植物由来の新規ホスホジエステラーゼ製剤
本発明は、ソルガムから抽出した５’−ホスホジエステラーゼの調整、および５’−ヌクレオチドが豊富な組成物、具体的に酵母抽出物の調整のための５’−ホスホジエステラーゼの使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、酵母の酵素処理による香味修飾剤の調整のための方法、それにより得られる香味修飾剤および香味修飾剤の使用に関する。
【０００２】
酵母抽出物は、粉末状又はペースト状で市販されているとともに、農業食品産業において香味剤として広く使用されている。
【０００３】
酵母抽出物は、一般的に自己分解又は加水分解によって得られる酵母の可溶成分の濃縮物として定義される。
【０００４】
自己分解とは、基本的に、酵母の実在分解酵素（プロテアーゼ）の活性化によって行われる酵母の細胞膜の損傷と、その結果としての細胞内化合物の可溶化とを目的とした方法である。
【０００５】
酵母抽出物は、高分解状態にある細胞内含有物の放出を可能とする試薬または酵素剤を用いる加水分解によっても得ることができる。
【０００６】
酵母抽出物は、天然香味剤という名で農業食品産業において広く受け入れられている。
【０００７】
酵母抽出物はまた、同等の香味強度をもつ他の香味剤（時に非天然のもの）と、価格面で非常に競合している。
【０００８】
酵母の酵素処理については、当該技術分野で広く知られている。
【０００９】
自己の内因性酵素化物質によって酵母を分解することにより調整される酵母の自己分解物は、食品添加物として広く知られている。
【００１０】
この自己分解は、酵母細胞を高温でインキュベートする方法、有機溶剤を加える方法、ＮａＣｌの濃度を増加する方法やこれらの様々な方法を組み合わせることによって開始させることができる。
【００１１】
自己分解の間に起こる主な変換として、タンパク質のペプチドおよびアミノ酸への分解がある。
【００１２】
結果として得られる自己分解物は、苦い香りや独特の強い酵母臭を有する。別のデメリットとしては、内因性リボヌクレアーゼが細胞間ＲＮＡを３’−リボヌクレオチドに変換するため、この自己分解物が香りに関して全く貢献しない３’−リボヌクレオチドのみを含むことが多いということがある。
【００１３】
酵母抽出物の調整方法は、Ｑｕｅｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂ．Ｖ．による欧州特許第０３５４６１０号に示されており、先ず第１に、嫌気条件下で外因性タンパク質分解酵素により細胞壁を分解し、続いて酸素条件下で細胞間ＲＮＡを分解する。この方法によれば、５’−ヌクレオチドの多い自己分解物を得ることが可能となる。
【００１４】
酵母自己分解物に含まれる公知の風味化合物は、アミノ酸、ペプチド、５’−ヌクレオチド、サッカリドおよび有機酸といった核酸を含む。５’−ヌクレオチド含有物は、風味化合物や香味化合物にとって非常に重要である。このような核酸は、例えば５’−イノシン一リン酸（５’−ＩＭＰ）や５’−グアノシン一リン酸（５’−ＧＭＰ）といった食品製剤の香味付けの際の粗化合物として使用されているが、医薬品の製造にも応用されている。
【００１５】
旨味は、甘味、塩味、苦味および酸味に続く第５の基本の味として認識されている。高い味覚増進力を有する５’−ヌクレオチドは旨味をも生産し、それ故、酵母抽出物に元来見られるグルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）効果を強化する。
【００１６】
５’−ヌクレオチドの生産には、極めて特異な酵素である５’−ホスホジエステラーゼ（５’−ＰＤＥ）を用いた粗ＲＮＡの加水分解を必要とする。ＣｏｈｎおよびＶｏｌｋｉｎ（１９５３）は初めて、ヘビ毒内の５’−ホスホジエステラーゼ活性の存在を実証した。ヘビ毒は、その非常に高い能力にも関らず、明確な理由のために、農業食品産業で使用することができない。
【００１７】
５’−ＰＤＥの他の主要源には、ペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｕｕｍ）といった特定の菌類や、ストレプトマイセス・アウレウス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｕｓ）といった特定の放射菌が含まれる。
【００１８】
実際、ペニシリウム・シトリヌムにより得られる５’−ＰＤＥは、とりわけ、ヌクレアーゼＲＰ−１Ｇ（またはＥＣ３．１．３０．１）という名で天野エンザイムから市販されている。非常に高い生産コストのため、この酵素は、工業規模上、主に固定化型で用いられる。５’−ヌクレオチドが豊富な酵母抽出物の生産方法にこの酵素を用いると、非常に高い追加の酵素コストが発生してしまう。
【００１９】
特定の植物胚における５’−ＰＤＥ活性の存在は、Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９５７）によって実証されている。多数の最近の研究は、特許出願のテーマとなるとともに、麦芽根（麦芽は大麦胚芽）の抽出物から５’−ヌクレオチドが豊富な酵母抽出物を生産する方法を主に開示している。麦芽は、醸造産業における副産物であり、したがって、酵母ＲＮＡ由来の５’−ヌクレオチド生産のための安価な酵素源となる可能性がある。この場合、５’−ＰＤＥは、酵素を安定化させるための酢酸亜鉛を含む水溶液中の麦芽根粉末を単に煮出すだけで調整でき、その使用により発生する、５’−ヌクレオチドの豊富な酵母抽出物の製造に掛かる追加コストは小さい。
【００２０】
酵素源として大麦麦芽を用い、５’−ヌクレオチドが豊富な酵素誘導体を生産する方法は、例えば、ＵＳ−Ａ−４ ８１０ ５０９、ＥＰ−Ａ−０２９９０７８、ＦＲ ７５ ０８４４６の文献や、Ｇ．ＲｅｅｄおよびＴ．Ｗ．Ｎａｇｏｄａｗｉｔｈａｎａ、“Ｙｅａｓｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”第２版（Ｖａｎ Ｎｏｓｔｒａｎｄ Ｒｅｉｎｈｏｌｄ、ＩＳＢＮ ０−４４２−３１８９２−８）、３８２〜３８５頁の参照マニュアルに開示されている。
【００２１】
麦芽または大麦胚芽から得た５’−ＰＤＥを用いることの主たるデメリットとして、アレルギー特性がある。酵素の派生源である原材料は、この場合大麦であるが、アレルギー特性を示すとともに、アレルギー（セリアック病）を引き起こす小麦グリアジンに似たプロラミンというホルデインを含む。実際、大麦は、ＥＣ指令２０００／１３／ＥＣ、ＥＣ指令２００３／８９／ＥＣにより修正、にグルテンを含む穀物に属するとしてリストされている。それ故、「アレルゲン」指令と称するこのＥＣ指令によれば、大麦または大麦の誘導体を含む製品は、標示の対象である。
【００２２】
これらのタンパク質の主たる特性としては、胃の酸性環境下においても、腸内の消化酵素によっても分解されないことである。分解されない状態であることから、これらのタンパク質は、そのままの状態で腸内に吸収され、それ故、免疫反応を引き起こしてしまう。セリアック病の場合、プロラミンの消費が体内反応を引き起こす。これらのタンパク質の消費は、小腸の細胞表面を損傷する強い炎症反応を引き起こすため、いわゆるセリアック病患者にとって、全てのこれらのプロラミンタンパク質は有毒である。このことは、タンパク質、脂肪、炭水化物、ビタミンやミネラルといった栄養素を吸収する小腸の能力を低下させるという影響をもつ。アレルギーは、胃腸性の兆候：胃けいれん、拡張および慢性下痢と関係がある。このことは、各種栄養素（鉄、カルシウム、葉酸）の吸収不良、消化不良（貧血や体重減少）、疲労、骨痛、筋けいれんや過敏症に繋がる可能性がある。
【００２３】
大麦麦芽からのＰＤＥの精製は、酵素と大麦プロラミンとが難なく分離できる場合、代替を構成する可能性がある。しかし、Ａｉ−Ｙｕ Ｗａｎｇら（（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、１０９５〜１１０２頁、第２９巻、第６版）、またはＢｅｌｕｈａｎら（（２００３）ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２５、１０９９〜１１０３頁）により発行された研究は、調製液中の大麦プロラミンの存在を測定することなく大麦麦芽から精製された５’−ＰＤＥを特徴つけることに焦点をおいている。この代替の精製方法は、高価であると見られ、酵素調製液からのグルテンの除去を示す分析記録はあるが、この酵素の活性に由来するアレルギー特性の不存在を立証する臨床記録は特にない。
【００２４】
代替の第２の精製方法としては、ペニシリウム・シトリヌムや黒色アスペルギルスといった糸状菌の菌株、またはアクタノミセス属やストレプトミセスといった細菌から得られる微生物起源の５’−ＰＤＥを用いるものがある。しかし、これら微生物起源は、菌株改良段階を伴う非常に長い進化である。加えて、この型の製品は、工業発酵／工業精製プラントや、プロセスを必要とし、その結果、高価な酵素となってしまう。
【００２５】
代替の第３の精製方法としては、プラント５’−ＰＤＥを工業用微生物内でクローンする方法があるだろう。この精製方法については本出願人の調査チームによって評価がなされているが、この酵素をコード化する配列が知られていないこと、このことが遺伝子組み換え生物（ＧＭＯ）由来の酵素に繋がるであろうこと、このようなタイプの製品は、様々なユーザークライアントから依然として非常に良く見られていないという事実があった。
【００２６】
それ故、市場で入手可能な市販酵素に見られるような経済的デメリットの無いグルテンフリーの食物酵素源を発見することは、今日まで未解決の問題である。本発明の製剤は更に、ＲＮＡ断片やヌクレオチドを分解して味覚増進力を有しない分解産物にするヌクレアーゼまたはホスファターゼを含まないはずである。本発明の製剤は、服用中に不本意ながら感受する可能性のある臭味や香味臭のいずれも生産しないはずである。
【００２７】
本出願人は、５’−ヌクレオチドの豊富な酵母抽出物の調整においてアレルギー特性を有する大麦麦芽に、ソルガム麦芽が完全に取って代わることができることを全く予想せずまた意外にもちょうど今見出した。さらに、ソルガムは、ＥＣ指令２００３／８９／ＥＣのグルテンを含む穀物のリストには記載されておらず、したがってグルテンの様なアレルギー特性が無い。
【００２８】
本出願人は、ソルガム麦芽の胚芽や細根を含む混合物から５’−ＰＤＥの酵素調整剤を作り出した。
【００２９】
より詳しくは、ソルガム麦芽根を煮出す方法により、ソルガム５’−ホスホジエステラーゼを作り出した。故に、粒径２０から２０００μｍ、好ましくは１００から２００μｍのソルガム根の粉末が、酢酸亜鉛または酢酸亜鉛の同等剤、すなわち同一の５’−ＰＤＥ安定化効果を備える薬剤の水溶液中に懸濁されている。この懸濁液は、５０から８０℃の温度で３０分から４時間インキュベートされる。好ましくは、この懸濁液は撹拌される。例えば、ソルガム根の粉末は５から２０％（ｗ／ｗ）、好ましくは１０から１５（ｗ／ｗ）、具体的に１３％の割合で用いられる。酢酸亜鉛の濃度は、好ましくは０．２から５ｇ／ｌである。他の実施形態では、細根を含む全ソルガム麦芽が用いられる。そして、好ましい実施形態としては、懸濁液の可溶性部分が回収される。例えば、調整液が遠心分離式のデカンタで分離され、その後、デカンタの上澄みが遠心清澄機で分けられる。
【００３０】
このようにして得られたソルガム５’−ＰＤＥ製剤は、５’−ヌクレオチドが豊富なグルテンフリーの組成物、５’−ヌクレオチドが豊富な酵母抽出物の調整剤のために用いることができる。
【００３１】
本発明はしたがって、酢酸亜鉛水溶液（０．２から５ｇ／ｌ）中の麦芽ソルガム根の懸濁液を５０から８０℃の温度で３０分から４時間調整するステップと、その後に不溶性成分を除去するステップとを含む、ソルガム５’−ＰＤＥの調整方法に関する。この調整方法は、濃縮するステップをさらに含んでもよい。
【００３２】
本発明は、この調整方法により得られるソルガム５’−ＰＤＥの調整剤、およびＲＮＡを分解するためのソルガム５’−ＰＤＥの使用に関し、より詳細には、５’−ヌクレオチドが豊富な組成物、好ましくは酵母抽出物であり、グルテンを含まない組成物の調整に関する。本発明はまた、ＲＮＡ含有組成物の５’−ヌクレオチドを豊富にするための、ソルガム麦芽から抽出した５’−ＰＤＥの使用に関する。本発明はしたがって、５’−ヌクレオチドの豊富なグルテンフリーな組成物、好ましくは酵母抽出物を調整するための方法であって、ＲＮＡを細胞外培地に放出させるための微生物細胞を処理するステップと、放出されたＲＮＡを５’−ヌクレオチドに変換させるために、得られた懸濁液をソルガム５’−ＰＤＥ調整剤と共に処理するステップとを含む。本方法で使用可能な他の微生物細胞の例としては、例えば、アスペルギルス属やトリコデルマ属型の糸状菌や、好ましくは乳酸菌属の乳酸桿菌である細菌がある。本方法は、ＲＮＡの完全または部分精製の中間ステップを含んでもよい（ＪＰ ５１１０６７９１参照）。
【００３３】
好ましい実施形態としては、本発明は、酵母抽出物またはソルガム懸濁液を５’−ＰＤＥ調整剤と共に処理するステップを含む。
【００３４】
したがって、本発明は、より詳細には、５’−ヌクレオチドが豊富でグルテンを含まない酵母抽出物を調整する方法に関し、
酵母懸濁液を加熱するステップ、
酵母懸濁液を５’−ホスホジエステラーゼと共に処理するステップ、
懸濁液から不溶性物質を分離するステップ、及び、
酵母抽出物を回収するステップ、を含み、
５’−ホスホジエステラーゼが、ソルガム、詳しくはソルガム麦芽、より詳しくはソルガム麦芽根から抽出されたことを特徴とする。
【００３５】
本発明に有用な酵母は、食用酵母である。本発明によれば、抽出物を調整するために用いられる酵素は、好ましくはサッカロミセス属であり、好ましくは更に、いわゆるサッカロミセス・カールスベルゲンシスを含むサッカロミセス・セレビシエ種である。サッカロミセス・セレビシエの酵母細胞は、ビール酵母の場合、サッカロミセス・カールスベルゲンシスと呼ばれることが多いが、“ＴＨＥ ＹＥＡＳＴＳ，ａ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｓｔｕｄｙ”第３版、Ｎ．Ｊ．Ｗ． Ｋｒｅｇｅｒ ｖａｎ Ｒｉｊ版−１９８４年によれば、正確な分類名はサッカロミセス・セレビシエである（他方、このマニュアルの１９９８年の第４版では、サッカロミセス・カールスベルゲンシスには二つの類義語：サッカロミセス・セレビシエおよびサッカロミセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）があるが、本明細書に参照として取り込むのは、１９８４年からあるこのマニュアルの第３版とする。）。更に、この酵母は、カンジダ属（例えばカンジダ酵母）、ピキア属、ハンゼヌラ、クルイベロミセス属（例えば、クルイベロミセス・ラクチス、クルイベロミセス・マルキサヌスまたはクルイベロミセス・フラジリス）、トルラ、フザリウム属、ザイモモナス属などの由来であってもよい。この酵母は、未使用の酵母または醸造プロセスで使用された酵母の細胞由来であってもよい。好ましい実施形態としては、この酵母は、サッカロミセス属、カンジダ属またはクルイベロミセス属である。
【００３６】
このように酵母が選ばれるのは、ＲＮＡ含有量が高いからである。特定の実施形態において、ＲＮＡ含有量は、乾燥重量で６から１５％である。
【００３７】
酵母は、そのＲＮＡ含有量を増加可能とするための予備処理を施してもよい。このような予備処理は、酵母の変異および抽出による予備処理としてＵＳ３，９０９，３５２およびＪＰ１１−１９６８５６に、培地中の硫酸カリウムの制限による予備処理としてＪＰ５−１７６７５７に開示されている。
【００３８】
酵母懸濁液中のＲＮＡ含有量は、人間の食品または動物性食品として承認されている微生物から得られたＲＮＡを添加することで増加させてもよい。このような微生物の例としては、例えばアスペルギルス属やトリコデルマ属型の糸状菌や、好ましくは乳酸菌属の乳酸桿菌である細菌がある。この場合、微生物はそのＲＮＡ含有量を放出するように処理される。特定の実施形態において、ＲＮＡを公知の手法（超ろ過法、クロマトグラフィー法または沈殿法）により完全または部分精製することができる。
【００３９】
酵母抽出物を調整する方法は、当業者に広く知られている。このような方法は、例えば以下の特許に開示されている：ＥＰ ２４９ ４３５；ＥＰ ２９９ ０７８；ＥＰ ３５４ ６１０；ＥＰ ４６６ ９２２；ＥＰ １ １９９ ３５３；ＥＰ １ ４７９ ２９９；ＵＳ ３，９６１，０８０；ＵＳ４，３０３，６８０；ＵＳ４，８１０，５０９。これらの方法は、一般に酵母懸濁液を加熱するステップを含み、追加的に酵母の自己分解および／または加水分解のためのステップを含み、好ましくは懸濁液から不溶性物質を分離するステップを含む。この懸濁液は、生きている酵母の懸濁液である。
【００４０】
好ましくは、ホスファターゼおよびヌクレアーゼを含む酵母酵素を不活性化させ、酵母の細胞内含有量およびＲＮＡを放出するように酵母を透過処理し、好ましくは細胞外培地にＲＮＡを選択的に可溶化し、結果的に酵母懸濁液のＲＮＡ含有量よりも多い５’−ヌクレオチド力価を得られるように、酵母懸濁液が原形質分離される。好ましくは、酵母懸濁液は１０から２５％の乾燥物質を含む。好ましい実施形態において、酵母懸濁液は、５から９５℃の範囲の温度で５分から３時間加熱される。具体的に、懸濁液を７５℃で２時間加熱し、その後６０℃まで冷却することができる。
【００４１】
例えば機械処理（フレンチプレス、ガラス球、電磁場など）、化学処理（酸、塩基、塩、溶媒、浄化剤など）または酵素処理（β−グルカナーゼ、キチナーゼ、プロテアーゼなど）といった、酵母の細胞内含有量を放出させる当業者に広く知られた他の技術を用いることもできる。
【００４２】
更に、本発明の方法は、酵素処理ステップを含んでもよく、この酵素は、プロテアーゼ、β−グルカナーゼ、アミラーゼ、リパーゼなどから選択できる。
【００４３】
故に、本発明は、５’−ヌクレオチドの豊富な酵母抽出物を調整する方法に関し、
ａ）酵母懸濁液の加熱ステップ；
ｂ）酵母の自己分解および／または酵素加水分解ステップ；
ｃ）懸濁液からの不溶性物質の分離ステップ；
ｄ）酵母抽出物の回収ステップ；
を含み、この方法は、酵母懸濁液をソルガム麦芽から抽出した５’−ホスホジエステラーゼと共に処理するステップを含むことを特徴とする。
【００４４】
ステップｂは、酵母外部から酵素を用いて処理されることが好ましく、酵母タンパク質の分解を促進するために、具体的にプロテアーゼを用いて処理されることが好ましい。このようなプロテアーゼの例としては、植物プロテアーゼ（パパイン、ブロメラインなど）または微生物プロテアーゼ（枯草菌、コウジカビなど）がある。
【００４５】
本発明の方法は、ソルガム５’−ホスホジエステラーゼと共に処理するステップの前に、ＲＮＡの完全または部分精製のステップを含んでもよい。
【００４６】
好ましい実施形態において、ソルガム５’−ＰＤＥと共に酵母懸濁液を処理するステップは、３５から７０℃の間の温度で５．０から７．５の間のｐＨで行われる。ソルガム５’−ＰＤＥが入った酵母懸濁液のインキュベート時間は、５から３０時間まで幅があってよい。好ましくは、ソルガム５’−ＰＤＥの調整液は、酵母懸濁液の１０％ｗ／ｗ加えられる。例えば、酵母懸濁液をソルガム５’−ＰＤＥと共に処理するステップは、６．３のｐＨ、６０℃で１８時間行うことができる。
【００４７】
好ましくは、本発明の酵母抽出物は、５’−ＧＭＰおよび／または５’−ＩＭＰが豊富である。具体的には、共に０．１から１５％の５’−ＧＭＰおよび５’−ＩＭＰレベル達成でき（二ナトリウム、七水和物の塩として表した場合）、好ましくは２から５％を達成できる。得られた酵母抽出物は、グルテンを含まない。
【００４８】
本発明の方法は、酵母懸濁液をデアミナーゼと共に処理するステップを追加的に含んでもよい。本処理は、酵母懸濁液をソルガムＰＤＥと共に処理する間または処理した後に行うことができる。好ましい実施形態において、デアミナーゼと共に処理する本ステップは、ソルガムＰＤＥと共に処理するステップと同時またはその後に行われる。例えば、デアミナーゼが、５’−ＰＤＥとの処理の最終段階で添加されてもよく、例えば４５℃まで懸濁液が冷却された後に添加されてもよい。本ステップにより、５’−ＡＭＰを所望の５’−ＩＭＰに変換可能となる。この追加的ステップは、当業者に広く知られており、例えばＥＰ ２４９ ４３５やＥＰ ３５４ ６１０に開示されている。市販されているデアミナーゼの一例としては、天野から生産されているデアミナーゼ５００００Ｇがある。好ましい実施形態として、本発明の方法は、多糖類を乳酸やコハク酸といった有機酸に変換可能な発酵ステップを含む。本ステップは当業者に広く知られており、例えばＥＰ １９１ ５１３やＥＰ ３５４ ６１０に開示されている。この発酵は、乳酸菌属または同等菌属の細菌補助剤と共に好ましく行うことができる。
【００４９】
好ましくは、本発明の酵母抽出物は、酵母細胞の不溶性部分からその後分離される。不溶性部分からこのように分離された酵母抽出物は、不溶性部分の膜脂質の酸化による臭味の発生が無いという良好な保存の効果をもたらす。例えば、本ステップは、液体成分の遠心分離またはろ過または回収により行うことができる。
【００５０】
可溶性成分にはその後、酵母抽出物に対する公知のあらゆる最終処理、具体的に、濃縮、ろ過、低温殺菌および／または乾燥が施される。
【００５１】
上述したように、酵母抽出物は普通、味覚増進剤として用いられる。「酵母抽出物」という表現は、本発明では、一般に自己分解または加水分解によって得られる酵母の可溶成分の濃縮物を意味するものと解される。５’−ヌクレオチドが豊富な本発明の酵母抽出物は、例えば、液体状、ペースト状、固体状といった様々な形態で供給される。本発明の酵母抽出物は、乾燥物質の少なくとも９０重量％、好ましくは乾燥物質の９４から９８重量％の５’−ヌクレオチドを有利に含む。
【００５２】
本発明はしたがって、本発明による方法により得られるまたは得ることのできる酵母抽出物、またはこれら酵母抽出物の食料部門への適用に関する。これら酵母抽出物は、グルテンを含まない。これら酵母抽出物は、好ましくは共に０．１から１５％の５’−ＧＭＰおよび５’−ＩＭＰレベル含む（二ナトリウム、七水和物の塩として表した場合）。
【００５３】
本発明は、本発明による酵母抽出物の食事献立における利用、このようにして得られた食事献立およびこの献立に基づいて得られる消費用食料品に関する。食事献立は例えば、ブロス、ソース、惣菜、パン生地または香辛料とできる。
【００５４】
本発明は、本発明による酵母抽出物を含む香味修飾剤にも関する。本発明による香味修飾剤は、不溶性物質も含むことができる。
【００５５】
本発明は、本発明による香味修飾剤の食事献立における利用、このようにして得られた食事献立およびこの献立に基づいて得られる消費用食料品に関する。食事献立は例えば、ブロス、ソース、惣菜、ベーカリー製品または香辛料とできる。
【００５６】
故に、本発明は、本発明による香味修飾剤が用いられることを特徴とする食料品の香味付けの方法に関する。
【００５７】
以下の実施例は、本発明を明らかにするために示されるものであるが、本発明の範囲を限定するものとして考慮されるべきではない。
【００５８】
実施例１
ソルガム根の抽出物の調整
使用するソルガム根は、アフリカのソルガム麦芽会社から入手した。５００μｍの平均粒子サイズを有する粉末を得るため、ソルガム根の１３ｇが磨り潰されまたは挽かれた。この粉末は、０．２ｇ／ｌの酢酸亜鉛水溶液中、２時間、６０℃の温度で、１３％（ｗ／ｗ）の煮汁に調整された。２回の遠心分離ステップにより固体および不溶物を抽出した後に、ソルガム根の抽出物を得た。
【００５９】
実施例２
５’−ヌクレオチドが豊富な酵母抽出物の調整−
ソルガム由来の５’−ＰＤＥと市販酵素との比較
１５％の乾物含有量および９．５％のＲＮＡ含有量（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｏｌｙｔｉｃ Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ ｏｆ ＲＮＡ ｉｎ Ｙｅａｓｔ ｂｙ Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｔｈａｎｏｌ ａｎｄ ｂｙ Ｄｒｙｉｎｇ／Ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ；Ｔｒｅｖｅｌｙａｎ，Ｊ．，Ｓｃｉ．ＦｏｏｄＡｇｒｃ．，１９７７，２８，５７９−５８８；およびＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｙｅａｓｔ ｔｏ Ｒｅｄｕｃｅ ｉｔｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＮａｓｅ Ａｃｔｉｏｎ ｂｙ ａ Ｓｉｍｐｌｅ Ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ， ａｎｄ ａｎ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｂｙ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ａｔ ｌｏｗ ｐＨ；Ｔｒｅｖｅｌｙａｎ，Ｊ．，Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄ．，１９７８，ｐｐ１４１−１７４に記載されたＴｒｅｖｅｌｙａｎ法による加水分解により測定。）を有するサッカロミセス・セレビシエ属のクリーム酵母の１，０００ｇが２時間７５℃で熱処理され、その後５６℃に冷却されると共に、５．３のｐＨに調節された（原形質分離）。このクリームは、５’−ＰＤＥを含む（１０％ ｗ／ｗ）ソルガム根の懸濁液の上澄みと共に混合される。混合液全体は、ＲＮＡを５’−ヌクレオチドに加水分解するため、５６℃で１５時間、穏やかに撹拌されながらインキュベートされる。固形物はその後、遠心分離によって分離され、再度遠心分離する前に脱塩水による洗浄にさらされる。２つの上澄み物は、混ぜ合わされ、濃縮され、スプレードライされる。粉体の分析をしたところ、２．４４％の５’−ＧＭＰ含有量を示した（二ナトリウム、七水和物の塩として表した場合）。この分析は、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ａｕｔｏｌｙｓａｔｅｓ ｏｆ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ ｇｒｏｗｎ ｏｎ ｗｈｅｙ； Ｂｅｌｅｍ，Ｍ．Ａ．Ｆ．，ら、Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６２，ｐｐ ８５１-８５４に記載されたＲＰ−ＨＰＬＣにより実施した。
【００６０】
同一条件で原型質分離を行うと共に、天野から入手した市販の５’−ＰＤＥ（トレードネーム＝ＰＤＥ ＲＰ−１、天野エンザイム・ヨーロッパ）の１ｇと１５時間インキュベートされた同一クリームの１ｋｇは、分離、濃縮および乾燥後、２．６０％５’−ＰＤＥの力価を有する粉体を与えた。加水分解の効率はしたがって、両者とも同様であり、ＲＮＡの加水分解という観点からも、ソルガム由来の５’−ＰＤＥは、より高価な市販酵素と同様の効率である。
【００６１】
実施例３
本方法は、麦芽になったソルガム根の１３ｇおよび前実施例で上述したクリーム酵母の１，０００ｇからスタートした。しかしながら、インキュベーションの１５時間後、温度を４５℃まで下げ、天野から入手した５’−アデニルデアミナーゼ（トレードネーム＝Ｄｅａｍｉｚｙｍｅ ５００００Ｇ、天野エンザイム・ヨーロッパ）の０．１ｇを加えた。５’−アデニルデアミナーゼで５’−ＡＭＰを５’−ＩＭＰに変換させるために、混合物全体が５時間インキュベートされた。固形物はその後、遠心分離によって分離され、再度遠心分離する前に脱塩水による洗浄にさらされる。２つの上澄み物は、混ぜ合わされ、濃縮され、スプレードライされる。粉体の分析をしたところ、２．８０％の５’−ＧＭＰ含有量および３．２１％の５’−ＩＭＰ含有量を示した（分析はＲＰ−ＨＰＬＣによるものであり、これらは二ナトリウム、七水和物の塩として表した）。
【００６２】
本方法は、麦芽になったソルガム根の１３ｇおよび前実施例で上述したクリーム酵母の１，０００ｇからスタートした。しかしながら、ソルガム麦芽５’−ＰＤＥを加える前に、酵母の乾物含量の可溶化を促進するためにパパインの０．５ｇが加えられた。本方法の残りの部分は、実施例３で５’−アデニルデアミナーゼを加えることを含み同様であった。結果物である粉体の分析をしたところ、１．９６％の５’−ＧＭＰ含有量および２．０７％の５’−ＩＭＰ含有量を示した（分析はＲＰ−ＨＰＬＣによるものであり、これらは二ナトリウム、七水和物の塩として表した）。
【００６３】
本方法は、サッカロミセス・セレビシエのクリーム酵母を、１３％の乾物含有量および１２．５％のＲＮＡ含有量を有するカンジダ酵母クリームに置き換えた他は、実施例１および２同様に行った。結果物である粉体の分析をしたところ、３．７５％の５’−ＧＭＰ含有量および３．９８％の５’−ＩＭＰ含有量を示した（これらは二ナトリウム、七水和物の塩として表した）。
【技術分野】
【０００１】
この発明は、酵母の酵素処理による香味修飾剤の調整のための方法、それにより得られる香味修飾剤および香味修飾剤の使用に関する。
【０００２】
酵母抽出物は、粉末状又はペースト状で市販されているとともに、農業食品産業において香味剤として広く使用されている。
【０００３】
酵母抽出物は、一般的に自己分解又は加水分解によって得られる酵母の可溶成分の濃縮物として定義される。
【０００４】
自己分解とは、基本的に、酵母の実在分解酵素（プロテアーゼ）の活性化によって行われる酵母の細胞膜の損傷と、その結果としての細胞内化合物の可溶化とを目的とした方法である。
【０００５】
酵母抽出物は、高分解状態にある細胞内含有物の放出を可能とする試薬または酵素剤を用いる加水分解によっても得ることができる。
【０００６】
酵母抽出物は、天然香味剤という名で農業食品産業において広く受け入れられている。
【０００７】
酵母抽出物はまた、同等の香味強度をもつ他の香味剤（時に非天然のもの）と、価格面で非常に競合している。
【０００８】
酵母の酵素処理については、当該技術分野で広く知られている。
【０００９】
自己の内因性酵素化物質によって酵母を分解することにより調整される酵母の自己分解物は、食品添加物として広く知られている。
【００１０】
この自己分解は、酵母細胞を高温でインキュベートする方法、有機溶剤を加える方法、ＮａＣｌの濃度を増加する方法やこれらの様々な方法を組み合わせることによって開始させることができる。
【００１１】
自己分解の間に起こる主な変換として、タンパク質のペプチドおよびアミノ酸への分解がある。
【００１２】
結果として得られる自己分解物は、苦い香りや独特の強い酵母臭を有する。別のデメリットとしては、内因性リボヌクレアーゼが細胞間ＲＮＡを３’−リボヌクレオチドに変換するため、この自己分解物が香りに関して全く貢献しない３’−リボヌクレオチドのみを含むことが多いということがある。
【００１３】
酵母抽出物の調整方法は、Ｑｕｅｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂ．Ｖ．による欧州特許第０３５４６１０号に示されており、先ず第１に、嫌気条件下で外因性タンパク質分解酵素により細胞壁を分解し、続いて酸素条件下で細胞間ＲＮＡを分解する。この方法によれば、５’−ヌクレオチドの多い自己分解物を得ることが可能となる。
【００１４】
酵母自己分解物に含まれる公知の風味化合物は、アミノ酸、ペプチド、５’−ヌクレオチド、サッカリドおよび有機酸といった核酸を含む。５’−ヌクレオチド含有物は、風味化合物や香味化合物にとって非常に重要である。このような核酸は、例えば５’−イノシン一リン酸（５’−ＩＭＰ）や５’−グアノシン一リン酸（５’−ＧＭＰ）といった食品製剤の香味付けの際の粗化合物として使用されているが、医薬品の製造にも応用されている。
【００１５】
旨味は、甘味、塩味、苦味および酸味に続く第５の基本の味として認識されている。高い味覚増進力を有する５’−ヌクレオチドは旨味をも生産し、それ故、酵母抽出物に元来見られるグルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）効果を強化する。
【００１６】
５’−ヌクレオチドの生産には、極めて特異な酵素である５’−ホスホジエステラーゼ（５’−ＰＤＥ）を用いた粗ＲＮＡの加水分解を必要とする。ＣｏｈｎおよびＶｏｌｋｉｎ（１９５３）は初めて、ヘビ毒内の５’−ホスホジエステラーゼ活性の存在を実証した。ヘビ毒は、その非常に高い能力にも関らず、明確な理由のために、農業食品産業で使用することができない。
【００１７】
５’−ＰＤＥの他の主要源には、ペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｕｕｍ）といった特定の菌類や、ストレプトマイセス・アウレウス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｕｓ）といった特定の放射菌が含まれる。
【００１８】
実際、ペニシリウム・シトリヌムにより得られる５’−ＰＤＥは、とりわけ、ヌクレアーゼＲＰ−１Ｇ（またはＥＣ３．１．３０．１）という名で天野エンザイムから市販されている。非常に高い生産コストのため、この酵素は、工業規模上、主に固定化型で用いられる。５’−ヌクレオチドが豊富な酵母抽出物の生産方法にこの酵素を用いると、非常に高い追加の酵素コストが発生してしまう。
【００１９】
特定の植物胚における５’−ＰＤＥ活性の存在は、Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９５７）によって実証されている。多数の最近の研究は、特許出願のテーマとなるとともに、麦芽根（麦芽は大麦胚芽）の抽出物から５’−ヌクレオチドが豊富な酵母抽出物を生産する方法を主に開示している。麦芽は、醸造産業における副産物であり、したがって、酵母ＲＮＡ由来の５’−ヌクレオチド生産のための安価な酵素源となる可能性がある。この場合、５’−ＰＤＥは、酵素を安定化させるための酢酸亜鉛を含む水溶液中の麦芽根粉末を単に煮出すだけで調整でき、その使用により発生する、５’−ヌクレオチドの豊富な酵母抽出物の製造に掛かる追加コストは小さい。
【００２０】
酵素源として大麦麦芽を用い、５’−ヌクレオチドが豊富な酵素誘導体を生産する方法は、例えば、ＵＳ−Ａ−４ ８１０ ５０９、ＥＰ−Ａ−０２９９０７８、ＦＲ ７５ ０８４４６の文献や、Ｇ．ＲｅｅｄおよびＴ．Ｗ．Ｎａｇｏｄａｗｉｔｈａｎａ、“Ｙｅａｓｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”第２版（Ｖａｎ Ｎｏｓｔｒａｎｄ Ｒｅｉｎｈｏｌｄ、ＩＳＢＮ ０−４４２−３１８９２−８）、３８２〜３８５頁の参照マニュアルに開示されている。
【００２１】
麦芽または大麦胚芽から得た５’−ＰＤＥを用いることの主たるデメリットとして、アレルギー特性がある。酵素の派生源である原材料は、この場合大麦であるが、アレルギー特性を示すとともに、アレルギー（セリアック病）を引き起こす小麦グリアジンに似たプロラミンというホルデインを含む。実際、大麦は、ＥＣ指令２０００／１３／ＥＣ、ＥＣ指令２００３／８９／ＥＣにより修正、にグルテンを含む穀物に属するとしてリストされている。それ故、「アレルゲン」指令と称するこのＥＣ指令によれば、大麦または大麦の誘導体を含む製品は、標示の対象である。
【００２２】
これらのタンパク質の主たる特性としては、胃の酸性環境下においても、腸内の消化酵素によっても分解されないことである。分解されない状態であることから、これらのタンパク質は、そのままの状態で腸内に吸収され、それ故、免疫反応を引き起こしてしまう。セリアック病の場合、プロラミンの消費が体内反応を引き起こす。これらのタンパク質の消費は、小腸の細胞表面を損傷する強い炎症反応を引き起こすため、いわゆるセリアック病患者にとって、全てのこれらのプロラミンタンパク質は有毒である。このことは、タンパク質、脂肪、炭水化物、ビタミンやミネラルといった栄養素を吸収する小腸の能力を低下させるという影響をもつ。アレルギーは、胃腸性の兆候：胃けいれん、拡張および慢性下痢と関係がある。このことは、各種栄養素（鉄、カルシウム、葉酸）の吸収不良、消化不良（貧血や体重減少）、疲労、骨痛、筋けいれんや過敏症に繋がる可能性がある。
【００２３】
大麦麦芽からのＰＤＥの精製は、酵素と大麦プロラミンとが難なく分離できる場合、代替を構成する可能性がある。しかし、Ａｉ−Ｙｕ Ｗａｎｇら（（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、１０９５〜１１０２頁、第２９巻、第６版）、またはＢｅｌｕｈａｎら（（２００３）ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２５、１０９９〜１１０３頁）により発行された研究は、調製液中の大麦プロラミンの存在を測定することなく大麦麦芽から精製された５’−ＰＤＥを特徴つけることに焦点をおいている。この代替の精製方法は、高価であると見られ、酵素調製液からのグルテンの除去を示す分析記録はあるが、この酵素の活性に由来するアレルギー特性の不存在を立証する臨床記録は特にない。
【００２４】
代替の第２の精製方法としては、ペニシリウム・シトリヌムや黒色アスペルギルスといった糸状菌の菌株、またはアクタノミセス属やストレプトミセスといった細菌から得られる微生物起源の５’−ＰＤＥを用いるものがある。しかし、これら微生物起源は、菌株改良段階を伴う非常に長い進化である。加えて、この型の製品は、工業発酵／工業精製プラントや、プロセスを必要とし、その結果、高価な酵素となってしまう。
【００２５】
代替の第３の精製方法としては、プラント５’−ＰＤＥを工業用微生物内でクローンする方法があるだろう。この精製方法については本出願人の調査チームによって評価がなされているが、この酵素をコード化する配列が知られていないこと、このことが遺伝子組み換え生物（ＧＭＯ）由来の酵素に繋がるであろうこと、このようなタイプの製品は、様々なユーザークライアントから依然として非常に良く見られていないという事実があった。
【００２６】
それ故、市場で入手可能な市販酵素に見られるような経済的デメリットの無いグルテンフリーの食物酵素源を発見することは、今日まで未解決の問題である。本発明の製剤は更に、ＲＮＡ断片やヌクレオチドを分解して味覚増進力を有しない分解産物にするヌクレアーゼまたはホスファターゼを含まないはずである。本発明の製剤は、服用中に不本意ながら感受する可能性のある臭味や香味臭のいずれも生産しないはずである。
【００２７】
本出願人は、５’−ヌクレオチドの豊富な酵母抽出物の調整においてアレルギー特性を有する大麦麦芽に、ソルガム麦芽が完全に取って代わることができることを全く予想せずまた意外にもちょうど今見出した。さらに、ソルガムは、ＥＣ指令２００３／８９／ＥＣのグルテンを含む穀物のリストには記載されておらず、したがってグルテンの様なアレルギー特性が無い。
【００２８】
本出願人は、ソルガム麦芽の胚芽や細根を含む混合物から５’−ＰＤＥの酵素調整剤を作り出した。
【００２９】
より詳しくは、ソルガム麦芽根を煮出す方法により、ソルガム５’−ホスホジエステラーゼを作り出した。故に、粒径２０から２０００μｍ、好ましくは１００から２００μｍのソルガム根の粉末が、酢酸亜鉛または酢酸亜鉛の同等剤、すなわち同一の５’−ＰＤＥ安定化効果を備える薬剤の水溶液中に懸濁されている。この懸濁液は、５０から８０℃の温度で３０分から４時間インキュベートされる。好ましくは、この懸濁液は撹拌される。例えば、ソルガム根の粉末は５から２０％（ｗ／ｗ）、好ましくは１０から１５（ｗ／ｗ）、具体的に１３％の割合で用いられる。酢酸亜鉛の濃度は、好ましくは０．２から５ｇ／ｌである。他の実施形態では、細根を含む全ソルガム麦芽が用いられる。そして、好ましい実施形態としては、懸濁液の可溶性部分が回収される。例えば、調整液が遠心分離式のデカンタで分離され、その後、デカンタの上澄みが遠心清澄機で分けられる。
【００３０】
このようにして得られたソルガム５’−ＰＤＥ製剤は、５’−ヌクレオチドが豊富なグルテンフリーの組成物、５’−ヌクレオチドが豊富な酵母抽出物の調整剤のために用いることができる。
【００３１】
本発明はしたがって、酢酸亜鉛水溶液（０．２から５ｇ／ｌ）中の麦芽ソルガム根の懸濁液を５０から８０℃の温度で３０分から４時間調整するステップと、その後に不溶性成分を除去するステップとを含む、ソルガム５’−ＰＤＥの調整方法に関する。この調整方法は、濃縮するステップをさらに含んでもよい。
【００３２】
本発明は、この調整方法により得られるソルガム５’−ＰＤＥの調整剤、およびＲＮＡを分解するためのソルガム５’−ＰＤＥの使用に関し、より詳細には、５’−ヌクレオチドが豊富な組成物、好ましくは酵母抽出物であり、グルテンを含まない組成物の調整に関する。本発明はまた、ＲＮＡ含有組成物の５’−ヌクレオチドを豊富にするための、ソルガム麦芽から抽出した５’−ＰＤＥの使用に関する。本発明はしたがって、５’−ヌクレオチドの豊富なグルテンフリーな組成物、好ましくは酵母抽出物を調整するための方法であって、ＲＮＡを細胞外培地に放出させるための微生物細胞を処理するステップと、放出されたＲＮＡを５’−ヌクレオチドに変換させるために、得られた懸濁液をソルガム５’−ＰＤＥ調整剤と共に処理するステップとを含む。本方法で使用可能な他の微生物細胞の例としては、例えば、アスペルギルス属やトリコデルマ属型の糸状菌や、好ましくは乳酸菌属の乳酸桿菌である細菌がある。本方法は、ＲＮＡの完全または部分精製の中間ステップを含んでもよい（ＪＰ ５１１０６７９１参照）。
【００３３】
好ましい実施形態としては、本発明は、酵母抽出物またはソルガム懸濁液を５’−ＰＤＥ調整剤と共に処理するステップを含む。
【００３４】
したがって、本発明は、より詳細には、５’−ヌクレオチドが豊富でグルテンを含まない酵母抽出物を調整する方法に関し、
酵母懸濁液を加熱するステップ、
酵母懸濁液を５’−ホスホジエステラーゼと共に処理するステップ、
懸濁液から不溶性物質を分離するステップ、及び、
酵母抽出物を回収するステップ、を含み、
５’−ホスホジエステラーゼが、ソルガム、詳しくはソルガム麦芽、より詳しくはソルガム麦芽根から抽出されたことを特徴とする。
【００３５】
本発明に有用な酵母は、食用酵母である。本発明によれば、抽出物を調整するために用いられる酵素は、好ましくはサッカロミセス属であり、好ましくは更に、いわゆるサッカロミセス・カールスベルゲンシスを含むサッカロミセス・セレビシエ種である。サッカロミセス・セレビシエの酵母細胞は、ビール酵母の場合、サッカロミセス・カールスベルゲンシスと呼ばれることが多いが、“ＴＨＥ ＹＥＡＳＴＳ，ａ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｓｔｕｄｙ”第３版、Ｎ．Ｊ．Ｗ． Ｋｒｅｇｅｒ ｖａｎ Ｒｉｊ版−１９８４年によれば、正確な分類名はサッカロミセス・セレビシエである（他方、このマニュアルの１９９８年の第４版では、サッカロミセス・カールスベルゲンシスには二つの類義語：サッカロミセス・セレビシエおよびサッカロミセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）があるが、本明細書に参照として取り込むのは、１９８４年からあるこのマニュアルの第３版とする。）。更に、この酵母は、カンジダ属（例えばカンジダ酵母）、ピキア属、ハンゼヌラ、クルイベロミセス属（例えば、クルイベロミセス・ラクチス、クルイベロミセス・マルキサヌスまたはクルイベロミセス・フラジリス）、トルラ、フザリウム属、ザイモモナス属などの由来であってもよい。この酵母は、未使用の酵母または醸造プロセスで使用された酵母の細胞由来であってもよい。好ましい実施形態としては、この酵母は、サッカロミセス属、カンジダ属またはクルイベロミセス属である。
【００３６】
このように酵母が選ばれるのは、ＲＮＡ含有量が高いからである。特定の実施形態において、ＲＮＡ含有量は、乾燥重量で６から１５％である。
【００３７】
酵母は、そのＲＮＡ含有量を増加可能とするための予備処理を施してもよい。このような予備処理は、酵母の変異および抽出による予備処理としてＵＳ３，９０９，３５２およびＪＰ１１−１９６８５６に、培地中の硫酸カリウムの制限による予備処理としてＪＰ５−１７６７５７に開示されている。
【００３８】
酵母懸濁液中のＲＮＡ含有量は、人間の食品または動物性食品として承認されている微生物から得られたＲＮＡを添加することで増加させてもよい。このような微生物の例としては、例えばアスペルギルス属やトリコデルマ属型の糸状菌や、好ましくは乳酸菌属の乳酸桿菌である細菌がある。この場合、微生物はそのＲＮＡ含有量を放出するように処理される。特定の実施形態において、ＲＮＡを公知の手法（超ろ過法、クロマトグラフィー法または沈殿法）により完全または部分精製することができる。
【００３９】
酵母抽出物を調整する方法は、当業者に広く知られている。このような方法は、例えば以下の特許に開示されている：ＥＰ ２４９ ４３５；ＥＰ ２９９ ０７８；ＥＰ ３５４ ６１０；ＥＰ ４６６ ９２２；ＥＰ １ １９９ ３５３；ＥＰ １ ４７９ ２９９；ＵＳ ３，９６１，０８０；ＵＳ４，３０３，６８０；ＵＳ４，８１０，５０９。これらの方法は、一般に酵母懸濁液を加熱するステップを含み、追加的に酵母の自己分解および／または加水分解のためのステップを含み、好ましくは懸濁液から不溶性物質を分離するステップを含む。この懸濁液は、生きている酵母の懸濁液である。
【００４０】
好ましくは、ホスファターゼおよびヌクレアーゼを含む酵母酵素を不活性化させ、酵母の細胞内含有量およびＲＮＡを放出するように酵母を透過処理し、好ましくは細胞外培地にＲＮＡを選択的に可溶化し、結果的に酵母懸濁液のＲＮＡ含有量よりも多い５’−ヌクレオチド力価を得られるように、酵母懸濁液が原形質分離される。好ましくは、酵母懸濁液は１０から２５％の乾燥物質を含む。好ましい実施形態において、酵母懸濁液は、５から９５℃の範囲の温度で５分から３時間加熱される。具体的に、懸濁液を７５℃で２時間加熱し、その後６０℃まで冷却することができる。
【００４１】
例えば機械処理（フレンチプレス、ガラス球、電磁場など）、化学処理（酸、塩基、塩、溶媒、浄化剤など）または酵素処理（β−グルカナーゼ、キチナーゼ、プロテアーゼなど）といった、酵母の細胞内含有量を放出させる当業者に広く知られた他の技術を用いることもできる。
【００４２】
更に、本発明の方法は、酵素処理ステップを含んでもよく、この酵素は、プロテアーゼ、β−グルカナーゼ、アミラーゼ、リパーゼなどから選択できる。
【００４３】
故に、本発明は、５’−ヌクレオチドの豊富な酵母抽出物を調整する方法に関し、
ａ）酵母懸濁液の加熱ステップ；
ｂ）酵母の自己分解および／または酵素加水分解ステップ；
ｃ）懸濁液からの不溶性物質の分離ステップ；
ｄ）酵母抽出物の回収ステップ；
を含み、この方法は、酵母懸濁液をソルガム麦芽から抽出した５’−ホスホジエステラーゼと共に処理するステップを含むことを特徴とする。
【００４４】
ステップｂは、酵母外部から酵素を用いて処理されることが好ましく、酵母タンパク質の分解を促進するために、具体的にプロテアーゼを用いて処理されることが好ましい。このようなプロテアーゼの例としては、植物プロテアーゼ（パパイン、ブロメラインなど）または微生物プロテアーゼ（枯草菌、コウジカビなど）がある。
【００４５】
本発明の方法は、ソルガム５’−ホスホジエステラーゼと共に処理するステップの前に、ＲＮＡの完全または部分精製のステップを含んでもよい。
【００４６】
好ましい実施形態において、ソルガム５’−ＰＤＥと共に酵母懸濁液を処理するステップは、３５から７０℃の間の温度で５．０から７．５の間のｐＨで行われる。ソルガム５’−ＰＤＥが入った酵母懸濁液のインキュベート時間は、５から３０時間まで幅があってよい。好ましくは、ソルガム５’−ＰＤＥの調整液は、酵母懸濁液の１０％ｗ／ｗ加えられる。例えば、酵母懸濁液をソルガム５’−ＰＤＥと共に処理するステップは、６．３のｐＨ、６０℃で１８時間行うことができる。
【００４７】
好ましくは、本発明の酵母抽出物は、５’−ＧＭＰおよび／または５’−ＩＭＰが豊富である。具体的には、共に０．１から１５％の５’−ＧＭＰおよび５’−ＩＭＰレベル達成でき（二ナトリウム、七水和物の塩として表した場合）、好ましくは２から５％を達成できる。得られた酵母抽出物は、グルテンを含まない。
【００４８】
本発明の方法は、酵母懸濁液をデアミナーゼと共に処理するステップを追加的に含んでもよい。本処理は、酵母懸濁液をソルガムＰＤＥと共に処理する間または処理した後に行うことができる。好ましい実施形態において、デアミナーゼと共に処理する本ステップは、ソルガムＰＤＥと共に処理するステップと同時またはその後に行われる。例えば、デアミナーゼが、５’−ＰＤＥとの処理の最終段階で添加されてもよく、例えば４５℃まで懸濁液が冷却された後に添加されてもよい。本ステップにより、５’−ＡＭＰを所望の５’−ＩＭＰに変換可能となる。この追加的ステップは、当業者に広く知られており、例えばＥＰ ２４９ ４３５やＥＰ ３５４ ６１０に開示されている。市販されているデアミナーゼの一例としては、天野から生産されているデアミナーゼ５００００Ｇがある。好ましい実施形態として、本発明の方法は、多糖類を乳酸やコハク酸といった有機酸に変換可能な発酵ステップを含む。本ステップは当業者に広く知られており、例えばＥＰ １９１ ５１３やＥＰ ３５４ ６１０に開示されている。この発酵は、乳酸菌属または同等菌属の細菌補助剤と共に好ましく行うことができる。
【００４９】
好ましくは、本発明の酵母抽出物は、酵母細胞の不溶性部分からその後分離される。不溶性部分からこのように分離された酵母抽出物は、不溶性部分の膜脂質の酸化による臭味の発生が無いという良好な保存の効果をもたらす。例えば、本ステップは、液体成分の遠心分離またはろ過または回収により行うことができる。
【００５０】
可溶性成分にはその後、酵母抽出物に対する公知のあらゆる最終処理、具体的に、濃縮、ろ過、低温殺菌および／または乾燥が施される。
【００５１】
上述したように、酵母抽出物は普通、味覚増進剤として用いられる。「酵母抽出物」という表現は、本発明では、一般に自己分解または加水分解によって得られる酵母の可溶成分の濃縮物を意味するものと解される。５’−ヌクレオチドが豊富な本発明の酵母抽出物は、例えば、液体状、ペースト状、固体状といった様々な形態で供給される。本発明の酵母抽出物は、乾燥物質の少なくとも９０重量％、好ましくは乾燥物質の９４から９８重量％の５’−ヌクレオチドを有利に含む。
【００５２】
本発明はしたがって、本発明による方法により得られるまたは得ることのできる酵母抽出物、またはこれら酵母抽出物の食料部門への適用に関する。これら酵母抽出物は、グルテンを含まない。これら酵母抽出物は、好ましくは共に０．１から１５％の５’−ＧＭＰおよび５’−ＩＭＰレベル含む（二ナトリウム、七水和物の塩として表した場合）。
【００５３】
本発明は、本発明による酵母抽出物の食事献立における利用、このようにして得られた食事献立およびこの献立に基づいて得られる消費用食料品に関する。食事献立は例えば、ブロス、ソース、惣菜、パン生地または香辛料とできる。
【００５４】
本発明は、本発明による酵母抽出物を含む香味修飾剤にも関する。本発明による香味修飾剤は、不溶性物質も含むことができる。
【００５５】
本発明は、本発明による香味修飾剤の食事献立における利用、このようにして得られた食事献立およびこの献立に基づいて得られる消費用食料品に関する。食事献立は例えば、ブロス、ソース、惣菜、ベーカリー製品または香辛料とできる。
【００５６】
故に、本発明は、本発明による香味修飾剤が用いられることを特徴とする食料品の香味付けの方法に関する。
【００５７】
以下の実施例は、本発明を明らかにするために示されるものであるが、本発明の範囲を限定するものとして考慮されるべきではない。
【００５８】
実施例１
ソルガム根の抽出物の調整
使用するソルガム根は、アフリカのソルガム麦芽会社から入手した。５００μｍの平均粒子サイズを有する粉末を得るため、ソルガム根の１３ｇが磨り潰されまたは挽かれた。この粉末は、０．２ｇ／ｌの酢酸亜鉛水溶液中、２時間、６０℃の温度で、１３％（ｗ／ｗ）の煮汁に調整された。２回の遠心分離ステップにより固体および不溶物を抽出した後に、ソルガム根の抽出物を得た。
【００５９】
実施例２
５’−ヌクレオチドが豊富な酵母抽出物の調整−
ソルガム由来の５’−ＰＤＥと市販酵素との比較
１５％の乾物含有量および９．５％のＲＮＡ含有量（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｏｌｙｔｉｃ Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ ｏｆ ＲＮＡ ｉｎ Ｙｅａｓｔ ｂｙ Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｔｈａｎｏｌ ａｎｄ ｂｙ Ｄｒｙｉｎｇ／Ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ；Ｔｒｅｖｅｌｙａｎ，Ｊ．，Ｓｃｉ．ＦｏｏｄＡｇｒｃ．，１９７７，２８，５７９−５８８；およびＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｙｅａｓｔ ｔｏ Ｒｅｄｕｃｅ ｉｔｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＮａｓｅ Ａｃｔｉｏｎ ｂｙ ａ Ｓｉｍｐｌｅ Ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ， ａｎｄ ａｎ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｂｙ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ａｔ ｌｏｗ ｐＨ；Ｔｒｅｖｅｌｙａｎ，Ｊ．，Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄ．，１９７８，ｐｐ１４１−１７４に記載されたＴｒｅｖｅｌｙａｎ法による加水分解により測定。）を有するサッカロミセス・セレビシエ属のクリーム酵母の１，０００ｇが２時間７５℃で熱処理され、その後５６℃に冷却されると共に、５．３のｐＨに調節された（原形質分離）。このクリームは、５’−ＰＤＥを含む（１０％ ｗ／ｗ）ソルガム根の懸濁液の上澄みと共に混合される。混合液全体は、ＲＮＡを５’−ヌクレオチドに加水分解するため、５６℃で１５時間、穏やかに撹拌されながらインキュベートされる。固形物はその後、遠心分離によって分離され、再度遠心分離する前に脱塩水による洗浄にさらされる。２つの上澄み物は、混ぜ合わされ、濃縮され、スプレードライされる。粉体の分析をしたところ、２．４４％の５’−ＧＭＰ含有量を示した（二ナトリウム、七水和物の塩として表した場合）。この分析は、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ａｕｔｏｌｙｓａｔｅｓ ｏｆ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ ｇｒｏｗｎ ｏｎ ｗｈｅｙ； Ｂｅｌｅｍ，Ｍ．Ａ．Ｆ．，ら、Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６２，ｐｐ ８５１-８５４に記載されたＲＰ−ＨＰＬＣにより実施した。
【００６０】
同一条件で原型質分離を行うと共に、天野から入手した市販の５’−ＰＤＥ（トレードネーム＝ＰＤＥ ＲＰ−１、天野エンザイム・ヨーロッパ）の１ｇと１５時間インキュベートされた同一クリームの１ｋｇは、分離、濃縮および乾燥後、２．６０％５’−ＰＤＥの力価を有する粉体を与えた。加水分解の効率はしたがって、両者とも同様であり、ＲＮＡの加水分解という観点からも、ソルガム由来の５’−ＰＤＥは、より高価な市販酵素と同様の効率である。
【００６１】
実施例３
本方法は、麦芽になったソルガム根の１３ｇおよび前実施例で上述したクリーム酵母の１，０００ｇからスタートした。しかしながら、インキュベーションの１５時間後、温度を４５℃まで下げ、天野から入手した５’−アデニルデアミナーゼ（トレードネーム＝Ｄｅａｍｉｚｙｍｅ ５００００Ｇ、天野エンザイム・ヨーロッパ）の０．１ｇを加えた。５’−アデニルデアミナーゼで５’−ＡＭＰを５’−ＩＭＰに変換させるために、混合物全体が５時間インキュベートされた。固形物はその後、遠心分離によって分離され、再度遠心分離する前に脱塩水による洗浄にさらされる。２つの上澄み物は、混ぜ合わされ、濃縮され、スプレードライされる。粉体の分析をしたところ、２．８０％の５’−ＧＭＰ含有量および３．２１％の５’−ＩＭＰ含有量を示した（分析はＲＰ−ＨＰＬＣによるものであり、これらは二ナトリウム、七水和物の塩として表した）。
【００６２】
本方法は、麦芽になったソルガム根の１３ｇおよび前実施例で上述したクリーム酵母の１，０００ｇからスタートした。しかしながら、ソルガム麦芽５’−ＰＤＥを加える前に、酵母の乾物含量の可溶化を促進するためにパパインの０．５ｇが加えられた。本方法の残りの部分は、実施例３で５’−アデニルデアミナーゼを加えることを含み同様であった。結果物である粉体の分析をしたところ、１．９６％の５’−ＧＭＰ含有量および２．０７％の５’−ＩＭＰ含有量を示した（分析はＲＰ−ＨＰＬＣによるものであり、これらは二ナトリウム、七水和物の塩として表した）。
【００６３】
本方法は、サッカロミセス・セレビシエのクリーム酵母を、１３％の乾物含有量および１２．５％のＲＮＡ含有量を有するカンジダ酵母クリームに置き換えた他は、実施例１および２同様に行った。結果物である粉体の分析をしたところ、３．７５％の５’−ＧＭＰ含有量および３．９８％の５’−ＩＭＰ含有量を示した（これらは二ナトリウム、七水和物の塩として表した）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’−ヌクレオチドが豊富でグルテンを含まない酵母抽出物を調整する方法であって、
ａ）酵母懸濁液を加熱するステップ；
ｂ）上記酵母懸濁液を５’−ホスホジエステラーゼと共に処理するステップ；
ｃ）上記懸濁液から不溶性物質を分離するステップ；及び、
ｄ）上記酵母抽出物を回収するステップ；
を含み、上記５’−ホスホジエステラーゼが、ソルガム麦芽根から抽出されたことを特徴とする。
【請求項２】
ソルガム麦芽根から抽出された上記５’−ホスホジエステラーゼが、３０分から４時間、５０から８０℃の温度で酢酸亜鉛水溶液（０．２から５ｇ／ｌ）中の懸濁状態の麦芽ソルガム根の粉末を煮出し、不溶性成分を除去することで調整されることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項３】
上記粉末の粒子径が２０から２０００μｍ、好ましくは１００から２００μｍであることを特徴とする請求項２の方法。
【請求項４】
上記酵母懸濁液をソルガム５’−ホスホジエステラーゼと共に処理するステップが、５から３０時間、３５から７０℃の間の温度で５．０から７．５の間のｐＨで行われることを特徴とする請求項１乃至３何れか１項の方法。
【請求項５】
上記方法が、上記加熱ステップの後に、上記酵母懸濁液を酵素消化するステップを更に含むことを特徴とする請求項１乃至４何れかの方法。
【請求項６】
上記方法が、上記酵母懸濁液をソルガム５’−ホスホジエステラーゼと共に処理するステップの前に、ＲＮＡの完全または部分精製のためのステップを更に含むことを特徴とする請求項１乃至５の何れか１項の方法。
【請求項７】
上記方法が、デアミナーゼと共に処理するステップを更に含むことを特徴とする請求項１乃至６の何れか１項の方法。
【請求項８】
上記酵母のＲＮＡ含有量が、乾燥重量で６から１５％であることを特徴とする請求項１乃至７の何れか１項の方法。
【請求項９】
前記酵母が、サッカロミセス属、カンジダ属またはクルイベロミセス属であることを特徴とする請求項１乃至８の何れか１項の方法。
【請求項１０】
請求項１乃至９の何れか１項の方法により得られる５’−ヌクレオチドが豊富で、グルテンを含まない酵母抽出物。
【請求項１１】
請求項１０または請求項１乃至９の何れか１項の方法により得られる５’−ヌクレオチドが豊富な酵母抽出物を含む香味修飾剤。
【請求項１２】
請求項１１の香味修飾剤が用いられることを特徴とする食料品の香味付けの方法。
【請求項１３】
請求項１１の香味修飾剤を含む食料品。
【請求項１４】
５’−ヌクレオチドが豊富な組成物の調整のためのソルガム麦芽から抽出した５’−ホスホジエステラーゼの使用。
【請求項１】
５’−ヌクレオチドが豊富でグルテンを含まない酵母抽出物を調整する方法であって、
ａ）酵母懸濁液を加熱するステップ；
ｂ）上記酵母懸濁液を５’−ホスホジエステラーゼと共に処理するステップ；
ｃ）上記懸濁液から不溶性物質を分離するステップ；及び、
ｄ）上記酵母抽出物を回収するステップ；
を含み、上記５’−ホスホジエステラーゼが、ソルガム麦芽根から抽出されたことを特徴とする。
【請求項２】
ソルガム麦芽根から抽出された上記５’−ホスホジエステラーゼが、３０分から４時間、５０から８０℃の温度で酢酸亜鉛水溶液（０．２から５ｇ／ｌ）中の懸濁状態の麦芽ソルガム根の粉末を煮出し、不溶性成分を除去することで調整されることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項３】
上記粉末の粒子径が２０から２０００μｍ、好ましくは１００から２００μｍであることを特徴とする請求項２の方法。
【請求項４】
上記酵母懸濁液をソルガム５’−ホスホジエステラーゼと共に処理するステップが、５から３０時間、３５から７０℃の間の温度で５．０から７．５の間のｐＨで行われることを特徴とする請求項１乃至３何れか１項の方法。
【請求項５】
上記方法が、上記加熱ステップの後に、上記酵母懸濁液を酵素消化するステップを更に含むことを特徴とする請求項１乃至４何れかの方法。
【請求項６】
上記方法が、上記酵母懸濁液をソルガム５’−ホスホジエステラーゼと共に処理するステップの前に、ＲＮＡの完全または部分精製のためのステップを更に含むことを特徴とする請求項１乃至５の何れか１項の方法。
【請求項７】
上記方法が、デアミナーゼと共に処理するステップを更に含むことを特徴とする請求項１乃至６の何れか１項の方法。
【請求項８】
上記酵母のＲＮＡ含有量が、乾燥重量で６から１５％であることを特徴とする請求項１乃至７の何れか１項の方法。
【請求項９】
前記酵母が、サッカロミセス属、カンジダ属またはクルイベロミセス属であることを特徴とする請求項１乃至８の何れか１項の方法。
【請求項１０】
請求項１乃至９の何れか１項の方法により得られる５’−ヌクレオチドが豊富で、グルテンを含まない酵母抽出物。
【請求項１１】
請求項１０または請求項１乃至９の何れか１項の方法により得られる５’−ヌクレオチドが豊富な酵母抽出物を含む香味修飾剤。
【請求項１２】
請求項１１の香味修飾剤が用いられることを特徴とする食料品の香味付けの方法。
【請求項１３】
請求項１１の香味修飾剤を含む食料品。
【請求項１４】
５’−ヌクレオチドが豊富な組成物の調整のためのソルガム麦芽から抽出した５’−ホスホジエステラーゼの使用。
【公表番号】特表２０１０−５０２２３６（Ｐ２０１０−５０２２３６Ａ）
【公表日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２７８６７（Ｐ２００９−５２７８６７）
【出願日】平成１９年９月１１日（２００７．９．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００７／０５１９０５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３１９８２
【国際公開日】平成２０年３月２０日（２００８．３．２０）
【出願人】（５０６２６１５６７）ルサッフル・エ・コンパニー (7)
【氏名又は名称原語表記】ＬＥＳＡＦＦＲＥ ＥＴ ＣＯＭＰＡＧＮＩＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月１１日（２００７．９．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００７／０５１９０５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３１９８２
【国際公開日】平成２０年３月２０日（２００８．３．２０）
【出願人】（５０６２６１５６７）ルサッフル・エ・コンパニー (7)
【氏名又は名称原語表記】ＬＥＳＡＦＦＲＥ ＥＴ ＣＯＭＰＡＧＮＩＥ
【Ｆターム（参考）】
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