健康を増進するあらゆる物質を意図する。
【００４１】
「基」、「官能基」、「部分」、「活性基」、「反応性基」及び「反応性部位」という用語は、化学技術分野においてすべて類義語であり、当技術分野及び本明細書において分子の別個の定義可能な部分若しくはユニットを指し、ある機能若しくは活性を示し、他の分子若しくは分子の一部と反応するユニットを指すのに用いられる。
【００４２】
「結合」という用語は、化学反応の結果として通常形成される「基」を指すのに用いられ、一般的に共有結合である。加水分解で不安定な結合は、水と反応して一般的に分子を２つ又はそれ以上の成分に分離するものである。
【００４３】
ＰｏｌｙがＰＥＧである場合、ポリマーは、少なくとも１０００Ｄａ、好ましくは少なくとも４０００、より好ましくは少なくとも１００００、さらにより好ましくは少なくとも２００００の平均分子量を優先的に有する。好ましい実施形態において、Ｐｏｌｙは、１０００から４００００Ｄａまでの平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）である。いくつかの好ましいＰｏｌｙは、直鎖又は分枝構造を有するＰＥＧ１００００、ＰＥＧ２００００、ＰＥＧ３００００、ＰＥＧ４００００である。
【００４４】
本発明は、上で報告したように、ｉｎ ｖｉｖｏで、又はリビング物質に由来する物質内に送達すべき分子のアミンへの結合に有用な反応性基の反応性をあらかじめ決める部分を含むＰＥＧ、すなわちＰＥＧ−Ｘ−ＮＨ−ＣＯ−Ａを含む。
ここで、「Ｘ」はスペーサー部分又は結合であり、
Ｘは以下の中から選択することもできる。
ａ）−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ1）−ＣＨ（Ｒ２）−、［式中、Ｒ１及びＲ２は、独立にＨ又は場合によって置換されたアルキル若しくは場合によって置換されたアリール若しくは場合によって置換されたアリールアルキル基又は好ましくはオキシ、ヒドロキシ、アミノ若しくはカルボキシ基から選択される基であり、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈであるとき、βアミノ酸スペーサーはβアラニンである］、
ｂ）又はＸは、好ましくはオキシ、ヒドロキシ、アミノ若しくはカルボキシ基から選択される１つ又は複数の基により場合によって置換された２から１０個の炭素を含むことが好ましいアルキル基であり、
ｃ）又はＸは、アリール基である。
Ｘは、ペプチド又はオリゴヌクレオチドとしての薬物であることもでき、ＰＥＧ誘導体と結合分子との間の結合が水中で加水分解性であるとき、これは、薬物の活性のトリガをあらかじめ決めるために活用することができる。
【００４５】
ここで、「Ａ」は、−ＮＨ−ＣＯ−部分と一緒になって反応性基を形成しており、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール又はｐ−ニトロフェノールの群から選択される。
【００４６】
好ましい実施形態において、ＰＥＧ誘導体は以下の式を有する。
ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ
ＰＥＧ−ＯＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ
ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ1）−ＣＨ（Ｒ２）−Ｎ（Ｒ３）−ＣＯ−ＮＨＳ
ここで、Ｒ1、Ｒ２及びＲ３は、独立にＨ又は場合によって置換されたアルキル若しくは場合によって置換されたアリール若しくは場合によって置換されたアリールアルキル基又は好ましくはオキシ、ヒドロキシ、アミノ若しくはカルボキシ基から選択される基であり、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈであるとき、βアミノ酸スペーサーはβアラニンである。
【実施例】
【００４７】
本発明はさらに、ＰＥＧ誘導体のいくつかの特定の例を用いて、それらの合成及び適用を説明する。
【００４８】
（実施例１）
ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ（ｎ＝１〜４）の調製
反応
【００４９】
【化５】
【００５０】
ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２２００００（５．０ｇ、０．２５ｍモル、ｎ＝１〜４）を５０ｍｌのアセトニトリルを用いて共沸により乾燥し、次いで、室温まで徐々に冷却した。得られた溶液に炭酸ジスクシンイミジル（２６５ｇ、１ｍモル）及びピリジン（０．２５ｍｌ）を加え、室温で一夜、反応を進行させた。次いで、溶媒を真空中で除去し、４０ｍｌの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２を残留物に加えた。不溶性固体をろ過により除去し、ろ液をｐＨ４．５の塩化ナトリウム飽和酢酸緩衝液で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶液を真空中で１５ｍｌまで濃縮した。濃縮溶液を３００ｍｌのジエチルエーテル上に激しく撹拌しながら滴下した。沈殿物をろ過により収集し、真空中で乾燥した。収量：４．６ｇ（９２％）。1Ｈ-ＮＭＲ、ＣＨ３Ｏ-ＰＥＧ-(ＣＨ２)２-ＮＨ-ＣＯ-ＮＨＳ (ＣＤＣｌ３): δ ３．６２ (ｂｓ, -Ｏ-ＣＨ２-ＰＥＧ), δ ３．５４ (ｔ, -ＣＨ２-ＣＨ２-ＮＨ-ＣＯ-ＮＨＳ), δ ２．８（ｓ，−ＮＨＳ）。
【００５１】
（実施例２）
（βアラニン）を経るＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳの調製
反応
【００５２】
【化６】
【００５３】
ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ２２００００（５．０ｇ、０．２５ｍモル）を５０ｍｌのトルエンを用いて共沸により乾燥し、次いで、室温まで徐々に冷却した。得られた１２ｍｌ溶液に１０ｍｌの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２、Ｎ−ＢＯＣ−βアラニンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１４４．７ｍｇ、０．５ｍモル）及びＥｔ３Ｎ（７０μｌ、０．５ｍモル）を加え、室温で一夜、反応を進行させた。次いで、溶液をろ過し、３００ｍｌのジエチルエーテル上に激しく撹拌しなから滴下した。ろ過により収集し、真空中で乾燥した沈殿物をＣＨ２Ｃｌ２／ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ（５４．５：４５．４：０．１）の２０ｍｌの溶液に溶解し、室温で３時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、得られた油に２０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２を加えた。得られた溶液に炭酸ジスクシンイミジル（２６５ｍｇ、１ｍモル）及びピリジン（０．２５ｍｌ）を加え、室温で一夜、反応を進行させた。次いで、溶媒を真空中で除去し、４０ｍｌの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２を残留物に加えた。不溶性固体をろ過により除去し、ろ液をｐＨ４．５の塩化ナトリウム飽和酢酸緩衝液で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶液を真空中で１５ｍｌまで濃縮した。濃縮溶液を３００ｍｌのジエチルエーテル上に激しく撹拌しながら滴下した。沈殿物をろ過により収集し、真空中で乾燥した。収量：４．２ｇ（８４％）。1Ｈ-ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）: δ ３．６２（ｂｓ，−Ｏ−ＣＨ２−ＰＥＧ）, δ ３．５４ （ｔ，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ）, δ ２．５ （ｔ，−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ）, δ ２．８（ｓ，−ＮＨＳ）。
【００５４】
（実施例３）
ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳの調製（ＤＣＣ／ＮＨＳを経る）
反応
【００５５】
【化７】
【００５６】
ジシクロヘキシルカルボジイミド（２３２ｍｇ、１．１２５ｍモル）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１３０ｍｇ、１．１２５ｍモル）を、１５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、室温で１時間撹拌した。次いで、溶液に事前に５０ｍｌのトルエンを用いて共沸により乾燥したＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ２２００００（５．０ｇ、０．２５ｍモル）及びＥｔ３Ｎ（７０μｌ、０．５ｍモル）を加えた。次いで、溶媒を真空中で除去し、４０ｍｌの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２を残留物に加えた。不溶性固体をろ過により除去し、ろ液をｐＨ４．５の塩化ナトリウム飽和酢酸緩衝液で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶液を真空中で１５ｍｌまで濃縮した。濃縮溶液を３００ｍｌのジエチルエーテル上に激しく撹拌しながら滴下した。沈殿物をろ過により収集し、真空中で乾燥した。収量：４．６ｇ（９２％）。1Ｈ-ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）: δ ３．６２（ｂｓ，−Ｏ−ＣＨ２−ＰＥＧ）, δ ３．５４ （ｔ，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ）, δ ２．５ （ｔ，−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ）, δ ２．８（ｓ，−ＮＨＳ）。
【００５７】
（実施例４）
ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ−（４−カルボキシメチル）−ピペリジン−ＣＯ−ＮＨＳ（ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＭＰ−ＣＯ−ＮＨＳ）の調製
反応
【００５８】
【化８】
【００５９】
ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ２２００００（５．０ｇ、０．２５ｍモル）を５０ｍｌのトルエンを用いて共沸により乾燥し、次いで、室温まで徐々に冷却した。得られた１２ｍｌ溶液に１０ｍｌの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２、Ｎ−ＢＯＣ−（４−カルボキシメチル）−ピペリジンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＣＭＰ；１７０ｍｇ、０．５ｍモル）及びＥｔ３Ｎ（７０μｌ、０．５ｍモル）を加え、室温で一夜、反応を進行させた。次いで、溶液をろ過し、３００ｍｌのジエチルエーテル上に激しく撹拌しなから滴下した。ろ過により収集し、真空中で乾燥した沈殿物をＣＨ２Ｃｌ２／ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ（５４．５：４５．４：０．１）の２０ｍｌの溶液に溶解し、室温で３時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、得られた油に２０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２を加えた。得られた溶液に炭酸ジスクシンイミジル（２６５ｍｇ、１ｍモル）及びピリジン（０．２５ｍｌ）を加え、室温で一夜、反応を進行させた。次いで、溶媒を真空中で除去し、４０ｍｌの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２を残留物に加えた。不溶性固体をろ過により除去し、ろ液をｐＨ４．５の塩化ナトリウム飽和酢酸緩衝液で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶液を真空中で１５ｍｌまで濃縮した。濃縮溶液を３００ｍｌのジエチルエーテル上に激しく撹拌しながら滴下した。沈殿物をろ過により収集し、真空中で乾燥した。収量：４．１ｇ（８２％）。
【００６０】
（実施例５）
ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ５０００によるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の修飾
反応
【００６１】
【化９】
【００６２】
リン酸緩衝液１０ｍＭ ｐＨ７中５ｍｇ／ｍｌのｈＧＨの溶液１ｍｌに、３４．３ｍｇのＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨＯＣ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ５０００（６．８５×１０−３ｍモル）を加えた。溶液を撹拌し、５℃に２時間維持した。５．１４ｍｇ（６．８５×１０−２ｍモル）のＧｌｙを加えて反応を停止させた。次いで、溶液を０．２２μｍフィルターによりろ過し、直接分析した。
【００６３】
得られた溶液をゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により調べたところ、図１に示すように天然ｈＧＨピーク（通常ｔｒ＝１０．２’）の消失により、２時間後にすべてのタンパク質の量がＰＥＧと反応した。主として、２つの複合体が生成し、１つは他のもの（ｔｒ＝７．４８０’）より高い流体力学的体積（ｔｒ＝６．９４７’）を有しており、差は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析検査により確認されたようにＰＥＧ化の程度の差に起因する。ゲル浸透によるピークを収集し、脱塩し、次いで、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分析した。分析により、ｔｒ＝７．４８０’におけるピークは主としてモノＰＥＧ−ｈＧＨ複合体により構成されており、ｔｒ＝６．９４７’におけるピークはジＰＥＧ−ｈＧＨ及びトリＰＥＧ−ｈＧＨ複合体により構成されていると思われた。
【００６４】
上で報告したように得られたＰＥＧ−ｈＧＨ複合体の溶液を室温でインキュベートするとき、ＧＰＣにおけるクロマトグラムプロファイルは、４８時間以内にモノＰＥＧ−ｈＧＨピークの増加及び遊離ｈＧＨ（ｔｒ＝１０．２’におけるピーク）の生成に釣り合うジ及びトリＰＥＧ−ｈＧＨ複合体に対応するピーク面積の緩やかな減少を示している（図２）。
【００６５】
データは、この結合に当量より大過剰のポリマー（３０倍）を用いたが、新規なＰＥＧ誘導体の少数の鎖のみ（主として１又は２本）がｈＧＨと反応することを示唆している。これは、１０〜３０までの範囲のＰＥＧ／タンパク質モル比を用いたポリ（エチレングリコール）５０００ＤａのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍＰＥＧ−ＣＯ−ＮＨＳ）によるヒト成長ホルモンのＰＥＧ化試験においてＣｌａｒｋ Ｒ．により報告（例えば、非特許文献１０参照）されたことと対照的であり、この場合、マルチＰＥＧ化複合体（テトラ−、ペンタ−及びエサ−ＰＥＧ−ｈＧＨ）から主として構成されている異性体の広範囲な混合物が得られた。このことから、ｍＰＥＧ−ＣＯ−ＮＨＳの反応性がより高い場合、該ポリマーはタンパク質中の温和な反応性のアミノ基とも反応することができ、それにより、すべての修飾可能アミノ基の識別とモノＰＥＧ化種のみを得ることとの両方が困難になるため、マルチＰＥＧ化につながることがわかる。さらに、Ｃｌａｒｋ Ｒ．により合成された複合体は結合ＰＥＧ鎖を放出せず、これは、ＰＥＧ化の後のタンパク質の活性の喪失が永久的であることを意味しており、一方、５日間のインキュベーションの後の、本発明のＰＥＧ誘導体物を用いて得られた複合体のＧＰＣのデータは、ＰＥＧ−ｈＧＨ複合体の緩やかな加水分解と、それによる十分に活性な天然タンパク質の部分的な回復を示している。
【００６６】
（実施例６）
実施例５において報告したように得られたＰＥＧ−ｈＧＨ複合体の薬物動態及び薬力学
実施例５から得られたＰＥＧ−ｈＧＨ複合体の薬物動態プロファイルをラット及びサルにおいて評価し、天然ｈＧＨと比較した。用いた用量は、ラットの場合には２．５ｍｇ／ｋｇ（タンパク質で表した）であり、サルにおいては１．５ｍｇ／ｋｇであった。図３及び４にラット及びサルにおける天然ｈＧＨ及びＰＥＧ−ｈＧＨの薬物動態プロファイルを示す。天然タンパク質からＰＥＧ化形への変化に伴う半減期（ｔ１／２）の延長は、ラット及びサルにおいてそれぞれぞれ約１０及び７倍であった。文献（例えば、非特許文献１０）に報告されたデータは、ジＰＥＧ５０００−ｈＧＨについては５．８時間、高度ＰＥＧ化のペンタＰＥＧ５０００−ｈＧＨについては１５時間のｔ１／２を示し、Ｃｌａｒｋ Ｒ．及び共同研究者らの試験において分析された複合体は、マルチＰＥＧ化ｈＧＨ異性体の広範囲の混合物の多段階精製によって得られた。両方が活性化ＰＥＧ誘導体としてｍＰＥＧ５０００−ＣＯ−ＮＨＳを用いて得られた。
【００６７】
薬力学は、ｈＧＨの毎日の皮下注射（６×４０μｇ／ｋｇ）、又はＰＥＧ−ｈＧＨ（実施例５から得られた）１日×２４０μｇ／ｋｇの１回の注射を行った下垂体切除ラットにおいて評価した。動物の体重増加を６日間追跡した。図５に示すように、ＰＥＧ−ｈＧＨの単回投与は、ｈＧＨの毎日の注射と等しい効力を有する。
【００６８】
（実施例７）
新規なＰＥＧ誘導体及びｍＰＥＧ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＳの安定性及び反応性
新規なＰＥＧ誘導体及びｍＰＥＧ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＳの安定性及び反応性は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の水中加水分解に基づいて評価した。ＮＨＳ加水分解の速度は、ホウ酸緩衝液０．１Ｍ ｐＨ８中０．１ｍモルの活性化ＰＥＧ誘導体の試料の２８０ｎｍでの吸光度の増加を検出することによって追跡した。図６にある種のＰＥＧ誘導体のＡＢＳ ２８０ｎｍ増加対時間を示す。ｍＰＥＧ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＳの安定性と比較してｍＰＥＧ−Ｘ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ誘導体の安定性が高いことは明らかである。表１に各ＰＥＧ誘導体のＮＨＳ加水分解ｔ１／２を示す。
【００６９】
【表１】
【００７０】
新規なＰＥＧ誘導体の水に対する反応性がより低いことを示している、この実験の結果は、これらの誘導体を用いて得られたタンパク質修飾の程度がより低いこと（実施例５に報告したように）と一致しており、したがって、タンパク質中の反応性が最も高い、及び露出した残基のみを修飾することができる。
【００７１】
（実施例８）
単一アミノ酸に対する異なるＰＥＧ誘導体の反応性の比較
ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳの反応性とｍＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍＰＥＧ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＳ）の反応性とを比較するために、Ｎ−ＢＯＣ−Ｔｙｒ、Ｎα−ＢＯＣ−Ｈｉｓ及びヒドロキシ基などの潜在的に反応性の基を有する他の保護されたアミノ酸に対するこれらのＰＥＧポリマーの結合を試験した。
【００７２】
７ｍｇ／ｍｌの最終濃度でＣＨ２Ｃｌ２中アミノ酸の溶液を調製し、Ｅｔ３ＮでｐＨを８にした。アミノ酸当量に対して１／５のモル比で、ＰＥＧ誘導体を加えた。カップリングの程度は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳは、Ｎα−ＢＯＣ−Ｈｉｓとのみ反応したが、同じ条件で、ｍＰＥＧ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＳは、ヒドロキシ基と複合体を形成する。これにより、タンパク質中の異なる反応性基を識別することを可能にする、新規なポリマーのより低い反応性が証明される。さらに、両誘導体はＮα−ＢＯＣ−Ｈｉｓとの複合体（イミダゾール側鎖におけるＮδ１原子への結合）を形成するが、ｍＰＥＧ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＳとアミノ酸との複合体は非常に不安定であり、実際、それは、一般的な活性化ポリエチレングリコールであるカルボニルイミダゾールＰＥＧを反映しており、一方、ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳを用いて得られた複合体はより安定であり、Ｎα−ＢＯＣ−Ｈｉｓの放出の程度は、水中での５日間のインキュベーションにわたって約３５％である。これを、ＰＥＧの結合をタンパク質のＨｉｓ残基に優先的に向ける条件を用いて（例えば、非特許文献１１に報告されたように）タンパク質のＰＥＧ化に活用し、それにより、血中半減期の延長を達成するのにｉｎ ｖｉｖｏで十分に安定であるが、同時に天然タンパク質又はそれとより少ない結合ＰＥＧ鎖との複合体を部分的に放出できる複合体を得ることができる。
【００７３】
（実施例９）
ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ５０００によるＬＨＲＨペプチドの修飾
反応
【００７４】
【化１０】
【００７５】
ＬＨＲＨペプチド（Ｐ−ＧｌｙＨｉｓＴｒｐＳｅｒＴｙｒＤＴｒｐＬｅｕＡｒｇＰｒｏＧｌｙ）は、ＰＥＧ結合のための第一級アミノ基を欠いており、他の潜在的に反応性のアミノ酸（ペプチドに存在するＴｙｒのような）は独立した実験において本発明のＰＥＧ誘導体に対する反応性を示さなかったことから、結合は、Ｈｉｓ側鎖のレベルでのみ起り得る。
【００７６】
リン酸緩衝液１０ｍＭ ｐＨ７中０．３２ｍｇ／ｍｌのＬＨＲＨペプチド溶液１ｍｌに、３６．６ｍｇのＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ５０００（７．３２×１０−３ｍモル）を加えた。溶液を撹拌し、５℃で２時間維持した。５．４９ｍｇ（７．３２×１０−２ｍモル）のＧｌｙを加えて反応を停止させた。溶液を０．２２μｍフィルターによりろ過し、次のように分析した。複合体をＧＰＣにより評価し、図７に示すように、７．９５５’におけるＬＨＲＨ−ＰＥＧ複合体ピークの出現は、複合体の生成を示すものであった。
【００７７】
（実施例１０）
ＰＥＧ２−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ２００００による顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の修飾
反応
【００７８】
【化１１】
【００７９】
リン酸緩衝液１０ｍＭ ｐＨ７中５ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦの溶液１ｍｌに８０．３４ｍｇのＰＥＧ２−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ２００００（４．０２×１０−３ｍモル）を加えた。溶液を撹拌し、５℃で２時間維持した。
【００８０】
３．０１ｍｇ（４．０２×１０−２ｍモル）のＧｌｙを加えて反応を停止させた。次いで、溶液を０．２２μｍフィルターによりろ過し、得られた生成物を図８に示すようにゲル透過クロマトグラフィーにより直接分析した。分析により、すべてのＧ−ＣＳＦが２時間以内にＰＥＧ化され（ｔｒ＝９．９２７’におけるＧ−ＣＳＦピークの消失）、同時に２つの複合体が生成し、１つは他のもの（ｔｒ＝６．８９７’）より高い流体力学的体積（ｔｒ＝６．４２２’）を有することが明らかになった。その差はポリマー結合の程度の差に起因しており、明らかに第１のものは第２のものよりタンパク質に結合した多くのＰＥＧ鎖を有している。
【００８１】
上で得られた複合体の溶液を室温で４８時間インキュベートし、ＧＣＰにより分析した。分析により、ｔｒ＝６．８９７’におけるピーク（低分子量複合体に対応する）の増加及び遊離Ｇ−ＣＳＦ（ｔｒ＝９．９２７’におけるピーク）の生成に釣り合うｔｒ＝６．４２２’におけるピーク（高分子量複合体に対応する）の面積の緩やかな減少が示された（図９）。
【００８２】
（実施例１１）
ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ５０００によるエピルビシンの修飾
反応
【００８３】
【化１２】
【００８４】
小薬物の体内滞在時間を延長させるのに有用であり得る巨大分子プロドラッグを調製するために、ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳをエピルビシンに結合させた。
【００８５】
４０ｍｌのＤＭＦに溶解した２５０ｍｇのエピルビシン・ＨＣｌ（０．４３ｍモル）に２．１５ｇのＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ（０．３５８ｍモル）を加えた。ＰＥＧの溶解後に、１１９．９μｌのＥｔ３Ｎ（０．８６ｍモル）を反応混合物に加えた。暗所で撹拌しながら１２時間にわたって反応を進行させた。次いで、約３０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２を加え、未反応のエピルビシンをＨＣｌ ０．１Ｎ（６×８０ｍｌ）により抽出した。無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した有機相を小容積に濃縮した。得られた油に、１５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２を加え、濃縮溶液を３００ｍｌのジエチルエーテル上に激しく撹拌しながら滴下した。沈殿をろ過により収集し、真空中で乾燥した。収量：１．８２ｇ（０．３２８ｍモル；９１．６％）。
【００８６】
本発明を例示した特定の実施形態において説明した。しかし、前記の説明は、本発明を例示した実施形態に限定することを意図するものでなく、当業者は、先の明細書に記述したように本発明の範囲内及び精神を逸脱せずに変形を行うことができることを認識すべきである。
【００８７】
一方、本発明は、添付した特許請求の範囲により定義されている本発明の真の精神及び範囲内に含めることができるすべての選択肢、修正及び同等物を含む。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ ５０００Ｄａを用いたｈＧＨのＰＥＧ化により得られたＰＥＧ−ｈＧＨ複合体のゲル透過プロファイルを示す図であり、ｔｒ＝６．９４７’におけるピークは高分子量の複合体を示し、ｔｒ＝７．４８０’におけるピークは低分子量の複合体を示し、ｔｒ＝１０．５４３’におけるピークは遊離ＮＨＳを示す図である。
【図２】ＰＢＳ １０ｍＭ ｐＨ７中で４８時間インキュベートしたＰＥＧ−ｈＧＨ複合体のゲル透過プロファイルを示す図であり、点線は反応混合物からのＰＥＧ−ｈＧＨ複合体を示し、実線は４８時間のインキュベーション後のＰＥＧ−ｈＧＨ複合体を示す図である。
【図３】ラットにおける天然ｈＧＨ及びＰＥＧ−ｈＧＨ（実施例５で得られた）の薬物動態プロファイルを示す図である。
【図４】サルにおける天然ｈＧＨ及びＰＥＧ−ｈＧＨ（実施例５で得られた）の薬物動態プロファイルを示す図である。
【図５】毎日ｈＧＨ又は１回ＰＥＧ−ｈＧＨ（実施例５で得られた）を皮下注射した下垂体切除ラットの体重増加を示す図である。
【図６】ホウ酸緩衝液０．１Ｍ ｐＨ８中でインキュベートしたＰＥＧ誘導体のＮＨＳの加水分解の速度を示す図である。
【図７】天然ＬＨＲＨ（赤線）及びＰＥＧ／ＬＨＲＨ複合体反応（黒点線）のゲル透過プロファイルを示す図であり、ｔｒ＝７．９５５’におけるピーク（黒三角）はＰＥＧ−ＬＨＲＨ複合体を示し、ｔｒ＝１０．４５７’におけるピーク（●）は天然ＬＨＲＨ及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドを示す図である。
【図８】ＰＥＧ２−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ ２００００ Ｄａを用いたＧ−ＣＳＦのＰＥＧ化により得られたＰＥＧ−Ｃ−ＧＳＦ複合体のゲル透過プロファイルを示す図であり、ｔｒ＝６．４２２’におけるピークは高分子量の複合体を示し、ｔｒ＝６．８９７’におけるピークは低分子量の複合体を示し、ｔｒ＝９．９２７’におけるピークは未反応Ｇ−ＣＳＦを示し、ｔｒ＝１０．３９２’におけるピークは遊離ＮＨＳを示す図である。
【図９】ＰＢＳ １０ｍＭ ｐＨ７中で４８時間インキュベートしたＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ複合体のゲル透過プロファイルを示す図であり、点線は、反応混合物からのＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ複合体を示し、実線は、４８時間のインキュベーション後のＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ複合体を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な活性化ポリ（エチレングリコール）及び他の親水性ポリマーの調製並びに生体材料を改良するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）としても知られているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、広範囲の分子量のものが入手可能である柔軟な直鎖ポリマーであり、主として多くの医薬製剤、例えば、非経口、局所、眼、経口及び直腸経路により投与される製剤に用いられることが知られている。それらは、一般式ＨＯＣＨ２（ＣＨ２ＯＣＨ２）ｍＣＨ２ＯＨに対応するか、又はメトキシ化形ＣＨ３ＯＣＨ２（ＣＨ２ＯＣＨ２）ｍＣＨ２ＯＨであり、式中、ｍはポリオキシエチレン部分の平均数を表す。ＰＥＧは、安定であり、組織及び粘膜との良好な適合性を示す。それらは、それらの分子量に応じて、いくつかの形で存在することができる。このように、２００ダルトン（Ｄａ）から６００ＤａまでのＰＥＧは液体であり、１０００ダルトンより高い分子量を有するＰＥＧはワックスタイプの固体であるが、６０００Ｄａ及びそれ以上を有するものは易流動性粉末である。
【０００３】
ＰＥＧは、経口、非経口及び局所適用で低い毒性を有する。ヒトにおける静脈内投与後に、１０００Ｄａから１００００Ｄａまでの分子量を有するＰＥＧは、主として腎経路により速やかに排泄され、より高い分子量を有するものは、分子量が増加するにつれて速度が低下する。
【０００４】
ＰＥＧは、水溶液に、粘度及びそれらの粘稠度を個々に調整するための物質として用いられている。約３０％に及ぶ濃度で、それらは非経口溶液用にも用いられている。固体の医薬剤形中では、高い分子量を有するＰＥＧは、結合剤の効率を増加させ、それにより、粒子に可塑性を付与することができる。高い分子量を有するものは、とりわけ滑沢剤としても用いられている（非特許文献１参照）。
【０００５】
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）及びその誘導体は、両親媒性挙動、水性及び有機溶媒における溶解性、高純度、低多分散性、生物学的適合性などのそれらの有用な特性のため、化学、生物医学及び他の産業適用分野においてますます多くの関心を集めつつある。それらは、他の化合物に結合した場合に活性化することができるので、そのようなポリマーは、例えば、薬物担体、液相ペプチド又はポリヌクレオチド合成用のマトリックス、表面改質剤として、並びにペプチド及びタンパク質との複合体を製造するために用いられている（例えば、非特許文献２及び非特許文献３参照）。
【０００６】
実際、タンパク質及びペプチドに対するＰＥＧの結合は、それらの溶解度の他に、安定性及びタンパク質分解性不活性化に対する抵抗性、薬物動態特性を改善することができ、さらに免疫原性及び抗原性を減弱させるためのものである（例えば、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７参照）。
【０００７】
言及した効果は、遮蔽効果により結合分子を覆い、保護し、それにより、タンパク質分解酵素の接近、免疫系細胞、受容体及び他の組織構成要素の接触を妨げるＰＥＧ及びその厳密に結合した水分子に起因することが示唆された。さらに、分子量の増加により、糸球体ろ過が減少し、結果として血漿半減期の延長及び複合体の薬物動態の改善が伴う。ＰＥＧに結合したタンパク質は、腎クリアランス及び免疫原性の低下のため、延長されたｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有することが開示されている（例えば、特許文献１（Ｄａｖｉｓら）参照）。さらに、文献に、遺伝子工学によっても得られる、興味深い生物学的特性を有するタンパク質性化合物のいくつかの例が記載されている。前記化合物のうち、ヘモグロビン、インスリン、ウロキナーゼ、αインターフェロン、Ｇ−ＣＳＦ、ｈＧＨ、アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ(過酸化水素及び分子状酸素中のスーパーオキシドラジカルの不均一化反応を触媒する金属酵素、以後ＳＯＤ)、カタラーゼ等を言及することができる（例えば、非特許文献８参照）。例えば、抗酸化酵素ＳＯＤ及びカタラーゼは、一般的に慢性関節リウマチ、靭帯変性疾患、虚血及び血管損傷の治療に用いることができた。しかし、未変性のタンパク質の治療効力は、それらの短い半減期及び起こり得るアレルギー副反応によって高度に制限される。これらの問題は、前記タンパク質をＰＥＧと結合させること（ＰＥＧ化として最もよく知られている方法により）で克服することができ、実際に、いくつかのＰＥＧ化タンパク質、特に、ＰＥＧ−アデノシンデアミナーゼ、ＰＥＧ−インターフェロン、ＰＥＧ−アスパラギナーゼ及びＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦがＦＤＡにより承認された。オリゴヌクレオチドもＰＥＧ化され、そのような生成物の１つがマキュゲン（Ｍａｃｕｇｅｎ）の商品名のもとに既に市販されている。
【０００８】
ＰＥＧを分子に結合させるためには、該ポリマーが該受容分子上の基との反応に適する末端の「活性基」を有することが必要である。医学研究における新発見及びナノテクノロジーツールの開発により、使用者の要求を満たすために適応させることができる種々の特性を有する新規かつ改良されたＰＥＧ誘導体に対する需要がますます多くなりつつある。
【０００９】
いくつかのものは、化学的方法又は酵素による法によりＰＥＧ化させることができるタンパク質中のアミノ酸残基であるが、アミンは、タンパク質中に一般的に存在し、溶媒に暴露されるという主な理由のため、さらにアミノアシル化又はアルキル化反応が文献（例えば、非特許文献９参照）により周知であるため、研究者の注意を最も引くものである。
【００１０】
例えば、Ｃｌａｒｋ Ｒ．は、１０から３０までのＰＥＧ／タンパク質モル比を用いたポリ（エチレングリコール）５０００Ｄａ（ｍＰＥＧ−ＣＯ−ＮＨＳ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルによるヒト成長ホルモンのＰＥＧ化を提案し（非特許文献１０参照）、マルチＰＥＧ化複合体から主として構成される異性体の広範囲にわたる混合物を得、それにより、活性化ＰＥＧ−脂肪酸（すなわち、ｍＰＥＧ−ＣＯ−ＮＨＳ）のような高反応性ＰＥＧを用いる場合、多くのポリマー鎖がタンパク質に結合し、モノＰＥＧ化種を得ることが困難になることを証明した。
【００１１】
炭酸スクシンイミジルＰＥＧ（ＳＣ−ＰＥＧ）の調製並びにタンパク質及びポリペプチドへのその結合が開示されている（例えば、特許文献２（１９９０年）（Ｚａｌｉｐｓｋｙ Ｓ．による）参照）。「活性化ＰＥＧ誘導体」はポリペプチドのアミノ基と速やかに反応するが、ｉｎ ｖｉｖｏで加水分解される能力を有し、出発の未変性タンパク質を生じさせる結合である、αインターフェロンのヒツチジンへのＰＥＧの結合（結合した総ＰＥＧの少なくとも３０％）を優先的に誘導する方法が開示されている（例えば、特許文献３（１９９９年）参照）。
【００１２】
しかし、ＳＣ−ＰＥＧ誘導体は依然タンパク質中の求核基とあまりにも速やかに反応し、それにより、ＰＥＧ誘導体がタンパク質中の異なる反応性アミノ酸残基を識別する可能性が減少し、したがって、ＰＥＧ化タンパク質異性体の複雑な混合物がもたらされる（例えば、非特許文献１１参照）。モノＰＥＧ−インターフェロン複合体混合物中に、ポリマーが不安定な結合によりヒスチジン３４に結合している異性体（異性体の総量の約４０％）が存在し、十分に活性なタンパク質の復元が望まれるにもかかわらず、それが他方で、安定なポリマー結合により達成された血液中の複合体の延長された半減期の十分な活用を妨げ得る。実際、加水分解後に未変性のタンパク質は速やかな腎クリアランスを受ける。したがって、このアミノ酸に対するより高い程度の結合、ひいては、複合体の延長された半減期と未変性のタンパク質のより高い活性という２つの対照的な因子のより良好な結びつけに加えて、なおも未変性のタンパク質をより遅い速度で放出することができるヒスチジンのレベルでのより安定なＰＥＧ−タンパク質結合が望まれる。
【００１３】
【特許文献１】米国特許第４，１７９，３３７号明細書
【特許文献２】国際公開第９０／１３５４０号パンフレット
【特許文献３】米国特許第５，９５１，９７４号明細書
【特許文献４】米国特許第６，２１４，９６６号明細書
【非特許文献１】Handbook of excipients 2000, 392-398）
【非特許文献２】Roberts M. J. et al., Adv. Drug Del. Rev., 54: 459-476, 2002
【非特許文献３】Veronese F. M., Biomaterials, 22: 405-417, 2001
【非特許文献４】Delgado C. et al., Critical Rev Ther Drug Carrier Syst 1992, 9, 249-304
【非特許文献５】Adv. Drug reviews 2002, 54, 453-606
【非特許文献６】Harris JM, Chess RB: Effect of PEGylation on Pharmaceuticals. Nature Reviews Drug Discoveries 2003, 2, 214-221
【非特許文献７】Veronese F. M., Pasut G., Drug Disc Today 2005, 10, 1451-1458
【非特許文献８】Pasut G. et al. Expert Op Ther Patents 2004, 14, 859-894
【非特許文献９】Harris JM, Chess RB, Nature Reviews Drug Discoveries 2003, 2, 214
【非特許文献１０】Clark R. J Biol Chem 1996, 271(36), 21969-21977
【非特許文献１１】Wang Y., et al. Adv Drug Del Rev 2002, 54, 547-570
【非特許文献１２】Greenwald RB, et al. Bioconjugate Chem 2003, 14:395-403
【非特許文献１３】Greenwald RB, et al. J Med Chem 2000, 43:475-487
【非特許文献１４】Tsubery H, et al. J Biol Chem 2004, 279(37):38118-38124
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
最近、複合ポリマーからのタンパク質の放出のためのいくつかのシステムが提案された（例えば、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４参照）が、それらのすべてがタンパク質への結合の後に免疫原性の問題を生じさせる可能性がある芳香族スペーサーを含んでいる。さらに、それらの大部分において、タンパク質の放出は酵素制御切断によって実現されており、酵素濃度は各人で異なっているため、これが異なるタンパク質放出速度、すなわち、異なる治療反応につながる可能性がある。結合した薬物がポリマーの活性基に近い不安定な結合の水加水分解により放出される複合体を形成する、タンパク質又は他の薬剤に対する結合に有用なＰＥＧ及び関連ポリマー誘導体が開示されており（例えば、特許文献４（２００１年）参照（Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ））、放出により、薬物に結合したポリマーに属する前の小部分が残り、それにより、特にタンパク質の修飾のための免疫原性の問題が生ずる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
したがって、あらかじめ決定され、かつ一般的な加水分解による開裂の制御のもとで未変性の形の複合薬物を放出することができる脂肪族スペーサーが歓迎される。
【００１６】
本発明は、水溶性複合体を得るためのタンパク質、酵素、小分子及びその他を含む薬物への結合に適する化学的に活性なポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）及び関連ポリマーを提供する。
【００１７】
本発明のＰＥＧ及び関連ポリマー誘導体は、タンパク質としての薬物中の利用可能な基のすべての識別ができる弱い活性基を含み、例えば、一般的なＰＥＧアシル化誘導体によるアミノ修飾は通常、異性体の広範囲の混合物をもたらす。これらの誘導体は、ＰＥＧ−薬物複合体に十分な循環時間を与え、ＰＥＧがイミダゾール残基（例えば、ヒスチジンの）に結合している場合、結合した薬物はあらかじめ決定された速度での加水分解による分解により周囲環境中に放出される。この新規な活性ＰＥＧ及び関連ポリマーを製造する方法、及びＰＥＧ複合体を製造する方法も本発明に含まれる。
【００１８】
これらの活性化ＰＥＧ及び関連ポリマー誘導体の薬物への結合により、水溶解性、サイズの増加、腎クリアランスの減少、安定性及び複合体に対する免疫原性の低下を付与することが可能である。イミダゾール残基若しくは同様な分子又はアルコールを介してこれらの活性誘導体を結合させることにより、結合の適切な設計による水性環境中への結合薬物の制御可能な加水分解による放出をもたらすことも可能である。本発明の活性化誘導体は、それらの低い反応性により、それらが選択される薬物の反応性が最も高く、及び／又は露出した基と優先的に反応することを可能にするため、例えば、限定的でないが、これらのＰＥＧ誘導体はタンパク質の反応性が最も高いアミノ基に主として結合することができるため、薬物におけるすべての反応性基を識別するのに用いることができる。本発明の誘導体は、タンパク質、ペプチド及び非タンパク質薬物の溶解度を増加させ、血中半減期を延長させ、最終的にポリマーからの薬物の放出を制御するのに用いることができる。本発明によれば、ポリマーに永久的に結合させたとき、以前には低い生物活性を有していた薬物は、上記の放出できる方法（例えば、限定的でないが、イミダゾール結合）によりこれらのＰＥＧ及びポリマー誘導体に結合させた場合に今や高い活性を有することができる。
【００１９】
一般的な形では、本発明の活性化誘導体は、以下の式によって記述することができる。
【００２０】
【化１】
【００２１】
上式において、
「Ｐｏｌｙ」は、約３００から１０００００ダルトンの分子量を有する親水性ポリマーであり、
「Ａ」は、−ＮＨ−ＣＯ−と一緒になって反応性基を形成しており、
「Ｘ」は、スペーサー部分又は結合であり、
「ｎ」は、Ｐｏｌｙに存在する化学的に活性な末端基の数を表す、１から５０まで、好ましくは１から１０まで、より好ましくは１から５まで、さらにより好ましくは１を含む整数である。
（Ｂ−Ｐ）ｎは、Ｐｏｌｙへの結合のための分子であり、Ｐは活性薬物であり、Ｂは、Ａと反応性であり、例えば、Ｂがヒスチジンのイミダゾール残基又はアミノ基であるタンパク質ＰなどのＰ中に本来に含まれるか、又はそれに意図的に結合させることができる同じ薬物の反応性基である。
「Ｗ」は、ＡとＢとの反応により形成される新規な結合を表し、Ｂがアミノ基であるとき、水中で適度に安定であることができるか、或いはＢがヒスチジンのイミダゾール残基の第二級アミン又は同様な構造を有する分子又はアルコールであるとき、水中で加水分解性である。
【００２２】
Ｐの例は、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド及び他の薬剤である。Ａは、例えば、Ｂに対して反応性の基であってよく、いくつかの例において、Ａは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール又はｐ−ニトロフェノールであるが、Ｂは、アミン又はアルコールによって表される。Ｗの例としては、活性カルバミン酸エステルとアミンの反応により生成した尿素又は活性カルバミン酸エステルとヒドロキシル基との反応によるウレタンなどがある。Ｗは、水中で加水分解性であることができ、例えば、活性カルバミン酸エステルとヒスチジンのイミダゾール残基アミンとの反応により生成した尿素である（スキームＡ）か、又はアミノ基の場合に適度に安定である（スキームＢ）。いずれの場合にも、これらの新規なＰＥＧ及びポリマー誘導体の結合は、本発明のポリマー物の反応性がより低いため、選択される薬物における最も反応性が高い又は露出している基に限定されるか、又は優先的に向けられる。
【００２３】
【化２】
【００２４】
スキーム１ 加水分解性複合体を得る本発明の例で、メトキシ−ＰＥＧを、この薬物のイミダゾール残基へのカップリングによる薬物への結合に用いることがこの式によって示されている。
【００２５】
【化３】
【００２６】
スキーム２ 適度に安定な複合体を得る本発明の例で、メトキシ−ＰＥＧを、この薬物のアミノ基へのカップリングによる薬物への結合に用いることがこの式によって示されている。
【００２７】
タンパク質は、加水分解による分解によりその未変性の形で放出され、それに結合した別の分子はない。
【００２８】
本発明は、弱反応性カルバミン酸エステルがタンパク質などの多官能性薬物における利用可能な異なる基のすべてのより十分な識別を可能にし、薬物の結合の部位がイミダゾール（すなわち、ヒスチジン）のアミンである場合、得られる複合体が加水分解の後に未変性の薬物を放出することができる、活性化ＰＥＧ及び関連ポリマーを提供する。さらに、加水分解の速度は、ポリマーの活性基に近い適切な化学部分により調整することができる。
【００２９】
本発明の前述及び他の目的、利点、特徴並びに同一のものを達成する方法を、本発明の以下の詳細な説明においてさらに説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明の目的は、式：
Ｐｏｌｙ−（Ｘ−ＮＨ−ＣＯ−Ａ）ｎ
の化合物によって表される。
式中、
Ｐｏｌｙは、約３００から１０００００ダルトンの分子量を有する親水性ポリマーであり、
Ａは、−ＮＨ−ＣＯ−と一緒になって反応性基を形成しており、好ましい実施形態において、Ａは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール又はｐ−ニトロフェノールから選択され、
Ｘは、スペーサー部分又は結合であり、
ｎは、Ｐｏｌｙに存在する化学的に活性な末端基の数を表す、１から５０まで、好ましくは１から１０まで、より好ましくは１から５までを含む、さらにより好ましくはｎは１に等しい整数である。
【００３１】
本発明の実施形態によれば、Ｘは、
ａ）−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ１）−ＣＨ（Ｒ２）−
［式中、Ｒ１及びＲ２は、互いに独立に、Ｈ、場合によって置換されたアルキル基、場合によって置換されたアリール基、場合によって置換されたアリールアルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基及び／又はカルボキシ基から選択される］、
ｂ）ヒドロキシ、アミノ又はカルボキシ基から好ましくは選択される１つ又は複数の基により場合によって置換されたアルキル基、
ｃ）アリール基、
から選択される。
【００３２】
他の実施形態によれば、ＸはＣ２〜Ｃ１０アルキル基であってもよく、Ｒ１及び／又はＲ２はＨ又はＣ２〜Ｃ１０アルキル基であってもよい。Ｘはまた、ペプチド又はオリゴヌクレオチドとしての分子であることができる。Ｐｏｌｙは、直鎖若しくは分枝ポリ（エチレングリコール）又はその誘導体であってもよく、好ましくはメトキシ−ポリ（エチレングリコール）若しくはジオール−ポリ（エチレングリコール）から選択され、特に、ポリ（エチレングリコール）は、約１００００から６００００ダルトン、好ましくは５０００から４００００ダルトンの分子量を有していてよい。
【００３３】
他の実施形態は、薬学的又は診断上活性な物質と本発明による化合物との複合体の調製の方法によって表され、当該方法は、以下を含む。
・薬学的又は診断上活性な物質と本発明による化合物とを混合すること、
・最終複合体を分離すること。
【００３４】
好ましくは、混合は、水又は緩衝溶液中で３〜４０℃の温度で１〜３時間行い、次に、分離は、好ましくは沈殿、又はイオン交換、ゲルろ過若しくは逆相クロマトグラフィーなどのクロマトグラフ法により行う。
【００３５】
以下の詳細な説明では、概要において示した以下の一般式によって表されるような本発明において開示した誘導体のいくつかの例を述べる。
【００３６】
【化４】
【００３７】
以下の記述において、Ｐｏｌｙは、便宜上しばしばＰＥＧと呼ぶ。しかし、同様な特性の他の親水性ポリマーも本発明の実施における使用に適しており、ＰＥＧという用語の使用は、この点で、包含的であって、排他的ではないことを意図する。
【００３８】
ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）としても知られているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、本発明の実施において有用である。ＰＥＧは、主として多くの医薬製剤、例えば、非経口、局所、眼、経口及び直腸経路により投与される製剤に用いられる。ＰＥＧは、安定であり、組織及び粘膜との良好な適合性を示す。ＰＥＧは、一般的に透明、無色、無臭、水に可溶で、熱に対して安定、多くの化学物質に対して不活性であり、加水分解又は変質せず、無毒性である。ポリ（エチレングリコール）及びその誘導体は、両親媒性挙動、水性及び有機溶媒における溶解性、高純度、低多分散性、生物学的適合性などのそれらの有用な特性のため、化学、生物医学及び他の産業用途においてますます多くの関心を集めつつあり、それらは他の化合物に結合する場合に活性化することができるので、そのようなポリマーは、例えば、薬物担体、液相ペプチド又はポリヌクレオチド合成用のマトリックス、表面改質剤として、並びにペプチド及びタンパク質との複合体を製造するために用いられている。ＰＥＧは、体内である種の望ましい機能を有する部分に結合させた場合、薬物のサイズを増加させて、腎クリアランスを低下させ、薬物表面を遮蔽する傾向があり、生物体が、より低いクリアランスのためその機能をより長く明らかにすることができる薬物の存在に耐えることができるように、免疫反応を低減又は無くすことができる。したがって、本発明の活性化ＰＥＧは、実質的に無毒性であるはずであり、免疫反応又は他の望ましくない作用をもたらす傾向はないはずである。
【００３９】
ＰＥＧ以外の他の水溶性ポリマー、例えば、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（オキシエチル化ソルビトール）等、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（アクリロイルモルホリン）（ＰＡｃＭ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）は、同様な用途に適している。ポリマーは、リンカーへの結合に利用可能な単一活性部位を有するｍＰＥＧ及び他のキャップされた単官能ＰＥＧと同様な直鎖若しくは分枝した構造を有する、又は置換若しくは非置換ホモポリマー又はランダム若しくはブロックコポリマーであることができる。
【００４０】
「薬物」という用語は、ヒト及び他の動物における疾患の診断、治療、緩和、治癒若しくは予防に有用な、又は他の点では身体的若しくは精神的健康を増進するあらゆる物質を意図する。
【００４１】
「基」、「官能基」、「部分」、「活性基」、「反応性基」及び「反応性部位」という用語は、化学技術分野においてすべて類義語であり、当技術分野及び本明細書において分子の別個の定義可能な部分若しくはユニットを指し、ある機能若しくは活性を示し、他の分子若しくは分子の一部と反応するユニットを指すのに用いられる。
【００４２】
「結合」という用語は、化学反応の結果として通常形成される「基」を指すのに用いられ、一般的に共有結合である。加水分解で不安定な結合は、水と反応して一般的に分子を２つ又はそれ以上の成分に分離するものである。
【００４３】
ＰｏｌｙがＰＥＧである場合、ポリマーは、少なくとも１０００Ｄａ、好ましくは少なくとも４０００、より好ましくは少なくとも１００００、さらにより好ましくは少なくとも２００００の平均分子量を優先的に有する。好ましい実施形態において、Ｐｏｌｙは、１０００から４００００Ｄａまでの平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）である。いくつかの好ましいＰｏｌｙは、直鎖又は分枝構造を有するＰＥＧ１００００、ＰＥＧ２００００、ＰＥＧ３００００、ＰＥＧ４００００である。
【００４４】
本発明は、上で報告したように、ｉｎ ｖｉｖｏで、又はリビング物質に由来する物質内に送達すべき分子のアミンへの結合に有用な反応性基の反応性をあらかじめ決める部分を含むＰＥＧ、すなわちＰＥＧ−Ｘ−ＮＨ−ＣＯ−Ａを含む。
ここで、「Ｘ」はスペーサー部分又は結合であり、
Ｘは以下の中から選択することもできる。
ａ）−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ1）−ＣＨ（Ｒ２）−、［式中、Ｒ１及びＲ２は、独立にＨ又は場合によって置換されたアルキル若しくは場合によって置換されたアリール若しくは場合によって置換されたアリールアルキル基又は好ましくはオキシ、ヒドロキシ、アミノ若しくはカルボキシ基から選択される基であり、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈであるとき、βアミノ酸スペーサーはβアラニンである］、
ｂ）又はＸは、好ましくはオキシ、ヒドロキシ、アミノ若しくはカルボキシ基から選択される１つ又は複数の基により場合によって置換された２から１０個の炭素を含むことが好ましいアルキル基であり、
ｃ）又はＸは、アリール基である。
Ｘは、ペプチド又はオリゴヌクレオチドとしての薬物であることもでき、ＰＥＧ誘導体と結合分子との間の結合が水中で加水分解性であるとき、これは、薬物の活性のトリガをあらかじめ決めるために活用することができる。
【００４５】
ここで、「Ａ」は、−ＮＨ−ＣＯ−部分と一緒になって反応性基を形成しており、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール又はｐ−ニトロフェノールの群から選択される。
【００４６】
好ましい実施形態において、ＰＥＧ誘導体は以下の式を有する。
ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ
ＰＥＧ−ＯＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ
ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ1）−ＣＨ（Ｒ２）−Ｎ（Ｒ３）−ＣＯ−ＮＨＳ
ここで、Ｒ1、Ｒ２及びＲ３は、独立にＨ又は場合によって置換されたアルキル若しくは場合によって置換されたアリール若しくは場合によって置換されたアリールアルキル基又は好ましくはオキシ、ヒドロキシ、アミノ若しくはカルボキシ基から選択される基であり、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈであるとき、βアミノ酸スペーサーはβアラニンである。
【実施例】
【００４７】
本発明はさらに、ＰＥＧ誘導体のいくつかの特定の例を用いて、それらの合成及び適用を説明する。
【００４８】
（実施例１）
ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ（ｎ＝１〜４）の調製
反応
【００４９】
【化５】
【００５０】
ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２２００００（５．０ｇ、０．２５ｍモル、ｎ＝１〜４）を５０ｍｌのアセトニトリルを用いて共沸により乾燥し、次いで、室温まで徐々に冷却した。得られた溶液に炭酸ジスクシンイミジル（２６５ｇ、１ｍモル）及びピリジン（０．２５ｍｌ）を加え、室温で一夜、反応を進行させた。次いで、溶媒を真空中で除去し、４０ｍｌの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２を残留物に加えた。不溶性固体をろ過により除去し、ろ液をｐＨ４．５の塩化ナトリウム飽和酢酸緩衝液で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶液を真空中で１５ｍｌまで濃縮した。濃縮溶液を３００ｍｌのジエチルエーテル上に激しく撹拌しながら滴下した。沈殿物をろ過により収集し、真空中で乾燥した。収量：４．６ｇ（９２％）。1Ｈ-ＮＭＲ、ＣＨ３Ｏ-ＰＥＧ-(ＣＨ２)２-ＮＨ-ＣＯ-ＮＨＳ (ＣＤＣｌ３): δ ３．６２ (ｂｓ, -Ｏ-ＣＨ２-ＰＥＧ), δ ３．５４ (ｔ, -ＣＨ２-ＣＨ２-ＮＨ-ＣＯ-ＮＨＳ), δ ２．８（ｓ，−ＮＨＳ）。
【００５１】
（実施例２）
（βアラニン）を経るＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳの調製
反応
【００５２】
【化６】
【００５３】
ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ２２００００（５．０ｇ、０．２５ｍモル）を５０ｍｌのトルエンを用いて共沸により乾燥し、次いで、室温まで徐々に冷却した。得られた１２ｍｌ溶液に１０ｍｌの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２、Ｎ−ＢＯＣ−βアラニンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１４４．７ｍｇ、０．５ｍモル）及びＥｔ３Ｎ（７０μｌ、０．５ｍモル）を加え、室温で一夜、反応を進行させた。次いで、溶液をろ過し、３００ｍｌのジエチルエーテル上に激しく撹拌しなから滴下した。ろ過により収集し、真空中で乾燥した沈殿物をＣＨ２Ｃｌ２／ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ（５４．５：４５．４：０．１）の２０ｍｌの溶液に溶解し、室温で３時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、得られた油に２０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２を加えた。得られた溶液に炭酸ジスクシンイミジル（２６５ｍｇ、１ｍモル）及びピリジン（０．２５ｍｌ）を加え、室温で一夜、反応を進行させた。次いで、溶媒を真空中で除去し、４０ｍｌの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２を残留物に加えた。不溶性固体をろ過により除去し、ろ液をｐＨ４．５の塩化ナトリウム飽和酢酸緩衝液で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶液を真空中で１５ｍｌまで濃縮した。濃縮溶液を３００ｍｌのジエチルエーテル上に激しく撹拌しながら滴下した。沈殿物をろ過により収集し、真空中で乾燥した。収量：４．２ｇ（８４％）。1Ｈ-ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）: δ ３．６２（ｂｓ，−Ｏ−ＣＨ２−ＰＥＧ）, δ ３．５４ （ｔ，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ）, δ ２．５ （ｔ，−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ）, δ ２．８（ｓ，−ＮＨＳ）。
【００５４】
（実施例３）
ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳの調製（ＤＣＣ／ＮＨＳを経る）
反応
【００５５】
【化７】
【００５６】
ジシクロヘキシルカルボジイミド（２３２ｍｇ、１．１２５ｍモル）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１３０ｍｇ、１．１２５ｍモル）を、１５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、室温で１時間撹拌した。次いで、溶液に事前に５０ｍｌのトルエンを用いて共沸により乾燥したＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ２２００００（５．０ｇ、０．２５ｍモル）及びＥｔ３Ｎ（７０μｌ、０．５ｍモル）を加えた。次いで、溶媒を真空中で除去し、４０ｍｌの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２を残留物に加えた。不溶性固体をろ過により除去し、ろ液をｐＨ４．５の塩化ナトリウム飽和酢酸緩衝液で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶液を真空中で１５ｍｌまで濃縮した。濃縮溶液を３００ｍｌのジエチルエーテル上に激しく撹拌しながら滴下した。沈殿物をろ過により収集し、真空中で乾燥した。収量：４．６ｇ（９２％）。1Ｈ-ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）: δ ３．６２（ｂｓ，−Ｏ−ＣＨ２−ＰＥＧ）, δ ３．５４ （ｔ，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ）, δ ２．５ （ｔ，−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ）, δ ２．８（ｓ，−ＮＨＳ）。
【００５７】
（実施例４）
ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ−（４−カルボキシメチル）−ピペリジン−ＣＯ−ＮＨＳ（ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＭＰ−ＣＯ−ＮＨＳ）の調製
反応
【００５８】
【化８】
【００５９】
ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ２２００００（５．０ｇ、０．２５ｍモル）を５０ｍｌのトルエンを用いて共沸により乾燥し、次いで、室温まで徐々に冷却した。得られた１２ｍｌ溶液に１０ｍｌの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２、Ｎ−ＢＯＣ−（４−カルボキシメチル）−ピペリジンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＣＭＰ；１７０ｍｇ、０．５ｍモル）及びＥｔ３Ｎ（７０μｌ、０．５ｍモル）を加え、室温で一夜、反応を進行させた。次いで、溶液をろ過し、３００ｍｌのジエチルエーテル上に激しく撹拌しなから滴下した。ろ過により収集し、真空中で乾燥した沈殿物をＣＨ２Ｃｌ２／ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ（５４．５：４５．４：０．１）の２０ｍｌの溶液に溶解し、室温で３時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、得られた油に２０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２を加えた。得られた溶液に炭酸ジスクシンイミジル（２６５ｍｇ、１ｍモル）及びピリジン（０．２５ｍｌ）を加え、室温で一夜、反応を進行させた。次いで、溶媒を真空中で除去し、４０ｍｌの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２を残留物に加えた。不溶性固体をろ過により除去し、ろ液をｐＨ４．５の塩化ナトリウム飽和酢酸緩衝液で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶液を真空中で１５ｍｌまで濃縮した。濃縮溶液を３００ｍｌのジエチルエーテル上に激しく撹拌しながら滴下した。沈殿物をろ過により収集し、真空中で乾燥した。収量：４．１ｇ（８２％）。
【００６０】
（実施例５）
ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ５０００によるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の修飾
反応
【００６１】
【化９】
【００６２】
リン酸緩衝液１０ｍＭ ｐＨ７中５ｍｇ／ｍｌのｈＧＨの溶液１ｍｌに、３４．３ｍｇのＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨＯＣ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ５０００（６．８５×１０−３ｍモル）を加えた。溶液を撹拌し、５℃に２時間維持した。５．１４ｍｇ（６．８５×１０−２ｍモル）のＧｌｙを加えて反応を停止させた。次いで、溶液を０．２２μｍフィルターによりろ過し、直接分析した。
【００６３】
得られた溶液をゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により調べたところ、図１に示すように天然ｈＧＨピーク（通常ｔｒ＝１０．２’）の消失により、２時間後にすべてのタンパク質の量がＰＥＧと反応した。主として、２つの複合体が生成し、１つは他のもの（ｔｒ＝７．４８０’）より高い流体力学的体積（ｔｒ＝６．９４７’）を有しており、差は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析検査により確認されたようにＰＥＧ化の程度の差に起因する。ゲル浸透によるピークを収集し、脱塩し、次いで、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分析した。分析により、ｔｒ＝７．４８０’におけるピークは主としてモノＰＥＧ−ｈＧＨ複合体により構成されており、ｔｒ＝６．９４７’におけるピークはジＰＥＧ−ｈＧＨ及びトリＰＥＧ−ｈＧＨ複合体により構成されていると思われた。
【００６４】
上で報告したように得られたＰＥＧ−ｈＧＨ複合体の溶液を室温でインキュベートするとき、ＧＰＣにおけるクロマトグラムプロファイルは、４８時間以内にモノＰＥＧ−ｈＧＨピークの増加及び遊離ｈＧＨ（ｔｒ＝１０．２’におけるピーク）の生成に釣り合うジ及びトリＰＥＧ−ｈＧＨ複合体に対応するピーク面積の緩やかな減少を示している（図２）。
【００６５】
データは、この結合に当量より大過剰のポリマー（３０倍）を用いたが、新規なＰＥＧ誘導体の少数の鎖のみ（主として１又は２本）がｈＧＨと反応することを示唆している。これは、１０〜３０までの範囲のＰＥＧ／タンパク質モル比を用いたポリ（エチレングリコール）５０００ＤａのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍＰＥＧ−ＣＯ−ＮＨＳ）によるヒト成長ホルモンのＰＥＧ化試験においてＣｌａｒｋ Ｒ．により報告（例えば、非特許文献１０参照）されたことと対照的であり、この場合、マルチＰＥＧ化複合体（テトラ−、ペンタ−及びエサ−ＰＥＧ−ｈＧＨ）から主として構成されている異性体の広範囲な混合物が得られた。このことから、ｍＰＥＧ−ＣＯ−ＮＨＳの反応性がより高い場合、該ポリマーはタンパク質中の温和な反応性のアミノ基とも反応することができ、それにより、すべての修飾可能アミノ基の識別とモノＰＥＧ化種のみを得ることとの両方が困難になるため、マルチＰＥＧ化につながることがわかる。さらに、Ｃｌａｒｋ Ｒ．により合成された複合体は結合ＰＥＧ鎖を放出せず、これは、ＰＥＧ化の後のタンパク質の活性の喪失が永久的であることを意味しており、一方、５日間のインキュベーションの後の、本発明のＰＥＧ誘導体物を用いて得られた複合体のＧＰＣのデータは、ＰＥＧ−ｈＧＨ複合体の緩やかな加水分解と、それによる十分に活性な天然タンパク質の部分的な回復を示している。
【００６６】
（実施例６）
実施例５において報告したように得られたＰＥＧ−ｈＧＨ複合体の薬物動態及び薬力学
実施例５から得られたＰＥＧ−ｈＧＨ複合体の薬物動態プロファイルをラット及びサルにおいて評価し、天然ｈＧＨと比較した。用いた用量は、ラットの場合には２．５ｍｇ／ｋｇ（タンパク質で表した）であり、サルにおいては１．５ｍｇ／ｋｇであった。図３及び４にラット及びサルにおける天然ｈＧＨ及びＰＥＧ−ｈＧＨの薬物動態プロファイルを示す。天然タンパク質からＰＥＧ化形への変化に伴う半減期（ｔ１／２）の延長は、ラット及びサルにおいてそれぞれぞれ約１０及び７倍であった。文献（例えば、非特許文献１０）に報告されたデータは、ジＰＥＧ５０００−ｈＧＨについては５．８時間、高度ＰＥＧ化のペンタＰＥＧ５０００−ｈＧＨについては１５時間のｔ１／２を示し、Ｃｌａｒｋ Ｒ．及び共同研究者らの試験において分析された複合体は、マルチＰＥＧ化ｈＧＨ異性体の広範囲の混合物の多段階精製によって得られた。両方が活性化ＰＥＧ誘導体としてｍＰＥＧ５０００−ＣＯ−ＮＨＳを用いて得られた。
【００６７】
薬力学は、ｈＧＨの毎日の皮下注射（６×４０μｇ／ｋｇ）、又はＰＥＧ−ｈＧＨ（実施例５から得られた）１日×２４０μｇ／ｋｇの１回の注射を行った下垂体切除ラットにおいて評価した。動物の体重増加を６日間追跡した。図５に示すように、ＰＥＧ−ｈＧＨの単回投与は、ｈＧＨの毎日の注射と等しい効力を有する。
【００６８】
（実施例７）
新規なＰＥＧ誘導体及びｍＰＥＧ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＳの安定性及び反応性
新規なＰＥＧ誘導体及びｍＰＥＧ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＳの安定性及び反応性は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の水中加水分解に基づいて評価した。ＮＨＳ加水分解の速度は、ホウ酸緩衝液０．１Ｍ ｐＨ８中０．１ｍモルの活性化ＰＥＧ誘導体の試料の２８０ｎｍでの吸光度の増加を検出することによって追跡した。図６にある種のＰＥＧ誘導体のＡＢＳ ２８０ｎｍ増加対時間を示す。ｍＰＥＧ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＳの安定性と比較してｍＰＥＧ−Ｘ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ誘導体の安定性が高いことは明らかである。表１に各ＰＥＧ誘導体のＮＨＳ加水分解ｔ１／２を示す。
【００６９】
【表１】
【００７０】
新規なＰＥＧ誘導体の水に対する反応性がより低いことを示している、この実験の結果は、これらの誘導体を用いて得られたタンパク質修飾の程度がより低いこと（実施例５に報告したように）と一致しており、したがって、タンパク質中の反応性が最も高い、及び露出した残基のみを修飾することができる。
【００７１】
（実施例８）
単一アミノ酸に対する異なるＰＥＧ誘導体の反応性の比較
ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳの反応性とｍＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍＰＥＧ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＳ）の反応性とを比較するために、Ｎ−ＢＯＣ−Ｔｙｒ、Ｎα−ＢＯＣ−Ｈｉｓ及びヒドロキシ基などの潜在的に反応性の基を有する他の保護されたアミノ酸に対するこれらのＰＥＧポリマーの結合を試験した。
【００７２】
７ｍｇ／ｍｌの最終濃度でＣＨ２Ｃｌ２中アミノ酸の溶液を調製し、Ｅｔ３ＮでｐＨを８にした。アミノ酸当量に対して１／５のモル比で、ＰＥＧ誘導体を加えた。カップリングの程度は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳは、Ｎα−ＢＯＣ−Ｈｉｓとのみ反応したが、同じ条件で、ｍＰＥＧ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＳは、ヒドロキシ基と複合体を形成する。これにより、タンパク質中の異なる反応性基を識別することを可能にする、新規なポリマーのより低い反応性が証明される。さらに、両誘導体はＮα−ＢＯＣ−Ｈｉｓとの複合体（イミダゾール側鎖におけるＮδ１原子への結合）を形成するが、ｍＰＥＧ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＳとアミノ酸との複合体は非常に不安定であり、実際、それは、一般的な活性化ポリエチレングリコールであるカルボニルイミダゾールＰＥＧを反映しており、一方、ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳを用いて得られた複合体はより安定であり、Ｎα−ＢＯＣ−Ｈｉｓの放出の程度は、水中での５日間のインキュベーションにわたって約３５％である。これを、ＰＥＧの結合をタンパク質のＨｉｓ残基に優先的に向ける条件を用いて（例えば、非特許文献１１に報告されたように）タンパク質のＰＥＧ化に活用し、それにより、血中半減期の延長を達成するのにｉｎ ｖｉｖｏで十分に安定であるが、同時に天然タンパク質又はそれとより少ない結合ＰＥＧ鎖との複合体を部分的に放出できる複合体を得ることができる。
【００７３】
（実施例９）
ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ５０００によるＬＨＲＨペプチドの修飾
反応
【００７４】
【化１０】
【００７５】
ＬＨＲＨペプチド（Ｐ−ＧｌｙＨｉｓＴｒｐＳｅｒＴｙｒＤＴｒｐＬｅｕＡｒｇＰｒｏＧｌｙ）は、ＰＥＧ結合のための第一級アミノ基を欠いており、他の潜在的に反応性のアミノ酸（ペプチドに存在するＴｙｒのような）は独立した実験において本発明のＰＥＧ誘導体に対する反応性を示さなかったことから、結合は、Ｈｉｓ側鎖のレベルでのみ起り得る。
【００７６】
リン酸緩衝液１０ｍＭ ｐＨ７中０．３２ｍｇ／ｍｌのＬＨＲＨペプチド溶液１ｍｌに、３６．６ｍｇのＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ５０００（７．３２×１０−３ｍモル）を加えた。溶液を撹拌し、５℃で２時間維持した。５．４９ｍｇ（７．３２×１０−２ｍモル）のＧｌｙを加えて反応を停止させた。溶液を０．２２μｍフィルターによりろ過し、次のように分析した。複合体をＧＰＣにより評価し、図７に示すように、７．９５５’におけるＬＨＲＨ−ＰＥＧ複合体ピークの出現は、複合体の生成を示すものであった。
【００７７】
（実施例１０）
ＰＥＧ２−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ２００００による顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の修飾
反応
【００７８】
【化１１】
【００７９】
リン酸緩衝液１０ｍＭ ｐＨ７中５ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦの溶液１ｍｌに８０．３４ｍｇのＰＥＧ２−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ２００００（４．０２×１０−３ｍモル）を加えた。溶液を撹拌し、５℃で２時間維持した。
【００８０】
３．０１ｍｇ（４．０２×１０−２ｍモル）のＧｌｙを加えて反応を停止させた。次いで、溶液を０．２２μｍフィルターによりろ過し、得られた生成物を図８に示すようにゲル透過クロマトグラフィーにより直接分析した。分析により、すべてのＧ−ＣＳＦが２時間以内にＰＥＧ化され（ｔｒ＝９．９２７’におけるＧ−ＣＳＦピークの消失）、同時に２つの複合体が生成し、１つは他のもの（ｔｒ＝６．８９７’）より高い流体力学的体積（ｔｒ＝６．４２２’）を有することが明らかになった。その差はポリマー結合の程度の差に起因しており、明らかに第１のものは第２のものよりタンパク質に結合した多くのＰＥＧ鎖を有している。
【００８１】
上で得られた複合体の溶液を室温で４８時間インキュベートし、ＧＣＰにより分析した。分析により、ｔｒ＝６．８９７’におけるピーク（低分子量複合体に対応する）の増加及び遊離Ｇ−ＣＳＦ（ｔｒ＝９．９２７’におけるピーク）の生成に釣り合うｔｒ＝６．４２２’におけるピーク（高分子量複合体に対応する）の面積の緩やかな減少が示された（図９）。
【００８２】
（実施例１１）
ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ５０００によるエピルビシンの修飾
反応
【００８３】
【化１２】
【００８４】
小薬物の体内滞在時間を延長させるのに有用であり得る巨大分子プロドラッグを調製するために、ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳをエピルビシンに結合させた。
【００８５】
４０ｍｌのＤＭＦに溶解した２５０ｍｇのエピルビシン・ＨＣｌ（０．４３ｍモル）に２．１５ｇのＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ（０．３５８ｍモル）を加えた。ＰＥＧの溶解後に、１１９．９μｌのＥｔ３Ｎ（０．８６ｍモル）を反応混合物に加えた。暗所で撹拌しながら１２時間にわたって反応を進行させた。次いで、約３０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２を加え、未反応のエピルビシンをＨＣｌ ０．１Ｎ（６×８０ｍｌ）により抽出した。無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した有機相を小容積に濃縮した。得られた油に、１５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２を加え、濃縮溶液を３００ｍｌのジエチルエーテル上に激しく撹拌しながら滴下した。沈殿をろ過により収集し、真空中で乾燥した。収量：１．８２ｇ（０．３２８ｍモル；９１．６％）。
【００８６】
本発明を例示した特定の実施形態において説明した。しかし、前記の説明は、本発明を例示した実施形態に限定することを意図するものでなく、当業者は、先の明細書に記述したように本発明の範囲内及び精神を逸脱せずに変形を行うことができることを認識すべきである。
【００８７】
一方、本発明は、添付した特許請求の範囲により定義されている本発明の真の精神及び範囲内に含めることができるすべての選択肢、修正及び同等物を含む。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ ５０００Ｄａを用いたｈＧＨのＰＥＧ化により得られたＰＥＧ−ｈＧＨ複合体のゲル透過プロファイルを示す図であり、ｔｒ＝６．９４７’におけるピークは高分子量の複合体を示し、ｔｒ＝７．４８０’におけるピークは低分子量の複合体を示し、ｔｒ＝１０．５４３’におけるピークは遊離ＮＨＳを示す図である。
【図２】ＰＢＳ １０ｍＭ ｐＨ７中で４８時間インキュベートしたＰＥＧ−ｈＧＨ複合体のゲル透過プロファイルを示す図であり、点線は反応混合物からのＰＥＧ−ｈＧＨ複合体を示し、実線は４８時間のインキュベーション後のＰＥＧ−ｈＧＨ複合体を示す図である。
【図３】ラットにおける天然ｈＧＨ及びＰＥＧ−ｈＧＨ（実施例５で得られた）の薬物動態プロファイルを示す図である。
【図４】サルにおける天然ｈＧＨ及びＰＥＧ−ｈＧＨ（実施例５で得られた）の薬物動態プロファイルを示す図である。
【図５】毎日ｈＧＨ又は１回ＰＥＧ−ｈＧＨ（実施例５で得られた）を皮下注射した下垂体切除ラットの体重増加を示す図である。
【図６】ホウ酸緩衝液０．１Ｍ ｐＨ８中でインキュベートしたＰＥＧ誘導体のＮＨＳの加水分解の速度を示す図である。
【図７】天然ＬＨＲＨ（赤線）及びＰＥＧ／ＬＨＲＨ複合体反応（黒点線）のゲル透過プロファイルを示す図であり、ｔｒ＝７．９５５’におけるピーク（黒三角）はＰＥＧ−ＬＨＲＨ複合体を示し、ｔｒ＝１０．４５７’におけるピーク（●）は天然ＬＨＲＨ及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドを示す図である。
【図８】ＰＥＧ２−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＳ ２００００ Ｄａを用いたＧ−ＣＳＦのＰＥＧ化により得られたＰＥＧ−Ｃ−ＧＳＦ複合体のゲル透過プロファイルを示す図であり、ｔｒ＝６．４２２’におけるピークは高分子量の複合体を示し、ｔｒ＝６．８９７’におけるピークは低分子量の複合体を示し、ｔｒ＝９．９２７’におけるピークは未反応Ｇ−ＣＳＦを示し、ｔｒ＝１０．３９２’におけるピークは遊離ＮＨＳを示す図である。
【図９】ＰＢＳ １０ｍＭ ｐＨ７中で４８時間インキュベートしたＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ複合体のゲル透過プロファイルを示す図であり、点線は、反応混合物からのＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ複合体を示し、実線は、４８時間のインキュベーション後のＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ複合体を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
Ｐｏｌｙ−（Ｘ−ＮＨ−ＣＯ−Ａ）ｎ
で表される化合物。
［式中、
Ｐｏｌｙは、約３００から１０００００ダルトンの分子量を有する親水性ポリマーであり、
Ａは、−ＮＨ−ＣＯ−と一緒になって反応性基を形成しており、
Ｘは、スペーサー部分又は結合であり、
ｎは、１から５０までを含む整数である］
【請求項２】
Ａは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール及びｐ−ニトロフェノールから選択されることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｘは、
ａ）−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ１）−ＣＨ（Ｒ２）−
［式中、Ｒ１及びＲ２は、互いに独立に、Ｈ、場合によって置換されたアルキル基、場合によって置換されたアリール基、場合によって置換されたアリールアルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基及び／又はカルボキシ基から選択される］、
ｂ）ヒドロキシ、アミノ又はカルボキシ基から好ましくは選択される１つ又は複数の基により場合によって置換されたアルキル基、
ｃ）アリール基
から選択されることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
ＸはＣ２〜Ｃ１０アルキル基であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１及び／又はＲ２はＨであることを特徴とする請求項３に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ１及び／又はＲ２はＣ２〜Ｃ１０アルキル基であることを特徴とする請求項３に記載の化合物。
【請求項７】
ｎは、１から１０まで、好ましくは１から５までを含む整数であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
ｎは、１であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
Ｐｏｌｙは直鎖若しくは分枝のポリ（エチレングリコール）又はその誘導体であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
前記誘導体はメトキシ−ポリ（エチレングリコール）又はジオール−ポリ（エチレングリコール）から選択されることを特徴とする請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
前記ポリ（エチレングリコール）は、約１００００から６００００ダルトン、好ましくは５０００から４００００ダルトンの分子量を有することを特徴とする請求項９に記載の化合物。
【請求項１２】
薬学的又は診断上活性な物質との複合体の製造のための請求項１から１１のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項１３】
前記活性な物質は、ペプチド、オリゴヌクレオチド、タンパク質又は非ペプチド薬から選択されることを特徴とする請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
薬学的又は診断上活性な物質と請求項１から１１のいずれか一項に記載の化合物との複合体を調製する方法であって、
ａ）薬学的又は診断上活性な物質と請求項１から１１のいずれか一項に記載の化合物とを混合するステップと、
ｂ）最終複合体を分離するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記活性な物質は、ペプチド、オリゴヌクレオチド、タンパク質又は非ペプチド薬から選択されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記活性な物質は、ヘモグロビン、インスリン、ウロキナーゼ、αインターフェロン、Ｇ−ＣＳＦ、ｈＧＨ、アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ及びカタラーゼから選択されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
混合は水又は緩衝溶液中で行うことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
混合は３〜４０℃の温度で行うことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
混合は１〜３時間行うことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
分離は沈殿又はクロマトグラフ法により行うことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１２から２０のいずれか一項に従って得ることができることを特徴とする複合体。
【請求項２２】
請求項２１に記載の複合体を含むことを特徴とする医薬又は診断用組成物。
【請求項２３】
経口、非経口、直腸、局所、膣、眼又は吸入用であることを特徴とする請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
水溶液であることを特徴とする請求項２２に記載の組成物。
【請求項１】
式：
Ｐｏｌｙ−（Ｘ−ＮＨ−ＣＯ−Ａ）ｎ
で表される化合物。
［式中、
Ｐｏｌｙは、約３００から１０００００ダルトンの分子量を有する親水性ポリマーであり、
Ａは、−ＮＨ−ＣＯ−と一緒になって反応性基を形成しており、
Ｘは、スペーサー部分又は結合であり、
ｎは、１から５０までを含む整数である］
【請求項２】
Ａは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール及びｐ−ニトロフェノールから選択されることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｘは、
ａ）−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ１）−ＣＨ（Ｒ２）−
［式中、Ｒ１及びＲ２は、互いに独立に、Ｈ、場合によって置換されたアルキル基、場合によって置換されたアリール基、場合によって置換されたアリールアルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基及び／又はカルボキシ基から選択される］、
ｂ）ヒドロキシ、アミノ又はカルボキシ基から好ましくは選択される１つ又は複数の基により場合によって置換されたアルキル基、
ｃ）アリール基
から選択されることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
ＸはＣ２〜Ｃ１０アルキル基であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１及び／又はＲ２はＨであることを特徴とする請求項３に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ１及び／又はＲ２はＣ２〜Ｃ１０アルキル基であることを特徴とする請求項３に記載の化合物。
【請求項７】
ｎは、１から１０まで、好ましくは１から５までを含む整数であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
ｎは、１であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
Ｐｏｌｙは直鎖若しくは分枝のポリ（エチレングリコール）又はその誘導体であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
前記誘導体はメトキシ−ポリ（エチレングリコール）又はジオール−ポリ（エチレングリコール）から選択されることを特徴とする請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
前記ポリ（エチレングリコール）は、約１００００から６００００ダルトン、好ましくは５０００から４００００ダルトンの分子量を有することを特徴とする請求項９に記載の化合物。
【請求項１２】
薬学的又は診断上活性な物質との複合体の製造のための請求項１から１１のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項１３】
前記活性な物質は、ペプチド、オリゴヌクレオチド、タンパク質又は非ペプチド薬から選択されることを特徴とする請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
薬学的又は診断上活性な物質と請求項１から１１のいずれか一項に記載の化合物との複合体を調製する方法であって、
ａ）薬学的又は診断上活性な物質と請求項１から１１のいずれか一項に記載の化合物とを混合するステップと、
ｂ）最終複合体を分離するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記活性な物質は、ペプチド、オリゴヌクレオチド、タンパク質又は非ペプチド薬から選択されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記活性な物質は、ヘモグロビン、インスリン、ウロキナーゼ、αインターフェロン、Ｇ−ＣＳＦ、ｈＧＨ、アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ及びカタラーゼから選択されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
混合は水又は緩衝溶液中で行うことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
混合は３〜４０℃の温度で行うことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
混合は１〜３時間行うことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
分離は沈殿又はクロマトグラフ法により行うことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１２から２０のいずれか一項に従って得ることができることを特徴とする複合体。
【請求項２２】
請求項２１に記載の複合体を含むことを特徴とする医薬又は診断用組成物。
【請求項２３】
経口、非経口、直腸、局所、膣、眼又は吸入用であることを特徴とする請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
水溶液であることを特徴とする請求項２２に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００９−５３１４７８（Ｐ２００９−５３１４７８Ａ）
【公表日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０１８６８（Ｐ２００９−５０１８６８）
【出願日】平成１８年１２月２９日（２００６．１２．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０７０２６５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１１２７９４
【国際公開日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【出願人】（５０８２０２４１８）バイオ−ケル ソシエタ ア レスポンサビリタ リミタータ (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月２９日（２００６．１２．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０７０２６５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１１２７９４
【国際公開日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【出願人】（５０８２０２４１８）バイオ−ケル ソシエタ ア レスポンサビリタ リミタータ (4)
【Ｆターム（参考）】
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