新規フラバン化合物
【課題】公知のエピガロカテキンガレートより強力な生理活性を有する新規フラバン系化合物及びその製造法と前記フラバン化合物を含有する食品又は医薬品の提供。
【解決手段】下記式（１）
で表される新規フラバン化合物。
【解決手段】下記式（１）
で表される新規フラバン化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌活性を有する新規フラバン化合物、該新規フラバン化合物を含む抗癌剤、食品又は医薬品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
コニフェリルアルコールは植物の二次代謝産物の一つであり、例えば樹木の主成分であるリグニンやリグナンの前駆体となる。また他の多くの植物成分の前駆体にもなっており、天然界に比較的多く存在する成分である。松樹皮や安息香に含有することが知られており、食経験があり人に対する安全性も比較的高い成分である。コニフェリルアルコール自体には優れた薬理作用等の特筆すべき有用性はないものの、コニフェリルアルコールを原料として、食品原料や香粧品原料等多種の有用成分が作り出されている。例えば、香料として多用されているバニリンをコニフェリルアルコールから効率的に製造する方法（特許文献１、特許文献２）、コニフェリルアルコールをペルオキシダーゼと過酸化水素を含有する水溶液と接触せしめて得られる突然変異抑制剤（特許文献３）、トウガラシ類に含まれる交感神経の活性化剤であるコニフェリル誘導体をコニフェリルアルコールから製造する方法（特許文献４）等が開示されている。
【０００３】
このように、原料としてのコニフェリルアルコールの用途は広いため、植物から得るだけではなく人工的に効率的に製造する技術も知られている。例えば、新規酵素を用いてコニフェリルアルコール等のｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド誘導体等の製造方法（特許文献５）、バニリルアルコールオキシダーゼをコードする遺伝子を含んだ酵母によりコニフェリルアルコール等を産生する方法（特許文献６）等があげられる。
【０００４】
すなわち、原料としてのコニフェリルアルコールの価値の高さから、効率的なコニフェリルアルコールの製造方法は進歩しており、このような現状ではコニフェリルアルコールを用いた新規素材の開発やコニフェリルアルコールを用いた素材の更なる用途拡大が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平５−２４４９６５号公報
【特許文献２】特開２０００−２９０２１５号公報
【特許文献３】特許第２５５９６７９号
【特許文献４】特開２００７−２１０９６９号公報
【特許文献５】特開平１０−２３４３６３号公報
【特許文献６】特表２００９−５２８０４１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らはコニフェリルアルコールや該化合物を用いた有用化合物に関する前記の状況を鑑みて、新規な生理活性を有するコニフェリルアルコール関連化合物の探索と、その製造方法を確立すべく鋭意検討した結果、驚くべきことにコニフェリルアルコールをアルカリ条件下で加熱処理することのみで、原料であるコニフェリルアルコールには認められない優れた生理活性を有する新規フラバン化合物を生成させることを初めて見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
したがって、本発明は、新規なフラバン化合物を提供し、さらにこの安全性の高い新規化合物を、効率よく、安全に生成する方法を提供することを目的とする。
また、このフラバン化合物は、極めて優れた抗癌活性を有することから、この新規化合物を有効成分として含有する抗癌剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の要旨は、
〔１〕 下記式（１）で表されるフラバン化合物又はその薬学的に許容可能な塩、
【０００９】
【化１】
【００１０】
〔２〕 請求項１記載のフラバン化合物及びその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有する抗癌剤、
〔３〕 請求項１に記載のフラバン化合物及びその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする食品又は医薬品、
〔４〕 コニフェリルアルコールをアルカリ条件下で加熱処理することにより前記式（１）で表される化合物を生成することを特徴とする前記式（１）で表されるフラバン化合物の製造方法
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、抗癌活性に優れた新規なフラバン化合物及びその製造方法を提供することができる。また、本発明により原料のコニフェリルアルコールが持たない抗癌活性を有することから優れた抗癌剤を提供することができる。
本発明の新規フラバン系化合物は、前記のような生理活性に優れることに加えて、安全性にも優れることから、食品又は医薬品に配合することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、実施例１で行ったＨＰＬＣの分析結果を示す。上図が加熱後、下図が加熱前の結果であり、「※」が新規フラバン化合物のピークを示す。
【図２】図２は実施例３の細胞増殖抑制試験より得られた結果を示すグラフである。 図２の縦軸は細胞生存率を、横軸は各試料の濃度を示している。
【図３】図３は、実施例４のＤＮＡラダー（ｌａｄｄｅｒ）法より得られた電気泳動の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１４】
本発明のフラバン化合物は、式（１）：
【００１５】
【化２】
【００１６】
で表される構造式を有する。
【００１７】
また、本発明では、前記式（１）で表されるフラバン化合物は、薬学的に許容可能な塩でもよい。薬学的に許容可能な塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アルミニウムヒドロキシド塩等の金属ヒドロキシド塩； アルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、トリアルキルアミン塩、アルキレンジアミン塩、シクロアルキルアミン塩、アリールアミン塩、アラルキルアミン塩、複素環式アミン塩等のアミン塩； α−アミノ酸塩、ω−アミノ酸塩等のアミノ酸塩；ペプチド塩又はそれらから誘導される第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミン塩等が挙げられる。これらの薬理的に許容し得る塩は、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００１８】
前記式（１）で表されるフラバン化合物又は薬学的に許容可能な塩（以下、本発明の新規フラバン化合物ともいう）は、フラバン骨格を有していることから、カテキン類同様に様々な生理活性を有することが予想される。
【００１９】
例えば、本発明の新規フラバン化合物は、カテキン類で抗癌活性が強いことが知られているエピガロカテキンガレートと比べて、抗癌活性が高い。
【００２０】
本発明の新規フラバン化合物は、コニフェリルアルコールを含有する組成物を、アルカリ条件下で加熱処理することで生成することができる。この製造方法としては、具体的には、アルカリ条件下において、前記組成物温度７０℃以上に加熱処理する。
【００２１】
本発明の新規フラバン化合物は、コニフェリルアルコール以外の原料を用いて化学合成することも可能ではあるが、その場合には反応工程が複雑であり有害な試薬や工程を必要とする。また、不純物を除去するという安全性の観点から精製を徹底する必要もあり、工業的には不向きな方法である。これに対して、前記の本発明の新規フラバン化合物の製造方法は、安価で入手できるコニフェリルアルコールをアルカリ条件下で加熱処理する工程を有するものであり、有害な試薬や、危険な工程を必要としない効率的で安全な製造方法である。
【００２２】
本発明の新規フラバン化合物の前駆体としてコニフェリルアルコールが必要である。コニフェリルアルコールは、天然由来のものであっても、化学合成された純度の高い化成品であっても良い。天然由来のコニフェリルアルコールを用いる場合は、完全に精製されたものである必要はなく、その後の所望の反応が進み最終的に新規化合物が得られるから、混合物であっても問題ない。ただし、回収量の観点からは、コニフェリルアルコールが５重量％以上含有された混合物が原料として望ましい。このような原料としては、機能性原料としても使用される松樹皮エキスや、廃棄されるような樹皮の抽出液や樹皮の分解処理物等、樹木由来エキス、安息香、あるいは先行技術に示されるような微生物発酵による培養液等が挙げられる。
【００２３】
コニフェリルアルコールの純品、あるいはコニフェリルアルコール含有混合物を、適切な溶媒に溶解させる。この際、溶媒が水のみであればコニフェリルアルコールの溶解度が著しく低いために、水と有機溶媒の混液や、有機溶媒のみに溶解させればよい。水と有機溶媒の配合比や、有機溶媒の種類に特に制限はなく、コニフェリルアルコールが十分に溶解すれば良い。望ましくは、メタノールやエタノールのみか、水とメタノール、水とエタノールの混液を使用することが、安全性やコスト面から望ましい。最終的な精製を十分に適用せずに食品に使用する場合には、安全性や法規面からエタノールや含水エタノールの使用が望ましい。
【００２４】
上記で得られたコニフェリルアルコール含有溶液を、アルカリ性に調整する。コニフェリルアルコール含有溶液を調製した後に試薬を添加しｐＨを調整しても良いし、前述のコニフェリルアルコール含有溶液の調製時に前もって溶媒のｐＨを調整しておいても良い。ｐＨは最終的に８．０以上であれば反応が進むが、ｐＨ１３．０を越えると反応と同時に、他の反応や目的化合物の分解も一方で生じるために最終的な回収量が低下する。したがって、反応開始時のｐＨは８．０〜１３．０が望ましい。コニフェリルアルコールの濃度に制限はなく、反応前に十分に溶解していなくとも反応時に溶解することがある。コニフェリルアルコールの濃度が高いほど、溶媒使用量が少ない等のメリットもあるため、濃度は各々の溶媒に対しコニフェリルアルコールが飽和する濃度近辺が好ましい。
【００２５】
コニフェリルアルコール含有溶液をアルカリ性に調整するために使用できるアルカリに特に制限はないが、安全性、効率及びコスト面からは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウムが望ましい。反応時のｐＨ変化を極力抑える場合が生じた際には、緩衝溶液を用いても良いが、必ずしも必要な手法ではない。
【００２６】
アルカリ性に調整されたコニフェリルアルコール含有溶液は、加熱される。所望の反応を効率的に進ませるために、加熱温度は７０℃以上が必要である。溶媒の沸点から考え、加圧加温が望ましい。開放容器にコニフェリルアルコール含有溶液を入れ高温で容器を加温する、密閉容器にコニフェリルアルコール含有溶液を入れ加温する、レトルト装置やオートクレーブを用いて加圧加温する等、少なくとも部分的に溶液温度が７０℃以上に達することが必要である。回収効率面から、溶液温度が均一に７０℃〜１５０℃になることが、さらに好ましい。加熱時間も加熱温度と同様に限られたものではなく、効率的に目的の反応が進行する時間条件とすればよい。特に、加熱時間は加熱温度との兼ね合いによるものであり、加熱温度に応じた加熱時間にすることが望ましい。例えば、１１０℃付近で加熱する場合は、５分〜６０分の加熱時間が望ましい。また、加熱反応は、一度でも良いし、複数回に分けて繰り返し加熱しても良い。効率面から判断すればよい。
【００２７】
前記のアルカリ条件下で加熱処理することでコニフェリルアルコールがアルカリ処理されて、前記式（１）で表されるフラバン化合物を含有した混合物が得られる。安全な原料のみを用いた工程で得られた場合には、混合物の状態で使用することが可能である。例えば、天然由来のコニフェリルアルコールを含水エタノール溶媒に溶解し、水酸化ナトリウムや炭酸水素ナトリウムでｐＨ調整を行い、加熱反応させた場合には、混合物として食品原料の一つとして使用が可能である。
【００２８】
風味面での改良やさらなる高機能化を望む場合は、本発明の新規フラバン化合物を濃縮して濃度を高める、あるいは精製し純品を得ることができる。濃縮、精製は、公知の方法で実施可能である。クロロホルム、酢酸エチル、エタノール、メタノール等の溶媒抽出法や炭酸ガスによる超臨界抽出法等で抽出して濃縮できる。カラムクロマトグラフィーを利用して濃縮や精製を施すことも可能である。再結晶法や限外ろ過膜等の膜処理法も適用可能である。最後に減圧乾燥や凍結乾燥により溶媒除去すると、粉末状の本発明の新規フラバン化合物の純品を得ることができる。
【００２９】
本発明の新規フラバン化合物は、後述のように、優れた抗癌活性を有するために、本発明の新規フラバン化合物を有効成分として含有する抗癌剤を提供することができる。また、前記抗癌剤では、他の有効成分を含有しても良い。
【００３０】
また、本発明の新規フラバン化合物は、前記抗癌効果を目的として、液状、ペースト状、ゲル状、及び固形状の食品又は医薬品等として使用することができる。
【００３１】
例えば、食品の場合には、水、アルコール、澱粉質、蛋白質、繊維質、糖質、脂質、ビタミン、ミネラル、着香料、着色料、甘味料、調味料、安定剤、防腐剤のような食品に通常配合される原料又は素材と組み合わせて、また医薬品の場合には、担体、賦形剤、希釈剤、安定剤と組み合わせて、本発明の新規フラバン化合物を使用することが出来る。特に、本発明の新規フラバン化合物の生理活性分野を考慮すると、癌予防・癌治療等の健康維持増進、さらには疾病治癒分野において用いることが好ましい。
【００３２】
本発明の新規フラバン化合物が持つさらなる効果効能は、得られた生理活性データより類推できる範囲で使用できる。
【００３３】
本発明の新規フラバン化合物を医薬用途で使用する場合、例えば、化合物の摂取量は、所望の改善、治療又は予防効果が得られるような量であれば特に制限されず、通常その態様、患者の年齢、性別、体質その他の条件、疾患の種類並びにその程度等に応じて適宜選択される。１日当たり約０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ程度とするのがよく、これを１日に１〜４回に分けて摂取することができる。
【００３４】
本発明の新規フラバン化合物は、機能性食品、健康食品、健康志向食品等の食品に使用することができる。食品の形態としては、例えば、飲料、アルコール飲料、ゼリー、菓子等、どのような形態でもよく、例えば、菓子類の中でも、その容量等から保存や携帯に優れた、ハードキャンディ、ソフトキャンディ、グミキャンディ、タブレット等が挙げられるが、特に限定はない。
【００３５】
また、本発明の新規フラバン化合物を医薬品又は食品として経口から投与又は摂取する場合には、常法に基づいて、錠剤、丸剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤等としてもよい。錠剤、丸剤、顆粒剤、顆粒を含有するカプセル剤の顆粒は、必要により、ショ糖等の糖類、マルチトール等の糖アルコールで糖衣を施したり、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等でコーティングを施したりすることもできる。または胃溶性もしくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。また、製剤の溶解性を向上させるために、公知の可溶化処理を施すこともできる。常法に基づいて、注射剤、点滴剤に配合して使用してもよい。
【００３６】
前記の医薬品又は食品は、安全性に優れたものであるので、ヒトに対してだけでなく、例えば、非ヒト動物、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類等の治療剤又は飼料に配合してもよい。
【００３７】
次に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
（実施例１：新規フラバン化合物の生成）
コニフェリルアルコール（和光純薬）１ｇをエタノール２０ｍｌに溶解し、５％ＮａＨＣＯ3水溶液２０ｍｌを加えた混合液（ｐＨ＝９．４）をオートクレーブ（ＳＡＮＹＯ ＬＡＢＯ ＡＵＴＯＣＬＡＶＥ）にて１１０℃、２０分間加熱した。得られた反応後組成物１ｍｌをメタノールにて５０ｍｌにメスアップし、このうちの１０μｌをＨＰＬＣにより分析した。
ＨＰＬＣ分析は以下条件にて行った。
カラム：逆相用カラム「Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ（登録商標）Ｃ−３０−ＵＧ−５」（４．６ｍｍｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）
移動相：Ａ・・・Ｈ2Ｏ（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））， Ｂ・・・アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
注入：１０μｌ
検出：２５４ｎｍ
勾配（容量％）：８０％Ａ／２０％Ｂから２０％Ａ／８０％Ｂまで３０分間、２０％Ａ／８０％Ｂから１００％Ｂまで５分間、１００％Ｂで１０分間（全て直線）
【００３９】
得られたクロマトグラムを図１に示す。上記の反応後に、増大したピークがいくつか確認されたことから、複数の化合物が生成されていることが確認された。中でも、※のピークで示された化合物は、下図が示すように反応前溶液には存在が認められないことから、上記の反応により生成されていることがわかる。
【００４０】
（実施例２：新規フラバン化合物の単離・構造決定）
実施例１で得られた反応物における、図１の※で示したピークに含まれる化合物を分取ＨＰＬＣにより単離し、常法により乾燥したところ新規化合物を５０ｍｇ得た。単離精製した新規化合物は、黄色粉末状物質となった。
【００４１】
次いで、前記新規化合物の分子量を高分解能電子イオン化質量分析法（Electron Ionization-Mass Spectrometry）にて測定したところ、測定値は３４２．４８６０であり、理論値との比較から、以下の分子式を得た。
理論値Ｃ２０Ｈ２２Ｏ５(M+) : ３４２．４８５７
分子式Ｃ20Ｈ22Ｏ5
【００４２】
次に、前記新規化合物を核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定に供し、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及び各種２次元ＮＭＲデータの解析から、前記新規化合物が式（１）で表される構造を有することを確認した。式（１）で表されるフラバン化合物は本発明の方法で効率的に生成できることが示された。
【００４３】
なお、ＮＭＲ測定値について、式（１）で表される新規フラバン系化合物の各部位を
【００４４】
【化３】
【００４５】
として、それぞれの1Ｈ核磁気共鳴スペクトル、13Ｃ核磁気共鳴スペクトルをそれぞれ表１に示す。
値はδ、ｐｐｍで、溶媒はＭｅｔｈａｎｏｌ−ｄ３で測定した値である。
【００４６】
【表１】
【００４７】
また、前記新規フラバン化合物の物理化学的性状は、以下のようになった。
（性状）
黄色粉末
（溶解性）
水： 不溶
メタノール： 可溶
エタノール： 可溶
ＤＭＳＯ： 可溶
クロロホルム： 可溶
酢酸エチル： 可溶
【００４８】
（実施例３：新規フラバン化合物の抗癌作用１）
次に癌細胞に対する新規フラバン化合物の効果を見るため、ＨＬ−６０細胞（Ｈｕｍａｎ ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｏｋｅｍｉａｃｅｌｌｓ：ヒト骨髄球性白血病細胞）を用いた癌細胞増殖抑制作用について試験した。
【００４９】
ＨＬ−６０細胞の培養には、４ｍＭグルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、ＳＩＧＭＡ）、１０％ＦＢＳ（Ｆｏｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を含む高栄養培地ＲＰＭＩ−１６９０（ＳＩＧＭＡ）を使用した。試験には細胞培養用９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用い、５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように細胞数を調整したＨＬ−６０細胞を１ウェルあたり１００μｌずつ播種した。
【００５０】
試料は、コニフェリルアルコール（和光純薬）、エピガロカテキンガレート（和光純薬、以下ＥＧＣｇ）、実施例２で得られた本発明品である新規フラバン化合物の３種類を用いた。ＥＧＣｇは、フラバン骨格を有し、ＨＬ−６０に対する高い細胞増殖抑制能を有することが知られている化合物である。試料調製については、各々の化合物をＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、和光純薬）にて溶解し、ＨＬ−６０細胞培養液中に最終濃度がそれぞれ０．５μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、及び２０μＭとなるように添加し、試験を開始した。
【００５１】
生存細胞数の定量はｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８（ＤＯＪＩＮＤＯ）を用いたMTT法にて行った。試験開始より２４時間後、各ウェルにｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８を１０μｌ添加し、よく攪拌した。１時間の遮光反応後にプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｍｏｄｅｌ ６８０）を用いて測定波長４５０ｎｍの吸光度測定を行い、得られたデータをもとに細胞生存率を算出した。
【００５２】
得られた結果を図２に示す。図２に示すグラフの縦軸は細胞生存率を、横軸はそれぞれの試料の濃度について示している。また、細胞生存率とは、溶媒であるＤＭＳＯのみを添加した培養液の生存細胞数を１００％とし、各化合物の濃度下における細胞の生存細胞数を相対値として算出した値である。各化合物濃度と細胞生存率の関係から、細胞増殖を５０％抑制する濃度ＩＣ50（５０％阻害濃度：ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を求めた。結果を表２に示す。
【００５３】
【表２】
【００５４】
表２及び図２の結果より、実施例２で得られたフラバン化合物は、コニフェリルアルコールやＥＧＣｇよりも、細胞生存率が低く、ＨＬ−６０細胞の増殖を抑制する効果がより高いことが示唆される。また、ＩＣ50は実施例２で得られたフラバン化合物は６．０μＭであり、ＥＧＣｇの１４．６μＭと比較して、２倍程度効果が強いことがわかった。
【００５５】
（実施例４：新規フラバン化合物の抗癌作用２）
次いで、抗癌作用の試験を、ＨＬ−６０細胞を用いて実施した。ＨＬ−６０細胞を５．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１００ｍｍスタンダードディッシュ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に播種し、ＤＭＳＯにて調整したコニフェリルアルコールと新規フラバン化合物をそれぞれ１０μＭとなるように添加した。２４時間培養を行い、回収した細胞をＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ ＰＢＳ（−） Ｗａｋｏ）にて洗浄し、既知のＤＮＡ抽出法を用いて細胞からＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡサンプルを１％アガロースゲル（Ｔａｋａｒａ ａｇａｒｏｓｅ）に２００ｎｇ／ｗｅｌｌとなるようにアプライした。電気泳動を行い、染色反応はエチジウムブロマイド（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて行った。
【００５６】
得られた結果を図３に示す。
図３は、各試料のＤＮＡ抽出物の電気泳動写真であり、電流は上から下に流されている。レーン左より、通常培養細胞（第１レーン）、ＤＭＳＯ処理（第２レーン）、コニフェリルアルコール１０μＭ処理（第３レーン）、新規フラバン化合物１０μＭ処理（第４レーン）、ＤＮＡ分子量マーカーλ/Ｐｓｔ(第５レーン)を流した。通常培養細胞（第１レーン）及びＤＭＳＯ処理細胞（第２レーン）ではＤＮＡのラダー化が確認されない点から、本実験の信頼性が確認できる。
また、細胞を１０μＭの新規フラバン化合物で処理したもの（第４レーン）ではＤＮＡのラダー化が観察できるのに対して、同濃度のコニフェリルアルコール（第３レーン）ではＤＮＡのラダー化は観察されなかった。これより、新規フラバン化合物はアポトーシスを誘導する高い効果を有し、その効力はコニフェリルアルコールよりも高いことが示された。
【００５７】
（実施例５：加熱温度によるフラバン化合物の生成量の違い）
コニフェリルアルコール１００ｍｇ、エタノール１ｍｌ、５％ＮａＨＣＯ3水溶液１ｍｌの混合溶液（ｐＨ＝９．４）を、オートクレーブにて７０℃、９０℃、１１０℃、１３０℃の各温度条件で２０分間加熱した。それぞれの温度条件で得られた反応後組成物１ｍｌをメタノールにて５０ｍｌにメスアップし、実施例１と同様にＨＰＬＣにより分析した。
【００５８】
その結果、いずれでも新規化合物の生成は確認できた。コニフェリルアルコールからの生成費比率（重量％）は、７０℃が極微量、９０℃が２％、１１０℃が５％、１３０℃が３％となり、１１０℃での加熱がもっとも多く新規化合物が生成していた。
【００５９】
（実施例６：新規フラバン化合物含有エキスの調製）
松樹皮エキス１０ｇ、エタノール１０ｍｌ、５％ＮａＨＣＯ3水溶液を１０ｍｌ加えて調製した混合溶液（ｐＨ＝９．０）を、オートクレーブにて１１０℃、２０分間加熱した。得られた反応溶液を減圧加熱させて乾固し、新規フラバン化合物含有エキスを６ｇ得た。得られた新規フラバン化合物含有エキス６ｇ中には、実施例５と同様の手法で確認したところ新規フラバン化合物が０．０２０ｇ含有されていた。必要に応じてこの作業を繰り返した。
【００６０】
（実施例７：新規フラバン化合物を含有する食品）
実施例６で得た新規フラバン化合物含有エキス１ｇをあらかじめ１００ｍＬのエタノールに溶解させ、これに砂糖５００ｇ、水飴４００ｇを混合溶解し、生クリーム１００ｇ、バター２０ｇ、練乳７０ｇ、乳化剤１．０ｇを混合した後、真空釜にて−５５０mmＨｇ減圧させ、１１５℃の条件下で濃縮し、水分値３．０重量％のミルクハードキャンディを得た。このミルクハードキャンディは、菓子として食べ易いものであることはもちろん、癌患者における癌の拡散のリスクを低減したり、癌の発症のリスクを低減したり、癌の予防を期待した機能性食品としても利用できる。
【００６１】
（実施例８：新規フラバン化合物を含有する医薬品）
実施例１，２と同様の方法で得た新規フラバン化合物をエタノールに溶解し、これを微結晶セルロースに吸着させた後に、減圧乾燥させた。これを常法に従い、打錠品を得た。処方は、フラバン化合物を１０重量部、コーンスターチ２３重量部、乳糖１２重量部、カルボキシメチルセルロース８重量部、微結晶セルロース３２重量部、ポリビニルピロリドン４重量部、ステアリン酸マグネシウム３重量部、タルク８重量部の通りである。本打錠品は、癌治癒を目的とする医薬品として有効に利用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌活性を有する新規フラバン化合物、該新規フラバン化合物を含む抗癌剤、食品又は医薬品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
コニフェリルアルコールは植物の二次代謝産物の一つであり、例えば樹木の主成分であるリグニンやリグナンの前駆体となる。また他の多くの植物成分の前駆体にもなっており、天然界に比較的多く存在する成分である。松樹皮や安息香に含有することが知られており、食経験があり人に対する安全性も比較的高い成分である。コニフェリルアルコール自体には優れた薬理作用等の特筆すべき有用性はないものの、コニフェリルアルコールを原料として、食品原料や香粧品原料等多種の有用成分が作り出されている。例えば、香料として多用されているバニリンをコニフェリルアルコールから効率的に製造する方法（特許文献１、特許文献２）、コニフェリルアルコールをペルオキシダーゼと過酸化水素を含有する水溶液と接触せしめて得られる突然変異抑制剤（特許文献３）、トウガラシ類に含まれる交感神経の活性化剤であるコニフェリル誘導体をコニフェリルアルコールから製造する方法（特許文献４）等が開示されている。
【０００３】
このように、原料としてのコニフェリルアルコールの用途は広いため、植物から得るだけではなく人工的に効率的に製造する技術も知られている。例えば、新規酵素を用いてコニフェリルアルコール等のｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド誘導体等の製造方法（特許文献５）、バニリルアルコールオキシダーゼをコードする遺伝子を含んだ酵母によりコニフェリルアルコール等を産生する方法（特許文献６）等があげられる。
【０００４】
すなわち、原料としてのコニフェリルアルコールの価値の高さから、効率的なコニフェリルアルコールの製造方法は進歩しており、このような現状ではコニフェリルアルコールを用いた新規素材の開発やコニフェリルアルコールを用いた素材の更なる用途拡大が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平５−２４４９６５号公報
【特許文献２】特開２０００−２９０２１５号公報
【特許文献３】特許第２５５９６７９号
【特許文献４】特開２００７−２１０９６９号公報
【特許文献５】特開平１０−２３４３６３号公報
【特許文献６】特表２００９−５２８０４１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らはコニフェリルアルコールや該化合物を用いた有用化合物に関する前記の状況を鑑みて、新規な生理活性を有するコニフェリルアルコール関連化合物の探索と、その製造方法を確立すべく鋭意検討した結果、驚くべきことにコニフェリルアルコールをアルカリ条件下で加熱処理することのみで、原料であるコニフェリルアルコールには認められない優れた生理活性を有する新規フラバン化合物を生成させることを初めて見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
したがって、本発明は、新規なフラバン化合物を提供し、さらにこの安全性の高い新規化合物を、効率よく、安全に生成する方法を提供することを目的とする。
また、このフラバン化合物は、極めて優れた抗癌活性を有することから、この新規化合物を有効成分として含有する抗癌剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の要旨は、
〔１〕 下記式（１）で表されるフラバン化合物又はその薬学的に許容可能な塩、
【０００９】
【化１】
【００１０】
〔２〕 請求項１記載のフラバン化合物及びその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有する抗癌剤、
〔３〕 請求項１に記載のフラバン化合物及びその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする食品又は医薬品、
〔４〕 コニフェリルアルコールをアルカリ条件下で加熱処理することにより前記式（１）で表される化合物を生成することを特徴とする前記式（１）で表されるフラバン化合物の製造方法
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、抗癌活性に優れた新規なフラバン化合物及びその製造方法を提供することができる。また、本発明により原料のコニフェリルアルコールが持たない抗癌活性を有することから優れた抗癌剤を提供することができる。
本発明の新規フラバン系化合物は、前記のような生理活性に優れることに加えて、安全性にも優れることから、食品又は医薬品に配合することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、実施例１で行ったＨＰＬＣの分析結果を示す。上図が加熱後、下図が加熱前の結果であり、「※」が新規フラバン化合物のピークを示す。
【図２】図２は実施例３の細胞増殖抑制試験より得られた結果を示すグラフである。 図２の縦軸は細胞生存率を、横軸は各試料の濃度を示している。
【図３】図３は、実施例４のＤＮＡラダー（ｌａｄｄｅｒ）法より得られた電気泳動の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１４】
本発明のフラバン化合物は、式（１）：
【００１５】
【化２】
【００１６】
で表される構造式を有する。
【００１７】
また、本発明では、前記式（１）で表されるフラバン化合物は、薬学的に許容可能な塩でもよい。薬学的に許容可能な塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アルミニウムヒドロキシド塩等の金属ヒドロキシド塩； アルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、トリアルキルアミン塩、アルキレンジアミン塩、シクロアルキルアミン塩、アリールアミン塩、アラルキルアミン塩、複素環式アミン塩等のアミン塩； α−アミノ酸塩、ω−アミノ酸塩等のアミノ酸塩；ペプチド塩又はそれらから誘導される第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミン塩等が挙げられる。これらの薬理的に許容し得る塩は、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００１８】
前記式（１）で表されるフラバン化合物又は薬学的に許容可能な塩（以下、本発明の新規フラバン化合物ともいう）は、フラバン骨格を有していることから、カテキン類同様に様々な生理活性を有することが予想される。
【００１９】
例えば、本発明の新規フラバン化合物は、カテキン類で抗癌活性が強いことが知られているエピガロカテキンガレートと比べて、抗癌活性が高い。
【００２０】
本発明の新規フラバン化合物は、コニフェリルアルコールを含有する組成物を、アルカリ条件下で加熱処理することで生成することができる。この製造方法としては、具体的には、アルカリ条件下において、前記組成物温度７０℃以上に加熱処理する。
【００２１】
本発明の新規フラバン化合物は、コニフェリルアルコール以外の原料を用いて化学合成することも可能ではあるが、その場合には反応工程が複雑であり有害な試薬や工程を必要とする。また、不純物を除去するという安全性の観点から精製を徹底する必要もあり、工業的には不向きな方法である。これに対して、前記の本発明の新規フラバン化合物の製造方法は、安価で入手できるコニフェリルアルコールをアルカリ条件下で加熱処理する工程を有するものであり、有害な試薬や、危険な工程を必要としない効率的で安全な製造方法である。
【００２２】
本発明の新規フラバン化合物の前駆体としてコニフェリルアルコールが必要である。コニフェリルアルコールは、天然由来のものであっても、化学合成された純度の高い化成品であっても良い。天然由来のコニフェリルアルコールを用いる場合は、完全に精製されたものである必要はなく、その後の所望の反応が進み最終的に新規化合物が得られるから、混合物であっても問題ない。ただし、回収量の観点からは、コニフェリルアルコールが５重量％以上含有された混合物が原料として望ましい。このような原料としては、機能性原料としても使用される松樹皮エキスや、廃棄されるような樹皮の抽出液や樹皮の分解処理物等、樹木由来エキス、安息香、あるいは先行技術に示されるような微生物発酵による培養液等が挙げられる。
【００２３】
コニフェリルアルコールの純品、あるいはコニフェリルアルコール含有混合物を、適切な溶媒に溶解させる。この際、溶媒が水のみであればコニフェリルアルコールの溶解度が著しく低いために、水と有機溶媒の混液や、有機溶媒のみに溶解させればよい。水と有機溶媒の配合比や、有機溶媒の種類に特に制限はなく、コニフェリルアルコールが十分に溶解すれば良い。望ましくは、メタノールやエタノールのみか、水とメタノール、水とエタノールの混液を使用することが、安全性やコスト面から望ましい。最終的な精製を十分に適用せずに食品に使用する場合には、安全性や法規面からエタノールや含水エタノールの使用が望ましい。
【００２４】
上記で得られたコニフェリルアルコール含有溶液を、アルカリ性に調整する。コニフェリルアルコール含有溶液を調製した後に試薬を添加しｐＨを調整しても良いし、前述のコニフェリルアルコール含有溶液の調製時に前もって溶媒のｐＨを調整しておいても良い。ｐＨは最終的に８．０以上であれば反応が進むが、ｐＨ１３．０を越えると反応と同時に、他の反応や目的化合物の分解も一方で生じるために最終的な回収量が低下する。したがって、反応開始時のｐＨは８．０〜１３．０が望ましい。コニフェリルアルコールの濃度に制限はなく、反応前に十分に溶解していなくとも反応時に溶解することがある。コニフェリルアルコールの濃度が高いほど、溶媒使用量が少ない等のメリットもあるため、濃度は各々の溶媒に対しコニフェリルアルコールが飽和する濃度近辺が好ましい。
【００２５】
コニフェリルアルコール含有溶液をアルカリ性に調整するために使用できるアルカリに特に制限はないが、安全性、効率及びコスト面からは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウムが望ましい。反応時のｐＨ変化を極力抑える場合が生じた際には、緩衝溶液を用いても良いが、必ずしも必要な手法ではない。
【００２６】
アルカリ性に調整されたコニフェリルアルコール含有溶液は、加熱される。所望の反応を効率的に進ませるために、加熱温度は７０℃以上が必要である。溶媒の沸点から考え、加圧加温が望ましい。開放容器にコニフェリルアルコール含有溶液を入れ高温で容器を加温する、密閉容器にコニフェリルアルコール含有溶液を入れ加温する、レトルト装置やオートクレーブを用いて加圧加温する等、少なくとも部分的に溶液温度が７０℃以上に達することが必要である。回収効率面から、溶液温度が均一に７０℃〜１５０℃になることが、さらに好ましい。加熱時間も加熱温度と同様に限られたものではなく、効率的に目的の反応が進行する時間条件とすればよい。特に、加熱時間は加熱温度との兼ね合いによるものであり、加熱温度に応じた加熱時間にすることが望ましい。例えば、１１０℃付近で加熱する場合は、５分〜６０分の加熱時間が望ましい。また、加熱反応は、一度でも良いし、複数回に分けて繰り返し加熱しても良い。効率面から判断すればよい。
【００２７】
前記のアルカリ条件下で加熱処理することでコニフェリルアルコールがアルカリ処理されて、前記式（１）で表されるフラバン化合物を含有した混合物が得られる。安全な原料のみを用いた工程で得られた場合には、混合物の状態で使用することが可能である。例えば、天然由来のコニフェリルアルコールを含水エタノール溶媒に溶解し、水酸化ナトリウムや炭酸水素ナトリウムでｐＨ調整を行い、加熱反応させた場合には、混合物として食品原料の一つとして使用が可能である。
【００２８】
風味面での改良やさらなる高機能化を望む場合は、本発明の新規フラバン化合物を濃縮して濃度を高める、あるいは精製し純品を得ることができる。濃縮、精製は、公知の方法で実施可能である。クロロホルム、酢酸エチル、エタノール、メタノール等の溶媒抽出法や炭酸ガスによる超臨界抽出法等で抽出して濃縮できる。カラムクロマトグラフィーを利用して濃縮や精製を施すことも可能である。再結晶法や限外ろ過膜等の膜処理法も適用可能である。最後に減圧乾燥や凍結乾燥により溶媒除去すると、粉末状の本発明の新規フラバン化合物の純品を得ることができる。
【００２９】
本発明の新規フラバン化合物は、後述のように、優れた抗癌活性を有するために、本発明の新規フラバン化合物を有効成分として含有する抗癌剤を提供することができる。また、前記抗癌剤では、他の有効成分を含有しても良い。
【００３０】
また、本発明の新規フラバン化合物は、前記抗癌効果を目的として、液状、ペースト状、ゲル状、及び固形状の食品又は医薬品等として使用することができる。
【００３１】
例えば、食品の場合には、水、アルコール、澱粉質、蛋白質、繊維質、糖質、脂質、ビタミン、ミネラル、着香料、着色料、甘味料、調味料、安定剤、防腐剤のような食品に通常配合される原料又は素材と組み合わせて、また医薬品の場合には、担体、賦形剤、希釈剤、安定剤と組み合わせて、本発明の新規フラバン化合物を使用することが出来る。特に、本発明の新規フラバン化合物の生理活性分野を考慮すると、癌予防・癌治療等の健康維持増進、さらには疾病治癒分野において用いることが好ましい。
【００３２】
本発明の新規フラバン化合物が持つさらなる効果効能は、得られた生理活性データより類推できる範囲で使用できる。
【００３３】
本発明の新規フラバン化合物を医薬用途で使用する場合、例えば、化合物の摂取量は、所望の改善、治療又は予防効果が得られるような量であれば特に制限されず、通常その態様、患者の年齢、性別、体質その他の条件、疾患の種類並びにその程度等に応じて適宜選択される。１日当たり約０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ程度とするのがよく、これを１日に１〜４回に分けて摂取することができる。
【００３４】
本発明の新規フラバン化合物は、機能性食品、健康食品、健康志向食品等の食品に使用することができる。食品の形態としては、例えば、飲料、アルコール飲料、ゼリー、菓子等、どのような形態でもよく、例えば、菓子類の中でも、その容量等から保存や携帯に優れた、ハードキャンディ、ソフトキャンディ、グミキャンディ、タブレット等が挙げられるが、特に限定はない。
【００３５】
また、本発明の新規フラバン化合物を医薬品又は食品として経口から投与又は摂取する場合には、常法に基づいて、錠剤、丸剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤等としてもよい。錠剤、丸剤、顆粒剤、顆粒を含有するカプセル剤の顆粒は、必要により、ショ糖等の糖類、マルチトール等の糖アルコールで糖衣を施したり、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等でコーティングを施したりすることもできる。または胃溶性もしくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。また、製剤の溶解性を向上させるために、公知の可溶化処理を施すこともできる。常法に基づいて、注射剤、点滴剤に配合して使用してもよい。
【００３６】
前記の医薬品又は食品は、安全性に優れたものであるので、ヒトに対してだけでなく、例えば、非ヒト動物、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類等の治療剤又は飼料に配合してもよい。
【００３７】
次に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
（実施例１：新規フラバン化合物の生成）
コニフェリルアルコール（和光純薬）１ｇをエタノール２０ｍｌに溶解し、５％ＮａＨＣＯ3水溶液２０ｍｌを加えた混合液（ｐＨ＝９．４）をオートクレーブ（ＳＡＮＹＯ ＬＡＢＯ ＡＵＴＯＣＬＡＶＥ）にて１１０℃、２０分間加熱した。得られた反応後組成物１ｍｌをメタノールにて５０ｍｌにメスアップし、このうちの１０μｌをＨＰＬＣにより分析した。
ＨＰＬＣ分析は以下条件にて行った。
カラム：逆相用カラム「Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ（登録商標）Ｃ−３０−ＵＧ−５」（４．６ｍｍｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）
移動相：Ａ・・・Ｈ2Ｏ（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））， Ｂ・・・アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
注入：１０μｌ
検出：２５４ｎｍ
勾配（容量％）：８０％Ａ／２０％Ｂから２０％Ａ／８０％Ｂまで３０分間、２０％Ａ／８０％Ｂから１００％Ｂまで５分間、１００％Ｂで１０分間（全て直線）
【００３９】
得られたクロマトグラムを図１に示す。上記の反応後に、増大したピークがいくつか確認されたことから、複数の化合物が生成されていることが確認された。中でも、※のピークで示された化合物は、下図が示すように反応前溶液には存在が認められないことから、上記の反応により生成されていることがわかる。
【００４０】
（実施例２：新規フラバン化合物の単離・構造決定）
実施例１で得られた反応物における、図１の※で示したピークに含まれる化合物を分取ＨＰＬＣにより単離し、常法により乾燥したところ新規化合物を５０ｍｇ得た。単離精製した新規化合物は、黄色粉末状物質となった。
【００４１】
次いで、前記新規化合物の分子量を高分解能電子イオン化質量分析法（Electron Ionization-Mass Spectrometry）にて測定したところ、測定値は３４２．４８６０であり、理論値との比較から、以下の分子式を得た。
理論値Ｃ２０Ｈ２２Ｏ５(M+) : ３４２．４８５７
分子式Ｃ20Ｈ22Ｏ5
【００４２】
次に、前記新規化合物を核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定に供し、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及び各種２次元ＮＭＲデータの解析から、前記新規化合物が式（１）で表される構造を有することを確認した。式（１）で表されるフラバン化合物は本発明の方法で効率的に生成できることが示された。
【００４３】
なお、ＮＭＲ測定値について、式（１）で表される新規フラバン系化合物の各部位を
【００４４】
【化３】
【００４５】
として、それぞれの1Ｈ核磁気共鳴スペクトル、13Ｃ核磁気共鳴スペクトルをそれぞれ表１に示す。
値はδ、ｐｐｍで、溶媒はＭｅｔｈａｎｏｌ−ｄ３で測定した値である。
【００４６】
【表１】
【００４７】
また、前記新規フラバン化合物の物理化学的性状は、以下のようになった。
（性状）
黄色粉末
（溶解性）
水： 不溶
メタノール： 可溶
エタノール： 可溶
ＤＭＳＯ： 可溶
クロロホルム： 可溶
酢酸エチル： 可溶
【００４８】
（実施例３：新規フラバン化合物の抗癌作用１）
次に癌細胞に対する新規フラバン化合物の効果を見るため、ＨＬ−６０細胞（Ｈｕｍａｎ ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｏｋｅｍｉａｃｅｌｌｓ：ヒト骨髄球性白血病細胞）を用いた癌細胞増殖抑制作用について試験した。
【００４９】
ＨＬ−６０細胞の培養には、４ｍＭグルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、ＳＩＧＭＡ）、１０％ＦＢＳ（Ｆｏｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を含む高栄養培地ＲＰＭＩ−１６９０（ＳＩＧＭＡ）を使用した。試験には細胞培養用９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用い、５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように細胞数を調整したＨＬ−６０細胞を１ウェルあたり１００μｌずつ播種した。
【００５０】
試料は、コニフェリルアルコール（和光純薬）、エピガロカテキンガレート（和光純薬、以下ＥＧＣｇ）、実施例２で得られた本発明品である新規フラバン化合物の３種類を用いた。ＥＧＣｇは、フラバン骨格を有し、ＨＬ−６０に対する高い細胞増殖抑制能を有することが知られている化合物である。試料調製については、各々の化合物をＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、和光純薬）にて溶解し、ＨＬ−６０細胞培養液中に最終濃度がそれぞれ０．５μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、及び２０μＭとなるように添加し、試験を開始した。
【００５１】
生存細胞数の定量はｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８（ＤＯＪＩＮＤＯ）を用いたMTT法にて行った。試験開始より２４時間後、各ウェルにｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８を１０μｌ添加し、よく攪拌した。１時間の遮光反応後にプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｍｏｄｅｌ ６８０）を用いて測定波長４５０ｎｍの吸光度測定を行い、得られたデータをもとに細胞生存率を算出した。
【００５２】
得られた結果を図２に示す。図２に示すグラフの縦軸は細胞生存率を、横軸はそれぞれの試料の濃度について示している。また、細胞生存率とは、溶媒であるＤＭＳＯのみを添加した培養液の生存細胞数を１００％とし、各化合物の濃度下における細胞の生存細胞数を相対値として算出した値である。各化合物濃度と細胞生存率の関係から、細胞増殖を５０％抑制する濃度ＩＣ50（５０％阻害濃度：ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を求めた。結果を表２に示す。
【００５３】
【表２】
【００５４】
表２及び図２の結果より、実施例２で得られたフラバン化合物は、コニフェリルアルコールやＥＧＣｇよりも、細胞生存率が低く、ＨＬ−６０細胞の増殖を抑制する効果がより高いことが示唆される。また、ＩＣ50は実施例２で得られたフラバン化合物は６．０μＭであり、ＥＧＣｇの１４．６μＭと比較して、２倍程度効果が強いことがわかった。
【００５５】
（実施例４：新規フラバン化合物の抗癌作用２）
次いで、抗癌作用の試験を、ＨＬ−６０細胞を用いて実施した。ＨＬ−６０細胞を５．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１００ｍｍスタンダードディッシュ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に播種し、ＤＭＳＯにて調整したコニフェリルアルコールと新規フラバン化合物をそれぞれ１０μＭとなるように添加した。２４時間培養を行い、回収した細胞をＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ ＰＢＳ（−） Ｗａｋｏ）にて洗浄し、既知のＤＮＡ抽出法を用いて細胞からＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡサンプルを１％アガロースゲル（Ｔａｋａｒａ ａｇａｒｏｓｅ）に２００ｎｇ／ｗｅｌｌとなるようにアプライした。電気泳動を行い、染色反応はエチジウムブロマイド（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて行った。
【００５６】
得られた結果を図３に示す。
図３は、各試料のＤＮＡ抽出物の電気泳動写真であり、電流は上から下に流されている。レーン左より、通常培養細胞（第１レーン）、ＤＭＳＯ処理（第２レーン）、コニフェリルアルコール１０μＭ処理（第３レーン）、新規フラバン化合物１０μＭ処理（第４レーン）、ＤＮＡ分子量マーカーλ/Ｐｓｔ(第５レーン)を流した。通常培養細胞（第１レーン）及びＤＭＳＯ処理細胞（第２レーン）ではＤＮＡのラダー化が確認されない点から、本実験の信頼性が確認できる。
また、細胞を１０μＭの新規フラバン化合物で処理したもの（第４レーン）ではＤＮＡのラダー化が観察できるのに対して、同濃度のコニフェリルアルコール（第３レーン）ではＤＮＡのラダー化は観察されなかった。これより、新規フラバン化合物はアポトーシスを誘導する高い効果を有し、その効力はコニフェリルアルコールよりも高いことが示された。
【００５７】
（実施例５：加熱温度によるフラバン化合物の生成量の違い）
コニフェリルアルコール１００ｍｇ、エタノール１ｍｌ、５％ＮａＨＣＯ3水溶液１ｍｌの混合溶液（ｐＨ＝９．４）を、オートクレーブにて７０℃、９０℃、１１０℃、１３０℃の各温度条件で２０分間加熱した。それぞれの温度条件で得られた反応後組成物１ｍｌをメタノールにて５０ｍｌにメスアップし、実施例１と同様にＨＰＬＣにより分析した。
【００５８】
その結果、いずれでも新規化合物の生成は確認できた。コニフェリルアルコールからの生成費比率（重量％）は、７０℃が極微量、９０℃が２％、１１０℃が５％、１３０℃が３％となり、１１０℃での加熱がもっとも多く新規化合物が生成していた。
【００５９】
（実施例６：新規フラバン化合物含有エキスの調製）
松樹皮エキス１０ｇ、エタノール１０ｍｌ、５％ＮａＨＣＯ3水溶液を１０ｍｌ加えて調製した混合溶液（ｐＨ＝９．０）を、オートクレーブにて１１０℃、２０分間加熱した。得られた反応溶液を減圧加熱させて乾固し、新規フラバン化合物含有エキスを６ｇ得た。得られた新規フラバン化合物含有エキス６ｇ中には、実施例５と同様の手法で確認したところ新規フラバン化合物が０．０２０ｇ含有されていた。必要に応じてこの作業を繰り返した。
【００６０】
（実施例７：新規フラバン化合物を含有する食品）
実施例６で得た新規フラバン化合物含有エキス１ｇをあらかじめ１００ｍＬのエタノールに溶解させ、これに砂糖５００ｇ、水飴４００ｇを混合溶解し、生クリーム１００ｇ、バター２０ｇ、練乳７０ｇ、乳化剤１．０ｇを混合した後、真空釜にて−５５０mmＨｇ減圧させ、１１５℃の条件下で濃縮し、水分値３．０重量％のミルクハードキャンディを得た。このミルクハードキャンディは、菓子として食べ易いものであることはもちろん、癌患者における癌の拡散のリスクを低減したり、癌の発症のリスクを低減したり、癌の予防を期待した機能性食品としても利用できる。
【００６１】
（実施例８：新規フラバン化合物を含有する医薬品）
実施例１，２と同様の方法で得た新規フラバン化合物をエタノールに溶解し、これを微結晶セルロースに吸着させた後に、減圧乾燥させた。これを常法に従い、打錠品を得た。処方は、フラバン化合物を１０重量部、コーンスターチ２３重量部、乳糖１２重量部、カルボキシメチルセルロース８重量部、微結晶セルロース３２重量部、ポリビニルピロリドン４重量部、ステアリン酸マグネシウム３重量部、タルク８重量部の通りである。本打錠品は、癌治癒を目的とする医薬品として有効に利用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される新規フラバン化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
【化１】
【請求項２】
請求項１記載のフラバン化合物及びその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有する抗癌剤。
【請求項３】
請求項１に記載のフラバン化合物及びその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする食品又は医薬品。
【請求項４】
コニフェリルアルコールをアルカリ条件下で加熱処理することにより下記式（１）で表されるフラバン化合物を生成することを特徴とする、式（１）で表されるフラバン化合物の製造方法。
【化２】
【請求項１】
下記式（１）で表される新規フラバン化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
【化１】
【請求項２】
請求項１記載のフラバン化合物及びその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有する抗癌剤。
【請求項３】
請求項１に記載のフラバン化合物及びその薬学的に許容可能な塩からなる群より選ばれる１種以上の化合物を含有することを特徴とする食品又は医薬品。
【請求項４】
コニフェリルアルコールをアルカリ条件下で加熱処理することにより下記式（１）で表されるフラバン化合物を生成することを特徴とする、式（１）で表されるフラバン化合物の製造方法。
【化２】
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−３１１０３（Ｐ２０１２−３１１０３Ａ）
【公開日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１７２２８８（Ｐ２０１０−１７２２８８）
【出願日】平成２２年７月３０日（２０１０．７．３０）
【出願人】（３９００２０１８９）ユーハ味覚糖株式会社 (242)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月３０日（２０１０．７．３０）
【出願人】（３９００２０１８９）ユーハ味覚糖株式会社 (242)
【Ｆターム（参考）】
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