樹状細胞−Ｔ細胞の相互作用を調節するための組成物及び方法
【課題】樹状細胞−Ｔ細胞の相互作用を調節するための組成物及び方法を提供すること。
【解決手段】本発明は、動物、特にヒト又は他の哺乳動物の免疫応答を調節、特に抑制するための組成物の調製における樹状細胞の表面上のＣ型レクチンに結合する化合物の使用に関する。該組成物は、特に、樹状細胞とＴ細胞、具体的には、樹状細胞の表面上のＣ型レクチンとＴ細胞の表面上のＩＣＡＭとの相互作用を調節する。組成物は、特異的な抗原に対する免疫応答を阻止／阻害するために、免疫療法のために、免疫抑制のために、自己免疫疾患の治療、アレルギーの治療、及び／又はＨＩＶ感染を阻害するために使用できる。Ｃ型レクチンに結合する化合物は、好ましくは、マンノース、フコース、植物レクチン、抗生物質、糖、タンパク質、又はＣ型レクチンに対する抗体である。本発明は、このような抗体にも関し、このような抗体を用いて樹状細胞を単離する方法にも関する。
【解決手段】本発明は、動物、特にヒト又は他の哺乳動物の免疫応答を調節、特に抑制するための組成物の調製における樹状細胞の表面上のＣ型レクチンに結合する化合物の使用に関する。該組成物は、特に、樹状細胞とＴ細胞、具体的には、樹状細胞の表面上のＣ型レクチンとＴ細胞の表面上のＩＣＡＭとの相互作用を調節する。組成物は、特異的な抗原に対する免疫応答を阻止／阻害するために、免疫療法のために、免疫抑制のために、自己免疫疾患の治療、アレルギーの治療、及び／又はＨＩＶ感染を阻害するために使用できる。Ｃ型レクチンに結合する化合物は、好ましくは、マンノース、フコース、植物レクチン、抗生物質、糖、タンパク質、又はＣ型レクチンに対する抗体である。本発明は、このような抗体にも関し、このような抗体を用いて樹状細胞を単離する方法にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト又は他の哺乳動物のような動物における免疫応答を調節するための、特に増加又は抑制するための組成物及び方法に関する。
【０００２】
ある態様では、本発明は、樹状細胞のＴ細胞への接着を調節するための、特に抑制するための組成物及び方法に関する。
【０００３】
より具体的には、本発明の該態様は、Ｔ細胞の表面上のＩＣＡＭ受容体への、樹状細胞の表面上のＣ型レクチン受容体の接着を調節するための、特に抑制するための組成物及び方法に関する。該接着を調節することによって、クラスターの形成及び抗原提示のような樹状細胞−Ｔ細胞相互作用、並びに、例えば、これに依存する一次Ｔ細胞応答が共に影響を受けることができ、免疫応答の調節がもたらされる。
【０００４】
本発明の組成物及び方法は、それ故、特異的な抗原に対する免疫応答に加えて、自己免疫疾患又はアレルギーで起こり得るような、免疫系の疾患によって引き起こされた免疫応答を変化させるために使用し得る。
【０００５】
さらなる態様では、本発明の方法は、さらに、ＨＩＶ感染の治療及び類似の免疫系疾患の治療に加えて、移植片に対する又は移植後の免疫応答を調節するために使用し得る。
【０００６】
別の態様では、本発明は、ヒト又は他の哺乳動物のような動物における免疫応答を調節するための、特に増加させるための化合物、組成物及び方法に関する。
【０００７】
より具体的には、本態様では、特異的な抗原に対する免疫応答は、樹状細胞の表面上のＣ型レクチン受容体に結合できる形態で、前記抗原又はその抗原部分を樹状細胞に提示することによって、生じ、増加され、又は促進される。このようにして提示された抗原は、樹状細胞に入り、続いて、樹状細胞がＴ細胞に抗原を提示することにより、抗原に対する免疫応答、又は増加した免疫応答を惹起する。
【０００８】
本発明のさらなる態様は、前記組成物を用いた、及び／又は上述の方法を具体化した予防手法及び診断手法に関する。
【０００９】
本発明は、樹状細胞のＴ細胞への接着は、樹状細胞の表面上のＣ型レクチン受容体によって媒介されるという驚くべき発見に基づいている。このＣ型レクチンは、Ｔ細胞の表面上にあるＩＣＡＭ受容体に結合するということも明らかとなった。「ＩＣＡＭ受容体」という語は、ＩＣＡＭ−２及びＩＣＡＭ−３受容体の両者を意味し、特にＩＣＡＭ−３受容体を意味する。
【００１０】
本発明は、さらに、既知のＣ型レクチンの阻害剤及び／又はＣ型レクチン受容体に対して誘導された特異的抗体によるような、樹状細胞上の該Ｃ型レクチン受容体の阻害は、Ｔ細胞の樹状細胞への接着を調節、より具体的には抑制することができ、それによって、免疫応答、とりわけ免疫応答の初発段階に影響を与えることができるという発見に基づいている。
【背景技術】
【００１１】
ＷＯ ９６／２３８８２は、樹状細胞及び胸腺上皮細胞の表面上に豊富に発現されているＣ型レクチンドメインを有するマウス及びヒト受容体を記載している。「ＤＥＣ−２０５」と名付けられたマウス受容体は、１０個のＣ型レクチンドメインを含有し、マクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ）と相同性のある、約７．５の等電点を有する２０５ｋＤａのタンパク質として記載されている。
【００１２】
ＷＯ ９６／２３８８２は、さらに、ＤＥＣ−２０５に対するモノクローナル及びポリクローナル抗体を記載している。しかしながら、これらの抗体は、樹状細胞の機能をブロックすることはできなかった。特に、モノクローナル及びポリクローナル抗ＤＥＣ−２０５抗体は、インビトロ（一方向混合リンパ球反応で、抗ＤＥＣ−２０５が同種異系のＴ細胞の増殖を阻害できないことによって決定された）及びインビボ（抗ＤＥＣ−２０５が、インビボ応答を、すなわち、局所的な移植片対宿主（ＧＶＨ）反応で阻害できないことによって決定された）の両者で、樹状細胞とヘルパーＴ細胞間の相互作用を阻害することができなかった。これらの結果は、ＤＥＣ−２０５受容体が、樹状細胞−Ｔ細胞の相互作用（すなわち、接着）に関与しておらず、抗ＤＥＣ−２０５抗体は、免疫応答を調節するために使用することができないということを示唆している。
【００１３】
Ｃｕｒｔｉｓらは、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９（１９９２），ｐ．８３５６−８３６０及びＷＯ ９３／０１８２０中で、ヒト胎盤組織から単離され、クローニングされた非ＣＤ４ｇｐ１２０受容体を記載している。該ｇｐ１２０受容体は、胎盤、骨格筋、脳、神経及び粘膜細胞のような高レベルのＣＤ４を発現していない哺乳類細胞、並びに、腸、胸腺、心臓、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びマクロファージ（但し、肝臓又は腎臓にはない）を含む他の組織及び細胞上に発現されている。ＷＯ ９３／０１８２０の配列番号１及び２に開示されているＣ型レクチンｇｐ１２０受容体のアミノ酸配列は、樹状細胞上に存在することが、今、見出されたＣ型レクチンと高度の配列相同性（＞９８％）を有している。
【００１４】
Ｃｕｒｔｉｓ及びＷＯ ９３／０１８２０は、さらに、該Ｃ型レクチン受容体が、上記細胞／組織のＨＩＶによる感染、すなわち、ビリオンが細胞中に取り込まれる前に、主要なＨＩＶエンベロープである糖タンパク質ｇｐ１２０を結合することによる感染において果たしている役割についてさらに考察している。Ｃ型レクチンｇｐ１２０受容体の阻害は、これらの細胞／組織のＨＩＶ感染を抑制又は阻害し得ることが見出された。適切な阻害剤として、ＷＯ ９３／０１８２０は、マンノース炭水化物、フコース炭水化物、コンカナバリンＡのような植物レクチン、プラジミシンＡ（ｐｒａｄｉｍｉｃｉｎ Ａ）のような特異的抗生物質、並びに（効力がより弱いと記載されているが）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及びガラクトースのような糖を開示している。それらを含有するこれらの化合物及び組成物は、ＨＩＶの細胞表面への結合を阻害するために、インビトロ又はインビボの何れかで使用される。
【００１５】
ＷＯ ９３／０１８２０は、さらに、ＣＯＳ−７細胞へのＨＩＶの結合が、ｇｐ１２０を抗ｇｐ１２０モノクローナル抗体（「抗体１１０．１」と名付けられた）とプレインキュベートすることによって阻害され得ることを開示している。しかしながら、本抗体は、Ｃ型レクチンではなく、ｇｐ１２０タンパク質に対して誘導されている。
【００１６】
しかしながら、Ｃｕｒｔｉｓ及びＷＯ ９３／０１８２０は、何れも、樹状細胞上にこのようなＣ型レクチンが存在することを記載し、又は示唆していないのみならず、これらの参考文献は、免疫応答における初発段階中の樹状細胞−Ｔ細胞の相互作用におけるそれらの役割についても記載又は示唆していない。
【００１７】
ＷＯ ９５／３２７３４は、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）架橋（又はクロスリンキング）組成物、及び特異的な抗原に対する免疫応答の調節におけるそれらの使用を記載している。この参照文献は、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）上のＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）分子の架橋は、必須の共同刺激分子Ｂ７−１／２の発現を損ない（すなわち、それらのアップレギュレーションを阻止する）、それによって、接着分子ＩＣＡＭ−３の発現を損なわせ（すなわち、接着分子ＩＣＡＭ−３のダウンレギュレーションを引き起こす）、抗原特異的なＴ細胞の活性化を共同刺激（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅ）する単球の能力が損なわれるという機能的結果がもたらされる（すなわち、抗原特異的なＴ細胞の非応答性の調節がもたらされる）。架橋剤は、凝集したヒトＩｇＧ分子、又はそのＦｃ断片；ＦｃγＲＩＩに対するニ価又は多価モノクローナル抗体又はその断片、又は二以上のヒトＩｇＧ Ｆｃ部分の融合物から選択される。
【００１８】
ＷＯ ９５／３２７３４は、それ故、とりわけ、エフェクター細胞への増殖及び成熟化を誘導するために、Ｔ細胞の活性化に必要とされる共同刺激シグナル（すなわち、ＴｃＲ／ＣＤ３相互作用の初発シグナルの他に）を調節する（すなわち、阻害する）ことに関している。ＷＯ ９５／３２７３４は、樹状細胞−Ｔ細胞の接着を調節することには関しておらず、樹状細胞（の表面）上にＣ型レクチンが存在することも、Ｔ細胞上のＩＣＡＭ−３受容体とのそれらの相互作用も開示又は示唆していない。
【００１９】
ＷＯ ９８／０２４５６は、刺激されたヒトマクロファージライブラリーから単離されたII群ヒトＣ型レクチンを開示している。ＷＯ ９８／４９３０６は、ヒト膵炎関連タンパク質（ＰＡＰ；ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）中に存在するIV群Ｃ型レクチンを開示している。ＷＯ ９８／４１６３３は、ヒト腫瘍クローンから単離されたV群ヒトＣ型レクチンを開示している。
【００２０】
ＷＯ ９８／０２４５６、ＷＯ ９８／４９３０６、及びＷＯ ９８／４１６３３は、さらに、これらのＣ型レクチンに対する抗体を製造する方法を開示している。
【００２１】
しかしながら、これらの参照文献は、何れも、樹状細胞上のＣ型レクチンに関しておらず、これらの参照文献に開示されたＣ型レクチンは、由来、生物学的機能、及び構造において、それらに記載されているＣ型レクチンとは異なっている。
【００２２】
樹状細胞（ＤＣ）は、抹消組織中の抗原を捕捉し、リンパ又は血液を介して、排出（ｄｒａｉｎｉｎｇ）リンパ節及び脾臓のＴ細胞領域に移動する専門の抗原提示細胞である。ここで、それらは、加工された抗原をナイーブＴ細胞に提示し、抗原特異的な一次Ｔ細胞応答を開始する。
【００２３】
身体表面における免疫監視細胞としてのそれらの地位のため、ＤＣは、粘膜暴露後、ＨＩＶに感染する最初の細胞であるように思われ、それ故、ＨＩＶの免疫的な病因で重要な役割を果たしていると推定されている。原発性サル免疫不全ウイルスを感染させたマカクをモデル系として用いて、インビボで実証されたように（Ｓｐｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９６）（Ｊｏａｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７）、現在では、ＨＩＶは、リンパ節に侵入し、ＣＤ４＋ Ｔ細胞に接近するために、ＤＣの正常な移動過程を変化せしめると一般的に信じられている。ＤＣのＨＩＶによる増殖性感染が、幾人かの研究者によって報告されており（Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２（４），２７３３−７，１９９８）（Ｂｌａｕｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ ３（１２），１３６９−７５．１９９７．）、相当の証拠が、インビトロでＨＩＶを規則的に与えたＤＣをＴ細胞と共に培養すると、強い感染を引き起こし得ることを示している（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７（５０６８），３８３−７，１９９２）．同様のシナリオが、ＨＩＶに感染した個体に起こっているかどうかは未だ不明確であるが、ＤＣからＴ細胞へのＨＩＶ−１の伝達は、ＡＩＤＳで観察されるＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇に寄与し得るかもしれない。ＨＩＶ−ＤＣの相互作用を研究することは、ＨＩＶ感染の初期の出来事を理解するのに寄与するはずであり、おそらくは、伝達における初期の出来事をブロックすることを目的とした戦略に導くであろう。さらなる考察については、ＷＯ ９５／３２７３４及びＷＯ ９６／２３８８２も参照される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１） 動物、特にヒト又は他の哺乳動物の免疫応答を調節、特に抑制するための組成物の調製における樹状細胞の表面上のＣ型レクチン（但し、該Ｃ型レクチンは、ＤＥＣ−２０５受容体ではない）に結合する化合物の使用。
（項目２） 樹状細胞とＴ細胞間の一以上の相互作用を調節するための、特に抑制するための組成物の調製における項目１に記載の使用。
（項目３） 樹状細胞とＴ細胞間の接着、特に樹状細胞の表面上のＣ型レクチンとＴ細胞の表面上のＩＣＡＭ受容体、特にＴ細胞の表面上のＩＣＡＭ−２又はＩＣＡＭ−３受容体間の接着を調節するための、特に抑制するための組成物の調製における項目１及び／又は２に記載の使用。
（項目４） 特異的な抗原に対する免疫応答を阻止し、又は阻害するための、免疫寛容を誘導するための、免疫療法のための、免疫抑制のための、自己免疫疾患の治療のための、及び／又はアレルギーの治療のための組成物の調製における項目１〜３の何れか１項に記載の使用。
（項目５） 樹状細胞のＨＩＶ感染を阻害するための、特に樹状細胞の表面へのＨＩＶ表面タンパク質（すなわち、ｇｐ１２０）の接着を阻害することによって、前記樹状細胞内へのＨＩＶの侵入を阻害するための組成物の調製における樹状細胞の表面上のＣ型レクチンを結合する、又はＣ型レクチンに結合することができる化合物の使用。
（項目６） 感染した樹状細胞から感染していないＴ細胞へのＨＩＶの転移を阻害するための組成物の調製における、樹状細胞の表面上のＣ型レクチンを結合する、又はＣ型レクチンに結合することができる化合物の使用。
（項目７） 動物、特にヒト又は他の哺乳動物の前記抗原に対する免疫応答を調節するための、特に生じさせるための、増加するための、及び／又は促進するための組成物の調製における１）樹状細胞の表面上のＣ型レクチンに結合し、これに付着した化合物：２）抗原又はその断片若しくは一部の組み合わせの使用。
（項目８） 前記抗原が、Ｃ型レクチンに結合することができる化合物に共有結合し、又は融合している項目７に記載の使用。
（項目９） 抗原が、前記抗原、又は感染症（に対するワクチンで使用される）抗原を含有、又は発現する腫瘍細胞に対して免疫応答を生じせしめるために使用することができる癌抗原から選択される項目７又は８に記載の使用。
（項目１０） 樹状細胞の表面上のＣ型レクチンに結合できる化合物が、マンナン及びＤ−マンノースのようなマンノース炭水化物；Ｌ−フコースのようなフコース炭水化物；コンカナバリンＡのような植物レクチン；プラジミシンＡのような抗生物質；Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及びガラクトースのような糖；ｇｐ１２０及びその類縁体又はそれらの断片のようなタンパク質；及び樹状細胞の表面上に発現されたＣ型レクチンに対して誘導された抗体又はその一部、断片、若しくはエピトープからなる群から選択される項目１〜９の何れか１項に記載の使用。
（項目１１） 樹状細胞の表面上のＣ型レクチンが、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質、又はその天然の変異形、又はその均等物である項目１〜９の何れか１項に記載の使用。
（項目１２） 樹状細胞の表面上のＣ型レクチンに結合することができる化合物が、モノクローナル抗体、好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣ型レクチンに対して誘導されたモノクローナル抗体、又はその天然の変異形若しくは均等物；及び／又はその一部、断片、若しくはエピトープである項目１０又は１１に記載の使用。
（項目１３） 配列番号１又は図９のアミノ酸配列を有するＣ型レクチンに対して誘導された抗体、好ましくはモノクローナル抗体、又はその天然の変異形若しくは均等物；及び／又はその一部、断片、若しくはエピトープ。
（項目１４） ＡＺＮ−Ｄ１又はＡＺＮ−Ｄ２の何れかである項目１３に記載の抗体。
（項目１５） 少なくとも一つの項目１３又は１４に記載の抗体と、それ自体公知である少なくとも一つのさらなる担体、賦形剤、アジュバント、及び／又はフォーミュラントを含有する薬学的組成物。
（項目１６） １）樹状細胞の表面上のＣ型レクチンに結合し、これに付着した化合物：２）抗原又はその断片若しくは一部の組み合わせ。
（項目１７） 前記抗原が、Ｃ型レクチンに結合し得る化合物と共有結合し、又は融合している項目１６に記載の組み合わせ。
（項目１８） 抗原が、前記抗原、又は感染症（に対するワクチンで使用される）抗原を含有する、又は発現する腫瘍細胞に対する免疫応答を生じせしめるために使用することができる癌抗原から選択される項目１６又は１７に記載の組み合わせ。
（項目１９） 樹状細胞の表面上のＣ型レクチンに結合できる化合物が、マンナン及びＤ−マンノースのようなマンノース炭水化物；Ｌ−フコースのようなフコース炭水化物；コンカナバリンＡのような植物レクチン；プラジミシンＡのような抗生物質；Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及びガラクトースのような糖；ｇｐ１２０及びその類縁体又はそれらの断片のようなタンパク質；及び樹状細胞の表面上に発現されたＣ型レクチンに対して誘導された抗体又はその一部、断片、若しくはエピトープからなる群から選択される項目１６〜１８の何れか１項に記載の組み合わせ。
（項目２０） 生物学的試料中の樹状細胞の検出における項目１３又は１４に記載の抗体の使用。
（項目２１） 生物学的試料又は培地からの樹状細胞の単離、調製、及び／又は精製における項目１３又は１４に記載の抗体の使用。
（項目２２） 生物学的試料中のＣ型レクチン、特に、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣ型レクチン、又はその天然の変異形、若しくは均等物である；及び／又はその一部、断片、又はエピトープの存在及び／又は発現を決定するためのアッセイにおける項目１３又は１４に記載の抗体の使用。
（項目２３） 生物学的試料又は培地から樹状細胞を生産し、単離し、及び／又は精製する方法であって、
ａ）樹状細胞を含有する生物学的試料又は培地を項目１３又は１４に記載の抗体と接触させる工程と；
ｂ）前記抗体に結合していない細胞から、及び、必要に応じて前記試料又は培地の任意のさらなる構成成分から、前記抗体に結合している細胞を分離する工程とを備え、
必要に応じて、さらに
ｃ）前記抗体から前記抗体に結合している細胞を分離する工程
を備えた方法。
（項目２４） 前記抗体が、カラム又はマトリックスに、（常）磁性ビーズに、又は類似の固相支持体に付着されている項目２３に記載の方法。
（項目２５） 前記生物学的試料が、血液、血漿、又はリンパ液のような生物学的流体である項目２３又は２４に記載の方法。
（項目２６） 項目２３又は２４の方法によって得た樹状細胞。
ＤＣは、非活性化Ｔ細胞と相互作用し、活性化する能力がユニークである。しかしながら、本発明の以前には、ＤＣ−Ｔ細胞接触がどのように開始され、調節されるかについては殆ど不明であった。本明細書では、ＤＣ−Ｔ細胞相互作用におけるＩＣＡＭ−３の役割が調べられている。ＤＣは、ＩＣＡＭ−３に強く接着するが、この接着は、ＬＦＡ−１、αＤ、又は他の全てのインテグリンによっては媒介されないことが実証されている。ＤＣ上の該新規ＩＣＡＭ−３受容体を検索する上で、ＤＣが多く発現しているＣ型レクチン受容体がクローニングされ、ＤＣ−ＳＩＧＮと名付けられた。ＤＣ−Ｔ細胞のクラスタリング及びＴ細胞応答の開始におけるその顕著な役割に加えて、我々は、ＤＣ−ＳＩＧＮが、ＤＣの感染、及びそれに続くＴ細胞へのＨＩＶ−１伝達に関与する主要なＨＩＶ−１受容体であることを発見した。このため、ＨＩＶと非活性化Ｔ細胞は、ＤＣと相互作用するために、類似の高度に発現された受容体を利用する。
【００２５】
第一の側面では、本発明は、動物、特にヒト又は他の哺乳動物の免疫応答を調節するための、特に抑制するための組成物の調製における樹状細胞の表面上のＣ型レクチンを結合する、又はＣ型レクチンに結合できる化合物の使用に関する。
【００２６】
特に、本発明の該側面は、樹状細胞とＴ細胞間の相互作用を調節する、特に阻害するための組成物の調製における、樹状細胞の表面上のＣ型レクチンを結合する、又はＣ型レクチンに結合できる化合物の使用に関する。
【００２７】
より具体的には、本発明の該側面は、樹状細胞とＴ細胞間の接着を調節するための、特に抑制するための組成物の調製における化合物の使用に関する。
【００２８】
特に、本発明の該側面は、樹状細胞の表面上のＣ型レクチンとＴ細胞の表面上のＩＣＡＭ受容体間の接着を調節するための、特に抑制するための組成物の調製における、樹状細胞の表面上のＣ型レクチンを結合する、又はＣ型レクチンに結合できる化合物の使用に関する。
【００２９】
樹状細胞のＴ細胞への結合に関与することが見出されたあるＣ型レクチンのアミノ酸配列が、配列番号１と図９に示されている。該Ｃ型レクチン受容体は、実質的に、Ｃｕｒｔｉｓらによって、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９（１９９２），ｐ．８３５６−８３６０及びＷＯ ９３／０１８２０に記載されたＣ型レクチンｇｐ１２０受容体に類似している。特に、それは、ＷＯ ９３／０１８２０の配列番号１に記載のアミノ酸配列と高度の相同性（＜９８％）を有する。それは、４０４アミノ酸のII群Ｃ型レクチンであり；約４４ｋＤａの見かけの分子量を有し、；細胞質のアミノ末端を含む第一のドメイン（Ｍｅｔ１〜Ａｌａ７６）、タンデムリピートを含む第二のドメイン（Ｉｌｅ７７〜Ｖａｌ２４９）、及びII型膜タンパク質である他の公知のC型レクチンと高度な相同性を有する第三のドメイン（Ｃｙｓ２５３〜Ａｌａ４０４）を有する。さらなる特性決定は、以下に示されている。
【００３０】
本発明では、樹状細胞上の該Ｃ型レクチンは、Ｔ細胞の表面上にあるＩＣＡＭ受容体に結合することが見出された。
【００３１】
従って、本発明の組成物は、樹状細胞とＴ細胞間の相互作用を調節する（すなわち、変化及び／又は修飾する）ために、より具体的には阻害する（すなわち、抑制、及び／又はダウンチューンする）ために使用し得る。
【００３２】
このような相互作用には、例えば、樹状細胞−Ｔ細胞クラスタリング、Ｔ細胞の活性化におけるＴ細胞の樹状細胞への接着が含まれ、さらに、樹状細胞とＴ細胞間の接触に依存する全ての相互作用（直接的な細胞−細胞接触、又は樹状細胞とＴ細胞の近接化の何れかを意味する）が含まれる。
【００３３】
このようなさらなる相互作用には、免疫応答を生じさせるのに関与するプロセス、とりわけ、Ｔリンパ球の一次感作／活性化（すなわち、抗原及び／又はＭＨＣに結合したペプチドのＴ細胞への提示）、及びＴ細胞の共同刺激のような、このような応答の初発段階における免疫応答；並びに化学的なシグナリング、エンドサイトーシス、及び経上皮輸送のようなプロセスを生じせしめるのに関与するプロセスが含まれるが、これらに限定されない。一般的に樹状細胞−Ｔ細胞の相互作用を論述する場合、それらの全ては、本発明の組成物によって影響を受け得、以下の考察、並びにＷＯ ９５／３２７３４及びＷＯ ９６／２３８８２が参照される。
【００３４】
本発明の組成物は、それ故、樹状細胞の免疫制御能力に影響を与えるために；樹状細胞を介した（一次）Ｔ細胞応答を調節、特に抑制するために；及び／又は、一般的に免疫系に影響を与える、特に阻害するために使用され得る。
【００３５】
幾つかの具体的な応用には、特定の抗原に対する免疫応答を阻止又は阻害すること；免疫寛容を誘導すること；免疫療法；例えば、移植の拒絶を阻止するための免疫抑制：甲状腺炎、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、及び自己免疫性糖尿病のような自己免疫疾患の治療；並びにアレルギーの防止又は治療が含まれる。
【００３６】
本発明の組成物には、樹状細胞のＴ細胞への接着又は接近に依存するＴ細胞上にある他の受容体の活性化も調節し得る。さらに、樹状細胞上のＣ型レクチンが、Ｔ細胞上のＩＣＡＭ受容体に結合するという本発明の発見は、樹状細胞とＴ細胞間の相互作用に影響を与えることによって、一般的に免疫系を調節するための新たな戦略又は可能性を開き得る。
【００３７】
さらに、本発明の組成物は、化学物質、ケモカイン及び／又はインターロイキンなどのようなシグナリング因子などの物質、とりわけ、ＨＩＶのようなウイルス粒子の樹状細胞からＴ細胞への移送を阻止又は抑制するために使用され得る。このようにして、本発明の組成物を使用することによって、ＨＩＶの樹状細胞への初期の接着が阻害され得るのみならず、樹状細胞からＴ細胞へのＨＩＶ感染の伝播も阻害され得る。
【００３８】
樹状細胞は、特にＨＩＶ感染の初期段階の間、ＨＩＶの「貯蔵場所（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）」として働き得ると考えられているので、この発見は、特に重要である。本発明の組成物は、それ故、樹状細胞のＨＩＶ感染を阻止するために使用され得るのみならず、樹状細胞が感染した後に、ＨＩＶ感染がＴ細胞に広がるのを抑制することにより、該疾病の過程を遅くするために使用され得る。
【００３９】
Ｔ細胞の、すなわちリンパでの活性化は、ＨＩＶに感染した患者におけるＡＩＤＳの進行に重要な役割を果たしていることも知られている。本発明の組成物は、前記Ｔ細胞の活性化を阻止し、阻害し、又は少なくとも遅延させることにより、該疾病の開始及び/又は進行を遅らせるために使用し得ると考えられている。
【００４０】
それ故、さらなる側面では、本発明は、さらに、樹状細胞のＨＩＶ感染を阻害するための、特に、樹状細胞の表面へのＨＩＶ表面タンパク質（すなわち、ｇｐ１２０）の接着を阻害することにより、前記樹状細胞へのＨＩＶの進入を阻害するための組成物の調製における、樹状細胞の表面上のＣ型レクチンを結合する、又はＣ型レクチンに結合することができる化合物の使用に関する。
【００４１】
本発明は、さらに、感染した樹状細胞から感染していない樹状細胞へのＨＩＶの転移を阻害するための組成物の調製における、樹状細胞の表面上のＣ型レクチンを結合する、又はＣ型レクチンに結合することができる化合物の使用に関する。
【００４２】
本発明の組成物に使用できる化合物には、上記ＷＯ ９３／０１８２０号に記載されているものを含む（これらに限定されない）、それ自体公知であるＣ型レクチンの阻害剤が含まれる。
【００４３】
一般的に、これらは、Ｃ型レクチン、特に、配列番号１／図９のＣ型レクチン、又はその天然の変異形若しくは均等物に結合し得る、又は（好ましくは、可逆的な態様で）接着し得る、又は、これらのリガンドとして働き得る化合物である。例は、マンナン及びＤ−マンノースのようなマンノース炭水化物；Ｌ−フコースのようなフコース炭水化物；コンカナバリンＡのような植物レクチン；プラジミシンＡのような抗生物質；Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及びガラクトースのような糖（効力がより弱いと記載されているが）；並びに、例えば、ファージディスプレー法を用いて同定され得る適切なペプチド模倣化合物及び小薬剤分子である。さらに、ｇｐ１２０のようなタンパク質、及びその類縁体若しくは断片、又は樹状細胞上のＣ型レクチンへの結合能を有する類似のタンパク質に加えて、単離されたＩＣＡＭ受容体と、その一部及び断片を含むその類縁体が使用され得る。このような一部又は断片は、好ましくは、その時になお、樹状細胞の表面上のＣ型レクチンに結合できるようなものであるべきである。
【００４４】
しかしながら、炭水化物の使用は、インビボで迅速に代謝され得るので、通常、治療的観点からすると、より望ましくない。また、コンカナバリンＡ及びプラジミシン抗生物質のような植物のレクチンの使用は、治療環境で、特に、自己免疫疾患及び／又はＨＩＶ感染を有する患者を治療するときに、不利な点を有し得る。
【００４５】
好ましくは、ＷＯ ９３／０１８２０に記載されているような、一以上の生理的に耐えられる及び／又は薬学的に許容され得る化合物が使用される。例えば、ｇｐ１２０又はその誘導体の使用は、特に、神経系に望ましくない副作用を引き起こし得る（ＷＯ ９３／０１８２０）。
【００４６】
それ故、本発明によれば、好ましくは、樹状細胞の表面上に存在する／発現されたＣ型レクチンに対して誘導された抗体、又はその一部、断片、若しくはエピトープが使用される。本明細書において使用される抗体という語には、とりわけ、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ及び一本鎖抗体、並びに断片（Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａ）及びＦａｂ発現ライブラリーが含まれる。さらに、例えば、ＷＯ９８／４９３０６に記載されているような「ヒト化」抗体を使用し得る。
【００４７】
本発明のＣ型レクチンに対するこのような抗体は、以下に記載されているように、又は、ＷＯ ９５／３２７３４、ＷＯ ９６／２３８８２、ＷＯ ９８／０２４５６、ＷＯ ９８／４１６３３、及び／又はＷＯ ９８／４９３０６に記載されているようなそれ自体公知である任意の他の方法で得ることができる。
【００４８】
例えば、必要に応じて、（ウシ血清アルブミン又はスカシガイヘモシアニンのような）免疫原の担体、及び／又は、フロイントのアジュバント、サポニン、ＩＳＣＯＭ’ｓ、水酸化アルミニウム、又は類似のミネラルゲル、又はスカシガイヘモシアニン、又は類似の界面活性物質のようなアジュバントの使用とともに、Ｃ型レクチン、又はその免疫原部分、断片、若しくは融合物を用いてヤギ、ウサギ、ヒツジ、ラット、ブタ、又はマウスのような適切な宿主を免疫することによって、ポリクローナル抗体を取得し得る。必要に応じて、公知のイムノアッセイ手法を用いて（例えば、ここでも、ＷＯ ９６／２３８８２号が参照される）、所望の特性（すなわち、特異性）を有する抗体をスクリーニングする工程を含んでもよい、それ自体公知の方法で、（通常、１〜７日以内に）Ｃ型レクチンに対する免疫応答が生じた後、抗体は、免疫された動物から採取した血液又は血清から単離することができる。
【００４９】
モノクローナルは、ハイブリドーマ及び類似の手法を含む、連続した培養細胞系統を用いて製造され得る。ここでも、実質的には、上記参照文献に記載されているとおりである。
【００５０】
Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、及びＦａｂ断片のようなＦａｂ−断片は、それぞれ、ペプシン又は他のプロテアーゼを用いた抗体の消化、ジスルフィド結合の還元、及びパパインと還元剤による処理によって得られ得る。Ｆａｂ−発現ライブラリーは、例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：１２７５−１２８１の方法によって得られ得る。
【００５１】
好ましくは、樹状細胞上のＣ型レクチンに対するモノクローナル抗体、より具体的には、配列番号１及び２及び図９に示された／コードされたアミノ酸配列を有するペプチドに対するモノクローナル抗体、又は（抗原性のある）その一部が使用される、このようなモノクローナルは、本発明のさらなる側面である。以下、本発明は、本明細書でＡＺＮ−Ｄ１及びＡＺＮ−Ｄ２と称される２つのこのようなモノクローナルによって説明されるが、Ｃ型レクチンに対して同等の特異性を有する類似のモノクローナルも使用し得る。
【００５２】
さらなる側面では、本発明は、樹状細胞上のＣ型レクチンに対する、より具体的には、配列番号１及び２及び図９に示された／コードされたアミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体、好ましくはモノクローナル抗体、又は（抗原性のある）その一部を産生するハイブリドーマのような細胞系統を提供する。本発明の上記モノクローナルＡＺＮ−１及びＡＺＮ−２を産生するハイブリドーマは、１９９９年４月８日、それぞれ（仮）ＥＣＡＣＣ受付番号９９０４００８１８及び９９０４０８１９で、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された。
【００５３】
本発明は、樹状細胞上のＣ型レクチンに対する、より具体的には、配列番号１及び２及び図９に示された（又はコードされたアミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体、好ましくはモノクローナル抗体、又は（抗原性のある）その一部を製造する方法にも関し、該方法は、前記抗体を産生する細胞又は細胞系統を栽培する工程と；細胞培養から抗体を採取／単離する工程を備える。
【００５４】
樹状細胞上のＣ型レクチンに対する（モノクローナル）抗体、及びこのような抗体を産生する細胞又は細胞株は、何れも、これまで本分野で記載されておらず、本発明の新規抗体は、（すなわち、本明細書で開示した薬学的／治療的使用に加えて）広範な応用性を有するものと想定される。（本発明の別の側面を構成する）これらの出願のうち幾つかは、本明細書の開示から、当業者に明らかであろう。
【００５５】
例えば、本明細書の抗体は、組織又は細胞全体の中又は上にあるＣ型レクチンの存在を検出するために、（及び、それにより、その発現を決定するために）、並びに、細胞断片のような他の生物学的試料中、又は細胞調製物中のＣ型レクチンの存在を検出するために使用され得る。このようにして得られた情報は、続いて、本発明の方法又は組成物が、このような組織又は細胞に適用できるかどうかを決定するために使用され得る。続いて、このようにして得られた情報は、本発明の方法又は組成物がこのような組織又は細胞に適用できるかどうかを決定するために（も）使用できる。本発明の抗体は、例えば、血液、血漿、又はリンパ液のような生物学的流体；骨髄、皮膚組織、腫瘍組織などのような組織試料又は細胞試料、又は細胞培養、又は栽培用培地を含む生物学的試料中／からの樹状細胞を（定性的に、及び／又は定量的に）検出し、単離し、精製し、及び／又は製造するためにも使用され得る。
【００５６】
例えば、ロイカフェレース（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｅ）後に蛍光活性化細胞ソーティングを含むＵＳ−Ａ−５，６４３，７８６号に記載された方法のような、生物学的試料から樹状細胞を単離／製造するために現在利用できる数少ない方法は、低い収率と均質でない試料のみを与える極めて扱いにくい多段階操作である。その結果、樹状細胞の入手が限られるため、この重要なクラスの細胞に対する研究が著しく妨げられてきた。
【００５７】
本発明のモノクローナルを用いることによって、より高い収率と高い特異性で樹状細胞を単離し、製造することができる。このような方法では、モノクローナルは、抗体を用いて、生物学的流体から細胞を採集し、単離し、及び／又は精製するための、それ自体公知の方法で使用され得る。
【００５８】
例えば、モノクローナルは、カラム又はマトリックスに、（常）磁性ビーズに、又は類似の固相支持体に付着された後、樹状細胞を含有する生物学的試料又は培地と接触され得る。それ自体は担体に付着しない細胞は、例えば、洗浄することによって、分離又は除去され、その後、樹状細胞は、それ自体公知の方法で担体から分離され、単離される。
【００５９】
また、本発明のモノクローナルは、樹状細胞（及び／又はＣ型レクチン）の存在、及び／又は、生物学的試料中のそれをコードする遺伝子の発現を検出／定量するために使用することができ、ここでも、競合阻害アッセイ又はＥＬＩＳＡタイプのイムノアッセイのような、それ自体公知である抗体の分析のための方法で、抗体を使用することができる。例えば、抗体は、顕微鏡法、フローサイトメトリー及びＦＡＣＳを含む細胞ソーティング手法、（抗体に付着され得る）固相支持体及び／又は検出可能な標識又はマーカーをベースとする手法、（常）磁性ビーズをベースとする手法、又は他の任意の検出、又は抗体を使用できるそれ自体公知のアッセイ手法と組み合わせて使用することができる。（本発明の抗体の他に、抗体をベースとするアッセイ用のそれ自体公知のさらなる成分を全て含有し得る）このようなアッセイ及びキット並びにマニュアル等は、本発明のさらなる側面を構成する。
【００６０】
このように、本発明のモノクローナルは、インビトロ及びインビボの両者で使用するのに、極めて有用な診断及び研究ツールを構成する。考えられる非限定的な応用の分野には、樹状細胞及びそれらの機能及び相互作用の研究：免疫系の研究；滑膜組織及び皮膚組織／皮膚細胞（皮膚樹状細胞）のような細胞、組織、又は生物学的流体中の樹状細胞及び／又はＣ型レクチンの検出；並びに、癌（腫瘍形成及び発達に照射する（ｉｒｒａｄｉｃａｔｅ）ための臨床試験において、樹状細胞がインビボで使用される）及び（例えば、慢性関節リウマチを含む）自己免疫疾患のような生物学的プロセス又は疾病機序において樹状細胞が果たす役割の研究が含まれる。
【００６１】
本発明の抗体が使用できるそれ自体公知の方法及び手法のさらなる記載としては、Ｄ．Ｐ．Ｓｉｔｅｓ，Ａ．Ｉ．Ｔｅｒｒ，Ｔ．Ｇ． Ｐａｒｓｌｏｗ：“Ｂａｓｉｃ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，８ｔｈ Ｅｄ．，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ（１９９４）；Ｉ． Ｒｏｉｔｔ，Ｊ． Ｂｒｏｓｔｏｆ，Ｄ．Ｍａｌｅ“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，２ｎｄ．Ｅｄ．，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ（１９９４）のような一般的なテキストブックが参照され、全て参照文献として本明細書に組み込まれる。抗体及びそれに関連する手法の一般的な使用は、Ｊａｎｅｗａｙ−Ｔｒａｖｅｒｓによる一般的な参照文献集：“Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ”，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎの２．７〜２．１７部に挙げられているものが特に参照される。
【００６２】
本発明の組成物は、ニ以上の上記活性な化合物を含有してもよく、又はこのような化合物は組み合わせて使用してもよい。例えば、抗Ｃ型レクチン抗体は、マンノース又はフコース炭水化物、レクチン類及び／又はプリダミシンＡのような抗生物質と調合することができ、これによって相乗効果が得られるかもしれない。
【００６３】
本発明の組成物は、抗ＬＦ３Ａのような公知の共同阻害化合物；並びに治療すべき状態に応じて、それ自体公知である他の活性成分を含んでもよく、又は組み合わせて使用してもよい。例えば、本発明の組成物は、免疫抑制剤（すなわち、移植の拒絶を抑えるための）、免疫調節剤、抗生物質、自己抗原又はアレルゲン（例えば、ＷＯ ９５／３２３４又はＷＯ９６／２３８８２に記載されているようなもの）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、並びに抗ＨＩＶ剤のような抗ウイルス剤及びＬｅｕ−３ＡのようなＣＤ４に対して誘導された抗体を含むＣＤ４阻害剤のに調合され、又は組み合わせて使用してもよく、同じく、これによって相乗効果を得ることができる。
【００６４】
本発明の組成物は、さらに、好ましくは単位投与量形態で、錠剤、カプセル、粉末、凍結乾燥された調製物、注射用の溶液等のような、それ自体公知の医薬形態を与えるために、公知の担体及び／又はアジュバントを使用して調合することができる。このような医薬形態、それらの使用、及び投与（単又は複投薬形態）、並びにその中で使用するための担体、賦形剤、アジュバント、及び／又はフォーミュラント（ｆｏｒｍｕｌａｎｔ）は、本分野で一般的に公知であり、例えば、ＷＯ ９３／０１８２０、ＷＯ ９５／３２７３４、ＷＯ ９６／２３８８２、ＷＯ ９８／０２４５６、ＷＯ ９８／４１６３３、及び／又はＷＯ ９８／４９３０６に記載されており、全て、本明細書に参照文献として組み込まれる。さらに、調合物（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、ＷＯ ９３／０１８２０に記載されているような、リポソームの形態であり得る。
【００６５】
抗体の医薬調合物、それらの投与、及び使用は、一般的に、ＷＯ ９５／３２７３４、ＷＯ ９６／２３８８２、ＷＯ ９８／０２４５６、ＷＯ ９８／４１６３３、及び／又はＷＯ ９８／４９３０６に記載されている。
【００６６】
本発明の組成物は、必要に応じて、適切な患者情報のパンフレット及び／又は使用上の説明書とともに、さらに、例えば、バイアル、瓶、袋（ｓａｃｈｅｔ）、泡（ｂｌｉｓｔｅｒ）等の中にパッケージしてもよい。
【００６７】
さらなる側面では、本発明は、動物、特に、ヒト又は他の哺乳動物の免疫応答を調節する方法であって、好ましくは上述の組成物の形態で、免疫応答を変化、又は修飾するのに十分な量で、樹状細胞の表面上のＣ型レクチンを結合する、又はレクチンに結合することができる化合物を前記動物に投与することを備えた方法に関する。
【００６８】
該化合物又は組成物は、特に、樹状細胞とＴ細胞の相互作用が変化し、又は修飾されるような量で投与され、さらに具体的には、樹状細胞のＴ細胞への接着が減少するような量で投与される。
【００６９】
本方法は、免疫系の疾患を予防し、及び／又は治療するために、並びに、上述のように、移植の拒絶を予防するために使用できる。
【００７０】
本発明は、さらに、ＨＩＶ感染を予防又は治療する方法であって、ＨＩＶに感染した患者又はＨＩＶに感染するリスクがある人に、ＨＩＶの樹状細胞への接着、とりわけ、ＨＩＶのｇｐ１２０エンベロープタンパク質の、樹状細胞の表面上のＣ型レクチンへの接着が阻害される量で、樹状細胞の表面上のＣ型レクチンを結合する、又はＣ型レクチンに結合することができる化合物を投与することを備えた方法に関する。
【００７１】
本発明は、さらに、ＨＩＶ感染の治療する方法であって、樹状細胞の表面上のＣ型レクチンを結合する、又はＣ型レクチンに結合することができる化合物を、感染した樹状細胞から感染していないＴ細胞へのＨＩＶの転移を阻害する量で、ＨＩＶに感染した患者に投与することを備えた方法にも関する。
【００７２】
さらなる側面では、本発明は、樹状細胞の表面上のＣ型レクチン受容体に結合することができる形態で、前記抗原、又は一以上のその抗原部分を樹状細胞に提示することにより、ヒト又は他の哺乳動物のような動物の、特異的な抗原又は抗原の組み合わせに対する免疫応答を調節するために、とりわけ、免疫応答を生じさせ、増加し、及び／又は促進するために使用される。このように提示された抗原は、樹状細胞に侵入した後、続いて、樹状細胞がＴ細胞に抗原を提示することによって、抗原に対する免疫応答を引き起こす。
【００７３】
「樹状細胞の表面上のＣ型レクチン受容体に結合することができる形態」とは、一般的に、抗原又は抗原性断片が、上記化合物／リガンド又はその一部のような、樹状細胞の表面上のＣ型レクチンに結合し得る化合物、リガンド、又は残基（ｒｅｓｉｄｕ）に付着していることを意味する。前記付着は、例えば、（好ましくは共有）結合、リガンド−リガンド相互作用、複合体形成、連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）、タンパク質の融合（例えば、前記融合物の発現を介した）、又は他の任意の種類の物理的又は化学的相互作用、またはＣ型レクチンに対するリガンドと共に、抗原を樹状細胞に提示することができる結合、すなわち安定な又は準安定な部分（ｅｎｔｉｔｙ）に結合されることにより得る。
【００７４】
例えば、抗原は、上述のマンノース及びフコース炭水化物と共に、共有結合した基又は側鎖として与えられ得る；コンカナバリンＡのような植物レクチン又はプラジミシンＡのような抗生物質に共有結合され得る；又は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及び（より好ましくないが）ガラクトースのような糖残基とともに与えることができ、これらは全て、抗原を樹状細胞に「誘導（ｄｉｒｅｃｔ）」する役割を果たす。
【００７５】
好ましくは、抗原は、ｇｐ１２０及びその類縁体、若しくはＩＣＡＭ受容体及びその類縁体のようなＣ型レクチンに対するリガントに結合できる、若しくはリガンドとして働き得るタンパク質に、又はこのようなタンパク質の断片の一部に付着される（例えば、融合され、又は共有結合される）。あるいは、抗原は、Ｃ型レクチンに対して誘導された抗体、好ましくは、上述のＡＺＮ−Ｄ１及びＡＺＮ−Ｄ２のようなモノクローナル抗体に；又は、上記したこのような抗体の一部若しくは断片に付着（例えば、融合又は共有結合）することができる。
【００７６】
抗原は、それに対する（増加した）免疫応答が得られる任意の抗原、又は任意のその一部若しくは断片であり得る。好ましくは、任意のこのような断片の一部は、それ自体、エピトープのような、免疫反応を引き起こし（ｉｌｌｉｃｉｔｉｎｇ）得るようである。しかしながら、本発明によれば、断片は、樹状細胞に対して誘導されている、すなわち増加した特異性又は親和性を有しており、本来免疫応答を引き起こすことができないであろう部分断片が、本明細書に記載したＣ型レクチンに対するリガンドと共に使用すると免疫応答を与え得るので、これは必要とされない。一般的には、Ｃ型レクチンに対するリガントと共に抗原を使用すると、抗原の効力を増加させ得る、すなわち投与される抗原の単位量当たり、より高い又は強い免疫応答を与え得る。このように、（血清又はワクチン中に存在するもののみならず、所望の抗原をコードするレトロウイルスも含む）抗原は、より低い投薬で投与しながらも、十分な免疫応答を与えることができる。
【００７７】
適切な抗原の例は、ｇｐ１００、ｇ２５０、ｐ５３、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＭＡＲＴ １、チロシナーゼ関連タンパク質II、及びチロシナーゼ関連タンパク質を含む癌抗原であり、これらは全て、前記抗原を含有する又は発現する腫瘍細胞に対する免疫応答を生じさせるために使用できる。本発明に使用できる他の種類の抗原には、インフルエンザ、おたふく風邪、麻疹、風疹、ジフテリア、破傷風、ヘモフィラス・インフルエンザ（例えば、ｂ型）、ナイセリア、ボルデテラ・パーチュシス、ポリオミレタス、インフルエンザウイルス、及びニューモコッカスのような微生物の感染に起因する（感染性）疾病、及び、一般的には、寄生虫の、原生動物、及び／又はＨＩＶ及びヘルペスのようなウイルス感染も含む、それに対するワクチンを開発することができる、又は想定することができる他の任意の感染又は疾病に対するワクチンに使用される実質的に全ての抗原が含まれる。血清又はワクチンを与えるために、本発明の化合物は、さらにそれ自体公知の他の抗原と組み合わせ得る。
【００７８】
本発明の該側面は、それ故、動物、特にヒト又は他の哺乳動物の前記抗原に対する免疫応答を調節するための、特に、生じさせるための、増加するための、及び／又は促進するための組成物の調製における、１）樹状細胞の表面上のＣ型レクチンに結合し、これに付着した化合物：２）抗原又はその断片若しくは一部の組み合わせの使用に関する。
【００７９】
それ自体本発明の別の側面を構成する、（例えば、複合体、化学物質又は部分、又は融合タンパク質若しくはタンパク質構造の形態である）これらの組み合わせは、同じく、上述のようなそれ自体公知の方法で調合し、投与することができる。
【００８０】
上記方法、態様では全て、使用される化合物／組成物は、治療的に有効な量で（用語の参照は、一般的に、ＷＯ ９３／０１８２０、ＷＯ ９５／３２７３４、及び／又はＷＯ ９６／２３８８２に対してなされる）投与されるであろう。投与は、単回投与であり得るが、好ましくは、一日、一週間、又は一ヶ月以上にわたって行われる複数回投与治療計画の一部である。
【００８１】
本明細書で使用される全ての用語は、当分野における通常の意味であり、とりわけ、同様に適用された、ＷＯ ９３／０１８２０、ＷＯ ９５／３２７３４、ＷＯ ９６／２３８８２、ＷＯ ９８／０２４５６、ＷＯ ９８／４１６３３、及び／又はＷＯ ９８／４９３０６で与えられた定義を参照することができる。
【００８２】
さらに、本明細書において、本発明は、本明細書に開示された特定の４４ｋＤａのＣ型レクチン受容体に関して記載されているが、配列番号１及び図９の配列の天然の変異形を含む他の、一般的に類似したＣ型レクチンが、樹状細胞上に存在してもよく、及び／又は樹状細胞−Ｔ細胞相互作用に関与し得ることが排除されるわけではない。このような変異形は、通常、本明細書に開示した特定のＣ型レクチンと高度のアミノ酸相同性（８０％超〜９０％超）を有し、及び／又は機能的に等価であろう。任意のこのような受容体は、一般的に、本明細書に記載されたものと類似の特性を示すであろう；とりわけ、該受容体の阻害は、炭水化物阻害剤又は特異抗体の何れかによって、樹状細胞／Ｔ細胞相互作用の変化をもたらすであろう。任意のこのような変異形受容体は、しかしながら、ＷＯ ９６／２３８８２に開示されたＣ型レクチン受容体とは区別されなければならず、その阻害は、樹状細胞とＴ細胞の相互作用の阻害をもたらさない。
ここで、本発明は、以下に示された実験の部、及び図によってさらに説明されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１Ａ】図１Ａ−１Ｃは、白血球のＩＣＡＭ−１とＩＣＡＭ−３への自発的接着（図１Ａ）；β２−インテグリンの活性化後の、白血球のＩＣＡＭ−３への接着（図１Ｂ）；β２−インテグリン（ＮＫＩ−Ｌ１９）、β１−インテグリン（ＡIIＢ２）、ＩＣＡＭ−３（ＣＢＲ−ＩＣ３／１、ＣＢＲ−ＩＣ３／２）に対する遮断抗体（２０μｇ／ｍＬ）の存在下、又はＥＤＴＡ（５ｍＭ）若しくはＥＧＴＡ（５ｍＭ）の存在下でのＤＣのＩＣＡＭ−３への接着（図１Ｃ）を示すグラフである。
【図１Ｂ】図１Ａ−１Ｃは、白血球のＩＣＡＭ−１とＩＣＡＭ−３への自発的接着（図１Ａ）；β２−インテグリンの活性化後の、白血球のＩＣＡＭ−３への接着（図１Ｂ）；β２−インテグリン（ＮＫＩ−Ｌ１９）、β１−インテグリン（ＡIIＢ２）、ＩＣＡＭ−３（ＣＢＲ−ＩＣ３／１、ＣＢＲ−ＩＣ３／２）に対する遮断抗体（２０μｇ／ｍＬ）の存在下、又はＥＤＴＡ（５ｍＭ）若しくはＥＧＴＡ（５ｍＭ）の存在下でのＤＣのＩＣＡＭ−３への接着（図１Ｃ）を示すグラフである。
【図１Ｃ】図１Ａ−１Ｃは、白血球のＩＣＡＭ−１とＩＣＡＭ−３への自発的接着（図１Ａ）；β２−インテグリンの活性化後の、白血球のＩＣＡＭ−３への接着（図１Ｂ）；β２−インテグリン（ＮＫＩ−Ｌ１９）、β１−インテグリン（ＡIIＢ２）、ＩＣＡＭ−３（ＣＢＲ−ＩＣ３／１、ＣＢＲ−ＩＣ３／２）に対する遮断抗体（２０μｇ／ｍＬ）の存在下、又はＥＤＴＡ（５ｍＭ）若しくはＥＧＴＡ（５ｍＭ）の存在下でのＤＣのＩＣＡＭ−３への接着（図１Ｃ）を示すグラフである。
【図２Ａ】図２Ａ−２Ｃは、抗体ＡＺＮ−Ｄ１とＡＺＮ−Ｄ２が、ＤＣのＩＣＡＭ−３への接着を阻害し、ＤＣによって特異的に発現されている抗原を認識することを示しているグラフである。
【図２Ｂ】図２Ａ−２Ｃは、抗体ＡＺＮ−Ｄ１とＡＺＮ−Ｄ２が、ＤＣのＩＣＡＭ−３への接着を阻害し、ＤＣによって特異的に発現されている抗原を認識することを示しているグラフである。
【図２Ｃ】図２Ａ−２Ｃは、抗体ＡＺＮ−Ｄ１とＡＺＮ−Ｄ２が、ＤＣのＩＣＡＭ−３への接着を阻害し、ＤＣによって特異的に発現されている抗原を認識することを示しているグラフである。
【図２Ｄ】図２Ｄである。
【図３Ａ】図３Ａと３Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３Ａ）及びヒトＤＣから単離されたＤＣ−ＳＩＧＮの図示（３Ｂ）から分かるように、ＤＣ−ＳＩＧＮがヒト胎盤ＨＩＶｇｐ１２０結合Ｃ型レクチンと同一であることを示している。
【図３Ｂ】図３Ａと３Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３Ａ）及びヒトＤＣから単離されたＤＣ−ＳＩＧＮの図示（３Ｂ）から分かるように、ＤＣ−ＳＩＧＮがヒト胎盤ＨＩＶｇｐ１２０結合Ｃ型レクチンと同一であることを示している。
【図４Ａ】図４Ａと４Ｂは、ＣＯＳ７細胞で過剰発現されたＤＣ−ＳＩＧＮが、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体ＡＺＮ−Ｄ１によって認識され、ＩＣＡＭ−３に結合することを示している。
【図４Ｂ】図４Ａと４Ｂは、ＣＯＳ７細胞で過剰発現されたＤＣ−ＳＩＧＮが、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体ＡＺＮ−Ｄ１によって認識され、ＩＣＡＭ−３に結合することを示している。
【図５】図５は、扁桃（ＡとＢ）及びリンパ節（ＣとＤ）切片におけるＤＣ−ＳＩＧＮの発現の免疫組織化学的な分析によって決定されたＤＣ−ＳＩＧＮの組織分布を示している（ＯＭ×１００）。
【図６Ａ】図６Ａ−６Ｄは、ＤＣ−ＳＩＧＮを介したＤＣのＩＣＡＭ−３への接着（図６Ａ）；ＤＣとＫ５６２−ＩＣＡＭ−３細胞との異種（ｈｅｔｅｒｏｔｙｐｉｃ）細胞クラスタリング（図６Ｂ）；非活性化ＰＢＬとＤＣとの動的な細胞クラスタリング（図６Ｃ）；及びＤＣ誘導性のＴ細胞増殖で果たしているＤＣ−ＳＩＧＮ−ＩＣＡＭ−３相互作用の役割（図６Ｄ）によって実証されているように、ＤＣ−ＳＩＧＮを介したＤＣのＩＣＡＭ−３への接着が、ＤＣ−Ｔリンパ球の相互作用に関与していることを示している。
【図６Ｂ】図６Ａ−６Ｄは、ＤＣ−ＳＩＧＮを介したＤＣのＩＣＡＭ−３への接着（図６Ａ）；ＤＣとＫ５６２−ＩＣＡＭ−３細胞との異種（ｈｅｔｅｒｏｔｙｐｉｃ）細胞クラスタリング（図６Ｂ）；非活性化ＰＢＬとＤＣとの動的な細胞クラスタリング（図６Ｃ）；及びＤＣ誘導性のＴ細胞増殖で果たしているＤＣ−ＳＩＧＮ−ＩＣＡＭ−３相互作用の役割（図６Ｄ）によって実証されているように、ＤＣ−ＳＩＧＮを介したＤＣのＩＣＡＭ−３への接着が、ＤＣ−Ｔリンパ球の相互作用に関与していることを示している。
【図６Ｃ】図６Ａ−６Ｄは、ＤＣ−ＳＩＧＮを介したＤＣのＩＣＡＭ−３への接着（図６Ａ）；ＤＣとＫ５６２−ＩＣＡＭ−３細胞との異種（ｈｅｔｅｒｏｔｙｐｉｃ）細胞クラスタリング（図６Ｂ）；非活性化ＰＢＬとＤＣとの動的な細胞クラスタリング（図６Ｃ）；及びＤＣ誘導性のＴ細胞増殖で果たしているＤＣ−ＳＩＧＮ−ＩＣＡＭ−３相互作用の役割（図６Ｄ）によって実証されているように、ＤＣ−ＳＩＧＮを介したＤＣのＩＣＡＭ−３への接着が、ＤＣ−Ｔリンパ球の相互作用に関与していることを示している。
【図６Ｄ】図６Ａ−６Ｄは、ＤＣ−ＳＩＧＮを介したＤＣのＩＣＡＭ−３への接着（図６Ａ）；ＤＣとＫ５６２−ＩＣＡＭ−３細胞との異種（ｈｅｔｅｒｏｔｙｐｉｃ）細胞クラスタリング（図６Ｂ）；非活性化ＰＢＬとＤＣとの動的な細胞クラスタリング（図６Ｃ）；及びＤＣ誘導性のＴ細胞増殖で果たしているＤＣ−ＳＩＧＮ−ＩＣＡＭ−３相互作用の役割（図６Ｄ）によって実証されているように、ＤＣ−ＳＩＧＮを介したＤＣのＩＣＡＭ−３への接着が、ＤＣ−Ｔリンパ球の相互作用に関与していることを示している。
【図７】図７は、ＤＣ ＳＩＧＮが、ＤＣ上のＨＩＶ−１に対する受容体であることを示している。
【図８】図８は、ＤＣ ＳＩＧＮが、ＩＣＡＭ−３とＩＣＡＭ−３を発現しているＫ５６２細胞の両者に結合することを示している。
【図９】図９は、ＤＣ−ＳＩＧＮの配列を示している。
【実施例】
【００８４】
実験
樹状細胞（ＤＣ）は、抗原を捕捉し、それらがナイーブＴ細胞に抗原を提示する場所である二次リンパ組織に移動する。ＨＩＶ−１は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に接近するために、このユニークな能力を破壊する。本発明では、ＩＣＡＭ−２及び／又はＩＣＡＭ−３に高い親和性で結合するのみならず、ＨＩＶ−１にも結合することができるＤＣ特異的なＣ型レクチンがクローニングされ、ＤＳ−ＳＩＧＮと名付けられた。また、一過性のＤＣ−Ｔ細胞相互作用とＤＣ誘導性のＴ細胞の増殖を阻害するのみならず、ＤＣのＨＩＶ−１感染も効率的に阻害する抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体が開発された。これらの発見は、ＣＤ４非依存性のＨＩＶのＤＣ中への侵入に対する理解に重要な結果を有するのみならず、一次免疫応答の開始におけるＤＣ−ＳＩＧＮの役割に新たな光を投じる。
【００８５】
例１：ＤＣのＩＣＡＭ−３への接着はインテグリンによって媒介されない
最初のＤＣ−Ｔ細胞接触におけるＩＣＡＭ−３を介した接着の役割を調べた。ＩＣＡＭ−３−Ｆｃキメラをコートした蛍光ビーズ（Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ ｅｔ ａｌ．）を含む新規なフローサイトメトリー接着アッセイを利用して、ＤＣ、非活性化末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、及び単球がこのインテグリンリガンドに結合する能力をテストした。ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦの存在下で、７日間単球を培養した後に得られた、未成熟なＤＣは、予めβ２インテグリンの活性化がなくても、強固にＩＣＡＭ−３を結合する（７２％、図１Ａ）。図１は、ＤＣのＩＣＡＭ−３への接着が、Ｃａ２＋依存性であり、インテグリン非依存性であることを実証している：図１Ａ、Ｂ、及びＣには、少なくとも３つの実験のうち代表的な実験が１つ示されている（ＳＤ＜５％）。
【００８６】
−１Ａ：ＩＣＡＭ−１及びＩＣＡＭ−３への白血球の自発的な接着。単離したばかりのＰＢＬ、単球、及びＤＣを、ＩＣＡＭ−１Ｆｃ又はＩＣＡＭ−３Ｆｃ蛍光ビーズのうち何れかとともに、３０分間、３７℃でインキュベートした。洗浄後、フローサイトメトリーによって、ビーズに結合した細胞のパーセントを決定した。
【００８７】
−１Ｂ：β２−インテグリンの活性化後の、白血球のＩＣＡＭ−３への接着。蛍光性ＩＣＡＭ−３Ｆｃビーズの結合を、ＰＭＡ（９８０ｎＭ）又は活性化抗β２インテグリン抗体ＫＩＭ１８５（１０μｇ／ｍＬ）のうち何れかの存在下において、３０分後に３７℃でインキュベートした。ＰＭＡ活性化後に、遮断抗ＬＦＡ−１抗体ＮＫＩ−Ｌ１５（２０μｇ／ｍＬ）の存在下で、ＬＦＡ−１特異的な接着の阻害を測定した。
【００８８】
−１Ｃ：β２−インテグリン（ＮＫＩ−Ｌ１９）、β１−インテグリン（ＡＩＩＢ２）、ＩＣＡＭ−３（ＣＢＲ−ＩＣ３／１、ＣＢＲ−ＩＣ３／２）に対する遮断抗体（２０μｇ／ｍＬ）の存在下での、又はＥＤＴＡ（５ｍＭ）若しくはＥＧＴＡ（５ｍＭ）の存在下でのＤＣのＩＣＡＭ−３への接着。該接着は、図１Ａに記載されているように決定された。
【００８９】
ＤＣのＩＣＡＭ−３へのこの自発的結合は、単球のそれよりも強力であるのに対して、非活性化ＰＢＬは、ほとんどＩＣＡＭ−３を結合しない（図１Ａ）。ＤＣのＩＣＡＭ−３への接着は、何れの抗αＬ又は抗β２インテグリン抗体によってもブロックすることはできなかった（図１Ａ）。対照的に、接着は、抗αＬ抗体によってブロックされないので、ＩＣＡＭ−３への単球の接着はＬＦＡ−１依存的である（図１Ａ）。他のβ２インテグリンメンバー（αＤβ２、αＭβ２、αＸβ２、データは示さず）に対して誘導された抗体も、他のインテグリン（β１、β７インテグリン、図１Ｂ）に対して誘導された抗体もＤＣのＩＣＡＭ−３への接着をブロックしなかったので、ＤＣのＩＣＡＭ−３への結合は、インテグリン非依存性であると結論付けた。
【００９０】
本発明の抗ＩＣＡＭ−３抗体ＣＢＲ３／１、ＣＢＲ３／２及び両抗体の組み合わせは、かなりの程度、接着を阻害することができるので（図１Ｂ）、ＤＣとＩＣＡＭ−３−Ｆｃビーズの相互作用は、ＩＣＡＭ−３特異的である。興味深いことに、ＤＣのＩＣＡＭ−３への接着は、ＥＤＴＡとＥＧＴＡによって完全にブロックされ得る（図１Ｂ）。これらの発見は、ＤＣが、β１又はβ２インテグリンファミリーに属していないＣａ２＋依存性の表面受容体を介してＩＣＡＭ−３に結合することを強く示唆している。この分子は、ＤＣ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩＣＡＭ−３ Ｇｒａｂｂｉｎｇ Ｎｏｎ−ｉｎｔｅｇｒｉｎ（ＤＣ−ＳＩＧＮ）と名付けられた。
【００９１】
例２：ＤＣ−ＳＩＧＮに対する抗体は、ＤＣ−ＩＣＡＭ−３相互作用を阻害する
ＤＣ−ＳＩＧＮをより詳細に調べるために、ＩＣＡＭ−３結合受容体に対する抗体を産生せしめた。ＤＣで免疫したマウスの脾臓をＳＰ２／０ミエローマ細胞と融合し、ＤＣ特異的なＩＣＡＭ−３への接着を阻害することができる抗体の存在について、得られたハイブリドーマの上清をスクリーニングした。２つのハイブリドーマを選択し、クローニングし、得られた抗体をＡＺＮ−Ｄ１及びＡＺＮ−Ｄ２と名付けた。精製された両抗体は、ＤＣのＩＣＡＭ−３への接着を強く阻害するが、ＬＦＡ−１を介した単球のＩＣＡＭ−３への接着には影響を与えない（図２Ａ）。図２は、抗体ＡＺＮ−Ｄ１とＡＺＮ−Ｄ２が、ＤＣのＩＣＡＭ−３への接着を阻害し、ＤＣによって特異的に発現されている抗原を認識することを実証している。
【００９２】
−２Ａ：モノクローナル抗体ＡＺＮ−Ｄ１とＡＺＮ−Ｄ２（２０μｇ／ｍＬ）は、ＤＣの蛍光性ＩＣＡＭ−３Ｆｃビーズへの接着をブロックするが、単離したばかりの単球の接着はブロックしない。少なくとも３つの実験のうち、代表的な実験が示されている（ＳＤ＜５％）。
【００９３】
−２Ｂ：ＤＣ−ＳＩＧＮの発現は、ＤＣの発達中に増加した。ＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下で単球から培養した。異なる時点で、単球マーカーＣＤ１４、β２インテグリンＬＦＡ−１、及びＤＣ−ＳＩＧＮの発現について、発達中のＤＣを分析した。細胞は、フォワード側の散乱でゲートされ、ヒストグラムの右上隅に平均蛍光が示されている。３つの実験のうちの代表的な実験が示されている。
【００９４】
−２Ｃ：ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下で、単球から発育しているＤＣは、ＤＣ−ＳＩＧＮ依存性の態様で、次第に多くのＩＣＡＭ−３に結合する。培養中の異なる時点で、細胞を採集し、遮断抗β２−インテグリン抗体ＡＺＮ−Ｌ１９又はＡＺＮ−Ｄ１抗体（２０μｇ／ｍＬ）の存在下で、蛍光ＩＣＡＭ−３Ｆｃビーズとともにインキュベートした。接着は、図１Ａで記載したように決定した。ＡＺＮ−Ｄ２は、ＡＺＮ−Ｄ１と同様に、ＩＣＡＭ−３への接着を阻害した（結果は示されていない）。３つの実験のうち代表的な実験が示されている（ＳＤ＜５％）
【００９５】
−２Ｄ：発育しているＤＣによるβ２インテグリン及びＤＣ−ＳＩＧＮを介したＩＣＡＭ−３への接着の相対的寄与。相対的寄与は、図２Ｃに記載されているように、ＡＺＮ−Ｄ１又はＡＺＮ−Ｌ１９の存在下での接着の阻害から算出される。
【００９６】
フローサイトメトリー分析でＡＺＮ−Ｄ１抗体を使用して、ＤＣ−ＳＩＧＮは、単球によって発現されていないことが実証された（図２Ｂ）。ＤＣ−ＳＩＧＮを発現している細胞は、培養の１日後に、既に検出できる。ＤＣ−ＳＩＧＮの発現レベルは、培養の間に増加する（図２Ｂ）。単球マーカーＣＤ１４の発現は、培養の間、徐々に減少し、７日目には、低いＣＤ１４の発現のみが観察される（図２Ｂ）。さらなるフローサイトメトリー分析によって、７日目に、単球の未成熟なＤＣへの分化と一致して、細胞が、高レベルのＭＨＣクラスI、II、β２インテグリンｐ１５０，９５、及びＣＤ８６も発現していることが実証された（データは示されていない）。これらの結果は、ＤＣ−ＳＩＧＮが７日目にＤＣによって豊富に発現され、発現レベルがＬＦＡ−１のそれより数倍高いことを実証している。
【００９７】
同時に、単球が未成熟なＤＣに分化する間の、ＩＣＡＭ−３結合におけるＤＣ−ＳＩＧＮの関与を調べた（図２Ｃ）。遮断抗β２インテグリン抗体Ｌ１９（図２Ｃ）による接着の阻害によって実証されたように、培養の開始時点で（０日）、単球によるＩＣＡＭ−３への結合は、完全にβ２インテグリン（ＬＦＡ−１）依存性である。第１日目に、低レベルのＤＣ−ＳＩＧＮが発現されると（図２Ｂ）、ＩＣＡＭ−３特異的な接着は、β２インテグリン（ＬＦＡ−１）とＤＣ−ＳＩＧＮの両者に依存する（図２Ｃ）。２日から７日まで、ＩＣＡＭ−３特異的な接着が増加して、β２インテグリン非依存性になり（図２Ｃ）、抗ＤＣ−ＳＩＧＮが該接着を完全にブロックするので、２日目からは、専らＤＣ−ＳＩＧＮによって媒介される。ＤＣ−ＳＩＧＮを介した接着は、７日目に最大に達する（図２Ｃ）。
【００９８】
これらの結果を合わせると、ＤＣ−ＳＩＧＮの発現の増加は、ＩＣＡＭ−３結合の観察された増加と一致することを示している（図２ＡとＢ）。これらの発見から、抗体ＡＺＮ−Ｄ１とＡＺＮ−Ｄ２によって認識されるＤＣ−ＳＩＧＮは、ＤＣによって発現される新規ＩＣＡＭ−３結合受容体であると結論することができる。
【００９９】
例３：ＤＣ−ＳＩＧＮは、４４ｋＤａのタンパク質である。
【０１００】
ＤＣ−ＳＩＧＮの分子量に関する情報を得るために、１２５−表面標識したＤＣの溶解物からＤＣ−ＳＩＧＮを免疫沈降した。還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析によって、単一の４４ｋＤａのタンパク質が明らかとなった（図３Ａ、レーン１−２）。図３は、ＤＣ−ＳＩＧＮが、ヒト胎盤ＨＩＶｇｐ１２０結合Ｃ型レクチンと同一であることを実証している。
【０１０１】
−３Ａ：ＤＣ−ＳＩＧＮは、４４ｋＤａのタンパク質である。ＤＣは、１２５Ｉで表面標識され、溶解され、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体ＡＺＮ−Ｄ１（レーン１）、ＡＺＮ−Ｄ２（レーン２）、及びＡＺＮ−Ｌ１９（抗β２−インテグリン；レーン３）でＤＣ−ＳＩＧＮを免疫沈降した。免疫沈降物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５〜１５％ゲル）、続くオートラジオグラフィーによって分析した（５−１５％）。分子量マーカーの移動は、左側に示されている。矢印は、ＬＦＡ−１（αＬ、１８０ｋＤａ）のα鎖、ＭＡＣ−１（αＭ、１６５ｋＤａ）、及びｐ１５０，９５（αＸ、１５０ｋＤａ）、β２インテグリン鎖（９５ｋＤａ）、及びＤＣ−ＳＩＧＮ（４４ｋＤａ）を示している。同様の結果は、他の３つの実験で得られた。
【０１０２】
−３Ｂ：ヒトＤＣから単離されたＤＣ−ＳＩＧＮの模式図。２つの四角に囲まれたペプチド（ヒト胎盤ｇｐ１２０結合Ｃ型レクチン（）のアミノ酸２９６〜３０６位、及び１８７〜１９７位）が、エドマン分解を用いた、免疫沈降したＤＣ−ＳＩＧｎの内部ペプチド配列決定によって同定された。ＤＣ−ＳＩＧＮをコードするｃＤＮＡは、ＤＣから単離された。推定アミノ酸配列は、ヒト胎盤ｇｐ１２０結合Ｃ型レクチン（）の配列と１００％同じである。膜貫通領域、レクチンドメイン、並びに７つの完全な、及び８つの部分的なリピート（Ｒ１−Ｒ８）が示されている。
【０１０３】
非還元性のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での免疫沈降の分析は、ＤＣ−ＳＩＧＮがモノマーとして存在することを示している（結果は示されていない）。さらに、ＩＣＡＭ−３−Ｆｃコートされたビーズを用いて、ＤＣ溶解物から４４ｋＤａのタンパク質を抽出することができたのに対して、遮断抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体の存在下では、このタンパク質は、ＩＣＡＭ−３−Ｆｃコートされたビーズを用いて沈殿させることができなかった（結果は示されていない）。これらの発見は、ＤＣ−ＳＩＧＮが、還元条件下で、４４ｋＤａのタンパク質としてＤＣによって発現されていることを示している。ＩＣＡＭ−３Ｆｃを結合したビーズが、ＤＣ溶解物から４４ｋＤａのタンパク質のみを抽出したという観察は、ＤＣ−ＳＩＧＮが、同じくＤＣによって発現され（図３Ａ）、ＩＣＡＭ−３を結合すると報告されてきた（Ｖａｎｄｅｒｖｉｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．３，６８３−６９０，１９９５）ＬＦＡ−１又はαＤβ２に比べて、ＩＣＡＭ−３に対して、ずっと高い親和性を有することを示している（図３Ａ）。ＤＣ−ＳＩＧＮと比較して、極めて低量のＬＦＡ−１は、免疫沈降しないので（図３Ａ、レーン１と３）、これは、ＤＣ−ＳＩＧＮが、ＬＦＡ−１に比べてＤＣによって、より豊富に発現されていることを確かめている。総合すると、これらのデータは、ＤＣ−ＳＩＧＮが、４４ｋＤａの単一ポリペプチドであり、ＤＣ上のＩＣＡＭ−３に対する一次的な受容体であることを実証している。
【０１０４】
例４：ＤＣ−ＳＩＧＮが、ヒトＨＩＶｇｐ１２０結合Ｃ型レクチンに同一である
ＤＣ−ＳＩＧＮを同定するために、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体ＡＺＮ−Ｄ１を用いたＤＣ溶解物からの予備的免疫沈降を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから４４ｋＤａタンパク質を切り出した。トリプシン消化後、生じたペプチドをゲルから抽出し、予備的ＨＰＬＣを用いて精製した。続いて、エドマン分解操作を用いて２つのペプチドのアミノ酸配列（０．５〜１ｐｍｏｌ）を決定した。両ペプチドは、１１アミノ酸残基からなり（図３Ｂ）、該ペプチド配列は、公知のタンパク質との相同性をＥＭＢＬデータベースでスクリーニングするために使用された。両ペプチドは、ヒトＨＩＶｇｐ１２０結合Ｃ型レクチンの推定アミノ酸配列（Ｃｕｒｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２）と１００％同一であることが証明された。該タンパク質は、これまでは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０に対するＣＤ４非依存性の受容体として、専ら胎盤だけに同定されていた。
【０１０５】
ｇｐ１２０結合Ｃ型レクチン配列、ＤＣから単離されたＲＮＡに基づくプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ分析は、１２３７ｎｔの長さを有すると予想されるＰＣＲ産物を与えた。ＤＣ特異的なＰＣＲ産物をクローニングし、配列決定によって、ヒトｇｐ１２０結合レクチンと１００％の同一性を確認した（図３Ｂ）。胎盤ｇｐ１２０結合Ｃ型レクチンをコードするｃＤＮＡをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞のフローサイトメトリー分析は、ｇｐ１２０結合Ｃ型レクチンがＤＣ−ＳＩＧＮと実際に同一であることを明確に証明している（図４Ａ）。図４は、ＣＯＳ７細胞中で過剰発現されたＤＣ−ＳＩＧＮは、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体ＡＺＮ−Ｄ１によって認識され、ＩＣＡＭ−３を結合することを示している。
【０１０６】
−４Ａ：ＡＺＮ−Ｄ１は、ＤＣ−ＳＩＧＮをコードするｃＤＮＡをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を認識するが（黒）、モックトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞（白）は認識しない。ＡＺＮ−Ｄ２は、同様の染色を与えた（結果は示されていない）。
【０１０７】
−４Ｂ：ＣＯＳ７−ＤＣ−ＳＩＧＮのＩＣＡＭ−３への接着。ＣＯＳ７細胞にトランスフェクトし、接着は、それぞれ、図１Ａに記載されているように決定した。ＣＳＯ７−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞のＩＣＡＭ−３への接着は、ＥＧＴＡ（５ｍＭ）及びＤＣ−ＳＩＧＮ（ＡＺＮ−Ｄ１）、ＩＣＡＭ−３（ＣＢＲ−ＩＣ３／１、ＣＢＲ−ＩＣ３／２）、及びβインテグリン（ＡＺＮ−Ｌ１９）に対する遮断抗体の存在下で測定した。３つの実験のうち代表的な実験が示されている（ＳＤ＜５％）。トランスフェクトされたＣＯＳ７細胞の約３０％が、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体で染色され、それ故、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現している。さらに、ＣＯＳ７−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞は、ＩＣＡＭ−３を結合することができるのに対して、モックトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞は、ＩＣＡＭ−３を結合することができない（図４Ｂ）。ＣＯＳ７によって発現されたＤＣ−ＳＩＧＮの結合は、ＩＣＡＭ３及びＤＣ−ＳＩＧＮに対する抗体によって完全に阻害され得、ＥＧＴＡは接着を完全にブロックするので、Ｃａ２＋依存性であった（図４Ｂ）。
【０１０８】
ＤＣによって発現されるＩＣＡＭ−３結合受容体（ＤＣ−ＳＩＧＮ）は、４０４のアミノ酸からなり、３つの異なるドメインを有するII型膜貫通タンパク質である胎盤ＨＩＶｇｐ１２０結合Ｃ型レクチン（Ｃｕｒｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９２）と同一であると結論付けられた。４０アミノ酸残基のＮ末端細胞質ドメインは、１５アミノ酸の疎水性のストレッチによって、ほぼ同一の配列の７つの完全なタンデムリピートと１つの不完全なタンデムリピートからなる領域から、分断されている。残りのＣ末端領域（Ｃｙｓ２５３−Ａｌａ４０４）は、Ｃａ２＋依存性（Ｃ型）レクチンと相同性を示している（図３Ｂ）。
【０１０９】
例５：ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＤＣによって特異的に発現されている
ＡＺＮ−Ｄ１／Ｄ２抗体を用いた多岐にわたる造血細胞群のフローサイトメトリー分析は、抗原が、ＤＣによって優先的に発現されていることを実証している（表１）。テストした全ての造血細胞は、ＤＣを除いて、ＤＣ−ＳＩＧＮの発現が陰性であった。さらに、ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＤＣ−ＳＩＧＮをコードするｍＲＮＡが、ＤＣ中で特異的に転写されているのを確認し、これは、ＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質の発現パターンと一致している（表１）。
【０１１０】
ＤＣ−ＳＩＧＮの発現をインビボでさらに調べるために、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体を用いて二次リンパ組織の免疫組織化学的分析を行った。これらの組織は、樹状細胞を含有していることが知られている。扁桃及びリンパ節の切片は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞を含有しており、これは、主として、扁桃とリンパ節の両者のＴ細胞領域中に観察された（図５）。図５は、ＤＣ−ＳＩＧＮの組織分布を示している：扁桃及びリンパ節切片におけるＤＣ−ＳＩＧＮの発現の免疫組織化学的分析（ＯＭ×１００）。切片は、アセトンで固定し、核の染色は、ヘマテインを用いて行った。ＤＣ−ＳＩＧＮの染色は、ＡＺＮ−Ｄ１を用いて行った。胚芽中心（ＧＣ）、Ｔ（Ｔ）及びＢ細胞（Ｂ）領域が図示されている。樹状細胞の分布及び形態と一致して、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現している細胞は、胚芽中心及びリンパ組織のマントルゾーンには検出されない（図５）。ＣＤ３とＣＤ１４に対する連続切片の染色によって、これらの細胞のフローサイトメトリー分析とＲＴ−ＰＣＲの両者によっても実証されたように（表１）、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現している細胞は、Ｔ細胞及び単球とは異なること（データは示されていない）が確認された。
【０１１１】
例６：ＤＣ−ＳＩＧＮ／ＩＣＡＭ−３相互作用は、一過性のＤＣ−Ｔリンパ球クラスタリングを媒介する
ＤＣが、ＤＣ−ＳＩＧＮ依存性の態様で、ＩＣＡＭ−３を発現しているトランスフェクタントに結合することを実証するために、ＩＣＡＭ−３をコードするｃＤＮＡをトランスフェクトした白血病細胞株Ｋ５６２（Ｋ５６２−ＩＣＡＭ−３）がＤＣに結合する能力を調べた。図６Ａに示されているように、相互作用が抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体によってブロックできるので、ＤＣは、ＤＣ−ＳＩＧＮ依存性の態様で、Ｋ５６２−ＩＣＡＭ−３とクラスターを形成する。ＤＣとＫ５６２との間ではクラスタリングが全く観察されなかったことは、ＩＣＡＭ−３がＤＣ−ＳＩＧＮに対するリガンドであることを実証している。図６は、ＤＣ−ＳＩＧＮを介したＤＣのＩＣＡＭ−３への接着が、ＤＣ−Ｔリンパ球相互作用に関与していることを示す。
【０１１２】
−６Ａ：ＤＣ−ＳＩＧＮを介したＤＣのＩＣＡＭ−３への接着は、完全な状態の細胞骨格に依存する。ＤＣのＩＣＡＭ−３ビーズへの接着は、様々な濃度で滴定された、サイトカラシンＤの存在下、遮断ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体ＡＺＮ−Ｄ１あり（白四角）、又はなし（黒四角）で決定した。２つの実験のうち代表的な実験が示されている（ＳＤ＜５％）。
【０１１３】
−６Ｂ：ＤＣとＫ５６２−ＩＣＡＭ−３細胞との異種細胞クラスタリング。Ｋ５６２及びＩＣＭＡ−３をコードするｃＤＮＡを安定にトランスフェクトしたＫ５６２細胞（Ｋ５６２−ＩＣＡＭ−３）を、赤い色素ＨＥ（ハイドロエチジン）で標識した。ＤＣは緑の色素ＳＦＤＡで標識した。Ｋ５６２とＫ５６２−ＩＣＡＭ−３を、遮断抗体ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体（ＡＺＮ−Ｄ１；１０分。プレインキュベーション）あり、又はなしで、ＤＣ（５０×１０３細胞／細胞種類）とともに、３７℃でインキュベートした。異なる時点で、細胞をパラホルムアルデヒド（０．５％）で固定し、異種細胞のクラスタリングをフローサイトメトリーで測定した。２つの実験のうち代表的な実験が示されている。
【０１１４】
−６Ｃ：非活性化ＰｂＬとＤＣの動的な細胞クラスタリングは、ＤＣ−ＳＩＧＮによって媒介される。抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体ＡＺＮ−Ｄ１とＡＺＮ−Ｄ２（１０μｇ／ｍＬ）あり／なしで、１０分間室温で、ＤＣ（５０×１０３細胞）をプレインキュベートした。蛍光性色素カルセインＡ（２５μｇ／１０７細胞／ｍＬ、３０分間３７℃）で標識した、同種異系ＰＢＬ（１×１０６細胞）を加え、細胞混合物を３７℃でインキュベートした。クラスタリングは、フローサイトメトリーによって測定した。２つの実験のうち代表的な実験が示されている。
【０１１５】
−６Ｄ：ＤＣ−ＳＩＧＮ−ＩＣＡＭ−３相互作用は、ＤＣ誘導性のＴ細胞増殖に重要である。ＬＦＡ−３（ＴＳ２／９）とＤＣ−ＳＩＧＮ（ＡＺＮ−Ｄ１、ＡＺＮ−Ｄ２）に対する遮断抗体（２０μｇ／ｍＬ）の存在下で、同種異系の反応性（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）Ｔリンパ球（１００×１０３）をＤＣ刺激因子（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）（１．５×１０３）に加えた。細胞を４日間培養した。４日目に、［３Ｈ］メチルチミジンを１６時間細胞にパルスし、取り込み量を決定した。結果は、３つのウェルからのＣＰＭの平均パーセントとして表されている。
【０１１６】
ＤＣ−ＳＩＧＮ依存性のクラスタリングが一過性であり、６０分に最大となることは、ＤＣ−ＳＩＧＮ−ＩＣＡＭ−３相互作用がＤＣによって積極的に調整され得ることを示している。さらに、この現象は、ＴＣＲの参加後にこの相互作用化が強化されるまで、ＤＣが複数のナイーブＴ細胞と一過性に相互作用することを可能とする。
【０１１７】
これをテストするために、ＤＣのＴ細胞へのクラスタリングが、ＤＣ−ＳＩＧＮによって媒介されるかどうか、及びこの相互作用も一過性であるかどうかを調べた。ＤＣを非活性化同種異系Ｔ細胞（ＤＣ：Ｔ細胞、１：２０）とともにインキュベートして、ＤＣ−Ｔ細胞クラスタリングを決定した。図６Ｂに示されているように、ＤＣとＴ細胞とのクラスタリングは一過性であり、２０分後に最大（３２％）に達する。さらに、ＤＣ−Ｔ細胞相互作用は、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体によって阻害することができ（約５０％）、ＤＣ−Ｔ細胞のクラスタリングは、他の表面受容体によっても媒介されることが示唆されている。このように、ＤＣ−Ｔ細胞クラスタリングは、実際に一過性であり、部分的には、ＤＣ−ＳＩＧＮ／ＩＣＡＭ−３相互作用によって媒介されている。同様に、図８は、ＤＣ−ＳＩＧＮが、ＩＣＡＭ−３をコードするｃＤＮＡを発現しているＫ５６２細胞と結合するのみならず、ＩＣＡＭ−３をコードするｃＤＮＡを発現している細胞に結合し、前記結合は、マンナンと抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体の両者によって阻害され得ることを示している。
【０１１８】
例７：同種異系ＤＣによって誘導された非活性化Ｔ細胞の増殖は、ＤＣ−ＳＩＧＮ依存性である
ＤＣ−ＳＩＧＮのＩＣＡＭ−３への結合は、ＤＣのＴ細胞とのクラスタリングに重要なので、ＤＣ誘導性のＴ細胞増殖におけるＤＳ−ＳＩＧＮの役割も調べた。遮断抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体の存在下、又は非存在下で、同種異系ＤＣを用いて非活性化Ｔリンパ球を刺激した。図６Ｃに示されているように、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体ＡＺＮ−Ｄ１とＡＺＮ−Ｄ２は、ともにＴリンパ球の増殖を７５％超、阻害した。同様に、Ｔ細胞上のＣＤ２に結合し、Ｔ細胞増殖を媒介することも知られている共同刺激分子ＬＦＡ−３に対する抗体は、Ｔ細胞の増殖を阻害する。抗ＬＦＡ−３と抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体の組み合わせは、Ｔ細胞の増殖を完全に阻害する（図６Ｃ）。
【０１１９】
例８：ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＤＣのＨＩＶ感染に関与している
上記のごとく、ＤＣ−ＳＩＧＮは、胎盤ＨＩＶｇｐ１２０結合レクチンと同一であり、ＤＣによって豊富に発現されていることが実証されたので、ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＨＩＶ−１のＤＣ中への侵入を促進し得るかもしれない。これを調べるために、ＤＣにＨＩＶ−１をパルスし、ＤＣ−Ｔ細胞共培養中の増殖性感染を測定した。ＩＬ−４とＧＭ−ＣＳＦの存在下で、７日間培養した後に採集したＤＣは、低レベルのＣＤ４（Ｂｌａｕｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８４（６），２４３３−８，１９９６）と高レベルのＤＣ−ＳＩＧＮ（図７）を発現した。図７に示されているように、ＤＣに、２時間、ＨＩＶ−１をパルスし、洗浄し、活性化されたＰＢＭＣ細胞の存在下で培養すると強力な増殖性感染が起こる。ＤＣ−Ｔ細胞の共培養の３日目までに、ＨＩＶ−１複製の指標であるｐ２４Ｇａｇタンパク質が、培地中に蓄積し始め（図７）、他者によって示されたのと同様に（Ｂｌａｕｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ９（１），２１−２９，１９９９）、ＨＩＶ−１が共培養中で効率的に複製されることを実証している。しかしながら、ＨＩＶ−１パルスに先立って、ＤＣを抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体とプレインキュベートし、活性化されたＰＢＭＣとインキュベートすると、ＤＣ−Ｔ細胞の共培養の３及び５日目に示されているように、ＨＩＶ−１の複製が７５％超、阻害される（図７）。ＨＩＶ−１でパルスした後、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体とＤＣをインキュベートすると、ＤＣ−Ｔ細胞の共培養中に、効率的なＨＩＶ−１複製が、なお観察された（図７）。これらの発見は、ＤＣからＴ細胞へのＨＩＶ−１の伝達ではなく、ＨＩＶ−１のＤＣへの結合の阻害を通じて、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体がＨＩＶ−１の感染をブロックすることを実証しており、ＤＣ−ＳＩＧＮが、ＤＣ上の主要なＨＩＶ−１受容体として作用することを示している。このように、ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＤＣ上に高度に発現されており、ＩＣＡＭ−３とＨＩＶ−１の両者に対するＤＣ特異的な受容体として機能する。
【０１２０】
上記の実験結果から、ＤＣとＴリンパ球との最初の相互作用は、抗原非依存性であり、且つ一過性であると、特に結論付けることができる。この一過性の性質は、増殖性のＴＣＲの参加がなされるまで、多数のＴ細胞と相互作用する能力をＤＣに与える。現在まで、この一過性のプロセスが開始される機序は不明確であった。本明細書では、新規ＤＣ特異的な受容体、ＤＣ−ＳＩＧＮとＩＣＡＭ−３との相互作用が、この一過性のＤＣ−Ｔ細胞相互作用を媒介することが実証されている。ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＤＣによって豊富に発現されており、ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＤＣ上の主要なＨＩＶ−１受容体として働くことが示された。
【０１２１】
ＨＩＶ−１感染中のＤＣの重要な役割は、ＨＩＶ−１をＴ細胞に伝播して、ＣＤ４＋Ｔ細胞の死をもたらす大量の複製を促進することである（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｃａｍｅｒｏｎ：ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １０（１），６１−７１，１９９４）。ＤＣの増殖性ＨＩＶ−１感染は明確に実証されており、ＤＣの発育段階に依存する（Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。ＩＬ−４とＧＭ−ＣＳＦの存在下で単球から培養された未成熟なＤＣは、Ｍ−トロピック（ｔｒｏｐｉｃ）ＨＩＶ−１株によって増殖性に感染される（Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８）（Ｂｌａｕｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７）のに対して、Ｍ及びＴトロピックＨＩＶ−１の成熟したＤＣへの侵入は、ともに、増殖性の感染をもたらさない（Ｇｒａｎｅｌｌｉ １９９８）。しかしながら、両種類のＤＣへのＨＩＶ−１の侵入は、非活性化又は活性化Ｔ細胞の何れかとともに共培養すると、爆発的な複製をもたらす（Ｇｒａｎｅｌｌｉ １９９８，１９９９）。標的細胞のＨＩＶ−１感染における最初の出来事には、受容体の結合と膜の融合が含まれる。このプロセスは、エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０のＣＤ４への高親和性結合によって開始される。しかしながら、ＣＤ４のみでは、融合を開始するのに十分ではなく、最後の融合現象が起こるための共受容体として、ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４のようなケモカイン受容体が必要とされる（Ｌｉｔｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８による総説）（Ｄｒａｇｉｃ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８１（６５８４），６６７−７３，１９９６；Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２（５２６３），８７２−７，１９９６）。ＤＣは、低量のＣＤ４を発現しているのに対して、細胞表面上には高レベルのＤＣ―ＳＩＧＮが発現されている。ＤＣの増殖性感染、及びＨＩＶ−１を捕捉し、続いてＨＩＶ−１を転移させるその能力は、別個の経路を通じて媒介されると示唆されてきた。ＤＣの増殖性感染は、ＣＤ４依存性の経路によって媒介されるのに対して、ＨＩＶ−１は、なおＤＣがＨＩＶ−１をＴ細胞に転移させるのを可能とするＣＤ４非依存性の経路を介してＤＣによりＨＩＶ−１を捕捉することができる（Ｂｌａｕｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７））。本明細書では、ＨＩＶ−１パルスの前に、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体とともにＤＣをプレインキュベートすると、ＤＣ−Ｔ細胞の共培養中に増殖性の感染が欠如することによって測定されたように、ＤＣ−ＳＩＧＮが、ＨＩＶ−１のＤＣへの侵入を特異的に媒介することが示された。抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体は、ＨＩＶ−１のＤＣ中への侵入を完全には阻害しない。このＤＣ−ＳＩＧＮ非依存性の経路は、おそらく、ＤＣ上に低レベルで発現されているＣＤ４（）によって媒介される。これらの結果は、ＤＣ中へのウイルスの侵入経路に、ＣＤ４依存性の経路と非依存性の経路の両者が存在することを確認している。様々な接着分子が、ＤＣ−Ｔ細胞接触の妨害を通じて、ＤＣからＴ細胞へのＨＩＶ−１の伝達を阻害し得ることが示された（Ｔｓｕｎｅｔｓｕｇｕ−Ｙｏｋｏｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。ＤＣ−Ｔ細胞相互作用を阻害するために、ＨＩＶ−１パルス後に抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体を添加すると、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体は、Ｔ細胞へのＨＩＶ−１の伝達を阻止することができなかった。これらのデータは、ＤＣ−ＳＩＧＮが、ＨＩＶ−１がＤＣ中に侵入するための主要な受容体として働いていることを示している。ＤＣが、高レベルのＤＣ−ＳＩＧＮと低レベルのＣＤ４を発現しているという事実（図７）は、ＤＣ中へのＨＩＶ−１の侵入が、主としてＤＣ−ＳＩＧＮによって媒介されることをさらに実証している。ＤＣ−ＳＩＧＮのＨＩＶ−１受容体としての発見は、ＨＩＶ−１のＤＣ中への侵入をよりよく理解する上で重要であり得る。さらに、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体の存在下で観察されるＨＩＶ−１感染の阻害は、ウイルス感染と局所的なＨＩＶ−１の拡散に対する治療的な戦略での抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体の開発を可能にするであろう。
【０１２２】
ＤＣは、様々な組織で、僅かなレベルで存在する細胞の異種集団を構成する。様々な集団をより明確にするために、ＤＣ系統特異的な細胞表面分子に対して誘導される抗体の生成に努力が注がれている。これまでは、ヒトＤＣ特異的な抗原を認識する２〜３の抗体のみが作られてきた（（Ｈｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．８３，５７３−５８１，１９９４）（ｄｅ Ｓａｉｎｔ−Ｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ９（３），３２５−３６，１９９８）（Ｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７））。本明細書において、テストした全ての造血細胞のうち、ＤＣのみが、タンパク質及びｍＲＮＡレベルでＤＣ−ＳＩＧＮを発現していることが実証されたので、いま、ヒトＤＣ特異的な抗原のこのリストに、ＤＣ−ＳＩＧＮを加えることができる（表１）。インシチュで、ＤＣ−ＳＩＧＮは、専ら、扁桃及びリンパ節のＴ細胞領域に存在するＤＣサブセットによって発現されている。これらの成熟ＤＣは、ナイーブＴ細胞の活性化に極めて強い効力を有する。それ故、インシチュでのＤＣ−ＳＩＧＮ発現は、ＤＣ−Ｔ細胞クラスタリング及びそれに引き続くＴ細胞の活性化の重要な媒介物質としてのその機能と相関している。
【０１２３】
抗原提示細胞による非活性化Ｔリンパ球の活性化は、後天性の免疫応答における極めて重要な工程である。多くの組織に局在し、ＤＣは抗原を捕捉、加工し、それらがナイーブな抗原特異的Ｔ細胞と相互作用し、これを活性化する場所であるリンパ組織に移動する。Ｔ細胞は、ケモカインによって、これらの抗原提示部位に誘導される。最近、ナイーブＴ細胞を免疫開始部位に特異的に誘引するＤＣ特異的なケモカインＤＣ−ＣＫ１が同定された（Ａｄｅｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８７， ７１３−７１７，１９９７）。二次リンパ組織に到達すると、Ｔ細胞はＤＣと相互作用し、ＭＨＣ分子に結合したペプチドのＴＣＲ認識後に活性化が起こる。しかしながら、ＭＨＣ分子によって提示された抗原に対するＴＣＲの親和性は極めて低いので、ＡＰＣ上の特異的なＭＨＣ−ペプチド複合体の数は限られており、ＴＣＲの抗原との相互作用は、通常、完全な活性化に必要なＤＣとＴリンパ球との近接した膜接触の形成を駆動するには不十分である。
【０１２４】
現在まで、ＬＦＡ−１は、ＤＣ上のＩＣＡＭ−３に対する最も重要な受容体であった。しかしながら、ＩＣＡＭ−３結合におけるその役割は、本明細書におけるＤＣ−ＳＩＧＮの発見のため、現在では、議論の余地があるものとなった。ＤＣのＩＣＡＭ−３への接着は、ＤＣ−ＳＩＧＮによって完全に媒介されることが実証された。ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＬＦＡ−１よりＤＣによって、より豊富に発現されている（図２Ｂ）。さらに、ＬＦＡ−１は、ＤＣ上で不活性であり（図２Ｃ）、ＩＣＡＭ−３に対するその親和性は、ＩＣＡＭ−３に対するＤＣ−ＳＩＧＮの親和性よりずっと低い。これらのデータは、ＤＣ−ＳＩＧＮが、ＤＣ上の主要なＩＣＡＭ−３受容体であることを明確に実証している。ＤＣに対するＤＣ−ＳＩＧＮの機能は、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体が一過性のＤＣ−Ｔ細胞クラスタリングを部分的に阻害したという発見によってさらに明確にされた。それ故、ＤＣ−ＳＩＧＮは、免疫応答における最初のＤＣ−Ｔ細胞相互作用に関わっている。以前は、ＬＦＡ−１に割り振られた役割であった。ＤＣ−ＳＩＧＮによって媒介されるＤＣ−Ｔ細胞相互作用の一過性の性質は、増殖性のＴＣＲを介した相互作用が起こり、それによって相互作用が安定化されるまで、ＤＣが多数の非活性化Ｔ細胞と相互作用することを可能にする。ＤＣ−ＳＩＮＧ−ＩＣＡＭ−３相互作用の重要性は、ＤＣ−ＳＩＧＮに対する抗体が、同種異系のＤＣ誘導性Ｔリンパ球増殖を阻害し得るという発見によって、さらに強調される。さらに、ＤＣ−ＳＩＧＮと公知の共同刺激分子ＬＦＡ−３（）に対する抗体の組み合わせは、ほぼ完全にＴリンパ球の増殖を阻害する。それ故、ＤＣ−ＳＩＧＮのＩＣＡＭ−３への一過性の高親和性接着は、ＤＣとナイーブＴ細胞間の最初の抗原非依存性相互作用において重要な役割を果たしている。おそらく、この最初の高親和性相互作用は、ＭＨＣに結合した抗原によるＴＣＲの関与を可能とし、引き続き、ＬＦＡ−１−ＩＣＡＭ−１相互作用のような、ＤＣとＴ細胞間の他の幾つかの接着性相互作用を開始させる。ＬＦＡ−１はＴ細胞に対して不活性なので、ＤＣによる抗原提示後におけるＴＣＲ／ＣＤ３複合体の活性化は、ＬＦＡ−１の活性化と、引き続くＤＣ上に発現されたＬＦＡ−１のＩＣＡＭ−１への強力な結合（）をもたらすであろう。複数の接触を介したＤＣとＴ細胞間の相互作用の強化は、続いて、ＤＣ刺激因子によるＴリンパ球の完全な活性化をもたらすであろう（）。
【０１２５】
結論をいえば、ＤＣ上に新規ＩＣＡＭ−３受容体が同定され、ＤＣ−ＳＩＧＮと名付けられ、この受容体は、ヒトＤＣによって特異的に発現されており、免疫応答を開始するために必要な最初の一過性ＤＣ−Ｔ細胞相互作用に関与している。興味深いことに、ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１２０も結合し、ＨＩＶ−１のＤＣへの侵入を促進することもできる。本明細書に開示した発見に基づいて、様々な治療的及び予防的可能性と手法が、当業者に示唆されるであろう。
【０１２６】
例９：実験の手順
例９Ａ：抗体
以下の抗体：ＫＩＭ１８５（抗β２インテグリン、（Ａｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３，２２１７−２２２２，１９９３）、ＡＺＮ−Ｌ１９（抗β２インテグリン、）、ＮＫＩ−Ｌ１５（抗αＬ、（Ｋｅｉｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５，１１４２−１１４７，１９８５））、ＡIIＢ２（抗β１インテグリン、（Ｄａ Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３，６１７−６２２，１９８９））、ＣＢＲ−ＩＣ３／１及びＣＢＲ−ＩＣ３／２（抗ＩＣＡＭ−３（ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７，１１８７−１１９２，１９９３））、ＣＤ１４（ＷＴ１４（））、ＣＤ４（ｗｔ４（））を使用した。抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体ＡＺＮ−Ｄ１及びＡＺＮ−Ｄ２は、ＢＡＬＢ／ｃマウスをＤＣで免疫し、続いて、ハイブリドーマ上清が、蛍光性ビーズの接着アッセイによて測定したＤＣのＩＣＡＭ−３への接着をブロックする能力をスクリーニングすることによって得られた。
【０１２７】
例９Ｂ：細胞
ＤＣは、記載に従って単球から培養した（Ｓａｌｌｕｓｔｏ ａｎｄ Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９，１１０９−１１１８，１９９４；Ｒｏｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０，８２−９３，１９９４）。簡潔に述べれば、接着工程によって、新鮮なＰＢＭＣから単球を単離した。ＩＬ−４（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ；５００Ｕ／ｍＬ）及びＧＭ−ＣＳＦ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ；１０００Ｕ／ｍＬ）の存在下で、単球を７日間培養した。４日目に、新鮮なサイトカインを添加した。７日目に、ＭＨＣクラスI及びII、ＣＤ１ａ、ｐ１５０，９５、及びＣＤ８０の発現のフローサイトメトリー分析によって、培養されたＤＣの表現型を確認した。ＩＣＡＭ−３を発現している安定なＫ５６２トランスフェクタント（Ｋ５６２−ＩＣＡＭ−３）は、記載のごとく（Ｌｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ ８，７１９−７２８，１９９７）エレクトロポレーションによって、１０μｇのＰＣＲＩＩ ＩＣＡＭ−３ Ｒ１プラスミド（Ｄ．Ｓｉｍｍｏｎｓ博士から入手）と２μｇのＰＧＫ−ｈｙｇベクター（ｔｅ Ｒｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ １９９０）でＫ５６２をトランスフェクションすることによって作成した。非活性化Ｔ細胞（＞９０％ ＣＤ３ 陽性）は、記載のごとく（Ｆｉｇｄｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６８，７３−８７，１９８４）、健康なドナーの骨髄からＰＢＭＣの遠心による水力分級によって得た。
【０１２８】
例９Ｃ：放射能標識、免疫沈降、及びタンパク質配列の分析
ラクトペルオキシダーゼ法（Ｐｉｎｋ ａｎｄ Ｚｉｅｇｌｅｒ，１９７９，ｉｎ：Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｌ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ａｎｄ Ｂ Ｐｅｒｎｉｓ，ｅｄｓ．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓ），ｐｐ．１６９−１８０）により、細胞をＮａ１２５Ｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）で表面標識した。４℃で１時間、溶解用緩衝液（１％ ＮＰ−４０、５０ｍＭトリエタノールアミン（ｐＨ７．８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．０２ｍｇ／ｍＬロイペプチン）の中でＤＣを溶解した。４℃で１５分間、１３，０００ｇでの遠心によって、核の破砕物を溶離液から除去した。タンパク質Ａ−セファロースＣＬ−４Ｂビーズに共有結合したｍＡｂとともに、予め清澄にした溶離液を３時間インキュベートした（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）。免疫沈降物を溶解用緩衝液で徹底的に洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉの操作（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ ２２７，６８０６８５，１９７０）変法に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。切り出したタンパク質をトリプシン消化し、生じたペプチドを精製し、Ｅｕｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅ ＢＶ（Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって配列分析を行った。
【０１２９】
例９Ｄ：ＤＣ−ＳＩＧＮをコードするｃＤＮＡの単離及び発現
酸性のグアニジニウムイソチオシアネート−フェノール−クロロホルム操作によって全ＲＮＡを単離した（Ｃｈｏｍｃｚｙｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １６２（１），１５６−９，１９８７）。胎盤ｇｐ１２０結合Ｃ型レクチンをコードするｃＤＮＡは、全ＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲによって、ＤＣから増幅した。ＰＣＲプライマーは、胎盤ｇｐ１２０結合Ｃ型レクチンのヌクレオチド配列（受付番号Ｍ９８４５７、（Ｃｕｒｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２））に基づいており、ヌクレオチド配列（５’から３’）は、以下のとおりである：ＸＦ２９、ＡＧＡＧＴＧＧＧＧＴＧＡＣＡＴＧＡＧＴＧ；ＸＲ１２６５，ＧＡＡＧＴＴＣＴＧＣＴＡＣＧＣＡＧＧＡＧである。ＰＣＲ断片をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）中にクローニングし、配列を決定した。クローニングされたｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、胎盤ｇｐ１２０結合Ｃ型レクチンの配列と同じであった（Ｃｕｒｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。続いて、真核細胞発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ中にｃＤＮＡをクローニングし（ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＤＣ−ＳＩＧＮ））、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｓｅｅｄ ａｎｄ Ａｒｕｆｆｏ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４，３３６５−３３６９，１９８７）を用いて、ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＤＣ−ＳＩＧＮでＣＯＳ７細胞を一過性にトランスフェクトした。
【０１３０】
例９Ｅ：蛍光ビーズ接着アッセイ
以前記載したとおりに（Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９９９ 投稿された）、ＩＣＡＭ−１ＦｃとＩＣＡＭ−３を用いて、カルボキシレートで修飾されたＴｒａｎｓＦｌｕｏｒＳｐｈｅｒｅｓ（４８８／６４５ｎｍ、１．０μｍ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）をコートした。簡潔に述べれば、２０μＬのストレプトアビジン（５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液中５ｍｇ／ｍＬ）を５０μＬのＴｒａｎｓＦｌｕｏｒＳｐｈｅｒｅｓに添加した。３０μＬのＥＤＡＣ（１．３３ｍｇ／ｍＬ）を添加し、混合液を室温で２時間インキュベートした。反応は、１００ｍＭの最終濃度になるようにグリシンを添加することによって停止された。ストレプトアビジンでコートされたビーズをＰＢＳ（５０ｍＭ リン酸、０．９％ ＮａＣｌ ｐＨ７．４）で３回洗浄し、１５０μＬのＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）中に再懸濁した。０．５ｍＬのＰＢＡ中、３７℃で２時間、ビオチン化されたヤギ−抗ヒト抗ＦｃＦａｂ２断片（６μｇ／ｍＬ）とともに、ストレプトアビジンでコートされたビーズ（１５μL）をインキュベートした。ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡで一度ビーズを洗浄し、０．５ｍＬ中、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ融合リガンド（ＩＣＡＭ−１ Ｆｃ、ＶＣＡＭ−１ Ｆｃ；２５０ｎｇ／ｍＬ）とともに、４℃で一晩インキュベートした。リガンドをコートしたビーズを洗浄し、１００μＬのＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ中に再懸濁し、４℃で保存した。ＩＣＡＭ−１ ＦｃとＩＣＡＭ−３ Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片（Ｄ．Ｓｉｍｍｏｎｓ博士が提供）に融合されたタンパク質の細胞外部分からなる。蛍光性ビーズの接着アッセイは、Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら（投稿された）によって記載されたように行った。簡潔に述べれば、Ｔｒｉｓ−Ｓｏｄｉｕｍ−ＢＳＡ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｓｉ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５％ ＢＳＡ；５×１０６細胞／ｍＬ）中に再懸濁した。遮断ｍＡｂ（２０μｇ／ｍＬ）あり／なしで、１０分間室温で、９６ウェルのＶ字底プレート中、５０．０００細胞をプレインキュベートした。リガンドをコートされた蛍光性ビーズ（２０ビーズ／細胞）と様々な刺激／阻害剤を添加し、３７℃で３０分間、懸濁物をインキュベートした。細胞を洗浄し、１００μＬのＴＳＡ中に再懸濁した。ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ ａｎｄ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏ．，Ｏｘｎａｒｄ，ＣＡ）を用いたフローサイトメトリーによって、結合した蛍光性ビーズを有する、細胞のパーセントを測定することによって接着を決定した。
【０１３１】
例９Ｆ：異種細胞クラスタリングアッセイ
ＤＣ、及びＩＣＡＭ−３を発現している細胞間のクラスタリングをフローサイトメトリーによって評価した。ＤＣ、及びＩＣＡＭ−３を発現している細胞（２×１０６細胞／ｍＬ）を、それぞれ、スルフォフルオレセイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；５０μｇ／ｍＬ）とハイドロエチジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；４０μｇ／ｍＬ）により、３７℃で１時間標識した。洗浄後、ＤＣ、及びＩＣＡＭ−３を発現している細胞を混合し（それぞれ５０×１０３細胞）、３７℃でインキュベートした。異なる時点で、細胞をパラホルムアルデヒド（０．５％）で固定し、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ ａｎｄ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏ．，Ｏｘｎａｒｄ，ＣＡ）を用いたフローサイトメトリーによって、異種細胞クラスタリングを測定した。
【０１３２】
ＤＣと非活性化Ｔ細胞間のクラスタリングは、異なる方法によって評価した。ＤＣ（５０×１０３細胞）を、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体ＡＺＮ−Ｄ１とＡＺＮ−Ｄ２（１０ｇ／ｍＬ）あり／なしで、１０分間室温でプレインキュベートした。蛍光色素カルセイン−Ａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；２５μｇ／１０７細胞／ｍＬ、３７℃で３０分間）で標識した同種異系のＰＢＬ（１×１０６細胞）を添加し、細胞混合物を３７℃でインキュベートした。ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ ａｎｄ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏ．，Ｏｘｎａｒｄ，ＣＡ）を用いたフローサイトメトリーによって、結合した蛍光性のＴ細胞を有するＤＣのパーセントを測定することにより、クラスタリングを決定した。
【０１３３】
例９Ｇ：ＤＣ誘導性Ｔ細胞増殖アッセイ
遮断抗体（２０ ｇ／ｍｌ）の存在下で、同種異系の反応性Ｔリンパ球（１００×１０３）をＤＣ−刺激因子（１．５×１０３）に加えた。該細胞を４日間培養した。４日目に、細胞に、１６時間、［３Ｈ］メチル−チミジン（１．５２ＴＢｑ／ｍｍｏｌ／ｍｍｏｌ、０．５μＣｉ／ウェル；Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）をパルスし、取り込み量を定量した。
【０１３４】
例９Ｈ：ＤＣのＨＩＶ−１感染
単球由来のマクロファージ（ＭＤＭ）中で、ＨＩＶＢａ−Ｌを高力価になるまで増殖させた。ＭＤＭに対するウイルス株の滴定から７日後、ｐ２４抗原ＥＬＩＳＡ（（Ｄｉｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｍａｒｎｅｓ ｌａ Ｃｏｑｕｅｔｔｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いてＴＣＩＤ５０を決定し、１０４／ｍＬと推定した。室温で２０分間、抗体（５０μｇ／ｍＬ）とともにプレインキュベートしたＤＣ（５０×１０３）を２時間、（１０５細胞当たり１０３の感染単位という多数の感染で）野生型ＨＩＶＢａ−Ｌをパルスし、洗浄し、ＰＨＡ／ＩＬ−２活性化されたＰＢＭＣ（５０×１０３）とともに共培養した。ＤＣ−Ｔ細胞の共培養から３日及び５日後に、上清を集めて、ｐ２４抗原ＥＬＩＳＡによって、ｐ２４抗原レベルを測定した（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｐａｓｔｅｕｒ、Ｍａｒｎｅｓ ｌａ Ｃｏｑｕｅｔｔｅ，Ｆｒａｎｃｅ）。ＰＢＭＣは、ＩＬ−２（１０Ｕ／ｍＬ）とＰＨＡ（１０μｇ／ｍＬ）の存在下でそれらを培養することによって活性化した。
【０１３５】
例９Ｉ：免疫組織化学的分析
扁桃とリンパ節の凍結切片（８μｍ）を１００％のアセトンで固定化し（１０分）、ＰＢＳで洗浄し、第一の抗体（１０μｇ／ｍＬ）とともに、室温で６０分間インキュベートした。洗浄後、製造者のプロトコールに従って、ＡＢＣ−ＡＰベクタスタインキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いて最終染色を行った。核の染色は、ヘマテインを用いて行った（）。
【０１３６】
【表１】
［配列表］
【表２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト又は他の哺乳動物のような動物における免疫応答を調節するための、特に増加又は抑制するための組成物及び方法に関する。
【０００２】
ある態様では、本発明は、樹状細胞のＴ細胞への接着を調節するための、特に抑制するための組成物及び方法に関する。
【０００３】
より具体的には、本発明の該態様は、Ｔ細胞の表面上のＩＣＡＭ受容体への、樹状細胞の表面上のＣ型レクチン受容体の接着を調節するための、特に抑制するための組成物及び方法に関する。該接着を調節することによって、クラスターの形成及び抗原提示のような樹状細胞−Ｔ細胞相互作用、並びに、例えば、これに依存する一次Ｔ細胞応答が共に影響を受けることができ、免疫応答の調節がもたらされる。
【０００４】
本発明の組成物及び方法は、それ故、特異的な抗原に対する免疫応答に加えて、自己免疫疾患又はアレルギーで起こり得るような、免疫系の疾患によって引き起こされた免疫応答を変化させるために使用し得る。
【０００５】
さらなる態様では、本発明の方法は、さらに、ＨＩＶ感染の治療及び類似の免疫系疾患の治療に加えて、移植片に対する又は移植後の免疫応答を調節するために使用し得る。
【０００６】
別の態様では、本発明は、ヒト又は他の哺乳動物のような動物における免疫応答を調節するための、特に増加させるための化合物、組成物及び方法に関する。
【０００７】
より具体的には、本態様では、特異的な抗原に対する免疫応答は、樹状細胞の表面上のＣ型レクチン受容体に結合できる形態で、前記抗原又はその抗原部分を樹状細胞に提示することによって、生じ、増加され、又は促進される。このようにして提示された抗原は、樹状細胞に入り、続いて、樹状細胞がＴ細胞に抗原を提示することにより、抗原に対する免疫応答、又は増加した免疫応答を惹起する。
【０００８】
本発明のさらなる態様は、前記組成物を用いた、及び／又は上述の方法を具体化した予防手法及び診断手法に関する。
【０００９】
本発明は、樹状細胞のＴ細胞への接着は、樹状細胞の表面上のＣ型レクチン受容体によって媒介されるという驚くべき発見に基づいている。このＣ型レクチンは、Ｔ細胞の表面上にあるＩＣＡＭ受容体に結合するということも明らかとなった。「ＩＣＡＭ受容体」という語は、ＩＣＡＭ−２及びＩＣＡＭ−３受容体の両者を意味し、特にＩＣＡＭ−３受容体を意味する。
【００１０】
本発明は、さらに、既知のＣ型レクチンの阻害剤及び／又はＣ型レクチン受容体に対して誘導された特異的抗体によるような、樹状細胞上の該Ｃ型レクチン受容体の阻害は、Ｔ細胞の樹状細胞への接着を調節、より具体的には抑制することができ、それによって、免疫応答、とりわけ免疫応答の初発段階に影響を与えることができるという発見に基づいている。
【背景技術】
【００１１】
ＷＯ ９６／２３８８２は、樹状細胞及び胸腺上皮細胞の表面上に豊富に発現されているＣ型レクチンドメインを有するマウス及びヒト受容体を記載している。「ＤＥＣ−２０５」と名付けられたマウス受容体は、１０個のＣ型レクチンドメインを含有し、マクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ）と相同性のある、約７．５の等電点を有する２０５ｋＤａのタンパク質として記載されている。
【００１２】
ＷＯ ９６／２３８８２は、さらに、ＤＥＣ−２０５に対するモノクローナル及びポリクローナル抗体を記載している。しかしながら、これらの抗体は、樹状細胞の機能をブロックすることはできなかった。特に、モノクローナル及びポリクローナル抗ＤＥＣ−２０５抗体は、インビトロ（一方向混合リンパ球反応で、抗ＤＥＣ−２０５が同種異系のＴ細胞の増殖を阻害できないことによって決定された）及びインビボ（抗ＤＥＣ−２０５が、インビボ応答を、すなわち、局所的な移植片対宿主（ＧＶＨ）反応で阻害できないことによって決定された）の両者で、樹状細胞とヘルパーＴ細胞間の相互作用を阻害することができなかった。これらの結果は、ＤＥＣ−２０５受容体が、樹状細胞−Ｔ細胞の相互作用（すなわち、接着）に関与しておらず、抗ＤＥＣ−２０５抗体は、免疫応答を調節するために使用することができないということを示唆している。
【００１３】
Ｃｕｒｔｉｓらは、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９（１９９２），ｐ．８３５６−８３６０及びＷＯ ９３／０１８２０中で、ヒト胎盤組織から単離され、クローニングされた非ＣＤ４ｇｐ１２０受容体を記載している。該ｇｐ１２０受容体は、胎盤、骨格筋、脳、神経及び粘膜細胞のような高レベルのＣＤ４を発現していない哺乳類細胞、並びに、腸、胸腺、心臓、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びマクロファージ（但し、肝臓又は腎臓にはない）を含む他の組織及び細胞上に発現されている。ＷＯ ９３／０１８２０の配列番号１及び２に開示されているＣ型レクチンｇｐ１２０受容体のアミノ酸配列は、樹状細胞上に存在することが、今、見出されたＣ型レクチンと高度の配列相同性（＞９８％）を有している。
【００１４】
Ｃｕｒｔｉｓ及びＷＯ ９３／０１８２０は、さらに、該Ｃ型レクチン受容体が、上記細胞／組織のＨＩＶによる感染、すなわち、ビリオンが細胞中に取り込まれる前に、主要なＨＩＶエンベロープである糖タンパク質ｇｐ１２０を結合することによる感染において果たしている役割についてさらに考察している。Ｃ型レクチンｇｐ１２０受容体の阻害は、これらの細胞／組織のＨＩＶ感染を抑制又は阻害し得ることが見出された。適切な阻害剤として、ＷＯ ９３／０１８２０は、マンノース炭水化物、フコース炭水化物、コンカナバリンＡのような植物レクチン、プラジミシンＡ（ｐｒａｄｉｍｉｃｉｎ Ａ）のような特異的抗生物質、並びに（効力がより弱いと記載されているが）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及びガラクトースのような糖を開示している。それらを含有するこれらの化合物及び組成物は、ＨＩＶの細胞表面への結合を阻害するために、インビトロ又はインビボの何れかで使用される。
【００１５】
ＷＯ ９３／０１８２０は、さらに、ＣＯＳ−７細胞へのＨＩＶの結合が、ｇｐ１２０を抗ｇｐ１２０モノクローナル抗体（「抗体１１０．１」と名付けられた）とプレインキュベートすることによって阻害され得ることを開示している。しかしながら、本抗体は、Ｃ型レクチンではなく、ｇｐ１２０タンパク質に対して誘導されている。
【００１６】
しかしながら、Ｃｕｒｔｉｓ及びＷＯ ９３／０１８２０は、何れも、樹状細胞上にこのようなＣ型レクチンが存在することを記載し、又は示唆していないのみならず、これらの参考文献は、免疫応答における初発段階中の樹状細胞−Ｔ細胞の相互作用におけるそれらの役割についても記載又は示唆していない。
【００１７】
ＷＯ ９５／３２７３４は、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）架橋（又はクロスリンキング）組成物、及び特異的な抗原に対する免疫応答の調節におけるそれらの使用を記載している。この参照文献は、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）上のＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）分子の架橋は、必須の共同刺激分子Ｂ７−１／２の発現を損ない（すなわち、それらのアップレギュレーションを阻止する）、それによって、接着分子ＩＣＡＭ−３の発現を損なわせ（すなわち、接着分子ＩＣＡＭ−３のダウンレギュレーションを引き起こす）、抗原特異的なＴ細胞の活性化を共同刺激（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅ）する単球の能力が損なわれるという機能的結果がもたらされる（すなわち、抗原特異的なＴ細胞の非応答性の調節がもたらされる）。架橋剤は、凝集したヒトＩｇＧ分子、又はそのＦｃ断片；ＦｃγＲＩＩに対するニ価又は多価モノクローナル抗体又はその断片、又は二以上のヒトＩｇＧ Ｆｃ部分の融合物から選択される。
【００１８】
ＷＯ ９５／３２７３４は、それ故、とりわけ、エフェクター細胞への増殖及び成熟化を誘導するために、Ｔ細胞の活性化に必要とされる共同刺激シグナル（すなわち、ＴｃＲ／ＣＤ３相互作用の初発シグナルの他に）を調節する（すなわち、阻害する）ことに関している。ＷＯ ９５／３２７３４は、樹状細胞−Ｔ細胞の接着を調節することには関しておらず、樹状細胞（の表面）上にＣ型レクチンが存在することも、Ｔ細胞上のＩＣＡＭ−３受容体とのそれらの相互作用も開示又は示唆していない。
【００１９】
ＷＯ ９８／０２４５６は、刺激されたヒトマクロファージライブラリーから単離されたII群ヒトＣ型レクチンを開示している。ＷＯ ９８／４９３０６は、ヒト膵炎関連タンパク質（ＰＡＰ；ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）中に存在するIV群Ｃ型レクチンを開示している。ＷＯ ９８／４１６３３は、ヒト腫瘍クローンから単離されたV群ヒトＣ型レクチンを開示している。
【００２０】
ＷＯ ９８／０２４５６、ＷＯ ９８／４９３０６、及びＷＯ ９８／４１６３３は、さらに、これらのＣ型レクチンに対する抗体を製造する方法を開示している。
【００２１】
しかしながら、これらの参照文献は、何れも、樹状細胞上のＣ型レクチンに関しておらず、これらの参照文献に開示されたＣ型レクチンは、由来、生物学的機能、及び構造において、それらに記載されているＣ型レクチンとは異なっている。
【００２２】
樹状細胞（ＤＣ）は、抹消組織中の抗原を捕捉し、リンパ又は血液を介して、排出（ｄｒａｉｎｉｎｇ）リンパ節及び脾臓のＴ細胞領域に移動する専門の抗原提示細胞である。ここで、それらは、加工された抗原をナイーブＴ細胞に提示し、抗原特異的な一次Ｔ細胞応答を開始する。
【００２３】
身体表面における免疫監視細胞としてのそれらの地位のため、ＤＣは、粘膜暴露後、ＨＩＶに感染する最初の細胞であるように思われ、それ故、ＨＩＶの免疫的な病因で重要な役割を果たしていると推定されている。原発性サル免疫不全ウイルスを感染させたマカクをモデル系として用いて、インビボで実証されたように（Ｓｐｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９６）（Ｊｏａｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７）、現在では、ＨＩＶは、リンパ節に侵入し、ＣＤ４＋ Ｔ細胞に接近するために、ＤＣの正常な移動過程を変化せしめると一般的に信じられている。ＤＣのＨＩＶによる増殖性感染が、幾人かの研究者によって報告されており（Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２（４），２７３３−７，１９９８）（Ｂｌａｕｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ ３（１２），１３６９−７５．１９９７．）、相当の証拠が、インビトロでＨＩＶを規則的に与えたＤＣをＴ細胞と共に培養すると、強い感染を引き起こし得ることを示している（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７（５０６８），３８３−７，１９９２）．同様のシナリオが、ＨＩＶに感染した個体に起こっているかどうかは未だ不明確であるが、ＤＣからＴ細胞へのＨＩＶ−１の伝達は、ＡＩＤＳで観察されるＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇に寄与し得るかもしれない。ＨＩＶ−ＤＣの相互作用を研究することは、ＨＩＶ感染の初期の出来事を理解するのに寄与するはずであり、おそらくは、伝達における初期の出来事をブロックすることを目的とした戦略に導くであろう。さらなる考察については、ＷＯ ９５／３２７３４及びＷＯ ９６／２３８８２も参照される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１） 動物、特にヒト又は他の哺乳動物の免疫応答を調節、特に抑制するための組成物の調製における樹状細胞の表面上のＣ型レクチン（但し、該Ｃ型レクチンは、ＤＥＣ−２０５受容体ではない）に結合する化合物の使用。
（項目２） 樹状細胞とＴ細胞間の一以上の相互作用を調節するための、特に抑制するための組成物の調製における項目１に記載の使用。
（項目３） 樹状細胞とＴ細胞間の接着、特に樹状細胞の表面上のＣ型レクチンとＴ細胞の表面上のＩＣＡＭ受容体、特にＴ細胞の表面上のＩＣＡＭ−２又はＩＣＡＭ−３受容体間の接着を調節するための、特に抑制するための組成物の調製における項目１及び／又は２に記載の使用。
（項目４） 特異的な抗原に対する免疫応答を阻止し、又は阻害するための、免疫寛容を誘導するための、免疫療法のための、免疫抑制のための、自己免疫疾患の治療のための、及び／又はアレルギーの治療のための組成物の調製における項目１〜３の何れか１項に記載の使用。
（項目５） 樹状細胞のＨＩＶ感染を阻害するための、特に樹状細胞の表面へのＨＩＶ表面タンパク質（すなわち、ｇｐ１２０）の接着を阻害することによって、前記樹状細胞内へのＨＩＶの侵入を阻害するための組成物の調製における樹状細胞の表面上のＣ型レクチンを結合する、又はＣ型レクチンに結合することができる化合物の使用。
（項目６） 感染した樹状細胞から感染していないＴ細胞へのＨＩＶの転移を阻害するための組成物の調製における、樹状細胞の表面上のＣ型レクチンを結合する、又はＣ型レクチンに結合することができる化合物の使用。
（項目７） 動物、特にヒト又は他の哺乳動物の前記抗原に対する免疫応答を調節するための、特に生じさせるための、増加するための、及び／又は促進するための組成物の調製における１）樹状細胞の表面上のＣ型レクチンに結合し、これに付着した化合物：２）抗原又はその断片若しくは一部の組み合わせの使用。
（項目８） 前記抗原が、Ｃ型レクチンに結合することができる化合物に共有結合し、又は融合している項目７に記載の使用。
（項目９） 抗原が、前記抗原、又は感染症（に対するワクチンで使用される）抗原を含有、又は発現する腫瘍細胞に対して免疫応答を生じせしめるために使用することができる癌抗原から選択される項目７又は８に記載の使用。
（項目１０） 樹状細胞の表面上のＣ型レクチンに結合できる化合物が、マンナン及びＤ−マンノースのようなマンノース炭水化物；Ｌ−フコースのようなフコース炭水化物；コンカナバリンＡのような植物レクチン；プラジミシンＡのような抗生物質；Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及びガラクトースのような糖；ｇｐ１２０及びその類縁体又はそれらの断片のようなタンパク質；及び樹状細胞の表面上に発現されたＣ型レクチンに対して誘導された抗体又はその一部、断片、若しくはエピトープからなる群から選択される項目１〜９の何れか１項に記載の使用。
（項目１１） 樹状細胞の表面上のＣ型レクチンが、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質、又はその天然の変異形、又はその均等物である項目１〜９の何れか１項に記載の使用。
（項目１２） 樹状細胞の表面上のＣ型レクチンに結合することができる化合物が、モノクローナル抗体、好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣ型レクチンに対して誘導されたモノクローナル抗体、又はその天然の変異形若しくは均等物；及び／又はその一部、断片、若しくはエピトープである項目１０又は１１に記載の使用。
（項目１３） 配列番号１又は図９のアミノ酸配列を有するＣ型レクチンに対して誘導された抗体、好ましくはモノクローナル抗体、又はその天然の変異形若しくは均等物；及び／又はその一部、断片、若しくはエピトープ。
（項目１４） ＡＺＮ−Ｄ１又はＡＺＮ−Ｄ２の何れかである項目１３に記載の抗体。
（項目１５） 少なくとも一つの項目１３又は１４に記載の抗体と、それ自体公知である少なくとも一つのさらなる担体、賦形剤、アジュバント、及び／又はフォーミュラントを含有する薬学的組成物。
（項目１６） １）樹状細胞の表面上のＣ型レクチンに結合し、これに付着した化合物：２）抗原又はその断片若しくは一部の組み合わせ。
（項目１７） 前記抗原が、Ｃ型レクチンに結合し得る化合物と共有結合し、又は融合している項目１６に記載の組み合わせ。
（項目１８） 抗原が、前記抗原、又は感染症（に対するワクチンで使用される）抗原を含有する、又は発現する腫瘍細胞に対する免疫応答を生じせしめるために使用することができる癌抗原から選択される項目１６又は１７に記載の組み合わせ。
（項目１９） 樹状細胞の表面上のＣ型レクチンに結合できる化合物が、マンナン及びＤ−マンノースのようなマンノース炭水化物；Ｌ−フコースのようなフコース炭水化物；コンカナバリンＡのような植物レクチン；プラジミシンＡのような抗生物質；Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及びガラクトースのような糖；ｇｐ１２０及びその類縁体又はそれらの断片のようなタンパク質；及び樹状細胞の表面上に発現されたＣ型レクチンに対して誘導された抗体又はその一部、断片、若しくはエピトープからなる群から選択される項目１６〜１８の何れか１項に記載の組み合わせ。
（項目２０） 生物学的試料中の樹状細胞の検出における項目１３又は１４に記載の抗体の使用。
（項目２１） 生物学的試料又は培地からの樹状細胞の単離、調製、及び／又は精製における項目１３又は１４に記載の抗体の使用。
（項目２２） 生物学的試料中のＣ型レクチン、特に、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣ型レクチン、又はその天然の変異形、若しくは均等物である；及び／又はその一部、断片、又はエピトープの存在及び／又は発現を決定するためのアッセイにおける項目１３又は１４に記載の抗体の使用。
（項目２３） 生物学的試料又は培地から樹状細胞を生産し、単離し、及び／又は精製する方法であって、
ａ）樹状細胞を含有する生物学的試料又は培地を項目１３又は１４に記載の抗体と接触させる工程と；
ｂ）前記抗体に結合していない細胞から、及び、必要に応じて前記試料又は培地の任意のさらなる構成成分から、前記抗体に結合している細胞を分離する工程とを備え、
必要に応じて、さらに
ｃ）前記抗体から前記抗体に結合している細胞を分離する工程
を備えた方法。
（項目２４） 前記抗体が、カラム又はマトリックスに、（常）磁性ビーズに、又は類似の固相支持体に付着されている項目２３に記載の方法。
（項目２５） 前記生物学的試料が、血液、血漿、又はリンパ液のような生物学的流体である項目２３又は２４に記載の方法。
（項目２６） 項目２３又は２４の方法によって得た樹状細胞。
ＤＣは、非活性化Ｔ細胞と相互作用し、活性化する能力がユニークである。しかしながら、本発明の以前には、ＤＣ−Ｔ細胞接触がどのように開始され、調節されるかについては殆ど不明であった。本明細書では、ＤＣ−Ｔ細胞相互作用におけるＩＣＡＭ−３の役割が調べられている。ＤＣは、ＩＣＡＭ−３に強く接着するが、この接着は、ＬＦＡ−１、αＤ、又は他の全てのインテグリンによっては媒介されないことが実証されている。ＤＣ上の該新規ＩＣＡＭ−３受容体を検索する上で、ＤＣが多く発現しているＣ型レクチン受容体がクローニングされ、ＤＣ−ＳＩＧＮと名付けられた。ＤＣ−Ｔ細胞のクラスタリング及びＴ細胞応答の開始におけるその顕著な役割に加えて、我々は、ＤＣ−ＳＩＧＮが、ＤＣの感染、及びそれに続くＴ細胞へのＨＩＶ−１伝達に関与する主要なＨＩＶ−１受容体であることを発見した。このため、ＨＩＶと非活性化Ｔ細胞は、ＤＣと相互作用するために、類似の高度に発現された受容体を利用する。
【００２５】
第一の側面では、本発明は、動物、特にヒト又は他の哺乳動物の免疫応答を調節するための、特に抑制するための組成物の調製における樹状細胞の表面上のＣ型レクチンを結合する、又はＣ型レクチンに結合できる化合物の使用に関する。
【００２６】
特に、本発明の該側面は、樹状細胞とＴ細胞間の相互作用を調節する、特に阻害するための組成物の調製における、樹状細胞の表面上のＣ型レクチンを結合する、又はＣ型レクチンに結合できる化合物の使用に関する。
【００２７】
より具体的には、本発明の該側面は、樹状細胞とＴ細胞間の接着を調節するための、特に抑制するための組成物の調製における化合物の使用に関する。
【００２８】
特に、本発明の該側面は、樹状細胞の表面上のＣ型レクチンとＴ細胞の表面上のＩＣＡＭ受容体間の接着を調節するための、特に抑制するための組成物の調製における、樹状細胞の表面上のＣ型レクチンを結合する、又はＣ型レクチンに結合できる化合物の使用に関する。
【００２９】
樹状細胞のＴ細胞への結合に関与することが見出されたあるＣ型レクチンのアミノ酸配列が、配列番号１と図９に示されている。該Ｃ型レクチン受容体は、実質的に、Ｃｕｒｔｉｓらによって、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９（１９９２），ｐ．８３５６−８３６０及びＷＯ ９３／０１８２０に記載されたＣ型レクチンｇｐ１２０受容体に類似している。特に、それは、ＷＯ ９３／０１８２０の配列番号１に記載のアミノ酸配列と高度の相同性（＜９８％）を有する。それは、４０４アミノ酸のII群Ｃ型レクチンであり；約４４ｋＤａの見かけの分子量を有し、；細胞質のアミノ末端を含む第一のドメイン（Ｍｅｔ１〜Ａｌａ７６）、タンデムリピートを含む第二のドメイン（Ｉｌｅ７７〜Ｖａｌ２４９）、及びII型膜タンパク質である他の公知のC型レクチンと高度な相同性を有する第三のドメイン（Ｃｙｓ２５３〜Ａｌａ４０４）を有する。さらなる特性決定は、以下に示されている。
【００３０】
本発明では、樹状細胞上の該Ｃ型レクチンは、Ｔ細胞の表面上にあるＩＣＡＭ受容体に結合することが見出された。
【００３１】
従って、本発明の組成物は、樹状細胞とＴ細胞間の相互作用を調節する（すなわち、変化及び／又は修飾する）ために、より具体的には阻害する（すなわち、抑制、及び／又はダウンチューンする）ために使用し得る。
【００３２】
このような相互作用には、例えば、樹状細胞−Ｔ細胞クラスタリング、Ｔ細胞の活性化におけるＴ細胞の樹状細胞への接着が含まれ、さらに、樹状細胞とＴ細胞間の接触に依存する全ての相互作用（直接的な細胞−細胞接触、又は樹状細胞とＴ細胞の近接化の何れかを意味する）が含まれる。
【００３３】
このようなさらなる相互作用には、免疫応答を生じさせるのに関与するプロセス、とりわけ、Ｔリンパ球の一次感作／活性化（すなわち、抗原及び／又はＭＨＣに結合したペプチドのＴ細胞への提示）、及びＴ細胞の共同刺激のような、このような応答の初発段階における免疫応答；並びに化学的なシグナリング、エンドサイトーシス、及び経上皮輸送のようなプロセスを生じせしめるのに関与するプロセスが含まれるが、これらに限定されない。一般的に樹状細胞−Ｔ細胞の相互作用を論述する場合、それらの全ては、本発明の組成物によって影響を受け得、以下の考察、並びにＷＯ ９５／３２７３４及びＷＯ ９６／２３８８２が参照される。
【００３４】
本発明の組成物は、それ故、樹状細胞の免疫制御能力に影響を与えるために；樹状細胞を介した（一次）Ｔ細胞応答を調節、特に抑制するために；及び／又は、一般的に免疫系に影響を与える、特に阻害するために使用され得る。
【００３５】
幾つかの具体的な応用には、特定の抗原に対する免疫応答を阻止又は阻害すること；免疫寛容を誘導すること；免疫療法；例えば、移植の拒絶を阻止するための免疫抑制：甲状腺炎、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、及び自己免疫性糖尿病のような自己免疫疾患の治療；並びにアレルギーの防止又は治療が含まれる。
【００３６】
本発明の組成物には、樹状細胞のＴ細胞への接着又は接近に依存するＴ細胞上にある他の受容体の活性化も調節し得る。さらに、樹状細胞上のＣ型レクチンが、Ｔ細胞上のＩＣＡＭ受容体に結合するという本発明の発見は、樹状細胞とＴ細胞間の相互作用に影響を与えることによって、一般的に免疫系を調節するための新たな戦略又は可能性を開き得る。
【００３７】
さらに、本発明の組成物は、化学物質、ケモカイン及び／又はインターロイキンなどのようなシグナリング因子などの物質、とりわけ、ＨＩＶのようなウイルス粒子の樹状細胞からＴ細胞への移送を阻止又は抑制するために使用され得る。このようにして、本発明の組成物を使用することによって、ＨＩＶの樹状細胞への初期の接着が阻害され得るのみならず、樹状細胞からＴ細胞へのＨＩＶ感染の伝播も阻害され得る。
【００３８】
樹状細胞は、特にＨＩＶ感染の初期段階の間、ＨＩＶの「貯蔵場所（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）」として働き得ると考えられているので、この発見は、特に重要である。本発明の組成物は、それ故、樹状細胞のＨＩＶ感染を阻止するために使用され得るのみならず、樹状細胞が感染した後に、ＨＩＶ感染がＴ細胞に広がるのを抑制することにより、該疾病の過程を遅くするために使用され得る。
【００３９】
Ｔ細胞の、すなわちリンパでの活性化は、ＨＩＶに感染した患者におけるＡＩＤＳの進行に重要な役割を果たしていることも知られている。本発明の組成物は、前記Ｔ細胞の活性化を阻止し、阻害し、又は少なくとも遅延させることにより、該疾病の開始及び/又は進行を遅らせるために使用し得ると考えられている。
【００４０】
それ故、さらなる側面では、本発明は、さらに、樹状細胞のＨＩＶ感染を阻害するための、特に、樹状細胞の表面へのＨＩＶ表面タンパク質（すなわち、ｇｐ１２０）の接着を阻害することにより、前記樹状細胞へのＨＩＶの進入を阻害するための組成物の調製における、樹状細胞の表面上のＣ型レクチンを結合する、又はＣ型レクチンに結合することができる化合物の使用に関する。
【００４１】
本発明は、さらに、感染した樹状細胞から感染していない樹状細胞へのＨＩＶの転移を阻害するための組成物の調製における、樹状細胞の表面上のＣ型レクチンを結合する、又はＣ型レクチンに結合することができる化合物の使用に関する。
【００４２】
本発明の組成物に使用できる化合物には、上記ＷＯ ９３／０１８２０号に記載されているものを含む（これらに限定されない）、それ自体公知であるＣ型レクチンの阻害剤が含まれる。
【００４３】
一般的に、これらは、Ｃ型レクチン、特に、配列番号１／図９のＣ型レクチン、又はその天然の変異形若しくは均等物に結合し得る、又は（好ましくは、可逆的な態様で）接着し得る、又は、これらのリガンドとして働き得る化合物である。例は、マンナン及びＤ−マンノースのようなマンノース炭水化物；Ｌ−フコースのようなフコース炭水化物；コンカナバリンＡのような植物レクチン；プラジミシンＡのような抗生物質；Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及びガラクトースのような糖（効力がより弱いと記載されているが）；並びに、例えば、ファージディスプレー法を用いて同定され得る適切なペプチド模倣化合物及び小薬剤分子である。さらに、ｇｐ１２０のようなタンパク質、及びその類縁体若しくは断片、又は樹状細胞上のＣ型レクチンへの結合能を有する類似のタンパク質に加えて、単離されたＩＣＡＭ受容体と、その一部及び断片を含むその類縁体が使用され得る。このような一部又は断片は、好ましくは、その時になお、樹状細胞の表面上のＣ型レクチンに結合できるようなものであるべきである。
【００４４】
しかしながら、炭水化物の使用は、インビボで迅速に代謝され得るので、通常、治療的観点からすると、より望ましくない。また、コンカナバリンＡ及びプラジミシン抗生物質のような植物のレクチンの使用は、治療環境で、特に、自己免疫疾患及び／又はＨＩＶ感染を有する患者を治療するときに、不利な点を有し得る。
【００４５】
好ましくは、ＷＯ ９３／０１８２０に記載されているような、一以上の生理的に耐えられる及び／又は薬学的に許容され得る化合物が使用される。例えば、ｇｐ１２０又はその誘導体の使用は、特に、神経系に望ましくない副作用を引き起こし得る（ＷＯ ９３／０１８２０）。
【００４６】
それ故、本発明によれば、好ましくは、樹状細胞の表面上に存在する／発現されたＣ型レクチンに対して誘導された抗体、又はその一部、断片、若しくはエピトープが使用される。本明細書において使用される抗体という語には、とりわけ、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ及び一本鎖抗体、並びに断片（Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａ）及びＦａｂ発現ライブラリーが含まれる。さらに、例えば、ＷＯ９８／４９３０６に記載されているような「ヒト化」抗体を使用し得る。
【００４７】
本発明のＣ型レクチンに対するこのような抗体は、以下に記載されているように、又は、ＷＯ ９５／３２７３４、ＷＯ ９６／２３８８２、ＷＯ ９８／０２４５６、ＷＯ ９８／４１６３３、及び／又はＷＯ ９８／４９３０６に記載されているようなそれ自体公知である任意の他の方法で得ることができる。
【００４８】
例えば、必要に応じて、（ウシ血清アルブミン又はスカシガイヘモシアニンのような）免疫原の担体、及び／又は、フロイントのアジュバント、サポニン、ＩＳＣＯＭ’ｓ、水酸化アルミニウム、又は類似のミネラルゲル、又はスカシガイヘモシアニン、又は類似の界面活性物質のようなアジュバントの使用とともに、Ｃ型レクチン、又はその免疫原部分、断片、若しくは融合物を用いてヤギ、ウサギ、ヒツジ、ラット、ブタ、又はマウスのような適切な宿主を免疫することによって、ポリクローナル抗体を取得し得る。必要に応じて、公知のイムノアッセイ手法を用いて（例えば、ここでも、ＷＯ ９６／２３８８２号が参照される）、所望の特性（すなわち、特異性）を有する抗体をスクリーニングする工程を含んでもよい、それ自体公知の方法で、（通常、１〜７日以内に）Ｃ型レクチンに対する免疫応答が生じた後、抗体は、免疫された動物から採取した血液又は血清から単離することができる。
【００４９】
モノクローナルは、ハイブリドーマ及び類似の手法を含む、連続した培養細胞系統を用いて製造され得る。ここでも、実質的には、上記参照文献に記載されているとおりである。
【００５０】
Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、及びＦａｂ断片のようなＦａｂ−断片は、それぞれ、ペプシン又は他のプロテアーゼを用いた抗体の消化、ジスルフィド結合の還元、及びパパインと還元剤による処理によって得られ得る。Ｆａｂ−発現ライブラリーは、例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：１２７５−１２８１の方法によって得られ得る。
【００５１】
好ましくは、樹状細胞上のＣ型レクチンに対するモノクローナル抗体、より具体的には、配列番号１及び２及び図９に示された／コードされたアミノ酸配列を有するペプチドに対するモノクローナル抗体、又は（抗原性のある）その一部が使用される、このようなモノクローナルは、本発明のさらなる側面である。以下、本発明は、本明細書でＡＺＮ−Ｄ１及びＡＺＮ−Ｄ２と称される２つのこのようなモノクローナルによって説明されるが、Ｃ型レクチンに対して同等の特異性を有する類似のモノクローナルも使用し得る。
【００５２】
さらなる側面では、本発明は、樹状細胞上のＣ型レクチンに対する、より具体的には、配列番号１及び２及び図９に示された／コードされたアミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体、好ましくはモノクローナル抗体、又は（抗原性のある）その一部を産生するハイブリドーマのような細胞系統を提供する。本発明の上記モノクローナルＡＺＮ−１及びＡＺＮ−２を産生するハイブリドーマは、１９９９年４月８日、それぞれ（仮）ＥＣＡＣＣ受付番号９９０４００８１８及び９９０４０８１９で、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された。
【００５３】
本発明は、樹状細胞上のＣ型レクチンに対する、より具体的には、配列番号１及び２及び図９に示された（又はコードされたアミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体、好ましくはモノクローナル抗体、又は（抗原性のある）その一部を製造する方法にも関し、該方法は、前記抗体を産生する細胞又は細胞系統を栽培する工程と；細胞培養から抗体を採取／単離する工程を備える。
【００５４】
樹状細胞上のＣ型レクチンに対する（モノクローナル）抗体、及びこのような抗体を産生する細胞又は細胞株は、何れも、これまで本分野で記載されておらず、本発明の新規抗体は、（すなわち、本明細書で開示した薬学的／治療的使用に加えて）広範な応用性を有するものと想定される。（本発明の別の側面を構成する）これらの出願のうち幾つかは、本明細書の開示から、当業者に明らかであろう。
【００５５】
例えば、本明細書の抗体は、組織又は細胞全体の中又は上にあるＣ型レクチンの存在を検出するために、（及び、それにより、その発現を決定するために）、並びに、細胞断片のような他の生物学的試料中、又は細胞調製物中のＣ型レクチンの存在を検出するために使用され得る。このようにして得られた情報は、続いて、本発明の方法又は組成物が、このような組織又は細胞に適用できるかどうかを決定するために使用され得る。続いて、このようにして得られた情報は、本発明の方法又は組成物がこのような組織又は細胞に適用できるかどうかを決定するために（も）使用できる。本発明の抗体は、例えば、血液、血漿、又はリンパ液のような生物学的流体；骨髄、皮膚組織、腫瘍組織などのような組織試料又は細胞試料、又は細胞培養、又は栽培用培地を含む生物学的試料中／からの樹状細胞を（定性的に、及び／又は定量的に）検出し、単離し、精製し、及び／又は製造するためにも使用され得る。
【００５６】
例えば、ロイカフェレース（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｅ）後に蛍光活性化細胞ソーティングを含むＵＳ−Ａ−５，６４３，７８６号に記載された方法のような、生物学的試料から樹状細胞を単離／製造するために現在利用できる数少ない方法は、低い収率と均質でない試料のみを与える極めて扱いにくい多段階操作である。その結果、樹状細胞の入手が限られるため、この重要なクラスの細胞に対する研究が著しく妨げられてきた。
【００５７】
本発明のモノクローナルを用いることによって、より高い収率と高い特異性で樹状細胞を単離し、製造することができる。このような方法では、モノクローナルは、抗体を用いて、生物学的流体から細胞を採集し、単離し、及び／又は精製するための、それ自体公知の方法で使用され得る。
【００５８】
例えば、モノクローナルは、カラム又はマトリックスに、（常）磁性ビーズに、又は類似の固相支持体に付着された後、樹状細胞を含有する生物学的試料又は培地と接触され得る。それ自体は担体に付着しない細胞は、例えば、洗浄することによって、分離又は除去され、その後、樹状細胞は、それ自体公知の方法で担体から分離され、単離される。
【００５９】
また、本発明のモノクローナルは、樹状細胞（及び／又はＣ型レクチン）の存在、及び／又は、生物学的試料中のそれをコードする遺伝子の発現を検出／定量するために使用することができ、ここでも、競合阻害アッセイ又はＥＬＩＳＡタイプのイムノアッセイのような、それ自体公知である抗体の分析のための方法で、抗体を使用することができる。例えば、抗体は、顕微鏡法、フローサイトメトリー及びＦＡＣＳを含む細胞ソーティング手法、（抗体に付着され得る）固相支持体及び／又は検出可能な標識又はマーカーをベースとする手法、（常）磁性ビーズをベースとする手法、又は他の任意の検出、又は抗体を使用できるそれ自体公知のアッセイ手法と組み合わせて使用することができる。（本発明の抗体の他に、抗体をベースとするアッセイ用のそれ自体公知のさらなる成分を全て含有し得る）このようなアッセイ及びキット並びにマニュアル等は、本発明のさらなる側面を構成する。
【００６０】
このように、本発明のモノクローナルは、インビトロ及びインビボの両者で使用するのに、極めて有用な診断及び研究ツールを構成する。考えられる非限定的な応用の分野には、樹状細胞及びそれらの機能及び相互作用の研究：免疫系の研究；滑膜組織及び皮膚組織／皮膚細胞（皮膚樹状細胞）のような細胞、組織、又は生物学的流体中の樹状細胞及び／又はＣ型レクチンの検出；並びに、癌（腫瘍形成及び発達に照射する（ｉｒｒａｄｉｃａｔｅ）ための臨床試験において、樹状細胞がインビボで使用される）及び（例えば、慢性関節リウマチを含む）自己免疫疾患のような生物学的プロセス又は疾病機序において樹状細胞が果たす役割の研究が含まれる。
【００６１】
本発明の抗体が使用できるそれ自体公知の方法及び手法のさらなる記載としては、Ｄ．Ｐ．Ｓｉｔｅｓ，Ａ．Ｉ．Ｔｅｒｒ，Ｔ．Ｇ． Ｐａｒｓｌｏｗ：“Ｂａｓｉｃ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，８ｔｈ Ｅｄ．，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ（１９９４）；Ｉ． Ｒｏｉｔｔ，Ｊ． Ｂｒｏｓｔｏｆ，Ｄ．Ｍａｌｅ“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，２ｎｄ．Ｅｄ．，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ（１９９４）のような一般的なテキストブックが参照され、全て参照文献として本明細書に組み込まれる。抗体及びそれに関連する手法の一般的な使用は、Ｊａｎｅｗａｙ−Ｔｒａｖｅｒｓによる一般的な参照文献集：“Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ”，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎの２．７〜２．１７部に挙げられているものが特に参照される。
【００６２】
本発明の組成物は、ニ以上の上記活性な化合物を含有してもよく、又はこのような化合物は組み合わせて使用してもよい。例えば、抗Ｃ型レクチン抗体は、マンノース又はフコース炭水化物、レクチン類及び／又はプリダミシンＡのような抗生物質と調合することができ、これによって相乗効果が得られるかもしれない。
【００６３】
本発明の組成物は、抗ＬＦ３Ａのような公知の共同阻害化合物；並びに治療すべき状態に応じて、それ自体公知である他の活性成分を含んでもよく、又は組み合わせて使用してもよい。例えば、本発明の組成物は、免疫抑制剤（すなわち、移植の拒絶を抑えるための）、免疫調節剤、抗生物質、自己抗原又はアレルゲン（例えば、ＷＯ ９５／３２３４又はＷＯ９６／２３８８２に記載されているようなもの）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、並びに抗ＨＩＶ剤のような抗ウイルス剤及びＬｅｕ−３ＡのようなＣＤ４に対して誘導された抗体を含むＣＤ４阻害剤のに調合され、又は組み合わせて使用してもよく、同じく、これによって相乗効果を得ることができる。
【００６４】
本発明の組成物は、さらに、好ましくは単位投与量形態で、錠剤、カプセル、粉末、凍結乾燥された調製物、注射用の溶液等のような、それ自体公知の医薬形態を与えるために、公知の担体及び／又はアジュバントを使用して調合することができる。このような医薬形態、それらの使用、及び投与（単又は複投薬形態）、並びにその中で使用するための担体、賦形剤、アジュバント、及び／又はフォーミュラント（ｆｏｒｍｕｌａｎｔ）は、本分野で一般的に公知であり、例えば、ＷＯ ９３／０１８２０、ＷＯ ９５／３２７３４、ＷＯ ９６／２３８８２、ＷＯ ９８／０２４５６、ＷＯ ９８／４１６３３、及び／又はＷＯ ９８／４９３０６に記載されており、全て、本明細書に参照文献として組み込まれる。さらに、調合物（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、ＷＯ ９３／０１８２０に記載されているような、リポソームの形態であり得る。
【００６５】
抗体の医薬調合物、それらの投与、及び使用は、一般的に、ＷＯ ９５／３２７３４、ＷＯ ９６／２３８８２、ＷＯ ９８／０２４５６、ＷＯ ９８／４１６３３、及び／又はＷＯ ９８／４９３０６に記載されている。
【００６６】
本発明の組成物は、必要に応じて、適切な患者情報のパンフレット及び／又は使用上の説明書とともに、さらに、例えば、バイアル、瓶、袋（ｓａｃｈｅｔ）、泡（ｂｌｉｓｔｅｒ）等の中にパッケージしてもよい。
【００６７】
さらなる側面では、本発明は、動物、特に、ヒト又は他の哺乳動物の免疫応答を調節する方法であって、好ましくは上述の組成物の形態で、免疫応答を変化、又は修飾するのに十分な量で、樹状細胞の表面上のＣ型レクチンを結合する、又はレクチンに結合することができる化合物を前記動物に投与することを備えた方法に関する。
【００６８】
該化合物又は組成物は、特に、樹状細胞とＴ細胞の相互作用が変化し、又は修飾されるような量で投与され、さらに具体的には、樹状細胞のＴ細胞への接着が減少するような量で投与される。
【００６９】
本方法は、免疫系の疾患を予防し、及び／又は治療するために、並びに、上述のように、移植の拒絶を予防するために使用できる。
【００７０】
本発明は、さらに、ＨＩＶ感染を予防又は治療する方法であって、ＨＩＶに感染した患者又はＨＩＶに感染するリスクがある人に、ＨＩＶの樹状細胞への接着、とりわけ、ＨＩＶのｇｐ１２０エンベロープタンパク質の、樹状細胞の表面上のＣ型レクチンへの接着が阻害される量で、樹状細胞の表面上のＣ型レクチンを結合する、又はＣ型レクチンに結合することができる化合物を投与することを備えた方法に関する。
【００７１】
本発明は、さらに、ＨＩＶ感染の治療する方法であって、樹状細胞の表面上のＣ型レクチンを結合する、又はＣ型レクチンに結合することができる化合物を、感染した樹状細胞から感染していないＴ細胞へのＨＩＶの転移を阻害する量で、ＨＩＶに感染した患者に投与することを備えた方法にも関する。
【００７２】
さらなる側面では、本発明は、樹状細胞の表面上のＣ型レクチン受容体に結合することができる形態で、前記抗原、又は一以上のその抗原部分を樹状細胞に提示することにより、ヒト又は他の哺乳動物のような動物の、特異的な抗原又は抗原の組み合わせに対する免疫応答を調節するために、とりわけ、免疫応答を生じさせ、増加し、及び／又は促進するために使用される。このように提示された抗原は、樹状細胞に侵入した後、続いて、樹状細胞がＴ細胞に抗原を提示することによって、抗原に対する免疫応答を引き起こす。
【００７３】
「樹状細胞の表面上のＣ型レクチン受容体に結合することができる形態」とは、一般的に、抗原又は抗原性断片が、上記化合物／リガンド又はその一部のような、樹状細胞の表面上のＣ型レクチンに結合し得る化合物、リガンド、又は残基（ｒｅｓｉｄｕ）に付着していることを意味する。前記付着は、例えば、（好ましくは共有）結合、リガンド−リガンド相互作用、複合体形成、連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）、タンパク質の融合（例えば、前記融合物の発現を介した）、又は他の任意の種類の物理的又は化学的相互作用、またはＣ型レクチンに対するリガンドと共に、抗原を樹状細胞に提示することができる結合、すなわち安定な又は準安定な部分（ｅｎｔｉｔｙ）に結合されることにより得る。
【００７４】
例えば、抗原は、上述のマンノース及びフコース炭水化物と共に、共有結合した基又は側鎖として与えられ得る；コンカナバリンＡのような植物レクチン又はプラジミシンＡのような抗生物質に共有結合され得る；又は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及び（より好ましくないが）ガラクトースのような糖残基とともに与えることができ、これらは全て、抗原を樹状細胞に「誘導（ｄｉｒｅｃｔ）」する役割を果たす。
【００７５】
好ましくは、抗原は、ｇｐ１２０及びその類縁体、若しくはＩＣＡＭ受容体及びその類縁体のようなＣ型レクチンに対するリガントに結合できる、若しくはリガンドとして働き得るタンパク質に、又はこのようなタンパク質の断片の一部に付着される（例えば、融合され、又は共有結合される）。あるいは、抗原は、Ｃ型レクチンに対して誘導された抗体、好ましくは、上述のＡＺＮ−Ｄ１及びＡＺＮ−Ｄ２のようなモノクローナル抗体に；又は、上記したこのような抗体の一部若しくは断片に付着（例えば、融合又は共有結合）することができる。
【００７６】
抗原は、それに対する（増加した）免疫応答が得られる任意の抗原、又は任意のその一部若しくは断片であり得る。好ましくは、任意のこのような断片の一部は、それ自体、エピトープのような、免疫反応を引き起こし（ｉｌｌｉｃｉｔｉｎｇ）得るようである。しかしながら、本発明によれば、断片は、樹状細胞に対して誘導されている、すなわち増加した特異性又は親和性を有しており、本来免疫応答を引き起こすことができないであろう部分断片が、本明細書に記載したＣ型レクチンに対するリガンドと共に使用すると免疫応答を与え得るので、これは必要とされない。一般的には、Ｃ型レクチンに対するリガントと共に抗原を使用すると、抗原の効力を増加させ得る、すなわち投与される抗原の単位量当たり、より高い又は強い免疫応答を与え得る。このように、（血清又はワクチン中に存在するもののみならず、所望の抗原をコードするレトロウイルスも含む）抗原は、より低い投薬で投与しながらも、十分な免疫応答を与えることができる。
【００７７】
適切な抗原の例は、ｇｐ１００、ｇ２５０、ｐ５３、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＭＡＲＴ １、チロシナーゼ関連タンパク質II、及びチロシナーゼ関連タンパク質を含む癌抗原であり、これらは全て、前記抗原を含有する又は発現する腫瘍細胞に対する免疫応答を生じさせるために使用できる。本発明に使用できる他の種類の抗原には、インフルエンザ、おたふく風邪、麻疹、風疹、ジフテリア、破傷風、ヘモフィラス・インフルエンザ（例えば、ｂ型）、ナイセリア、ボルデテラ・パーチュシス、ポリオミレタス、インフルエンザウイルス、及びニューモコッカスのような微生物の感染に起因する（感染性）疾病、及び、一般的には、寄生虫の、原生動物、及び／又はＨＩＶ及びヘルペスのようなウイルス感染も含む、それに対するワクチンを開発することができる、又は想定することができる他の任意の感染又は疾病に対するワクチンに使用される実質的に全ての抗原が含まれる。血清又はワクチンを与えるために、本発明の化合物は、さらにそれ自体公知の他の抗原と組み合わせ得る。
【００７８】
本発明の該側面は、それ故、動物、特にヒト又は他の哺乳動物の前記抗原に対する免疫応答を調節するための、特に、生じさせるための、増加するための、及び／又は促進するための組成物の調製における、１）樹状細胞の表面上のＣ型レクチンに結合し、これに付着した化合物：２）抗原又はその断片若しくは一部の組み合わせの使用に関する。
【００７９】
それ自体本発明の別の側面を構成する、（例えば、複合体、化学物質又は部分、又は融合タンパク質若しくはタンパク質構造の形態である）これらの組み合わせは、同じく、上述のようなそれ自体公知の方法で調合し、投与することができる。
【００８０】
上記方法、態様では全て、使用される化合物／組成物は、治療的に有効な量で（用語の参照は、一般的に、ＷＯ ９３／０１８２０、ＷＯ ９５／３２７３４、及び／又はＷＯ ９６／２３８８２に対してなされる）投与されるであろう。投与は、単回投与であり得るが、好ましくは、一日、一週間、又は一ヶ月以上にわたって行われる複数回投与治療計画の一部である。
【００８１】
本明細書で使用される全ての用語は、当分野における通常の意味であり、とりわけ、同様に適用された、ＷＯ ９３／０１８２０、ＷＯ ９５／３２７３４、ＷＯ ９６／２３８８２、ＷＯ ９８／０２４５６、ＷＯ ９８／４１６３３、及び／又はＷＯ ９８／４９３０６で与えられた定義を参照することができる。
【００８２】
さらに、本明細書において、本発明は、本明細書に開示された特定の４４ｋＤａのＣ型レクチン受容体に関して記載されているが、配列番号１及び図９の配列の天然の変異形を含む他の、一般的に類似したＣ型レクチンが、樹状細胞上に存在してもよく、及び／又は樹状細胞−Ｔ細胞相互作用に関与し得ることが排除されるわけではない。このような変異形は、通常、本明細書に開示した特定のＣ型レクチンと高度のアミノ酸相同性（８０％超〜９０％超）を有し、及び／又は機能的に等価であろう。任意のこのような受容体は、一般的に、本明細書に記載されたものと類似の特性を示すであろう；とりわけ、該受容体の阻害は、炭水化物阻害剤又は特異抗体の何れかによって、樹状細胞／Ｔ細胞相互作用の変化をもたらすであろう。任意のこのような変異形受容体は、しかしながら、ＷＯ ９６／２３８８２に開示されたＣ型レクチン受容体とは区別されなければならず、その阻害は、樹状細胞とＴ細胞の相互作用の阻害をもたらさない。
ここで、本発明は、以下に示された実験の部、及び図によってさらに説明されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１Ａ】図１Ａ−１Ｃは、白血球のＩＣＡＭ−１とＩＣＡＭ−３への自発的接着（図１Ａ）；β２−インテグリンの活性化後の、白血球のＩＣＡＭ−３への接着（図１Ｂ）；β２−インテグリン（ＮＫＩ−Ｌ１９）、β１−インテグリン（ＡIIＢ２）、ＩＣＡＭ−３（ＣＢＲ−ＩＣ３／１、ＣＢＲ−ＩＣ３／２）に対する遮断抗体（２０μｇ／ｍＬ）の存在下、又はＥＤＴＡ（５ｍＭ）若しくはＥＧＴＡ（５ｍＭ）の存在下でのＤＣのＩＣＡＭ−３への接着（図１Ｃ）を示すグラフである。
【図１Ｂ】図１Ａ−１Ｃは、白血球のＩＣＡＭ−１とＩＣＡＭ−３への自発的接着（図１Ａ）；β２−インテグリンの活性化後の、白血球のＩＣＡＭ−３への接着（図１Ｂ）；β２−インテグリン（ＮＫＩ−Ｌ１９）、β１−インテグリン（ＡIIＢ２）、ＩＣＡＭ−３（ＣＢＲ−ＩＣ３／１、ＣＢＲ−ＩＣ３／２）に対する遮断抗体（２０μｇ／ｍＬ）の存在下、又はＥＤＴＡ（５ｍＭ）若しくはＥＧＴＡ（５ｍＭ）の存在下でのＤＣのＩＣＡＭ−３への接着（図１Ｃ）を示すグラフである。
【図１Ｃ】図１Ａ−１Ｃは、白血球のＩＣＡＭ−１とＩＣＡＭ−３への自発的接着（図１Ａ）；β２−インテグリンの活性化後の、白血球のＩＣＡＭ−３への接着（図１Ｂ）；β２−インテグリン（ＮＫＩ−Ｌ１９）、β１−インテグリン（ＡIIＢ２）、ＩＣＡＭ−３（ＣＢＲ−ＩＣ３／１、ＣＢＲ−ＩＣ３／２）に対する遮断抗体（２０μｇ／ｍＬ）の存在下、又はＥＤＴＡ（５ｍＭ）若しくはＥＧＴＡ（５ｍＭ）の存在下でのＤＣのＩＣＡＭ−３への接着（図１Ｃ）を示すグラフである。
【図２Ａ】図２Ａ−２Ｃは、抗体ＡＺＮ−Ｄ１とＡＺＮ−Ｄ２が、ＤＣのＩＣＡＭ−３への接着を阻害し、ＤＣによって特異的に発現されている抗原を認識することを示しているグラフである。
【図２Ｂ】図２Ａ−２Ｃは、抗体ＡＺＮ−Ｄ１とＡＺＮ−Ｄ２が、ＤＣのＩＣＡＭ−３への接着を阻害し、ＤＣによって特異的に発現されている抗原を認識することを示しているグラフである。
【図２Ｃ】図２Ａ−２Ｃは、抗体ＡＺＮ−Ｄ１とＡＺＮ−Ｄ２が、ＤＣのＩＣＡＭ−３への接着を阻害し、ＤＣによって特異的に発現されている抗原を認識することを示しているグラフである。
【図２Ｄ】図２Ｄである。
【図３Ａ】図３Ａと３Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３Ａ）及びヒトＤＣから単離されたＤＣ−ＳＩＧＮの図示（３Ｂ）から分かるように、ＤＣ−ＳＩＧＮがヒト胎盤ＨＩＶｇｐ１２０結合Ｃ型レクチンと同一であることを示している。
【図３Ｂ】図３Ａと３Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３Ａ）及びヒトＤＣから単離されたＤＣ−ＳＩＧＮの図示（３Ｂ）から分かるように、ＤＣ−ＳＩＧＮがヒト胎盤ＨＩＶｇｐ１２０結合Ｃ型レクチンと同一であることを示している。
【図４Ａ】図４Ａと４Ｂは、ＣＯＳ７細胞で過剰発現されたＤＣ−ＳＩＧＮが、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体ＡＺＮ−Ｄ１によって認識され、ＩＣＡＭ−３に結合することを示している。
【図４Ｂ】図４Ａと４Ｂは、ＣＯＳ７細胞で過剰発現されたＤＣ−ＳＩＧＮが、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体ＡＺＮ−Ｄ１によって認識され、ＩＣＡＭ−３に結合することを示している。
【図５】図５は、扁桃（ＡとＢ）及びリンパ節（ＣとＤ）切片におけるＤＣ−ＳＩＧＮの発現の免疫組織化学的な分析によって決定されたＤＣ−ＳＩＧＮの組織分布を示している（ＯＭ×１００）。
【図６Ａ】図６Ａ−６Ｄは、ＤＣ−ＳＩＧＮを介したＤＣのＩＣＡＭ−３への接着（図６Ａ）；ＤＣとＫ５６２−ＩＣＡＭ−３細胞との異種（ｈｅｔｅｒｏｔｙｐｉｃ）細胞クラスタリング（図６Ｂ）；非活性化ＰＢＬとＤＣとの動的な細胞クラスタリング（図６Ｃ）；及びＤＣ誘導性のＴ細胞増殖で果たしているＤＣ−ＳＩＧＮ−ＩＣＡＭ−３相互作用の役割（図６Ｄ）によって実証されているように、ＤＣ−ＳＩＧＮを介したＤＣのＩＣＡＭ−３への接着が、ＤＣ−Ｔリンパ球の相互作用に関与していることを示している。
【図６Ｂ】図６Ａ−６Ｄは、ＤＣ−ＳＩＧＮを介したＤＣのＩＣＡＭ−３への接着（図６Ａ）；ＤＣとＫ５６２−ＩＣＡＭ−３細胞との異種（ｈｅｔｅｒｏｔｙｐｉｃ）細胞クラスタリング（図６Ｂ）；非活性化ＰＢＬとＤＣとの動的な細胞クラスタリング（図６Ｃ）；及びＤＣ誘導性のＴ細胞増殖で果たしているＤＣ−ＳＩＧＮ−ＩＣＡＭ−３相互作用の役割（図６Ｄ）によって実証されているように、ＤＣ−ＳＩＧＮを介したＤＣのＩＣＡＭ−３への接着が、ＤＣ−Ｔリンパ球の相互作用に関与していることを示している。
【図６Ｃ】図６Ａ−６Ｄは、ＤＣ−ＳＩＧＮを介したＤＣのＩＣＡＭ−３への接着（図６Ａ）；ＤＣとＫ５６２−ＩＣＡＭ−３細胞との異種（ｈｅｔｅｒｏｔｙｐｉｃ）細胞クラスタリング（図６Ｂ）；非活性化ＰＢＬとＤＣとの動的な細胞クラスタリング（図６Ｃ）；及びＤＣ誘導性のＴ細胞増殖で果たしているＤＣ−ＳＩＧＮ−ＩＣＡＭ−３相互作用の役割（図６Ｄ）によって実証されているように、ＤＣ−ＳＩＧＮを介したＤＣのＩＣＡＭ−３への接着が、ＤＣ−Ｔリンパ球の相互作用に関与していることを示している。
【図６Ｄ】図６Ａ−６Ｄは、ＤＣ−ＳＩＧＮを介したＤＣのＩＣＡＭ−３への接着（図６Ａ）；ＤＣとＫ５６２−ＩＣＡＭ−３細胞との異種（ｈｅｔｅｒｏｔｙｐｉｃ）細胞クラスタリング（図６Ｂ）；非活性化ＰＢＬとＤＣとの動的な細胞クラスタリング（図６Ｃ）；及びＤＣ誘導性のＴ細胞増殖で果たしているＤＣ−ＳＩＧＮ−ＩＣＡＭ−３相互作用の役割（図６Ｄ）によって実証されているように、ＤＣ−ＳＩＧＮを介したＤＣのＩＣＡＭ−３への接着が、ＤＣ−Ｔリンパ球の相互作用に関与していることを示している。
【図７】図７は、ＤＣ ＳＩＧＮが、ＤＣ上のＨＩＶ−１に対する受容体であることを示している。
【図８】図８は、ＤＣ ＳＩＧＮが、ＩＣＡＭ−３とＩＣＡＭ−３を発現しているＫ５６２細胞の両者に結合することを示している。
【図９】図９は、ＤＣ−ＳＩＧＮの配列を示している。
【実施例】
【００８４】
実験
樹状細胞（ＤＣ）は、抗原を捕捉し、それらがナイーブＴ細胞に抗原を提示する場所である二次リンパ組織に移動する。ＨＩＶ−１は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に接近するために、このユニークな能力を破壊する。本発明では、ＩＣＡＭ−２及び／又はＩＣＡＭ−３に高い親和性で結合するのみならず、ＨＩＶ−１にも結合することができるＤＣ特異的なＣ型レクチンがクローニングされ、ＤＳ−ＳＩＧＮと名付けられた。また、一過性のＤＣ−Ｔ細胞相互作用とＤＣ誘導性のＴ細胞の増殖を阻害するのみならず、ＤＣのＨＩＶ−１感染も効率的に阻害する抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体が開発された。これらの発見は、ＣＤ４非依存性のＨＩＶのＤＣ中への侵入に対する理解に重要な結果を有するのみならず、一次免疫応答の開始におけるＤＣ−ＳＩＧＮの役割に新たな光を投じる。
【００８５】
例１：ＤＣのＩＣＡＭ−３への接着はインテグリンによって媒介されない
最初のＤＣ−Ｔ細胞接触におけるＩＣＡＭ−３を介した接着の役割を調べた。ＩＣＡＭ−３−Ｆｃキメラをコートした蛍光ビーズ（Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ ｅｔ ａｌ．）を含む新規なフローサイトメトリー接着アッセイを利用して、ＤＣ、非活性化末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、及び単球がこのインテグリンリガンドに結合する能力をテストした。ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦの存在下で、７日間単球を培養した後に得られた、未成熟なＤＣは、予めβ２インテグリンの活性化がなくても、強固にＩＣＡＭ−３を結合する（７２％、図１Ａ）。図１は、ＤＣのＩＣＡＭ−３への接着が、Ｃａ２＋依存性であり、インテグリン非依存性であることを実証している：図１Ａ、Ｂ、及びＣには、少なくとも３つの実験のうち代表的な実験が１つ示されている（ＳＤ＜５％）。
【００８６】
−１Ａ：ＩＣＡＭ−１及びＩＣＡＭ−３への白血球の自発的な接着。単離したばかりのＰＢＬ、単球、及びＤＣを、ＩＣＡＭ−１Ｆｃ又はＩＣＡＭ−３Ｆｃ蛍光ビーズのうち何れかとともに、３０分間、３７℃でインキュベートした。洗浄後、フローサイトメトリーによって、ビーズに結合した細胞のパーセントを決定した。
【００８７】
−１Ｂ：β２−インテグリンの活性化後の、白血球のＩＣＡＭ−３への接着。蛍光性ＩＣＡＭ−３Ｆｃビーズの結合を、ＰＭＡ（９８０ｎＭ）又は活性化抗β２インテグリン抗体ＫＩＭ１８５（１０μｇ／ｍＬ）のうち何れかの存在下において、３０分後に３７℃でインキュベートした。ＰＭＡ活性化後に、遮断抗ＬＦＡ−１抗体ＮＫＩ−Ｌ１５（２０μｇ／ｍＬ）の存在下で、ＬＦＡ−１特異的な接着の阻害を測定した。
【００８８】
−１Ｃ：β２−インテグリン（ＮＫＩ−Ｌ１９）、β１−インテグリン（ＡＩＩＢ２）、ＩＣＡＭ−３（ＣＢＲ−ＩＣ３／１、ＣＢＲ−ＩＣ３／２）に対する遮断抗体（２０μｇ／ｍＬ）の存在下での、又はＥＤＴＡ（５ｍＭ）若しくはＥＧＴＡ（５ｍＭ）の存在下でのＤＣのＩＣＡＭ−３への接着。該接着は、図１Ａに記載されているように決定された。
【００８９】
ＤＣのＩＣＡＭ−３へのこの自発的結合は、単球のそれよりも強力であるのに対して、非活性化ＰＢＬは、ほとんどＩＣＡＭ−３を結合しない（図１Ａ）。ＤＣのＩＣＡＭ−３への接着は、何れの抗αＬ又は抗β２インテグリン抗体によってもブロックすることはできなかった（図１Ａ）。対照的に、接着は、抗αＬ抗体によってブロックされないので、ＩＣＡＭ−３への単球の接着はＬＦＡ−１依存的である（図１Ａ）。他のβ２インテグリンメンバー（αＤβ２、αＭβ２、αＸβ２、データは示さず）に対して誘導された抗体も、他のインテグリン（β１、β７インテグリン、図１Ｂ）に対して誘導された抗体もＤＣのＩＣＡＭ−３への接着をブロックしなかったので、ＤＣのＩＣＡＭ−３への結合は、インテグリン非依存性であると結論付けた。
【００９０】
本発明の抗ＩＣＡＭ−３抗体ＣＢＲ３／１、ＣＢＲ３／２及び両抗体の組み合わせは、かなりの程度、接着を阻害することができるので（図１Ｂ）、ＤＣとＩＣＡＭ−３−Ｆｃビーズの相互作用は、ＩＣＡＭ−３特異的である。興味深いことに、ＤＣのＩＣＡＭ−３への接着は、ＥＤＴＡとＥＧＴＡによって完全にブロックされ得る（図１Ｂ）。これらの発見は、ＤＣが、β１又はβ２インテグリンファミリーに属していないＣａ２＋依存性の表面受容体を介してＩＣＡＭ−３に結合することを強く示唆している。この分子は、ＤＣ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩＣＡＭ−３ Ｇｒａｂｂｉｎｇ Ｎｏｎ−ｉｎｔｅｇｒｉｎ（ＤＣ−ＳＩＧＮ）と名付けられた。
【００９１】
例２：ＤＣ−ＳＩＧＮに対する抗体は、ＤＣ−ＩＣＡＭ−３相互作用を阻害する
ＤＣ−ＳＩＧＮをより詳細に調べるために、ＩＣＡＭ−３結合受容体に対する抗体を産生せしめた。ＤＣで免疫したマウスの脾臓をＳＰ２／０ミエローマ細胞と融合し、ＤＣ特異的なＩＣＡＭ−３への接着を阻害することができる抗体の存在について、得られたハイブリドーマの上清をスクリーニングした。２つのハイブリドーマを選択し、クローニングし、得られた抗体をＡＺＮ−Ｄ１及びＡＺＮ−Ｄ２と名付けた。精製された両抗体は、ＤＣのＩＣＡＭ−３への接着を強く阻害するが、ＬＦＡ−１を介した単球のＩＣＡＭ−３への接着には影響を与えない（図２Ａ）。図２は、抗体ＡＺＮ−Ｄ１とＡＺＮ−Ｄ２が、ＤＣのＩＣＡＭ−３への接着を阻害し、ＤＣによって特異的に発現されている抗原を認識することを実証している。
【００９２】
−２Ａ：モノクローナル抗体ＡＺＮ−Ｄ１とＡＺＮ−Ｄ２（２０μｇ／ｍＬ）は、ＤＣの蛍光性ＩＣＡＭ−３Ｆｃビーズへの接着をブロックするが、単離したばかりの単球の接着はブロックしない。少なくとも３つの実験のうち、代表的な実験が示されている（ＳＤ＜５％）。
【００９３】
−２Ｂ：ＤＣ−ＳＩＧＮの発現は、ＤＣの発達中に増加した。ＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下で単球から培養した。異なる時点で、単球マーカーＣＤ１４、β２インテグリンＬＦＡ−１、及びＤＣ−ＳＩＧＮの発現について、発達中のＤＣを分析した。細胞は、フォワード側の散乱でゲートされ、ヒストグラムの右上隅に平均蛍光が示されている。３つの実験のうちの代表的な実験が示されている。
【００９４】
−２Ｃ：ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下で、単球から発育しているＤＣは、ＤＣ−ＳＩＧＮ依存性の態様で、次第に多くのＩＣＡＭ−３に結合する。培養中の異なる時点で、細胞を採集し、遮断抗β２−インテグリン抗体ＡＺＮ−Ｌ１９又はＡＺＮ−Ｄ１抗体（２０μｇ／ｍＬ）の存在下で、蛍光ＩＣＡＭ−３Ｆｃビーズとともにインキュベートした。接着は、図１Ａで記載したように決定した。ＡＺＮ−Ｄ２は、ＡＺＮ−Ｄ１と同様に、ＩＣＡＭ−３への接着を阻害した（結果は示されていない）。３つの実験のうち代表的な実験が示されている（ＳＤ＜５％）
【００９５】
−２Ｄ：発育しているＤＣによるβ２インテグリン及びＤＣ−ＳＩＧＮを介したＩＣＡＭ−３への接着の相対的寄与。相対的寄与は、図２Ｃに記載されているように、ＡＺＮ−Ｄ１又はＡＺＮ−Ｌ１９の存在下での接着の阻害から算出される。
【００９６】
フローサイトメトリー分析でＡＺＮ−Ｄ１抗体を使用して、ＤＣ−ＳＩＧＮは、単球によって発現されていないことが実証された（図２Ｂ）。ＤＣ−ＳＩＧＮを発現している細胞は、培養の１日後に、既に検出できる。ＤＣ−ＳＩＧＮの発現レベルは、培養の間に増加する（図２Ｂ）。単球マーカーＣＤ１４の発現は、培養の間、徐々に減少し、７日目には、低いＣＤ１４の発現のみが観察される（図２Ｂ）。さらなるフローサイトメトリー分析によって、７日目に、単球の未成熟なＤＣへの分化と一致して、細胞が、高レベルのＭＨＣクラスI、II、β２インテグリンｐ１５０，９５、及びＣＤ８６も発現していることが実証された（データは示されていない）。これらの結果は、ＤＣ−ＳＩＧＮが７日目にＤＣによって豊富に発現され、発現レベルがＬＦＡ−１のそれより数倍高いことを実証している。
【００９７】
同時に、単球が未成熟なＤＣに分化する間の、ＩＣＡＭ−３結合におけるＤＣ−ＳＩＧＮの関与を調べた（図２Ｃ）。遮断抗β２インテグリン抗体Ｌ１９（図２Ｃ）による接着の阻害によって実証されたように、培養の開始時点で（０日）、単球によるＩＣＡＭ−３への結合は、完全にβ２インテグリン（ＬＦＡ−１）依存性である。第１日目に、低レベルのＤＣ−ＳＩＧＮが発現されると（図２Ｂ）、ＩＣＡＭ−３特異的な接着は、β２インテグリン（ＬＦＡ−１）とＤＣ−ＳＩＧＮの両者に依存する（図２Ｃ）。２日から７日まで、ＩＣＡＭ−３特異的な接着が増加して、β２インテグリン非依存性になり（図２Ｃ）、抗ＤＣ−ＳＩＧＮが該接着を完全にブロックするので、２日目からは、専らＤＣ−ＳＩＧＮによって媒介される。ＤＣ−ＳＩＧＮを介した接着は、７日目に最大に達する（図２Ｃ）。
【００９８】
これらの結果を合わせると、ＤＣ−ＳＩＧＮの発現の増加は、ＩＣＡＭ−３結合の観察された増加と一致することを示している（図２ＡとＢ）。これらの発見から、抗体ＡＺＮ−Ｄ１とＡＺＮ−Ｄ２によって認識されるＤＣ−ＳＩＧＮは、ＤＣによって発現される新規ＩＣＡＭ−３結合受容体であると結論することができる。
【００９９】
例３：ＤＣ−ＳＩＧＮは、４４ｋＤａのタンパク質である。
【０１００】
ＤＣ−ＳＩＧＮの分子量に関する情報を得るために、１２５−表面標識したＤＣの溶解物からＤＣ−ＳＩＧＮを免疫沈降した。還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析によって、単一の４４ｋＤａのタンパク質が明らかとなった（図３Ａ、レーン１−２）。図３は、ＤＣ−ＳＩＧＮが、ヒト胎盤ＨＩＶｇｐ１２０結合Ｃ型レクチンと同一であることを実証している。
【０１０１】
−３Ａ：ＤＣ−ＳＩＧＮは、４４ｋＤａのタンパク質である。ＤＣは、１２５Ｉで表面標識され、溶解され、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体ＡＺＮ−Ｄ１（レーン１）、ＡＺＮ−Ｄ２（レーン２）、及びＡＺＮ−Ｌ１９（抗β２−インテグリン；レーン３）でＤＣ−ＳＩＧＮを免疫沈降した。免疫沈降物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５〜１５％ゲル）、続くオートラジオグラフィーによって分析した（５−１５％）。分子量マーカーの移動は、左側に示されている。矢印は、ＬＦＡ−１（αＬ、１８０ｋＤａ）のα鎖、ＭＡＣ−１（αＭ、１６５ｋＤａ）、及びｐ１５０，９５（αＸ、１５０ｋＤａ）、β２インテグリン鎖（９５ｋＤａ）、及びＤＣ−ＳＩＧＮ（４４ｋＤａ）を示している。同様の結果は、他の３つの実験で得られた。
【０１０２】
−３Ｂ：ヒトＤＣから単離されたＤＣ−ＳＩＧＮの模式図。２つの四角に囲まれたペプチド（ヒト胎盤ｇｐ１２０結合Ｃ型レクチン（）のアミノ酸２９６〜３０６位、及び１８７〜１９７位）が、エドマン分解を用いた、免疫沈降したＤＣ−ＳＩＧｎの内部ペプチド配列決定によって同定された。ＤＣ−ＳＩＧＮをコードするｃＤＮＡは、ＤＣから単離された。推定アミノ酸配列は、ヒト胎盤ｇｐ１２０結合Ｃ型レクチン（）の配列と１００％同じである。膜貫通領域、レクチンドメイン、並びに７つの完全な、及び８つの部分的なリピート（Ｒ１−Ｒ８）が示されている。
【０１０３】
非還元性のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での免疫沈降の分析は、ＤＣ−ＳＩＧＮがモノマーとして存在することを示している（結果は示されていない）。さらに、ＩＣＡＭ−３−Ｆｃコートされたビーズを用いて、ＤＣ溶解物から４４ｋＤａのタンパク質を抽出することができたのに対して、遮断抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体の存在下では、このタンパク質は、ＩＣＡＭ−３−Ｆｃコートされたビーズを用いて沈殿させることができなかった（結果は示されていない）。これらの発見は、ＤＣ−ＳＩＧＮが、還元条件下で、４４ｋＤａのタンパク質としてＤＣによって発現されていることを示している。ＩＣＡＭ−３Ｆｃを結合したビーズが、ＤＣ溶解物から４４ｋＤａのタンパク質のみを抽出したという観察は、ＤＣ−ＳＩＧＮが、同じくＤＣによって発現され（図３Ａ）、ＩＣＡＭ−３を結合すると報告されてきた（Ｖａｎｄｅｒｖｉｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．３，６８３−６９０，１９９５）ＬＦＡ−１又はαＤβ２に比べて、ＩＣＡＭ−３に対して、ずっと高い親和性を有することを示している（図３Ａ）。ＤＣ−ＳＩＧＮと比較して、極めて低量のＬＦＡ−１は、免疫沈降しないので（図３Ａ、レーン１と３）、これは、ＤＣ−ＳＩＧＮが、ＬＦＡ−１に比べてＤＣによって、より豊富に発現されていることを確かめている。総合すると、これらのデータは、ＤＣ−ＳＩＧＮが、４４ｋＤａの単一ポリペプチドであり、ＤＣ上のＩＣＡＭ−３に対する一次的な受容体であることを実証している。
【０１０４】
例４：ＤＣ−ＳＩＧＮが、ヒトＨＩＶｇｐ１２０結合Ｃ型レクチンに同一である
ＤＣ−ＳＩＧＮを同定するために、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体ＡＺＮ−Ｄ１を用いたＤＣ溶解物からの予備的免疫沈降を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから４４ｋＤａタンパク質を切り出した。トリプシン消化後、生じたペプチドをゲルから抽出し、予備的ＨＰＬＣを用いて精製した。続いて、エドマン分解操作を用いて２つのペプチドのアミノ酸配列（０．５〜１ｐｍｏｌ）を決定した。両ペプチドは、１１アミノ酸残基からなり（図３Ｂ）、該ペプチド配列は、公知のタンパク質との相同性をＥＭＢＬデータベースでスクリーニングするために使用された。両ペプチドは、ヒトＨＩＶｇｐ１２０結合Ｃ型レクチンの推定アミノ酸配列（Ｃｕｒｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２）と１００％同一であることが証明された。該タンパク質は、これまでは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０に対するＣＤ４非依存性の受容体として、専ら胎盤だけに同定されていた。
【０１０５】
ｇｐ１２０結合Ｃ型レクチン配列、ＤＣから単離されたＲＮＡに基づくプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ分析は、１２３７ｎｔの長さを有すると予想されるＰＣＲ産物を与えた。ＤＣ特異的なＰＣＲ産物をクローニングし、配列決定によって、ヒトｇｐ１２０結合レクチンと１００％の同一性を確認した（図３Ｂ）。胎盤ｇｐ１２０結合Ｃ型レクチンをコードするｃＤＮＡをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞のフローサイトメトリー分析は、ｇｐ１２０結合Ｃ型レクチンがＤＣ−ＳＩＧＮと実際に同一であることを明確に証明している（図４Ａ）。図４は、ＣＯＳ７細胞中で過剰発現されたＤＣ−ＳＩＧＮは、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体ＡＺＮ−Ｄ１によって認識され、ＩＣＡＭ−３を結合することを示している。
【０１０６】
−４Ａ：ＡＺＮ−Ｄ１は、ＤＣ−ＳＩＧＮをコードするｃＤＮＡをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を認識するが（黒）、モックトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞（白）は認識しない。ＡＺＮ−Ｄ２は、同様の染色を与えた（結果は示されていない）。
【０１０７】
−４Ｂ：ＣＯＳ７−ＤＣ−ＳＩＧＮのＩＣＡＭ−３への接着。ＣＯＳ７細胞にトランスフェクトし、接着は、それぞれ、図１Ａに記載されているように決定した。ＣＳＯ７−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞のＩＣＡＭ−３への接着は、ＥＧＴＡ（５ｍＭ）及びＤＣ−ＳＩＧＮ（ＡＺＮ−Ｄ１）、ＩＣＡＭ−３（ＣＢＲ−ＩＣ３／１、ＣＢＲ−ＩＣ３／２）、及びβインテグリン（ＡＺＮ−Ｌ１９）に対する遮断抗体の存在下で測定した。３つの実験のうち代表的な実験が示されている（ＳＤ＜５％）。トランスフェクトされたＣＯＳ７細胞の約３０％が、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体で染色され、それ故、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現している。さらに、ＣＯＳ７−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞は、ＩＣＡＭ−３を結合することができるのに対して、モックトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞は、ＩＣＡＭ−３を結合することができない（図４Ｂ）。ＣＯＳ７によって発現されたＤＣ−ＳＩＧＮの結合は、ＩＣＡＭ３及びＤＣ−ＳＩＧＮに対する抗体によって完全に阻害され得、ＥＧＴＡは接着を完全にブロックするので、Ｃａ２＋依存性であった（図４Ｂ）。
【０１０８】
ＤＣによって発現されるＩＣＡＭ−３結合受容体（ＤＣ−ＳＩＧＮ）は、４０４のアミノ酸からなり、３つの異なるドメインを有するII型膜貫通タンパク質である胎盤ＨＩＶｇｐ１２０結合Ｃ型レクチン（Ｃｕｒｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９２）と同一であると結論付けられた。４０アミノ酸残基のＮ末端細胞質ドメインは、１５アミノ酸の疎水性のストレッチによって、ほぼ同一の配列の７つの完全なタンデムリピートと１つの不完全なタンデムリピートからなる領域から、分断されている。残りのＣ末端領域（Ｃｙｓ２５３−Ａｌａ４０４）は、Ｃａ２＋依存性（Ｃ型）レクチンと相同性を示している（図３Ｂ）。
【０１０９】
例５：ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＤＣによって特異的に発現されている
ＡＺＮ−Ｄ１／Ｄ２抗体を用いた多岐にわたる造血細胞群のフローサイトメトリー分析は、抗原が、ＤＣによって優先的に発現されていることを実証している（表１）。テストした全ての造血細胞は、ＤＣを除いて、ＤＣ−ＳＩＧＮの発現が陰性であった。さらに、ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＤＣ−ＳＩＧＮをコードするｍＲＮＡが、ＤＣ中で特異的に転写されているのを確認し、これは、ＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質の発現パターンと一致している（表１）。
【０１１０】
ＤＣ−ＳＩＧＮの発現をインビボでさらに調べるために、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体を用いて二次リンパ組織の免疫組織化学的分析を行った。これらの組織は、樹状細胞を含有していることが知られている。扁桃及びリンパ節の切片は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞を含有しており、これは、主として、扁桃とリンパ節の両者のＴ細胞領域中に観察された（図５）。図５は、ＤＣ−ＳＩＧＮの組織分布を示している：扁桃及びリンパ節切片におけるＤＣ−ＳＩＧＮの発現の免疫組織化学的分析（ＯＭ×１００）。切片は、アセトンで固定し、核の染色は、ヘマテインを用いて行った。ＤＣ−ＳＩＧＮの染色は、ＡＺＮ−Ｄ１を用いて行った。胚芽中心（ＧＣ）、Ｔ（Ｔ）及びＢ細胞（Ｂ）領域が図示されている。樹状細胞の分布及び形態と一致して、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現している細胞は、胚芽中心及びリンパ組織のマントルゾーンには検出されない（図５）。ＣＤ３とＣＤ１４に対する連続切片の染色によって、これらの細胞のフローサイトメトリー分析とＲＴ−ＰＣＲの両者によっても実証されたように（表１）、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現している細胞は、Ｔ細胞及び単球とは異なること（データは示されていない）が確認された。
【０１１１】
例６：ＤＣ−ＳＩＧＮ／ＩＣＡＭ−３相互作用は、一過性のＤＣ−Ｔリンパ球クラスタリングを媒介する
ＤＣが、ＤＣ−ＳＩＧＮ依存性の態様で、ＩＣＡＭ−３を発現しているトランスフェクタントに結合することを実証するために、ＩＣＡＭ−３をコードするｃＤＮＡをトランスフェクトした白血病細胞株Ｋ５６２（Ｋ５６２−ＩＣＡＭ−３）がＤＣに結合する能力を調べた。図６Ａに示されているように、相互作用が抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体によってブロックできるので、ＤＣは、ＤＣ−ＳＩＧＮ依存性の態様で、Ｋ５６２−ＩＣＡＭ−３とクラスターを形成する。ＤＣとＫ５６２との間ではクラスタリングが全く観察されなかったことは、ＩＣＡＭ−３がＤＣ−ＳＩＧＮに対するリガンドであることを実証している。図６は、ＤＣ−ＳＩＧＮを介したＤＣのＩＣＡＭ−３への接着が、ＤＣ−Ｔリンパ球相互作用に関与していることを示す。
【０１１２】
−６Ａ：ＤＣ−ＳＩＧＮを介したＤＣのＩＣＡＭ−３への接着は、完全な状態の細胞骨格に依存する。ＤＣのＩＣＡＭ−３ビーズへの接着は、様々な濃度で滴定された、サイトカラシンＤの存在下、遮断ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体ＡＺＮ−Ｄ１あり（白四角）、又はなし（黒四角）で決定した。２つの実験のうち代表的な実験が示されている（ＳＤ＜５％）。
【０１１３】
−６Ｂ：ＤＣとＫ５６２−ＩＣＡＭ−３細胞との異種細胞クラスタリング。Ｋ５６２及びＩＣＭＡ−３をコードするｃＤＮＡを安定にトランスフェクトしたＫ５６２細胞（Ｋ５６２−ＩＣＡＭ−３）を、赤い色素ＨＥ（ハイドロエチジン）で標識した。ＤＣは緑の色素ＳＦＤＡで標識した。Ｋ５６２とＫ５６２−ＩＣＡＭ−３を、遮断抗体ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体（ＡＺＮ−Ｄ１；１０分。プレインキュベーション）あり、又はなしで、ＤＣ（５０×１０３細胞／細胞種類）とともに、３７℃でインキュベートした。異なる時点で、細胞をパラホルムアルデヒド（０．５％）で固定し、異種細胞のクラスタリングをフローサイトメトリーで測定した。２つの実験のうち代表的な実験が示されている。
【０１１４】
−６Ｃ：非活性化ＰｂＬとＤＣの動的な細胞クラスタリングは、ＤＣ−ＳＩＧＮによって媒介される。抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体ＡＺＮ−Ｄ１とＡＺＮ−Ｄ２（１０μｇ／ｍＬ）あり／なしで、１０分間室温で、ＤＣ（５０×１０３細胞）をプレインキュベートした。蛍光性色素カルセインＡ（２５μｇ／１０７細胞／ｍＬ、３０分間３７℃）で標識した、同種異系ＰＢＬ（１×１０６細胞）を加え、細胞混合物を３７℃でインキュベートした。クラスタリングは、フローサイトメトリーによって測定した。２つの実験のうち代表的な実験が示されている。
【０１１５】
−６Ｄ：ＤＣ−ＳＩＧＮ−ＩＣＡＭ−３相互作用は、ＤＣ誘導性のＴ細胞増殖に重要である。ＬＦＡ−３（ＴＳ２／９）とＤＣ−ＳＩＧＮ（ＡＺＮ−Ｄ１、ＡＺＮ−Ｄ２）に対する遮断抗体（２０μｇ／ｍＬ）の存在下で、同種異系の反応性（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）Ｔリンパ球（１００×１０３）をＤＣ刺激因子（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）（１．５×１０３）に加えた。細胞を４日間培養した。４日目に、［３Ｈ］メチルチミジンを１６時間細胞にパルスし、取り込み量を決定した。結果は、３つのウェルからのＣＰＭの平均パーセントとして表されている。
【０１１６】
ＤＣ−ＳＩＧＮ依存性のクラスタリングが一過性であり、６０分に最大となることは、ＤＣ−ＳＩＧＮ−ＩＣＡＭ−３相互作用がＤＣによって積極的に調整され得ることを示している。さらに、この現象は、ＴＣＲの参加後にこの相互作用化が強化されるまで、ＤＣが複数のナイーブＴ細胞と一過性に相互作用することを可能とする。
【０１１７】
これをテストするために、ＤＣのＴ細胞へのクラスタリングが、ＤＣ−ＳＩＧＮによって媒介されるかどうか、及びこの相互作用も一過性であるかどうかを調べた。ＤＣを非活性化同種異系Ｔ細胞（ＤＣ：Ｔ細胞、１：２０）とともにインキュベートして、ＤＣ−Ｔ細胞クラスタリングを決定した。図６Ｂに示されているように、ＤＣとＴ細胞とのクラスタリングは一過性であり、２０分後に最大（３２％）に達する。さらに、ＤＣ−Ｔ細胞相互作用は、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体によって阻害することができ（約５０％）、ＤＣ−Ｔ細胞のクラスタリングは、他の表面受容体によっても媒介されることが示唆されている。このように、ＤＣ−Ｔ細胞クラスタリングは、実際に一過性であり、部分的には、ＤＣ−ＳＩＧＮ／ＩＣＡＭ−３相互作用によって媒介されている。同様に、図８は、ＤＣ−ＳＩＧＮが、ＩＣＡＭ−３をコードするｃＤＮＡを発現しているＫ５６２細胞と結合するのみならず、ＩＣＡＭ−３をコードするｃＤＮＡを発現している細胞に結合し、前記結合は、マンナンと抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体の両者によって阻害され得ることを示している。
【０１１８】
例７：同種異系ＤＣによって誘導された非活性化Ｔ細胞の増殖は、ＤＣ−ＳＩＧＮ依存性である
ＤＣ−ＳＩＧＮのＩＣＡＭ−３への結合は、ＤＣのＴ細胞とのクラスタリングに重要なので、ＤＣ誘導性のＴ細胞増殖におけるＤＳ−ＳＩＧＮの役割も調べた。遮断抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体の存在下、又は非存在下で、同種異系ＤＣを用いて非活性化Ｔリンパ球を刺激した。図６Ｃに示されているように、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体ＡＺＮ−Ｄ１とＡＺＮ−Ｄ２は、ともにＴリンパ球の増殖を７５％超、阻害した。同様に、Ｔ細胞上のＣＤ２に結合し、Ｔ細胞増殖を媒介することも知られている共同刺激分子ＬＦＡ−３に対する抗体は、Ｔ細胞の増殖を阻害する。抗ＬＦＡ−３と抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体の組み合わせは、Ｔ細胞の増殖を完全に阻害する（図６Ｃ）。
【０１１９】
例８：ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＤＣのＨＩＶ感染に関与している
上記のごとく、ＤＣ−ＳＩＧＮは、胎盤ＨＩＶｇｐ１２０結合レクチンと同一であり、ＤＣによって豊富に発現されていることが実証されたので、ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＨＩＶ−１のＤＣ中への侵入を促進し得るかもしれない。これを調べるために、ＤＣにＨＩＶ−１をパルスし、ＤＣ−Ｔ細胞共培養中の増殖性感染を測定した。ＩＬ−４とＧＭ−ＣＳＦの存在下で、７日間培養した後に採集したＤＣは、低レベルのＣＤ４（Ｂｌａｕｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８４（６），２４３３−８，１９９６）と高レベルのＤＣ−ＳＩＧＮ（図７）を発現した。図７に示されているように、ＤＣに、２時間、ＨＩＶ−１をパルスし、洗浄し、活性化されたＰＢＭＣ細胞の存在下で培養すると強力な増殖性感染が起こる。ＤＣ−Ｔ細胞の共培養の３日目までに、ＨＩＶ−１複製の指標であるｐ２４Ｇａｇタンパク質が、培地中に蓄積し始め（図７）、他者によって示されたのと同様に（Ｂｌａｕｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ９（１），２１−２９，１９９９）、ＨＩＶ−１が共培養中で効率的に複製されることを実証している。しかしながら、ＨＩＶ−１パルスに先立って、ＤＣを抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体とプレインキュベートし、活性化されたＰＢＭＣとインキュベートすると、ＤＣ−Ｔ細胞の共培養の３及び５日目に示されているように、ＨＩＶ−１の複製が７５％超、阻害される（図７）。ＨＩＶ−１でパルスした後、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体とＤＣをインキュベートすると、ＤＣ−Ｔ細胞の共培養中に、効率的なＨＩＶ−１複製が、なお観察された（図７）。これらの発見は、ＤＣからＴ細胞へのＨＩＶ−１の伝達ではなく、ＨＩＶ−１のＤＣへの結合の阻害を通じて、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体がＨＩＶ−１の感染をブロックすることを実証しており、ＤＣ−ＳＩＧＮが、ＤＣ上の主要なＨＩＶ−１受容体として作用することを示している。このように、ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＤＣ上に高度に発現されており、ＩＣＡＭ−３とＨＩＶ−１の両者に対するＤＣ特異的な受容体として機能する。
【０１２０】
上記の実験結果から、ＤＣとＴリンパ球との最初の相互作用は、抗原非依存性であり、且つ一過性であると、特に結論付けることができる。この一過性の性質は、増殖性のＴＣＲの参加がなされるまで、多数のＴ細胞と相互作用する能力をＤＣに与える。現在まで、この一過性のプロセスが開始される機序は不明確であった。本明細書では、新規ＤＣ特異的な受容体、ＤＣ−ＳＩＧＮとＩＣＡＭ−３との相互作用が、この一過性のＤＣ−Ｔ細胞相互作用を媒介することが実証されている。ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＤＣによって豊富に発現されており、ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＤＣ上の主要なＨＩＶ−１受容体として働くことが示された。
【０１２１】
ＨＩＶ−１感染中のＤＣの重要な役割は、ＨＩＶ−１をＴ細胞に伝播して、ＣＤ４＋Ｔ細胞の死をもたらす大量の複製を促進することである（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｃａｍｅｒｏｎ：ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １０（１），６１−７１，１９９４）。ＤＣの増殖性ＨＩＶ−１感染は明確に実証されており、ＤＣの発育段階に依存する（Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。ＩＬ−４とＧＭ−ＣＳＦの存在下で単球から培養された未成熟なＤＣは、Ｍ−トロピック（ｔｒｏｐｉｃ）ＨＩＶ−１株によって増殖性に感染される（Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８）（Ｂｌａｕｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７）のに対して、Ｍ及びＴトロピックＨＩＶ−１の成熟したＤＣへの侵入は、ともに、増殖性の感染をもたらさない（Ｇｒａｎｅｌｌｉ １９９８）。しかしながら、両種類のＤＣへのＨＩＶ−１の侵入は、非活性化又は活性化Ｔ細胞の何れかとともに共培養すると、爆発的な複製をもたらす（Ｇｒａｎｅｌｌｉ １９９８，１９９９）。標的細胞のＨＩＶ−１感染における最初の出来事には、受容体の結合と膜の融合が含まれる。このプロセスは、エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０のＣＤ４への高親和性結合によって開始される。しかしながら、ＣＤ４のみでは、融合を開始するのに十分ではなく、最後の融合現象が起こるための共受容体として、ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４のようなケモカイン受容体が必要とされる（Ｌｉｔｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８による総説）（Ｄｒａｇｉｃ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８１（６５８４），６６７−７３，１９９６；Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２（５２６３），８７２−７，１９９６）。ＤＣは、低量のＣＤ４を発現しているのに対して、細胞表面上には高レベルのＤＣ―ＳＩＧＮが発現されている。ＤＣの増殖性感染、及びＨＩＶ−１を捕捉し、続いてＨＩＶ−１を転移させるその能力は、別個の経路を通じて媒介されると示唆されてきた。ＤＣの増殖性感染は、ＣＤ４依存性の経路によって媒介されるのに対して、ＨＩＶ−１は、なおＤＣがＨＩＶ−１をＴ細胞に転移させるのを可能とするＣＤ４非依存性の経路を介してＤＣによりＨＩＶ−１を捕捉することができる（Ｂｌａｕｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７））。本明細書では、ＨＩＶ−１パルスの前に、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体とともにＤＣをプレインキュベートすると、ＤＣ−Ｔ細胞の共培養中に増殖性の感染が欠如することによって測定されたように、ＤＣ−ＳＩＧＮが、ＨＩＶ−１のＤＣへの侵入を特異的に媒介することが示された。抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体は、ＨＩＶ−１のＤＣ中への侵入を完全には阻害しない。このＤＣ−ＳＩＧＮ非依存性の経路は、おそらく、ＤＣ上に低レベルで発現されているＣＤ４（）によって媒介される。これらの結果は、ＤＣ中へのウイルスの侵入経路に、ＣＤ４依存性の経路と非依存性の経路の両者が存在することを確認している。様々な接着分子が、ＤＣ−Ｔ細胞接触の妨害を通じて、ＤＣからＴ細胞へのＨＩＶ−１の伝達を阻害し得ることが示された（Ｔｓｕｎｅｔｓｕｇｕ−Ｙｏｋｏｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。ＤＣ−Ｔ細胞相互作用を阻害するために、ＨＩＶ−１パルス後に抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体を添加すると、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体は、Ｔ細胞へのＨＩＶ−１の伝達を阻止することができなかった。これらのデータは、ＤＣ−ＳＩＧＮが、ＨＩＶ−１がＤＣ中に侵入するための主要な受容体として働いていることを示している。ＤＣが、高レベルのＤＣ−ＳＩＧＮと低レベルのＣＤ４を発現しているという事実（図７）は、ＤＣ中へのＨＩＶ−１の侵入が、主としてＤＣ−ＳＩＧＮによって媒介されることをさらに実証している。ＤＣ−ＳＩＧＮのＨＩＶ−１受容体としての発見は、ＨＩＶ−１のＤＣ中への侵入をよりよく理解する上で重要であり得る。さらに、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体の存在下で観察されるＨＩＶ−１感染の阻害は、ウイルス感染と局所的なＨＩＶ−１の拡散に対する治療的な戦略での抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体の開発を可能にするであろう。
【０１２２】
ＤＣは、様々な組織で、僅かなレベルで存在する細胞の異種集団を構成する。様々な集団をより明確にするために、ＤＣ系統特異的な細胞表面分子に対して誘導される抗体の生成に努力が注がれている。これまでは、ヒトＤＣ特異的な抗原を認識する２〜３の抗体のみが作られてきた（（Ｈｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．８３，５７３−５８１，１９９４）（ｄｅ Ｓａｉｎｔ−Ｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ９（３），３２５−３６，１９９８）（Ｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７））。本明細書において、テストした全ての造血細胞のうち、ＤＣのみが、タンパク質及びｍＲＮＡレベルでＤＣ−ＳＩＧＮを発現していることが実証されたので、いま、ヒトＤＣ特異的な抗原のこのリストに、ＤＣ−ＳＩＧＮを加えることができる（表１）。インシチュで、ＤＣ−ＳＩＧＮは、専ら、扁桃及びリンパ節のＴ細胞領域に存在するＤＣサブセットによって発現されている。これらの成熟ＤＣは、ナイーブＴ細胞の活性化に極めて強い効力を有する。それ故、インシチュでのＤＣ−ＳＩＧＮ発現は、ＤＣ−Ｔ細胞クラスタリング及びそれに引き続くＴ細胞の活性化の重要な媒介物質としてのその機能と相関している。
【０１２３】
抗原提示細胞による非活性化Ｔリンパ球の活性化は、後天性の免疫応答における極めて重要な工程である。多くの組織に局在し、ＤＣは抗原を捕捉、加工し、それらがナイーブな抗原特異的Ｔ細胞と相互作用し、これを活性化する場所であるリンパ組織に移動する。Ｔ細胞は、ケモカインによって、これらの抗原提示部位に誘導される。最近、ナイーブＴ細胞を免疫開始部位に特異的に誘引するＤＣ特異的なケモカインＤＣ−ＣＫ１が同定された（Ａｄｅｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８７， ７１３−７１７，１９９７）。二次リンパ組織に到達すると、Ｔ細胞はＤＣと相互作用し、ＭＨＣ分子に結合したペプチドのＴＣＲ認識後に活性化が起こる。しかしながら、ＭＨＣ分子によって提示された抗原に対するＴＣＲの親和性は極めて低いので、ＡＰＣ上の特異的なＭＨＣ−ペプチド複合体の数は限られており、ＴＣＲの抗原との相互作用は、通常、完全な活性化に必要なＤＣとＴリンパ球との近接した膜接触の形成を駆動するには不十分である。
【０１２４】
現在まで、ＬＦＡ−１は、ＤＣ上のＩＣＡＭ−３に対する最も重要な受容体であった。しかしながら、ＩＣＡＭ−３結合におけるその役割は、本明細書におけるＤＣ−ＳＩＧＮの発見のため、現在では、議論の余地があるものとなった。ＤＣのＩＣＡＭ−３への接着は、ＤＣ−ＳＩＧＮによって完全に媒介されることが実証された。ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＬＦＡ−１よりＤＣによって、より豊富に発現されている（図２Ｂ）。さらに、ＬＦＡ−１は、ＤＣ上で不活性であり（図２Ｃ）、ＩＣＡＭ−３に対するその親和性は、ＩＣＡＭ−３に対するＤＣ−ＳＩＧＮの親和性よりずっと低い。これらのデータは、ＤＣ−ＳＩＧＮが、ＤＣ上の主要なＩＣＡＭ−３受容体であることを明確に実証している。ＤＣに対するＤＣ−ＳＩＧＮの機能は、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体が一過性のＤＣ−Ｔ細胞クラスタリングを部分的に阻害したという発見によってさらに明確にされた。それ故、ＤＣ−ＳＩＧＮは、免疫応答における最初のＤＣ−Ｔ細胞相互作用に関わっている。以前は、ＬＦＡ−１に割り振られた役割であった。ＤＣ−ＳＩＧＮによって媒介されるＤＣ−Ｔ細胞相互作用の一過性の性質は、増殖性のＴＣＲを介した相互作用が起こり、それによって相互作用が安定化されるまで、ＤＣが多数の非活性化Ｔ細胞と相互作用することを可能にする。ＤＣ−ＳＩＮＧ−ＩＣＡＭ−３相互作用の重要性は、ＤＣ−ＳＩＧＮに対する抗体が、同種異系のＤＣ誘導性Ｔリンパ球増殖を阻害し得るという発見によって、さらに強調される。さらに、ＤＣ−ＳＩＧＮと公知の共同刺激分子ＬＦＡ−３（）に対する抗体の組み合わせは、ほぼ完全にＴリンパ球の増殖を阻害する。それ故、ＤＣ−ＳＩＧＮのＩＣＡＭ−３への一過性の高親和性接着は、ＤＣとナイーブＴ細胞間の最初の抗原非依存性相互作用において重要な役割を果たしている。おそらく、この最初の高親和性相互作用は、ＭＨＣに結合した抗原によるＴＣＲの関与を可能とし、引き続き、ＬＦＡ−１−ＩＣＡＭ−１相互作用のような、ＤＣとＴ細胞間の他の幾つかの接着性相互作用を開始させる。ＬＦＡ−１はＴ細胞に対して不活性なので、ＤＣによる抗原提示後におけるＴＣＲ／ＣＤ３複合体の活性化は、ＬＦＡ−１の活性化と、引き続くＤＣ上に発現されたＬＦＡ−１のＩＣＡＭ−１への強力な結合（）をもたらすであろう。複数の接触を介したＤＣとＴ細胞間の相互作用の強化は、続いて、ＤＣ刺激因子によるＴリンパ球の完全な活性化をもたらすであろう（）。
【０１２５】
結論をいえば、ＤＣ上に新規ＩＣＡＭ−３受容体が同定され、ＤＣ−ＳＩＧＮと名付けられ、この受容体は、ヒトＤＣによって特異的に発現されており、免疫応答を開始するために必要な最初の一過性ＤＣ−Ｔ細胞相互作用に関与している。興味深いことに、ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１２０も結合し、ＨＩＶ−１のＤＣへの侵入を促進することもできる。本明細書に開示した発見に基づいて、様々な治療的及び予防的可能性と手法が、当業者に示唆されるであろう。
【０１２６】
例９：実験の手順
例９Ａ：抗体
以下の抗体：ＫＩＭ１８５（抗β２インテグリン、（Ａｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３，２２１７−２２２２，１９９３）、ＡＺＮ−Ｌ１９（抗β２インテグリン、）、ＮＫＩ−Ｌ１５（抗αＬ、（Ｋｅｉｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５，１１４２−１１４７，１９８５））、ＡIIＢ２（抗β１インテグリン、（Ｄａ Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３，６１７−６２２，１９８９））、ＣＢＲ−ＩＣ３／１及びＣＢＲ−ＩＣ３／２（抗ＩＣＡＭ−３（ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７，１１８７−１１９２，１９９３））、ＣＤ１４（ＷＴ１４（））、ＣＤ４（ｗｔ４（））を使用した。抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体ＡＺＮ−Ｄ１及びＡＺＮ−Ｄ２は、ＢＡＬＢ／ｃマウスをＤＣで免疫し、続いて、ハイブリドーマ上清が、蛍光性ビーズの接着アッセイによて測定したＤＣのＩＣＡＭ−３への接着をブロックする能力をスクリーニングすることによって得られた。
【０１２７】
例９Ｂ：細胞
ＤＣは、記載に従って単球から培養した（Ｓａｌｌｕｓｔｏ ａｎｄ Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９，１１０９−１１１８，１９９４；Ｒｏｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０，８２−９３，１９９４）。簡潔に述べれば、接着工程によって、新鮮なＰＢＭＣから単球を単離した。ＩＬ−４（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ；５００Ｕ／ｍＬ）及びＧＭ−ＣＳＦ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ；１０００Ｕ／ｍＬ）の存在下で、単球を７日間培養した。４日目に、新鮮なサイトカインを添加した。７日目に、ＭＨＣクラスI及びII、ＣＤ１ａ、ｐ１５０，９５、及びＣＤ８０の発現のフローサイトメトリー分析によって、培養されたＤＣの表現型を確認した。ＩＣＡＭ−３を発現している安定なＫ５６２トランスフェクタント（Ｋ５６２−ＩＣＡＭ−３）は、記載のごとく（Ｌｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ ８，７１９−７２８，１９９７）エレクトロポレーションによって、１０μｇのＰＣＲＩＩ ＩＣＡＭ−３ Ｒ１プラスミド（Ｄ．Ｓｉｍｍｏｎｓ博士から入手）と２μｇのＰＧＫ−ｈｙｇベクター（ｔｅ Ｒｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ １９９０）でＫ５６２をトランスフェクションすることによって作成した。非活性化Ｔ細胞（＞９０％ ＣＤ３ 陽性）は、記載のごとく（Ｆｉｇｄｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６８，７３−８７，１９８４）、健康なドナーの骨髄からＰＢＭＣの遠心による水力分級によって得た。
【０１２８】
例９Ｃ：放射能標識、免疫沈降、及びタンパク質配列の分析
ラクトペルオキシダーゼ法（Ｐｉｎｋ ａｎｄ Ｚｉｅｇｌｅｒ，１９７９，ｉｎ：Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｌ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ａｎｄ Ｂ Ｐｅｒｎｉｓ，ｅｄｓ．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓ），ｐｐ．１６９−１８０）により、細胞をＮａ１２５Ｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）で表面標識した。４℃で１時間、溶解用緩衝液（１％ ＮＰ−４０、５０ｍＭトリエタノールアミン（ｐＨ７．８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．０２ｍｇ／ｍＬロイペプチン）の中でＤＣを溶解した。４℃で１５分間、１３，０００ｇでの遠心によって、核の破砕物を溶離液から除去した。タンパク質Ａ−セファロースＣＬ−４Ｂビーズに共有結合したｍＡｂとともに、予め清澄にした溶離液を３時間インキュベートした（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）。免疫沈降物を溶解用緩衝液で徹底的に洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉの操作（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ ２２７，６８０６８５，１９７０）変法に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。切り出したタンパク質をトリプシン消化し、生じたペプチドを精製し、Ｅｕｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅ ＢＶ（Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって配列分析を行った。
【０１２９】
例９Ｄ：ＤＣ−ＳＩＧＮをコードするｃＤＮＡの単離及び発現
酸性のグアニジニウムイソチオシアネート−フェノール−クロロホルム操作によって全ＲＮＡを単離した（Ｃｈｏｍｃｚｙｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １６２（１），１５６−９，１９８７）。胎盤ｇｐ１２０結合Ｃ型レクチンをコードするｃＤＮＡは、全ＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲによって、ＤＣから増幅した。ＰＣＲプライマーは、胎盤ｇｐ１２０結合Ｃ型レクチンのヌクレオチド配列（受付番号Ｍ９８４５７、（Ｃｕｒｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２））に基づいており、ヌクレオチド配列（５’から３’）は、以下のとおりである：ＸＦ２９、ＡＧＡＧＴＧＧＧＧＴＧＡＣＡＴＧＡＧＴＧ；ＸＲ１２６５，ＧＡＡＧＴＴＣＴＧＣＴＡＣＧＣＡＧＧＡＧである。ＰＣＲ断片をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）中にクローニングし、配列を決定した。クローニングされたｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、胎盤ｇｐ１２０結合Ｃ型レクチンの配列と同じであった（Ｃｕｒｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。続いて、真核細胞発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ中にｃＤＮＡをクローニングし（ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＤＣ−ＳＩＧＮ））、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｓｅｅｄ ａｎｄ Ａｒｕｆｆｏ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４，３３６５−３３６９，１９８７）を用いて、ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＤＣ−ＳＩＧＮでＣＯＳ７細胞を一過性にトランスフェクトした。
【０１３０】
例９Ｅ：蛍光ビーズ接着アッセイ
以前記載したとおりに（Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９９９ 投稿された）、ＩＣＡＭ−１ＦｃとＩＣＡＭ−３を用いて、カルボキシレートで修飾されたＴｒａｎｓＦｌｕｏｒＳｐｈｅｒｅｓ（４８８／６４５ｎｍ、１．０μｍ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）をコートした。簡潔に述べれば、２０μＬのストレプトアビジン（５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液中５ｍｇ／ｍＬ）を５０μＬのＴｒａｎｓＦｌｕｏｒＳｐｈｅｒｅｓに添加した。３０μＬのＥＤＡＣ（１．３３ｍｇ／ｍＬ）を添加し、混合液を室温で２時間インキュベートした。反応は、１００ｍＭの最終濃度になるようにグリシンを添加することによって停止された。ストレプトアビジンでコートされたビーズをＰＢＳ（５０ｍＭ リン酸、０．９％ ＮａＣｌ ｐＨ７．４）で３回洗浄し、１５０μＬのＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）中に再懸濁した。０．５ｍＬのＰＢＡ中、３７℃で２時間、ビオチン化されたヤギ−抗ヒト抗ＦｃＦａｂ２断片（６μｇ／ｍＬ）とともに、ストレプトアビジンでコートされたビーズ（１５μL）をインキュベートした。ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡで一度ビーズを洗浄し、０．５ｍＬ中、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ融合リガンド（ＩＣＡＭ−１ Ｆｃ、ＶＣＡＭ−１ Ｆｃ；２５０ｎｇ／ｍＬ）とともに、４℃で一晩インキュベートした。リガンドをコートしたビーズを洗浄し、１００μＬのＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ中に再懸濁し、４℃で保存した。ＩＣＡＭ−１ ＦｃとＩＣＡＭ−３ Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片（Ｄ．Ｓｉｍｍｏｎｓ博士が提供）に融合されたタンパク質の細胞外部分からなる。蛍光性ビーズの接着アッセイは、Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら（投稿された）によって記載されたように行った。簡潔に述べれば、Ｔｒｉｓ−Ｓｏｄｉｕｍ−ＢＳＡ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｓｉ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５％ ＢＳＡ；５×１０６細胞／ｍＬ）中に再懸濁した。遮断ｍＡｂ（２０μｇ／ｍＬ）あり／なしで、１０分間室温で、９６ウェルのＶ字底プレート中、５０．０００細胞をプレインキュベートした。リガンドをコートされた蛍光性ビーズ（２０ビーズ／細胞）と様々な刺激／阻害剤を添加し、３７℃で３０分間、懸濁物をインキュベートした。細胞を洗浄し、１００μＬのＴＳＡ中に再懸濁した。ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ ａｎｄ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏ．，Ｏｘｎａｒｄ，ＣＡ）を用いたフローサイトメトリーによって、結合した蛍光性ビーズを有する、細胞のパーセントを測定することによって接着を決定した。
【０１３１】
例９Ｆ：異種細胞クラスタリングアッセイ
ＤＣ、及びＩＣＡＭ−３を発現している細胞間のクラスタリングをフローサイトメトリーによって評価した。ＤＣ、及びＩＣＡＭ−３を発現している細胞（２×１０６細胞／ｍＬ）を、それぞれ、スルフォフルオレセイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；５０μｇ／ｍＬ）とハイドロエチジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；４０μｇ／ｍＬ）により、３７℃で１時間標識した。洗浄後、ＤＣ、及びＩＣＡＭ−３を発現している細胞を混合し（それぞれ５０×１０３細胞）、３７℃でインキュベートした。異なる時点で、細胞をパラホルムアルデヒド（０．５％）で固定し、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ ａｎｄ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏ．，Ｏｘｎａｒｄ，ＣＡ）を用いたフローサイトメトリーによって、異種細胞クラスタリングを測定した。
【０１３２】
ＤＣと非活性化Ｔ細胞間のクラスタリングは、異なる方法によって評価した。ＤＣ（５０×１０３細胞）を、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体ＡＺＮ−Ｄ１とＡＺＮ−Ｄ２（１０ｇ／ｍＬ）あり／なしで、１０分間室温でプレインキュベートした。蛍光色素カルセイン−Ａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；２５μｇ／１０７細胞／ｍＬ、３７℃で３０分間）で標識した同種異系のＰＢＬ（１×１０６細胞）を添加し、細胞混合物を３７℃でインキュベートした。ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ ａｎｄ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏ．，Ｏｘｎａｒｄ，ＣＡ）を用いたフローサイトメトリーによって、結合した蛍光性のＴ細胞を有するＤＣのパーセントを測定することにより、クラスタリングを決定した。
【０１３３】
例９Ｇ：ＤＣ誘導性Ｔ細胞増殖アッセイ
遮断抗体（２０ ｇ／ｍｌ）の存在下で、同種異系の反応性Ｔリンパ球（１００×１０３）をＤＣ−刺激因子（１．５×１０３）に加えた。該細胞を４日間培養した。４日目に、細胞に、１６時間、［３Ｈ］メチル−チミジン（１．５２ＴＢｑ／ｍｍｏｌ／ｍｍｏｌ、０．５μＣｉ／ウェル；Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）をパルスし、取り込み量を定量した。
【０１３４】
例９Ｈ：ＤＣのＨＩＶ−１感染
単球由来のマクロファージ（ＭＤＭ）中で、ＨＩＶＢａ−Ｌを高力価になるまで増殖させた。ＭＤＭに対するウイルス株の滴定から７日後、ｐ２４抗原ＥＬＩＳＡ（（Ｄｉｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｍａｒｎｅｓ ｌａ Ｃｏｑｕｅｔｔｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いてＴＣＩＤ５０を決定し、１０４／ｍＬと推定した。室温で２０分間、抗体（５０μｇ／ｍＬ）とともにプレインキュベートしたＤＣ（５０×１０３）を２時間、（１０５細胞当たり１０３の感染単位という多数の感染で）野生型ＨＩＶＢａ−Ｌをパルスし、洗浄し、ＰＨＡ／ＩＬ−２活性化されたＰＢＭＣ（５０×１０３）とともに共培養した。ＤＣ−Ｔ細胞の共培養から３日及び５日後に、上清を集めて、ｐ２４抗原ＥＬＩＳＡによって、ｐ２４抗原レベルを測定した（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｐａｓｔｅｕｒ、Ｍａｒｎｅｓ ｌａ Ｃｏｑｕｅｔｔｅ，Ｆｒａｎｃｅ）。ＰＢＭＣは、ＩＬ−２（１０Ｕ／ｍＬ）とＰＨＡ（１０μｇ／ｍＬ）の存在下でそれらを培養することによって活性化した。
【０１３５】
例９Ｉ：免疫組織化学的分析
扁桃とリンパ節の凍結切片（８μｍ）を１００％のアセトンで固定化し（１０分）、ＰＢＳで洗浄し、第一の抗体（１０μｇ／ｍＬ）とともに、室温で６０分間インキュベートした。洗浄後、製造者のプロトコールに従って、ＡＢＣ−ＡＰベクタスタインキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いて最終染色を行った。核の染色は、ヘマテインを用いて行った（）。
【０１３６】
【表１】
［配列表］
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１０−２８５４５０（Ｐ２０１０−２８５４５０Ａ）
【公開日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１７６８２４（Ｐ２０１０−１７６８２４）
【出願日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【分割の表示】特願２０００−６１２３３７（Ｐ２０００−６１２３３７）の分割
【原出願日】平成１２年４月１９日（２０００．４．１９）
【出願人】（５００５７９３６１）カトリーケ・ウニベルジテート・ニイメゲン (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【分割の表示】特願２０００−６１２３３７（Ｐ２０００−６１２３３７）の分割
【原出願日】平成１２年４月１９日（２０００．４．１９）
【出願人】（５００５７９３６１）カトリーケ・ウニベルジテート・ニイメゲン (1)
【Ｆターム（参考）】
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