新規リンカー類を有する末端リン酸標識ヌクレオチド類
酵素類に対する末端リン酸標識ヌクレオチド類の基質性を高める方法、核酸検出方法類及び末端リン酸標識ヌクレオチド類のマンガン錯体類の提供。
【課題】 本発明はマンガン塩存在下において末端リン酸標識ヌクレオチド類を用いてさまざまな酵素類に対するそれらの基質性を高める方法類が記載される。特に、マンガン塩存在下において末端リン酸標識ヌクレオチド類を核酸ポリメラーゼ類の基質類として用いることに基づくサンプル中の核酸検出方法類が記載される。さらに、末端リン酸標識ヌクレオチド類ならびに基質性を高め新規リンカー類を有する末端リン酸標識ヌクレオチド類のマンガン錯体類が提供される。
【解決手段】 マンガン塩を存在させることにより末端リン酸標識ヌクレオチド類の酵素基質性を高め、それを利用したサンプル中の核酸検出方法類及びそのための新規リンカー類を有する末端リン酸標識ヌクレオチド類のマンガン錯体類を提供する。
【課題】 本発明はマンガン塩存在下において末端リン酸標識ヌクレオチド類を用いてさまざまな酵素類に対するそれらの基質性を高める方法類が記載される。特に、マンガン塩存在下において末端リン酸標識ヌクレオチド類を核酸ポリメラーゼ類の基質類として用いることに基づくサンプル中の核酸検出方法類が記載される。さらに、末端リン酸標識ヌクレオチド類ならびに基質性を高め新規リンカー類を有する末端リン酸標識ヌクレオチド類のマンガン錯体類が提供される。
【解決手段】 マンガン塩を存在させることにより末端リン酸標識ヌクレオチド類の酵素基質性を高め、それを利用したサンプル中の核酸検出方法類及びそのための新規リンカー類を有する末端リン酸標識ヌクレオチド類のマンガン錯体類を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、一般的に、活性増強のための補因子としてのMn++存在下において核酸ポリメラーゼ類を含む種々の酵素類の基質としての3個以上のリン酸類を有する末端リン酸標識ヌクレオチド類の用途に関する。使用した標識類は、化学発光、蛍光、電気化学的及び発色源部分ならびに質量タグ類であり、直接検出可能なものならびに酵素活性化後又は他のプロセスに投入して異なるシグナルを産生させた後に検出可能なものを含む。これらの末端リン酸標識ヌクレオチド類は、特定の遺伝子型又は遺伝子配列を同定することを含めて均質系アッセイで使用できるであろう。さらに、標識をヌクレオチド類の末端リン酸に連結してそれらの基質性を高める、すなわち異なる酵素類によるそれらの利用速度を高めるリンカー類を有する新規末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類が提供される。
【背景技術】
【0002】
いくつかの酵素類は、ヌクレオシド三リン酸及びそれらのアナログ類を利用するか又はそれらに作用する。これらの酵素類には、リガーゼ類、核酸ポリメラーゼ類、ホスホジエステラーゼ類、ホスホリラーゼ類、キナーゼ類及びホスファターゼ類が含まれる。これらの酵素類は全て、ある金属イオン類を補因子として必要とし、これらの酵素類の多くが異なる金属イオン類の存在下で作用できるが、一般的に、あるひとつの金属が他よりも好適である。
【0003】
核酸ポリメラーゼ類は、ヌクレオシド5′−三リン酸類の重合を触媒しDNA又はRNAを形成させる酵素類である。それらには、DNA依存性DNAポリメラーゼ類、DNA依存性RNAポリメラーゼ類及びRNA依存性DNAポリメラーゼ類が含まれる。これらの酵素類は、典型的にはMg2+である二価金属イオンの存在を補因子として必要とするが、Mn2+及びCa2+さえも時にはMg2+の代わりとなり得ることが知られている。正常ヌクレオチド類では、他の金属イオンよりもMg2+を利用すると反応速度が速い。
【0004】
例えば蛍光標識類を有する化合物を含むいくつかのヌクレオチドアナログ類が作製されており、それらは核酸ポリメラーゼ類のための基質としても作用できる。これらの標識類は、前記ヌクレオチドの塩基部分に結合されてきたが、ヌクレオチドの糖部分に結合される場合もまれにある。これらは、同一二価金属イオン補因子類によるほとんど同一反応条件下で、正常な非置換ヌクレオチド類としてポリメラーゼ類の基質類として作用してきた。
【0005】
また、ガンマリン酸位に標識したヌクレオチド類の利用にも関心が向けられている。いくつかのγ−リン酸標識ヌクレオシド三リン酸類が、Molecular Probes(米国特許6,323,186)から市販されている。これらのヌクレオチド類において、ホスホロチオアート結合を介して色素(ボディピ)を前記のγ−リン酸に結合する。標題「γ−ホスホエステルヌクレオシド三リン酸類」の米国特許6,399,335は、γ−ホスホエステル結合ヌクレオシド三リン酸を用いてポリメラーゼにより特定のヌクレオチド類を重合させるための方法類及び組成物類を提供している。LI−COR社(米国特許6,232,075、米国特許2003/0194740、WO 01/94609、及び米国特許2003/0186255)からのいくつかの他の特許出願は、異なる塩基及びγ−リン酸標識ヌクレオシド−5′−三リン酸の合成とその使用方法を記載している。これらのヌクレオチド類をDNAポリメラーゼとともに使用することで、前記ヌクレオチド塩基がRNA又はDNAに取り込まれると放出される標識ピロリン酸を同定することによって、DNA又はRNA配列中の特定ヌクレオチド類を同定できる。
【0006】
サンプル中の特定核酸類すなわち分析物質類を高い特異性と感度で検出するための方法類が公知である。このような方法では、一般的に、最初に特定標的配列又は分析物質の存在に基づき核酸配列を増幅することが必要である。増幅後、増幅配列を検出し定量する。従来の核酸類検出系には、蛍光標識類の検出、蛍光酵素結合検出系、抗体媒介標識検出及び放射性標識の検出が含まれる。
【0007】
これら方法類のひとつの欠点は、前記標識出発物質から前記標識生成物のなんらかの分離を必要とするばかりでなく、前記標識が生成物に結合しているので、同定すべき天然産物とは異なっていることがあげられる。したがって、修飾されていない生成物を形成することと同時に起こった反応に特徴的なシグナルを生ずる方法類及び基質類を使用することが有益であろう。さらに、もし前記の生成したシグナルが前記出発物質からの分離を必要としなければそれは有益であるし、さらに、もし分離が必要であるにしても非修飾生成物を産生することの利点は、圧倒的である。
【特許文献1】米国暫定出願60/445,189
【特許文献2】米国特許6,323,186
【特許文献3】米国特許6,399,335
【特許文献4】米国特許6,232,075
【特許文献5】米国特許2003/0194740
【特許文献6】WO 01/94609
【特許文献7】米国特許2003/0186255
【特許文献8】WO 03/020891
【特許文献9】WO 03/020984
【特許文献10】WO 03/020734
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
ガンマリン酸標識ヌクレオチド類は、このような機会を現実に提供する。たとえば、ガンマリン酸標識ヌクレオチド類をDNA又はRNAに核酸ポリメラーゼにより取り込ませると、非修飾DNA又はRNAが産生され、また同時に、産生した標識ピロリン酸は標的を検出し、特性解析し及び/又は定量するために使用される。しかし、これらのヌクレオチド類はさまざまな核酸ポリメラーゼ類にとっては極めて良好でない基質類であり、従って、これらの末端リン酸標識ヌクレオチド類の取り込み速度を改善することは有益であろう。先にも述べたように(WO 03/020891、WO 03/020984、WO 03/020734)、前記標識とヌクレオチドの間のポリリン酸鎖を長くすることによって、速度増強が一部達成することができる。この速度増強はいくつかの適用では有用であるが、現実的理由により数百のヌクレオチド類を短時間に付加しなければならない例えばPCRのような多くの適用では、未だに不十分である。
【0009】
したがって、末端リン酸標識ヌクレオチド利用速度をさらに高めることが有益であろう。これについて及び他の問題についても下記で述べる。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は、末端リン酸標識ヌクレオチド類(また、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類とも称される)の使用方法類、ならびにその有用性を高めるための組成物類を提供する。本発明は、酵素反応において末端リン酸標識ヌクレオチド類とともにマンガン塩類を使用し、たとえ他の金属塩類が存在しているにしてもマンガンがない状況で観察される酵素利用をはるかに上回るように酵素類によるそれらの利用を高める方法類を提供する。また、末端リン酸標識ヌクレオチド類の形状でそれらの基質性を高めるリンカーを有する重要な新規組成物を提供する。
【0011】
本発明は、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸からの酵素触媒ヌクレオシド一リン酸移動速度を高め、前記酵素又は前記末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の活性を検出する方法を提供し、前記方法は、マンガン塩を含む反応緩衝液中において末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸反応からの前記酵素触媒ヌクレオシド一リン酸移動を実行させ、それによって、もし他の二価金属塩類が前記緩衝液中に存在しているにしてもマンガンが存在していない状況下における反応速度を上回るように、反応速度を高めることを含む。
【0012】
本発明は、核酸配列の存在を検出する方法を提供し、前記方法は、a)マンガン塩存在下で核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類の利用速度を高めること、ここで、前記ポリメラーゼ反応が末端リン酸標識ヌクレオチドを反応させること及び標識ポリリン酸を産生させることを含み、b)前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、検出可能な種を産生させること、及びc)前記検出可能種の存在を検出することを含む。本発明においてホスファターゼの定義は、リン酸モノエステル類、ポリリン酸類及びヌクレオチド類を切断して、無機リン酸を放出する酵素を全て含む。本発明の文脈において、この酵素は、末端標識ヌクレオシドリン酸を切断しない(すなわち、前記末端リン酸標識ヌクレオチドが、実質的にホスファターゼに反応性でない)。ここで述べたホスファターゼ定義は 具体的には、アルカリホスファターゼ(EC3.1.3.1)及び酸ホスファターゼ(EC3.1.3.2)を含むがそれらに限定されない。ヌクレオチドの本発明における定義は、天然又は修飾ヌクレオシドリン酸を含む。
【0013】
本発明はさらにDNA配列存在を検出する方法を提供し、本方法は、a)末端リン酸標識ヌクレオチドとマンガン塩存在下においてDNAポリメラーゼ反応を起こさせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の利用速度を高めること、この反応の結果、標識ポリリン酸が産生され、b)前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、検出可能な種を産生させること、及びc)検出可能な種の存在を検出することを含む。
【0014】
また、核酸配列存在を検出する方法を提供し、本方法は、a)マンガン塩存在下において核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類とポリリン酸鎖中に4個以上のリン酸基を有する少なくとも1個の末端リン酸標識ヌクレオチドの利用速度を高めること、この反応の結果、標識ポリリン酸が産生され、及びb)前記標識ポリリン酸を検出することを含む。
【0015】
さらに、本発明は、核酸配列存在を検出する方法に関し、本方法は、a)マンガン塩存在下において核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類とポリリン酸鎖中に4個以上のリン酸基を有する少なくとも1個の末端リン酸標識ヌクレオチドの利用速度を高めること、この反応の結果、標識ポリリン酸が産生され、b)前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、検出可能な種を産生させること、及びc)前記検出可能種の存在を検出することを含む。
【0016】
本発明のさらに別の面は、核酸定量化方法に関し、前記方法は、a)マンガン塩存在下において核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類の利用速度を高め、前記反応には、末端リン酸標識ヌクレオチドが含まれ、この反応の結果、標識ポリリン酸が産生され、b)前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、核酸量に実質的に比例する量の検出可能な副産物種を産生させること、c)前記検出可能な種を測定すること、及びd)公知の標準物質を用いて前記測定値を比較し、核酸量を決定することを含む。
【0017】
本発明はさらに、DNA配列定量化方法に関し、前記方法は、a)マンガン塩存在下において核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類と末端リン酸標識ヌクレオチドの利用速度を高め、前記反応の結果、標識ポリリン酸が産生され、b)前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、DNA配列量に実質的に比例する量の検出可能な副産物種を産生させること、c)前記検出可能な種を測定すること、及びd)公知の標準物質を用いて前記測定値を比較し、DNA量を決定することを含む。
【0018】
本発明はさらに別の面において、核酸配列中の単一ヌクレオチドを同定し決定する方法に関し、この方法は、a)少なくとも1個の末端リン酸標識ヌクレオチドとマンガン塩存在下において核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類の利用速度を高め、前記反応の結果、標識ポリリン酸が産生され、b)前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、検出可能な種を産生させること、c)前記検出可能な種の存在を検出すること、及びd)取り込まれたヌクレオシドを同定することを含む。
【0019】
また、核酸配列中の単一ヌクレオチドを同定し決定する方法を提供し、この方法は、a)マンガン塩存在下において核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類とポリリン酸鎖中に4個以上のリン酸基類を有する少なくとも1個の末端リン酸標識ヌクレオチドの利用速度を高め、前記反応の結果、標識ポリリン酸が産生され、b)前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、検出可能な種を産生させること、c)前記検出可能な種の存在を検出すること、及びd)取り込まれたヌクレオシドを同定することを含む。
【0020】
本発明はさらに核酸検出キットを含み、前記キットは、
a)式I:
【0021】
【化1】
【0022】
(式中、P=リン酸(PO3)とその誘導体類であり、nは2以上であり、Yは、酸素又はイオウ原子であり、Bは、窒素含有複素環塩基であり、Sは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、P−Lは、リン酸を除去すると独立して検出可能となるリン酸化標識であり、
ここでLは、天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸においてリン酸エステル、チオエステル、又はホスホルアミデート結合を形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能標識である)による1種以上以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
b)DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、又は逆転写酵素の1種以上、
c)ホスファターゼ、及び
d)マンガン塩を含む反応緩衝液を含む。
【0023】
本発明はさらに核酸検出キットを含み、前記キットは、
a)下記の式I:
【0024】
【化2】
【0025】
(式中、P=リン酸(PO3)とその誘導体類であり、nは2以上であり、Yは、酸素又はイオウ原子であり、Bは、窒素含有複素環塩基であり、Sは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、P−Lは、LとPの間にリンカーを有するリン酸化標識であり、
ここでLは、天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸においてリン酸エステル、チオエステル、アルキルフォスフォネート又はホスホルアミデート結合を形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基、ハロアルキル基、又はアミノ基を含む標識である)による1種以上以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
b)DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、又は逆転写酵素の1種以上、及び
c)マンガン塩を含む反応緩衝液を含む。
【0026】
本発明はさらに、リンカーを有する新規末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類を提供し、それらは、ポリメラーゼにとってより優れた基質類である。これらのヌクレオチド類は、下記の構造:
【0027】
【化3】
【0028】
(式中、Lは、検出可能部分であり、x及びyは、独立してCH2、NH,O又はSから選択され、Zは、1個以上の複素原子を含みかつ適宜、正又は負の荷電を有する直線状、分枝状、環式、飽和又は非飽和炭化水素であり、ポリリン酸は、四リン酸又はそれよりも高次のリン酸であり、糖は、天然又は修飾糖であり、塩基は、天然又は修飾されたDNA又はRNA塩基である)によって表される。
【0029】
本発明はまた、式II:
【0030】
【化4】
【0031】
(式中、Labelは、リンカーを有していても有していなくてもよいNPPに結合した検出可能部分であり、NPPは、4個以上のリン酸類を有するヌクレオシドポリリン酸であり、及びxは1以上である)の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類のマンガン錯体類を提供する。
【0032】
さらに核酸検出キットが提供され、
a)式II:
【0033】
【化5】
【0034】
(式中、Labelは、リンカーを有していても有していなくてもよいNPPに結合した検出可能部分であり、NPPは、4個以上のリン酸類を有するヌクレオシドポリリン酸であり、及びxは1以上である)の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の1種以上のマンガン錯体、及び
b)核酸ポリメラーゼを含む。
【0035】
また、核酸検出キットが提供され、
a)式II:
【0036】
【化6】
【0037】
(式中、Labelは、リンカーを有していても有していなくてもよいNPPに結合した検出可能部分であり、NPPは、4個以上のリン酸類を有するヌクレオシドポリリン酸であり、及びxは1以上である)の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の1種以上のマンガン錯体、
b)核酸ポリメラーゼ、及び
c)金属イオン結合緩衝液を含む。
【0038】
本発明の前記目的と特徴は、下記の発明の詳細な説明と付属の図面を参照すればより充分に明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【0039】
用語「ヌクレオシド」は、本文で、1′位又は同等の位置における環式炭素又は非環式部分のような糖又は糖置換物に結合したプリンデアザプリン、ピリミジン又は修飾塩基を含む化合物として定義され、2′−デオキシ及び2′−ハイドロキシ、及び2′、3′−ジデオキシ形状ならびに他の置換物類を含む。
【0040】
用語「ヌクレオチド」は、本文で、ヌクレオシドのリン酸エステルを称するものとして使用し、前記エステル化部位が典型的には、5炭糖のC−5位に結合した水酸基に対応する。
【0041】
用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチド類又はその誘導体類の直線状オリゴマー類を含み、デオキシリボヌクレオシド類、リボヌクレオシド類等を含む。本明細書全体において、オリゴヌクレオチドが文字配列によって表されている場合にはすべて、前記ヌクレオチド類は、左から右に5′→3′方向にあり、他に断りがなければ、Aはデオキシアデノシンを示し、Cはデオキシシチジンを示し、Gはデオキシグアノシンを示し、及びTはチミジンを示す。
【0042】
用語「プライマー」は、特定の核酸配列に特定の方法でアニーリングしその特定配列の増幅を可能にする直線状オリゴヌクレオチドを称する。
【0043】
句「標的核酸配列」等は、配列のアイデンテティ(内容)又はヌクレオシド類の順序又は位置が本発明の1種以上の方法類によって決定される核酸を称する。
【0044】
用語「金属イオン緩衝液」とは、Mn2+のような溶液中遊離金属イオンの濃度を制御する物質を意味する。
【0045】
本発明は、酵素反応において末端リン酸標識ヌクレオチド類とともにマンガン塩類を使用し、たとえ他の金属塩類が存在するにしてもマンガン不在下で観察される酵素類による利用を上回るように酵素類によるそれらの利用を高める方法類を提供する。いくつかの酵素類は、それらの活性のために二価金属イオン類を補因子類として使用することが公知である。多くの場合、これらの金属イオン類は、他の金属イオン類により置換できるが、しかしこの置換の結果、酵素活性が低下することになる。本発明者らは、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸ではこれが真実ではなく、異なる金属イオンたとえばこの場合マンガンを添加すると、実際に、ヌクレオシド一リン酸移動を触媒する酵素類によるそれらの利用速度が高まることを見出した。
【0046】
したがって、本発明は、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸からの酵素触媒ヌクレオシド一リン酸移動速度を高め、前記酵素又は前記末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の活性を検出する方法を提供し、前記方法は、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸反応からのマンガン塩を含む反応緩衝液中における前記酵素触媒ヌクレオシド一リン酸移動を実行させ、それによって、もしたとえ他の二価金属塩類が前記緩衝液中に存在しているにしてもマンガン不在下における前記反応速度を上回るように前記反応速度を高めることを含む。
【0047】
本発明は、サンプル中のポリヌクレオチドを検出する方法類に関し、従来のアッセイを用いて、核酸ポリメラーゼ活性によりRNA又はDNA合成をモニタリングする。RNA及びDNAポリメラーゼ類は、ヌクレオシド三リン酸(NTP)又はデオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)から成長するオリゴヌクレオチド鎖の3′水酸基へのヌクレオシド一リン酸の移動により、オリゴヌクレオチド類を合成する。この反応を進める力となっているのは、無水物結合の切断と無機ピロリン酸の同時形成である。本発明は、ヌクレオチドの末端リン酸の構造的修飾がポリメラーゼ反応で機能するその能力を完全に破壊することはないという知見を利用している。前記のオリゴヌクレオチド合成反応では、ヌクレオチドのα−及びβ−ホスホリル基においてのみの直接変化を伴い、末端リン酸位におけるヌクレオチド類の修飾により核酸ポリメラーゼ反応のための基質として貴重となっている。しかし、これらの末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類は、ポリメラーゼにとって非常に貧弱な基質類である。本発明者らは、それらの基質性を、マンガン塩を添加することによって実質的に高めることができることを見出した。
【0048】
したがって、本発明は、マンガン塩存在下において末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類を使用する方法を提供し、この存在により、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類がより優れた酵素基質類として作用する能力が生まれる。マンガン塩類は、過去において配列決定方法類(WO 99/37810)ならびに核酸増幅方法類において使用されてきた。前者の場合、マンガンの使用は、異なる塩基で終止する断片の配列決定によるシグナル強度を均一にすることであり、それにより、配列分析が簡易になった。しかし、図3に示したように、マンガン塩存在下における塩基標識ヌクレオチド類の取り込み速度は、実際には、マグネシウム存在下における速度よりも遅い。核酸増幅方法類の場合、マンガン存在により、より長いDNA断片増幅が可能となったが、そのプロセスにおいてまた、複製エラーが増加する原因となった。末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類上でのポリメラーゼ利用に及ぼすマンガンの効果は、極めて異なっている。図4に示したように、5mM MgCl2を含む反応混合物に0.05mM MnCl2を添加すると、その結果、活性が増強され40倍を超えるようになる。さらに、取り込みエラーがMnCl2により増加するという証拠もない(図6)。反応速度のこのような向上に必要なマンガンの量はわずかで10μMであり、好適な濃度は、0.01から50mMの範囲である。さらに好適には、前記濃度は、0.05から10mMの間である。また、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム等のような他の塩類の存在は、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類の基質性に及ぼすマンガンの効果を妨害しない。
【0049】
ある態様において、前記ポリメラーゼは、DNAポリメラーゼI、II又はIII、又はDNAポリメラーゼα、β、γのようなDNAポリメラーゼ、又は末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ又はテロメラーゼである。他の態様において、適切なポリメラーゼ類にはDNA依存性RNAポリメラーゼ、プリマーゼ、又はRNA依存性DNAポリメラーゼ(逆転写酵素)が含まれるが、それらに限定されない。
【0050】
本発明が提供する方法類は、デオキシヌクレオシドポリリン酸、リボヌクレオシドポリリン酸、ジデオキシヌクレオシドポリリン酸、環式炭素ヌクレオシドポリリン酸、又は電気化学的標識、質量タグ、又は比色色素、化学発光標識又は末端リン酸に結合した蛍光標識を有する非環式ヌクレオシドポリリン酸アナログが含まれる。核酸ポリメラーゼがこのアナログを基質として利用する時、酵素活性化可能な標識が、ホスホリル移動の無機ポリリン酸副産物上に存在するであろう。ホスホリル移動のポリリン酸産物をホスファターゼにより切断すると、それに結合した標識に検出可能な変化が生じる。RNA及びDNAポリメラーゼ類が修飾された末端ホスホリル基を有するヌクレオチド類を認識できる一方、本発明者らは、この出発物質がホスファターゼ類のテンプレートではないと決定したことに注意されたい。下記の図は、本発明の方法に最も関連する分子類を示しており、すなわち、末端リン酸標識ヌクレオチド、標識ポリリン酸副産物及び酵素活性化標識を示している。
【0051】
【化7】
【0052】
上記図において、nは1以上であり、R1とR2は、独立してH、OH、SH、SR、OR、F、Br、Cl、I、N3、NHR又はNH2であり、Bは、ヌクレオチド塩基又は修飾複素環塩基であり、Xは、O、S、CH2又はNHであり、Yは、O、S又はBH3であり、及びLは、リンカーを有していても有していなくてもよいホスファターゼが活性化可能な標識であり、それは、着色又は蛍光色素、発色源、蛍光源又は化学発光分子、質量タグ又は電気化学的タグであることができる。質量タグは、質量差により他の成分から容易に識別可能な質量分析に適した低分子量部分である。電気化学的タグは、容易に酸化可能であるか又は還元可能な種である。nが2以上である時、前記ヌクレオチド類は、nが1である時よりもポリメラーゼ類にとって有意に優れた基質であることがわかった。したがって、好適な態様において、nは2、3又は4であり、R1とR2は、独立してH又はOHであり、XとYはOであり、Bは、ヌクレオチド塩基であり、及び、Lは、発色源、蛍光源又は化学発光分子であることができる標識である。
【0053】
本文に示した核酸配列存在を検出する方法の1態様において、前記工程は、a)Mn塩存在下で核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類の利用速度を高めること、ここで、前記反応が末端リン酸標識ヌクレオチドを反応させること及び前記ポリメラーゼ反応の結果標識ポリリン酸が産生し、b)前記標識ポリリン酸を前記リン酸エステルの加水分解に適したホスファターゼと反応させ、検出可能な種を産生させること、及びc)適切な手段により前記検出可能種の存在を検出することを含む。本態様において、核酸ポリメラーゼ反応に使用したテンプレートは、ヘテロポリマー又はホモポリマーのテンプレートであることができる。末端リン酸標識ヌクレオチドとは、本明細書全体において、成長するヌクレオチド鎖へのヌクレオシド一リン酸の取り込み後同時に放出された標識ポリリン酸が、それ自体として分離してもしなくても検出できるか、又はホスファターゼと反応させ検出可能な種を産生させることを意味する。他のヌクレオチド類も本反応に含めることができ、それらは、実質的にホスファターゼに対して非反応性であり、例えば、検出可能種を産生しない部分により末端リン酸でブロックされたヌクレオチド類がある。この特定の態様における検出のための核酸には、RNA、天然又は合成オリゴヌクレオチド、ミトコンドリア又は染色体DNAが含まれる。
【0054】
本発明はさらに、DNA配列存在を検出する方法を提供し、本方法は、a)末端リン酸標識ヌクレオチドとマンガン塩存在下においてDNAポリメラーゼ反応を起こさせ、この反応の結果、標識ポリリン酸が産生され、b)前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、検出可能な種を産生させること、及びc)前記検出可能な種の存在を検出することを含む。検出用DNA配列には、細胞から単離したDNA、ビスルファイト処理メチル化DNAのような化学的に処理したDNA、又は当該技術で公知の方法により化学的に又は酵素的に合成したDNAが含まれる。このような方法には、PCR及び本文で参考として引用したDNA Structure Part A:Synthesis and Physical analysis of DNA、Lilley,D.M.J.及びDahlberg、J.E.(編著)、Methods Enzymol.、211、Academic Press、Inc.,New York(1992)に記載のものが含まれる。さらに、前記DNA配列には、染色体DNA及び天然又は合成オリゴヌクレオチド類が含まれる。前記DNAは、二重鎖又は一重鎖である。
【0055】
本発明の方法類はさらに、前記ポリメラーゼ反応において1個以上の追加検出試薬類を含む。前記の追加検出試薬類は、前記の検出可能な種とは検出可能なほど異なる応答ができる。たとえば、前記追加検出試薬は、抗体であってもよい。
【0056】
ポリメラーゼ反応における基質として付加するための適切なヌクレオチド類は、ヌクレオシドポリリン酸類を含み、それらには、デオキシリボヌクレオシドポリリン酸類、リボヌクレオシドポリリン酸類、ジデオキシヌクレオシドポリリン酸類、環式炭素ヌクレオシドポリリン酸類及び非環式ヌクレオシドポリリン酸類及びそのアナログ類が含まれるが、それらに限定されない。末端リン酸が標識されている三、四、五又は六リン酸基類を前記のポリリン酸鎖中に含むヌクレオチド類が特に好適である。
【0057】
ポリリン酸鎖中に4個以上のリン酸類を含む末端リン酸標識ヌクレオチド類を含む態様において、ホスホリル移動の標識ポリリン酸副産物がホスファターゼ処理を行わずに検出できることも本発明の範囲内であることに注意されたい。たとえば、天然又は修飾ヌクレオシド塩基類、特にグアニンは、蛍光マーカー類クエンチングの原因となることが公知である。したがって、末端リン酸標識ヌクレオチドにおいて、前記標識は前記塩基によって部分的に消失することもある。前記ヌクレオシド一リン酸が取り込まれると、標識ポリリン酸副産物を、その蛍光増強により検出することもできる。これとは別に、蛍光、色、化学発光又は電気化学的検出により同定する前に、前記の標識ポリリン酸産物をクロマトグラフィで物理的に分離することも可能である。さらに、質量分析を用いて質量差により前記産物類を検出することもできるであろう。
【0058】
本発明の方法類には、1種以上のDNA又はRNAポリメラーゼの存在下でポリメラーゼ反応を行うことを含むことができる。適切な核酸ポリメラーゼ類にはまた、プリマーゼ類、テロメラーゼ類、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ類、及び逆転写酵素類が含まれる。核酸テンプレートは、ポリメラーゼ反応が起こるために必要であろうし、ポリメラーゼ反応溶液に添加することもできる。本発明の検出方法における段階a)、b)及びc)のすべてを単一の、均質反応混合物を用いて同時に行わせることもできるし、また、順次行わせることもできる。
【0059】
本発明の範囲内で、核酸ポリメラーゼ反応は、ポリメラーゼ類を利用する増幅方法を含むこともできる。このような方法類の例として、ポリメラーゼチェーン反応(PCR)、ローリングサークル増幅(RCA)、及び核酸配列に基づく増幅(NASBA)が含まれる。前記標的分子がDNAのような核酸ポリマーである場合、アデニン、チミン、シトシン、グアニン又は他の窒素複素環塩基類のようなガンマ−リン酸標識ヌクレオチド塩基類のDNA分子中への取り込みを、PCRによって検出することもできる。前記ポリメラーゼチェーン反応(PCR)方法は、Saikiら、Science Vol.239、487ページ、1988、Mullisら、米国特許4,683,195によって、及び、Sambrook,J.ら(編著)、Molecular Cloning、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1980),Ausubel,F.M.ら(編著)、Current Protocols in Mlecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,NY(1999)及びWu,R.(編著)、Recombinant DNA Methodology II、Methods in Zumulogy, Academic Press,Inc.,NY(1995)によって記載されている。PCRを用いて、DNAのような検出用標的核酸を直接、PCR試薬類及び適切なプライマー類を含む反応容器に入れ、それを増幅させる。典型的には、前記標的核酸の少なくとも一部に配列が相補性であるプライマーを選択する。
【0060】
本発明の方法類の段階a)を実施するために適した核酸ポリメラーゼ反応類には、さらに、さまざまな核酸配列増幅RCA方法類を含めることができる。たとえば、本文で参考として引用するLizardi,Paul M.、米国特許5,854,033に開示されたものは、有用である。ポリメラーゼ反応にはさらに、核酸配列に基づく増幅(NASBA)を含めることができ、この系では、DNAではなくRNAの増幅を伴い、この増幅は等温性であり、ひとつの温度(41℃)で起こる。標的RNAのNASBAによる増幅には、逆転写酵素、Rnase H及びT7 RNAポリメラーゼという酵素3種の活性がサンプルである標的RNAに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー類と共同して作用することが必要になる。これらの酵素類は、4つの段階:伸長、分解、DNA合成及び環式RNA増幅で標的一重鎖RNAの指数対数的増幅を触媒する。
【0061】
RT−PCR、RCA及びNASBAの方法類では、一般に、標的核酸の当初の量が増幅産物の定量によって間接的に測定されることが必要となる。増幅産物類は最初に、アガロースゲル上での電気泳動により出発物質から分離され増幅がうまくいったことを確認し、その後、蛍光標識の検出、酵素結合検出系、抗体媒介標識検出及び放射性標識検出のような核酸用の従来の検出系のいずれかを用いて、定量する。対照的に、本方法では、ポリメラーゼ反応の産物を出発物質から分離してこれらの産物を検出するという必要性がなくなる。たとえば、本発明では、レポーター分子(蛍光、化学発光又は発色源)又は他の有用分子を、リン酸結合によってマスキングした時にある条件下でそれが検出できるようにヌクレオチドに結合させる。しかし、成長するオリゴヌクレオチド鎖にヌクレオチドが取り込まれ前記反応物をホスファターゼ処理すると、前記標識がそれらの条件下で検出可能である。たとえば、もし1,3−ジクロロ−9,9−ジメチル−アクリジン−2−オン(DDAO)の3重環構造側の水酸基をヌクレオチドの末端リン酸位に結合させると、このDDAOは、659nmで蛍光を発しない。ヌクレオシド一リン酸がDNAにいったん取り込まれると、他の産物DDAOポリリン酸(659nmで同様に蛍光を発しない)がホスファターゼの基質となる。いったん脱リン酸されDDAOを形成すると、色素部分が659nmで蛍光を発するようになり、従って検出可能となる。ポリリン酸産物の具体的分析は、ポリメラーゼ反応溶液中で行うことができ、出発物質類から反応産物を分離する必要がなくなる。このスキームにより、分光光度計のような通常の機器類を用いて、ポリメラーゼ反応中に形成された核酸類の検出と適宜その定量が可能となる。
【0062】
上述の方法類において、ポリメラーゼ反応段階はさらに、ホスファターゼ存在下においてポリメラーゼ反応を実行することを含み、標識ポリリン酸副産物を検出可能な標識に変換する。このようなものとして、検出可能な種の形成を連続的にモニタリングでき核酸配列の存在を検出するために便利なアッセイが確立される。このことは、それが一本の試験管で行うことができるという点において、均質アッセイ様式の代表である。
【0063】
上記アッセイ方法類のひとつの様式には、検出可能な種を産生できる末端リン酸標識単一種ヌクレオチドの存在下ポリメラーゼ反応を実行することを含むが、これに限定されない。たとえば、末端リン酸修飾ATPでは他のヌクレオチド類全てが実質的にホスファターゼ類に非反応性であるが、非検出可能種を産生する。
【0064】
別のアッセイ様式では、ポリメラーゼ反応を1種を超える末端リン酸標識ヌクレオチド存在下で実施できるが、このヌクレオチド類のそれぞれは、独自に検出可能な種を産生可能である。たとえば、前記アッセイには、酵素的に無機ポリリン酸から放出されるとホスホリル移動の副産物が第1波長で光を放出する第1標識に結合した第1ヌクレオチド(例 アデノシンポリリン酸)と第2波長で光を放出する第2標識に結合した第2ヌクレオチド(例 グアノシンポリリン酸)が含まれる。望ましいのは、前記第1及び第2波長における発光が、実質的にほとんどあるいは全く重ならないことである。ヌクレオチド配列情報に基づく複数の同時アッセイ類がその後、前記ポリリン酸から放出された特定標識に基づいて誘導できることも、本発明の範囲内である。
【0065】
本発明の別の面では、反応媒体中におけるマンガンイオン類濃度を制御する金属イオン緩衝液類が提供される。希釈に応答して又は溶液からのイオンの添加又は除去に応答する遊離イオンの濃度変化に対抗することによって、緩衝液は、溶液中の種(例 金属イオン)の濃度を制御する。このような緩衝液には例えば、酒石酸のようなアルキルジカルボン酸のようなカルボン酸が含まれるが、前記アルキルは、炭素原子1−8個の直鎖又は分枝状鎖である。ジカルボン酸の他の例には、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、グルタル酸、アジピン酸、フマル酸、グルタミン酸、アスパラギン酸及びフタル酸が含まれる。他の金属イオン緩衝液には、例えば、クエン酸、N−ハイドロキシエチルイミノニ酢酸、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸、ジチオスレイトール、及びN,N−ビスハイドロキシエチルグリシンが含まれる。金属イオン緩衝液をpH緩衝液(すなわち、溶液中遊離H+濃度を制御する化合物)の存在下、使用することもできる。前記マンガンイオンは通常は、例えば硫酸マンガン(MnSO4)、塩化マンガン(MnCl2)又は酢酸マンガンのような塩から生成するであろう。
【0066】
「ジカルボン酸」とは、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、酒石酸、グルタミン酸、アジピン酸、フマル酸、フタル酸、グルタル酸、又はアスパラギン酸のような2個のカルボン酸基を含む低級アルキル、ハイドロキシアルキル又はアミノアルキル化合物を全て意味する。
【0067】
上述の方法類にはさらに、核酸配列を定量する段階が含まれる。関連する面において、前記検出可能な種は、増幅核酸配列量に実質的に比例する量で産生させることができる。核酸配列を定量する段階は、望ましくは、公知のスペクトルと検出可能種が生成したスペクトルを比較することによって行われる。
【0068】
本発明は、1態様において、核酸配列を定量する方法を提供し、本方法は、a)マンガン塩存在下において核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ、前記ポリメラーゼ反応は、少なくとも1個の末端リン酸標識ヌクレオチドの他にホスファターゼに実質的に反応しないヌクレオチドの反応を含み、前記反応の結果、標識ポリリン酸類が生成し、b)前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、定量すべき核酸量に実質的に比例する量の検出可能な副産物種を産生させること、c)前記検出可能種を測定すること、及びd)前記測定値を公知の標準物質を用いて比較し、核酸量を求めることを含む。核酸定量方法のこの態様において、定量すべき核酸はRNAであることができる。核酸はさらに、天然又は合成オリゴヌクレオチド、染色体DNA又はRNAであることができる。
【0069】
本発明はさらに、DNA配列を定量する方法を提供し、本方法は、a)マンガン塩存在下においてDNAポリメラーゼ反応を起こさせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類と末端リン酸標識ヌクレオチドの利用速度を高め、前記反応の結果、標識ポリリン酸類が生成し、b)前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、定量すべきDNA配列量に実質的に比例する量の検出可能な副産物種を産生させること、c)前記検出可能種を測定すること、及びd)前記測定値を公知の標準物質を用いて比較し、DNA量を求めることを含む。この態様において、定量すべきDNA配列には、天然又は合成オリゴヌクレオチド、又は染色体DNAを含む細胞から単離したDNAを含むことができる。
【0070】
上述の核酸配列定量化のためこれら方法のそれぞれにおいて、ポリメラーゼ反応段階にはさらに、ホスファターゼ存在下においてポリメラーゼ反応を行うことが含まれる。先に本明細書で述べたように、これにより、核酸ポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングが可能となり、従って、定量する標的核酸配列のリアルタイム検出が可能となる。
【0071】
本文に述べた核酸配列定量化方法類に有用な末端リン酸標識ヌクレオチドは、上記の式Iによって表される。最も有用な例には、酵素活性化可能な標識を有するものが挙げられる。この酵素活性化可能な標識は、標識と天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸の間のリン酸エステル結合を検出可能な種を産生するように変化させるホスファターゼの酵素活性を介して、検出可能となる。検出可能種は、色、蛍光発光、化学発光、質量差又は電気化学的電位のいずれか又は組合せの存在下において検出可能となる。先にも既に述べたように、酵素活性化可能な標識は、1,2−ジオキセタン化学発光化合物、蛍光色素、発色源性色素、質量タグ又は電気化学的タグ又はその組合せであることができる。適切な標識は、上記に述べたものと同じである。
【0072】
実施例のセクションでさらに詳細に述べるが、本発明は、標的核酸配列中の1個のヌクレオチドがなんであるかそのアイデンテティを決定する方法類を提供する。これらの方法類は、a)マンガン塩存在下において核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類と少なくとも1個の末端リン酸標識ヌクレオチドの利用速度を高め、前記反応の結果、標識ポリリン酸が産生され、b)前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、検出可能な種を産生させること、c)前記検出可能な種の存在を検出すること、及びd)取り込まれたヌクレオシドを同定することを含む。好適な態様において、前記末端リン酸標識ヌクレオチドは、4個以上のリン酸類をポリリン酸鎖中に含む。
【0073】
核酸配列の存在を検出する上述の方法類のひとつの面において、末端リン酸標識ヌクレオチドは、式I:
【0074】
【化8】
【0075】
(式中、P=リン酸(PO3)とその誘導体類であり、nは2以上であり、Yは、酸素又はイオウ原子であり、Bは、窒素含有複素環塩基であり、Sは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、P−Lは、リン酸を除去すると独立して検出可能となるリン酸化標識であり、ここで、Lは、リン酸エステル、チオエステル、又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能標識である)によって表すこともできる。
【0076】
核酸配列の存在を検出する上述の方法類のもうひとつの面において、末端リン酸標識ヌクレオチドは、式I:
【0077】
【化9】
【0078】
(式中、P=リン酸(PO3)とその誘導体類であり、nは2以上であり、Yは、酸素又はイオウ原子であり、Bは、窒素含有複素環塩基であり、Sは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、P−Lは、LとPの間にリンカーを有するリン酸化標識であり、ここでLは、リン酸エステル、チオエステル、アルキルフォスフォネート又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基、ハロアルキル基、又はアミノ基を含む標識である)によって表すこともできる。
本発明の別の態様では、ヌクレオシドポリリン酸(テトラ−(四)、ペンタ−(五)、ヘキサ−(六))を本発明に用いた標識に連結しそれらをポリメラーゼのためのよりすぐれた基質とするリンカーを有する新規末端リン酸標識ヌクレオチド類を提供する。これらの化合物は、式
【0079】
【化10】
【0080】
(式中、Labelは、検出可能な部分であり、x及びyは、独立してCH2、NH,O又はSから選択され:Zは、1個以上の複素原子を含みかつ適宜、正又は負の荷電を有する直線状、分枝状、環式、飽和又は非飽和炭化水素であり、ポリリン酸は、四リン酸又はそれよりも高次のリン酸であり、糖は、天然又は修飾糖であり、塩基は、天然又は修飾されたDNA又はRNA塩基である)によって表される。
【0081】
本発明の好適な態様において、リンカーであるx−Z−yは、3−100個の原子を含み、正又は負の荷電を含むことができる。より好適な態様において、前記リンカーx−Z−yは、アルカンジオール類、ジアミン類、アミノアルコール類、ジメルカプタン類、アミノ酸類、ペプチド類、アミノメルカプタン類、及びその組合せから選択される。
【0082】
本発明はまた、式II:
【0083】
【化11】
【0084】
(Labelは、リンカーを有していても有していなくてもよいNPPに結合した検出可能部分であり、NPPは、4個以上のリン酸類を有するヌクレオシドポリリン酸であり、xは1以上である)の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類のマンガン錯体類を述べている。
【0085】
これらの錯体類は、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類をマンガン塩類と混合することによって容易に調製でき、ポリリン酸鎖中のリン酸類の数に応じて、ヌクレオチドに錯化したマンガンイオン類の数が変化できる。好適な組成物類において、反応性末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸は、少なくとも1個のマンガンイオンを有している。
本発明の方法類及び新規組成物類のため、有用な環式炭素部分が、Ferraro,M.及びGotor,V.によってChem Rev.2000、第100巻、4319−48に記載されている。適切な糖部分は、Joeng,L.S.ら、J. Med. Chem.1993、第356巻、2627−38、Kim H.O.ら、J. Med.Chem.193、第36巻、30−7、及びEschenmosser A.、Science 1999、第284巻、2118−2114によって記載されている。さらに、有用な非環式部分が、Martinez,C.I.ら、Nucleic Acids Research 1999,vol.27,1271−1274によって、Martinez,C.I.ら、Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 1997,vol.7、3013−3016によって、及びTrainer,G.L.の米国特許5,558,91において記載されている。これらの部分の構造類を下記に示したが、全ての部分について、Rは、H、OH、NHR、F、N3、SH、SR、OR低級アルキル及びアリルであり、糖部分について、X及びYは独立して、O、S又はNHであり、非環式部分について、Xは、O、S、NH又はNRである。
【0086】
【化12】
【0087】
ある態様において、式中の糖部分は、下記から選択することができる:リボシル、2′−デオキシリボシル、3′−デオキシリボシル、2′、3′−ジデハイドロジデオキシリボシル、2′、3′−ジデオキシリボシル、2′−又は3′−アルコキシリボシル、2′−又は3′−アミノリボシル、2′−又は3′−フルオロリボシル、2′−又は3′−メルカプトリボシル、2′−又は3′−アルキルチオリボシル、非環式、環式炭素及び他の修飾糖類。
【0088】
さらに上記式中、前記塩基には、ウラシル、チミン、シトシン、5−メチルシトシン、グアニン、7−デアザグアニン、ヒポキサンチン、7−デアザヒポキサンチン、アデニン、7−デアザアデニン、2,6−ジアミノプリン又はそのアナログ類が含まれる。
【0089】
末端リン酸標識ヌクレオチド中の末端リン酸位において結合した標識は、1,2−デオキセタン化学発光化合物類、蛍光源性色素類、発色源性色素類、質量タグ類及び電気化学的タグ類から構成される群から選択することができる。これによる検出可能種が、色、蛍光発光、化学発光、質量変化、電気化学的検出又はその組合せのいずれの存在によって検出可能な種とすることができる。
【0090】
直接又はリンカーを介して末端リン酸基に結合できる標識類の例を下記の表1−2に示し、直接結合した標識を有し、リン酸類の除去後検出可能となる末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類ならびにリン酸類を除去しないでも検出可能な標識を有する末端リン酸標識ヌクレオチド類のいくつかの例をそれぞれ表3と4に示した。
【0091】
【表1】
【0092】
【表2】
【0093】
さらに、ドナー色素とアクセプター色素を結合させることによって調製したエネルギー移動色素類もまた、本発明で有用である。
表3:標識がポリリン酸鎖に直接結合している標識ヌクレオシドポリリン酸類の例
アデノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちA3P−DDAO
グアノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちG3P−DDAO
シチジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちC3P−DDAO
チミジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちT3P−DDAO
ウリジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちU3P−DDAO
2′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちdA3P−DDAO
2′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちdG3P−DDAO
2′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちdC3P−DDAO
2′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちdT3P−DDAO
2′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちdU3P−DDAO
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちddA3P−DDAO
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちddG3P−DDAO
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちddC3P−DDAO
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちddT3P−DDAO
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちddU3P−DDAO
3′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわち3′−dA3P−DDAO
3′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわち3′−dG3P−DDAO
3′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわち3′−dC3P−DDAO
3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわち3′−dT3P−DDAO
3′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわち3′−dU3P−DDAO
アデノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちA4P−DDAO
グアノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちG4P−DDAO
シチジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちC4P−DDAO
チミジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちT4P−DDAO
ウリジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちU4P−DDAO
2′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちdA4P−DDAO
2′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちdG4P−DDAO
2′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちdC4P−DDAO
2′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちdT4P−DDAO
2′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちdU4P−DDAO
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちddA4P−DDAO
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちddG4P−DDAO
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちddC4P−DDAO
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちddT4P−DDAO
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちddU4P−DDAO
3′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわち3′−dA4P−DDAO
3′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわち3′−dG4P−DDAO
3′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわち3′−dC4P−DDAO
3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわち3′−dT4P−DDAO
3′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわち3′−dU4P−DDAO
アデノシン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちA5P−DDAO
グアノシン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちG5P−DDAO
シチジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちC5P−DDAO
チミジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちT5P−DDAO
ウリジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちU5P−DDAO
2′−デオキシアデノシン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちdA5P−DDAO
2′−デオキシグアノシン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちdG5P−DDAO
2′−デオキシシチジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちdC5P−DDAO
2′−デオキシチミジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちdT5P−DDAO
2′−デオキシウリジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちdU5P−DDAO
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちddA5P−DDAO
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちddG5P−DDAO
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちddC5P−DDAO
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちddT5P−DDAO
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちddU5P−DDAO
3′−デオキシアデノシン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわち3′−dA5P−DDAO
3′−デオキシグアノシン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわち3′−dG5P−DDAO
3′−デオキシシチジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわち3′−dC5P−DDAO
3′−デオキシチミジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわち3′−dT5P−DDAO
3′−デオキシウリジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわち3′−dU5P−DDAO
アデノシン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちA6P−DDAO
グアノシン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちG6P−DDAO
シチジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちC6P−DDAO
チミジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちT6P−DDAO
ウリジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちU6P−DDAO
2′−デオキシアデノシン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちdA6P−DDAO
2′−デオキシグアノシン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちdG6P−DDAO
2′−デオキシシチジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちdC6P−DDAO
2′−デオキシチミジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちdT6P−DDAO
2′−デオキシウリジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちdU6P−DDAO
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちddA6P−DDAO
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちddG6P−DDAO
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちddC6P−DDAO
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちddT6P−DDAO
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちddU6P−DDAO
3′−デオキシアデノシン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわち3′−dA6P−DDAO
3′−デオキシグアノシン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわち3′−dG6P−DDAO
3′−デオキシシチジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわち3′−dC6P−DDAO
3′−デオキシチミジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわち3′−dT6P−DDAO
3′−デオキシウリジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわち3′−dU6P−DDAO
アデノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちA3P−Umb
グアノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)))三リン酸すなわちG3P−Umb
シチジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちC3P−Umb
チミジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちT3P−Umb
ウリジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちU3P−Umb
2′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちdA3P−Umb
2′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちdG3P−Umb
2′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちdC3P−Umb
2′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちdT3P−Umb
2′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちdU3P−Umb
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちddA3P−Umb
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちddG3P−Umb
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちddC3P−Umb
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちddT3P−Umb
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちddU3P−Umb
3′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわち3′−dA3P−Umb
3′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわち3′−dG3P−Umb
3′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわち3′−dC3P−Umb
3′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわち3′−dT3P−Umb
3′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわち3′−dU3P−Umb
アデノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちA4P−Umb
グアノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)))四リン酸すなわちG4P−Umb
シチジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちC4P−Umb
チミジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちT4P−Umb
ウリジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちU4P−Umb
2′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちdA4P−Umb
2′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちdG4P−Umb
2′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちdC4P−Umb
2′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちdT4P−Umb
2′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちdU4P−Umb
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちddA4P−Umb
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちddG4P−Umb
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちddC4P−Umb
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちddT4P−Umb
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちddU4P−Umb
3′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわち3′−dA4P−Umb
3′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわち3′−dG4P−Umb
3′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわち3′−dC4P−Umb
3′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわち3′−dT4P−Umb
3′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわち3′−dU4P−Umb
アデノシン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちA5P−Umb
グアノシン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちG5P−Umb
シチジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちC5P−Umb
チミジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちT5P−Umb
ウリジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちU5P−Umb
2′−デオキシアデノシン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちdA5P−Umb
2′−デオキシグアノシン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちdG5P−Umb
2′−デオキシシチジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちdC5P−Umb
2′−デオキシチミジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちdT5P−Umb
2′−デオキシウリジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちdU5P−Umb
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちddA5P−Umb
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちddG5P−Umb
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちddC5P−Umb
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちddT5P−Umb
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちddU5P−Umb
3′−デオキシアデノシン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわち3′−dA5P−Umb
3′−デオキシグアノシン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわち3′−dG5P−Umb
3′−デオキシシチジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわち3′−dC5P−Umb
3′−デオキシチミジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわち3′−dT5P−Umb
3′−デオキシウリジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわち3′−dU5P−Umb
アデノシン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちA6P−Umb
グアノシン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちG6P−Umb
シチジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちC6P−Umb
チミジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちT6P−Umb
ウリジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちU6P−Umb
2′−デオキシアデノシン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちdA6P−Umb
2′−デオキシグアノシン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちdG6P−Umb
2′−デオキシシチジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちdC6P−Umb
2′−デオキシチミジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちdT6P−Umb
2′−デオキシウリジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちdU6P−Umb
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちddA6P−Umb
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちddG6P−Umb
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちddC6P−Umb
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちddT6P−Umb
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちddU6P−Umb
3′−デオキシアデノシン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわち3′−dA6P−Umb
3′−デオキシグアノシン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわち3′−dG6P−Umb
3′−デオキシシチジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわち3′−dC6P−Umb
3′−デオキシチミジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわち3′−dT6P−Umb
3′−デオキシウリジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわち3′−dU6P−Umb
アデノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちA3P−MeUmb
グアノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))))三リン酸すなわちG3P−MeUmb
シチジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちC3P−MeUmb
チミジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちT3P−MeUmb
ウリジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちU3P−MeUmb
2′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちdA3P−MeUmb
2′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちdG3P−MeUmb
2′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちdC3P−MeUmb
2′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちdT3P−MeUmb
2′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちdU3P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちddA3P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちddG3P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちddC3P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちddT3P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちddU3P−MeUmb
3′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわち3′−dA3P−MeUmb
3′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわち3′−dG3P−MeUmb
3′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわち3′−dC3P−MeUmb
3′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわち3′−dT3P−MeUmb
3′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわち3′−dU3P−MeUmb
アデノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちA4P−MeUmb
グアノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))))四リン酸すなわちG4P−MeUmb
シチジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちC4P−MeUmb
チミジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちT4P−MeUmb
ウリジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちU4P−MeUmb
2′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちdA4P−MeUmb
2′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちdG4P−MeUmb
2′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちdC4P−MeUmb
2′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちdT4P−MeUmb
2′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちdU4P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちddA4P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちddG4P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちddC4P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちddT4P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちddU4P−MeUmb
3′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわち3′−dA4P−MeUmb
3′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわち3′−dG4P−MeUmb
3′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわち3′−dC4P−MeUmb
3′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわち3′−dT4P−MeUmb
3′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわち3′−dU4P−MeUmb
アデノシン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちA5P−MeUmb
グアノシン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちG5P−MeUmb
シチジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちC5P−MeUmb
チミジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちT5P−MeUmb
ウリジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちU5P−MeUmb
2′−デオキシアデノシン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちdA5P−MeUmb
2′−デオキシグアノシン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちdG5P−MeUmb
2′−デオキシシチジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちdC5P−MeUmb
2′−デオキシチミジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちdT5P−MeUmb
2′−デオキシウリジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちdU5P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちddA5P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちddG5P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちddC5P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちddT5P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちddU5P−MeUmb
3′−デオキシアデノシン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわち3′−dA5P−MeUmb
3′−デオキシグアノシン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわち3′−dG5P−MeUmb
3′−デオキシシチジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわち3′−dC5P−MeUmb
3′−デオキシチミジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわち3′−dT5P−MeUmb
3′−デオキシウリジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわち3′−dU5P−MeUmb
アデノシン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちA6P−MeUmb
グアノシン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちG6P−MeUmb
シチジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちC6P−MeUmb
チミジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちT6P−MeUmb
ウリジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちU6P−MeUmb
2′−デオキシアデノシン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちdA6P−MeUmb
2′−デオキシグアノシン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちdG6P−MeUmb
2′−デオキシシチジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちdC6P−MeUmb
2′−デオキシチミジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちdT6P−MeUmb
2′−デオキシウリジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちdU6P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちddA6P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちddG6P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちddC6P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちddT6P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちddU6P−MeUmb
3′−デオキシアデノシン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわち3′−dA6P−MeUmb
3′−デオキシグアノシン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわち3′−dG6P−MeUmb
3′−デオキシシチジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわち3′−dC6P−MeUmb
3′−デオキシチミジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわち3′−dT6P−MeUmb
3′−デオキシウリジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわち3′−dU6P−MeUmb
アデノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちA3P−RR
グアノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)))三リン酸すなわちG3P−RR
シチジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちC3P−RR
チミジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちT3P−RR
ウリジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちU3P−RR
2′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちdA3P−RR
2′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちdG3P−RR
2′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちdC3P−RR
2′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちdT3P−RR
2′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちdU3P−RR
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちddA3P−RR
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちddG3P−RR
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちddC3P−RR
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちddT3P−RR
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちddU3P−RR
3′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわち3′−dA3P−RR
3′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわち3′−dG3P−RR
3′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわち3′−dC3P−RR
3′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわち3′−dT3P−RR
3′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわち3′−dU3P−RR
アデノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちA4P−RR
グアノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)))四リン酸すなわちG4P−RR
シチジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちC4P−RR
チミジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちT4P−RR
ウリジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちU4P−RR
2′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちdA4P−RR
2′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちdG4P−RR
2′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちdC4P−RR
2′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちdT4P−RR
2′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちdU4P−RR
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちddA4P−RR
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちddG4P−RR
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちddC4P−RR
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちddT4P−RR
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちddU4P−RR
3′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわち3′−dA4P−RR
3′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわち3′−dG4P−RR
3′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわち3′−dC4P−RR
3′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわち3′−dT4P−RR
3′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわち3′−dU4P−RR
アデノシン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちA5P−RR
グアノシン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちG5P−RR
シチジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちC5P−RR
チミジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちT5P−RR
ウリジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちU5P−RR
2′−デオキシアデノシン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちdA5P−RR
2′−デオキシグアノシン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちdG5P−RR
2′−デオキシシチジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちdC5P−RR
2′−デオキシチミジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちdT5P−RR
2′−デオキシウリジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちdU5P−RR
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちddA5P−RR
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちddG5P−RR
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちddC5P−RR
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちddT5P−RR
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちddU5P−RR
3′−デオキシアデノシン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわち3′−dA5P−RR
3′−デオキシグアノシン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわち3′−dG5P−RR
3′−デオキシシチジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわち3′−dC5P−RR
3′−デオキシチミジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわち3′−dT5P−RR
3′−デオキシウリジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわち3′−dU5P−RR
アデノシン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちA6P−RR
グアノシン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちG6P−RR
シチジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちC6P−RR
チミジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちT6P−RR
ウリジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちU6P−RR
2′−デオキシアデノシン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちdA6P−RR
2′−デオキシグアノシン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちdG6P−RR
2′−デオキシシチジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちdC6P−RR
2′−デオキシチミジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちdT6P−RR
2′−デオキシウリジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちdU6P−RR
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちddA6P−RR
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちddG6P−RR
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちddC6P−RR
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちddT6P−RR
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちddU6P−RR
3′−デオキシアデノシン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわち3′−dA6P−RR
3′−デオキシグアノシン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわち3′−dG6P−RR
3′−デオキシシチジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわち3′−dC6P−RR
3′−デオキシチミジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわち3′−dT6P−RR
3′−デオキシウリジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわち3′−dU6P−RR
アデノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちA3P−FlEt
グアノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))))三リン酸すなわちG3P−FlEt
シチジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちC3P−FlEt
チミジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちT3P−FlEt
ウリジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちU3P−FlEt
2′−デオキシアデノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちdA3P−FlEt
2′−デオキシグアノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちdG3P−FlEt
2′−デオキシシチジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちdC3P−FlEt
2′−デオキシチミジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちdT3P−FlEt
2′−デオキシウリジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちdU3P−FlEt
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちddA3P−FlEt
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちddG3P−FlEt
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちddC3P−FlEt
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちddT3P−FlEt
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちddU3P−FlEt
3′−デオキシアデノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわち3′−dA3P−FlEt
3′−デオキシグアノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわち3′−dG3P−FlEt
3′−デオキシシチジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわち3′−dC3P−FlEt
3′−デオキシチミジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわち3′−dT3P−FlEt
3′−デオキシウリジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわち3′−dU3P−FlEt
アデノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちA4P−FlEt
グアノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))))四リン酸すなわちG4P−FlEt
シチジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちC4P−FlEt
チミジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちT4P−FlEt
ウリジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちU4P−FlEt
2′−デオキシアデノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちdA4P−FlEt
2′−デオキシグアノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちdG4P−FlEt
2′−デオキシシチジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちdC4P−FlEt
2′−デオキシチミジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちdT4P−FlEt
2′−デオキシウリジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちdU4P−FlEt
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちddA4P−FlEt
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちddG4P−FlEt
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちddC4P−FlEt
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちddT4P−FlEt
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちddU4P−FlEt
3′−デオキシアデノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわち3′−dA4P−FlEt
3′−デオキシグアノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわち3′−dG4P−FlEt
3′−デオキシシチジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわち3′−dC4P−FlEt
3′−デオキシチミジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわち3′−dT4P−FlEt
3′−デオキシウリジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわち3′−dU4P−FlEt
アデノシン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちA5P−FlEt
グアノシン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちG5P−FlEt
シチジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちC5P−FlEt
チミジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちT5P−FlEt
ウリジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちU5P−FlEt
2′−デオキシアデノシン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちdA5P−FlEt
2′−デオキシグアノシン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちdG5P−FlEt
2′−デオキシシチジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちdC5P−FlEt
2′−デオキシチミジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちdT5P−FlEt
2′−デオキシウリジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちdU5P−FlEt
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちddA5P−FlEt
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちddG5P−FlEt
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちddC5P−FlEt
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちddT5P−FlEt
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちddU5P−FlEt
3′−デオキシアデノシン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわち3′−dA5P−FlEt
3′−デオキシグアノシン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわち3′−dG5P−FlEt
3′−デオキシシチジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわち3′−dC5P−FlEt
3′−デオキシチミジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわち3′−dT5P−FlEt
3′−デオキシウリジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわち3′−dU5P−FlEt
アデノシン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちA6P−FlEt
グアノシン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちG6P−FlEt
シチジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちC6P−FlEt
チミジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちT6P−FlEt
ウリジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちU6P−FlEt
2′−デオキシアデノシン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちdA6P−FlEt
2′−デオキシグアノシン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちdG6P−FlEt
2′−デオキシシチジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちdC6P−FlEt
2′−デオキシチミジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちdT6P−FlEt
2′−デオキシウリジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちdU6P−FlEt
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちddA6P−FlEt
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちddG6P−FlEt
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちddC6P−FlEt
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちddT6P−FlEt
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちddU6P−FlEt
3′−デオキシアデノシン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわち3′−dA6P−FlEt
3′−デオキシグアノシン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわち3′−dG6P−FlEt
3′−デオキシシチジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわち3′−dC6P−FlEt
3′−デオキシチミジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわち3′−dT6P−FlEt
3′−デオキシウリジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわち3′−dU6P−FlEt
表4:リン酸を除去せずに検出可能な標識を有する末端リン酸標識ヌクレオチド類の例
FAM−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−三リン酸
ROX−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−三リン酸
REG−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−三リン酸
R110−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−三リン酸
TAMRA−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−三リン酸
ROX−アミドへプチル−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
REG−アミドへプチル−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
R110−アミドへプチル−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
TAMRA−アミドへプチル−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
ROX−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシシチジン−三リン酸
REG−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシシチジン−三リン酸
R110−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシシチジン−三リン酸
TAMRA−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシシチジン−三リン酸
ROX−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシアデノシンン−三リン酸
REG−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシアデノシン−三リン酸
R110−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシアデノシン−三リン酸
TAMRA−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシアデノシン−三リン酸
ROX−アミドプロピル−ガンマ−アミド−デオキシアデノシン−三リン酸
REG−アミドプロピル−ガンマ−アミド−デオキシアデノシン−三リン酸
R110−アミドプロピル−ガンマ−アミド−デオキシアデノシン−三リン酸
TAMRA−アミドプロピル−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
TAMRA−アミドドデシル−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
TAMRA−アミドシクロヘキシル−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
TAMRA−アミドキシレン−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
FAM−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−四リン酸
ROX−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−四リン酸
REG−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−四リン酸
R110−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−四リン酸
TAMRA−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−四リン酸
Cy3−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−5′−四リン酸
Cy5−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−5′−四リン酸
アレキサ(Alexa)−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−5′−四リン酸
FAM−アミド−トリエチレングリコール−デオキシアデノシン−5′−三リン酸
FAM−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−三リン酸
REG−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−三リン酸
TAMRA−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−三リン酸
ROX−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−三リン酸
Cy3−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−三リン酸
Cy5−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−三リン酸
Cy5−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−四リン酸
TAMRA−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−四リン酸
ROX−アミド−テトラエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−四リン酸
Cy3−アミド−テトラエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−四リン酸
TAMRA−アミド−テトラエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−四リン酸
TAMRA−アミド−テトラエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−五リン酸
TAMRA−(Lys)n−アミドへプチル−アミド−デオキシグアノシン−5′−四リン酸
TAMRA−(Lys)n−アミドへプチル−アミド−チミジン−5′−四リン酸
式I中のリン酸化標識が蛍光源部分である時、それは、望ましくは、下記(全て、ホスホモノエステルとして記載)のひとつから選択される:ELF97の名称で市販されている2−(5′−クロロ−2′−ホスホリルオキシフェニル)−6−クロロ−4−(3H)−キナゾリノン(Molecular Probes社)、フルオレセインジホスフェート(四アンモニウ塩)、フルオレセイン3′(6′)−O−アルキル−6′(3′)−リン酸、9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン−7−イル)リン酸(ニアンモニウム塩)、4−メチルウンベリフェリルリン酸(遊離酸)、レゾルフィンリン酸、4−トリフルオロメチルウンベリフェリルリン酸、ウンベリフェリルリン酸、3−シアノウンベリフェリルリン酸、9,9−ジメチルアクリジン−2−オン−7−イルリン酸、6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルリン酸及びその誘導体類。これらの色素類の構造を下記に示した。
【0094】
【化13】
【0095】
【化14】
【0096】
【化15】
【0097】
上記式I中のリン酸化標識部分が発色源部分であるとき、それは、下記から選択される:5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルリン酸、3−インドキシルリン酸、p−ニトロフェニルリン酸及びその誘導体類。これらの発色源色素類の構造を、下記にホスホモノエステル類として示した。
【0098】
【化16】
【0099】
末端リン酸位における部分はさらに、化学発光化合物であることができ、それは、ホスファターゼ活性化1,2−ジオキセタン化合物であることが望ましい。この1、2−ジオキセタン化合物には、CDP−Starの名称で市販されている2−クロロ−5−(4−メトキシスピロ[1,2−ジオキセタン−3,2′−(5−クロロ−)トリシクロ[3,3,1−13,7]−デカン]−1−イル)−1−フェニルリン酸ニナトリウム塩(Tropix社,Bedford、MA)、CSPDの名称で市販されているクロロアダマンチ−2′−イリデンメトキシフェノキシリン酸化ジオキセタン(Tropix)、及びAMPPDの名称で市販されている3−(2′−スピロアダマンタン)−4−メトキシ−4−(3″−ホスホリルオキシ)フェニル−1,2−ジオキセタン(Tropix)が含まれるが、それらに限定されない。これらの市販ジオキセタン化合物類の構造は、米国特許5,582,980、5,112,960及び4,978,614にそれぞれ開示されており、本文で参考として引用している。
【0100】
リン酸を除去せずに検出可能でマンガン塩存在下でポリメラーゼによりDNA中によく取り込まれる色素を有する末端リン酸標識ヌクレオチド類の数例を、下記の構造式に示した。
【0101】
【化17】
【0102】
【化18】
【0103】
本発明はさらに核酸検出キットを含み、前記キットは、
a)式I:
【0104】
【化19】
【0105】
(式中、
P=リン酸(PO3)とその誘導体類であり、nは2以上であり、Yは、酸素又はイオウ原子であり、Bは、窒素含有複素環塩基であり、Sは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、P−Lは、リン酸を除去すると独立して検出可能となるリン酸化標識であり、
ここでLは、リン酸エステル、チオエステル、又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能標識である)による1種以上以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
b)DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、又は逆転写酵素の1種以上、
c)ホスファターゼ、及び
d)マンガン塩を含む反応緩衝液を含む。
【0106】
本発明はさらに核酸検出キットを含み、前記キットは、
a)式I:
【0107】
【化20】
【0108】
(式中、P=リン酸(PO3)とその誘導体類であり、nは2以上であり、Yは、酸素又はイオウ原子であり、Bは、窒素含有複素環塩基であり、Sは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、P−Lは、LとPの間にリンカーを有するリン酸化標識であり、
ここでLは、リン酸エステル、チオエステル、アルキルフォスフォネート又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基、ハロアルキル基、又はアミノ基を含む標識である)による1種以上以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
b)DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、又は逆転写酵素の1種以上、及び
c)マンガン塩を含む反応緩衝液を含む。
【0109】
本発明はさらに核酸検出キットを含み、前記キットは、
a)下記の式II:
【0110】
【化21】
【0111】
(式中、Labelは、リンカーを有していても有していなくてもよいNPPに結合した検出可能部分であり、NPPは、4個以上のリン酸類を有するヌクレオシドポリリン酸であり、及びxは1以上である)の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類の少なくとも1個のマンガン錯体、及び
b)核酸ポリメラーゼを含む。
【0112】
さらに核酸検出キットが提供され、
a)式II:
【0113】
【化22】
【0114】
(式中、Labelは、リンカーを有していても有していなくてもよいNPPに結合した検出可能部分であり、NPPは、4個以上のリン酸類を有するヌクレオシドポリリン酸であり、及びxは1以上である)の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の1種以上のマンガン錯体、
b)核酸ポリメラーゼ、及び
c)金属イオン結合緩衝液を含む。
【0115】
前記キットに含まれる末端リン酸標識ヌクレオチド又はそのマンガン錯体中の糖部分には、リボシル、2′−デオキシリボシル、3′−デオキシリボシル、2′、3′−ジデオキシリボシル、2′、3′−ジデハイドロジデオキシリボシル、2′−又は3′−アルコキシリボシル、2′−又は3′−アミノリボシル、2′−又は3′−フルオロリボシル、2′−又は3′−メルカプトリボシル、2′−又は3′−アルキルチオリボシル、非環式、環式炭素及び他の修飾糖類が含まれるが、それらに限定されない。
前記塩基には、ウラシル、チミン、シトシン、5−メチルシトシン、グアニン、7−デアザグアニン、ヒポキサンチン、7−デアザヒポキサンチン、アデニン、7−デアザアデニン、2,6−ジアミノプリン及びそのアナログ類が含まれるが、それらに限定されない。
【0116】
さらに、上記にも述べたように、酵素活性化可能な標識には、1,2−ジオキセタン化学発光化合物、蛍光色素、発色源色素、質量タグ、電気化学的タグ又はその組合せであることができる。前記ヌクレオチドの末端リン酸位における結合に適した化合物類は、上記に述べたものと同じである。さらに、前記標識は、ホスファターゼによる活性化を必要としない検出可能な標識であることもできる。
本発明の化合物類は、下記の図に示した方法類によって合成することもできる。
末端リン酸標識ヌクレオシド三リン酸類の合成:
【0117】
【化23】
【0118】
式中、Xは、NH、O、S又はCH2であり、
Yは、NH、O、S、ONH、CH2、CO又は色素部分と共有結合を形成可能な別の官能基であり、及びPがH又はハライド又はスルホネートのような脱離基である。
末端リン酸標識ヌクレオシド−5′−四リン酸類の合成:
【0119】
【化24】
【0120】
式中、Xは、NH、O、S又はCH2であり、
Yは、NH、O、S、ONH、CO、CH2又は色素部分と共有結合を形成可能な別の官能基であり、及びPがH又はハライド又はスルホネートのような脱離基である。
末端リン酸標識ヌクレオシド−5′−五リン酸類の合成:
【0121】
【化25】
【0122】
式中、Xは、NH、O、S又はCH2であり、
Yは、NH、O、S、ONH、CH2、CO又は色素部分と共有結合を形成可能な別の官能基であり、及びPがH又はハライド又はスルホネートのような脱離基である。
【0123】
本発明をさらに、下記の実施例を引用して説明する。
【実施例】
【0124】
下記の実施例は本発明の好適な態様類を示すが、それらは、全ての態様を例示することを意図していない。これらの実施例は、付属の請求の範囲及び/又は本発明の範囲を限定するものではない。
【0125】
実施例1
γ−(4−トリフルオロメチルクマリニル)ddGTP(γCF3クマリン−ddGTP)の調製
ddGTP(純度96%を超える46.4mM溶液200μl)を、無水ジメチルホルムアミド(DMF、2×0.5ml)とともに共蒸発した。これに、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC、9.6mg、5当量)を添加し、混合物を再度、無水DMF(0.5ml)とともに共蒸発した。残渣を無水DMF(0.5ml)に取り、混合物を一晩、攪拌した。約20%の環化されていない三リン酸がまだ存在していた(おそらく、カラム上での環状三メタリン酸の加水分解によるのであろう)。この混合物に対して、さらにDCC 2当量を添加し、2時間攪拌後、7−ハイドロキシ−4−トリフルオロメチルクマリン(4−トリフルオロメチルウンベリフェロン、42.7mg、20当量)とトリエチルアミン(26μl、20当量)を添加し、混合物を室温で攪拌した。2日後、HPLC(0.1Mトリエチルアンモニウム酢酸(TEAA)中0−30%のアセトニトリルにより15分間、30−50%のアセトニトリルにより5分間及び50−100%のアセトニトリルにより10分間、C18 3.9×150mmカラム、流速1ml/分)により、9.7分のところに新規産物が示され、出発環式三リン酸が示された(254nmにおいて、77対5)。混合物をさらにもう1日攪拌した。P−31 NMRにより、反応混合物の主成分としてガンマ標識ヌクレオシド−三リン酸が示された。反応混合物をロータリエバポレータで濃縮した。残渣を水で抽出した(5×1ml)。HPLCにより、254nmにおいて純度82%及び335nmにおいて81%が示された。水溶液をまとめ、ロータリエバポレータで濃縮し、水で再度溶解させた(1ml)。流速15ml/分で0.1Mトリエチルアンモニウムバイカーボネート(TEAB,pH8.3)中0−30%アセトニトリルを30分間、30−50%アセトニトリルを10分間用いて、1インチ×300cmのC18カラムで精製した。生成物ピークを、3個の分画で採取した。分画1は、上記と同じ調製HPLC方法により再度精製したが、ただしTEAB緩衝液のpHはCO2を通気することにより6.7に低下させた。生成物ピークを濃縮し、MeOH(2回)と水(1回)で共蒸発させた。サンプルを水1mlに溶解させた。HPLCは、254nmと335nmにおいて99%を超える純度を示した。UVにより、322nmにおける吸光係数11,000を示す濃縮物2.2mM(7−ハイドロキシ−4−トリフルオロメチルクマリンのベータガラクトシド誘導体について報告、Molecular Probes Catalog)が示された。MS:M−=702.18(理論値702.31)、UVλA=253,276&322nm。ddGTPのガンマリン酸に結合したトリフルオロクマリン色素は、322nmの励起最大値を有しかつ約415nmの発光最大値を有する蛍光である。前記リン酸エステルを加水分解すると遊離クマリン色素が放出され、そのスペクトルは、約385nmの励起最大と約502nmの発光最大に変化する。この変化は、簡易な蛍光測定又は色の変化により容易に検出される。ガンマヌクレオチド類の合成は、一般的に、Arzumanov,A.ら、J.Biol.Chem(1996)、10月4日、271(40):24389−94に記載されている。
【0126】
【化26】
【0127】
γ−(4−トリフルオロメチルクマリニル)ジデオキシグアノシン−5′−三リン酸(γCF3クマリン−ddGTP)
実施例2
γ−(3−シアノクマリニル)ddATP(γCNクマリン−ddATP)の調製
ddATP(純度96%を超える89mM溶液100μl)を、無水DMF(2×1ml)とともに共蒸発した。これに、DCC(9.2mg、5当量)を添加し、混合物を再度、無水DMF(1ml)とともに共蒸発した。残渣を無水DMF(0.5ml)に取り、反応物を室温で攪拌した。一晩した後、7−ハイドロキシ−3−シアノクマリン(33.3mg、20当量)とTEA(25μl、20当量)を添加し、混合物を室温で攪拌した。1日後、主成分(254nmにおいて55%)が8.1分後に観察され、別のマイナーな産物(約10%)が10分で観察された。もう1日しても有意な変化が起こらなかった。反応混合物をロータリエバポレータで濃縮し、残渣を水3×2mlで抽出した後、ろ過した。水溶液を濃縮し、流速15ml/分で0.1M TEAB(pH6.7)中0−30%アセトニトリルを30分間、30−50%アセトニトリルを10分間用いて、C−18カラムで精製した。主ピークを、3個の分画で採取した。主ピーク(分画2)のHPLCは、254nmにおいて純度95.6%及び335nmにおいて98.1%の純度を示した。それをロータリエバポレータで(室温で)濃縮し、MeOH(2×)と水(1×)で共蒸発した。残渣を水0.5mlに溶解させた。サンプル5μlを希釈し、UV分析用に1mlに希釈した。A346nm=0.784。吸光係数20,000(7−エトキシ−3−シアノクマリンについて報告されている、Molecular Probes Catalog)を想定すると、濃度は7.84mMであった。収率=3.92μM、44%。サンプルは、再度、上記と同一方法を用いてC−18カラムで精製した。サンプルピークは、3個の分画で採取した。分画2&3は254nmにおいて98%を超える純度を有しており、340nmにおいては99.5%を超えており、それらをまとめた。濃縮後、残渣をMeOH(2×)と水(1×)で共蒸発した。サンプルを水(1ml)に溶解させ、2.77mM溶液を得た。MS:M−=642.98au(理論値643.00au)、UVλA=263&346nm。ddATPのガンマリン酸に結合したシアノクマリン色素は、346nmの励起最大値を有しかつ約411nmの発光最大値を有する蛍光である。前記リン酸エステルを加水分解すると遊離クマリン色素が放出され、そのスペクトルは、約408nmの励起最大と約450nmの発光最大に変化する。この変化は、簡易な蛍光測定又は色の変化により容易に検出される。ガンマヌクレオチド類の合成は、一般的に、Arzumanov,A.ら、J.Biol.Chem(1996)、10月4日、271(40):24389−94に記載されている。
【0128】
【化27】
【0129】
γ−(3−シアノクマリニル)ジデオキシアデノシン−5′−三リン酸(γCNクマリン−ddATP)
実施例3
δ−9H(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン−7−イル)−ジデオキシチミジン−5′−四リン酸(ddT4P−DDAO)の調製
ddTTP(80mM溶液100μl)を、無水ジメチルホルムアミド(DMF、2×1ml)とともに共蒸発した。これに、ジシクロゲキシルカルボジイミド(8.3mg、5当量)を添加し、混合物を再度、無水DMF(1ml)とともに共蒸発した。残渣を無水DMF(1ml)に取り、反応物を室温で一晩、攪拌した。HPLCにより、ほとんどが環化された三リン酸(約82%)を示していた。この反応混合物を濃縮し、残渣を無水ジエチルエーテルで3回洗浄した。それを再度、無水DMFに溶解させ、ロータリエバポレータで乾燥するまで濃縮した。残渣を、200μlの無水DMF中にDDAO−一リン酸アンモニウム塩(5mg、1.5当量)とともに入れ、週末中ずっと40℃で攪拌した。HPLCは、所望のUV特徴を11.96分に有する新規生成物が形成されたことを示していた。(HPLC法: 0.1Mトリエチルアンモニウム酢酸(pH7)中0.30%のアセトニトリルにより15分間、30−50%のアセトニトリルにより5分間、Novapak C−18 3.9×150mmカラム、流速1ml/分)。LCMS(ES−)はまた、M−1ピークについて主要マスピーク834を示した。反応混合物を濃縮し、Deltapak C18、19×300mmカラムで0.1M TEAB(pH6.7)とアセトニトリルを用いて精製した。生成物を有する分画を、上記と同様の方法を用いてHPLCによって精製した。純粋な生成物を含む分画を濃縮し、MeoH(2×)と水(1×)で共蒸発させた。残渣を水(1.2ml)に溶解させ、1.23mM溶液を得た。254nmにおけるHPLC純度は、97.5%を超えており、455nmにおいては、96%を超えていた、UVλA=267nmと455nm、MS:M−1=834.04(理論値8.33.95)。δ−9H(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン−7−イル)−ジデオキシシチジン−5′−四リン酸(ddC4P−DDAO)、δ−9H(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)−ジデオキアデノシン−5′−四リン酸(ddA4P−DDAO)、及びδ−9H(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン−イル)−ジデオキシグアノシン−5′−四リン酸(ddG4P−DDAO)を、同様に合成し精製した。これらの精製化合物類の分析により、下記のデータを得た:ddC4P−DDAO:UVλA=268nmと454nm、MS:M−1=819.32(理論値818.96)、ddA4P−DDAO:UVλA=263nmと457nm、MS:M−1=843.30(理論値842.97)、ddG4P−DDAO:UVλA=257nmと457nm、MS:M−1=859.40(理論値858.97)。
【0130】
【化28】
【0131】
実施例4
ε−9H(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン−7−イル)−ジデオキシチミジン−5′−五リン酸DDAO−ddT−五リン酸(ddT5P−DDAO)
A.DDAOピロリン酸の調製
DDAO−リン酸ジアンモニウム塩(11.8μmol)を無水DMF(3×10.25ml)とともに共蒸発し、DMF(0.5ml)に溶解させた。これに、カルボニルジイミダゾール(CDI、9.6mg、5当量)を添加し、混合物を室温で一晩、攪拌した。過剰のCDIをMeoH(5μl)を添加し30分間攪拌することによって分解した。この混合物に対し、トリブチルアンモニウムジハイドロゲンリン酸(10当量、0.5M DMF溶液236ml)を添加し、この混合物を室温で4日間攪拌した。反応混合物をロータリエバポレータで濃縮した。残渣を緩衝液Aとして0.1M TEAB/アセトニトリル(3:1)及び緩衝液Bとして1M TEAB/アセトニトリル(3:1)を用いて0−100%Bを用いるHiPrep 16.10 Q XLカラムで精製した。主ピーク(HPLC純度98%)を採取し、濃縮しメタノール(2×)で共蒸発した。残渣を水1mlに溶解させ、5.9mM溶液を得た。UV/VISλmax=456nm。
B.ddT5P−DDAOの調製
ddTTP(47.5mM水溶液100μl)を無水DMF(2×1ml)とともに共蒸発した。これに対して、DCC(5当量、4.9mg)を添加し、混合物をDMF(1×1ml)とともに共蒸発した。残渣を無水DMF(0.5ml)にとり、室温で3時間攪拌した。これに対して、別に無水DMF(2×1ml)とともに共蒸発したDDAOピロリン酸1.03当量をDMF溶液として添加した。この混合物を乾燥するまで濃縮し、その後、無水DMF200μlに取った。混合物を38℃で2日間加熱した。反応混合物を濃縮し、水で希釈し、ろ過し、2段階勾配を用いて0−100%A−BによりHiTrap 5ml イオン交換カラムで精製した。溶媒A=0.1M TEAB/アセトニトリル(3:1)及び溶媒B=1M TEAB/アセトニトリル(3:1)。生成物の大半を含む分画12×13をまとめ、濃縮しメタノール(2×)で共蒸発した。残渣を5カラム容量の0.30%アセトニトリルの0.1MTEAB溶液と2カラム容量の30−50%アセトニトリルを用いて、流速10ml/分でXterra RP C−18 30−100mmカラムで再度精製した。純粋な生成物を含む分画を濃縮し、メタノール(2×)と水(1×)で共蒸発した。455nmにおけるHPLC純度は99%を超えていた。UV/VIS=268nm及び455nm。MS:M−1=914.03(理論値913.93)。
【0132】
これらのポリリン酸類の末端リン酸に結合したDDAO色素は、励起最大455nm及び発光最大約608nmにおいて蛍光性である。リン酸エステルを加水分解させ遊離色素を放出させると、前記スペクトルが変化し、励起最大約645nm及び発光最大約659nmであった。この変化は、単純に蛍光測定値又は色変化によって容易に検出される。
【0133】
【化29】
【0134】
実施例5
A)dCTP−ジアミノヘプチル−REG(dCTP−NH(CH2)7−NH−REG又はdCTP−DAH−REGの合成
【0135】
【化30】
【0136】
a:dCTP−トリエチルアンモニウム塩10μmolをトリブチルアミン40μmolと混合し、乾燥するまで蒸発させた。残渣を乾燥するまで2回、無水DMFと共蒸発させた。これをDMF1mlに再度溶解させ、DCC50μmolを添加し、乾燥するまで蒸発させた。この混合物を無水DMF1mlに溶解させ、室温で一晩、攪拌した。
b:ジアミノへプタン500μmolを無水DMF5mlに溶解し、乾燥するまで蒸発させた。この後、乾燥DMFによる共蒸発を2回行った。残渣を乾燥DMF2mlに溶解させた。この溶液をDCC−dCTP反応物(16時間のDCC−dCTP反応後)とまとめた。4時間後、HPLCは、ジアミノヘプチルdCTPに86%が変換したことを示していた。
【0137】
反応物を水で25mlに希釈しNaOHによりpH12に調整した。この混合物をジエチルエーテルで2回、抽出した。水相を蒸発させ、エーテルを除去した。化合物を、0.1M TEAB/アセトニトリル勾配を用いてDelta pakカラム19×300で精製した。純粋なdCTP−NH(CH2)7NH2を示す分画をまとめて、乾燥するまで濃縮した。残渣をエタノールで2回、共蒸発させた。化合物を水(2ml)に再度溶解させた。UV/Vis分光分析による収率は6.4μmolであった。Xterra RP C18 4.6×150mmカラム、0.1M TEAB/MeCN勾配(0−15%MeCN)15分によるHPCL分析:滞留時間4.55分。λmax270nm。
c:dCTP−ジアミノへプタン(上記より)1μmolを0.1M NaHCO3pH9.3により400μlに希釈した。これに対して、200μlDMF中5−REG NHSエステル2μmolを添加した。反応は、室温で2時間進行させた。反応物を水で10mlに希釈し、HR10/10Mono Qカラムに載せた。カラムを0.1M TEAB/25% アセトニトリルから1M TEAB/25%アセトニトリルまでの勾配により溶出した。dCTP−DAH−REGを含む分画をまとめ、乾燥するまで濃縮し、エタノールによる共蒸発を2回、行った。生成物を水で溶解し、収量190nmolを得た。
B)dA4P−ジアミノヘプチル−TAMRA(dA4P−NH(CH2)7−NH−TAMRAの合成
【0138】
【化31】
【0139】
a:dA4Pの合成:TEA dATP200μmolをトリブチルアミン1mMと混合し、乾燥するまで濃縮させた。残渣を無水ピリジンで1回共蒸発させ、乾燥DMFでもう1回行った。dATPを乾燥DMF5mlに再度溶解させ、カルボニルジイミダゾール1mMを添加した。反応物を4時間攪拌した。4時間後、メタノール8μlを添加し30分間攪拌した。次に、TBA−H2PO41mMを添加し、反応物を室温で一晩、攪拌した。
【0140】
反応物を水で25mlに希釈し、Q Sepharose XL16/10カラムで0.1M TEABから1M TEABの勾配pH6.8を用いて精製した。生成物を含む分画を、Xterra RP C18 19×100カラムにのせ、0.1M TEAB/アセトニトリル勾配で溶出した。純粋な生成物を含む分画を、乾燥するまで濃縮させ、メタノールで2回、共蒸発させた。dA4PをHPCLでアッセイした(Xterra RP C18 4.6×150 0.1M TEAA/MeCN 0−40%、12分間)。純度98%。滞留時間4.95分。収量110μM。
b:dA4−ジアミノヘプチルの合成:下記の試薬類をまとめた:
水2ml中dA4P 50μmol、0.2M 1−メチルイミダゾール−HCl、pH6を2.5ml、EDAC96mg、及びジアミノへプタン162mg。pHは、HClで6に調整し、反応を5時間進行させた。反応物を水で50mlに希釈し、Q Sepharose XL16/10カラムにのせ、0.1M TEAB/1M TEABの0−100%勾配で溶出させた。純粋な生成物を含む分画をまとめて、乾燥するまで濃縮させ、メタノールで2回、共蒸発させた。HPLC:Xterra RP C18 0−80% 0.1M TEAA/アセトニトリル12分。純度85%。滞留時間4.4分。収量7μM。
c:dA4P−ジアミノへプチル−TAMRAの合成:dA4P−ジアミノヘプチル2.5μMを0.1M NaHCO3 pH9.2 500μlに溶解させ、DMF400μlに溶解させたTAMRA5−NHSエステル3.5mgと混合した。反応は、室温で一晩進行させた。反応物を水で10mlに希釈し、HR10/10Mono Qカラムで0.1M TEAB/25% MeCNから1M TEAB/25%MeCNまでの勾配により精製した。生成物を含む分画を濃縮し、アセトニトリルを除去し、Xterra RP C18 19×100カラムに載せ、0−40%の0.1M TEAB/アセトニトリル勾配で溶出した。純粋な生成物を含む分画を乾燥するまで濃縮し、メタノールで2回、共蒸発させた。HPLC:Xterra RP 4.6×150mm、0.1M TEAA/アセトニトリル勾配。純度99%。収量450nM。
【0141】
上記実施例1−5に記載のものに類似の方法を用いて、末端リン酸に結合した色素類又は他の検出可能部分を有する類似のヌクレオチド化合物類もまた、作製できたことに注意されたい。これらには、リボヌクレオチド類、デオキシリボヌクレオチド類、ヌクレオシド−四リン酸類、天然塩基類(アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ヒポキサンチン及びウラシル)ならびに修飾塩基類又は修飾糖類のいずれかを有するヌクレオチド類が含まれる。
【0142】
下記の実施例6及び7では、末端リン酸に結合した色素誘導体を有するジデオキシヌクレオチド類が基質類として、成長する核酸中に核酸検出のためのテンプレート特異的プロセスにおいて核酸ポリメラーゼによって効果的に取り込まれることを示す。
【0143】
実施例6
ガンマリン酸標識ddGTPのポリメラーゼ取り込みによる核酸配列検出
反応は、実施例(1)のジデオキシヌクレオチドを用いて、室温(23℃)で組み立てた。反応物は、dC又はdTのいずれかにより、プライマーの3′末端に隣接する次のテンプレートヌクレオチドとしてそれぞれ配列番号2及び配列番号3に対応する2つの異なるオリゴヌクレオチドテンプレート類のひとつにアニーリングさせた単一ヌクレオチドプライマー(配列番号1によって表される)を有するプライマー−テンプレート組合せを含有していた。
【0144】
【化32】
【0145】
ここで図1について説明すると、本実施例におけるテンプレート1(配列番号2)について、DNAポリメラーゼはこのプライマーを標識ddGTPにより伸長させると考えられる。同様に、図1のテンプレート2(配列番号3)について、DNAポリメラーゼはこのプライマーを標識ddGTPではなくddATPにより伸長させると考えられる
反応条件:25mM Tris,pH8.0、5%グリセロール、5mM MgCl2,0.5mM ベータ−メルカプトエタノール、0.01% tween−20、0.25単位のエビアルカリホスファターゼ、テンプレート(次のテンプレートヌクレオチドは、示したようにdCMP又はdTMPのいずれかである)にアニーリングさせた100nMプライマー、及び2μM ddGTP−CF3−クマリンを含む反応物70μlを、LS−55ルミネセンススペクトロメータ(Perkin Elmer)中の石英蛍光超ミクロチューブ中で調製し、タイムドライブモードで作動させた。励起及び発光波長は、それぞれ、390nmと500nmであった。スリット幅は、励起スリットについて5nmとし、発光スリットについて15nmであった。反応を、3′、5′エキソヌクレアーゼ活性、5′、3′エキソヌクレアーゼ活性及びジデオキシヌクレオチド類に対する識別を消滅させるように遺伝子工学で作製したクローニングしたDNAポリメラーゼIを0.35μl(11単位)と0.25mM MnCl2を添加し、開始させた。
【0146】
図1に示したように、ガンマ標識ddGTPを含む反応について、色素発光は、プライマー:テンプレート1によってのみ検出されたが、テンプレート中の次のヌクレオチドは、dCであった。エビアルカリホスファターゼによりホスホリル移動のピロリン酸生成物を切断すると、CF3−クマリン標識に検出可能な変化が起こり、核酸検出を可能とする。検出可能な色素発光は、プライマー:テンプレート2では、得られなかった。
【0147】
実施例7
ガンマリン酸標識ddATPのポリメラーゼ取り込みによる核酸配列検出
反応は、実施例(2)のジデオキシヌクレオチドを用いて、室温(23℃)で組み立てた。反応物は、dC又はdTのいずれかによりプライマーの3′末端に隣接するテンプレートヌクレオチドとしてそれぞれ配列番号2及び配列番号3に対応する2つの異なるオリゴヌクレオチドテンプレート類のひとつにアニーリングさせた単一ヌクレオチドプライマー(配列番号1)を有するプライマー:テンプレート組合せを含有していた。
【0148】
ここで図2について説明すると、本実施例におけるテンプレート2(配列番号3)について、DNAポリメラーゼはこのプライマーを標識ddATPにより伸長させると考えられる。同様に、図2のテンプレート1(配列番号2)について、DNAポリメラーゼはこのプライマーを標識ddATPではなくddGTPにより伸長させると考えられる
反応条件:25mM Tris、pH8.0、5%グリセロール、5mM MgCl2、0.5mM ベータ−メルカプトエタノール、0.01% tween−20、0.25単位のエビアルカリホスファターゼ、テンプレートにアニーリングさせた100nMプライマー、及び2μM ddATP−CN−クマリンを含む反応物70μlを、LS−55ルミネセンススペクトロメータ(Perkin Elmer)中の石英蛍光超ミクロチューブ中で調製し、タイムドライブモードで作動させた。励起及び発光波長は、それぞれ、410nmと450nmであった。スリット幅は、励起スリットについて5nmとし、発光スリットについて15nmであった。反応を、3′−5′エキソヌクレアーゼ活性、5′−3′エキソヌクレアーゼ活性及びジデオキシヌクレオチド類に対する識別を消滅させるように遺伝子工学で作製したクローニングしたDNAポリメラーゼIを0.35μl(11単位)と0.25mM MnCl2を添加し、開始させた。
【0149】
図2に示したように、ガンマ標識ddATPを含む反応について、色素発光は、プライマー:テンプレート2によってのみ検出されたが、テンプレート中の次のヌクレオチドは、dTであった。エビアルカリホスファターゼによりホスホリル移動のピロリン酸生成物を切断すると、CN−クマリン標識に検出可能な変化が起こり、核酸検出を可能とする。検出可能な色素発光は、プライマー:テンプレート1により得られなかった。
【0150】
実施例8−13は、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類を用いた核酸ポリメラーゼ反応におけるマンガンの重要性を示している。
【0151】
実施例8
マグネシウム又はマンガンを含有する緩衝液中におけるリン酸標識ヌクレオチド類対塩基標識ヌクレオチド類の相対的取り込み速度
反応物(10μl、50℃、10分)は、1×反応緩衝液(25mM HEPES 8.5、0.01%tween−20)、活性化DNA3μg(染色体DNA)、5mMのMnCl2(丸)又はMgCl2(四角)のいずれか、FAM−TAM−11−ddTTP(点線)又はddT4P−DDAO(実線)のいずれか1μMと、1回の反応当たり10単位から1回の反応当たり0.01単位としたThermo Sequenase I(商標) DNAポリメラーゼを4倍ずつ希釈した溶液を含んでいた。結果(図3)を、線型及び対数スケールの両者でプロットし、酵素と相対的取り込み効率に対して両者とも直線性であることを示している。この結果、マグネシウム緩衝液に対してマンガン緩衝液における塩基標識ヌクレオチドの取りこみ効率が1.4倍低下したが、マグネシウム緩衝液に対してマンガン緩衝液中でリン酸標識ヌクレオチドの取りこみ効率が28倍増加したことを示している。
【0152】
実施例9
5mM塩化マグネシウム存在下におけるdGTP−DAH−REGの取りこみに及ぼす種々の濃度の塩化マンガンの効果
下記の反応混合物を調製した:200nM dGTP−DAH−REG(DAH=ジアミノヘプチルリンカー)、100nM プライマー/テンプレート、0.01mg/ml Phi 29 exo−、25mM Tris pH8、50mM KCl、1mM ベータメルカプトエタノール、エビアルカリホスファターゼ0.25単位、5mM MgCl2、及び種々の濃度のMnCl2。取りこみ速度は、REG−ピロリン酸放出に伴うREG蛍光の傾きの変化を測定することによって測定した。図4は、検討した濃度範囲でMnCl2添加により有意に速度が大きくなることを明らかにしている。
【0153】
【化33】
【0154】
実施例10
MgCl2を添加しないMnCl2存在下における核酸合成
上記の操作を用いて、dGTP−DAH−REGの取りこみ速度を、プライマー(配列番号1)と正確及び正確でないテンプレート1と2(それぞれ、配列番号2と配列番号3)を用いて測定した。図5に示したように、正確なテンプレートによる速度がミスマッチテンプレートによる速度よりもはるかに速いことを示している。
【0155】
実施例11
dCTP−DAH−ROXの取りこみの忠実性
実施例9と同じプライマー及びテンプレート(配列番号4)を用いて、反応開始後さまざまな時点におけるdCTP−DAH−ROXの取り込みを調べた。アッセイ条件は下記のようであった:総反応容量:30μlで、100nMプライマー/テンプレート、100nM Phi 29 exo−ポリメラーゼ、50mM Tris pH7.5、75mM KCl、0.7mM MnCl2,0.1mM DTT、0.3mg/ml BSA。反応は、濃縮物25μMに対してROX−dCTPを添加することによって開始した。生成物をゲル上で分離し、それらは明らかに、単一塩基の伸長とdCTP−DAH−ROXのそれ以上の取り込みがないことを示しており、強制条件下においてさえも取りこみミスが起こらないことを示唆している。
【0156】
【化34】
【0157】
実施例12
さまざまなポリメラーゼ類による末端リン酸標識ヌクレオチド類の取り込みに及ぼすMnCl2の効果
オリゴdT(35mer)は、各等量を20μM濃度で混合し80℃で4分間インキュベーションし氷上で急激に冷却することによって、ポリdAによりアニーリングした。この溶液1μlを25mM Hepes,pH8.0、0.01% Tween−20,10μM dT4P−DDAO,0.005u/μlBAP、図7に示した濃度のポリメラーゼ及び種々の濃度のMnCl2及びMgCl2を含む反応物20μlに混合した。反応物を、図7に示したように60℃で15分又は30分間インキュベーションした。図7は、試験したすべてのポリメラーゼについて、MnCl2は単独又はMgCl2存在下において取りこみ速度に大きな正の効果を及ぼすことを明らかにしている。実際、MnCl2が存在していないと、速度は非常に遅い。
【0158】
実施例13
4種のガンマ標識dNTP類をすべて用いた伸長合成
実施例9と同一のプライマー/テンプレート(配列番号1及び配列番号2)を用いて、下記の反応を組み立てた。反応容量:70μlで、25mM Tris、pH8.0、50mM KCl、0.7mM MnCl2、0.5mM ベータ−メルカプトエタノール、0.1mg/mlBSA、0.005単位/μl SAP、それぞれ75nMのプライマー及びテンプレート、それぞれ1μMのDDAO−dNTP(ここで、N=A、T、G、C)及び0.12mg/mlのPhi 29 exo−ポリメラーゼを6μl含んで反応を開始した。図8に示したように、核酸合成は、およそ30分で完了した。マンガン不在下でほとんどか又は全く合成は起こらなかった。
【0159】
実施例14
標識と末端リン酸の間にリンカーを有する末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類の取りこみ速度に及ぼすリンカー類の効果
さまざまなリンカーを有する下記末端リン酸標識ヌクレオチド類を調べた:TAMRA−NH−リンカー−NH−dTTP(2′−デオキシチミジン誘導体)及びREG−NH−リンカーdATP。リンカーは図9に示し、さらに得られたデータも示した。プライマー及びテンプレート配列は、実施例9に述べたものであるが、ただし、取りこみ部位のテンプレート塩基は、入ってくるヌクレオチドの塩基に依存して、さまざまであった(SEQ ID 1,3及び5)。
【0160】
【化35】
【0161】
25mM Tris、pH8.0、50mM KCl、5% グリセロール、1mM ベータ−メルカプトエタノール、0.25単位のSAP、0.5mM MgCl2,0.125mM MnCl2,100nMプライマー/テンプレート、1μMヌクレオチド及び150nMΔTts ポリメラーゼを含む70μlのサンプルを調製し、30℃でインキュベーションした。反応混合物を異なる時点でゲル上に流し、取りこみ量を求めた。明らかなように、短いリンカー(ジオキシプロパン)を有する末端リン酸標識ヌクレオシド三リン酸は、このポリメラーゼには余りよく受け入れられていない。程度は異なるものの残りは受け入れられ、ヘプチルが最良である。
【0162】
実施例15
異なるDNAポリメラーゼによる取りこみ速度に対して末端リン酸と色素部分の間のリンカーにポリペプチドを添加することが有する効果
dNTPに結合させた最適リンカー(末端リン酸と色素部分の間のNH(CH2)7NH)の取りこみ速度を、さらにペンタリシンを結合させたdNTPと比較した。いくつかの異なるDNAポリメラーゼ類を本研究に用いて、ヌクレオチド取り込みに及ぼすリンカー中のリシン部分の効果を確認した。反応は、下記に示したように実施し、結果を下記の表5に示した。
【0163】
【表3】
【0164】
【化36】
【0165】
反応混合物は、10nM Cy5−20merプライマー(配列番号1)と40merのオリゴヌクレオチドテンプレート(上記に示した配列番号5)、20mM Tris−HCl、0.01% Tween20、5mM MgCl2,0.5mM MnCl2,1mM DTT,バクテリアルアルカリホスファターゼ(BAP)及び100mMの末端リン酸標識ヌクレオチド及びDNAポリメラーゼを含んでいた。
a.DNAポリメラーゼを除いて全成分を混合し0.0015U/μlのBAP存在下25℃で5分間インキュベーションし、標識されていないヌクレオチドをすべて加水分解した。
b.反応混合物1μlを時点ゼロで取り除き、95%ホルムアミド/25mM EDTA4μl中でクエンチングさせた。
c.DNAポリメラーゼ1μlを添加し反応を開始させた。異なる時点でアリコット2μlを取り(短い時間コースでは、15、30及び60秒)、95%ホルムアミド/25mM EDTA8μl中でクエンチングさせた。
d.サンプルを沸騰水中で4分間変性させ、氷で急激に冷却し、2μlを25%(19:1−アクリルアミド:ビスアクリルアミド)、8M尿素、1×TBE PAGEに載せた。ゲルを約1時間、500Vで流した。
e.DNA生成物をStorm860で可視化し、21mer生成物に変換された20merプライマーの総量分画を計算することによって定量した。
【0166】
上記表5から、ペンタ−リシン結合ヌクレオチドが、異なるポリメラーゼ類によってC7結合ヌクレオチドよりもはるかに効率的に取り込まれることが明らかである。
【0167】
実施例16
リンカーを有していない三、四、及び五リン酸類と色素と末端リン酸の間にC7又はTEGリンカーを有する上記リン酸類とのPhi29 DNAポリメラーゼを用いた取り込み速度の比較
下記のプライマー/テンプレートを使用した A(デオキシグアノシンアナログ用、配列番号1及び配列番号2)及びB(チミジンアナログ用、配列番号1及び配列番号5)
【0168】
【化37】
【0169】
上記実施例15で報告したものと同じ操作を用いた。結果を下記の表16に示した。
【0170】
【表4】
【0171】
これらのデータは、リンカー中にさらにリン酸類があると取りこみ速度を高めることを明確に示しており、例えば、化合物3対1でわかる。さらに、TEGリンカーがジアミノヘプチル(NH(CH2)7NH)リンカーよりも優れており、化合物2対1及び化合物5対4でわかる。
【0172】
色素上にさらに負の電荷があると、取りこみ速度を高め、それは、化合物4対3(色素上に負の電荷)でわかる。
【0173】
上記に記載の本発明の教示の恩恵を受ける当該技術の当業者は、それに対して数多くの変更を行うことができる。これらの変更も、付属の請求の範囲に示したような本発明の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【0174】
【図1】ホスファターゼ存在下テンプレート特異的プロセスにおけるガンマ−リン酸標識ddGTPのポリメラーゼ利用によって得られた蛍光を示すグラフである。
【図2】ホスファターゼ存在下テンプレート特異的プロセスにおけるガンマ−リン酸標識ddATPのポリメラーゼ利用によって得られた蛍光を示すグラフである。
【図3】補因子としてのMg++又はMn++の存在下における塩基標識ジデオキシヌクレオチド類とリン酸標識ジデオキシヌクレオチド類の取り込みを示したグラフである。
【図4】5mM固定濃度のMgCl2存在下、エキソヌクレアーゼ欠乏Phi29 DNAポリメラーゼを用いたγ−ローダミン−6G標識GTPの取り込みに及ぼすMnCl2の効果を示したグラフである。
【図5】異なる濃度でMnCl2のみが存在している時の末端リン酸標識ヌクレオチド類の取り込みを示すグラフである。
【図6】MnCl2単独存在下、エキソヌクレアーゼ欠乏Phi29DNAポリメラーゼによるdCTP−γ−ROXの取り込みを示したグラフである。Mn単独存在下では、取り込みミスは観察されなかった。
【図7A−E】Mg++単独存在、Mn++単独存在及びMg++及びMn++塩類混合物存在下におけるポリAテンプレート上での異なるDNAポリメラーゼによる末端リン酸標識−ddT4P(ddT4P−DDAO)の取り込みを示す一連のグラフである。
【図8】MnCl2存在下、4種の末端リン酸標識ヌクレオチド類を全て用い、テンプレートとして20merオリゴヌクレオチドプライマーと40merのオリゴヌクレオチドを用いた40merのDNA合成を示すゲルファイルである。
【図9】リンカーを有する末端リン酸標識ヌクレオチド類の取り込み量に及ぼす種々のリンカー類の効果を示した。
【技術分野】
【0001】
本発明は、一般的に、活性増強のための補因子としてのMn++存在下において核酸ポリメラーゼ類を含む種々の酵素類の基質としての3個以上のリン酸類を有する末端リン酸標識ヌクレオチド類の用途に関する。使用した標識類は、化学発光、蛍光、電気化学的及び発色源部分ならびに質量タグ類であり、直接検出可能なものならびに酵素活性化後又は他のプロセスに投入して異なるシグナルを産生させた後に検出可能なものを含む。これらの末端リン酸標識ヌクレオチド類は、特定の遺伝子型又は遺伝子配列を同定することを含めて均質系アッセイで使用できるであろう。さらに、標識をヌクレオチド類の末端リン酸に連結してそれらの基質性を高める、すなわち異なる酵素類によるそれらの利用速度を高めるリンカー類を有する新規末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類が提供される。
【背景技術】
【0002】
いくつかの酵素類は、ヌクレオシド三リン酸及びそれらのアナログ類を利用するか又はそれらに作用する。これらの酵素類には、リガーゼ類、核酸ポリメラーゼ類、ホスホジエステラーゼ類、ホスホリラーゼ類、キナーゼ類及びホスファターゼ類が含まれる。これらの酵素類は全て、ある金属イオン類を補因子として必要とし、これらの酵素類の多くが異なる金属イオン類の存在下で作用できるが、一般的に、あるひとつの金属が他よりも好適である。
【0003】
核酸ポリメラーゼ類は、ヌクレオシド5′−三リン酸類の重合を触媒しDNA又はRNAを形成させる酵素類である。それらには、DNA依存性DNAポリメラーゼ類、DNA依存性RNAポリメラーゼ類及びRNA依存性DNAポリメラーゼ類が含まれる。これらの酵素類は、典型的にはMg2+である二価金属イオンの存在を補因子として必要とするが、Mn2+及びCa2+さえも時にはMg2+の代わりとなり得ることが知られている。正常ヌクレオチド類では、他の金属イオンよりもMg2+を利用すると反応速度が速い。
【0004】
例えば蛍光標識類を有する化合物を含むいくつかのヌクレオチドアナログ類が作製されており、それらは核酸ポリメラーゼ類のための基質としても作用できる。これらの標識類は、前記ヌクレオチドの塩基部分に結合されてきたが、ヌクレオチドの糖部分に結合される場合もまれにある。これらは、同一二価金属イオン補因子類によるほとんど同一反応条件下で、正常な非置換ヌクレオチド類としてポリメラーゼ類の基質類として作用してきた。
【0005】
また、ガンマリン酸位に標識したヌクレオチド類の利用にも関心が向けられている。いくつかのγ−リン酸標識ヌクレオシド三リン酸類が、Molecular Probes(米国特許6,323,186)から市販されている。これらのヌクレオチド類において、ホスホロチオアート結合を介して色素(ボディピ)を前記のγ−リン酸に結合する。標題「γ−ホスホエステルヌクレオシド三リン酸類」の米国特許6,399,335は、γ−ホスホエステル結合ヌクレオシド三リン酸を用いてポリメラーゼにより特定のヌクレオチド類を重合させるための方法類及び組成物類を提供している。LI−COR社(米国特許6,232,075、米国特許2003/0194740、WO 01/94609、及び米国特許2003/0186255)からのいくつかの他の特許出願は、異なる塩基及びγ−リン酸標識ヌクレオシド−5′−三リン酸の合成とその使用方法を記載している。これらのヌクレオチド類をDNAポリメラーゼとともに使用することで、前記ヌクレオチド塩基がRNA又はDNAに取り込まれると放出される標識ピロリン酸を同定することによって、DNA又はRNA配列中の特定ヌクレオチド類を同定できる。
【0006】
サンプル中の特定核酸類すなわち分析物質類を高い特異性と感度で検出するための方法類が公知である。このような方法では、一般的に、最初に特定標的配列又は分析物質の存在に基づき核酸配列を増幅することが必要である。増幅後、増幅配列を検出し定量する。従来の核酸類検出系には、蛍光標識類の検出、蛍光酵素結合検出系、抗体媒介標識検出及び放射性標識の検出が含まれる。
【0007】
これら方法類のひとつの欠点は、前記標識出発物質から前記標識生成物のなんらかの分離を必要とするばかりでなく、前記標識が生成物に結合しているので、同定すべき天然産物とは異なっていることがあげられる。したがって、修飾されていない生成物を形成することと同時に起こった反応に特徴的なシグナルを生ずる方法類及び基質類を使用することが有益であろう。さらに、もし前記の生成したシグナルが前記出発物質からの分離を必要としなければそれは有益であるし、さらに、もし分離が必要であるにしても非修飾生成物を産生することの利点は、圧倒的である。
【特許文献1】米国暫定出願60/445,189
【特許文献2】米国特許6,323,186
【特許文献3】米国特許6,399,335
【特許文献4】米国特許6,232,075
【特許文献5】米国特許2003/0194740
【特許文献6】WO 01/94609
【特許文献7】米国特許2003/0186255
【特許文献8】WO 03/020891
【特許文献9】WO 03/020984
【特許文献10】WO 03/020734
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
ガンマリン酸標識ヌクレオチド類は、このような機会を現実に提供する。たとえば、ガンマリン酸標識ヌクレオチド類をDNA又はRNAに核酸ポリメラーゼにより取り込ませると、非修飾DNA又はRNAが産生され、また同時に、産生した標識ピロリン酸は標的を検出し、特性解析し及び/又は定量するために使用される。しかし、これらのヌクレオチド類はさまざまな核酸ポリメラーゼ類にとっては極めて良好でない基質類であり、従って、これらの末端リン酸標識ヌクレオチド類の取り込み速度を改善することは有益であろう。先にも述べたように(WO 03/020891、WO 03/020984、WO 03/020734)、前記標識とヌクレオチドの間のポリリン酸鎖を長くすることによって、速度増強が一部達成することができる。この速度増強はいくつかの適用では有用であるが、現実的理由により数百のヌクレオチド類を短時間に付加しなければならない例えばPCRのような多くの適用では、未だに不十分である。
【0009】
したがって、末端リン酸標識ヌクレオチド利用速度をさらに高めることが有益であろう。これについて及び他の問題についても下記で述べる。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は、末端リン酸標識ヌクレオチド類(また、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類とも称される)の使用方法類、ならびにその有用性を高めるための組成物類を提供する。本発明は、酵素反応において末端リン酸標識ヌクレオチド類とともにマンガン塩類を使用し、たとえ他の金属塩類が存在しているにしてもマンガンがない状況で観察される酵素利用をはるかに上回るように酵素類によるそれらの利用を高める方法類を提供する。また、末端リン酸標識ヌクレオチド類の形状でそれらの基質性を高めるリンカーを有する重要な新規組成物を提供する。
【0011】
本発明は、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸からの酵素触媒ヌクレオシド一リン酸移動速度を高め、前記酵素又は前記末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の活性を検出する方法を提供し、前記方法は、マンガン塩を含む反応緩衝液中において末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸反応からの前記酵素触媒ヌクレオシド一リン酸移動を実行させ、それによって、もし他の二価金属塩類が前記緩衝液中に存在しているにしてもマンガンが存在していない状況下における反応速度を上回るように、反応速度を高めることを含む。
【0012】
本発明は、核酸配列の存在を検出する方法を提供し、前記方法は、a)マンガン塩存在下で核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類の利用速度を高めること、ここで、前記ポリメラーゼ反応が末端リン酸標識ヌクレオチドを反応させること及び標識ポリリン酸を産生させることを含み、b)前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、検出可能な種を産生させること、及びc)前記検出可能種の存在を検出することを含む。本発明においてホスファターゼの定義は、リン酸モノエステル類、ポリリン酸類及びヌクレオチド類を切断して、無機リン酸を放出する酵素を全て含む。本発明の文脈において、この酵素は、末端標識ヌクレオシドリン酸を切断しない(すなわち、前記末端リン酸標識ヌクレオチドが、実質的にホスファターゼに反応性でない)。ここで述べたホスファターゼ定義は 具体的には、アルカリホスファターゼ(EC3.1.3.1)及び酸ホスファターゼ(EC3.1.3.2)を含むがそれらに限定されない。ヌクレオチドの本発明における定義は、天然又は修飾ヌクレオシドリン酸を含む。
【0013】
本発明はさらにDNA配列存在を検出する方法を提供し、本方法は、a)末端リン酸標識ヌクレオチドとマンガン塩存在下においてDNAポリメラーゼ反応を起こさせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の利用速度を高めること、この反応の結果、標識ポリリン酸が産生され、b)前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、検出可能な種を産生させること、及びc)検出可能な種の存在を検出することを含む。
【0014】
また、核酸配列存在を検出する方法を提供し、本方法は、a)マンガン塩存在下において核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類とポリリン酸鎖中に4個以上のリン酸基を有する少なくとも1個の末端リン酸標識ヌクレオチドの利用速度を高めること、この反応の結果、標識ポリリン酸が産生され、及びb)前記標識ポリリン酸を検出することを含む。
【0015】
さらに、本発明は、核酸配列存在を検出する方法に関し、本方法は、a)マンガン塩存在下において核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類とポリリン酸鎖中に4個以上のリン酸基を有する少なくとも1個の末端リン酸標識ヌクレオチドの利用速度を高めること、この反応の結果、標識ポリリン酸が産生され、b)前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、検出可能な種を産生させること、及びc)前記検出可能種の存在を検出することを含む。
【0016】
本発明のさらに別の面は、核酸定量化方法に関し、前記方法は、a)マンガン塩存在下において核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類の利用速度を高め、前記反応には、末端リン酸標識ヌクレオチドが含まれ、この反応の結果、標識ポリリン酸が産生され、b)前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、核酸量に実質的に比例する量の検出可能な副産物種を産生させること、c)前記検出可能な種を測定すること、及びd)公知の標準物質を用いて前記測定値を比較し、核酸量を決定することを含む。
【0017】
本発明はさらに、DNA配列定量化方法に関し、前記方法は、a)マンガン塩存在下において核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類と末端リン酸標識ヌクレオチドの利用速度を高め、前記反応の結果、標識ポリリン酸が産生され、b)前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、DNA配列量に実質的に比例する量の検出可能な副産物種を産生させること、c)前記検出可能な種を測定すること、及びd)公知の標準物質を用いて前記測定値を比較し、DNA量を決定することを含む。
【0018】
本発明はさらに別の面において、核酸配列中の単一ヌクレオチドを同定し決定する方法に関し、この方法は、a)少なくとも1個の末端リン酸標識ヌクレオチドとマンガン塩存在下において核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類の利用速度を高め、前記反応の結果、標識ポリリン酸が産生され、b)前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、検出可能な種を産生させること、c)前記検出可能な種の存在を検出すること、及びd)取り込まれたヌクレオシドを同定することを含む。
【0019】
また、核酸配列中の単一ヌクレオチドを同定し決定する方法を提供し、この方法は、a)マンガン塩存在下において核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類とポリリン酸鎖中に4個以上のリン酸基類を有する少なくとも1個の末端リン酸標識ヌクレオチドの利用速度を高め、前記反応の結果、標識ポリリン酸が産生され、b)前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、検出可能な種を産生させること、c)前記検出可能な種の存在を検出すること、及びd)取り込まれたヌクレオシドを同定することを含む。
【0020】
本発明はさらに核酸検出キットを含み、前記キットは、
a)式I:
【0021】
【化1】
【0022】
(式中、P=リン酸(PO3)とその誘導体類であり、nは2以上であり、Yは、酸素又はイオウ原子であり、Bは、窒素含有複素環塩基であり、Sは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、P−Lは、リン酸を除去すると独立して検出可能となるリン酸化標識であり、
ここでLは、天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸においてリン酸エステル、チオエステル、又はホスホルアミデート結合を形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能標識である)による1種以上以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
b)DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、又は逆転写酵素の1種以上、
c)ホスファターゼ、及び
d)マンガン塩を含む反応緩衝液を含む。
【0023】
本発明はさらに核酸検出キットを含み、前記キットは、
a)下記の式I:
【0024】
【化2】
【0025】
(式中、P=リン酸(PO3)とその誘導体類であり、nは2以上であり、Yは、酸素又はイオウ原子であり、Bは、窒素含有複素環塩基であり、Sは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、P−Lは、LとPの間にリンカーを有するリン酸化標識であり、
ここでLは、天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸においてリン酸エステル、チオエステル、アルキルフォスフォネート又はホスホルアミデート結合を形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基、ハロアルキル基、又はアミノ基を含む標識である)による1種以上以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
b)DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、又は逆転写酵素の1種以上、及び
c)マンガン塩を含む反応緩衝液を含む。
【0026】
本発明はさらに、リンカーを有する新規末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類を提供し、それらは、ポリメラーゼにとってより優れた基質類である。これらのヌクレオチド類は、下記の構造:
【0027】
【化3】
【0028】
(式中、Lは、検出可能部分であり、x及びyは、独立してCH2、NH,O又はSから選択され、Zは、1個以上の複素原子を含みかつ適宜、正又は負の荷電を有する直線状、分枝状、環式、飽和又は非飽和炭化水素であり、ポリリン酸は、四リン酸又はそれよりも高次のリン酸であり、糖は、天然又は修飾糖であり、塩基は、天然又は修飾されたDNA又はRNA塩基である)によって表される。
【0029】
本発明はまた、式II:
【0030】
【化4】
【0031】
(式中、Labelは、リンカーを有していても有していなくてもよいNPPに結合した検出可能部分であり、NPPは、4個以上のリン酸類を有するヌクレオシドポリリン酸であり、及びxは1以上である)の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類のマンガン錯体類を提供する。
【0032】
さらに核酸検出キットが提供され、
a)式II:
【0033】
【化5】
【0034】
(式中、Labelは、リンカーを有していても有していなくてもよいNPPに結合した検出可能部分であり、NPPは、4個以上のリン酸類を有するヌクレオシドポリリン酸であり、及びxは1以上である)の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の1種以上のマンガン錯体、及び
b)核酸ポリメラーゼを含む。
【0035】
また、核酸検出キットが提供され、
a)式II:
【0036】
【化6】
【0037】
(式中、Labelは、リンカーを有していても有していなくてもよいNPPに結合した検出可能部分であり、NPPは、4個以上のリン酸類を有するヌクレオシドポリリン酸であり、及びxは1以上である)の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の1種以上のマンガン錯体、
b)核酸ポリメラーゼ、及び
c)金属イオン結合緩衝液を含む。
【0038】
本発明の前記目的と特徴は、下記の発明の詳細な説明と付属の図面を参照すればより充分に明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【0039】
用語「ヌクレオシド」は、本文で、1′位又は同等の位置における環式炭素又は非環式部分のような糖又は糖置換物に結合したプリンデアザプリン、ピリミジン又は修飾塩基を含む化合物として定義され、2′−デオキシ及び2′−ハイドロキシ、及び2′、3′−ジデオキシ形状ならびに他の置換物類を含む。
【0040】
用語「ヌクレオチド」は、本文で、ヌクレオシドのリン酸エステルを称するものとして使用し、前記エステル化部位が典型的には、5炭糖のC−5位に結合した水酸基に対応する。
【0041】
用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチド類又はその誘導体類の直線状オリゴマー類を含み、デオキシリボヌクレオシド類、リボヌクレオシド類等を含む。本明細書全体において、オリゴヌクレオチドが文字配列によって表されている場合にはすべて、前記ヌクレオチド類は、左から右に5′→3′方向にあり、他に断りがなければ、Aはデオキシアデノシンを示し、Cはデオキシシチジンを示し、Gはデオキシグアノシンを示し、及びTはチミジンを示す。
【0042】
用語「プライマー」は、特定の核酸配列に特定の方法でアニーリングしその特定配列の増幅を可能にする直線状オリゴヌクレオチドを称する。
【0043】
句「標的核酸配列」等は、配列のアイデンテティ(内容)又はヌクレオシド類の順序又は位置が本発明の1種以上の方法類によって決定される核酸を称する。
【0044】
用語「金属イオン緩衝液」とは、Mn2+のような溶液中遊離金属イオンの濃度を制御する物質を意味する。
【0045】
本発明は、酵素反応において末端リン酸標識ヌクレオチド類とともにマンガン塩類を使用し、たとえ他の金属塩類が存在するにしてもマンガン不在下で観察される酵素類による利用を上回るように酵素類によるそれらの利用を高める方法類を提供する。いくつかの酵素類は、それらの活性のために二価金属イオン類を補因子類として使用することが公知である。多くの場合、これらの金属イオン類は、他の金属イオン類により置換できるが、しかしこの置換の結果、酵素活性が低下することになる。本発明者らは、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸ではこれが真実ではなく、異なる金属イオンたとえばこの場合マンガンを添加すると、実際に、ヌクレオシド一リン酸移動を触媒する酵素類によるそれらの利用速度が高まることを見出した。
【0046】
したがって、本発明は、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸からの酵素触媒ヌクレオシド一リン酸移動速度を高め、前記酵素又は前記末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の活性を検出する方法を提供し、前記方法は、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸反応からのマンガン塩を含む反応緩衝液中における前記酵素触媒ヌクレオシド一リン酸移動を実行させ、それによって、もしたとえ他の二価金属塩類が前記緩衝液中に存在しているにしてもマンガン不在下における前記反応速度を上回るように前記反応速度を高めることを含む。
【0047】
本発明は、サンプル中のポリヌクレオチドを検出する方法類に関し、従来のアッセイを用いて、核酸ポリメラーゼ活性によりRNA又はDNA合成をモニタリングする。RNA及びDNAポリメラーゼ類は、ヌクレオシド三リン酸(NTP)又はデオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)から成長するオリゴヌクレオチド鎖の3′水酸基へのヌクレオシド一リン酸の移動により、オリゴヌクレオチド類を合成する。この反応を進める力となっているのは、無水物結合の切断と無機ピロリン酸の同時形成である。本発明は、ヌクレオチドの末端リン酸の構造的修飾がポリメラーゼ反応で機能するその能力を完全に破壊することはないという知見を利用している。前記のオリゴヌクレオチド合成反応では、ヌクレオチドのα−及びβ−ホスホリル基においてのみの直接変化を伴い、末端リン酸位におけるヌクレオチド類の修飾により核酸ポリメラーゼ反応のための基質として貴重となっている。しかし、これらの末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類は、ポリメラーゼにとって非常に貧弱な基質類である。本発明者らは、それらの基質性を、マンガン塩を添加することによって実質的に高めることができることを見出した。
【0048】
したがって、本発明は、マンガン塩存在下において末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類を使用する方法を提供し、この存在により、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類がより優れた酵素基質類として作用する能力が生まれる。マンガン塩類は、過去において配列決定方法類(WO 99/37810)ならびに核酸増幅方法類において使用されてきた。前者の場合、マンガンの使用は、異なる塩基で終止する断片の配列決定によるシグナル強度を均一にすることであり、それにより、配列分析が簡易になった。しかし、図3に示したように、マンガン塩存在下における塩基標識ヌクレオチド類の取り込み速度は、実際には、マグネシウム存在下における速度よりも遅い。核酸増幅方法類の場合、マンガン存在により、より長いDNA断片増幅が可能となったが、そのプロセスにおいてまた、複製エラーが増加する原因となった。末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類上でのポリメラーゼ利用に及ぼすマンガンの効果は、極めて異なっている。図4に示したように、5mM MgCl2を含む反応混合物に0.05mM MnCl2を添加すると、その結果、活性が増強され40倍を超えるようになる。さらに、取り込みエラーがMnCl2により増加するという証拠もない(図6)。反応速度のこのような向上に必要なマンガンの量はわずかで10μMであり、好適な濃度は、0.01から50mMの範囲である。さらに好適には、前記濃度は、0.05から10mMの間である。また、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム等のような他の塩類の存在は、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類の基質性に及ぼすマンガンの効果を妨害しない。
【0049】
ある態様において、前記ポリメラーゼは、DNAポリメラーゼI、II又はIII、又はDNAポリメラーゼα、β、γのようなDNAポリメラーゼ、又は末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ又はテロメラーゼである。他の態様において、適切なポリメラーゼ類にはDNA依存性RNAポリメラーゼ、プリマーゼ、又はRNA依存性DNAポリメラーゼ(逆転写酵素)が含まれるが、それらに限定されない。
【0050】
本発明が提供する方法類は、デオキシヌクレオシドポリリン酸、リボヌクレオシドポリリン酸、ジデオキシヌクレオシドポリリン酸、環式炭素ヌクレオシドポリリン酸、又は電気化学的標識、質量タグ、又は比色色素、化学発光標識又は末端リン酸に結合した蛍光標識を有する非環式ヌクレオシドポリリン酸アナログが含まれる。核酸ポリメラーゼがこのアナログを基質として利用する時、酵素活性化可能な標識が、ホスホリル移動の無機ポリリン酸副産物上に存在するであろう。ホスホリル移動のポリリン酸産物をホスファターゼにより切断すると、それに結合した標識に検出可能な変化が生じる。RNA及びDNAポリメラーゼ類が修飾された末端ホスホリル基を有するヌクレオチド類を認識できる一方、本発明者らは、この出発物質がホスファターゼ類のテンプレートではないと決定したことに注意されたい。下記の図は、本発明の方法に最も関連する分子類を示しており、すなわち、末端リン酸標識ヌクレオチド、標識ポリリン酸副産物及び酵素活性化標識を示している。
【0051】
【化7】
【0052】
上記図において、nは1以上であり、R1とR2は、独立してH、OH、SH、SR、OR、F、Br、Cl、I、N3、NHR又はNH2であり、Bは、ヌクレオチド塩基又は修飾複素環塩基であり、Xは、O、S、CH2又はNHであり、Yは、O、S又はBH3であり、及びLは、リンカーを有していても有していなくてもよいホスファターゼが活性化可能な標識であり、それは、着色又は蛍光色素、発色源、蛍光源又は化学発光分子、質量タグ又は電気化学的タグであることができる。質量タグは、質量差により他の成分から容易に識別可能な質量分析に適した低分子量部分である。電気化学的タグは、容易に酸化可能であるか又は還元可能な種である。nが2以上である時、前記ヌクレオチド類は、nが1である時よりもポリメラーゼ類にとって有意に優れた基質であることがわかった。したがって、好適な態様において、nは2、3又は4であり、R1とR2は、独立してH又はOHであり、XとYはOであり、Bは、ヌクレオチド塩基であり、及び、Lは、発色源、蛍光源又は化学発光分子であることができる標識である。
【0053】
本文に示した核酸配列存在を検出する方法の1態様において、前記工程は、a)Mn塩存在下で核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類の利用速度を高めること、ここで、前記反応が末端リン酸標識ヌクレオチドを反応させること及び前記ポリメラーゼ反応の結果標識ポリリン酸が産生し、b)前記標識ポリリン酸を前記リン酸エステルの加水分解に適したホスファターゼと反応させ、検出可能な種を産生させること、及びc)適切な手段により前記検出可能種の存在を検出することを含む。本態様において、核酸ポリメラーゼ反応に使用したテンプレートは、ヘテロポリマー又はホモポリマーのテンプレートであることができる。末端リン酸標識ヌクレオチドとは、本明細書全体において、成長するヌクレオチド鎖へのヌクレオシド一リン酸の取り込み後同時に放出された標識ポリリン酸が、それ自体として分離してもしなくても検出できるか、又はホスファターゼと反応させ検出可能な種を産生させることを意味する。他のヌクレオチド類も本反応に含めることができ、それらは、実質的にホスファターゼに対して非反応性であり、例えば、検出可能種を産生しない部分により末端リン酸でブロックされたヌクレオチド類がある。この特定の態様における検出のための核酸には、RNA、天然又は合成オリゴヌクレオチド、ミトコンドリア又は染色体DNAが含まれる。
【0054】
本発明はさらに、DNA配列存在を検出する方法を提供し、本方法は、a)末端リン酸標識ヌクレオチドとマンガン塩存在下においてDNAポリメラーゼ反応を起こさせ、この反応の結果、標識ポリリン酸が産生され、b)前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、検出可能な種を産生させること、及びc)前記検出可能な種の存在を検出することを含む。検出用DNA配列には、細胞から単離したDNA、ビスルファイト処理メチル化DNAのような化学的に処理したDNA、又は当該技術で公知の方法により化学的に又は酵素的に合成したDNAが含まれる。このような方法には、PCR及び本文で参考として引用したDNA Structure Part A:Synthesis and Physical analysis of DNA、Lilley,D.M.J.及びDahlberg、J.E.(編著)、Methods Enzymol.、211、Academic Press、Inc.,New York(1992)に記載のものが含まれる。さらに、前記DNA配列には、染色体DNA及び天然又は合成オリゴヌクレオチド類が含まれる。前記DNAは、二重鎖又は一重鎖である。
【0055】
本発明の方法類はさらに、前記ポリメラーゼ反応において1個以上の追加検出試薬類を含む。前記の追加検出試薬類は、前記の検出可能な種とは検出可能なほど異なる応答ができる。たとえば、前記追加検出試薬は、抗体であってもよい。
【0056】
ポリメラーゼ反応における基質として付加するための適切なヌクレオチド類は、ヌクレオシドポリリン酸類を含み、それらには、デオキシリボヌクレオシドポリリン酸類、リボヌクレオシドポリリン酸類、ジデオキシヌクレオシドポリリン酸類、環式炭素ヌクレオシドポリリン酸類及び非環式ヌクレオシドポリリン酸類及びそのアナログ類が含まれるが、それらに限定されない。末端リン酸が標識されている三、四、五又は六リン酸基類を前記のポリリン酸鎖中に含むヌクレオチド類が特に好適である。
【0057】
ポリリン酸鎖中に4個以上のリン酸類を含む末端リン酸標識ヌクレオチド類を含む態様において、ホスホリル移動の標識ポリリン酸副産物がホスファターゼ処理を行わずに検出できることも本発明の範囲内であることに注意されたい。たとえば、天然又は修飾ヌクレオシド塩基類、特にグアニンは、蛍光マーカー類クエンチングの原因となることが公知である。したがって、末端リン酸標識ヌクレオチドにおいて、前記標識は前記塩基によって部分的に消失することもある。前記ヌクレオシド一リン酸が取り込まれると、標識ポリリン酸副産物を、その蛍光増強により検出することもできる。これとは別に、蛍光、色、化学発光又は電気化学的検出により同定する前に、前記の標識ポリリン酸産物をクロマトグラフィで物理的に分離することも可能である。さらに、質量分析を用いて質量差により前記産物類を検出することもできるであろう。
【0058】
本発明の方法類には、1種以上のDNA又はRNAポリメラーゼの存在下でポリメラーゼ反応を行うことを含むことができる。適切な核酸ポリメラーゼ類にはまた、プリマーゼ類、テロメラーゼ類、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ類、及び逆転写酵素類が含まれる。核酸テンプレートは、ポリメラーゼ反応が起こるために必要であろうし、ポリメラーゼ反応溶液に添加することもできる。本発明の検出方法における段階a)、b)及びc)のすべてを単一の、均質反応混合物を用いて同時に行わせることもできるし、また、順次行わせることもできる。
【0059】
本発明の範囲内で、核酸ポリメラーゼ反応は、ポリメラーゼ類を利用する増幅方法を含むこともできる。このような方法類の例として、ポリメラーゼチェーン反応(PCR)、ローリングサークル増幅(RCA)、及び核酸配列に基づく増幅(NASBA)が含まれる。前記標的分子がDNAのような核酸ポリマーである場合、アデニン、チミン、シトシン、グアニン又は他の窒素複素環塩基類のようなガンマ−リン酸標識ヌクレオチド塩基類のDNA分子中への取り込みを、PCRによって検出することもできる。前記ポリメラーゼチェーン反応(PCR)方法は、Saikiら、Science Vol.239、487ページ、1988、Mullisら、米国特許4,683,195によって、及び、Sambrook,J.ら(編著)、Molecular Cloning、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1980),Ausubel,F.M.ら(編著)、Current Protocols in Mlecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,NY(1999)及びWu,R.(編著)、Recombinant DNA Methodology II、Methods in Zumulogy, Academic Press,Inc.,NY(1995)によって記載されている。PCRを用いて、DNAのような検出用標的核酸を直接、PCR試薬類及び適切なプライマー類を含む反応容器に入れ、それを増幅させる。典型的には、前記標的核酸の少なくとも一部に配列が相補性であるプライマーを選択する。
【0060】
本発明の方法類の段階a)を実施するために適した核酸ポリメラーゼ反応類には、さらに、さまざまな核酸配列増幅RCA方法類を含めることができる。たとえば、本文で参考として引用するLizardi,Paul M.、米国特許5,854,033に開示されたものは、有用である。ポリメラーゼ反応にはさらに、核酸配列に基づく増幅(NASBA)を含めることができ、この系では、DNAではなくRNAの増幅を伴い、この増幅は等温性であり、ひとつの温度(41℃)で起こる。標的RNAのNASBAによる増幅には、逆転写酵素、Rnase H及びT7 RNAポリメラーゼという酵素3種の活性がサンプルである標的RNAに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー類と共同して作用することが必要になる。これらの酵素類は、4つの段階:伸長、分解、DNA合成及び環式RNA増幅で標的一重鎖RNAの指数対数的増幅を触媒する。
【0061】
RT−PCR、RCA及びNASBAの方法類では、一般に、標的核酸の当初の量が増幅産物の定量によって間接的に測定されることが必要となる。増幅産物類は最初に、アガロースゲル上での電気泳動により出発物質から分離され増幅がうまくいったことを確認し、その後、蛍光標識の検出、酵素結合検出系、抗体媒介標識検出及び放射性標識検出のような核酸用の従来の検出系のいずれかを用いて、定量する。対照的に、本方法では、ポリメラーゼ反応の産物を出発物質から分離してこれらの産物を検出するという必要性がなくなる。たとえば、本発明では、レポーター分子(蛍光、化学発光又は発色源)又は他の有用分子を、リン酸結合によってマスキングした時にある条件下でそれが検出できるようにヌクレオチドに結合させる。しかし、成長するオリゴヌクレオチド鎖にヌクレオチドが取り込まれ前記反応物をホスファターゼ処理すると、前記標識がそれらの条件下で検出可能である。たとえば、もし1,3−ジクロロ−9,9−ジメチル−アクリジン−2−オン(DDAO)の3重環構造側の水酸基をヌクレオチドの末端リン酸位に結合させると、このDDAOは、659nmで蛍光を発しない。ヌクレオシド一リン酸がDNAにいったん取り込まれると、他の産物DDAOポリリン酸(659nmで同様に蛍光を発しない)がホスファターゼの基質となる。いったん脱リン酸されDDAOを形成すると、色素部分が659nmで蛍光を発するようになり、従って検出可能となる。ポリリン酸産物の具体的分析は、ポリメラーゼ反応溶液中で行うことができ、出発物質類から反応産物を分離する必要がなくなる。このスキームにより、分光光度計のような通常の機器類を用いて、ポリメラーゼ反応中に形成された核酸類の検出と適宜その定量が可能となる。
【0062】
上述の方法類において、ポリメラーゼ反応段階はさらに、ホスファターゼ存在下においてポリメラーゼ反応を実行することを含み、標識ポリリン酸副産物を検出可能な標識に変換する。このようなものとして、検出可能な種の形成を連続的にモニタリングでき核酸配列の存在を検出するために便利なアッセイが確立される。このことは、それが一本の試験管で行うことができるという点において、均質アッセイ様式の代表である。
【0063】
上記アッセイ方法類のひとつの様式には、検出可能な種を産生できる末端リン酸標識単一種ヌクレオチドの存在下ポリメラーゼ反応を実行することを含むが、これに限定されない。たとえば、末端リン酸修飾ATPでは他のヌクレオチド類全てが実質的にホスファターゼ類に非反応性であるが、非検出可能種を産生する。
【0064】
別のアッセイ様式では、ポリメラーゼ反応を1種を超える末端リン酸標識ヌクレオチド存在下で実施できるが、このヌクレオチド類のそれぞれは、独自に検出可能な種を産生可能である。たとえば、前記アッセイには、酵素的に無機ポリリン酸から放出されるとホスホリル移動の副産物が第1波長で光を放出する第1標識に結合した第1ヌクレオチド(例 アデノシンポリリン酸)と第2波長で光を放出する第2標識に結合した第2ヌクレオチド(例 グアノシンポリリン酸)が含まれる。望ましいのは、前記第1及び第2波長における発光が、実質的にほとんどあるいは全く重ならないことである。ヌクレオチド配列情報に基づく複数の同時アッセイ類がその後、前記ポリリン酸から放出された特定標識に基づいて誘導できることも、本発明の範囲内である。
【0065】
本発明の別の面では、反応媒体中におけるマンガンイオン類濃度を制御する金属イオン緩衝液類が提供される。希釈に応答して又は溶液からのイオンの添加又は除去に応答する遊離イオンの濃度変化に対抗することによって、緩衝液は、溶液中の種(例 金属イオン)の濃度を制御する。このような緩衝液には例えば、酒石酸のようなアルキルジカルボン酸のようなカルボン酸が含まれるが、前記アルキルは、炭素原子1−8個の直鎖又は分枝状鎖である。ジカルボン酸の他の例には、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、グルタル酸、アジピン酸、フマル酸、グルタミン酸、アスパラギン酸及びフタル酸が含まれる。他の金属イオン緩衝液には、例えば、クエン酸、N−ハイドロキシエチルイミノニ酢酸、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸、ジチオスレイトール、及びN,N−ビスハイドロキシエチルグリシンが含まれる。金属イオン緩衝液をpH緩衝液(すなわち、溶液中遊離H+濃度を制御する化合物)の存在下、使用することもできる。前記マンガンイオンは通常は、例えば硫酸マンガン(MnSO4)、塩化マンガン(MnCl2)又は酢酸マンガンのような塩から生成するであろう。
【0066】
「ジカルボン酸」とは、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、酒石酸、グルタミン酸、アジピン酸、フマル酸、フタル酸、グルタル酸、又はアスパラギン酸のような2個のカルボン酸基を含む低級アルキル、ハイドロキシアルキル又はアミノアルキル化合物を全て意味する。
【0067】
上述の方法類にはさらに、核酸配列を定量する段階が含まれる。関連する面において、前記検出可能な種は、増幅核酸配列量に実質的に比例する量で産生させることができる。核酸配列を定量する段階は、望ましくは、公知のスペクトルと検出可能種が生成したスペクトルを比較することによって行われる。
【0068】
本発明は、1態様において、核酸配列を定量する方法を提供し、本方法は、a)マンガン塩存在下において核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ、前記ポリメラーゼ反応は、少なくとも1個の末端リン酸標識ヌクレオチドの他にホスファターゼに実質的に反応しないヌクレオチドの反応を含み、前記反応の結果、標識ポリリン酸類が生成し、b)前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、定量すべき核酸量に実質的に比例する量の検出可能な副産物種を産生させること、c)前記検出可能種を測定すること、及びd)前記測定値を公知の標準物質を用いて比較し、核酸量を求めることを含む。核酸定量方法のこの態様において、定量すべき核酸はRNAであることができる。核酸はさらに、天然又は合成オリゴヌクレオチド、染色体DNA又はRNAであることができる。
【0069】
本発明はさらに、DNA配列を定量する方法を提供し、本方法は、a)マンガン塩存在下においてDNAポリメラーゼ反応を起こさせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類と末端リン酸標識ヌクレオチドの利用速度を高め、前記反応の結果、標識ポリリン酸類が生成し、b)前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、定量すべきDNA配列量に実質的に比例する量の検出可能な副産物種を産生させること、c)前記検出可能種を測定すること、及びd)前記測定値を公知の標準物質を用いて比較し、DNA量を求めることを含む。この態様において、定量すべきDNA配列には、天然又は合成オリゴヌクレオチド、又は染色体DNAを含む細胞から単離したDNAを含むことができる。
【0070】
上述の核酸配列定量化のためこれら方法のそれぞれにおいて、ポリメラーゼ反応段階にはさらに、ホスファターゼ存在下においてポリメラーゼ反応を行うことが含まれる。先に本明細書で述べたように、これにより、核酸ポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングが可能となり、従って、定量する標的核酸配列のリアルタイム検出が可能となる。
【0071】
本文に述べた核酸配列定量化方法類に有用な末端リン酸標識ヌクレオチドは、上記の式Iによって表される。最も有用な例には、酵素活性化可能な標識を有するものが挙げられる。この酵素活性化可能な標識は、標識と天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸の間のリン酸エステル結合を検出可能な種を産生するように変化させるホスファターゼの酵素活性を介して、検出可能となる。検出可能種は、色、蛍光発光、化学発光、質量差又は電気化学的電位のいずれか又は組合せの存在下において検出可能となる。先にも既に述べたように、酵素活性化可能な標識は、1,2−ジオキセタン化学発光化合物、蛍光色素、発色源性色素、質量タグ又は電気化学的タグ又はその組合せであることができる。適切な標識は、上記に述べたものと同じである。
【0072】
実施例のセクションでさらに詳細に述べるが、本発明は、標的核酸配列中の1個のヌクレオチドがなんであるかそのアイデンテティを決定する方法類を提供する。これらの方法類は、a)マンガン塩存在下において核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類と少なくとも1個の末端リン酸標識ヌクレオチドの利用速度を高め、前記反応の結果、標識ポリリン酸が産生され、b)前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、検出可能な種を産生させること、c)前記検出可能な種の存在を検出すること、及びd)取り込まれたヌクレオシドを同定することを含む。好適な態様において、前記末端リン酸標識ヌクレオチドは、4個以上のリン酸類をポリリン酸鎖中に含む。
【0073】
核酸配列の存在を検出する上述の方法類のひとつの面において、末端リン酸標識ヌクレオチドは、式I:
【0074】
【化8】
【0075】
(式中、P=リン酸(PO3)とその誘導体類であり、nは2以上であり、Yは、酸素又はイオウ原子であり、Bは、窒素含有複素環塩基であり、Sは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、P−Lは、リン酸を除去すると独立して検出可能となるリン酸化標識であり、ここで、Lは、リン酸エステル、チオエステル、又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能標識である)によって表すこともできる。
【0076】
核酸配列の存在を検出する上述の方法類のもうひとつの面において、末端リン酸標識ヌクレオチドは、式I:
【0077】
【化9】
【0078】
(式中、P=リン酸(PO3)とその誘導体類であり、nは2以上であり、Yは、酸素又はイオウ原子であり、Bは、窒素含有複素環塩基であり、Sは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、P−Lは、LとPの間にリンカーを有するリン酸化標識であり、ここでLは、リン酸エステル、チオエステル、アルキルフォスフォネート又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基、ハロアルキル基、又はアミノ基を含む標識である)によって表すこともできる。
本発明の別の態様では、ヌクレオシドポリリン酸(テトラ−(四)、ペンタ−(五)、ヘキサ−(六))を本発明に用いた標識に連結しそれらをポリメラーゼのためのよりすぐれた基質とするリンカーを有する新規末端リン酸標識ヌクレオチド類を提供する。これらの化合物は、式
【0079】
【化10】
【0080】
(式中、Labelは、検出可能な部分であり、x及びyは、独立してCH2、NH,O又はSから選択され:Zは、1個以上の複素原子を含みかつ適宜、正又は負の荷電を有する直線状、分枝状、環式、飽和又は非飽和炭化水素であり、ポリリン酸は、四リン酸又はそれよりも高次のリン酸であり、糖は、天然又は修飾糖であり、塩基は、天然又は修飾されたDNA又はRNA塩基である)によって表される。
【0081】
本発明の好適な態様において、リンカーであるx−Z−yは、3−100個の原子を含み、正又は負の荷電を含むことができる。より好適な態様において、前記リンカーx−Z−yは、アルカンジオール類、ジアミン類、アミノアルコール類、ジメルカプタン類、アミノ酸類、ペプチド類、アミノメルカプタン類、及びその組合せから選択される。
【0082】
本発明はまた、式II:
【0083】
【化11】
【0084】
(Labelは、リンカーを有していても有していなくてもよいNPPに結合した検出可能部分であり、NPPは、4個以上のリン酸類を有するヌクレオシドポリリン酸であり、xは1以上である)の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類のマンガン錯体類を述べている。
【0085】
これらの錯体類は、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類をマンガン塩類と混合することによって容易に調製でき、ポリリン酸鎖中のリン酸類の数に応じて、ヌクレオチドに錯化したマンガンイオン類の数が変化できる。好適な組成物類において、反応性末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸は、少なくとも1個のマンガンイオンを有している。
本発明の方法類及び新規組成物類のため、有用な環式炭素部分が、Ferraro,M.及びGotor,V.によってChem Rev.2000、第100巻、4319−48に記載されている。適切な糖部分は、Joeng,L.S.ら、J. Med. Chem.1993、第356巻、2627−38、Kim H.O.ら、J. Med.Chem.193、第36巻、30−7、及びEschenmosser A.、Science 1999、第284巻、2118−2114によって記載されている。さらに、有用な非環式部分が、Martinez,C.I.ら、Nucleic Acids Research 1999,vol.27,1271−1274によって、Martinez,C.I.ら、Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 1997,vol.7、3013−3016によって、及びTrainer,G.L.の米国特許5,558,91において記載されている。これらの部分の構造類を下記に示したが、全ての部分について、Rは、H、OH、NHR、F、N3、SH、SR、OR低級アルキル及びアリルであり、糖部分について、X及びYは独立して、O、S又はNHであり、非環式部分について、Xは、O、S、NH又はNRである。
【0086】
【化12】
【0087】
ある態様において、式中の糖部分は、下記から選択することができる:リボシル、2′−デオキシリボシル、3′−デオキシリボシル、2′、3′−ジデハイドロジデオキシリボシル、2′、3′−ジデオキシリボシル、2′−又は3′−アルコキシリボシル、2′−又は3′−アミノリボシル、2′−又は3′−フルオロリボシル、2′−又は3′−メルカプトリボシル、2′−又は3′−アルキルチオリボシル、非環式、環式炭素及び他の修飾糖類。
【0088】
さらに上記式中、前記塩基には、ウラシル、チミン、シトシン、5−メチルシトシン、グアニン、7−デアザグアニン、ヒポキサンチン、7−デアザヒポキサンチン、アデニン、7−デアザアデニン、2,6−ジアミノプリン又はそのアナログ類が含まれる。
【0089】
末端リン酸標識ヌクレオチド中の末端リン酸位において結合した標識は、1,2−デオキセタン化学発光化合物類、蛍光源性色素類、発色源性色素類、質量タグ類及び電気化学的タグ類から構成される群から選択することができる。これによる検出可能種が、色、蛍光発光、化学発光、質量変化、電気化学的検出又はその組合せのいずれの存在によって検出可能な種とすることができる。
【0090】
直接又はリンカーを介して末端リン酸基に結合できる標識類の例を下記の表1−2に示し、直接結合した標識を有し、リン酸類の除去後検出可能となる末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類ならびにリン酸類を除去しないでも検出可能な標識を有する末端リン酸標識ヌクレオチド類のいくつかの例をそれぞれ表3と4に示した。
【0091】
【表1】
【0092】
【表2】
【0093】
さらに、ドナー色素とアクセプター色素を結合させることによって調製したエネルギー移動色素類もまた、本発明で有用である。
表3:標識がポリリン酸鎖に直接結合している標識ヌクレオシドポリリン酸類の例
アデノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちA3P−DDAO
グアノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちG3P−DDAO
シチジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちC3P−DDAO
チミジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちT3P−DDAO
ウリジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちU3P−DDAO
2′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちdA3P−DDAO
2′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちdG3P−DDAO
2′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちdC3P−DDAO
2′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちdT3P−DDAO
2′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちdU3P−DDAO
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちddA3P−DDAO
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちddG3P−DDAO
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちddC3P−DDAO
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちddT3P−DDAO
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわちddU3P−DDAO
3′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわち3′−dA3P−DDAO
3′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわち3′−dG3P−DDAO
3′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわち3′−dC3P−DDAO
3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわち3′−dT3P−DDAO
3′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))三リン酸すなわち3′−dU3P−DDAO
アデノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちA4P−DDAO
グアノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちG4P−DDAO
シチジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちC4P−DDAO
チミジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちT4P−DDAO
ウリジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちU4P−DDAO
2′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちdA4P−DDAO
2′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちdG4P−DDAO
2′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちdC4P−DDAO
2′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちdT4P−DDAO
2′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちdU4P−DDAO
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちddA4P−DDAO
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちddG4P−DDAO
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちddC4P−DDAO
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちddT4P−DDAO
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわちddU4P−DDAO
3′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわち3′−dA4P−DDAO
3′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわち3′−dG4P−DDAO
3′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわち3′−dC4P−DDAO
3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわち3′−dT4P−DDAO
3′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))四リン酸すなわち3′−dU4P−DDAO
アデノシン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちA5P−DDAO
グアノシン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちG5P−DDAO
シチジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちC5P−DDAO
チミジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちT5P−DDAO
ウリジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちU5P−DDAO
2′−デオキシアデノシン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちdA5P−DDAO
2′−デオキシグアノシン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちdG5P−DDAO
2′−デオキシシチジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちdC5P−DDAO
2′−デオキシチミジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちdT5P−DDAO
2′−デオキシウリジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちdU5P−DDAO
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちddA5P−DDAO
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちddG5P−DDAO
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちddC5P−DDAO
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちddT5P−DDAO
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわちddU5P−DDAO
3′−デオキシアデノシン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわち3′−dA5P−DDAO
3′−デオキシグアノシン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわち3′−dG5P−DDAO
3′−デオキシシチジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわち3′−dC5P−DDAO
3′−デオキシチミジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわち3′−dT5P−DDAO
3′−デオキシウリジン−5′−(ε−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))五リン酸すなわち3′−dU5P−DDAO
アデノシン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちA6P−DDAO
グアノシン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちG6P−DDAO
シチジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちC6P−DDAO
チミジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちT6P−DDAO
ウリジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちU6P−DDAO
2′−デオキシアデノシン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちdA6P−DDAO
2′−デオキシグアノシン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちdG6P−DDAO
2′−デオキシシチジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちdC6P−DDAO
2′−デオキシチミジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちdT6P−DDAO
2′−デオキシウリジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちdU6P−DDAO
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちddA6P−DDAO
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちddG6P−DDAO
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちddC6P−DDAO
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちddT6P−DDAO
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわちddU6P−DDAO
3′−デオキシアデノシン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわち3′−dA6P−DDAO
3′−デオキシグアノシン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわち3′−dG6P−DDAO
3′−デオキシシチジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわち3′−dC6P−DDAO
3′−デオキシチミジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわち3′−dT6P−DDAO
3′−デオキシウリジン−5′−(ζ−7−(9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)))六リン酸すなわち3′−dU6P−DDAO
アデノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちA3P−Umb
グアノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)))三リン酸すなわちG3P−Umb
シチジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちC3P−Umb
チミジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちT3P−Umb
ウリジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちU3P−Umb
2′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちdA3P−Umb
2′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちdG3P−Umb
2′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちdC3P−Umb
2′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちdT3P−Umb
2′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちdU3P−Umb
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちddA3P−Umb
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちddG3P−Umb
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちddC3P−Umb
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちddT3P−Umb
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわちddU3P−Umb
3′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわち3′−dA3P−Umb
3′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわち3′−dG3P−Umb
3′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわち3′−dC3P−Umb
3′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわち3′−dT3P−Umb
3′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)三リン酸すなわち3′−dU3P−Umb
アデノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちA4P−Umb
グアノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)))四リン酸すなわちG4P−Umb
シチジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちC4P−Umb
チミジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちT4P−Umb
ウリジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちU4P−Umb
2′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちdA4P−Umb
2′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちdG4P−Umb
2′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちdC4P−Umb
2′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちdT4P−Umb
2′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちdU4P−Umb
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちddA4P−Umb
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちddG4P−Umb
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちddC4P−Umb
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちddT4P−Umb
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわちddU4P−Umb
3′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわち3′−dA4P−Umb
3′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわち3′−dG4P−Umb
3′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわち3′−dC4P−Umb
3′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわち3′−dT4P−Umb
3′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−ウンベリフェロン)四リン酸すなわち3′−dU4P−Umb
アデノシン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちA5P−Umb
グアノシン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちG5P−Umb
シチジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちC5P−Umb
チミジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちT5P−Umb
ウリジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちU5P−Umb
2′−デオキシアデノシン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちdA5P−Umb
2′−デオキシグアノシン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちdG5P−Umb
2′−デオキシシチジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちdC5P−Umb
2′−デオキシチミジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちdT5P−Umb
2′−デオキシウリジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちdU5P−Umb
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちddA5P−Umb
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちddG5P−Umb
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちddC5P−Umb
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちddT5P−Umb
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわちddU5P−Umb
3′−デオキシアデノシン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわち3′−dA5P−Umb
3′−デオキシグアノシン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわち3′−dG5P−Umb
3′−デオキシシチジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわち3′−dC5P−Umb
3′−デオキシチミジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわち3′−dT5P−Umb
3′−デオキシウリジン−5′−(ε−7−ウンベリフェロン)五リン酸すなわち3′−dU5P−Umb
アデノシン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちA6P−Umb
グアノシン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちG6P−Umb
シチジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちC6P−Umb
チミジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちT6P−Umb
ウリジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちU6P−Umb
2′−デオキシアデノシン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちdA6P−Umb
2′−デオキシグアノシン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちdG6P−Umb
2′−デオキシシチジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちdC6P−Umb
2′−デオキシチミジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちdT6P−Umb
2′−デオキシウリジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちdU6P−Umb
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちddA6P−Umb
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちddG6P−Umb
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちddC6P−Umb
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちddT6P−Umb
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわちddU6P−Umb
3′−デオキシアデノシン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわち3′−dA6P−Umb
3′−デオキシグアノシン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわち3′−dG6P−Umb
3′−デオキシシチジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわち3′−dC6P−Umb
3′−デオキシチミジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわち3′−dT6P−Umb
3′−デオキシウリジン−5′−(ζ−7−ウンベリフェロン)六リン酸すなわち3′−dU6P−Umb
アデノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちA3P−MeUmb
グアノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))))三リン酸すなわちG3P−MeUmb
シチジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちC3P−MeUmb
チミジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちT3P−MeUmb
ウリジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちU3P−MeUmb
2′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちdA3P−MeUmb
2′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちdG3P−MeUmb
2′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちdC3P−MeUmb
2′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちdT3P−MeUmb
2′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちdU3P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちddA3P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちddG3P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちddC3P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちddT3P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわちddU3P−MeUmb
3′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわち3′−dA3P−MeUmb
3′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわち3′−dG3P−MeUmb
3′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわち3′−dC3P−MeUmb
3′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわち3′−dT3P−MeUmb
3′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))三リン酸すなわち3′−dU3P−MeUmb
アデノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちA4P−MeUmb
グアノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))))四リン酸すなわちG4P−MeUmb
シチジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちC4P−MeUmb
チミジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちT4P−MeUmb
ウリジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちU4P−MeUmb
2′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちdA4P−MeUmb
2′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちdG4P−MeUmb
2′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちdC4P−MeUmb
2′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちdT4P−MeUmb
2′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちdU4P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちddA4P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちddG4P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちddC4P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちddT4P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわちddU4P−MeUmb
3′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわち3′−dA4P−MeUmb
3′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわち3′−dG4P−MeUmb
3′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわち3′−dC4P−MeUmb
3′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわち3′−dT4P−MeUmb
3′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−(4−メチルウンベリフェロン))四リン酸すなわち3′−dU4P−MeUmb
アデノシン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちA5P−MeUmb
グアノシン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちG5P−MeUmb
シチジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちC5P−MeUmb
チミジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちT5P−MeUmb
ウリジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちU5P−MeUmb
2′−デオキシアデノシン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちdA5P−MeUmb
2′−デオキシグアノシン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちdG5P−MeUmb
2′−デオキシシチジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちdC5P−MeUmb
2′−デオキシチミジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちdT5P−MeUmb
2′−デオキシウリジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちdU5P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちddA5P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちddG5P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちddC5P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちddT5P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわちddU5P−MeUmb
3′−デオキシアデノシン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわち3′−dA5P−MeUmb
3′−デオキシグアノシン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわち3′−dG5P−MeUmb
3′−デオキシシチジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわち3′−dC5P−MeUmb
3′−デオキシチミジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわち3′−dT5P−MeUmb
3′−デオキシウリジン−5′−(ε−7−(4−メチルウンベリフェロン))五リン酸すなわち3′−dU5P−MeUmb
アデノシン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちA6P−MeUmb
グアノシン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちG6P−MeUmb
シチジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちC6P−MeUmb
チミジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちT6P−MeUmb
ウリジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちU6P−MeUmb
2′−デオキシアデノシン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちdA6P−MeUmb
2′−デオキシグアノシン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちdG6P−MeUmb
2′−デオキシシチジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちdC6P−MeUmb
2′−デオキシチミジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちdT6P−MeUmb
2′−デオキシウリジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちdU6P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちddA6P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちddG6P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちddC6P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちddT6P−MeUmb
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわちddU6P−MeUmb
3′−デオキシアデノシン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわち3′−dA6P−MeUmb
3′−デオキシグアノシン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわち3′−dG6P−MeUmb
3′−デオキシシチジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわち3′−dC6P−MeUmb
3′−デオキシチミジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわち3′−dT6P−MeUmb
3′−デオキシウリジン−5′−(ζ−7−(4−メチルウンベリフェロン))六リン酸すなわち3′−dU6P−MeUmb
アデノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちA3P−RR
グアノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)))三リン酸すなわちG3P−RR
シチジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちC3P−RR
チミジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちT3P−RR
ウリジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちU3P−RR
2′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちdA3P−RR
2′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちdG3P−RR
2′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちdC3P−RR
2′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちdT3P−RR
2′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちdU3P−RR
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちddA3P−RR
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちddG3P−RR
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちddC3P−RR
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちddT3P−RR
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわちddU3P−RR
3′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわち3′−dA3P−RR
3′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわち3′−dG3P−RR
3′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわち3′−dC3P−RR
3′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわち3′−dT3P−RR
3′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)三リン酸すなわち3′−dU3P−RR
アデノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちA4P−RR
グアノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)))四リン酸すなわちG4P−RR
シチジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちC4P−RR
チミジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちT4P−RR
ウリジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちU4P−RR
2′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちdA4P−RR
2′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちdG4P−RR
2′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちdC4P−RR
2′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちdT4P−RR
2′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちdU4P−RR
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちddA4P−RR
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちddG4P−RR
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちddC4P−RR
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちddT4P−RR
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわちddU4P−RR
3′−デオキシアデノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわち3′−dA4P−RR
3′−デオキシグアノシン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわち3′−dG4P−RR
3′−デオキシシチジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわち3′−dC4P−RR
3′−デオキシチミジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわち3′−dT4P−RR
3′−デオキシウリジン−5′−(δ−7−レゾルフィン)四リン酸すなわち3′−dU4P−RR
アデノシン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちA5P−RR
グアノシン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちG5P−RR
シチジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちC5P−RR
チミジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちT5P−RR
ウリジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちU5P−RR
2′−デオキシアデノシン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちdA5P−RR
2′−デオキシグアノシン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちdG5P−RR
2′−デオキシシチジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちdC5P−RR
2′−デオキシチミジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちdT5P−RR
2′−デオキシウリジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちdU5P−RR
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちddA5P−RR
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちddG5P−RR
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちddC5P−RR
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちddT5P−RR
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわちddU5P−RR
3′−デオキシアデノシン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわち3′−dA5P−RR
3′−デオキシグアノシン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわち3′−dG5P−RR
3′−デオキシシチジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわち3′−dC5P−RR
3′−デオキシチミジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわち3′−dT5P−RR
3′−デオキシウリジン−5′−(ε−7−レゾルフィン)五リン酸すなわち3′−dU5P−RR
アデノシン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちA6P−RR
グアノシン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちG6P−RR
シチジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちC6P−RR
チミジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちT6P−RR
ウリジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちU6P−RR
2′−デオキシアデノシン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちdA6P−RR
2′−デオキシグアノシン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちdG6P−RR
2′−デオキシシチジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちdC6P−RR
2′−デオキシチミジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちdT6P−RR
2′−デオキシウリジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちdU6P−RR
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちddA6P−RR
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちddG6P−RR
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちddC6P−RR
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちddT6P−RR
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわちddU6P−RR
3′−デオキシアデノシン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわち3′−dA6P−RR
3′−デオキシグアノシン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわち3′−dG6P−RR
3′−デオキシシチジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわち3′−dC6P−RR
3′−デオキシチミジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわち3′−dT6P−RR
3′−デオキシウリジン−5′−(ζ−7−レゾルフィン)六リン酸すなわち3′−dU6P−RR
アデノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちA3P−FlEt
グアノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))))三リン酸すなわちG3P−FlEt
シチジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちC3P−FlEt
チミジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちT3P−FlEt
ウリジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちU3P−FlEt
2′−デオキシアデノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちdA3P−FlEt
2′−デオキシグアノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちdG3P−FlEt
2′−デオキシシチジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちdC3P−FlEt
2′−デオキシチミジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちdT3P−FlEt
2′−デオキシウリジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちdU3P−FlEt
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちddA3P−FlEt
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちddG3P−FlEt
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちddC3P−FlEt
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちddT3P−FlEt
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわちddU3P−FlEt
3′−デオキシアデノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわち3′−dA3P−FlEt
3′−デオキシグアノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわち3′−dG3P−FlEt
3′−デオキシシチジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわち3′−dC3P−FlEt
3′−デオキシチミジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわち3′−dT3P−FlEt
3′−デオキシウリジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))三リン酸すなわち3′−dU3P−FlEt
アデノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちA4P−FlEt
グアノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))))四リン酸すなわちG4P−FlEt
シチジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちC4P−FlEt
チミジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちT4P−FlEt
ウリジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちU4P−FlEt
2′−デオキシアデノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちdA4P−FlEt
2′−デオキシグアノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちdG4P−FlEt
2′−デオキシシチジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちdC4P−FlEt
2′−デオキシチミジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちdT4P−FlEt
2′−デオキシウリジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちdU4P−FlEt
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちddA4P−FlEt
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちddG4P−FlEt
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちddC4P−FlEt
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちddT4P−FlEt
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわちddU4P−FlEt
3′−デオキシアデノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわち3′−dA4P−FlEt
3′−デオキシグアノシン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわち3′−dG4P−FlEt
3′−デオキシシチジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわち3′−dC4P−FlEt
3′−デオキシチミジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわち3′−dT4P−FlEt
3′−デオキシウリジン−5′−(δ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))四リン酸すなわち3′−dU4P−FlEt
アデノシン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちA5P−FlEt
グアノシン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちG5P−FlEt
シチジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちC5P−FlEt
チミジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちT5P−FlEt
ウリジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちU5P−FlEt
2′−デオキシアデノシン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちdA5P−FlEt
2′−デオキシグアノシン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちdG5P−FlEt
2′−デオキシシチジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちdC5P−FlEt
2′−デオキシチミジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちdT5P−FlEt
2′−デオキシウリジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちdU5P−FlEt
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちddA5P−FlEt
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちddG5P−FlEt
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちddC5P−FlEt
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちddT5P−FlEt
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわちddU5P−FlEt
3′−デオキシアデノシン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわち3′−dA5P−FlEt
3′−デオキシグアノシン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわち3′−dG5P−FlEt
3′−デオキシシチジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわち3′−dC5P−FlEt
3′−デオキシチミジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわち3′−dT5P−FlEt
3′−デオキシウリジン−5′−(ε−3′−(6′−エチルフルオロセイン))五リン酸すなわち3′−dU5P−FlEt
アデノシン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちA6P−FlEt
グアノシン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちG6P−FlEt
シチジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちC6P−FlEt
チミジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちT6P−FlEt
ウリジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちU6P−FlEt
2′−デオキシアデノシン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちdA6P−FlEt
2′−デオキシグアノシン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちdG6P−FlEt
2′−デオキシシチジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちdC6P−FlEt
2′−デオキシチミジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちdT6P−FlEt
2′−デオキシウリジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちdU6P−FlEt
2′、3′−ジデオキシアデノシン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちddA6P−FlEt
2′、3′−ジデオキシグアノシン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちddG6P−FlEt
2′、3′−ジデオキシシチジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちddC6P−FlEt
2′、3′−ジデオキシチミジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちddT6P−FlEt
2′、3′−ジデオキシウリジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわちddU6P−FlEt
3′−デオキシアデノシン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわち3′−dA6P−FlEt
3′−デオキシグアノシン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわち3′−dG6P−FlEt
3′−デオキシシチジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわち3′−dC6P−FlEt
3′−デオキシチミジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわち3′−dT6P−FlEt
3′−デオキシウリジン−5′−(ζ−3′−(6′−エチルフルオロセイン))六リン酸すなわち3′−dU6P−FlEt
表4:リン酸を除去せずに検出可能な標識を有する末端リン酸標識ヌクレオチド類の例
FAM−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−三リン酸
ROX−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−三リン酸
REG−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−三リン酸
R110−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−三リン酸
TAMRA−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−三リン酸
ROX−アミドへプチル−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
REG−アミドへプチル−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
R110−アミドへプチル−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
TAMRA−アミドへプチル−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
ROX−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシシチジン−三リン酸
REG−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシシチジン−三リン酸
R110−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシシチジン−三リン酸
TAMRA−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシシチジン−三リン酸
ROX−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシアデノシンン−三リン酸
REG−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシアデノシン−三リン酸
R110−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシアデノシン−三リン酸
TAMRA−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシアデノシン−三リン酸
ROX−アミドプロピル−ガンマ−アミド−デオキシアデノシン−三リン酸
REG−アミドプロピル−ガンマ−アミド−デオキシアデノシン−三リン酸
R110−アミドプロピル−ガンマ−アミド−デオキシアデノシン−三リン酸
TAMRA−アミドプロピル−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
TAMRA−アミドドデシル−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
TAMRA−アミドシクロヘキシル−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
TAMRA−アミドキシレン−ガンマ−アミド−チミジン−三リン酸
FAM−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−四リン酸
ROX−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−四リン酸
REG−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−四リン酸
R110−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−四リン酸
TAMRA−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−四リン酸
Cy3−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−5′−四リン酸
Cy5−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−5′−四リン酸
アレキサ(Alexa)−アミドへプチル−ガンマ−アミド−デオキシグアノシン−5′−四リン酸
FAM−アミド−トリエチレングリコール−デオキシアデノシン−5′−三リン酸
FAM−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−三リン酸
REG−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−三リン酸
TAMRA−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−三リン酸
ROX−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−三リン酸
Cy3−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−三リン酸
Cy5−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−三リン酸
Cy5−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−四リン酸
TAMRA−アミド−トリエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−四リン酸
ROX−アミド−テトラエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−四リン酸
Cy3−アミド−テトラエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−四リン酸
TAMRA−アミド−テトラエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−四リン酸
TAMRA−アミド−テトラエチレングリコール−デオキシグアノシン−5′−五リン酸
TAMRA−(Lys)n−アミドへプチル−アミド−デオキシグアノシン−5′−四リン酸
TAMRA−(Lys)n−アミドへプチル−アミド−チミジン−5′−四リン酸
式I中のリン酸化標識が蛍光源部分である時、それは、望ましくは、下記(全て、ホスホモノエステルとして記載)のひとつから選択される:ELF97の名称で市販されている2−(5′−クロロ−2′−ホスホリルオキシフェニル)−6−クロロ−4−(3H)−キナゾリノン(Molecular Probes社)、フルオレセインジホスフェート(四アンモニウ塩)、フルオレセイン3′(6′)−O−アルキル−6′(3′)−リン酸、9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン−7−イル)リン酸(ニアンモニウム塩)、4−メチルウンベリフェリルリン酸(遊離酸)、レゾルフィンリン酸、4−トリフルオロメチルウンベリフェリルリン酸、ウンベリフェリルリン酸、3−シアノウンベリフェリルリン酸、9,9−ジメチルアクリジン−2−オン−7−イルリン酸、6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルリン酸及びその誘導体類。これらの色素類の構造を下記に示した。
【0094】
【化13】
【0095】
【化14】
【0096】
【化15】
【0097】
上記式I中のリン酸化標識部分が発色源部分であるとき、それは、下記から選択される:5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルリン酸、3−インドキシルリン酸、p−ニトロフェニルリン酸及びその誘導体類。これらの発色源色素類の構造を、下記にホスホモノエステル類として示した。
【0098】
【化16】
【0099】
末端リン酸位における部分はさらに、化学発光化合物であることができ、それは、ホスファターゼ活性化1,2−ジオキセタン化合物であることが望ましい。この1、2−ジオキセタン化合物には、CDP−Starの名称で市販されている2−クロロ−5−(4−メトキシスピロ[1,2−ジオキセタン−3,2′−(5−クロロ−)トリシクロ[3,3,1−13,7]−デカン]−1−イル)−1−フェニルリン酸ニナトリウム塩(Tropix社,Bedford、MA)、CSPDの名称で市販されているクロロアダマンチ−2′−イリデンメトキシフェノキシリン酸化ジオキセタン(Tropix)、及びAMPPDの名称で市販されている3−(2′−スピロアダマンタン)−4−メトキシ−4−(3″−ホスホリルオキシ)フェニル−1,2−ジオキセタン(Tropix)が含まれるが、それらに限定されない。これらの市販ジオキセタン化合物類の構造は、米国特許5,582,980、5,112,960及び4,978,614にそれぞれ開示されており、本文で参考として引用している。
【0100】
リン酸を除去せずに検出可能でマンガン塩存在下でポリメラーゼによりDNA中によく取り込まれる色素を有する末端リン酸標識ヌクレオチド類の数例を、下記の構造式に示した。
【0101】
【化17】
【0102】
【化18】
【0103】
本発明はさらに核酸検出キットを含み、前記キットは、
a)式I:
【0104】
【化19】
【0105】
(式中、
P=リン酸(PO3)とその誘導体類であり、nは2以上であり、Yは、酸素又はイオウ原子であり、Bは、窒素含有複素環塩基であり、Sは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、P−Lは、リン酸を除去すると独立して検出可能となるリン酸化標識であり、
ここでLは、リン酸エステル、チオエステル、又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能標識である)による1種以上以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
b)DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、又は逆転写酵素の1種以上、
c)ホスファターゼ、及び
d)マンガン塩を含む反応緩衝液を含む。
【0106】
本発明はさらに核酸検出キットを含み、前記キットは、
a)式I:
【0107】
【化20】
【0108】
(式中、P=リン酸(PO3)とその誘導体類であり、nは2以上であり、Yは、酸素又はイオウ原子であり、Bは、窒素含有複素環塩基であり、Sは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、P−Lは、LとPの間にリンカーを有するリン酸化標識であり、
ここでLは、リン酸エステル、チオエステル、アルキルフォスフォネート又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基、ハロアルキル基、又はアミノ基を含む標識である)による1種以上以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
b)DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、又は逆転写酵素の1種以上、及び
c)マンガン塩を含む反応緩衝液を含む。
【0109】
本発明はさらに核酸検出キットを含み、前記キットは、
a)下記の式II:
【0110】
【化21】
【0111】
(式中、Labelは、リンカーを有していても有していなくてもよいNPPに結合した検出可能部分であり、NPPは、4個以上のリン酸類を有するヌクレオシドポリリン酸であり、及びxは1以上である)の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類の少なくとも1個のマンガン錯体、及び
b)核酸ポリメラーゼを含む。
【0112】
さらに核酸検出キットが提供され、
a)式II:
【0113】
【化22】
【0114】
(式中、Labelは、リンカーを有していても有していなくてもよいNPPに結合した検出可能部分であり、NPPは、4個以上のリン酸類を有するヌクレオシドポリリン酸であり、及びxは1以上である)の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の1種以上のマンガン錯体、
b)核酸ポリメラーゼ、及び
c)金属イオン結合緩衝液を含む。
【0115】
前記キットに含まれる末端リン酸標識ヌクレオチド又はそのマンガン錯体中の糖部分には、リボシル、2′−デオキシリボシル、3′−デオキシリボシル、2′、3′−ジデオキシリボシル、2′、3′−ジデハイドロジデオキシリボシル、2′−又は3′−アルコキシリボシル、2′−又は3′−アミノリボシル、2′−又は3′−フルオロリボシル、2′−又は3′−メルカプトリボシル、2′−又は3′−アルキルチオリボシル、非環式、環式炭素及び他の修飾糖類が含まれるが、それらに限定されない。
前記塩基には、ウラシル、チミン、シトシン、5−メチルシトシン、グアニン、7−デアザグアニン、ヒポキサンチン、7−デアザヒポキサンチン、アデニン、7−デアザアデニン、2,6−ジアミノプリン及びそのアナログ類が含まれるが、それらに限定されない。
【0116】
さらに、上記にも述べたように、酵素活性化可能な標識には、1,2−ジオキセタン化学発光化合物、蛍光色素、発色源色素、質量タグ、電気化学的タグ又はその組合せであることができる。前記ヌクレオチドの末端リン酸位における結合に適した化合物類は、上記に述べたものと同じである。さらに、前記標識は、ホスファターゼによる活性化を必要としない検出可能な標識であることもできる。
本発明の化合物類は、下記の図に示した方法類によって合成することもできる。
末端リン酸標識ヌクレオシド三リン酸類の合成:
【0117】
【化23】
【0118】
式中、Xは、NH、O、S又はCH2であり、
Yは、NH、O、S、ONH、CH2、CO又は色素部分と共有結合を形成可能な別の官能基であり、及びPがH又はハライド又はスルホネートのような脱離基である。
末端リン酸標識ヌクレオシド−5′−四リン酸類の合成:
【0119】
【化24】
【0120】
式中、Xは、NH、O、S又はCH2であり、
Yは、NH、O、S、ONH、CO、CH2又は色素部分と共有結合を形成可能な別の官能基であり、及びPがH又はハライド又はスルホネートのような脱離基である。
末端リン酸標識ヌクレオシド−5′−五リン酸類の合成:
【0121】
【化25】
【0122】
式中、Xは、NH、O、S又はCH2であり、
Yは、NH、O、S、ONH、CH2、CO又は色素部分と共有結合を形成可能な別の官能基であり、及びPがH又はハライド又はスルホネートのような脱離基である。
【0123】
本発明をさらに、下記の実施例を引用して説明する。
【実施例】
【0124】
下記の実施例は本発明の好適な態様類を示すが、それらは、全ての態様を例示することを意図していない。これらの実施例は、付属の請求の範囲及び/又は本発明の範囲を限定するものではない。
【0125】
実施例1
γ−(4−トリフルオロメチルクマリニル)ddGTP(γCF3クマリン−ddGTP)の調製
ddGTP(純度96%を超える46.4mM溶液200μl)を、無水ジメチルホルムアミド(DMF、2×0.5ml)とともに共蒸発した。これに、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC、9.6mg、5当量)を添加し、混合物を再度、無水DMF(0.5ml)とともに共蒸発した。残渣を無水DMF(0.5ml)に取り、混合物を一晩、攪拌した。約20%の環化されていない三リン酸がまだ存在していた(おそらく、カラム上での環状三メタリン酸の加水分解によるのであろう)。この混合物に対して、さらにDCC 2当量を添加し、2時間攪拌後、7−ハイドロキシ−4−トリフルオロメチルクマリン(4−トリフルオロメチルウンベリフェロン、42.7mg、20当量)とトリエチルアミン(26μl、20当量)を添加し、混合物を室温で攪拌した。2日後、HPLC(0.1Mトリエチルアンモニウム酢酸(TEAA)中0−30%のアセトニトリルにより15分間、30−50%のアセトニトリルにより5分間及び50−100%のアセトニトリルにより10分間、C18 3.9×150mmカラム、流速1ml/分)により、9.7分のところに新規産物が示され、出発環式三リン酸が示された(254nmにおいて、77対5)。混合物をさらにもう1日攪拌した。P−31 NMRにより、反応混合物の主成分としてガンマ標識ヌクレオシド−三リン酸が示された。反応混合物をロータリエバポレータで濃縮した。残渣を水で抽出した(5×1ml)。HPLCにより、254nmにおいて純度82%及び335nmにおいて81%が示された。水溶液をまとめ、ロータリエバポレータで濃縮し、水で再度溶解させた(1ml)。流速15ml/分で0.1Mトリエチルアンモニウムバイカーボネート(TEAB,pH8.3)中0−30%アセトニトリルを30分間、30−50%アセトニトリルを10分間用いて、1インチ×300cmのC18カラムで精製した。生成物ピークを、3個の分画で採取した。分画1は、上記と同じ調製HPLC方法により再度精製したが、ただしTEAB緩衝液のpHはCO2を通気することにより6.7に低下させた。生成物ピークを濃縮し、MeOH(2回)と水(1回)で共蒸発させた。サンプルを水1mlに溶解させた。HPLCは、254nmと335nmにおいて99%を超える純度を示した。UVにより、322nmにおける吸光係数11,000を示す濃縮物2.2mM(7−ハイドロキシ−4−トリフルオロメチルクマリンのベータガラクトシド誘導体について報告、Molecular Probes Catalog)が示された。MS:M−=702.18(理論値702.31)、UVλA=253,276&322nm。ddGTPのガンマリン酸に結合したトリフルオロクマリン色素は、322nmの励起最大値を有しかつ約415nmの発光最大値を有する蛍光である。前記リン酸エステルを加水分解すると遊離クマリン色素が放出され、そのスペクトルは、約385nmの励起最大と約502nmの発光最大に変化する。この変化は、簡易な蛍光測定又は色の変化により容易に検出される。ガンマヌクレオチド類の合成は、一般的に、Arzumanov,A.ら、J.Biol.Chem(1996)、10月4日、271(40):24389−94に記載されている。
【0126】
【化26】
【0127】
γ−(4−トリフルオロメチルクマリニル)ジデオキシグアノシン−5′−三リン酸(γCF3クマリン−ddGTP)
実施例2
γ−(3−シアノクマリニル)ddATP(γCNクマリン−ddATP)の調製
ddATP(純度96%を超える89mM溶液100μl)を、無水DMF(2×1ml)とともに共蒸発した。これに、DCC(9.2mg、5当量)を添加し、混合物を再度、無水DMF(1ml)とともに共蒸発した。残渣を無水DMF(0.5ml)に取り、反応物を室温で攪拌した。一晩した後、7−ハイドロキシ−3−シアノクマリン(33.3mg、20当量)とTEA(25μl、20当量)を添加し、混合物を室温で攪拌した。1日後、主成分(254nmにおいて55%)が8.1分後に観察され、別のマイナーな産物(約10%)が10分で観察された。もう1日しても有意な変化が起こらなかった。反応混合物をロータリエバポレータで濃縮し、残渣を水3×2mlで抽出した後、ろ過した。水溶液を濃縮し、流速15ml/分で0.1M TEAB(pH6.7)中0−30%アセトニトリルを30分間、30−50%アセトニトリルを10分間用いて、C−18カラムで精製した。主ピークを、3個の分画で採取した。主ピーク(分画2)のHPLCは、254nmにおいて純度95.6%及び335nmにおいて98.1%の純度を示した。それをロータリエバポレータで(室温で)濃縮し、MeOH(2×)と水(1×)で共蒸発した。残渣を水0.5mlに溶解させた。サンプル5μlを希釈し、UV分析用に1mlに希釈した。A346nm=0.784。吸光係数20,000(7−エトキシ−3−シアノクマリンについて報告されている、Molecular Probes Catalog)を想定すると、濃度は7.84mMであった。収率=3.92μM、44%。サンプルは、再度、上記と同一方法を用いてC−18カラムで精製した。サンプルピークは、3個の分画で採取した。分画2&3は254nmにおいて98%を超える純度を有しており、340nmにおいては99.5%を超えており、それらをまとめた。濃縮後、残渣をMeOH(2×)と水(1×)で共蒸発した。サンプルを水(1ml)に溶解させ、2.77mM溶液を得た。MS:M−=642.98au(理論値643.00au)、UVλA=263&346nm。ddATPのガンマリン酸に結合したシアノクマリン色素は、346nmの励起最大値を有しかつ約411nmの発光最大値を有する蛍光である。前記リン酸エステルを加水分解すると遊離クマリン色素が放出され、そのスペクトルは、約408nmの励起最大と約450nmの発光最大に変化する。この変化は、簡易な蛍光測定又は色の変化により容易に検出される。ガンマヌクレオチド類の合成は、一般的に、Arzumanov,A.ら、J.Biol.Chem(1996)、10月4日、271(40):24389−94に記載されている。
【0128】
【化27】
【0129】
γ−(3−シアノクマリニル)ジデオキシアデノシン−5′−三リン酸(γCNクマリン−ddATP)
実施例3
δ−9H(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン−7−イル)−ジデオキシチミジン−5′−四リン酸(ddT4P−DDAO)の調製
ddTTP(80mM溶液100μl)を、無水ジメチルホルムアミド(DMF、2×1ml)とともに共蒸発した。これに、ジシクロゲキシルカルボジイミド(8.3mg、5当量)を添加し、混合物を再度、無水DMF(1ml)とともに共蒸発した。残渣を無水DMF(1ml)に取り、反応物を室温で一晩、攪拌した。HPLCにより、ほとんどが環化された三リン酸(約82%)を示していた。この反応混合物を濃縮し、残渣を無水ジエチルエーテルで3回洗浄した。それを再度、無水DMFに溶解させ、ロータリエバポレータで乾燥するまで濃縮した。残渣を、200μlの無水DMF中にDDAO−一リン酸アンモニウム塩(5mg、1.5当量)とともに入れ、週末中ずっと40℃で攪拌した。HPLCは、所望のUV特徴を11.96分に有する新規生成物が形成されたことを示していた。(HPLC法: 0.1Mトリエチルアンモニウム酢酸(pH7)中0.30%のアセトニトリルにより15分間、30−50%のアセトニトリルにより5分間、Novapak C−18 3.9×150mmカラム、流速1ml/分)。LCMS(ES−)はまた、M−1ピークについて主要マスピーク834を示した。反応混合物を濃縮し、Deltapak C18、19×300mmカラムで0.1M TEAB(pH6.7)とアセトニトリルを用いて精製した。生成物を有する分画を、上記と同様の方法を用いてHPLCによって精製した。純粋な生成物を含む分画を濃縮し、MeoH(2×)と水(1×)で共蒸発させた。残渣を水(1.2ml)に溶解させ、1.23mM溶液を得た。254nmにおけるHPLC純度は、97.5%を超えており、455nmにおいては、96%を超えていた、UVλA=267nmと455nm、MS:M−1=834.04(理論値8.33.95)。δ−9H(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン−7−イル)−ジデオキシシチジン−5′−四リン酸(ddC4P−DDAO)、δ−9H(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン)−ジデオキアデノシン−5′−四リン酸(ddA4P−DDAO)、及びδ−9H(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン−イル)−ジデオキシグアノシン−5′−四リン酸(ddG4P−DDAO)を、同様に合成し精製した。これらの精製化合物類の分析により、下記のデータを得た:ddC4P−DDAO:UVλA=268nmと454nm、MS:M−1=819.32(理論値818.96)、ddA4P−DDAO:UVλA=263nmと457nm、MS:M−1=843.30(理論値842.97)、ddG4P−DDAO:UVλA=257nmと457nm、MS:M−1=859.40(理論値858.97)。
【0130】
【化28】
【0131】
実施例4
ε−9H(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン−7−イル)−ジデオキシチミジン−5′−五リン酸DDAO−ddT−五リン酸(ddT5P−DDAO)
A.DDAOピロリン酸の調製
DDAO−リン酸ジアンモニウム塩(11.8μmol)を無水DMF(3×10.25ml)とともに共蒸発し、DMF(0.5ml)に溶解させた。これに、カルボニルジイミダゾール(CDI、9.6mg、5当量)を添加し、混合物を室温で一晩、攪拌した。過剰のCDIをMeoH(5μl)を添加し30分間攪拌することによって分解した。この混合物に対し、トリブチルアンモニウムジハイドロゲンリン酸(10当量、0.5M DMF溶液236ml)を添加し、この混合物を室温で4日間攪拌した。反応混合物をロータリエバポレータで濃縮した。残渣を緩衝液Aとして0.1M TEAB/アセトニトリル(3:1)及び緩衝液Bとして1M TEAB/アセトニトリル(3:1)を用いて0−100%Bを用いるHiPrep 16.10 Q XLカラムで精製した。主ピーク(HPLC純度98%)を採取し、濃縮しメタノール(2×)で共蒸発した。残渣を水1mlに溶解させ、5.9mM溶液を得た。UV/VISλmax=456nm。
B.ddT5P−DDAOの調製
ddTTP(47.5mM水溶液100μl)を無水DMF(2×1ml)とともに共蒸発した。これに対して、DCC(5当量、4.9mg)を添加し、混合物をDMF(1×1ml)とともに共蒸発した。残渣を無水DMF(0.5ml)にとり、室温で3時間攪拌した。これに対して、別に無水DMF(2×1ml)とともに共蒸発したDDAOピロリン酸1.03当量をDMF溶液として添加した。この混合物を乾燥するまで濃縮し、その後、無水DMF200μlに取った。混合物を38℃で2日間加熱した。反応混合物を濃縮し、水で希釈し、ろ過し、2段階勾配を用いて0−100%A−BによりHiTrap 5ml イオン交換カラムで精製した。溶媒A=0.1M TEAB/アセトニトリル(3:1)及び溶媒B=1M TEAB/アセトニトリル(3:1)。生成物の大半を含む分画12×13をまとめ、濃縮しメタノール(2×)で共蒸発した。残渣を5カラム容量の0.30%アセトニトリルの0.1MTEAB溶液と2カラム容量の30−50%アセトニトリルを用いて、流速10ml/分でXterra RP C−18 30−100mmカラムで再度精製した。純粋な生成物を含む分画を濃縮し、メタノール(2×)と水(1×)で共蒸発した。455nmにおけるHPLC純度は99%を超えていた。UV/VIS=268nm及び455nm。MS:M−1=914.03(理論値913.93)。
【0132】
これらのポリリン酸類の末端リン酸に結合したDDAO色素は、励起最大455nm及び発光最大約608nmにおいて蛍光性である。リン酸エステルを加水分解させ遊離色素を放出させると、前記スペクトルが変化し、励起最大約645nm及び発光最大約659nmであった。この変化は、単純に蛍光測定値又は色変化によって容易に検出される。
【0133】
【化29】
【0134】
実施例5
A)dCTP−ジアミノヘプチル−REG(dCTP−NH(CH2)7−NH−REG又はdCTP−DAH−REGの合成
【0135】
【化30】
【0136】
a:dCTP−トリエチルアンモニウム塩10μmolをトリブチルアミン40μmolと混合し、乾燥するまで蒸発させた。残渣を乾燥するまで2回、無水DMFと共蒸発させた。これをDMF1mlに再度溶解させ、DCC50μmolを添加し、乾燥するまで蒸発させた。この混合物を無水DMF1mlに溶解させ、室温で一晩、攪拌した。
b:ジアミノへプタン500μmolを無水DMF5mlに溶解し、乾燥するまで蒸発させた。この後、乾燥DMFによる共蒸発を2回行った。残渣を乾燥DMF2mlに溶解させた。この溶液をDCC−dCTP反応物(16時間のDCC−dCTP反応後)とまとめた。4時間後、HPLCは、ジアミノヘプチルdCTPに86%が変換したことを示していた。
【0137】
反応物を水で25mlに希釈しNaOHによりpH12に調整した。この混合物をジエチルエーテルで2回、抽出した。水相を蒸発させ、エーテルを除去した。化合物を、0.1M TEAB/アセトニトリル勾配を用いてDelta pakカラム19×300で精製した。純粋なdCTP−NH(CH2)7NH2を示す分画をまとめて、乾燥するまで濃縮した。残渣をエタノールで2回、共蒸発させた。化合物を水(2ml)に再度溶解させた。UV/Vis分光分析による収率は6.4μmolであった。Xterra RP C18 4.6×150mmカラム、0.1M TEAB/MeCN勾配(0−15%MeCN)15分によるHPCL分析:滞留時間4.55分。λmax270nm。
c:dCTP−ジアミノへプタン(上記より)1μmolを0.1M NaHCO3pH9.3により400μlに希釈した。これに対して、200μlDMF中5−REG NHSエステル2μmolを添加した。反応は、室温で2時間進行させた。反応物を水で10mlに希釈し、HR10/10Mono Qカラムに載せた。カラムを0.1M TEAB/25% アセトニトリルから1M TEAB/25%アセトニトリルまでの勾配により溶出した。dCTP−DAH−REGを含む分画をまとめ、乾燥するまで濃縮し、エタノールによる共蒸発を2回、行った。生成物を水で溶解し、収量190nmolを得た。
B)dA4P−ジアミノヘプチル−TAMRA(dA4P−NH(CH2)7−NH−TAMRAの合成
【0138】
【化31】
【0139】
a:dA4Pの合成:TEA dATP200μmolをトリブチルアミン1mMと混合し、乾燥するまで濃縮させた。残渣を無水ピリジンで1回共蒸発させ、乾燥DMFでもう1回行った。dATPを乾燥DMF5mlに再度溶解させ、カルボニルジイミダゾール1mMを添加した。反応物を4時間攪拌した。4時間後、メタノール8μlを添加し30分間攪拌した。次に、TBA−H2PO41mMを添加し、反応物を室温で一晩、攪拌した。
【0140】
反応物を水で25mlに希釈し、Q Sepharose XL16/10カラムで0.1M TEABから1M TEABの勾配pH6.8を用いて精製した。生成物を含む分画を、Xterra RP C18 19×100カラムにのせ、0.1M TEAB/アセトニトリル勾配で溶出した。純粋な生成物を含む分画を、乾燥するまで濃縮させ、メタノールで2回、共蒸発させた。dA4PをHPCLでアッセイした(Xterra RP C18 4.6×150 0.1M TEAA/MeCN 0−40%、12分間)。純度98%。滞留時間4.95分。収量110μM。
b:dA4−ジアミノヘプチルの合成:下記の試薬類をまとめた:
水2ml中dA4P 50μmol、0.2M 1−メチルイミダゾール−HCl、pH6を2.5ml、EDAC96mg、及びジアミノへプタン162mg。pHは、HClで6に調整し、反応を5時間進行させた。反応物を水で50mlに希釈し、Q Sepharose XL16/10カラムにのせ、0.1M TEAB/1M TEABの0−100%勾配で溶出させた。純粋な生成物を含む分画をまとめて、乾燥するまで濃縮させ、メタノールで2回、共蒸発させた。HPLC:Xterra RP C18 0−80% 0.1M TEAA/アセトニトリル12分。純度85%。滞留時間4.4分。収量7μM。
c:dA4P−ジアミノへプチル−TAMRAの合成:dA4P−ジアミノヘプチル2.5μMを0.1M NaHCO3 pH9.2 500μlに溶解させ、DMF400μlに溶解させたTAMRA5−NHSエステル3.5mgと混合した。反応は、室温で一晩進行させた。反応物を水で10mlに希釈し、HR10/10Mono Qカラムで0.1M TEAB/25% MeCNから1M TEAB/25%MeCNまでの勾配により精製した。生成物を含む分画を濃縮し、アセトニトリルを除去し、Xterra RP C18 19×100カラムに載せ、0−40%の0.1M TEAB/アセトニトリル勾配で溶出した。純粋な生成物を含む分画を乾燥するまで濃縮し、メタノールで2回、共蒸発させた。HPLC:Xterra RP 4.6×150mm、0.1M TEAA/アセトニトリル勾配。純度99%。収量450nM。
【0141】
上記実施例1−5に記載のものに類似の方法を用いて、末端リン酸に結合した色素類又は他の検出可能部分を有する類似のヌクレオチド化合物類もまた、作製できたことに注意されたい。これらには、リボヌクレオチド類、デオキシリボヌクレオチド類、ヌクレオシド−四リン酸類、天然塩基類(アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ヒポキサンチン及びウラシル)ならびに修飾塩基類又は修飾糖類のいずれかを有するヌクレオチド類が含まれる。
【0142】
下記の実施例6及び7では、末端リン酸に結合した色素誘導体を有するジデオキシヌクレオチド類が基質類として、成長する核酸中に核酸検出のためのテンプレート特異的プロセスにおいて核酸ポリメラーゼによって効果的に取り込まれることを示す。
【0143】
実施例6
ガンマリン酸標識ddGTPのポリメラーゼ取り込みによる核酸配列検出
反応は、実施例(1)のジデオキシヌクレオチドを用いて、室温(23℃)で組み立てた。反応物は、dC又はdTのいずれかにより、プライマーの3′末端に隣接する次のテンプレートヌクレオチドとしてそれぞれ配列番号2及び配列番号3に対応する2つの異なるオリゴヌクレオチドテンプレート類のひとつにアニーリングさせた単一ヌクレオチドプライマー(配列番号1によって表される)を有するプライマー−テンプレート組合せを含有していた。
【0144】
【化32】
【0145】
ここで図1について説明すると、本実施例におけるテンプレート1(配列番号2)について、DNAポリメラーゼはこのプライマーを標識ddGTPにより伸長させると考えられる。同様に、図1のテンプレート2(配列番号3)について、DNAポリメラーゼはこのプライマーを標識ddGTPではなくddATPにより伸長させると考えられる
反応条件:25mM Tris,pH8.0、5%グリセロール、5mM MgCl2,0.5mM ベータ−メルカプトエタノール、0.01% tween−20、0.25単位のエビアルカリホスファターゼ、テンプレート(次のテンプレートヌクレオチドは、示したようにdCMP又はdTMPのいずれかである)にアニーリングさせた100nMプライマー、及び2μM ddGTP−CF3−クマリンを含む反応物70μlを、LS−55ルミネセンススペクトロメータ(Perkin Elmer)中の石英蛍光超ミクロチューブ中で調製し、タイムドライブモードで作動させた。励起及び発光波長は、それぞれ、390nmと500nmであった。スリット幅は、励起スリットについて5nmとし、発光スリットについて15nmであった。反応を、3′、5′エキソヌクレアーゼ活性、5′、3′エキソヌクレアーゼ活性及びジデオキシヌクレオチド類に対する識別を消滅させるように遺伝子工学で作製したクローニングしたDNAポリメラーゼIを0.35μl(11単位)と0.25mM MnCl2を添加し、開始させた。
【0146】
図1に示したように、ガンマ標識ddGTPを含む反応について、色素発光は、プライマー:テンプレート1によってのみ検出されたが、テンプレート中の次のヌクレオチドは、dCであった。エビアルカリホスファターゼによりホスホリル移動のピロリン酸生成物を切断すると、CF3−クマリン標識に検出可能な変化が起こり、核酸検出を可能とする。検出可能な色素発光は、プライマー:テンプレート2では、得られなかった。
【0147】
実施例7
ガンマリン酸標識ddATPのポリメラーゼ取り込みによる核酸配列検出
反応は、実施例(2)のジデオキシヌクレオチドを用いて、室温(23℃)で組み立てた。反応物は、dC又はdTのいずれかによりプライマーの3′末端に隣接するテンプレートヌクレオチドとしてそれぞれ配列番号2及び配列番号3に対応する2つの異なるオリゴヌクレオチドテンプレート類のひとつにアニーリングさせた単一ヌクレオチドプライマー(配列番号1)を有するプライマー:テンプレート組合せを含有していた。
【0148】
ここで図2について説明すると、本実施例におけるテンプレート2(配列番号3)について、DNAポリメラーゼはこのプライマーを標識ddATPにより伸長させると考えられる。同様に、図2のテンプレート1(配列番号2)について、DNAポリメラーゼはこのプライマーを標識ddATPではなくddGTPにより伸長させると考えられる
反応条件:25mM Tris、pH8.0、5%グリセロール、5mM MgCl2、0.5mM ベータ−メルカプトエタノール、0.01% tween−20、0.25単位のエビアルカリホスファターゼ、テンプレートにアニーリングさせた100nMプライマー、及び2μM ddATP−CN−クマリンを含む反応物70μlを、LS−55ルミネセンススペクトロメータ(Perkin Elmer)中の石英蛍光超ミクロチューブ中で調製し、タイムドライブモードで作動させた。励起及び発光波長は、それぞれ、410nmと450nmであった。スリット幅は、励起スリットについて5nmとし、発光スリットについて15nmであった。反応を、3′−5′エキソヌクレアーゼ活性、5′−3′エキソヌクレアーゼ活性及びジデオキシヌクレオチド類に対する識別を消滅させるように遺伝子工学で作製したクローニングしたDNAポリメラーゼIを0.35μl(11単位)と0.25mM MnCl2を添加し、開始させた。
【0149】
図2に示したように、ガンマ標識ddATPを含む反応について、色素発光は、プライマー:テンプレート2によってのみ検出されたが、テンプレート中の次のヌクレオチドは、dTであった。エビアルカリホスファターゼによりホスホリル移動のピロリン酸生成物を切断すると、CN−クマリン標識に検出可能な変化が起こり、核酸検出を可能とする。検出可能な色素発光は、プライマー:テンプレート1により得られなかった。
【0150】
実施例8−13は、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類を用いた核酸ポリメラーゼ反応におけるマンガンの重要性を示している。
【0151】
実施例8
マグネシウム又はマンガンを含有する緩衝液中におけるリン酸標識ヌクレオチド類対塩基標識ヌクレオチド類の相対的取り込み速度
反応物(10μl、50℃、10分)は、1×反応緩衝液(25mM HEPES 8.5、0.01%tween−20)、活性化DNA3μg(染色体DNA)、5mMのMnCl2(丸)又はMgCl2(四角)のいずれか、FAM−TAM−11−ddTTP(点線)又はddT4P−DDAO(実線)のいずれか1μMと、1回の反応当たり10単位から1回の反応当たり0.01単位としたThermo Sequenase I(商標) DNAポリメラーゼを4倍ずつ希釈した溶液を含んでいた。結果(図3)を、線型及び対数スケールの両者でプロットし、酵素と相対的取り込み効率に対して両者とも直線性であることを示している。この結果、マグネシウム緩衝液に対してマンガン緩衝液における塩基標識ヌクレオチドの取りこみ効率が1.4倍低下したが、マグネシウム緩衝液に対してマンガン緩衝液中でリン酸標識ヌクレオチドの取りこみ効率が28倍増加したことを示している。
【0152】
実施例9
5mM塩化マグネシウム存在下におけるdGTP−DAH−REGの取りこみに及ぼす種々の濃度の塩化マンガンの効果
下記の反応混合物を調製した:200nM dGTP−DAH−REG(DAH=ジアミノヘプチルリンカー)、100nM プライマー/テンプレート、0.01mg/ml Phi 29 exo−、25mM Tris pH8、50mM KCl、1mM ベータメルカプトエタノール、エビアルカリホスファターゼ0.25単位、5mM MgCl2、及び種々の濃度のMnCl2。取りこみ速度は、REG−ピロリン酸放出に伴うREG蛍光の傾きの変化を測定することによって測定した。図4は、検討した濃度範囲でMnCl2添加により有意に速度が大きくなることを明らかにしている。
【0153】
【化33】
【0154】
実施例10
MgCl2を添加しないMnCl2存在下における核酸合成
上記の操作を用いて、dGTP−DAH−REGの取りこみ速度を、プライマー(配列番号1)と正確及び正確でないテンプレート1と2(それぞれ、配列番号2と配列番号3)を用いて測定した。図5に示したように、正確なテンプレートによる速度がミスマッチテンプレートによる速度よりもはるかに速いことを示している。
【0155】
実施例11
dCTP−DAH−ROXの取りこみの忠実性
実施例9と同じプライマー及びテンプレート(配列番号4)を用いて、反応開始後さまざまな時点におけるdCTP−DAH−ROXの取り込みを調べた。アッセイ条件は下記のようであった:総反応容量:30μlで、100nMプライマー/テンプレート、100nM Phi 29 exo−ポリメラーゼ、50mM Tris pH7.5、75mM KCl、0.7mM MnCl2,0.1mM DTT、0.3mg/ml BSA。反応は、濃縮物25μMに対してROX−dCTPを添加することによって開始した。生成物をゲル上で分離し、それらは明らかに、単一塩基の伸長とdCTP−DAH−ROXのそれ以上の取り込みがないことを示しており、強制条件下においてさえも取りこみミスが起こらないことを示唆している。
【0156】
【化34】
【0157】
実施例12
さまざまなポリメラーゼ類による末端リン酸標識ヌクレオチド類の取り込みに及ぼすMnCl2の効果
オリゴdT(35mer)は、各等量を20μM濃度で混合し80℃で4分間インキュベーションし氷上で急激に冷却することによって、ポリdAによりアニーリングした。この溶液1μlを25mM Hepes,pH8.0、0.01% Tween−20,10μM dT4P−DDAO,0.005u/μlBAP、図7に示した濃度のポリメラーゼ及び種々の濃度のMnCl2及びMgCl2を含む反応物20μlに混合した。反応物を、図7に示したように60℃で15分又は30分間インキュベーションした。図7は、試験したすべてのポリメラーゼについて、MnCl2は単独又はMgCl2存在下において取りこみ速度に大きな正の効果を及ぼすことを明らかにしている。実際、MnCl2が存在していないと、速度は非常に遅い。
【0158】
実施例13
4種のガンマ標識dNTP類をすべて用いた伸長合成
実施例9と同一のプライマー/テンプレート(配列番号1及び配列番号2)を用いて、下記の反応を組み立てた。反応容量:70μlで、25mM Tris、pH8.0、50mM KCl、0.7mM MnCl2、0.5mM ベータ−メルカプトエタノール、0.1mg/mlBSA、0.005単位/μl SAP、それぞれ75nMのプライマー及びテンプレート、それぞれ1μMのDDAO−dNTP(ここで、N=A、T、G、C)及び0.12mg/mlのPhi 29 exo−ポリメラーゼを6μl含んで反応を開始した。図8に示したように、核酸合成は、およそ30分で完了した。マンガン不在下でほとんどか又は全く合成は起こらなかった。
【0159】
実施例14
標識と末端リン酸の間にリンカーを有する末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類の取りこみ速度に及ぼすリンカー類の効果
さまざまなリンカーを有する下記末端リン酸標識ヌクレオチド類を調べた:TAMRA−NH−リンカー−NH−dTTP(2′−デオキシチミジン誘導体)及びREG−NH−リンカーdATP。リンカーは図9に示し、さらに得られたデータも示した。プライマー及びテンプレート配列は、実施例9に述べたものであるが、ただし、取りこみ部位のテンプレート塩基は、入ってくるヌクレオチドの塩基に依存して、さまざまであった(SEQ ID 1,3及び5)。
【0160】
【化35】
【0161】
25mM Tris、pH8.0、50mM KCl、5% グリセロール、1mM ベータ−メルカプトエタノール、0.25単位のSAP、0.5mM MgCl2,0.125mM MnCl2,100nMプライマー/テンプレート、1μMヌクレオチド及び150nMΔTts ポリメラーゼを含む70μlのサンプルを調製し、30℃でインキュベーションした。反応混合物を異なる時点でゲル上に流し、取りこみ量を求めた。明らかなように、短いリンカー(ジオキシプロパン)を有する末端リン酸標識ヌクレオシド三リン酸は、このポリメラーゼには余りよく受け入れられていない。程度は異なるものの残りは受け入れられ、ヘプチルが最良である。
【0162】
実施例15
異なるDNAポリメラーゼによる取りこみ速度に対して末端リン酸と色素部分の間のリンカーにポリペプチドを添加することが有する効果
dNTPに結合させた最適リンカー(末端リン酸と色素部分の間のNH(CH2)7NH)の取りこみ速度を、さらにペンタリシンを結合させたdNTPと比較した。いくつかの異なるDNAポリメラーゼ類を本研究に用いて、ヌクレオチド取り込みに及ぼすリンカー中のリシン部分の効果を確認した。反応は、下記に示したように実施し、結果を下記の表5に示した。
【0163】
【表3】
【0164】
【化36】
【0165】
反応混合物は、10nM Cy5−20merプライマー(配列番号1)と40merのオリゴヌクレオチドテンプレート(上記に示した配列番号5)、20mM Tris−HCl、0.01% Tween20、5mM MgCl2,0.5mM MnCl2,1mM DTT,バクテリアルアルカリホスファターゼ(BAP)及び100mMの末端リン酸標識ヌクレオチド及びDNAポリメラーゼを含んでいた。
a.DNAポリメラーゼを除いて全成分を混合し0.0015U/μlのBAP存在下25℃で5分間インキュベーションし、標識されていないヌクレオチドをすべて加水分解した。
b.反応混合物1μlを時点ゼロで取り除き、95%ホルムアミド/25mM EDTA4μl中でクエンチングさせた。
c.DNAポリメラーゼ1μlを添加し反応を開始させた。異なる時点でアリコット2μlを取り(短い時間コースでは、15、30及び60秒)、95%ホルムアミド/25mM EDTA8μl中でクエンチングさせた。
d.サンプルを沸騰水中で4分間変性させ、氷で急激に冷却し、2μlを25%(19:1−アクリルアミド:ビスアクリルアミド)、8M尿素、1×TBE PAGEに載せた。ゲルを約1時間、500Vで流した。
e.DNA生成物をStorm860で可視化し、21mer生成物に変換された20merプライマーの総量分画を計算することによって定量した。
【0166】
上記表5から、ペンタ−リシン結合ヌクレオチドが、異なるポリメラーゼ類によってC7結合ヌクレオチドよりもはるかに効率的に取り込まれることが明らかである。
【0167】
実施例16
リンカーを有していない三、四、及び五リン酸類と色素と末端リン酸の間にC7又はTEGリンカーを有する上記リン酸類とのPhi29 DNAポリメラーゼを用いた取り込み速度の比較
下記のプライマー/テンプレートを使用した A(デオキシグアノシンアナログ用、配列番号1及び配列番号2)及びB(チミジンアナログ用、配列番号1及び配列番号5)
【0168】
【化37】
【0169】
上記実施例15で報告したものと同じ操作を用いた。結果を下記の表16に示した。
【0170】
【表4】
【0171】
これらのデータは、リンカー中にさらにリン酸類があると取りこみ速度を高めることを明確に示しており、例えば、化合物3対1でわかる。さらに、TEGリンカーがジアミノヘプチル(NH(CH2)7NH)リンカーよりも優れており、化合物2対1及び化合物5対4でわかる。
【0172】
色素上にさらに負の電荷があると、取りこみ速度を高め、それは、化合物4対3(色素上に負の電荷)でわかる。
【0173】
上記に記載の本発明の教示の恩恵を受ける当該技術の当業者は、それに対して数多くの変更を行うことができる。これらの変更も、付属の請求の範囲に示したような本発明の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【0174】
【図1】ホスファターゼ存在下テンプレート特異的プロセスにおけるガンマ−リン酸標識ddGTPのポリメラーゼ利用によって得られた蛍光を示すグラフである。
【図2】ホスファターゼ存在下テンプレート特異的プロセスにおけるガンマ−リン酸標識ddATPのポリメラーゼ利用によって得られた蛍光を示すグラフである。
【図3】補因子としてのMg++又はMn++の存在下における塩基標識ジデオキシヌクレオチド類とリン酸標識ジデオキシヌクレオチド類の取り込みを示したグラフである。
【図4】5mM固定濃度のMgCl2存在下、エキソヌクレアーゼ欠乏Phi29 DNAポリメラーゼを用いたγ−ローダミン−6G標識GTPの取り込みに及ぼすMnCl2の効果を示したグラフである。
【図5】異なる濃度でMnCl2のみが存在している時の末端リン酸標識ヌクレオチド類の取り込みを示すグラフである。
【図6】MnCl2単独存在下、エキソヌクレアーゼ欠乏Phi29DNAポリメラーゼによるdCTP−γ−ROXの取り込みを示したグラフである。Mn単独存在下では、取り込みミスは観察されなかった。
【図7A−E】Mg++単独存在、Mn++単独存在及びMg++及びMn++塩類混合物存在下におけるポリAテンプレート上での異なるDNAポリメラーゼによる末端リン酸標識−ddT4P(ddT4P−DDAO)の取り込みを示す一連のグラフである。
【図8】MnCl2存在下、4種の末端リン酸標識ヌクレオチド類を全て用い、テンプレートとして20merオリゴヌクレオチドプライマーと40merのオリゴヌクレオチドを用いた40merのDNA合成を示すゲルファイルである。
【図9】リンカーを有する末端リン酸標識ヌクレオチド類の取り込み量に及ぼす種々のリンカー類の効果を示した。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸からの酵素触媒ヌクレオシド一リン酸移動速度を高め前記酵素又は前記末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の活性を検出する方法で、
a)マンガン塩を含む反応緩衝液中における末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸反応から前記酵素触媒ヌクレオシド一リン酸移動を行なわせ、それによって、マンガン不在下における反応速度を上回るように前記反応速度を高めること
を含む、方法。
【請求項2】
前記酵素が核酸ポリメラーゼ、リガーゼ、テロメラーゼ、プリマーゼ又はヌクレオチドハイドロラーゼから選択される請求項1記載の方法。
【請求項3】
前記核酸ポリメラーゼが、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素又は末端トランスフェラーゼ類から選択される請求項2記載の方法。
【請求項4】
前記ポリメラーゼが、Phi29 DNAポリメラーゼ、クレノウexo−、シークエナーゼ(Sequenase)、Taq DNAポリメラーゼ、Thermo Sequenase I、Thermo Sequenase II,Thermo Sequenase E681M、T.hypogea(ThyB)、T.neapolitana(Tne)、T.subterranea(Tsu)、T.barossii(Tba)、T.litoralis(NEB Vent)、T.kodakaraensis(Novagen)、P.furiosis(Strategene)、P.GB−D(NEB Deep Vent)、Human Pol beta,Tsp JS1,AMV−逆転写酵素、MMLV−逆転写酵素及びHIV−逆転写酵素から選択される請求項2記載の方法。
【請求項5】
マンガン塩の濃度が以上0.01mMである請求項1記載の方法。
【請求項6】
マンガン塩濃度が、0.01乃至50mMの間である請求項1記載の方法。
【請求項7】
マンガン塩濃度が、0.1乃至10mMの間である請求項1記載の方法。
【請求項8】
マンガン以外に他の金属塩もまた末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸とともに存在する請求項1記載の方法。
【請求項9】
前記他の金属塩が、マグネシウム又はカルシウム塩である請求項8記載の方法。
【請求項10】
前記他の金属塩が、0.01mM乃至50mMの濃度で存在する請求項8記載の方法。
【請求項11】
さらに金属イオン緩衝液存在下で前記反応を行なわせ遊離金属イオン濃度を調節することを含む請求項1記載の方法。
【請求項12】
前記金属イオン緩衝液がジカルボン酸である請求項11記載の方法。
【請求項13】
核酸配列の存在を検出する方法で、
a)マンガン塩存在下で請求項3記載の核酸ポリメラーゼ反応を行なわせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類の利用速度を高め、前記ポリメラーゼ反応が、1種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド類を反応させること及び標識ポリリン酸を生成させることを含み、
b)前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、検出可能な種を産生させること、及び
c)前記検出可能な種の存在を検出すること
を含む、方法
【請求項14】
段階(a)がさらにホスファターゼ存在下で前記ポリメラーゼ反応を行なわせることを含む請求項13記載の方法。
【請求項15】
前記核酸配列がRNAである請求項13記載の方法。
【請求項16】
段階a)がさらに、明確な標識類を有する2種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド類の存在下で前記ポリメラーゼ反応を行なわせることを含む請求項13記載の方法。
【請求項17】
前記標識類が、化学発光化合物類、蛍光源性色素類、発色源性色素類、質量タグ類、電気化学的タグ類及びその組合せから構成される群から選択される酵素活性化可能な標識類である請求項16記載の方法。
【請求項18】
前記1種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドが前記ポリリン酸鎖中に4個以上のリン酸基を含む請求項13記載の方法。
【請求項19】
さらに前記核酸配列を定量化する段階を含む請求項13記載の方法。
【請求項20】
前記検出可能な種が核酸配列量に実質的に比例する量で産生される請求項13記載の方法。
【請求項21】
前記核酸配列が天然又は合成オリゴヌクレオチドである請求項13記載の方法。
【請求項22】
前記核酸配列が染色体又は染色体の一部である請求項13記載の方法。
【請求項23】
前記核酸配列がDNAである請求項13記載の方法。
【請求項24】
前記ポリメラーゼ反応がさらに、1種以上のDNA又はRNAポリメラーゼの存在下で核酸配列をインキュベーションする段階を含む請求項13記載の方法。
【請求項25】
さらに、前記ポリメラーゼ反応において1種以上の他の検出試薬類を含む段階を含む請求項13記載の方法。
【請求項26】
前記他の検出試薬類が、前記検出可能な種と検出可能な程異なる応答が可能である請求項25記載の方法。
【請求項27】
前記他の検出試薬が抗体である請求項25記載の方法。
【請求項28】
前記検出可能な種が、色、蛍光発光、化学発光、質量変化、還元/酸化電位及びその組合せから構成される群から選択された性質により検出可能である請求項13記載の方法。
【請求項29】
前記検出可能な種によって産生されたスペクトルを公知のスペクトルと比較することによって前記核酸配列を定量化する段階をさらに含む請求項13記載の方法。
【請求項30】
核酸配列中の単一ヌクレオチドを同定確認する方法で、
a)請求項13記載のポリメラーゼ反応を行なわせること、及び
b)取り込まれたヌクレオシドを同定すること
を含む、方法。
【請求項31】
前記1種以上の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類の1種以上が4個以上のリン酸基を含む請求項13記載の核酸配列存在検出方法。
【請求項32】
前記末端リン酸標識ヌクレオチドが、式I:
【化1】
(式中、
P=リン酸(PO3)とその誘導体類であり、nは2以上であり、
Yは、酸素又はイオウ原子であり、
Bは、窒素含有複素環塩基であり、
Sは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、
P−Lは、リン酸を除去すると独立して検出可能となるリン酸化標識であり、
ここでLは、リン酸エステル、チオエステル、又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能標識である)によって表される請求項13記載の方法。
【請求項33】
前記酵素活性化可能な標識が、化学発光化合物類、蛍光源性色素類、発色源性色素類、質量タグ類、電気化学的タグ類及びその組合せから構成される群から選択される請求項32記載の方法。
【請求項34】
前記リン酸化標識が、2−(5′−クロロ−2′−ホスホリルオキシフェニル)−6−クロロ−4−(3H)−キナゾリノン、フルオレセインジホスフェート、フルオレセイン3′(6′)−O−アルキル−6′(3′)−リン酸、9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン−イル)リン酸、4−メチルウンベリフェリルリン酸、レゾルフィンリン酸、4−トリフルオロメチルウンベリフェリルリン酸、ウンベリフェリルリン酸、3−シアノウンベリフェリルリン酸、9,9−ジメチルアクリジン−2−オン−7−イルリン酸、6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルリン酸、及びその誘導体類から構成される群から選択された蛍光源性部分である請求項32記載の方法。
【請求項35】
前記リン酸化標識が、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルリン酸、3−インドリルリン酸、p−ニトロフェニルリン酸、及びその誘導体類から構成される群から選択された発色源性部分である請求項32記載の方法。
【請求項36】
前記化学発光化合物がホスファターゼ活性化1,2−ジオキセタン化合物である請求項32記載の方法。
【請求項37】
前記1,2−ジオキセタン化合物が、2−クロロ−5−(4−メトキシスピロ[1,2−ジオキセタン−3,2′−(5−クロロ−)トリシクロ[3,3,1−13,7]−デカン]−1−イル)−1−フェニルリン酸、クロロアダマンチ−2′−イリデンメトキシフェノキシリン酸化ジオキセタン、3−(2′−スピロアダマンタン)−4−メトキシ−4−(3″−ホスホリルオキシ)フェニル−1,2−ジオキセタン及びその誘導体類から構成される群から選択される請求項36記載の方法。
【請求項38】
前記糖部分が、リボシル、2′−デオキシリボシル、3′−デオキシリボシル、2′、3′−ジデオキシリボシル、2′、3′−ジデハイドロジデオキシリボシル、2′−アルコキシリボシル、2′−アジドリボシル、2′−アミノリボシル、2′−フルオロリボシル、2′−メルカプトリボキシル、2′−アルキルチオリボシル、環式炭素、非環式及び他の修飾糖類から構成される群から選択される請求項32記載の方法。
【請求項39】
前記塩基が、ウラシル、チミン、シトシン、5−メチルシトシン、グアニン、7−デアザグアニン、ヒポキサンチン、7−デアザヒポキサンチン、アデニン、7−デアザアデニン、2,6−ジアミノプリン及びそのアナログ類から構成される群から選択される請求項32記載の方法。
【請求項40】
a)式I
【化2】
(式中、
P=リン酸(PO3)とその誘導体類であり、nは2以上であり、
Yは、酸素又はイオウ原子であり、
Bは、窒素含有複素環塩基であり、
Sは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、
P−Lは、リン酸を除去すると独立して検出可能となるリン酸化標識であり、
ここでLは、リン酸エステル、チオエステル、又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能標識である)による1種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
b)DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、又は逆転写酵素の1種以上、
c)ホスファターゼ、及び
d)マンガン塩を含む反応緩衝液、
を含む核酸検出キット。
【請求項41】
a)式I
【化3】
(式中、
P=リン酸(PO3)とその誘導体類であり、nは2以上であり、
Yは、酸素又はイオウ原子であり、
Bは、窒素含有複素環塩基であり、
Sは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、
P−Lは、リン酸を除去すると独立して検出可能となるリン酸化標識であり、
ここでLは、リン酸エステル、チオエステル、又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能標識である)による1種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
b)1種以上のDNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、又は逆転写酵素、
c)ホスファターゼ、
d)マンガン塩を含む反応緩衝液、及び
e)金属イオン結合緩衝液、
を含む核酸検出キット。
【請求項42】
前記糖部分が、リボシル、2′−デオキシリボシル、3′−デオキシリボシル、2′、3′−ジデハイドロジデオキシリボシル、2′、3′−ジデオキシリボシル、2′−アルコキシリボシル、2′−アジドリボシル、2′−アミノリボシル、2′−フルオロリボシル、2′−メルカプトリボシル、2′−アルキルチオリボシル、環式炭素、非環式及び他の修飾糖類から構成される群から選択される請求項40又は41のいずれか1項に記載のキット。
【請求項43】
前記塩基が、ウラシル、チミン、シトシン、5−メチルシトシン、グアニン、7−デアザグアニン、ヒポキサンチン、7−デアザヒポキサンチン、アデニン、7−デアザアデニン、2,6−ジアミノプリン及びそのアナログ類から構成される群から選択される請求項40又は41のいずれか1項に記載のキット。
【請求項44】
前記標識が、化学発光化合物類、蛍光化合物類、着色色素類、蛍光源性色素類、発色源性色素類、質量タグ類、電気化学的タグ類及びその組合せから構成される群から選択される請求項40又は41のいずれか1項に記載のキット。
【請求項45】
前記末端リン酸標識ヌクレオチドが、式
【化4】
(式中、
P=リン酸(PO3)とその誘導体類であり、nは2以上であり、
Yは、酸素又はイオウ原子であり、
Bは、窒素含有複素環塩基であり、
Sは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、
P−Lは、LとPの間にリンカーを有するリン酸化標識であり、
ここでLは、リン酸エステル、チオエステル、アルキルフォスフォネート、又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基、ハロアルキル基、又はアミノ基を含む標識である)によって表わすことができる請求項13記載の方法。
【請求項46】
前記標識が、蛍光色素類、着色色素類、化学発光化合物類、蛍光源性色素類、発色源性色素類、質量タグ類、電気化学的タグ類又はその組合せから構成される群から選択される請求項45記載の方法。
【請求項47】
前記標識が、フルオロセイン類、ローダミン類、シアニン類、ピレン類、ダンシル類、クマリン類、テキサスレッド、アレキサ色素類、ロドール色素類、オレゴングリーン類及びその誘導体類から構成される群から選択された蛍光部分である請求項45記載の方法。
【請求項48】
前記糖部分が、リボシル、2′−デオキシリボシル、3′−デオキシリボシル、2′、3′−ジデオキシリボシル、2′、3′−ジデハイドロジデオキシリボシル、2′−アルコキシリボシル、2′−アジドリボシル、2′−アミノリボシル、2′−フルオロリボシル、2′−メルカプトリボキシル、2′−アルキルチオリボシル、環式炭素、非環式及び他の修飾糖類から構成される群から選択される請求項45記載の方法。
【請求項49】
前記塩基が、ウラシル、チミン、シトシン、5−メチルシトシン、グアニン、7−デアザグアニン、ヒポキサンチン、7−デアザヒポキサンチン、アデニン、7−デアザアデニン、2,6−ジアミノプリン及びそのアナログ類から構成される群から選択される請求項45記載の方法。
【請求項50】
a)式I
【化5】
(式中、
P=リン酸(PO3)とその誘導体類であり、nは2以上であり、
Yは、酸素又はイオウ原子であり、
Bは、窒素含有複素環塩基であり、
Sは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、
P−Lは、LとPの間にリンカーを有するリン酸化標識であり、
ここでLは、リン酸エステル、チオエステル、アルキルフォスフォネート又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基、ハロアルキル基、又はアミノ基を含む標識である)による1種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
b)1種以上のDNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、又は逆転写酵素、及び
c)マンガン塩を含む反応緩衝液、
を含む核酸検出キット。
【請求項51】
a)式I
【化6】
(式中、
P=リン酸(PO3)とその誘導体類であり、nは2以上であり、
Yは、酸素又はイオウ原子であり、
Bは、窒素含有複素環塩基であり、
Sは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、
P−Lは、LとPの間にリンカーを有するリン酸化標識であり、
ここでLは、リン酸エステル、チオエステル、アルキルフォスフォネート又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基、ハロアルキル基、又はアミノ基を含む標識である)による1種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
b)1種以上のDNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、又は逆転写酵素、
c)マンガン塩を含む反応緩衝液、及び
d)金属イオン結合緩衝液、
を含む核酸検出キット。
【請求項52】
前記糖部分が、リボシル、2′−デオキシリボシル、3′−デオキシリボシル、2′、3′−ジデハイドロジデオキシリボシル、2′、3′−ジデオキシリボシル、2′−アルコキシリボシル、2′−アチドリボシル、2′−アミノリボシル、2′−フルオロリボシル、2′−メルカプトリボシル、2′−アルキルチオリボシル、環式炭素、非環式及び他の修飾糖類から構成される群から選択される請求項50又は51のいずれか1項に記載のキット。
【請求項53】
前記塩基が、ウラシル、チミン、シトシン、5−メチルシトシン、グアニン、7−デアザグアニン、ヒポキサンチン、7−デアザヒポキサンチン、アデニン、7−デアザアデニン、2,6−ジアミノプリン及びそのアナログ類から構成される群から選択される請求項50又は51のいずれか1項に記載のキット。
【請求項54】
前記標識が、化学発光化合物類、蛍光化合物類、着色色素類、蛍光源性色素類、発色源性色素類、質量タグ類、電気化学的タグ類及びその組合せから構成される群から選択される請求項50又は51のいずれか1項に記載のキット。
【請求項55】
式:
【化7】
(式中、
Lは、検出可能部分であり、
x及びyは、独立してCH2、NH,O又はSから選択され、
Zは、1個以上の複素原子を含みかつ適宜、正又は負の荷電を有する直線状、分枝状、環式、飽和又は非飽和炭化水素であり、ポリリン酸は、四リン酸又はそれよりも高次のリン酸であり、糖は、天然又は修飾糖であり、塩基は、天然又は修飾されたDNA又はRNA塩基である)
の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸。
【請求項56】
単位としてのx−Z−yが、ジアミノへプタン、ジアミノシクヘキサン、ジアミノキシレン、p−アミノフェノール、9−(2−アミノエチル)−トリエチレングリコール、アミノ−トリエチレングリコール、アミノ−テトラエチレングリコール、ジアミノヘプチル−リシン類、エチレン又は高級グリコール類、ジアミノヘプチルペンタリシン、又は2−(2−アミノエトキシ)エタノールから構成される群から選択される請求項55記載の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸。
【請求項57】
前記糖部分が、リボシル、2′−デオキシリボシル、3′−デオキシリボシル、2′、3′−ジデオキシリボシル、2′、3′−ジデハイドロジデオキシリボシル、2′−アルコキシリボシル、2′−アジドリボシル、2′−アミノリボシル、2′−フルオロリボシル、2′−メルカプトリボキシル、2′−アルキルチオリボシル、環式炭素、非環式及び他の修飾糖類から構成される群から選択される請求項55記載の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸。
【請求項58】
前記塩基が、ウラシル、チミン、シトシン、5−メチルシトシン、グアニン、7−デアザグアニン、ヒポキサンチン、7−デアザヒポキサンチン、アデニン、7−デアザアデニン、2,6−ジアミノプリン及びそのアナログ類から構成される群から選択される請求項55に記載の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸。
【請求項59】
下記構造:
【化8】
(式中、
Labelは、リンカーを有していても有していなくてもよいNPPに結合した検出可能部分であり、NPPは、4個以上のリン酸類を有するヌクレオシドポリリン酸であり、及びxは1以上である)
の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸のマンガン錯体。
【請求項60】
xが1又は10である請求項59記載の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸のマンガン錯体。
【請求項61】
前記ヌクレオシドポリリン酸が天然又は修飾ヌクレオシドである請求項59記載の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸のマンガン錯体。
【請求項62】
Lが、構造x−Z−yのリンカーを介してNPPに結合している請求項59記載の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸のマンガン錯体。
【請求項63】
単位としてのx−Z−yが、ジアミノへプタン、ジアミノシクヘキサン、ジアミノキシレン、p−アミノフェノール、9−(2−アミノエチル)−トリエチレングリコール、アミノ−トリエチレングリコール、アミノ−テトラエチレングリコール、ジアミノヘプチル−リシン類、グリコール類、ジアミノヘプチルペンタリシン、又は2−(2−アミノエトキシ)エタノールから構成される群から選択される請求項62記載の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸のマンガン錯体。
【請求項64】
a)式II:
【化9】
(式中、
Labelは、リンカーを有していても有していなくてもよいNPPに結合した検出可能部分であり、
NPPは、4個以上のリン酸類を有するヌクレオシドポリリン酸であり、及びxは1以上である)の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の1種以上のマンガン錯体、及び
b)核酸ポリメラーゼ、
を含む核酸検出キット。
【請求項65】
a)式II:
【化10】
(式中、
Labelは、リンカーを有していても有していなくてもよいNPPに結合した検出可能部分であり、
NPPは、4個以上のリン酸類を有するヌクレオシドポリリン酸であり、及びxは1以上である)の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の1種以上のマンガン錯体、
b)核酸ポリメラーゼ、及び
c)金属イオン結合緩衝液、
を含む核酸検出キット。
【請求項66】
前記標識が、化学発光化合物類、蛍光化合物類、着色色素類、蛍光源性色素類、発色源性色素類、質量タグ類、電気化学的タグ類及びその組合せから構成される群から選択される請求項64又は65のいずれか1項に記載のキット。
【請求項1】
末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸からの酵素触媒ヌクレオシド一リン酸移動速度を高め前記酵素又は前記末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の活性を検出する方法で、
a)マンガン塩を含む反応緩衝液中における末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸反応から前記酵素触媒ヌクレオシド一リン酸移動を行なわせ、それによって、マンガン不在下における反応速度を上回るように前記反応速度を高めること
を含む、方法。
【請求項2】
前記酵素が核酸ポリメラーゼ、リガーゼ、テロメラーゼ、プリマーゼ又はヌクレオチドハイドロラーゼから選択される請求項1記載の方法。
【請求項3】
前記核酸ポリメラーゼが、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素又は末端トランスフェラーゼ類から選択される請求項2記載の方法。
【請求項4】
前記ポリメラーゼが、Phi29 DNAポリメラーゼ、クレノウexo−、シークエナーゼ(Sequenase)、Taq DNAポリメラーゼ、Thermo Sequenase I、Thermo Sequenase II,Thermo Sequenase E681M、T.hypogea(ThyB)、T.neapolitana(Tne)、T.subterranea(Tsu)、T.barossii(Tba)、T.litoralis(NEB Vent)、T.kodakaraensis(Novagen)、P.furiosis(Strategene)、P.GB−D(NEB Deep Vent)、Human Pol beta,Tsp JS1,AMV−逆転写酵素、MMLV−逆転写酵素及びHIV−逆転写酵素から選択される請求項2記載の方法。
【請求項5】
マンガン塩の濃度が以上0.01mMである請求項1記載の方法。
【請求項6】
マンガン塩濃度が、0.01乃至50mMの間である請求項1記載の方法。
【請求項7】
マンガン塩濃度が、0.1乃至10mMの間である請求項1記載の方法。
【請求項8】
マンガン以外に他の金属塩もまた末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸とともに存在する請求項1記載の方法。
【請求項9】
前記他の金属塩が、マグネシウム又はカルシウム塩である請求項8記載の方法。
【請求項10】
前記他の金属塩が、0.01mM乃至50mMの濃度で存在する請求項8記載の方法。
【請求項11】
さらに金属イオン緩衝液存在下で前記反応を行なわせ遊離金属イオン濃度を調節することを含む請求項1記載の方法。
【請求項12】
前記金属イオン緩衝液がジカルボン酸である請求項11記載の方法。
【請求項13】
核酸配列の存在を検出する方法で、
a)マンガン塩存在下で請求項3記載の核酸ポリメラーゼ反応を行なわせ、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類の利用速度を高め、前記ポリメラーゼ反応が、1種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド類を反応させること及び標識ポリリン酸を生成させることを含み、
b)前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させ、検出可能な種を産生させること、及び
c)前記検出可能な種の存在を検出すること
を含む、方法
【請求項14】
段階(a)がさらにホスファターゼ存在下で前記ポリメラーゼ反応を行なわせることを含む請求項13記載の方法。
【請求項15】
前記核酸配列がRNAである請求項13記載の方法。
【請求項16】
段階a)がさらに、明確な標識類を有する2種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド類の存在下で前記ポリメラーゼ反応を行なわせることを含む請求項13記載の方法。
【請求項17】
前記標識類が、化学発光化合物類、蛍光源性色素類、発色源性色素類、質量タグ類、電気化学的タグ類及びその組合せから構成される群から選択される酵素活性化可能な標識類である請求項16記載の方法。
【請求項18】
前記1種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドが前記ポリリン酸鎖中に4個以上のリン酸基を含む請求項13記載の方法。
【請求項19】
さらに前記核酸配列を定量化する段階を含む請求項13記載の方法。
【請求項20】
前記検出可能な種が核酸配列量に実質的に比例する量で産生される請求項13記載の方法。
【請求項21】
前記核酸配列が天然又は合成オリゴヌクレオチドである請求項13記載の方法。
【請求項22】
前記核酸配列が染色体又は染色体の一部である請求項13記載の方法。
【請求項23】
前記核酸配列がDNAである請求項13記載の方法。
【請求項24】
前記ポリメラーゼ反応がさらに、1種以上のDNA又はRNAポリメラーゼの存在下で核酸配列をインキュベーションする段階を含む請求項13記載の方法。
【請求項25】
さらに、前記ポリメラーゼ反応において1種以上の他の検出試薬類を含む段階を含む請求項13記載の方法。
【請求項26】
前記他の検出試薬類が、前記検出可能な種と検出可能な程異なる応答が可能である請求項25記載の方法。
【請求項27】
前記他の検出試薬が抗体である請求項25記載の方法。
【請求項28】
前記検出可能な種が、色、蛍光発光、化学発光、質量変化、還元/酸化電位及びその組合せから構成される群から選択された性質により検出可能である請求項13記載の方法。
【請求項29】
前記検出可能な種によって産生されたスペクトルを公知のスペクトルと比較することによって前記核酸配列を定量化する段階をさらに含む請求項13記載の方法。
【請求項30】
核酸配列中の単一ヌクレオチドを同定確認する方法で、
a)請求項13記載のポリメラーゼ反応を行なわせること、及び
b)取り込まれたヌクレオシドを同定すること
を含む、方法。
【請求項31】
前記1種以上の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸類の1種以上が4個以上のリン酸基を含む請求項13記載の核酸配列存在検出方法。
【請求項32】
前記末端リン酸標識ヌクレオチドが、式I:
【化1】
(式中、
P=リン酸(PO3)とその誘導体類であり、nは2以上であり、
Yは、酸素又はイオウ原子であり、
Bは、窒素含有複素環塩基であり、
Sは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、
P−Lは、リン酸を除去すると独立して検出可能となるリン酸化標識であり、
ここでLは、リン酸エステル、チオエステル、又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能標識である)によって表される請求項13記載の方法。
【請求項33】
前記酵素活性化可能な標識が、化学発光化合物類、蛍光源性色素類、発色源性色素類、質量タグ類、電気化学的タグ類及びその組合せから構成される群から選択される請求項32記載の方法。
【請求項34】
前記リン酸化標識が、2−(5′−クロロ−2′−ホスホリルオキシフェニル)−6−クロロ−4−(3H)−キナゾリノン、フルオレセインジホスフェート、フルオレセイン3′(6′)−O−アルキル−6′(3′)−リン酸、9H−(1,3−ジクロロ−9,9−ジメチルアクリジン−2−オン−イル)リン酸、4−メチルウンベリフェリルリン酸、レゾルフィンリン酸、4−トリフルオロメチルウンベリフェリルリン酸、ウンベリフェリルリン酸、3−シアノウンベリフェリルリン酸、9,9−ジメチルアクリジン−2−オン−7−イルリン酸、6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルリン酸、及びその誘導体類から構成される群から選択された蛍光源性部分である請求項32記載の方法。
【請求項35】
前記リン酸化標識が、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルリン酸、3−インドリルリン酸、p−ニトロフェニルリン酸、及びその誘導体類から構成される群から選択された発色源性部分である請求項32記載の方法。
【請求項36】
前記化学発光化合物がホスファターゼ活性化1,2−ジオキセタン化合物である請求項32記載の方法。
【請求項37】
前記1,2−ジオキセタン化合物が、2−クロロ−5−(4−メトキシスピロ[1,2−ジオキセタン−3,2′−(5−クロロ−)トリシクロ[3,3,1−13,7]−デカン]−1−イル)−1−フェニルリン酸、クロロアダマンチ−2′−イリデンメトキシフェノキシリン酸化ジオキセタン、3−(2′−スピロアダマンタン)−4−メトキシ−4−(3″−ホスホリルオキシ)フェニル−1,2−ジオキセタン及びその誘導体類から構成される群から選択される請求項36記載の方法。
【請求項38】
前記糖部分が、リボシル、2′−デオキシリボシル、3′−デオキシリボシル、2′、3′−ジデオキシリボシル、2′、3′−ジデハイドロジデオキシリボシル、2′−アルコキシリボシル、2′−アジドリボシル、2′−アミノリボシル、2′−フルオロリボシル、2′−メルカプトリボキシル、2′−アルキルチオリボシル、環式炭素、非環式及び他の修飾糖類から構成される群から選択される請求項32記載の方法。
【請求項39】
前記塩基が、ウラシル、チミン、シトシン、5−メチルシトシン、グアニン、7−デアザグアニン、ヒポキサンチン、7−デアザヒポキサンチン、アデニン、7−デアザアデニン、2,6−ジアミノプリン及びそのアナログ類から構成される群から選択される請求項32記載の方法。
【請求項40】
a)式I
【化2】
(式中、
P=リン酸(PO3)とその誘導体類であり、nは2以上であり、
Yは、酸素又はイオウ原子であり、
Bは、窒素含有複素環塩基であり、
Sは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、
P−Lは、リン酸を除去すると独立して検出可能となるリン酸化標識であり、
ここでLは、リン酸エステル、チオエステル、又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能標識である)による1種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
b)DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、又は逆転写酵素の1種以上、
c)ホスファターゼ、及び
d)マンガン塩を含む反応緩衝液、
を含む核酸検出キット。
【請求項41】
a)式I
【化3】
(式中、
P=リン酸(PO3)とその誘導体類であり、nは2以上であり、
Yは、酸素又はイオウ原子であり、
Bは、窒素含有複素環塩基であり、
Sは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、
P−Lは、リン酸を除去すると独立して検出可能となるリン酸化標識であり、
ここでLは、リン酸エステル、チオエステル、又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能標識である)による1種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
b)1種以上のDNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、又は逆転写酵素、
c)ホスファターゼ、
d)マンガン塩を含む反応緩衝液、及び
e)金属イオン結合緩衝液、
を含む核酸検出キット。
【請求項42】
前記糖部分が、リボシル、2′−デオキシリボシル、3′−デオキシリボシル、2′、3′−ジデハイドロジデオキシリボシル、2′、3′−ジデオキシリボシル、2′−アルコキシリボシル、2′−アジドリボシル、2′−アミノリボシル、2′−フルオロリボシル、2′−メルカプトリボシル、2′−アルキルチオリボシル、環式炭素、非環式及び他の修飾糖類から構成される群から選択される請求項40又は41のいずれか1項に記載のキット。
【請求項43】
前記塩基が、ウラシル、チミン、シトシン、5−メチルシトシン、グアニン、7−デアザグアニン、ヒポキサンチン、7−デアザヒポキサンチン、アデニン、7−デアザアデニン、2,6−ジアミノプリン及びそのアナログ類から構成される群から選択される請求項40又は41のいずれか1項に記載のキット。
【請求項44】
前記標識が、化学発光化合物類、蛍光化合物類、着色色素類、蛍光源性色素類、発色源性色素類、質量タグ類、電気化学的タグ類及びその組合せから構成される群から選択される請求項40又は41のいずれか1項に記載のキット。
【請求項45】
前記末端リン酸標識ヌクレオチドが、式
【化4】
(式中、
P=リン酸(PO3)とその誘導体類であり、nは2以上であり、
Yは、酸素又はイオウ原子であり、
Bは、窒素含有複素環塩基であり、
Sは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、
P−Lは、LとPの間にリンカーを有するリン酸化標識であり、
ここでLは、リン酸エステル、チオエステル、アルキルフォスフォネート、又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基、ハロアルキル基、又はアミノ基を含む標識である)によって表わすことができる請求項13記載の方法。
【請求項46】
前記標識が、蛍光色素類、着色色素類、化学発光化合物類、蛍光源性色素類、発色源性色素類、質量タグ類、電気化学的タグ類又はその組合せから構成される群から選択される請求項45記載の方法。
【請求項47】
前記標識が、フルオロセイン類、ローダミン類、シアニン類、ピレン類、ダンシル類、クマリン類、テキサスレッド、アレキサ色素類、ロドール色素類、オレゴングリーン類及びその誘導体類から構成される群から選択された蛍光部分である請求項45記載の方法。
【請求項48】
前記糖部分が、リボシル、2′−デオキシリボシル、3′−デオキシリボシル、2′、3′−ジデオキシリボシル、2′、3′−ジデハイドロジデオキシリボシル、2′−アルコキシリボシル、2′−アジドリボシル、2′−アミノリボシル、2′−フルオロリボシル、2′−メルカプトリボキシル、2′−アルキルチオリボシル、環式炭素、非環式及び他の修飾糖類から構成される群から選択される請求項45記載の方法。
【請求項49】
前記塩基が、ウラシル、チミン、シトシン、5−メチルシトシン、グアニン、7−デアザグアニン、ヒポキサンチン、7−デアザヒポキサンチン、アデニン、7−デアザアデニン、2,6−ジアミノプリン及びそのアナログ類から構成される群から選択される請求項45記載の方法。
【請求項50】
a)式I
【化5】
(式中、
P=リン酸(PO3)とその誘導体類であり、nは2以上であり、
Yは、酸素又はイオウ原子であり、
Bは、窒素含有複素環塩基であり、
Sは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、
P−Lは、LとPの間にリンカーを有するリン酸化標識であり、
ここでLは、リン酸エステル、チオエステル、アルキルフォスフォネート又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基、ハロアルキル基、又はアミノ基を含む標識である)による1種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
b)1種以上のDNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、又は逆転写酵素、及び
c)マンガン塩を含む反応緩衝液、
を含む核酸検出キット。
【請求項51】
a)式I
【化6】
(式中、
P=リン酸(PO3)とその誘導体類であり、nは2以上であり、
Yは、酸素又はイオウ原子であり、
Bは、窒素含有複素環塩基であり、
Sは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、
P−Lは、LとPの間にリンカーを有するリン酸化標識であり、
ここでLは、リン酸エステル、チオエステル、アルキルフォスフォネート又はホスホルアミデート結合を天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸において形成するのに適した水酸基、スルフィドリル基、ハロアルキル基、又はアミノ基を含む標識である)による1種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
b)1種以上のDNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、又は逆転写酵素、
c)マンガン塩を含む反応緩衝液、及び
d)金属イオン結合緩衝液、
を含む核酸検出キット。
【請求項52】
前記糖部分が、リボシル、2′−デオキシリボシル、3′−デオキシリボシル、2′、3′−ジデハイドロジデオキシリボシル、2′、3′−ジデオキシリボシル、2′−アルコキシリボシル、2′−アチドリボシル、2′−アミノリボシル、2′−フルオロリボシル、2′−メルカプトリボシル、2′−アルキルチオリボシル、環式炭素、非環式及び他の修飾糖類から構成される群から選択される請求項50又は51のいずれか1項に記載のキット。
【請求項53】
前記塩基が、ウラシル、チミン、シトシン、5−メチルシトシン、グアニン、7−デアザグアニン、ヒポキサンチン、7−デアザヒポキサンチン、アデニン、7−デアザアデニン、2,6−ジアミノプリン及びそのアナログ類から構成される群から選択される請求項50又は51のいずれか1項に記載のキット。
【請求項54】
前記標識が、化学発光化合物類、蛍光化合物類、着色色素類、蛍光源性色素類、発色源性色素類、質量タグ類、電気化学的タグ類及びその組合せから構成される群から選択される請求項50又は51のいずれか1項に記載のキット。
【請求項55】
式:
【化7】
(式中、
Lは、検出可能部分であり、
x及びyは、独立してCH2、NH,O又はSから選択され、
Zは、1個以上の複素原子を含みかつ適宜、正又は負の荷電を有する直線状、分枝状、環式、飽和又は非飽和炭化水素であり、ポリリン酸は、四リン酸又はそれよりも高次のリン酸であり、糖は、天然又は修飾糖であり、塩基は、天然又は修飾されたDNA又はRNA塩基である)
の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸。
【請求項56】
単位としてのx−Z−yが、ジアミノへプタン、ジアミノシクヘキサン、ジアミノキシレン、p−アミノフェノール、9−(2−アミノエチル)−トリエチレングリコール、アミノ−トリエチレングリコール、アミノ−テトラエチレングリコール、ジアミノヘプチル−リシン類、エチレン又は高級グリコール類、ジアミノヘプチルペンタリシン、又は2−(2−アミノエトキシ)エタノールから構成される群から選択される請求項55記載の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸。
【請求項57】
前記糖部分が、リボシル、2′−デオキシリボシル、3′−デオキシリボシル、2′、3′−ジデオキシリボシル、2′、3′−ジデハイドロジデオキシリボシル、2′−アルコキシリボシル、2′−アジドリボシル、2′−アミノリボシル、2′−フルオロリボシル、2′−メルカプトリボキシル、2′−アルキルチオリボシル、環式炭素、非環式及び他の修飾糖類から構成される群から選択される請求項55記載の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸。
【請求項58】
前記塩基が、ウラシル、チミン、シトシン、5−メチルシトシン、グアニン、7−デアザグアニン、ヒポキサンチン、7−デアザヒポキサンチン、アデニン、7−デアザアデニン、2,6−ジアミノプリン及びそのアナログ類から構成される群から選択される請求項55に記載の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸。
【請求項59】
下記構造:
【化8】
(式中、
Labelは、リンカーを有していても有していなくてもよいNPPに結合した検出可能部分であり、NPPは、4個以上のリン酸類を有するヌクレオシドポリリン酸であり、及びxは1以上である)
の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸のマンガン錯体。
【請求項60】
xが1又は10である請求項59記載の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸のマンガン錯体。
【請求項61】
前記ヌクレオシドポリリン酸が天然又は修飾ヌクレオシドである請求項59記載の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸のマンガン錯体。
【請求項62】
Lが、構造x−Z−yのリンカーを介してNPPに結合している請求項59記載の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸のマンガン錯体。
【請求項63】
単位としてのx−Z−yが、ジアミノへプタン、ジアミノシクヘキサン、ジアミノキシレン、p−アミノフェノール、9−(2−アミノエチル)−トリエチレングリコール、アミノ−トリエチレングリコール、アミノ−テトラエチレングリコール、ジアミノヘプチル−リシン類、グリコール類、ジアミノヘプチルペンタリシン、又は2−(2−アミノエトキシ)エタノールから構成される群から選択される請求項62記載の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸のマンガン錯体。
【請求項64】
a)式II:
【化9】
(式中、
Labelは、リンカーを有していても有していなくてもよいNPPに結合した検出可能部分であり、
NPPは、4個以上のリン酸類を有するヌクレオシドポリリン酸であり、及びxは1以上である)の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の1種以上のマンガン錯体、及び
b)核酸ポリメラーゼ、
を含む核酸検出キット。
【請求項65】
a)式II:
【化10】
(式中、
Labelは、リンカーを有していても有していなくてもよいNPPに結合した検出可能部分であり、
NPPは、4個以上のリン酸類を有するヌクレオシドポリリン酸であり、及びxは1以上である)の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の1種以上のマンガン錯体、
b)核酸ポリメラーゼ、及び
c)金属イオン結合緩衝液、
を含む核酸検出キット。
【請求項66】
前記標識が、化学発光化合物類、蛍光化合物類、着色色素類、蛍光源性色素類、発色源性色素類、質量タグ類、電気化学的タグ類及びその組合せから構成される群から選択される請求項64又は65のいずれか1項に記載のキット。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図8】
【図9】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図8】
【図9】
【公表番号】特表2006−524040(P2006−524040A)
【公表日】平成18年10月26日(2006.10.26)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2006−503342(P2006−503342)
【出願日】平成16年2月5日(2004.2.5)
【国際出願番号】PCT/US2004/003284
【国際公開番号】WO2004/072238
【国際公開日】平成16年8月26日(2004.8.26)
【出願人】(598041463)ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・コーポレイション (43)
【住所又は居所原語表記】800 Centennial Avenue, P.O.Box 1327,Piscataway,New Jersey 08855−1327,United States of America
【Fターム(参考)】
【公表日】平成18年10月26日(2006.10.26)
【国際特許分類】
【出願日】平成16年2月5日(2004.2.5)
【国際出願番号】PCT/US2004/003284
【国際公開番号】WO2004/072238
【国際公開日】平成16年8月26日(2004.8.26)
【出願人】(598041463)ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・コーポレイション (43)
【住所又は居所原語表記】800 Centennial Avenue, P.O.Box 1327,Piscataway,New Jersey 08855−1327,United States of America
【Fターム(参考)】
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