核酸検出カセット、核酸検出装置及び核酸検出システム
【課題】核酸増幅およびその他の必要な処理と目標核酸の検出までを一貫して自動的に処理する。
【解決手段】核酸検出カセット１００は、容積が可変で試薬を保持可能でかつ核酸検出カセット１００外部と連通可能な開状態と閉鎖可能な閉状態を選択可能な出入口孔を有する保持流路１１１と、この保持流路１１１に接続され保持流路１１１と連通可能な開状態と閉鎖可能な閉状態を選択可能な連結流路１１６，１１７と、出入口孔を閉状態で維持可能な出入パッド４０４，４０５と、連結流路１１６，１１７を閉状態で維持可能な連結パッド４０６，４０７とを備える。
【解決手段】核酸検出カセット１００は、容積が可変で試薬を保持可能でかつ核酸検出カセット１００外部と連通可能な開状態と閉鎖可能な閉状態を選択可能な出入口孔を有する保持流路１１１と、この保持流路１１１に接続され保持流路１１１と連通可能な開状態と閉鎖可能な閉状態を選択可能な連結流路１１６，１１７と、出入口孔を閉状態で維持可能な出入パッド４０４，４０５と、連結流路１１６，１１７を閉状態で維持可能な連結パッド４０６，４０７とを備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸を含む試料の投入から、核酸増幅およびその他の必要な処理と目標核酸の検出までを一貫して自動的に処理するのに用いられる閉鎖型の核酸検出カセット、核酸検出装置およびそれを用いた核酸検出システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅技術の登場と核酸検出技術の向上により、特定ＤＮＡストランドの検出の実施が増加している。しかしながら、核酸増幅においては増幅した核酸による汚染の可能性、あるいは温度条件、注液、混合等の複雑な操作が必要なため、これらの技術の実施は試験研究用に限られてきた。
【０００３】
従来、こうした問題点を解決し、病院、臨床試験所、検疫所等で核酸検出を実施できるようにするため、核酸を含む試料の処理から目標核酸の検出までを一貫して自動的に処理する、使い捨て可能な閉鎖型検出容器およびそれを用いた検出装置が開示されてきた。
【０００４】
例えば、特許２５３６９４５号公報（特許文献１）には必要なすべての試薬を収納する核酸の増幅および検出用のキュベット（ｃｕｖｅｔｔｅ）が、特開平８-６２２２５号公報（特許文献２）には遠心力を利用して送液する試験ユニットが、特表平９-５１１４０７号公報（特許文献３）には微細加工技術を使用して固体基板に形成された微細流路および反応室が開示されている。
【特許文献１】特許２５３６９４５号公報
【特許文献２】特開平８-６２２２５号公報
【特許文献３】特表平９-５１１４０７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
（１）気泡の悪影響
核酸増幅から検査までの一連の過程を一貫して実施可能な流路構造において、液体内に気泡が取り込まれると以下のような悪影響が発生する。
【０００６】
１）ＰＣＲおよび加熱過程において、気泡内に水分が蒸発することにより試薬濃度の増加をもたらし、反応の阻害要因となる。
【０００７】
２）気泡、気体部分があると気体の熱膨張率が大きいので、容器内圧力の上昇につながり、液漏れ、汚染の原因となる。
【０００８】
３）気泡、気体部分があると熱伝導率が小さいので熱伝達を阻害する。
４）加圧・吸引による送液時に、気泡があると気泡の体積が変化するので送液困難となる。
【０００９】
（２）特許文献１の問題点（特許２５３６９４５号公報）
特許２５３６９４５号公報には、パウチ型のキュベットを利用した核酸増幅から検査までの一連の過程を一貫して実施可能な流路構造が示されている。しかしながらパウチ型のキュベットでは、形状が不安定で、注液時に気泡の混入が避けられない。また送液には、キュベット内に複数のピストンを必要とする実施例が示されているが、これでは、使い捨てに対して望ましくない。
【００１０】
（３）特許文献２の問題点（特開平８-６２２２５号公報）
特開平８-６２２２５号公報には、遠心力を利用した核酸増幅から検査までの一連の過程を一貫して実施可能な流路構造が示されている。遠心力を利用すれば、気相と液相とを分離でき気泡を除去できるが、装置の複雑化、大型化からまぬがれない。さらに、遠心力と逆方向への送液ができない。したがって液体の往復動ができず、試薬混合、検出での洗浄が困難になる。
【００１１】
（４）特許文献３の問題点（特表平９-５１１４０７号公報）
特表平９-５１１４０７号公報には、固定基板上の微細流路利用した、核酸増幅から検査までの一連の過程を一貫して実施可能な流路構造が示されている。しかしながら、初期的に気体で充填されている流路内に、気泡を巻き込まずに流路内に試薬の注入する方法については開示されていない。また送液に関しては、全流路の端部に位置する入出力ポートからの加圧・吸引による送液方法が開示されているが、気泡があると気体の体積が変動する可能性があるので、実施に際しては制御が困難である。さらに、細く長い流路の端部での、圧力による液体の移動制御は流体の移動時の抵抗が大きくなり制御困難である。
【００１２】
（５）閉鎖系での試薬混合
オペレータによる反応の実施においては、試薬の混合は公知の加振器等で行なわれてきたが、このとき試薬を保持するチューブには液層と気層が存在しているので、振動によって気泡が液体中に多数取り込まれる。このため、混合の後には遠心分離機を用いて、チューブ内を液層と気層の２つに分離する必要があった。ところが、これまでの技術では、特開平８-６２２２５号公報に示されるような、遠心力利用の自動検出装置以外では、使い捨て可能な閉鎖型検出容器において、気泡を巻き込まずに試薬を混合する有効な方法が開示されていない。
【００１３】
（６）流体の移動制御が容易な流路
特開平８-６２２２５号公報に示されるような、遠心力利用の自動検出装置以外では、送液、混合のため、長く曲がりくねった複雑な流路構造のみが開示され、流体の移動制御が容易な流路を構成する技術は開示されていない。
【００１４】
本発明は上記課題を解決するためになされたもので、その目的とするところは、核酸増幅およびその他の必要な処理と目標核酸の検出までを一貫して自動的に処理するのに用いられる閉鎖型の核酸検出カセット、核酸検出装置およびそれを用いた核酸検出システムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明のある観点によれば、試料に含まれる核酸を検出するために固定部材と可撓性部材との組合せにより流路が構成された核酸検出カセットであって、前記流路は、容積が可変で試薬を保持可能でかつ前記核酸検出カセット外部と連通可能な開状態と閉鎖可能な閉状態を選択可能な出入口孔を有する保持流路と、この保持流路に接続され保持流路と連通可能な開状態と閉鎖可能な閉状態を選択可能な連結流路とを備え、前記核酸検出カセットは、前記出入口孔を閉状態で維持可能な出入口開閉手段と、前記連結流路を閉状態で維持可能な連結流路開閉手段と、を備えることを特徴とする核酸検出カセットが提供される。
【００１６】
また、本発明の別の観点によれば、上記核酸検出カセットと、この核酸検出カセットの保持流路内に充填された試薬と、前記核酸検出カセットの検出流路内に固定化され、検出対象の核酸に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブとを具備してなることを特徴とする核酸検出装置が提供される。
【００１７】
本発明のさらに別の観点によれば、記載の核酸検出カセットと、この核酸検出カセットを保持するカセット保持手段と、このカセット保持手段により保持された前記核酸検出カセット内の前記保持流路の第１の領域に対して前記可撓性部材を変形させて前記保持流路を変形させる第１の駆動機構と、前記カセット保持手段により保持された前記核酸検出カセット内の前記保持流路の第２の領域に対して前記可撓性部材を変形させて前記保持流路を変形させる第２の駆動機構と、前記連結流路開閉手段を駆動する連結流路開閉駆動機構と、前記保持流路及びまたは前記検出流路の温度を制御する温度制御手段と、を具備してなることを特徴とする核酸検出システムが提供される。
【００１８】
また、装置あるいはシステムに係る本発明は、その装置あるいはシステムにより実現される方法の発明としても成立する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、液体内に気泡が取り込まれることがなく、核酸増幅およびその他の必要な処理と目標核酸の検出までを一貫して自動的に処理することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態を説明する。
【００２１】
（第１実施形態）
（１）カセット基本構造
図１は本発明の第１実施形態に係る核酸検出カセット１００の概観斜視図である。この核酸検出カセット１００は、大別して固定基板１と、可撓性シート２と、カバープレート３からなる流路閉鎖型のカセットである。固定基板１は固定部材により構成され、連続している流路を形成する。可撓性シート２は、固定基板１により形成された流路の上面を覆うもので、可撓性部材により構成されている。カバープレート３は、固定基板１との間に可撓性シート２を挟んで支持するとともに、可撓性シート２を局部的に押圧し変形させる押圧ブロック４を備えている。
【００２２】
固定基板１は、ポリプロピレン、ポリカーボネイト、ＰＯＭ、ＰＭＭＡ等の高分子材料、シリコン、ガラスやセラミックスなど、あるいはステンレス、アルミなどの金属により構成される。可撓性シート２は、シリコーンゴム、ポリプロピレンゴム、ウレタンゴム等の高分子エラストマーなどにより構成される。カバープレート３は、ポリプロピレン、ポリカーボネイト、ＰＯＭ、ＰＭＭＡ等の高分子材料あるいは、シリコン、ステンレス、アルミ等の金属などにより構成される。固定基板１、可撓性シート２及びカバープレート３が複数の部品から構成される場合には、それぞれ別の材料を選択してもよい。
【００２３】
また、核酸検出カセット１００はその機能によりブロック化されている。図１の例では、上流側、すなわち図１の左側から順に、端部ブロック１０２と、２つの中間部ブロック１０１と、検出部ブロック１０６と、中間部ブロック１０１と、端部ブロック１０３からなる。検出部ブロック１０６は特に核酸検出用のブロックであり、それ以外の端部ブロック１０２、１０３及び中間部ブロック１０１は、核酸検出以外の各種反応用のブロックである。これら各ブロックはその表面に設けられた流路が連結されるように互いに接合されている。各ブロックの接合は、不図示の締結部材や締結部によりなされる。あるいは、各ブロックを統合して一体的に形成される。
【００２４】
図２は図１に示す核酸検出カセット１００の各構成を分離して示した斜視図である。
【００２５】
固定基板１の上面には溝が設けられている。この溝を覆うように、固定基板１の上面に可撓性シート２の下面が接着あるいは溶着されることにより、溝が閉鎖された流路として機能する。すなわち、底面及び側面は固定基板１により構成され、上面は可撓性シート２で覆われた流路が形成される。端部ブロック１０２、中間部ブロック１０１上に設けられた溝は保持流路１１１として、検出部ブロック１０６上に設けられた溝は退避流路１３１として機能する。各保持流路１１１及び退避流路１３１の間は互いに流路により連結される。可撓性シート２の上面には、カバープレート３の下面が接着あるいは溶着される。これにより、カバープレート３の上面に設けられた押圧ブロック４の押圧により、対応する押圧部分の可撓性シート２を撓ませ流路を閉じることができる。
【００２６】
検出部ブロック１０６の下面には、検出用の流路が設けられた検出流路シール５２０を挟んで核酸検出チップ５００が固定化される。また、検出部ブロック１０６には、その表面から裏面まで貫通して形成された接点部開口１５１が２つ設けられている。この接点部開口１５１に電気コネクタを挿入して露出した核酸検出チップ５００の表面に接触させることにより、チップ表面から電気信号を取り出すことができる。
【００２７】
（２）流路及び押圧機構
次に、図３〜図２８を用いて、押圧ブロック４により可撓性シート２を変形させ、流路の所要部分の容積を可変させるための構造及び動作について説明する。
【００２８】
（２）−１ 中間部ブロック１０１
図３は中間部ブロック１０１を他のブロックから切断して部分的に示した斜視図である。図３に示すように、ほぼ長方形の保持流路１１１の流路開始端部と流路終了端部には、出入流路１１４及び１１５がそれぞれ接続されている。これら出入流路１１４及び１１５は、試薬および核酸を含む試料を核酸検出カセット１００内に注入し、あるいは核酸検出カセット１００外に排出するのに用いられる。また、流路開始端部にはさらに連結流路１１６が、流路終了端部にはさらに連結流路１１７が接続されている。これら連結流路１１６及び１１７は、中間部ブロック１０１の周縁まで延びており、隣接して結合される他のブロックに設けられた流路と連結可能に構成されている。これら連結流路１１６、保持流路１１１、連結流路１１７の順に連結した流路が構成される。すなわち、これら連結流路１１６及び１１７の一方を通じて、他のブロックからの液体や気体（以下、単に流体と呼ぶ）を受け入れて保持流路１１１に送り込み、かつ連結流路１１６及び１１７の他方を通じて、他のブロックに保持流路１１１内の流体を送り出すことができる。
【００２９】
（２）−２ 端部ブロック１０２、１０３及び検出部ブロック１０６
図４は中間部ブロック１０１、端部ブロック１０２、１０３及び検出部ブロック１０６の詳細を示す斜視図である。
【００３０】
端部ブロック１０２は、ほぼ長方形の保持流路１１１を備える点、保持流路１１１の流路開始端部及び流路終了端部に出入流路１１４及び１１５が接続される点、流路終了端部にはさらに連結流路１１７が接続されている点で中間部ブロック１０１と共通する。端部ブロック１０２の場合、中間部ブロック１０１と異なり、流路開始端部には連結流路が設けられていない。
【００３１】
検出部ブロック１０６には、保持流路１１１の代わりにほぼ長方形の退避流路１３１が設けられている。退避流路１３１の構成は保持流路１１１と同じでよい。退避流路１３１の流路開始端部及び流路終了端部にはそれぞれ連結流路１１６及び１１７が接続されている。出入流路は設けられていない。また、連結流路１１６にはさらに流路１１８が接続され、連結流路１１７にはさらに流路１１９が接続されている。これら流路１１８及び１１９は、さらに検出部ブロック１０６の裏面まで貫通形成された後述の左導入流路１２６及び右導入流路１２７に接続されている。この不図示の左導入流路１２６及び右導入流路１２７を介して、検出部ブロック１０６の裏面に設けられる検出流路と流路１１８及び１１９が接続され、流体が退避流路１３１と検出流路を行き来することができるようになっている。
【００３２】
また、端部ブロック１０３は、ほぼ長方形の保持流路１１１を備える点、保持流路１１１の流路開始端部及び流路終了端部に出入流路１１４及び１１５が接続される点、流路開始端部にはさらに連結流路１１６が接続されている点で中間部ブロック１０１と共通する。端部ブロック１０３の場合、中間部ブロック１０１と異なり、流路終了端部には連結流路が設けられていない。
【００３３】
（２）−３ 流路主要寸法形状例
上記図３及び図４に示される各構成の寸法例は以下の通りである。
【００３４】
保持流路１１１及び退避流路１３１の寸法は、深さ約０．５ｍｍ、隣接流路に向かう方向の長さ、すなわち流路開始端部と流路終了端部との間の長さ約１０ｍｍ、隣接流路に向かう方向とは垂直な方向の長さ、すなわち流路幅約１０ｍｍ、で、標準保持容積約４０μｌである。押圧ブロック４が外側に開く場合には、可撓性シート２は外側に膨張することができ、例えば標準保持容積の約２〜３倍の保持容積を維持することができる。なお、退避流路１３１の容積は、核酸検出動作開始前は縮小された状態で維持され、検出動作開始時には拡大可能であり、その拡大時と縮小時の流路容積の差は検出流路内の充填物の体積以上に設定される。
【００３５】
出入流路１１４、１１５の寸法は、深さ約０．２５ｍｍ、保持流路に向かう方向の長さ約２〜３ｍｍ、保持流路に向かう方向とは垂直な方向の長さ、すなわち流路幅約２ｍｍで、流路容積がほぼゼロの全閉状態が設定可能である。
【００３６】
連結流路１１６、１１７の寸法は、深さ約０．２５ｍｍ、隣接流路に向かう方向の長さ約２〜６ｍｍ、保持流路に向かう方向とは垂直な方向の長さ、すなわち流路幅約２ｍｍで、流路容積がほぼゼロの全閉状態が設定可能である。
【００３７】
また、可撓性シート２が撓む際に無理な内部応力等が発生せずに、かつ流路底面に対して確実に密着して流路容積がほぼゼロになるように設定可能なように、流路断面の底面から側面にかけていずれも滑らかな曲線で構成されている。
【００３８】
可撓性シート２の厚さは０．２〜０．５ｍｍで、ゴム硬度ＪＩＳ−Ａ２０°〜３０°、アスカーＣ２０°〜４０°の比較的硬度の高いものと、硬度の低い柔らかいもののいずれも使用可能である。
【００３９】
（２）−４ 押圧パッド
図３にはさらに、可撓性シート２と押圧部材すなわち押圧ブロック４が固定基板１へ接着される前の分離した状態で示されている。なお、説明の便宜のため、図３では押圧ブロック４の一部としてパッドのみを示している。可撓性シート２及び押圧ブロック４は、他のブロック上に設けられるものから切断して部分的に示してある。中間部ブロック１０１には、保持流路１１１、出入流路１１４及び１１５、連結流路１１６及び１１７が設けられている。可撓性シート２はこれら各流路開口面を覆い閉鎖流路を形成する。また、この可撓性シート２上には複数のパッドが配置される。
【００４０】
保持流路１１１の上部で可撓性シート２上には、中央パッド４０１、左翼パッド４０２及び右翼パッド４０３が配置される。左翼パッド４０２及び右翼パッド４０３はそれぞれ保持流路１１１の流路開始端部と流路終了端部の上部とその近傍に位置する。中央パッド４０１は、流路幅が広がった部分でかつ左翼パッド４０２及び右翼パッド４０３に接する部分に位置する。これらパッド４０１，４０２及び４０３により保持流路１１１の上部がほぼ覆われる。本実施形態では、左翼パッド４０２及び右翼パッド４０３はほぼ同面積で、中央パッド４０１は左翼パッド４０２及び右翼パッド４０３の面積をあわせた程度に設定されている。
【００４１】
出入流路１１４及び１１５の上部には、それぞれ左出入パッド４０４及び右出入パッド４０５が配置されている。
【００４２】
連結流路１１６および１１７の上部には、それぞれ左連結パッド４０６及び右連結パッド４０７が配置されている。
【００４３】
これら各パッドは、可撓性シート２表面側から固定基板１側に向けてほぼ垂直に押圧されることにより、対応する固定基板１の溝に可撓性シート２が密着して容積がほぼゼロになるような形状をなす。
【００４４】
（２）−５ 流路断面メカニズム
（２）−５−１ Ａ−Ａ断面
図５は図３の中間部ブロック１０１をＡ−Ａ部分で切断した要部断面図であり、出入口部の構成を詳細に示すものである。図５（ａ）は開状態、図５（ｂ）は閉状態を示す図である。出入流路１１４及び１１５の底面の一部には、開口部１２１及び１２２が連結されている。この開口部１２１及び１２２は固定基板１の裏面まで貫通して形成されており、試薬などを外部から注入することができる。
【００４５】
図５（ａ）に示すように、左出入パッド４０４及び右出入パッド４０５が可撓性シート２に対して押し込まれていない状態では、出入流路１１４及び１１５と、開口部１２１及び１２２とにより、核酸検出カセット１００の外部と流路内部で試薬などの流体の移動が可能である。これに対して、図５（ｂ）に示すように、左出入パッド４０４及び右出入パッド４０５が外部駆動力により可撓性シート２に対して同図矢印に示す方向に押し込まれている状態では、可撓性シート２が変形し、出入流路１１４及び１１５の流れを閉鎖し、核酸検出カセット１００の外部と流路内部が隔絶される。
【００４６】
（２）−５−２ Ｂ−Ｂ断面
図６は図３の中間部ブロック１０１をＢ−Ｂ部分で切断した要部断面図であり、連結流路１１２及び１１３近傍の構造を詳細に示すものである。図６（ａ）は開状態、図６（ｂ）は半開半閉状態、図６（ｃ）は閉状態を示す図である。
【００４７】
図６（ａ）に示すように、左翼パッド４０２および右翼パッド４０３が可撓性シート２に対して押し込まれていない状態では、保持流路１１１底面と可撓性シート２とで形成される空間で流体の保持が可能である。図６（ｂ）に示すように、左翼パッド４０２が不図示の外部駆動力により押し込まれ右翼パッド４０３が押し込まれていない状態では、可撓性シート２が変形し、保持流路１１１の左側部分の流路開始端部近傍を閉鎖することが可能である。このとき保持流路１１１底面と可撓性シート２とで形成される流路容積は図６（ａ）の場合のおよそ１／２になる。また、右翼パッド４０３のみが押し込まれている状態も同様である。図６（ｃ）に示すように、さらに右翼パッド４０３が不図示の外部駆動力により押し込まれている状態では、可撓性シート２が変形し、さらに保持流路１１１の右側部分の流路終了端部近傍を閉鎖することが可能である。このとき保持流路１１１底面と可撓性シート２とで形成される連結流路１１２及び１１３近傍の流路容積を、ほぼゼロにし、保持流路１１１全体の流路容積をおよそ１／４とすることができる。
【００４８】
（２）−５−３ Ｃ−Ｃ断面
図７は図３の中間部ブロック１０１をＣ−Ｃ部分で切断した要部断面図であり、連結流路１１２及び１１３から離れた部分の構造を詳細に示すものである。図７（ａ）は開状態、図７（ｂ）は閉状態を示す図である。図７（ａ）に示すように、中央パッド４０１が可撓性シート２に対して押し込まれていない状態では、保持流路１１１底面と可撓性シート２とで形成される空間で流体の保持が可能である。図７（ｂ）に示すように、中央パッド４０１が不図示の外部駆動力により同図矢印に示す方向に押し込まれている状態では、可撓性シート２が変形し、保持流路１１１は閉鎖される。このとき保持流路１１１底面と可撓性シート２とで形成される連結流路１１２及び１１３から離れた部分の流路容積を、ほぼゼロにし、保持流路１１１全体の流路容積をおよそ１／４とすることができる。
【００４９】
（２）−５−４ Ｄ−Ｄ断面
図８は図３の中間部ブロック１０１をＤ−Ｄ部分で切断した要部断面図であり、連結流路１１７の構造を詳細に示すものである。図８（ａ）は開状態、図８（ｂ）は閉状態を示す図である。図８（ａ）に示すように、右連結パッド４０７が可撓性シート２に対して押し込まれていない状態では、連結流路１１７底面と可撓性シート２とで形成される空間で流体の保持が可能である。図８（ｂ）に示すように、右連結パッド４０７が不図示の外部駆動力により同図矢印に示す方向に押し込まれている状態では、可撓性シート２が変形し、連結流路１１３が閉鎖される。このとき連結流路１１７底面と可撓性シート２とで形成される流路容積を、ほぼゼロにすることができる。また、連結流路１１６についても同様に流路容積を変えることができる。
【００５０】
なお、退避流路１３１についても、図６〜図８で説明した保持流路１１１と同様に、流路容積を変えることができる。
【００５１】
（２）−６ 押圧ブロック４の開閉機構
（２）−６−１ 押圧ブロック基本構造
次に、図９〜図２８を用いて、押圧ブロック４とカバープレート３の各部の連動で動作する、押圧ブロック４の開閉機構について中間部ブロック１０１を例にとり説明する。
【００５２】
押圧パッド４０１〜４０８の移動および固定には各種の方法が適応可能だが、以下で説明するように本実施形態では１つの支点を有する可動ロッドと、可動ロッドの端部を一時固定するロック部を採用する。
【００５３】
図９〜図１６は、押圧ブロック４の詳細構成を示す斜視図であり、各々の図が各構成の開閉状態に対応している。図１７は、図９〜図１６に示した押圧ブロック４の各構成を分解して示した斜視図である。
【００５４】
図１７に示すように、可動ロッドとして中央ロッド４１１、左翼ロッド４１２、右翼ロッド４１３、可動ロッド４１４及び４１５、可動ロッド４１６及び４１７が設けられている。これら各可動ロッド４１１〜４１７には、それぞれ中央パッド４０１、左翼パッド４０２、右翼パッド４０３、左出入パッド４０４、右出入パッド４０５、左連結パッド４０６及び右連結パッド４０７が一体的に形成されている。
【００５５】
図９〜図１６は押圧ブロック４を種々開閉し、あるいは省略した中間部ブロック１０１の斜視図である。図９は、すべてのロッド４１１〜４１７を閉じた状態を示している。図１０は、すべてのロッド４１１〜４１７を省略して示している。図１１は、ロッド４１４及び４１５のみを閉じ、他のロッド４１１〜４１３、４１６及び４１７を省略した状態を示している。図１２は、ロッド４１６及び４１７のみを閉じ、他のロッド４１１〜４１５を省略した状態を示している。図１３は、中央ロッド４１１のみを閉じ、他のロッド４１２〜４１７を省略した状態を示している。図１４は、左翼ロッド４１２のみを閉じ、他のロッド４１１、４１３、４１４〜４１７を省略した状態を示している。図１５は、右翼ロッド４１３のみを閉じ、他のロッド４１１、４１２、４１４〜４１７を省略した状態を示している。図１６は、中央ロッド４１１、左翼ロッド４１２、右翼ロッド４１３のみを閉じ、他のロッド４１４〜４１７を省略した状態を示している。
【００５６】
可動ロッド４１１〜４１７の固定方法は大別して２つあり、１つは、押圧固定した状態を保持するために爪状部材をロック部に設けられた凹部にはめ込みロッドを押し下げ固定する方法であり、可動ロッド４１１〜４１３、４１６及び４１７が該当する。もう１つは、押圧固定した状態を保持するためにロック部をロッドとカバープレート３との間に挿入しロッドを持ち上げ固定する方法であり、可動ロッド４１４及び４１５が該当する。
【００５７】
押し下げ固定手法による可動ロッドは支点部、棒状部材、爪状部材及びパッドが一体的に形成された構成をなす。また、ロック部は、爪状部材と凹部とを備える。図１７に示すように、各可動ロッド４１１〜４１３、４１６及び４１７の一端にはそれぞれ支点部４５１、４６１、４７１、４８１及び４９１が設けられている。そして、これら支点部４５１、４６１、４７１、４８１及び４９１には棒状部材４５２、４６２、４７２、４８２及び４９２が取り付けられている。棒状部材４５２、４６２、４７２、４８２及び４９２の先端には、それぞれ爪状部材４５３、４６３、４７３、４８３及び４９３が設けられ、その中途の部分には、それぞれパッド４０１、４０２、４０３、４０６及び４０７が固定されている。
【００５８】
支点部４５１、４６１、４７１、４８１及び４９１はいずれも、カバープレート３に固定された一連の後方支点部４４６に可動可能に取り付けられている。より具体的には、後方支点部４４６の各孔と、支点部４５１、４６１、４７１、４８１及び４９１の孔に不図示の固定バーを通すことにより、可動ロッド４１１〜４１３、４１６及び４１７が支点部４５１、４６１、４７１、４８１及び４９１を中心として、可動範囲で回動可能である。
【００５９】
可動ロッド４１１〜４１３、４１６及び４１７は、カバープレート３に形成されたロック部４３１、４３２、４３３、４３６及び４３７で、それぞれ対応する流路部分を閉鎖状態で維持できる。すなわち、各ロッドに設けられた爪状部材４５３、４６３、４７３、４８３及び４９３をそれぞれロック部４３１、４３２、４３３、４３６及び４３７の凹部にはめこみ固定することで、各ロッドは押し下がった状態に保持され対応する流路を閉鎖できる。
【００６０】
ロック部４３１、４３２、４３３、４３６及び４３７は、それぞれ核酸検出カセット１００の外部からの駆動力でその爪状部材部分が弾性的に撓み、各可動ロッド４１１、４１２、４１３、４１６及び４１７を個別に開放する。このとき可撓性シート２は自己の弾性力で撓む前の元の状態に復帰し、対応する流路部分が開放される。ただし、外部からの駆動力により、開放速度にブレーキをかけ規制することは可能である。
【００６１】
なお、退避流路１３１の各流路に対しても同様のメカニズムで閉鎖、開放が可能である。
【００６２】
持ち上げ固定手法による可動ロッドは、棒状部材、支点及びパッドが一体的に形成された構成をなす。また、ロック部は、爪状部材と凹部とを備える。各可動ロッド４１４及び４１５の棒状部材４１４ａ及び４１５ａの一端には、出入パッド４０４及び４０５がそれぞれ固定される。また、棒状部材４１４ａ及び４１５ａの中途の部分には支点部４１４ｂ及び４１５ｂがそれぞれ設けられている。
【００６３】
支点部４１４ｂ及び４１５ｂはいずれも、カバープレート３に固定された一連の前方支点部４４４ａ及び４４４ｂに可動可能に取り付けられている。より具体的には、前方支点部４４４ａ及び４４４ｂの各孔と、支点部４１４ｂ及び４１５ｂの孔に不図示の固定バーを通すことにより、可動ロッド４１４及び４１５が支点部４１４ｂ及び４１５ｂを中心として可動範囲で回動可能である。
【００６４】
可動ロッド４１４及び４１５は、それぞれカバープレート３に形成されたロック部４３４及び４３５で、出入流路１１４及び１１５を閉鎖状態に維持できる。より具体的には、ロック部４３４及び４３５を可動ロッド４１４及び４１５とカバープレート３との間に挿入すればよい。ロック部４３４は、カセット１００の外部からの駆動力でその爪状部材部分が弾性的に撓み、可動ロッド４１４を開放し、出入流路１１４を開放する。このとき可撓性シート２は自己の弾性力で元の状態に復帰する。出入流路１１５に対する右出入パッド４０５に対しても同様のメカニズムで閉鎖状態維持、開放が可能である。
【００６５】
（２）−６−２ 保持流路１１１及び退避流路１３１
次に、図１８〜図２４を用いて保持流路１１１及び退避流路１３１の開閉動作の詳細を説明する。
【００６６】
保持流路１１１および退避流路１３１は、中央ロッド４１１、左翼ロッド４１２、右翼ロッド４１３を個別に駆動させることにより、様々な種類の流路容積パターンが実施可能である。
【００６７】
以下、図１８（ａ）〜（ｄ）の断面図、図１９〜図２４の切断部分斜視図を使用して、全閉状態から全開状態までの各種パターンの例を示す。
【００６８】
図１８（ａ）、図１９は、中央ロッド４１１、左翼ロッド４１２及び右翼ロッド４１３がそれぞれロック部４３１、４３２及び４３３によってロックされ、保持流路１１１が全閉状態で維持されている状態を示している。この状態から、図２０に示すように、右翼ロッド４１３のみを開放することも可能で、このとき保持流路１１１は、流路終了端部近傍が半開放状態となる。なお、図２０では左翼ロッド４１２は省略してある。さらに、図１８（ｂ）、図２１に示すように、左翼ロッド４１２、右翼ロッド４１３の両方を開放すると、保持流路１１１は前方、すなわち流路開始端部及び流路終了端部に近い部分が半開放状態となる。一方、図１８（ｃ）、図２２に示すように、中央ロッド４１１のみを開放すると、保持流路１１１は後方、すなわち流路開始端部及び流路終了端部から離れた部分が半開放状態となる。なお、図２２では左翼ロッド４１２及び右翼ロッド４１３は省略してある。図１８（ｄ）、図２３は、中央ロッド４１１、左翼ロッド４１２、右翼ロッド４１３のすべてを開放し、保持流路１１１が全開状態で維持されている状態を示している。なお、図２４は、中央ロッド４１１、左翼ロッド４１２、右翼ロッド４１３をさらに開放し、パッド形成面を示してある。
【００６９】
（２）−６−３ 連結流路１１６及び１１７
図２５（ａ）は、可動ロッド４１６がロック部４３６によってロックされ、連結流路１１６が全閉状態で維持されている状態を示している。この状態でロックを外すと図２５（ｂ）のようになる。すなわち、図２５（ｂ）は、外部駆動力によってロック部４３６が変形し、可動ロッド４１６がロック部４３６から開放され、連結流路１１２が全開状態で維持されている状態を示している。
【００７０】
なお、連結流路１１７についても同様に開閉が制御できる。
【００７１】
（２）−６−４ 出入流路１１４及び１１５
図２６（ａ）は、可動ロッド４１４がロック部４３４によってロックされ、出入流路１１４が全閉状態で維持されている状態を示している。より具体的には、ロック部４３４が可動ロッド４１４とカバープレート３との間に挿入されているため、可動ロッド４１４のパッドが形成されている側と支点部４１４ｂを挟んで反対側の部分を押し上げる力が働く。これに対応して、支点部４１４ｂを挟んで反対側の左出入パッド４０４は押し下がり、全閉状態が維持される。
【００７２】
図２６（ｂ）は、外部駆動力によってロック部４３４が変形し、可動ロッド４１４がロック部４３４から開放され、出入流路１１４が全開状態で維持されている状態を示している。ロック部４３４の変形は、例えば同図矢印で示す方向にロック部４３４を引き抜くことで、ロック部４３４の押し上げ力が無くなる。これに対応して、支点部４１４ｂを挟んで反対側の左出入パッド４０４は押し上がり、可撓性シート２の復元力により全開状態が維持される。
【００７３】
（３）流体移動制御方法
これまで述べてきた流路およびその容積を可変する押圧機構を使用して、流路内を移動する流体制御方法について説明する。
【００７４】
（３）−１ 試薬・試料注入
（３）−１−１ 試薬送液
保持流路１１１に試薬を注入するためには、核酸検出カセット１００の裏面に設けられた開口部１２１及び１２２を利用する。
【００７５】
図２７は試薬送液の工程を模式的に示す図である。図２７は、可変容積型の保持流路１１１を模式的に示している。また、図２８は、この試薬送液の工程に沿った保持流路１１１の断面図を模式的に示している。
【００７６】
同図の出入バルブ３１４及び３１５は、出入流路１１４及び１１５、出入パッド４０４及び４０５と可撓性シート２とを組み合わせて、その機能を表現する構成として模式的に示したものである。
【００７７】
連結バルブ３１６及び３１７は、連結流路１１６及び１１７、連結パッド４０６及び４０7と可撓性シート２と組み合わせて、その機能を表現する構成として模式的に示したものである。
【００７８】
容積が可変する保持流路１１１は、その容積の平面形状が模式的に示される。なお、図２７では示していないが退避流路１３１についても同様に示される。
【００７９】
ａ．初期流路容積設定
まず、図２７（ａ）に示すように、連結バルブ３１６及び３１７を閉じたままで、出入バルブ３１４及び３１５を開く。次に、中央パッド４０１を押し込み、保持流路１１１の幅を狭くし流路容積を初期状態に必要な大きさに設定する。このとき保持流路１１１内部の気体３０４は、出入バルブ３１４及び３１５を通って開口部１２１及び１２２から、可変した容積に対応した量の流体が保持流路１１１外に排出される。このときの保持流路１１１要部断面は図２８（ａ）に示される。
【００８０】
ｂ．試薬注液開始
上記ａ．の工程で保持流路１１１の初期容積が定まると、試薬送液が開始される。図２９は開口部１２１及び１２２の要部断面図である。図２９（ａ）は試薬送液時の断面を示す図である。図２９（ａ）に示すように、開口部１２１及び１２２が保持流路１１１に対して上側になるように核酸検出カセット１００を配置する。そして、注入すべき試薬３０３の容量よりわずかに多い量が充填されたピペット３００の先端チップ３０１を開口部１２１に挿入する。同時に、試薬を充填したピペット３００を挿入した側とは反対側の開口部１２２に、試薬が充填されず外部に開放された先端チップ３０２を挿入する。図２９（ｂ）はこれらピペット３００及び先端チップ３０２の挿入時の開口部１２１及び１２２の要部断面を示している。
【００８１】
次に、図２７（ｂ）に示すように、先端チップ３０１から試薬３０３を注入する、このとき保持流路１１１の幅が狭いので、液体である試薬３０３と流路内に充満している気体３０４との界面は、表面張力によって１つの曲面を維持できる。したがって、気体３０４を試薬液体内に巻き込むことなしに、確実に試薬３０３を保持流路１１１内に充填することができる。
【００８２】
ｃ．試薬注液終了
図２７（ｃ）に示すように、気体出口側の先端チップ３０２内に試薬３０３が到達するまで、試薬３０３を注液する。このときの試薬量が所定の値であれば、注液を終了し「出入バルブ閉鎖」工程に移行する。あるいは、試薬量が保持流路１１１の最大容積である場合には次の「試薬補充注液」工程に移行する。
【００８３】
このときの保持流路１１１要部断面は図２８（ｂ）に示される。
【００８４】
ｄ．試薬補充注液
図２７（ｄ）に示すように、気体出口側の出入バルブ３１５を閉じ、中央パッド４０１を開放し、試薬３０３をさらに注液する。中央パッド４０１を開放したときは、保持流路１１１内はわずかに負圧となるが、ピペット３００内には十分な試薬の量があるので気体を試薬液体内に巻き込むことはない。このときの保持流路１１１の要部断面は図２８（ｃ）に示される。
【００８５】
液体入口側の先端チップ３０１内に試薬３０３がわずかに残るまでさらに試薬３０３を注液し、保持流路１１１内がわずかに加圧側になるまで試薬３０３を押し込む。次に先端チップ３０１の開口部１２１と反対側を外気圧と同一にし、先端チップ３０１内の試薬３０３量が少し増加するのを確認する。このとき保持流路１１１内が負圧で、先端チップ３０１内の試薬３０３が保持流路１１１内にわずかに吸い込まれたとしても、先端チップ３０１内に試薬３０３が残っていれば気体を試薬液体内に巻き込むことはない。
【００８６】
このときの保持流路１１１の要部断面は図２８（ｄ）に示される。
【００８７】
ｅ．出入バルブ閉鎖
最後に、図２７（ｅ）に示すように、出入バルブ３１４、３１５を閉じ、先端チップ３０１、３０２を開口部１２１、１２２から外す。
【００８８】
以上の工程により、試薬内に気体を巻き込むことなしに、２段階の設定量での保持流路１１１への試薬注入充填が可能になる。また、この試薬注入のとき、可撓性シート２の内側と外側は圧力が等しいため、可撓性シート２は所定の形状を維持しているので、充填量は常に一定となる。さらに、極端な負圧・加圧が液体に印加されていないので、保持流路１１１内への外部からの気体の侵入、あるいは流路内からの液漏れが発生しにくい。また、流路内には気体部分がないので、長期保存において試薬内に気体が溶け込むことも防止できる。
【００８９】
（３）−１−２ 試料注入
あらかじめ所定の量の試薬が充填されている保持流路１１１内に、新たに検査すべき核酸材料を含む液体試料３０５を注入する方法について説明する。
【００９０】
図３０は試料注入工程の模式図である。
【００９１】
ａ．試料注液開始
図３０（ａ）に示すように、連結バルブ３１６及び３１７は閉じたままで、出入バルブ３１４及び３１５を開く。
【００９２】
次に、開口部１２１及び１２２が上側になるように核酸検出カセット１００を配置し、注入すべき試料３０５が充填されたピペット３００の先端チップ３０１を開口部１２１に挿入する。同時に、反対側開口部１２２に外部に開放された先端チップ３０２を挿入する。これでカセットのセッティングが終了し、先端チップ３０１から試料３０５の注入を開始する。
【００９３】
ｂ．試料注液終了
図３０（ｂ）に示すように、出口側の先端チップ３０２内に試薬３０３が押し出されて到達するまで、試料３０５を注液する。
【００９４】
ｃ．出入バルブ閉鎖
最後に、図３０（ｃ）に示すように、出入バルブ３１４及び３１５を閉じ、先端チップ３０１及び３０２を開口部１２１及び１２２から外す。
【００９５】
試料３０５の試薬３０３に対する比重が重く、かつ試薬３０３に対する拡散速度が小さく、さらに重力の方向が、同図矢印に示すように保持流路１１１の中心から見て出入バルブ３１４及び３１５と反対側の場合には、図３０（ｃ）に示すように保持流路１１１の鉛直下側に試料３０５が沈降する。
【００９６】
以上の工程により、試料および試薬内に気体を巻き込むことなしに、あらかじめ所定の量の試薬が充填されている保持流路１１１への検査すべき核酸材料を含む試料の注入が可能になる。
【００９７】
（３）−２ 送液
注液工程を使用して試薬を注入された複数の保持流路１１１間での流体の移動方法について説明する。流体移動方法として、以下では一定量送液の場合と最大保持量送液との場合について説明する。ここでは、保持流路１１１ａと保持流路１１１ｂとの間での送液について説明する。
【００９８】
（３）−２−１ 一定量送液
一定量送液では、最大保持量を保持している保持流路１１１ａから最少量保持している保持流路１１１ｂに対して一定量を送液し、保持流路１１１ｂの液量がその最大保持量となるようにする。最少量保持は、前述の図２７（ｃ）に示された左翼パッド４０２及び右翼パッド４０３が開状態で、中央パッド４０１が閉状態の場合の容積であり、最大量は、左翼パッド４０２、右翼パッド４０３、中央パッド４０１がすべて開状態の場合の容積である。
【００９９】
以下一定量送液工程を順次説明する。
【０１００】
ａ．連結バルブ開
図３１（ａ）に示すように、保持流路１１１ａと保持流路１１１ｂ間の連結バルブ３１７を開状態にする。その他の連結バルブおよび出入バルブは閉状態のままにしておく。
【０１０１】
次に、保持流路１１１ａの中央パッド４０１ａをわずかに押し込み、連結バルブ３１７が完全に開くように加圧する。
【０１０２】
連結バルブ３１７を構成する可撓性シート２は連結流路１１７の底面に隙間なく押さえつけられている。したがって、連結流路１１７に対する可動ロッド４１７のロック部４３７を解除しても、可撓性シート２の弾性による回復力が弱い場合には、大気圧によってこの部分の可撓性シート２が底面に押さえつけられて、なかなか連結バルブ３１７が完全に開かない。このことへの対応として保持流路１１１ａの加圧が行われる。
【０１０３】
ｂ．送液開始
図３１（ｂ）に示すように、保持流路１１１ｂの中央パッド４０１ｂを開状態にした直後に、保持流路１１１ａの中央パッド４０１ａを押し込み、送液を開始する。
【０１０４】
このとき、保持流路１１１ａの中央パッド４０１ａを押し込む前において、保持流路１１１ｂと保持流路１１１ａの圧力が均衡するように、送液が開始してしまう場合もある。
【０１０５】
連結流路１１７を開く前に、保持流路１１１ｂの中央パッド４０１ｂを開状態にすることも可能である。しかしながらこの場合、保持流路１１１ｂに負圧がかかるので、連結流路１１７が開きにくくなる場合がある。
【０１０６】
ｃ．送液終了・連結バルブ閉
図３１（ｃ）に示すように、保持流路１１１ａ
の中央パッド４０１ａを全閉状態とし、次に連結流路１１７を全閉状態とする。このとき、連結流路１１７内のわずかな量の液体は保持流路１１１ａおよび保持流路１１１ｂ内に送液され、連結流路１１７内の液体はほぼ完全に排除される。
【０１０７】
以上の一定量送液工程では、保持流路のロック機構が一段である場合には、送液体積はおよそ、
送液体積Ｖｔ＝保持流路最大保持量Ｖｍａｘ−保持流路最小保持量Ｖｍｉｎ
の関係を満たしている。
【０１０８】
（３）−２−２ 最大保持量送液
最大保持量送液では、最大保持量を保持している保持流路１１１ａから全閉状態の保持流路１１１ｂに対して最大保持量の液体を送液し、保持流路１１１ｂの液量が保持流路の最大保持量となるようにする。
【０１０９】
全閉状態は、中央パッド４０１、左翼パッド４０２及び右翼パッド４０３がすべて閉状態の場合の容積である。可撓性シート２のゴム硬度が大きく、保持流路１１１と出入流路１１４及び１１５、連結流路１１６及び１１７の継ぎ目が滑らかに加工されていないと、全閉状態おいても保持流路１１１内に空隙が生じる可能性がある。しかし、保持流路１１１は最小保持量と最大保持量の間の液体もしくは流動体を、初期的に注入して使用するので、この空隙は液体もしくは流動体で満たされた残留液体もしくは残留流動体となり、保持流路１１１内に気泡が含まれることはない。
【０１１０】
以下最大保持量送液工程を順次説明する。
【０１１１】
ａ．連結バルブ開
図３２（ａ）に示すように、保持流路１１１ａと保持流路１１１ｂ間の連結バルブ３１７を開状態にする。その他の連結バルブおよび出入バルブは閉状態のままにしておく。
【０１１２】
次に保持流路１１１ａの中央パッド４０１ａをわずかに押し込み、連結バルブ３１７が完全に開くように加圧する。
【０１１３】
ｂ．送液開始
図３２（ｂ）に示すように、保持流路１１１ｂの中央パッド４０１ｂおよび左翼パッド４０２ｂを開状態にした直後に、保持流路１１１ａの中央パッド４０１ａを押し込み、送液を開始する。
【０１１４】
ｃ．送液中間段階
図３２（ｃ）に示すように、保持流路１１１ａの中央パッド４０１ａが全閉状態となった後、保持流路１１１ｂの右翼パッド４０３ｂを開状態とし、その後保持流路１１１ａの左翼パッド４０２ａの押し込みを開始する。これは、保持流路１１１ａ内部の液体が円滑に連結バルブ３１７の方向に向かうようにするためである。保持流路１１１ａの左翼パッド４０２ａと右翼パッド４０３ａを同時に押し込む場合には、加工精度や外部駆動力の位置精度の関係で、右翼パッド４０３ａが先に全閉状態となる場合がある。この場合、左翼パッド４０２ａ下のわずかな液体が連結バルブ３１７の方向に移動できなくなってしまう恐れがある。
【０１１５】
ｄ．送液終了・連結バルブ閉
図３２（ｄ）に示すように、左翼パッド４０２ａが全閉状態となった後、さらに右翼パッド４０３ａの押し込みを開始し、最終的に右翼パッド４０３ａも全閉状態とする。これで保持流路１１１ａの押圧パッドはすべてを全閉状態となるので、次に連結流路１１７を全閉状態とする。
【０１１６】
保持流路１１１ｂの最大保持量Ｖｍａｘは、
保持流路最大保持量Ｖｍａｘ＝保持流路全注入量Ｖｉ−保持流路残渣量Ｖｒ
の関係を満たしている。
【０１１７】
ｅ．送液の効果
以上のような送液方法により、
（ｉ）低圧力差で等容積の送液が可能である。
【０１１８】
各流路の容積は可変するが、流路全体の容積はほぼ一定である。また、可変する流路そのもの容積を変えて、送液に必要な圧力差を発生させている。このため、全流路の両端で圧力を印加して送液する方式に比べて、流路間の圧力差および外部の圧力差を小さくすることができ、液体のシール、送液制御が確実になる。
【０１１９】
（ｉｉ）連動送液が可能である。
【０１２０】
さらに送液側と授液側の保持流路の加圧パッドを連動させて駆動することも可能で、この場合送液側の加圧パッドの押込み速度と、授液側の加圧パッドの開放速度をほぼ同じにする。これにより、流路間の圧力差をおよび外部の圧力差を、さらに小さくすることができる。
【０１２１】
ｆ．連結部分の無気泡閉鎖
連結部分の無気泡閉鎖を確実にするために、予め保持流路注液時もしくはその前に、わずかな量の試薬を連結流路に導き、わずかな空隙でも液体で充填しておくことが可能である。この場合には、連結流路両側の保持流路でのそれぞれの反応に対して、両方に悪影響を及ぼさない液体であることが必要となる。
【０１２２】
（３）−３ 混合
核酸を含む試料の投入から、核酸増幅およびその他の必要な処理と目標核酸の検出までを一貫して処理する過程においては、複数の反応が必要とされている。本実施形態の流路系においては、例えば、
ａ．前の保持流路での反応の生成物を次の保持流路に移送する。
【０１２３】
ｂ．次の保持流路内に予め充填されている試薬と位相された前の生成物を混合し、次の保持流路内で試薬と前の生成物との混合を行う。
【０１２４】
ｃ．新たな生成物をさらに次の保持流路に移送する。
【０１２５】
というようにして、各種反応を逐次処理して連続工程を実現することができる。この逐次処理に必要な試薬の混合方法について以下、１流路内加圧移動、１流路内等圧移動及び２流路間往復移動の３種に分けて説明する。
【０１２６】
（３）−３−１ １流路内加圧移動
図３３（ａ）は流路系を模式的に示すもので、液体を保持流路１１１ａから保持流路１１１ｂに一定量送液し、保持流路１１１ａの中央パッド４０１ａが全閉状態となった後、連結バルブ３１７を全閉状態としたときを示している。送液量は本実施形態で示した寸法に従う場合には約３６μｌとなる。
【０１２７】
このとき、保持流路１１１ｂでは、予め保持流路１１１ｂ内に充填してあった試薬と、保持流路１１１ａから送液された反応生成物は既に混じり合っているが、均質になっていない場合がある。
【０１２８】
そこで、図３３（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の順に連続的に示すように、保持流路１１１ｂの左翼パッド４０２ｂ、右翼パッド４０３ｂ及び中央パッド４０１ｂを順次所定量押し込み、保持流路１１１ｂ内部で液体の移動を発生させる。さらに、押圧パッドの押し込み順序、速度、サイクル数／秒等を変えることで、保持流路１１１ｂ内部で試薬の反応生成物を均質に混合させることができる。
【０１２９】
この場合、保持流路１１１ｂは最大保持量まで液体を保持しているので、押圧パッド４０１ｂ、４０２ｂ及び４０３ｂの押し込み量が大きいと、保持流路１１１ｂの内部圧力が大きくなり、液洩れの原因となるので、押圧パッド４０１ｂ、４０２ｂ及び４０３ｂの押し込み量を調整する必要がある。これが１流路内加圧移動である。
【０１３０】
（３）−３−２ １流路内等圧移動
保持流路１１１ａから保持流路１１１ｂへ送液する場合に、保持流路１１１ｂの内部圧力をあまり大きくせずに保持流路１１１ｂ内部で液体の移動量を大きくするためには、以下で説明する工程により送液量を２段階にし、１流路内で等圧で液体を移動させることができる。
【０１３１】
ａ．初期送液
図３４（ａ）に示すように、保持流路１１１ａの左翼パッド４０２ａのみを押圧し、約２４μｌを送液する。
【０１３２】
ｂ．初期混合
約２４μｌを送液した後に、連結バルブ３１７を全閉状態にし、図３３（ｂ）〜（ｄ）に連続的に示すように、保持流路１１１ｂの左翼パッド４０２ｂ、右翼パッド４０３ｂ、中央パッド４０１ｂを順次所定量押し込み、保持流路１１１ｂ内部で液体の移動を発生させる。
【０１３３】
この場合、最大保持量約４８μｌに対して十分余裕があるので、押圧パッドの押し込み量を比較的大きくしても、保持流路１１１ｂの内部圧力は外圧より高くならず、液洩れの恐れがない。この状態で、混合に十分な保持流路１１１ｂ内部で液体の移動を発生させることができる。
【０１３４】
ｃ．後期送液
図３４（ｂ）に示すように、保持流路１１１ａの左翼パッド４０２ａを解除し、最終目標状態である保持流路１１１ａの中央パッド４０１ａを全閉状態とし、連結バルブ３１７を全閉状態とする。このとき、残りの約１２μｌが送液され、合計約３６μｌが送液される。
【０１３５】
ｄ．後期混合
この状態での混合は、図３３（ａ）に示す状態と同様であり、図３３（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）に連続的に示す加圧状態での混合が実施される。
【０１３６】
この場合、既に半分以上の液量が混合されているので、各パッドの押し込み量をそれほど大きくしなくても、十分に混合が達成できる。
【０１３７】
この例では、パッドに規定された送液量で制御したが、押圧パッドを任意の位置で保持し、連結バルブ３１７を全閉状態とし、任意の送液量で保持流路１１１ｂの混合を開始してもよい。
【０１３８】
（３）−３−３ ２流路間往復移動
液体を保持流路１１１ａから保持流路１１１ｂに一定量送液する際に、中間段階として、液体を保持流路１１１ｂから保持流路１１１ａに逆流させても差し支えない場合には、２流路間内液体往復移動が可能となる。
【０１３９】
図３５は２流路間内液体往復移動を説明するための模式図である。まず、図３５（ａ）に示すように、保持流路１１１ａでの中央パッド４０１ａの押し込みを行って保持流路１１１ａから保持流路１１１ｂに液体を送液する。次に、図３５（ｂ）に示すように、保持流路１１１ｂでの中央パッド４０１ｂの押し込みを行って保持流路１１１ｂから保持流路１１１ａに液体を送液する。これら図３５（ａ）及び（ｂ）に示す動作を交互に繰り返し行うことにより、両方の保持流路１１１ａ及び１１１ｂの内部液体を均質に混合することができる。
【０１４０】
このとき、逆流が不可の場合と可能な場合では同じ送液量でも試薬と生成物の混合比が異なってくる。例えば、
保持流路１１１ａ内の生成物の量をＡ０、最終保持量をＡ１、保持流路１１１ｂ内の試薬の量をＢ０とすると、
逆流が不可の場合、試薬：生成物＝Ｂ０：Ａ１
逆流が可能の場合、試薬：生成物＝Ｂ０：Ａ０
となる。
【０１４１】
また、反応生成物の一部を保持流路１１１ｂでの反応の有害物である残渣として、送液元の保持流路１１１ａに残留させる場合には、この混合方法に用いる逆流が可能ではない。
【０１４２】
（３）−３−４ 混合の効果
従来、気液２層系において複数の反応を逐次処理する場合には、１つの反応チャンバに反応ごとに必要な試薬を逐次投入する方法が用いられてきた。この場合、反応チャンバ内の液量が反応ごとに増えていくので、廃液チャンバが必要になり、複雑な流路系を必要とした。また、試薬の量が少なくなると送液制御が困難であり、特に少ない試薬が長い送液流路に残留するので、試薬の無駄、送液量の不均一が問題であった。
【０１４３】
微細流路系においては、液体同士の混合に際して流路内で攪拌することが困難であり、合流流路等を使用しても、均質な混合が困難であった。
【０１４４】
これに対して上記実施形態によれば、比較的少ない量の試薬に対して、比較的多い量の反応生成物自体が移動していくので、送液及び混合ともに制御が容易である。
【０１４５】
また、混合に際しては、液体や反応の条件に適合した様々なパターンを採用することができる。さらに、混合は無気泡状態で行うことができ、したがって気液２層に分離するための遠心分離装置が不要である。
【０１４６】
（３）−４ 変形例
上述した試薬・試料注入や、送液、混合工程において、押圧パッドをより多数に分割する、また押圧パッドの固定に使用するロックを多段にすると、さらに多種の保持容積、送液量、送液パターン、混合パターンの実施が可能であり、液体や反応の条件への適合が容易になる。
【０１４７】
（４）流路パターンと送液順序
（４）−１ 検出流路
１）核酸検出方法
目標核酸の検出方法は、検出流路内部に固定化された、検出すべき目標核酸に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを使用するものなら、周知の光学的方式、電気化学的方式等が使用できる。
【０１４８】
本実施形態では、基本的には登録第２５７３４４３号公報に開示される電気化学的な検出方法を適用した。光学的方式を使用する場合は、光透過性の材料で固定基板１を作製することで対応できる。
【０１４９】
２）核酸検出チップ
検出センサである核酸検出チップ５００は固定部材からなる基板が用いられる。より具体的には、特開２００２−１９５９９７号公報に開示されるような核酸検出センサを使用した。検出方法、使用材料、電極構造等は同じであるが、検出基板の構造だけが同公報の従来例として示される構造を採用してある。
【０１５０】
図３６は、核酸検出チップ５００の構造の概略を示す図である。ガラス基板５００ａ上に特開２００２−１９５９９７号公報に開示されるように、核酸固定化電極５０１、対抗電極５０３及び参照電極５０４が形成されている。さらにガラス基板５００ａ上には、これらの電極５０１，５０３及び５０４と検査装置とで電気信号を入出力するための接点として、それぞれ核酸固定化電極用接点５１１、対抗電極用接点５１３、参照電極用接点５１４が形成されている。
【０１５１】
また、核酸固定化電極５０１上には、特開２００２−１９５９９７号公報に開示される方法で、検出すべき目標核酸に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブ５０２が固定化されている。
【０１５２】
３）検出流路構造
図３７は、検出流路シール５２０を核酸検出チップ５００上に位置決めし載置した図である。可撓性部材である検出流路シール５２０は、可撓性シート２と同一の材料が使用できるが、押圧パッドによる局部的変形がないので、比較的硬いゴム硬度のものが使用できる。図３７に示すように、検出流路シール５２０は蛇行した流路開口５２１を有している。核酸固定化電極５０１、対抗電極５０３、参照電極５０４がすべて流路開口５２１の内部に位置し、各電極５０１，５０３，５０４が検出流路シール５２０で隠れないように位置決めされて核酸検出チップ５００と検出流路シール５２０は接している。
【０１５３】
４）検出流路の流路基板への接合
図３８は検出部ブロック１０６を表面側から見た斜視図であり、図４０は、図３８に示す検出部ブロック１０６を裏面側から見た斜視図である。検出部ブロック１０６の裏面には、核酸検出チップ５００の厚さとほぼ同じ深さを有し、核酸検出チップ５００の面積とほぼ同面積のチップレセス１２８が形成されている。このチップレセス１２８の一部には接点部開口１５１が貫通形成されている。
【０１５４】
チップレセス１２８のさらに一部には、チップレセス１２８の底面からさらに検出流路シール５２０の厚さとほぼ同じ深さを有するシールレセス１２５が設けられている。このシールレセス１２５の最深部平面と接するように検出流路シール５２０が組み込まれ、さらにこの検出流路シール５２０に接するように、チップレセス１２８の最深部平面と接するように核酸検出チップ５００が組み込まれる。
【０１５５】
これによって、核酸検出チップ５００と検出流路シール５２０と検出部ブロック１０６からなる、外部と隔離した検出流路５３１が形成される。核酸検出チップ５００、検出流路シール５２０、検出部ブロック１０６は接着、溶着等が可能である。また図示されていない締結部材もしくは締結部分で一体的に接合され、閉鎖型の核酸検出カセット１００を形成する。
【０１５６】
５）退避流路と検出流路の関係
図３８に示す検出部ブロック１０６は退避流路１３１を含むブロックであり、検出流路５３１はこの退避流路１３１の下部に配置される。検出流路５３１には、検出部ブロック１０６にその表裏を貫通して形成される左導入流路１２６及び右導入流路１２７が含まれ、一条の流路を形成している。
【０１５７】
図３９は、図３８と同じく検出部ブロック１０６を表面側から見た斜視図であるが、裏面に形成される検出流路５３１や各レセスなどの配置位置を破線で示してある。
【０１５８】
図４１は図３８に示す検出部ブロック１０６のＥ−Ｅ断面図である。図４１に示すように、検出流路５３１は２つの流路端部、すなわち左導入流路１２６及び右導入流路１２７に配置される検出流路端部１１８及び１１９を介して連結流路１１６及び１１７に連結されている。
【０１５９】
すなわち、連結流路端部１１８の左側は連結流路１１７ａによって保持流路１１１ａと連結され、右側は連結流路１１６ｂによって退避流路１３１と連結されている。これらの連結流路は、対応する連結パッド４０７ａ、４０６ｂによって開閉が可能である。
【０１６０】
同様に、連結流路端部１１９の左側は連結流路１１７ｂによって退避流路１３１と連結され、右側は連結流路１１６ｃによって保持流路１１１ｃと連結されている。これらの連結流路は、対応する連結パッド４０７ｂ、４０６aによって開閉が可能である。
【０１６１】
６）接点部開口
図３８に示すように検出部ブロック１０６には、核酸検出チップ５００上の核酸固定化電極用接点５１１、対抗電極用接点５１３、参照電極用接点５１４をカセット外部の検査装置と接続するための接点部開口１５１が設けられている。この接点部開口１５１にあわせて各接点５１１，５１３，５１４が検出部ブロック１０６で隠れないように位置決めし固定されて用いられる。
【０１６２】
（４）−２ 初期注入
図４２は、本実施形態で使用した核酸検出カセット１００の流路系の模式図を示す。
【０１６３】
同図左側から順に、端部ブロック１０２と、２つの中間部ブロック１０１と、検出部ブロック１０６と、中間部ブロック１０１と、端部ブロック１０３が配置されている場合の流路系統を示している。端部ブロック１０２は保持流路８１１ａを、これに隣接する中間部ブロック１０１は保持流路８１１ｂを有し、さらにこれに隣接する中間部ブロック１０１は保持流路８１１ｃを有している。この中間部ブロック１０１に隣接する検出部ブロック１０６は退避流路８１１ｄとこの退避流路８１１ｄに迂回して設けられた検出流路５３１を有する。この検出部ブロック１０６の右側に隣接する中間部ブロック１０１は保持流路８１１ｅを有する。右端の端部ブロック１０３は保持流路８１１ｆを有する。隣接する流路は互いに連結流路を介して連結され、その連結流路にはそれぞれバルブが設けられ、開閉制御可能になっている。
【０１６４】
各処理過程は、特に言及の無い限りは、登録第２５７３４４３号公報、特開２００２−１９５９９７号公報に詳しく開示される方法が適用される。まず、必要な全試薬が注入された出荷状態としての初期状態と、各試薬を用いた反応過程について説明する。
【０１６５】
１）核酸増幅
保持流路８１１ａでは、核酸を含んだ試料からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等を行い、試料内の核酸を増幅する。核酸の増幅方法に関しては特にこれに限るものではなく、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの温度変化を伴う方法や等温増幅方法など種々の核酸増幅方法が実施可能である。核酸を含む試料としては、血液、血清、尿、唾液、口腔粘膜等の生体試料等、を用いることができる。例えば、ＰＣＲ法においては、以下のような熱循環を施し、核酸の増幅を連続させる。
【０１６６】
ａ．９２〜９５℃で、約１０〜１５秒にわたって加熱し、２本鎖核酸を変性させ、ほどき分離し１本鎖にする。
【０１６７】
ｂ．次に、冷却され、５５〜６５℃で、約１０〜１５秒にわたって保持し、プライマーをアニ−ルし、２種類のプライマーを分離した１本鎖に結合させ部分的に２本鎖を形成する。
【０１６８】
ｃ．次に、７０〜７２℃で、約１０〜１５秒にわたって保持し、２種類のプライマーをそれぞれ核酸合成の開始点として、相補性をもつもう１本核酸を伸長させる。
【０１６９】
このＰＣＲ実施のため、保持流路８１１ａにはｄＮＴＰ、プライマー、ポリメラーゼ、その他ＰＣＲに必要なその他試薬を含む緩衝液を注入する。必要であれば、試料溶液中に核酸増幅阻害物質の影響排除試薬（例えば、島津製作所製Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ）を加えることもできる。核酸増幅阻害物質の影響排除試薬は、血液から直接核酸を取り出してＰＣＲの実施を可能にする試薬である。注入される全試薬量は約４８μｌである。
【０１７０】
２）１本鎖化
保持流路８１１ｂでは、保持流路８１１ａの核酸増幅工程で増幅された２本鎖核酸を、周知のλエキソヌクレアーゼ法等によって１本鎖核酸に調整する。このとき酵素反応を維持するため、３５〜３９℃で、約３０分〜３時間にわたって保持し、最後に酵素を失活するために９２〜９５℃で、約３〜６分にわたって加熱する。この過程で使用されるエキソヌクレアーゼおよび緩衝液の全試薬量約１２μｌが注入される。
【０１７１】
３）保護鎖付与
保持流路８１１ｃでは、特開平６−７０７９９号公報に開示されている方法を用いて、試料としての１本鎖核酸に、核酸プローブ５０２に相補的でない部分の配列に対して相補的な核酸鎖を保護鎖として添加する。これにより、核酸試料のセルフハイブリダイゼーションを防止し、検出感度を向上させることができる。このとき、必要であれば核酸試料を９５〜９８℃で約１〜５分にわたって保持し核酸を熱変性したのち、毎分２℃ずつ２５℃まで緩やかに冷却することで保護鎖と核酸試料のハイブリダイゼーション反応を行う。この過程で使用される全試薬量約１２μｌが注入される。
【０１７２】
４）ハイブリダイゼーション
検出流路５３１では、増幅され前処理された核酸試料と、核酸固定化電極５０１上の核酸プローブ５０２と所定の反応温度（たとえば、２０〜４０℃、３０〜６０分）を保持し、ハイブリダイゼーション反応を行う。核酸プローブ５０２は乾燥して保存することが可能で、検出流路５３１内は浄化・滅菌された窒素や空気等の気体が充填されている。ハイブリダイゼーション時には核酸試料を含む液体で検出流路５３１が充填されることになる。閉鎖系カセットにおいては、初期充填されていた気体を外部に排出できないので、この気体を退避させる容積が退避流路８１１ｄに設定されている。退避流路８１１ｄの初期状態はほぼ容積ゼロで、完全閉鎖されている。もしくは検出流路５３１内には気体の充填物に代えて緩衝液あるいは生理食塩水等の液体を充填しても良い。
【０１７３】
５）洗浄
検出流路５３１では、ハイブリダイゼーション反応が終了した後、核酸固定化電極５０１上の洗浄を行い、ハイブリダイズしなかった核酸試料を核酸固定化電極５０１上から除去する。この過程では緩衝液が洗浄液として使用される。使用される洗浄液は、保持流路８１１ｅに注入され、使用時に、検出流路５３１まで送液される。保持流路８１１ｅには、全試薬量約４８μｌが注入される。
【０１７４】
６）電気化学測定
検出流路５３１では、洗浄後、ハイブリダイズした２本鎖部分に選択的に結合する２本鎖認識体である、挿入剤（インターカレータ）を作用させ電気化学的測定を行う。測定では、挿入剤が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加し、挿入剤に由来する反応電流値を測定する。このとき電位は定速で掃引される。得られた電流値を元に、目標核酸検出を判定する。また、測定中は温度をたとえば、２０〜２５℃に保持する。使用される挿入剤は、保持流路８１１ｆに注入され、使用時に、検出流路５３１まで送液される。保持流路８１１ｆには、全試薬量約４８μｌが注入される。
【０１７５】
（４）−３ 送液順序
検査用の核酸検出カセット１００は、図４２で模式的に示された必要試薬充填状態で、使用者に提供される。
【０１７６】
１）核酸増幅
まず、出入バルブ８１４及び８１５を開いて、核酸を含む試料を注入する。試料注入後、出入バルブ８１４及び８１５を閉じる。次に図４２に示すように、連結バルブ８３１が閉じられた状態で、保持流路８１１ａに、図示しない熱伝達手段から所定の温度サイクルを付与し、核酸の増幅を行う。
【０１７７】
２）１本鎖化
図４３に示すように、核酸増幅終了後連結バルブ８３１を開き、保持流路８１１ａの中央パッド４０１aを押込む。これにより、反応後の生成物である増幅された核酸試料を保持流路８１１ａから保持流路８１１ｂに約３６μｌ送液する。このとき、保持流路８１１ｂにある試薬と送液された生成物とを十分に混合させる。混合が終了した後、連結バルブ８３１を閉鎖する。次に保持流路８１１ｂに所定の温度を付与し、１本鎖化の反応を開始する。
【０１７８】
３）保護鎖付与
図４４に示すように、１本鎖化反応終了後連結バルブ８３２を開き、保持流路８１１ｂの中央パッド４０１ｂを押込み、反応後の生成物である１本鎖化された核酸試料を保持流路８１１ｂから保持流路８１１ｃに約３６μｌ送液する。このとき、保持流路８１１ｃにある試薬と送液された生成物とを十分に混合させる。混合が終了した後、連結バルブ８３２を閉鎖する。この後、必要であれば、保持流路８１１ｃに所定の温度を付与し、保護鎖付与の反応を開始する。
【０１７９】
４）ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション工程は、詳細には以下の４ａ）ハイブリダイゼーション、４ｂ）エアパージその１、４ｃ）使用済生成物の送液その１、４ｄ）使用済生成物の送液その２からなる。
【０１８０】
４ａ）ハイブリダイゼーション
図４５に示すように、保護鎖付与反応終了後、連結バルブ８３３及び８３５を開き、保持流路８１１ｃの中央パッド４０１ｃ、左翼パッド４０２ｃ及び右翼パッド４０３ｃを押込み、反応後の生成物である保護鎖付与された核酸試料を保持流路８１１ｃから検出流路５３１に約４８μｌ送液する。同時に、退避流路８１１ｄの中央パッド４０１ｄ、左翼パッド４０２ｄ、右翼パッド４０３ｄの各々に対応するロック部を開放し、検出流路５３１にある充填気体を約４８μｌ退避流路８１１ｄに退避させる。
【０１８１】
試料送液時に、検出流路５３１内に固定されている核酸プローブ５０２と送液された核酸試料とを十分になじませるため、もしくは検出流路５３１の先頭と最後で核酸試料の濃度を均一にするために、一定送液速度だけでなく、往復動あるいはパルス的送液することが可能である。これにより電流測定値のばらつきを抑えることができる。検出流路５３１から保持流路８１１ｃ方向への送液は、退避流路８１１ｄの押圧パッド（中央パッド４０１ｄ、左翼パッド４０２ｄ及び右翼パッド４０３ｄ）を押込むことで実施される。送液が終了した後、連結バルブ８３３及び８３５を閉鎖する。連結バルブ８３３及び８３５の閉鎖後、検出流路５３１を所定の温度で保持し、ハイブリダイゼーション反応を開始する。
【０１８２】
４ｂ）エアパージその１
図４６に示すように、ハイブリダイゼーション反応終了後、連結バルブ８３５及び８３３を開き、退避流路８１１ｄの中央パッド４０１ｄ、左翼パッド４０２ｄ及び右翼パッド４０３ｄを押込み、退避流路８１１ｄにある充填気体を検出流路５３１に約４８μｌ充填する。このとき、同時に保持流路８１１ｃの中央パッド４０１ｃ、左翼パッド４０２ｃ、右翼パッド４０３ｃの各々に対応するロック部を開放し、ハイブリダイゼーション反応終了後の核酸試料を検出流路５３１から保持流路８１１ｃに約４８μｌ送液する。送液が終了した後、連結バルブ８３３及び８３５を閉鎖する。これにより、検出流路５３１のエアパージその１が終了する。
【０１８３】
４ｃ）使用済生成物の送液その１
図４７に示すように、検出流路５３１のエアパージその１が終了後、連結バルブ８３１を開き、保持流路８１１ｂにある左翼パッド４０２ｂ及び右翼パッド４０３ｂをさらに押込み全閉状態とする。これにより、保持流路８１１ｂにある残留液体約１２μｌが保持流路８１１ａに送液される。このとき保持流路８１１ａでは左翼パッド４０２ａのみが閉状態であり、保持流路８１１ａの容積状態約２４μｌを維持している。これにより、保持流路８１１ａが負圧になることはない。送液が終了した後、連結バルブ８３１を閉鎖する。
【０１８４】
４ｄ）使用済生成物の送液その２
図４８に示すように、保持流路８１１ｂにある残留液体の送液後、連結バルブ８３２を開き、保持流路８１１ｃの中央パッド４０１ｃ、左翼パッド４０２ｃ及び右翼パッド４０３ｃを押込む。これにより、ハイブリダイゼーション反応終了後の核酸試料が保持流路８１１ｃからさらに保持流路８１１ｂに約４８μｌ送液される。このとき同時に、保持流路８１１ｂの中央パッド４０１ｂ、左翼パッド４０２ｂ、右翼パッド４０３ｂのロック部が開放状態にある。送液が終了した後、連結バルブ８３２を閉鎖する。
【０１８５】
５）洗浄
洗浄工程は、以下の５ａ）洗浄、５ｂ）エアパージその２からなる。
【０１８６】
５ａ）洗浄
図４９に示すように、保持流路８１１ｃにある残留液体の送液後、連結バルブ８３４及び８３６を開き、保持流路８１１ｅの中央パッド４０１ｅ、左翼パッド４０２ｅ及び右翼パッド４０３ｅを押込み、洗浄液を保持流路８１１ｅから検出流路５３１に約４８μｌ送液する。同時に、退避流路８１１ｄの中央パッド４０１ｄ、左翼パッド４０２ｄ及び右翼パッド４０３ｄのロック部を開放し、検出流路５３１にある充填気体を約４８μｌ退避流路８１１ｄに退避させる。
【０１８７】
洗浄液送液時に、核酸プローブ５０２にハイブリダイズしなかった核酸試料を核酸固定化電極５０１上から確実に除去するために、一定送液速度だけでなく、往復動あるいはパルス的送液をすることが可能である。これにより電流測定値のばらつきを抑えることができる。
【０１８８】
検出流路５３１から保持流路８１１ｅ方向への送液は、退避流路８１１ｄの押圧パッドを押込むことで実施される。この送液が終了した後、連結バルブ８３４、８３６を閉鎖する。
【０１８９】
５ｂ）エアパージその２
図５０に示すように、洗浄終了後、連結バルブ８３５及び８３３を開き、退避流路８１１ｄの中央パッド４０１ｄ、左翼パッド４０２ｄ及び右翼パッド４０３ｄを押込む。これにより、退避流路８１１ｄにある充填気体が検出流路５３１に約４８μｌ充填される。このとき同時に保持流路８１１ｃの中央パッド４０１ｃ、左翼パッド４０２ｃ及び右翼パッド４０３ｃのロック部を開放し、洗浄終了後の洗浄液を検出流路５３１から保持流路８１１ｃに約４８μｌ送液する。送液が終了した後、連結バルブ８３３及び８３５を閉鎖する。これにより、検出流路５３１のエアパージその２が終了する。
【０１９０】
６）電気化学的測定
この電気化学的測定は、６ａ）挿入剤の移送、６ｂ）挿入および電気化学的測定からなる。
【０１９１】
６ａ）挿入剤の移送
図５１に示すように、エアパージその２の後、連結バルブ８３７を開き、保持流路８１１ｆの中央パッド４０１ｆ、左翼パッド４０２ｆ及び右翼パッド４０３ｆを押込み、挿入剤を保持流路８１１ｆから保持流路８１１ｅに約４８μｌ送液する。このとき同時に、保持流路８１１ｅの中央パッド４０１ｅ、左翼パッド４０２ｅ及び右翼パッド４０３ｅのロック部が開放状態である。送液が終了した後、連結バルブ８３７を閉鎖する。
【０１９２】
６ｂ）挿入および電気化学的測定
図５２に示すように、挿入剤の移送後、連結バルブ８３４及び８３６を開き、保持流路８１１ｅの中央パッド４０１ｅ、左翼パッド４０２ｅ及び右翼パッド４０３ｅを押込み、挿入剤を保持流路８１１ｅから検出流路５３１に約４８μｌ送液する。同時に、退避流路８１１ｄの中央パッド４０１ｄ、左翼パッド４０２ｄ及び右翼パッド４０３ｄの各々に対応するロック部を開放し、検出流路５３１にある充填気体を約４８μｌ退避流路８１１ｄに退避させる。
【０１９３】
挿入剤送液時に、検出流路５３１内に固定されているハイブリダイズした核酸プローブ５０２に挿入剤を十分に作用させるため、もしくは検出流路５３１の先頭と最後で挿入剤の濃度を均一にするために、一定送液速度だけでなく、往復動あるいはパルス的送液をすることが可能である。これにより電流測定値のばらつきを抑えることができる。
【０１９４】
検出流路５３１から保持流路８１１ｅ方向への送液は、退避流路８１１ｄの押圧パッドを押込むことで実施される。送液が終了した後、連結バルブ８３４及び８３６を閉鎖する。連結バルブ８３４及び８３６の閉鎖後、検出流路５３１を所定の温度で保持し、電気化学的測定を開始する。
【０１９５】
７）連続反応操作における効果
以上のように、可変流路構造を有する閉鎖型の核酸検出カセット１００による効果は以下のようにまとめられる。
【０１９６】
７ａ）反応・送液に有害な気泡を巻き込まずに、試薬が注入できる。
【０１９７】
７ｂ）連結流路が最小長さで配置できるので、この部分での空隙、残留液体の保持がほとんどない。
【０１９８】
７ｃ）試薬保持流路内部と外部との圧力差が少ないので長期保存時に液洩れの恐れがない。
【０１９９】
７ｄ）送液時、外部との圧力差が少ないので液洩れの恐れがない。
【０２００】
７ｅ）試薬と反応生成物の混合が容易で良好な反応が実施できる。
【０２０１】
７ｆ）ハイブリダイゼーション、洗浄、挿入剤との反応において、最終的な電流測定値のばらつきを抑えることができるような、複雑な送液パターンが実施できる。
【０２０２】
（５）熱伝達ユニット
次に、図５３〜図５６に基づき熱伝達ユニットの詳細な構成を説明する。
【０２０３】
図５３は２つの熱伝達ブロック６００ａ及び６００ｂからなる熱伝達ユニット６００の閉鎖系の核酸検出カセット１００への熱伝達時の構成の一例を示す斜視図である。図５４は熱伝達ブロック６００ａ及び６００ｂを核酸検出カセット１００から離間した状態の断面図である。図５５は熱伝達ブロック６００ａ及び６００ｂを核酸検出カセット１００に接触させた状態の断面図である。
【０２０４】
（５）−１ 熱伝達ユニット構造
図５４に示すように、熱伝達ユニット６００はＰＣＲでの温度循環の付与に使用されるので、加熱と冷却を行なえるものでなくてはならない。そこで熱伝達ブロック６００ａは、ペルチェ素子６０１ａ、アルミや銅のような熱伝導率のよい金属からなる接触パッド６０４ａ、ヒートシンク６０２ａ及び冷却ファン６０３ａからなる。ペルチェ素子６０１ａと接触パッド６０４ａ、ペルチェ素子６０１ａとヒートシンク６０２ａは、シリコーンオイルを基油にアルミナなど熱伝導性のよい粉末を配合したグリースで接合されている。図５４には示されていないが、核酸検出カセット１００もしくは熱伝達ブロック６００ａ、６００ｂの所定部分の温度を測定し、核酸検出カセット１００もしくは熱伝達ブロック６００ａ、６００ｂ、６１０ａ及び６１０ｂの温度制御を行なう温度センサを備えている。熱伝達ブロック６００ａ、６００ｂ、６１０ａ及び６１０ｂの構造は同一である。
【０２０５】
（５）−２ 熱伝達ユニットのカセットへの接触
図５４は、熱伝達ユニット６００の初期配備状態を示す。保持流路１１１に対応する中央パッド４０１、左翼パッド４０２及び右翼パッド４０３からなる押圧ブロック４は閉状態である。この状態で熱伝達ユニット６００及び６１０は核酸検出カセット１００に対して相対的に移動可能で、核酸検出カセット１００の任意の位置で配備できる。
【０２０６】
図５５は、熱伝達ユニット６００の核酸検出カセット１００への熱伝達状態を示す。押圧ブロック４は開状態から、さらに開いた全開状態である。この押圧ブロック４の全開状態により、熱伝達ブロック６００ａは、可撓性シート２を介して流路内部の液体に熱伝達が可能である。可撓性シート２の厚さが０.３ｍｍ程度なのに対応して、保持流路１１１の裏面にあたる固定基板１の厚さを０.４ｍｍ程度にして、両側からの熱伝達の条件をほぼ同一にしている。このようにして、熱伝達ブロック６００ａ、６００ｂは核酸検出カセット１００の熱伝達を実施する保持流路１１１に対して、両側から接触して熱伝達を行なう。
【０２０７】
図５６は、流路内部の液体６０５が熱伝達ユニット６００からの熱伝達により膨張している様子を模式的に示したものである。熱伝達ブロック６００ａ、６００ｂは、熱伝達ブロック押ばね６０４a、６０４ｂにより一定の荷重がかけられ、流路内部の液体６０５が熱膨張すると、可撓性シート２が核酸検出カセット１００の外側に膨らみ、流路内部の容積が拡大する。このため、加熱時においても流路内部の圧力上昇が緩和され、核酸検出カセット１００の外部および他の流路内部への圧力上昇に伴う流路内部の液体６０５の漏出を防止することができる。特にPCR法による核酸増幅時における急激な熱循環に伴う、急激な流路内部の圧力変動を緩和するため、核酸増幅時の流路内部の液体漏出に効果がある。
【０２０８】
可撓性シート２が核酸検出カセット１００の外側に膨らむことによって流路内部の圧力上昇が緩和し、かつ接触パッド６０４ａとの接触を維持することによって熱伝達を行うには、可撓性シート２側の熱伝達ブロック押ばね６０４aは低荷重ばねであり、好ましくは定荷重ばねが用いられる。あるいは、接触パッド６０４ａと可撓性シート２は全面もしく部分的に接触せず近接状態に置かれていても、可撓性シート２への熱伝達と熱膨張を同時に満足することができる。
【０２０９】
以上のように可撓性シート２の可撓性は、
１）流路内部に変形することにより流路内部の流体に圧力を加え、
連結流路１１７を介して隣接する保持流路１１１ｂに流路内部の流体を送液する。
【０２１０】
２）熱膨張等の流体の体積増加に対応して、流路外部に変形することにより流路内部の流体の圧力上昇を緩和し、液漏れを防止する。
【０２１１】
３）熱膨張時にも接触パッド６０４ａと良好な接触もしくは近接状態を維持して熱伝達を行う。
【０２１２】
という３つの機能を同時に満たすことができる。
【０２１３】
（５）−３ 隣接保持流路冷却
図５３に、核酸検出カセット１００に対する熱伝達ブロック６００ａ、６００ｂ、６１０ａ、６１０ｂの接触状況を示す。図５３で、熱伝達ブロック６００ａ、６００ｂが配置されているのは、核酸増幅を行なう保持流路８１１ａの位置である。例えば、核酸増幅をＰＣＲで実施した場合、９８℃付近まで保持流路８１１ａの温度が上昇する。また、等温増幅反応であるLAMP法では６０〜６５℃に保持流路８１１ａは置かれる。このとき隣接する保持流路８１１ｂには、酵素を含む試薬がすでに充填されている。保持流路８１１ｂに充填されている酵素は５０℃以上になると機能が劣化し始めるので、核酸増幅が実施されている保持流路８１１ａからの熱伝導で、保持流路８１１ｂの温度が５０℃以上になることを防止しなければならない。このため、隣接する保持流路８１１ｂに接している熱伝達ユニット６１０ａ、６１０ｂは、冷却ユニットとして隣接保持流路８１１ｂを冷却する。
【０２１４】
（５）−４ 直列流路
また保持流路８１１ｃの試薬、特に検出流路５３１の核酸プローブは熱に弱いので、核酸増幅実施時には隣接保持流路８１１ｂだけでなく、保持流路８１１ｃ、検出流路５３１の冷却も必要になる。図５３に示すように、核酸検出カセット１００は、各保持流路１１１および退避流路１３１などの保持流路が直列に配置されているので、核酸増幅実施時でも隣接する保持流路のみを冷却することで、現在加熱下にある保持流路からの熱の移動を、隣接保持流路で吸収（吸熱）することが可能である。これにより、隣接保持流路以降の保持流路の温度上昇を抑制することができる。
【０２１５】
（５）−５ 熱伝達ユニットの効果
以上のように、熱伝達ユニット６００及び６１０と可変流路構造を有する核酸検出カセット１００の組合せによる効果は以下のようにまとめられる。
【０２１６】
ａ）流路が直列に配置されているので、隣接保持流路の冷却だけで、未使用試薬の温度上昇を抑制できる。
【０２１７】
ｂ）可変流路に使用する押圧ブロックは可動するので、全開状態を設定することができ、これにより、保持流路に対して損失の少ない両側熱伝達が達成できる。
【０２１８】
（６）自動制御装置の全体構造
図５７は上記各構成を自動制御するための構成を含めた核酸検出システムのブロック図である。図５７に示すように、ホストパーソナルコンピュータ７５１からの指令に基づき、核酸検出カセット１００に対して各種操作を行い自動で核酸検出を行うことができる。検査装置本体７５２には、ホストパーソナルコンピュータ７５１からの指令に基づき各種構成に制御信号を出力して制御する制御部７５３が設けられている。制御部７５３は、メインコントローラ７５４と、このメインコントローラ７５４からの指令に基づき動作するアクチュエータドライバ７５５、温度制御ドライバ７５６及び電流測定ドライバ７５７を備える。メインコントローラ７５４は制御部７５３外に設けられた電源・ファン７５８により動作する。
【０２１９】
アクチュエータドライバ７５５は例えばステッピングモータドライバで実現される。このアクチュエータドライバ７５５は、位置センサ７６４で検出された核酸検出カセット１００の位置に基づき送液アクチュエータ７６２や着脱アクチュエータ７６３を駆動し送液や着脱動作を実現する。位置センサ７６４は特に図示されていないが、核酸検出カセット１００の後述する駆動ユニット７０１及び７０２の移動位置近傍に設置される。送液アクチュエータ７６２及び着脱アクチュエータ７６３は、本実施形態では駆動ユニット７０１及び７０２で実現される。
【０２２０】
温度制御ドライバ７５６は、温度センサ７６６で検出された温度に基づきヒータ／クーラ７６５を制御して温度調整を行う。ヒータ／クーラ７６５は本実施形態では熱伝達ユニット６００及び６１０で実現される。
【０２２１】
電流測定ドライバ７５７は、カセットホルダ７２１により支持された核酸検出カセット１００に接続された電気コネクタ７０３を介して電流信号を取り出し、この電流信号を電流測定端子部７６１を介して取得する。
【０２２２】
図５８及び図５９は上記各反応を自動で実行するための自動制御機構の一例を示す図である。図５８は使用時の形態を示す斜視図であり、図５９は説明の便宜のため各構成を分離して示した斜視図である。
【０２２３】
図５８に示すように、支持台７２０上にはカセットホルダ７２１と固定Ｘステージ７２２が固定配置されている。カセットホルダ７２１はカセット１００の外枠の２辺を支持して核酸検出カセット１００をＸ軸方向に操作部に導くレール７２１ａ及び７２１ｂを有する。固定Ｘステージ７２２上には可動Ｘステージ７２３が載置され、Ｘ駆動装置７１４により固定Ｘステージ７２２上をＸ方向に位置決め可能である。
【０２２４】
操作部には、電気コネクタ７０３と、２つの駆動ユニット７０１及び７０２と、２つの熱伝達ユニット６００及び６１０が駆動の対象として設けられている。この操作部は、前述のＸ方向の駆動系統と、さらにＹ方向及びＺ方向の駆動系統により、Ｘ、Ｙ及びＺ軸方向に自在に移動可能である。
【０２２５】
Ｙ方向の駆動系統は、固定Ｙステージ７３１と、この固定Ｙステージ７３１に対してＹ方向に位置決め可能にＹ駆動装置７３２で駆動可能な可動Ｙステージ７１３ａ及びこの可動Ｙステージ７１３ａとともに移動する可動取付板７１３ｂからなる。固定Ｙステージ７３１は、可動Ｘステージ７２３に固定されている。したがって、固定Ｙステージ７３１は可動Ｘステージ７２３のＸ方向の移動とともにＸ方向に移動する。
【０２２６】
Ｚ方向の第１駆動系統は、固定Ｚステージ７２５ａと、この固定Ｚステージ７２５ａに対してＺ方向に位置決め可能に第１Ｚ駆動装置７１１で駆動可能な可動Ｚステージ７２６ａからなる。固定Ｚステージ７２５ａは可動取付板７１３ｂに固定された第１Ｚステージ取付板７２４ａに固定されており、そのＸ，Ｙ方向の移動とともに固定Ｚステージ７２５ａもＸ，Ｙ方向に移動する。
【０２２７】
Ｚ方向の第２駆動系統は、固定Ｚステージ７２５ｂと、この固定Ｚステージ７２５ｂに対してＺ方向に位置決め可能に第２Ｚ駆動装置７１２で駆動可能な可動Ｚステージ７２６ｂからなる。固定Ｚステージ７２５ｂは可動取付板７１３ｂに固定された第２Ｚステージ取付板７２４ｂに固定されており、そのＸ，Ｙ方向の移動とともに固定Ｚステージ７２５ｂもＸ，Ｙ方向に移動する。
【０２２８】
駆動ユニット７０１及び７０２は、この可動Ｚステージ７２６ａ及び７２６ｂにそれぞれ取付板７２７ａ及び７２７ｂを介して固定される。これにより、可動Ｚステージ７２６ａ及び７２６ｂのＸ，Ｙ，Ｚ方向の移動とともに駆動ユニット７０１及び７０２がＸ，Ｙ，Ｚ方向に自在に移動する。
【０２２９】
また、熱伝達ユニット６００及び６１０も、可動Ｚステージ７２６ａ及び７２６ｂに取付台７４１及び７４２あるいはさらに取付板７２７ａ及び７２７ｂを介して選択的に移動可能なように固定され、電気コネクタ７０３も同様に駆動ユニット７０１及び７０２の直上近傍に位置するように可動Ｚステージ７２６ａ及び７２６ｂに選択的に移動可能なように固定される。これにより、熱伝達ユニット６００及び６１０、電気コネクタ７０３も、可動Ｚステージ７２６ａ及び７２６ｂのＸ，Ｙ，Ｚ方向の移動とともにＸ，Ｙ，Ｚ方向に自在に移動する。ただし、Ｚ方向に関しては選択的に移動することができ、必要とされるタイミングに別個に、熱伝達ユニット６００及び６１０、電気コネクタ７０３を核酸検出カセット１００に近接もしくは接触させることができる。
【０２３０】
２台の駆動ユニット７０１及び７０２を設け、これらを別個に駆動することができる構成をなす。これにより、一方ではパッドを加圧する動作を、他方ではパッドの加圧を開放する動作を行うことにより、送液動作を実現できる。例えば、保持流路の中央を駆動ユニット７０１を用いて押し込み、保持流路の左翼の加圧を駆動ユニット７０２で開放するというように利用することで、保持流路内の試薬を循環させることができる。
【０２３１】
同様に、２台の熱伝達ユニット６００及び６１０を設け、これらを別個に温度制御することができる構成をなす。これにより、一方の流路では加熱し、他方の流路では冷却する等の制御が可能となる。
【０２３２】
以上説明したように本実施形態の核酸検出カセット１００及びこの核酸検出カセット１００とこれを自動制御する駆動系、制御系を備えた核酸検出システムによれば、核酸増幅およびその他の必要な処理と目標核酸の検出までを一貫して自動的に閉鎖系で処理することができる。
【０２３３】
本発明は上記実施形態に限定されるものではない。
固定基板１、可撓性シート２、カバープレート３の材料は、例示した材料に限定されない。
【０２３４】
図１に示される各ブロック１０１、１０２、１０３及び１０６の構成に限定されるものではなく、必要とする反応の内容に応じて異なる種類のブロックを設けてもよい。例えば、中間部ブロック１０１を省略して端部ブロック１０２、検出部ブロック１０６及び端部ブロック１０３のみで構成してもよいし、図１よりも多くの中間部ブロック１０１を配置してもよい。
【０２３５】
各可撓性シート２を押圧するパッドの形状は上記実施形態に限定されるものではない。例えば、保持流路１１１や退避流路１３１のパッドは３つのパッドからなる例を示したが２つ以下であってもよいし、４つ以上であってもよい。
【０２３６】
また、本実施形態では２つの駆動ユニット７０１及び７０２で各流路の開閉を制御する場合を示したが、３つ以上の駆動ユニットを用いてもよい。同様に、熱伝達ユニット６００及び６１０以外にさらに多くの熱伝達ユニットを用いてもよい。
【０２３７】
（第２実施形態）
本実施形態は第１実施形態の変形例に関わる。本実施形態は、カセット構造や流路パターンの変形例に関わる。本実施形態で特に言及しない限り、第１実施形態と同様の構成が適用される。
【０２３８】
１．カセット構造の変形例
図６０〜図６４はそれぞれ変形例に関するカセット構造の断面図であり、第１実施形態の図４１の断面図の符号Ｆで囲まれた部分に対応する。
【０２３９】
図６０は、固定基板に流路を形成する例であり、第１実施形態の図４１に示した例と共通する。固定基板７７１に流路７７２が形成されており、固定基板７７１上に可撓性シート７７３が接着されている。このように、固定基板７７１側に溝を形成し、この溝を流路７７２として機能させる。
【０２４０】
図６１は、可撓性シートに流路を形成する例である。固定基板７７６は溝が形成されていない平板であり、この固定基板７７６上に流路７７７の形成された可撓性シート７７８が接着される。このように、可撓性シート７７８側に溝を形成し、この溝を流路７７７として機能させる。
【０２４１】
図６２は固定基板及び可撓性シートの双方に流路を形成する例である。固定基板７７１に流路７７２が形成されている。この固定基板７７１上には流路７７７が形成された可撓性シート７７８が接着される。
【０２４２】
図６３は可撓性シートの膨張により流路を形成する例である。固定基板７７６上には、可撓性シート７７９を撓ませて固定基板７７６との間に空間が生じるように接着させる。この空間が流路７８０として機能する。空間がある状態では流路が開放されている状態である。流路を閉鎖するには、不図示のカバー膨張規制部材で固定基板７７６に対して可撓性シート７７９を押さえ込めばよい。
【０２４３】
図６４は固定基板に流路を形成する例であり、固定基板側に表面コーティングを施す例である。流路７７２の形成された固定基板７７１表面を覆うようにコーティング部材７８１が接着されている。固定基板７７１上の可撓性シート７７３はこのコーティング部材７８１を介して固定基板７７１と接着される。
【０２４４】
なお、この図６０〜図６４に示した例はほんの一例にすぎず、また１つの核酸検出カセット内でその機能などに応じて組み合わせて用いることができる。
【０２４５】
２．流路パターンの変形例
図６５は退避流路と検出流路の変形例に係る核酸検出カセット７９０の模式図である。図６５（ａ）は図４２〜図５２の模式図に対応して示されているものであり、図６５（ｂ）はその保持流路近傍の断面図である。
【０２４６】
図６５（ａ）の左側から順に、保持流路７９１ａ、７９１ｂ及び７９１ｃ、退避流路７９１ｄ、検出流路７９１ｅ、退避流路７９１ｆ、保持流路７９１ｇ及び７９１ｈが配置されている。
【０２４７】
保持流路７９１ａは核酸増幅反応を行うための反応室として用いられる。保持流路７９１ａと７９１ｂとは連結バルブ７９２ａを介して連結流路で連結されている。保持流路７９１ａには２つのバルブ７９３ａ及び７９４ａを介してそれぞれ試薬や試料を注入することができる。
【０２４８】
保持流路７９１ｂは一本鎖化反応を行うための反応室として用いられる。保持流路７９１ｂと７９１ｃとは連結バルブ７９２ｂを介して連結流路で連結されている。保持流路７９１ｂにはバルブ７９４ｂを介して試薬を注入することができる。
【０２４９】
保持流路７９１ｃは保護鎖付与反応を行うための反応室として用いられる。保持流路７９１ｃと７９１ｄあるいは７９１ｅとは連結バルブ７９２ｃを介して連結流路で連結されている。保持流路７９１ｃにはバルブ７９４ｃを介して試薬を注入することができる。
【０２５０】
退避流路７９１ｄは検出流路７９１ｅの退避流路として用いられる。退避流路７９１ｄは検出流路７９１ｅ及び保持流路７９１ｃと連結バルブ７９２ｄで連結されている。退避流路７９１ｄにはバルブ７９４ｄを介して試薬を注入することができる。
【０２５１】
検出流路７９１ｅはハイブリダイゼーションなどの反応を行い検出を行うための反応室として用いられる。
【０２５２】
退避流路７９１ｆは検出流路７９１ｅの退避流路として用いられる。退避流路７９１ｆは検出流路７９１ｅ及び保持流路７９１ｇと連結バルブ７９２ｅで連結されている。退避流路７９１ｆにはバルブ７９４ｆを介して試薬を注入することができる。
【０２５３】
保持流路７９１ｇは、ハイブリダイゼーションを行った後、検出流路７９１ｅにおいて洗浄を行うための洗浄液を保持する室として用いられる。保持流路７９１ｇは検出流路７９１ｅと保持流路７９１ｈと連結バルブ７９２ｆを介して連結流路で連結されている。保持流路７９１ｇにはバルブ７９４ｇを介して試薬を注入することができる。
【０２５４】
保持流路７９１ｈは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄を行った後、検出流路７９１ｅにおいて挿入剤付与を行うための挿入剤溶液を保持する室として用いられる。保持流路７９１ｈは検出流路７９１ｅと連結バルブ７９２ｇを介して連結流路で連結されている。保持流路７９１ｈにはバルブ７９４ｈあるいは７９３ｂを介して試薬を注入することができる。
【０２５５】
図６５（ｂ）に示すように、各流路７９１ａ〜７９１ｈは固定基板７９５上の可撓性シート７９６に設けられた溝により平面的に形成されており、この点で検出流路と退避流路が上下２層構造に形成されている第１実施形態と異なる。このように、平面構造にすることにより、カセット構造を薄型化することができる。なお、図６５（ｂ）の例では退避流路が２つ設けられる場合を示したが、いずれか一方のみを残し他方の退避流路は設けない構造とすることもできる。
【０２５６】
また、この図６５に示す構成以外にも流路パターンを種々変形可能である。例えば、各保持流路や退避流路、検出流路などの反応室の基準容量として４８μｌの場合を示したが、これを減少させることでカセット構造の小型化を実現できる。
【０２５７】
また、この図６５に示す例のように、単一の可撓性シート７９６で各保持流路７９１ａなどと検出流路７９１ｅを形成することにより、可撓性部材を兼用することもできる。
【０２５８】
また、第１実施形態で示した例では、核酸検出チップ５００がガラス基板５００ａに固定化されて用いられる例を示したが、これに限定されない。例えば固定基板１に核酸固定化電極５０１、対抗電極５０３及び参照電極５０４などを形成することにより、核酸検出チップ５００を一体化することができる。図６５に示す固定基板７９５を使用する場合には、固定基板７９５上に、核酸固定化電極５０１、対抗電極５０３及び参照電極５０４などを形成することができる。
【０２５９】
また、第１実施形態で示した例では、核酸検出チップ５００が固定基板１に固定化されて用いられる例を示したが、これに限定されない。固定基板１として例えばガラス基板を用いる場合に、このガラス基板に核酸固定化電極５０１、対抗電極５０３及び参照電極５０４などを形成することにより、核酸検出チップ５００を一体化することができる。
【０２６０】
また、第１実施形態の例では保持流路や退避流路は単一線上に配置される例を示したが、複数の直線上にそれぞれ保持流路や退避流路を配置し検出装置を多重化することもできる。図６６は多重化した核酸検出カセット７９７の一例を示す概観斜視図であり、第１実施形態の図４に対応するものである。図６６に示すように、端部ブロック１０２には保持流路１１１ａ、１１１ｂ、…、１１１ｎというようにｎ個の同一構成の保持流路が形成されている。また、隣接する２つの中間部ブロック１０１にもｎ個の同一構成の保持流路が形成され、さらに隣接する検出部ブロック１０６にもｎ個の同一構成の退避流路１３１が形成され、さらにこれに隣接する中間部ブロック１０１にもｎ個の同じ保持流路が形成され、端部ブロック１０３にもｎ個の同じ構成の保持流路が形成されている。また、不図示の保持流路周辺部分の構成もｎ個についてそれぞれ共通する構成をなす。なお、ここでは詳細に示していないが、ブロック内部の構成は第１実施形態で示したものと共通する。このように、流路構成をｎ本に多重化することにより、複数の反応及び検出を同時に進めることができ、複数種類の目標核酸を同時検出できる、複数試料を同時検出できる、及び検出データを均一化する等の利点がある。なお、図６６の例では、ｎ個の退避流路１３１、すなわちｎ個の検出流路５３１に対して１つの接点部開口１５１が設けられているが、ｎ個の各々に接点部開口１５１を配置してもよい。
【０２６１】
さらに他の流路パターンとしては、上記連続する流路、すなわち反応室の数を拡張し、あるいは縮小する構成である。例えば第１実施形態の例では６つの反応室が連続して配置される例を、図６５の例では退避流路を含め８つの流路が連続して配置される例を示したが、この数に限定されないことはもちろんである。
【０２６２】
このように本実施形態によれば、第１実施形態に示される構成を変形しても第１実施形態と同様に、核酸増幅およびその他の必要な処理と目標核酸の検出までを一貫して自動的に処理するのに用いられる閉鎖型の核酸検出カセットが提供される。
【０２６３】
（第３実施形態）
本実施形態は第１及び第２実施形態の変形例に関わる。本実施形態は、保持流路や退避流路などの可変流路の形状の変形例に関わる。第１実施形態の例ではほぼ長方形の形状を備えた流路構成を示したが、本実施形態のように、例えばＵ字型の可変流路を用いてもよい。本実施形態で特に言及しない限り、第１実施形態と同様の構成が適用される。
【０２６４】
図６７及び図６８はＵ字型可変流路を採用した核酸検出カセット９００の基本構造の一例を示す図である。図６７は組み立て前の分解斜視図を、図６８は組み立て後の使用時の構成の斜視図を示す。
【０２６５】
図６７に示すように、核酸検出カセット９００はチップホルダ９０１と、核酸検出チップ９０２と、チップカバー９０３と、流路ブロック９０４と、可撓性シート９０５と、シールブロック９０６からなる。核酸検出チップ９０２には不図示の電極が配置されている。この電極を覆うように流路９１１が形成された検出流路シール９１２が接着されチップカバー９０３でこの検出流路シール９１２を覆った上でチップホルダ９０１で核酸検出チップ９０２、検出流路シール９１２、チップカバー９０３を固定する。
【０２６６】
流路ブロック９０４の表面には容積可変のＵ字型流路９１３が複数形成されている。隣接するＵ字型流路９１３は連結バルブ９１４で連結されている。右側から３番目のＵ字型流路９１３は検出流路として機能するもので、この裏面にチップホルダ９０１が核酸検出チップ９０２を一体化した状態で固定化される。また、すべてのＵ字型流路９１３は可撓性シート９０５で覆われ、さらにこの可撓性シート９０５上にはシールブロック９０６が接着される。以上により図６８に示すような核酸検出カセット９００が完成する。
【０２６７】
図６９は製品作製時のＵ字型流路９１３の構成の一例を示す図である。Ｕ字型流路は９１３ａ〜９１３ｆの６つあり、９１３ａから順に核酸増幅反応室、一本鎖化反応室、保護鎖付与反応室、退避流路、洗浄液保持室、挿入剤保持室として機能する。また、隣接するＵ字型流路同士は連結バルブ９１６ａ〜９１６ｇを介して連結流路で連結されている。また、各Ｕ字型流路９１３ａ〜９１３ｆには、それぞれ２つずつ自己封止型ポート９１７ａ〜９１７ｌが設けられている。退避流路として機能するＵ字型流路９１３ｄの両端には検出流路９１８が連結されている。
【０２６８】
図７０は製品出荷時の構成例を示す図である。各Ｕ字型流路９１３ａ〜９１６ｆ内には必要な試薬がすべて充填されている。使用時は検体のみ注液するだけで、装置による検出が可能となる。
【０２６９】
図７１は容積可変のＵ字型流路９１３ａの基本構造を説明するための図である。同図（ａ）は上面図、（ｂ）は断面図である。圧縮用加圧パッド９１８ａ〜９１８ｃがそれぞれ流路の右翼、左翼及び中央に配置される。自己封止型ポート９１７ａと保持流路９１３ａとの間は出入バルブ９２４ａで開閉が制御され、自己封止型ポート９１７ｂと保持流路９１３ａとの間は出入バルブ９２４ｂで開閉が制御される。他のＵ字型流路も同様の構成である。図７２はこの圧縮用加圧パッド９１８ａ〜９１８ｃを用いた流路開閉状態を示す図である。同図（ａ）は流路全開、（ｂ）は流路半開、（ｃ）は流路全閉状態を示している。
【０２７０】
図７３は自己封止型ポートを用いたカセット注液動作を説明するための斜視図である。自己封止型ポート９１７ａ及び９１７ｂにそれぞれ注液チップ９２０ａ及び逆止弁付チップ９２０ｂを挿入する。注液チップ９２０ａには試薬を入れて注液し、逆止弁付チップ９２０ｂからエア抜きを行う。自己封止型ポート９１７ａ及び９１７ｂは膨張及び縮小可能な可撓性部材により構成されており、外力が加わらない状態では膨張した状態で、ポートが閉鎖されカセット内外の気液の行き来を遮断する。この自己封止型ポート９１７ａ及び９１７ｂに注液チップ９２０ａ及び逆止弁付チップ９２０ｂを挿入すると、可撓性部材がチップの大きさ分だけ縮小してチップ内とカセット内の流路との間で気液の行き来が可能となる。
【０２７１】
図７４はシールブロック９０６の詳細な構成を示す図である。流路加圧パッド９２１ａ〜９２１ｆは流路９１３ａ〜９１３ｆの各々を加圧するパッドであり、詳細には図７１のようにそれぞれ３つのパッド９１８ａ〜９１８ｃから構成される。連結加圧パッド９２２ａ〜９２２ｇは流路９１３ａ〜９１３ｆ同士を連結する連結流路を開閉するパッドであり、これらにより連結バルブ９１６ａ〜９１６ｇが実現される。出入加圧パッド９２３ａ〜９２３ｌは各流路９１３ａ〜９１３ｆと自己封止型ポート９１７ａ及び９１７ｌとの間を結ぶ出入流路を開閉するパッドであり、これにより自己封止型ポート９１７ａ及び９１７ｌと各流路９１３ａ〜９１３ｆとの間の連結バルブが実現される。
【０２７２】
図７５は無気泡注液を説明するための図である。図７５（ａ）に示すように、まず流路容積を加圧パッド９２１ａを用いて注入容積の容積に設定する。次に、図７５（ｂ）に示すように、注液チップ９２０ａ及び逆止弁付チップ９２０ｂを自己封止型ポート９１７ａ及び９１７ｂに差し込んだ上で、気泡を捕獲しないように溶液をゆっくりと注入する。次に、図７５（ｃ）に示すように、エア抜き用の逆止弁付チップ９２０ｂにわずかに溶液が入るまで注液をし、図７５（ｄ）に示すように出入加圧パッド９２３ａ及び９２３ｂを加圧することにより出入バルブ９２４ａ及び９２４ｂを閉じて流路を密閉する。
【０２７３】
図７６は試薬を保持する実施形態の変形例に関わる。混合試薬の保存が可能でない場合には、必要な試薬を同図のように保持流路９１３と隣接する保持流路９１３とを結ぶ連結流路９２５に個別試薬保持部９２６を設けておけばよい。
【０２７４】
図７７は熱伝達時の熱循環動作を説明するための斜視図である。熱伝達ユニット６１０及び６００は、同図Ｙ軸方向及びＺ軸方向に可動である。核酸検出カセット９００の表裏から挟むように熱伝達ユニット６１０を接触させる。この際に、流路加圧パッド９２１ａは持ち上げられた状態で可撓性シート９０５に接触させる。この熱循環時の流路の詳細の模式図を図７８に示す。まず、図７８（ａ）に示すように、熱伝達ユニット６１０で溶液を流路中央部に集中させる。そして、図７８（ｂ）に示すように、表裏から熱伝達ユニット６１０ではさみこみ、９３１に示す領域を加熱し、また冷却するサイクルを繰り返す。
【０２７５】
図７７に示す工程で核酸増幅のための保持流路９１３ａの加熱・冷却が終わると、さらに図７９に示すように、核酸検出カセット９００が同図Ｘ軸方向に移動し、隣接する保持流路９１３ｂの加熱及び冷却と、保持流路９１３ｃの余熱が行われ、反応が順次進められる。
【０２７６】
図８０は送液工程の一例を説明するための斜視図である。核酸検出カセット９００に対して水平方向、すなわち同図Ｘ軸方向に移動可能な送液モジュール９３３に設けられた加圧パッド開閉ローラ９３４及び９３４が核酸検出カセット９００表面に設けられたロック部を解除し、あるいは各パッドを加圧してロック部をロックすることで、送液が実現される。加圧パッド開閉ローラ９３４及び９３４は同図Ｙ軸方向に可動である。図８１は送液の工程を示す模式図である。図８１（ａ）に示すように、連結バルブ９１６ａを開いて保持流路９１３ａを圧縮して送液を開始する。均等に圧縮できるとは限らないため、まず図８１（ｂ）に示すように送液元である保持流路９１３ａの左側部分を完全に圧縮する。次に、図８１（ｃ）に示すように、保持流路９１３ａの中央部分を圧縮する。最後に、図８１（ｄ）に示すように、保持流路９１３ａを完全に圧縮し、連結バルブ９１６ａを閉じる。
【０２７７】
図８２は保持流路９１３にフィルタ９３７を配置した例である。例えば核酸増幅後の検体残渣が送液されてしまう場合には、保持流路９１３の中途部分にフィルタ９３７を配置し、残渣を除去する。
【０２７８】
このように本実施形態によれば、第１実施形態や第２実施形態に示される構成を変形しても第１実施形態や第２実施形態と同様に、核酸増幅およびその他の必要な処理と目標核酸の検出までを一貫して自動的に処理するのに用いられる閉鎖型の核酸検出カセットが提供される。
【０２７９】
本発明は上記第１乃至第３実施形態に限定されるものではない。上記実施形態で示された構成は一例にすぎず、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々変更できることはいうまでもない。
【産業上の利用可能性】
【０２８０】
以上説明したようにこの発明は、核酸を含む試料の投入から、核酸増幅およびその他の必要な処理と目標核酸の検出までを一貫して自動的に処理するのに用いられる閉鎖型の核酸検出カセット、核酸検出装置およびそれを用いた核酸検出システムの技術分野に有効である。
【図面の簡単な説明】
【０２８１】
【図１】本発明の第１実施形態に係る核酸検出カセットの概観斜視図。
【図２】同実施形態に係る核酸検出カセットの各構成を分離して示した斜視図。
【図３】同実施形態に係る中間部ブロックの切断部分斜視図。
【図４】同実施形態に係る中間部ブロック、端部ブロック及び検出部ブロックの詳細を示す斜視図。
【図５】同実施形態に係る中間部ブロックをＡ−Ａ部分で切断した要部断面図。
【図６】同実施形態に係る中間部ブロックをＢ−Ｂ部分で切断した要部断面図。
【図７】同実施形態に係る中間部ブロックをＣ−Ｃ部分で切断した要部断面図。
【図８】同実施形態に係る中間部ブロックをＤ−Ｄ部分で切断した要部断面図。
【図９】同実施形態に係るすべてのロッドを閉じた状態の中間部ブロックの斜視図。
【図１０】同実施形態に係るすべてのロッドを省略した状態の中間部ブロックの斜視図。
【図１１】同実施形態に係る出入流路用ロッドのみを閉じ、他のロッドを省略した状態の中間部ブロックの斜視図。
【図１２】同実施形態に係る連結流路用ロッドのみを閉じ、他のロッドを省略した状態の中間部ブロックの斜視図。
【図１３】同実施形態に係る中央ロッドのみを閉じ、他のロッドを省略した状態の中間部ブロックの斜視図。
【図１４】同実施形態に係る左翼ロッドのみを閉じ、他のロッドを省略した状態の中間部ブロックの斜視図。
【図１５】同実施形態に係る右翼ロッドのみを閉じ、他のロッドを省略した状態の中間部ブロックの斜視図。
【図１６】同実施形態に係る中央ロッド、左翼ロッド、右翼ロッドのみを閉じ、他のロッドを省略した状態の中間部ブロックの斜視図。
【図１７】同実施形態に係る押圧ブロックの各構成を分解して示した斜視図。
【図１８】同実施形態に係る保持流路の工程断面図。
【図１９】同実施形態に係る中間部ブロック及び押圧ブロックの切断部分斜視図。
【図２０】同実施形態に係る中間部ブロック及び押圧ブロックの切断部分斜視図。
【図２１】同実施形態に係る中間部ブロック及び押圧ブロックの切断部分斜視図。
【図２２】同実施形態に係る中間部ブロック及び押圧ブロックの切断部分斜視図。
【図２３】同実施形態に係る中間部ブロック及び押圧ブロックの切断部分斜視図。
【図２４】同実施形態に係る中間部ブロック及び押圧ブロックの切断部分斜視図。
【図２５】同実施形態に係る連結流路の断面図。
【図２６】同実施形態に係る出入流路の断面図。
【図２７】同実施形態に係る試薬送液の工程を模式的に示す図。
【図２８】同実施形態に係る試薬送液の工程に沿った保持流路の断面図。
【図２９】同実施形態に係る開口部の要部断面図。
【図３０】同実施形態に係る試料注入工程の模式図。
【図３１】同実施形態に係る一定量送液工程の模式図。
【図３２】同実施形態に係る最大保持量送液工程の模式図。
【図３３】同実施形態に係る１流路内加圧移動工程の模式図。
【図３４】同実施形態に係る１流路内等圧移動工程の模式図。
【図３５】同実施形態に係る２流路間往復移動工程の模式図。
【図３６】同実施形態に係る核酸検出チップの斜視図。
【図３７】同実施形態に係る検出流路シールを載置した核酸検出チップの斜視図。
【図３８】同実施形態に係る流路基板を含む検出部ブロックを表面側から見た斜視図。
【図３９】同実施形態に係る検出部ブロックを表面側から見た斜視図。
【図４０】同実施形態に係る検出部ブロックを裏面側から見た斜視図。
【図４１】同実施形態に係る検出部ブロックのＥ−Ｅ断面図。
【図４２】同実施形態に係る核酸検出カセットの流路系の初期注入の模式図。
【図４３】同実施形態に係る核酸検出カセットの流路系の１本鎖化の模式図。
【図４４】同実施形態に係る核酸検出カセットの流路系の保護鎖付与の模式図。
【図４５】同実施形態に係る核酸検出カセットの流路系のハイブリダイゼーションの模式図。
【図４６】同実施形態に係る核酸検出カセットの流路系のエアパージその１の模式図。
【図４７】同実施形態に係る核酸検出カセットの流路系の使用済生成物の送液その１の模式図。
【図４８】同実施形態に係る核酸検出カセットの流路系の使用済生成物の送液その２の模式図。
【図４９】同実施形態に係る核酸検出カセットの流路系の洗浄の模式図。
【図５０】同実施形態に係る核酸検出カセットの流路系のエアパージその２の模式図。
【図５１】同実施形態に係る核酸検出カセットの流路系の挿入剤の移送の模式図。
【図５２】同実施形態に係る核酸検出カセットの流路系の挿入および電気化学的測定の模式図。
【図５３】同実施形態に係る熱伝達ユニットの閉鎖系の核酸検出カセットへの熱伝達時の構成の一例を示す斜視図。
【図５４】同実施形態に係る熱伝達ユニットを核酸検出カセットから離間した状態の断面図。
【図５５】同実施形態に係る熱伝達ユニットを核酸検出カセットに接触させた状態の断面図。
【図５６】同実施形態に係る熱伝達ユニットを核酸検出カセットに接触させた状態の断面図。
【図５７】同実施形態に係る核酸検出システムのブロック図。
【図５８】同実施形態に係る自動制御機構の一例を示す図。
【図５９】同実施形態に係る自動制御機構の各構成を分離して示した斜視図。
【図６０】本発明の第２実施形態に係るカセット構造の断面図。
【図６１】同実施形態に係るカセット構造の断面図。
【図６２】同実施形態に係るカセット構造の断面図。
【図６３】同実施形態に係るカセット構造の断面図。
【図６４】同実施形態に係るカセット構造の断面図。
【図６５】同実施形態に係る退避流路と検出流路の変形例に係る核酸検出カセットの模式図。
【図６６】同実施形態に係る多重化した核酸検出カセットの一例を示す概観斜視図。
【図６７】同実施形態に係るＵ字型可変流路を採用した核酸検出カセットの組み立て前の分解斜視図。
【図６８】同実施形態に係るＵ字型可変流路を採用した核酸検出カセットの組み立て後の使用時の構成の斜視図。
【図６９】同実施形態に係る製品作製時のＵ字型流路の構成の一例を示す図。
【図７０】同実施形態に係る核酸検出カセットの製品出荷時の構成例を示す図。
【図７１】同実施形態に係る容積可変のＵ字型流路の基本構造を説明するための図。
【図７２】同実施形態に係る圧縮用加圧を用いた流路開閉状態を示す図。
【図７３】同実施形態に係る自己封止型ポートを用いたカセット注液動作を説明するための斜視図。
【図７４】同実施形態に係る流路ブロックの詳細な構成を示す図。
【図７５】同実施形態に係る無気泡注液を説明するための図。
【図７６】同実施形態に係る試薬を保持する実施形態の変形例を示す図。
【図７７】同実施形態に係る熱伝達時の熱循環動作を説明するための斜視図。
【図７８】同実施形態に係る熱循環時の流路の詳細の模式図。
【図７９】同実施形態に係る熱伝達時の熱循環動作を説明するための斜視図。
【図８０】同実施形態に係る送液工程の一例を説明するための斜視図。
【図８１】同実施形態に係る送液の工程を示す模式図。
【図８２】同実施形態に係る保持流路にフィルタを配置した例を示す図。
【符号の説明】
【０２８２】
１…固定基板、２…可撓性シート、３…カバープレート、４…押圧ブロック
１００…核酸検出カセット、１０１…中間部ブロック、１０２、１０３…端部ブロック、０６…検出部ブロック、１１１…保持流路、１１２，１１３…連結流路、１１４，１１５…出入流路、１１６〜１１７…連結流路、１１８〜１１９…検出流路端部、１２１，１２２…開口部、１２５…シールレセス、１２６…左導入流路、１２７…右導入流路、１２８…チップレセス、１３１…退避流路、１５１…接点部開口、３００…ピペット、３０１，３０２…先端チップ、３０３…試薬、３０４…気体、３０５…試料、３１４，３１５…出入バルブ、３１６，３１７…連結バルブ、４０１〜４０８…押圧パッド、４１１〜４１７…可動ロッド、４１４ａ…棒状部材、４１４ｂ…支点部、４３１〜４３７…ロック部、４４４ａ，４４４ｂ…前方支点部、４４６…後方支点部、４５１，４６１…支点部、４５２，４６２…棒状部材、４５３，４６３…爪状部材、５００…核酸検出チップ、５０１…核酸固定化電極、５０１，５０３，５０４…電極、５０２…核酸プローブ、５１１，５１３，５１４…接点、５２０…検出流路シール、５２１…流路開口、５３１…検出流路、６００，６１０…熱伝達ユニット、６０１ａ…ペルチェ素子、６０２ａ…ヒートシンク、６０３ａ…冷却ファン、６０４ａ…接触パッド、７０１，７０２…駆動ユニット、７０３…電気コネクタ、７１１…Ｚ駆動装置、７１３ａ…可動Ｙステージ、７１３ｂ…可動取付板、７１４…Ｘ駆動装置、７２０…支持台、７２１…カセットホルダ、７２１ａ，７２１ｂ…レール、７２２…固定Ｘステージ、７２３…可動Ｘステージ、７２４…Ｚステージ取付板、７２５…固定Ｚステージ、７２６…可動Ｚステージ、７２７…取付板、７３２…Ｙ駆動装置、７４１…取付台、７５１…ホストパーソナルコンピュータ、７５２…検査装置本体、７５３…制御部、７５４…メインコントローラ、７５５…アクチュエータドライバ、７５６…温度制御ドライバ、７５７…電流測定ドライバ、７５８…電源・ファン、７６１…電流測定端子部、７６２…送液アクチュエータ、７６３…着脱アクチュエータ、７６４…位置センサ、７６５…クーラ、７６６…温度センサ、７７１…固定基板、７７２…流路、７７３…可撓性シート、７７６…固定基板、７７７…流路、７７８…可撓性シート、７７９…可撓性シート、７８０…流路、７８１…コーティング部材、７９０…核酸検出カセット、７９１ａ〜７９１ｈ…流路、７９２ａ〜７９２ｇ…連結バルブ、７９３ａ，７９３ｂ，７９４ａ〜７９４ｈ…バルブ、７９５…固定基板、７９６…可撓性シート、７９７…核酸検出カセット、８１１ａ〜８１１ｆ…流路、８１４…出入バルブ、８３１〜８３７…連結バルブ、９００…核酸検出カセット、９０１…チップホルダ、９０２…核酸検出チップ、９０３…チップカバー、９０４…流路ブロック、９０５…可撓性シート、９０６…シールブロック、９１１…流路、９１２…検出流路シール、９１３…Ｕ字型流路、９１４…連結バルブ、９１６ａ〜９１６ｇ…連結バルブ、９１７ａ…自己封止型ポート、９１８…検出流路、９１８ａ〜９１８ｃ…圧縮用加圧パッド、９２０ａ…注液チップ、９２０ｂ…逆止弁付チップ、９２１ａ〜９２１ｆ…流路加圧パッド、９２２ａ〜９２２ｇ…連結加圧パッド、９２３ａ〜９２３ｌ…出入加圧パッド、９２４ａ，９２４ｂ…出入バルブ、９２５…連結流路、９２６…個別試薬保持部、９３３…送液モジュール、９３４…加圧パッド開閉ローラ、９３７…フィルタ
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸を含む試料の投入から、核酸増幅およびその他の必要な処理と目標核酸の検出までを一貫して自動的に処理するのに用いられる閉鎖型の核酸検出カセット、核酸検出装置およびそれを用いた核酸検出システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅技術の登場と核酸検出技術の向上により、特定ＤＮＡストランドの検出の実施が増加している。しかしながら、核酸増幅においては増幅した核酸による汚染の可能性、あるいは温度条件、注液、混合等の複雑な操作が必要なため、これらの技術の実施は試験研究用に限られてきた。
【０００３】
従来、こうした問題点を解決し、病院、臨床試験所、検疫所等で核酸検出を実施できるようにするため、核酸を含む試料の処理から目標核酸の検出までを一貫して自動的に処理する、使い捨て可能な閉鎖型検出容器およびそれを用いた検出装置が開示されてきた。
【０００４】
例えば、特許２５３６９４５号公報（特許文献１）には必要なすべての試薬を収納する核酸の増幅および検出用のキュベット（ｃｕｖｅｔｔｅ）が、特開平８-６２２２５号公報（特許文献２）には遠心力を利用して送液する試験ユニットが、特表平９-５１１４０７号公報（特許文献３）には微細加工技術を使用して固体基板に形成された微細流路および反応室が開示されている。
【特許文献１】特許２５３６９４５号公報
【特許文献２】特開平８-６２２２５号公報
【特許文献３】特表平９-５１１４０７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
（１）気泡の悪影響
核酸増幅から検査までの一連の過程を一貫して実施可能な流路構造において、液体内に気泡が取り込まれると以下のような悪影響が発生する。
【０００６】
１）ＰＣＲおよび加熱過程において、気泡内に水分が蒸発することにより試薬濃度の増加をもたらし、反応の阻害要因となる。
【０００７】
２）気泡、気体部分があると気体の熱膨張率が大きいので、容器内圧力の上昇につながり、液漏れ、汚染の原因となる。
【０００８】
３）気泡、気体部分があると熱伝導率が小さいので熱伝達を阻害する。
４）加圧・吸引による送液時に、気泡があると気泡の体積が変化するので送液困難となる。
【０００９】
（２）特許文献１の問題点（特許２５３６９４５号公報）
特許２５３６９４５号公報には、パウチ型のキュベットを利用した核酸増幅から検査までの一連の過程を一貫して実施可能な流路構造が示されている。しかしながらパウチ型のキュベットでは、形状が不安定で、注液時に気泡の混入が避けられない。また送液には、キュベット内に複数のピストンを必要とする実施例が示されているが、これでは、使い捨てに対して望ましくない。
【００１０】
（３）特許文献２の問題点（特開平８-６２２２５号公報）
特開平８-６２２２５号公報には、遠心力を利用した核酸増幅から検査までの一連の過程を一貫して実施可能な流路構造が示されている。遠心力を利用すれば、気相と液相とを分離でき気泡を除去できるが、装置の複雑化、大型化からまぬがれない。さらに、遠心力と逆方向への送液ができない。したがって液体の往復動ができず、試薬混合、検出での洗浄が困難になる。
【００１１】
（４）特許文献３の問題点（特表平９-５１１４０７号公報）
特表平９-５１１４０７号公報には、固定基板上の微細流路利用した、核酸増幅から検査までの一連の過程を一貫して実施可能な流路構造が示されている。しかしながら、初期的に気体で充填されている流路内に、気泡を巻き込まずに流路内に試薬の注入する方法については開示されていない。また送液に関しては、全流路の端部に位置する入出力ポートからの加圧・吸引による送液方法が開示されているが、気泡があると気体の体積が変動する可能性があるので、実施に際しては制御が困難である。さらに、細く長い流路の端部での、圧力による液体の移動制御は流体の移動時の抵抗が大きくなり制御困難である。
【００１２】
（５）閉鎖系での試薬混合
オペレータによる反応の実施においては、試薬の混合は公知の加振器等で行なわれてきたが、このとき試薬を保持するチューブには液層と気層が存在しているので、振動によって気泡が液体中に多数取り込まれる。このため、混合の後には遠心分離機を用いて、チューブ内を液層と気層の２つに分離する必要があった。ところが、これまでの技術では、特開平８-６２２２５号公報に示されるような、遠心力利用の自動検出装置以外では、使い捨て可能な閉鎖型検出容器において、気泡を巻き込まずに試薬を混合する有効な方法が開示されていない。
【００１３】
（６）流体の移動制御が容易な流路
特開平８-６２２２５号公報に示されるような、遠心力利用の自動検出装置以外では、送液、混合のため、長く曲がりくねった複雑な流路構造のみが開示され、流体の移動制御が容易な流路を構成する技術は開示されていない。
【００１４】
本発明は上記課題を解決するためになされたもので、その目的とするところは、核酸増幅およびその他の必要な処理と目標核酸の検出までを一貫して自動的に処理するのに用いられる閉鎖型の核酸検出カセット、核酸検出装置およびそれを用いた核酸検出システムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明のある観点によれば、試料に含まれる核酸を検出するために固定部材と可撓性部材との組合せにより流路が構成された核酸検出カセットであって、前記流路は、容積が可変で試薬を保持可能でかつ前記核酸検出カセット外部と連通可能な開状態と閉鎖可能な閉状態を選択可能な出入口孔を有する保持流路と、この保持流路に接続され保持流路と連通可能な開状態と閉鎖可能な閉状態を選択可能な連結流路とを備え、前記核酸検出カセットは、前記出入口孔を閉状態で維持可能な出入口開閉手段と、前記連結流路を閉状態で維持可能な連結流路開閉手段と、を備えることを特徴とする核酸検出カセットが提供される。
【００１６】
また、本発明の別の観点によれば、上記核酸検出カセットと、この核酸検出カセットの保持流路内に充填された試薬と、前記核酸検出カセットの検出流路内に固定化され、検出対象の核酸に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブとを具備してなることを特徴とする核酸検出装置が提供される。
【００１７】
本発明のさらに別の観点によれば、記載の核酸検出カセットと、この核酸検出カセットを保持するカセット保持手段と、このカセット保持手段により保持された前記核酸検出カセット内の前記保持流路の第１の領域に対して前記可撓性部材を変形させて前記保持流路を変形させる第１の駆動機構と、前記カセット保持手段により保持された前記核酸検出カセット内の前記保持流路の第２の領域に対して前記可撓性部材を変形させて前記保持流路を変形させる第２の駆動機構と、前記連結流路開閉手段を駆動する連結流路開閉駆動機構と、前記保持流路及びまたは前記検出流路の温度を制御する温度制御手段と、を具備してなることを特徴とする核酸検出システムが提供される。
【００１８】
また、装置あるいはシステムに係る本発明は、その装置あるいはシステムにより実現される方法の発明としても成立する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、液体内に気泡が取り込まれることがなく、核酸増幅およびその他の必要な処理と目標核酸の検出までを一貫して自動的に処理することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態を説明する。
【００２１】
（第１実施形態）
（１）カセット基本構造
図１は本発明の第１実施形態に係る核酸検出カセット１００の概観斜視図である。この核酸検出カセット１００は、大別して固定基板１と、可撓性シート２と、カバープレート３からなる流路閉鎖型のカセットである。固定基板１は固定部材により構成され、連続している流路を形成する。可撓性シート２は、固定基板１により形成された流路の上面を覆うもので、可撓性部材により構成されている。カバープレート３は、固定基板１との間に可撓性シート２を挟んで支持するとともに、可撓性シート２を局部的に押圧し変形させる押圧ブロック４を備えている。
【００２２】
固定基板１は、ポリプロピレン、ポリカーボネイト、ＰＯＭ、ＰＭＭＡ等の高分子材料、シリコン、ガラスやセラミックスなど、あるいはステンレス、アルミなどの金属により構成される。可撓性シート２は、シリコーンゴム、ポリプロピレンゴム、ウレタンゴム等の高分子エラストマーなどにより構成される。カバープレート３は、ポリプロピレン、ポリカーボネイト、ＰＯＭ、ＰＭＭＡ等の高分子材料あるいは、シリコン、ステンレス、アルミ等の金属などにより構成される。固定基板１、可撓性シート２及びカバープレート３が複数の部品から構成される場合には、それぞれ別の材料を選択してもよい。
【００２３】
また、核酸検出カセット１００はその機能によりブロック化されている。図１の例では、上流側、すなわち図１の左側から順に、端部ブロック１０２と、２つの中間部ブロック１０１と、検出部ブロック１０６と、中間部ブロック１０１と、端部ブロック１０３からなる。検出部ブロック１０６は特に核酸検出用のブロックであり、それ以外の端部ブロック１０２、１０３及び中間部ブロック１０１は、核酸検出以外の各種反応用のブロックである。これら各ブロックはその表面に設けられた流路が連結されるように互いに接合されている。各ブロックの接合は、不図示の締結部材や締結部によりなされる。あるいは、各ブロックを統合して一体的に形成される。
【００２４】
図２は図１に示す核酸検出カセット１００の各構成を分離して示した斜視図である。
【００２５】
固定基板１の上面には溝が設けられている。この溝を覆うように、固定基板１の上面に可撓性シート２の下面が接着あるいは溶着されることにより、溝が閉鎖された流路として機能する。すなわち、底面及び側面は固定基板１により構成され、上面は可撓性シート２で覆われた流路が形成される。端部ブロック１０２、中間部ブロック１０１上に設けられた溝は保持流路１１１として、検出部ブロック１０６上に設けられた溝は退避流路１３１として機能する。各保持流路１１１及び退避流路１３１の間は互いに流路により連結される。可撓性シート２の上面には、カバープレート３の下面が接着あるいは溶着される。これにより、カバープレート３の上面に設けられた押圧ブロック４の押圧により、対応する押圧部分の可撓性シート２を撓ませ流路を閉じることができる。
【００２６】
検出部ブロック１０６の下面には、検出用の流路が設けられた検出流路シール５２０を挟んで核酸検出チップ５００が固定化される。また、検出部ブロック１０６には、その表面から裏面まで貫通して形成された接点部開口１５１が２つ設けられている。この接点部開口１５１に電気コネクタを挿入して露出した核酸検出チップ５００の表面に接触させることにより、チップ表面から電気信号を取り出すことができる。
【００２７】
（２）流路及び押圧機構
次に、図３〜図２８を用いて、押圧ブロック４により可撓性シート２を変形させ、流路の所要部分の容積を可変させるための構造及び動作について説明する。
【００２８】
（２）−１ 中間部ブロック１０１
図３は中間部ブロック１０１を他のブロックから切断して部分的に示した斜視図である。図３に示すように、ほぼ長方形の保持流路１１１の流路開始端部と流路終了端部には、出入流路１１４及び１１５がそれぞれ接続されている。これら出入流路１１４及び１１５は、試薬および核酸を含む試料を核酸検出カセット１００内に注入し、あるいは核酸検出カセット１００外に排出するのに用いられる。また、流路開始端部にはさらに連結流路１１６が、流路終了端部にはさらに連結流路１１７が接続されている。これら連結流路１１６及び１１７は、中間部ブロック１０１の周縁まで延びており、隣接して結合される他のブロックに設けられた流路と連結可能に構成されている。これら連結流路１１６、保持流路１１１、連結流路１１７の順に連結した流路が構成される。すなわち、これら連結流路１１６及び１１７の一方を通じて、他のブロックからの液体や気体（以下、単に流体と呼ぶ）を受け入れて保持流路１１１に送り込み、かつ連結流路１１６及び１１７の他方を通じて、他のブロックに保持流路１１１内の流体を送り出すことができる。
【００２９】
（２）−２ 端部ブロック１０２、１０３及び検出部ブロック１０６
図４は中間部ブロック１０１、端部ブロック１０２、１０３及び検出部ブロック１０６の詳細を示す斜視図である。
【００３０】
端部ブロック１０２は、ほぼ長方形の保持流路１１１を備える点、保持流路１１１の流路開始端部及び流路終了端部に出入流路１１４及び１１５が接続される点、流路終了端部にはさらに連結流路１１７が接続されている点で中間部ブロック１０１と共通する。端部ブロック１０２の場合、中間部ブロック１０１と異なり、流路開始端部には連結流路が設けられていない。
【００３１】
検出部ブロック１０６には、保持流路１１１の代わりにほぼ長方形の退避流路１３１が設けられている。退避流路１３１の構成は保持流路１１１と同じでよい。退避流路１３１の流路開始端部及び流路終了端部にはそれぞれ連結流路１１６及び１１７が接続されている。出入流路は設けられていない。また、連結流路１１６にはさらに流路１１８が接続され、連結流路１１７にはさらに流路１１９が接続されている。これら流路１１８及び１１９は、さらに検出部ブロック１０６の裏面まで貫通形成された後述の左導入流路１２６及び右導入流路１２７に接続されている。この不図示の左導入流路１２６及び右導入流路１２７を介して、検出部ブロック１０６の裏面に設けられる検出流路と流路１１８及び１１９が接続され、流体が退避流路１３１と検出流路を行き来することができるようになっている。
【００３２】
また、端部ブロック１０３は、ほぼ長方形の保持流路１１１を備える点、保持流路１１１の流路開始端部及び流路終了端部に出入流路１１４及び１１５が接続される点、流路開始端部にはさらに連結流路１１６が接続されている点で中間部ブロック１０１と共通する。端部ブロック１０３の場合、中間部ブロック１０１と異なり、流路終了端部には連結流路が設けられていない。
【００３３】
（２）−３ 流路主要寸法形状例
上記図３及び図４に示される各構成の寸法例は以下の通りである。
【００３４】
保持流路１１１及び退避流路１３１の寸法は、深さ約０．５ｍｍ、隣接流路に向かう方向の長さ、すなわち流路開始端部と流路終了端部との間の長さ約１０ｍｍ、隣接流路に向かう方向とは垂直な方向の長さ、すなわち流路幅約１０ｍｍ、で、標準保持容積約４０μｌである。押圧ブロック４が外側に開く場合には、可撓性シート２は外側に膨張することができ、例えば標準保持容積の約２〜３倍の保持容積を維持することができる。なお、退避流路１３１の容積は、核酸検出動作開始前は縮小された状態で維持され、検出動作開始時には拡大可能であり、その拡大時と縮小時の流路容積の差は検出流路内の充填物の体積以上に設定される。
【００３５】
出入流路１１４、１１５の寸法は、深さ約０．２５ｍｍ、保持流路に向かう方向の長さ約２〜３ｍｍ、保持流路に向かう方向とは垂直な方向の長さ、すなわち流路幅約２ｍｍで、流路容積がほぼゼロの全閉状態が設定可能である。
【００３６】
連結流路１１６、１１７の寸法は、深さ約０．２５ｍｍ、隣接流路に向かう方向の長さ約２〜６ｍｍ、保持流路に向かう方向とは垂直な方向の長さ、すなわち流路幅約２ｍｍで、流路容積がほぼゼロの全閉状態が設定可能である。
【００３７】
また、可撓性シート２が撓む際に無理な内部応力等が発生せずに、かつ流路底面に対して確実に密着して流路容積がほぼゼロになるように設定可能なように、流路断面の底面から側面にかけていずれも滑らかな曲線で構成されている。
【００３８】
可撓性シート２の厚さは０．２〜０．５ｍｍで、ゴム硬度ＪＩＳ−Ａ２０°〜３０°、アスカーＣ２０°〜４０°の比較的硬度の高いものと、硬度の低い柔らかいもののいずれも使用可能である。
【００３９】
（２）−４ 押圧パッド
図３にはさらに、可撓性シート２と押圧部材すなわち押圧ブロック４が固定基板１へ接着される前の分離した状態で示されている。なお、説明の便宜のため、図３では押圧ブロック４の一部としてパッドのみを示している。可撓性シート２及び押圧ブロック４は、他のブロック上に設けられるものから切断して部分的に示してある。中間部ブロック１０１には、保持流路１１１、出入流路１１４及び１１５、連結流路１１６及び１１７が設けられている。可撓性シート２はこれら各流路開口面を覆い閉鎖流路を形成する。また、この可撓性シート２上には複数のパッドが配置される。
【００４０】
保持流路１１１の上部で可撓性シート２上には、中央パッド４０１、左翼パッド４０２及び右翼パッド４０３が配置される。左翼パッド４０２及び右翼パッド４０３はそれぞれ保持流路１１１の流路開始端部と流路終了端部の上部とその近傍に位置する。中央パッド４０１は、流路幅が広がった部分でかつ左翼パッド４０２及び右翼パッド４０３に接する部分に位置する。これらパッド４０１，４０２及び４０３により保持流路１１１の上部がほぼ覆われる。本実施形態では、左翼パッド４０２及び右翼パッド４０３はほぼ同面積で、中央パッド４０１は左翼パッド４０２及び右翼パッド４０３の面積をあわせた程度に設定されている。
【００４１】
出入流路１１４及び１１５の上部には、それぞれ左出入パッド４０４及び右出入パッド４０５が配置されている。
【００４２】
連結流路１１６および１１７の上部には、それぞれ左連結パッド４０６及び右連結パッド４０７が配置されている。
【００４３】
これら各パッドは、可撓性シート２表面側から固定基板１側に向けてほぼ垂直に押圧されることにより、対応する固定基板１の溝に可撓性シート２が密着して容積がほぼゼロになるような形状をなす。
【００４４】
（２）−５ 流路断面メカニズム
（２）−５−１ Ａ−Ａ断面
図５は図３の中間部ブロック１０１をＡ−Ａ部分で切断した要部断面図であり、出入口部の構成を詳細に示すものである。図５（ａ）は開状態、図５（ｂ）は閉状態を示す図である。出入流路１１４及び１１５の底面の一部には、開口部１２１及び１２２が連結されている。この開口部１２１及び１２２は固定基板１の裏面まで貫通して形成されており、試薬などを外部から注入することができる。
【００４５】
図５（ａ）に示すように、左出入パッド４０４及び右出入パッド４０５が可撓性シート２に対して押し込まれていない状態では、出入流路１１４及び１１５と、開口部１２１及び１２２とにより、核酸検出カセット１００の外部と流路内部で試薬などの流体の移動が可能である。これに対して、図５（ｂ）に示すように、左出入パッド４０４及び右出入パッド４０５が外部駆動力により可撓性シート２に対して同図矢印に示す方向に押し込まれている状態では、可撓性シート２が変形し、出入流路１１４及び１１５の流れを閉鎖し、核酸検出カセット１００の外部と流路内部が隔絶される。
【００４６】
（２）−５−２ Ｂ−Ｂ断面
図６は図３の中間部ブロック１０１をＢ−Ｂ部分で切断した要部断面図であり、連結流路１１２及び１１３近傍の構造を詳細に示すものである。図６（ａ）は開状態、図６（ｂ）は半開半閉状態、図６（ｃ）は閉状態を示す図である。
【００４７】
図６（ａ）に示すように、左翼パッド４０２および右翼パッド４０３が可撓性シート２に対して押し込まれていない状態では、保持流路１１１底面と可撓性シート２とで形成される空間で流体の保持が可能である。図６（ｂ）に示すように、左翼パッド４０２が不図示の外部駆動力により押し込まれ右翼パッド４０３が押し込まれていない状態では、可撓性シート２が変形し、保持流路１１１の左側部分の流路開始端部近傍を閉鎖することが可能である。このとき保持流路１１１底面と可撓性シート２とで形成される流路容積は図６（ａ）の場合のおよそ１／２になる。また、右翼パッド４０３のみが押し込まれている状態も同様である。図６（ｃ）に示すように、さらに右翼パッド４０３が不図示の外部駆動力により押し込まれている状態では、可撓性シート２が変形し、さらに保持流路１１１の右側部分の流路終了端部近傍を閉鎖することが可能である。このとき保持流路１１１底面と可撓性シート２とで形成される連結流路１１２及び１１３近傍の流路容積を、ほぼゼロにし、保持流路１１１全体の流路容積をおよそ１／４とすることができる。
【００４８】
（２）−５−３ Ｃ−Ｃ断面
図７は図３の中間部ブロック１０１をＣ−Ｃ部分で切断した要部断面図であり、連結流路１１２及び１１３から離れた部分の構造を詳細に示すものである。図７（ａ）は開状態、図７（ｂ）は閉状態を示す図である。図７（ａ）に示すように、中央パッド４０１が可撓性シート２に対して押し込まれていない状態では、保持流路１１１底面と可撓性シート２とで形成される空間で流体の保持が可能である。図７（ｂ）に示すように、中央パッド４０１が不図示の外部駆動力により同図矢印に示す方向に押し込まれている状態では、可撓性シート２が変形し、保持流路１１１は閉鎖される。このとき保持流路１１１底面と可撓性シート２とで形成される連結流路１１２及び１１３から離れた部分の流路容積を、ほぼゼロにし、保持流路１１１全体の流路容積をおよそ１／４とすることができる。
【００４９】
（２）−５−４ Ｄ−Ｄ断面
図８は図３の中間部ブロック１０１をＤ−Ｄ部分で切断した要部断面図であり、連結流路１１７の構造を詳細に示すものである。図８（ａ）は開状態、図８（ｂ）は閉状態を示す図である。図８（ａ）に示すように、右連結パッド４０７が可撓性シート２に対して押し込まれていない状態では、連結流路１１７底面と可撓性シート２とで形成される空間で流体の保持が可能である。図８（ｂ）に示すように、右連結パッド４０７が不図示の外部駆動力により同図矢印に示す方向に押し込まれている状態では、可撓性シート２が変形し、連結流路１１３が閉鎖される。このとき連結流路１１７底面と可撓性シート２とで形成される流路容積を、ほぼゼロにすることができる。また、連結流路１１６についても同様に流路容積を変えることができる。
【００５０】
なお、退避流路１３１についても、図６〜図８で説明した保持流路１１１と同様に、流路容積を変えることができる。
【００５１】
（２）−６ 押圧ブロック４の開閉機構
（２）−６−１ 押圧ブロック基本構造
次に、図９〜図２８を用いて、押圧ブロック４とカバープレート３の各部の連動で動作する、押圧ブロック４の開閉機構について中間部ブロック１０１を例にとり説明する。
【００５２】
押圧パッド４０１〜４０８の移動および固定には各種の方法が適応可能だが、以下で説明するように本実施形態では１つの支点を有する可動ロッドと、可動ロッドの端部を一時固定するロック部を採用する。
【００５３】
図９〜図１６は、押圧ブロック４の詳細構成を示す斜視図であり、各々の図が各構成の開閉状態に対応している。図１７は、図９〜図１６に示した押圧ブロック４の各構成を分解して示した斜視図である。
【００５４】
図１７に示すように、可動ロッドとして中央ロッド４１１、左翼ロッド４１２、右翼ロッド４１３、可動ロッド４１４及び４１５、可動ロッド４１６及び４１７が設けられている。これら各可動ロッド４１１〜４１７には、それぞれ中央パッド４０１、左翼パッド４０２、右翼パッド４０３、左出入パッド４０４、右出入パッド４０５、左連結パッド４０６及び右連結パッド４０７が一体的に形成されている。
【００５５】
図９〜図１６は押圧ブロック４を種々開閉し、あるいは省略した中間部ブロック１０１の斜視図である。図９は、すべてのロッド４１１〜４１７を閉じた状態を示している。図１０は、すべてのロッド４１１〜４１７を省略して示している。図１１は、ロッド４１４及び４１５のみを閉じ、他のロッド４１１〜４１３、４１６及び４１７を省略した状態を示している。図１２は、ロッド４１６及び４１７のみを閉じ、他のロッド４１１〜４１５を省略した状態を示している。図１３は、中央ロッド４１１のみを閉じ、他のロッド４１２〜４１７を省略した状態を示している。図１４は、左翼ロッド４１２のみを閉じ、他のロッド４１１、４１３、４１４〜４１７を省略した状態を示している。図１５は、右翼ロッド４１３のみを閉じ、他のロッド４１１、４１２、４１４〜４１７を省略した状態を示している。図１６は、中央ロッド４１１、左翼ロッド４１２、右翼ロッド４１３のみを閉じ、他のロッド４１４〜４１７を省略した状態を示している。
【００５６】
可動ロッド４１１〜４１７の固定方法は大別して２つあり、１つは、押圧固定した状態を保持するために爪状部材をロック部に設けられた凹部にはめ込みロッドを押し下げ固定する方法であり、可動ロッド４１１〜４１３、４１６及び４１７が該当する。もう１つは、押圧固定した状態を保持するためにロック部をロッドとカバープレート３との間に挿入しロッドを持ち上げ固定する方法であり、可動ロッド４１４及び４１５が該当する。
【００５７】
押し下げ固定手法による可動ロッドは支点部、棒状部材、爪状部材及びパッドが一体的に形成された構成をなす。また、ロック部は、爪状部材と凹部とを備える。図１７に示すように、各可動ロッド４１１〜４１３、４１６及び４１７の一端にはそれぞれ支点部４５１、４６１、４７１、４８１及び４９１が設けられている。そして、これら支点部４５１、４６１、４７１、４８１及び４９１には棒状部材４５２、４６２、４７２、４８２及び４９２が取り付けられている。棒状部材４５２、４６２、４７２、４８２及び４９２の先端には、それぞれ爪状部材４５３、４６３、４７３、４８３及び４９３が設けられ、その中途の部分には、それぞれパッド４０１、４０２、４０３、４０６及び４０７が固定されている。
【００５８】
支点部４５１、４６１、４７１、４８１及び４９１はいずれも、カバープレート３に固定された一連の後方支点部４４６に可動可能に取り付けられている。より具体的には、後方支点部４４６の各孔と、支点部４５１、４６１、４７１、４８１及び４９１の孔に不図示の固定バーを通すことにより、可動ロッド４１１〜４１３、４１６及び４１７が支点部４５１、４６１、４７１、４８１及び４９１を中心として、可動範囲で回動可能である。
【００５９】
可動ロッド４１１〜４１３、４１６及び４１７は、カバープレート３に形成されたロック部４３１、４３２、４３３、４３６及び４３７で、それぞれ対応する流路部分を閉鎖状態で維持できる。すなわち、各ロッドに設けられた爪状部材４５３、４６３、４７３、４８３及び４９３をそれぞれロック部４３１、４３２、４３３、４３６及び４３７の凹部にはめこみ固定することで、各ロッドは押し下がった状態に保持され対応する流路を閉鎖できる。
【００６０】
ロック部４３１、４３２、４３３、４３６及び４３７は、それぞれ核酸検出カセット１００の外部からの駆動力でその爪状部材部分が弾性的に撓み、各可動ロッド４１１、４１２、４１３、４１６及び４１７を個別に開放する。このとき可撓性シート２は自己の弾性力で撓む前の元の状態に復帰し、対応する流路部分が開放される。ただし、外部からの駆動力により、開放速度にブレーキをかけ規制することは可能である。
【００６１】
なお、退避流路１３１の各流路に対しても同様のメカニズムで閉鎖、開放が可能である。
【００６２】
持ち上げ固定手法による可動ロッドは、棒状部材、支点及びパッドが一体的に形成された構成をなす。また、ロック部は、爪状部材と凹部とを備える。各可動ロッド４１４及び４１５の棒状部材４１４ａ及び４１５ａの一端には、出入パッド４０４及び４０５がそれぞれ固定される。また、棒状部材４１４ａ及び４１５ａの中途の部分には支点部４１４ｂ及び４１５ｂがそれぞれ設けられている。
【００６３】
支点部４１４ｂ及び４１５ｂはいずれも、カバープレート３に固定された一連の前方支点部４４４ａ及び４４４ｂに可動可能に取り付けられている。より具体的には、前方支点部４４４ａ及び４４４ｂの各孔と、支点部４１４ｂ及び４１５ｂの孔に不図示の固定バーを通すことにより、可動ロッド４１４及び４１５が支点部４１４ｂ及び４１５ｂを中心として可動範囲で回動可能である。
【００６４】
可動ロッド４１４及び４１５は、それぞれカバープレート３に形成されたロック部４３４及び４３５で、出入流路１１４及び１１５を閉鎖状態に維持できる。より具体的には、ロック部４３４及び４３５を可動ロッド４１４及び４１５とカバープレート３との間に挿入すればよい。ロック部４３４は、カセット１００の外部からの駆動力でその爪状部材部分が弾性的に撓み、可動ロッド４１４を開放し、出入流路１１４を開放する。このとき可撓性シート２は自己の弾性力で元の状態に復帰する。出入流路１１５に対する右出入パッド４０５に対しても同様のメカニズムで閉鎖状態維持、開放が可能である。
【００６５】
（２）−６−２ 保持流路１１１及び退避流路１３１
次に、図１８〜図２４を用いて保持流路１１１及び退避流路１３１の開閉動作の詳細を説明する。
【００６６】
保持流路１１１および退避流路１３１は、中央ロッド４１１、左翼ロッド４１２、右翼ロッド４１３を個別に駆動させることにより、様々な種類の流路容積パターンが実施可能である。
【００６７】
以下、図１８（ａ）〜（ｄ）の断面図、図１９〜図２４の切断部分斜視図を使用して、全閉状態から全開状態までの各種パターンの例を示す。
【００６８】
図１８（ａ）、図１９は、中央ロッド４１１、左翼ロッド４１２及び右翼ロッド４１３がそれぞれロック部４３１、４３２及び４３３によってロックされ、保持流路１１１が全閉状態で維持されている状態を示している。この状態から、図２０に示すように、右翼ロッド４１３のみを開放することも可能で、このとき保持流路１１１は、流路終了端部近傍が半開放状態となる。なお、図２０では左翼ロッド４１２は省略してある。さらに、図１８（ｂ）、図２１に示すように、左翼ロッド４１２、右翼ロッド４１３の両方を開放すると、保持流路１１１は前方、すなわち流路開始端部及び流路終了端部に近い部分が半開放状態となる。一方、図１８（ｃ）、図２２に示すように、中央ロッド４１１のみを開放すると、保持流路１１１は後方、すなわち流路開始端部及び流路終了端部から離れた部分が半開放状態となる。なお、図２２では左翼ロッド４１２及び右翼ロッド４１３は省略してある。図１８（ｄ）、図２３は、中央ロッド４１１、左翼ロッド４１２、右翼ロッド４１３のすべてを開放し、保持流路１１１が全開状態で維持されている状態を示している。なお、図２４は、中央ロッド４１１、左翼ロッド４１２、右翼ロッド４１３をさらに開放し、パッド形成面を示してある。
【００６９】
（２）−６−３ 連結流路１１６及び１１７
図２５（ａ）は、可動ロッド４１６がロック部４３６によってロックされ、連結流路１１６が全閉状態で維持されている状態を示している。この状態でロックを外すと図２５（ｂ）のようになる。すなわち、図２５（ｂ）は、外部駆動力によってロック部４３６が変形し、可動ロッド４１６がロック部４３６から開放され、連結流路１１２が全開状態で維持されている状態を示している。
【００７０】
なお、連結流路１１７についても同様に開閉が制御できる。
【００７１】
（２）−６−４ 出入流路１１４及び１１５
図２６（ａ）は、可動ロッド４１４がロック部４３４によってロックされ、出入流路１１４が全閉状態で維持されている状態を示している。より具体的には、ロック部４３４が可動ロッド４１４とカバープレート３との間に挿入されているため、可動ロッド４１４のパッドが形成されている側と支点部４１４ｂを挟んで反対側の部分を押し上げる力が働く。これに対応して、支点部４１４ｂを挟んで反対側の左出入パッド４０４は押し下がり、全閉状態が維持される。
【００７２】
図２６（ｂ）は、外部駆動力によってロック部４３４が変形し、可動ロッド４１４がロック部４３４から開放され、出入流路１１４が全開状態で維持されている状態を示している。ロック部４３４の変形は、例えば同図矢印で示す方向にロック部４３４を引き抜くことで、ロック部４３４の押し上げ力が無くなる。これに対応して、支点部４１４ｂを挟んで反対側の左出入パッド４０４は押し上がり、可撓性シート２の復元力により全開状態が維持される。
【００７３】
（３）流体移動制御方法
これまで述べてきた流路およびその容積を可変する押圧機構を使用して、流路内を移動する流体制御方法について説明する。
【００７４】
（３）−１ 試薬・試料注入
（３）−１−１ 試薬送液
保持流路１１１に試薬を注入するためには、核酸検出カセット１００の裏面に設けられた開口部１２１及び１２２を利用する。
【００７５】
図２７は試薬送液の工程を模式的に示す図である。図２７は、可変容積型の保持流路１１１を模式的に示している。また、図２８は、この試薬送液の工程に沿った保持流路１１１の断面図を模式的に示している。
【００７６】
同図の出入バルブ３１４及び３１５は、出入流路１１４及び１１５、出入パッド４０４及び４０５と可撓性シート２とを組み合わせて、その機能を表現する構成として模式的に示したものである。
【００７７】
連結バルブ３１６及び３１７は、連結流路１１６及び１１７、連結パッド４０６及び４０7と可撓性シート２と組み合わせて、その機能を表現する構成として模式的に示したものである。
【００７８】
容積が可変する保持流路１１１は、その容積の平面形状が模式的に示される。なお、図２７では示していないが退避流路１３１についても同様に示される。
【００７９】
ａ．初期流路容積設定
まず、図２７（ａ）に示すように、連結バルブ３１６及び３１７を閉じたままで、出入バルブ３１４及び３１５を開く。次に、中央パッド４０１を押し込み、保持流路１１１の幅を狭くし流路容積を初期状態に必要な大きさに設定する。このとき保持流路１１１内部の気体３０４は、出入バルブ３１４及び３１５を通って開口部１２１及び１２２から、可変した容積に対応した量の流体が保持流路１１１外に排出される。このときの保持流路１１１要部断面は図２８（ａ）に示される。
【００８０】
ｂ．試薬注液開始
上記ａ．の工程で保持流路１１１の初期容積が定まると、試薬送液が開始される。図２９は開口部１２１及び１２２の要部断面図である。図２９（ａ）は試薬送液時の断面を示す図である。図２９（ａ）に示すように、開口部１２１及び１２２が保持流路１１１に対して上側になるように核酸検出カセット１００を配置する。そして、注入すべき試薬３０３の容量よりわずかに多い量が充填されたピペット３００の先端チップ３０１を開口部１２１に挿入する。同時に、試薬を充填したピペット３００を挿入した側とは反対側の開口部１２２に、試薬が充填されず外部に開放された先端チップ３０２を挿入する。図２９（ｂ）はこれらピペット３００及び先端チップ３０２の挿入時の開口部１２１及び１２２の要部断面を示している。
【００８１】
次に、図２７（ｂ）に示すように、先端チップ３０１から試薬３０３を注入する、このとき保持流路１１１の幅が狭いので、液体である試薬３０３と流路内に充満している気体３０４との界面は、表面張力によって１つの曲面を維持できる。したがって、気体３０４を試薬液体内に巻き込むことなしに、確実に試薬３０３を保持流路１１１内に充填することができる。
【００８２】
ｃ．試薬注液終了
図２７（ｃ）に示すように、気体出口側の先端チップ３０２内に試薬３０３が到達するまで、試薬３０３を注液する。このときの試薬量が所定の値であれば、注液を終了し「出入バルブ閉鎖」工程に移行する。あるいは、試薬量が保持流路１１１の最大容積である場合には次の「試薬補充注液」工程に移行する。
【００８３】
このときの保持流路１１１要部断面は図２８（ｂ）に示される。
【００８４】
ｄ．試薬補充注液
図２７（ｄ）に示すように、気体出口側の出入バルブ３１５を閉じ、中央パッド４０１を開放し、試薬３０３をさらに注液する。中央パッド４０１を開放したときは、保持流路１１１内はわずかに負圧となるが、ピペット３００内には十分な試薬の量があるので気体を試薬液体内に巻き込むことはない。このときの保持流路１１１の要部断面は図２８（ｃ）に示される。
【００８５】
液体入口側の先端チップ３０１内に試薬３０３がわずかに残るまでさらに試薬３０３を注液し、保持流路１１１内がわずかに加圧側になるまで試薬３０３を押し込む。次に先端チップ３０１の開口部１２１と反対側を外気圧と同一にし、先端チップ３０１内の試薬３０３量が少し増加するのを確認する。このとき保持流路１１１内が負圧で、先端チップ３０１内の試薬３０３が保持流路１１１内にわずかに吸い込まれたとしても、先端チップ３０１内に試薬３０３が残っていれば気体を試薬液体内に巻き込むことはない。
【００８６】
このときの保持流路１１１の要部断面は図２８（ｄ）に示される。
【００８７】
ｅ．出入バルブ閉鎖
最後に、図２７（ｅ）に示すように、出入バルブ３１４、３１５を閉じ、先端チップ３０１、３０２を開口部１２１、１２２から外す。
【００８８】
以上の工程により、試薬内に気体を巻き込むことなしに、２段階の設定量での保持流路１１１への試薬注入充填が可能になる。また、この試薬注入のとき、可撓性シート２の内側と外側は圧力が等しいため、可撓性シート２は所定の形状を維持しているので、充填量は常に一定となる。さらに、極端な負圧・加圧が液体に印加されていないので、保持流路１１１内への外部からの気体の侵入、あるいは流路内からの液漏れが発生しにくい。また、流路内には気体部分がないので、長期保存において試薬内に気体が溶け込むことも防止できる。
【００８９】
（３）−１−２ 試料注入
あらかじめ所定の量の試薬が充填されている保持流路１１１内に、新たに検査すべき核酸材料を含む液体試料３０５を注入する方法について説明する。
【００９０】
図３０は試料注入工程の模式図である。
【００９１】
ａ．試料注液開始
図３０（ａ）に示すように、連結バルブ３１６及び３１７は閉じたままで、出入バルブ３１４及び３１５を開く。
【００９２】
次に、開口部１２１及び１２２が上側になるように核酸検出カセット１００を配置し、注入すべき試料３０５が充填されたピペット３００の先端チップ３０１を開口部１２１に挿入する。同時に、反対側開口部１２２に外部に開放された先端チップ３０２を挿入する。これでカセットのセッティングが終了し、先端チップ３０１から試料３０５の注入を開始する。
【００９３】
ｂ．試料注液終了
図３０（ｂ）に示すように、出口側の先端チップ３０２内に試薬３０３が押し出されて到達するまで、試料３０５を注液する。
【００９４】
ｃ．出入バルブ閉鎖
最後に、図３０（ｃ）に示すように、出入バルブ３１４及び３１５を閉じ、先端チップ３０１及び３０２を開口部１２１及び１２２から外す。
【００９５】
試料３０５の試薬３０３に対する比重が重く、かつ試薬３０３に対する拡散速度が小さく、さらに重力の方向が、同図矢印に示すように保持流路１１１の中心から見て出入バルブ３１４及び３１５と反対側の場合には、図３０（ｃ）に示すように保持流路１１１の鉛直下側に試料３０５が沈降する。
【００９６】
以上の工程により、試料および試薬内に気体を巻き込むことなしに、あらかじめ所定の量の試薬が充填されている保持流路１１１への検査すべき核酸材料を含む試料の注入が可能になる。
【００９７】
（３）−２ 送液
注液工程を使用して試薬を注入された複数の保持流路１１１間での流体の移動方法について説明する。流体移動方法として、以下では一定量送液の場合と最大保持量送液との場合について説明する。ここでは、保持流路１１１ａと保持流路１１１ｂとの間での送液について説明する。
【００９８】
（３）−２−１ 一定量送液
一定量送液では、最大保持量を保持している保持流路１１１ａから最少量保持している保持流路１１１ｂに対して一定量を送液し、保持流路１１１ｂの液量がその最大保持量となるようにする。最少量保持は、前述の図２７（ｃ）に示された左翼パッド４０２及び右翼パッド４０３が開状態で、中央パッド４０１が閉状態の場合の容積であり、最大量は、左翼パッド４０２、右翼パッド４０３、中央パッド４０１がすべて開状態の場合の容積である。
【００９９】
以下一定量送液工程を順次説明する。
【０１００】
ａ．連結バルブ開
図３１（ａ）に示すように、保持流路１１１ａと保持流路１１１ｂ間の連結バルブ３１７を開状態にする。その他の連結バルブおよび出入バルブは閉状態のままにしておく。
【０１０１】
次に、保持流路１１１ａの中央パッド４０１ａをわずかに押し込み、連結バルブ３１７が完全に開くように加圧する。
【０１０２】
連結バルブ３１７を構成する可撓性シート２は連結流路１１７の底面に隙間なく押さえつけられている。したがって、連結流路１１７に対する可動ロッド４１７のロック部４３７を解除しても、可撓性シート２の弾性による回復力が弱い場合には、大気圧によってこの部分の可撓性シート２が底面に押さえつけられて、なかなか連結バルブ３１７が完全に開かない。このことへの対応として保持流路１１１ａの加圧が行われる。
【０１０３】
ｂ．送液開始
図３１（ｂ）に示すように、保持流路１１１ｂの中央パッド４０１ｂを開状態にした直後に、保持流路１１１ａの中央パッド４０１ａを押し込み、送液を開始する。
【０１０４】
このとき、保持流路１１１ａの中央パッド４０１ａを押し込む前において、保持流路１１１ｂと保持流路１１１ａの圧力が均衡するように、送液が開始してしまう場合もある。
【０１０５】
連結流路１１７を開く前に、保持流路１１１ｂの中央パッド４０１ｂを開状態にすることも可能である。しかしながらこの場合、保持流路１１１ｂに負圧がかかるので、連結流路１１７が開きにくくなる場合がある。
【０１０６】
ｃ．送液終了・連結バルブ閉
図３１（ｃ）に示すように、保持流路１１１ａ
の中央パッド４０１ａを全閉状態とし、次に連結流路１１７を全閉状態とする。このとき、連結流路１１７内のわずかな量の液体は保持流路１１１ａおよび保持流路１１１ｂ内に送液され、連結流路１１７内の液体はほぼ完全に排除される。
【０１０７】
以上の一定量送液工程では、保持流路のロック機構が一段である場合には、送液体積はおよそ、
送液体積Ｖｔ＝保持流路最大保持量Ｖｍａｘ−保持流路最小保持量Ｖｍｉｎ
の関係を満たしている。
【０１０８】
（３）−２−２ 最大保持量送液
最大保持量送液では、最大保持量を保持している保持流路１１１ａから全閉状態の保持流路１１１ｂに対して最大保持量の液体を送液し、保持流路１１１ｂの液量が保持流路の最大保持量となるようにする。
【０１０９】
全閉状態は、中央パッド４０１、左翼パッド４０２及び右翼パッド４０３がすべて閉状態の場合の容積である。可撓性シート２のゴム硬度が大きく、保持流路１１１と出入流路１１４及び１１５、連結流路１１６及び１１７の継ぎ目が滑らかに加工されていないと、全閉状態おいても保持流路１１１内に空隙が生じる可能性がある。しかし、保持流路１１１は最小保持量と最大保持量の間の液体もしくは流動体を、初期的に注入して使用するので、この空隙は液体もしくは流動体で満たされた残留液体もしくは残留流動体となり、保持流路１１１内に気泡が含まれることはない。
【０１１０】
以下最大保持量送液工程を順次説明する。
【０１１１】
ａ．連結バルブ開
図３２（ａ）に示すように、保持流路１１１ａと保持流路１１１ｂ間の連結バルブ３１７を開状態にする。その他の連結バルブおよび出入バルブは閉状態のままにしておく。
【０１１２】
次に保持流路１１１ａの中央パッド４０１ａをわずかに押し込み、連結バルブ３１７が完全に開くように加圧する。
【０１１３】
ｂ．送液開始
図３２（ｂ）に示すように、保持流路１１１ｂの中央パッド４０１ｂおよび左翼パッド４０２ｂを開状態にした直後に、保持流路１１１ａの中央パッド４０１ａを押し込み、送液を開始する。
【０１１４】
ｃ．送液中間段階
図３２（ｃ）に示すように、保持流路１１１ａの中央パッド４０１ａが全閉状態となった後、保持流路１１１ｂの右翼パッド４０３ｂを開状態とし、その後保持流路１１１ａの左翼パッド４０２ａの押し込みを開始する。これは、保持流路１１１ａ内部の液体が円滑に連結バルブ３１７の方向に向かうようにするためである。保持流路１１１ａの左翼パッド４０２ａと右翼パッド４０３ａを同時に押し込む場合には、加工精度や外部駆動力の位置精度の関係で、右翼パッド４０３ａが先に全閉状態となる場合がある。この場合、左翼パッド４０２ａ下のわずかな液体が連結バルブ３１７の方向に移動できなくなってしまう恐れがある。
【０１１５】
ｄ．送液終了・連結バルブ閉
図３２（ｄ）に示すように、左翼パッド４０２ａが全閉状態となった後、さらに右翼パッド４０３ａの押し込みを開始し、最終的に右翼パッド４０３ａも全閉状態とする。これで保持流路１１１ａの押圧パッドはすべてを全閉状態となるので、次に連結流路１１７を全閉状態とする。
【０１１６】
保持流路１１１ｂの最大保持量Ｖｍａｘは、
保持流路最大保持量Ｖｍａｘ＝保持流路全注入量Ｖｉ−保持流路残渣量Ｖｒ
の関係を満たしている。
【０１１７】
ｅ．送液の効果
以上のような送液方法により、
（ｉ）低圧力差で等容積の送液が可能である。
【０１１８】
各流路の容積は可変するが、流路全体の容積はほぼ一定である。また、可変する流路そのもの容積を変えて、送液に必要な圧力差を発生させている。このため、全流路の両端で圧力を印加して送液する方式に比べて、流路間の圧力差および外部の圧力差を小さくすることができ、液体のシール、送液制御が確実になる。
【０１１９】
（ｉｉ）連動送液が可能である。
【０１２０】
さらに送液側と授液側の保持流路の加圧パッドを連動させて駆動することも可能で、この場合送液側の加圧パッドの押込み速度と、授液側の加圧パッドの開放速度をほぼ同じにする。これにより、流路間の圧力差をおよび外部の圧力差を、さらに小さくすることができる。
【０１２１】
ｆ．連結部分の無気泡閉鎖
連結部分の無気泡閉鎖を確実にするために、予め保持流路注液時もしくはその前に、わずかな量の試薬を連結流路に導き、わずかな空隙でも液体で充填しておくことが可能である。この場合には、連結流路両側の保持流路でのそれぞれの反応に対して、両方に悪影響を及ぼさない液体であることが必要となる。
【０１２２】
（３）−３ 混合
核酸を含む試料の投入から、核酸増幅およびその他の必要な処理と目標核酸の検出までを一貫して処理する過程においては、複数の反応が必要とされている。本実施形態の流路系においては、例えば、
ａ．前の保持流路での反応の生成物を次の保持流路に移送する。
【０１２３】
ｂ．次の保持流路内に予め充填されている試薬と位相された前の生成物を混合し、次の保持流路内で試薬と前の生成物との混合を行う。
【０１２４】
ｃ．新たな生成物をさらに次の保持流路に移送する。
【０１２５】
というようにして、各種反応を逐次処理して連続工程を実現することができる。この逐次処理に必要な試薬の混合方法について以下、１流路内加圧移動、１流路内等圧移動及び２流路間往復移動の３種に分けて説明する。
【０１２６】
（３）−３−１ １流路内加圧移動
図３３（ａ）は流路系を模式的に示すもので、液体を保持流路１１１ａから保持流路１１１ｂに一定量送液し、保持流路１１１ａの中央パッド４０１ａが全閉状態となった後、連結バルブ３１７を全閉状態としたときを示している。送液量は本実施形態で示した寸法に従う場合には約３６μｌとなる。
【０１２７】
このとき、保持流路１１１ｂでは、予め保持流路１１１ｂ内に充填してあった試薬と、保持流路１１１ａから送液された反応生成物は既に混じり合っているが、均質になっていない場合がある。
【０１２８】
そこで、図３３（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の順に連続的に示すように、保持流路１１１ｂの左翼パッド４０２ｂ、右翼パッド４０３ｂ及び中央パッド４０１ｂを順次所定量押し込み、保持流路１１１ｂ内部で液体の移動を発生させる。さらに、押圧パッドの押し込み順序、速度、サイクル数／秒等を変えることで、保持流路１１１ｂ内部で試薬の反応生成物を均質に混合させることができる。
【０１２９】
この場合、保持流路１１１ｂは最大保持量まで液体を保持しているので、押圧パッド４０１ｂ、４０２ｂ及び４０３ｂの押し込み量が大きいと、保持流路１１１ｂの内部圧力が大きくなり、液洩れの原因となるので、押圧パッド４０１ｂ、４０２ｂ及び４０３ｂの押し込み量を調整する必要がある。これが１流路内加圧移動である。
【０１３０】
（３）−３−２ １流路内等圧移動
保持流路１１１ａから保持流路１１１ｂへ送液する場合に、保持流路１１１ｂの内部圧力をあまり大きくせずに保持流路１１１ｂ内部で液体の移動量を大きくするためには、以下で説明する工程により送液量を２段階にし、１流路内で等圧で液体を移動させることができる。
【０１３１】
ａ．初期送液
図３４（ａ）に示すように、保持流路１１１ａの左翼パッド４０２ａのみを押圧し、約２４μｌを送液する。
【０１３２】
ｂ．初期混合
約２４μｌを送液した後に、連結バルブ３１７を全閉状態にし、図３３（ｂ）〜（ｄ）に連続的に示すように、保持流路１１１ｂの左翼パッド４０２ｂ、右翼パッド４０３ｂ、中央パッド４０１ｂを順次所定量押し込み、保持流路１１１ｂ内部で液体の移動を発生させる。
【０１３３】
この場合、最大保持量約４８μｌに対して十分余裕があるので、押圧パッドの押し込み量を比較的大きくしても、保持流路１１１ｂの内部圧力は外圧より高くならず、液洩れの恐れがない。この状態で、混合に十分な保持流路１１１ｂ内部で液体の移動を発生させることができる。
【０１３４】
ｃ．後期送液
図３４（ｂ）に示すように、保持流路１１１ａの左翼パッド４０２ａを解除し、最終目標状態である保持流路１１１ａの中央パッド４０１ａを全閉状態とし、連結バルブ３１７を全閉状態とする。このとき、残りの約１２μｌが送液され、合計約３６μｌが送液される。
【０１３５】
ｄ．後期混合
この状態での混合は、図３３（ａ）に示す状態と同様であり、図３３（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）に連続的に示す加圧状態での混合が実施される。
【０１３６】
この場合、既に半分以上の液量が混合されているので、各パッドの押し込み量をそれほど大きくしなくても、十分に混合が達成できる。
【０１３７】
この例では、パッドに規定された送液量で制御したが、押圧パッドを任意の位置で保持し、連結バルブ３１７を全閉状態とし、任意の送液量で保持流路１１１ｂの混合を開始してもよい。
【０１３８】
（３）−３−３ ２流路間往復移動
液体を保持流路１１１ａから保持流路１１１ｂに一定量送液する際に、中間段階として、液体を保持流路１１１ｂから保持流路１１１ａに逆流させても差し支えない場合には、２流路間内液体往復移動が可能となる。
【０１３９】
図３５は２流路間内液体往復移動を説明するための模式図である。まず、図３５（ａ）に示すように、保持流路１１１ａでの中央パッド４０１ａの押し込みを行って保持流路１１１ａから保持流路１１１ｂに液体を送液する。次に、図３５（ｂ）に示すように、保持流路１１１ｂでの中央パッド４０１ｂの押し込みを行って保持流路１１１ｂから保持流路１１１ａに液体を送液する。これら図３５（ａ）及び（ｂ）に示す動作を交互に繰り返し行うことにより、両方の保持流路１１１ａ及び１１１ｂの内部液体を均質に混合することができる。
【０１４０】
このとき、逆流が不可の場合と可能な場合では同じ送液量でも試薬と生成物の混合比が異なってくる。例えば、
保持流路１１１ａ内の生成物の量をＡ０、最終保持量をＡ１、保持流路１１１ｂ内の試薬の量をＢ０とすると、
逆流が不可の場合、試薬：生成物＝Ｂ０：Ａ１
逆流が可能の場合、試薬：生成物＝Ｂ０：Ａ０
となる。
【０１４１】
また、反応生成物の一部を保持流路１１１ｂでの反応の有害物である残渣として、送液元の保持流路１１１ａに残留させる場合には、この混合方法に用いる逆流が可能ではない。
【０１４２】
（３）−３−４ 混合の効果
従来、気液２層系において複数の反応を逐次処理する場合には、１つの反応チャンバに反応ごとに必要な試薬を逐次投入する方法が用いられてきた。この場合、反応チャンバ内の液量が反応ごとに増えていくので、廃液チャンバが必要になり、複雑な流路系を必要とした。また、試薬の量が少なくなると送液制御が困難であり、特に少ない試薬が長い送液流路に残留するので、試薬の無駄、送液量の不均一が問題であった。
【０１４３】
微細流路系においては、液体同士の混合に際して流路内で攪拌することが困難であり、合流流路等を使用しても、均質な混合が困難であった。
【０１４４】
これに対して上記実施形態によれば、比較的少ない量の試薬に対して、比較的多い量の反応生成物自体が移動していくので、送液及び混合ともに制御が容易である。
【０１４５】
また、混合に際しては、液体や反応の条件に適合した様々なパターンを採用することができる。さらに、混合は無気泡状態で行うことができ、したがって気液２層に分離するための遠心分離装置が不要である。
【０１４６】
（３）−４ 変形例
上述した試薬・試料注入や、送液、混合工程において、押圧パッドをより多数に分割する、また押圧パッドの固定に使用するロックを多段にすると、さらに多種の保持容積、送液量、送液パターン、混合パターンの実施が可能であり、液体や反応の条件への適合が容易になる。
【０１４７】
（４）流路パターンと送液順序
（４）−１ 検出流路
１）核酸検出方法
目標核酸の検出方法は、検出流路内部に固定化された、検出すべき目標核酸に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを使用するものなら、周知の光学的方式、電気化学的方式等が使用できる。
【０１４８】
本実施形態では、基本的には登録第２５７３４４３号公報に開示される電気化学的な検出方法を適用した。光学的方式を使用する場合は、光透過性の材料で固定基板１を作製することで対応できる。
【０１４９】
２）核酸検出チップ
検出センサである核酸検出チップ５００は固定部材からなる基板が用いられる。より具体的には、特開２００２−１９５９９７号公報に開示されるような核酸検出センサを使用した。検出方法、使用材料、電極構造等は同じであるが、検出基板の構造だけが同公報の従来例として示される構造を採用してある。
【０１５０】
図３６は、核酸検出チップ５００の構造の概略を示す図である。ガラス基板５００ａ上に特開２００２−１９５９９７号公報に開示されるように、核酸固定化電極５０１、対抗電極５０３及び参照電極５０４が形成されている。さらにガラス基板５００ａ上には、これらの電極５０１，５０３及び５０４と検査装置とで電気信号を入出力するための接点として、それぞれ核酸固定化電極用接点５１１、対抗電極用接点５１３、参照電極用接点５１４が形成されている。
【０１５１】
また、核酸固定化電極５０１上には、特開２００２−１９５９９７号公報に開示される方法で、検出すべき目標核酸に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブ５０２が固定化されている。
【０１５２】
３）検出流路構造
図３７は、検出流路シール５２０を核酸検出チップ５００上に位置決めし載置した図である。可撓性部材である検出流路シール５２０は、可撓性シート２と同一の材料が使用できるが、押圧パッドによる局部的変形がないので、比較的硬いゴム硬度のものが使用できる。図３７に示すように、検出流路シール５２０は蛇行した流路開口５２１を有している。核酸固定化電極５０１、対抗電極５０３、参照電極５０４がすべて流路開口５２１の内部に位置し、各電極５０１，５０３，５０４が検出流路シール５２０で隠れないように位置決めされて核酸検出チップ５００と検出流路シール５２０は接している。
【０１５３】
４）検出流路の流路基板への接合
図３８は検出部ブロック１０６を表面側から見た斜視図であり、図４０は、図３８に示す検出部ブロック１０６を裏面側から見た斜視図である。検出部ブロック１０６の裏面には、核酸検出チップ５００の厚さとほぼ同じ深さを有し、核酸検出チップ５００の面積とほぼ同面積のチップレセス１２８が形成されている。このチップレセス１２８の一部には接点部開口１５１が貫通形成されている。
【０１５４】
チップレセス１２８のさらに一部には、チップレセス１２８の底面からさらに検出流路シール５２０の厚さとほぼ同じ深さを有するシールレセス１２５が設けられている。このシールレセス１２５の最深部平面と接するように検出流路シール５２０が組み込まれ、さらにこの検出流路シール５２０に接するように、チップレセス１２８の最深部平面と接するように核酸検出チップ５００が組み込まれる。
【０１５５】
これによって、核酸検出チップ５００と検出流路シール５２０と検出部ブロック１０６からなる、外部と隔離した検出流路５３１が形成される。核酸検出チップ５００、検出流路シール５２０、検出部ブロック１０６は接着、溶着等が可能である。また図示されていない締結部材もしくは締結部分で一体的に接合され、閉鎖型の核酸検出カセット１００を形成する。
【０１５６】
５）退避流路と検出流路の関係
図３８に示す検出部ブロック１０６は退避流路１３１を含むブロックであり、検出流路５３１はこの退避流路１３１の下部に配置される。検出流路５３１には、検出部ブロック１０６にその表裏を貫通して形成される左導入流路１２６及び右導入流路１２７が含まれ、一条の流路を形成している。
【０１５７】
図３９は、図３８と同じく検出部ブロック１０６を表面側から見た斜視図であるが、裏面に形成される検出流路５３１や各レセスなどの配置位置を破線で示してある。
【０１５８】
図４１は図３８に示す検出部ブロック１０６のＥ−Ｅ断面図である。図４１に示すように、検出流路５３１は２つの流路端部、すなわち左導入流路１２６及び右導入流路１２７に配置される検出流路端部１１８及び１１９を介して連結流路１１６及び１１７に連結されている。
【０１５９】
すなわち、連結流路端部１１８の左側は連結流路１１７ａによって保持流路１１１ａと連結され、右側は連結流路１１６ｂによって退避流路１３１と連結されている。これらの連結流路は、対応する連結パッド４０７ａ、４０６ｂによって開閉が可能である。
【０１６０】
同様に、連結流路端部１１９の左側は連結流路１１７ｂによって退避流路１３１と連結され、右側は連結流路１１６ｃによって保持流路１１１ｃと連結されている。これらの連結流路は、対応する連結パッド４０７ｂ、４０６aによって開閉が可能である。
【０１６１】
６）接点部開口
図３８に示すように検出部ブロック１０６には、核酸検出チップ５００上の核酸固定化電極用接点５１１、対抗電極用接点５１３、参照電極用接点５１４をカセット外部の検査装置と接続するための接点部開口１５１が設けられている。この接点部開口１５１にあわせて各接点５１１，５１３，５１４が検出部ブロック１０６で隠れないように位置決めし固定されて用いられる。
【０１６２】
（４）−２ 初期注入
図４２は、本実施形態で使用した核酸検出カセット１００の流路系の模式図を示す。
【０１６３】
同図左側から順に、端部ブロック１０２と、２つの中間部ブロック１０１と、検出部ブロック１０６と、中間部ブロック１０１と、端部ブロック１０３が配置されている場合の流路系統を示している。端部ブロック１０２は保持流路８１１ａを、これに隣接する中間部ブロック１０１は保持流路８１１ｂを有し、さらにこれに隣接する中間部ブロック１０１は保持流路８１１ｃを有している。この中間部ブロック１０１に隣接する検出部ブロック１０６は退避流路８１１ｄとこの退避流路８１１ｄに迂回して設けられた検出流路５３１を有する。この検出部ブロック１０６の右側に隣接する中間部ブロック１０１は保持流路８１１ｅを有する。右端の端部ブロック１０３は保持流路８１１ｆを有する。隣接する流路は互いに連結流路を介して連結され、その連結流路にはそれぞれバルブが設けられ、開閉制御可能になっている。
【０１６４】
各処理過程は、特に言及の無い限りは、登録第２５７３４４３号公報、特開２００２−１９５９９７号公報に詳しく開示される方法が適用される。まず、必要な全試薬が注入された出荷状態としての初期状態と、各試薬を用いた反応過程について説明する。
【０１６５】
１）核酸増幅
保持流路８１１ａでは、核酸を含んだ試料からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等を行い、試料内の核酸を増幅する。核酸の増幅方法に関しては特にこれに限るものではなく、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの温度変化を伴う方法や等温増幅方法など種々の核酸増幅方法が実施可能である。核酸を含む試料としては、血液、血清、尿、唾液、口腔粘膜等の生体試料等、を用いることができる。例えば、ＰＣＲ法においては、以下のような熱循環を施し、核酸の増幅を連続させる。
【０１６６】
ａ．９２〜９５℃で、約１０〜１５秒にわたって加熱し、２本鎖核酸を変性させ、ほどき分離し１本鎖にする。
【０１６７】
ｂ．次に、冷却され、５５〜６５℃で、約１０〜１５秒にわたって保持し、プライマーをアニ−ルし、２種類のプライマーを分離した１本鎖に結合させ部分的に２本鎖を形成する。
【０１６８】
ｃ．次に、７０〜７２℃で、約１０〜１５秒にわたって保持し、２種類のプライマーをそれぞれ核酸合成の開始点として、相補性をもつもう１本核酸を伸長させる。
【０１６９】
このＰＣＲ実施のため、保持流路８１１ａにはｄＮＴＰ、プライマー、ポリメラーゼ、その他ＰＣＲに必要なその他試薬を含む緩衝液を注入する。必要であれば、試料溶液中に核酸増幅阻害物質の影響排除試薬（例えば、島津製作所製Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ）を加えることもできる。核酸増幅阻害物質の影響排除試薬は、血液から直接核酸を取り出してＰＣＲの実施を可能にする試薬である。注入される全試薬量は約４８μｌである。
【０１７０】
２）１本鎖化
保持流路８１１ｂでは、保持流路８１１ａの核酸増幅工程で増幅された２本鎖核酸を、周知のλエキソヌクレアーゼ法等によって１本鎖核酸に調整する。このとき酵素反応を維持するため、３５〜３９℃で、約３０分〜３時間にわたって保持し、最後に酵素を失活するために９２〜９５℃で、約３〜６分にわたって加熱する。この過程で使用されるエキソヌクレアーゼおよび緩衝液の全試薬量約１２μｌが注入される。
【０１７１】
３）保護鎖付与
保持流路８１１ｃでは、特開平６−７０７９９号公報に開示されている方法を用いて、試料としての１本鎖核酸に、核酸プローブ５０２に相補的でない部分の配列に対して相補的な核酸鎖を保護鎖として添加する。これにより、核酸試料のセルフハイブリダイゼーションを防止し、検出感度を向上させることができる。このとき、必要であれば核酸試料を９５〜９８℃で約１〜５分にわたって保持し核酸を熱変性したのち、毎分２℃ずつ２５℃まで緩やかに冷却することで保護鎖と核酸試料のハイブリダイゼーション反応を行う。この過程で使用される全試薬量約１２μｌが注入される。
【０１７２】
４）ハイブリダイゼーション
検出流路５３１では、増幅され前処理された核酸試料と、核酸固定化電極５０１上の核酸プローブ５０２と所定の反応温度（たとえば、２０〜４０℃、３０〜６０分）を保持し、ハイブリダイゼーション反応を行う。核酸プローブ５０２は乾燥して保存することが可能で、検出流路５３１内は浄化・滅菌された窒素や空気等の気体が充填されている。ハイブリダイゼーション時には核酸試料を含む液体で検出流路５３１が充填されることになる。閉鎖系カセットにおいては、初期充填されていた気体を外部に排出できないので、この気体を退避させる容積が退避流路８１１ｄに設定されている。退避流路８１１ｄの初期状態はほぼ容積ゼロで、完全閉鎖されている。もしくは検出流路５３１内には気体の充填物に代えて緩衝液あるいは生理食塩水等の液体を充填しても良い。
【０１７３】
５）洗浄
検出流路５３１では、ハイブリダイゼーション反応が終了した後、核酸固定化電極５０１上の洗浄を行い、ハイブリダイズしなかった核酸試料を核酸固定化電極５０１上から除去する。この過程では緩衝液が洗浄液として使用される。使用される洗浄液は、保持流路８１１ｅに注入され、使用時に、検出流路５３１まで送液される。保持流路８１１ｅには、全試薬量約４８μｌが注入される。
【０１７４】
６）電気化学測定
検出流路５３１では、洗浄後、ハイブリダイズした２本鎖部分に選択的に結合する２本鎖認識体である、挿入剤（インターカレータ）を作用させ電気化学的測定を行う。測定では、挿入剤が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加し、挿入剤に由来する反応電流値を測定する。このとき電位は定速で掃引される。得られた電流値を元に、目標核酸検出を判定する。また、測定中は温度をたとえば、２０〜２５℃に保持する。使用される挿入剤は、保持流路８１１ｆに注入され、使用時に、検出流路５３１まで送液される。保持流路８１１ｆには、全試薬量約４８μｌが注入される。
【０１７５】
（４）−３ 送液順序
検査用の核酸検出カセット１００は、図４２で模式的に示された必要試薬充填状態で、使用者に提供される。
【０１７６】
１）核酸増幅
まず、出入バルブ８１４及び８１５を開いて、核酸を含む試料を注入する。試料注入後、出入バルブ８１４及び８１５を閉じる。次に図４２に示すように、連結バルブ８３１が閉じられた状態で、保持流路８１１ａに、図示しない熱伝達手段から所定の温度サイクルを付与し、核酸の増幅を行う。
【０１７７】
２）１本鎖化
図４３に示すように、核酸増幅終了後連結バルブ８３１を開き、保持流路８１１ａの中央パッド４０１aを押込む。これにより、反応後の生成物である増幅された核酸試料を保持流路８１１ａから保持流路８１１ｂに約３６μｌ送液する。このとき、保持流路８１１ｂにある試薬と送液された生成物とを十分に混合させる。混合が終了した後、連結バルブ８３１を閉鎖する。次に保持流路８１１ｂに所定の温度を付与し、１本鎖化の反応を開始する。
【０１７８】
３）保護鎖付与
図４４に示すように、１本鎖化反応終了後連結バルブ８３２を開き、保持流路８１１ｂの中央パッド４０１ｂを押込み、反応後の生成物である１本鎖化された核酸試料を保持流路８１１ｂから保持流路８１１ｃに約３６μｌ送液する。このとき、保持流路８１１ｃにある試薬と送液された生成物とを十分に混合させる。混合が終了した後、連結バルブ８３２を閉鎖する。この後、必要であれば、保持流路８１１ｃに所定の温度を付与し、保護鎖付与の反応を開始する。
【０１７９】
４）ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション工程は、詳細には以下の４ａ）ハイブリダイゼーション、４ｂ）エアパージその１、４ｃ）使用済生成物の送液その１、４ｄ）使用済生成物の送液その２からなる。
【０１８０】
４ａ）ハイブリダイゼーション
図４５に示すように、保護鎖付与反応終了後、連結バルブ８３３及び８３５を開き、保持流路８１１ｃの中央パッド４０１ｃ、左翼パッド４０２ｃ及び右翼パッド４０３ｃを押込み、反応後の生成物である保護鎖付与された核酸試料を保持流路８１１ｃから検出流路５３１に約４８μｌ送液する。同時に、退避流路８１１ｄの中央パッド４０１ｄ、左翼パッド４０２ｄ、右翼パッド４０３ｄの各々に対応するロック部を開放し、検出流路５３１にある充填気体を約４８μｌ退避流路８１１ｄに退避させる。
【０１８１】
試料送液時に、検出流路５３１内に固定されている核酸プローブ５０２と送液された核酸試料とを十分になじませるため、もしくは検出流路５３１の先頭と最後で核酸試料の濃度を均一にするために、一定送液速度だけでなく、往復動あるいはパルス的送液することが可能である。これにより電流測定値のばらつきを抑えることができる。検出流路５３１から保持流路８１１ｃ方向への送液は、退避流路８１１ｄの押圧パッド（中央パッド４０１ｄ、左翼パッド４０２ｄ及び右翼パッド４０３ｄ）を押込むことで実施される。送液が終了した後、連結バルブ８３３及び８３５を閉鎖する。連結バルブ８３３及び８３５の閉鎖後、検出流路５３１を所定の温度で保持し、ハイブリダイゼーション反応を開始する。
【０１８２】
４ｂ）エアパージその１
図４６に示すように、ハイブリダイゼーション反応終了後、連結バルブ８３５及び８３３を開き、退避流路８１１ｄの中央パッド４０１ｄ、左翼パッド４０２ｄ及び右翼パッド４０３ｄを押込み、退避流路８１１ｄにある充填気体を検出流路５３１に約４８μｌ充填する。このとき、同時に保持流路８１１ｃの中央パッド４０１ｃ、左翼パッド４０２ｃ、右翼パッド４０３ｃの各々に対応するロック部を開放し、ハイブリダイゼーション反応終了後の核酸試料を検出流路５３１から保持流路８１１ｃに約４８μｌ送液する。送液が終了した後、連結バルブ８３３及び８３５を閉鎖する。これにより、検出流路５３１のエアパージその１が終了する。
【０１８３】
４ｃ）使用済生成物の送液その１
図４７に示すように、検出流路５３１のエアパージその１が終了後、連結バルブ８３１を開き、保持流路８１１ｂにある左翼パッド４０２ｂ及び右翼パッド４０３ｂをさらに押込み全閉状態とする。これにより、保持流路８１１ｂにある残留液体約１２μｌが保持流路８１１ａに送液される。このとき保持流路８１１ａでは左翼パッド４０２ａのみが閉状態であり、保持流路８１１ａの容積状態約２４μｌを維持している。これにより、保持流路８１１ａが負圧になることはない。送液が終了した後、連結バルブ８３１を閉鎖する。
【０１８４】
４ｄ）使用済生成物の送液その２
図４８に示すように、保持流路８１１ｂにある残留液体の送液後、連結バルブ８３２を開き、保持流路８１１ｃの中央パッド４０１ｃ、左翼パッド４０２ｃ及び右翼パッド４０３ｃを押込む。これにより、ハイブリダイゼーション反応終了後の核酸試料が保持流路８１１ｃからさらに保持流路８１１ｂに約４８μｌ送液される。このとき同時に、保持流路８１１ｂの中央パッド４０１ｂ、左翼パッド４０２ｂ、右翼パッド４０３ｂのロック部が開放状態にある。送液が終了した後、連結バルブ８３２を閉鎖する。
【０１８５】
５）洗浄
洗浄工程は、以下の５ａ）洗浄、５ｂ）エアパージその２からなる。
【０１８６】
５ａ）洗浄
図４９に示すように、保持流路８１１ｃにある残留液体の送液後、連結バルブ８３４及び８３６を開き、保持流路８１１ｅの中央パッド４０１ｅ、左翼パッド４０２ｅ及び右翼パッド４０３ｅを押込み、洗浄液を保持流路８１１ｅから検出流路５３１に約４８μｌ送液する。同時に、退避流路８１１ｄの中央パッド４０１ｄ、左翼パッド４０２ｄ及び右翼パッド４０３ｄのロック部を開放し、検出流路５３１にある充填気体を約４８μｌ退避流路８１１ｄに退避させる。
【０１８７】
洗浄液送液時に、核酸プローブ５０２にハイブリダイズしなかった核酸試料を核酸固定化電極５０１上から確実に除去するために、一定送液速度だけでなく、往復動あるいはパルス的送液をすることが可能である。これにより電流測定値のばらつきを抑えることができる。
【０１８８】
検出流路５３１から保持流路８１１ｅ方向への送液は、退避流路８１１ｄの押圧パッドを押込むことで実施される。この送液が終了した後、連結バルブ８３４、８３６を閉鎖する。
【０１８９】
５ｂ）エアパージその２
図５０に示すように、洗浄終了後、連結バルブ８３５及び８３３を開き、退避流路８１１ｄの中央パッド４０１ｄ、左翼パッド４０２ｄ及び右翼パッド４０３ｄを押込む。これにより、退避流路８１１ｄにある充填気体が検出流路５３１に約４８μｌ充填される。このとき同時に保持流路８１１ｃの中央パッド４０１ｃ、左翼パッド４０２ｃ及び右翼パッド４０３ｃのロック部を開放し、洗浄終了後の洗浄液を検出流路５３１から保持流路８１１ｃに約４８μｌ送液する。送液が終了した後、連結バルブ８３３及び８３５を閉鎖する。これにより、検出流路５３１のエアパージその２が終了する。
【０１９０】
６）電気化学的測定
この電気化学的測定は、６ａ）挿入剤の移送、６ｂ）挿入および電気化学的測定からなる。
【０１９１】
６ａ）挿入剤の移送
図５１に示すように、エアパージその２の後、連結バルブ８３７を開き、保持流路８１１ｆの中央パッド４０１ｆ、左翼パッド４０２ｆ及び右翼パッド４０３ｆを押込み、挿入剤を保持流路８１１ｆから保持流路８１１ｅに約４８μｌ送液する。このとき同時に、保持流路８１１ｅの中央パッド４０１ｅ、左翼パッド４０２ｅ及び右翼パッド４０３ｅのロック部が開放状態である。送液が終了した後、連結バルブ８３７を閉鎖する。
【０１９２】
６ｂ）挿入および電気化学的測定
図５２に示すように、挿入剤の移送後、連結バルブ８３４及び８３６を開き、保持流路８１１ｅの中央パッド４０１ｅ、左翼パッド４０２ｅ及び右翼パッド４０３ｅを押込み、挿入剤を保持流路８１１ｅから検出流路５３１に約４８μｌ送液する。同時に、退避流路８１１ｄの中央パッド４０１ｄ、左翼パッド４０２ｄ及び右翼パッド４０３ｄの各々に対応するロック部を開放し、検出流路５３１にある充填気体を約４８μｌ退避流路８１１ｄに退避させる。
【０１９３】
挿入剤送液時に、検出流路５３１内に固定されているハイブリダイズした核酸プローブ５０２に挿入剤を十分に作用させるため、もしくは検出流路５３１の先頭と最後で挿入剤の濃度を均一にするために、一定送液速度だけでなく、往復動あるいはパルス的送液をすることが可能である。これにより電流測定値のばらつきを抑えることができる。
【０１９４】
検出流路５３１から保持流路８１１ｅ方向への送液は、退避流路８１１ｄの押圧パッドを押込むことで実施される。送液が終了した後、連結バルブ８３４及び８３６を閉鎖する。連結バルブ８３４及び８３６の閉鎖後、検出流路５３１を所定の温度で保持し、電気化学的測定を開始する。
【０１９５】
７）連続反応操作における効果
以上のように、可変流路構造を有する閉鎖型の核酸検出カセット１００による効果は以下のようにまとめられる。
【０１９６】
７ａ）反応・送液に有害な気泡を巻き込まずに、試薬が注入できる。
【０１９７】
７ｂ）連結流路が最小長さで配置できるので、この部分での空隙、残留液体の保持がほとんどない。
【０１９８】
７ｃ）試薬保持流路内部と外部との圧力差が少ないので長期保存時に液洩れの恐れがない。
【０１９９】
７ｄ）送液時、外部との圧力差が少ないので液洩れの恐れがない。
【０２００】
７ｅ）試薬と反応生成物の混合が容易で良好な反応が実施できる。
【０２０１】
７ｆ）ハイブリダイゼーション、洗浄、挿入剤との反応において、最終的な電流測定値のばらつきを抑えることができるような、複雑な送液パターンが実施できる。
【０２０２】
（５）熱伝達ユニット
次に、図５３〜図５６に基づき熱伝達ユニットの詳細な構成を説明する。
【０２０３】
図５３は２つの熱伝達ブロック６００ａ及び６００ｂからなる熱伝達ユニット６００の閉鎖系の核酸検出カセット１００への熱伝達時の構成の一例を示す斜視図である。図５４は熱伝達ブロック６００ａ及び６００ｂを核酸検出カセット１００から離間した状態の断面図である。図５５は熱伝達ブロック６００ａ及び６００ｂを核酸検出カセット１００に接触させた状態の断面図である。
【０２０４】
（５）−１ 熱伝達ユニット構造
図５４に示すように、熱伝達ユニット６００はＰＣＲでの温度循環の付与に使用されるので、加熱と冷却を行なえるものでなくてはならない。そこで熱伝達ブロック６００ａは、ペルチェ素子６０１ａ、アルミや銅のような熱伝導率のよい金属からなる接触パッド６０４ａ、ヒートシンク６０２ａ及び冷却ファン６０３ａからなる。ペルチェ素子６０１ａと接触パッド６０４ａ、ペルチェ素子６０１ａとヒートシンク６０２ａは、シリコーンオイルを基油にアルミナなど熱伝導性のよい粉末を配合したグリースで接合されている。図５４には示されていないが、核酸検出カセット１００もしくは熱伝達ブロック６００ａ、６００ｂの所定部分の温度を測定し、核酸検出カセット１００もしくは熱伝達ブロック６００ａ、６００ｂ、６１０ａ及び６１０ｂの温度制御を行なう温度センサを備えている。熱伝達ブロック６００ａ、６００ｂ、６１０ａ及び６１０ｂの構造は同一である。
【０２０５】
（５）−２ 熱伝達ユニットのカセットへの接触
図５４は、熱伝達ユニット６００の初期配備状態を示す。保持流路１１１に対応する中央パッド４０１、左翼パッド４０２及び右翼パッド４０３からなる押圧ブロック４は閉状態である。この状態で熱伝達ユニット６００及び６１０は核酸検出カセット１００に対して相対的に移動可能で、核酸検出カセット１００の任意の位置で配備できる。
【０２０６】
図５５は、熱伝達ユニット６００の核酸検出カセット１００への熱伝達状態を示す。押圧ブロック４は開状態から、さらに開いた全開状態である。この押圧ブロック４の全開状態により、熱伝達ブロック６００ａは、可撓性シート２を介して流路内部の液体に熱伝達が可能である。可撓性シート２の厚さが０.３ｍｍ程度なのに対応して、保持流路１１１の裏面にあたる固定基板１の厚さを０.４ｍｍ程度にして、両側からの熱伝達の条件をほぼ同一にしている。このようにして、熱伝達ブロック６００ａ、６００ｂは核酸検出カセット１００の熱伝達を実施する保持流路１１１に対して、両側から接触して熱伝達を行なう。
【０２０７】
図５６は、流路内部の液体６０５が熱伝達ユニット６００からの熱伝達により膨張している様子を模式的に示したものである。熱伝達ブロック６００ａ、６００ｂは、熱伝達ブロック押ばね６０４a、６０４ｂにより一定の荷重がかけられ、流路内部の液体６０５が熱膨張すると、可撓性シート２が核酸検出カセット１００の外側に膨らみ、流路内部の容積が拡大する。このため、加熱時においても流路内部の圧力上昇が緩和され、核酸検出カセット１００の外部および他の流路内部への圧力上昇に伴う流路内部の液体６０５の漏出を防止することができる。特にPCR法による核酸増幅時における急激な熱循環に伴う、急激な流路内部の圧力変動を緩和するため、核酸増幅時の流路内部の液体漏出に効果がある。
【０２０８】
可撓性シート２が核酸検出カセット１００の外側に膨らむことによって流路内部の圧力上昇が緩和し、かつ接触パッド６０４ａとの接触を維持することによって熱伝達を行うには、可撓性シート２側の熱伝達ブロック押ばね６０４aは低荷重ばねであり、好ましくは定荷重ばねが用いられる。あるいは、接触パッド６０４ａと可撓性シート２は全面もしく部分的に接触せず近接状態に置かれていても、可撓性シート２への熱伝達と熱膨張を同時に満足することができる。
【０２０９】
以上のように可撓性シート２の可撓性は、
１）流路内部に変形することにより流路内部の流体に圧力を加え、
連結流路１１７を介して隣接する保持流路１１１ｂに流路内部の流体を送液する。
【０２１０】
２）熱膨張等の流体の体積増加に対応して、流路外部に変形することにより流路内部の流体の圧力上昇を緩和し、液漏れを防止する。
【０２１１】
３）熱膨張時にも接触パッド６０４ａと良好な接触もしくは近接状態を維持して熱伝達を行う。
【０２１２】
という３つの機能を同時に満たすことができる。
【０２１３】
（５）−３ 隣接保持流路冷却
図５３に、核酸検出カセット１００に対する熱伝達ブロック６００ａ、６００ｂ、６１０ａ、６１０ｂの接触状況を示す。図５３で、熱伝達ブロック６００ａ、６００ｂが配置されているのは、核酸増幅を行なう保持流路８１１ａの位置である。例えば、核酸増幅をＰＣＲで実施した場合、９８℃付近まで保持流路８１１ａの温度が上昇する。また、等温増幅反応であるLAMP法では６０〜６５℃に保持流路８１１ａは置かれる。このとき隣接する保持流路８１１ｂには、酵素を含む試薬がすでに充填されている。保持流路８１１ｂに充填されている酵素は５０℃以上になると機能が劣化し始めるので、核酸増幅が実施されている保持流路８１１ａからの熱伝導で、保持流路８１１ｂの温度が５０℃以上になることを防止しなければならない。このため、隣接する保持流路８１１ｂに接している熱伝達ユニット６１０ａ、６１０ｂは、冷却ユニットとして隣接保持流路８１１ｂを冷却する。
【０２１４】
（５）−４ 直列流路
また保持流路８１１ｃの試薬、特に検出流路５３１の核酸プローブは熱に弱いので、核酸増幅実施時には隣接保持流路８１１ｂだけでなく、保持流路８１１ｃ、検出流路５３１の冷却も必要になる。図５３に示すように、核酸検出カセット１００は、各保持流路１１１および退避流路１３１などの保持流路が直列に配置されているので、核酸増幅実施時でも隣接する保持流路のみを冷却することで、現在加熱下にある保持流路からの熱の移動を、隣接保持流路で吸収（吸熱）することが可能である。これにより、隣接保持流路以降の保持流路の温度上昇を抑制することができる。
【０２１５】
（５）−５ 熱伝達ユニットの効果
以上のように、熱伝達ユニット６００及び６１０と可変流路構造を有する核酸検出カセット１００の組合せによる効果は以下のようにまとめられる。
【０２１６】
ａ）流路が直列に配置されているので、隣接保持流路の冷却だけで、未使用試薬の温度上昇を抑制できる。
【０２１７】
ｂ）可変流路に使用する押圧ブロックは可動するので、全開状態を設定することができ、これにより、保持流路に対して損失の少ない両側熱伝達が達成できる。
【０２１８】
（６）自動制御装置の全体構造
図５７は上記各構成を自動制御するための構成を含めた核酸検出システムのブロック図である。図５７に示すように、ホストパーソナルコンピュータ７５１からの指令に基づき、核酸検出カセット１００に対して各種操作を行い自動で核酸検出を行うことができる。検査装置本体７５２には、ホストパーソナルコンピュータ７５１からの指令に基づき各種構成に制御信号を出力して制御する制御部７５３が設けられている。制御部７５３は、メインコントローラ７５４と、このメインコントローラ７５４からの指令に基づき動作するアクチュエータドライバ７５５、温度制御ドライバ７５６及び電流測定ドライバ７５７を備える。メインコントローラ７５４は制御部７５３外に設けられた電源・ファン７５８により動作する。
【０２１９】
アクチュエータドライバ７５５は例えばステッピングモータドライバで実現される。このアクチュエータドライバ７５５は、位置センサ７６４で検出された核酸検出カセット１００の位置に基づき送液アクチュエータ７６２や着脱アクチュエータ７６３を駆動し送液や着脱動作を実現する。位置センサ７６４は特に図示されていないが、核酸検出カセット１００の後述する駆動ユニット７０１及び７０２の移動位置近傍に設置される。送液アクチュエータ７６２及び着脱アクチュエータ７６３は、本実施形態では駆動ユニット７０１及び７０２で実現される。
【０２２０】
温度制御ドライバ７５６は、温度センサ７６６で検出された温度に基づきヒータ／クーラ７６５を制御して温度調整を行う。ヒータ／クーラ７６５は本実施形態では熱伝達ユニット６００及び６１０で実現される。
【０２２１】
電流測定ドライバ７５７は、カセットホルダ７２１により支持された核酸検出カセット１００に接続された電気コネクタ７０３を介して電流信号を取り出し、この電流信号を電流測定端子部７６１を介して取得する。
【０２２２】
図５８及び図５９は上記各反応を自動で実行するための自動制御機構の一例を示す図である。図５８は使用時の形態を示す斜視図であり、図５９は説明の便宜のため各構成を分離して示した斜視図である。
【０２２３】
図５８に示すように、支持台７２０上にはカセットホルダ７２１と固定Ｘステージ７２２が固定配置されている。カセットホルダ７２１はカセット１００の外枠の２辺を支持して核酸検出カセット１００をＸ軸方向に操作部に導くレール７２１ａ及び７２１ｂを有する。固定Ｘステージ７２２上には可動Ｘステージ７２３が載置され、Ｘ駆動装置７１４により固定Ｘステージ７２２上をＸ方向に位置決め可能である。
【０２２４】
操作部には、電気コネクタ７０３と、２つの駆動ユニット７０１及び７０２と、２つの熱伝達ユニット６００及び６１０が駆動の対象として設けられている。この操作部は、前述のＸ方向の駆動系統と、さらにＹ方向及びＺ方向の駆動系統により、Ｘ、Ｙ及びＺ軸方向に自在に移動可能である。
【０２２５】
Ｙ方向の駆動系統は、固定Ｙステージ７３１と、この固定Ｙステージ７３１に対してＹ方向に位置決め可能にＹ駆動装置７３２で駆動可能な可動Ｙステージ７１３ａ及びこの可動Ｙステージ７１３ａとともに移動する可動取付板７１３ｂからなる。固定Ｙステージ７３１は、可動Ｘステージ７２３に固定されている。したがって、固定Ｙステージ７３１は可動Ｘステージ７２３のＸ方向の移動とともにＸ方向に移動する。
【０２２６】
Ｚ方向の第１駆動系統は、固定Ｚステージ７２５ａと、この固定Ｚステージ７２５ａに対してＺ方向に位置決め可能に第１Ｚ駆動装置７１１で駆動可能な可動Ｚステージ７２６ａからなる。固定Ｚステージ７２５ａは可動取付板７１３ｂに固定された第１Ｚステージ取付板７２４ａに固定されており、そのＸ，Ｙ方向の移動とともに固定Ｚステージ７２５ａもＸ，Ｙ方向に移動する。
【０２２７】
Ｚ方向の第２駆動系統は、固定Ｚステージ７２５ｂと、この固定Ｚステージ７２５ｂに対してＺ方向に位置決め可能に第２Ｚ駆動装置７１２で駆動可能な可動Ｚステージ７２６ｂからなる。固定Ｚステージ７２５ｂは可動取付板７１３ｂに固定された第２Ｚステージ取付板７２４ｂに固定されており、そのＸ，Ｙ方向の移動とともに固定Ｚステージ７２５ｂもＸ，Ｙ方向に移動する。
【０２２８】
駆動ユニット７０１及び７０２は、この可動Ｚステージ７２６ａ及び７２６ｂにそれぞれ取付板７２７ａ及び７２７ｂを介して固定される。これにより、可動Ｚステージ７２６ａ及び７２６ｂのＸ，Ｙ，Ｚ方向の移動とともに駆動ユニット７０１及び７０２がＸ，Ｙ，Ｚ方向に自在に移動する。
【０２２９】
また、熱伝達ユニット６００及び６１０も、可動Ｚステージ７２６ａ及び７２６ｂに取付台７４１及び７４２あるいはさらに取付板７２７ａ及び７２７ｂを介して選択的に移動可能なように固定され、電気コネクタ７０３も同様に駆動ユニット７０１及び７０２の直上近傍に位置するように可動Ｚステージ７２６ａ及び７２６ｂに選択的に移動可能なように固定される。これにより、熱伝達ユニット６００及び６１０、電気コネクタ７０３も、可動Ｚステージ７２６ａ及び７２６ｂのＸ，Ｙ，Ｚ方向の移動とともにＸ，Ｙ，Ｚ方向に自在に移動する。ただし、Ｚ方向に関しては選択的に移動することができ、必要とされるタイミングに別個に、熱伝達ユニット６００及び６１０、電気コネクタ７０３を核酸検出カセット１００に近接もしくは接触させることができる。
【０２３０】
２台の駆動ユニット７０１及び７０２を設け、これらを別個に駆動することができる構成をなす。これにより、一方ではパッドを加圧する動作を、他方ではパッドの加圧を開放する動作を行うことにより、送液動作を実現できる。例えば、保持流路の中央を駆動ユニット７０１を用いて押し込み、保持流路の左翼の加圧を駆動ユニット７０２で開放するというように利用することで、保持流路内の試薬を循環させることができる。
【０２３１】
同様に、２台の熱伝達ユニット６００及び６１０を設け、これらを別個に温度制御することができる構成をなす。これにより、一方の流路では加熱し、他方の流路では冷却する等の制御が可能となる。
【０２３２】
以上説明したように本実施形態の核酸検出カセット１００及びこの核酸検出カセット１００とこれを自動制御する駆動系、制御系を備えた核酸検出システムによれば、核酸増幅およびその他の必要な処理と目標核酸の検出までを一貫して自動的に閉鎖系で処理することができる。
【０２３３】
本発明は上記実施形態に限定されるものではない。
固定基板１、可撓性シート２、カバープレート３の材料は、例示した材料に限定されない。
【０２３４】
図１に示される各ブロック１０１、１０２、１０３及び１０６の構成に限定されるものではなく、必要とする反応の内容に応じて異なる種類のブロックを設けてもよい。例えば、中間部ブロック１０１を省略して端部ブロック１０２、検出部ブロック１０６及び端部ブロック１０３のみで構成してもよいし、図１よりも多くの中間部ブロック１０１を配置してもよい。
【０２３５】
各可撓性シート２を押圧するパッドの形状は上記実施形態に限定されるものではない。例えば、保持流路１１１や退避流路１３１のパッドは３つのパッドからなる例を示したが２つ以下であってもよいし、４つ以上であってもよい。
【０２３６】
また、本実施形態では２つの駆動ユニット７０１及び７０２で各流路の開閉を制御する場合を示したが、３つ以上の駆動ユニットを用いてもよい。同様に、熱伝達ユニット６００及び６１０以外にさらに多くの熱伝達ユニットを用いてもよい。
【０２３７】
（第２実施形態）
本実施形態は第１実施形態の変形例に関わる。本実施形態は、カセット構造や流路パターンの変形例に関わる。本実施形態で特に言及しない限り、第１実施形態と同様の構成が適用される。
【０２３８】
１．カセット構造の変形例
図６０〜図６４はそれぞれ変形例に関するカセット構造の断面図であり、第１実施形態の図４１の断面図の符号Ｆで囲まれた部分に対応する。
【０２３９】
図６０は、固定基板に流路を形成する例であり、第１実施形態の図４１に示した例と共通する。固定基板７７１に流路７７２が形成されており、固定基板７７１上に可撓性シート７７３が接着されている。このように、固定基板７７１側に溝を形成し、この溝を流路７７２として機能させる。
【０２４０】
図６１は、可撓性シートに流路を形成する例である。固定基板７７６は溝が形成されていない平板であり、この固定基板７７６上に流路７７７の形成された可撓性シート７７８が接着される。このように、可撓性シート７７８側に溝を形成し、この溝を流路７７７として機能させる。
【０２４１】
図６２は固定基板及び可撓性シートの双方に流路を形成する例である。固定基板７７１に流路７７２が形成されている。この固定基板７７１上には流路７７７が形成された可撓性シート７７８が接着される。
【０２４２】
図６３は可撓性シートの膨張により流路を形成する例である。固定基板７７６上には、可撓性シート７７９を撓ませて固定基板７７６との間に空間が生じるように接着させる。この空間が流路７８０として機能する。空間がある状態では流路が開放されている状態である。流路を閉鎖するには、不図示のカバー膨張規制部材で固定基板７７６に対して可撓性シート７７９を押さえ込めばよい。
【０２４３】
図６４は固定基板に流路を形成する例であり、固定基板側に表面コーティングを施す例である。流路７７２の形成された固定基板７７１表面を覆うようにコーティング部材７８１が接着されている。固定基板７７１上の可撓性シート７７３はこのコーティング部材７８１を介して固定基板７７１と接着される。
【０２４４】
なお、この図６０〜図６４に示した例はほんの一例にすぎず、また１つの核酸検出カセット内でその機能などに応じて組み合わせて用いることができる。
【０２４５】
２．流路パターンの変形例
図６５は退避流路と検出流路の変形例に係る核酸検出カセット７９０の模式図である。図６５（ａ）は図４２〜図５２の模式図に対応して示されているものであり、図６５（ｂ）はその保持流路近傍の断面図である。
【０２４６】
図６５（ａ）の左側から順に、保持流路７９１ａ、７９１ｂ及び７９１ｃ、退避流路７９１ｄ、検出流路７９１ｅ、退避流路７９１ｆ、保持流路７９１ｇ及び７９１ｈが配置されている。
【０２４７】
保持流路７９１ａは核酸増幅反応を行うための反応室として用いられる。保持流路７９１ａと７９１ｂとは連結バルブ７９２ａを介して連結流路で連結されている。保持流路７９１ａには２つのバルブ７９３ａ及び７９４ａを介してそれぞれ試薬や試料を注入することができる。
【０２４８】
保持流路７９１ｂは一本鎖化反応を行うための反応室として用いられる。保持流路７９１ｂと７９１ｃとは連結バルブ７９２ｂを介して連結流路で連結されている。保持流路７９１ｂにはバルブ７９４ｂを介して試薬を注入することができる。
【０２４９】
保持流路７９１ｃは保護鎖付与反応を行うための反応室として用いられる。保持流路７９１ｃと７９１ｄあるいは７９１ｅとは連結バルブ７９２ｃを介して連結流路で連結されている。保持流路７９１ｃにはバルブ７９４ｃを介して試薬を注入することができる。
【０２５０】
退避流路７９１ｄは検出流路７９１ｅの退避流路として用いられる。退避流路７９１ｄは検出流路７９１ｅ及び保持流路７９１ｃと連結バルブ７９２ｄで連結されている。退避流路７９１ｄにはバルブ７９４ｄを介して試薬を注入することができる。
【０２５１】
検出流路７９１ｅはハイブリダイゼーションなどの反応を行い検出を行うための反応室として用いられる。
【０２５２】
退避流路７９１ｆは検出流路７９１ｅの退避流路として用いられる。退避流路７９１ｆは検出流路７９１ｅ及び保持流路７９１ｇと連結バルブ７９２ｅで連結されている。退避流路７９１ｆにはバルブ７９４ｆを介して試薬を注入することができる。
【０２５３】
保持流路７９１ｇは、ハイブリダイゼーションを行った後、検出流路７９１ｅにおいて洗浄を行うための洗浄液を保持する室として用いられる。保持流路７９１ｇは検出流路７９１ｅと保持流路７９１ｈと連結バルブ７９２ｆを介して連結流路で連結されている。保持流路７９１ｇにはバルブ７９４ｇを介して試薬を注入することができる。
【０２５４】
保持流路７９１ｈは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄を行った後、検出流路７９１ｅにおいて挿入剤付与を行うための挿入剤溶液を保持する室として用いられる。保持流路７９１ｈは検出流路７９１ｅと連結バルブ７９２ｇを介して連結流路で連結されている。保持流路７９１ｈにはバルブ７９４ｈあるいは７９３ｂを介して試薬を注入することができる。
【０２５５】
図６５（ｂ）に示すように、各流路７９１ａ〜７９１ｈは固定基板７９５上の可撓性シート７９６に設けられた溝により平面的に形成されており、この点で検出流路と退避流路が上下２層構造に形成されている第１実施形態と異なる。このように、平面構造にすることにより、カセット構造を薄型化することができる。なお、図６５（ｂ）の例では退避流路が２つ設けられる場合を示したが、いずれか一方のみを残し他方の退避流路は設けない構造とすることもできる。
【０２５６】
また、この図６５に示す構成以外にも流路パターンを種々変形可能である。例えば、各保持流路や退避流路、検出流路などの反応室の基準容量として４８μｌの場合を示したが、これを減少させることでカセット構造の小型化を実現できる。
【０２５７】
また、この図６５に示す例のように、単一の可撓性シート７９６で各保持流路７９１ａなどと検出流路７９１ｅを形成することにより、可撓性部材を兼用することもできる。
【０２５８】
また、第１実施形態で示した例では、核酸検出チップ５００がガラス基板５００ａに固定化されて用いられる例を示したが、これに限定されない。例えば固定基板１に核酸固定化電極５０１、対抗電極５０３及び参照電極５０４などを形成することにより、核酸検出チップ５００を一体化することができる。図６５に示す固定基板７９５を使用する場合には、固定基板７９５上に、核酸固定化電極５０１、対抗電極５０３及び参照電極５０４などを形成することができる。
【０２５９】
また、第１実施形態で示した例では、核酸検出チップ５００が固定基板１に固定化されて用いられる例を示したが、これに限定されない。固定基板１として例えばガラス基板を用いる場合に、このガラス基板に核酸固定化電極５０１、対抗電極５０３及び参照電極５０４などを形成することにより、核酸検出チップ５００を一体化することができる。
【０２６０】
また、第１実施形態の例では保持流路や退避流路は単一線上に配置される例を示したが、複数の直線上にそれぞれ保持流路や退避流路を配置し検出装置を多重化することもできる。図６６は多重化した核酸検出カセット７９７の一例を示す概観斜視図であり、第１実施形態の図４に対応するものである。図６６に示すように、端部ブロック１０２には保持流路１１１ａ、１１１ｂ、…、１１１ｎというようにｎ個の同一構成の保持流路が形成されている。また、隣接する２つの中間部ブロック１０１にもｎ個の同一構成の保持流路が形成され、さらに隣接する検出部ブロック１０６にもｎ個の同一構成の退避流路１３１が形成され、さらにこれに隣接する中間部ブロック１０１にもｎ個の同じ保持流路が形成され、端部ブロック１０３にもｎ個の同じ構成の保持流路が形成されている。また、不図示の保持流路周辺部分の構成もｎ個についてそれぞれ共通する構成をなす。なお、ここでは詳細に示していないが、ブロック内部の構成は第１実施形態で示したものと共通する。このように、流路構成をｎ本に多重化することにより、複数の反応及び検出を同時に進めることができ、複数種類の目標核酸を同時検出できる、複数試料を同時検出できる、及び検出データを均一化する等の利点がある。なお、図６６の例では、ｎ個の退避流路１３１、すなわちｎ個の検出流路５３１に対して１つの接点部開口１５１が設けられているが、ｎ個の各々に接点部開口１５１を配置してもよい。
【０２６１】
さらに他の流路パターンとしては、上記連続する流路、すなわち反応室の数を拡張し、あるいは縮小する構成である。例えば第１実施形態の例では６つの反応室が連続して配置される例を、図６５の例では退避流路を含め８つの流路が連続して配置される例を示したが、この数に限定されないことはもちろんである。
【０２６２】
このように本実施形態によれば、第１実施形態に示される構成を変形しても第１実施形態と同様に、核酸増幅およびその他の必要な処理と目標核酸の検出までを一貫して自動的に処理するのに用いられる閉鎖型の核酸検出カセットが提供される。
【０２６３】
（第３実施形態）
本実施形態は第１及び第２実施形態の変形例に関わる。本実施形態は、保持流路や退避流路などの可変流路の形状の変形例に関わる。第１実施形態の例ではほぼ長方形の形状を備えた流路構成を示したが、本実施形態のように、例えばＵ字型の可変流路を用いてもよい。本実施形態で特に言及しない限り、第１実施形態と同様の構成が適用される。
【０２６４】
図６７及び図６８はＵ字型可変流路を採用した核酸検出カセット９００の基本構造の一例を示す図である。図６７は組み立て前の分解斜視図を、図６８は組み立て後の使用時の構成の斜視図を示す。
【０２６５】
図６７に示すように、核酸検出カセット９００はチップホルダ９０１と、核酸検出チップ９０２と、チップカバー９０３と、流路ブロック９０４と、可撓性シート９０５と、シールブロック９０６からなる。核酸検出チップ９０２には不図示の電極が配置されている。この電極を覆うように流路９１１が形成された検出流路シール９１２が接着されチップカバー９０３でこの検出流路シール９１２を覆った上でチップホルダ９０１で核酸検出チップ９０２、検出流路シール９１２、チップカバー９０３を固定する。
【０２６６】
流路ブロック９０４の表面には容積可変のＵ字型流路９１３が複数形成されている。隣接するＵ字型流路９１３は連結バルブ９１４で連結されている。右側から３番目のＵ字型流路９１３は検出流路として機能するもので、この裏面にチップホルダ９０１が核酸検出チップ９０２を一体化した状態で固定化される。また、すべてのＵ字型流路９１３は可撓性シート９０５で覆われ、さらにこの可撓性シート９０５上にはシールブロック９０６が接着される。以上により図６８に示すような核酸検出カセット９００が完成する。
【０２６７】
図６９は製品作製時のＵ字型流路９１３の構成の一例を示す図である。Ｕ字型流路は９１３ａ〜９１３ｆの６つあり、９１３ａから順に核酸増幅反応室、一本鎖化反応室、保護鎖付与反応室、退避流路、洗浄液保持室、挿入剤保持室として機能する。また、隣接するＵ字型流路同士は連結バルブ９１６ａ〜９１６ｇを介して連結流路で連結されている。また、各Ｕ字型流路９１３ａ〜９１３ｆには、それぞれ２つずつ自己封止型ポート９１７ａ〜９１７ｌが設けられている。退避流路として機能するＵ字型流路９１３ｄの両端には検出流路９１８が連結されている。
【０２６８】
図７０は製品出荷時の構成例を示す図である。各Ｕ字型流路９１３ａ〜９１６ｆ内には必要な試薬がすべて充填されている。使用時は検体のみ注液するだけで、装置による検出が可能となる。
【０２６９】
図７１は容積可変のＵ字型流路９１３ａの基本構造を説明するための図である。同図（ａ）は上面図、（ｂ）は断面図である。圧縮用加圧パッド９１８ａ〜９１８ｃがそれぞれ流路の右翼、左翼及び中央に配置される。自己封止型ポート９１７ａと保持流路９１３ａとの間は出入バルブ９２４ａで開閉が制御され、自己封止型ポート９１７ｂと保持流路９１３ａとの間は出入バルブ９２４ｂで開閉が制御される。他のＵ字型流路も同様の構成である。図７２はこの圧縮用加圧パッド９１８ａ〜９１８ｃを用いた流路開閉状態を示す図である。同図（ａ）は流路全開、（ｂ）は流路半開、（ｃ）は流路全閉状態を示している。
【０２７０】
図７３は自己封止型ポートを用いたカセット注液動作を説明するための斜視図である。自己封止型ポート９１７ａ及び９１７ｂにそれぞれ注液チップ９２０ａ及び逆止弁付チップ９２０ｂを挿入する。注液チップ９２０ａには試薬を入れて注液し、逆止弁付チップ９２０ｂからエア抜きを行う。自己封止型ポート９１７ａ及び９１７ｂは膨張及び縮小可能な可撓性部材により構成されており、外力が加わらない状態では膨張した状態で、ポートが閉鎖されカセット内外の気液の行き来を遮断する。この自己封止型ポート９１７ａ及び９１７ｂに注液チップ９２０ａ及び逆止弁付チップ９２０ｂを挿入すると、可撓性部材がチップの大きさ分だけ縮小してチップ内とカセット内の流路との間で気液の行き来が可能となる。
【０２７１】
図７４はシールブロック９０６の詳細な構成を示す図である。流路加圧パッド９２１ａ〜９２１ｆは流路９１３ａ〜９１３ｆの各々を加圧するパッドであり、詳細には図７１のようにそれぞれ３つのパッド９１８ａ〜９１８ｃから構成される。連結加圧パッド９２２ａ〜９２２ｇは流路９１３ａ〜９１３ｆ同士を連結する連結流路を開閉するパッドであり、これらにより連結バルブ９１６ａ〜９１６ｇが実現される。出入加圧パッド９２３ａ〜９２３ｌは各流路９１３ａ〜９１３ｆと自己封止型ポート９１７ａ及び９１７ｌとの間を結ぶ出入流路を開閉するパッドであり、これにより自己封止型ポート９１７ａ及び９１７ｌと各流路９１３ａ〜９１３ｆとの間の連結バルブが実現される。
【０２７２】
図７５は無気泡注液を説明するための図である。図７５（ａ）に示すように、まず流路容積を加圧パッド９２１ａを用いて注入容積の容積に設定する。次に、図７５（ｂ）に示すように、注液チップ９２０ａ及び逆止弁付チップ９２０ｂを自己封止型ポート９１７ａ及び９１７ｂに差し込んだ上で、気泡を捕獲しないように溶液をゆっくりと注入する。次に、図７５（ｃ）に示すように、エア抜き用の逆止弁付チップ９２０ｂにわずかに溶液が入るまで注液をし、図７５（ｄ）に示すように出入加圧パッド９２３ａ及び９２３ｂを加圧することにより出入バルブ９２４ａ及び９２４ｂを閉じて流路を密閉する。
【０２７３】
図７６は試薬を保持する実施形態の変形例に関わる。混合試薬の保存が可能でない場合には、必要な試薬を同図のように保持流路９１３と隣接する保持流路９１３とを結ぶ連結流路９２５に個別試薬保持部９２６を設けておけばよい。
【０２７４】
図７７は熱伝達時の熱循環動作を説明するための斜視図である。熱伝達ユニット６１０及び６００は、同図Ｙ軸方向及びＺ軸方向に可動である。核酸検出カセット９００の表裏から挟むように熱伝達ユニット６１０を接触させる。この際に、流路加圧パッド９２１ａは持ち上げられた状態で可撓性シート９０５に接触させる。この熱循環時の流路の詳細の模式図を図７８に示す。まず、図７８（ａ）に示すように、熱伝達ユニット６１０で溶液を流路中央部に集中させる。そして、図７８（ｂ）に示すように、表裏から熱伝達ユニット６１０ではさみこみ、９３１に示す領域を加熱し、また冷却するサイクルを繰り返す。
【０２７５】
図７７に示す工程で核酸増幅のための保持流路９１３ａの加熱・冷却が終わると、さらに図７９に示すように、核酸検出カセット９００が同図Ｘ軸方向に移動し、隣接する保持流路９１３ｂの加熱及び冷却と、保持流路９１３ｃの余熱が行われ、反応が順次進められる。
【０２７６】
図８０は送液工程の一例を説明するための斜視図である。核酸検出カセット９００に対して水平方向、すなわち同図Ｘ軸方向に移動可能な送液モジュール９３３に設けられた加圧パッド開閉ローラ９３４及び９３４が核酸検出カセット９００表面に設けられたロック部を解除し、あるいは各パッドを加圧してロック部をロックすることで、送液が実現される。加圧パッド開閉ローラ９３４及び９３４は同図Ｙ軸方向に可動である。図８１は送液の工程を示す模式図である。図８１（ａ）に示すように、連結バルブ９１６ａを開いて保持流路９１３ａを圧縮して送液を開始する。均等に圧縮できるとは限らないため、まず図８１（ｂ）に示すように送液元である保持流路９１３ａの左側部分を完全に圧縮する。次に、図８１（ｃ）に示すように、保持流路９１３ａの中央部分を圧縮する。最後に、図８１（ｄ）に示すように、保持流路９１３ａを完全に圧縮し、連結バルブ９１６ａを閉じる。
【０２７７】
図８２は保持流路９１３にフィルタ９３７を配置した例である。例えば核酸増幅後の検体残渣が送液されてしまう場合には、保持流路９１３の中途部分にフィルタ９３７を配置し、残渣を除去する。
【０２７８】
このように本実施形態によれば、第１実施形態や第２実施形態に示される構成を変形しても第１実施形態や第２実施形態と同様に、核酸増幅およびその他の必要な処理と目標核酸の検出までを一貫して自動的に処理するのに用いられる閉鎖型の核酸検出カセットが提供される。
【０２７９】
本発明は上記第１乃至第３実施形態に限定されるものではない。上記実施形態で示された構成は一例にすぎず、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々変更できることはいうまでもない。
【産業上の利用可能性】
【０２８０】
以上説明したようにこの発明は、核酸を含む試料の投入から、核酸増幅およびその他の必要な処理と目標核酸の検出までを一貫して自動的に処理するのに用いられる閉鎖型の核酸検出カセット、核酸検出装置およびそれを用いた核酸検出システムの技術分野に有効である。
【図面の簡単な説明】
【０２８１】
【図１】本発明の第１実施形態に係る核酸検出カセットの概観斜視図。
【図２】同実施形態に係る核酸検出カセットの各構成を分離して示した斜視図。
【図３】同実施形態に係る中間部ブロックの切断部分斜視図。
【図４】同実施形態に係る中間部ブロック、端部ブロック及び検出部ブロックの詳細を示す斜視図。
【図５】同実施形態に係る中間部ブロックをＡ−Ａ部分で切断した要部断面図。
【図６】同実施形態に係る中間部ブロックをＢ−Ｂ部分で切断した要部断面図。
【図７】同実施形態に係る中間部ブロックをＣ−Ｃ部分で切断した要部断面図。
【図８】同実施形態に係る中間部ブロックをＤ−Ｄ部分で切断した要部断面図。
【図９】同実施形態に係るすべてのロッドを閉じた状態の中間部ブロックの斜視図。
【図１０】同実施形態に係るすべてのロッドを省略した状態の中間部ブロックの斜視図。
【図１１】同実施形態に係る出入流路用ロッドのみを閉じ、他のロッドを省略した状態の中間部ブロックの斜視図。
【図１２】同実施形態に係る連結流路用ロッドのみを閉じ、他のロッドを省略した状態の中間部ブロックの斜視図。
【図１３】同実施形態に係る中央ロッドのみを閉じ、他のロッドを省略した状態の中間部ブロックの斜視図。
【図１４】同実施形態に係る左翼ロッドのみを閉じ、他のロッドを省略した状態の中間部ブロックの斜視図。
【図１５】同実施形態に係る右翼ロッドのみを閉じ、他のロッドを省略した状態の中間部ブロックの斜視図。
【図１６】同実施形態に係る中央ロッド、左翼ロッド、右翼ロッドのみを閉じ、他のロッドを省略した状態の中間部ブロックの斜視図。
【図１７】同実施形態に係る押圧ブロックの各構成を分解して示した斜視図。
【図１８】同実施形態に係る保持流路の工程断面図。
【図１９】同実施形態に係る中間部ブロック及び押圧ブロックの切断部分斜視図。
【図２０】同実施形態に係る中間部ブロック及び押圧ブロックの切断部分斜視図。
【図２１】同実施形態に係る中間部ブロック及び押圧ブロックの切断部分斜視図。
【図２２】同実施形態に係る中間部ブロック及び押圧ブロックの切断部分斜視図。
【図２３】同実施形態に係る中間部ブロック及び押圧ブロックの切断部分斜視図。
【図２４】同実施形態に係る中間部ブロック及び押圧ブロックの切断部分斜視図。
【図２５】同実施形態に係る連結流路の断面図。
【図２６】同実施形態に係る出入流路の断面図。
【図２７】同実施形態に係る試薬送液の工程を模式的に示す図。
【図２８】同実施形態に係る試薬送液の工程に沿った保持流路の断面図。
【図２９】同実施形態に係る開口部の要部断面図。
【図３０】同実施形態に係る試料注入工程の模式図。
【図３１】同実施形態に係る一定量送液工程の模式図。
【図３２】同実施形態に係る最大保持量送液工程の模式図。
【図３３】同実施形態に係る１流路内加圧移動工程の模式図。
【図３４】同実施形態に係る１流路内等圧移動工程の模式図。
【図３５】同実施形態に係る２流路間往復移動工程の模式図。
【図３６】同実施形態に係る核酸検出チップの斜視図。
【図３７】同実施形態に係る検出流路シールを載置した核酸検出チップの斜視図。
【図３８】同実施形態に係る流路基板を含む検出部ブロックを表面側から見た斜視図。
【図３９】同実施形態に係る検出部ブロックを表面側から見た斜視図。
【図４０】同実施形態に係る検出部ブロックを裏面側から見た斜視図。
【図４１】同実施形態に係る検出部ブロックのＥ−Ｅ断面図。
【図４２】同実施形態に係る核酸検出カセットの流路系の初期注入の模式図。
【図４３】同実施形態に係る核酸検出カセットの流路系の１本鎖化の模式図。
【図４４】同実施形態に係る核酸検出カセットの流路系の保護鎖付与の模式図。
【図４５】同実施形態に係る核酸検出カセットの流路系のハイブリダイゼーションの模式図。
【図４６】同実施形態に係る核酸検出カセットの流路系のエアパージその１の模式図。
【図４７】同実施形態に係る核酸検出カセットの流路系の使用済生成物の送液その１の模式図。
【図４８】同実施形態に係る核酸検出カセットの流路系の使用済生成物の送液その２の模式図。
【図４９】同実施形態に係る核酸検出カセットの流路系の洗浄の模式図。
【図５０】同実施形態に係る核酸検出カセットの流路系のエアパージその２の模式図。
【図５１】同実施形態に係る核酸検出カセットの流路系の挿入剤の移送の模式図。
【図５２】同実施形態に係る核酸検出カセットの流路系の挿入および電気化学的測定の模式図。
【図５３】同実施形態に係る熱伝達ユニットの閉鎖系の核酸検出カセットへの熱伝達時の構成の一例を示す斜視図。
【図５４】同実施形態に係る熱伝達ユニットを核酸検出カセットから離間した状態の断面図。
【図５５】同実施形態に係る熱伝達ユニットを核酸検出カセットに接触させた状態の断面図。
【図５６】同実施形態に係る熱伝達ユニットを核酸検出カセットに接触させた状態の断面図。
【図５７】同実施形態に係る核酸検出システムのブロック図。
【図５８】同実施形態に係る自動制御機構の一例を示す図。
【図５９】同実施形態に係る自動制御機構の各構成を分離して示した斜視図。
【図６０】本発明の第２実施形態に係るカセット構造の断面図。
【図６１】同実施形態に係るカセット構造の断面図。
【図６２】同実施形態に係るカセット構造の断面図。
【図６３】同実施形態に係るカセット構造の断面図。
【図６４】同実施形態に係るカセット構造の断面図。
【図６５】同実施形態に係る退避流路と検出流路の変形例に係る核酸検出カセットの模式図。
【図６６】同実施形態に係る多重化した核酸検出カセットの一例を示す概観斜視図。
【図６７】同実施形態に係るＵ字型可変流路を採用した核酸検出カセットの組み立て前の分解斜視図。
【図６８】同実施形態に係るＵ字型可変流路を採用した核酸検出カセットの組み立て後の使用時の構成の斜視図。
【図６９】同実施形態に係る製品作製時のＵ字型流路の構成の一例を示す図。
【図７０】同実施形態に係る核酸検出カセットの製品出荷時の構成例を示す図。
【図７１】同実施形態に係る容積可変のＵ字型流路の基本構造を説明するための図。
【図７２】同実施形態に係る圧縮用加圧を用いた流路開閉状態を示す図。
【図７３】同実施形態に係る自己封止型ポートを用いたカセット注液動作を説明するための斜視図。
【図７４】同実施形態に係る流路ブロックの詳細な構成を示す図。
【図７５】同実施形態に係る無気泡注液を説明するための図。
【図７６】同実施形態に係る試薬を保持する実施形態の変形例を示す図。
【図７７】同実施形態に係る熱伝達時の熱循環動作を説明するための斜視図。
【図７８】同実施形態に係る熱循環時の流路の詳細の模式図。
【図７９】同実施形態に係る熱伝達時の熱循環動作を説明するための斜視図。
【図８０】同実施形態に係る送液工程の一例を説明するための斜視図。
【図８１】同実施形態に係る送液の工程を示す模式図。
【図８２】同実施形態に係る保持流路にフィルタを配置した例を示す図。
【符号の説明】
【０２８２】
１…固定基板、２…可撓性シート、３…カバープレート、４…押圧ブロック
１００…核酸検出カセット、１０１…中間部ブロック、１０２、１０３…端部ブロック、０６…検出部ブロック、１１１…保持流路、１１２，１１３…連結流路、１１４，１１５…出入流路、１１６〜１１７…連結流路、１１８〜１１９…検出流路端部、１２１，１２２…開口部、１２５…シールレセス、１２６…左導入流路、１２７…右導入流路、１２８…チップレセス、１３１…退避流路、１５１…接点部開口、３００…ピペット、３０１，３０２…先端チップ、３０３…試薬、３０４…気体、３０５…試料、３１４，３１５…出入バルブ、３１６，３１７…連結バルブ、４０１〜４０８…押圧パッド、４１１〜４１７…可動ロッド、４１４ａ…棒状部材、４１４ｂ…支点部、４３１〜４３７…ロック部、４４４ａ，４４４ｂ…前方支点部、４４６…後方支点部、４５１，４６１…支点部、４５２，４６２…棒状部材、４５３，４６３…爪状部材、５００…核酸検出チップ、５０１…核酸固定化電極、５０１，５０３，５０４…電極、５０２…核酸プローブ、５１１，５１３，５１４…接点、５２０…検出流路シール、５２１…流路開口、５３１…検出流路、６００，６１０…熱伝達ユニット、６０１ａ…ペルチェ素子、６０２ａ…ヒートシンク、６０３ａ…冷却ファン、６０４ａ…接触パッド、７０１，７０２…駆動ユニット、７０３…電気コネクタ、７１１…Ｚ駆動装置、７１３ａ…可動Ｙステージ、７１３ｂ…可動取付板、７１４…Ｘ駆動装置、７２０…支持台、７２１…カセットホルダ、７２１ａ，７２１ｂ…レール、７２２…固定Ｘステージ、７２３…可動Ｘステージ、７２４…Ｚステージ取付板、７２５…固定Ｚステージ、７２６…可動Ｚステージ、７２７…取付板、７３２…Ｙ駆動装置、７４１…取付台、７５１…ホストパーソナルコンピュータ、７５２…検査装置本体、７５３…制御部、７５４…メインコントローラ、７５５…アクチュエータドライバ、７５６…温度制御ドライバ、７５７…電流測定ドライバ、７５８…電源・ファン、７６１…電流測定端子部、７６２…送液アクチュエータ、７６３…着脱アクチュエータ、７６４…位置センサ、７６５…クーラ、７６６…温度センサ、７７１…固定基板、７７２…流路、７７３…可撓性シート、７７６…固定基板、７７７…流路、７７８…可撓性シート、７７９…可撓性シート、７８０…流路、７８１…コーティング部材、７９０…核酸検出カセット、７９１ａ〜７９１ｈ…流路、７９２ａ〜７９２ｇ…連結バルブ、７９３ａ，７９３ｂ，７９４ａ〜７９４ｈ…バルブ、７９５…固定基板、７９６…可撓性シート、７９７…核酸検出カセット、８１１ａ〜８１１ｆ…流路、８１４…出入バルブ、８３１〜８３７…連結バルブ、９００…核酸検出カセット、９０１…チップホルダ、９０２…核酸検出チップ、９０３…チップカバー、９０４…流路ブロック、９０５…可撓性シート、９０６…シールブロック、９１１…流路、９１２…検出流路シール、９１３…Ｕ字型流路、９１４…連結バルブ、９１６ａ〜９１６ｇ…連結バルブ、９１７ａ…自己封止型ポート、９１８…検出流路、９１８ａ〜９１８ｃ…圧縮用加圧パッド、９２０ａ…注液チップ、９２０ｂ…逆止弁付チップ、９２１ａ〜９２１ｆ…流路加圧パッド、９２２ａ〜９２２ｇ…連結加圧パッド、９２３ａ〜９２３ｌ…出入加圧パッド、９２４ａ，９２４ｂ…出入バルブ、９２５…連結流路、９２６…個別試薬保持部、９３３…送液モジュール、９３４…加圧パッド開閉ローラ、９３７…フィルタ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に含まれる核酸を検出するために固定部材と可撓性部材との組合せにより流路が構成された核酸検出カセットであって、
前記流路は、容積が可変で試薬を保持可能でかつ前記核酸検出カセット外部と連通可能な開状態と閉鎖可能な閉状態を選択可能な出入口孔を有する保持流路と、この保持流路に接続され保持流路と連通可能な開状態と閉鎖可能な閉状態を選択可能な連結流路とを備え、
前記核酸検出カセットは、
前記出入口孔を閉状態で維持可能な出入口開閉手段と、
前記連結流路を閉状態で維持可能な連結流路開閉手段と
を備えることを特徴とする核酸検出カセット。
【請求項１】
試料に含まれる核酸を検出するために固定部材と可撓性部材との組合せにより流路が構成された核酸検出カセットであって、
前記流路は、容積が可変で試薬を保持可能でかつ前記核酸検出カセット外部と連通可能な開状態と閉鎖可能な閉状態を選択可能な出入口孔を有する保持流路と、この保持流路に接続され保持流路と連通可能な開状態と閉鎖可能な閉状態を選択可能な連結流路とを備え、
前記核酸検出カセットは、
前記出入口孔を閉状態で維持可能な出入口開閉手段と、
前記連結流路を閉状態で維持可能な連結流路開閉手段と
を備えることを特徴とする核酸検出カセット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５４】
【図５５】
【図５６】
【図５７】
【図５８】
【図５９】
【図６０】
【図６１】
【図６２】
【図６３】
【図６４】
【図６５】
【図６６】
【図６７】
【図６８】
【図６９】
【図７０】
【図７１】
【図７２】
【図７３】
【図７４】
【図７５】
【図７６】
【図７７】
【図７８】
【図７９】
【図８０】
【図８１】
【図８２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５４】
【図５５】
【図５６】
【図５７】
【図５８】
【図５９】
【図６０】
【図６１】
【図６２】
【図６３】
【図６４】
【図６５】
【図６６】
【図６７】
【図６８】
【図６９】
【図７０】
【図７１】
【図７２】
【図７３】
【図７４】
【図７５】
【図７６】
【図７７】
【図７８】
【図７９】
【図８０】
【図８１】
【図８２】
【公開番号】特開２００８−２２８７３５（Ｐ２００８−２２８７３５Ａ）
【公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−９４３２３（Ｐ２００８−９４３２３）
【出願日】平成２０年３月３１日（２００８．３．３１）
【分割の表示】特願２００４−３３１９１２（Ｐ２００４−３３１９１２）の分割
【原出願日】平成１６年１１月１６日（２００４．１１．１６）
【出願人】（０００００３０７８）株式会社東芝 (54,554)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月３１日（２００８．３．３１）
【分割の表示】特願２００４−３３１９１２（Ｐ２００４−３３１９１２）の分割
【原出願日】平成１６年１１月１６日（２００４．１１．１６）
【出願人】（０００００３０７８）株式会社東芝 (54,554)
【Ｆターム（参考）】
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