新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法
本発明は、（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを効率よく生成する新規ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチドおよびその利用方法を提供する。本発明は、以下の（１）から（４）の理化学的性質を有するポリペプチドである：（１）作用：ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを補酵素として、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンに作用し、（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する、（２）作用至適ｐＨ：５．５から６．０、（３）作用至適温度：５０℃から５５℃、（４）分子量：ゲル濾過分析において約５５０００、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約２８０００。本発明は、また、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び、該ポリペプチドを高生産する形質転換体である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、式（１）
で表されるＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して、式（２）
で表される（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および該発現ベクターで形質転換された形質転換体に関する。
本発明はまた、該形質転換体を用いた光学活性アルコール、とりわけ光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノール、光学活性２−テトラロール誘導体、及び、光学活性１−フェニルエタノール誘導体の製造法に関する。光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノール、光学活性２−テトラロール誘導体、及び、光学活性１−フェニルエタノール誘導体は、医薬、農薬等の合成原料として有用な化合物である。
【背景技術】
光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの製造方法としては、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元する活性を有する酵素の存在下、このＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを製造する方法（特開平６−１４１８７６号公報）、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンにデポダスカス（Ｄｅｐｏｄａｓｃｕｓ）属等の微生物の菌体、培養物又はそれらの処理物を作用させて光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを製造する方法（特開平１０−１５０９９７号公報）が知られている。
また、光学活性２−テトラロール誘導体の製造方法としては、ベンゼン環上に置換基を有する２−テトラロン誘導体にパン酵母を作用させて、対応する光学活性２−テトラロール誘導体を製造する方法（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５１，１１５３１，（１９９５））が知られている。
また、光学活性１−フェニルエタノール誘導体の製造方法としては、２−ハロ−１−（置換フェニル）エタノンに、アシビア属やオガタエア属等に属する微生物またはその処理物を作用させ、光学活性２−ハロ−１−（置換フェニル）エタノールを得る方法（特開平４−２１８３８４号公報、及び、特開平１１−２１５９９５号公報）、１−（置換フェニル）エタノンにゲオトリカム・キャンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｎｄｉｄｕｍ）の乾燥菌体を作用させ、光学活性１−（置換フェニル）エタノールを得る方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３，８９５７（１９９８））が知られている。
しかしながら、これらの方法はいずれも、その基質仕込み濃度および基質から生成物への転換率が実用上十分ではなく、より効率の良い方法が待ち望まれていた。
発明の要約
本発明は、上記現状に鑑み、光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノール、光学活性２−テトラロール誘導体、光学活性１−フェニルエタノール誘導体を始めとする各種光学活性アルコールの製造に有用なポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および該発現ベクターで形質転換された形質転換体を提供することを課題とする。
また、本発明は、該形質転換体を用いて、光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノール、光学活性２−テトラロール誘導体、及び、光学活性１−フェニルエタノール誘導体を始めとする各種光学活性アルコールを効率よく製造する方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元し、（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する活性を有する微生物より、該活性を有するポリペプチドを単離した。そして、該ポリペプチドを利用することにより光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールのみならず、光学活性２−テトラロール誘導体及び光学活性１−フェニルエタノール誘導体を始めとする、有用な光学活性アルコールを効率良く製造することが可能であることを見出した。また、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離し、更には、発現ベクター並びに形質転換体を創製することにも成功し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して、（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成し得るポリペプチドである。
また、本発明は、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
また、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含有する発現ベクターである。
また、本発明は、上記ポリペプチドを高生産する形質転換体である。
更に、本発明は、該形質転換体を用いた、光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノール、光学活性２−テトラロール誘導体、及び、光学活性１−フェニルエタノール誘導体を始めとする、有用な光学活性アルコールの実用的な製造方法である。
発明の詳細な開示
以下、詳細に本発明を説明する。本発明のポリペプチドとしては、以下の（１）から（４）の理化学的性質を有するポリペプチドが挙げられる。
（１）ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを補酵素として、下記式（１）
で表されるＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して、下記式（２）
で表される（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する活性を有し、
（２）作用至適ｐＨが５．５から６．０、
（３）作用至適温度が５０℃から５５℃、
（４）分子量が、ゲル濾過分析において約５５０００、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動において約２８０００。
また、本発明のポリペプチドとしては、例えば、（ａ）配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、（ｂ）配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列または配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失または付加されたアミノ酸配列を含み、かつＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する活性を有するポリペプチドを挙げることができる。
配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失または付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８９）等に記載の公知の方法に準じて調製することができ、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する活性を有する限り、本発明のポリペプチドに包含される。
このようなポリペプチドは、当該活性を有する微生物から単離することができる。本発明のポリペプチドの起源として用いられる微生物は、特に限定されないが、例えばデボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属細菌が挙げられ、特に好ましいものとしてはデボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）ＩＦＯ１３５８４株を挙げることができる。
本発明のポリペプチドを生産する微生物は、野生株または変異株のいずれであってもよく、また、細胞融合または遺伝子操作などの遺伝学的手法により誘導された微生物であってもよい。
遺伝子操作された、本発明のポリペプチドを生産する微生物は、例えば、これらのポリペプチドを単離および／または精製してそのアミノ酸配列の一部または全部を決定する工程、このアミノ酸配列に基づいてポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を決定する工程、およびこのポリヌクレオチドを他の微生物に導入して組換え微生物を得る工程を包含する方法により得られ得る。
本発明のポリペプチドを有する微生物からの該ポリペプチドの精製は、常法により行い得る。例えば、該微生物の菌体を適当な培地で培養し、培養液から遠心分離により菌体を集める。得られた菌体を例えば、超音波破砕機などで破砕し、遠心分離にて菌体残さを除き、無細胞抽出液を得る。この無細胞抽出液から、例えば、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過、イオン交換、逆相等のカラムクロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、または組み合わせて用いて、ポリペプチドが精製され得る。
該酵素活性は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノン５ｍＭ、補酵素ＮＡＤＨ０．２５ｍＭおよび酵素を添加し、３０℃で波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより確認および計算することができる。
本発明のポリヌクレオチドとしては、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであればいずれも用いることができるが、例えば、（ｃ）配列表の配列番号２に示した塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は、（ｄ）配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、前記式（１）で表されるＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して、前記式（２）で表される（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。
配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。
ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、配列番号２に示されるポリヌクレオチドと、配列同一性が６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のポリヌクレオチドをあげることができ、コードされるポリペプチドがＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する活性を有する限り、本発明のポリヌクレオチドに包含される。
ここで、「配列の同一性（％）」とは、対比される２つのポリヌクレオチドを最適に整列させ、核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が両方の配列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に１００を乗じた数値で表される。
配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る：ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ８、１９９４年９月、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ５３７１１；Ｒｉｃｅ、Ｐ．（１９９６）Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ＥＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｐｅｔｅｒ Ｒｉｃｅ、Ｔｈｅ Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ、Ｈｉｎｘｔｏｎ Ｈａｌｌ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＣＢ１０ １ＲＱ、Ｅｎｇｌａｎｄ）、および、ｔｈｅ ＥｘＰＡＳｙ Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ分子生物学用サーバー（Ｇｅｎｅｖａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ａｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｖａ、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
本発明のポリヌクレオチドは、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する活性を有する微生物より取得することができる。該微生物として、例えばデボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属細菌が挙げられ、特に好ましいものとしてはデボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）ＩＦＯ１３５８４株を挙げることができる。
以下に、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する活性を有する微生物より、本発明のポリヌクレオチドを取得する方法の例を記載するが、本発明はこれに限定されない。
まず、精製した前記ポリペプチド、および該ポリペプチドを適当なエンドペプチダーゼで消化することにより得られるペプチド断片の部分アミノ酸配列を、エドマン法により決定する。そして、このアミノ酸配列情報をもとにヌクレオチドプライマーを合成する。次に、本発明のポリヌクレオチドの起源となる微生物より、通常のＤＮＡ単離法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８９）等に記載の方法により、該微生物の染色体ＤＮＡを調製する。
この染色体ＤＮＡを鋳型として、先述のヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一部を増幅する。ここで増幅されたポリヌクレオチドの塩基配列は、ジデオキシ・シークエンス法、ジデオキシ・チェイン・ターミネイション法などにより決定することができる。例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡ Ｓｅｑｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて行い得る。
該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一部の塩基配列が明らかになれば、例えば、ｉ−ＰＣＲ法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６，８１８６（１９８８））によりその全体の塩基配列を決定することができる。また、染色体ＤＮＡ上の該ポリヌクレオチドがイントロンを含むものであった場合は、例えば、以下の方法によりイントロンを含まない成熟型ポリヌクレオチドの塩基配列を決定する事ができる。
即ち、まず、該ポリヌクレオチドの起源となる微生物より、通常のヌクレオチド単離法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８９）等に記載の方法により、該微生物のｍＲＮＡを調製する。次に、このｍＲＮＡを鋳型とし、先に判明している該ポリヌクレオチドの５’末端および３’末端付近の配列を有するヌクレオチドプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，８９９８（１９８８））により成熟型ポリヌクレオチドを増幅し、その塩基配列を先と同様に決定する。
本発明のポリヌクレオチドを宿主微生物内に導入し、それをその導入された宿主微生物内で発現させるために用いられるベクターとしては、適当な宿主微生物内で該ポリヌクレオチド中の遺伝子を発現できるものであればいずれもが用いられ得る。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター等から選ばれたものが挙げられる。また、他の宿主株との間で遺伝子交換が可能なシャトルベクターであってもよい。
このようなベクターは、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のポリヌクレオチドと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に用いられ得る。
本願明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要素（例えば、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。
本願明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、該ポリヌクレオチド中の遺伝子が発現するように、ポリヌクレオチドが、その発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプおよび種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを導入する宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などがあげられるが、大腸菌が特に好ましい。
本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターは、常法により宿主細胞に導入され得る。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、例えば塩化カルシウム法により、本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを導入することができる。
本発明のポリペプチドを用いてＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生産する場合、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等の補酵素が必要となる。補酵素は通常、基質と等モルを要するが、酸化された該補酵素を還元型に変換する能力（以後、補酵素再生能と呼ぶ）を有する酵素をその基質とともに反応系に添加することにより、つまり補酵素再生系を、本発明のポリペプチドと組み合わせて反応を行うことにより、高価な補酵素の使用量を大幅に削減することができる。
補酵素再生能を有する酵素としては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素およびグルコース脱水素酵素などを用いることが出来る。好適には、グルコース脱水素酵素が用いられる。
上記の補酵素再生能を有する酵素を、不斉還元反応系に別途添加することによっても当該反応が行われ得るが、本発明のポリヌクレオチド、および補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの両者により形質転換せしめられた形質転換体を触媒として用いた場合、補酵素再生能を有する酵素を別に調製し反応系に添加することなしに、該反応を効率良く実施し得る。
このような形質転換体は、本発明のポリヌクレオチド、および補酵素再生能を有するポリペプチド（例えば、グルコース脱水素酵素）をコードするポリヌクレオチドを、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる他、これら２種のポリヌクレオチドを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それら２種のベクターを同一の宿主細胞に導入することによっても得られる。
なお、上述したように、本発明の発現ベクターは、上記ポリヌクレオチドを含むものである。好ましくは、プラスミドｐＮＴＤＲである発現ベクターが挙げられる。
本発明の発現ベクターとしては、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含むものも挙げられる。上記グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドは、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のグルコース脱水素酵素であることが好ましい。より好ましくは、プラスミドｐＮＴＤＲＧ１である発現ベクターが挙げられる。
本発明の形質転換体は、上記発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換して得られたものである。上記宿主細胞としては、大腸菌が好ましい。
また、本発明の形質転換体として、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲ）は、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８４５７の受託番号で、平成１５年８月２５日付で、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）は、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８４５８の受託番号で、平成１５年８月２５日付で、
それぞれ、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ブタペスト条約に基づいて国際寄託されている。
形質転換体中の補酵素再生能を有する酵素の活性は常法により測定することができる。例えば、グルコース脱水素酵素活性の測定は、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、基質グルコース０．１Ｍ、補酵素ＮＡＤＰ２ｍＭおよび酵素を添加し、２５℃で波長３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行い得る。
本発明の形質転換体を用いた光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノール、光学活性２−テトラロール誘導体、及び、光学活性１−フェニルエタノール誘導体等の光学活性アルコールの生産は以下のように実施され得る。つまり、形質転換体の培養物またはその処理物を、カルボニル基を有する化合物と反応させることにより、光学活性アルコールを製造する。
まず、適当な溶媒中に基質となるカルボニル基を有する化合物、ＮＡＤＨ等の補酵素、および該形質転換体の培養物またはその処理物等を添加し、ｐＨ調整下、攪拌して反応させる。
形質転換体の培養は、その微生物が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いて行い得る。また、培養温度は、好ましくは４〜５０℃である。
ここで形質転換体の処理物等とは、例えば、粗抽出液、培養菌体、凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、あるいはそれらの磨砕物等を意味する。さらにそれらは、ポリペプチド自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化されて用いられ得る。
また、本反応を行う際、形質転換体として本発明のポリペプチドと補酵素再生能を有する酵素（例えば、グルコース脱水素酵素）の両者を生産するものを用いる場合、反応系に補酵素再生のための基質（例えば、グルコース）を添加することにより、補酵素の使用量を大幅に減らすことが可能である。
基質となるカルボニル基を有する化合物としては、例えば、式（１）
で表されるＮ−ベンジル−３−ピロリジノン、一般式（３）
（式中、Ｒ１、Ｒ２は水素原子、水酸基又はアルコキシ基を示し、それぞれ同一でも異なってもよい。また、ｎは１又は２を示す。）で表される２−テトラロン誘導体、及び、一般式（５）
（式中、Ｒ３、Ｒ４は水素原子、ハロゲン原子、アルコキシ基又はニトロ基を示し、それぞれ同一でも異なってもよい。また、Ｒ５は水素原子、ハロゲン原子、水酸基又は置換基を有してもよいアルキル基を示す。）で表される１−フェニルエタノン誘導体を挙げることができる。式（３）、（５）で表される化合物としてより詳しくは、例えば、７−メトキシ−２−テトラロン、３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オン、２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノン、及び２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンを挙げることができる。
また、上記方法により得られる光学活性アルコールとしては、例えば式（２）
で表される（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノール、一般式（４）
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びｎは前記と同じ）で表される２−テトラロール誘導体、又は、一般式（６）
（式中、Ｒ３、Ｒ４、及び、Ｒ５は前記と同じ）で表される１−フェニルエタノール誘導体を挙げることができる。式（４）、（６）で表される化合物としてより詳しくは、例えば、７−メトキシ−２−テトラロール、３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オール、２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノール、又は、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールを挙げることができる。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４におけるアルコキシ基としては、炭素数１〜３のアルコキシ基であり、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等が挙げられる。好ましくはメトキシ基である。
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５におけるハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
Ｒ５における置換基を有してもよいアルキル基のアルキル基としては、炭素数１〜８のアルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ヘキシル基、オクチル基等が挙げられる。好ましくは炭素数１〜２のアルキル基である。Ｒ５における置換基を有してもよいアルキル基の置換基としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、水酸基、アミノ基等が挙げられる。
反応には水系溶媒を用いてもよいし、水系溶媒と有機系溶媒を混合して用いてもよい。有機系溶媒としては、例えば、トルエン、ヘキサン、ジイソプロピルエーテル、酢酸ｎ−ブチル、酢酸エチル等が挙げられる。
反応温度は、１０℃〜７０℃、好ましくは２０〜４０℃であり、反応時間は、１〜１００時間、好ましくは１０〜５０時間である。また、反応中、反応液のｐＨは、例えば塩酸、水酸化ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液等を用いて、４〜１０、好ましくは５〜８に維持する。
反応はバッチ方式あるいは連続方式で行われ得る。バッチ方式の場合、反応基質は０．１％から７０％（ｗ／ｖ）の仕込み濃度で添加される。
反応で生じた光学活性アルコールは常法により精製し得る。例えば、反応で生じた光学活性アルコールがＮ−ベンジル−３−ピロリジノール、７−メトキシ−２−テトラロール、３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オール、２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノール、又は、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールである場合、必要に応じ遠心分離、濾過などの処理を施して反応物から菌体等の懸濁物を除去した後、水酸化ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、塩酸等で抽出に適したｐＨ（３〜１１）に調整し、酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出し、有機溶媒を減圧下で除去する。さらに、蒸留、晶析またはクロマトグラフィー等の処理を行うことにより、精製され得る。
Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノン、及び、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの定量は、ガスクロマトグラフィー（カラム：ＵｎｉｐｏｒｔＢ １０％ＰＥＧ−２０Ｍ（ＩＤ３．０ｍｍ×１．０ｍ、ジーエルサイエンス社製）、カラム温度：２００℃、キャリアガス：窒素、検出：ＦＩＤ）で行い得る。
また、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの光学純度の測定は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＢ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、ダイセル化学工業株式会社製）、溶離液：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／ジエチルアミン＝９９／１／０．１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２５４ｎｍ、カラム温度：室温）で行い得る。
７−メトキシ−２−テトラロン、３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オン、７−メトキシ−２−テトラロール、及び、３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オールの定量は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：ナカライテスク株式会社製ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ８−ＭＳ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：水／アセトニトリル＝１／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ、カラム温度：室温）で行い得る。
また、７−メトキシ−２−テトラロール、及び、３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オールの光学純度の測定は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：ダイセル化学工業株式会社製Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＪ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール＝９／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２５４ｎｍ、カラム温度：室温）で行い得る。
２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノン、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノン、２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノール、及び、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールの定量は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：株式会社ワイエムシィ製ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ Ａ−３０３（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：水／アセトニトリル＝１／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ、カラム温度：室温）で行い得る。
また、２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノール、及び、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールの光学純度の測定は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：ダイセル化学工業株式会社製Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＪ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール＝３９／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２５４ｎｍ、カラム温度：室温）で行い得る。
以上のように、本発明に従えば、本発明のポリペフチドの効率的生産が可能であり、それを利用することにより、種々の有用な光学活性アルコールの優れた製造法が提供される。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のポリヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示す図である。
図２は、組換えプラスミドｐＮＴＤＲＧ１の作製方法及び構造を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている。
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）。
実施例１ 酵素の精製
以下の方法に従って、デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）ＩＦＯ１３５８４株よりＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する活性を有する酵素を単一に精製した。特に断りのない限り、精製操作は４℃で行った。（デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）ＩＦＯ１３５８４株の培養）
２Ｌ容坂口フラスコ７２本に下記の組成からなる液体培地４００ｍｌを分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。
培地組成（％は（ｗ／ｖ）で表示） ：
ポリペプトン １．０％
イーストエキス ０．３％
肉エキス ０．３％
モルトエキス １．０％
ＮａＣｌ ０．３％
アデカノールＬＧ−１０９（日本油脂社製） ０．００３％
水道水
ｐＨ７．０
この培地に、予め同培地にて前培養しておいたデボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）ＩＦＯ１３５８４株の培養液を５ｍｌずつ接種し、３０℃で、４８時間振とう培養した。
（無細胞抽出液の調整）
上記の培養液２８０００ｍｌから遠心分離により菌体を集めた後、生理食塩水で菌体を洗浄し、該菌株の湿菌体３６３ｇを得た。この湿菌体を５００ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、ＳＯＮＩＦＩＥＲ２５０型超音波破砕機（ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用いて破砕した。破砕物から遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液８４０ｍｌを得た。
（無細胞抽出液の熱処理および酸処理）
上記の無細胞抽出液を入れたビーカーを６０℃の恒温水槽に浸け、２５分間攪拌した後、氷浴中で４℃まで冷却した。生じた沈殿物を遠心分離にて除いた後、この遠心上清のｐＨをリン酸を用いて５．０に調整し、氷浴中で３時間攪拌した。生じた沈殿物を再度遠心分離にて除き、粗酵素液８３０ｍｌを得た。
（硫酸アンモニウム分画）
上記で得た粗酵素液のｐＨをアンモニア水を用いて７．０に調整した後、３５％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加、溶解し、生じた沈殿を遠心分離により除いた（この際粗酵素液のｐＨをアンモニア水でｐＨ７．０に維持しながら行った）。先と同様ｐＨ７．０を維持しながら、この遠心上清に５５％飽和となるようさらに硫酸アンモニウムを添加、溶解し、生じた沈殿を遠心分離により集めた。この沈殿を５０ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した後、同一緩衝液で１夜透析し、粗酵素液８３ｍｌを得た。
（ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィー）
上記硫酸アンモニウム分画で得られた粗酵素液のｐＨをアンモニア水を用いて８．０に調整した。これを、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（２５０ｍｌ）に供し、同一緩衝液で活性画分を溶出させた。活性画分を集め、リン酸を添加してｐＨ７．０に調製した。
（Ｐｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィー）
上記ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィーで得られた粗酵素液に終濃度１Ｍとなるよう硫酸アンモニウムを溶解し（この際、粗酵素液にアンモニア水を添加してｐＨ７．０に維持しながら行った）、１Ｍの硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＰｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（１００ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウムのリニアグラジエント（１Ｍから０Ｍまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１夜透析を行い、電気泳動的に単一な精製酵素標品を得た。以後、この酵素をＲＤＲと呼ぶことにする。
実施例２ 酵素の性質の測定
実施例１で得られたＲＤＲの酵素学的性質について検討した。酵素活性の測定は、基本的には、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノン５ｍＭ、補酵素ＮＡＤＨ０．２５ｍＭおよび酵素を添加し、３０℃で１分間反応させ、波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより行った。
（１）作用
ＮＡＤＨを補酵素として、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンに作用し、光学純度９９．９％ｅｅ以上の（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成した。ＮＡＤＰＨを補酵素として上記方法に準じて酵素活性を測定した場合、ＮＡＤＨを補酵素とした場合の約０．６％の活性を示した。
（２）作用至適ｐＨ
緩衝液として１００ｍＭリン酸緩衝液および１００ｍＭ酢酸緩衝液を用いて、ｐＨを４．０から８．０の範囲とした以外は、上記酵素活性の測定と同様にして酵素活性を測定した。その結果、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンに作用する至適ｐＨは５．５から６．０であった。
（３）作用至適温度
温度を２０℃から６０℃とした以外は、上記酵素活性の測定と同様にして、酵素活性を測定した。その結果、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンに作用する至適温度は５０℃から５５℃であった。
（４）分子量
溶離液として１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用い、ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ ＳＷＸＬカラム（東ソー株式会社製）による精製酵素ＲＤＲのゲル濾過クロマトグラフィー分析を行った結果、標準タンパク質との相対保持時間から算出した本酵素の分子量は約５５０００であった。また、酵素のサブユニットの分子量はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、標準タンパク質との相対移動度から算出した。本酵素のサブユニットの分子量は約２８０００であった。
実施例３ ＲＤＲ遺伝子のクローニング
（ＰＣＲプライマーの作成）
実施例１で得られた精製ＲＤＲを８Ｍ尿素存在下で変性した後、アクロモバクター由来のリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業株式会社製）で消化し、得られたペプチド断片のアミノ酸配列をＡＢＩ４９２型プロテインシーケンサー（パーキンエルマー社製）により決定した。このアミノ酸配列をもとに、ＤＮＡプライマー２種（プライマー１：配列番号３、プライマー２：配列番号４）を常法に従って合成した。
（ＰＣＲによるＲＤＲ遺伝子の増幅）
デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）ＩＦＯ１３５８４株の培養菌体からＭｕｒｒａｙ等の方法（Ｎｕｃｌ．，Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４３２１−４３２５（１９８０））に従って染色体ＤＮＡを抽出した。次に、上記で調製したＤＮＡプライマーを用い、得られた染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ったところ、ＲＤＲ遺伝子の一部と考えられる約７００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された（ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼとしてＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造株式会社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。）。このＤＮＡ断片を、プラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にクローニングし、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いてその塩基配列を確認した。
（ｉ−ＰＣＲ法によるＲＤＲ遺伝子の全長配列の決定）
デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）ＩＦＯ１３５８４株の染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで完全消化し、得られたＤＮＡ断片の混合物をＴ４リガーゼにより分子内環化させた。これを鋳型として用い、前項で判明したＲＤＲ遺伝子の部分塩基配列情報をもとに、ｉ−ＰＣＲ法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６，８１８６（１９８８））により、染色体ＤＮＡ上のＲＤＲ遺伝子の全塩基配列を決定した（ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼとしてＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造株式会社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。また、塩基配列の決定は先と同様に行った）。
その塩基配列を図１に示した。また、塩基配列がコードするアミノ酸配列を塩基配列の下段に示した。このアミノ酸配列と、精製ＲＤＲのリシルエンドペプチダーゼ消化断片の部分アミノ酸配列を比較した結果、精製ＲＤＲの部分アミノ酸配列は全て、このアミノ酸配列中に存在した。図１中のアミノ酸配列において、精製ＲＤＲの部分アミノ酸配列と一致した部分には下線を付した。なお、図１の塩基配列及びアミノ酸配列は、配列表の配列番号２のものと同一である。
実施例４ ＲＤＲ遺伝子を含む組換えプラスミドの作製
実施例３で決定された塩基配列を基に、ＲＤＲ遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加したＮ末端ＤＮＡプライマー（プライマー３：配列番号５）、および同遺伝子の３’末端の直後にＥｃｏＲＩ部位を付加したＣ末端ＤＮＡプライマー（プライマー４：配列番号６）を合成した。次に、この２種のＤＮＡをプライマーとして用い、実施例３で調製したデボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）ＩＦＯ１３５８４株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加し、３’末端の直後にＥｃｏＲＩ切断点を付加した、ＲＤＲ遺伝子を増幅した（ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼとしてＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造株式会社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。）。これを、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより、組換えプラスミドｐＮＴＤＲを得た。
実施例５ ＲＤＲ遺伝子およびグルコース脱水素酵素遺伝子の両者を含む組換えプラスミドの作製
バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＡＭ１０３０株由来のグルコース脱水素酵素（以後、ＧＤＨと称する）の遺伝子の塩基配列情報（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８６，３８９（１９８９））を基に、ＧＤＨの構造遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のＳｈａｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（９塩基）を、さらにその直前にＥｃｏＲＩ切断点を付加したＮ末端ＤＮＡプライマー（プライマー５：配列番号７）と、ＧＤＨの構造遺伝子の終始コドンの直後にＳａｌＩ部位を付加したＣ末端ＤＮＡプライマー（プライマー６：配列番号８）を常法に従って合成した。これら２つのＤＮＡプライマーを用い、プラスミドｐＧＤＫ１（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８６，３８９（１９８９））を鋳型としてＰＣＲにより二本鎖ＤＮＡを合成した。このＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３）のｌａｃプロモーターの下流のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ部位に挿入することにより、組換えプラスミドｐＮＴＧ１を得た。次に、実施例４で調製したｐＮＴＤＲをＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化して得られるＲＤＲ遺伝子を、このｐＮＴＧ１上のＧＤＨ遺伝子の上流に存在するＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入し、プラスミドｐＮＴＤＲＧ１を得た。ｐＮＴＤＲＧ１の作製法および構造を図２に示す。
実施例６ 組換え大腸菌の作製
実施例４および５で得た組換えプラスミドｐＮＴＤＲ又はｐＮＴＤＲＧ１を用いて大腸菌ＨＢ１０１（宝酒造株式会社製）を形質転換し、組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲ）およびＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）を得た。
こうして得られた形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲ）およびＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）は、それぞれ、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８４５７およびＦＥＲＭ ＢＰ−０８４５８として、平成１５年８月２５日付で、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所に寄託されている。
実施例７ 組換え大腸菌におけるＲＤＲの生産
実施例６で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲ）を１２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地で培養し、遠心分離により集菌後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕し、無細胞抽出液を得た。
この無細胞抽出液のＲＤＲ活性を以下のように測定した。ＲＤＲ活性の測定は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノン５ｍＭ、補酵素ＮＡＤＨ０．２５ｍＭおよび酵素を添加し、３０℃で波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより行った。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨをＮＡＤに酸化する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。この様に測定した無細胞抽出液中のＲＤＲ活性を比活性として表し、ベクタープラスミドを保持する形質転換体と比較した。また、実施例１と同様の方法で調製したデボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）ＩＦＯ１３５８４株の無細胞抽出液中のＲＤＲ活性についても同様に比較した。それらの結果を表１に示す。
大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲ）では、ベクタープラスミドのみの形質転換体である大腸菌ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）と比較して明らかなＲＤＲ活性の増加が見られ、デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）ＩＦＯ１３５８４株と比較して、比活性は約１７倍に達した。
実施例８ 組換え大腸菌におけるＲＤＲおよびＧＤＨの同時生産
実施例６で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）を、実施例７と同様に処理して得られる無細胞抽出液のＧＤＨ活性を、以下のように測定した。ＧＤＨ活性の測定は１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、基質グルコース０．１Ｍ、補酵素ＮＡＤＰ２ｍＭ及び酵素を添加し、２５℃で波長３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行った。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。また、ＲＤＲ活性についても実施例７と同様に測定した。
このように測定した無細胞抽出液中のＲＤＲおよびＧＤＨ活性を比活性として表し、大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲ）およびベクターのみの形質転換体ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）と比較した結果を表２に示す。大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）では、ベクタープラスミドのみの形質転換体である大腸菌ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）と比較して、明らかなＲＤＲおよびＧＤＨ活性の増加が見られた。
実施例９ ＲＤＲおよびグルコース脱水素酵素を同時生産させた組換え大腸菌を用いたＮ−ベンジル−３−ピロリジノンからの（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの合成
実施例８で得られた組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）の培養液を、ＳＯＮＩＦＩＲＥ２５０（ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用いて超音波破砕した。この菌体破砕液２０ｍｌにグルコース２ｇ、ＮＡＤ１ｍｇ、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノン１ｇを添加した。この反応液を、５Ｍの塩酸および水酸化ナトリウム水溶液を添加することによりｐＨ６．５に調整しつつ、窒素雰囲気下、３０℃で１８時間攪拌した。反応終了後、５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液２ｍｌを添加し、反応液をトルエンで抽出した。抽出液をエバポレーターで脱溶剤した後、抽出物の分析を行ったところ、収率９６％でＮ−ベンジル−３−ピロリジノールが得られた。この際、生成したＮ−ベンジル−３−ピロリジノールは光学純度９９．９％ｅｅのＲ体であった。
Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノン、及び、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの定量は、ガスクロマトグラフィー（カラム：ＵｎｉｐｏｒｔＢ １０％ＰＥＧ−２０Ｍ（ＩＤ３．０ｍｍ×１．０ｍ、ジーエルサイエンス社製）、カラム温度：２００℃、キャリアガス：窒素、検出：ＦＩＤ）で行った。
また、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの光学純度の測定は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＢ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、ダイセル化学工業社製）、溶離液：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／ジエチルアミン＝９９／１／０．１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２５４ｎｍ、カラム温度：室温）で行った。
実施例１０ ＲＤＲおよびグルコース脱水素酵素を同時生産させた組換え大腸菌を用いた７−メトキシ−２−テトラロンからの（Ｒ）−７−メトキシ−２−テトラロールの合成
実施例８で得られた組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）の培養液２０ｍｌにグルコース３ｇ、ＮＡＤ２ｍｇ、７−メトキシ−２−テトラロン２ｇを添加し、５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液の滴下によりｐＨ６．５に調整しつつ、窒素雰囲気下、３０℃で１５時間攪拌した。この反応液をトルエンで抽出し、脱溶剤した後、抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、７−メトキシ−２−テトラロール１．７ｇを得た。光学純度を測定した結果、生成した７−メトキシ−２−テトラロールは光学純度９９．９％ｅｅのＲ体であった。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ １．６２（ｓ，１Ｈ），１．７３〜１．８７（ｍ，１Ｈ），１．９８〜２．０８（ｍ，１Ｈ），２．７０〜２．８１（ｍ，２Ｈ），２．８８（ａｐｐ ｄｔ，１Ｈ），３．０５（ｄｄ，１Ｈ），３．７６（ｓ，３Ｈ），４．０９〜４．１９（ｍ，１Ｈ），６．６１（ｄ，１Ｈ），６．６９（ｄｄ，１Ｈ），７．００（ｄ，１Ｈ）
７−メトキシ−２−テトラロン、及び、７−メトキシ−２−テトラロールの定量は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：ナカライテスク株式会社製ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ８−ＭＳ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：水／アセトニトリル＝１／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ、カラム温度：室温）で行った。
また、７−メトキシ−２−テトラロールの光学純度の測定は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：ダイセル化学工業株式会社製Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＪ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール＝９／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２５４ｎｍ、カラム温度：室温）で行った。
実施例１１ ＲＤＲおよびグルコース脱水素酵素を同時生産させた組換え大腸菌を用いた３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オンからの（Ｒ）−３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オールの合成
実施例８で得られた組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）の培養液２０ｍｌにグルコース３ｇ、ＮＡＤ２ｍｇ、５０％（ｗ／ｗ）の３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オンのトルエン溶液４ｇを添加し、５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液の滴下によりｐＨ６．５に調整しつつ、窒素雰囲気下、３０℃で１８時間攪拌した。この反応液をトルエンで抽出し、脱溶剤した後、抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オール１．６ｇを得た。光学純度を測定した結果、生成した３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オールは光学純度９９．９％ｅｅのＲ体であった。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ １．４０〜１．６５（ｍ，２Ｈ），１．７０〜１．９５（ｍ，２Ｈ），１．９５〜２．２０（ｍ，１Ｈ），２．６５〜２．７５（ｍ，２Ｈ），２．９０〜３．１０（ｍ，２Ｈ），３．７８（ｓ，３Ｈ），３．６５〜３．９０（ｍ，１Ｈ），６．６６（ｄｄ，１Ｈ），６．７３（ｄ，１Ｈ），６．９８（ｄ，１Ｈ）
３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オン、及び、３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オールの定量は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：ナカライテスク株式会社製ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ８−ＭＳ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：水／アセトニトリル＝１／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ、カラム温度：室温）で行った。
また、３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オールの光学純度の測定は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：ダイセル化学工業株式会社製Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＪ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール＝９／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２５４ｎｍ、カラム温度：室温）で行った。
実施例１２ ＲＤＲおよびグルコース脱水素酵素を同時発現させた組換え大腸菌を用いた２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノンからの（Ｓ）−２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノールの合成
実施例８で得られた組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）の培養液５０ｍｌにグルコース１０ｇ、ＮＡＤ５ｍｇ、及び、５０％（ｗ／ｗ）の２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノンのトルエン溶液１０ｇを添加し、５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液の滴下によりｐＨ６．５に調整しつつ、３０℃で２２時間攪拌した。この反応液をトルエンで抽出し、脱溶剤した後、蒸留（１１０℃，０．８ｍｍＨｇ）し、無色オイル状の２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノール４．１ｇを得た。光学純度を測定した結果、生成した２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノールは光学純度９９．９％ｅｅのＳ体であった。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ ３．１０（ｓ，１Ｈ），３．６１（ｄｄ，１Ｈ），３．７０（ｄｄ，１Ｈ），４．８８（ｄｄ，１Ｈ），７．０６（ｍ，２Ｈ），７．３５（ｍ，２Ｈ）
２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノン、及び、２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノールの定量は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：株式会社ワイエムシィ製ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ Ａ−３０３（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：水／アセトニトリル＝１／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ、カラム温度：室温）で行った。また、２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノールの光学純度の測定は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：ダイセル化学工業株式会社製Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＪ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール＝３９／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２５４ｎｍ、カラム温度：室温）で行った。
実施例１３ ＲＤＲおよびグルコース脱水素酵素を同時発現させた組換え大腸菌を用いた２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンからの（Ｓ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールの合成
実施例８で得られた組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）の培養液５０ｍｌにグルコース１０ｇ、ＮＡＤ５ｍｇ、及び、５０％（ｗ／ｗ）の２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンのトルエン溶液１０ｇを添加し、５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液の滴下によりｐＨ６．５に調整しつつ、３０℃で２２時間攪拌した。この反応液をトルエンで抽出し、脱溶剤した後、抽出物の分析を行った。その結果、収率９７％で２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールが得られた。この際、生成した２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールは光学純度９９．９％ｅｅのＳ体であった。
２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノン、及び、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールの定量は、２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノン、及び、２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノールの場合と同様に行った。また、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールの光学純度の測定は、２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノールの場合と同様に行った。
実施例１４ ＲＤＲの基質特異性
０．３３％（ｖ／ｖ）のジメチルスルフォキシドを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質となる表３の各種カルボニル化合物を終濃度１ｍＭ、補酵素ＮＡＤＨを終濃度０．２５ｍＭとなるようそれぞれ溶解した。これにＲＤＲを添加し、３０℃で波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨをＮＡＤに酸化する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。そして、各種カルボニル化合物に対する活性を、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンに対する活性を１００％とした場合の相対値で表し、表３に示した。ＲＤＲは非常に広範なカルボニル化合物に対して還元活性を示した。
【産業上の利用可能性】
Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する活性を有するポリペプチド遺伝子のクローニング、およびそのヌクレオチド配列の解析により、該ポリペプチド産生能の高い形質転換体を得ることが可能になった。また、該ポリペプチドおよびグルコース脱水素酵素を同時に高生産する能力を有する形質転換体をも得ることが可能になった。さらに、これらの形質転換体を用いることにより、種々のカルボニル化合物から光学活性アルコールを効率良く合成することが可能となった。
【配列表】
【図１】
【図２】
【技術分野】
本発明は、式（１）
で表されるＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して、式（２）
で表される（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および該発現ベクターで形質転換された形質転換体に関する。
本発明はまた、該形質転換体を用いた光学活性アルコール、とりわけ光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノール、光学活性２−テトラロール誘導体、及び、光学活性１−フェニルエタノール誘導体の製造法に関する。光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノール、光学活性２−テトラロール誘導体、及び、光学活性１−フェニルエタノール誘導体は、医薬、農薬等の合成原料として有用な化合物である。
【背景技術】
光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの製造方法としては、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元する活性を有する酵素の存在下、このＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを製造する方法（特開平６−１４１８７６号公報）、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンにデポダスカス（Ｄｅｐｏｄａｓｃｕｓ）属等の微生物の菌体、培養物又はそれらの処理物を作用させて光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを製造する方法（特開平１０−１５０９９７号公報）が知られている。
また、光学活性２−テトラロール誘導体の製造方法としては、ベンゼン環上に置換基を有する２−テトラロン誘導体にパン酵母を作用させて、対応する光学活性２−テトラロール誘導体を製造する方法（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５１，１１５３１，（１９９５））が知られている。
また、光学活性１−フェニルエタノール誘導体の製造方法としては、２−ハロ−１−（置換フェニル）エタノンに、アシビア属やオガタエア属等に属する微生物またはその処理物を作用させ、光学活性２−ハロ−１−（置換フェニル）エタノールを得る方法（特開平４−２１８３８４号公報、及び、特開平１１−２１５９９５号公報）、１−（置換フェニル）エタノンにゲオトリカム・キャンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｎｄｉｄｕｍ）の乾燥菌体を作用させ、光学活性１−（置換フェニル）エタノールを得る方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３，８９５７（１９９８））が知られている。
しかしながら、これらの方法はいずれも、その基質仕込み濃度および基質から生成物への転換率が実用上十分ではなく、より効率の良い方法が待ち望まれていた。
発明の要約
本発明は、上記現状に鑑み、光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノール、光学活性２−テトラロール誘導体、光学活性１−フェニルエタノール誘導体を始めとする各種光学活性アルコールの製造に有用なポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および該発現ベクターで形質転換された形質転換体を提供することを課題とする。
また、本発明は、該形質転換体を用いて、光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノール、光学活性２−テトラロール誘導体、及び、光学活性１−フェニルエタノール誘導体を始めとする各種光学活性アルコールを効率よく製造する方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元し、（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する活性を有する微生物より、該活性を有するポリペプチドを単離した。そして、該ポリペプチドを利用することにより光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールのみならず、光学活性２−テトラロール誘導体及び光学活性１−フェニルエタノール誘導体を始めとする、有用な光学活性アルコールを効率良く製造することが可能であることを見出した。また、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離し、更には、発現ベクター並びに形質転換体を創製することにも成功し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して、（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成し得るポリペプチドである。
また、本発明は、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
また、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含有する発現ベクターである。
また、本発明は、上記ポリペプチドを高生産する形質転換体である。
更に、本発明は、該形質転換体を用いた、光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノール、光学活性２−テトラロール誘導体、及び、光学活性１−フェニルエタノール誘導体を始めとする、有用な光学活性アルコールの実用的な製造方法である。
発明の詳細な開示
以下、詳細に本発明を説明する。本発明のポリペプチドとしては、以下の（１）から（４）の理化学的性質を有するポリペプチドが挙げられる。
（１）ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを補酵素として、下記式（１）
で表されるＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して、下記式（２）
で表される（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する活性を有し、
（２）作用至適ｐＨが５．５から６．０、
（３）作用至適温度が５０℃から５５℃、
（４）分子量が、ゲル濾過分析において約５５０００、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動において約２８０００。
また、本発明のポリペプチドとしては、例えば、（ａ）配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、（ｂ）配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列または配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失または付加されたアミノ酸配列を含み、かつＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する活性を有するポリペプチドを挙げることができる。
配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失または付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８９）等に記載の公知の方法に準じて調製することができ、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する活性を有する限り、本発明のポリペプチドに包含される。
このようなポリペプチドは、当該活性を有する微生物から単離することができる。本発明のポリペプチドの起源として用いられる微生物は、特に限定されないが、例えばデボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属細菌が挙げられ、特に好ましいものとしてはデボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）ＩＦＯ１３５８４株を挙げることができる。
本発明のポリペプチドを生産する微生物は、野生株または変異株のいずれであってもよく、また、細胞融合または遺伝子操作などの遺伝学的手法により誘導された微生物であってもよい。
遺伝子操作された、本発明のポリペプチドを生産する微生物は、例えば、これらのポリペプチドを単離および／または精製してそのアミノ酸配列の一部または全部を決定する工程、このアミノ酸配列に基づいてポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を決定する工程、およびこのポリヌクレオチドを他の微生物に導入して組換え微生物を得る工程を包含する方法により得られ得る。
本発明のポリペプチドを有する微生物からの該ポリペプチドの精製は、常法により行い得る。例えば、該微生物の菌体を適当な培地で培養し、培養液から遠心分離により菌体を集める。得られた菌体を例えば、超音波破砕機などで破砕し、遠心分離にて菌体残さを除き、無細胞抽出液を得る。この無細胞抽出液から、例えば、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過、イオン交換、逆相等のカラムクロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、または組み合わせて用いて、ポリペプチドが精製され得る。
該酵素活性は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノン５ｍＭ、補酵素ＮＡＤＨ０．２５ｍＭおよび酵素を添加し、３０℃で波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより確認および計算することができる。
本発明のポリヌクレオチドとしては、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであればいずれも用いることができるが、例えば、（ｃ）配列表の配列番号２に示した塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は、（ｄ）配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、前記式（１）で表されるＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して、前記式（２）で表される（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。
配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。
ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、配列番号２に示されるポリヌクレオチドと、配列同一性が６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のポリヌクレオチドをあげることができ、コードされるポリペプチドがＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する活性を有する限り、本発明のポリヌクレオチドに包含される。
ここで、「配列の同一性（％）」とは、対比される２つのポリヌクレオチドを最適に整列させ、核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が両方の配列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に１００を乗じた数値で表される。
配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る：ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ８、１９９４年９月、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ５３７１１；Ｒｉｃｅ、Ｐ．（１９９６）Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ＥＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｐｅｔｅｒ Ｒｉｃｅ、Ｔｈｅ Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ、Ｈｉｎｘｔｏｎ Ｈａｌｌ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＣＢ１０ １ＲＱ、Ｅｎｇｌａｎｄ）、および、ｔｈｅ ＥｘＰＡＳｙ Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ分子生物学用サーバー（Ｇｅｎｅｖａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ａｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｖａ、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
本発明のポリヌクレオチドは、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する活性を有する微生物より取得することができる。該微生物として、例えばデボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属細菌が挙げられ、特に好ましいものとしてはデボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）ＩＦＯ１３５８４株を挙げることができる。
以下に、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する活性を有する微生物より、本発明のポリヌクレオチドを取得する方法の例を記載するが、本発明はこれに限定されない。
まず、精製した前記ポリペプチド、および該ポリペプチドを適当なエンドペプチダーゼで消化することにより得られるペプチド断片の部分アミノ酸配列を、エドマン法により決定する。そして、このアミノ酸配列情報をもとにヌクレオチドプライマーを合成する。次に、本発明のポリヌクレオチドの起源となる微生物より、通常のＤＮＡ単離法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８９）等に記載の方法により、該微生物の染色体ＤＮＡを調製する。
この染色体ＤＮＡを鋳型として、先述のヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一部を増幅する。ここで増幅されたポリヌクレオチドの塩基配列は、ジデオキシ・シークエンス法、ジデオキシ・チェイン・ターミネイション法などにより決定することができる。例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡ Ｓｅｑｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて行い得る。
該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一部の塩基配列が明らかになれば、例えば、ｉ−ＰＣＲ法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６，８１８６（１９８８））によりその全体の塩基配列を決定することができる。また、染色体ＤＮＡ上の該ポリヌクレオチドがイントロンを含むものであった場合は、例えば、以下の方法によりイントロンを含まない成熟型ポリヌクレオチドの塩基配列を決定する事ができる。
即ち、まず、該ポリヌクレオチドの起源となる微生物より、通常のヌクレオチド単離法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８９）等に記載の方法により、該微生物のｍＲＮＡを調製する。次に、このｍＲＮＡを鋳型とし、先に判明している該ポリヌクレオチドの５’末端および３’末端付近の配列を有するヌクレオチドプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，８９９８（１９８８））により成熟型ポリヌクレオチドを増幅し、その塩基配列を先と同様に決定する。
本発明のポリヌクレオチドを宿主微生物内に導入し、それをその導入された宿主微生物内で発現させるために用いられるベクターとしては、適当な宿主微生物内で該ポリヌクレオチド中の遺伝子を発現できるものであればいずれもが用いられ得る。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター等から選ばれたものが挙げられる。また、他の宿主株との間で遺伝子交換が可能なシャトルベクターであってもよい。
このようなベクターは、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のポリヌクレオチドと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に用いられ得る。
本願明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要素（例えば、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。
本願明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、該ポリヌクレオチド中の遺伝子が発現するように、ポリヌクレオチドが、その発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプおよび種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを導入する宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などがあげられるが、大腸菌が特に好ましい。
本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターは、常法により宿主細胞に導入され得る。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、例えば塩化カルシウム法により、本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを導入することができる。
本発明のポリペプチドを用いてＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生産する場合、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等の補酵素が必要となる。補酵素は通常、基質と等モルを要するが、酸化された該補酵素を還元型に変換する能力（以後、補酵素再生能と呼ぶ）を有する酵素をその基質とともに反応系に添加することにより、つまり補酵素再生系を、本発明のポリペプチドと組み合わせて反応を行うことにより、高価な補酵素の使用量を大幅に削減することができる。
補酵素再生能を有する酵素としては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素およびグルコース脱水素酵素などを用いることが出来る。好適には、グルコース脱水素酵素が用いられる。
上記の補酵素再生能を有する酵素を、不斉還元反応系に別途添加することによっても当該反応が行われ得るが、本発明のポリヌクレオチド、および補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの両者により形質転換せしめられた形質転換体を触媒として用いた場合、補酵素再生能を有する酵素を別に調製し反応系に添加することなしに、該反応を効率良く実施し得る。
このような形質転換体は、本発明のポリヌクレオチド、および補酵素再生能を有するポリペプチド（例えば、グルコース脱水素酵素）をコードするポリヌクレオチドを、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる他、これら２種のポリヌクレオチドを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それら２種のベクターを同一の宿主細胞に導入することによっても得られる。
なお、上述したように、本発明の発現ベクターは、上記ポリヌクレオチドを含むものである。好ましくは、プラスミドｐＮＴＤＲである発現ベクターが挙げられる。
本発明の発現ベクターとしては、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含むものも挙げられる。上記グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドは、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のグルコース脱水素酵素であることが好ましい。より好ましくは、プラスミドｐＮＴＤＲＧ１である発現ベクターが挙げられる。
本発明の形質転換体は、上記発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換して得られたものである。上記宿主細胞としては、大腸菌が好ましい。
また、本発明の形質転換体として、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲ）は、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８４５７の受託番号で、平成１５年８月２５日付で、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）は、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８４５８の受託番号で、平成１５年８月２５日付で、
それぞれ、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ブタペスト条約に基づいて国際寄託されている。
形質転換体中の補酵素再生能を有する酵素の活性は常法により測定することができる。例えば、グルコース脱水素酵素活性の測定は、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、基質グルコース０．１Ｍ、補酵素ＮＡＤＰ２ｍＭおよび酵素を添加し、２５℃で波長３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行い得る。
本発明の形質転換体を用いた光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノール、光学活性２−テトラロール誘導体、及び、光学活性１−フェニルエタノール誘導体等の光学活性アルコールの生産は以下のように実施され得る。つまり、形質転換体の培養物またはその処理物を、カルボニル基を有する化合物と反応させることにより、光学活性アルコールを製造する。
まず、適当な溶媒中に基質となるカルボニル基を有する化合物、ＮＡＤＨ等の補酵素、および該形質転換体の培養物またはその処理物等を添加し、ｐＨ調整下、攪拌して反応させる。
形質転換体の培養は、その微生物が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いて行い得る。また、培養温度は、好ましくは４〜５０℃である。
ここで形質転換体の処理物等とは、例えば、粗抽出液、培養菌体、凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、あるいはそれらの磨砕物等を意味する。さらにそれらは、ポリペプチド自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化されて用いられ得る。
また、本反応を行う際、形質転換体として本発明のポリペプチドと補酵素再生能を有する酵素（例えば、グルコース脱水素酵素）の両者を生産するものを用いる場合、反応系に補酵素再生のための基質（例えば、グルコース）を添加することにより、補酵素の使用量を大幅に減らすことが可能である。
基質となるカルボニル基を有する化合物としては、例えば、式（１）
で表されるＮ−ベンジル−３−ピロリジノン、一般式（３）
（式中、Ｒ１、Ｒ２は水素原子、水酸基又はアルコキシ基を示し、それぞれ同一でも異なってもよい。また、ｎは１又は２を示す。）で表される２−テトラロン誘導体、及び、一般式（５）
（式中、Ｒ３、Ｒ４は水素原子、ハロゲン原子、アルコキシ基又はニトロ基を示し、それぞれ同一でも異なってもよい。また、Ｒ５は水素原子、ハロゲン原子、水酸基又は置換基を有してもよいアルキル基を示す。）で表される１−フェニルエタノン誘導体を挙げることができる。式（３）、（５）で表される化合物としてより詳しくは、例えば、７−メトキシ−２−テトラロン、３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オン、２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノン、及び２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンを挙げることができる。
また、上記方法により得られる光学活性アルコールとしては、例えば式（２）
で表される（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノール、一般式（４）
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びｎは前記と同じ）で表される２−テトラロール誘導体、又は、一般式（６）
（式中、Ｒ３、Ｒ４、及び、Ｒ５は前記と同じ）で表される１−フェニルエタノール誘導体を挙げることができる。式（４）、（６）で表される化合物としてより詳しくは、例えば、７−メトキシ−２−テトラロール、３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オール、２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノール、又は、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールを挙げることができる。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４におけるアルコキシ基としては、炭素数１〜３のアルコキシ基であり、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等が挙げられる。好ましくはメトキシ基である。
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５におけるハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
Ｒ５における置換基を有してもよいアルキル基のアルキル基としては、炭素数１〜８のアルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ヘキシル基、オクチル基等が挙げられる。好ましくは炭素数１〜２のアルキル基である。Ｒ５における置換基を有してもよいアルキル基の置換基としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、水酸基、アミノ基等が挙げられる。
反応には水系溶媒を用いてもよいし、水系溶媒と有機系溶媒を混合して用いてもよい。有機系溶媒としては、例えば、トルエン、ヘキサン、ジイソプロピルエーテル、酢酸ｎ−ブチル、酢酸エチル等が挙げられる。
反応温度は、１０℃〜７０℃、好ましくは２０〜４０℃であり、反応時間は、１〜１００時間、好ましくは１０〜５０時間である。また、反応中、反応液のｐＨは、例えば塩酸、水酸化ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液等を用いて、４〜１０、好ましくは５〜８に維持する。
反応はバッチ方式あるいは連続方式で行われ得る。バッチ方式の場合、反応基質は０．１％から７０％（ｗ／ｖ）の仕込み濃度で添加される。
反応で生じた光学活性アルコールは常法により精製し得る。例えば、反応で生じた光学活性アルコールがＮ−ベンジル−３−ピロリジノール、７−メトキシ−２−テトラロール、３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オール、２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノール、又は、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールである場合、必要に応じ遠心分離、濾過などの処理を施して反応物から菌体等の懸濁物を除去した後、水酸化ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、塩酸等で抽出に適したｐＨ（３〜１１）に調整し、酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出し、有機溶媒を減圧下で除去する。さらに、蒸留、晶析またはクロマトグラフィー等の処理を行うことにより、精製され得る。
Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノン、及び、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの定量は、ガスクロマトグラフィー（カラム：ＵｎｉｐｏｒｔＢ １０％ＰＥＧ−２０Ｍ（ＩＤ３．０ｍｍ×１．０ｍ、ジーエルサイエンス社製）、カラム温度：２００℃、キャリアガス：窒素、検出：ＦＩＤ）で行い得る。
また、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの光学純度の測定は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＢ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、ダイセル化学工業株式会社製）、溶離液：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／ジエチルアミン＝９９／１／０．１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２５４ｎｍ、カラム温度：室温）で行い得る。
７−メトキシ−２−テトラロン、３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オン、７−メトキシ−２−テトラロール、及び、３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オールの定量は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：ナカライテスク株式会社製ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ８−ＭＳ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：水／アセトニトリル＝１／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ、カラム温度：室温）で行い得る。
また、７−メトキシ−２−テトラロール、及び、３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オールの光学純度の測定は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：ダイセル化学工業株式会社製Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＪ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール＝９／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２５４ｎｍ、カラム温度：室温）で行い得る。
２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノン、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノン、２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノール、及び、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールの定量は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：株式会社ワイエムシィ製ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ Ａ−３０３（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：水／アセトニトリル＝１／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ、カラム温度：室温）で行い得る。
また、２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノール、及び、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールの光学純度の測定は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：ダイセル化学工業株式会社製Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＪ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール＝３９／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２５４ｎｍ、カラム温度：室温）で行い得る。
以上のように、本発明に従えば、本発明のポリペフチドの効率的生産が可能であり、それを利用することにより、種々の有用な光学活性アルコールの優れた製造法が提供される。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のポリヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示す図である。
図２は、組換えプラスミドｐＮＴＤＲＧ１の作製方法及び構造を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている。
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）。
実施例１ 酵素の精製
以下の方法に従って、デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）ＩＦＯ１３５８４株よりＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する活性を有する酵素を単一に精製した。特に断りのない限り、精製操作は４℃で行った。（デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）ＩＦＯ１３５８４株の培養）
２Ｌ容坂口フラスコ７２本に下記の組成からなる液体培地４００ｍｌを分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。
培地組成（％は（ｗ／ｖ）で表示） ：
ポリペプトン １．０％
イーストエキス ０．３％
肉エキス ０．３％
モルトエキス １．０％
ＮａＣｌ ０．３％
アデカノールＬＧ−１０９（日本油脂社製） ０．００３％
水道水
ｐＨ７．０
この培地に、予め同培地にて前培養しておいたデボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）ＩＦＯ１３５８４株の培養液を５ｍｌずつ接種し、３０℃で、４８時間振とう培養した。
（無細胞抽出液の調整）
上記の培養液２８０００ｍｌから遠心分離により菌体を集めた後、生理食塩水で菌体を洗浄し、該菌株の湿菌体３６３ｇを得た。この湿菌体を５００ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、ＳＯＮＩＦＩＥＲ２５０型超音波破砕機（ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用いて破砕した。破砕物から遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液８４０ｍｌを得た。
（無細胞抽出液の熱処理および酸処理）
上記の無細胞抽出液を入れたビーカーを６０℃の恒温水槽に浸け、２５分間攪拌した後、氷浴中で４℃まで冷却した。生じた沈殿物を遠心分離にて除いた後、この遠心上清のｐＨをリン酸を用いて５．０に調整し、氷浴中で３時間攪拌した。生じた沈殿物を再度遠心分離にて除き、粗酵素液８３０ｍｌを得た。
（硫酸アンモニウム分画）
上記で得た粗酵素液のｐＨをアンモニア水を用いて７．０に調整した後、３５％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加、溶解し、生じた沈殿を遠心分離により除いた（この際粗酵素液のｐＨをアンモニア水でｐＨ７．０に維持しながら行った）。先と同様ｐＨ７．０を維持しながら、この遠心上清に５５％飽和となるようさらに硫酸アンモニウムを添加、溶解し、生じた沈殿を遠心分離により集めた。この沈殿を５０ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した後、同一緩衝液で１夜透析し、粗酵素液８３ｍｌを得た。
（ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィー）
上記硫酸アンモニウム分画で得られた粗酵素液のｐＨをアンモニア水を用いて８．０に調整した。これを、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（２５０ｍｌ）に供し、同一緩衝液で活性画分を溶出させた。活性画分を集め、リン酸を添加してｐＨ７．０に調製した。
（Ｐｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィー）
上記ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィーで得られた粗酵素液に終濃度１Ｍとなるよう硫酸アンモニウムを溶解し（この際、粗酵素液にアンモニア水を添加してｐＨ７．０に維持しながら行った）、１Ｍの硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＰｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（１００ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウムのリニアグラジエント（１Ｍから０Ｍまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１夜透析を行い、電気泳動的に単一な精製酵素標品を得た。以後、この酵素をＲＤＲと呼ぶことにする。
実施例２ 酵素の性質の測定
実施例１で得られたＲＤＲの酵素学的性質について検討した。酵素活性の測定は、基本的には、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノン５ｍＭ、補酵素ＮＡＤＨ０．２５ｍＭおよび酵素を添加し、３０℃で１分間反応させ、波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより行った。
（１）作用
ＮＡＤＨを補酵素として、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンに作用し、光学純度９９．９％ｅｅ以上の（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成した。ＮＡＤＰＨを補酵素として上記方法に準じて酵素活性を測定した場合、ＮＡＤＨを補酵素とした場合の約０．６％の活性を示した。
（２）作用至適ｐＨ
緩衝液として１００ｍＭリン酸緩衝液および１００ｍＭ酢酸緩衝液を用いて、ｐＨを４．０から８．０の範囲とした以外は、上記酵素活性の測定と同様にして酵素活性を測定した。その結果、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンに作用する至適ｐＨは５．５から６．０であった。
（３）作用至適温度
温度を２０℃から６０℃とした以外は、上記酵素活性の測定と同様にして、酵素活性を測定した。その結果、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンに作用する至適温度は５０℃から５５℃であった。
（４）分子量
溶離液として１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用い、ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ ＳＷＸＬカラム（東ソー株式会社製）による精製酵素ＲＤＲのゲル濾過クロマトグラフィー分析を行った結果、標準タンパク質との相対保持時間から算出した本酵素の分子量は約５５０００であった。また、酵素のサブユニットの分子量はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、標準タンパク質との相対移動度から算出した。本酵素のサブユニットの分子量は約２８０００であった。
実施例３ ＲＤＲ遺伝子のクローニング
（ＰＣＲプライマーの作成）
実施例１で得られた精製ＲＤＲを８Ｍ尿素存在下で変性した後、アクロモバクター由来のリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業株式会社製）で消化し、得られたペプチド断片のアミノ酸配列をＡＢＩ４９２型プロテインシーケンサー（パーキンエルマー社製）により決定した。このアミノ酸配列をもとに、ＤＮＡプライマー２種（プライマー１：配列番号３、プライマー２：配列番号４）を常法に従って合成した。
（ＰＣＲによるＲＤＲ遺伝子の増幅）
デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）ＩＦＯ１３５８４株の培養菌体からＭｕｒｒａｙ等の方法（Ｎｕｃｌ．，Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４３２１−４３２５（１９８０））に従って染色体ＤＮＡを抽出した。次に、上記で調製したＤＮＡプライマーを用い、得られた染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ったところ、ＲＤＲ遺伝子の一部と考えられる約７００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された（ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼとしてＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造株式会社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。）。このＤＮＡ断片を、プラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にクローニングし、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）およびＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いてその塩基配列を確認した。
（ｉ−ＰＣＲ法によるＲＤＲ遺伝子の全長配列の決定）
デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）ＩＦＯ１３５８４株の染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで完全消化し、得られたＤＮＡ断片の混合物をＴ４リガーゼにより分子内環化させた。これを鋳型として用い、前項で判明したＲＤＲ遺伝子の部分塩基配列情報をもとに、ｉ−ＰＣＲ法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６，８１８６（１９８８））により、染色体ＤＮＡ上のＲＤＲ遺伝子の全塩基配列を決定した（ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼとしてＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造株式会社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。また、塩基配列の決定は先と同様に行った）。
その塩基配列を図１に示した。また、塩基配列がコードするアミノ酸配列を塩基配列の下段に示した。このアミノ酸配列と、精製ＲＤＲのリシルエンドペプチダーゼ消化断片の部分アミノ酸配列を比較した結果、精製ＲＤＲの部分アミノ酸配列は全て、このアミノ酸配列中に存在した。図１中のアミノ酸配列において、精製ＲＤＲの部分アミノ酸配列と一致した部分には下線を付した。なお、図１の塩基配列及びアミノ酸配列は、配列表の配列番号２のものと同一である。
実施例４ ＲＤＲ遺伝子を含む組換えプラスミドの作製
実施例３で決定された塩基配列を基に、ＲＤＲ遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加したＮ末端ＤＮＡプライマー（プライマー３：配列番号５）、および同遺伝子の３’末端の直後にＥｃｏＲＩ部位を付加したＣ末端ＤＮＡプライマー（プライマー４：配列番号６）を合成した。次に、この２種のＤＮＡをプライマーとして用い、実施例３で調製したデボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）ＩＦＯ１３５８４株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加し、３’末端の直後にＥｃｏＲＩ切断点を付加した、ＲＤＲ遺伝子を増幅した（ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼとしてＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造株式会社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。）。これを、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより、組換えプラスミドｐＮＴＤＲを得た。
実施例５ ＲＤＲ遺伝子およびグルコース脱水素酵素遺伝子の両者を含む組換えプラスミドの作製
バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＡＭ１０３０株由来のグルコース脱水素酵素（以後、ＧＤＨと称する）の遺伝子の塩基配列情報（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８６，３８９（１９８９））を基に、ＧＤＨの構造遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のＳｈａｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（９塩基）を、さらにその直前にＥｃｏＲＩ切断点を付加したＮ末端ＤＮＡプライマー（プライマー５：配列番号７）と、ＧＤＨの構造遺伝子の終始コドンの直後にＳａｌＩ部位を付加したＣ末端ＤＮＡプライマー（プライマー６：配列番号８）を常法に従って合成した。これら２つのＤＮＡプライマーを用い、プラスミドｐＧＤＫ１（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８６，３８９（１９８９））を鋳型としてＰＣＲにより二本鎖ＤＮＡを合成した。このＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３）のｌａｃプロモーターの下流のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ部位に挿入することにより、組換えプラスミドｐＮＴＧ１を得た。次に、実施例４で調製したｐＮＴＤＲをＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化して得られるＲＤＲ遺伝子を、このｐＮＴＧ１上のＧＤＨ遺伝子の上流に存在するＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入し、プラスミドｐＮＴＤＲＧ１を得た。ｐＮＴＤＲＧ１の作製法および構造を図２に示す。
実施例６ 組換え大腸菌の作製
実施例４および５で得た組換えプラスミドｐＮＴＤＲ又はｐＮＴＤＲＧ１を用いて大腸菌ＨＢ１０１（宝酒造株式会社製）を形質転換し、組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲ）およびＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）を得た。
こうして得られた形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲ）およびＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）は、それぞれ、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８４５７およびＦＥＲＭ ＢＰ−０８４５８として、平成１５年８月２５日付で、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所に寄託されている。
実施例７ 組換え大腸菌におけるＲＤＲの生産
実施例６で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲ）を１２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地で培養し、遠心分離により集菌後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕し、無細胞抽出液を得た。
この無細胞抽出液のＲＤＲ活性を以下のように測定した。ＲＤＲ活性の測定は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノン５ｍＭ、補酵素ＮＡＤＨ０．２５ｍＭおよび酵素を添加し、３０℃で波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより行った。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨをＮＡＤに酸化する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。この様に測定した無細胞抽出液中のＲＤＲ活性を比活性として表し、ベクタープラスミドを保持する形質転換体と比較した。また、実施例１と同様の方法で調製したデボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）ＩＦＯ１３５８４株の無細胞抽出液中のＲＤＲ活性についても同様に比較した。それらの結果を表１に示す。
大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲ）では、ベクタープラスミドのみの形質転換体である大腸菌ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）と比較して明らかなＲＤＲ活性の増加が見られ、デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）ＩＦＯ１３５８４株と比較して、比活性は約１７倍に達した。
実施例８ 組換え大腸菌におけるＲＤＲおよびＧＤＨの同時生産
実施例６で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）を、実施例７と同様に処理して得られる無細胞抽出液のＧＤＨ活性を、以下のように測定した。ＧＤＨ活性の測定は１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、基質グルコース０．１Ｍ、補酵素ＮＡＤＰ２ｍＭ及び酵素を添加し、２５℃で波長３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行った。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。また、ＲＤＲ活性についても実施例７と同様に測定した。
このように測定した無細胞抽出液中のＲＤＲおよびＧＤＨ活性を比活性として表し、大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲ）およびベクターのみの形質転換体ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）と比較した結果を表２に示す。大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）では、ベクタープラスミドのみの形質転換体である大腸菌ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）と比較して、明らかなＲＤＲおよびＧＤＨ活性の増加が見られた。
実施例９ ＲＤＲおよびグルコース脱水素酵素を同時生産させた組換え大腸菌を用いたＮ−ベンジル−３−ピロリジノンからの（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの合成
実施例８で得られた組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）の培養液を、ＳＯＮＩＦＩＲＥ２５０（ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用いて超音波破砕した。この菌体破砕液２０ｍｌにグルコース２ｇ、ＮＡＤ１ｍｇ、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノン１ｇを添加した。この反応液を、５Ｍの塩酸および水酸化ナトリウム水溶液を添加することによりｐＨ６．５に調整しつつ、窒素雰囲気下、３０℃で１８時間攪拌した。反応終了後、５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液２ｍｌを添加し、反応液をトルエンで抽出した。抽出液をエバポレーターで脱溶剤した後、抽出物の分析を行ったところ、収率９６％でＮ−ベンジル−３−ピロリジノールが得られた。この際、生成したＮ−ベンジル−３−ピロリジノールは光学純度９９．９％ｅｅのＲ体であった。
Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノン、及び、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの定量は、ガスクロマトグラフィー（カラム：ＵｎｉｐｏｒｔＢ １０％ＰＥＧ−２０Ｍ（ＩＤ３．０ｍｍ×１．０ｍ、ジーエルサイエンス社製）、カラム温度：２００℃、キャリアガス：窒素、検出：ＦＩＤ）で行った。
また、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの光学純度の測定は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＢ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、ダイセル化学工業社製）、溶離液：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／ジエチルアミン＝９９／１／０．１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２５４ｎｍ、カラム温度：室温）で行った。
実施例１０ ＲＤＲおよびグルコース脱水素酵素を同時生産させた組換え大腸菌を用いた７−メトキシ−２−テトラロンからの（Ｒ）−７−メトキシ−２−テトラロールの合成
実施例８で得られた組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）の培養液２０ｍｌにグルコース３ｇ、ＮＡＤ２ｍｇ、７−メトキシ−２−テトラロン２ｇを添加し、５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液の滴下によりｐＨ６．５に調整しつつ、窒素雰囲気下、３０℃で１５時間攪拌した。この反応液をトルエンで抽出し、脱溶剤した後、抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、７−メトキシ−２−テトラロール１．７ｇを得た。光学純度を測定した結果、生成した７−メトキシ−２−テトラロールは光学純度９９．９％ｅｅのＲ体であった。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ １．６２（ｓ，１Ｈ），１．７３〜１．８７（ｍ，１Ｈ），１．９８〜２．０８（ｍ，１Ｈ），２．７０〜２．８１（ｍ，２Ｈ），２．８８（ａｐｐ ｄｔ，１Ｈ），３．０５（ｄｄ，１Ｈ），３．７６（ｓ，３Ｈ），４．０９〜４．１９（ｍ，１Ｈ），６．６１（ｄ，１Ｈ），６．６９（ｄｄ，１Ｈ），７．００（ｄ，１Ｈ）
７−メトキシ−２−テトラロン、及び、７−メトキシ−２−テトラロールの定量は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：ナカライテスク株式会社製ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ８−ＭＳ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：水／アセトニトリル＝１／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ、カラム温度：室温）で行った。
また、７−メトキシ−２−テトラロールの光学純度の測定は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：ダイセル化学工業株式会社製Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＪ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール＝９／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２５４ｎｍ、カラム温度：室温）で行った。
実施例１１ ＲＤＲおよびグルコース脱水素酵素を同時生産させた組換え大腸菌を用いた３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オンからの（Ｒ）−３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オールの合成
実施例８で得られた組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）の培養液２０ｍｌにグルコース３ｇ、ＮＡＤ２ｍｇ、５０％（ｗ／ｗ）の３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オンのトルエン溶液４ｇを添加し、５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液の滴下によりｐＨ６．５に調整しつつ、窒素雰囲気下、３０℃で１８時間攪拌した。この反応液をトルエンで抽出し、脱溶剤した後、抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オール１．６ｇを得た。光学純度を測定した結果、生成した３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オールは光学純度９９．９％ｅｅのＲ体であった。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ １．４０〜１．６５（ｍ，２Ｈ），１．７０〜１．９５（ｍ，２Ｈ），１．９５〜２．２０（ｍ，１Ｈ），２．６５〜２．７５（ｍ，２Ｈ），２．９０〜３．１０（ｍ，２Ｈ），３．７８（ｓ，３Ｈ），３．６５〜３．９０（ｍ，１Ｈ），６．６６（ｄｄ，１Ｈ），６．７３（ｄ，１Ｈ），６．９８（ｄ，１Ｈ）
３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オン、及び、３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オールの定量は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：ナカライテスク株式会社製ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ８−ＭＳ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：水／アセトニトリル＝１／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ、カラム温度：室温）で行った。
また、３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オールの光学純度の測定は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：ダイセル化学工業株式会社製Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＪ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール＝９／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２５４ｎｍ、カラム温度：室温）で行った。
実施例１２ ＲＤＲおよびグルコース脱水素酵素を同時発現させた組換え大腸菌を用いた２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノンからの（Ｓ）−２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノールの合成
実施例８で得られた組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）の培養液５０ｍｌにグルコース１０ｇ、ＮＡＤ５ｍｇ、及び、５０％（ｗ／ｗ）の２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノンのトルエン溶液１０ｇを添加し、５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液の滴下によりｐＨ６．５に調整しつつ、３０℃で２２時間攪拌した。この反応液をトルエンで抽出し、脱溶剤した後、蒸留（１１０℃，０．８ｍｍＨｇ）し、無色オイル状の２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノール４．１ｇを得た。光学純度を測定した結果、生成した２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノールは光学純度９９．９％ｅｅのＳ体であった。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ ３．１０（ｓ，１Ｈ），３．６１（ｄｄ，１Ｈ），３．７０（ｄｄ，１Ｈ），４．８８（ｄｄ，１Ｈ），７．０６（ｍ，２Ｈ），７．３５（ｍ，２Ｈ）
２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノン、及び、２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノールの定量は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：株式会社ワイエムシィ製ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ Ａ−３０３（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：水／アセトニトリル＝１／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ、カラム温度：室温）で行った。また、２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノールの光学純度の測定は、高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：ダイセル化学工業株式会社製Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＪ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール＝３９／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２５４ｎｍ、カラム温度：室温）で行った。
実施例１３ ＲＤＲおよびグルコース脱水素酵素を同時発現させた組換え大腸菌を用いた２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンからの（Ｓ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールの合成
実施例８で得られた組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）の培養液５０ｍｌにグルコース１０ｇ、ＮＡＤ５ｍｇ、及び、５０％（ｗ／ｗ）の２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンのトルエン溶液１０ｇを添加し、５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液の滴下によりｐＨ６．５に調整しつつ、３０℃で２２時間攪拌した。この反応液をトルエンで抽出し、脱溶剤した後、抽出物の分析を行った。その結果、収率９７％で２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールが得られた。この際、生成した２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールは光学純度９９．９％ｅｅのＳ体であった。
２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノン、及び、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールの定量は、２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノン、及び、２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノールの場合と同様に行った。また、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールの光学純度の測定は、２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノールの場合と同様に行った。
実施例１４ ＲＤＲの基質特異性
０．３３％（ｖ／ｖ）のジメチルスルフォキシドを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質となる表３の各種カルボニル化合物を終濃度１ｍＭ、補酵素ＮＡＤＨを終濃度０．２５ｍＭとなるようそれぞれ溶解した。これにＲＤＲを添加し、３０℃で波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨをＮＡＤに酸化する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。そして、各種カルボニル化合物に対する活性を、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンに対する活性を１００％とした場合の相対値で表し、表３に示した。ＲＤＲは非常に広範なカルボニル化合物に対して還元活性を示した。
【産業上の利用可能性】
Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する活性を有するポリペプチド遺伝子のクローニング、およびそのヌクレオチド配列の解析により、該ポリペプチド産生能の高い形質転換体を得ることが可能になった。また、該ポリペプチドおよびグルコース脱水素酵素を同時に高生産する能力を有する形質転換体をも得ることが可能になった。さらに、これらの形質転換体を用いることにより、種々のカルボニル化合物から光学活性アルコールを効率良く合成することが可能となった。
【配列表】
【図１】
【図２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）から（４）の理化学的性質を有するポリペプチド：
（１）作用：ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを補酵素として、式（１）
で表されるＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して、式（２）
で表される（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する、
（２）作用至適ｐＨ：５．５から６．０、
（３）作用至適温度：５０℃から５５℃、
（４）分子量：ゲル濾過分析において約５５０００、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約２８０００。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド：
（ａ）配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列または配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、式（１）
で表されるＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して、式（２）
で表される（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
ポリペプチドがデボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属に属する微生物に由来する請求の範囲第１または２項に記載のポリペプチド。
【請求項４】
デボシア属に属する微生物が、デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）ＩＦＯ１３５８４株である請求の範囲第３項記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求の範囲第１から４項のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
以下の（ｃ）又は（ｄ）のポリヌクレオチド：
（ｃ）配列表の配列番号２に示した塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｄ）配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、式（１）
で表されるＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して、式（２）
で表される（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求の範囲第５または６項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８】
プラスミドｐＮＴＤＲである請求の範囲第７項記載の発現ベクター。
【請求項９】
グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求の範囲第７項に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
前記グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドがバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のグルコース脱水素酵素である、請求の範囲第９項に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
プラスミドｐＮＴＤＲＧ１である請求の範囲第１０項に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
請求の範囲第７から１１項のいずれかに記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体。
【請求項１３】
前記宿主細胞が大腸菌である請求の範囲第１２項に記載の形質転換体。
【請求項１４】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲ）（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８４５７）である請求の範囲第１３項に記載の形質転換体。
【請求項１５】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８４５８）である請求の範囲第１３項に記載の形質転換体。
【請求項１６】
請求の範囲第１２から１５項のいずれかに記載の形質転換体の培養物またはその処理物を、カルボニル基を有する化合物と反応させることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法。
【請求項１７】
前記カルボニル基を有する化合物が、式（１）
で表されるＮ−ベンジル−３−ピロリジノンであり、前記光学活性アルコールが、式（２）
で表される（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールである、請求の範囲第１６項に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記カルボニル基を有する化合物が、一般式（３）
（式中、Ｒ１、Ｒ２は水素原子、水酸基又はアルコキシ基を示し、それぞれ同一でも異なってもよい。また、ｎは１又は２を示す。）で表される２−テトラロン誘導体であり、前記光学活性アルコールが、一般式（４）
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びｎは前記と同じ）で表される２−テトラロール誘導体である請求の範囲第１６項に記載の製造方法。
【請求項１９】
前記２−テトラロン誘導体が７−メトキシ−２−テトラロンであり、前記２−テトラロール誘導体が（Ｒ）−７−メトキシ−２−テトラロールである請求の範囲第１８項に記載の製造方法。
【請求項２０】
前記２−テトラロン誘導体が３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オンであり、前記２−テトラロール誘導体が（Ｒ）−３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オールである請求の範囲第１８項に記載の製造方法。
【請求項２１】
前記カルボニル基を有する化合物が、一般式（５）
（式中、Ｒ３、Ｒ４は水素原子、ハロゲン原子、アルコキシ基又はニトロ基を示し、それぞれ同一でも異なってもよい。また、Ｒ５は水素原子、ハロゲン原子、水酸基又は置換基を有してもよいアルキル基を示す。）で表される１−フェニルエタノン誘導体であり、前記光学活性アルコールが、一般式（６）
（式中、Ｒ３、Ｒ４、及び、Ｒ５は前記と同じ）で表される１−フェニルエタノール誘導体である請求の範囲第１６項に記載の製造方法。
【請求項２２】
前記１−フェニルエタノン誘導体が２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノンであり、前記１−フェニルエタノール誘導体が（Ｓ）−２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノールである、請求の範囲第２１項に記載の製造方法。
【請求項２３】
前記１−フェニルエタノン誘導体が２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンであり、前記１−フェニルエタノール誘導体が（Ｓ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールである請求の範囲第２１項に記載の製造方法。
【請求項１】
以下の（１）から（４）の理化学的性質を有するポリペプチド：
（１）作用：ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを補酵素として、式（１）
で表されるＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して、式（２）
で表される（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する、
（２）作用至適ｐＨ：５．５から６．０、
（３）作用至適温度：５０℃から５５℃、
（４）分子量：ゲル濾過分析において約５５０００、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約２８０００。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド：
（ａ）配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列または配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、式（１）
で表されるＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して、式（２）
で表される（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
ポリペプチドがデボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属に属する微生物に由来する請求の範囲第１または２項に記載のポリペプチド。
【請求項４】
デボシア属に属する微生物が、デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）ＩＦＯ１３５８４株である請求の範囲第３項記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求の範囲第１から４項のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
以下の（ｃ）又は（ｄ）のポリヌクレオチド：
（ｃ）配列表の配列番号２に示した塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｄ）配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、式（１）
で表されるＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して、式（２）
で表される（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求の範囲第５または６項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８】
プラスミドｐＮＴＤＲである請求の範囲第７項記載の発現ベクター。
【請求項９】
グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求の範囲第７項に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
前記グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドがバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のグルコース脱水素酵素である、請求の範囲第９項に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
プラスミドｐＮＴＤＲＧ１である請求の範囲第１０項に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
請求の範囲第７から１１項のいずれかに記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体。
【請求項１３】
前記宿主細胞が大腸菌である請求の範囲第１２項に記載の形質転換体。
【請求項１４】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲ）（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８４５７）である請求の範囲第１３項に記載の形質転換体。
【請求項１５】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８４５８）である請求の範囲第１３項に記載の形質転換体。
【請求項１６】
請求の範囲第１２から１５項のいずれかに記載の形質転換体の培養物またはその処理物を、カルボニル基を有する化合物と反応させることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法。
【請求項１７】
前記カルボニル基を有する化合物が、式（１）
で表されるＮ−ベンジル−３−ピロリジノンであり、前記光学活性アルコールが、式（２）
で表される（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールである、請求の範囲第１６項に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記カルボニル基を有する化合物が、一般式（３）
（式中、Ｒ１、Ｒ２は水素原子、水酸基又はアルコキシ基を示し、それぞれ同一でも異なってもよい。また、ｎは１又は２を示す。）で表される２−テトラロン誘導体であり、前記光学活性アルコールが、一般式（４）
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びｎは前記と同じ）で表される２−テトラロール誘導体である請求の範囲第１６項に記載の製造方法。
【請求項１９】
前記２−テトラロン誘導体が７−メトキシ−２−テトラロンであり、前記２−テトラロール誘導体が（Ｒ）−７−メトキシ−２−テトラロールである請求の範囲第１８項に記載の製造方法。
【請求項２０】
前記２−テトラロン誘導体が３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オンであり、前記２−テトラロール誘導体が（Ｒ）−３−メトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−６−オールである請求の範囲第１８項に記載の製造方法。
【請求項２１】
前記カルボニル基を有する化合物が、一般式（５）
（式中、Ｒ３、Ｒ４は水素原子、ハロゲン原子、アルコキシ基又はニトロ基を示し、それぞれ同一でも異なってもよい。また、Ｒ５は水素原子、ハロゲン原子、水酸基又は置換基を有してもよいアルキル基を示す。）で表される１−フェニルエタノン誘導体であり、前記光学活性アルコールが、一般式（６）
（式中、Ｒ３、Ｒ４、及び、Ｒ５は前記と同じ）で表される１−フェニルエタノール誘導体である請求の範囲第１６項に記載の製造方法。
【請求項２２】
前記１−フェニルエタノン誘導体が２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノンであり、前記１−フェニルエタノール誘導体が（Ｓ）−２−クロロ−１−（４’−フルオロフェニル）エタノールである、請求の範囲第２１項に記載の製造方法。
【請求項２３】
前記１−フェニルエタノン誘導体が２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンであり、前記１−フェニルエタノール誘導体が（Ｓ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールである請求の範囲第２１項に記載の製造方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２７０５５
【国際公開日】平成１６年４月１日（２００４．４．１）
【発行日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５３７９９０（Ｐ２００４−５３７９９０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１１９５７
【国際出願日】平成１５年９月１９日（２００３．９．１９）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年４月１日（２００４．４．１）
【発行日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１１９５７
【国際出願日】平成１５年９月１９日（２００３．９．１９）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
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