新規抗菌性ペプチド
本発明は、特にグラム陽性及びグラム陰性菌に対する抗菌活性を有するモノマー及びマルチマーペプチド化合物に関する。さらに、本発明は、医学的用途に用いられる、殺菌剤及び／又は洗剤として用いられる、又は保存料として用いられる前記ペプチド化合物を含む組成物に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特にグラム陽性及びグラム陰性菌に対する抗菌活性を有するモノマー及びマルチマーペプチド化合物に関する。さらに、本発明は、医学的用途に用いられる、殺菌剤及び／又は洗剤として使用される、あるいは保存料として使用される、前記ペプチド化合物を含む組成物に関する。
【０００２】
多剤耐性微生物の発生の増加は、新規抗菌剤の開発において新たな関心を生む。耐性を回避し得る新規部位を標的とする最新薬を製造する流れは、細菌感染の長期制御に重要である（参考文献１）。
【０００３】
医薬産業は、以前は、既存の抗生物質を修飾し、最新の抗生物質をタイミングよく開発することによって、このニーズに対応してきた。これらの試みの成功によって、様々な現在入手可能な薬物クラスの抗生物質、すなわちベータラクタム（ペニシリン、カルバペネム、セファロスポリン）、糖ペプチド、マクロライド、ケトライド、アミノグリコシド、フルオロキノロン、オキサゾリジノンなどが産生されてきた（参考文献２）。しかし、最近、ほとんど又は全ての既知クラスの抗生物質に対して耐性である微生物が検出された。したがって、新規抗生物質化合物に対する必要性が増大している。
【０００４】
抗菌性ペプチドは、有望な種類の抗感染症薬である、非特異的免疫系の成分である。それらの作用機序は十分には理解されていないが、細胞膜や細胞分裂及び高分子合成の過程をはじめとする多数の標的を有すると考えられている（参考文献３）。
【０００５】
ペプチド抗生物質の総説がＲ．Ｅ．Ｗ．Ｈａｎｃｏｃｋにより発表されている（参考文献４）。この総説の主な焦点は、従来の抗生物質と比較した場合のカチオン性抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）の利点及び欠点であり、これらのペプチドを用いた最近の臨床開発をまとめている。これらは短鎖（１０〜５０アミノ酸）であり、全体的な正電荷（一般的に＋２〜＋９）及び実質的な割合（≧３０％又はそれ以上）の疎水性残基を有すると定義することができる。これらの特性により、ペプチドは、しばしば膜と接触すると三次元で両親媒性構造に折りたたまれ、かくして正に荷電した疎水性アミノ酸を多く含む独立したパッチを形成する。
【０００６】
ＡＭＰは、細菌、真菌、エンベロープを持ったウイルス、寄生生物及びさらには腫瘍細胞など様々な標的に対してｉｎ ｖｉｔｒｏで広範囲の殺活性を示す（参考文献５及び６）。
【０００７】
ここ１５年以内に、ほぼ９００のＡＭＰが種間で同定され、今や自然免疫系の必須成分として認識されている（参考文献７）。マゲイニン、たとえばマゲイニン２及びＰＧＬａは、最もよく研究されているＡＭＰに含まれる。これらは、最初にアフリカツメガエルの皮膚から単離された直鎖ペプチドである。マゲイニンは、２つの重要な活性、すなわち広い抗菌スペクトルと抗エンドトキシン活性とを有するαへリックスイオノフォアである（参考文献８）。
【０００８】
哺乳動物における大きなＡＭＰファミリーは、カテリシジンによって代表される。これらは、アミノ末端カテプシンＬ阻害物質ドメインを有するＡＭＰ（カテリン）である。唯一のヒトカテリシジンｈ−ＣＡＰ１８のＣ末端３７アミノ酸ドメインであるＬＬ−３７は、広い抗菌活性を発揮する両親媒性らせん状ペプチドである（参考文献９）。
【０００９】
さまざまな合成ペプチドがｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏとで分析されている。たとえば、米国特許出願第６０／６５１，２７０号は、様々な病原体に対して活性な抗菌性ヘキサペプチド及びそれらの脂肪誘導体を開示する。これらのペプチドは、動物における真菌性及び細菌性疾患の治療において特に有効であり、多剤耐性菌に対するポリミキシンＢなど従来の抗生物質の殺菌活性を促進する可能性を示す。
【００１０】
ＷＯ２００６／００６１９５は、抗菌性ペプチド、とりわけ、配列ＱＫＫＩＲＶＲＬＳＡ（配列番号１）を有するペプチドを開示している。これらのペプチドは抗菌活性を示すが、これらは非常に不安定であるため実用化できない。実際、Ｎ末端Ｇｌｎはピログルタミン誘導体を提供し、その含有量は生成物の保存中に増大する。
【００１１】
本発明は、感染性疾患を治療及び／又は予防するために新規抗菌性ペプチド化合物を使用及び製造するための方法を提供する。
【００１２】
これらの新規ペプチド化合物は、配列スキャニング法及び直鎖デカペプチドに関する伸長ステップにより同定された。Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ化学反応によって固相で実施されるペプチド合成によって、ＷＯ２００６／００６１９５に開示される本来の配列（配列番号１）と比較した場合に増大した抗菌活性を有するペプチドのライブラリを単離することができた。
【００１３】
本発明の主題は、一般式（Ｉａ）：
Ｚ−［Ｋ］n−Ｋ−Ｉ−Ｒ−Ｖ−Ｒ（配列番号２５）
（式中、Ｋは、リシン側鎖、特にＬ−若しくはＤ−リシンを有するアミノ酸残基、又は正に荷電した側鎖を有する別のアミノ酸残基であり、
Ｉは、イソロイシン側鎖、特にＬ−若しくはＤ−イソロイシンを有するアミノ酸残基であり、
Ｒは、アルギニン側鎖又はＮ−アルキル置換グアニジン側鎖、特にＬ−若しくはＤ−アルギニンを有するアミノ酸残基であり、
Ｖは、バリン側鎖、特にＬ−若しくはＤ−バリンを有するアミノ酸残基であり、
ここで、アミノ酸残基Ｋ、Ｉ、Ｒ及びＶのうち１つは、アラニン側鎖、特にＬ−若しくはＤ−アラニンを有するアミノ酸残基で置換されていてもよく、
Ｚは、少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、
（ｉ）芳香族アミノ酸残基又は少なくとも１つの芳香族アミノ酸残基を含むジ−、トリ−若しくはテトラペプチジル基（芳香族アミノ酸残基は、特にトリプトファン、Ｎ−メチルトリプトファン、フェニルアラニン、β−フェニルアラニン、ナフチルアラニン、β−ナフチルアラニン、β−ジフェニルアラニン、β−（４，４’−ビフェニル）アラニン、β−アントラセン−９−イルアラニン及びβ−インドール−３−イルアラニン、又はそれらの置換誘導体から選択される）
（ｉｉ）脂肪族アミノ酸残基又は少なくとも１つの脂肪族アミノ酸残基を含むジ−、トリ−、テトラペプチジル基（脂肪族残基は、特に脂肪族、好ましくは少なくとも３個のＣ原子を有する分岐脂肪族側鎖を含むα−アミノ酸残基から選択される）
（ｉｉｉ）ピログルタミン酸（ｐｙｒＥ）残基又はＮ末端ピログルタミン酸残基を含むジ−、トリ−若しくはテトラペプチジル基、
（ｉｖ）残基Ｑ*又はＮ末端Ｑ*残基を含むジ−、トリ−若しくはテトラペプチジル基（Ｑ*は、グルタミン側鎖を有する保護アミノ酸残基、特に保護Ｌ−グルタミン残基である）、並びに
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つの組み合わせ、たとえば（ｉ）及び（ｉｉｉ）、（ｉ）及び（ｉｖ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）及び（ｉｉ）又は（ｉｖ）
から選択されるペプチド化合物のＮ末端基であり、
ｎは０又は１である）によって表されるアミノ酸配列を含む３５アミノ酸残基までの長さを有するペプチド化合物である。
【００１４】
好適な実施形態において、本発明は、一般式（Ｉｂ）：
Ｚ−［Ｋ］n−Ｋ−Ｉ−Ｒ−Ｖ−Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ａ（配列番号２６）
（式中、Ｋ、Ｉ、Ｒ、Ｖ、Ｚ及びｎは前記定義のとおりであり、
Ａは、アラニン側鎖、特にＬ−アラニンを有するアミノ酸残基であり、
Ｓは、セリン側鎖、特にＬ−セリンを有するアミノ酸残基であり、
Ｌは、ロイシン側鎖、特にＬ−ロイシンを有するアミノ酸残基であり、
アミノ酸残基Ｋ、Ｉ、Ｒ、Ｌ、Ｖ及びＳのうち１つはアラニン側鎖を有するアミノ酸残基で置換されていてもよい）によって表されるアミノ酸配列を含む３５アミノ酸残基までの長さを有するペプチド化合物に関する。
【００１５】
さらなる実施形態において、本発明は、前記定義の複数のペプチド化合物を含むマルチマー化合物に関し、この場合、個々のペプチド化合物は、たとえば多官能性、たとえば二又は三官能性アミノ酸などの二又は三官能性部分によって共有結合している。
【００１６】
本発明は、ペプチド化合物に関する。「ペプチド化合物」という用語は共有結合により、好ましくはカルボキサミド結合により結合したアミノ酸構成単位又はその類似体を少なくとも部分的に含む化合物を包含する。構成単位は、好ましくはアミノカルボン酸、たとえばα−アミノカルボン酸又は他の種類のカルボン酸、たとえばβ−又はさらにはω−アミノカルボン酸から選択される。アミノ酸構成単位は、遺伝的にコードされたＬ−α−アミノカルボン酸及び／又はそれらのＤ−エナンチオマー及び／又は天然に存在しないアミノ酸構成単位から選択することができる。ペプチド化合物の個々の構成単位は、共有結合、たとえばカルボキサミド、カーバメート、エステル及びチオエステル結合によって結合する。本発明のペプチド化合物は、直鎖又は環状であってよい。モノマーペプチド化合物は、３５アミノ酸残基までの長さ、好ましくは少なくとも８、さらに好ましくは少なくとも１０及び１５アミノ酸構成単位までの長さを有する。
【００１７】
一実施形態において、本発明のペプチド化合物は、芳香族アミノ酸残基、好ましくは少なくとも１つの単環式若しくは多環式芳香族環、好ましくは少なくとも１つの二環式若しくは三環式芳香族環、たとえばフェニル、ナフチル、アントラセニル、ジフェニル、インドリルなどを含むα−アミノ酸残基、又は前記のような少なくとも１つの芳香族アミノ酸構成単位を含むジ−、トリ−若しくはテトラ−ペプチジル基を含むＮ末端基Ｚを含む。
【００１８】
芳香族アミノ酸残基の具体例は、トリプトファン、Ｎ−メチルトリプトファン、フェニルアラニン、β−フェニルアラニン、ナフチルアラニン、β−ナフチルアラニン、β−ジフェニルアラニン、β−（４−４’−ビフェニル）アラニン、β−アントラセン−９−イルアラニン及びβ−インドール−３−イルアラニン、又はそれらの置換誘導体、たとえばそれらの一若しくは多アルキル置換誘導体である。さらに好ましくは、芳香族アミノ酸残基は、トリプトファン側鎖（Ｗ）、たとえばＬ（又はＤ）−トリプトファンを含む。
【００１９】
さらなる実施形態において、本発明のペプチド化合物は、脂肪族アミノ酸残基、好ましくは脂肪族、さらに好ましくは少なくとも３個のＣ原子、たとえば３、４、５、６若しくは７個のＣ原子を有する分岐脂肪族側鎖を含むα−アミノ酸残基又は少なくとも１つの前記定義の脂肪族アミノ酸構成単位を含むジ−、トリ−若しくはテトラ−ペプチジル基を含むＮ末端基Ｚを含む。脂肪族アミノ酸残基の具体例は、分岐アルキル、たとえば２−アミノペンタン酸、２−アミノヘキサン酸若しくは２−アミノヘプタン酸のメチル誘導体又はそれらのＬ−若しくはＤ−エナンチオマー形である。さらに好ましくは、脂肪族アミノ酸残基は、ロイシン側鎖（Ｌ）、たとえばＬ−ロイシンを含む。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態において、ペプチド化合物は、ピログルタミン酸（ｐｙｒＥ）残基又はＮ末端ピログルタミン酸残基を含むジ−、トリ−若しくはテトラ−ペプチジル基であるＮ末端基を含む。
【００２１】
本発明のさらに別の実施形態において、ペプチド化合物は、Ｑ*残基であるＮ末端基を含み、この場合、Ｑ*はグルタミン側鎖を有する保護アミノ酸残基、特に保護Ｌ−グルタミン、又はその誘導体のＮ末端Ｑ*残基を含むジ−、トリ−、若しくはテトラ−ペプチジル基である。Ｑ*残基の好適な例は、ジペプチジル残基Ｘ−Ｑであり、ここでＸはＱとは異なるアミノ酸残基、たとえばＧ（グリシン）又はＮ末端アミノ酸及び／又はカルボキシル側鎖基が、たとえばアセチル基などのアシル、アミノ基によって保護されたＱ残基である。
【００２２】
さらなる実施形態において、本発明のペプチド化合物は、芳香族アミノ酸残基とＮ末端ピログルタミン酸残基との組み合わせ又は芳香族アミノ酸残基とＮ末端Ｑ*残基との組み合わせを含む。
【００２３】
特に好適な実施形態において、ペプチド化合物のＮ末端基Ｚは、Ａｒ、Ａｒ−Ｑ、Ｇ−Ｑ若しくはアセチル−ＱなどのＱ*、Ｇ−Ｑ−Ａｒ若しくはアセチル−Ｑ−ＡｒなどのＱ*−Ａｒ、ｐｙｒＥ及びｐｙｒＥ−Ａｒ（ここで、Ａｒは前記定義の芳香族アミノ酸残基である）から選択される。
【００２４】
本発明のペプチド化合物の具体例は：
ＷＫＫＩＲＶＲＬＳＡ（配列番号６）
ｐｙｒＥＷＫＩＲＶＲＬＳＡ（配列番号２７）
ＧＱＷＫＩＲＶＲＬＳＡ（配列番号１４）
アセチル−ＱＷＫＩＲＶＲＬＳＡ（配列番号１２）
Ａｏａ−ＱＷＫＩＲＶＲＬＳＡ（配列番号１６）
（ＧＱＷＫＩＲＶＲＬＳＡ）2Ｋ−β−Ａｌａ（配列番号１９）
（式中、ｐｒｙＥはピログルタミン酸残基であり、Ａｏａは８−アミノオクタン酸残基であり、β−Ａｌａはβ−アラニン残基であり、前記ペプチドはそれらのＣ末端で場合によってアミド化されている））から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２５】
好適な実施形態において、本発明は、前記の複数のペプチド化合物を含むマルチマー化合物に関する。たとえば、本発明のマルチマー化合物は、２、３、４、５、６、７、８又はそれ以上のペプチド化合物を含み得る。マルチマー化合物は、マトリックス、たとえばポリペプチド、単糖、オリゴ糖若しくは多糖又は有機ポリマー、好ましくは直鎖有機ポリマーに基づくマトリックス上でマルチマー化されたペプチド化合物を含み得る。たとえば、マトリックスは、ポリ（Ｎ−アルキル（メタ）アクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキル（メタ）アクリルアミド）、ポリメラミン、デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール及び／又はポリビニルピロリドンから選択することができる。ペプチド化合物のマトリックスとのカップリングは、ペプチド化合物のＮ末端及び／又はＣ末端により、好ましくはマトリックス上の反応性基、たとえばヒドロキシ基、アミノ基、チオール基、又はカルボキシル基とのカップリングを可能にするホモ−及び／又はヘテロ−二官能性リンカーを用いて行われる。
【００２６】
さらなる好適な実施形態において、マルチマー化合物は分岐した、特にデンドリマー構造を有する。
【００２７】
さらに別の実施形態において、マルチマー化合物は：
（ｉ）Ｒ−（Ｙ1−Ｒ）m−Ｙ1−（Ｒ）m’（ＩＩａ）
（式中、Ｒは請求項１〜６のいずれか１項で定義されたペプチド化合物であり、Ｙ1は共有結合又は二官能性リンカー、たとえばプロピレングリコールなどのジアルコール、コハク酸などのジカルボン酸、エチレンジアミンなどのジアミン、アミノ酸、ヒドロキシカルボン酸、たとえばヒドロキシアルカン酸、又はジイソシアネートであり、ｍは０又は正の整数であり、ｍ’は０又は１である）
（ｉｉ）［［（Ｒ）n1Ｙ1’］n2］Ｙ2（ＩＩｂ）
（式中、Ｒは、請求項１〜６のいずれか１項で定義されたペプチド化合物であり、
Ｙ1’はそれぞれの場合独立して少なくとも３の官能価を有するリンカー、たとえばリシン、オルニチン、ノルリシン、アミノアラニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸などの三官能性アミノ酸であり、
Ｙ2は、少なくとも２の官能価を有するリンカーであり、
ｎ1及びｎ2はそれぞれの場合独立して、少なくとも２、好ましくは２、３又は４、さらに好ましくは２の整数である）、
（ｉｉｉ）｛［［（Ｒ）n1Ｙ1］n2］Ｙ2’｝n3Ｙ3（ＩＩｃ）
（式中、Ｒは、請求項１〜６のいずれか１項で定義されたペプチド化合物であり、
Ｙ1及びＹ2’は、それぞれの場合独立して、少なくとも３の官能価を有するリンカー、たとえばリシン、オルニチン、ノルリシン、アミノアラニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸などの三官能性アミノ酸であり、
Ｙ3は、少なくとも２の官能価を有するリンカーであり、
ｎ1、ｎ2及びｎ3は、それぞれの場合独立して、少なくとも２、好ましくは２、３又は４、さらに好ましくは２の整数である）
から選択される。
【００２８】
マルチマー化合物（ＩＩａ）は、複数のペプチド化合物が共有結合及び／又はホモ−若しくはヘテロ−二官能性リンカーＹ1によって結合したマルチマー直鎖化合物である。好ましくは、マルチマー化合物は、８個まで、さらに好ましくは４個までのペプチド化合物（Ｉａ）若しくは（Ｉｂ）の単位を含む。
【００２９】
マルチマー化合物（ＩＩｂ）及び（ＩＩｃ）は、個々のペプチド単位Ｒが、少なくとも３の官能価を有するリンカーによって結合した分岐化合物である。好適な実施形態において、マルチマー化合物（ＩＩｂ）は４個のペプチド単位を含み、構造：
【化１】
を有する。
【００３０】
さらなる好適な実施形態において、マルチマー化合物（ＩＩｃ）は８個のペプチド単位を含み、構造：
【化２】
を有する。
【００３１】
本発明のさらなる実施形態において、ペプチド及びマルチマー化合物は、少なくとも１つの修飾を含み、特に脂質、アミド、エステル、アシル及び／又はアルキル部分から選択されるものが結合し、たとえばＮ末端基、Ｃ末端基及び／又は側鎖基に結合している。Ｎ−及び／又はＣ末端修飾が好適である。
【００３２】
特に好適な修飾は、３〜２５、好ましくは５〜２５個のＣ原子を有する直鎖又は環状、飽和又は一不飽和若しくは多不飽和炭化水素基を含む少なくとも１つのアミノカルボン酸、たとえば５−アミノバレロイック酸（valeroic acid）、８−アミノオクタン酸又は２−アミノデカン酸である、少なくとも１つの脂質部分が結合していることである。好ましくは、脂質部分は、化合物のＮ末端及び／又はＣ末端に結合する。脂質部分は、たとえばペプチド化合物及び／又はマルチマー化合物の遊離Ｎ末端若しくはＣ末端と結合することができる。しかし、脂質部分は、たとえば化合物（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）及び（ＩＩｃ）に関して記載したように、Ｎ末端及び／又はＣ末端リンカーと結合することもできる。化合物（ＩＩｂ）及び（ＩＩｃ）の好適な実施形態において、Ｃ末端リンカーＹ2及びＹ3は、脂質部分が結合可能な三官能性リンカーである。
【００３３】
さらなる好適な実施形態は、Ｎ末端へのアシル、たとえばアセチル基の結合及び／又は遊離Ｃ末端のアミド化である。
【００３４】
本発明の化合物は、抗菌活性、特に、原核生物、たとえば真正細菌又は古細菌、及び真核生物、たとえば真菌、藻類又は寄生生物から選択される病原生物に対する活性を有し得る。好ましくは、化合物は、抗菌活性、たとえばグラム陰性及び／又はグラム陽性細菌に対する活性を有する。
【００３５】
本発明の化合物は、抗バイオフィルム活性も有し得る。体内への医療機器の挿入に関連する感染は、時間とともに増大する。その過程は、器具上への生物の接着、増殖及びバイオフィルム形成を伴う。バイオフィルムは、従来の抗菌剤で根絶するのが困難であり、抗菌性耐性はバイオフィルム成長のある特異性によって決定される（参考文献１０）。したがって、さらなる態様において、本発明の化合物は、バイオフィルムに埋め込まれた細菌、たとえばこれらに限定されるものではないが：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、及び黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の成長及び増殖を防止又は阻害するために用いることもできる。
【００３６】
本発明のさらなる主題は、少なくとも１つの前記定義の化合物、たとえば前記定義のペプチド又はマルチマー化合物を、薬剤的に許容される担体、希釈剤及び／又はアジュバントとともに含む医療用組成物である。人間医学又は獣医学において使用するために、組成物は、好ましくは、固体、液体又はゲル及びこれらの組み合わせから選択される医薬投与形態、たとえば洗眼液、洗口液、軟膏、エアロゾル又は局所製品としての形態である。医薬投与形態は、医薬有効量の本発明のモノマー又はマルチマーペプチド化合物、すなわち、病原生物の存在によって引き起こされる、関連する、又は不随して起きる障害の治療及び／又は予防に有効な活性剤の量を含む。「薬剤的に許容される」という表現は、本明細書では、妥当な損益比に相応して、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症なしに、ヒト又は場合によって動物の組織と接触する使用に適した化合物、物質、組成物、及び／又は投与形態を意味するために用いられる。
【００３７】
本発明の医薬投与形態における活性剤の実際の量は、投与経路並びに治療される障害の種類及び重篤度に応じて変わり得る。所望の（１つ若しくは複数の）効果を達成するために、ペプチドモノマー又はマルチマー化合物を、単回投与量又は分割量として、たとえば少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ（体重）乃至約２００〜５５０ｍｇ／ｋｇ（体重）、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ（体重）乃至約１００〜３００ｍｇ／ｋｇ（体重）、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）乃至約５０〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）又は少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ（体重）乃至約１０〜５０ｍｇ／ｋｇ（体重）又は少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ乃至約２０ｍｇ／ｋｇ（体重）で投与することができるが、他の用量でも有益な結果が得られる可能性がある。
【００３８】
医薬組成物を製造するためには、本発明のペプチドを合成、又は他の方法で得、必要であるか若しくは望ましいならば精製し、次いで好ましくは凍結乾燥し、安定化させる。ペプチドを次いで適当な濃度に調節することができ、場合によって、他の薬剤的に許容される薬剤と組み合わせることができる。
【００３９】
このように、本発明の治療用ペプチドを含む１以上の好適な単位投与形態は、経口、局所、非経口（皮下、静脈内、筋肉内及び腹腔内を包含する）、膣、直腸、皮膚、経皮、胸腔内、肺内及び鼻内（呼吸器）経路をはじめとする様々な経路により投与することができる。
【００４０】
局所投与に関して、活性剤を標的部分、たとえば爪及び皮膚に直接適用するために当該分野で既知のように処方することができる。局所適用のために主に調節された形態は、たとえば、ラッカー、クリーム、乳液、ゲル、粉末、分散液、又はミクロエマルジョン、多少増粘されたローション、含浸パッド、軟膏又はスティック、エアロゾル処方（たとえばスプレー若しくはフォーム）、石けん、洗剤、ローション若しくは固形石けんの形態を取る。この目的のための他の通常の形態としては、創傷包帯、コーティングされた包帯又は他のポリマーカバリング、軟膏、クリーム、ローションが挙げられる。
【００４１】
さらなる好適な実施形態において、本発明のモノマー若しくはマルチマー化合物又は組成物は、獣医用医薬用途において用いられる。したがって、本発明は、前記の少なくとも１つの化合物を含む獣医用組成物にも関する。
【００４２】
本発明のさらに別の実施形態は、前記の少なくとも１つの化合物を含む、殺菌剤及び／又は洗剤として使用される、又は保存料、たとえば医薬、化粧品若しくは食品用保存料の使用のための、前記の少なくとも１つの化合物を含む組成物に関する。
【００４３】
本発明のさらなる実施形態は、バイオフィルムに埋め込まれた微生物の成長又は増殖を減少させるための、前記の少なくとも１つの化合物を含む組成物に関する。
【００４４】
本発明のさらに別の実施形態において、ペプチド化合物及び組成物は、装置、好ましくは微生物耐性であることが望ましい医療機器の表面を処理するために用いられる。特に、本発明のこの態様によれば、ペプチド化合物及びそれらの組成物を、特に本発明の化合物及び組成物を医療機器上に結合、コーティング及び／又は埋め込むことによって、医療機器の表面上にコーティングする。医療機器の例としては、管類及びカニューレ、ステント、手術器具、カテーテル、ペースメーカー、人工心臓弁、人工関節、人工喉頭、コンタクトレンズ、及び子宮内避妊器具が挙げられる。
【００４５】
さらに、本発明を、以下の図面及び実施例によりさらに詳細に説明する。
【００４６】
図１は、ｉｎ ｖｉｖｏ試験での有効性のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ生存率プロットを示し、ここでは、本発明の二量体ペプチド化合物ＩＤ２４（配列番号２４、第４表を参照）をマウス敗血症モデルにおける同じ用法での参考抗生物質化合物コリスチンメタンスルホン酸ナトリウム（ＣＭＳ）と比較した。
【００４７】
図２ａ及び図２ｂは、２つのヒストグラムプロットを示し、この図では、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＡＴＣＣ２７８５３の２４時間バイオフィルムの、異なる濃度の二量体ペプチド化合物ＩＤ２４及び参考抗生物質化合物ＣＭＳそれぞれへの暴露を記録する。
【００４８】
特に、図２ａは、緑膿菌ＡＴＣＣ２７８５３の２４時間バイオフィルムの、異なる濃度の本発明のＩＤ２４化合物への暴露を示す。複製数／濃度はｎ＝２である。
【００４９】
一方、図２ｂは、緑膿菌ＡＴＣＣ２７８５３の２４時間バイオフィルムの、異なる濃度のコリスチンメタンスルホン酸ナトリウム（ＣＭＳ）への暴露を示す。複製数／濃度はｎ＝２である。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、ｉｎ ｖｉｖｏ試験での有効性のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ生存率プロットを示す図である。
【図２ａ】図２ａは、緑膿菌ＡＴＣＣ２７８５３の２４時間バイオフィルムの、異なる濃度の本発明のＩＤ２４化合物への暴露を示す図である。
【図２ｂ】図２ｂは、緑膿菌ＡＴＣＣ２７８５３の２４時間バイオフィルムの、異なる濃度のコリスチンメタンスルホン酸ナトリウム（ＣＭＳ）への暴露を示す図である。
【００５１】
実施例
材料
溶媒（すべてＨＰＬＣ等級）をＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州セントルイス）から入手し、さらに精製せずに使用した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、ピペリジン、トリフルオロ酢酸及びトリイソプロピルシランをＡｌｄｒｉｃｈ ａｎｄ Ｆｌｕｋａ（米国ミズーリ州セントルイス）から購入した。Ｆｍｏｃ−アミノ酸、ＨＯＢＴ、ＨＢＴＵ及び樹脂は、Ｃｈｅｍ−ｌｍｐｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（イリノイ州ウッドデール）及びＭｅｒｃｋ（ドイツ国ダルムシュタット）から提供された。
【００５２】
ペプチド合成。全てのペプチドは、ＭｕｌｔｉＳｙｎＴｅｃｈ Ｓｙｒｏ（ドイツ国ウィッテン）上、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ化学を用いて、固相合成によって合成した。カップリング活性化は、ＤＭＦ中ＨＯＢｔ／ＤＩＰＥＡ／ＨＢＴＵ（１／２／０．９）によって実施し、ＮＭＰ中４０％ピペリジンを用いてアミン上のＦｍｏｃ保護を除去した。側鎖保護基は、Ｇｌｕ及びＡｓｐについてはｔｅｒｔ−ブチルエステル、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ及びＡｓｎについてはトリチル、Ａｒｇについては２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒについてはｔｅｒｔ−ブチルエーテル、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ及びＴｒｐについてはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）であった。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨは、二量体及び四量体ペプチドを合成するために使用されたアミノ酸であった。Ｆｍｏｃ−５−アミノ吉草酸（５−Ａｖａ）及びＦｍｏｃ−８−アミノオクタン酸（８−Ａｏａ）を用いて、直鎖ペプチド及び二量体ペプチドの両方のＮ末端及び／又はＣ末端で脂質化を実施した。四量体、二量体及び直鎖ペプチドを、リンクアミド４−ベンズヒドリルアミン樹脂（ＭＢＨＡ）上で製造し、遊離アミノ基における最終ローディングを分光光度計によって測定することによって評価し、同時に酸ペプチドを２−クロロトリチルクロリド樹脂上で製造した。全ペプチドを樹脂から開裂させ、トリフルオロ酢酸、水及びトリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ、９５：２．５：２．５）での処理によって脱保護した。ジエチルエーテル中で沈降させることによって得られた粗ペプチドを、Ｃ12Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘカラム上Ｗａｔｅｒｓ ＨＰＬＣ−ＵＶ（マサチューセッツ州ミルフォード）によって精製し、Ｂｒｕｋｅｒ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光分析（マサチューセッツ州ビレリカ）によって特性化した。
【００５３】
ＭＩＣの決定。ＭＩＣは、ＭＨＢ中、微量液体希釈法により、ＣＬＳＩ法（従来はＮＣＣＬＳ、参考文献１１）にしたがって、１〜５×１０5ＣＦＵ／ｍＬの最終細菌接種物を用いることにより、決定した。分析を、丸底ウェルを有する滅菌９６穴マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）中で実施した。プレートを３７℃でインキュベーションし、２０〜２４時間後に読み取った。ＭＩＣを、視認可能な細菌成長の完全な抑制を引き起こす最低薬剤濃度として定義した。全化合物を（５％ｖ／ｖＤＭＳＯ）中に溶解させた。
【００５４】
実施例Ｉ
２−Ｘ1ミニライブラリ合成
ペプチド合成を前述のように２−クロロトリチルクロリド樹脂上で実施した。一般的配列Ｈ−Ｘ1−ＫＫＩＲＶＲＬＳＡ−ＯＨ（Ｘ1＝Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｗ、Ｙ）を有する６つの直鎖酸ペプチドを合成し、等モル量で組み合わせた。得られた粗ペプチド混合物をＣ12ＨＰＬＣカラム上で精製して、開裂によって生じる塩及びスカベンジャーを除去し、ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州サンタクララ）と連結したＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ／イオントラップ）により、成分を勾配モード（Ｂ ２０分で５→９５％；Ａ 水中０．１％ＴＦＡ、Ｂ アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ）を１．０ｍＬ／分の流速で溶出して分析した。ＭＳ（ＬＣ−ＭＳ ＥＳＩ／イオントラップ）：（ＩＤ２）Ｃ56Ｈ100Ｎ18Ｏ12（Ｘ1＝Ｆ）の計算値は（Ｍ）１２１６であり、実測値は１２１７（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ３）Ｃ53Ｈ102Ｎ18Ｏ12（Ｘ1＝Ｉ）の計算値は（Ｍ）１１８２であり、実測値は１１８３（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ４）Ｃ53Ｈ102Ｎ18Ｏ12（Ｘ1＝Ｌ）の計算値は（Ｍ）１１８２であり、実測値は１１８３（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ５）Ｃ52Ｈ100Ｎ18Ｏ12（Ｘ1＝Ｖ）の計算値は（Ｍ）１１６８であり、実測値は１１６９（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ６）Ｃ58Ｈ101Ｎ19Ｏ12（Ｘ1＝Ｗ）の計算値は（Ｍ）１２５５であり、実測値は１２５６（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ７）Ｃ56Ｈ100Ｎ18Ｏ13（Ｘ1＝Ｙ）の計算値は（Ｍ）１２３２であり、実測値は１２３３（Ｍ＋Ｈ）である。
【００５５】
実施例ＩＩ
３−Ｘ1ミニライブラリ合成
前記のようにしてペプチド合成を実施した。一般的配列Ｈ−Ｑ−Ｘ1−ＫＩＲＶＲＬＳＡ−ＯＨ（Ｘ1＝Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｗ、Ｙ）を有する６つの直鎖酸ペプチドを合成し、等モル量で組み合わせた。粗ペプチド混合物を実施例Ｉで記載するようにして精製した。ＭＳ（ＬＣ−ＭＳ ＥＳＩ／イオントラップ）：（ＩＤ８）Ｃ55Ｈ96Ｎ18Ｏ13（Ｘ1＝Ｆ）の計算値は（Ｍ）１２１６であり、実測値は１２１７（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ９）Ｃ53Ｈ101Ｎ18Ｏ13（Ｘ1＝Ｉ）の計算値は（Ｍ）１１９７であり、実測値は１１９８（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ１０）Ｃ52Ｈ98Ｎ18Ｏ13（Ｘ1＝Ｌ）の計算値は（Ｍ）１１８２であり、実測値は１１８３（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ１１）Ｃ51Ｈ96Ｎ18Ｏ13（Ｘ1＝Ｖ）の計算値は（Ｍ）１１６８であり、実測値は１１６９（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ１２）Ｃ57Ｈ97Ｎ19Ｏ13（Ｘ1＝Ｗ）の計算値は（Ｍ）１２５５であり、実測値は１２５６（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ１３）Ｃ55Ｈ96Ｎ18Ｏ14（Ｘ1＝Ｙ）の計算値は（Ｍ）１２３２であり、実測値は１２３３（Ｍ＋Ｈ）である。
【００５６】
実施例ＩＩＩ
直鎖酸ペプチド合成：ＩＤ１、ＩＤ６及びＩＤ１４
酸ペプチド合成を前記のとおり実施した。合成後、粗ペプチドをＨＰＬＣ−ＵＶによって勾配Ｂ（２０分で５→９５％）により精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって特性化した。質量値（Ｍ＋Ｈ）は次のとおりであった：（ＩＤ１）計算値は（Ｍ）１１９７であり、実測値は１１９８（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ６）計算値は（Ｍ）１２５５であり、実測値は１２５６（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ１４）計算値は（Ｍ）１３８３であり、実測値は１３８４（Ｍ＋Ｈ）である。
【００５７】
実施例ＩＶ
Ｎ−アシル化直鎖アミドペプチド合成：ＩＤ１５、ＩＤ１６及びＩＤ１７
アミドペプチド合成は、ペプチド合成の項で前述したようにリンクアミド樹脂上で実施した。合成後、実施例Ｉで記載されているように、粗ペプチドをＨＰＬＣ−ＵＶによって精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって特性化した。質量値（Ｍ＋Ｈ）は以下のとおりであった：（ＩＤ１５）計算値は（Ｍ）１３９５であり、実測値は１３９７（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ１６）計算値は（Ｍ）１３９５であり、実測値は１３９７（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ１７）計算値は（Ｍ）１３３７）であり、実測値は１３３９（Ｍ＋Ｈ）である。
【００５８】
実施例Ｖ
二量体ペプチド合成：ＩＤ１８、ＩＤ１９及びＩＤ２０
前記のようにしてペプチド合成を実施した。合成後、実施例Ｉで記載されているように、粗ペプチドをＨＰＬＣ−ＵＶによって精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって特性化した。質量値（Ｍ＋Ｈ）は以下のとおりであった：（ＩＤ１８）計算値は（Ｍ）２６９４であり、実測値は２６９６（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ１９）計算値は（Ｍ）２８０７）であり、実測値は２８０８（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ２０）計算値は（Ｍ）２６９１であり、実測値は２６９２（Ｍ＋Ｈ）である。
【００５９】
実施例ＶＩ
二量体脂質化ペプチド合成：ＩＤ２１、ＩＤ２２、ＩＤ２３及びＩＤ２４
前記のようにしてペプチド合成を実施した。合成後、実施例Ｉで記載されているように、粗ペプチドをＨＰＬＣ−ＵＶによって精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって特性化した。質量値（Ｍ＋Ｈ）は以下のとおりであった：（ＩＤ２１）計算値は（Ｍ）２８９１であり、実測値は２８９２（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ２２）計算値は（Ｍ）２８９１であり、実測値は２８９３（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ２３）計算値は（Ｍ）２８５９であり、実測値は２８６２（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ２４）計算値は（Ｍ）２７６３であり、実測値は２７６４（Ｍ＋Ｈ）である。
【００６０】
実施例ＶＩＩ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性分析
ＨｅＬａ（ヒト上皮癌細胞系）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝細胞肝癌由来細胞系）及びＨａＣａｔ（ヒトケラチノサイト）をコンフルエンスまで成長させ、次いで２０，０００、１２，５００及び３０，０００細胞／ウェルで播種した（各細胞系について最適の細胞数をあらかじめ決めた）。２４時間後、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ中ＩＤ２４を８００〜１００ｕｇ／ｍｌの範囲の濃度で添加した。正の対照として、１００％の生存率を表す無血清培地で洗浄した１００ｕＬの細胞及び、負の対照として、１００ｕＬの無血清培地も添加した。
【００６１】
５％ｖ／ｖＣＯ2雰囲気中３７℃で２４時間インキュベーションした後、１０ｕｌのＭＴＴ試薬［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラソジウムブロミド、最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、２〜４時間インキュベーションした。ＭＴＴの代謝還元によって形成されたホルマザンの可溶化は、ストップミックス溶液（１０％ｗ／ｖドデシル硫酸ナトリウム、４５％ｖ／ｖジメチルホルムアミド、氷酢酸でｐＨ４．５に調節）を用いて得られた。プレートをマイクロプレート分光光度計（Ｂｉｏｒａｄ， Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ ｐｌｕｓ）で読み取った。ＩＤ２４に暴露された、又は培地単独に暴露された培養物を、分光光度計によって二波長（５６５〜６５０ｎｍ）で測定した。実験は３連で実施した。
【００６２】
実施例ＶＩＩＩ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ溶血
２つの異なる分析によって溶血を測定した。このうち１つは、新鮮なヒト赤血球のみを用いることによって、Ｓｈｉｎらの方法を適応させた（参考文献１２）。もう１つでは、ＩＤ２４溶液を全血中でインキュベーションした。
【００６３】
第１の方法
溶血分析をＳｈｉｎらの方法から適応させた（参考文献１２）。新鮮なヒト赤血球を使用して、ペプチドの溶血活性を試験した。４％ｗ／ｖクエン酸ナトリウム溶液を含む滅菌管中に全血を集め（１：１０のクエン酸ナトリウム：全血の比）、氷中に入れ、４℃にて５分間１０００ｇで遠心分離した。
【００６４】
赤血球ペレット上の白血球を含む上清を慎重に除去し、廃棄した。無傷赤血球を２容積（１ｍＬ）のあらかじめ冷却した無ピロゲン塩水（ＰＢＳ（１×））で３回洗浄した。赤血球懸濁液を調節して、０．８％（１ｍＬ中８ｕｌ又は２０ｍＬ中１６０ｕＬ）のＰＢＳ（１×）にした。
【００６５】
溶血分析のために、ＩＤ２４の連続２倍希釈液をＰＢＳ（１×）中で製造し、１００ｕＬアリコートを、滅菌９６穴マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）中の等体積の０．８％赤血球懸濁液（ＰＢＳ（１×）中）に３連で添加した。プレートを３７℃で２時間インキュベーションした。
【００６６】
続いて、無傷赤血球を１０００ｇで５分間４℃にて遠心分離することによりペレット化した。各ウェルからの上清１００マイクロリットルを適宜新しい９６穴マイクロタイタープレートに移し、４９０ｎｍの参考波長に対して４１４ｎｍでの吸光度を読み取ることによって、上清中に放出されたヘモグロビンの量を測定した。ＰＢＳ（１×）中１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００中に溶解させた０．４％赤血球１００ｕＬを含む正の対照（２００ｕＬのＰＢＳ（１×）中赤血球懸濁液０．８％及び２００ｕＬのＰＢＳ（１×）と２％（４ｕＬ）ＴｒｉｔｏｎＸ１００）を１００％溶解とみなした。負の対照は、最小の溶解をもたらすＰＢＳ（１×）単独中の赤血球であった。これを０％の溶血と見なした。
【００６７】
第２の方法
全血を、４％ｗ／ｖのクエン酸ナトリウム溶液を含む滅菌管中に集め（１：１０のクエン酸ナトリウム：全血比で）、氷中で保存した。ＩＤ２４の連続希釈（１ｍｇ／ｍＬから６２．５ｕｇ／ｍＬ）を１：１又は１：１０の比で全血に添加した。溶血可能性をサポニンに対して表し、同じ割合で添加し、１００％溶血と見なした。負の対照は、最小溶解をもたらす生理溶液中の全血であった。各懸濁液の１００ｕＬアリコートを滅菌９６穴マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）中に３連で添加した。プレートを３７℃で３０分間インキュベーションした。
【００６８】
続いて、１０００ｇで１０分間４℃にて遠心分離することによって、懸濁液をペレット化した。１００マイクロリットルの各ウェルからの上清を適宜新しい９６穴マイクロタイタープレートに移し、５６０ｎｍでの吸光度を読み取ることによって、上清中に放出されたヘモグロビンの量を測定した。
【００６９】
実施例ＩＸ
マウス敗血症モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ有効性
ＩＤ２４を、７．５×１０2ＣＦＵの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＣ４７（最終体積０．５ｍＬ）で腹腔内感染させたマウスに静脈内投与した。特に、ＩＤ２４を感染後１５分及び６時間に３ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。コリスチンメタンスルホン酸ナトリウム（ＣＭＳ）を感染後１５分に単回注射として３ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。
【００７０】
動物
実験当日に体重２５グラムのメスＩＣＲマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｉｔａｌｙ、イタリア国サン・ピエトロ・アル・ナティゾーネ）を使用した。実験開始前にマウスを恒温恒湿室内で少なくとも５日間飼育し、標準的実験室用飼料及び水を自由に与えた。
【００７１】
試験化合物及び参考化合物
試験化合物及び参考化合物であるＩＤ２４及びコリスチンメタンスルホン酸ナトリウム（ＣＭＳ）をそれぞれ０．１Ｍのリン酸塩緩衝塩溶液ｐＨ６．９中に必要とされる薬剤濃度で溶解させた。溶液を投与直前に作製し、計画された処置の最後まで４℃で保存した。大腸菌ＥＣ４７株に関するＩＤ２４ＭＩＣ値は２ｕｇ／ｍＬである［ＭＩＣは、Ｍｕｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ培地中微量液体希釈法（ＮＣＣＬＳガイドライン）により、約１０5ＣＦＵ／ｍＬの細菌接種物を用いて測定した］。
【００７２】
感染懸濁液の製造
大腸菌ＥＣ４７株の凍結バイアルを使用して、５０ｍＬのＤｉｆｃｏブレインハートインフュージョンブロスに接種し、培養物をロータリーシェーカー水浴（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国ニュージャージー州）上で２０時間３５℃にてインキュベーションし、次いで５％のＤｉｆｃｏ細菌ムチン中で１：１，０００，０００に希釈した。実際の接種物のサイズは、懸濁液の１０倍溶液の２つの０．０２５ｍＬアリコートをＤｉｆｃｏ Ｔｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ寒天プレート上に播種することによって決定した。
【００７３】
動物を７．５×１０2ＣＦＵの大腸菌ＥＣ４７（最終体積０．５ｍＬ）で腹腔内感染させた。この接種物は、未処置動物の１００％を感染の７２時間以内に死亡させるのに十分であった。
【００７４】
抗生物質処置
ＩＤ２４を３ｍｇ／ｋｇの用量で、感染後１５分及び６時間に投与した。総用量は６ｍｇ／ｋｇである。コリスチンメタンスルホン酸ナトリウム（ＣＭＳ）を１回量で、すなわち単回注射において３ｍｇ／ｋｇで感染後１５分に投与した。
【００７５】
処置は静脈内経路により行い（０．２５ｍＬ／マウス）、８匹の動物を各用量の各抗生物質で処置した。細菌接種後７日間、毎日１回死亡率を記録した。
【００７６】
実施例Ｘ
バイオフィルム根絶の実験手順
約１×１０7ＣＦＵ／ｍＬの緑膿菌ＡＴＣＣ２７８５３の対数期接種物をＭＢＥＣ ＴＭハイスループット分析用Ｉｎｎｏｖｏｔｅｃｈプレートの試薬容器（Ｉｎｎｏｖｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、カナダ国エドモントン）中に注いだ。２２ｍＬの接種物をトラフに添加し、ペグ付蓋を被せた。装置を３７℃の加湿ボックス中、８０ｒｐｍのシェーキングインキュベータ上に置いた。
【００７７】
２４時間のインキュベーション後、ペグを、２００ｕＬの生理溶液を含むプレート中にすすいで、軽く付着した浮遊細胞をバイオフィルムから除去し、次いでＴＳＢ中で連続希釈した２００ｕＬの異なる抗生物質溶液を含むマイクロプレート中に入れた。
【００７８】
シェーキングインキュベータ上３７℃で４時間接触及びインキュベーションした後、ペグ付蓋をトラフから取り出し、リンスプレート中に２分間浸漬した。
【００７９】
次いで、試料ペグを含む塩溶液を含む新しいマイクロタイターを、超音波洗浄器のトレイ中に入れ、そして３０分間音波処理して、９６ペグの表面からバイオフィルムを分離させた。
【００８０】
各ウェルの１０倍連続希釈の二重アリコート（０．０１又は０．００５ｍＬ）をＭＨＡプレート上に塗布し、２４時間のインキュベーション後、生存細胞計数のためコロニーを読み取った。
【００８１】
実施例ＸＩ
ｉｎ ｖｉｖｏ急性毒性
動物
９〜１０週令メスＣＤ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂ． Ｉｔａｌｉａ ｓ．ｒ．ｌ． Ｖｉａ Ｉｎｄｉｐｅｎｄｅｎｚａ， １１−２３８８５ Ｃａｌｃｏ（ＬＣ），Ｉｔａｌｙ）（実験当日の平均体重２８．２３ｇ）を使用した。マウスを実験開始前に恒温恒湿室内で３日間飼育し、標準的実験室用飼料及び水を自由に与えた。
【００８２】
試験化合物
ＩＤ２４を、用量濃度２０及び４０ｍｇ／ｋｇでヒトに投与するため０．９％ｗ／ｖのＮａＣｌ滅菌溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中に溶解し、音波処理した。化合物製造は、投与直前に実施した。
【００８３】
抗生物質の投与
２種の用量（２０ｍｇ／ｋｇ及び４０ｍｇ／ｋｇ）のＩＤ２４を単回腹腔内注射とともにマウスに投与した。５匹の動物を各用量の抗生物質で処置した。注射後７日間、有害症状を毎日モニタリングした。
【００８４】
結果の評価
生存及び臨床／行動的兆候を１４日間毎日記録した。
【００８５】
観察されるパラメータ
Ｉｒｗｉｎ試験によって得られた主な行動的パラメータ及び臨床的兆候（参考文献１３）。
【００８６】
単回量注射後に全群を観察することによって、以下の症状及び行動の変化を強調することができる：
２０ｍｇ／ｋｇ：行動の変化なし；
４０ｍｇ／ｋｇ：行動の変化なし。
【００８７】
ＩＤ２４のＩＰ投与後、有害症状、行動変化及び死亡は記録されず、４０ｍｇ／ｋｇの最高用量でも記録されなかった。
【００８８】
結果
ミニライブラリ構築及びＭＩＣの測定
ＷＯ２００６／００６１９５に記載されている直鎖デカペプチド配列番号１を、グラム陰性菌に対する活性の点で最適化した。このペプチドは、リシンコア上に四量体構造として存在する場合に活性であった。モノマー形態で、ペプチドはごくわずかな活性しか有していなかった。最適化法は、第１表に概略が記載されているような配列スキャニングによって得られる９のペプチドミニライブラリの合成から構成されていた。
【００８９】
第１表 ９のデカペプチド位置スキャニングライブラリ
【表１】
*：Ｘnは：ｎ＝１ならば、Ｏ＝Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｗ、Ｙ；ｎ＝２ならば、Ｏ＝Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、Ｑ；ｎ＝３ならば、Ｏ＝Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅを含む６のアミノ酸の群に対応する。
【００９０】
全ての天然のアミノ酸は、その化学物理的特性に基づいて３群に分割される。合計２７のミニライブラリ（それぞれは等モル量で６つのペプチドを含む）を得、参考株としての大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２に対して分析した。ＭＩＣで表した活性値を第２表に記載する。ＭＩＣ（最小阻止濃度）は、視認可能な成長を１００％阻害する最低濃度として定義される。
【００９１】
第２表 ９のデカペプチド位置スキャニングミニライブラリ：活性又は大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２に対する結果として得られる２７のペプチドミニライブラリ
【表２】
ａ：不活性な本来の１０ｍｅｒ配列。
【００９２】
６２．５ｕｇ／ｍＬのＭＩＣを有する４つのミニライブラリは、配列番号１よりも活性が高いと見なされた。これらのペプチドを個々に合成し、各配列の活性を分析した。最も活性の高いミニライブラリ（２−Ｘ1、２−Ｘ2、３−Ｘ1及び８−Ｘ1）を開き、抗菌活性に対する各配列位置での各残基の寄与を評価した。さらに、Ｌｙｓ−β−Ａｌａ又はＬｙｓ−８−Ａｏａ（８−アミノオクタン酸）上でのＮ−及びＣ−アシル化ならびに二量化などの修飾も、ミニライブラリから単離されたさらに活性の高い配列に関して実施した。第３表では、グラム陰性株大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２、緑膿菌ＡＴＣＣ２７８５３及び肺炎桿菌ＡＴＣＣ１００３１ならびにグラム陽性株黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２５９２３に対して試験した、ミニライブラリ２−Ｘ1 ｅ ３−Ｘ1に属するペプチドを記載する。２−Ｘ2及び８−Ｘ1という名称の他の２つの最も活性の高いミニライブラリも開いたが、個々に試験した各ペプチドは＞１２８ｕｇ／ｍＬの活性を有していた（データは割愛）。
【００９３】
第３表 ミニライブラリペプチドを個々に合成した：グラム陰性及びグラム陽性菌に対するＭＩＣ（ｕｇ／ｍＬ）を記載する。
【００９４】
【表３】
【００９５】
ピログルタミン酸又はジペプチドＧｌｙ−Ｇｌｎの導入は、ペプチドの活性に影響を及ぼすことなく位置Ａ1で実施することができる（データは割愛）。これらの修飾は、ピログルタメート形成でＮ末端グルタミンが環化するのを防止する。
【００９６】
２−Ｘ1−Ｗ及び３−Ｘ1−Ｗという名称の２つのミニライブラリから単離された２つの選択されたペプチド（配列番号６及び１４）を二量体形態（配列番号１８及び１９）で合成し、それらの直鎖カウンターパートについての多価性に関連する増大した活性を証明した。ペプチド配列番号１４は、Ｇｌｎの環化を回避するためにＮ末端にＧｌｙが導入されている選択されたペプチド配列番号１２の誘導体である。さらに、直鎖及び二量体ペプチドの両方のＮ末端（ＩＤ１６、１６、１７、２１、２２及び２３）並びにＣ末端（配列番号２４）での５−アミノ吉草酸（５−Ａｖａ）及び８−アミノオクタン酸（８−Ａｏａ）での脂質化などの修飾を実施し、結果として得られた生成物を試験した。
【００９７】
第４表において、直鎖及び二量体ペプチドならびにそれらの脂肪誘導体のＭＩＣ値を記載する。
【００９８】
第４表 直鎖及び二量体ペプチドならびにそれらの脂肪誘導体のＭＩＣ値。
【００９９】
【表４】
ＮＤ：測定せず。
【０１００】
２つの化合物ＩＤ１８及びＩＤ２４は活性が最も高かった。これらの化合物をグラム陰性臨床分離株の大パネルに対して試験し、相対的ＭＩＣ値を第５表に記載した（パート１〜３）。
【０１０１】
第５表 ＩＤ２４及びＩＤ１８対いくつかのグラム陰性菌臨床分離株のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性（パート１）
【表５】
【０１０２】
第５表 ＩＤ２４及びＩＤ１８対いくつかのグラム陰性菌臨床分離株のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性（パート２）
【表６】
【０１０３】
第５表 ＩＤ２４及びＩＤ１８対いくつかのグラム陰性菌臨床分離株のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性（パート３）
【表７】
【０１０４】
細胞毒性及び溶血ｉｎ ｖｉｔｒｏ効果
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性
ｉｎ ｖｉｔｒｏＩＤ２４細胞毒性を３つの細胞系に関して、ＭＴＴ色素還元分析を用いて試験した。ＩＤ２４についてのＣＣ50値を第６表にまとめる。
【０１０５】
第６表 ＩＤ２４のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性
【表８】
【０１０６】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ溶血
溶血を実施例ＶＩＩＩで記載されているように、２つの異なる分析によって測定した。第７表〜第９表に、全ての溶血率（％）値（ＵＶ−ＶＩＳ分光光度法によって測定）を記載する。第７表では、特に、異なる濃度で、赤血球懸濁液と１：１の割合のＩＤ２４の溶血率（％）を記載する。溶血率（％）は、４１４ｎｍでの吸光度を読み取ることにより、上清中に放出されるヘモグロビンの量を測定するＵＶ−ＶＩＳ分光光度法によって測定した（参考波長４９０ｎｍ）。これらの結果は、Ｓｈｉｎのプロトコル（参考文献１２）に準拠した実施例ＶＩＩＩの第１の方法を参照する。
【０１０７】
第７表 赤血球懸濁液中様々な濃度でのＩＤ２４の溶血率（％）
【表９】
*：ブランク（生理溶液）を差し引いた吸光度値。３回の測定を各処置について実施した。
【０１０８】
第８表には、全血と１：１比の異なる量のＩＤ２４の溶血率（％）を記載し、一方、第９表には、全血と１：１０比の異なる量のＩＤ２４の溶血率（％）を記載する。上清中に放出されたヘモグロビンの量は、５６０ｎｍでの吸光度を読み取ることによって測定した。これらの結果は、実施例ＶＩＩＩの第２の方法を参照する。
【０１０９】
第８表 全血と１：１比のＩＤ２４の溶血率（％）
【表１０】
*：ブランク（生理溶液）を差し引いた吸光度値。３回の測定を各処置に関して実施した。
【０１１０】
第９表 全血と１：１０比のＩＤ２４の溶血率（％）。
【０１１１】
【表１１】
*：ブランク（生理溶液）を差し引いた吸光度値。３回の測定を各処置に関して実施した。
【０１１２】
マウス敗血症モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ有効性
ＩＤ２４を、７．５×１０2ＣＦＵの大腸菌ＥＣ４７で腹腔内感染させたマウスに静脈内投与した。特に、ＩＤ２４を感染後１５分及び６時間に１回量で投与した。結果を図１に示し、この図は、ＩＤ２４を感染後１５分及び６時間に３ｍｇ／ｋｇの用量で２回投与し、一方、コリスチンメタンスルホン酸ナトリウム（ＣＭＳ）を感染後１５分に３ｍｇ／ｋｇの用量で１回投与した場合の、カプラン・マイヤー生存曲線を示す。対照群に含まれるマウスは第３日までに全て死亡した。各群は８匹のマウスで構成されていた。
【０１１３】
ＩＤ２４は、大腸菌の臨床分離株（ＥＣ４７）によって引き起こされる感染症からマウスを保護することが証明された。
【０１１４】
抗バイオフィルム活性
異なる濃度のＩＤ２４（ＭＩＣ値の１／４、１／２、１、２及び４倍）に暴露すると、細菌バイオフィルムが実質的に減少し、実施した２つの実験において、８８．７％〜９９．９％の範囲の阻害率（％）（０．９５から３．０５ｌｏｇ１０の減少）が、未処理の対照と比較して試験した全ての濃度で観察された。抑制濃度以下で、０．９から２．３５ｌｏｇ１０の減少が、ＭＩＣ値のそれぞれ１／４及び１／４倍で観察された。
【０１１５】
他の方法では、コリスチンはＩＤ２４よりも活性が低くなり、試験した全濃度について、バイオフィルム減少は８８．３％〜９７．１％（０．８８から１．５５ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬの減少）であった。結果を図２ａ及び２ｂに示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特にグラム陽性及びグラム陰性菌に対する抗菌活性を有するモノマー及びマルチマーペプチド化合物に関する。さらに、本発明は、医学的用途に用いられる、殺菌剤及び／又は洗剤として使用される、あるいは保存料として使用される、前記ペプチド化合物を含む組成物に関する。
【０００２】
多剤耐性微生物の発生の増加は、新規抗菌剤の開発において新たな関心を生む。耐性を回避し得る新規部位を標的とする最新薬を製造する流れは、細菌感染の長期制御に重要である（参考文献１）。
【０００３】
医薬産業は、以前は、既存の抗生物質を修飾し、最新の抗生物質をタイミングよく開発することによって、このニーズに対応してきた。これらの試みの成功によって、様々な現在入手可能な薬物クラスの抗生物質、すなわちベータラクタム（ペニシリン、カルバペネム、セファロスポリン）、糖ペプチド、マクロライド、ケトライド、アミノグリコシド、フルオロキノロン、オキサゾリジノンなどが産生されてきた（参考文献２）。しかし、最近、ほとんど又は全ての既知クラスの抗生物質に対して耐性である微生物が検出された。したがって、新規抗生物質化合物に対する必要性が増大している。
【０００４】
抗菌性ペプチドは、有望な種類の抗感染症薬である、非特異的免疫系の成分である。それらの作用機序は十分には理解されていないが、細胞膜や細胞分裂及び高分子合成の過程をはじめとする多数の標的を有すると考えられている（参考文献３）。
【０００５】
ペプチド抗生物質の総説がＲ．Ｅ．Ｗ．Ｈａｎｃｏｃｋにより発表されている（参考文献４）。この総説の主な焦点は、従来の抗生物質と比較した場合のカチオン性抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）の利点及び欠点であり、これらのペプチドを用いた最近の臨床開発をまとめている。これらは短鎖（１０〜５０アミノ酸）であり、全体的な正電荷（一般的に＋２〜＋９）及び実質的な割合（≧３０％又はそれ以上）の疎水性残基を有すると定義することができる。これらの特性により、ペプチドは、しばしば膜と接触すると三次元で両親媒性構造に折りたたまれ、かくして正に荷電した疎水性アミノ酸を多く含む独立したパッチを形成する。
【０００６】
ＡＭＰは、細菌、真菌、エンベロープを持ったウイルス、寄生生物及びさらには腫瘍細胞など様々な標的に対してｉｎ ｖｉｔｒｏで広範囲の殺活性を示す（参考文献５及び６）。
【０００７】
ここ１５年以内に、ほぼ９００のＡＭＰが種間で同定され、今や自然免疫系の必須成分として認識されている（参考文献７）。マゲイニン、たとえばマゲイニン２及びＰＧＬａは、最もよく研究されているＡＭＰに含まれる。これらは、最初にアフリカツメガエルの皮膚から単離された直鎖ペプチドである。マゲイニンは、２つの重要な活性、すなわち広い抗菌スペクトルと抗エンドトキシン活性とを有するαへリックスイオノフォアである（参考文献８）。
【０００８】
哺乳動物における大きなＡＭＰファミリーは、カテリシジンによって代表される。これらは、アミノ末端カテプシンＬ阻害物質ドメインを有するＡＭＰ（カテリン）である。唯一のヒトカテリシジンｈ−ＣＡＰ１８のＣ末端３７アミノ酸ドメインであるＬＬ−３７は、広い抗菌活性を発揮する両親媒性らせん状ペプチドである（参考文献９）。
【０００９】
さまざまな合成ペプチドがｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏとで分析されている。たとえば、米国特許出願第６０／６５１，２７０号は、様々な病原体に対して活性な抗菌性ヘキサペプチド及びそれらの脂肪誘導体を開示する。これらのペプチドは、動物における真菌性及び細菌性疾患の治療において特に有効であり、多剤耐性菌に対するポリミキシンＢなど従来の抗生物質の殺菌活性を促進する可能性を示す。
【００１０】
ＷＯ２００６／００６１９５は、抗菌性ペプチド、とりわけ、配列ＱＫＫＩＲＶＲＬＳＡ（配列番号１）を有するペプチドを開示している。これらのペプチドは抗菌活性を示すが、これらは非常に不安定であるため実用化できない。実際、Ｎ末端Ｇｌｎはピログルタミン誘導体を提供し、その含有量は生成物の保存中に増大する。
【００１１】
本発明は、感染性疾患を治療及び／又は予防するために新規抗菌性ペプチド化合物を使用及び製造するための方法を提供する。
【００１２】
これらの新規ペプチド化合物は、配列スキャニング法及び直鎖デカペプチドに関する伸長ステップにより同定された。Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ化学反応によって固相で実施されるペプチド合成によって、ＷＯ２００６／００６１９５に開示される本来の配列（配列番号１）と比較した場合に増大した抗菌活性を有するペプチドのライブラリを単離することができた。
【００１３】
本発明の主題は、一般式（Ｉａ）：
Ｚ−［Ｋ］n−Ｋ−Ｉ−Ｒ−Ｖ−Ｒ（配列番号２５）
（式中、Ｋは、リシン側鎖、特にＬ−若しくはＤ−リシンを有するアミノ酸残基、又は正に荷電した側鎖を有する別のアミノ酸残基であり、
Ｉは、イソロイシン側鎖、特にＬ−若しくはＤ−イソロイシンを有するアミノ酸残基であり、
Ｒは、アルギニン側鎖又はＮ−アルキル置換グアニジン側鎖、特にＬ−若しくはＤ−アルギニンを有するアミノ酸残基であり、
Ｖは、バリン側鎖、特にＬ−若しくはＤ−バリンを有するアミノ酸残基であり、
ここで、アミノ酸残基Ｋ、Ｉ、Ｒ及びＶのうち１つは、アラニン側鎖、特にＬ−若しくはＤ−アラニンを有するアミノ酸残基で置換されていてもよく、
Ｚは、少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、
（ｉ）芳香族アミノ酸残基又は少なくとも１つの芳香族アミノ酸残基を含むジ−、トリ−若しくはテトラペプチジル基（芳香族アミノ酸残基は、特にトリプトファン、Ｎ−メチルトリプトファン、フェニルアラニン、β−フェニルアラニン、ナフチルアラニン、β−ナフチルアラニン、β−ジフェニルアラニン、β−（４，４’−ビフェニル）アラニン、β−アントラセン−９−イルアラニン及びβ−インドール−３−イルアラニン、又はそれらの置換誘導体から選択される）
（ｉｉ）脂肪族アミノ酸残基又は少なくとも１つの脂肪族アミノ酸残基を含むジ−、トリ−、テトラペプチジル基（脂肪族残基は、特に脂肪族、好ましくは少なくとも３個のＣ原子を有する分岐脂肪族側鎖を含むα−アミノ酸残基から選択される）
（ｉｉｉ）ピログルタミン酸（ｐｙｒＥ）残基又はＮ末端ピログルタミン酸残基を含むジ−、トリ−若しくはテトラペプチジル基、
（ｉｖ）残基Ｑ*又はＮ末端Ｑ*残基を含むジ−、トリ−若しくはテトラペプチジル基（Ｑ*は、グルタミン側鎖を有する保護アミノ酸残基、特に保護Ｌ−グルタミン残基である）、並びに
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つの組み合わせ、たとえば（ｉ）及び（ｉｉｉ）、（ｉ）及び（ｉｖ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）及び（ｉｉ）又は（ｉｖ）
から選択されるペプチド化合物のＮ末端基であり、
ｎは０又は１である）によって表されるアミノ酸配列を含む３５アミノ酸残基までの長さを有するペプチド化合物である。
【００１４】
好適な実施形態において、本発明は、一般式（Ｉｂ）：
Ｚ−［Ｋ］n−Ｋ−Ｉ−Ｒ−Ｖ−Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ａ（配列番号２６）
（式中、Ｋ、Ｉ、Ｒ、Ｖ、Ｚ及びｎは前記定義のとおりであり、
Ａは、アラニン側鎖、特にＬ−アラニンを有するアミノ酸残基であり、
Ｓは、セリン側鎖、特にＬ−セリンを有するアミノ酸残基であり、
Ｌは、ロイシン側鎖、特にＬ−ロイシンを有するアミノ酸残基であり、
アミノ酸残基Ｋ、Ｉ、Ｒ、Ｌ、Ｖ及びＳのうち１つはアラニン側鎖を有するアミノ酸残基で置換されていてもよい）によって表されるアミノ酸配列を含む３５アミノ酸残基までの長さを有するペプチド化合物に関する。
【００１５】
さらなる実施形態において、本発明は、前記定義の複数のペプチド化合物を含むマルチマー化合物に関し、この場合、個々のペプチド化合物は、たとえば多官能性、たとえば二又は三官能性アミノ酸などの二又は三官能性部分によって共有結合している。
【００１６】
本発明は、ペプチド化合物に関する。「ペプチド化合物」という用語は共有結合により、好ましくはカルボキサミド結合により結合したアミノ酸構成単位又はその類似体を少なくとも部分的に含む化合物を包含する。構成単位は、好ましくはアミノカルボン酸、たとえばα−アミノカルボン酸又は他の種類のカルボン酸、たとえばβ−又はさらにはω−アミノカルボン酸から選択される。アミノ酸構成単位は、遺伝的にコードされたＬ−α−アミノカルボン酸及び／又はそれらのＤ−エナンチオマー及び／又は天然に存在しないアミノ酸構成単位から選択することができる。ペプチド化合物の個々の構成単位は、共有結合、たとえばカルボキサミド、カーバメート、エステル及びチオエステル結合によって結合する。本発明のペプチド化合物は、直鎖又は環状であってよい。モノマーペプチド化合物は、３５アミノ酸残基までの長さ、好ましくは少なくとも８、さらに好ましくは少なくとも１０及び１５アミノ酸構成単位までの長さを有する。
【００１７】
一実施形態において、本発明のペプチド化合物は、芳香族アミノ酸残基、好ましくは少なくとも１つの単環式若しくは多環式芳香族環、好ましくは少なくとも１つの二環式若しくは三環式芳香族環、たとえばフェニル、ナフチル、アントラセニル、ジフェニル、インドリルなどを含むα−アミノ酸残基、又は前記のような少なくとも１つの芳香族アミノ酸構成単位を含むジ−、トリ−若しくはテトラ−ペプチジル基を含むＮ末端基Ｚを含む。
【００１８】
芳香族アミノ酸残基の具体例は、トリプトファン、Ｎ−メチルトリプトファン、フェニルアラニン、β−フェニルアラニン、ナフチルアラニン、β−ナフチルアラニン、β−ジフェニルアラニン、β−（４−４’−ビフェニル）アラニン、β−アントラセン−９−イルアラニン及びβ−インドール−３−イルアラニン、又はそれらの置換誘導体、たとえばそれらの一若しくは多アルキル置換誘導体である。さらに好ましくは、芳香族アミノ酸残基は、トリプトファン側鎖（Ｗ）、たとえばＬ（又はＤ）−トリプトファンを含む。
【００１９】
さらなる実施形態において、本発明のペプチド化合物は、脂肪族アミノ酸残基、好ましくは脂肪族、さらに好ましくは少なくとも３個のＣ原子、たとえば３、４、５、６若しくは７個のＣ原子を有する分岐脂肪族側鎖を含むα−アミノ酸残基又は少なくとも１つの前記定義の脂肪族アミノ酸構成単位を含むジ−、トリ−若しくはテトラ−ペプチジル基を含むＮ末端基Ｚを含む。脂肪族アミノ酸残基の具体例は、分岐アルキル、たとえば２−アミノペンタン酸、２−アミノヘキサン酸若しくは２−アミノヘプタン酸のメチル誘導体又はそれらのＬ−若しくはＤ−エナンチオマー形である。さらに好ましくは、脂肪族アミノ酸残基は、ロイシン側鎖（Ｌ）、たとえばＬ−ロイシンを含む。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態において、ペプチド化合物は、ピログルタミン酸（ｐｙｒＥ）残基又はＮ末端ピログルタミン酸残基を含むジ−、トリ−若しくはテトラ−ペプチジル基であるＮ末端基を含む。
【００２１】
本発明のさらに別の実施形態において、ペプチド化合物は、Ｑ*残基であるＮ末端基を含み、この場合、Ｑ*はグルタミン側鎖を有する保護アミノ酸残基、特に保護Ｌ−グルタミン、又はその誘導体のＮ末端Ｑ*残基を含むジ−、トリ−、若しくはテトラ−ペプチジル基である。Ｑ*残基の好適な例は、ジペプチジル残基Ｘ−Ｑであり、ここでＸはＱとは異なるアミノ酸残基、たとえばＧ（グリシン）又はＮ末端アミノ酸及び／又はカルボキシル側鎖基が、たとえばアセチル基などのアシル、アミノ基によって保護されたＱ残基である。
【００２２】
さらなる実施形態において、本発明のペプチド化合物は、芳香族アミノ酸残基とＮ末端ピログルタミン酸残基との組み合わせ又は芳香族アミノ酸残基とＮ末端Ｑ*残基との組み合わせを含む。
【００２３】
特に好適な実施形態において、ペプチド化合物のＮ末端基Ｚは、Ａｒ、Ａｒ−Ｑ、Ｇ−Ｑ若しくはアセチル−ＱなどのＱ*、Ｇ−Ｑ−Ａｒ若しくはアセチル−Ｑ−ＡｒなどのＱ*−Ａｒ、ｐｙｒＥ及びｐｙｒＥ−Ａｒ（ここで、Ａｒは前記定義の芳香族アミノ酸残基である）から選択される。
【００２４】
本発明のペプチド化合物の具体例は：
ＷＫＫＩＲＶＲＬＳＡ（配列番号６）
ｐｙｒＥＷＫＩＲＶＲＬＳＡ（配列番号２７）
ＧＱＷＫＩＲＶＲＬＳＡ（配列番号１４）
アセチル−ＱＷＫＩＲＶＲＬＳＡ（配列番号１２）
Ａｏａ−ＱＷＫＩＲＶＲＬＳＡ（配列番号１６）
（ＧＱＷＫＩＲＶＲＬＳＡ）2Ｋ−β−Ａｌａ（配列番号１９）
（式中、ｐｒｙＥはピログルタミン酸残基であり、Ａｏａは８−アミノオクタン酸残基であり、β−Ａｌａはβ−アラニン残基であり、前記ペプチドはそれらのＣ末端で場合によってアミド化されている））から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２５】
好適な実施形態において、本発明は、前記の複数のペプチド化合物を含むマルチマー化合物に関する。たとえば、本発明のマルチマー化合物は、２、３、４、５、６、７、８又はそれ以上のペプチド化合物を含み得る。マルチマー化合物は、マトリックス、たとえばポリペプチド、単糖、オリゴ糖若しくは多糖又は有機ポリマー、好ましくは直鎖有機ポリマーに基づくマトリックス上でマルチマー化されたペプチド化合物を含み得る。たとえば、マトリックスは、ポリ（Ｎ−アルキル（メタ）アクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキル（メタ）アクリルアミド）、ポリメラミン、デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール及び／又はポリビニルピロリドンから選択することができる。ペプチド化合物のマトリックスとのカップリングは、ペプチド化合物のＮ末端及び／又はＣ末端により、好ましくはマトリックス上の反応性基、たとえばヒドロキシ基、アミノ基、チオール基、又はカルボキシル基とのカップリングを可能にするホモ−及び／又はヘテロ−二官能性リンカーを用いて行われる。
【００２６】
さらなる好適な実施形態において、マルチマー化合物は分岐した、特にデンドリマー構造を有する。
【００２７】
さらに別の実施形態において、マルチマー化合物は：
（ｉ）Ｒ−（Ｙ1−Ｒ）m−Ｙ1−（Ｒ）m’（ＩＩａ）
（式中、Ｒは請求項１〜６のいずれか１項で定義されたペプチド化合物であり、Ｙ1は共有結合又は二官能性リンカー、たとえばプロピレングリコールなどのジアルコール、コハク酸などのジカルボン酸、エチレンジアミンなどのジアミン、アミノ酸、ヒドロキシカルボン酸、たとえばヒドロキシアルカン酸、又はジイソシアネートであり、ｍは０又は正の整数であり、ｍ’は０又は１である）
（ｉｉ）［［（Ｒ）n1Ｙ1’］n2］Ｙ2（ＩＩｂ）
（式中、Ｒは、請求項１〜６のいずれか１項で定義されたペプチド化合物であり、
Ｙ1’はそれぞれの場合独立して少なくとも３の官能価を有するリンカー、たとえばリシン、オルニチン、ノルリシン、アミノアラニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸などの三官能性アミノ酸であり、
Ｙ2は、少なくとも２の官能価を有するリンカーであり、
ｎ1及びｎ2はそれぞれの場合独立して、少なくとも２、好ましくは２、３又は４、さらに好ましくは２の整数である）、
（ｉｉｉ）｛［［（Ｒ）n1Ｙ1］n2］Ｙ2’｝n3Ｙ3（ＩＩｃ）
（式中、Ｒは、請求項１〜６のいずれか１項で定義されたペプチド化合物であり、
Ｙ1及びＹ2’は、それぞれの場合独立して、少なくとも３の官能価を有するリンカー、たとえばリシン、オルニチン、ノルリシン、アミノアラニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸などの三官能性アミノ酸であり、
Ｙ3は、少なくとも２の官能価を有するリンカーであり、
ｎ1、ｎ2及びｎ3は、それぞれの場合独立して、少なくとも２、好ましくは２、３又は４、さらに好ましくは２の整数である）
から選択される。
【００２８】
マルチマー化合物（ＩＩａ）は、複数のペプチド化合物が共有結合及び／又はホモ−若しくはヘテロ−二官能性リンカーＹ1によって結合したマルチマー直鎖化合物である。好ましくは、マルチマー化合物は、８個まで、さらに好ましくは４個までのペプチド化合物（Ｉａ）若しくは（Ｉｂ）の単位を含む。
【００２９】
マルチマー化合物（ＩＩｂ）及び（ＩＩｃ）は、個々のペプチド単位Ｒが、少なくとも３の官能価を有するリンカーによって結合した分岐化合物である。好適な実施形態において、マルチマー化合物（ＩＩｂ）は４個のペプチド単位を含み、構造：
【化１】
を有する。
【００３０】
さらなる好適な実施形態において、マルチマー化合物（ＩＩｃ）は８個のペプチド単位を含み、構造：
【化２】
を有する。
【００３１】
本発明のさらなる実施形態において、ペプチド及びマルチマー化合物は、少なくとも１つの修飾を含み、特に脂質、アミド、エステル、アシル及び／又はアルキル部分から選択されるものが結合し、たとえばＮ末端基、Ｃ末端基及び／又は側鎖基に結合している。Ｎ−及び／又はＣ末端修飾が好適である。
【００３２】
特に好適な修飾は、３〜２５、好ましくは５〜２５個のＣ原子を有する直鎖又は環状、飽和又は一不飽和若しくは多不飽和炭化水素基を含む少なくとも１つのアミノカルボン酸、たとえば５−アミノバレロイック酸（valeroic acid）、８−アミノオクタン酸又は２−アミノデカン酸である、少なくとも１つの脂質部分が結合していることである。好ましくは、脂質部分は、化合物のＮ末端及び／又はＣ末端に結合する。脂質部分は、たとえばペプチド化合物及び／又はマルチマー化合物の遊離Ｎ末端若しくはＣ末端と結合することができる。しかし、脂質部分は、たとえば化合物（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）及び（ＩＩｃ）に関して記載したように、Ｎ末端及び／又はＣ末端リンカーと結合することもできる。化合物（ＩＩｂ）及び（ＩＩｃ）の好適な実施形態において、Ｃ末端リンカーＹ2及びＹ3は、脂質部分が結合可能な三官能性リンカーである。
【００３３】
さらなる好適な実施形態は、Ｎ末端へのアシル、たとえばアセチル基の結合及び／又は遊離Ｃ末端のアミド化である。
【００３４】
本発明の化合物は、抗菌活性、特に、原核生物、たとえば真正細菌又は古細菌、及び真核生物、たとえば真菌、藻類又は寄生生物から選択される病原生物に対する活性を有し得る。好ましくは、化合物は、抗菌活性、たとえばグラム陰性及び／又はグラム陽性細菌に対する活性を有する。
【００３５】
本発明の化合物は、抗バイオフィルム活性も有し得る。体内への医療機器の挿入に関連する感染は、時間とともに増大する。その過程は、器具上への生物の接着、増殖及びバイオフィルム形成を伴う。バイオフィルムは、従来の抗菌剤で根絶するのが困難であり、抗菌性耐性はバイオフィルム成長のある特異性によって決定される（参考文献１０）。したがって、さらなる態様において、本発明の化合物は、バイオフィルムに埋め込まれた細菌、たとえばこれらに限定されるものではないが：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、及び黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の成長及び増殖を防止又は阻害するために用いることもできる。
【００３６】
本発明のさらなる主題は、少なくとも１つの前記定義の化合物、たとえば前記定義のペプチド又はマルチマー化合物を、薬剤的に許容される担体、希釈剤及び／又はアジュバントとともに含む医療用組成物である。人間医学又は獣医学において使用するために、組成物は、好ましくは、固体、液体又はゲル及びこれらの組み合わせから選択される医薬投与形態、たとえば洗眼液、洗口液、軟膏、エアロゾル又は局所製品としての形態である。医薬投与形態は、医薬有効量の本発明のモノマー又はマルチマーペプチド化合物、すなわち、病原生物の存在によって引き起こされる、関連する、又は不随して起きる障害の治療及び／又は予防に有効な活性剤の量を含む。「薬剤的に許容される」という表現は、本明細書では、妥当な損益比に相応して、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症なしに、ヒト又は場合によって動物の組織と接触する使用に適した化合物、物質、組成物、及び／又は投与形態を意味するために用いられる。
【００３７】
本発明の医薬投与形態における活性剤の実際の量は、投与経路並びに治療される障害の種類及び重篤度に応じて変わり得る。所望の（１つ若しくは複数の）効果を達成するために、ペプチドモノマー又はマルチマー化合物を、単回投与量又は分割量として、たとえば少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ（体重）乃至約２００〜５５０ｍｇ／ｋｇ（体重）、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ（体重）乃至約１００〜３００ｍｇ／ｋｇ（体重）、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）乃至約５０〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）又は少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ（体重）乃至約１０〜５０ｍｇ／ｋｇ（体重）又は少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ乃至約２０ｍｇ／ｋｇ（体重）で投与することができるが、他の用量でも有益な結果が得られる可能性がある。
【００３８】
医薬組成物を製造するためには、本発明のペプチドを合成、又は他の方法で得、必要であるか若しくは望ましいならば精製し、次いで好ましくは凍結乾燥し、安定化させる。ペプチドを次いで適当な濃度に調節することができ、場合によって、他の薬剤的に許容される薬剤と組み合わせることができる。
【００３９】
このように、本発明の治療用ペプチドを含む１以上の好適な単位投与形態は、経口、局所、非経口（皮下、静脈内、筋肉内及び腹腔内を包含する）、膣、直腸、皮膚、経皮、胸腔内、肺内及び鼻内（呼吸器）経路をはじめとする様々な経路により投与することができる。
【００４０】
局所投与に関して、活性剤を標的部分、たとえば爪及び皮膚に直接適用するために当該分野で既知のように処方することができる。局所適用のために主に調節された形態は、たとえば、ラッカー、クリーム、乳液、ゲル、粉末、分散液、又はミクロエマルジョン、多少増粘されたローション、含浸パッド、軟膏又はスティック、エアロゾル処方（たとえばスプレー若しくはフォーム）、石けん、洗剤、ローション若しくは固形石けんの形態を取る。この目的のための他の通常の形態としては、創傷包帯、コーティングされた包帯又は他のポリマーカバリング、軟膏、クリーム、ローションが挙げられる。
【００４１】
さらなる好適な実施形態において、本発明のモノマー若しくはマルチマー化合物又は組成物は、獣医用医薬用途において用いられる。したがって、本発明は、前記の少なくとも１つの化合物を含む獣医用組成物にも関する。
【００４２】
本発明のさらに別の実施形態は、前記の少なくとも１つの化合物を含む、殺菌剤及び／又は洗剤として使用される、又は保存料、たとえば医薬、化粧品若しくは食品用保存料の使用のための、前記の少なくとも１つの化合物を含む組成物に関する。
【００４３】
本発明のさらなる実施形態は、バイオフィルムに埋め込まれた微生物の成長又は増殖を減少させるための、前記の少なくとも１つの化合物を含む組成物に関する。
【００４４】
本発明のさらに別の実施形態において、ペプチド化合物及び組成物は、装置、好ましくは微生物耐性であることが望ましい医療機器の表面を処理するために用いられる。特に、本発明のこの態様によれば、ペプチド化合物及びそれらの組成物を、特に本発明の化合物及び組成物を医療機器上に結合、コーティング及び／又は埋め込むことによって、医療機器の表面上にコーティングする。医療機器の例としては、管類及びカニューレ、ステント、手術器具、カテーテル、ペースメーカー、人工心臓弁、人工関節、人工喉頭、コンタクトレンズ、及び子宮内避妊器具が挙げられる。
【００４５】
さらに、本発明を、以下の図面及び実施例によりさらに詳細に説明する。
【００４６】
図１は、ｉｎ ｖｉｖｏ試験での有効性のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ生存率プロットを示し、ここでは、本発明の二量体ペプチド化合物ＩＤ２４（配列番号２４、第４表を参照）をマウス敗血症モデルにおける同じ用法での参考抗生物質化合物コリスチンメタンスルホン酸ナトリウム（ＣＭＳ）と比較した。
【００４７】
図２ａ及び図２ｂは、２つのヒストグラムプロットを示し、この図では、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＡＴＣＣ２７８５３の２４時間バイオフィルムの、異なる濃度の二量体ペプチド化合物ＩＤ２４及び参考抗生物質化合物ＣＭＳそれぞれへの暴露を記録する。
【００４８】
特に、図２ａは、緑膿菌ＡＴＣＣ２７８５３の２４時間バイオフィルムの、異なる濃度の本発明のＩＤ２４化合物への暴露を示す。複製数／濃度はｎ＝２である。
【００４９】
一方、図２ｂは、緑膿菌ＡＴＣＣ２７８５３の２４時間バイオフィルムの、異なる濃度のコリスチンメタンスルホン酸ナトリウム（ＣＭＳ）への暴露を示す。複製数／濃度はｎ＝２である。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、ｉｎ ｖｉｖｏ試験での有効性のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ生存率プロットを示す図である。
【図２ａ】図２ａは、緑膿菌ＡＴＣＣ２７８５３の２４時間バイオフィルムの、異なる濃度の本発明のＩＤ２４化合物への暴露を示す図である。
【図２ｂ】図２ｂは、緑膿菌ＡＴＣＣ２７８５３の２４時間バイオフィルムの、異なる濃度のコリスチンメタンスルホン酸ナトリウム（ＣＭＳ）への暴露を示す図である。
【００５１】
実施例
材料
溶媒（すべてＨＰＬＣ等級）をＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州セントルイス）から入手し、さらに精製せずに使用した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、ピペリジン、トリフルオロ酢酸及びトリイソプロピルシランをＡｌｄｒｉｃｈ ａｎｄ Ｆｌｕｋａ（米国ミズーリ州セントルイス）から購入した。Ｆｍｏｃ−アミノ酸、ＨＯＢＴ、ＨＢＴＵ及び樹脂は、Ｃｈｅｍ−ｌｍｐｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（イリノイ州ウッドデール）及びＭｅｒｃｋ（ドイツ国ダルムシュタット）から提供された。
【００５２】
ペプチド合成。全てのペプチドは、ＭｕｌｔｉＳｙｎＴｅｃｈ Ｓｙｒｏ（ドイツ国ウィッテン）上、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ化学を用いて、固相合成によって合成した。カップリング活性化は、ＤＭＦ中ＨＯＢｔ／ＤＩＰＥＡ／ＨＢＴＵ（１／２／０．９）によって実施し、ＮＭＰ中４０％ピペリジンを用いてアミン上のＦｍｏｃ保護を除去した。側鎖保護基は、Ｇｌｕ及びＡｓｐについてはｔｅｒｔ−ブチルエステル、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ及びＡｓｎについてはトリチル、Ａｒｇについては２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒについてはｔｅｒｔ−ブチルエーテル、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ及びＴｒｐについてはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）であった。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨは、二量体及び四量体ペプチドを合成するために使用されたアミノ酸であった。Ｆｍｏｃ−５−アミノ吉草酸（５−Ａｖａ）及びＦｍｏｃ−８−アミノオクタン酸（８−Ａｏａ）を用いて、直鎖ペプチド及び二量体ペプチドの両方のＮ末端及び／又はＣ末端で脂質化を実施した。四量体、二量体及び直鎖ペプチドを、リンクアミド４−ベンズヒドリルアミン樹脂（ＭＢＨＡ）上で製造し、遊離アミノ基における最終ローディングを分光光度計によって測定することによって評価し、同時に酸ペプチドを２−クロロトリチルクロリド樹脂上で製造した。全ペプチドを樹脂から開裂させ、トリフルオロ酢酸、水及びトリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ、９５：２．５：２．５）での処理によって脱保護した。ジエチルエーテル中で沈降させることによって得られた粗ペプチドを、Ｃ12Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘカラム上Ｗａｔｅｒｓ ＨＰＬＣ−ＵＶ（マサチューセッツ州ミルフォード）によって精製し、Ｂｒｕｋｅｒ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光分析（マサチューセッツ州ビレリカ）によって特性化した。
【００５３】
ＭＩＣの決定。ＭＩＣは、ＭＨＢ中、微量液体希釈法により、ＣＬＳＩ法（従来はＮＣＣＬＳ、参考文献１１）にしたがって、１〜５×１０5ＣＦＵ／ｍＬの最終細菌接種物を用いることにより、決定した。分析を、丸底ウェルを有する滅菌９６穴マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）中で実施した。プレートを３７℃でインキュベーションし、２０〜２４時間後に読み取った。ＭＩＣを、視認可能な細菌成長の完全な抑制を引き起こす最低薬剤濃度として定義した。全化合物を（５％ｖ／ｖＤＭＳＯ）中に溶解させた。
【００５４】
実施例Ｉ
２−Ｘ1ミニライブラリ合成
ペプチド合成を前述のように２−クロロトリチルクロリド樹脂上で実施した。一般的配列Ｈ−Ｘ1−ＫＫＩＲＶＲＬＳＡ−ＯＨ（Ｘ1＝Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｗ、Ｙ）を有する６つの直鎖酸ペプチドを合成し、等モル量で組み合わせた。得られた粗ペプチド混合物をＣ12ＨＰＬＣカラム上で精製して、開裂によって生じる塩及びスカベンジャーを除去し、ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州サンタクララ）と連結したＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ／イオントラップ）により、成分を勾配モード（Ｂ ２０分で５→９５％；Ａ 水中０．１％ＴＦＡ、Ｂ アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ）を１．０ｍＬ／分の流速で溶出して分析した。ＭＳ（ＬＣ−ＭＳ ＥＳＩ／イオントラップ）：（ＩＤ２）Ｃ56Ｈ100Ｎ18Ｏ12（Ｘ1＝Ｆ）の計算値は（Ｍ）１２１６であり、実測値は１２１７（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ３）Ｃ53Ｈ102Ｎ18Ｏ12（Ｘ1＝Ｉ）の計算値は（Ｍ）１１８２であり、実測値は１１８３（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ４）Ｃ53Ｈ102Ｎ18Ｏ12（Ｘ1＝Ｌ）の計算値は（Ｍ）１１８２であり、実測値は１１８３（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ５）Ｃ52Ｈ100Ｎ18Ｏ12（Ｘ1＝Ｖ）の計算値は（Ｍ）１１６８であり、実測値は１１６９（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ６）Ｃ58Ｈ101Ｎ19Ｏ12（Ｘ1＝Ｗ）の計算値は（Ｍ）１２５５であり、実測値は１２５６（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ７）Ｃ56Ｈ100Ｎ18Ｏ13（Ｘ1＝Ｙ）の計算値は（Ｍ）１２３２であり、実測値は１２３３（Ｍ＋Ｈ）である。
【００５５】
実施例ＩＩ
３−Ｘ1ミニライブラリ合成
前記のようにしてペプチド合成を実施した。一般的配列Ｈ−Ｑ−Ｘ1−ＫＩＲＶＲＬＳＡ−ＯＨ（Ｘ1＝Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｗ、Ｙ）を有する６つの直鎖酸ペプチドを合成し、等モル量で組み合わせた。粗ペプチド混合物を実施例Ｉで記載するようにして精製した。ＭＳ（ＬＣ−ＭＳ ＥＳＩ／イオントラップ）：（ＩＤ８）Ｃ55Ｈ96Ｎ18Ｏ13（Ｘ1＝Ｆ）の計算値は（Ｍ）１２１６であり、実測値は１２１７（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ９）Ｃ53Ｈ101Ｎ18Ｏ13（Ｘ1＝Ｉ）の計算値は（Ｍ）１１９７であり、実測値は１１９８（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ１０）Ｃ52Ｈ98Ｎ18Ｏ13（Ｘ1＝Ｌ）の計算値は（Ｍ）１１８２であり、実測値は１１８３（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ１１）Ｃ51Ｈ96Ｎ18Ｏ13（Ｘ1＝Ｖ）の計算値は（Ｍ）１１６８であり、実測値は１１６９（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ１２）Ｃ57Ｈ97Ｎ19Ｏ13（Ｘ1＝Ｗ）の計算値は（Ｍ）１２５５であり、実測値は１２５６（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ１３）Ｃ55Ｈ96Ｎ18Ｏ14（Ｘ1＝Ｙ）の計算値は（Ｍ）１２３２であり、実測値は１２３３（Ｍ＋Ｈ）である。
【００５６】
実施例ＩＩＩ
直鎖酸ペプチド合成：ＩＤ１、ＩＤ６及びＩＤ１４
酸ペプチド合成を前記のとおり実施した。合成後、粗ペプチドをＨＰＬＣ−ＵＶによって勾配Ｂ（２０分で５→９５％）により精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって特性化した。質量値（Ｍ＋Ｈ）は次のとおりであった：（ＩＤ１）計算値は（Ｍ）１１９７であり、実測値は１１９８（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ６）計算値は（Ｍ）１２５５であり、実測値は１２５６（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ１４）計算値は（Ｍ）１３８３であり、実測値は１３８４（Ｍ＋Ｈ）である。
【００５７】
実施例ＩＶ
Ｎ−アシル化直鎖アミドペプチド合成：ＩＤ１５、ＩＤ１６及びＩＤ１７
アミドペプチド合成は、ペプチド合成の項で前述したようにリンクアミド樹脂上で実施した。合成後、実施例Ｉで記載されているように、粗ペプチドをＨＰＬＣ−ＵＶによって精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって特性化した。質量値（Ｍ＋Ｈ）は以下のとおりであった：（ＩＤ１５）計算値は（Ｍ）１３９５であり、実測値は１３９７（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ１６）計算値は（Ｍ）１３９５であり、実測値は１３９７（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ１７）計算値は（Ｍ）１３３７）であり、実測値は１３３９（Ｍ＋Ｈ）である。
【００５８】
実施例Ｖ
二量体ペプチド合成：ＩＤ１８、ＩＤ１９及びＩＤ２０
前記のようにしてペプチド合成を実施した。合成後、実施例Ｉで記載されているように、粗ペプチドをＨＰＬＣ−ＵＶによって精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって特性化した。質量値（Ｍ＋Ｈ）は以下のとおりであった：（ＩＤ１８）計算値は（Ｍ）２６９４であり、実測値は２６９６（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ１９）計算値は（Ｍ）２８０７）であり、実測値は２８０８（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ２０）計算値は（Ｍ）２６９１であり、実測値は２６９２（Ｍ＋Ｈ）である。
【００５９】
実施例ＶＩ
二量体脂質化ペプチド合成：ＩＤ２１、ＩＤ２２、ＩＤ２３及びＩＤ２４
前記のようにしてペプチド合成を実施した。合成後、実施例Ｉで記載されているように、粗ペプチドをＨＰＬＣ−ＵＶによって精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって特性化した。質量値（Ｍ＋Ｈ）は以下のとおりであった：（ＩＤ２１）計算値は（Ｍ）２８９１であり、実測値は２８９２（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ２２）計算値は（Ｍ）２８９１であり、実測値は２８９３（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ２３）計算値は（Ｍ）２８５９であり、実測値は２８６２（Ｍ＋Ｈ）であり；（ＩＤ２４）計算値は（Ｍ）２７６３であり、実測値は２７６４（Ｍ＋Ｈ）である。
【００６０】
実施例ＶＩＩ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性分析
ＨｅＬａ（ヒト上皮癌細胞系）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝細胞肝癌由来細胞系）及びＨａＣａｔ（ヒトケラチノサイト）をコンフルエンスまで成長させ、次いで２０，０００、１２，５００及び３０，０００細胞／ウェルで播種した（各細胞系について最適の細胞数をあらかじめ決めた）。２４時間後、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ中ＩＤ２４を８００〜１００ｕｇ／ｍｌの範囲の濃度で添加した。正の対照として、１００％の生存率を表す無血清培地で洗浄した１００ｕＬの細胞及び、負の対照として、１００ｕＬの無血清培地も添加した。
【００６１】
５％ｖ／ｖＣＯ2雰囲気中３７℃で２４時間インキュベーションした後、１０ｕｌのＭＴＴ試薬［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラソジウムブロミド、最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、２〜４時間インキュベーションした。ＭＴＴの代謝還元によって形成されたホルマザンの可溶化は、ストップミックス溶液（１０％ｗ／ｖドデシル硫酸ナトリウム、４５％ｖ／ｖジメチルホルムアミド、氷酢酸でｐＨ４．５に調節）を用いて得られた。プレートをマイクロプレート分光光度計（Ｂｉｏｒａｄ， Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ ｐｌｕｓ）で読み取った。ＩＤ２４に暴露された、又は培地単独に暴露された培養物を、分光光度計によって二波長（５６５〜６５０ｎｍ）で測定した。実験は３連で実施した。
【００６２】
実施例ＶＩＩＩ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ溶血
２つの異なる分析によって溶血を測定した。このうち１つは、新鮮なヒト赤血球のみを用いることによって、Ｓｈｉｎらの方法を適応させた（参考文献１２）。もう１つでは、ＩＤ２４溶液を全血中でインキュベーションした。
【００６３】
第１の方法
溶血分析をＳｈｉｎらの方法から適応させた（参考文献１２）。新鮮なヒト赤血球を使用して、ペプチドの溶血活性を試験した。４％ｗ／ｖクエン酸ナトリウム溶液を含む滅菌管中に全血を集め（１：１０のクエン酸ナトリウム：全血の比）、氷中に入れ、４℃にて５分間１０００ｇで遠心分離した。
【００６４】
赤血球ペレット上の白血球を含む上清を慎重に除去し、廃棄した。無傷赤血球を２容積（１ｍＬ）のあらかじめ冷却した無ピロゲン塩水（ＰＢＳ（１×））で３回洗浄した。赤血球懸濁液を調節して、０．８％（１ｍＬ中８ｕｌ又は２０ｍＬ中１６０ｕＬ）のＰＢＳ（１×）にした。
【００６５】
溶血分析のために、ＩＤ２４の連続２倍希釈液をＰＢＳ（１×）中で製造し、１００ｕＬアリコートを、滅菌９６穴マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）中の等体積の０．８％赤血球懸濁液（ＰＢＳ（１×）中）に３連で添加した。プレートを３７℃で２時間インキュベーションした。
【００６６】
続いて、無傷赤血球を１０００ｇで５分間４℃にて遠心分離することによりペレット化した。各ウェルからの上清１００マイクロリットルを適宜新しい９６穴マイクロタイタープレートに移し、４９０ｎｍの参考波長に対して４１４ｎｍでの吸光度を読み取ることによって、上清中に放出されたヘモグロビンの量を測定した。ＰＢＳ（１×）中１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００中に溶解させた０．４％赤血球１００ｕＬを含む正の対照（２００ｕＬのＰＢＳ（１×）中赤血球懸濁液０．８％及び２００ｕＬのＰＢＳ（１×）と２％（４ｕＬ）ＴｒｉｔｏｎＸ１００）を１００％溶解とみなした。負の対照は、最小の溶解をもたらすＰＢＳ（１×）単独中の赤血球であった。これを０％の溶血と見なした。
【００６７】
第２の方法
全血を、４％ｗ／ｖのクエン酸ナトリウム溶液を含む滅菌管中に集め（１：１０のクエン酸ナトリウム：全血比で）、氷中で保存した。ＩＤ２４の連続希釈（１ｍｇ／ｍＬから６２．５ｕｇ／ｍＬ）を１：１又は１：１０の比で全血に添加した。溶血可能性をサポニンに対して表し、同じ割合で添加し、１００％溶血と見なした。負の対照は、最小溶解をもたらす生理溶液中の全血であった。各懸濁液の１００ｕＬアリコートを滅菌９６穴マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）中に３連で添加した。プレートを３７℃で３０分間インキュベーションした。
【００６８】
続いて、１０００ｇで１０分間４℃にて遠心分離することによって、懸濁液をペレット化した。１００マイクロリットルの各ウェルからの上清を適宜新しい９６穴マイクロタイタープレートに移し、５６０ｎｍでの吸光度を読み取ることによって、上清中に放出されたヘモグロビンの量を測定した。
【００６９】
実施例ＩＸ
マウス敗血症モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ有効性
ＩＤ２４を、７．５×１０2ＣＦＵの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＣ４７（最終体積０．５ｍＬ）で腹腔内感染させたマウスに静脈内投与した。特に、ＩＤ２４を感染後１５分及び６時間に３ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。コリスチンメタンスルホン酸ナトリウム（ＣＭＳ）を感染後１５分に単回注射として３ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。
【００７０】
動物
実験当日に体重２５グラムのメスＩＣＲマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｉｔａｌｙ、イタリア国サン・ピエトロ・アル・ナティゾーネ）を使用した。実験開始前にマウスを恒温恒湿室内で少なくとも５日間飼育し、標準的実験室用飼料及び水を自由に与えた。
【００７１】
試験化合物及び参考化合物
試験化合物及び参考化合物であるＩＤ２４及びコリスチンメタンスルホン酸ナトリウム（ＣＭＳ）をそれぞれ０．１Ｍのリン酸塩緩衝塩溶液ｐＨ６．９中に必要とされる薬剤濃度で溶解させた。溶液を投与直前に作製し、計画された処置の最後まで４℃で保存した。大腸菌ＥＣ４７株に関するＩＤ２４ＭＩＣ値は２ｕｇ／ｍＬである［ＭＩＣは、Ｍｕｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ培地中微量液体希釈法（ＮＣＣＬＳガイドライン）により、約１０5ＣＦＵ／ｍＬの細菌接種物を用いて測定した］。
【００７２】
感染懸濁液の製造
大腸菌ＥＣ４７株の凍結バイアルを使用して、５０ｍＬのＤｉｆｃｏブレインハートインフュージョンブロスに接種し、培養物をロータリーシェーカー水浴（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国ニュージャージー州）上で２０時間３５℃にてインキュベーションし、次いで５％のＤｉｆｃｏ細菌ムチン中で１：１，０００，０００に希釈した。実際の接種物のサイズは、懸濁液の１０倍溶液の２つの０．０２５ｍＬアリコートをＤｉｆｃｏ Ｔｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ寒天プレート上に播種することによって決定した。
【００７３】
動物を７．５×１０2ＣＦＵの大腸菌ＥＣ４７（最終体積０．５ｍＬ）で腹腔内感染させた。この接種物は、未処置動物の１００％を感染の７２時間以内に死亡させるのに十分であった。
【００７４】
抗生物質処置
ＩＤ２４を３ｍｇ／ｋｇの用量で、感染後１５分及び６時間に投与した。総用量は６ｍｇ／ｋｇである。コリスチンメタンスルホン酸ナトリウム（ＣＭＳ）を１回量で、すなわち単回注射において３ｍｇ／ｋｇで感染後１５分に投与した。
【００７５】
処置は静脈内経路により行い（０．２５ｍＬ／マウス）、８匹の動物を各用量の各抗生物質で処置した。細菌接種後７日間、毎日１回死亡率を記録した。
【００７６】
実施例Ｘ
バイオフィルム根絶の実験手順
約１×１０7ＣＦＵ／ｍＬの緑膿菌ＡＴＣＣ２７８５３の対数期接種物をＭＢＥＣ ＴＭハイスループット分析用Ｉｎｎｏｖｏｔｅｃｈプレートの試薬容器（Ｉｎｎｏｖｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、カナダ国エドモントン）中に注いだ。２２ｍＬの接種物をトラフに添加し、ペグ付蓋を被せた。装置を３７℃の加湿ボックス中、８０ｒｐｍのシェーキングインキュベータ上に置いた。
【００７７】
２４時間のインキュベーション後、ペグを、２００ｕＬの生理溶液を含むプレート中にすすいで、軽く付着した浮遊細胞をバイオフィルムから除去し、次いでＴＳＢ中で連続希釈した２００ｕＬの異なる抗生物質溶液を含むマイクロプレート中に入れた。
【００７８】
シェーキングインキュベータ上３７℃で４時間接触及びインキュベーションした後、ペグ付蓋をトラフから取り出し、リンスプレート中に２分間浸漬した。
【００７９】
次いで、試料ペグを含む塩溶液を含む新しいマイクロタイターを、超音波洗浄器のトレイ中に入れ、そして３０分間音波処理して、９６ペグの表面からバイオフィルムを分離させた。
【００８０】
各ウェルの１０倍連続希釈の二重アリコート（０．０１又は０．００５ｍＬ）をＭＨＡプレート上に塗布し、２４時間のインキュベーション後、生存細胞計数のためコロニーを読み取った。
【００８１】
実施例ＸＩ
ｉｎ ｖｉｖｏ急性毒性
動物
９〜１０週令メスＣＤ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂ． Ｉｔａｌｉａ ｓ．ｒ．ｌ． Ｖｉａ Ｉｎｄｉｐｅｎｄｅｎｚａ， １１−２３８８５ Ｃａｌｃｏ（ＬＣ），Ｉｔａｌｙ）（実験当日の平均体重２８．２３ｇ）を使用した。マウスを実験開始前に恒温恒湿室内で３日間飼育し、標準的実験室用飼料及び水を自由に与えた。
【００８２】
試験化合物
ＩＤ２４を、用量濃度２０及び４０ｍｇ／ｋｇでヒトに投与するため０．９％ｗ／ｖのＮａＣｌ滅菌溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中に溶解し、音波処理した。化合物製造は、投与直前に実施した。
【００８３】
抗生物質の投与
２種の用量（２０ｍｇ／ｋｇ及び４０ｍｇ／ｋｇ）のＩＤ２４を単回腹腔内注射とともにマウスに投与した。５匹の動物を各用量の抗生物質で処置した。注射後７日間、有害症状を毎日モニタリングした。
【００８４】
結果の評価
生存及び臨床／行動的兆候を１４日間毎日記録した。
【００８５】
観察されるパラメータ
Ｉｒｗｉｎ試験によって得られた主な行動的パラメータ及び臨床的兆候（参考文献１３）。
【００８６】
単回量注射後に全群を観察することによって、以下の症状及び行動の変化を強調することができる：
２０ｍｇ／ｋｇ：行動の変化なし；
４０ｍｇ／ｋｇ：行動の変化なし。
【００８７】
ＩＤ２４のＩＰ投与後、有害症状、行動変化及び死亡は記録されず、４０ｍｇ／ｋｇの最高用量でも記録されなかった。
【００８８】
結果
ミニライブラリ構築及びＭＩＣの測定
ＷＯ２００６／００６１９５に記載されている直鎖デカペプチド配列番号１を、グラム陰性菌に対する活性の点で最適化した。このペプチドは、リシンコア上に四量体構造として存在する場合に活性であった。モノマー形態で、ペプチドはごくわずかな活性しか有していなかった。最適化法は、第１表に概略が記載されているような配列スキャニングによって得られる９のペプチドミニライブラリの合成から構成されていた。
【００８９】
第１表 ９のデカペプチド位置スキャニングライブラリ
【表１】
*：Ｘnは：ｎ＝１ならば、Ｏ＝Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｗ、Ｙ；ｎ＝２ならば、Ｏ＝Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、Ｑ；ｎ＝３ならば、Ｏ＝Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅを含む６のアミノ酸の群に対応する。
【００９０】
全ての天然のアミノ酸は、その化学物理的特性に基づいて３群に分割される。合計２７のミニライブラリ（それぞれは等モル量で６つのペプチドを含む）を得、参考株としての大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２に対して分析した。ＭＩＣで表した活性値を第２表に記載する。ＭＩＣ（最小阻止濃度）は、視認可能な成長を１００％阻害する最低濃度として定義される。
【００９１】
第２表 ９のデカペプチド位置スキャニングミニライブラリ：活性又は大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２に対する結果として得られる２７のペプチドミニライブラリ
【表２】
ａ：不活性な本来の１０ｍｅｒ配列。
【００９２】
６２．５ｕｇ／ｍＬのＭＩＣを有する４つのミニライブラリは、配列番号１よりも活性が高いと見なされた。これらのペプチドを個々に合成し、各配列の活性を分析した。最も活性の高いミニライブラリ（２−Ｘ1、２−Ｘ2、３−Ｘ1及び８−Ｘ1）を開き、抗菌活性に対する各配列位置での各残基の寄与を評価した。さらに、Ｌｙｓ−β−Ａｌａ又はＬｙｓ−８−Ａｏａ（８−アミノオクタン酸）上でのＮ−及びＣ−アシル化ならびに二量化などの修飾も、ミニライブラリから単離されたさらに活性の高い配列に関して実施した。第３表では、グラム陰性株大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２、緑膿菌ＡＴＣＣ２７８５３及び肺炎桿菌ＡＴＣＣ１００３１ならびにグラム陽性株黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２５９２３に対して試験した、ミニライブラリ２−Ｘ1 ｅ ３−Ｘ1に属するペプチドを記載する。２−Ｘ2及び８−Ｘ1という名称の他の２つの最も活性の高いミニライブラリも開いたが、個々に試験した各ペプチドは＞１２８ｕｇ／ｍＬの活性を有していた（データは割愛）。
【００９３】
第３表 ミニライブラリペプチドを個々に合成した：グラム陰性及びグラム陽性菌に対するＭＩＣ（ｕｇ／ｍＬ）を記載する。
【００９４】
【表３】
【００９５】
ピログルタミン酸又はジペプチドＧｌｙ−Ｇｌｎの導入は、ペプチドの活性に影響を及ぼすことなく位置Ａ1で実施することができる（データは割愛）。これらの修飾は、ピログルタメート形成でＮ末端グルタミンが環化するのを防止する。
【００９６】
２−Ｘ1−Ｗ及び３−Ｘ1−Ｗという名称の２つのミニライブラリから単離された２つの選択されたペプチド（配列番号６及び１４）を二量体形態（配列番号１８及び１９）で合成し、それらの直鎖カウンターパートについての多価性に関連する増大した活性を証明した。ペプチド配列番号１４は、Ｇｌｎの環化を回避するためにＮ末端にＧｌｙが導入されている選択されたペプチド配列番号１２の誘導体である。さらに、直鎖及び二量体ペプチドの両方のＮ末端（ＩＤ１６、１６、１７、２１、２２及び２３）並びにＣ末端（配列番号２４）での５−アミノ吉草酸（５−Ａｖａ）及び８−アミノオクタン酸（８−Ａｏａ）での脂質化などの修飾を実施し、結果として得られた生成物を試験した。
【００９７】
第４表において、直鎖及び二量体ペプチドならびにそれらの脂肪誘導体のＭＩＣ値を記載する。
【００９８】
第４表 直鎖及び二量体ペプチドならびにそれらの脂肪誘導体のＭＩＣ値。
【００９９】
【表４】
ＮＤ：測定せず。
【０１００】
２つの化合物ＩＤ１８及びＩＤ２４は活性が最も高かった。これらの化合物をグラム陰性臨床分離株の大パネルに対して試験し、相対的ＭＩＣ値を第５表に記載した（パート１〜３）。
【０１０１】
第５表 ＩＤ２４及びＩＤ１８対いくつかのグラム陰性菌臨床分離株のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性（パート１）
【表５】
【０１０２】
第５表 ＩＤ２４及びＩＤ１８対いくつかのグラム陰性菌臨床分離株のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性（パート２）
【表６】
【０１０３】
第５表 ＩＤ２４及びＩＤ１８対いくつかのグラム陰性菌臨床分離株のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性（パート３）
【表７】
【０１０４】
細胞毒性及び溶血ｉｎ ｖｉｔｒｏ効果
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性
ｉｎ ｖｉｔｒｏＩＤ２４細胞毒性を３つの細胞系に関して、ＭＴＴ色素還元分析を用いて試験した。ＩＤ２４についてのＣＣ50値を第６表にまとめる。
【０１０５】
第６表 ＩＤ２４のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性
【表８】
【０１０６】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ溶血
溶血を実施例ＶＩＩＩで記載されているように、２つの異なる分析によって測定した。第７表〜第９表に、全ての溶血率（％）値（ＵＶ−ＶＩＳ分光光度法によって測定）を記載する。第７表では、特に、異なる濃度で、赤血球懸濁液と１：１の割合のＩＤ２４の溶血率（％）を記載する。溶血率（％）は、４１４ｎｍでの吸光度を読み取ることにより、上清中に放出されるヘモグロビンの量を測定するＵＶ−ＶＩＳ分光光度法によって測定した（参考波長４９０ｎｍ）。これらの結果は、Ｓｈｉｎのプロトコル（参考文献１２）に準拠した実施例ＶＩＩＩの第１の方法を参照する。
【０１０７】
第７表 赤血球懸濁液中様々な濃度でのＩＤ２４の溶血率（％）
【表９】
*：ブランク（生理溶液）を差し引いた吸光度値。３回の測定を各処置について実施した。
【０１０８】
第８表には、全血と１：１比の異なる量のＩＤ２４の溶血率（％）を記載し、一方、第９表には、全血と１：１０比の異なる量のＩＤ２４の溶血率（％）を記載する。上清中に放出されたヘモグロビンの量は、５６０ｎｍでの吸光度を読み取ることによって測定した。これらの結果は、実施例ＶＩＩＩの第２の方法を参照する。
【０１０９】
第８表 全血と１：１比のＩＤ２４の溶血率（％）
【表１０】
*：ブランク（生理溶液）を差し引いた吸光度値。３回の測定を各処置に関して実施した。
【０１１０】
第９表 全血と１：１０比のＩＤ２４の溶血率（％）。
【０１１１】
【表１１】
*：ブランク（生理溶液）を差し引いた吸光度値。３回の測定を各処置に関して実施した。
【０１１２】
マウス敗血症モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ有効性
ＩＤ２４を、７．５×１０2ＣＦＵの大腸菌ＥＣ４７で腹腔内感染させたマウスに静脈内投与した。特に、ＩＤ２４を感染後１５分及び６時間に１回量で投与した。結果を図１に示し、この図は、ＩＤ２４を感染後１５分及び６時間に３ｍｇ／ｋｇの用量で２回投与し、一方、コリスチンメタンスルホン酸ナトリウム（ＣＭＳ）を感染後１５分に３ｍｇ／ｋｇの用量で１回投与した場合の、カプラン・マイヤー生存曲線を示す。対照群に含まれるマウスは第３日までに全て死亡した。各群は８匹のマウスで構成されていた。
【０１１３】
ＩＤ２４は、大腸菌の臨床分離株（ＥＣ４７）によって引き起こされる感染症からマウスを保護することが証明された。
【０１１４】
抗バイオフィルム活性
異なる濃度のＩＤ２４（ＭＩＣ値の１／４、１／２、１、２及び４倍）に暴露すると、細菌バイオフィルムが実質的に減少し、実施した２つの実験において、８８．７％〜９９．９％の範囲の阻害率（％）（０．９５から３．０５ｌｏｇ１０の減少）が、未処理の対照と比較して試験した全ての濃度で観察された。抑制濃度以下で、０．９から２．３５ｌｏｇ１０の減少が、ＭＩＣ値のそれぞれ１／４及び１／４倍で観察された。
【０１１５】
他の方法では、コリスチンはＩＤ２４よりも活性が低くなり、試験した全濃度について、バイオフィルム減少は８８．３％〜９７．１％（０．８８から１．５５ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬの減少）であった。結果を図２ａ及び２ｂに示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉａ）：
Ｚ−［Ｋ］n−Ｋ−Ｉ−Ｒ−Ｖ−Ｒ（配列番号２５）
（式中、Ｋは、リシン側鎖、特にＬ−リシンを有するアミノ酸残基、又は正に荷電した側鎖を有する別のアミノ酸残基であり、
Ｉは、イソロイシン側鎖、特にＬ−イソロイシンを有するアミノ酸残基であり、
Ｒは、アルギニン又はＮ−アルキル置換グアニジン側鎖、特にＬ−アルギニンを有するアミノ酸残基であり、
Ｖは、バリン側鎖、特にＬ−バリンを有するアミノ酸残基であり、
前記アミノ酸残基Ｋ、Ｉ、Ｒ及びＶのうち１つは、アラニン側鎖、特にＬ−アラニンを有するアミノ酸残基により置換されていてもよく、
Ｚは、少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、
（ｉ）芳香族アミノ酸残基又は少なくとも１つの芳香族アミノ酸残基を含むジ−、トリ−若しくはテトラペプチジル基（ここで、前記芳香族アミノ酸残基は、トリプトファン、Ｎ−メチルトリプトファン、フェニルアラニン、β−フェニルアラニン、ナフチルアラニン、β−ナフチルアラニン、β−ジフェニルアラニン、β−（４，４’−ビフェニル）アラニン、β−アントラセン−９−イルアラニン及びβ−インドール−３−イルアラニン、又はその置換誘導体から特に選択される）、
（ｉｉ）脂肪族アミノ酸残基又は少なくとも１つの脂肪族アミノ酸残基を含むジ−、トリ−、テトラペプチジル基（ここで、前記脂肪族残基は、特に、脂肪族、好ましくは少なくとも３個のＣ原子を有する分岐脂肪族側鎖を含むα−アミノ酸残基から選択される）
（ｉｉｉ）ピログルタミン酸（ｐｙｒＥ）残基又はＮ末端ピログルタミン酸残基を含むジ−、トリ−若しくはテトラ−ペプチジル基、
（ｉｖ）残基Ｑ*又はＮ末端Ｑ*残基を含むジ−、トリ−若しくはテトラペプチジル基（ここで、Ｑ*は、グルタミン側鎖を有する保護アミノ酸残基、特に保護Ｌ−グルタミン残基である）、
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つの組み合わせ、たとえば（ｉ）及び（ｉｉｉ）、（ｉ）及び（ｉｖ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）及び（ｉｉ）又は（ｉｉ）及び（ｉｖ）
から選択されるペプチド化合物のＮ末端基であり、
ｎは０又は１である）
により表されるアミノ酸配列を含む３５アミノ酸残基までの長さを有するペプチド化合物であって、前記ペプチド化合物が、Ｌ−及び／又はＤ−アミノ酸残基構成単位を含み得る、ペプチド化合物。
【請求項２】
一般式（Ｉｂ）：
Ｚ−［Ｋ］n−Ｋ−Ｉ−Ｒ−Ｖ−Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ａ（配列番号２６）
（式中、Ｋ、Ｉ、Ｒ、Ｖ、Ｚ及びｎは前記定義のとおりであり、
Ｓはセリン側鎖、特にＬ−セリンを有するアミノ酸残基であり、
Ａは、アラニン側鎖、特にＬ−アラニンを有するアミノ酸残基であり、
Ｌは、ロイシン側鎖、特にＬ−ロイシンを有するアミノ酸残基であり、前記アミノ酸残基Ｋ、Ｉ、Ｒ、Ｌ、Ｖ及びＳのうち１つが、アラニン側鎖を有するアミノ酸残基で置換されていてもよく、Ｚ及びｎは請求項１で定義したとおりである）により表されるアミノ酸配列を含む３５アミノ酸残基までの長さを有し、Ｌ−及び／又はＤ−アミノ酸残基構成単位を含み得る、請求項１に記載のペプチド化合物。
【請求項３】
前記Ｎ末端基Ｚが、Ａｒ、Ａｒ−Ｑ、Ｇ−Ｑ又はアセチル−ＱなどのＱ*、Ｇ−Ｑ−Ａｒ又はアセチル−Ｑ−ＡｒなどのＱ*−Ａｒ、ｐｙｒＥ及びｐｙｒＥ−Ａｒ（ここで、Ａｒは芳香族アミノ酸残基である）から選択される、請求項１又は２に記載のペプチド化合物。
【請求項４】
ＷＫＫＩＲＶＲＬＳＡ（配列番号６）
ｐｙｒＥＷＫＩＲＶＲＬＳＡ（配列番号２７）
ＧＱＷＫＩＲＶＲＬＳＡ（配列番号１４）
アセチル−ＱＷＫＩＲＶＲＬＳＡ（配列番号１２）
Ａｏａ−ＱＷＩＲＶＲＬＳＡ（配列番号１６）
（ＧＱＷＫＩＲＶＲＬＳＡ）2Ｋ−β−Ａｌａ（配列番号１９）
（ここで、ｐｒｙＥはピログルタミン酸残基であり、Ａｏａは８−アミノオクタン酸残基であり、β−Ａｌａはβ−アラニン残基である）から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ペプチドが場合によりそれらのＣ末端でアミド化されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド化合物。
【請求項５】
１５アミノ酸残基までの長さを有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド化合物。
【請求項６】
直鎖又は環状形態を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド化合物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項で定義されたペプチド化合物を複数含む、マルチマー化合物。
【請求項８】
ポリ（Ｎ−アルキル（メタ）アクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキル（メタ）アクリルアミド）、ポリメラミン、デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール及び／又はポリビニルピロリドンから特に選択されるマトリックス上でマルチマー化される、請求項７に記載のマルチマー化合物。
【請求項９】
分岐した、特にデンドリマー構造を有する、請求項７に記載のマルチマー化合物。
【請求項１０】
（ｉ）Ｒ−（Ｙ1−Ｒ）m−Ｙ1−（Ｒ）m’（ＩＩａ）
（式中、Ｒは、請求項１〜６のいずれか１項で定義されたペプチド化合物であり、
Ｙ1は、共有結合又は二官能性リンカー、たとえばプロピレングリコールなどのジアルコール、コハク酸などのジカルボン酸、エチレンジアミンなどのジアミン、アミノ酸、ヒドロキシカルボン酸、若しくはジイソシアネートであり、ｍは０又は正の整数であり、ｍ’は０又は１である）
（ｉｉ）［［（Ｒ）n1Ｙ1’］n2］Ｙ2（ＩＩｂ）
（式中、Ｒは、請求項１〜６のいずれか１項で定義されたペプチド化合物であり、Ｙ1’はそれぞれの場合独立して、少なくとも３の官能価を有するリンカー、たとえばリシン、オルニチン、ノルリシン、アミノアラニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸などの三官能性アミノ酸であり、
Ｙ2は、少なくとも２の官能価を有するリンカーであり、ｎ1及びｎ2はそれぞれの場合独立して、少なくとも２、好ましくは２、３又は４、さらに好ましくは２の整数である）、
（ｉｉｉ）｛［［（Ｒ）n1Ｙ1’］n2］Ｙ2’｝n3Ｙ3（ＩＩｃ）
（式中、Ｒは、請求項１〜６のいずれか１項で定義されたペプチド化合物であり、
Ｙ1及びＹ2’はそれぞれの場合少なくとも３の官能価を有する独立したリンカー、たとえばリシン、オルニチン、ノルリシン、アミノアラニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸などの三官能性アミノ酸であり、
Ｙ3は、少なくとも２の官能価を有するリンカーであり、
ｎ1、ｎ2及びｎ3は、それぞれの場合独立して、少なくとも２、好ましくは２、３又は４、さらに好ましくは２の整数である）
から選択される、請求項７又は９に記載のマルチマー化合物。
【請求項１１】
特にこれに結合した脂質、アミド、エステル、アシル及び／又はアルキル部分から選択される少なくとも１つの修飾を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
３〜２５個のＣ原子を有する直鎖又は環状飽和一不飽和若しくは多不飽和炭化水素基、たとえば５−アミノ吉草酸、８−アミノオクタン酸又は２−アミノデカン酸を含む少なくとも１つのアミノカルボン酸であり、好ましくは、前記化合物のＮ末端及び／又はＣ末端と結合した少なくとも１つの脂質部分を含む、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
原核生物、たとえば真正細菌又は古細菌、及び真核生物、たとえば真菌、藻類又は寄生生物から選択される病原生物に対する活性を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１４】
抗菌活性を有する請求項１〜１３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項で定義した少なくとも１つの化合物を薬学的に許容される担体、希釈剤及び／又はアジュバントとともに含む、医療用組成物。
【請求項１６】
固体、液体又はゲル及びこれらの組み合わせから選択される、たとえば洗眼液、洗口液、軟膏、エアゾル又は局所製品としての医薬投与形態の形状の請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか１項で定義した少なくとも１つの化合物を含む殺菌剤及び／又は洗剤として用いられる組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１４のいずれか１項で定義した少なくとも１つの化合物を含む保存料として用いられる組成物。
【請求項１９】
医薬、化粧品又は食品の保存料としての請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
バイオフィルムに埋め込まれた微生物の成長又は増殖を減少させるための請求項１８に記載の化合物。
【請求項２１】
請求項１〜１４のいずれか１項で定義した少なくとも１つの化合物を含む獣医学用組成物。
【請求項１】
一般式（Ｉａ）：
Ｚ−［Ｋ］n−Ｋ−Ｉ−Ｒ−Ｖ−Ｒ（配列番号２５）
（式中、Ｋは、リシン側鎖、特にＬ−リシンを有するアミノ酸残基、又は正に荷電した側鎖を有する別のアミノ酸残基であり、
Ｉは、イソロイシン側鎖、特にＬ−イソロイシンを有するアミノ酸残基であり、
Ｒは、アルギニン又はＮ−アルキル置換グアニジン側鎖、特にＬ−アルギニンを有するアミノ酸残基であり、
Ｖは、バリン側鎖、特にＬ−バリンを有するアミノ酸残基であり、
前記アミノ酸残基Ｋ、Ｉ、Ｒ及びＶのうち１つは、アラニン側鎖、特にＬ−アラニンを有するアミノ酸残基により置換されていてもよく、
Ｚは、少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、
（ｉ）芳香族アミノ酸残基又は少なくとも１つの芳香族アミノ酸残基を含むジ−、トリ−若しくはテトラペプチジル基（ここで、前記芳香族アミノ酸残基は、トリプトファン、Ｎ−メチルトリプトファン、フェニルアラニン、β−フェニルアラニン、ナフチルアラニン、β−ナフチルアラニン、β−ジフェニルアラニン、β−（４，４’−ビフェニル）アラニン、β−アントラセン−９−イルアラニン及びβ−インドール−３−イルアラニン、又はその置換誘導体から特に選択される）、
（ｉｉ）脂肪族アミノ酸残基又は少なくとも１つの脂肪族アミノ酸残基を含むジ−、トリ−、テトラペプチジル基（ここで、前記脂肪族残基は、特に、脂肪族、好ましくは少なくとも３個のＣ原子を有する分岐脂肪族側鎖を含むα−アミノ酸残基から選択される）
（ｉｉｉ）ピログルタミン酸（ｐｙｒＥ）残基又はＮ末端ピログルタミン酸残基を含むジ−、トリ−若しくはテトラ−ペプチジル基、
（ｉｖ）残基Ｑ*又はＮ末端Ｑ*残基を含むジ−、トリ−若しくはテトラペプチジル基（ここで、Ｑ*は、グルタミン側鎖を有する保護アミノ酸残基、特に保護Ｌ−グルタミン残基である）、
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つの組み合わせ、たとえば（ｉ）及び（ｉｉｉ）、（ｉ）及び（ｉｖ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）及び（ｉｉ）又は（ｉｉ）及び（ｉｖ）
から選択されるペプチド化合物のＮ末端基であり、
ｎは０又は１である）
により表されるアミノ酸配列を含む３５アミノ酸残基までの長さを有するペプチド化合物であって、前記ペプチド化合物が、Ｌ−及び／又はＤ−アミノ酸残基構成単位を含み得る、ペプチド化合物。
【請求項２】
一般式（Ｉｂ）：
Ｚ−［Ｋ］n−Ｋ−Ｉ−Ｒ−Ｖ−Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ａ（配列番号２６）
（式中、Ｋ、Ｉ、Ｒ、Ｖ、Ｚ及びｎは前記定義のとおりであり、
Ｓはセリン側鎖、特にＬ−セリンを有するアミノ酸残基であり、
Ａは、アラニン側鎖、特にＬ−アラニンを有するアミノ酸残基であり、
Ｌは、ロイシン側鎖、特にＬ−ロイシンを有するアミノ酸残基であり、前記アミノ酸残基Ｋ、Ｉ、Ｒ、Ｌ、Ｖ及びＳのうち１つが、アラニン側鎖を有するアミノ酸残基で置換されていてもよく、Ｚ及びｎは請求項１で定義したとおりである）により表されるアミノ酸配列を含む３５アミノ酸残基までの長さを有し、Ｌ−及び／又はＤ−アミノ酸残基構成単位を含み得る、請求項１に記載のペプチド化合物。
【請求項３】
前記Ｎ末端基Ｚが、Ａｒ、Ａｒ−Ｑ、Ｇ−Ｑ又はアセチル−ＱなどのＱ*、Ｇ−Ｑ−Ａｒ又はアセチル−Ｑ−ＡｒなどのＱ*−Ａｒ、ｐｙｒＥ及びｐｙｒＥ−Ａｒ（ここで、Ａｒは芳香族アミノ酸残基である）から選択される、請求項１又は２に記載のペプチド化合物。
【請求項４】
ＷＫＫＩＲＶＲＬＳＡ（配列番号６）
ｐｙｒＥＷＫＩＲＶＲＬＳＡ（配列番号２７）
ＧＱＷＫＩＲＶＲＬＳＡ（配列番号１４）
アセチル−ＱＷＫＩＲＶＲＬＳＡ（配列番号１２）
Ａｏａ−ＱＷＩＲＶＲＬＳＡ（配列番号１６）
（ＧＱＷＫＩＲＶＲＬＳＡ）2Ｋ−β−Ａｌａ（配列番号１９）
（ここで、ｐｒｙＥはピログルタミン酸残基であり、Ａｏａは８−アミノオクタン酸残基であり、β−Ａｌａはβ−アラニン残基である）から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ペプチドが場合によりそれらのＣ末端でアミド化されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド化合物。
【請求項５】
１５アミノ酸残基までの長さを有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド化合物。
【請求項６】
直鎖又は環状形態を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド化合物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項で定義されたペプチド化合物を複数含む、マルチマー化合物。
【請求項８】
ポリ（Ｎ−アルキル（メタ）アクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキル（メタ）アクリルアミド）、ポリメラミン、デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール及び／又はポリビニルピロリドンから特に選択されるマトリックス上でマルチマー化される、請求項７に記載のマルチマー化合物。
【請求項９】
分岐した、特にデンドリマー構造を有する、請求項７に記載のマルチマー化合物。
【請求項１０】
（ｉ）Ｒ−（Ｙ1−Ｒ）m−Ｙ1−（Ｒ）m’（ＩＩａ）
（式中、Ｒは、請求項１〜６のいずれか１項で定義されたペプチド化合物であり、
Ｙ1は、共有結合又は二官能性リンカー、たとえばプロピレングリコールなどのジアルコール、コハク酸などのジカルボン酸、エチレンジアミンなどのジアミン、アミノ酸、ヒドロキシカルボン酸、若しくはジイソシアネートであり、ｍは０又は正の整数であり、ｍ’は０又は１である）
（ｉｉ）［［（Ｒ）n1Ｙ1’］n2］Ｙ2（ＩＩｂ）
（式中、Ｒは、請求項１〜６のいずれか１項で定義されたペプチド化合物であり、Ｙ1’はそれぞれの場合独立して、少なくとも３の官能価を有するリンカー、たとえばリシン、オルニチン、ノルリシン、アミノアラニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸などの三官能性アミノ酸であり、
Ｙ2は、少なくとも２の官能価を有するリンカーであり、ｎ1及びｎ2はそれぞれの場合独立して、少なくとも２、好ましくは２、３又は４、さらに好ましくは２の整数である）、
（ｉｉｉ）｛［［（Ｒ）n1Ｙ1’］n2］Ｙ2’｝n3Ｙ3（ＩＩｃ）
（式中、Ｒは、請求項１〜６のいずれか１項で定義されたペプチド化合物であり、
Ｙ1及びＹ2’はそれぞれの場合少なくとも３の官能価を有する独立したリンカー、たとえばリシン、オルニチン、ノルリシン、アミノアラニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸などの三官能性アミノ酸であり、
Ｙ3は、少なくとも２の官能価を有するリンカーであり、
ｎ1、ｎ2及びｎ3は、それぞれの場合独立して、少なくとも２、好ましくは２、３又は４、さらに好ましくは２の整数である）
から選択される、請求項７又は９に記載のマルチマー化合物。
【請求項１１】
特にこれに結合した脂質、アミド、エステル、アシル及び／又はアルキル部分から選択される少なくとも１つの修飾を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
３〜２５個のＣ原子を有する直鎖又は環状飽和一不飽和若しくは多不飽和炭化水素基、たとえば５−アミノ吉草酸、８−アミノオクタン酸又は２−アミノデカン酸を含む少なくとも１つのアミノカルボン酸であり、好ましくは、前記化合物のＮ末端及び／又はＣ末端と結合した少なくとも１つの脂質部分を含む、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
原核生物、たとえば真正細菌又は古細菌、及び真核生物、たとえば真菌、藻類又は寄生生物から選択される病原生物に対する活性を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１４】
抗菌活性を有する請求項１〜１３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項で定義した少なくとも１つの化合物を薬学的に許容される担体、希釈剤及び／又はアジュバントとともに含む、医療用組成物。
【請求項１６】
固体、液体又はゲル及びこれらの組み合わせから選択される、たとえば洗眼液、洗口液、軟膏、エアゾル又は局所製品としての医薬投与形態の形状の請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか１項で定義した少なくとも１つの化合物を含む殺菌剤及び／又は洗剤として用いられる組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１４のいずれか１項で定義した少なくとも１つの化合物を含む保存料として用いられる組成物。
【請求項１９】
医薬、化粧品又は食品の保存料としての請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
バイオフィルムに埋め込まれた微生物の成長又は増殖を減少させるための請求項１８に記載の化合物。
【請求項２１】
請求項１〜１４のいずれか１項で定義した少なくとも１つの化合物を含む獣医学用組成物。
【図１】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【公表番号】特表２０１１−５２１９８４（Ｐ２０１１−５２１９８４Ａ）
【公表日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１２０１３（Ｐ２０１１−５１２０１３）
【出願日】平成２１年６月２日（２００９．６．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００３９３１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４６８８６
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（５１０３１８４８０）スパイダー バイオテック ソチエタ・レスポンサビリタ・リミタータ (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｓｐｉｄｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｓ．ｒ．ｌ．
【住所又は居所原語表記】Ｂｉｏｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｐａｒｋ ｄｅｌ Ｃａｎａｖｅｓｅ， Ｖｉａ Ｒｉｂｅｓ ５， Ｉ−１００１０ Ｃｏｌｌｅｒｅｔｔｏ Ｇｉａｃｏｓａ， Ｉｔａｌｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月２日（２００９．６．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００３９３１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４６８８６
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（５１０３１８４８０）スパイダー バイオテック ソチエタ・レスポンサビリタ・リミタータ (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｓｐｉｄｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｓ．ｒ．ｌ．
【住所又は居所原語表記】Ｂｉｏｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｐａｒｋ ｄｅｌ Ｃａｎａｖｅｓｅ， Ｖｉａ Ｒｉｂｅｓ ５， Ｉ−１００１０ Ｃｏｌｌｅｒｅｔｔｏ Ｇｉａｃｏｓａ， Ｉｔａｌｙ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]