新規微生物
【課題】通常、バクテリアは新しい環境（培地）に置かれると、増殖を開始する前に増殖準備期間といわれる誘導期が数時間存在するが、本発明の目的は、その期間が全くなく、即座に対数増殖を開始する非溶血性の新規微生物を提供する。
【解決手段】Bacillus sp.ＯＹＫ−０１−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９４）、Bacillus sp.ＯＹＫ−０３−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９５）またはBacillus sp.ＯＹＫ−０４−０００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９６）である。その特徴は、ＯＹＫ菌が対数増殖している期間に他の菌は殆ど増殖しない時期が数時間存在し、この数時間だけをみるとＯＹＫの菌数は他の菌に比べて数万倍となる。ＯＹＫ菌はそれ自身、有害菌（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌を含む黄色ブドウ球菌など）に抗菌活性を示すが、上述したような増殖スピードの差が悪臭発生菌や多くの有害感染菌を抑制する。
【解決手段】Bacillus sp.ＯＹＫ−０１−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９４）、Bacillus sp.ＯＹＫ−０３−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９５）またはBacillus sp.ＯＹＫ−０４−０００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９６）である。その特徴は、ＯＹＫ菌が対数増殖している期間に他の菌は殆ど増殖しない時期が数時間存在し、この数時間だけをみるとＯＹＫの菌数は他の菌に比べて数万倍となる。ＯＹＫ菌はそれ自身、有害菌（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌を含む黄色ブドウ球菌など）に抗菌活性を示すが、上述したような増殖スピードの差が悪臭発生菌や多くの有害感染菌を抑制する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は溶血性を有さない新規微生物、及びその利用に関し、詳しくは増殖により悪臭を発生せしめる有害菌（例えば黄色ブドウ球菌、肺炎桿菌など）に対して高い抗菌活性を有し、これにより、例えば排水処理施設より発生する悪臭を除去することができ、また、その他の細菌（例えばメチシリン耐性黄色ブドウ球菌、病原性大腸菌Ｏ−１５７、レジオネラ菌など）に対しても高い抗菌活性を有することから幅広い用途で用いることのできる新規微生物、及びその利用に関する。
【０００２】
なお、本発明の新規微生物における抗菌活性は当該新規微生物の菌体外生成物、及び菌体内生成物によって起こるのみならず、次のようなメカニズムによっても発揮されている。
【０００３】
すなわち、本発明の新規微生物は、例えば１０３個／ｇ（ｍｌ）の菌濃度が ２０〜４０℃の培養条件下にて約２時間で１０６個／ｇ（ｍｌ）の菌濃度に達し、しかも６時間以内に１０８個／ｇ（ｍｌ）に達するといった、増殖開始時から通常では考えられないような急激な増殖スピードで以て繁殖する。ところで、通常の細菌の増殖は、６時間前後の増殖準備期間（菌体が新しい環境に置かれた場合、その環境に順応して増殖を開始するための準備期間）、いわゆる“誘導期”を経たのち行なわれるが、本発明の新規微生物は、前述したように上記“誘導期”が殆どなく、実質的には、培養開始後、速やかに、かつ爆発的に細胞分裂を起こして固体数を殖やしていく。このように、前記雑菌の誘導期において、本発明の微生物が回りの栄養分を貪欲に消化しながら爆発的に繁殖し、これによって前記雑菌の繁殖が抑圧され、結果的に上記した有害菌等に抗菌活性を呈するものと考えられる。すなわち、誘導期を殆ど持たず、培養後、即時に増殖する新規微生物が有害菌の増殖を抑制していると考えられる。
【０００４】
ところで、細菌の中には比較的高温で増殖する高温菌（例えばミクロモノスポラ、ノカルディア、ストレプトマイセスなどの放線菌、アルタナリア、アスペルギルス、ケトミウムなどの糸状菌など）があり、本発明の微生物が極めて短い誘導期を経たのち爆発的に増殖し、これにより増殖系内の温度が５０〜６０℃位になるまで熱を発したのち、前記の高温菌が増殖を開始して更に温度が高まり、外気温が３０℃程度の場合でも１００℃近くに達する。
【背景技術】
【０００５】
最近、例えば排水処理技術のように、微生物を利用した技術が盛んである。排水処理に使用される微生物は多数あるが、そのうち主要なものとしては次のものがあげられる。すなわち、細菌としては、Zooglea、Sphaerotilusなどが、原生動物としてはアメーバー類、繊毛虫類、鞭毛虫類などが、また藻類としては藍藻類、緑藻類、ケイ藻類などがあげられる。
【０００６】
これらは、有機物、及び一部の無機物を分解することが出来るが、その分解時において、悪臭（アンモニア、硫化水素等）及び悪臭発生物質の産生を引き起こす場合があり、そして処理場から発生する悪臭が、しばしば社会問題として取りざたされていた。つまり生物学的処理法に基づく排水処理に於いて有機物質または無機物質の分解が効率よく行われたとしても、処理場から発生する悪臭に関しては放置されたままであった。特に、沈澱槽に沈澱する活性汚泥は次第に嫌気性となり、嫌気性菌の増殖に伴って多量の悪臭が発生するが、この汚泥を曝気槽に返送する際、排水処理場の周辺に多量の悪臭を漂わせた。
【発明の開示】
【０００７】
本発明者らは、上記したような問題の発生を背景にして新たな有用微生物を鋭意探索した結果、ついに、有機物の分解時において硫化水素、メチルメルカプタン等による悪臭を発生せず、しかも増殖により悪臭を発生せしめる細菌Staphylococcus aureusおよびKlebsiella pneumoniaeや、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、病原性大腸菌Ｏ−１５７、レジオネラ菌あるいは緑膿菌などの細菌に対して抗菌性を有する新規な有用微生物を土壌から分離することに成功し、そしてこの新規微生物を幅広い領域で利用できることを見い出し、そして本発明に至った。
【０００８】
本発明の新規微生物は、非溶血性バチルスズブチルス類縁菌で、標準枯草菌 （ＩＦＯ３１３４株）に比較して菌体体積が４倍以上あり、かつ３７℃におけるニュートリエントブロス浸透培養では培養初期に殆ど誘導期がないため１０３個／ｍｌの初期菌数が４時間後に１０７個／ｍｌ以上に増加し、これらの相乗効果により、増殖によって発生する代謝エネルギーが、前記標準枯草菌のそれに比べて１万倍以上になるものであり、黄色ブドウ球菌、肺炎桿菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、病原性大腸菌Ｏ−１５７、レジオネラ菌、緑膿菌、フザリウム、麹カビ、青カビ、白癬菌及びくものすかびに対して抗菌性を有する。
【０００９】
本発明の新規微生物であるバチルスズブチルスの類縁菌の具体例としては下記のＯＹＫ菌（通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに国際寄託されている）が挙げられる。
（１）Bacillus sp.ＯＹＫ−０１−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９４）、
（２）Bacillus sp.ＯＹＫ−０３−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９５）、
（３）Bacillus sp.ＯＹＫ−０４−０００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９６）。
以下、ＯＹＫ−０１−６００、ＯＹＫ−０３−６００、及びＯＹＫ−０４−０００のそれぞれを、単に「ＯＹＫ菌」ともいう。
【００１０】
ＯＹＫ菌はタンパク質を消化してよく繁殖する。また、ＯＹＫ菌は溶血素を産生しない特徴を有し、人に対して安全性の高い菌である。なお、この菌を動物に対して静脈内投与、経気道投与、経口投与および皮膚投与の４種類の投与を行ない、当該菌の安全性が確認されている。
【００１１】
更にＯＹＫ菌は黄色ブドウ球菌、肺炎桿菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、緑膿菌、レジオネラ菌、大腸菌Ｏ−１５７、フザリウム（アカカビ）等に抗菌性を有しているので高濃度のＯＹＫ菌を投与してこの菌の効力を顕著ならしめることで多方面での利用が可能である。また、このＯＹＫ菌は増殖時に、悪臭の源であり、人に対して特に敏感な悪臭であるメチルメルカプタン、硫化水素、トリメチルアミンを生成しないので防臭を必要とする処に用いても効果が発揮される。
【００１２】
一般的に菌密度の大きい方が優勢に増殖する傾向にあるので、最初に投与するときの菌濃度は極めて重要になる。本発明における好ましい菌濃度は、１０６〜１０９個／ｇ（ｍｌ）である。
【００１３】
ＯＹＫ菌はズブチルス種の中でも比較的大型である。例えば、バチルスズブチルスの標準菌（ＩＦＯ−３１３４、（０．４〜０．６×１．５〜３．２μｍ））の約４倍（体積比）である。しかもＯＹＫ菌は培養開始後の初期増殖力に優れ、これにより代謝エネルギーを大量に発生する（標準菌が培養開始後４時間で６倍程度の増殖しかないのに対し、ＯＹＫ菌は約８０，０００倍という極めて高い増殖を行なう）。また、通性嫌気性であることから、好気嫌気の両条件で強い増殖が可能となる。これにより、堆肥化の際に有機性廃棄物を速やかに昇温させ、そして高温菌である放線菌、糸状菌の活動を促すことで堆肥化の期間を短縮できると共に完全な熟成堆肥が得られる。
【００１４】
堆肥は、言うまでもなく農作物の生育のために使用されるもので、堆肥化に用いられた菌を農作物が、或いは人が吸収する可能性があるので、前記菌の安全性は特に重要である。高い熱（７０〜８０℃）履歴を経過した完熟堆肥は、糞中に含まれる雑草の種子はもちろんの事、有害感染菌はすべて死滅しており、言い換えれば消毒されたものと考えられる。このようにして得られた堆肥は、最近、肉牛の畜舎の敷料として利用されている。敷料としてしかれた完熟堆肥は、牛に快適感を与え牛はよく眠る。肉牛は、快適ではない敷料では寝ずに立ち、これによって肉質が硬くなると言われており、完熟堆肥の別の利用方法として注目されている。この点に鑑み、安全性が確認された菌、すなわちＯＹＫ菌を用いることが好ましい。
【００１５】
本発明の新規微生物は抗菌防臭効果に優れている。従って、例えば、排水処理場に用いることにより悪臭を発することなく排水を処理することができる。また、増殖スピードが極めて速いことから、堆肥の製造が、気温が比較的低い冬期の場合でも素早く、しかも完全熟成タイプの堆肥の製造が可能となる。
【００１６】
さらに、本発明の新規微生物から抗菌性物質を精製することができる。そもそもこの微生物は、毒性が少ないとされる土壌由来の微生物より分離精製したものであるので、その抗菌性物質についても人体に対して比較的安全であることから、おむつや生理用ナプキンあるいは風呂水の雑菌増殖抑制など、従来使用できない分野における抗菌加工を可能にするばかりか、繊維分野における製品（衣料、タオルなど）のように従来より抗菌加工が行なわれてきている製品にはみられない穏やかな抗菌性による抗菌加工（アレルギーが起こらない）ができる。
【００１７】
［菌体製剤］
本発明のバチルスズブチルスの類縁菌は、そのままの状態あるいは胞子化した状態で使用することも可能であるが、当該細菌の増殖速度を速やかに上げ（濃度を速やかに上げ）、しかも取扱い易い形態と成すべく、当該細菌を富栄養源に包囲、付着あるいは混入させた菌体製剤として使用されることが好適である。
【００１８】
富栄養源としては、その主成分がタンパク質であることが好ましい。タンパク質としては、大豆、脱脂大豆、おからなどの大豆加工品や大豆滓、大豆を絞った豆乳およびこれを濃縮したものやフリーズドライ化したもの、大豆を粉末化して水などの溶媒に分散あるいは溶解した混合物、穀類に含まれるグルテン、乳に含まれるカゼイン、コラーゲンを熱湯処理したゼラチン、魚粉から得られる魚タンパク質などが挙げられる。その他、富栄養源としては米糠、ふすま、バレイショ、ビール酵母、さとうきび等を用いることが出来る。富栄養源として例えば大豆加工品を用いる場合、固形分が多いものでは菌を直接植え付けた後、粉砕乾燥させて用いる。液状のものでは予め水分をある程度除去して粘状物とし、その後、菌を植え付ける。植え付ける菌の形態としては、培養液を含む生菌の状態で行なう。
【００１９】
菌体製剤の形態としては特に限定はなく、粉末状、粒状、シート状、成型体等が挙げられる。富栄養源の添加物として、本発明の新規微生物に好気性環境をもたらす、多孔質物が考えられ、コーヒー粕、おがくず、パーライト、ゼオライト、活性炭などが挙げられる。菌の増殖にはバランスのとれた炭素、窒素、リン、硫黄の４元素が必要であり、大豆はこれを満足している。さらに、５０℃以上の高温域で増殖する高温菌（放線菌や糸状菌など）を胞子化させた粉体の状態で混在させて本発明の菌体製剤とすることもできる。上述したような富栄養源を用いることで菌濃度１×１０８個／ｇ〜１×１０１０個／ｇが確保されるような菌体製剤を得ることができる。
【００２０】
前記の菌体製剤を有機性廃棄物（生ゴミ）及び排泄物に投入して発酵を促し、堆肥化を図る。本発明の新規微生物は、平均して１０〜５０℃の温度範囲で活発に増殖活動し、より高温で発酵する菌の活動を促進するための環境を速やかに作り出す。そして、高温域ではＯＹＫ菌は温度上昇により死滅、もしくは胞子化し、高温増殖菌の栄養源として取り込まれ、殆ど消滅する。６０℃前後で、系の上部と下部とを入れ替えるような作業（切り返し）を行なえば、未発酵物を菌体に接触させることができ、また好気環境を作ることもでき、切り返しによって一時的にみられる温度降下を打ち消す昇温がのちにあり、全体は完熟堆肥へ進行する。
【００２１】
高密度の細菌を含んだ菌体製剤を有機性廃棄物に投入し、適温での切り返しにより好気発酵を促す。好気発酵時、アンモニアが多少発生するが、混在させたコーヒー粕などの多孔質物がこれを吸着する。この増殖による代謝エネルギーにより、温度が５０℃以上に上がり、これにより高温発酵菌（放線菌、カビ）の活動を促し、７０℃以上の温度になる。この高温により有害微生物及び昆虫は死滅し、植物発育障害をもたらす難分解有機物の分解も促進され、また糞中に混在する雑草の種子も死滅する。このことにより、有機栽培に必要な安全な完熟堆肥が得られる。
【００２２】
［脱臭剤］
本発明の新規微生物は、嫌気発酵によって発生する不快臭（硫化水素、メチルメルカプタン、トリエチルアミン）に対する脱臭剤として使用することもできる。 脱臭剤としては、そのままの状態あるいは胞子化した状態で使用することも可能であるが、前項で述べた菌体製剤を用いることが好ましい。ただ、防臭を目的とする関係上、有穴盤状、球状、平板状、多角形状、網状、多枝状など、単位重量あたりの表面積が大きい形状であることが好ましい。平板状物にパンチング、ドリリングなどの手段で穴を設けたものでも構わない。なお、脱臭剤を水溶性とすることにより使用範囲が広くなって好ましい。
【００２３】
本発明の脱臭剤をそのまま、あるいはネット状の容器に入れて、例えば調理場の流し（シンク）、排水経路（排水口を含む）、動物の飼育場や動物処理場（屠殺場など）あるいは医療現場における汚物処理場やその床や洗浄槽などに用いる。
【００２４】
本発明の新規微生物を防臭剤として使用するに当たり、当該微生物に求められる好適な条件を以下に列挙する。
（１）人にやさしく、かつ高密度微生物群を構成し得る菌体である。
（２）高密度微生物群を持続形成するために、多孔性富栄養源中（臭気を吸収する機能を持つものなど）で培養される。
（３）熱湯中では、胞子を形成して生存し得る性質を有する。
（４）低濃度の残留塩素に耐え得る。
（５）増殖にあたり悪臭を発生しないか、又は発生しても微量である。
（６）高湿度環境下、富栄養源を含有する水溶性固形物に分散した場合、増殖に伴い悪臭を発生する他の微生物（雑菌）の増殖を上回る増殖能を有する。
（７）抗菌性物質を生成して分泌し、低濃度の雑菌類の増殖を阻害する。
（８）例え口に入っても安全である。
【００２５】
［風呂水用雑菌増殖抑制］
本発明の新規微生物を用いて浴槽の水あるいは浴槽の壁面や蓋における雑菌の増殖の抑制と脱臭を行なうこともできる。
【００２６】
［生理対応用品］
本発明の新規微生物を生理対応用品に含ませて用いることもできる。ここでいう生理対応用品とは、人やその他の動物の生理現象に伴う分泌物、排泄物に対処するための用品を指すものであり、例えば生理用ナプキン、おむつ、床ずれ予防シート、肌着などが挙げられるがこれによって限定されるものではない。上掲した生理対応用品のうち、特に有効なものは生理用ナプキンである。すなわち、経血は吸水性の高い高分子素材や繊維素材からなる吸水部材に吸収されるから、当該吸収部材にあらかじめ、本発明の新規微生物、例えばＯＹＫ菌や菌体製剤を含ませておけば、経血吸収領域における有害菌を含む雑菌の繁殖を抑制するとともに脱臭作用を奏する。排泄物の吸収や漏れを防止するおむつに本発明の新規微生物を適用しても同様の作用効果を奏する。すなわち、おむつに新規微生物を適用した場合、排泄物に含まれ悪臭の原因となる雑菌の繁殖を抑制すると共に脱臭作用を奏し、同時に本発明の新規微生物が持つ抗菌活性によって感染症の予防が期待され得る。
【００２７】
上記した生理対応用品にＯＹＫ菌あるいは粉末状のＯＹＫ菌を保持させる方法としては種々考えられるが、対象物に菌が定着しにくい場合はペプトンを含む生理食塩液に粉末状の菌を混合して噴霧器で散布すればよい。また、対象物が濡れているような場合にはむしろ粉末状の菌を直接散布する。その他の方法としては、例えば次のような方法が挙げられる。すなわち、水溶解シートからなる袋体の内部に収納したものを生理対応用品に取着するか、あるいは前記水溶解シートの表面に水溶解性バインダを用いて菌を定着させたものを生理対応用品に取り付ける。水溶解性材料としては澱粉、カゼイン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）等を用いる。
【００２８】
人あるいはその他の動物が長期に亘って床に伏すような場合、床に当接した皮膚において、いわゆる“床ずれ”を起こす。魚類においては、水槽に長時間保管する場合は魚同士の接触によって鱗が損傷したり、魚体の体表においてヌメリが発生する。鳥類においては翼の表面の艶が失われることがある。犬や猫などの愛玩小動物あるいは牛、豚、羊、馬などの家畜では毛並みが不揃いとなる。これらは全て、体表面や獣毛からの分泌物の蓄積や、魚類においては体表に付着した餌の残留物の腐敗が原因で起こる。すなわち、動物の体表面や獣毛からの分泌物が堆積し、当該分泌物に雑菌が繁殖することにより上記したような異常を来すわけである。時には、緑膿菌など皮膚を犯す菌が繁殖する場合もあり、常在菌の健全な繁殖分布が損なわれる。
【００２９】
ＯＹＫ菌は上記した分泌物を分解し、かつ有害な菌に対して抗菌性を示すので、上記したような症例に対しては、ＯＹＫ菌を体表面に対して散布あるいは塗布することにより顕著に改善される。人やその他の動物の皮膚、羽、獣毛にＯＹＫ菌を直接的に散布あるいは塗布するには、ＯＹＫ菌を含む溶液を用いるか、あるいは胞子化した粉末を用いるのが手軽である。粉末を用いる場合は、例えばエアスプレー式の粉体散布器を用いて直接散布する。散布されたＯＹＫ菌の胞子は、生体からの湿気を得て発芽し、分泌物を消化しながら増殖していく。増殖速度は速く、また増殖時にアンモニアを生産しないので、暫くすると臭気が消え、散布箇所がサラサラして獣毛は洗浄した時と同様の感触が得られる。鳥の羽毛にも同様の効果が得られる。また、魚類の棲む水槽にＯＹＫ菌の粉末を投入することにより、体表のぬめりを解消することができ、鱗が仮に損傷しても治癒が速い。この場合は淡水魚が好ましい。散布あるいは塗布されるＯＹＫ菌濃度としては、１×１０６〜１×１０８個／ｇで、菌の富栄養源を併用しても良い。
【００３０】
［抗菌グッズ］
本発明における抗菌グッズとしては、上掲の生理対応用品の他に、ＯＡ機器のケーシング、下敷きや筆箱などの文房具、ＦＡＸや電話機などの通信機器などがあげられる。
【００３１】
［加温グッズ］
加温グッズとしては例えば面状発熱体が挙げられる。菌体製剤は５０〜６０％程度の湿気を帯びると約４０〜５０℃に昇温することが確認されている。したがて、本発明の菌体製剤を、例えば密封容器あるいは密封袋体に入れておき、開封時において湿気に晒された細菌が増殖を始め、これによる代謝エネルギーを前記面状発熱体のエネルギー源とすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明の実施例を説明するが、これらの実施例は本発明を説明するための一例であって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３３】
Ａ．新規微生物スクリーニング
増殖により悪臭を発生する細菌に対して抗菌性を有する微生物を土壌より３菌分離した。土壌菌は一般に毒性が少ないと言われており、このような土壌より分離した前記３つのＯＹＫ菌も人体に対し安全である（やさしい）といえる。
【００３４】
Ｂ．菌株の同定
ここで分離選別した菌体の菌学的性質を下記[1]、[2]に基づいて同定した。即ち
[1] Bergey's Mannual of Determinative Bacteriology、 Vol.2 (1986), Williams & Wilkins U.S.A
[2] R.E.Gordon, W.C.Haynes, C.H.Pang. (1973) The Genus Bacillus. Agr. Handbook No.427 United states department of Agriculture. Washington D.C.
に基づいて同定した。試験は、下記の手法により行った。
【００３５】
１．形態的性質（結果を下記［表１］に示す）
（１）細胞の大きさ
（２）細胞の形
（３）細胞の多形性の有無
倍率５，０００〜３０，０００倍での電子顕微鏡にて観察する。試験菌は普通寒天平板培地で３７℃×１日培養して、発生したコロニーより取る。使われた普通寒天培地は、肉エキス５ｇ、ペプトン１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、寒天１５ｇ、蒸留水１，０００ｍｌからなる。
【００３６】
（４）運動性の有無
１）西沢・菅原の方法にて鞭毛を染色し、電子顕微鏡（倍率１０，０００倍）にて観察する。第１液は、タンニン酸１００ｍｌ、局方塩化第二鉄液１．５ｍｌ、ホルマリン２ｍｌ、１％ＮａＯＨ１ｍｌ、蒸留水１００ｍｌからなり、第２液は硝酸銀２ｇ、局方アンモニア水少量、蒸留水１００ｍｌからなる。
２）半流動性普通寒天高層培地に穿刺培養し、培地全体の混濁にて判定する。使われた半流動性寒天培地は、肉エキス５ｇ、ペプトン１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、寒天５ｇ、蒸留水１，０００ｍｌからなる。
【００３７】
（５）胞子の有無
１）普通ブイヨン培地にて振とう培養した培養液を、８５℃×１５分加熱後、普通寒天平板培地へ混釈培養し、コロニーの発生にて判断する。使われた普通ブイヨン培地は、肉エキス３ｇ、ペプトン５ｇ、蒸留水１，０００ｍｌからなる。
２）Ｗｉｒｔｚの法（Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ−Ｆｕｌｔｏｎの変法）により胞子を染色し、菌体は赤、胞子は緑の染色性にて判断する。菌体の赤色は０．５％サフラニン水溶液、胞子の緑色は５％マラカイトグリーン水溶液による。
【００３８】
（６）胞子嚢の形
（７）胞子の形
（８）胞子の形成部位
（９）胞子の大きさ
Ｗｉｒｔｚの法（Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ−Ｆｕｌｔｏｎの変法）により胞子を染色し、倍率５，０００倍での電子顕微鏡にて観察する。試験菌は普通寒天平板培地で３７℃×１日培養した後、４℃×１日間冷蔵庫にて冷却したコロニーより取る。
【００３９】
（10）グラム染色
Ｈｕｃｋｅｒの変法にて行う。陽性はクリスタルバイオレットの紫に、陰性は対比染色のサフラニンの赤で判定する。試験菌は普通寒天平板培地で３７℃×１日培養して、発生したコロニーより取る。
【００４０】
（11）抗酸性
Ｚｉｉｅｈｌ−Ｎｅｅｉｓｅｎ染色法により行う。陽性は石炭酸フクシンの赤に、陰性は対比染色のマラカイトグリーンの緑で判定する。試験菌は普通寒天平板培地で３７℃×１日培養して、発生したコロニーより取る。
【００４１】
【表１】
【００４２】
２．各培地に於ける生育状態（結果を下記［表２］［表３］に示す）
（１）普通寒天平板培養
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
肉エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、ペプトン１０ｇ、寒天１５ｇ（ｐＨ７．０±０．１）
［培養条件］
滅菌シャーレ上に培地を固定し、その上に画線培養する。３７℃×３日。
【００４３】
（２）普通寒天斜面培養
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
同上
［培養条件］
滅菌試験管内に培地を斜面固定し、その上に画線培養する。３７℃×３日。
【００４４】
（３）普通ブイヨン液体培養
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
肉エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、ペプトン１０ｇ、ｐＨ７．０±０．１
［培養条件］
滅菌試験管に培地を分注し、その中に菌を懸濁する。３７℃×３日、１７０回／分で振とう培養。
【００４５】
（４）ゼラチン穿刺培養
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
肉エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、ペプトン１０ｇ、ゼラチン１５ｇ（ｐＨ７．０±０．１）
［培養条件］
滅菌試験管に培地を高層固定し、穿刺培養する。２５℃×７日
［生育以外の観察項目］
タンパク質の消化によるゼラチンの液化。
【００４６】
（５）リトマスミルク液体培養
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
脱脂粉乳１１０ｇ、リトマス液適量、ｐＨ７．０±０．１
［培養条件］
滅菌試験管に培地を分注しその中に菌を懸濁する。２５℃×１４日、静置培養
［生育以外の観察項目］
乳糖の分解時、酸の産生による牛乳の凝固
乳糖の分解時、凝乳酵素の産生による牛乳の凝固
乳糖の分解時、凝乳酵素の産生による牛清の析出。
【００４７】
【表２】
【００４８】
【表３】
【００４９】
３．生理学的性質（１）（結果を下記［表４］に示す）
（１）硝酸塩の還元
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
硝酸カリウム１ｇ、ペプトン５ｇ
［培養条件］
滅菌試験管に培地を分注し、その中に１白金耳の菌を懸濁。３７℃×５日、１７０回／分で振とう培養
［観察項目］
亜硝酸塩の検出：α−ナフチルアミン液１ｍｌとスルファニル酸液１ｍｌを培地に良く混ぜ桃赤色になれば陽性と判定する。
【００５０】
（２）脱窒反応
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
１）硝酸ナトリウム１０ｇ、肉エキス５ｇ
２）肉エキス５ｇ
［培養条件］
滅菌試験管に上記１、２の培地を２本づつ分注し、その中に１白金耳の菌を懸濁する。２本のうち一方に流動パラフィンを１〜２ｃｍ重層する。３７℃×１〜３日、静置培養
［観察項目］
硝酸塩存在下における嫌気的生育があるか：硝酸塩の有無、さらに流動パラフィンの有無の４本の濁度、ガスの発生の観察にて判定する。
【００５１】
（３）ＶＰテスト
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
ペプトン５ｇ、リン酸二水素カリウム５ｇ、ブドウ糖５ｇ
［培養条件］
滅菌試験管に培地を分注し、その中に１白金耳の菌を懸濁する。３７℃×３日、１７０回／分、振とう培養
［観察項目］
グルコース分解産物であるacetylmethylcarbinolの存否を調べる：培養液１ｍｌにα−ナフトール溶液０．６ｍｌと４０％ＫＯＨ水溶液０．２ｍｌとを加え、濃い赤色になったものを陽性と判定する。
【００５２】
（４）ＭＲテスト
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
ペプトン５ｇ、リン酸二水素カリウム５ｇ、ブドウ糖５ｇ
［培養条件］
滅菌試験管に培地を分注し、その中に１白金耳の菌を懸濁する。３７℃×３日、１７０回／分で振とう培養
［観察項目］
グルコース分解による酸形成を調べる：培養液１ｍｌにメチルレッドを滴下し、赤色が陽性、黄色が陰性と判定。
【００５３】
（５）インドールの産生
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ
［培養条件］
滅菌試験管に培地を分注し、その中に１白金耳の菌を懸濁する。３７℃×３日、１７０回／分で振とう培養
［観察項目］
インドールの検出：アミノ酸のトリプトファンからインドールを産生する能力の有無を調べる。培養液の１／５〜１／１０のＫｏｖａｃ試薬（下記参照）を加えよく振って静置し、２層に分離した上層が真紅色なら陽性、黄色なら陰性と判定
＜Ｋｏｖａｃ試薬＞
ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド５ｇ、アミルアルコール７５ｍｌ、濃塩酸２５ｍｌ。
【００５４】
（６）硫化水素の産生
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中、市販ＴＳＩ寒天培地）
肉エキス５ｇ、ブドウ糖１ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、クエン酸第二鉄０．２ｇ、ペプトン１５ｇ、チオ硫酸ナトリウム０．２ｇ、乳糖１０ｇ、フェノールレッド０．００２ｇ、白糖１０ｇ、寒天１５ｇ
［培養条件］
滅菌試験管に培地を半斜面に固定し、高層部に穿刺培養し、斜面に塗布培養する。３７℃×１日
［観察項目］
硫化水素の検出：斜面低位に黒変物あれば陽性と判定する。
【００５５】
（７）デンプンの加水分解
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
デンプン２ｇ、肉エキス５ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１５ｇ
［培養条件］
滅菌シャーレ上に培地を固定し、その上に画線培養する。室温×５日
［観察項目］
デンプンの検出：ヨード、ヨードカリ液（下記参照）を菌の増殖が見られるシャーレに滴下、濃い紫色が消えると陽性と判定
＜ヨード、ヨードカリ液＞
ヨウ化カリウム５ｇ、ヨウ素４ｇ／２００ｍｌ。
【００５６】
（８）カゼインの液化
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
スキムミルク２ｇ、寒天５ｇ
［培養条件］
上記の培地を別々に滅菌し、滅菌シャーレ上で混合固定し、その上に画線培養する。３７℃×１日
［観察項目］
カゼインの残存：画線部分の周囲に透明な部分が見られたら陽性と判定。
【００５７】
（９）クエン酸の利用
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中、市販ＣＩＴ寒天培地）
リン酸二カリウム１ｇ、リン酸一アンモニウム１ｇ、クエン酸ナトリウム２ｇ硫酸マグネシウム０．２ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、ＢＴＢ０．０２４ｇ、寒天１５ｇ
［培養条件］
滅菌シャーレ上に培地を固定し、その上に画線培養する。３７℃×１〜３日
［観察項目］
炭素栄養源としてクエン酸のみを利用して生育するかの有無：培地の青変または菌の生育が認められるとき陽性と判定する。
【００５８】
（10）色素の生成
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
ペプトン２０ｇ、グリセリン１０ｇ、Ｋ２ＳＯ４１０ｇ、ＭｇＣｌ２１．４ｇ、寒天１５ｇ
［培養条件］
滅菌シャーレ上に培地を固定し、その上に画線培養する。２５℃×５日
［観察項目］
色素の生成：コロニー周辺部のみに着色した時は非水溶性、培地全体に着色した時は水溶性各色素の生成があると判定する。
【００５９】
（11）ウレアーゼ
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
尿素２０ｇ、ペプトン２ｇ、ブドウ糖１ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、リン酸二水素カリウム２ｇ、０．２％フェノールレッド６ｍｌ、寒天１５ｇ（ただし、寒天は１２１℃×１５分滅菌、それ以外は濾過滅菌する）
［培養条件］
滅菌試験管に培地を斜面に固定し、その上に塗布培養する。３７℃×１日
［観察項目］
アンモニアの検出：培地が赤色となった時、陽性と判定する。
【００６０】
（12）オキシターゼ
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
肉エキス５ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１５ｇ
［培養条件］
滅菌シャーレ上に培地を固定し、その上に画線培養する。３７℃×１日
［観察項目］
チトクロームの存否：平板上のコロニーに、 dimetyl-p -phenylenediamineの１％水溶液を滴下し、滴下色がピンクを経て黒に変わった時、陽性と判定。
【００６１】
（13）カタラーゼ
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
肉エキス５ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１５ｇ
［培養条件］
滅菌シャーレ上に培地を固定し、その上に画線培養する。３７℃×１日
［観察項目］
カタラーゼの存否：過酸化水素の分解を触媒する酵素の存否。スライドグラスに３％Ｈ２Ｏ２液を１滴のせ、それに菌を１白金耳良く混ぜて入れる。酸素の気泡が多量にまたは継続的に発生した時、陽性と判定する。
【００６２】
【表４】
【００６３】
４．生理学的性質（２）（結果を下記［表５］［表６］に示す）
（１）ｐＨによる生育
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中、市販ニュートリエントブロス）
肉エキス３ｇ、ペプトン５ｇ、ｐＨ調整剤（酸：Ｈ２ＳＯ４ １ｍｌ／１００ｍｌ，アルカリ：ＮａＯＨ ４ｇ／１，０００ｍｌ）、ｐＨの変化は、３．６〜１０．９の１５水準で行う
［培養条件］
滅菌試験管に培地を分注し、その中に１白金耳の菌を懸濁する。３７℃×１日、１７０回／分で振とう培養
［観察項目］
生育の有無
＋＋………良く生育する
＋…………生育する
−＋………僅か生育する
−…………極僅か生育する
−−………全く生育しない。
【００６４】
（２）温度による生育
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中、市販普通寒天培地）
肉エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、ペプトン１０ｇ、寒天１５ｇ（ｐＨ７．０±０．１）
［培養条件］
滅菌シャーレ上に培地を固定し、その上に画線培養
温度を４，１０，２０，３０，３７，４０，５０℃に変えそれぞれ×１日
［観察項目］
生育の有無
＋＋………良く生育する
＋…………生育する
−＋………僅か生育する
−…………極僅か生育する
−−………全く生育しない。
【００６５】
（３）酸素に対する態度
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中、市販普通寒天培地）
肉エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、ペプトン１０ｇ、寒天１５ｇ（ｐＨ７．０±０．１）
［培養条件］
滅菌試験管に菌と培地を混釈した状態で高層に固定して培養。３７℃×１日
［観察項目］
好気、嫌気での生育の有無
表面のみ生育………………好気性
表面と高層内で生育………通性嫌気性
高層内のみ生育……………偏性嫌気性。
【００６６】
（４）Ｏ−Ｆテスト
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
ペプトン２ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．３ｇ、寒天３ｇ、０．２％ＢＴＢ１５ｍｌ、グルコース１０ｇ（ただし、グルコースはろ過滅菌、その他は１２１℃×１５分滅菌する）
［培養条件］
２本の滅菌試験管に培地を分注し高層に固定する。それぞれに穿刺培養し、内１本に流動パラフィンを１〜２ｃｍ重層する。３７℃×３〜４日
［観察項目］
糖分解が酸化的に行われるか、発酵的に行われるか見る
”０”………酸化的糖分解（嫌気条件のみ黄変した時）
”Ｆ”………発酵的糖分解（好気、嫌気条件とも黄変した時）。
【００６７】
（５）ＰＰＡテスト
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
酵母エキス３ｇ、フェニルアラニン２ｇ、燐酸ナトリウム１ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１５ｍｌ
［培養条件］
滅菌試験管に培地を斜面固定し、その上に塗布培養する。３７℃×１日
［観察項目］
フェニルアラニンをフェニルピルピン酸に脱アミノ化するかの有無：１０％塩化第二鉄水溶液の滴下により緑変した時、陽性と判定する。
【００６８】
（６）プロピオン酸の利用
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
硫酸マグネシウム０．２ｇ、プロピオン酸ソーダ２ｇ、燐酸水素二カリウム１ｇ、燐酸一アンモニウム１ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１０ｇ、０．２％ＢＴＢ溶液１２ｍｌ
［培養条件］
滅菌シャーレに培地を固定し、その上に画線培養する。３７℃×１日
［観察項目］
炭素栄養源としてプロピオン酸のみを利用して生育するかの有無：培地の青変または菌の生育が認められるとき陽性と判定する。
【００６９】
（７）チロシンの分解
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
Ｌ−チロシン５ｇ、肉エキス３ｇ、ペプトン５ｇ、寒天１５ｇ（ただし、チロチンとニュートリエントアガーは、別々に湿熱滅菌し混合する）
［培養条件］
滅菌シャーレに培地を固定し、その上に画線培養する。３７℃×７〜１４日
［観察項目］
チロシンの分解の有無：コロニーの下に結晶で存在するチロシンが溶解した時、陽性と判断する。
【００７０】
（８）卵黄反応
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
ペプトン１０ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４ ５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ、ＮａＣｌ２ｇ、ＭｇＳＯ４ ０．１ｇ、グルコース２ｇ、卵黄１５ｍｌ（ただし、卵黄以外は湿熱滅菌し、それに無菌的に吸い取った卵黄を加え一昼夜冷蔵庫でならす。卵黄の加えないブロスも用意する）
［培養条件］
二本の滅菌試験管に卵黄のありなしの培地を分注し、それぞれのその中に１白金耳の菌を懸濁する。３７℃×７日、観察は、１、３、５、７日に行う。１７０回／分で振とう培養
［観察項目］
白色沈澱物の有無：卵黄無しに比べ、卵黄ありに白色沈澱物が試験管低部や表面に見られた時、陽性と判定する。
【００７１】
（９）２％ＮａＣｌ下での生育
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
肉エキス３ｇ、ペプトン５ｇ、ＮａＣｌ２０ｇ
［培養条件］
滅菌試験管に培地を分注し、その中に１白金耳の菌を懸濁する。３７℃×１４日、１７０回／分で振とう培養
［観察項目］
生育の有無
＋＋………良く生育する
＋…………生育する
−＋………僅か生育する
−…………極僅か生育する
−−………全く生育しない。
【００７２】
（10）５％ＮａＣｌ下での生育
（11）７％ＮａＣｌ下での生育
（12）１２％ＮａＣｌ下での生育
（13）２０％ＮａＣｌ下での生育
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
上記９のＮａＣｌを７０ｇ、１２０ｇ、２００ｇに変える
［培養条件］
上記９と同じ
［観察項目］
上記９と同じ。
【００７３】
（14）リゾチウム存在下での生育
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
肉エキス３ｇ、ペプトン５ｇ、リゾチウム０．１ｇ（リゾチウムは０．０１ＮのＨＣｌ溶液中で２０分間煮沸した後ニュートリエントブロスに加える）
［培養条件］
滅菌試験管に培地を分注し、その中に１白金耳の菌を懸濁する。３７℃×１４日、１７０回／分で振とう培養
［観察項目］
生育の有無
＋＋………良く生育する
＋…………生育する
−＋………僅か生育する
−…………極僅か生育する
−−………全く生育しない。
【００７４】
（15）溶血素の産生
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中、市販羊血液寒天培地）
Pancreatic Digest of Casein.１４．５ｇ、Papaic Digest of Soybean Meal.５．０ｇ、Sodium Chloride.５．０ｇ、Growth Factors１. ５ｇ、Agar１４．０ｇ、Sheep blood, defibrinated.５．０％
［培養条件］
滅菌シャーレに培地を固定し、その上に画線する。３７℃×１日
［観察項目］
溶血素の産生の有無
α型溶血……コロニー周辺に緑色帯（ヘモグロビンの変質）
β型溶血……コロニー周辺を透明化（赤血球膜の破壊）。
【００７５】
【表５】
【００７６】
【表６】
【００７７】
５．炭素源の酸及びガスの生成（結果を下記［表７］に示す）
（１）Ｄ−グルコース
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
ペプトン１ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１０ｇ、０．２％ＢＴＢ１５ｍｌ、Ｄ−グルコース８ｇ
［培養条件］
滅菌試験管に培地を分注し、高層に固定する。その後、それに穿刺培養する。３７℃×１４日
［観察項目］
酸の生成：ＢＴＢ試薬の黄変度にて判定
＋＋………良く生成
＋…………生成
−＋………生成微弱
−…………生成無し
ガスの生成：高層部に亀裂の有無で判定
＋＋………良く生成
＋…………生成
−＋………生成微弱
−…………生成無し。
【００７８】
（２）Ｌ−アラビノース
（３）Ｄ−キシロース
（４）Ｄ−マンニット
（５）Ｄ−マンノース
（６）Ｄ−ガラクトース
（７）Ｄ−ソルビトース
（８）イノシトール
（９）トレハロース
（10）ラクトース
（11）マルトース
（12）フルクトース
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
上記（１）の糖（Ｄ−グルコース）の部分を、上の（２）〜（12）の糖に変更 ［培養条件］
上記（１）と同じ
［観察項目］
上記（１）と同じ。
【００７９】
【表７】
【００８０】
６．同定結果
ＯＹＫ−０１−６００、ＯＹＫ−０３−６００、及びＯＹＫ−０４−０００の３株を、下記の文献に従って分類した。
[1] Bergey's Mannual of Determinative Bacteriology、 Vol.2 (1986)，Williams &Wilkins U.S.A
[2] R.E.Gordon，W.C.Haynes，C.H.Pang. (1973) The Genus Bacillus. Agr. Handbook No.427 United states department of Agriculture. Washington D.C.
【００８１】
【表８】
【００８２】
【表９】
【００８３】
【表１０】
これにより、上記３株とも［表８］よりBacillus属に属すると認められ、次に［表９］［表１０］よりB.subtilisの類縁菌であると考えられるが、嫌気下で生育すること、糖からの酸の産生が微弱であること、及び７％ＮａＣｌで生育しないことにより同定に至らず、新種であると判断しBacillus sp.とした。
【００８４】
［寄託された生物材料への言及］
[1] 寄託機関の名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物 寄託センター
あて名 ：郵便番号３０５−００４６ 日本国茨城県つくば市東１−１−３（ＴＥＬ；０２９８−５４−６０２９）
[2] 寄託日 ：１９９８年６月２９日
[3] 寄託番号：（１）ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９４
（２）ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９５
（３）ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９６。
【００８５】
上記の変異株は、増殖に伴って悪臭を発生させる菌に対して抗菌性を有する。また、当該微生物を培養し、この培養液から抗菌性物質を分離精製することができる。分離精製された抗菌性物質をそのまま、あるいは水などの適当な溶媒に溶解または分散したものを、そのまま、または適宜希釈して、その単独をあるいは他の物質と併用した混合物を、撒布、塗布、含浸、潜着、係着、接着、付着、混入、添加、内服、注射、のうちの少なくとも１つ以上の手段を用いて、抗菌、防臭したい物品、あるいはこれらの性能をあらかじめ備えておこうとする物品、例えば繊維製品、寝具、衣料品、医療品、サニタリー機器及び備品、生理用品、履き物、各種空調設備・エアーコンディショナー（空気清浄装置を含む）のフィルター、内外装を含む建材、家具、動物、動物飼育場、動物飼育機器、動物飼育用水及び飼料、食器、薬品、汚水または汚水処理場または機器、マイクロカプセル、旅客輸送車両または船舶または航空機の座席も含めたインテリア材、死体安置及び葬儀用品などに直接あるいは間接的に付与する。
さらに詳しくは、引き続き以下の実施例にて説明する。
【００８６】
Ｃ．微生物の持つ抗菌活性物質の確認（結果を下記［表１１］に示す）
Bacillus sp.ＯＹＫ−０１−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９４）、Bacillus sp.ＯＹＫ−０３−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９５）、Bacillus sp.ＯＹＫ−０４−０００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９６）が抗菌活性物質を分泌していることを以下の実験により確認した。
【００８７】
１．微生物の懸濁液の調整
（１）微生物
ＯＹＫ−０１−６００，ＯＹＫ−０３−６００，及びＯＹＫ−０４−０００の３株。
（２）前培養
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
ペプトン１０ｇ、肉エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１０ｇ
［培養条件］
滅菌シャーレに培地を固定し、その上に保存菌を画線培養する。３７℃×１日。
（３）本培養
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
ペプトン１０ｇ、肉エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ
［培養条件］
滅菌試験管に培地を分注し、その中に１白金耳の（２）を懸濁する。３７℃×１日、１７０回／分で振とう培養する。
【００８８】
２．抗菌試験菌の懸濁液の調整
（１）抗菌試験菌
Klebsiella pneumoniae ATCC 4352，Staphylococcus aureus ATCC 6538P。
（２）前培養
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
子牛脳浸出液２００ｇ、牛心臓浸出液２５０ｇ、プロテオースペプトン１０ｇ、ブドウ糖２ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、リン酸二ナトリウム２．５ｇ、寒天１５ｇ
［培養条件］
滅菌シャーレに培地を固定し、その上に保存菌を画線培養する。３７℃×１日。
（３）本培養
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
ペプトン１０ｇ、肉エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ
［培養条件］
滅菌試験管に培地を分注し、その中に（２）を入れ、振とう培養する。
Klebsiella pneumoniae ……３７℃×２０時間、１７０回／分
Staphylococcus aureus ……３７℃×１０時間、１７０回／分。
（４）菌数調整
滅菌緩衝生理食塩水にて菌数が、５〜３０×１０５個／ｍｌになるよう調整する。
【００８９】
３．抗菌性試験
（１）試験用培地の作成
１）上記（４）の２試験菌の菌液を、ペプトン１０ｇ、肉エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、及び寒天１０ｇよりなる培地（蒸留水１，０００ｍｌ中）にそれぞれ０．２ｍｌ混釈して、滅菌シャーレ上で固定する。
２）ペプトン１０ｇ、肉エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、及び寒天１０ｇよりなる培地（蒸留水１，０００ｍｌ中）を滅菌シャーレ上で固定し、その表面全体に上記（４）の２試験菌の菌液を０．２ｍｌスプレッダーにて植菌する。
【００９０】
（２）微生物と抗菌性の比較のための菌の準備
OYK-01-600,OYK-03-600,OYK-04-000の３株と比較するため納豆菌を含めたBacillus subtilisのＡ、Ｂ、Ｃ各菌の３株を準備した。
【００９１】
（３）微生物と抗菌性比較菌の植菌
上記した「１．微生物の懸濁液の調製」の（３）のOYK-01-600,OYK-03-600,OYK-04-000の３菌株と、上記（２）のＡ、Ｂ、Ｃ各菌の３菌株、計６菌株を、上記（１）で作成した試験用培地上に、下記の１）、２）の方法で植菌する。
１）シャーレ中央にペニシリンカップを置き、その中に各菌液０．０５ｍｌを注ぐ。
２）シャーレ中央に各菌液を０．０２ｍｌ滴下する。植菌されたものは、３７℃×１日静置培養する。
【００９２】
（４）判定方法
＋＋…試供菌のコロニーの下及び周辺に、試験菌の増殖はなく、２ｍｍ以上の増殖阻止帯（ハロー）が認められる
＋……試供菌のコロニーの下及び周辺に、試験菌の増殖はなく、０〜２ｍｍの増殖阻止帯（ハロー）が認められる
＋−…増殖阻止帯（ハロー）は認められないが、試供菌コロニー内に試験菌の増殖は認められない
−……試供菌のコロニー内の一部に、試験菌の増殖が認められる
−−…試供菌のコロニー内の全てに、試験菌の増殖が認められる
ＮＤ…試験を行っていない。
【００９３】
【表１１】
【００９４】
［表１１］の通り、微生物は、その増殖期において、Klebsiella pneumoniaeとStaphylococcus aureusの双方に対して抗菌活性を示す物質を分泌していると認められた。
【００９５】
Ｄ．微生物による排水処理場の防臭試験（結果を下記［表１２］に示す）
Bacillus sp.ＯＹＫ−０１−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９４）、Bacillus sp.ＯＹＫ−０３−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９５）、Bacillus sp.ＯＹＫ−０４−０００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９６）を排水処理場に投入する事により処理場周辺の防臭に効果があることを以下の実験により確認した。
【００９６】
１．試験に供した排水処理場の概要
（１）場所及び業種
三重県、洗濯業
（２）排水設備と処理能力
図１参照。
【００９７】
２．防臭試験方法
（１）微生物の懸濁液の調整
本試験にはBacillus sp.ＯＹＫ−０１−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９４）を選択し、上記した「１．微生物の懸濁液の調製」と同じ方法で微生物の懸濁液を調整した。
（２）排水設備への菌の投入
上記（１）で調整された微生物懸濁液２．５リットルを、図１における排水処理設備原水槽に投入した。
（３）効果の判定
１）判定者：同工場社員３名
２）判定基準：６段階臭気強度表示法
臭気強度０＝無臭
１＝やっと感知出来る臭い（検知閾値濃度）
２＝何の臭いかわかる弱い臭い（認知閾値濃度）
３＝楽に感知できる臭い
４＝強い臭い
５＝強烈な臭い
３）判定場所
沈澱槽より活性汚泥が曝気槽に返送される場所
４）その他の測定項目
ＢＯＤ、投入菌のｍｌ当たりの菌数
【００９８】
【表１２】
【００９９】
［表１２］の通り、微生物の増殖に伴って、臭気の強さが減少することを確認できた。この微生物は、増殖時に、人に少量で不快を感ずる硫化水素、メチルメルカプタン、トリエチルメタン等の発生がなく、また糖分解もガスの発生なしで行うため上記の結果が得られたと考えられる。他の微生物が増殖するとき、発生するガスを栄養的に消費するかどうかの確認はしていない。
【０１００】
なお、Bacillus sp.ＯＹＫ−０３−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９５）及びBacillus sp.ＯＹＫ−０４−０００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９６）についても上記と同様の好結果が得られる旨を確認した。
【０１０１】
Ｅ．微生物が生成する分泌物の分離精製
Bacillus sp.ＯＹＫ−０１−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９４）、Bacillus sp.ＯＹＫ−０３−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９５）、Bacillus sp.ＯＹＫ−０４−０００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９６）が、Klebsiella pneumoniae と、Staphylococcus aureus に対して抗菌活性を示した物質を下記の通り分離精製した。
【０１０２】
１．微生物の懸濁液の調整
（１）微生物
ＯＹＫ−０１−６００，ＯＹＫ−０３−６００，ＯＹＫ−０４−０００の３株、比較のため納豆菌を含めたBacillus subtilis のＡ、Ｂ、Ｃ各菌の３株も同様の作業を行なった。
（２）前培養
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
ペプトン１０ｇ、肉エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１０ｇ
［培養条件］
滅菌シャーレに培地を固定し、その上に保存菌を画線培養する。３７℃×１日
（３）本培養
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
ペプトン１０ｇ、肉エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ
［培養条件］
滅菌坂口フラスコに培地を分注し、その中に１白金耳の（２）を懸濁する。３７℃×２日、１７０回／分で振とう培養する。
【０１０３】
２．菌体と分泌物の分離
得られた培養液を４℃、回転数１２，０００ＲＰＭで１４分間低温遠心分離機にかける。その上澄みだけを取り出し、その液を０．４５μのメンブランフィルターで吸引ろ過する。
【０１０４】
３．分泌物の濃縮化
得られたろ過液を、なす型フラスコに移し、ろ過液が完全にフラスコ壁面に凍結させた後、４８時間凍結真空乾燥機にて乾燥し、粉末精製物を得た。
【０１０５】
Ｆ．微生物が生成する物質の抗菌力試験（結果を下記［表１３］に示す）
Bacillus sp.ＯＹＫ−０１−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９４）、Bacillus sp.ＯＹＫ−０３−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９５）、Bacillus sp.ＯＹＫ−０４−０００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９６）の分泌物から得られた抗菌活性を持つと考えられる分離精製物の抗菌力を下記の方法で確認した。
【０１０６】
１．試供物
上記「３．分泌物の濃縮化」で得られた分泌物質
[1] Bacillus sp. ＯＹＫ−０１−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９４）
[2] Bacillus sp. ＯＹＫ−０３−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９５）
[3] Bacillus sp. ＯＹＫ−０４−０００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９６）
[4] Bacillus sp. Ａ
[5] Bacillus sp. Ｂ
[6] Bacillus sp. Ｃ
の６種の分泌物質と、抗菌力基準薬剤として用いた下記[7]、[8]の計８種の試供物で行なった。
[7] クロラムフェニコール（和光純薬工業（株）製抗生物質、Ｍｗ：323.13 CAS:56-75-7、タンパク合成阻止作用を持ち、グラム陽性菌、グラム陰性菌、リケッチア、ウィルスに有効、抗菌作用は、通常静菌的。抗菌テストには１０ｍｇ／１００ｍｌの水溶液を０．２ｍｌ使用）。
[8] ニッカノンＲＢ（日華化学（株）製の第四級アンモニウム系合成抗菌剤、黄色ブドウ球菌に優れた抗菌性があり、防かび性も有する。洗濯耐久性のある抗菌防臭剤。抗菌テストには、１ｍｌ／１００ｍｌの水溶液を０．２ｍｌ使用）。計上記[1]〜[8]の８種の試供物で行う。
【０１０７】
２．抗菌試験菌
上記した「２．抗菌試験菌の懸濁液の調整」で得られた２種
[1] Klebsiella pneumoniae ATCC 4352
[2] Staphylococcus aureus ATCC 6538P 。
【０１０８】
３．抗菌性試験方法
（１）培養液の白濁度で判定する方法
１）［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中、市販ニュートリエントブロス） 肉エキス５ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ
２）［培養条件］
滅菌試験管に培地を５ｍｌ分注し、それに試供物０．０２ｇと、試験菌懸濁液０．１ｍｌを加え混釈する。３７℃×１日、１７０回／分振とう培養
３）［観察項目］
日立製作所（株）製Ｍｏｄｅｌ １００−２０ 分光光度計にて培養液の透過率を測定する。測定波長４７５ｎｍ、表示単位％（Klebsiella pneumoniae で、菌数約５〜３０×１０８は、透過率５２％を示す）。
【０１０９】
（２）菌数の測定で判定する方法
１）［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中、市販普通寒天培地）
肉エキス５ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１５ｇ
２）［培養条件］
滅菌シャーレに培地を１５ｍｌ分注し、その中に試供物０．０２ｇを混釈溶解したのち固定する。その表面に試験菌懸濁液０．２ｍｌを均一に塗布培養する。３７℃×１日
３）［観察項目］
シャーレ上に増殖したコロニーをカウントする。表示単位：指数部（例えば、Ａ×１０Ｂの場合は「Ｂ」と表示）。
【０１１０】
（３）増殖阻止帯（ハロー）の観察で判定する方法
１）［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中、市販普通寒天培地）
肉エキス５ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１５ｇ
２）［培養条件］
滅菌シャーレに培地を１５ｍｌ分注固定し、その表面に試験菌懸濁液０．２ｍｌを均一に塗布し、表面が半乾き後シャーレ中央に試供物を固形の状態で０．０２ｇ置き静置培養する。３７℃×１日
３）［観察項目］
発生したハローの最大直径を計測する。表示単位：ｍｍ。
【０１１１】
（４）ペニシリンカップ法
１）［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中、市販ニュートリエントブロス） 下層培地：肉エキス５ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１５ｇ 上層重層培地：肉エキス５ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天７ｇ
２）［培養条件］
滅菌シャーレに下層培地を１５ｍｌ分注固定する。その上に上層培地４ｍｌに試験菌懸濁液０．１ｍｌを混釈し重層する。表面が半乾き後、シャーレ中央にステンレススチール製の円筒（内径６ｍｍ、外径８ｍｍ、高さ１０ｍｍ）を１０〜１３ｍｍの高さから垂直に落下させる。その円筒内に試供物０．０２ｇを０．２ｍｌの滅菌水に溶解したものを入れて静置培養する。３７℃×１日
３）［観察項目］
カップ内外に発生した試験菌の増殖を観察
表示単位
−−…カップ内全体に試験菌の増殖が見られる
＋−…カップ内の一部に試験菌の増殖が見られる
＋……カップ内に全く試験菌の増殖が見られない
Ａ……カップ外に最大直径Ａｍｍ（例えば）のハローが観察された時。
【０１１２】
【表１３】
【０１１３】
［表１３］の通り、微生物が分泌する物質が抗菌効果を有することが確認できた。
【０１１４】
Ｇ．ＯＹＫ菌体生成物の抗菌活性テスト
ＯＹＫ菌としてBacillus sp.ＯＹＫ−０１−６００を用いたが、Bacillus sp.ＯＹＫ−０３−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９５）及びBacillus sp.ＯＹＫ−０４−０００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９６）についても同様の好結果が得られている。
【０１１５】
１．ＯＹＫ菌体生成物の分離精製
[1] 菌体外生成物
（１）−８２℃で凍結保存された種菌１ｍｌを解凍した。
（２）試験管に滅菌されたＢＧＧ液体培地（大豆蛋白抽出物とグルコースとグルタミン酸ソーダよりなる培地、以下同様）４ｍｌを取り、その中に上記（１）で得た菌を入れ、３７℃で２４時間種培養した。
（３）坂口フラスコに滅菌されたＢＧＧ液体培地１００ｍｌを取り、その中に上記（２）の菌を入れ、３７℃で７２時間本培養した。（ＯＤ＝１０，ｐＨ＝７．９）
（４）のち遠心分離し、上澄みを取った。（１２，０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ、４℃）
（５）メンブランフィルターにて上記（４）を濾過した。（０．２μｍフィルター）
（６）上記（５）における濾液を凍結乾燥した。
（７）上記（６）にて凍結乾燥したものを３〜４ｍｌの生理食塩水で溶解した。
（８）後述する抗菌テストでは、上記（７）の溶解液を５０μリットル滴下した。
【０１１６】
[2] 菌体内生成物
（１）−８２℃で凍結保存された種菌１ｍｌを解凍した。
（２）試験管に滅菌されたＢＧＧ液体培地４ｍｌを取り、その中に上記（１）で得た菌を入れ、３７℃で２４時間種培養した。
（３）坂口フラスコに滅菌されたＢＧＧ液体培地１００ｍｌを取り、その中に上記（２）の菌を入れ、３７℃で７２時間本培養した。（ＯＤ＝１０，ｐＨ＝７．９）
（４）のち遠心分離し、沈殿物を取った。（１２，０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ、４℃）
（５）上記沈殿物に５ｍｌの生理食塩水を加え、沈殿物を分散した。
（６）前記沈殿物が分散したものに対し、２０ｍｌのｎ−ブタノールを加え、１時間撹拌し、水層とアルコール層に分離するまで待った。
（７）上記（６）のアルコール層を取り出し、エバポレーションにてｎ−ブタノールを蒸発させた。
（８）これをデシケータに移し、さらに乾燥した。
（９）この乾燥物に生理食塩水を１ｍｌ加え、精製物を分散させた。
（10）この分散液をメンブランフィルターにて濾過した。（０．２μｍフィルター）
（11）次項の抗菌テストでは上記（10）の濾液を５０μリットル滴下した。
【０１１７】
２．ＯＹＫ菌菌体生成物の抗菌テスト
[1] 試供菌体生成物
（１）上記１．の[1]で得られたＯＹＫ菌菌体外生成物
（２）上記１．の[2]で得られたＯＹＫ菌菌体内生成物
【０１１８】
[2] 対象試験菌
（１）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｏｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ２５９２３、黄色ブドウ球菌）
（２）Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ１３８８３、肺炎桿菌）
（３）ＭＲＳＡ１００２（分離株、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）
（４）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ−１５７（Ｓ１８０、大腸菌Ｏ−１５７）
（５）Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｌａ（ＯＣＩ ８８１７１、レジオネラ菌）
（６）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＩＦＯ３４５２、緑膿菌（赤色色素産生））
（７）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＡＴＣＣ２７８５３、緑膿菌（青色色素産生））
（８）Ｆｕｚａｒｉｕｍ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ Ｎｉｒｅｎｂｅｒｇ Ｓ１２（ＩＦＯ６３４９、フザリウム（アカカビ））
（９）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｖａｎ Ｔｉｅｇｈｅｍ Ｓ１（ＩＦＯ６３４１、麹カビ）
（10）Ｐｅｎｉｓｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｔｒｉｎｕｍ Ｔｈｏｍ Ｓ５（ＩＦＯ６３５２、青カビ）
（11）Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ（ＩＦＯ５４６６、白癬菌）
（12）Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ Ｌｉｎｄ Ｓ７（ＦＥＲＭ Ｓ−７、くものすカビ）。
【０１１９】
[3] 試験方法
（１）保存試験菌を試験菌のそれぞれの最適条件で種培養した。
（２）一定の菌数の試験菌菌液をそれぞれの試験菌の最適固形培地上に一定量塗布し、半乾きになるまで放置した。
（３）２種類の試供菌体生成物（上記[1]参照）を上記（２）の培地上に５０μリットル滴下した。
（４）試験菌の最適培養条件にて培養した。
（５）抗菌活性があれば、滴下点に増殖阻止帯（ハロー）が見られる。その阻止帯の直径（短径、長径）を測定した（単位ｃｍ）。結果を下記［表１４］に記載する。
【０１２０】
【表１４】
【０１２１】
Ｈ．ＯＹＫ菌の増殖速度試験（図２参照）
本発明の新規微生物は、培養開始後、誘導期（増殖準備期間）を必要とせず速やかに増殖を始める。例えば、約１０３個／ｍｌ（ｇ）の菌濃度が、２０〜４０℃の培養条件下にて６時間以内に１０８個／ｍｌ（ｇ）以上に増加する。
【０１２２】
図２に、Bacillus sp ．ＯＹＫ−０１−６００の経時的な増殖状況を示す。なお、比較対照のため、B.subtilisの標準菌（ＩＦＯ３１３４）の増殖状況を併記する。図２に示したグラフは、縦軸に菌数の対数を取り、横軸に時間を取ってプロットした増殖曲線である。このグラフからも分かるように、本発明のＯＹＫ菌は、誘導期が殆どなく、培養開始後に速やかに増殖を始め、約１０３個／ｇの菌濃度が５時間程度で１０８個／ｍｌ以上に達している。これに対し、B.subtilisの標準菌（ＩＦＯ３１３４）は、培養開始後、６〜８時間の誘導期を経たのち、本格的な増殖が始まり、約１０８個／ｇの菌濃度に達するまでにおよそ１２時間かかっている。一方、ＯＹＫ菌は、上記標準菌の体積に対し４倍の体積を有し、かつ４時間後においては標準菌の増殖が６倍であるのに対し、ＯＹＫ菌は２０，０００倍であるから、体積については２０，０００×４＝８０，０００倍である。単純に比較すれば８０，０００÷６＝１３，３３３…となり、優に１万倍以上の体積を占めることになる。
【０１２３】
Ｉ．ＯＹＫ菌の利用
なお、ＯＹＫ菌としてBacillus sp ．ＯＹＫ−０１−６００を用いたが、Bacillus sp.ＯＹＫ−０３−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９５）、及びBacillus sp.ＯＹＫ−０４−０００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９６）についても同様の好結果が得られている。
【０１２４】
（ＯＹＫ菌の粉末化）
以下、ＯＹＫ菌を粉体にする工程を説明する。
（１）−８２℃で凍結保存された種菌１ｍｌを解凍した。
（２）試験管に滅菌されたＢＧＧ液体培地４ｍｌを取り、その中に上記（１）にて解凍した菌を入れ、３７℃で２４時間種培養した。
（３）坂口フラスコに滅菌されたＢＧＧ液体培地１００ｍｌを取り、その中に上記（２）の菌を入れ、３７℃で２４時間本培養した。このときのＯＤ値は、約１０を示し、菌数は１×１０８個／ｍｌであった。
（４）上記（３）の液体を凍結乾燥し、１ｇの菌粉末（培地成分も含まれる）を得た。菌数は１×１０１０個／ｇであった。
【０１２５】
得られた菌粉体は、ＯＹＫ菌全てが胞子化されていた。これにより次のような作用効果を奏する。すなわち、
[1] 胞子化されているため防湿さえ考慮すれば、常温での保管が可能であり、菌数の減少や菌の変異等の心配がない。
[2] 打込み強さが１０トン程度の打錠機にて錠剤化できる。打錠による菌数減少はない。
[3] 芳香剤、凝固剤、遅溶剤など、錠剤にするために必要な化学薬品の添加が可能である。
【０１２６】
（錠剤としての利用）
上記実施例で得られた菌粉体を、菌の増殖を促進させる添加物（例えばグルコース、グルタミン酸ソーダ、大豆タンパクの抽出物、培地成分など）を加えたうえで打錠機で打錠し、錠剤にすることができた。この錠剤を生ゴミの中に投入すると、結果として生ゴミから発生する悪臭を防止することができた。これは、前記錠剤を生ゴミの中に投入することによって湿気や水分により溶解し、胞子は水分を得て菌として活動を始め、臭気を出す腐敗菌の増殖に勝る速度で当該ＯＹＫ菌が増殖したものと考えられる。また、ＯＹＫ菌は大腸菌Ｏ−１５７にも抗菌活性があることから、台所回りでの上記錠剤の使用により食中毒の防止にも応用できる。
【０１２７】
（堆肥の製造例と製造された堆肥の効果）
さらに、本発明のＯＹＫ菌は、堆肥の製造工程においても有効な作用を示す。特に製造工程中、初期の発酵温度の立上がりに有効な作用を示す。その一例を以下に示す。
【０１２８】
牛糞７００ｇが温度５０℃まで昇温する日数を測った結果が８日であるのに対し、牛糞７００ｇに濃度１×１０８個／ｍｌのＯＹＫ菌液（ＯＹＫ−０１−６００）５０ｍｌを添加したものは３日しか掛からず、時間の短縮が見られた。また、４０℃以上保持される時間については、添加しない場合は６日であるのに対し、ＯＹＫ菌を添加したものについては１７日と保温時間の延長が見られた。堆肥製造工程は、それぞれの温度域で多数の菌や黴が増殖、死滅を繰り返し高分子有機物を低分子化すると言われている。このサイクルの中で７０℃の最高温では胞子として生存し、昇温または降温での４０℃付近で活発に増殖することによりサイクルの短縮を図っている。さらに、ＯＹＫ菌の特徴である増殖時に悪臭を発しないことから、製造工程中におけるメルカプタン、硫化水素臭の発散が防止された。
【０１２９】
（ＯＹＫ菌のシート化とその利用）
本発明のＯＹＫ菌の効果を医療現場において手軽に利用するための試みを行なった。以下詳述する。
菌（ＯＹＫ−０１−６００）濃度１×１０７個／ｍｌの菌液とバインダーとしてＰＶＡ（ポリビニルアルコール）を１０％添加した分散溶液を密度１５００メッシュのスクリーン捺染機を用いて１００ｇ／ｍ２の不織布に捺染した。水分を蒸発させたあと、前記不織布を顕微鏡で観察した結果、ＯＹＫ菌は胞子化されて不織布の繊維に絡まった状態に固定化されていることが確認できた。
この不織布を適当な広さに裁断し、これを、緑膿菌が原因とされている床ずれに悩む患者の背中に当てがうべく、シーツに敷いて様子を観察したところ、次第に悪臭がなくなり、床ずれも快方に向かうことが確認された。
なお、上記実施例において不織布を使用したが、これに限らず、合成樹脂繊維あるいは天然繊維からなる織物や編物、合成樹脂シート、合成樹脂発泡シート等を用いても構わない。
【０１３０】
（池水の浄化への利用）
ゴルフ場内にある池は、芝に多量の肥料を投入することから、その肥料が池に流れ込んで富栄養状態となっている。このような池は、時として、赤味を帯びた植物プランクトンが異常増殖し、さらにこの増殖により、池中の溶存酵素が減少する。これにより、嫌気性細菌の増殖を促し、悪臭の発生を招く。このような状態の池（４００ｔ水量規模）にＯＹＫ菌液（ＯＹＫ−０１−６００、菌濃度１×１０８個／ｍｌ）１０リットルを投入したところ、２週間で表面の赤味が消え、透明度が増した。このメカニズムは未だ解明していないが、ＯＹＫ菌の増殖により池水中の栄養物分が減少し、植物プランクトンが死滅したと推察できる。
【０１３１】
（脱臭剤としての利用）
富栄養状態の池における水浄化効果、あるいは上記した「Ｄ．微生物による排水処理場の防臭試験」の項で述べた排水（廃水）処理場の防臭効果については先述の通りであるが、乳牛や肉牛の飼育場、養鶏場、養豚場における悪臭に対しては堆肥の製造例に見るごとく、メルカプタン、硫化水素臭の発散を防止しうることからＯＹＫ菌の散布による脱臭が可能である。また、と殺場、手術室、衛生汚物、加工中の動物皮革においては、上記［表１２］とその次のパラグラフに記載したように、ＯＹＫ菌は蛋白質、脂質、炭水化物等を分解する際に悪臭を発生させる菌よりも速く増殖して防臭することができる。散布、混入、あるいは付着させるＯＹＫ菌は、菌の溶液をそのまま用いるか胞子化した粉体でも良く、さらに菌体内生成物あるいは菌体外生成物であっても同様の効果が得られる。
【０１３２】
（堆肥化における利用［Ｉ］）
ＯＹＫ菌が発酵温度にどのような効果をもたらすかを調べるため、少量の牛糞を用いて室内（室温１８℃）で堆肥化の試験を行った。試料の内訳は次の通りである。
（１−１） 牛糞 ４００ｇ（水分率６０％）
ＣＦＰ ４０ｇ（コーヒー搾り滓、水分率８％）
おから粉末 ２０ｇ（大豆タンパク源）
ＯＹＫ菌粉末 ４ｇ（菌濃度１×１０１０個／ｇ）
（１−２） 牛糞 ４００ｇ（水分率６０％）。
【０１３３】
これらの試料を魔法瓶内に置き、発酵温度の変化をグラフにしたものを図３に示す。第１日目は準備に費やされているが６時間毎の温度の変化を測定した。図中曲線（１−１），（１−２）の符号は上記試料の番号と一致させている。
【０１３４】
試料（１−１）に於けるおから粉末は、ＯＹＫ菌の富栄養源で増殖に寄与し、ＣＦＰは多孔質で水分調整の他に、微量発生するアンモニア臭気の吸収と好気的環境を作る働きがある。また、ＯＹＫ菌粉末は培養液を凍結乾燥したもので菌濃度は１×１０１０個／ｇである。試料（１−１）に於いては約１日で室温から７０℃迄上昇した。ＯＹＫ菌は、１０℃〜５５℃の範囲で活動し、３０〜４０℃の範囲で最も活発に活動し、牛糞の温度上昇を急速に促進させ、またＯＹＫ菌の増殖により多少のアンモニアが発生し、温度と弱アルカリにより放線菌などの高温菌の活動を促す。これにより、図３のグラフに示すように、約１日で牛糞の温度が７０℃に達したものと推察される。２日後からは再度室温まで降下していくが切り返しを行って再び発酵温度が上昇した。
【０１３５】
一方試料（１−２）に於いては牛糞の温度は１０℃程上昇しているとはいうものの発酵は不十分であり堆肥化されなかった。なお、上記テストは発酵温度を正確に測定するため、試料を魔法瓶の中に置き、強制通気を行った。
【０１３６】
（堆肥化における利用［ＩＩ］）
牛糞の水分率の影響をみるために次のような試料で同様の試験を試みた。室温は１８℃である。試料の温度変化をグラフにして図４に示す。
（２−１） 牛糞 ４００ｇ（水分調整せず。水分率８０％）
ＣＦＰ ４０ｇ（コーヒー搾り滓、水分率８％）
ＯＹＫ菌粉末 ４ｇ（菌濃度１×１０１０個／ｇ）
（２−２） 牛糞 ４００ｇ（水分率６０％）。
試料（２−１）では、温度は室温から上昇を続けるが最高温度の７０℃に達する。
また、試料（２−２）に於いては温度の上昇は僅かであり３０℃を越えることはなかった。
【０１３７】
（堆肥化における利用［ＩＩＩ］）
上記実施例１〜２を参考に屋外に於ける堆肥化試験を試みた。容量も７ｔに増やした。試験場所は、静岡県下の堆肥化センター内で堆肥化の困難な冬期に試験を行なった。試料は屋外で山積みとし、その上にシートを被せた。
（３−１） 牛糞 ５ｔ（水分調整せず。水分率８０％）
戻し堆肥 １．５ｔ（水分調整用に使用。水分率４４％）
ＣＦＰ １５０ｋｇ（コーヒー搾り滓、水分率８％）
脱脂大豆粕 １５０ｋｇ（大豆タンパク源）
ＯＹＫ菌粉末 ５ｋｇ（菌濃度１×１０１０個／ｇ）。
発酵温度及び外気の気温の変化をグラフにして図５に示す。冬期であるがため試料の温度も低く発酵温度が上昇するかどうかが懸念されたが、１日で２０℃の上昇が確認され、山積みの試料から蒸気の発生が確認された。その後は室内に於ける試験（上掲）と同様の上昇がみられ最高温度は７８度に達した。その後、温度の降下がみられ、この時点で“切り返し”を行った。これにより、再び発酵温度の上昇が確認された。
【０１３８】
（菌体製剤の作成）
上述した実施例では菌を直接粉体として用いているが、規模が大きくなると広範囲に高濃度の菌を効率よく混入するための菌体製剤が必要となる。次に菌体製剤の作成要領の一例を説明する。
【０１３９】
（１） 冷凍保存されたＯＹＫ菌をニュートリエンブロス（肉エキス培地）に１％植菌し３７℃にて２４時間振とう培養する。
（２） １日浸水した丸大豆を１２１℃，２０分，２気圧で高温高圧滅菌蒸煮を行う。
（３） 平型バットに、工程（２）にて滅菌蒸煮した丸大豆を敷き詰める。
（４） クリーンベンチ内でＯＹＫ菌液をスプレー植菌する。
（５） 植菌された丸大豆を３７℃の恒温室内に静置して２日間培養し、菌数を測定する。菌数が１×１０８個／ｇ以上存在することを確認する。
（６） 工程（５）が終了したものを６０℃にて充分乾燥させ、粉砕機にて顆粒状に粉砕する。この状態におけるＯＹＫ菌は胞子化して生存している。
【０１４０】
この様にして生成された顆粒状物が、本発明の菌体製剤の一例である。なお、上記（６）の工程において、乾燥物を顆粒状に粉砕したが、この大きさは、富栄養源の種類により、粒子の大きさを微粒子から顆粒の範囲で適宜変更する。その理由は、同一重量において粒子が細かい程、菌の増殖ポイントが増加するためである。
【０１４１】
（菌体製剤の堆肥化への利用）
本発明の菌体製剤が実用的であることを確認するため、静岡県下の堆肥化センター内の発酵レーンで菌体製剤を用いた堆肥化試験を行なった。なお、この試験は、堆肥化の困難な冬期に行なった。
【０１４２】
用意された試料は次のようなものである。
（４−１） 牛糞 ５４ｔ（水分調整せず。水分率８０％）
ＣＦＰ ９ｔ（コーヒー搾り滓、水分率８％）
脱脂大豆粕 ３ｔ（大豆タンパク源）
ＯＹＫ菌 ５０ｋｇ（大豆タンパク菌体製剤）
（４−２） 牛糞 ５４ｔ（水分調整済み）
ＣＦＰ ９ｔ
（４−３） 牛糞 ５４ｔ（水分調整無し）。
【０１４３】
発酵の温度変化及び外気の気温をグラフにして図６に示す。各曲線の符号は試料の番号である。試料（４−２）に示されるようにＣＦＰのみでは発酵温度は不十分でありまた試料（４−３）においては発酵温度の上昇は殆どみられない。これらの結果から菌体製剤が発酵温度の上昇に大きな効果があることが実用条件下で証明された。試料（４−１）に於いては試験開始後直ぐに温度の上昇がみられ、以後継続して上昇を続けた。その後の状況は図５とほぼ同様で実用可能な結果をもたらした。
【０１４４】
これによる堆肥は糞臭は全くなく僅かな土臭がした。しかしＣＦＰの添加は水分の調節と好気環境を保持する効果があり通性嫌気性菌であるＯＹＫ菌は、嫌気より好気の方が増殖効果が大きいため、ＯＹＫ菌の活動を活発にした。温度が低い環境での堆肥化は、微生物の活動により温度が上昇しかけてもすぐに周辺の低温部に熱を奪われ、結果的には４０℃以上の温度上昇はみられないことが多い。しかし、ＯＹＫ菌体製剤を混入する牛糞では、ＯＹＫ菌が標準菌に比べ投入直後では約１万倍という異常増殖を発生させ、これにより周辺低温部に負けない温度上昇が発生し、逆に周辺部に熱エネルギーを拡散し、その周辺にすでに生息する微生物の増殖を促し、全体が８０℃近い温度まで上昇させる。これは、高温発酵菌の増殖によるものである、これにより、有害菌、雑草の種子を死滅させた安全な完熟堆肥が製造できる。
【０１４５】
上述の実施例では本発明になる菌体製剤を牛糞に用いて説明しているが他の動物の排泄物（例えば鶏糞、馬糞）や生ゴミに対しても有効に使用しうることは云うまでもない。
【０１４６】
（菌体製剤の脱臭材への利用）
水１００ｃｃに粉末寒天１．５ｇ、グルコース１ｇ、グルタミンソーダ１ｇ、大豆タンパク菌体製剤１ｇ、コーヒー搾り滓１０ｇを溶解させ充分撹拌して容器に注入した。２０℃にて１日放置すると固形物が得られる。
この固形物を調理場の流し排水口や生ゴミ収容篭に投与した。これにより、流し排出口や生ゴミ収納篭からの悪臭の発散を予防することができた。これは、投入された固形物が少しずつ溶解しながらＯＹＫ菌が流出して増殖し、そしてこのＯＹＫ菌が腐敗菌の増殖を抑制して悪臭の発散を阻止したものと考えられる。
【０１４７】
（菌体製剤の錠剤）
大豆タンパクを含む菌体製剤、ゼラチンの水溶物、及びコーヒー搾り滓（ＣＦＰ）を混練し、バラけない程度に水分を蒸発させた。その後、混練物を打錠機で打錠して錠剤を得た。ゼラチンは菌のタンパク源となるほかバインダーとして働き、形状の維持に効果がある。また、ＣＦＰは通気性を良好にする。
得られた錠剤において、菌は胞子化した状態で生存する。この錠剤に水分を与えると菌の増殖が始まるので、例えば有機汚染された池などに投与すると、当該錠剤は浮遊しながら池表面に広がるので都合がよい。菌が実際にその効果を示す条件は投与時点で高濃度であることが必要で徐々に分散範囲を広げていくようにすれば菌の作用が顕著でやがて池全体に効果が及ぶ。
【０１４８】
（盤状脱臭剤の作成）
多数の貫通穴を有する円盤状の固形物の作成について説明する。
水１００ｃｃに、粉末寒天１ｇ、グルコース１ｇ、グルタミン酸ソーダ１ｇ、大豆タンパク１ｇ及びコーヒー抽出滓１００ｇを混合し溶解した。この混合液を充分攪拌し、１２０℃、２０分間オートクレーブ処理した。
上記混合液は７０℃以上では流動性を有しているので、図８に示すような、底面から上方に向けて延びる凸部（１３）を多数有するプラスチック製容器（１４）に上述の混合液（１５）を注入し、のち室温になるまで徐冷した。
１×１０９個／ｍｌのＯＹＫ菌濃縮液（１６）の約０．１ｍｌを混合液（１５）上に散布し、室温２０℃にて２４時間放置した。これにより、混合液（１５）が固形化した。なお、混合液（１５）は収縮しながら固形化するので、固化後、容器（１４）から簡単に離形させることができ、図７に示すような、穴（１２）を多数有する円盤状の固形物（１１）を得た。
【０１４９】
（盤状脱臭剤の利用）
上記実施例で得た固形物（１１）を脱臭剤として用いる。設置個所としては、調理場のシンク排水口や、シンク内に別途設置した、生ゴミ用の網目状容器などである。
【０１５０】
固形物（１１）を投入した箇所において、悪臭の発生を最小限に抑えることができた。これは、ＯＹＫ菌が、有機物の腐敗を促す雑菌の増殖を抑制した結果である。すなわち、固形物（１１）は、多数個のコーヒー搾り滓を互いに付着させることにより多孔質、つまり好気的環境となり、また固形物（１１）はＯＹＫ菌にとっては富栄養物でもあるので当該ＯＹＫ菌は活発に増殖する。そして穴（１２）は固形物（１１）の表面積を増大させると共に、水流の通り抜け口ともなる。 なお、上記実施例に用いた粉末寒天の一部を糊剤に変えることもできる。糊剤としては、澱粉などの天然高分子物質やアクリル酸系の合成高分子物質を用いることができる。例えば、粉末寒天１ｇに変え、０．２ｇの粉末寒天と０．８ｇの澱粉とすることができる。また、コーヒー搾り滓の代わりにその一部をおがくずで置換してもよい。おがくずは、水に添加する栄養物質を吸着するほか多孔質にて微生物の増殖基地としての役割を果たすことができる。
【０１５１】
多孔性無機物質を使用する例としては、パーライトに栄養分を付着させ、これに菌を入植させて用いる場合と、臭気を吸着する機能を有する多孔性無機物質、例えば粒状活性炭、ゼオライトなどの無機微粒子を適宜配合して吸収性能を向上した合成吸着剤を用いる場合がある。ゼオライトはトリメチルアミンやメチルメルカプタンの吸収能が高く、菌の増殖と相俟って脱臭作用に効を奏す。なお、ゼオライトを配合する場合の処方は、次の通り。水１００ｃｃ、粉末寒天１ｇ、グルコース１ｇ、グルタミン酸ソーダ１ｇ、大豆タンパク１ｇ、コーヒー搾り滓５０ｇ、ゼオライト細粒５ｇ
【０１５２】
（浴槽の湯における雑菌の繁殖防止）
ＯＹＫ菌を増殖させて浴槽の湯における雑菌の繁殖防止方法を図面に基づいて説明する。
先ず、水１００ｃｃに対し、寒天粉末１．５ｇと、菌が増殖するための栄養分としてグルタミン酸ソーダ、グルコースおよび大豆蛋白を各々溶解させ、１２０℃にて２０分間オートクレーブ処理した後、徐冷した。この混合液の粘度が高くなったところで、図９に示すように四角形（１５ｃｍ×１０ｃｍ）のポリエステル不織布（１ａ）上に厚さ２ｍｍの塗布厚で以て前記混合液を塗布し、固形化して寒天培地（２）を形成した。そして、この寒天培地（２）上にＯＹＫ菌の濃縮液（約１０９個／ｍｌ）を０．１ｍｌ散布した。
【０１５３】
その後、図１０に示すように、寒天培地（２）の全体を覆うようにポリエステル不織布（１ｂ）敷設するとともに、周辺部分にて両不織布を互いに接着剤で貼着し、ＯＹＫ菌担体（１０）を得た。
【０１５４】
図１１に示すように、浮き子（３）をポリエステル不織布（１ａ）の外側面に貼着することにより、ＯＹＫ菌担体（１０）を湯面に浮かせることができる。この浮き子（３）は、例えば内径２ｍｍの樹脂チューブの両端を閉じた物からなり、ＯＹＫ菌担体（１０）の四辺の各々に沿って貼着される。
【０１５５】
なお、図１２に示すように、ＯＹＫ菌担体（１０）の端部に紐（４）を輪奈状にして取り付け、図１３に示すように浴槽（５）に設けられた栓（６）に引掛けてもよい。これにより、槽壁（８）にＯＹＫ菌担体（１０）を設置することができる。また、ＯＹＫ菌担体（１０）を浴槽蓋（図示せず）の裏側に接着テープで貼着することもできる。さらに、ジャグジー風呂において、泡を発生させるための空気取り入れ口のフィルターにＯＹＫ菌担体（１０）を設置して外気から侵入する雑菌の増殖の抑制を図り、同時に空気供給パイプの内壁を清潔に維持することも可能である。
【０１５６】
その他、ＯＹＫ菌を２４時間風呂（浴槽の水を入浴ごと取り替えないで循環式にしてゴミを取り除き、しかも常時保温していつでも入浴できる快適さを持った風呂）に用いて浴槽の水における雑菌の繁殖防止を図ることもできる。すなわち、ＯＹＫ菌が繁殖して湯中に遊出し、２４時間風呂の温湯の循環経路や循環装置の内部を通る。増殖したＯＹＫ菌は長期間に亘り雑菌（例えばレジオネラ菌など）の増殖を抑制する共に雑菌が増殖した結果として発生する悪臭を減少させる。
【０１５７】
なお、上述の実施例で得た菌体製剤を用いて、浴槽の湯中におけるレジオネラ菌などの雑菌の繁殖防止を図ることもできる。
【０１５８】
（生理用ナプキンへの利用）
市販の女性用生理ナプキンの経血吸収領域に、多数のＯＹＫ菌が胞子化した粉末（菌濃度１×１０１０個／ｇ）を適量封入した。封入の仕方としては、例えば、当該粉末を加圧空気式の散布器に充填し、この散布器の噴射口から散布する方法がある。
【０１５９】
封入した粉体が経血に触れると発芽し、経血に含まれる蛋白質を消化して増殖する。ＯＹＫ菌は弱酸性から弱アルカリ性の領域および３０℃近い温度領域で最も良く活動し、しかも初期の菌濃度が極めて高いので、他の雑菌の繁殖を抑制して異臭の発散を防止するとともに局部を清潔に保つことができる。
なお、前記したＯＹＫ菌の粉末と粉末状の富栄養源、例えば大豆タンパクとを混合して用いることもできる。この場合にあっては、当該混合物を吸水部材に直接散布して用いるか、あるいは水溶解性のフィルムから成る扁平な袋に封止して吸水層に挟み込むのが適切である。水溶解性のフィルムの材料としては、例えば澱粉（オブラート）、カゼイン、ゼラチン、ＰＶＡ、ＣＭＣなどを使用する。
【０１６０】
また、ＯＹＫ菌の粉末を複数層に積層された不織布よりなる吸水部材の内部に固定することもできる。すなわち、生理用ナプキンの経血吸収部分は、複数層に積層された不織布からなる場合が多いが、そのうちの１つあるいは２以上の不織布にＯＹＫ菌を接着すればよい。例えば、濃度１×１０７個／ｍｌのＯＹＫ菌の菌液にＰＶＡ（バインダー）を１０％添加した分散溶液を不織布に対してスクリーン捺染機を用いて捺染し、のち６０℃程度で乾燥させてＯＹＫ菌を全て胞子化させる。これにより、ＯＹＫ菌の胞子の多数が不織布の繊維に絡まった状態に固定するので、この不織布を裁断して吸水部材を構成する不織布の一層とすることもできる。
【０１６１】
（おむつへの利用）
ＯＹＫ菌をおむつに適用する場合も、前述したように、ＯＹＫ菌の菌液にバインダーを添加した分散溶液を捺染した不織布を用いることもできる。
また、ＯＹＫ菌は、必ずしも胞子化した状態で付着させる必要はなく、例えば肉エキスとペプトンの混合粉末（ニュートリエントブロス）の７％溶液にＯＹＫ菌を投入して振とう培養し、この培養液に不織布を浸漬してＯＹＫ菌を含ませ、のち水分を除去して用いることもできる。この場合、ＯＹＫ菌は乾燥により胞子化されて繊維に絡まって保持される。
【０１６２】
（ＯＹＫ菌を混入させたフィルム）
澱粉、カゼイン、ゼラチン、ＰＶＡ、あるいはＣＭＣの水溶液に、胞子化したＯＹＫ菌を混合して分散させた。この分散液を、所定の厚みを以て平らな面に塗布し、のち５０〜７０℃で乾燥させた。そして、乾燥物を平らな面から剥がしてＯＹＫ菌を保持したフィルムを得た。
このようにして得たフィルムを、例えば上記した生理用ナプキンにおける経血吸水部分に積層したり、おむつに用いたりすることができる。
【０１６３】
（熱エネルギー源としての代謝エネルギーの利用）（図１４参照）
有機性廃棄物（例えば家畜糞尿）の堆肥化発酵工程では、発酵に伴う昇温がみられる。これを着脱可能な蓋付きの断熱容器（３１）内で、水分、栄養分（Ｃ／Ｎ比）、通気量、温度などを調節しながら最も効率の良い発酵を行なわせ、発生する余剰発酵熱を利用することができる。通常、家畜糞尿の発酵では３０〜５０℃程度しか昇温しないが、ＯＹＫ菌及びＯＹＫ菌と高温菌の菌体製剤を添加することにより堆肥化初期段階に急速に昇温し、高温菌（好熱菌）の活動が活性化され、７０〜１００℃の温度が得られる。ここでいう余剰発酵熱利用期間とは、堆肥化発酵工程において、熱交換を行なっても温度上昇が確認できる期間である。
【０１６４】
温度センサー（３８）が容器内の堆肥の温度を測定し、その温度状況により自動的にバルブ（３９）が制御される。発熱の際の水分蒸発を妨げないようにするために、エアーバルブ（３６）より適切量の水蒸気が放出され、栄養分や水分の不足に対しては、投入口（３５）より容器内へ投入できるようになっている。通気口（３７）は断熱容器（３１）の床面に設置されており、堆肥体積に対する空気の通過の極端なムラが生じないようになっている。また、容器内の発酵熱は熱交換機（３２）により、媒体として水、空気、高分子の液体等を用いて熱エネルギーを取り出すことができる。更に、容器内の発酵を均一化させるために、攪拌モータ（３３）と連動している攪拌スクリュー（３４）が回転する。攪拌は、発酵の状況にもよるが、１日１回程度の攪拌でよい。
【０１６５】
また、単に堆肥製造一次発酵槽、二次発酵槽の床面、壁面及び堆肥を覆うシートに熱交換機を配管し、堆肥化発酵工程における発酵熱を利用してもよい。
【０１６６】
有機性廃棄物の堆肥化発酵工程において、積極的な通気管理及び攪拌（切り返し）を行なっても温度が上昇しないようならば、一次発酵は終了したものと考えられる。当該装置において、堆肥の温度が上昇しないような状態になれば、断熱容器（３１）から搬出したものを堆肥として利用することができる。
【０１６７】
一般的に堆肥化発酵工程において、温度の履歴があるほど栄養分（Ｃ／Ｎ比）の値は低下する。当該装置において熱交換機を利用して発酵温度を調節し、堆肥の発酵自体を制御することによって完熟堆肥を製造するだけでなく、未分解の栄養成分を含んだ堆肥を製造することが可能になる。
【０１６８】
よって、当該装置を数機設置することで、有機性廃棄物の堆肥化発酵工程における余剰発酵熱を発酵初期段階に必要な熱源として利用することができたり、畜舎の床面の暖房、冬期における融雪などの熱源として利用することができ、農業環境の一層の改善につながるものである。
【０１６９】
また、乳牛などの畜舎における床や壁の温水洗浄として利用すれば、当該乳牛の乳房炎を防ぐのに極めて大きな効果をもたらす。
【０１７０】
さらに、廃棄物から可燃ガスを抽出する嫌気発酵手段にも用いることができる。すなわち、上述の装置から得られる温湯を嫌気発酵槽内の廃棄物の加温に使用するほか、本発明の菌体製剤を嫌気発酵の前段階に利用し、まず廃棄物を菌体製剤で４０℃程度まで昇温した後、嫌気環境に切り換え、嫌気発酵の高効率化を図ることができる。
【０１７１】
（カプセル化したＯＹＫ菌の利用）
ＯＹＫ菌またはこれを含んだＯＹＫ菌体製剤をカプセルまたは重層錠剤に封じ込め、それを経口投与した人または家畜、または座薬として投入した人または家畜の糞臭を抑えることに利用する方法を述べる。
【０１７２】
ＯＹＫ菌は、その性質から、ｐＨ６．１の環境では増殖するが、ｐＨ５．４では増殖しない。動物の胃の中はｐＨ２〜３の強い酸となっており、上記カプセル等を投与した場合、胃酸により細菌は死滅する。ＯＹＫ菌を生きたまま腸まで届かせ、糞臭をＯＹＫ菌の増殖によって抑えるためには、当該ＯＹＫ菌を胃中を通過させ、小腸の働きを妨害せずに直腸まで到達させ、直腸内の糞を有機性栄養分として取り込んで増殖させる必要がある。その方法としては次のような手段がある。すなわち、ＯＹＫ菌またはＯＹＫ菌体製剤を腸溶性（胃では溶けず腸で溶ける）の保護膜あるいはカプセルにより包み込んであるいはコーティングして、錠剤、カプセル剤、座薬などの製剤とすればよい。
【０１７３】
以下、具体的に述べる。
ゼラチン１４重量部、グリセリン３重量部、低メトキシルペクチン３重量、及び精製水８０重量部を均一に混合し、液状の被覆組成物を得た。この被覆組成物を環状孔から押し出すと同時に環状孔の内側において同心円状に設けられた内孔口よりＯＹＫ菌またはＯＹＫ菌体製剤の練り品を押し出し、この複合ジェットを冷却液中に放出した。これにより、０．５〜１０ｍｍφの粒度のカプセルを得た。これを塩化カルシウム水溶液に数分浸漬し、乾燥洗浄して腸溶性軟カプセルを得た。
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】防臭試験に供した排水処理場における排水設備と処理能力を示した説明図である。
【図２】ＯＹＫ菌とＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ標準菌との増殖速度を比較したグラフを示す図である。
【図３】堆肥化の温度変化をグラフに示した図である。
【図４】堆肥化の温度変化をグラフに示した図である。
【図５】屋外における堆肥化の温度変化をグラフに示した図である。
【図６】実用試験における堆肥化の温度変化をグラフに示した図である。
【図７】本発明の脱臭剤の形状を示す斜視図である。
【図８】本発明の脱臭剤として固形物を成形する状態を示す断面図である。
【図９】寒天培地の固定状態を示す断面図である。
【図１０】ＯＹＫ菌担体の断面図である。
【図１１】浮き子を貼着したＯＹＫ菌担体の断面図である。
【図１２】別の実施態様のＯＹＫ菌担体の断面図である。
【図１３】ＯＹＫ菌担体を浴槽に用いた例を示す断面図である。
【図１４】代謝エネルギーを熱エネルギー源として利用する装置の断面図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は溶血性を有さない新規微生物、及びその利用に関し、詳しくは増殖により悪臭を発生せしめる有害菌（例えば黄色ブドウ球菌、肺炎桿菌など）に対して高い抗菌活性を有し、これにより、例えば排水処理施設より発生する悪臭を除去することができ、また、その他の細菌（例えばメチシリン耐性黄色ブドウ球菌、病原性大腸菌Ｏ−１５７、レジオネラ菌など）に対しても高い抗菌活性を有することから幅広い用途で用いることのできる新規微生物、及びその利用に関する。
【０００２】
なお、本発明の新規微生物における抗菌活性は当該新規微生物の菌体外生成物、及び菌体内生成物によって起こるのみならず、次のようなメカニズムによっても発揮されている。
【０００３】
すなわち、本発明の新規微生物は、例えば１０３個／ｇ（ｍｌ）の菌濃度が ２０〜４０℃の培養条件下にて約２時間で１０６個／ｇ（ｍｌ）の菌濃度に達し、しかも６時間以内に１０８個／ｇ（ｍｌ）に達するといった、増殖開始時から通常では考えられないような急激な増殖スピードで以て繁殖する。ところで、通常の細菌の増殖は、６時間前後の増殖準備期間（菌体が新しい環境に置かれた場合、その環境に順応して増殖を開始するための準備期間）、いわゆる“誘導期”を経たのち行なわれるが、本発明の新規微生物は、前述したように上記“誘導期”が殆どなく、実質的には、培養開始後、速やかに、かつ爆発的に細胞分裂を起こして固体数を殖やしていく。このように、前記雑菌の誘導期において、本発明の微生物が回りの栄養分を貪欲に消化しながら爆発的に繁殖し、これによって前記雑菌の繁殖が抑圧され、結果的に上記した有害菌等に抗菌活性を呈するものと考えられる。すなわち、誘導期を殆ど持たず、培養後、即時に増殖する新規微生物が有害菌の増殖を抑制していると考えられる。
【０００４】
ところで、細菌の中には比較的高温で増殖する高温菌（例えばミクロモノスポラ、ノカルディア、ストレプトマイセスなどの放線菌、アルタナリア、アスペルギルス、ケトミウムなどの糸状菌など）があり、本発明の微生物が極めて短い誘導期を経たのち爆発的に増殖し、これにより増殖系内の温度が５０〜６０℃位になるまで熱を発したのち、前記の高温菌が増殖を開始して更に温度が高まり、外気温が３０℃程度の場合でも１００℃近くに達する。
【背景技術】
【０００５】
最近、例えば排水処理技術のように、微生物を利用した技術が盛んである。排水処理に使用される微生物は多数あるが、そのうち主要なものとしては次のものがあげられる。すなわち、細菌としては、Zooglea、Sphaerotilusなどが、原生動物としてはアメーバー類、繊毛虫類、鞭毛虫類などが、また藻類としては藍藻類、緑藻類、ケイ藻類などがあげられる。
【０００６】
これらは、有機物、及び一部の無機物を分解することが出来るが、その分解時において、悪臭（アンモニア、硫化水素等）及び悪臭発生物質の産生を引き起こす場合があり、そして処理場から発生する悪臭が、しばしば社会問題として取りざたされていた。つまり生物学的処理法に基づく排水処理に於いて有機物質または無機物質の分解が効率よく行われたとしても、処理場から発生する悪臭に関しては放置されたままであった。特に、沈澱槽に沈澱する活性汚泥は次第に嫌気性となり、嫌気性菌の増殖に伴って多量の悪臭が発生するが、この汚泥を曝気槽に返送する際、排水処理場の周辺に多量の悪臭を漂わせた。
【発明の開示】
【０００７】
本発明者らは、上記したような問題の発生を背景にして新たな有用微生物を鋭意探索した結果、ついに、有機物の分解時において硫化水素、メチルメルカプタン等による悪臭を発生せず、しかも増殖により悪臭を発生せしめる細菌Staphylococcus aureusおよびKlebsiella pneumoniaeや、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、病原性大腸菌Ｏ−１５７、レジオネラ菌あるいは緑膿菌などの細菌に対して抗菌性を有する新規な有用微生物を土壌から分離することに成功し、そしてこの新規微生物を幅広い領域で利用できることを見い出し、そして本発明に至った。
【０００８】
本発明の新規微生物は、非溶血性バチルスズブチルス類縁菌で、標準枯草菌 （ＩＦＯ３１３４株）に比較して菌体体積が４倍以上あり、かつ３７℃におけるニュートリエントブロス浸透培養では培養初期に殆ど誘導期がないため１０３個／ｍｌの初期菌数が４時間後に１０７個／ｍｌ以上に増加し、これらの相乗効果により、増殖によって発生する代謝エネルギーが、前記標準枯草菌のそれに比べて１万倍以上になるものであり、黄色ブドウ球菌、肺炎桿菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、病原性大腸菌Ｏ−１５７、レジオネラ菌、緑膿菌、フザリウム、麹カビ、青カビ、白癬菌及びくものすかびに対して抗菌性を有する。
【０００９】
本発明の新規微生物であるバチルスズブチルスの類縁菌の具体例としては下記のＯＹＫ菌（通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに国際寄託されている）が挙げられる。
（１）Bacillus sp.ＯＹＫ−０１−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９４）、
（２）Bacillus sp.ＯＹＫ−０３−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９５）、
（３）Bacillus sp.ＯＹＫ−０４−０００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９６）。
以下、ＯＹＫ−０１−６００、ＯＹＫ−０３−６００、及びＯＹＫ−０４−０００のそれぞれを、単に「ＯＹＫ菌」ともいう。
【００１０】
ＯＹＫ菌はタンパク質を消化してよく繁殖する。また、ＯＹＫ菌は溶血素を産生しない特徴を有し、人に対して安全性の高い菌である。なお、この菌を動物に対して静脈内投与、経気道投与、経口投与および皮膚投与の４種類の投与を行ない、当該菌の安全性が確認されている。
【００１１】
更にＯＹＫ菌は黄色ブドウ球菌、肺炎桿菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、緑膿菌、レジオネラ菌、大腸菌Ｏ−１５７、フザリウム（アカカビ）等に抗菌性を有しているので高濃度のＯＹＫ菌を投与してこの菌の効力を顕著ならしめることで多方面での利用が可能である。また、このＯＹＫ菌は増殖時に、悪臭の源であり、人に対して特に敏感な悪臭であるメチルメルカプタン、硫化水素、トリメチルアミンを生成しないので防臭を必要とする処に用いても効果が発揮される。
【００１２】
一般的に菌密度の大きい方が優勢に増殖する傾向にあるので、最初に投与するときの菌濃度は極めて重要になる。本発明における好ましい菌濃度は、１０６〜１０９個／ｇ（ｍｌ）である。
【００１３】
ＯＹＫ菌はズブチルス種の中でも比較的大型である。例えば、バチルスズブチルスの標準菌（ＩＦＯ−３１３４、（０．４〜０．６×１．５〜３．２μｍ））の約４倍（体積比）である。しかもＯＹＫ菌は培養開始後の初期増殖力に優れ、これにより代謝エネルギーを大量に発生する（標準菌が培養開始後４時間で６倍程度の増殖しかないのに対し、ＯＹＫ菌は約８０，０００倍という極めて高い増殖を行なう）。また、通性嫌気性であることから、好気嫌気の両条件で強い増殖が可能となる。これにより、堆肥化の際に有機性廃棄物を速やかに昇温させ、そして高温菌である放線菌、糸状菌の活動を促すことで堆肥化の期間を短縮できると共に完全な熟成堆肥が得られる。
【００１４】
堆肥は、言うまでもなく農作物の生育のために使用されるもので、堆肥化に用いられた菌を農作物が、或いは人が吸収する可能性があるので、前記菌の安全性は特に重要である。高い熱（７０〜８０℃）履歴を経過した完熟堆肥は、糞中に含まれる雑草の種子はもちろんの事、有害感染菌はすべて死滅しており、言い換えれば消毒されたものと考えられる。このようにして得られた堆肥は、最近、肉牛の畜舎の敷料として利用されている。敷料としてしかれた完熟堆肥は、牛に快適感を与え牛はよく眠る。肉牛は、快適ではない敷料では寝ずに立ち、これによって肉質が硬くなると言われており、完熟堆肥の別の利用方法として注目されている。この点に鑑み、安全性が確認された菌、すなわちＯＹＫ菌を用いることが好ましい。
【００１５】
本発明の新規微生物は抗菌防臭効果に優れている。従って、例えば、排水処理場に用いることにより悪臭を発することなく排水を処理することができる。また、増殖スピードが極めて速いことから、堆肥の製造が、気温が比較的低い冬期の場合でも素早く、しかも完全熟成タイプの堆肥の製造が可能となる。
【００１６】
さらに、本発明の新規微生物から抗菌性物質を精製することができる。そもそもこの微生物は、毒性が少ないとされる土壌由来の微生物より分離精製したものであるので、その抗菌性物質についても人体に対して比較的安全であることから、おむつや生理用ナプキンあるいは風呂水の雑菌増殖抑制など、従来使用できない分野における抗菌加工を可能にするばかりか、繊維分野における製品（衣料、タオルなど）のように従来より抗菌加工が行なわれてきている製品にはみられない穏やかな抗菌性による抗菌加工（アレルギーが起こらない）ができる。
【００１７】
［菌体製剤］
本発明のバチルスズブチルスの類縁菌は、そのままの状態あるいは胞子化した状態で使用することも可能であるが、当該細菌の増殖速度を速やかに上げ（濃度を速やかに上げ）、しかも取扱い易い形態と成すべく、当該細菌を富栄養源に包囲、付着あるいは混入させた菌体製剤として使用されることが好適である。
【００１８】
富栄養源としては、その主成分がタンパク質であることが好ましい。タンパク質としては、大豆、脱脂大豆、おからなどの大豆加工品や大豆滓、大豆を絞った豆乳およびこれを濃縮したものやフリーズドライ化したもの、大豆を粉末化して水などの溶媒に分散あるいは溶解した混合物、穀類に含まれるグルテン、乳に含まれるカゼイン、コラーゲンを熱湯処理したゼラチン、魚粉から得られる魚タンパク質などが挙げられる。その他、富栄養源としては米糠、ふすま、バレイショ、ビール酵母、さとうきび等を用いることが出来る。富栄養源として例えば大豆加工品を用いる場合、固形分が多いものでは菌を直接植え付けた後、粉砕乾燥させて用いる。液状のものでは予め水分をある程度除去して粘状物とし、その後、菌を植え付ける。植え付ける菌の形態としては、培養液を含む生菌の状態で行なう。
【００１９】
菌体製剤の形態としては特に限定はなく、粉末状、粒状、シート状、成型体等が挙げられる。富栄養源の添加物として、本発明の新規微生物に好気性環境をもたらす、多孔質物が考えられ、コーヒー粕、おがくず、パーライト、ゼオライト、活性炭などが挙げられる。菌の増殖にはバランスのとれた炭素、窒素、リン、硫黄の４元素が必要であり、大豆はこれを満足している。さらに、５０℃以上の高温域で増殖する高温菌（放線菌や糸状菌など）を胞子化させた粉体の状態で混在させて本発明の菌体製剤とすることもできる。上述したような富栄養源を用いることで菌濃度１×１０８個／ｇ〜１×１０１０個／ｇが確保されるような菌体製剤を得ることができる。
【００２０】
前記の菌体製剤を有機性廃棄物（生ゴミ）及び排泄物に投入して発酵を促し、堆肥化を図る。本発明の新規微生物は、平均して１０〜５０℃の温度範囲で活発に増殖活動し、より高温で発酵する菌の活動を促進するための環境を速やかに作り出す。そして、高温域ではＯＹＫ菌は温度上昇により死滅、もしくは胞子化し、高温増殖菌の栄養源として取り込まれ、殆ど消滅する。６０℃前後で、系の上部と下部とを入れ替えるような作業（切り返し）を行なえば、未発酵物を菌体に接触させることができ、また好気環境を作ることもでき、切り返しによって一時的にみられる温度降下を打ち消す昇温がのちにあり、全体は完熟堆肥へ進行する。
【００２１】
高密度の細菌を含んだ菌体製剤を有機性廃棄物に投入し、適温での切り返しにより好気発酵を促す。好気発酵時、アンモニアが多少発生するが、混在させたコーヒー粕などの多孔質物がこれを吸着する。この増殖による代謝エネルギーにより、温度が５０℃以上に上がり、これにより高温発酵菌（放線菌、カビ）の活動を促し、７０℃以上の温度になる。この高温により有害微生物及び昆虫は死滅し、植物発育障害をもたらす難分解有機物の分解も促進され、また糞中に混在する雑草の種子も死滅する。このことにより、有機栽培に必要な安全な完熟堆肥が得られる。
【００２２】
［脱臭剤］
本発明の新規微生物は、嫌気発酵によって発生する不快臭（硫化水素、メチルメルカプタン、トリエチルアミン）に対する脱臭剤として使用することもできる。 脱臭剤としては、そのままの状態あるいは胞子化した状態で使用することも可能であるが、前項で述べた菌体製剤を用いることが好ましい。ただ、防臭を目的とする関係上、有穴盤状、球状、平板状、多角形状、網状、多枝状など、単位重量あたりの表面積が大きい形状であることが好ましい。平板状物にパンチング、ドリリングなどの手段で穴を設けたものでも構わない。なお、脱臭剤を水溶性とすることにより使用範囲が広くなって好ましい。
【００２３】
本発明の脱臭剤をそのまま、あるいはネット状の容器に入れて、例えば調理場の流し（シンク）、排水経路（排水口を含む）、動物の飼育場や動物処理場（屠殺場など）あるいは医療現場における汚物処理場やその床や洗浄槽などに用いる。
【００２４】
本発明の新規微生物を防臭剤として使用するに当たり、当該微生物に求められる好適な条件を以下に列挙する。
（１）人にやさしく、かつ高密度微生物群を構成し得る菌体である。
（２）高密度微生物群を持続形成するために、多孔性富栄養源中（臭気を吸収する機能を持つものなど）で培養される。
（３）熱湯中では、胞子を形成して生存し得る性質を有する。
（４）低濃度の残留塩素に耐え得る。
（５）増殖にあたり悪臭を発生しないか、又は発生しても微量である。
（６）高湿度環境下、富栄養源を含有する水溶性固形物に分散した場合、増殖に伴い悪臭を発生する他の微生物（雑菌）の増殖を上回る増殖能を有する。
（７）抗菌性物質を生成して分泌し、低濃度の雑菌類の増殖を阻害する。
（８）例え口に入っても安全である。
【００２５】
［風呂水用雑菌増殖抑制］
本発明の新規微生物を用いて浴槽の水あるいは浴槽の壁面や蓋における雑菌の増殖の抑制と脱臭を行なうこともできる。
【００２６】
［生理対応用品］
本発明の新規微生物を生理対応用品に含ませて用いることもできる。ここでいう生理対応用品とは、人やその他の動物の生理現象に伴う分泌物、排泄物に対処するための用品を指すものであり、例えば生理用ナプキン、おむつ、床ずれ予防シート、肌着などが挙げられるがこれによって限定されるものではない。上掲した生理対応用品のうち、特に有効なものは生理用ナプキンである。すなわち、経血は吸水性の高い高分子素材や繊維素材からなる吸水部材に吸収されるから、当該吸収部材にあらかじめ、本発明の新規微生物、例えばＯＹＫ菌や菌体製剤を含ませておけば、経血吸収領域における有害菌を含む雑菌の繁殖を抑制するとともに脱臭作用を奏する。排泄物の吸収や漏れを防止するおむつに本発明の新規微生物を適用しても同様の作用効果を奏する。すなわち、おむつに新規微生物を適用した場合、排泄物に含まれ悪臭の原因となる雑菌の繁殖を抑制すると共に脱臭作用を奏し、同時に本発明の新規微生物が持つ抗菌活性によって感染症の予防が期待され得る。
【００２７】
上記した生理対応用品にＯＹＫ菌あるいは粉末状のＯＹＫ菌を保持させる方法としては種々考えられるが、対象物に菌が定着しにくい場合はペプトンを含む生理食塩液に粉末状の菌を混合して噴霧器で散布すればよい。また、対象物が濡れているような場合にはむしろ粉末状の菌を直接散布する。その他の方法としては、例えば次のような方法が挙げられる。すなわち、水溶解シートからなる袋体の内部に収納したものを生理対応用品に取着するか、あるいは前記水溶解シートの表面に水溶解性バインダを用いて菌を定着させたものを生理対応用品に取り付ける。水溶解性材料としては澱粉、カゼイン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）等を用いる。
【００２８】
人あるいはその他の動物が長期に亘って床に伏すような場合、床に当接した皮膚において、いわゆる“床ずれ”を起こす。魚類においては、水槽に長時間保管する場合は魚同士の接触によって鱗が損傷したり、魚体の体表においてヌメリが発生する。鳥類においては翼の表面の艶が失われることがある。犬や猫などの愛玩小動物あるいは牛、豚、羊、馬などの家畜では毛並みが不揃いとなる。これらは全て、体表面や獣毛からの分泌物の蓄積や、魚類においては体表に付着した餌の残留物の腐敗が原因で起こる。すなわち、動物の体表面や獣毛からの分泌物が堆積し、当該分泌物に雑菌が繁殖することにより上記したような異常を来すわけである。時には、緑膿菌など皮膚を犯す菌が繁殖する場合もあり、常在菌の健全な繁殖分布が損なわれる。
【００２９】
ＯＹＫ菌は上記した分泌物を分解し、かつ有害な菌に対して抗菌性を示すので、上記したような症例に対しては、ＯＹＫ菌を体表面に対して散布あるいは塗布することにより顕著に改善される。人やその他の動物の皮膚、羽、獣毛にＯＹＫ菌を直接的に散布あるいは塗布するには、ＯＹＫ菌を含む溶液を用いるか、あるいは胞子化した粉末を用いるのが手軽である。粉末を用いる場合は、例えばエアスプレー式の粉体散布器を用いて直接散布する。散布されたＯＹＫ菌の胞子は、生体からの湿気を得て発芽し、分泌物を消化しながら増殖していく。増殖速度は速く、また増殖時にアンモニアを生産しないので、暫くすると臭気が消え、散布箇所がサラサラして獣毛は洗浄した時と同様の感触が得られる。鳥の羽毛にも同様の効果が得られる。また、魚類の棲む水槽にＯＹＫ菌の粉末を投入することにより、体表のぬめりを解消することができ、鱗が仮に損傷しても治癒が速い。この場合は淡水魚が好ましい。散布あるいは塗布されるＯＹＫ菌濃度としては、１×１０６〜１×１０８個／ｇで、菌の富栄養源を併用しても良い。
【００３０】
［抗菌グッズ］
本発明における抗菌グッズとしては、上掲の生理対応用品の他に、ＯＡ機器のケーシング、下敷きや筆箱などの文房具、ＦＡＸや電話機などの通信機器などがあげられる。
【００３１】
［加温グッズ］
加温グッズとしては例えば面状発熱体が挙げられる。菌体製剤は５０〜６０％程度の湿気を帯びると約４０〜５０℃に昇温することが確認されている。したがて、本発明の菌体製剤を、例えば密封容器あるいは密封袋体に入れておき、開封時において湿気に晒された細菌が増殖を始め、これによる代謝エネルギーを前記面状発熱体のエネルギー源とすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明の実施例を説明するが、これらの実施例は本発明を説明するための一例であって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３３】
Ａ．新規微生物スクリーニング
増殖により悪臭を発生する細菌に対して抗菌性を有する微生物を土壌より３菌分離した。土壌菌は一般に毒性が少ないと言われており、このような土壌より分離した前記３つのＯＹＫ菌も人体に対し安全である（やさしい）といえる。
【００３４】
Ｂ．菌株の同定
ここで分離選別した菌体の菌学的性質を下記[1]、[2]に基づいて同定した。即ち
[1] Bergey's Mannual of Determinative Bacteriology、 Vol.2 (1986), Williams & Wilkins U.S.A
[2] R.E.Gordon, W.C.Haynes, C.H.Pang. (1973) The Genus Bacillus. Agr. Handbook No.427 United states department of Agriculture. Washington D.C.
に基づいて同定した。試験は、下記の手法により行った。
【００３５】
１．形態的性質（結果を下記［表１］に示す）
（１）細胞の大きさ
（２）細胞の形
（３）細胞の多形性の有無
倍率５，０００〜３０，０００倍での電子顕微鏡にて観察する。試験菌は普通寒天平板培地で３７℃×１日培養して、発生したコロニーより取る。使われた普通寒天培地は、肉エキス５ｇ、ペプトン１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、寒天１５ｇ、蒸留水１，０００ｍｌからなる。
【００３６】
（４）運動性の有無
１）西沢・菅原の方法にて鞭毛を染色し、電子顕微鏡（倍率１０，０００倍）にて観察する。第１液は、タンニン酸１００ｍｌ、局方塩化第二鉄液１．５ｍｌ、ホルマリン２ｍｌ、１％ＮａＯＨ１ｍｌ、蒸留水１００ｍｌからなり、第２液は硝酸銀２ｇ、局方アンモニア水少量、蒸留水１００ｍｌからなる。
２）半流動性普通寒天高層培地に穿刺培養し、培地全体の混濁にて判定する。使われた半流動性寒天培地は、肉エキス５ｇ、ペプトン１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、寒天５ｇ、蒸留水１，０００ｍｌからなる。
【００３７】
（５）胞子の有無
１）普通ブイヨン培地にて振とう培養した培養液を、８５℃×１５分加熱後、普通寒天平板培地へ混釈培養し、コロニーの発生にて判断する。使われた普通ブイヨン培地は、肉エキス３ｇ、ペプトン５ｇ、蒸留水１，０００ｍｌからなる。
２）Ｗｉｒｔｚの法（Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ−Ｆｕｌｔｏｎの変法）により胞子を染色し、菌体は赤、胞子は緑の染色性にて判断する。菌体の赤色は０．５％サフラニン水溶液、胞子の緑色は５％マラカイトグリーン水溶液による。
【００３８】
（６）胞子嚢の形
（７）胞子の形
（８）胞子の形成部位
（９）胞子の大きさ
Ｗｉｒｔｚの法（Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ−Ｆｕｌｔｏｎの変法）により胞子を染色し、倍率５，０００倍での電子顕微鏡にて観察する。試験菌は普通寒天平板培地で３７℃×１日培養した後、４℃×１日間冷蔵庫にて冷却したコロニーより取る。
【００３９】
（10）グラム染色
Ｈｕｃｋｅｒの変法にて行う。陽性はクリスタルバイオレットの紫に、陰性は対比染色のサフラニンの赤で判定する。試験菌は普通寒天平板培地で３７℃×１日培養して、発生したコロニーより取る。
【００４０】
（11）抗酸性
Ｚｉｉｅｈｌ−Ｎｅｅｉｓｅｎ染色法により行う。陽性は石炭酸フクシンの赤に、陰性は対比染色のマラカイトグリーンの緑で判定する。試験菌は普通寒天平板培地で３７℃×１日培養して、発生したコロニーより取る。
【００４１】
【表１】
【００４２】
２．各培地に於ける生育状態（結果を下記［表２］［表３］に示す）
（１）普通寒天平板培養
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
肉エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、ペプトン１０ｇ、寒天１５ｇ（ｐＨ７．０±０．１）
［培養条件］
滅菌シャーレ上に培地を固定し、その上に画線培養する。３７℃×３日。
【００４３】
（２）普通寒天斜面培養
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
同上
［培養条件］
滅菌試験管内に培地を斜面固定し、その上に画線培養する。３７℃×３日。
【００４４】
（３）普通ブイヨン液体培養
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
肉エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、ペプトン１０ｇ、ｐＨ７．０±０．１
［培養条件］
滅菌試験管に培地を分注し、その中に菌を懸濁する。３７℃×３日、１７０回／分で振とう培養。
【００４５】
（４）ゼラチン穿刺培養
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
肉エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、ペプトン１０ｇ、ゼラチン１５ｇ（ｐＨ７．０±０．１）
［培養条件］
滅菌試験管に培地を高層固定し、穿刺培養する。２５℃×７日
［生育以外の観察項目］
タンパク質の消化によるゼラチンの液化。
【００４６】
（５）リトマスミルク液体培養
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
脱脂粉乳１１０ｇ、リトマス液適量、ｐＨ７．０±０．１
［培養条件］
滅菌試験管に培地を分注しその中に菌を懸濁する。２５℃×１４日、静置培養
［生育以外の観察項目］
乳糖の分解時、酸の産生による牛乳の凝固
乳糖の分解時、凝乳酵素の産生による牛乳の凝固
乳糖の分解時、凝乳酵素の産生による牛清の析出。
【００４７】
【表２】
【００４８】
【表３】
【００４９】
３．生理学的性質（１）（結果を下記［表４］に示す）
（１）硝酸塩の還元
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
硝酸カリウム１ｇ、ペプトン５ｇ
［培養条件］
滅菌試験管に培地を分注し、その中に１白金耳の菌を懸濁。３７℃×５日、１７０回／分で振とう培養
［観察項目］
亜硝酸塩の検出：α−ナフチルアミン液１ｍｌとスルファニル酸液１ｍｌを培地に良く混ぜ桃赤色になれば陽性と判定する。
【００５０】
（２）脱窒反応
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
１）硝酸ナトリウム１０ｇ、肉エキス５ｇ
２）肉エキス５ｇ
［培養条件］
滅菌試験管に上記１、２の培地を２本づつ分注し、その中に１白金耳の菌を懸濁する。２本のうち一方に流動パラフィンを１〜２ｃｍ重層する。３７℃×１〜３日、静置培養
［観察項目］
硝酸塩存在下における嫌気的生育があるか：硝酸塩の有無、さらに流動パラフィンの有無の４本の濁度、ガスの発生の観察にて判定する。
【００５１】
（３）ＶＰテスト
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
ペプトン５ｇ、リン酸二水素カリウム５ｇ、ブドウ糖５ｇ
［培養条件］
滅菌試験管に培地を分注し、その中に１白金耳の菌を懸濁する。３７℃×３日、１７０回／分、振とう培養
［観察項目］
グルコース分解産物であるacetylmethylcarbinolの存否を調べる：培養液１ｍｌにα−ナフトール溶液０．６ｍｌと４０％ＫＯＨ水溶液０．２ｍｌとを加え、濃い赤色になったものを陽性と判定する。
【００５２】
（４）ＭＲテスト
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
ペプトン５ｇ、リン酸二水素カリウム５ｇ、ブドウ糖５ｇ
［培養条件］
滅菌試験管に培地を分注し、その中に１白金耳の菌を懸濁する。３７℃×３日、１７０回／分で振とう培養
［観察項目］
グルコース分解による酸形成を調べる：培養液１ｍｌにメチルレッドを滴下し、赤色が陽性、黄色が陰性と判定。
【００５３】
（５）インドールの産生
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ
［培養条件］
滅菌試験管に培地を分注し、その中に１白金耳の菌を懸濁する。３７℃×３日、１７０回／分で振とう培養
［観察項目］
インドールの検出：アミノ酸のトリプトファンからインドールを産生する能力の有無を調べる。培養液の１／５〜１／１０のＫｏｖａｃ試薬（下記参照）を加えよく振って静置し、２層に分離した上層が真紅色なら陽性、黄色なら陰性と判定
＜Ｋｏｖａｃ試薬＞
ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド５ｇ、アミルアルコール７５ｍｌ、濃塩酸２５ｍｌ。
【００５４】
（６）硫化水素の産生
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中、市販ＴＳＩ寒天培地）
肉エキス５ｇ、ブドウ糖１ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、クエン酸第二鉄０．２ｇ、ペプトン１５ｇ、チオ硫酸ナトリウム０．２ｇ、乳糖１０ｇ、フェノールレッド０．００２ｇ、白糖１０ｇ、寒天１５ｇ
［培養条件］
滅菌試験管に培地を半斜面に固定し、高層部に穿刺培養し、斜面に塗布培養する。３７℃×１日
［観察項目］
硫化水素の検出：斜面低位に黒変物あれば陽性と判定する。
【００５５】
（７）デンプンの加水分解
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
デンプン２ｇ、肉エキス５ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１５ｇ
［培養条件］
滅菌シャーレ上に培地を固定し、その上に画線培養する。室温×５日
［観察項目］
デンプンの検出：ヨード、ヨードカリ液（下記参照）を菌の増殖が見られるシャーレに滴下、濃い紫色が消えると陽性と判定
＜ヨード、ヨードカリ液＞
ヨウ化カリウム５ｇ、ヨウ素４ｇ／２００ｍｌ。
【００５６】
（８）カゼインの液化
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
スキムミルク２ｇ、寒天５ｇ
［培養条件］
上記の培地を別々に滅菌し、滅菌シャーレ上で混合固定し、その上に画線培養する。３７℃×１日
［観察項目］
カゼインの残存：画線部分の周囲に透明な部分が見られたら陽性と判定。
【００５７】
（９）クエン酸の利用
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中、市販ＣＩＴ寒天培地）
リン酸二カリウム１ｇ、リン酸一アンモニウム１ｇ、クエン酸ナトリウム２ｇ硫酸マグネシウム０．２ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、ＢＴＢ０．０２４ｇ、寒天１５ｇ
［培養条件］
滅菌シャーレ上に培地を固定し、その上に画線培養する。３７℃×１〜３日
［観察項目］
炭素栄養源としてクエン酸のみを利用して生育するかの有無：培地の青変または菌の生育が認められるとき陽性と判定する。
【００５８】
（10）色素の生成
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
ペプトン２０ｇ、グリセリン１０ｇ、Ｋ２ＳＯ４１０ｇ、ＭｇＣｌ２１．４ｇ、寒天１５ｇ
［培養条件］
滅菌シャーレ上に培地を固定し、その上に画線培養する。２５℃×５日
［観察項目］
色素の生成：コロニー周辺部のみに着色した時は非水溶性、培地全体に着色した時は水溶性各色素の生成があると判定する。
【００５９】
（11）ウレアーゼ
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
尿素２０ｇ、ペプトン２ｇ、ブドウ糖１ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、リン酸二水素カリウム２ｇ、０．２％フェノールレッド６ｍｌ、寒天１５ｇ（ただし、寒天は１２１℃×１５分滅菌、それ以外は濾過滅菌する）
［培養条件］
滅菌試験管に培地を斜面に固定し、その上に塗布培養する。３７℃×１日
［観察項目］
アンモニアの検出：培地が赤色となった時、陽性と判定する。
【００６０】
（12）オキシターゼ
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
肉エキス５ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１５ｇ
［培養条件］
滅菌シャーレ上に培地を固定し、その上に画線培養する。３７℃×１日
［観察項目］
チトクロームの存否：平板上のコロニーに、 dimetyl-p -phenylenediamineの１％水溶液を滴下し、滴下色がピンクを経て黒に変わった時、陽性と判定。
【００６１】
（13）カタラーゼ
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
肉エキス５ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１５ｇ
［培養条件］
滅菌シャーレ上に培地を固定し、その上に画線培養する。３７℃×１日
［観察項目］
カタラーゼの存否：過酸化水素の分解を触媒する酵素の存否。スライドグラスに３％Ｈ２Ｏ２液を１滴のせ、それに菌を１白金耳良く混ぜて入れる。酸素の気泡が多量にまたは継続的に発生した時、陽性と判定する。
【００６２】
【表４】
【００６３】
４．生理学的性質（２）（結果を下記［表５］［表６］に示す）
（１）ｐＨによる生育
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中、市販ニュートリエントブロス）
肉エキス３ｇ、ペプトン５ｇ、ｐＨ調整剤（酸：Ｈ２ＳＯ４ １ｍｌ／１００ｍｌ，アルカリ：ＮａＯＨ ４ｇ／１，０００ｍｌ）、ｐＨの変化は、３．６〜１０．９の１５水準で行う
［培養条件］
滅菌試験管に培地を分注し、その中に１白金耳の菌を懸濁する。３７℃×１日、１７０回／分で振とう培養
［観察項目］
生育の有無
＋＋………良く生育する
＋…………生育する
−＋………僅か生育する
−…………極僅か生育する
−−………全く生育しない。
【００６４】
（２）温度による生育
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中、市販普通寒天培地）
肉エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、ペプトン１０ｇ、寒天１５ｇ（ｐＨ７．０±０．１）
［培養条件］
滅菌シャーレ上に培地を固定し、その上に画線培養
温度を４，１０，２０，３０，３７，４０，５０℃に変えそれぞれ×１日
［観察項目］
生育の有無
＋＋………良く生育する
＋…………生育する
−＋………僅か生育する
−…………極僅か生育する
−−………全く生育しない。
【００６５】
（３）酸素に対する態度
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中、市販普通寒天培地）
肉エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、ペプトン１０ｇ、寒天１５ｇ（ｐＨ７．０±０．１）
［培養条件］
滅菌試験管に菌と培地を混釈した状態で高層に固定して培養。３７℃×１日
［観察項目］
好気、嫌気での生育の有無
表面のみ生育………………好気性
表面と高層内で生育………通性嫌気性
高層内のみ生育……………偏性嫌気性。
【００６６】
（４）Ｏ−Ｆテスト
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
ペプトン２ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．３ｇ、寒天３ｇ、０．２％ＢＴＢ１５ｍｌ、グルコース１０ｇ（ただし、グルコースはろ過滅菌、その他は１２１℃×１５分滅菌する）
［培養条件］
２本の滅菌試験管に培地を分注し高層に固定する。それぞれに穿刺培養し、内１本に流動パラフィンを１〜２ｃｍ重層する。３７℃×３〜４日
［観察項目］
糖分解が酸化的に行われるか、発酵的に行われるか見る
”０”………酸化的糖分解（嫌気条件のみ黄変した時）
”Ｆ”………発酵的糖分解（好気、嫌気条件とも黄変した時）。
【００６７】
（５）ＰＰＡテスト
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
酵母エキス３ｇ、フェニルアラニン２ｇ、燐酸ナトリウム１ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１５ｍｌ
［培養条件］
滅菌試験管に培地を斜面固定し、その上に塗布培養する。３７℃×１日
［観察項目］
フェニルアラニンをフェニルピルピン酸に脱アミノ化するかの有無：１０％塩化第二鉄水溶液の滴下により緑変した時、陽性と判定する。
【００６８】
（６）プロピオン酸の利用
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
硫酸マグネシウム０．２ｇ、プロピオン酸ソーダ２ｇ、燐酸水素二カリウム１ｇ、燐酸一アンモニウム１ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１０ｇ、０．２％ＢＴＢ溶液１２ｍｌ
［培養条件］
滅菌シャーレに培地を固定し、その上に画線培養する。３７℃×１日
［観察項目］
炭素栄養源としてプロピオン酸のみを利用して生育するかの有無：培地の青変または菌の生育が認められるとき陽性と判定する。
【００６９】
（７）チロシンの分解
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
Ｌ−チロシン５ｇ、肉エキス３ｇ、ペプトン５ｇ、寒天１５ｇ（ただし、チロチンとニュートリエントアガーは、別々に湿熱滅菌し混合する）
［培養条件］
滅菌シャーレに培地を固定し、その上に画線培養する。３７℃×７〜１４日
［観察項目］
チロシンの分解の有無：コロニーの下に結晶で存在するチロシンが溶解した時、陽性と判断する。
【００７０】
（８）卵黄反応
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
ペプトン１０ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４ ５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ、ＮａＣｌ２ｇ、ＭｇＳＯ４ ０．１ｇ、グルコース２ｇ、卵黄１５ｍｌ（ただし、卵黄以外は湿熱滅菌し、それに無菌的に吸い取った卵黄を加え一昼夜冷蔵庫でならす。卵黄の加えないブロスも用意する）
［培養条件］
二本の滅菌試験管に卵黄のありなしの培地を分注し、それぞれのその中に１白金耳の菌を懸濁する。３７℃×７日、観察は、１、３、５、７日に行う。１７０回／分で振とう培養
［観察項目］
白色沈澱物の有無：卵黄無しに比べ、卵黄ありに白色沈澱物が試験管低部や表面に見られた時、陽性と判定する。
【００７１】
（９）２％ＮａＣｌ下での生育
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
肉エキス３ｇ、ペプトン５ｇ、ＮａＣｌ２０ｇ
［培養条件］
滅菌試験管に培地を分注し、その中に１白金耳の菌を懸濁する。３７℃×１４日、１７０回／分で振とう培養
［観察項目］
生育の有無
＋＋………良く生育する
＋…………生育する
−＋………僅か生育する
−…………極僅か生育する
−−………全く生育しない。
【００７２】
（10）５％ＮａＣｌ下での生育
（11）７％ＮａＣｌ下での生育
（12）１２％ＮａＣｌ下での生育
（13）２０％ＮａＣｌ下での生育
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
上記９のＮａＣｌを７０ｇ、１２０ｇ、２００ｇに変える
［培養条件］
上記９と同じ
［観察項目］
上記９と同じ。
【００７３】
（14）リゾチウム存在下での生育
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
肉エキス３ｇ、ペプトン５ｇ、リゾチウム０．１ｇ（リゾチウムは０．０１ＮのＨＣｌ溶液中で２０分間煮沸した後ニュートリエントブロスに加える）
［培養条件］
滅菌試験管に培地を分注し、その中に１白金耳の菌を懸濁する。３７℃×１４日、１７０回／分で振とう培養
［観察項目］
生育の有無
＋＋………良く生育する
＋…………生育する
−＋………僅か生育する
−…………極僅か生育する
−−………全く生育しない。
【００７４】
（15）溶血素の産生
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中、市販羊血液寒天培地）
Pancreatic Digest of Casein.１４．５ｇ、Papaic Digest of Soybean Meal.５．０ｇ、Sodium Chloride.５．０ｇ、Growth Factors１. ５ｇ、Agar１４．０ｇ、Sheep blood, defibrinated.５．０％
［培養条件］
滅菌シャーレに培地を固定し、その上に画線する。３７℃×１日
［観察項目］
溶血素の産生の有無
α型溶血……コロニー周辺に緑色帯（ヘモグロビンの変質）
β型溶血……コロニー周辺を透明化（赤血球膜の破壊）。
【００７５】
【表５】
【００７６】
【表６】
【００７７】
５．炭素源の酸及びガスの生成（結果を下記［表７］に示す）
（１）Ｄ−グルコース
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
ペプトン１ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１０ｇ、０．２％ＢＴＢ１５ｍｌ、Ｄ−グルコース８ｇ
［培養条件］
滅菌試験管に培地を分注し、高層に固定する。その後、それに穿刺培養する。３７℃×１４日
［観察項目］
酸の生成：ＢＴＢ試薬の黄変度にて判定
＋＋………良く生成
＋…………生成
−＋………生成微弱
−…………生成無し
ガスの生成：高層部に亀裂の有無で判定
＋＋………良く生成
＋…………生成
−＋………生成微弱
−…………生成無し。
【００７８】
（２）Ｌ−アラビノース
（３）Ｄ−キシロース
（４）Ｄ−マンニット
（５）Ｄ−マンノース
（６）Ｄ−ガラクトース
（７）Ｄ−ソルビトース
（８）イノシトール
（９）トレハロース
（10）ラクトース
（11）マルトース
（12）フルクトース
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
上記（１）の糖（Ｄ−グルコース）の部分を、上の（２）〜（12）の糖に変更 ［培養条件］
上記（１）と同じ
［観察項目］
上記（１）と同じ。
【００７９】
【表７】
【００８０】
６．同定結果
ＯＹＫ−０１−６００、ＯＹＫ−０３−６００、及びＯＹＫ−０４−０００の３株を、下記の文献に従って分類した。
[1] Bergey's Mannual of Determinative Bacteriology、 Vol.2 (1986)，Williams &Wilkins U.S.A
[2] R.E.Gordon，W.C.Haynes，C.H.Pang. (1973) The Genus Bacillus. Agr. Handbook No.427 United states department of Agriculture. Washington D.C.
【００８１】
【表８】
【００８２】
【表９】
【００８３】
【表１０】
これにより、上記３株とも［表８］よりBacillus属に属すると認められ、次に［表９］［表１０］よりB.subtilisの類縁菌であると考えられるが、嫌気下で生育すること、糖からの酸の産生が微弱であること、及び７％ＮａＣｌで生育しないことにより同定に至らず、新種であると判断しBacillus sp.とした。
【００８４】
［寄託された生物材料への言及］
[1] 寄託機関の名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物 寄託センター
あて名 ：郵便番号３０５−００４６ 日本国茨城県つくば市東１−１−３（ＴＥＬ；０２９８−５４−６０２９）
[2] 寄託日 ：１９９８年６月２９日
[3] 寄託番号：（１）ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９４
（２）ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９５
（３）ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９６。
【００８５】
上記の変異株は、増殖に伴って悪臭を発生させる菌に対して抗菌性を有する。また、当該微生物を培養し、この培養液から抗菌性物質を分離精製することができる。分離精製された抗菌性物質をそのまま、あるいは水などの適当な溶媒に溶解または分散したものを、そのまま、または適宜希釈して、その単独をあるいは他の物質と併用した混合物を、撒布、塗布、含浸、潜着、係着、接着、付着、混入、添加、内服、注射、のうちの少なくとも１つ以上の手段を用いて、抗菌、防臭したい物品、あるいはこれらの性能をあらかじめ備えておこうとする物品、例えば繊維製品、寝具、衣料品、医療品、サニタリー機器及び備品、生理用品、履き物、各種空調設備・エアーコンディショナー（空気清浄装置を含む）のフィルター、内外装を含む建材、家具、動物、動物飼育場、動物飼育機器、動物飼育用水及び飼料、食器、薬品、汚水または汚水処理場または機器、マイクロカプセル、旅客輸送車両または船舶または航空機の座席も含めたインテリア材、死体安置及び葬儀用品などに直接あるいは間接的に付与する。
さらに詳しくは、引き続き以下の実施例にて説明する。
【００８６】
Ｃ．微生物の持つ抗菌活性物質の確認（結果を下記［表１１］に示す）
Bacillus sp.ＯＹＫ−０１−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９４）、Bacillus sp.ＯＹＫ−０３−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９５）、Bacillus sp.ＯＹＫ−０４−０００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９６）が抗菌活性物質を分泌していることを以下の実験により確認した。
【００８７】
１．微生物の懸濁液の調整
（１）微生物
ＯＹＫ−０１−６００，ＯＹＫ−０３−６００，及びＯＹＫ−０４−０００の３株。
（２）前培養
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
ペプトン１０ｇ、肉エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１０ｇ
［培養条件］
滅菌シャーレに培地を固定し、その上に保存菌を画線培養する。３７℃×１日。
（３）本培養
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
ペプトン１０ｇ、肉エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ
［培養条件］
滅菌試験管に培地を分注し、その中に１白金耳の（２）を懸濁する。３７℃×１日、１７０回／分で振とう培養する。
【００８８】
２．抗菌試験菌の懸濁液の調整
（１）抗菌試験菌
Klebsiella pneumoniae ATCC 4352，Staphylococcus aureus ATCC 6538P。
（２）前培養
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
子牛脳浸出液２００ｇ、牛心臓浸出液２５０ｇ、プロテオースペプトン１０ｇ、ブドウ糖２ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、リン酸二ナトリウム２．５ｇ、寒天１５ｇ
［培養条件］
滅菌シャーレに培地を固定し、その上に保存菌を画線培養する。３７℃×１日。
（３）本培養
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
ペプトン１０ｇ、肉エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ
［培養条件］
滅菌試験管に培地を分注し、その中に（２）を入れ、振とう培養する。
Klebsiella pneumoniae ……３７℃×２０時間、１７０回／分
Staphylococcus aureus ……３７℃×１０時間、１７０回／分。
（４）菌数調整
滅菌緩衝生理食塩水にて菌数が、５〜３０×１０５個／ｍｌになるよう調整する。
【００８９】
３．抗菌性試験
（１）試験用培地の作成
１）上記（４）の２試験菌の菌液を、ペプトン１０ｇ、肉エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、及び寒天１０ｇよりなる培地（蒸留水１，０００ｍｌ中）にそれぞれ０．２ｍｌ混釈して、滅菌シャーレ上で固定する。
２）ペプトン１０ｇ、肉エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、及び寒天１０ｇよりなる培地（蒸留水１，０００ｍｌ中）を滅菌シャーレ上で固定し、その表面全体に上記（４）の２試験菌の菌液を０．２ｍｌスプレッダーにて植菌する。
【００９０】
（２）微生物と抗菌性の比較のための菌の準備
OYK-01-600,OYK-03-600,OYK-04-000の３株と比較するため納豆菌を含めたBacillus subtilisのＡ、Ｂ、Ｃ各菌の３株を準備した。
【００９１】
（３）微生物と抗菌性比較菌の植菌
上記した「１．微生物の懸濁液の調製」の（３）のOYK-01-600,OYK-03-600,OYK-04-000の３菌株と、上記（２）のＡ、Ｂ、Ｃ各菌の３菌株、計６菌株を、上記（１）で作成した試験用培地上に、下記の１）、２）の方法で植菌する。
１）シャーレ中央にペニシリンカップを置き、その中に各菌液０．０５ｍｌを注ぐ。
２）シャーレ中央に各菌液を０．０２ｍｌ滴下する。植菌されたものは、３７℃×１日静置培養する。
【００９２】
（４）判定方法
＋＋…試供菌のコロニーの下及び周辺に、試験菌の増殖はなく、２ｍｍ以上の増殖阻止帯（ハロー）が認められる
＋……試供菌のコロニーの下及び周辺に、試験菌の増殖はなく、０〜２ｍｍの増殖阻止帯（ハロー）が認められる
＋−…増殖阻止帯（ハロー）は認められないが、試供菌コロニー内に試験菌の増殖は認められない
−……試供菌のコロニー内の一部に、試験菌の増殖が認められる
−−…試供菌のコロニー内の全てに、試験菌の増殖が認められる
ＮＤ…試験を行っていない。
【００９３】
【表１１】
【００９４】
［表１１］の通り、微生物は、その増殖期において、Klebsiella pneumoniaeとStaphylococcus aureusの双方に対して抗菌活性を示す物質を分泌していると認められた。
【００９５】
Ｄ．微生物による排水処理場の防臭試験（結果を下記［表１２］に示す）
Bacillus sp.ＯＹＫ−０１−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９４）、Bacillus sp.ＯＹＫ−０３−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９５）、Bacillus sp.ＯＹＫ−０４−０００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９６）を排水処理場に投入する事により処理場周辺の防臭に効果があることを以下の実験により確認した。
【００９６】
１．試験に供した排水処理場の概要
（１）場所及び業種
三重県、洗濯業
（２）排水設備と処理能力
図１参照。
【００９７】
２．防臭試験方法
（１）微生物の懸濁液の調整
本試験にはBacillus sp.ＯＹＫ−０１−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９４）を選択し、上記した「１．微生物の懸濁液の調製」と同じ方法で微生物の懸濁液を調整した。
（２）排水設備への菌の投入
上記（１）で調整された微生物懸濁液２．５リットルを、図１における排水処理設備原水槽に投入した。
（３）効果の判定
１）判定者：同工場社員３名
２）判定基準：６段階臭気強度表示法
臭気強度０＝無臭
１＝やっと感知出来る臭い（検知閾値濃度）
２＝何の臭いかわかる弱い臭い（認知閾値濃度）
３＝楽に感知できる臭い
４＝強い臭い
５＝強烈な臭い
３）判定場所
沈澱槽より活性汚泥が曝気槽に返送される場所
４）その他の測定項目
ＢＯＤ、投入菌のｍｌ当たりの菌数
【００９８】
【表１２】
【００９９】
［表１２］の通り、微生物の増殖に伴って、臭気の強さが減少することを確認できた。この微生物は、増殖時に、人に少量で不快を感ずる硫化水素、メチルメルカプタン、トリエチルメタン等の発生がなく、また糖分解もガスの発生なしで行うため上記の結果が得られたと考えられる。他の微生物が増殖するとき、発生するガスを栄養的に消費するかどうかの確認はしていない。
【０１００】
なお、Bacillus sp.ＯＹＫ−０３−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９５）及びBacillus sp.ＯＹＫ−０４−０００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９６）についても上記と同様の好結果が得られる旨を確認した。
【０１０１】
Ｅ．微生物が生成する分泌物の分離精製
Bacillus sp.ＯＹＫ−０１−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９４）、Bacillus sp.ＯＹＫ−０３−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９５）、Bacillus sp.ＯＹＫ−０４−０００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９６）が、Klebsiella pneumoniae と、Staphylococcus aureus に対して抗菌活性を示した物質を下記の通り分離精製した。
【０１０２】
１．微生物の懸濁液の調整
（１）微生物
ＯＹＫ−０１−６００，ＯＹＫ−０３−６００，ＯＹＫ−０４−０００の３株、比較のため納豆菌を含めたBacillus subtilis のＡ、Ｂ、Ｃ各菌の３株も同様の作業を行なった。
（２）前培養
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
ペプトン１０ｇ、肉エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１０ｇ
［培養条件］
滅菌シャーレに培地を固定し、その上に保存菌を画線培養する。３７℃×１日
（３）本培養
［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中）
ペプトン１０ｇ、肉エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ
［培養条件］
滅菌坂口フラスコに培地を分注し、その中に１白金耳の（２）を懸濁する。３７℃×２日、１７０回／分で振とう培養する。
【０１０３】
２．菌体と分泌物の分離
得られた培養液を４℃、回転数１２，０００ＲＰＭで１４分間低温遠心分離機にかける。その上澄みだけを取り出し、その液を０．４５μのメンブランフィルターで吸引ろ過する。
【０１０４】
３．分泌物の濃縮化
得られたろ過液を、なす型フラスコに移し、ろ過液が完全にフラスコ壁面に凍結させた後、４８時間凍結真空乾燥機にて乾燥し、粉末精製物を得た。
【０１０５】
Ｆ．微生物が生成する物質の抗菌力試験（結果を下記［表１３］に示す）
Bacillus sp.ＯＹＫ−０１−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９４）、Bacillus sp.ＯＹＫ−０３−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９５）、Bacillus sp.ＯＹＫ−０４−０００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９６）の分泌物から得られた抗菌活性を持つと考えられる分離精製物の抗菌力を下記の方法で確認した。
【０１０６】
１．試供物
上記「３．分泌物の濃縮化」で得られた分泌物質
[1] Bacillus sp. ＯＹＫ−０１−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９４）
[2] Bacillus sp. ＯＹＫ−０３−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９５）
[3] Bacillus sp. ＯＹＫ−０４−０００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９６）
[4] Bacillus sp. Ａ
[5] Bacillus sp. Ｂ
[6] Bacillus sp. Ｃ
の６種の分泌物質と、抗菌力基準薬剤として用いた下記[7]、[8]の計８種の試供物で行なった。
[7] クロラムフェニコール（和光純薬工業（株）製抗生物質、Ｍｗ：323.13 CAS:56-75-7、タンパク合成阻止作用を持ち、グラム陽性菌、グラム陰性菌、リケッチア、ウィルスに有効、抗菌作用は、通常静菌的。抗菌テストには１０ｍｇ／１００ｍｌの水溶液を０．２ｍｌ使用）。
[8] ニッカノンＲＢ（日華化学（株）製の第四級アンモニウム系合成抗菌剤、黄色ブドウ球菌に優れた抗菌性があり、防かび性も有する。洗濯耐久性のある抗菌防臭剤。抗菌テストには、１ｍｌ／１００ｍｌの水溶液を０．２ｍｌ使用）。計上記[1]〜[8]の８種の試供物で行う。
【０１０７】
２．抗菌試験菌
上記した「２．抗菌試験菌の懸濁液の調整」で得られた２種
[1] Klebsiella pneumoniae ATCC 4352
[2] Staphylococcus aureus ATCC 6538P 。
【０１０８】
３．抗菌性試験方法
（１）培養液の白濁度で判定する方法
１）［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中、市販ニュートリエントブロス） 肉エキス５ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ
２）［培養条件］
滅菌試験管に培地を５ｍｌ分注し、それに試供物０．０２ｇと、試験菌懸濁液０．１ｍｌを加え混釈する。３７℃×１日、１７０回／分振とう培養
３）［観察項目］
日立製作所（株）製Ｍｏｄｅｌ １００−２０ 分光光度計にて培養液の透過率を測定する。測定波長４７５ｎｍ、表示単位％（Klebsiella pneumoniae で、菌数約５〜３０×１０８は、透過率５２％を示す）。
【０１０９】
（２）菌数の測定で判定する方法
１）［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中、市販普通寒天培地）
肉エキス５ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１５ｇ
２）［培養条件］
滅菌シャーレに培地を１５ｍｌ分注し、その中に試供物０．０２ｇを混釈溶解したのち固定する。その表面に試験菌懸濁液０．２ｍｌを均一に塗布培養する。３７℃×１日
３）［観察項目］
シャーレ上に増殖したコロニーをカウントする。表示単位：指数部（例えば、Ａ×１０Ｂの場合は「Ｂ」と表示）。
【０１１０】
（３）増殖阻止帯（ハロー）の観察で判定する方法
１）［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中、市販普通寒天培地）
肉エキス５ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１５ｇ
２）［培養条件］
滅菌シャーレに培地を１５ｍｌ分注固定し、その表面に試験菌懸濁液０．２ｍｌを均一に塗布し、表面が半乾き後シャーレ中央に試供物を固形の状態で０．０２ｇ置き静置培養する。３７℃×１日
３）［観察項目］
発生したハローの最大直径を計測する。表示単位：ｍｍ。
【０１１１】
（４）ペニシリンカップ法
１）［培地組成］（蒸留水１，０００ｍｌ中、市販ニュートリエントブロス） 下層培地：肉エキス５ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１５ｇ 上層重層培地：肉エキス５ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天７ｇ
２）［培養条件］
滅菌シャーレに下層培地を１５ｍｌ分注固定する。その上に上層培地４ｍｌに試験菌懸濁液０．１ｍｌを混釈し重層する。表面が半乾き後、シャーレ中央にステンレススチール製の円筒（内径６ｍｍ、外径８ｍｍ、高さ１０ｍｍ）を１０〜１３ｍｍの高さから垂直に落下させる。その円筒内に試供物０．０２ｇを０．２ｍｌの滅菌水に溶解したものを入れて静置培養する。３７℃×１日
３）［観察項目］
カップ内外に発生した試験菌の増殖を観察
表示単位
−−…カップ内全体に試験菌の増殖が見られる
＋−…カップ内の一部に試験菌の増殖が見られる
＋……カップ内に全く試験菌の増殖が見られない
Ａ……カップ外に最大直径Ａｍｍ（例えば）のハローが観察された時。
【０１１２】
【表１３】
【０１１３】
［表１３］の通り、微生物が分泌する物質が抗菌効果を有することが確認できた。
【０１１４】
Ｇ．ＯＹＫ菌体生成物の抗菌活性テスト
ＯＹＫ菌としてBacillus sp.ＯＹＫ−０１−６００を用いたが、Bacillus sp.ＯＹＫ−０３−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９５）及びBacillus sp.ＯＹＫ−０４−０００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９６）についても同様の好結果が得られている。
【０１１５】
１．ＯＹＫ菌体生成物の分離精製
[1] 菌体外生成物
（１）−８２℃で凍結保存された種菌１ｍｌを解凍した。
（２）試験管に滅菌されたＢＧＧ液体培地（大豆蛋白抽出物とグルコースとグルタミン酸ソーダよりなる培地、以下同様）４ｍｌを取り、その中に上記（１）で得た菌を入れ、３７℃で２４時間種培養した。
（３）坂口フラスコに滅菌されたＢＧＧ液体培地１００ｍｌを取り、その中に上記（２）の菌を入れ、３７℃で７２時間本培養した。（ＯＤ＝１０，ｐＨ＝７．９）
（４）のち遠心分離し、上澄みを取った。（１２，０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ、４℃）
（５）メンブランフィルターにて上記（４）を濾過した。（０．２μｍフィルター）
（６）上記（５）における濾液を凍結乾燥した。
（７）上記（６）にて凍結乾燥したものを３〜４ｍｌの生理食塩水で溶解した。
（８）後述する抗菌テストでは、上記（７）の溶解液を５０μリットル滴下した。
【０１１６】
[2] 菌体内生成物
（１）−８２℃で凍結保存された種菌１ｍｌを解凍した。
（２）試験管に滅菌されたＢＧＧ液体培地４ｍｌを取り、その中に上記（１）で得た菌を入れ、３７℃で２４時間種培養した。
（３）坂口フラスコに滅菌されたＢＧＧ液体培地１００ｍｌを取り、その中に上記（２）の菌を入れ、３７℃で７２時間本培養した。（ＯＤ＝１０，ｐＨ＝７．９）
（４）のち遠心分離し、沈殿物を取った。（１２，０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ、４℃）
（５）上記沈殿物に５ｍｌの生理食塩水を加え、沈殿物を分散した。
（６）前記沈殿物が分散したものに対し、２０ｍｌのｎ−ブタノールを加え、１時間撹拌し、水層とアルコール層に分離するまで待った。
（７）上記（６）のアルコール層を取り出し、エバポレーションにてｎ−ブタノールを蒸発させた。
（８）これをデシケータに移し、さらに乾燥した。
（９）この乾燥物に生理食塩水を１ｍｌ加え、精製物を分散させた。
（10）この分散液をメンブランフィルターにて濾過した。（０．２μｍフィルター）
（11）次項の抗菌テストでは上記（10）の濾液を５０μリットル滴下した。
【０１１７】
２．ＯＹＫ菌菌体生成物の抗菌テスト
[1] 試供菌体生成物
（１）上記１．の[1]で得られたＯＹＫ菌菌体外生成物
（２）上記１．の[2]で得られたＯＹＫ菌菌体内生成物
【０１１８】
[2] 対象試験菌
（１）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｏｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ２５９２３、黄色ブドウ球菌）
（２）Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ１３８８３、肺炎桿菌）
（３）ＭＲＳＡ１００２（分離株、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）
（４）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ−１５７（Ｓ１８０、大腸菌Ｏ−１５７）
（５）Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｌａ（ＯＣＩ ８８１７１、レジオネラ菌）
（６）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＩＦＯ３４５２、緑膿菌（赤色色素産生））
（７）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＡＴＣＣ２７８５３、緑膿菌（青色色素産生））
（８）Ｆｕｚａｒｉｕｍ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ Ｎｉｒｅｎｂｅｒｇ Ｓ１２（ＩＦＯ６３４９、フザリウム（アカカビ））
（９）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｖａｎ Ｔｉｅｇｈｅｍ Ｓ１（ＩＦＯ６３４１、麹カビ）
（10）Ｐｅｎｉｓｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｔｒｉｎｕｍ Ｔｈｏｍ Ｓ５（ＩＦＯ６３５２、青カビ）
（11）Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ（ＩＦＯ５４６６、白癬菌）
（12）Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ Ｌｉｎｄ Ｓ７（ＦＥＲＭ Ｓ−７、くものすカビ）。
【０１１９】
[3] 試験方法
（１）保存試験菌を試験菌のそれぞれの最適条件で種培養した。
（２）一定の菌数の試験菌菌液をそれぞれの試験菌の最適固形培地上に一定量塗布し、半乾きになるまで放置した。
（３）２種類の試供菌体生成物（上記[1]参照）を上記（２）の培地上に５０μリットル滴下した。
（４）試験菌の最適培養条件にて培養した。
（５）抗菌活性があれば、滴下点に増殖阻止帯（ハロー）が見られる。その阻止帯の直径（短径、長径）を測定した（単位ｃｍ）。結果を下記［表１４］に記載する。
【０１２０】
【表１４】
【０１２１】
Ｈ．ＯＹＫ菌の増殖速度試験（図２参照）
本発明の新規微生物は、培養開始後、誘導期（増殖準備期間）を必要とせず速やかに増殖を始める。例えば、約１０３個／ｍｌ（ｇ）の菌濃度が、２０〜４０℃の培養条件下にて６時間以内に１０８個／ｍｌ（ｇ）以上に増加する。
【０１２２】
図２に、Bacillus sp ．ＯＹＫ−０１−６００の経時的な増殖状況を示す。なお、比較対照のため、B.subtilisの標準菌（ＩＦＯ３１３４）の増殖状況を併記する。図２に示したグラフは、縦軸に菌数の対数を取り、横軸に時間を取ってプロットした増殖曲線である。このグラフからも分かるように、本発明のＯＹＫ菌は、誘導期が殆どなく、培養開始後に速やかに増殖を始め、約１０３個／ｇの菌濃度が５時間程度で１０８個／ｍｌ以上に達している。これに対し、B.subtilisの標準菌（ＩＦＯ３１３４）は、培養開始後、６〜８時間の誘導期を経たのち、本格的な増殖が始まり、約１０８個／ｇの菌濃度に達するまでにおよそ１２時間かかっている。一方、ＯＹＫ菌は、上記標準菌の体積に対し４倍の体積を有し、かつ４時間後においては標準菌の増殖が６倍であるのに対し、ＯＹＫ菌は２０，０００倍であるから、体積については２０，０００×４＝８０，０００倍である。単純に比較すれば８０，０００÷６＝１３，３３３…となり、優に１万倍以上の体積を占めることになる。
【０１２３】
Ｉ．ＯＹＫ菌の利用
なお、ＯＹＫ菌としてBacillus sp ．ＯＹＫ−０１−６００を用いたが、Bacillus sp.ＯＹＫ−０３−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９５）、及びBacillus sp.ＯＹＫ−０４−０００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９６）についても同様の好結果が得られている。
【０１２４】
（ＯＹＫ菌の粉末化）
以下、ＯＹＫ菌を粉体にする工程を説明する。
（１）−８２℃で凍結保存された種菌１ｍｌを解凍した。
（２）試験管に滅菌されたＢＧＧ液体培地４ｍｌを取り、その中に上記（１）にて解凍した菌を入れ、３７℃で２４時間種培養した。
（３）坂口フラスコに滅菌されたＢＧＧ液体培地１００ｍｌを取り、その中に上記（２）の菌を入れ、３７℃で２４時間本培養した。このときのＯＤ値は、約１０を示し、菌数は１×１０８個／ｍｌであった。
（４）上記（３）の液体を凍結乾燥し、１ｇの菌粉末（培地成分も含まれる）を得た。菌数は１×１０１０個／ｇであった。
【０１２５】
得られた菌粉体は、ＯＹＫ菌全てが胞子化されていた。これにより次のような作用効果を奏する。すなわち、
[1] 胞子化されているため防湿さえ考慮すれば、常温での保管が可能であり、菌数の減少や菌の変異等の心配がない。
[2] 打込み強さが１０トン程度の打錠機にて錠剤化できる。打錠による菌数減少はない。
[3] 芳香剤、凝固剤、遅溶剤など、錠剤にするために必要な化学薬品の添加が可能である。
【０１２６】
（錠剤としての利用）
上記実施例で得られた菌粉体を、菌の増殖を促進させる添加物（例えばグルコース、グルタミン酸ソーダ、大豆タンパクの抽出物、培地成分など）を加えたうえで打錠機で打錠し、錠剤にすることができた。この錠剤を生ゴミの中に投入すると、結果として生ゴミから発生する悪臭を防止することができた。これは、前記錠剤を生ゴミの中に投入することによって湿気や水分により溶解し、胞子は水分を得て菌として活動を始め、臭気を出す腐敗菌の増殖に勝る速度で当該ＯＹＫ菌が増殖したものと考えられる。また、ＯＹＫ菌は大腸菌Ｏ−１５７にも抗菌活性があることから、台所回りでの上記錠剤の使用により食中毒の防止にも応用できる。
【０１２７】
（堆肥の製造例と製造された堆肥の効果）
さらに、本発明のＯＹＫ菌は、堆肥の製造工程においても有効な作用を示す。特に製造工程中、初期の発酵温度の立上がりに有効な作用を示す。その一例を以下に示す。
【０１２８】
牛糞７００ｇが温度５０℃まで昇温する日数を測った結果が８日であるのに対し、牛糞７００ｇに濃度１×１０８個／ｍｌのＯＹＫ菌液（ＯＹＫ−０１−６００）５０ｍｌを添加したものは３日しか掛からず、時間の短縮が見られた。また、４０℃以上保持される時間については、添加しない場合は６日であるのに対し、ＯＹＫ菌を添加したものについては１７日と保温時間の延長が見られた。堆肥製造工程は、それぞれの温度域で多数の菌や黴が増殖、死滅を繰り返し高分子有機物を低分子化すると言われている。このサイクルの中で７０℃の最高温では胞子として生存し、昇温または降温での４０℃付近で活発に増殖することによりサイクルの短縮を図っている。さらに、ＯＹＫ菌の特徴である増殖時に悪臭を発しないことから、製造工程中におけるメルカプタン、硫化水素臭の発散が防止された。
【０１２９】
（ＯＹＫ菌のシート化とその利用）
本発明のＯＹＫ菌の効果を医療現場において手軽に利用するための試みを行なった。以下詳述する。
菌（ＯＹＫ−０１−６００）濃度１×１０７個／ｍｌの菌液とバインダーとしてＰＶＡ（ポリビニルアルコール）を１０％添加した分散溶液を密度１５００メッシュのスクリーン捺染機を用いて１００ｇ／ｍ２の不織布に捺染した。水分を蒸発させたあと、前記不織布を顕微鏡で観察した結果、ＯＹＫ菌は胞子化されて不織布の繊維に絡まった状態に固定化されていることが確認できた。
この不織布を適当な広さに裁断し、これを、緑膿菌が原因とされている床ずれに悩む患者の背中に当てがうべく、シーツに敷いて様子を観察したところ、次第に悪臭がなくなり、床ずれも快方に向かうことが確認された。
なお、上記実施例において不織布を使用したが、これに限らず、合成樹脂繊維あるいは天然繊維からなる織物や編物、合成樹脂シート、合成樹脂発泡シート等を用いても構わない。
【０１３０】
（池水の浄化への利用）
ゴルフ場内にある池は、芝に多量の肥料を投入することから、その肥料が池に流れ込んで富栄養状態となっている。このような池は、時として、赤味を帯びた植物プランクトンが異常増殖し、さらにこの増殖により、池中の溶存酵素が減少する。これにより、嫌気性細菌の増殖を促し、悪臭の発生を招く。このような状態の池（４００ｔ水量規模）にＯＹＫ菌液（ＯＹＫ−０１−６００、菌濃度１×１０８個／ｍｌ）１０リットルを投入したところ、２週間で表面の赤味が消え、透明度が増した。このメカニズムは未だ解明していないが、ＯＹＫ菌の増殖により池水中の栄養物分が減少し、植物プランクトンが死滅したと推察できる。
【０１３１】
（脱臭剤としての利用）
富栄養状態の池における水浄化効果、あるいは上記した「Ｄ．微生物による排水処理場の防臭試験」の項で述べた排水（廃水）処理場の防臭効果については先述の通りであるが、乳牛や肉牛の飼育場、養鶏場、養豚場における悪臭に対しては堆肥の製造例に見るごとく、メルカプタン、硫化水素臭の発散を防止しうることからＯＹＫ菌の散布による脱臭が可能である。また、と殺場、手術室、衛生汚物、加工中の動物皮革においては、上記［表１２］とその次のパラグラフに記載したように、ＯＹＫ菌は蛋白質、脂質、炭水化物等を分解する際に悪臭を発生させる菌よりも速く増殖して防臭することができる。散布、混入、あるいは付着させるＯＹＫ菌は、菌の溶液をそのまま用いるか胞子化した粉体でも良く、さらに菌体内生成物あるいは菌体外生成物であっても同様の効果が得られる。
【０１３２】
（堆肥化における利用［Ｉ］）
ＯＹＫ菌が発酵温度にどのような効果をもたらすかを調べるため、少量の牛糞を用いて室内（室温１８℃）で堆肥化の試験を行った。試料の内訳は次の通りである。
（１−１） 牛糞 ４００ｇ（水分率６０％）
ＣＦＰ ４０ｇ（コーヒー搾り滓、水分率８％）
おから粉末 ２０ｇ（大豆タンパク源）
ＯＹＫ菌粉末 ４ｇ（菌濃度１×１０１０個／ｇ）
（１−２） 牛糞 ４００ｇ（水分率６０％）。
【０１３３】
これらの試料を魔法瓶内に置き、発酵温度の変化をグラフにしたものを図３に示す。第１日目は準備に費やされているが６時間毎の温度の変化を測定した。図中曲線（１−１），（１−２）の符号は上記試料の番号と一致させている。
【０１３４】
試料（１−１）に於けるおから粉末は、ＯＹＫ菌の富栄養源で増殖に寄与し、ＣＦＰは多孔質で水分調整の他に、微量発生するアンモニア臭気の吸収と好気的環境を作る働きがある。また、ＯＹＫ菌粉末は培養液を凍結乾燥したもので菌濃度は１×１０１０個／ｇである。試料（１−１）に於いては約１日で室温から７０℃迄上昇した。ＯＹＫ菌は、１０℃〜５５℃の範囲で活動し、３０〜４０℃の範囲で最も活発に活動し、牛糞の温度上昇を急速に促進させ、またＯＹＫ菌の増殖により多少のアンモニアが発生し、温度と弱アルカリにより放線菌などの高温菌の活動を促す。これにより、図３のグラフに示すように、約１日で牛糞の温度が７０℃に達したものと推察される。２日後からは再度室温まで降下していくが切り返しを行って再び発酵温度が上昇した。
【０１３５】
一方試料（１−２）に於いては牛糞の温度は１０℃程上昇しているとはいうものの発酵は不十分であり堆肥化されなかった。なお、上記テストは発酵温度を正確に測定するため、試料を魔法瓶の中に置き、強制通気を行った。
【０１３６】
（堆肥化における利用［ＩＩ］）
牛糞の水分率の影響をみるために次のような試料で同様の試験を試みた。室温は１８℃である。試料の温度変化をグラフにして図４に示す。
（２−１） 牛糞 ４００ｇ（水分調整せず。水分率８０％）
ＣＦＰ ４０ｇ（コーヒー搾り滓、水分率８％）
ＯＹＫ菌粉末 ４ｇ（菌濃度１×１０１０個／ｇ）
（２−２） 牛糞 ４００ｇ（水分率６０％）。
試料（２−１）では、温度は室温から上昇を続けるが最高温度の７０℃に達する。
また、試料（２−２）に於いては温度の上昇は僅かであり３０℃を越えることはなかった。
【０１３７】
（堆肥化における利用［ＩＩＩ］）
上記実施例１〜２を参考に屋外に於ける堆肥化試験を試みた。容量も７ｔに増やした。試験場所は、静岡県下の堆肥化センター内で堆肥化の困難な冬期に試験を行なった。試料は屋外で山積みとし、その上にシートを被せた。
（３−１） 牛糞 ５ｔ（水分調整せず。水分率８０％）
戻し堆肥 １．５ｔ（水分調整用に使用。水分率４４％）
ＣＦＰ １５０ｋｇ（コーヒー搾り滓、水分率８％）
脱脂大豆粕 １５０ｋｇ（大豆タンパク源）
ＯＹＫ菌粉末 ５ｋｇ（菌濃度１×１０１０個／ｇ）。
発酵温度及び外気の気温の変化をグラフにして図５に示す。冬期であるがため試料の温度も低く発酵温度が上昇するかどうかが懸念されたが、１日で２０℃の上昇が確認され、山積みの試料から蒸気の発生が確認された。その後は室内に於ける試験（上掲）と同様の上昇がみられ最高温度は７８度に達した。その後、温度の降下がみられ、この時点で“切り返し”を行った。これにより、再び発酵温度の上昇が確認された。
【０１３８】
（菌体製剤の作成）
上述した実施例では菌を直接粉体として用いているが、規模が大きくなると広範囲に高濃度の菌を効率よく混入するための菌体製剤が必要となる。次に菌体製剤の作成要領の一例を説明する。
【０１３９】
（１） 冷凍保存されたＯＹＫ菌をニュートリエンブロス（肉エキス培地）に１％植菌し３７℃にて２４時間振とう培養する。
（２） １日浸水した丸大豆を１２１℃，２０分，２気圧で高温高圧滅菌蒸煮を行う。
（３） 平型バットに、工程（２）にて滅菌蒸煮した丸大豆を敷き詰める。
（４） クリーンベンチ内でＯＹＫ菌液をスプレー植菌する。
（５） 植菌された丸大豆を３７℃の恒温室内に静置して２日間培養し、菌数を測定する。菌数が１×１０８個／ｇ以上存在することを確認する。
（６） 工程（５）が終了したものを６０℃にて充分乾燥させ、粉砕機にて顆粒状に粉砕する。この状態におけるＯＹＫ菌は胞子化して生存している。
【０１４０】
この様にして生成された顆粒状物が、本発明の菌体製剤の一例である。なお、上記（６）の工程において、乾燥物を顆粒状に粉砕したが、この大きさは、富栄養源の種類により、粒子の大きさを微粒子から顆粒の範囲で適宜変更する。その理由は、同一重量において粒子が細かい程、菌の増殖ポイントが増加するためである。
【０１４１】
（菌体製剤の堆肥化への利用）
本発明の菌体製剤が実用的であることを確認するため、静岡県下の堆肥化センター内の発酵レーンで菌体製剤を用いた堆肥化試験を行なった。なお、この試験は、堆肥化の困難な冬期に行なった。
【０１４２】
用意された試料は次のようなものである。
（４−１） 牛糞 ５４ｔ（水分調整せず。水分率８０％）
ＣＦＰ ９ｔ（コーヒー搾り滓、水分率８％）
脱脂大豆粕 ３ｔ（大豆タンパク源）
ＯＹＫ菌 ５０ｋｇ（大豆タンパク菌体製剤）
（４−２） 牛糞 ５４ｔ（水分調整済み）
ＣＦＰ ９ｔ
（４−３） 牛糞 ５４ｔ（水分調整無し）。
【０１４３】
発酵の温度変化及び外気の気温をグラフにして図６に示す。各曲線の符号は試料の番号である。試料（４−２）に示されるようにＣＦＰのみでは発酵温度は不十分でありまた試料（４−３）においては発酵温度の上昇は殆どみられない。これらの結果から菌体製剤が発酵温度の上昇に大きな効果があることが実用条件下で証明された。試料（４−１）に於いては試験開始後直ぐに温度の上昇がみられ、以後継続して上昇を続けた。その後の状況は図５とほぼ同様で実用可能な結果をもたらした。
【０１４４】
これによる堆肥は糞臭は全くなく僅かな土臭がした。しかしＣＦＰの添加は水分の調節と好気環境を保持する効果があり通性嫌気性菌であるＯＹＫ菌は、嫌気より好気の方が増殖効果が大きいため、ＯＹＫ菌の活動を活発にした。温度が低い環境での堆肥化は、微生物の活動により温度が上昇しかけてもすぐに周辺の低温部に熱を奪われ、結果的には４０℃以上の温度上昇はみられないことが多い。しかし、ＯＹＫ菌体製剤を混入する牛糞では、ＯＹＫ菌が標準菌に比べ投入直後では約１万倍という異常増殖を発生させ、これにより周辺低温部に負けない温度上昇が発生し、逆に周辺部に熱エネルギーを拡散し、その周辺にすでに生息する微生物の増殖を促し、全体が８０℃近い温度まで上昇させる。これは、高温発酵菌の増殖によるものである、これにより、有害菌、雑草の種子を死滅させた安全な完熟堆肥が製造できる。
【０１４５】
上述の実施例では本発明になる菌体製剤を牛糞に用いて説明しているが他の動物の排泄物（例えば鶏糞、馬糞）や生ゴミに対しても有効に使用しうることは云うまでもない。
【０１４６】
（菌体製剤の脱臭材への利用）
水１００ｃｃに粉末寒天１．５ｇ、グルコース１ｇ、グルタミンソーダ１ｇ、大豆タンパク菌体製剤１ｇ、コーヒー搾り滓１０ｇを溶解させ充分撹拌して容器に注入した。２０℃にて１日放置すると固形物が得られる。
この固形物を調理場の流し排水口や生ゴミ収容篭に投与した。これにより、流し排出口や生ゴミ収納篭からの悪臭の発散を予防することができた。これは、投入された固形物が少しずつ溶解しながらＯＹＫ菌が流出して増殖し、そしてこのＯＹＫ菌が腐敗菌の増殖を抑制して悪臭の発散を阻止したものと考えられる。
【０１４７】
（菌体製剤の錠剤）
大豆タンパクを含む菌体製剤、ゼラチンの水溶物、及びコーヒー搾り滓（ＣＦＰ）を混練し、バラけない程度に水分を蒸発させた。その後、混練物を打錠機で打錠して錠剤を得た。ゼラチンは菌のタンパク源となるほかバインダーとして働き、形状の維持に効果がある。また、ＣＦＰは通気性を良好にする。
得られた錠剤において、菌は胞子化した状態で生存する。この錠剤に水分を与えると菌の増殖が始まるので、例えば有機汚染された池などに投与すると、当該錠剤は浮遊しながら池表面に広がるので都合がよい。菌が実際にその効果を示す条件は投与時点で高濃度であることが必要で徐々に分散範囲を広げていくようにすれば菌の作用が顕著でやがて池全体に効果が及ぶ。
【０１４８】
（盤状脱臭剤の作成）
多数の貫通穴を有する円盤状の固形物の作成について説明する。
水１００ｃｃに、粉末寒天１ｇ、グルコース１ｇ、グルタミン酸ソーダ１ｇ、大豆タンパク１ｇ及びコーヒー抽出滓１００ｇを混合し溶解した。この混合液を充分攪拌し、１２０℃、２０分間オートクレーブ処理した。
上記混合液は７０℃以上では流動性を有しているので、図８に示すような、底面から上方に向けて延びる凸部（１３）を多数有するプラスチック製容器（１４）に上述の混合液（１５）を注入し、のち室温になるまで徐冷した。
１×１０９個／ｍｌのＯＹＫ菌濃縮液（１６）の約０．１ｍｌを混合液（１５）上に散布し、室温２０℃にて２４時間放置した。これにより、混合液（１５）が固形化した。なお、混合液（１５）は収縮しながら固形化するので、固化後、容器（１４）から簡単に離形させることができ、図７に示すような、穴（１２）を多数有する円盤状の固形物（１１）を得た。
【０１４９】
（盤状脱臭剤の利用）
上記実施例で得た固形物（１１）を脱臭剤として用いる。設置個所としては、調理場のシンク排水口や、シンク内に別途設置した、生ゴミ用の網目状容器などである。
【０１５０】
固形物（１１）を投入した箇所において、悪臭の発生を最小限に抑えることができた。これは、ＯＹＫ菌が、有機物の腐敗を促す雑菌の増殖を抑制した結果である。すなわち、固形物（１１）は、多数個のコーヒー搾り滓を互いに付着させることにより多孔質、つまり好気的環境となり、また固形物（１１）はＯＹＫ菌にとっては富栄養物でもあるので当該ＯＹＫ菌は活発に増殖する。そして穴（１２）は固形物（１１）の表面積を増大させると共に、水流の通り抜け口ともなる。 なお、上記実施例に用いた粉末寒天の一部を糊剤に変えることもできる。糊剤としては、澱粉などの天然高分子物質やアクリル酸系の合成高分子物質を用いることができる。例えば、粉末寒天１ｇに変え、０．２ｇの粉末寒天と０．８ｇの澱粉とすることができる。また、コーヒー搾り滓の代わりにその一部をおがくずで置換してもよい。おがくずは、水に添加する栄養物質を吸着するほか多孔質にて微生物の増殖基地としての役割を果たすことができる。
【０１５１】
多孔性無機物質を使用する例としては、パーライトに栄養分を付着させ、これに菌を入植させて用いる場合と、臭気を吸着する機能を有する多孔性無機物質、例えば粒状活性炭、ゼオライトなどの無機微粒子を適宜配合して吸収性能を向上した合成吸着剤を用いる場合がある。ゼオライトはトリメチルアミンやメチルメルカプタンの吸収能が高く、菌の増殖と相俟って脱臭作用に効を奏す。なお、ゼオライトを配合する場合の処方は、次の通り。水１００ｃｃ、粉末寒天１ｇ、グルコース１ｇ、グルタミン酸ソーダ１ｇ、大豆タンパク１ｇ、コーヒー搾り滓５０ｇ、ゼオライト細粒５ｇ
【０１５２】
（浴槽の湯における雑菌の繁殖防止）
ＯＹＫ菌を増殖させて浴槽の湯における雑菌の繁殖防止方法を図面に基づいて説明する。
先ず、水１００ｃｃに対し、寒天粉末１．５ｇと、菌が増殖するための栄養分としてグルタミン酸ソーダ、グルコースおよび大豆蛋白を各々溶解させ、１２０℃にて２０分間オートクレーブ処理した後、徐冷した。この混合液の粘度が高くなったところで、図９に示すように四角形（１５ｃｍ×１０ｃｍ）のポリエステル不織布（１ａ）上に厚さ２ｍｍの塗布厚で以て前記混合液を塗布し、固形化して寒天培地（２）を形成した。そして、この寒天培地（２）上にＯＹＫ菌の濃縮液（約１０９個／ｍｌ）を０．１ｍｌ散布した。
【０１５３】
その後、図１０に示すように、寒天培地（２）の全体を覆うようにポリエステル不織布（１ｂ）敷設するとともに、周辺部分にて両不織布を互いに接着剤で貼着し、ＯＹＫ菌担体（１０）を得た。
【０１５４】
図１１に示すように、浮き子（３）をポリエステル不織布（１ａ）の外側面に貼着することにより、ＯＹＫ菌担体（１０）を湯面に浮かせることができる。この浮き子（３）は、例えば内径２ｍｍの樹脂チューブの両端を閉じた物からなり、ＯＹＫ菌担体（１０）の四辺の各々に沿って貼着される。
【０１５５】
なお、図１２に示すように、ＯＹＫ菌担体（１０）の端部に紐（４）を輪奈状にして取り付け、図１３に示すように浴槽（５）に設けられた栓（６）に引掛けてもよい。これにより、槽壁（８）にＯＹＫ菌担体（１０）を設置することができる。また、ＯＹＫ菌担体（１０）を浴槽蓋（図示せず）の裏側に接着テープで貼着することもできる。さらに、ジャグジー風呂において、泡を発生させるための空気取り入れ口のフィルターにＯＹＫ菌担体（１０）を設置して外気から侵入する雑菌の増殖の抑制を図り、同時に空気供給パイプの内壁を清潔に維持することも可能である。
【０１５６】
その他、ＯＹＫ菌を２４時間風呂（浴槽の水を入浴ごと取り替えないで循環式にしてゴミを取り除き、しかも常時保温していつでも入浴できる快適さを持った風呂）に用いて浴槽の水における雑菌の繁殖防止を図ることもできる。すなわち、ＯＹＫ菌が繁殖して湯中に遊出し、２４時間風呂の温湯の循環経路や循環装置の内部を通る。増殖したＯＹＫ菌は長期間に亘り雑菌（例えばレジオネラ菌など）の増殖を抑制する共に雑菌が増殖した結果として発生する悪臭を減少させる。
【０１５７】
なお、上述の実施例で得た菌体製剤を用いて、浴槽の湯中におけるレジオネラ菌などの雑菌の繁殖防止を図ることもできる。
【０１５８】
（生理用ナプキンへの利用）
市販の女性用生理ナプキンの経血吸収領域に、多数のＯＹＫ菌が胞子化した粉末（菌濃度１×１０１０個／ｇ）を適量封入した。封入の仕方としては、例えば、当該粉末を加圧空気式の散布器に充填し、この散布器の噴射口から散布する方法がある。
【０１５９】
封入した粉体が経血に触れると発芽し、経血に含まれる蛋白質を消化して増殖する。ＯＹＫ菌は弱酸性から弱アルカリ性の領域および３０℃近い温度領域で最も良く活動し、しかも初期の菌濃度が極めて高いので、他の雑菌の繁殖を抑制して異臭の発散を防止するとともに局部を清潔に保つことができる。
なお、前記したＯＹＫ菌の粉末と粉末状の富栄養源、例えば大豆タンパクとを混合して用いることもできる。この場合にあっては、当該混合物を吸水部材に直接散布して用いるか、あるいは水溶解性のフィルムから成る扁平な袋に封止して吸水層に挟み込むのが適切である。水溶解性のフィルムの材料としては、例えば澱粉（オブラート）、カゼイン、ゼラチン、ＰＶＡ、ＣＭＣなどを使用する。
【０１６０】
また、ＯＹＫ菌の粉末を複数層に積層された不織布よりなる吸水部材の内部に固定することもできる。すなわち、生理用ナプキンの経血吸収部分は、複数層に積層された不織布からなる場合が多いが、そのうちの１つあるいは２以上の不織布にＯＹＫ菌を接着すればよい。例えば、濃度１×１０７個／ｍｌのＯＹＫ菌の菌液にＰＶＡ（バインダー）を１０％添加した分散溶液を不織布に対してスクリーン捺染機を用いて捺染し、のち６０℃程度で乾燥させてＯＹＫ菌を全て胞子化させる。これにより、ＯＹＫ菌の胞子の多数が不織布の繊維に絡まった状態に固定するので、この不織布を裁断して吸水部材を構成する不織布の一層とすることもできる。
【０１６１】
（おむつへの利用）
ＯＹＫ菌をおむつに適用する場合も、前述したように、ＯＹＫ菌の菌液にバインダーを添加した分散溶液を捺染した不織布を用いることもできる。
また、ＯＹＫ菌は、必ずしも胞子化した状態で付着させる必要はなく、例えば肉エキスとペプトンの混合粉末（ニュートリエントブロス）の７％溶液にＯＹＫ菌を投入して振とう培養し、この培養液に不織布を浸漬してＯＹＫ菌を含ませ、のち水分を除去して用いることもできる。この場合、ＯＹＫ菌は乾燥により胞子化されて繊維に絡まって保持される。
【０１６２】
（ＯＹＫ菌を混入させたフィルム）
澱粉、カゼイン、ゼラチン、ＰＶＡ、あるいはＣＭＣの水溶液に、胞子化したＯＹＫ菌を混合して分散させた。この分散液を、所定の厚みを以て平らな面に塗布し、のち５０〜７０℃で乾燥させた。そして、乾燥物を平らな面から剥がしてＯＹＫ菌を保持したフィルムを得た。
このようにして得たフィルムを、例えば上記した生理用ナプキンにおける経血吸水部分に積層したり、おむつに用いたりすることができる。
【０１６３】
（熱エネルギー源としての代謝エネルギーの利用）（図１４参照）
有機性廃棄物（例えば家畜糞尿）の堆肥化発酵工程では、発酵に伴う昇温がみられる。これを着脱可能な蓋付きの断熱容器（３１）内で、水分、栄養分（Ｃ／Ｎ比）、通気量、温度などを調節しながら最も効率の良い発酵を行なわせ、発生する余剰発酵熱を利用することができる。通常、家畜糞尿の発酵では３０〜５０℃程度しか昇温しないが、ＯＹＫ菌及びＯＹＫ菌と高温菌の菌体製剤を添加することにより堆肥化初期段階に急速に昇温し、高温菌（好熱菌）の活動が活性化され、７０〜１００℃の温度が得られる。ここでいう余剰発酵熱利用期間とは、堆肥化発酵工程において、熱交換を行なっても温度上昇が確認できる期間である。
【０１６４】
温度センサー（３８）が容器内の堆肥の温度を測定し、その温度状況により自動的にバルブ（３９）が制御される。発熱の際の水分蒸発を妨げないようにするために、エアーバルブ（３６）より適切量の水蒸気が放出され、栄養分や水分の不足に対しては、投入口（３５）より容器内へ投入できるようになっている。通気口（３７）は断熱容器（３１）の床面に設置されており、堆肥体積に対する空気の通過の極端なムラが生じないようになっている。また、容器内の発酵熱は熱交換機（３２）により、媒体として水、空気、高分子の液体等を用いて熱エネルギーを取り出すことができる。更に、容器内の発酵を均一化させるために、攪拌モータ（３３）と連動している攪拌スクリュー（３４）が回転する。攪拌は、発酵の状況にもよるが、１日１回程度の攪拌でよい。
【０１６５】
また、単に堆肥製造一次発酵槽、二次発酵槽の床面、壁面及び堆肥を覆うシートに熱交換機を配管し、堆肥化発酵工程における発酵熱を利用してもよい。
【０１６６】
有機性廃棄物の堆肥化発酵工程において、積極的な通気管理及び攪拌（切り返し）を行なっても温度が上昇しないようならば、一次発酵は終了したものと考えられる。当該装置において、堆肥の温度が上昇しないような状態になれば、断熱容器（３１）から搬出したものを堆肥として利用することができる。
【０１６７】
一般的に堆肥化発酵工程において、温度の履歴があるほど栄養分（Ｃ／Ｎ比）の値は低下する。当該装置において熱交換機を利用して発酵温度を調節し、堆肥の発酵自体を制御することによって完熟堆肥を製造するだけでなく、未分解の栄養成分を含んだ堆肥を製造することが可能になる。
【０１６８】
よって、当該装置を数機設置することで、有機性廃棄物の堆肥化発酵工程における余剰発酵熱を発酵初期段階に必要な熱源として利用することができたり、畜舎の床面の暖房、冬期における融雪などの熱源として利用することができ、農業環境の一層の改善につながるものである。
【０１６９】
また、乳牛などの畜舎における床や壁の温水洗浄として利用すれば、当該乳牛の乳房炎を防ぐのに極めて大きな効果をもたらす。
【０１７０】
さらに、廃棄物から可燃ガスを抽出する嫌気発酵手段にも用いることができる。すなわち、上述の装置から得られる温湯を嫌気発酵槽内の廃棄物の加温に使用するほか、本発明の菌体製剤を嫌気発酵の前段階に利用し、まず廃棄物を菌体製剤で４０℃程度まで昇温した後、嫌気環境に切り換え、嫌気発酵の高効率化を図ることができる。
【０１７１】
（カプセル化したＯＹＫ菌の利用）
ＯＹＫ菌またはこれを含んだＯＹＫ菌体製剤をカプセルまたは重層錠剤に封じ込め、それを経口投与した人または家畜、または座薬として投入した人または家畜の糞臭を抑えることに利用する方法を述べる。
【０１７２】
ＯＹＫ菌は、その性質から、ｐＨ６．１の環境では増殖するが、ｐＨ５．４では増殖しない。動物の胃の中はｐＨ２〜３の強い酸となっており、上記カプセル等を投与した場合、胃酸により細菌は死滅する。ＯＹＫ菌を生きたまま腸まで届かせ、糞臭をＯＹＫ菌の増殖によって抑えるためには、当該ＯＹＫ菌を胃中を通過させ、小腸の働きを妨害せずに直腸まで到達させ、直腸内の糞を有機性栄養分として取り込んで増殖させる必要がある。その方法としては次のような手段がある。すなわち、ＯＹＫ菌またはＯＹＫ菌体製剤を腸溶性（胃では溶けず腸で溶ける）の保護膜あるいはカプセルにより包み込んであるいはコーティングして、錠剤、カプセル剤、座薬などの製剤とすればよい。
【０１７３】
以下、具体的に述べる。
ゼラチン１４重量部、グリセリン３重量部、低メトキシルペクチン３重量、及び精製水８０重量部を均一に混合し、液状の被覆組成物を得た。この被覆組成物を環状孔から押し出すと同時に環状孔の内側において同心円状に設けられた内孔口よりＯＹＫ菌またはＯＹＫ菌体製剤の練り品を押し出し、この複合ジェットを冷却液中に放出した。これにより、０．５〜１０ｍｍφの粒度のカプセルを得た。これを塩化カルシウム水溶液に数分浸漬し、乾燥洗浄して腸溶性軟カプセルを得た。
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】防臭試験に供した排水処理場における排水設備と処理能力を示した説明図である。
【図２】ＯＹＫ菌とＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ標準菌との増殖速度を比較したグラフを示す図である。
【図３】堆肥化の温度変化をグラフに示した図である。
【図４】堆肥化の温度変化をグラフに示した図である。
【図５】屋外における堆肥化の温度変化をグラフに示した図である。
【図６】実用試験における堆肥化の温度変化をグラフに示した図である。
【図７】本発明の脱臭剤の形状を示す斜視図である。
【図８】本発明の脱臭剤として固形物を成形する状態を示す断面図である。
【図９】寒天培地の固定状態を示す断面図である。
【図１０】ＯＹＫ菌担体の断面図である。
【図１１】浮き子を貼着したＯＹＫ菌担体の断面図である。
【図１２】別の実施態様のＯＹＫ菌担体の断面図である。
【図１３】ＯＹＫ菌担体を浴槽に用いた例を示す断面図である。
【図１４】代謝エネルギーを熱エネルギー源として利用する装置の断面図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶血性バチルスズブチルス類縁菌で、標準枯草菌（ＩＦＯ３１３４株）に比較して菌体体積が４倍以上あり、かつ３７℃におけるニュートリエントブロス浸透培養では培養初期に殆ど誘導期がないため１０３個／ｍｌの初期菌数が４時間後に１０７個／ｍｌ以上に増加し、これらの相乗効果により、増殖によって発生する代謝エネルギーが、前記標準枯草菌のそれに比べて１万倍以上になることを特徴とする新規微生物。
【請求項２】
バチルス属に属するズブチルス種の溶血性を有さない類縁菌であり、少なくとも黄色ブドウ球菌、肺炎桿菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、病原性大腸菌Ｏ１５７、レジオネラ菌、緑膿菌、フザリウム、麹カビ、青カビ、白癬菌、及びくものすかびに対して抗菌性を有することを特徴とする新規微生物。
【請求項３】
Bacillus sp.ＯＹＫ−０１−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９４）、
Bacillus sp.ＯＹＫ−０３−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９５）、及び
Bacillus sp.ＯＹＫ−０４−０００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９６）からなる群より選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする請求項１または２に記載の新規微生物。
【請求項４】
堆肥製造用であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の新規微生物。
【請求項５】
請求項４に記載の新規微生物により製造された堆肥。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の新規微生物を、富栄養源に包囲、付着あるいは混入させてなることを特徴とする菌体製剤。
【請求項７】
前記富栄養源がタンパク質を主成分とすることを特徴とする請求項６に記載の菌体製剤。
【請求項８】
前記富栄養源の少なくとも一部が多孔性物質からなることを特徴とする請求項７に記載の菌体製剤。
【請求項９】
前記多孔性物質がコーヒー滓、食用油の抽出滓、おから、ビール滓、ヤシの実滓、果実滓などの植物の実の絞り滓などの食品の抽出滓、おがくず、籾殻などの植物細片からなる群より選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする請求項８に記載の菌体製剤。
【請求項１０】
５０℃以上の高温域で増殖する放線菌や糸状菌などの高温菌を混在させた請求項６〜９のいずれか１項に記載の菌体製剤
【請求項１１】
堆肥製造用であることを特徴とする請求項６〜１０のいずれか１項に記載の菌体製剤。
【請求項１２】
請求項１１に記載の菌体製剤を用いて製造された堆肥。
【請求項１３】
請求項６〜１０のいずれか１項に記載の菌体製剤を用いてこれに含まれる新規微生物を増殖させるときに発生する代謝エネルギーを熱エネルギー源とする加温方法。
【請求項１４】
請求項６〜１０のいずれか１項に記載の菌体製剤を用いてこれに含まれる新規微生物を増殖させるときに発生する代謝エネルギーを熱エネルギー源として利用した加熱装置。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の新規微生物を腸溶性の保護膜あるいは腸溶性のカプセルにより包囲してなる製剤。
【請求項１６】
請求項６〜１０のいずれか１項に記載の菌体製剤を含んでなる加温装置。
【請求項１７】
請求項６〜１０のいずれか１項に記載の菌体製剤を含んでなる抗菌グッズ。
【請求項１】
溶血性バチルスズブチルス類縁菌で、標準枯草菌（ＩＦＯ３１３４株）に比較して菌体体積が４倍以上あり、かつ３７℃におけるニュートリエントブロス浸透培養では培養初期に殆ど誘導期がないため１０３個／ｍｌの初期菌数が４時間後に１０７個／ｍｌ以上に増加し、これらの相乗効果により、増殖によって発生する代謝エネルギーが、前記標準枯草菌のそれに比べて１万倍以上になることを特徴とする新規微生物。
【請求項２】
バチルス属に属するズブチルス種の溶血性を有さない類縁菌であり、少なくとも黄色ブドウ球菌、肺炎桿菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、病原性大腸菌Ｏ１５７、レジオネラ菌、緑膿菌、フザリウム、麹カビ、青カビ、白癬菌、及びくものすかびに対して抗菌性を有することを特徴とする新規微生物。
【請求項３】
Bacillus sp.ＯＹＫ−０１−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９４）、
Bacillus sp.ＯＹＫ−０３−６００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９５）、及び
Bacillus sp.ＯＹＫ−０４−０００（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９６）からなる群より選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする請求項１または２に記載の新規微生物。
【請求項４】
堆肥製造用であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の新規微生物。
【請求項５】
請求項４に記載の新規微生物により製造された堆肥。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の新規微生物を、富栄養源に包囲、付着あるいは混入させてなることを特徴とする菌体製剤。
【請求項７】
前記富栄養源がタンパク質を主成分とすることを特徴とする請求項６に記載の菌体製剤。
【請求項８】
前記富栄養源の少なくとも一部が多孔性物質からなることを特徴とする請求項７に記載の菌体製剤。
【請求項９】
前記多孔性物質がコーヒー滓、食用油の抽出滓、おから、ビール滓、ヤシの実滓、果実滓などの植物の実の絞り滓などの食品の抽出滓、おがくず、籾殻などの植物細片からなる群より選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする請求項８に記載の菌体製剤。
【請求項１０】
５０℃以上の高温域で増殖する放線菌や糸状菌などの高温菌を混在させた請求項６〜９のいずれか１項に記載の菌体製剤
【請求項１１】
堆肥製造用であることを特徴とする請求項６〜１０のいずれか１項に記載の菌体製剤。
【請求項１２】
請求項１１に記載の菌体製剤を用いて製造された堆肥。
【請求項１３】
請求項６〜１０のいずれか１項に記載の菌体製剤を用いてこれに含まれる新規微生物を増殖させるときに発生する代謝エネルギーを熱エネルギー源とする加温方法。
【請求項１４】
請求項６〜１０のいずれか１項に記載の菌体製剤を用いてこれに含まれる新規微生物を増殖させるときに発生する代謝エネルギーを熱エネルギー源として利用した加熱装置。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の新規微生物を腸溶性の保護膜あるいは腸溶性のカプセルにより包囲してなる製剤。
【請求項１６】
請求項６〜１０のいずれか１項に記載の菌体製剤を含んでなる加温装置。
【請求項１７】
請求項６〜１０のいずれか１項に記載の菌体製剤を含んでなる抗菌グッズ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２００８−２７８８９０（Ｐ２００８−２７８８９０Ａ）
【公開日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１２２６９３（Ｐ２００８−１２２６９３）
【出願日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【分割の表示】特願２０００−５０８７６８（Ｐ２０００−５０８７６８）の分割
【原出願日】平成１０年９月３日（１９９８．９．３）
【出願人】（０００１１６２３１）ワシ興産株式会社 (25)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【分割の表示】特願２０００−５０８７６８（Ｐ２０００−５０８７６８）の分割
【原出願日】平成１０年９月３日（１９９８．９．３）
【出願人】（０００１１６２３１）ワシ興産株式会社 (25)
【Ｆターム（参考）】
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