治療因子を含むＨＤＬおよび治療における使用
本発明は、医薬として使用するための、特にアテローム血栓症、虚血性疾患、ＣＯＰＤおよび神経変性疾患の処置のための、アンチプロテアーゼ、抗酸化因子、有糸分裂阻害因子、抗アポトーシス因子および鉄代謝に関与する因子から成る群から選択される因子を含むＨＤＬを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本開示は、気腫を含めた多様な病状の処置に使用するためのネイティブなＨＤＬおよび組換えられたＨＤＬを提供する。
【０００２】
発明の背景
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、コレステロールおよびトリグリセリドのような脂質を輸送できるようにする、主要な５群のリポタンパク質（カイロミクロン、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ）の一つである。
【０００３】
ＨＤＬは、無極性脂質であるトリアグリセロール（triaglycerol）およびコレステロールエステルのコアならびにリン脂質および非エステル化コレステロールの表面単層を有する形状の円板状である。いくつかのアポリポタンパク質がＨＤＬ中に存在する。主なアポリポタンパク質は、２４３個のアミノ酸残基から成る２８kDa単鎖ポリペプチドであるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（アポＡ−Ｉ）である（Jay H. Stein, Internal medicine, Edition 5, Elsevier Health Sciences, 1998; 2515 pages）。
【０００４】
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の保護的役割は、いくつかの研究で確認されており、ＨＤＬおよびその主要タンパク質アポＡ−Ｉの血漿中レベルは、一貫してアテローム血栓リスクと逆相関する（BG Choi et al., The role of high-density lipoprotein cholesterol in atherothrombosis, Mt Sinai J Med. 2006 Jul; 73(4):690-701）。
【０００５】
α１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）は、５２kDの糖タンパク質である。その主機能は、好中球エラスターゼを阻害して組織損傷を防止することである。ＡＡＴ欠乏は、閉塞性肺疾患および肝機能障害へとつながる。現時点で最も広く使用されている処置は、高度に精製されたヒトＡＡＴの静脈内注入である。静脈内増強療法は、安全であると実証されており、ＡＡＴの週１回注入は、保護的であると見なされる濃度を超えた血漿ＡＡＴ濃度を生じる。（RC Hubbard et al., Alpha-1 antitrypsin augmentation therapy for alpha-1 antitrypsin deficiency, Am J Med. 1988 Jun 24; 84(6A):52-62）。
【０００６】
発明の概要
本発明者らは、ＨＤＬがアポリポタンパク質Ａ−Ｉ以外の多数の因子を担持できることを示した。本発明者らは、また、ＨＤＬにＡＡＴが存在することを示し、ＨＤＬがエラスターゼ活性を阻害し、アポトーシスなどのその関連作用を阻止することを実証した。
【０００７】
さらに本発明者らは、ＨＤＬに治療因子を強化し、ＨＤＬを特定器官に到達可能なベクターとして使用することができることを示した。
【０００８】
本発明は、医薬として使用するための因子であって、アンチプロテアーゼ、抗酸化因子、有糸分裂阻害因子、鉄代謝に関与する因子および抗アポトーシス因子から成る群より選択される因子を含むＨＤＬを提供する。
【０００９】
本発明の一態様では、本発明によるＨＤＬは、ネイティブなＨＤＬである。本発明の別の態様では、本発明によるＨＤＬは、再構成されたＨＤＬである。
【００１０】
本発明は、アテローム血栓症、虚血性疾患、慢性閉塞性肺疾患、神経変性疾患、ガン、ステント内再狭窄、および内皮機能不全を伴う全ての病態の処置に使用するための、アンチプロテアーゼを含むＨＤＬを提供する。
【００１１】
本発明は、アテローム血栓症、虚血性疾患、慢性閉塞性肺疾患、神経変性疾患、ガン、ステント内再狭窄、および内皮機能不全を伴う全ての病態の処置に使用するための、抗酸化因子を含むＨＤＬを提供する。
【００１２】
本発明は、ガンおよびステント内再狭窄の処置に使用するための、有糸分裂阻害因子を含むＨＤＬを提供する。
【００１３】
本発明は、アテローム血栓症、虚血性疾患、慢性閉塞性肺疾患および神経変性疾患の処置に使用するための、鉄代謝に関与する因子を含むＨＤＬを提供する。
【００１４】
本発明は、アテローム血栓症、虚血性疾患、慢性閉塞性肺疾患および内皮機能不全を伴う全ての病態の処置に使用するための、抗アポトーシス因子を含むＨＤＬを提供する。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、医薬として使用するための、アンチプロテアーゼ、抗酸化因子、有糸分裂阻害因子、鉄代謝に関与する因子および抗アポトーシス因子から成る群より選択される因子を含むＨＤＬを提供する。ＨＤＬは、ＨＤＬ粒子に対するその自然親和性が原因で、健康な被験者から単離されたＨＤＬと結合することが報告されているタンパク質またはペプチドのためのベクターを意味しうる（Karlsson H et al. Lipoproteomics II: mapping of proteins in high-density lipoprotein using two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry, Proteomics. 2005; 5(5):1431-45; T Vaisar et al., Shotgun proteomics implicates protease inhibition and complement activation in the anti-inflammatory properties of HDL, J Clin Invest. 2007; 117(3):746-56）。加えて、再構成されたＨＤＬの場合、精製されたアポＡ−Ｉがホスファチジルコリンなどのリン脂質と混合される。この特定ステップの間に、ＨＤＬに対して自然親和性を示さないタンパク質、ペプチドまたは他の分子を、原始型粒子内に捕捉し、ＨＤＬによって強制的に担持させることができる（PC Rensen et al., recombinant lipoproteins: lipoprotein-like lipid particles for drug targeting, Adv Drug Deliv Rev. 2001 Apr 25; 47(2-3):251-76）。
【００１６】
本明細書に使用されるような「ＨＤＬ」という用語は、ネイティブなＨＤＬまたは再構成されたＨＤＬを包含する。
【００１７】
典型的には、本発明によるＨＤＬに含まれる因子は、親油性またはＨＤＬを構成しているいくつかのタンパク質に対する親和性のいずれかを有する。または、その因子とＨＤＬとの結合を向上させるように、その因子を化学的に改変することができる。
【００１８】
本発明の一態様では、ＨＤＬはネイティブなＨＤＬである。本明細書に使用されるような「ネイティブなＨＤＬ」という用語は、健康なヒトドナーから精製されたＨＤＬを表す。典型的には、ＨＤＬは、二つの異なる方法：超遠心分離および免疫吸着（immunosorption）によって単離することができる。免疫吸着によるＨＤＬの単離は、アポＡ−Ｉに対するヤギポリクローナル抗体をSepharoseビーズに架橋結合させることによって調製された抗アポＡ−Ｉカラムを使用して行われる。超遠心分離によるＨＤＬの単離は、１．０６３〜１．２１０g/mlのＫＢｒ密度勾配間隔で古典的二段階超遠心分離することによって行われる。そのような方法を実施することは、技術者の能力の範囲内である。
【００１９】
本発明の別の態様では、ＨＤＬは、再構成されたＨＤＬである。本明細書に使用されるような「再構成されたＨＤＬ」、「ｒＨＤＬ」または「合成ＨＤＬ」は、ＨＤＬの少なくとも１種のタンパク質、好ましくはアポＡ−Ｉと結合した１種または複数種の脂質から構成される、ネイティブなＨＤＬに構造的に類似の粒子であって、ＨＤＬの公知の生理学的機能の全てを示す粒子を表す。典型的には、再構成されたＨＤＬの構成成分は、血液から得ることができるか、またはリコンビナント技法によって製造することができる。
【００２０】
典型的には、再構成されたＨＤＬは、リン脂質へのアポＡ−Ｉの複合体形成によって調製することができる。再構成されたＨＤＬを得るための方法は、EP 1 425 031および米国特許第５，６５２，３３９号に開示されている。
【００２１】
典型的には、ｒＨＤＬの調製に適した脂質は、リン脂質、好ましくはホスホチジル（phosphotidyl）コリン、例えば１−パルミトイル−２−リノレオイルホスファチジルコリン（ＰＣ）または１，２−ジパルミトイルＰＣである。場合により、ｒＨＤＬは、他の脂質、例えばコレステロール、コレステロールエステル、トリグリセリド、または他の脂質を含有する。脂質は、合成、天然脂質またはその組合せでありうる。
【００２２】
典型的には、ネイティブなＨＤＬまたは再構成されたＨＤＬは、２〜２５０、好ましくは１０〜２００、より好ましくは２０〜１００、より好ましくは２０〜５０、そして最も好ましくは３０〜４０のリン脂質／アポＡ−Ｉモル比を有する。
【００２３】
さらにｒＨＤＬは、場合によりコレステロール、コレステロールエステル、トリグリセリドおよび／またはスフィンゴ脂質などの追加的な脂質を、好ましくは最大２０の脂質／アポＡ−Ｉモル比で含有しうる。
【００２４】
典型的には、本発明によるＨＤＬは、注射によって、および／または例えば動脈内、腹腔内または好ましくは静脈内投与によって、所望の薬理効果を得るために十分な薬用量で投与することができる。
【００２５】
典型的には、アンチプロテアーゼ、抗酸化因子、有糸分裂阻害因子、鉄代謝に関与する因子、および抗アポトーシス因子から成る群より選択される因子を本発明によるＨＤＬにロードすることは、以下のように行うことができる：
− ＨＤＬを適切な濃度の該因子と共に静かに撹拌しながら３７℃で適切な時間インキュベーションすること（該濃度および時間は、ＨＤＬに対するその因子の親和性に依存する）；次に
− 密度の調整、ＫＢｒ溶液および最終的に食塩溶液を用いたオーバーレイ後に超遠心分離すること；ならびに
− 該因子が強化されたＨＤＬを収集し、食塩溶液に対して透析するか、または遠心装置を使用して濾過する。
【００２６】
または、アンチプロテアーゼ、抗酸化因子、有糸分裂阻害因子、鉄代謝に関与する因子、および抗アポトーシス因子から成る群より選択される因子を本発明によるＨＤＬにロードすることは、以下のように行うことができる：
− 該因子と共のＨＤＬのインキュベーションを、３７℃で適切な時間静かに撹拌しながら行い；そして
− カットオフ遠心装置を使用した濾過。遊離因子は通過画分に入り、一方で強化されたＨＤＬは、上の区画に残る。
【００２７】
当業者は、該ロードを実施するための条件を認識しているであろう。例えば、その因子がＨＤＬに対して低い親和性を有するならば、ＨＤＬは、その因子がＨＤＬに対して自然で高い親和性を有する場合よりも高い濃度の該因子と共により長い時間インキュベーションされよう。加えて、当業者は、上述の濾過を実施するために適切な分子量カットオフの遠心装置を選択可能である。
【００２８】
典型的には、ネイティブなＨＤＬの組成物中に自然に存在する因子をネイティブなＨＤＬにロードすることにより、それらの該因子の自然含量を５〜２０倍増加させることができる。そのようなロードは、本明細書下記に開示されるような様々な疾患の処置におけるＨＤＬの有効性を顕著に向上させる。
【００２９】
または、ネイティブなＨＤＬに、その組成物中に自然には存在しない因子をロードすることができる。そのようなロードは、本発明のＨＤＬに新しい性質を提供することから、本明細書下記に開示されるような様々な疾患の処置に有用である。
【００３０】
典型的には、本発明によるＨＤＬは、急性卒中時に再灌流のために行われる血栓摘除手技の間に動脈内注射によって投与することができる。血管内療法は、静脈内（ＩＶ）血栓溶解に不適当であるかまたは失敗した患者のための有望な代替となっている。（RG Nogueira, et al., Endovascular approaches to acute stroke, part 2: a comprehensive review of studies and trials, AJNR Am J Neuroradiol. 2009 May; 30(5):859-75 & M Mazighi, et al., Comparison of intravenous alteplase with a combined intravenous-endovascular approach in patients with stroke and confirmed arterial occlusion (RECANALISE study): a prospective cohort study, Lancet Neurol, 2009 Sep;8(9):802-9）。本発明によるＨＤＬは、また、エアロゾルによって投与することができる。
【００３１】
アンチプロテアーゼを含むＨＤＬ
本発明は、アンチプロテアーゼを含むＨＤＬに関する。典型的には、該アンチプロテアーゼは：
− エラスターゼ阻害因子であるα−１アンチトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ１、セルピンペプチダーゼ阻害因子クレードＡ−ＩＰＩ００３０５４５７、ＡＡＴ）；
− エラスターゼ阻害因子であるエラフィン（ＰＩ３：ペプチダーゼ阻害因子３）；
− トロンビン、プラスミンおよびプラスミノーゲン活性化因子の阻害因子であるプロテアーゼ−ネキシン１；
− プラスミン阻害因子であるα−２−アンチプラスミン（ＩＰＩ０００２９８６３）；
− エラスターゼ、プロテイナーゼ３およびカテプシンＧの阻害因子である単球／好中球エラスターゼ阻害因子（ＭＮＥＩ、セルピンＢ１）；
− インター−α−トリプシン阻害因子（ＩＰＩ００２１８１９２）；
− 組織性マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害因子；ならびに
− α−１ アンチキモトリプシン
から成る群より選択される。
【００３２】
本発明の一態様では、アンチプロテアーゼ／アポＡ−Ｉのモル比は、少なくとも０．１、好ましくは０．１〜２００、好ましくは０．１〜１００、より好ましくは１〜５０、最も好ましくは１０〜５０である。
【００３３】
特定の態様では、ネイティブなＨＤＬは、それらのアンチプロテアーゼ自然含量が５〜２０倍増加するなど、該アンチプロテアーゼが強化されている。
【００３４】
アポＡ−Ｉおよびアンチプロテアーゼレベルの決定は、当業者の能力の範囲内である。典型的には、該レベルは、市販のＥＬＩＳＡによって判定することができる。または、そして定性的な結果については、デンシトメトリー定量後に標準曲線を作成するために既知量のアポＡ−ＩおよびＡＡＴの両方を使用して、ウエスタンブロットによって両タンパク質を評価することができる。ＨＤＬ強化後にアンチプロテアーゼ活性を有するペプチドおよびタンパク質が存在することは、質量分析によってもモニターすることができる。
【００３５】
本発明の一態様では、アンチプロテアーゼを含むＨＤＬは、慢性閉塞性肺疾患、特に気腫の処置に使用される。ＡＡＴが気腫の処置に有用であることは、十分に確立されている。
【００３６】
気腫は、解剖学に基づき、終末細気管支から遠位の気腔のサイズに正常範囲を超えた増加を引き起こす、肺における構造変化を特徴とする疾患として定義される。本発明者らは、その疾患の臨床症状が、ＨＤＬまたはα−１アンチトリプシン強化ＨＤＬを投与することにより肺中のＡＡＴレベルを増大させることによって予防可能であることを示した。α−１アンチトリプシンは、特に好中球エラスターゼ活性による、肺における肺胞のタンパク質分解性損傷からの保護に有用である。
【００３７】
本発明者らは、単離されたヒトＨＤＬに精製ＡＡＴを強化してそれらのＡＡＴ自然含量を５〜２０倍増加させることが可能であることを示した。ＡＡＴの正常濃度は、１〜３g/Lの範囲であり、そのうち１％未満が循環ＨＤＬによって担持される。
【００３８】
好ましくは、アンチプロテアーゼをロードされた、本発明によるＨＤＬ中のアンチプロテアーゼ／アポＡ−Ｉのモル比は、１〜２００、好ましくは２〜１００、最も好ましくは１０〜５０である。
【００３９】
したがって、ＨＤＬへのα−１アンチトリプシンのロードは、より高いＡＡＴ濃度を提供し、慢性閉塞性肺疾患、特に気腫の処置における該ＨＤＬの有効性を向上させる。
【００４０】
典型的には、ＨＤＬへのＡＡＴのロードは、以下のように行うことができる：
− １mg/mLのＨＤＬをＡＡＴと共に静かに撹拌しながら３７℃で２時間インキュベーション；次に
− 適切な密度（ネイティブなＨＤＬについて１．２５）に調整ならびにＫＢｒ溶液および最終的に食塩溶液をオーバーレイ後に超遠心分離；ならびに
− ＡＡＴ強化ＨＤＬを収集し、食塩溶液に対して透析するか、または５kDaカットオフの遠心装置を使用して濾過する。
【００４１】
または、ＨＤＬのロードは、以下のように行うことができる：
− １mg/mLのＨＤＬをＡＡＴと共に静かに撹拌しながら３７℃で２時間インキュベーション；および
− １００kDaカットオフの遠心装置を使用して濾過。遊離ＡＡＴは通過画分に入り、一方で強化されたＨＤＬは、上の区画に残る。
【００４２】
本発明の別の態様では、アンチプロテアーゼを含むＨＤＬは、虚血性疾患、特に卒中、一過性虚血障害および心筋梗塞の処置に使用される。本発明者らは、アンチプロテアーゼを含むＨＤＬが虚血性疾患、特に卒中の処置に有用であることを示し、例示した。
【００４３】
本発明のなお別の態様では、アンチプロテアーゼを含むＨＤＬは、神経変性障害の処置に使用される。アンチプロテアーゼが神経変性障害の処置に有用であることは、周知である（S. Eriksson et al., Alpha1-antichymotrypsin regulates Alzheimer beta-amyloid peptide fibril formation, Proc. Natl. Acad. Sci. Vol 92, pp 2313-2317, 1995）。
【００４４】
本発明のさらに別の態様では、アンチプロテアーゼを含むＨＤＬは、アテローム血栓症、特に冠状動脈、頸動脈および末梢動脈疾患ならびに腹部大動脈瘤の処置に使用される。本発明者らは、エラスターゼ活性が増加しているアテローム血栓症の場合、ＨＤＬと結合しているＡＡＴが減少していることを示し、例示した。したがって、アンチプロテアーゼを含むＨＤＬは、アテローム血栓症の処置に有用である。
【００４５】
本発明のさらなる態様では、アンチプロテアーゼを含むＨＤＬは、ガンの処置に使用される。アンチプロテアーゼがガンの処置に有用であることは、周知である。（Li W et al., Matrix metalloproteinase-26 is associated with estrogen-dependent malignancies and targets alpha-1 antitrypsin serpin Cancer Res. 2004 Dec 1;64(23):8657-65; Uetsuji S et al, Effect of aprotinin on metastasis of Lewis lung tumor in mice, Surg Today. 1992; 22(5):439-42）。最近の研究は、エラスターゼが、細胞内基質を分解して腫瘍成長の増大につながることが可能なことを報告している（AM Houghton et al., Neutrophil elastase-mediated degradation of IRS-1 accelerates lung tumor growth, Nat Med. 2010 Feb;16(2):219-23）。本発明者らは、ＨＤＬおよびアンチプロテアーゼ強化ＨＤＬが、平滑筋細胞および内皮細胞を含めた、異なる細胞型によって取り込まれ、細胞内にアンチプロテアーゼを運搬（vectorize）することが可能であることを示した。
【００４６】
本発明のさらなる態様では、アンチプロテアーゼを含むＨＤＬは、ステント内再狭窄の処置に使用される。アンチプロテアーゼは、ステント内再狭窄の処置に有用である（Andrade-Gordon P et al., Administration of a potent antagonist of protease-activated receptor-1 (PAR-1) attenuates vascular restenosis following balloon angioplasty in rats, J Pharmacol Exp Ther. 2001 Jul; 298(1):34-42）。
【００４７】
なお別の態様では、アンチプロテアーゼを含むＨＤＬは、敗血症、または心筋梗塞および卒中を含めた虚血／再灌流状態などの、内皮機能不全を伴う病態の処置に使用される。本発明者らは、ネイティブなＨＤＬおよび再構成されたＨＤＬが血液脳関門（ＢＢＢ）に対して保護作用を提供することを実際に示し、例示した。
【００４８】
本発明は、さらに、アテローム血栓症、虚血性疾患、慢性閉塞性肺疾患、神経変性疾患、ガン、ステント内再狭窄、または内皮機能不全を伴う全ての病態を患う被験者を処置するための方法であって、アンチプロテアーゼを含むＨＤＬの有効量を該対象に投与するステップを含む方法に関する。
【００４９】
「ＨＤＬの有効量」によって、任意の医学的処置に適用可能な合理的な便益／リスク比で被験者を処置するために十分な量が意味される。しかしながら、ＨＤＬの合計１日使用量は、担当の医師によって健全な医学的判断の範囲内で決定されることが了解されている。それを必要とする任意の特定の被験者についての特異的治療有効用量レベルは、処置されている疾患または障害の病期ならびに特異的ＨＤＬの活性、被験者の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事、投与時間、投与経路、処置期間、その処置と組合せてまたは同時に使用される薬物を含めた多様な要因に依存する。
【００５０】
抗酸化因子を含むＨＤＬ
本発明は、抗酸化因子を含むＨＤＬに関する。典型的には、該抗酸化因子は：
− パラオキソナーゼ１、２または３（パラオキソナーゼ１、２または３は、細胞内酸化ストレスを抑制し、有機リン化合物を解毒させる）；
− カタラーゼ（カタラーゼは、Ｈ２Ｏ２解毒に関与する）；
− ビタミンＥ（ビタミンＥは親油性抗酸化因子である）；
− エイコサペンタエン酸、ＥＰＡ（Ｃ２０：５）およびドコサヘキサエン酸、ＤＨＡ（Ｃ２２：６）などのω−３脂肪酸；
− ブチルヒドロキシトルエン；
− Ｎ−アセチルシステイン；
− リポタンパク質の酸化を阻害するレスベラトロールおよびヒドロキシチロソールなどのポリフェノール；
− 気腫の発生を予防する抗酸化酵素ファミリーであるチオレドキシン；
− その抗酸化活性により内皮を保護することが報告されているエストロゲン（例えば、エストラジオールは、内皮の一酸化窒素およびプロスタサイクリン生成を増強する）；ならびに
− 赤ワインに含有されるポリフェノールなどの、抗酸化性およびアテローム産生抑制性を示す、エストロゲンレセプターαと結合可能な他の分子。
から成る群より選択される。
【００５１】
本発明の一態様では、抗酸化因子／アポＡ−Ｉのモル比は、少なくとも０．１、好ましくは０．１〜２００、好ましくは０．１〜１００、より好ましくは１〜５０、最も好ましくは１０〜５０である。
【００５２】
特定の態様では、ネイティブなＨＤＬは、それらの抗酸化因子自然含量が５〜２０倍増加するなど、該抗酸化因子が強化されている。
【００５３】
アポＡ−Ｉおよび抗酸化因子のレベルの決定は、当業者の能力の範囲内である。典型的には、アポＡ−Ｉのレベルは、市販のＥＬＩＳＡによって判定することができる。抗酸化因子がタンパク質の場合、そのレベルは、市販のＥＬＩＳＡによって判定することができる。抗酸化因子が脂質または別の種類の分子の場合、そのレベルは、質量分析によって判定することができる。または、抗酸化因子がタンパク質の場合、デンシトメトリー定量後に標準曲線を作成するために既知量のアポＡ−Ｉおよび抗酸化因子の両方を使用して、ウエスタンブロットによって両タンパク質を評価することができる。
【００５４】
本発明の一態様では、抗酸化因子を含むＨＤＬは、アテローム血栓症、特に冠状動脈、頸動脈および末梢動脈疾患ならびに腹部大動脈瘤の処置、ならびに虚血性疾患、特に卒中、一過性虚血障害および心筋梗塞の処置に使用される。酸化ストレスが血管機能障害およびアテローム血栓症のアテローム産生促進メカニズムに関与することは周知である（Z S Nedeljkovic et al., Mechanisms of oxidative stress and vascular dysfunction, Postgraduate Medical Journal 2003;79:195-200）。さらに、抗酸化因子は心保護作用を有する（N. Dhalla, A Elmoselhi, T Hata and N Makino, Status of myocardial antioxidants in ischemia-reperfusion injury, Cardiovascular Research 2000, 47(3):446-456）。したがって、抗酸化因子は、酸化ストレスを抑制することによってアテローム血栓症および虚血性疾患の処置に有用である。
【００５５】
本発明の別の態様では、抗酸化因子を含むＨＤＬは、慢性閉塞性肺疾患、特に気腫の処置に使用される。抗酸化因子が、慢性閉塞性肺疾患の処置、特に気腫の処置にも有用であることは、十分に立証されている（A Cantin et al., Oxidants, antioxidants and the pathogenesis of emphysema, Eur J Respir Dis Suppl., 1985;139:7-17）。
【００５６】
本発明のさらなる態様では、抗酸化因子を含むＨＤＬは、神経変性疾患の処置に使用される。抗酸化因子が神経変性障害の処置に有用であることは、周知である（B Moosmann et al., Antioxidants as treatment for neurodegenerative disorders, Expert Opinion on Investigational Drugs, October 2002, vol.11, No.10, pages 1407-1435）。
【００５７】
本発明のさらに別の態様では、抗酸化因子を含むＨＤＬは、ガンおよびステント内再狭窄の処置に使用される。抗酸化因子がガンの処置に有用であることは、十分に立証されている（Bardia A. et al, Anti-inflammatory drugs, antioxidants, and prostate cancer prevention, Curr Opin Pharmacol. 2009 Jun 30）。抗酸化因子がステント内再狭窄の処置に有用であることも、周知である。（JE Schneider et al., Probucol decreases neointimal formation in a swine model of coronary artery balloon injury: A possible role for antioxidants in restenosis, Circulation, Vol 88, 628-637）。
【００５８】
なお別の態様では、抗酸化因子を含むＨＤＬは、敗血症、または心筋梗塞および卒中を含めた虚血／再灌流状態などの内皮機能不全を伴う病態の処置に使用される。本発明者らは、ネイティブなＨＤＬが血液脳関門（ＢＢＢ）に対して保護作用を提供することを実際に示し、例示した。
【００５９】
本発明は、さらに、アテローム血栓症、虚血性疾患、慢性閉塞性肺疾患、神経変性疾患、ガン、ステント内再狭窄、または内皮機能不全を伴う全ての病態を患う被験者を処置するための方法であって、抗酸化因子を含むＨＤＬの有効量を該被験者に投与するステップを含む方法に関する。
【００６０】
有糸分裂阻害因子を含むＨＤＬ
本発明は、有糸分裂阻害因子を含むＨＤＬに関する。典型的には、該有糸分裂阻害因子は、ラパマイシンとも名付けられたシロミルス（Siromilus）である。
【００６１】
本発明の一態様では、有糸分裂阻害因子／アポＡ−Ｉのモル比は、少なくとも０．１、好ましくは０．１〜２００、好ましくは０．１〜１００、より好ましくは１〜５０、最も好ましくは１０〜５０である。
【００６２】
特定の態様では、ネイティブなＨＤＬは、それらの有糸分裂阻害因子自然含量が５〜２０倍増加するなど、該有糸分裂阻害因子が強化されている。
【００６３】
アポＡ−Ｉおよび有糸分裂阻害因子のレベルの決定は、当業者の能力の範囲内である。典型的には、該レベルは、市販のＥＬＩＳＡによって判定することができる。または、そして定性的な結果については、該レベルは、デンシトメトリー定量後に標準曲線を作成するために既知量の両タンパク質を使用して、ウエスタンブロットによって評価することができる。小分子による強化は、質量分析などの特異的方法によって評価すべきである。
【００６４】
本発明の一態様では、有糸分裂阻害因子を含むＨＤＬは、ガンおよびステント内再狭窄の処置に使用される。
【００６５】
タンパク質キナーゼは、増殖、浸潤、血管新生および転移を含めた、腫瘍の全ての局面の主要なレギュレーターとして出現した。ラパマイシン（シロミルス）およびその誘導体は、下流キナーゼである哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）を阻害する。ｍＴＯＲ阻害因子は、リンパ球およびある種の腫瘍細胞系の成長および増殖を強力に抑制する。したがって、シロミルスは、ガンの処置に有用である。（J Dancey et al., Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment, Nature Publishing Group, volume 2, April 2003, 293-313）。
【００６６】
シロミルスは、その抗増殖性に加えて抗遊走性を有する。シロミルスは、冠状動脈および潜在的に末梢動脈にステント留置後に、内膜肥厚からの保護を提供する。したがってシロミルスは、再狭窄の発生率を減少させるために有用である。（S Marx et al., The Development of Rapamycin and Its Application to Stent Restenosis; Circulation, 2001; 104:852）。
【００６７】
本発明は、さらに、ガンまたはステント再狭窄を患う被験者を処置するための方法であって、該被験者に有糸分裂阻害因子を含むＨＤＬの有効量を投与するステップを含む方法に関する。
【００６８】
鉄代謝に関与する因子を含むＨＤＬ
本発明は、鉄代謝に関与する因子を含むＨＤＬに関する。典型的には、鉄代謝に関与する該因子は：
− マクロファージによる鉄取込みに関与するトランスフェリン；
− マクロファージによるヘモグロビン取込みに関与するハプトグロビン；および
− 鉄代謝に関与するヘプシジン
から成る群より選択される。
【００６９】
本発明の一態様では、鉄代謝に関与する因子／アポＡ−Ｉのモル比は、少なくとも０．１、好ましくは０．１〜２００、好ましくは０．１〜１００、より好ましくは１〜５０、最も好ましくは１０〜５０である。
【００７０】
特定の態様では、ネイティブなＨＤＬは、それらの鉄代謝に関与する因子の自然含量が５〜２０倍増加するなど、該因子が強化されている。
【００７１】
アポＡ−Ｉのレベルおよび鉄代謝に関与する因子のレベルの決定は、当業者の能力の範囲内である。典型的には、該レベルは、市販のＥＬＩＳＡによって判定することができる。または、そして定性的な結果については、該レベルは、デンシトメトリー定量後に標準曲線を作成するために既知量の両タンパク質を使用して、ウエスタンブロットによって評価することができる。小分子による強化は、質量分析などの特異的方法によって評価すべきである。
【００７２】
一態様では、鉄代謝に関与する因子を含むＨＤＬは、アテローム血栓症、特に冠状動脈、頸動脈および末梢動脈疾患ならびに腹部大動脈瘤の処置に使用される。プラーク内出血がアテローム血栓プラークの易傷性の要因であることは、周知である。これには、酸化促進性の鉄を含有するヘモグロビンおよび結合したヘムの放出が含まれる。したがって、鉄代謝に関与する因子は、アテローム血栓症の処置に有用である（R.T. Calado et al., HFE gene mutations in coronary atherothrombotic disease, Braz J Med Biol Res. 2000 Mar; 33(3):301-6）。
【００７３】
別の態様では、鉄代謝に関与する因子を含むＨＤＬは、虚血性疾患、特に卒中、一過性虚血障害、および心筋梗塞の処置に使用される。トランスフェリンが急性卒中に保護的役割を果たすことは、周知である（C Altamura et al, Ceruloplasmin/Transferrin system is related to clinical status in acute stroke, Stroke. 2009 Apr; 40(4):1282-8. Epub 2009 Feb 19）。したがって、鉄代謝に関与する因子は、虚血性疾患の処置に有用である。
【００７４】
なお別の態様では、鉄代謝に関与する因子を含むＨＤＬは、慢性閉塞性肺疾患、特に気腫の処置に使用される。
【００７５】
さらなる態様では、鉄代謝に関与する因子を含むＨＤＬは、神経変性疾患の処置に使用される。鉄代謝がパーキンソン病およびアルツハイマー病などの神経変性障害に関与することは、立証されている（D Gerlach et al., Altered Brain Metabolism of Iron as a Cause of Neurodegenerative Diseases?, Volume 63 Issue 3, pages 793 - 807）。したがって、鉄代謝に関与する因子は、神経変性疾患の処置に有用である。
【００７６】
本発明は、さらに、アテローム血栓症、虚血性疾患、慢性閉塞性肺疾患または神経変性疾患を患う被験者を処置するための方法であって、該被験者に鉄代謝に関与する因子を含むＨＤＬの有効量を投与するステップを含む方法に関する。
【００７７】
抗アポトーシス因子を含むＨＤＬ
本発明は、抗アポトーシス因子を含むＨＤＬに関する。
【００７８】
典型的には、該抗アポトーシス因子は：
− 抗アポトーシス性であると報告された、細胞内膜においてスフィンゴミエリンの代謝から産生される生体活性脂質であるスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）（Morales A, Fernandez-Checa JC Pharmacological modulation of sphingolipids and role in disease and cancer cell biology. Mini Rev Med Chem. 2007. 7(4):371-82）；
− パラオキソナーゼ１および２；
− カタラーゼ；
− ω−３脂肪酸（アポトーシスをダウンレギュレーションし、そしてまた細胞生存を促進するω−３必須脂肪酸ファミリーのメンバーであってニューロプロテクチンＤ１前駆体であるドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ；２２：６ｎ−３）を含む）（Belayev L et al. Robust docosahexaenoic acid-mediated neuroprotection in a rat model of transient, focal cerebral ischemia. Stroke. 2009;40(9):3121-6）；
− エイコサペンタエン酸由来の抗炎症性メディエータであるレゾルビン（Resolvin）Ｅ１（ＲｖＥ１）（Keyes KT et al. Resolvin E1 protects the rat heart against reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2010;299(1):H153-64）；および
− ＨＤＬに自然に存在するクラスタリンまたはアポリポタンパク質Ｊ（Djeu JY, Wei S. Clusterin and chemoresistance Adv Cancer Res. 2009;105:77-92）
から成る群より選択される。
【００７９】
好ましくは、該抗アポトーシス因子はＳ１Ｐである。ＨＤＬ結合型Ｓ１Ｐは、血管弛緩、細胞生存、細胞接着性、血管新生、ならびに一酸化窒素（ＮＯ）およびプロスタサイクリン（ＰＧＩ２）などの二つの強力な内因性アテローム産生抑制抗血栓分子の合成に及ぼすＨＤＬの有益作用を担う（C Rodriguez et al. Sphingosine-1-phosphate: A bioactive lipid that confers high-density lipoprotein with vasculoprotection mediated by nitric oxide and prostacyclin. Thromb Haemost. 2009 Apr;101(4):665-73）。
【００８０】
本発明の一態様では、抗アポトーシス因子／アポＡ−Ｉのモル比は、少なくとも０．１、好ましくは０．１〜４００、好ましくは０．１〜２００、より好ましくは１〜１００、最も好ましくは１０〜５０である。
【００８１】
アポＡ−Ｉレベルおよび抗アポトーシス因子レベルの決定は、当業者の能力の範囲内である。典型的には、アポＡ−Ｉレベルは、市販のＥＬＩＳＡによって判定することができる。抗アポトーシス因子がタンパク質の場合、そのレベルは、市販のＥＬＩＳＡによって判定することができる。抗アポトーシス因子が脂質または別の小分子の場合、そのレベルは、質量分析によって判定することができる。または、抗アポトーシス因子がタンパク質の場合、デンシトメトリー定量後に標準曲線を作成するために既知量のアポＡ−Ｉおよび抗アポトーシス因子の両方を使用して、ウエスタンブロットによって両タンパク質を評価することができる。
【００８２】
特定の態様では、ネイティブなＨＤＬは、それらの抗アポトーシス因子自然含量が５〜２０倍増加するなど、ネイティブなＨＤＬの組成物中に自然に存在する該因子が強化されている。
【００８３】
別の態様では、ネイティブなＨＤＬは、抗アポトーシス因子／アポＡ−Ｉのモル比を１０〜２００倍増加させるように、ネイティブなＨＤＬの組成物中に自然には存在しない抗アポトーシス因子が強化されている。
【００８４】
一態様では、抗アポトーシス因子を含むＨＤＬは、アテローム血栓症、虚血性疾患、慢性閉塞性肺疾患および内皮機能不全を伴う全ての病態の処置に使用される。
【００８５】
本発明は、さらに、アテローム血栓症、虚血性疾患、慢性閉塞性肺疾患または内皮機能不全を伴う全ての病態を患う被験者を処置するための方法であって、該被験者に抗アポトーシス因子を含むＨＤＬの有効量を投与するステップを含む方法に関する。
【００８６】
以下において、以下の実施例および図面により本発明を例示する。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】超遠心分離により単離されたＨＤＬがα−１アンチトリプシンを含有することを示す図である。（Ａ）ヒト血漿由来ＨＤＬおよびＬＤＬは、ＫＢｒ勾配密度をかけた二段階超遠心分離によって単離した。α−１アンチトリプシン（ＡＡＴ、２００ng）抗体およびα−２−アンチプラスミン（ａ２ＡＰ、１００ng）抗体を用いて４個の異なるバッチのリポタンパク質（５μg）を免疫ブロッティングした。ＨＤＬは、ＡＡＴを含有したが、α２ＡＰを含有しなかった。（Ｂ）１００μｇのＨＤＬおよびＬＤＬを１００μgのＡＡＴと共に２００μLの合計体積で静かに振盪しながら３７℃一晩（１６時間）インキュベーションした。次に、両方のリポタンパク質を超遠心分離によって単離し、それぞれ１μｇをＡＡＴおよびアポＡ−Ｉに対するウエスタンブロット分析のためにロードした。結果は、３回の独立した実験の代表である。（Ｃ）超遠心分離によって単離されたＨＤＬ２画分およびＨＤＬ３画分を銀染色するか（上欄）または抗ＡＡＴ抗体を用いてウエスタンブロット分析に供するか（下欄）のいずれかとした。表示されたゲルは、４回の独立した実験の代表である。
【図２】ＬＤＬではなくＨＤＬが、アンチエラスターゼ活性を表すことを示す図である。（Ａ）５０μg/mL ＨＤＬ（４個の異なるバッチ）またはＬＤＬ（３個の異なるバッチ）の存在下または不在下で白血球エラスターゼ（１０nM）を発色性基質（ＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｐＮａ）と共にインキュベーションした。ＡＡＴ（１０nM）をエラスターゼ阻害の陽性対照として使用した。加水分解速度（mOD/min）のデータは、三つ組で行われた４回の実験の平均±ＳＤである（＊、エラスターゼ単独に比べてＰ＜０．０１）。（Ｂ）プラスミン活性は、ＨＤＬまたはＬＤＬ（５０μg/mL）と共のインキュベーションによって影響されない。Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓペプチド（ＶＦＫ）をプラスミン阻害因子として使用した。
【図３】ＨＤＬは、白血球エラスターゼによって誘導されたアノイキスを阻害することを示す図である。（Ａ〜Ｃ）培養ヒトＶＳＭＣの顕微鏡写真。（Ａ）未処置対照細胞。（Ｂ）エラスターゼ（１０nM）単独によって１６時間処置されたＶＳＭＣ、または（Ｃ）５０μg/mL ＨＤＬ存在下で処置されたＶＳＭＣ。（Ｄ）ＨＤＬと共のインキュベーションは、白血球エラスターゼによるフィブロネクチン分解を防止する。細胞培養上清中のフィブロネクチンを検出する代表的なウエスタンブロット。（Ｅ）生存接着ＶＳＭＣを、エラスターゼ（１０nM）による処理後にＭＴＴ試験を用いることによって定量した。結果を未処置対照細胞の率として表現する。各カラムは、三つ組で行われた４回の別々の実験の平均±ＳＤを表す（＊、エラスターゼに比べてＰ≦０．００５）。（Ｆ）それぞれ４人および３人の異なる被験者から１００μg/mLのＨＤＬまたはＬＤＬの存在下または不在下でＡＡＡ管腔内血栓の管腔層によって２４時間馴化された培地と共にインキュベーションされた細胞におけるアポトーシスの定量。結果を未処置細胞に対する率として表現する（対照吸光度：０．０８２±０．０２８nm）。各欄は、５人の異なる患者由来のＡＡＡ管腔内血栓によって馴化された培地を用いて二つ組で行われた２回の別々の実験の平均±ＳＤを表す（＊、ＨＤＬなしの処理に比べてＰ＜０．０５）。（Ｇ）ヒト胸動脈内膜を１０nMエラスターゼ±５０μg/mL ＨＤＬまたはＬＤＬと共に２４時間インキュベーション後の、Apostain（登録商標）によるアポトーシス核の検出（陽性の核は褐色に見える）。
【図４】細胞内ＨＤＬが、エラスターゼによって誘導されるアポトーシスを防止することを示す図である。（Ａ）ＭＴＴ試験。１００μg/mLのＨＤＬを４および１６時間予備インキュベーションし、次に細胞をすすいでから、１０nMエラスターゼと共に１６時間インキュベーションした。値は平均±ＳＤである（＊、エラスターゼ単独に比べてｐ＜０．００５）。（Ｂ）１００μg/mL ＨＤＬ（ＨＤＬは、ＤＩ−Ｃ１８カルボシアニンでラベルされている）をＶＳＭＣと共に８時間インキュベーションし、ＤＡＰＩで対比染色し、落射蛍光顕微鏡下で観察した。（Ｃ）５０μg/mL ＨＤＬと共に４時間インキュベーション後に、アポ−ＡＩおよびＡＡＴについて二重免疫染色を行った。共焦点顕微鏡法によって観察を行った（アポ−ＡＩ−緑、ＡＡＴ−赤、共局在は黄色）。
【図５】ＡＡＡを有する患者が、エラスターゼ活性に関連してより少ないα１ＡＴを保有することを示す図である。（Ａ）ＥＬＩＳＡによって測定されたアポＡ−Ｉレベルは、対照被験者（ｎ＝２３）に比べてＡＡＡを有する患者（ｎ＝１３）の血漿中で有意に減少している。データは、平均±ＳＤである（＊、健康対照に比べてＰ＜０．０００１）。（Ｂ）各被験者から個別に単離されたＨＤＬをＡＡＴの検出用に免疫ブロッティングした。バンドのデンシトメトリー分析によって得られた値を、ＨＤＬ−アポＡ−Ｉ濃度に対して基準化した。６人の患者および６人の対照のＨＤＬを示す、代表的なウエスタンブロット（分析した４３試料の合計からの結果を任意の単位/μg/μL（アポＡ−ＩのμL）で表現する。＊、対照に比べてｐ＜０．０００１）。（Ｃ）ＨＤＬのアンチエラスターゼ活性を判定するために、白血球エラスターゼ（１０nM）をＨＤＬと共にインキュベーションした。結果を（mOD/min)/μg/mLアポ−Ａ１で表現する。エラスターゼ阻害能は、ＡＡＡを有する患者由来のＨＤＬにおいて有意に減少している（＊、対照群に比べてＰ＜０．０００１）。（Ｄ）白血球エラスターゼを健康対照およびＡＡＡ患者由来の希釈血漿（１：１０００）と共にインキュベーションすることによって血漿アンチエラスターゼ活性をin vitroで試験した。結果をmOD/minで表現する。
【図６】ＡＡＴおよびアポリポタンパク質Ａ−Ｉのウエスタンブロット検出を示す図である。異なる量のＡＡＴおよび５または２０μgのＨＤＬをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（０．１〜１μg）にロードした。還元条件下で泳動後に、ゲルをニトロセルロース膜に転写（transblot）し、抗ＡＡＴ抗体および抗アポＡＩ抗体と共に古典的手順のウエスタンブロットを用いた）。
【図７】エラスターゼを点滴注入され、次に最初の１週間に食塩水、ＡＡＴ（３．５mg/kg）、ＨＤＬまたはＨＤＬ−ＡＡＴ（７５mg/kg）を４回注射されたマウスからの左肺の長軸矢状断（５μm）へのヘマトキシリン／エオシン染色を示す図である（左）。気腫発生の半定量（右）。
【図８】卒中の急性期におけるＨＤＬ療法の効果を示す図である。卒中開始の２４時間後のＴＴＣ染色を使用した脳梗塞の測定。梗塞は、赤色の正常脳の背景に白色に見える。図Ａ：ビヒクルによって処置されたラット。図Ｂ：卒中開始後にＨＤＬ注入（１０mgKg）によって処置されたラット。
【図９】代表的なゼラチンザイモグラムを示す図である。プロＭＭＰ９／ＭＭＰ９およびＭＭＰ２活性は、卒中開始の２４時間後に非梗塞領域（Ｃ）に比べて梗塞領域（Ｉ）で増加している。ＨＤＬ注入は、梗塞領域におけるプロＭＭＰ９／ＭＭＰ９活性化の顕著な減少と関連する。Ｒｅｆ．：プロＭＭＰ２／９および活性型ＭＭＰ２／９を含有する参照。Ｃ−Ｖ：ビヒクル群からの虚血と対側の半球。Ｉ−Ｖ：ビヒクル群からの梗塞領域。Ｃ−ＨＤＬＶ：ＨＤＬ群からの虚血と対側の半球。Ｉ−ＨＤＬ：ＨＤＬ群からの梗塞領域。
【図１０】正常または虚血条件下の血液脳関門（ＢＢＢ）の透過性に及ぼすエラスターゼおよび好中球の作用を示す図である。精製されたエラスターゼおよび好中球は、虚血条件下でのみＢＢＢの透過性増加を誘導した。ＨＤＬ（ヒト血漿から精製）は、ＢＢＢ透過性におけるこのプロテアーゼ介在性増加を有意に阻害することができた。
【図１１】ＨＤＬのＡＡＴ強化を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の硝酸銀染色を示す図である。
【図１２】卒中を患うラットにおけるリコンビナント組織プラスミノーゲン活性化因子（ｒｔＰＡ）を用いた処置後のＨＤＬの静脈内注射の保護作用を示す図である。Ａ：食塩水投与、リコンビナント組織プラスミノーゲン活性化因子（ｒｔＰＡ）、およびＨＤＬと一緒のｒｔＰＡで処置されたラットにおける梗塞体積（対側の半球に対する％）の測定。Ｂ：食塩水投与、リコンビナント組織プラスミノーゲン活性化因子（ｒｔＰＡ）、およびＨＤＬと一緒のｒｔＰＡで処置されたラットにおける出血の存在の肉眼的評価。
【００８８】
実施例
実施例１： ＨＤＬのアンチエラスターゼ活性は、平滑筋細胞アノイキスを防止する（新しいアテローム産生抑制性）
プロテオームアプローチを使用した様々な研究は、ＨＤＬがその構成的アポリポタンパク質Ａ−Ｉ以外の多数のタンパク質を担持しうることを示している。質量分析およびウエスタンブロットを使用して、本発明者らは、超遠心分離または抗アポＡ−Ｉカラムを使用した選択的アフィニティー免疫吸着のいずれかによって単離されたＨＤＬ中にα−１アンチトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ１、セルピンペプチダーゼ阻害因子クレードＡ、「ＡＡＴ」、エラスターゼ阻害因子）が存在することを示した。さらに、本発明者らは、ＨＤＬが強力なアンチエラスターゼ活性を有することを報告する。本発明者らは、また、ＬＤＬではなくＨＤＬだけがＡＡＴと結合可能であることを示した。ＨＤＬと結合したＡＡＴは、ヒト血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）およびex-vivoで培養された哺乳類動脈においてエラスターゼによって誘導される細胞外マトリックスの分解、細胞剥離およびアポトーシスを阻害可能であった。細胞周囲のタンパク質分解のマーカーとして使用されるエラスターゼによるフィブロネクチンの分解は、ＨＤＬの添加によって防止された。腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）血栓試料中に存在するエラスターゼは、培養ＶＳＭＣのアポトーシスを誘導することも可能であった。この現象は、ＬＤＬではなく、ＨＤＬの添加によって防止された。最終的に、本発明者らは、ＡＡＡを有する患者から単離されたＨＤＬ中のＡＡＴの比が、マッチした対照からの比よりも減少していることを報告するが、これは、これらの患者においてＨＤＬがエラスターゼを阻害する能力が減少していることを示している。結論として、本発明者らは、ＡＡＴおよびそのアンチエラスターゼ活性に起因しうるＨＤＬの新しい潜在的アテローム産生抑制性の証拠を提供する。
【００８９】
ＨＤＬ−コレステロールおよびその主要タンパク質であるアポＡ−Ｉの血漿中レベルは、観察研究において一貫してアテローム血栓リスクと逆相関している。ＨＤＬの有益作用は、抗酸化作用、抗炎症作用または抗血栓作用などの他のアテローム産生抑制性が十分に実証されているにもかかわらず、主としてコレステロールの逆輸送に起因するとされている。健康被験者からのＨＤＬに対するプロテオームアプローチを用いたいくつかの研究によって、ＨＤＬ２およびＨＤＬ３画分中にα−１アンチトリプシンが確認された。このセリンプロテアーゼ阻害因子は、好中球エラスターゼの天然循環阻害因子である。本発明者らは、アテローム血栓病変および循環白血球エラスターゼ−α−１アンチトリプシン複合体中に存在するこのプロテアーゼが、頸動脈狭窄ならびに心筋梗塞および卒中のリスクと相関したことを示した。加えて本発明者らは、腹部大動脈瘤の管腔内血栓中に存在する好中球エラスターゼが、動脈壁平滑筋細胞の消失およびその後の治癒不在に中心的な役割を果たすことを示した。病的動脈壁中に存在し、細胞外マトリックス分解に続いてアポトーシスを誘導可能であると報告されたプロテアーゼのうち、エラスターゼは、最も強力なもの一つである。多形核好中球（ＰＭＮ）は、腹部大動脈瘤またはプラーク内出血のいずれかにおいて血栓が形成する間に捕捉されると活性化する循環白血球の主要クラスを表し、破綻に向けたアテローム硬化性プラーク発展の推進力として最近記載された。ＰＭＮの脱顆粒は、細胞外区画におけるエラスターゼの放出へとつながり、エラスチン、フィブロネクチン、トロンボスポンジン、ビトロネクチンなどの多数の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を分解可能である。細胞外マトリックスのタンパク質分解は、機械抵抗を減少させることによって直接的に、および正常には生存シグナルを伝達する細胞−ＥＣＭ接触の破壊に続いて血管細胞のアポトーシスを誘導することによって間接的に、動脈壁を直接不安定化する。本研究において本発明者は、天然エラスターゼ阻害因子であるα−１アンチトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ１、セルピンペプチダーゼ阻害因子クレードＡ、「ＡＡＴ」）が、ＨＤＬおよびＨＤＬと結合していること、ならびにそれによりＨＤＬがエラスターゼ活性と、ＥＣＭ分解および平滑筋細胞アノイキスなどのin situ有害作用とを阻害することを示した。第二部では、本発明者らは、ＡＡＡを有するまたは有さない患者の血漿中のＨＤＬおよびＡＡＴ−ＨＤＬレベルを判定した。したがって、本発明者らは、本明細書においてＨＤＬのアテローム産生抑制能の原因となりうるＨＤＬの新しい機能、すなわち動脈壁安定化に有利になる可能性のあるアンチエラスターゼ活性を記載する。
【００９０】
材料および方法
反応物および細胞培養
ヒト好中球エラスターゼおよびα−１アンチトリプシンは、Calbiochem製であった。ヒト大動脈血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ、Promocell製）を、１０％ウシ胎児血清を含有する培地（Promocell SM2）中で培養した。
【００９１】
リポタンパク質の単離
ＥＤＴＡ上に採取された健康志願者の血漿から二つの異なる方法：超遠心分離および選択的アフィニティー免疫吸着によってリポタンパク質を単離した。免疫吸着によるＨＤＬの単離を行った。簡潔には、アポＡ−Ｉに対するウサギポリクローナル抗体をSepharoseビーズに架橋結合させることによって抗アポＡ−Ｉカラムを準備した。抗体を有さない模擬カラムおよび無関係な免疫グロブリンＧ（Innovative research）を使用してＩｇＧカラムを同条件で準備した。健康被験者由来の血漿（非喫煙者、年齢＞５０歳、インフォームドコンセントを得る）をアポＡ−Ｉ、疑似またはＩｇＧ Sepharoseビーズと共に（１２．５mLビーズに対してＥＤＴＡ−血漿１mL）静かに振盪しながら４℃で一晩インキュベーションした。次に、０．５Ｍ濃度に達するように追加的なＮａＣｌを含有する５容の食塩水（０．９％ ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、０．０２５％ ＮａＮ３）でカラムを３回すすいだ。食塩水で最後に洗浄した後に、０．２Ｍ酢酸、０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ３）を含有する溶液でカラムを溶出し、トリス塩基で直ちにｐＨ７．９に緩衝化した。次に、食塩水−ＥＤＴＡでＨＤＬを徹底的にすすぎ、遠心濃縮装置（カットオフ５kDa、Vivascience）を使用して濃縮した。または、血漿密度をＫＢｒでｄ＝１．０６３に調整し、ＫＢｒ食塩水溶液（ｄ＝１．０６３）をオーバーレイした。超遠心分離を１００，０００ｇ、１０℃で２０時間行った。ＬＤＬを含有する上のリポタンパク質画分をＫＢｒで密度１．２５g/mLに調整し、次に食塩水（ｄ＝１．００６）をオーバーレイしてから、１００，０００ｇ、１０℃で２０時間超遠心分離した。このステップの後に、ＬＤＬ画分（橙色の層）を単一バンドとして回収し、遠心濾過装置を使用した３回の洗浄ステップによってＫＢｒを除去した。最初の超遠心分離から生じ、ＨＤＬを含有する下の画分の密度をＫＢｒで１．２５ｇ／ｍＬに調整し、食塩水／ＫＢｒ溶液（ｄ＝１．２１）をオーバーレイした。２回目の超遠心分離および続く洗浄ステップは、ＨＤＬ画分がチューブの最上層となることを除き、ＬＤＬと同様である。記載した場合、ＨＤＬ２およびＨＤＬ３は別々に収集した。全ての画分は、生理食塩水で透析すること、または遠心分離を行い食塩水で３回洗浄することのいずれかによって脱塩した。
【００９２】
２Ｄ非変性電気泳動
正常リポタンパク質のヒト血漿から抗ＡＩ免疫吸着カラムクロマトグラフィーによってアポＡ−Ｉ含有リポタンパク質（ＬｐＡＩ）を精製した。抗ＨＳＡおよびプロテインＡセファロースカラムを通過させることによって、残留する血清アルブミンおよび免疫グロブリンを除去した。二次元アガロース×ＰＡＧ非変性電気泳動によってＬｐＡＩ画分を分析した。０．０６２Ｍトリス、０．０２７Ｍトリシン、０．００５Ｍ乳酸カルシウム（ｐＨ８．３）中に調製した０．８％アガロース（w/v）（Bio-Rad、カタログ番号162-0126）の中で１５V/cmの電場強度でＬｐＡＩを電気泳動した。ＰＡＧの直線勾配（０〜３０％ Ｔ）をかけた第二の方向にアガロース片を平衡になるまで５℃で電気泳動した（３０００V-h）。タンパク質混合物を使用して二次元ＰＡＧ（ストークス直径）を較正した。その混合物には：卵アルブミン（６．０nm）、ウシ血清アルブミン（７．１nm）、乳酸デヒドロゲナーゼ（８．１nm）、カタラーゼ（１０．４nm）、フェリチン（１２．２nm）、チログロブリン（１７．０nm）、低密度リポタンパク質（ｄ＝１．０３０〜１．０５０g/ml、２５nm）が含まれた。
【００９３】
２ＤＮゲルによって分離されたＨＤＬ種の質量分析
トリプシン（Promegaカタログ番号V5111）を用いたゲル内消化によって、２Ｄ ＰＡＧによって分離されたタンパク質を質量分析用に調製した。Ultimate ＨＰＬＣシステム（Dionex）を使用する逆相クロマトグラフィーによってペプチドを分離した。C18 Pepmap100カラム（７５um ＩＤ×１５cm）を採用して２〜３０％アセトニトリル／０．１％ギ酸の勾配を３８分間かけ、続いてさらに２分間かけて５０％アセトニトリル／０．１％ギ酸まで増加させた。溶出して来るペプチドをLTQ-Orbitrap（Thermo）に導入した。そこで以前にフラグメンテーションされた構成成分の動的排除（dynamic exclusion）を採用して、各サーベイスキャンで観察された６種の最も存在度の高い構成成分をデータ依存取得を用いてフラグメンテーションした。Mascot Distiller v2.1.1.0を使用して生データをピークリストに変換し、次にProtein Prospector v5.0（http://prospector2.ucsf.edu）を用いてデータベースのヒトのエントリーと照らし合わせて解析した。そのデータベースは、２００７年１２月４日にダウンロードされたUniprotデータベースから成り、そのデータベースの終わりに配列シャッフル／ランダム化されたデコイバージョンが連結され、合計１５２２４４個のエントリーが検索された。連結されたデータベースは、ペプチドの偽陽性率の推定を可能にした。検索パラメーターは、最大１個の切断ミスのトリプシン切断特異性、２０ppm以内のプリカーサー質量確度および０．６Da以内のフラグメント質量確度を必要とした。システインのカルバミドメチル化を、定常改変として検索し、メチオニン酸化、ペプチドＮ−末端グルタミンからのピログルタミン酸形成、およびタンパク質のＮ−末端アセチル化を可変改変として考慮した。受容基準は、最小ペプチドスコア１５、最小タンパク質スコア２２および最大期待値０．１であった。分析された全てのスポットについて、これらの閾値を超えて報告された合計１９９８種のペプチドがあり、それらには、データベースのデコイ部分との３個のマッチが含まれた。したがって、このデータセットに関する同定のペプチド偽陽性率は、約０．３％（（３×２）／１９９８）である。
【００９４】
２ＤＮゲルに関するウエスタンブロット
免疫ブロットについて、検量用タンパク質をビオチン化した（Bio-Rad、カタログ番号170-6529）。分離されたタンパク質をニトロセルロース膜（０．２μm, Bio-Rad、カタログ番号162-0212）上に電気泳動的に移動させた（５５Ｖ、１８ｈ、１０℃）。非特異的結合をカゼイン（２５mg/ml、０．０２Ｍトリス、ｐＨ８．５）でブロッキングした。アポＡ−Ｉに対する抗体（注文生産されたヤギポリクローナル抗体）およびα−１アンチトリプシンに対する抗体（Calbiochem、マウスモノクローナル抗体、カタログ番号178260)で膜を探索し、結合した抗体をビオチン化二次抗体であるアビジン−ビオチン−ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート(Pierce Chemical Co、カタログ番号1852410）、および０．１０Ｍイミダゾール（ｐＨ７．０）への３，３’−ジアミノベンジジン（０．０５％、w/v）／塩化ニッケル（２．５mM）／Ｈ２Ｏ２（０．０５％、v/v）を使用して明らかにした。
【００９５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のウエスタンブロット分析
それぞれ４個および３個の異なる調製物からのＨＤＬおよびＬＤＬ（５μg）をＳＤＳ−１２％ ＰＡＧＥによって分離した。電気泳動後に、タンパク質をニトロセルロース膜上に移動させ、ＴＢＳ−Ｔ（トリス緩衝食塩水、ｐＨ７．４、０．１％ Tween20）への５％粉乳でブロッキングし、次にウサギポリクローナル抗α−２−アンチプラスミン（α２ＡＰ）（１：１０００希釈、Calbiochem)またはウサギポリクローナル抗ＡＡＴ（１：１０００希釈、Dako）のいずれかと、ペルオキシダーゼコンジュゲート型二次抗体（１：２５００希釈、Jackson Immunoresearch laboratories）とを用いて探索した。精製ＡＡＴ（２００ng、Calbiochem）およびα２ＡＰ（１００ng、Calbiochem）を対照として使用した。細胞培養上清中のフィブロネクチンフラグメントを検出するために、馴化培地５μLをＳＤＳ−８％ＰＡＧＥによって分析した。次に、転写された膜を、ウサギポリクローナル抗ヒトフィブロネクチン（１：１０００希釈、Sigma製）を用いて探索した。全ての場合に、適切なペルオキシダーゼコンジュゲート型二次抗体を使用し（１：２５００希釈、Jackson Immunoresearch laboratories）、続いてＥＣＬ検出した。較正されたスキャナー（GS800 Bio-Rad）を使用してデンシトメトリー分析を行った。
【００９６】
エラスターゼおよびプラスミン活性の決定
ヒト好中球エラスターゼ（１０nM, Calbiochem）をＰＢＳ（終体積１００μl）中で１．５mMのエラスターゼ発色性基質ＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｐＮａ（Calbiochem）と共にインキュベーションした。プラスミン（１０nM, American Diagnostica）を５０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、８０mM ＮａＣｌ中で０．７５mMの選択的プラスミン発色性基質ＣＢＳ００６５（Diagnostica Stago, Asnieres, France）と共にインキュベーションした（終体積１００μl）。ＡＡＴ（４０nM）、ｄ−バニル−ｌ−フェニルアラニル−ｌ−リシンクロロメチルケトン（１０μM, VFK, Calbiochem）（プラスミンの選択的不可逆阻害剤）、ＨＤＬ（５０μgまたは用量反応実験については１〜４．５μg）およびＬＤＬ（５０μg）をエラスターゼまたはプラスミンと共に室温で１５分間予備インキュベーションしてから基質を添加した。ヒト血漿（１：１０００希釈）または患者由来のＨＤＬ（１：４希釈）を１０nMエラスターゼの存在下で同条件でインキュベーションした。４０５nmおよび４９０nmでの分光測定によって基質加水分解を３７℃で２時間モニターした。ＨＤＬアンチエラスターゼ活性をＨＤＬ−アポＡ−Ｉの量に対して基準化した。
【００９７】
細胞剥離アッセイおよびアポトーシス
ヒトＶＳＭＣを１２ウェルプレート中で集密になるまで成長させ、血清を２４時間欠乏させてから刺激した。次に、ＶＳＭＣを１０nMエラスターゼ（Calbiochem）またはヒトＡＡＡの管腔内血栓で馴化した培地（１：５希釈）と共に、ＨＤＬおよびＬＤＬ（１００μg/ml）の存在下または不在下で１６時間インキュベーションした。実験の終わりに、細胞上清を吸引し、３．０００ｇで５分間遠心分離し、ウエスタンブロットによりフィブロネクチンタンパク質分解フラグメントについて分析した。残りの生存接着細胞をＰＢＳで洗浄し、記載のようにＭＴＴ試験（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を用いて判定した。または、測光酵素イムノアッセイ（Cell death detection ELISAPLUS, Roche）を製造業者の説明書に従って用いてヒストン関連ＤＮＡフラグメントの定量によってアポトーシスを決定した。トリプシン化細胞にトリパンブルー排除試験を行うことによって、残りの接着細胞の９５％が膜透過化を示さなかったことを確認した。
【００９８】
アポトーシスのin situ検出
ヒト胸動脈は、Bichat病院（Paris, France）で心臓手術を受けている患者から得た。これらの組織は、フランス倫理法およびＩＮＳＥＲＭ倫理委員会により外科廃棄物として見なされる。外膜の除去によって得られた胸動脈の等しい区域（５mmの輪）を、無血清ＲＰＭＩ中でＨＤＬまたはＬＤＬ（それぞれ０．２mg/mL）の存在下または不在下で１０nMエラスターゼと共にまたはなしに３７℃（５％ ＣＯ２）で２４時間インキュベーションした。胸終動脈をエラスターゼと共にインキュベーション後に、組織を３．７％パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中に包埋した。アポトーシスのin situマーカーとして１本鎖ＤＮＡに対するモノクローナル抗体（Apostain, Alexis）を使用して、厚さ５μmの切片に免疫組織化学検査を行った。
【００９９】
ＡＡＡ由来馴化培地の調製
ＲＥＳＡＡプロトコール（REflet Sanguin de l'evolutivite des Anevrysmes de l'Aorte abdominale）に登録された手術を受けている患者から腹部大動脈瘤試料（ＡＡＡ）を得た。全ての患者から書面にてインフォームドコンセントを得て、そのプロトコールはフランス倫理委員会（CCPPRB, Cochin Hospital）によって承認された。手術の間に採取されたＡＡＡ管腔内血栓を１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）（２mL/g湿組織）と共に室温で２時間インキュベーションした。次に、エラスターゼを含有する抽出物を、培養アッセイのために以前に記載されたようにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で透析した。
【０１００】
カルボシアニンを用いたＨＤＬラベル化
ＨＤＬを１０μL/mL DiIC18カルボシアニン（Molecular Probes）と共に静かに振盪しながら３７℃で一晩インキュベーションし、次に上記のように超遠心分離によって分離した。ＶＳＭＣを１００μg/mLラベル化ＨＤＬと共に８時間インキュベーションした。ＰＢＳで３回洗浄後に、細胞をＤＡＰＩ（０．５μg/mL、１０分間）で対比染色し、落射蛍光顕微鏡下で視覚化した。
【０１０１】
免疫細胞蛍光
共焦点顕微鏡検査：ヒトＶＳＭＣをLabtekスライド上に蒔き、５０μg/mL ＨＤＬと共に４時間インキュベーションした。次に、このスライドをＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＳＢ−ＢＳＡ ４％に入れてブロッキングし、１：５０希釈のヤギ抗α−１アンチトリプシン抗体および抗アポＡＩ（Calbiochem）と共にインキュベーションした。次に、１：２００希釈された適切なフルオレセイン５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）ラベル化二次Ａｂ（Sigma）と共に、スライドを１時間インキュベーションした。
【０１０２】
Ａｍｅｔｈｙｓｔコホート
ＡＭＥＴＨＹＳＴ（動脈瘤メタロプロテイナーゼおよび高血圧の研究）は、１ヶ月以内に血管内修復を予定された無症候性ＡＡＡ（５cmよりも大きな大動脈直径を有する）の患者のコホートが参加している、Insermによって推進された進行中の研究である。これらの患者の年齢、性別を健康志願者とマッチさせた。全ての研究参加者からインフォームドコンセントを得た。研究は、倫理委員会によって承認された（Cochin Hospital Comite de Protection des Personnes se Pretant a la Recherche Biomedicale、承認番号1930 & 1931）。
【０１０３】
患者についての排除基準は、ガン、感染症、および任意の免疫介在疾患であった。予冷したＥＤＴＡチューブに最小限の血行静止で末梢血を標準条件（１０分間安静にした絶食中の被験者、午前８から１０時の間）で採血した。収集から３０分以内に２回の遠心分離（２５００rpm、１５min、１２℃および２５００rpm、１５min、４℃）を行って血球から血漿を分離した。使用まで血漿試料を−８０℃で保存した。
【０１０４】
アポＡ−Ｉ濃度の決定
アポリポタンパク質Ａ−Ｉ濃度は、Mabtech AB（Nacka Strand, Sweden）製ＥＬＩＳＡ試験を使用して製造業者の説明書に従って決定した。
【０１０５】
統計解析
GraphPAD InStat（GraphPAD Software）で統計解析を行った。ＡＡＡと年齢性別がマッチした対照との比較に関して、統計解析の間に、喫煙習慣についてのさらなる調整を行ったが、喫煙を調整していない比較の結果と変わらなかった。全ての実験を少なくとも３回行った。結果を平均±ＳＤとして表現し、ＡＮＯＶＡによって解析した（ｐ＜０．０５の場合に差が有意であると見なした）。
【０１０６】
結果
ＬＤＬではなくＨＤＬはα−１アンチトリプシンを含有する
本発明者らは、リポタンパク質のディファレンシャルな浮遊性を利用して、Karlssonらによって用いられた技法に類似する、ＫＢｒを用いた二段階超遠心分離技法によりＨＤＬを単離し、プロテオームアプローチによってＨＤＬ中からα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）を確認した。本発明者らは、４人の異なる被験者の血漿から単離されたＨＤＬがＡＡＴを含有するが、同条件で単離されたＬＤＬがこの主要血漿タンパク質を欠如することをウエスタンブロットによって示した（図１Ａ）。同じ試料について行われたα−２−アンチプラスミンに対するウエスタンブロットは、ＬＤＬにもＨＤＬにもこの別種の豊富な血漿タンパク質が存在することを示すことができなかった。血漿中のその高い濃度にもかかわらず、ＡＡＴは、ＨＤＬと同時に単離された混入物ではなさそうである。アポＡ−ＩまたはＡＡＴのいずれかをコーティングされたＥＬＩＳＡプレートで結合実験を行った。アポＡ−Ｉは、非飽和的であるがＡＡＴに結合可能であり、これは、低親和性または非特異的結合を示唆している。第二のステップで、本発明者らは、ＨＤＬがより多くのＡＡＴを捕捉する能力を試験した。このために、本発明者らは、ＨＤＬまたはＬＤＬのいずれかを精製ＡＡＴと共に（１mg：１mg）静かに撹拌しながら３７℃で１６時間インキュベーションし、次に遊離／未結合ＡＡＴを除去するために超遠心分離によって両リポタンパク質を再度単離した。本発明者らは、ＬＤＬではなくＨＤＬが追加的なＡＡＴと結合してそれを取込み可能であることをウエスタンブロットによって示した（図１Ｂ）。結果は、ＬＤＬとは対照的に、ＨＤＬがＡＡＴに対する親和性を有することを示している。最終的に本発明者らは、ＡＡＴがＨＤＬ２よりもＨＤＬ３画分に豊富に存在することを示した（図１Ｃ）。
【０１０７】
ＡＡＴはＨＤＬのα−１画分中に存在する
並行して、本発明者らは、抗アポリポタンパク質Ａ−Ｉカラムを使用する選択的アフィニティー免疫吸着によってＨＤＬを単離した。溶出はリポタンパク質ＡＩ含有画分（ＬｐＡＩ）の回収を可能にした。非変性二次元電気泳動ゲルによってＬｐＡＩ種を分離し、アポＡ−Ｉを含有する各粒子をその電荷と大きさに応じて泳動させた。ゲルをウエスタンブロット分析用に転写するか、または続くプロテオーム分析用にクマシーブルーによって染色した。十分なｙおよびｂ系列イオンを含有するスペクトルは、ＡＡＴおよびアポＡ−Ｉ由来のペプチドの同定を可能にした。コロイド状クマシーブルー染色によって検出された、種々のスポットに対して行われた質量分析から、直径７〜１０nmのStokes径の範囲のα−１粒子でのＡＡＴが確認され；予想どおりアポＡ−Ｉもこれらの粒子から確認された。２３種の独特なＡＡＴペプチドが最も小さな直径７nmの粒子から確認され、一方で３〜４種のペプチドが他方のより大きな８〜１０nmの粒子から確認されたが、これは、主なＬｐＡＩ ＡＡＴ質量が７nmのＬｐＡＩ粒子中に局在することを示唆している。これらの粒子中のアポＡ−Ｉ組成は変動し、７nmのＬｐＡＩ粒子から同定された独特なペプチドは、より大きな８〜１０nm粒子から同定されたペプチドよりも少なかった（それぞれ８種に対して１３〜１８種）。７nmのＬｐＡＩ粒子の組成には、より少ない量のパロキソナーゼ（paroxonase）、アポＡ−ＩＶ、アポＤ、アポＣ−ＩＩＩ、第Ｖ因子、およびα−１酸性糖タンパク質１が含まれた。ＡＡＴに関するウエスタンブロットから、α−１電気泳動移動度の７〜１０nmの粒子が抗アポＡ−Ｉ染色と共局在するＡＡＴを含有したことが示されたが、これは、質量分析によって得られた結果を確認している。ブロット上のアポＡ−Ｉに対する弱い免疫反応性は、アポＡ−Ｉに対する抗体が非変性条件下で２Ｄ電気泳動後のブロットとうまく反応しないという事実が原因でありそうである。ＡＡＴは、また、大型のα画分の方が検出される程度が少なかった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離後の通常のウエスタンブロットから、抗体なしの模擬カラムに比べて、抗ＡＩカラムによって単離されたＬｐＡＩ中にのみＡＡＴが存在することが確認された。同じ血漿からの超遠心分離によって単離されたＨＤＬもまた、ＡＡＴ陽性であった。
【０１０８】
ＨＤＬ結合型ＡＡＴはin vitroでアンチエラスターゼ活性を示す
第二のステップで、本発明者らは、ＨＤＬ結合型ＡＡＴがエラスターゼ活性を阻害する潜在性を試験した。健康な被験者から単離されたＨＤＬと共に白血球エラスターゼ（３０nM）をin vitroでインキュベーションし、その活性を発色性基質ＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｐＮａを使用して判定した。エラスターゼは、ＨＤＬによって用量依存的に阻害され、ＨＤＬのバッチ（異なる健康被験者から単離された）に応じて５〜２０μg/mL ＨＤＬの範囲でエラスターゼ活性のほぼ完全な阻害が達成された。対照的に、３人の異なる健康被験者からの５０μg/mLのＬＤＬは、全くアンチエラスターゼ活性を示さなかった（図２Ａ）。ヒトＡＡＡ管腔内血栓の管腔層からの馴化培地または白血球エラスターゼの供給源としての活性化好中球の上清を使用して類似の結果が得られた。ＨＤＬおよびＬＤＬの両方は、プラスミン活性を阻害することができなかった（図２Ｂ）。
【０１０９】
ＨＤＬはエラスターゼ誘導ＶＳＭＣアノイキスを防止する
以前に記載されたように、精製された白血球エラスターゼまたは腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）の血栓中に存在するエラスターゼは、細胞外マトリックスの分解によりヒト血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の剥離およびその後の死滅を誘導可能である（アノイキス）。本発明者らは、ＨＤＬが白血球エラスターゼにより誘導される剥離を防止する潜在性を試験するためにこのモデルを使用した。図３（Ａ〜Ｃ、Ｅ）において、本発明者らは、ＶＳＭＣの生存率が１０nMエラスターゼと共のインキュベーションによって減少したこと、およびこの作用がＨＤＬの存在下で用量依存的に防止されたことを示す（１００μg/mL ＨＤＬとの同時インキュベーションについて２４±９に対して９８±２％、ｐ＜０．００５）。しかしながら、ＬＤＬは、エラスターゼによって誘導されるＶＳＭＣ剥離に作用を有さなかった。ＬＤＬとは対照的に、ＨＤＬは、エラスターゼによって誘導されるフィブロネクチン分解をほぼ完全に防止することができ、これは、細胞周囲マトリックスタンパク質分解の直接阻害を示している（図３Ｄ）。次に、本発明者らは、ＡＡＡ管腔内血栓の管腔層によって馴化された培地と共にインキュベーションされた細胞に対するＨＤＬの保護作用を判定した。本発明者らは、白血球エラスターゼがＡＡＡ血栓の中間層および反管腔側層に比べて、主に管腔層に存在したこと、ならびにそれがＶＳＭＣの剥離を誘導可能であったことを以前に報告した。本発明者らは、ＨＤＬがこの現象を阻止することができ、ＡＡＡ血栓の管腔層からの馴化培地と共のインキュベーションによって誘導されるアポトーシスを阻害することを示す（図３Ｆ、ｐ＜０．０５）。最終的に、エラスターゼと共に胸終動脈をex vivoでインキュベーションすることは、組織内で検出可能なＶＳＭＣアポトーシスにつながり、この作用は、ＬＤＬではなく、ＨＤＬと共に同時インキュベーションすることによって阻害された。これは、ＨＤＬの存在下で胸動脈をエラスターゼと共にインキュベーションしたときの、アポスタイン（Apostain）陽性核の不在によって示される（図３Ｇ）。
【０１１０】
ＨＤＬは、ＡＡＴによって仲介されることが報告されていない、細胞内作用を含めた抗アポトーシス作用を示すことが公知であるので、本発明者らは、ＶＳＭＣをＨＤＬと共に予備インキュベーションすること（パルス−チェイス）がエラスターゼにより誘導されるアポトーシスを防止するために十分であるかどうかを試験した。細胞を１００μg/mL ＨＤＬと共に４または１６時間インキュベーションし、ＰＢＳで３回慎重にすすぎ、次に１０mMエラスターゼと共にインキュベーションした（図４Ａ）。本発明者らは、ＨＤＬによって１６時間前処理された細胞の場合にレムナント抗アポトーシス作用を観察できたことを示す（４１±８．２％の阻害）。本発明者らは、赤色カルボシアニン−ラベル化ＨＤＬを使用してＨＤＬが細胞によってインターナリゼーションされたことをチェックし（図４Ｂ）、アポＡＩが細胞内でＡＡＴと共局在したことを共焦点顕微鏡検査によって示した（図４Ｃ）。
【０１１１】
ＡＡＡ患者のＨＤＬは健康被験者由来のＨＤＬよりも少ないＡＡＴを担持する
他の形態のアテローム血栓症のように、正常な被験者よりもＡＡＡ患者の方がＨＤＬレベルが低いこと、および白血球エラスターゼがＡＡＡの病態生理に関与することが報告されている。本明細書で本発明者らは、ＡＡＡ患者が健康な被験者よりも有意に低いＨＤＬを有することを報告する（１．１１mmol/L±０．２３、ｎ＝１３対１．３５mmol/L±０．３、ｐ＝０．０１７、ｎ＝２３）。血漿アポＡ−Ｉレベルもまた、対照よりもＡＡＡ患者の方が６８±２．６％低かった（図５Ａ、ｐ＜０．０００１）。本発明者らは、ＡＡＡ患者由来のＨＤＬが対照被験者由来のＨＤＬよりも担持できるＡＡＴが少ないという仮説を検証した。このために、本発明者らは、各個体（ＡＡＡ患者またはマッチさせた対照）からＨＤＬを単離し、ウエスタンブロットによってＡＡＴの存在を判定し、それをＥＬＩＳＡによって定量されたアポＡＩ含量に対して基準化した（マッチさせた対照に比べて２９±０．５９％の減少、ｐ＜０．０００１）。図５Ｂに、直径＞５cmの動脈瘤を有する患者が、そのＨＤＬと結合したＡＡＴを対照群よりも有意に少なく有することを示す。したがって、ＨＤＬに関連するエラスターゼ阻害能は、対照よりも患者の方が低かった（図５Ｃ）が、全体的な血漿アンチエラスターゼ活性は、２群で類似しており（図５Ｄ）、血漿に比べて区画化組織が重要であることを強調している。
【０１１２】
結論として本発明者らは、本明細書において白血球エラスターゼおよび血管細胞に対するその関連する有害作用を阻害可能な、ＨＤＬについての新しいアンチプロテアーゼ活性を報告する。本発明者らは、ＡＡＡ患者におけるＨＤＬおよび結合したＡＡＴのレベル減少が、血管壁におけるエラスターゼに対する効果的な保護がより小さいことの原因となるおそれがあり、この疾患の進行に有利に働くことを示した。
【０１１３】
実施例２：ＡＡＴ強化ＨＤＬは正常マウスの肺に到達し気腫の発生を予防する
静脈内注射後の肺におけるＨＤＬのバイオアベイラビリティーを試験するために、ＨＤＬをカルボシアニン（赤色）（１０mg/kg）でラベル化した。注射の２時間後に、マウスを屠殺し；肺をＯＣＴ中に包埋し、凍結させてから切片にした。ＡＡＴについて免疫染色を行い（緑色）、核をＤＡＰＩで対比染色した。ヒト血漿から超遠心分離により精製されたＨＤＬを蛍光色素によってラベル化し、ＩＶ注射後に追跡した。注射されたＨＤＬは、肺に到達することができ、注射の２〜４８時間後に検出することができた。また、肺中ＨＤＬの検出が可能な最大注射後時間を検出した。マウスを屠殺した後で、肺および肝臓の両方を蛍光ＨＤＬの蓄積についてチェックした。
【０１１４】
方法
ａ／ ＨＤＬの精製、ＡＡＴの強化、品質管理
まず、同じバッチのＨＤＬおよびＡＡＴ強化ＨＤＬを用いて作業するために、超遠心分離によってヒト血漿から精製された大量のＨＤＬをプールした。ＡＡＴを静かに撹拌しながら３７℃で１６時間インキュベーションした。次に、それらのＨＤＬを超遠心分離によって再度精製し、遊離の未結合型ＡＡＴを除去した。ＨＤＬおよびＡＡＴをロードされたＨＤＬに関してＡＡＴおよびアポリポタンパク質Ａ−Ｉについてのウエスタンブロットを行った。正常ＨＤＬおよび強化ＨＤＬ中に存在するＡＡＴの量を判定するために、異なる量のＡＡＴもＷＢによって分析した（図６）。並行してアンチエラスターゼアッセイを行い、ＷＢによって得られた結果を裏付けた。これらの実験は、強化ＨＤＬ中のＡＡＴを定量するものである。次に、同量の遊離ＡＡＴを対照群に注射した。この実験の目的は、ＨＤＬ−ＡＡＴが単独で注射されたＡＡＴよりも気腫の発生を大きく予防するかどうかを試験することである。自然にＡＡＴを含有するＨＤＬもまた別の群に注射する
【０１１５】
実験スキーム
エラスターゼ処置マウスを４群に分け、食塩水、ＨＤＬ（７５mg/kg体重）、ＡＡＴ強化ＨＤＬ（７５mg/kg）またはＡＡＴ単独（３．７５mg/kg）単独を注射した。エラスターゼ注射の２時間後にＨＤＬ、ＨＤＬ−ＡＡＴ、ＡＡＴまたは食塩水を静脈内注射し、次にさらに３回、２４、４８および３６時間後に注射した。
【０１１６】
気管内点滴注入のために使用されたエラスターゼは、マウスによって迅速に排出された（１時間後に肺にエラスターゼの痕跡なし）。したがって、本発明によるアンチエラスターゼを含むＨＤＬの使用は、気腫の誘導に使用されるエラスターゼではなく、好中球浸潤に関連する内因性エラスターゼを阻害するためである。
【０１１７】
４５匹のマウスを気管内エラスターゼ点滴注入に供する。１週間目の間に１５匹のマウスに食塩水を４回注射し、続いてエラスターゼ処置を行い、次に各群の１０匹のマウスにＨＤＬ、ＡＡＴ強化ＨＤＬまたは同量のＡＡＴ単独を注射した。
【０１１８】
エラスターゼを最初に点滴注入した２８日後にマウスを屠殺し、肺胞破壊をスコア付けすることによって気腫を半定量した（２人の独立した病理学者による二重盲検判定）。
【０１１９】
平均±ＳＤを図７に示すが、これは、ＨＤＬ−ＡＡＴが気腫の発生を４０％保護するが、一方でＨＤＬおよびＡＡＴは軽度の保護作用だけを示すことを示している（ＨＤＬ−ＡＡＴ対食塩水：ｐ＜０．００１、ＨＤＬ−ＡＡＴ対ＨＤＬ：ｐ＝０．０１３、ＡＡＴ対食塩水：ｐ＝０．０９７、ＨＤＬ−ＡＡＴ対ＡＡＴ：ｐ＝０．１１２）。
【０１２０】
結論
本発明者らは、ＡＡＴ強化ＨＤＬが正常マウスの肺に到達し、気腫の発生を予防することを示した。
【０１２１】
実施例３：腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）におけるアンチプロテアーゼのベクターとしてのＨＤＬの評価
ＡＡＡは、腹部大動脈に局在する、アテローム血栓症の特定臨床症状であり、ＡＡＡではプロテアーゼ活性、特にエラスターゼが推進力であると示されている。いくつかの証拠は、ＨＤＬがアテローム硬化病変をターゲティングすることができ、そこでコレステロール浄化粒子として作用することを示している。ガドリニウム−ＨＤＬがアテローム硬化性プラークのイメージングのためのトレーサーとして使用されている。
【０１２２】
本発明者らは、アポＥ−／−マウスにおけるＤｉＩＣ１８ラベル化ＨＤＬの注射が大動脈洞からのアテローム硬化病変の脂質コアの強い染色を招くことを示す。
【０１２３】
以前の研究は、特にガンの分野においてリポタンパク質に薬物またはタンパク質をロードする実行可能性を実証してきた。本発明者らは、動脈瘤などの複雑アテローム血栓疾患の進行に二つの主なセリンプロテアーゼであるプラスミンおよびエラスターゼが関与するという証拠を提供した。
【０１２４】
本発明者らは、プラスミンおよびエラスターゼの阻害因子の運搬体としてＨＤＬを使用する。
【０１２５】
プラスミンは、プラスミノーゲンから、共に複雑プラークにおいて活性なその活性化因子（組織型（ｔＰＡ）またはウロキナーゼ（ｕＰＡ））によって産生される。ＨＤＬに以下の薬物およびタンパク質をロードしてから、アテローム血栓合併症に対するそれらの影響を評価するために動脈瘤性アポＥ欠損マウスモデルに注射する：
− α−１アンチトリプシン：好中球エラスターゼの自然阻害因子であり、ＨＤＬの一部であることが示されたもので、再構成されたＨＤＬ粒子に組込むことが容易である、
− トラネキサム酸：プラスミノーゲン上のリシン結合部位を可逆的にブロッキングすることによってそのアンチプラスミン作用を発揮する合成リシン誘導体である。これは、組織、フィブリンまたは細胞外マトリックスへのプラスミノーゲンの結合ならびにそれからプラスミンへのその後の変換を防止する。
【０１２６】
本発明者らは、実施例１においてＨＤＬにＡＡＴをロードできることを示した。
【０１２７】
アンジオテンシンＩＩを注入されたアポＥ欠損マウスモデルにおいて、ＨＤＬ介在性アンチプロテアーゼ療法を判定した。アポＥ−／−マウスは、アテローム血栓合併症なしに大動脈根に脂肪線条を発生する。
【０１２８】
いくつかのグループが、これらの高脂血症マウスにおけるＡｎｇ ＩＩ注入が急速に複雑病変の形成へとつながり、腹部大動脈瘤または複雑不安定プラークの発生を招くことを示している。
【０１２９】
マウスにおけるこれらの複雑病変は、中膜変性、外膜炎症、壁在血栓またはプラーク内出血を含めた、ヒト疾患の多数の局面を表す。
【０１３０】
このモデルにおいて、これらの不安定病変は、大動脈根ではなく下行大動脈に発生し、血管壁におけるタンパク質分解活性の増強の証拠を提供している。
【０１３１】
方法
アポＥ−／−−Ａｎｇ ＩＩマウスモデル
３〜６月齢雄性アポＥ−／−マウスを、皮下浸透圧ミニポンプを経由したＡｎｇ ＩＩ（１０００ng・kg-1・min-1）の４週間注入に供する（ｎ＝１０）。追加的な２群（ｎ＝１０）にＨＤＬまたはα−１アンチトリプシン強化ＨＤＬのいずれかを静脈内注射する。
【０１３２】
ＨＤＬへのα−１アンチトリプシンのロード
健康な個体から単離されたＨＤＬを、市販の精製α−１アンチトリプシン（１mg/mL）と共に静かに撹拌しながら３７℃で１６時間インキュベーションする。次に、ＨＤＬの密度をＫＢｒで１．２５g/mLに調整し、食塩水／ＫＢｒ溶液（ｄ＝１．２１）をオーバーレイした後に、ＨＤＬを超遠心分離（１００，０００ｇ、一晩）によって再度単離する。ＨＤＬ画分をチューブ最上部の単一バンドとして回収し、遠心フィルター装置を使用して３回の洗浄ステップによりＫＢｒを除去する。ウエスタンブロット分析は、α−１アンチトリプシン強化の効率を試験するものである。
【０１３３】
プラーク破綻および中膜変性の判定
動物を安楽死させ、腹腔および胸腔に入り、右心室から採血し、左心室を経由して大動脈をＰＢＳで洗浄する。腹部大動脈を解剖顕微鏡下で露出させ、外膜周囲組織を大動脈壁から慎重に切開する。デジタルノギスで最大大動脈直径を決定する。続いて大動脈根および心臓を切開する。腹部大動脈（最下位肋間動脈から回腸分岐部まで）および胸部大動脈を切断および秤量し、これらの組織の部分を凍結切片用にＯＣＴ中に包埋する（免疫組織化学検査および脂質の判定ためのオイルレッドＯ染色により判定される細胞組成の決定）か、または生化学アッセイのために均質化／超音波処理する（脂質含量の決定）。
【０１３４】
結論
ＨＤＬは、ＡＡＴを送達し、腹部大動脈瘤を予防することができる。
【０１３５】
実施例４：ラット卒中モデルにおけるＨＤＬの保護作用の評価
卒中は、西洋諸国における成人の罹患および死亡の主な原因である。急性期の卒中において現在承認されている唯一の薬物は、血小板溶解薬ｔＰＡである。ｔＰＡの使用は、非常に短期の治療ウインドウに限定され、症候性脳出血の１０倍増加も引き起こす。セリンプロテアーゼ（プラスミンおよびｔＰＡなど）およびマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ３、ＭＭＰ９）は、ｔＰＡ処置に関連してまたは関連せずに脳虚血損傷および出血性変化に決定的な役割を果たすことが示されている。
【０１３６】
他者によってすでに記載されたように、本発明者らは、ラット塞栓性卒中モデルにおいて虚血領域中のＭＭＰ９活性化を実証している。
【０１３７】
本発明者らは、卒中急性期の間のＨＤＬ注射が神経保護性でありうるという仮説を検証した。
【０１３８】
本発明者らは、ラット塞栓性卒中モデルを開発した（ex-vivoで作った血栓を中大脳動脈に注射）。
【０１３９】
卒中急性期におけるＨＤＬの静脈内注入は、その後の虚血性損傷に対して強い保護作用を招いた。
【０１４０】
卒中の２４時間後の死亡率は、プラセボ群で４１．６％であり、それに対してＨＤＬ処置群で１２．５％であった（１群ｎ＝１５）、ｐ＜０．０５。
【０１４１】
２４時間目に、脳梗塞体積の中央値はＨＤＬ群で９．２％（ＩＱＲ４．６〜１５．６）であり、それに対してプラセボ群では２９．５％（１２．９〜６６．６）であった（ｐ＜０．０５）。
【０１４２】
神経障害は、プラセボに比べてＨＤＬ群の方が減少し、ＭＭＰ９（プロ型および活性型の両方）は、ＨＤＬ治療後に虚血領域が有意に減少した（図８および９）。
【０１４３】
本発明者らの卒中モデルにおけるＨＤＬの神経保護メカニズムを解明するために、いくつかの仮説を検証し；特に本発明者らは、ＨＤＬに関連するアンチエラスターゼ活性の存在が、血栓によって誘導される脳損傷の予防に重要であるかどうかを評価する。本発明者らは、また、血液脳関門（ＢＢＢ）のin vitroモデルを使用して、ＢＢＢに対する血栓の細胞毒性およびその後の透過性を試験する。ＢＢＢに及ぼすＨＤＬの潜在的保護作用を試験する。
【０１４４】
ＨＤＬ粒子は、コレステロール輸送を逆転することに加えて、急性傷害から内皮細胞を保護しうる抗炎症作用、アンチプロテアーゼ作用、および抗血栓作用を発揮することが公知である。再構成されたＨＤＬの投与は、高コレステロール血症または低ＨＤＬレベルを有する患者における内皮機能不全を正常化することが示されている。多形核好中球（ＰＭＮ）は、急性虚血性脳損傷および虚血誘導ＢＢＢ破壊に主要な役割を果たし、ここで、それらに結合したマトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）は、ＢＢＢの分解に関与する。
【０１４５】
ＨＤＬは内皮接着分子のサイトカイン誘導発現を阻害することから、ＰＭＮの接着および遊出を減少させる。したがって、本発明者らは、卒中の開始後（０〜５時間）のＨＤＬ注射が虚血領域におけるＰＭＮの動員を、そしてまた卒中後の脳損傷に及ぼす有益作用を軽減しうるという仮説を立てた。
【０１４６】
材料および方法
塞栓性卒中モデル
動物の世話および実験プロトコールは、Animal Ethics Committee of the University Paris 7、認可番号75-214によって承認された。体重３００〜３５０gの雄性Sprague-Dawleyラットを、空気と混合されたイソフルラン（導入のために４％；手術中は１％）を用いて自然呼吸下で麻酔した。中大脳動脈中に前もって形成した血餅の塞栓によって局所脳虚血を誘導した。手術期間中に加熱パッドで体温を３７℃＿０．５に維持した。血糖、動脈血圧、および血液ガスもまた手術中にモニターした。
【０１４７】
標本サイズの計算
群間の脳梗塞体積における相対的な５０％の差（ＨＤＬ対プラセボ）の検出力が８０％となる研究を計画した。ｔ検定を用いて両側αレベル０．０５で統計検定を行った。卒中の２４時間後の梗塞体積が中央値４２．１であったことを示す予備データに基づいて（２５〜７５パーセンタイルを考慮する四分位間が１７．６〜６５．０）、本発明者らは、１群あたり１７匹のラットを使用した。
【０１４８】
実験プロトコール
ラットに卒中開始直後に精製ＨＤＬ（２または１０mgのアポＡ−Ｉ/kg体重）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ、１０mgアポＢ/kg体重）または食塩水を静脈内投与した（１群ｎ＝１７）。卒中開始の３または５時間後に追加の４群に食塩水またはＨＤＬ（１０mgアポＡ−Ｉ/kg体重）のいずれかを与えた。以前に報告された、ラットにおけるＨＤＬの薬物動態に従って、単回静脈内注射を行った。コンピューターベースの無作為化を用いて薬物治療方式を各群に割当てた。実験を盲検化し、作業者は手術および転帰判定の間に群の割当てを知らなかった。本発明者らは、卒中開始の２４時間後に運動、知覚およびバランス試験の複合である改変神経重症度スコア（modified Neurological Severity Score）を使用して死亡率および神経障害を評価した。
【０１４９】
除外基準
総病変体積が＿５％であった場合（生理食塩水群でｎ＝３、ＬＤＬ群でｎ＝２、ＨＤＬ群でｎ＝５）、またはくも膜下出血が存在した場合（ＨＤＬ群でｎ＝１）、動物を分析から除外した。塞栓性卒中誘導の３時間以内に麻酔または手術が原因の死亡は起こらなかった。
【０１５０】
梗塞体積および脳浮腫の測定
局所虚血誘導の２４時間後にラットを安楽死させた。脳の冠状切片７枚（厚さ２mm）を２％ ２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（Sigma-Aldrich）で室温で２０分間染色した。２４時間時点になる前に死亡した動物における梗塞体積も評価し、それを結果に含めた。次式を使用して浮腫を補正して体積計算を盲検的に行った：
１００×（対側性半球体積−非梗塞性同側性半球体積）／対側性半球体積
２個の半球の間の体積差を計算し、左半球の体積で除算することによって脳浮腫を決定した。酵素電気泳動（前記の２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド染色と適合性である）以外の全ての補助的実験（エバンスブルーおよび免疫染色）は、追加の動物に対して行った。
【０１５１】
ＨＤＬおよびＬＤＬの調製
以前に記載されたように超遠心分離によって健康志願者の血漿プールからＨＤＬおよびＬＤＬを単離した。免疫比濁法によって１４個のアポタンパク質Ｂおよびアポタンパク質Ａ１の濃度を決定したが、それらの濃度は、ＨＤＬおよびＬＤＬの相互混入を全く示さなかった。５個の異なるバッチのＨＤＬを研究のために使用した。ＬＤＬおよびＨＤＬ画分の純度（アルブミン混入の不在）は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に続くクマシーブルー染色によって検証した。
【０１５２】
カルボシアニンを用いたＨＤＬラベル化およびin vivoトラッキング
ＨＤＬを８．５g/mL DiIC18カルボシアニン（Molecular Probes Inc）と共に静かに振盪しながら３７℃で一晩インキュベーションし、次に超遠心分離によって分離した。卒中開始の直後にラベル化ＨＤＬ（１０mg アポＡ−Ｉ/kg）を静脈内投与し（ｎ＝６）、安楽死の直前にフルオレセインイソチオシアネート−デキストラン（２０００kDa; Sigma-Aldrich）を注射した（ｎ＝３）。断頭後に、脳切片を最適切削温度媒質中で包埋し、直ちに凍結した。クリオスタットを使用して冠状切片（８μm;ブレグマの０．７０mm後方）を調製した。細胞核を４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（０．５μg/mL、１０分間）で染色し、切片を落射蛍光顕微鏡下で観察した。
【０１５３】
肝機能の評価のためのアラニントランスアミナーゼおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの定量
各群からベースライン、卒中開始の１、３、および２４時間後に採血した（１群ｎ＝４）。アラニンおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの血漿活性を市販のキットによってOlympus AU400分光光度計を使用して測定した。
【０１５４】
エバンスブルーの血管外遊出
血管外遊出したエバンスブルー色素の蛍光検出を用いて、ＢＢＢの透過性を定量評価した。卒中誘導直後にラットをＨＤＬ（１０mg/kg）または食塩水で処置した（１群ｎ＝６）。次に、血餅注射の２４時間後に２％エバンスブルー食塩水溶液を注入した（４mL/kg静脈内）。３時間後に、ラットをペントバルビタールで深麻酔し、食塩水を経心的に灌流して血管内の色素を洗浄した。脳を取り出し、２mmの冠状切片にし、最適切削温度中で包埋し、凍結した。１０μm切片（ブレグマの０．７０mm後方）を調製した。エバンスブルーの血管外遊出を蛍光顕微鏡によって観察し、形態計測ソフトウェア（Histolab 6.1.5; Microvision Instruments）を用いて半自動的に定量した。
【０１５５】
免疫組織化学検査
凍結切片を３．７％パラホルムアルデヒドで固定し、１０％ヤギ血清でブロッキングした。切片を一次抗体と共に４℃で一晩インキュベーションした。マウス抗ラット内皮細胞抗原モノクローナル抗体（２．５μg/mL; Serotec）を使用して血管を検出し、ウサギ抗ミエロペルオキシダーゼポリクローナル抗体（１６．５μg/mL; Dako）を使用してＰＭＮを検出し、抗グリア線維性酸性タンパク質抗体（５．８μg/mL; Dakocytomation）を使用して星状細胞を検出し、抗ＮＦ２００抗体（１７μg/mL; Sigma-Aldrich）を使用してニューロンを視覚化した。マウス抗ラット細胞間接着分子−１モノクローナル抗体（１０μg/mL; Biolegend）も使用した。本発明者らは、各実験セットに一次抗体として非免疫性ＩｇＧを含めてシグナルの特異性を試験し、二次抗体としてAlexa-Fluor 488または555を使用した。デジタル取込みシステムをインターフェースで連結した蛍光顕微鏡を用いて免疫染色を分析した。形態計測ソフトウェア（Histolab 6.1.5; Microvision Instruments）を用いて免疫染色された細胞数を半自動的に決定した。全ての免疫組織学的評価は、処置を盲検化された観察者によって実施した。
【０１５６】
ゼラチン酵素電気泳動
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゼラチン酵素電気泳動
断頭および脳の取り出しの直後に、同側性虚血脳組織および対応する対側性非虚血領域を慎重に切開し、抗生物質および抗真菌剤を含有するＲＰＭＩ１６４０（１０μL/μg湿組織）（Gibco）中で３７℃で２４時間別々にインキュベーションし、脳組織によって放出されたプロテアーゼを収集した（ｎ＝７）。遠心分離（３０００ｇ、１０分間、２０℃）後に、等体積の馴化培地を、２．５mg/mLゼラチンを含有する１０％ポリアクリルアミドに溶かした０．２％ドデシル硫酸ナトリウムの存在下で非還元条件下で電気泳動した。National Institutes of Health Image 1.42qソフトウェアを使用したデンシトメトリーによってゼラチン溶解活性を定量した。
【０１５７】
In Situ酵素電気泳動
１０μm冠状切片（ブレグマの＋０．７０mm後方）をリン酸緩衝生理食塩水単独または１０mmol/L １，１０−フェナントロリン（広域ＭＭＰ阻害因子）のいずれかと共に室温で２時間予備インキュベーションした。次に、それらを蛍光発生基質ＤＱ−ゼラチン（４０μg/L; Molecular Probes）と共に酵素電気泳動緩衝液（５０mmol/L トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０mmol/L ＮａＣｌ、５mmol/L ＣａＣｌ２、２００μmol/L アジ化ナトリウム）中で３７℃で２時間インキュベーションし、続いて１０％中性ホルマリン固定を行った（１群ｎ＝４）。落射蛍光顕微鏡を使用してタンパク質分解活性を緑色蛍光として検出した。対照切片をＤＱ−ゼラチンなしに酵素電気泳動緩衝液中でインキュベーションして可能性のある組織自己蛍光を検出した。
【０１５８】
統計解析
データを連続変数については中央値（四分位）として、定性変数についてはパーセンテージとして表現する。本発明者らは、マン−ホイットニーのＵ検定によって、または＞１群が比較される場合にクルスカル−ワリス検定を行い、Ｐ＜０．０５ならば、続いてマン−ホイットニーのＵ検定を行うことによってのいずれかでデータを解析した。フィッシャー直接検定を用いて群間の死亡率の比較を行った。Ｐ＜０．０５の両側値を有意と見なした。JMP7.0.1を使用してデータを解析した。
【０１５９】
結果
体積および神経障害
生理食塩水注射に比べて、卒中の開始直後のＨＤＬの静脈内注射は、２４時間での卒中関連死を有意に減少させた。用量効果が観察され、用量１０mg/kgについて死亡率が６８．４％低下した（Ｐ＝０．０１５）。食塩水処置対照に比べて、ＨＤＬの投与は、卒中直後（Ｐ＝０．０００３）ならびに３および５時間後（それぞれＰ＝０．０１１およびＰ＝０．０１９）に梗塞サイズも有意に減少させた。この保護作用は用量依存的であった。したがって、ＨＤＬ処置群において卒中開始から２４時間後に神経障害が軽減した（Ｐ＝０．０１５）。精製ＬＤＬは、生理食塩水注射群に比べて梗塞サイズも卒中関連死も減少させなかった（それぞれＰ＝０．７５およびＰ＝０．６６）。ＨＤＬは肝損傷を誘導すると報告されているので、本発明者らは、循環肝臓酵素レベルを判定したが、ＨＤＬ注入後に卒中以来２４時間後に採取されたアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼおよびアラニンアミノトランスフェラーゼの血漿レベルは、ベースラインと異ならなかった。
【０１６０】
ＨＤＬはＢＢＢの破壊および脳浮腫を軽減した
本発明者らは、卒中開始から２４時間後での梗塞領域におけるエバンスブルーの血管外遊出を測定した。形態計測定量は、ＨＤＬ（１０mg/kg）が対照に比べてＢＢＢ透過性を６４％減少させたことを明らかにした（Ｐ＝０．００６６）。ＨＤＬ処置群（１０mg/kg）における脳浮腫は、食塩水処置群に比べて有意に軽減した（それぞれ１８．１％対５．７％；Ｐ＝０．０１）。
【０１６１】
ラベル化ＨＤＬは梗塞領域に浸透した
ＨＤＬ投与が梗塞領域に到達しうることで内皮に直接影響するかどうかを検証するために、本発明者らは、卒中の開始直後に蛍光ラベル化ＨＤＬを注射した。２４時間後に、ラットに血管マーカーであるフルオレセインイソチオシアネート−デキストランを静脈内注射し、それを１０秒間循環させてから安楽死させた。ＨＤＬは梗塞領域に浸透し、内皮細胞および星状細胞によって取込まれることができたが、ニューロンとの共局在は観察されなかった。
【０１６２】
ＨＤＬは梗塞領域におけるＰＭＮ動員および関連するＭＭＰゼラチナーゼ活性を減少させた
ミエロペルオキシダーゼ免疫染色に続く形態計測定量（ミエロペルオキシダーゼ陽性細胞数）によって、１０mg/kg ＨＤＬの注射がＰＭＮの動員を生理食塩水処置対照に比べて７０％減少させたことが明らかとなった（Ｐ＝０．０２７）。in situ酵素電気泳動によって、相同な対側性対照領域に比べて同側性梗塞領域における全体的なゼラチナーゼ活性の増加が示された。ＨＤＬ投与後に、このゼラチナーゼ活性増加は、食塩水処置群よりも重要ではないと思われた。卒中開始２４時間後に、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゼラチン酵素電気泳動は、対側性非梗塞領域よりも虚血領域の方がＭＭＰ−９の活性増加を示した。ＭＭＰ−９活性は、対照群よりもＨＤＬ処置群の方が梗塞領域中の活性が減少した。好中球関連ホモ二量体型ＭＭＰ−９について、類似の結果が得られた。
【０１６３】
ＨＤＬは梗塞領域における細胞間接着分子−１陽性血管を減少させた
本発明者らは、ＨＤＬ処置群におけるＰＭＮ動員減少が細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の発現減少に起因しうると仮定した。ＩＣＡＭ−１についての免疫染色によって、対照に比べてＨＤＬ処置群のＩＣＡＭ−１陽性血管における減少が明らかとなった。
【０１６４】
したがって本研究は、脳血管虚血に及ぼすＨＤＬの有益作用を示した。免疫染色によって示されたように、ＨＤＬは、ニューロンではなく内皮細胞およびグリア細胞によって取込まれる。本発明者らの知るところでは、ＨＤＬの神経保護作用が報告されているが、ＨＤＬが卒中開始の２時間前に注射されたことからこの作用は予防的であった。対照的に、本発明者らは、脳虚血開始の最大５時間後にＨＤＬを注射した。そのような注射は、治療的な神経および血管保護作用を提供した。
【０１６５】
実施例５：アテローム血栓症における新生血管の安定化におけるＨＤＬ
急性自然反応における最初の食細胞である好中球の蓄積が、プラーク破綻部位に報告されたが、好中球浸潤物は、急性冠症候群における責任病変に存在する。プラーク内出血は、プラーク中の好中球および好中球由来プロテアーゼの強化に関連すると示されている。この情報は、好中球がプラーク破綻につながるメカニズムに関与することを示す。好中球は、様々なメカニズムによってアテローム硬化性プラーク中の新生血管を不安定化する。好中球は、外来物質をエンドサイトーシスし、強力な活性酸素種を生成し、エラスターゼ、カテプシン、ＭＭＰ−８および−９、ならびにミエロペルオキシダーゼなどの、感染浄化を助けるだけでなく組織の分解および破壊にも関与する多様なタンパク質分解酵素を放出する。白血球由来セリンプロテアーゼ活性は、頸動脈内膜摘除標本における不安定領域から見出される。これは、過剰な白血球介在性ＥＣＭタンパク質分解が原因としてプラーク不安定化に関与することを示す。プラスミンおよびエラスターゼによる細胞外マトリックスのタンパク質分解は、プラークを安定化している重大な細胞である血管平滑筋細胞のアポトーシスを誘導する。
【０１６６】
白血球由来タンパク質分解活性は、間葉細胞の剥離および死滅（アノイキス）を誘発する能力に加えて、血管新生促進因子および血管新生抑制因子の分解によってアテローム血栓性プラーク中の新生血管の成熟も損なう。
【０１６７】
血管の成長および安定化に及ぼす好中球由来プロテアーゼの潜在的有害作用を検討するために、血管新生のin vitroおよびin vivoモデルを使用する。補充されたMatrigel中のラット大動脈輪およびヒト胸動脈からの毛細血管様構造の形成に及ぼす休止および活性化好中球の作用を、好中球由来プロテアーゼ阻害因子の存在下または不在下で比較する。
【０１６８】
いったん毛細血管様構造が既に形成した後の時点で、休止または活性化好中球をMatrigelに添加することによって、未熟血管の安定性および生存性に及ぼす好中球の作用を研究する。
【０１６９】
精製好中球の代わりに、ヒト頸動脈由来の複雑プラークまたは非複雑プラークのいずれかからの馴化培地を使用して類似の実験を行う。
【０１７０】
これらのin vitro研究と並行して、以下のようにin vivo実験を行う。成長因子をロードされたMatrigelを背側皮下チャンバー（dorsal skinfold chamber）に植込み、局所血管新生を誘導する。
【０１７１】
プロテアーゼ阻害因子の存在下または不在下で、新生血管を複雑プラークまたは非複雑プラーク由来の馴化培地で急性および局所的に刺激する。
【０１７２】
新生血管の透過性およびMatrigel中の出血発生率における改変を生体顕微鏡検査によって観察する。
【０１７３】
マウスプラーク破綻モデルが開発されたが、このモデルではアポＥ−／−マウスにおいて頸動脈上の血管周囲カフの留置と結紮を組合せる。この結果として、いくつかのマクロファージ、Ｔリンパ球、および平滑筋細胞を含有する、脂質およびコラーゲンに富む病変が生じる。続いて、カフの留置はフィブリン（フィブリノーゲン）陽性管腔血栓を伴うプラーク内出血およびプラーク破綻を誘発した。in vivoプラーク内出血に果たす好中球の役割を検討するために、好中球を枯渇させ、これらのマウスにおけるプラーク内出血およびプラーク破綻を予防する。
【０１７４】
両モデル（血管新生−皮下チャンバーおよびプラーク破綻モデル）においてＨＤＬ療法を試験する。
【０１７５】
まず、エラスターゼを注射してからの皮膚チャンバーモデルにおけるＨＤＬによる新生血管の潜在的安定化を試験し、アテローム血栓プラークからの馴化培地およびＨＤＬは、ずっとよくコントロールされる。
【０１７６】
エラスターゼ（好中球中またはプラーク中に含有される精製物）によって誘導される出血を予防する場合、α−１アンチトリプシンが強化されているか、または強化されていないＨＤＬの注射をマウスプラーク破綻モデルで試験する。
【０１７７】
結論
本発明者らは、この実験においてＨＤＬ療法が新生血管の安定化に有用なことを示す。
【０１７８】
実施例６：虚血条件下で好中球によって誘導される血液脳関門透過性にＨＤＬが及ぼす保護作用
ａ）健康被験者の血漿から単離されたＨＤＬの保護作用
血液脳関門（ＢＢＢ）は、内皮細胞が中心的な役割を果たす中枢神経系（ＣＮＳ）から血管区画を隔離するように設計された生体フィルターである。ＢＢＢの破壊または機能障害は、ＣＮＳのいくつかの血管疾患および変性疾患（腫瘍、てんかんまたは虚血性卒中）に関連する主なステップである。虚血によって誘導されるＢＢＢ破壊は、脳区画への循環白血球およびプロテアーゼを含めたそれらの分泌産物などの有害血液成分の進入を可能にし、出血性変化および／または脳浮腫のリスクを高めるおそれがある。本発明者らは、虚血条件下（ＯＧＤ：酸素およびグルコース欠乏）でＢＢＢに好中球およびエラスターゼが及ぼす効果、ならびにＨＤＬ（高密度リポタンパク質）の可能性のある保護作用を検討した。
【０１７９】
材料および方法
トランスウェル上で培養されたヒト不死化脳内皮細胞から成るヒト脳内皮細胞のin vitroモデルを使用して、上部区画にデキストラン−ＦＩＴＣ ７０kDaを添加すること、およびＯＧＤ条件で４時間後に下部区画における蛍光を測定することによって、ＢＢＢの透過性を試験した（BB Weksler et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line, FASEB J. 2005 Nov;19(13):1872-4）。
【０１８０】
透過性係数は、以前に報告されたように計算した（BB Weksler et al.）。そのような血液脳関門モデルは、エラスターゼおよび好中球が正常または虚血条件下で透過性に及ぼす作用の検討を可能にした。
【０１８１】
細胞間結合タンパク質または細胞外マトリックスタンパク質に対する特異的抗体を用いたウエスタンブロットは、ＨＤＬの存在下または不在下で好中球または精製エラスターゼによって誘導されたタンパク質分解の判定を可能にした。ＨＤＬを、超遠心分離によって健康志願者の血漿から単離した。
【０１８２】
結果
in vitro ＢＢＢモデルは、細胞間結合タンパク質（ＶＥ−カドヘリン）および密着結合タンパク質（ＪＡＭ−１、ＺＯ−１）を発現する。これらのタンパク質は、エラスターゼまたは活性化好中球の上清と共にインキュベーションされると分解され、ＢＢＢの透過性増加につながる。
【０１８３】
ＯＧＤ条件で４時間後に、透過性は有意には影響されなかった。ＯＧＤ条件下のエラスターゼおよび好中球と共のインキュベーションだけが、ＯＧＤ条件単独または正常酸素圧条件下のＯＧＤに比べて透過性を有意に増加させた。ＨＤＬの添加は、タンパク質分解を防止し、透過性を制限した（（図１０）。これらの結果は、エラスターゼ（精製物または好中球中に含有されるもの）およびＯＧＤ条件がＢＢＢに有害作用を有し、それをＨＤＬによって防止できることを示す。
【０１８４】
したがって本発明者らは、ＨＤＬ（ヒト血漿から精製）が虚血条件でのＢＢＢ透過性におけるこのプロテアーゼ介在性増加を有意に阻害可能であったことを示した。したがって本発明者らは、虚血が好中球の脱顆粒を促進すること、およびＨＤＬと結合したα−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）が、ＢＢＢにエラスターゼが及ぼす損傷を防止できたという事実に鑑みる。
【０１８５】
ｂ）ｒＨＤＬは、脳内皮細胞によって取込まれる
再構成されたＨＤＬ（ＣＳＬ１１１）または健康ドナーの血漿から単離されたＨＤＬ（ＨＤＬ）をＤｉＩＣ１８−カルボシアニンでラベル化し、次に脳内皮細胞と共に４時間インキュベーションした。本発明者らは、以下のように染色に着手した：
− 核をＤＡＰＩによって染色し；そして
− ＨＤＬをカルボシアニン（ＤｉＩＣ１８）でラベル化した。
【０１８６】
両方の種類のＨＤＬは、内皮細胞によって取り込まれたが、これは、虚血条件下でプロテアーゼによって誘導される透過性からの内皮細胞の保護に関連したＨＤＬの潜在的細胞内作用を示している。
【０１８７】
最近の研究は、エラスターゼが様々な細胞型にインターナリゼーションし、次にその細胞内の細胞内基質を分解可能であると報告している（AM Houghton et al., Neutrophil elastase-mediated degradation of IRS-1 accelerates lung tumor growth, Nat Med. 2010 Feb;16(2):219-23）。
【０１８８】
したがって、ＨＤＬまたはｒＨＤＬの使用は、エラスターゼの細胞内作用に対抗するための非常に有望な戦略である。
【０１８９】
実施例７：ロードされた再構成ＨＤＬ（ｒＨＤＬ）
ＡＡＴによるｒＨＤＬ強化の実行可能性をＣＳＬ１１１およびZemaira（CSL Behring）を使用して試験した。
【０１９０】
材料および方法
再構成されたＨＤＬ（ｒＨＤＬ）を、蛍光色素（ＤｉＩＣ１８「カルボシアニン」）存在下または不在下でＡＡＴと共に静かに撹拌しながら３７℃で２時間インキュベーションした。初期密度を１．１５に調整し、ｄ＝１．１で、最終的にｄ＝１でオーバーレイし、ＫＢｒ勾配をかけた超遠心分離後に、ｒＨＤＬを密度１．１で単離することができた（１００，０００ｇ、２０℃で１６時間）。
【０１９１】
結果
ＡＡＴの強化によって、超遠心分離後に、蛍光色素を有さない超遠心分離チューブから直接目に見え、ＡＡＴ単独（ｒＨＤＬと共にインキュベーションしない）では観察されない白色バンドが生じる。超遠心分離によってｒＨＤＬを再単離した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に硝酸銀染色を行う（図１１）。該染色は、超遠心分離によるｒＨＤＬの再単離後に、ＨＤＬにＡＡＴが強化されていること（中心のレーン）を示す。
【０１９２】
このように、本発明者らは、ｒＨＤＬにＡＡＴなどの因子を強化できるという事実を説明した。
【０１９３】
実施例８：卒中を患うラットにおけるｒｔＰＡ処置後の静脈内ＨＤＬ注射の保護作用
リコンビナント組織プラスミノーゲン活性化因子（ｒｔＰＡ）は、卒中において塞栓性血餅を溶解する、ヒトに唯一承認および使用されている薬物である。しかしながら、ｒｔＰＡは、出血合併症のリスクを増加させて血液脳関門（ＢＢＢ）に有害作用を示すと報告されているプロテアーゼである。本発明者らは、ＨＤＬがヒトにおける卒中の治療因子のために使用される場合に臨床状況を刺激するために、ＨＤＬがｒｔＰＡの存在下で梗塞体積を依然として減少可能であるかどうかを試験した。
【０１９４】
材料および方法
動物の世話および実験プロトコールは、INSERM-University Paris 7動物倫理委員会、認可番号75-214によって承認された。体重３００〜３５０ｇの雄性Sprague-Dawleyラット（Janvier, France）を、自然呼吸下で空気と混合したイソフルラン（導入のために４％；手術中は１％）で麻酔した。中大脳動脈の管腔内縫合閉塞によって局所脳虚血を４時間３０分間誘導した。リコンビナントｔＰＡ（１０mg/kg体重; Genetech）を有するかまたは有さない生理食塩水（２．０mL/kg体重）を右大腿静脈を経由してラットに投与した（１０％ボーラス、９０％連続注入）。ヒトにおける血栓溶解療法に類似した線維素溶解作用をラットにおいて達成するために、比較的高用量のｔＰＡが必要であった（W Liu W et al. Normobaric hyperoxia reduces the neurovascular complications associated with delayed tissue plasminogen activator treatment in a rat model of focal cerebral ischemia Stroke. 2009 Jul;40(7):2526-31）。再灌流の直前にｔＰＡまたは食塩水処置を開始し、縫合糸の抜き取りから３０分間継続した。この方式は、再灌流された組織がその因子に曝露されたことを保証した。食塩水またはｔＰＡ投与後に、ラットを自分のケージに戻した。
【０１９５】
動物を、対照（食塩水処置のみ）；ｔ−ＰＡ単独（１０mg/kg）；ＨＤＬ単独（１０mg/kg ＩＶ、頸静脈）；およびｔ−ＰＡ＋ＨＤＬの４群の一つに割当てた（１群ｎ＝１０）。ＨＤＬ １０mg/kg ＩＶを再灌流開始の５分前に注射した。梗塞測定のための屠殺は、卒中の２４時間後に起こった。手術が継続する間に加熱パッドで体温を３７℃±０．５に維持した。血糖、動脈血圧および血中ガスもまた、手術中にモニターした。
【０１９６】
結果
ｒｔＰＡの注射時点でＨＤＬによって処置されたラットの方が梗塞体積が有意に減少した（図１２Ａ）
出血の存在を肉眼で評価した。ｒｔ−ＰＡによって誘導される出血の発生率は、ｒｔＰＡ＋ＨＤＬによって同時処置されたラットの方が減少した（７５％対５０％）（図１２Ｂ）。
【０１９７】
したがって本発明者らは、ＨＤＬの注射がＢＢＢの保護を提供し、したがって出血性合併症のリスクを減少させることによってリコンビナント組織プラスミノーゲン活性化因子（ｒｔＰＡ）注射の有害作用を緩和することを示した。
【０１９８】
参考文献
本出願にわたり、本発明が属する技術分野の状況を様々な参考文献が説明している。これらの参考文献の開示は、本開示の参照により本明細書に組入れられる。
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本開示は、気腫を含めた多様な病状の処置に使用するためのネイティブなＨＤＬおよび組換えられたＨＤＬを提供する。
【０００２】
発明の背景
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、コレステロールおよびトリグリセリドのような脂質を輸送できるようにする、主要な５群のリポタンパク質（カイロミクロン、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ）の一つである。
【０００３】
ＨＤＬは、無極性脂質であるトリアグリセロール（triaglycerol）およびコレステロールエステルのコアならびにリン脂質および非エステル化コレステロールの表面単層を有する形状の円板状である。いくつかのアポリポタンパク質がＨＤＬ中に存在する。主なアポリポタンパク質は、２４３個のアミノ酸残基から成る２８kDa単鎖ポリペプチドであるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（アポＡ−Ｉ）である（Jay H. Stein, Internal medicine, Edition 5, Elsevier Health Sciences, 1998; 2515 pages）。
【０００４】
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の保護的役割は、いくつかの研究で確認されており、ＨＤＬおよびその主要タンパク質アポＡ−Ｉの血漿中レベルは、一貫してアテローム血栓リスクと逆相関する（BG Choi et al., The role of high-density lipoprotein cholesterol in atherothrombosis, Mt Sinai J Med. 2006 Jul; 73(4):690-701）。
【０００５】
α１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）は、５２kDの糖タンパク質である。その主機能は、好中球エラスターゼを阻害して組織損傷を防止することである。ＡＡＴ欠乏は、閉塞性肺疾患および肝機能障害へとつながる。現時点で最も広く使用されている処置は、高度に精製されたヒトＡＡＴの静脈内注入である。静脈内増強療法は、安全であると実証されており、ＡＡＴの週１回注入は、保護的であると見なされる濃度を超えた血漿ＡＡＴ濃度を生じる。（RC Hubbard et al., Alpha-1 antitrypsin augmentation therapy for alpha-1 antitrypsin deficiency, Am J Med. 1988 Jun 24; 84(6A):52-62）。
【０００６】
発明の概要
本発明者らは、ＨＤＬがアポリポタンパク質Ａ−Ｉ以外の多数の因子を担持できることを示した。本発明者らは、また、ＨＤＬにＡＡＴが存在することを示し、ＨＤＬがエラスターゼ活性を阻害し、アポトーシスなどのその関連作用を阻止することを実証した。
【０００７】
さらに本発明者らは、ＨＤＬに治療因子を強化し、ＨＤＬを特定器官に到達可能なベクターとして使用することができることを示した。
【０００８】
本発明は、医薬として使用するための因子であって、アンチプロテアーゼ、抗酸化因子、有糸分裂阻害因子、鉄代謝に関与する因子および抗アポトーシス因子から成る群より選択される因子を含むＨＤＬを提供する。
【０００９】
本発明の一態様では、本発明によるＨＤＬは、ネイティブなＨＤＬである。本発明の別の態様では、本発明によるＨＤＬは、再構成されたＨＤＬである。
【００１０】
本発明は、アテローム血栓症、虚血性疾患、慢性閉塞性肺疾患、神経変性疾患、ガン、ステント内再狭窄、および内皮機能不全を伴う全ての病態の処置に使用するための、アンチプロテアーゼを含むＨＤＬを提供する。
【００１１】
本発明は、アテローム血栓症、虚血性疾患、慢性閉塞性肺疾患、神経変性疾患、ガン、ステント内再狭窄、および内皮機能不全を伴う全ての病態の処置に使用するための、抗酸化因子を含むＨＤＬを提供する。
【００１２】
本発明は、ガンおよびステント内再狭窄の処置に使用するための、有糸分裂阻害因子を含むＨＤＬを提供する。
【００１３】
本発明は、アテローム血栓症、虚血性疾患、慢性閉塞性肺疾患および神経変性疾患の処置に使用するための、鉄代謝に関与する因子を含むＨＤＬを提供する。
【００１４】
本発明は、アテローム血栓症、虚血性疾患、慢性閉塞性肺疾患および内皮機能不全を伴う全ての病態の処置に使用するための、抗アポトーシス因子を含むＨＤＬを提供する。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、医薬として使用するための、アンチプロテアーゼ、抗酸化因子、有糸分裂阻害因子、鉄代謝に関与する因子および抗アポトーシス因子から成る群より選択される因子を含むＨＤＬを提供する。ＨＤＬは、ＨＤＬ粒子に対するその自然親和性が原因で、健康な被験者から単離されたＨＤＬと結合することが報告されているタンパク質またはペプチドのためのベクターを意味しうる（Karlsson H et al. Lipoproteomics II: mapping of proteins in high-density lipoprotein using two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry, Proteomics. 2005; 5(5):1431-45; T Vaisar et al., Shotgun proteomics implicates protease inhibition and complement activation in the anti-inflammatory properties of HDL, J Clin Invest. 2007; 117(3):746-56）。加えて、再構成されたＨＤＬの場合、精製されたアポＡ−Ｉがホスファチジルコリンなどのリン脂質と混合される。この特定ステップの間に、ＨＤＬに対して自然親和性を示さないタンパク質、ペプチドまたは他の分子を、原始型粒子内に捕捉し、ＨＤＬによって強制的に担持させることができる（PC Rensen et al., recombinant lipoproteins: lipoprotein-like lipid particles for drug targeting, Adv Drug Deliv Rev. 2001 Apr 25; 47(2-3):251-76）。
【００１６】
本明細書に使用されるような「ＨＤＬ」という用語は、ネイティブなＨＤＬまたは再構成されたＨＤＬを包含する。
【００１７】
典型的には、本発明によるＨＤＬに含まれる因子は、親油性またはＨＤＬを構成しているいくつかのタンパク質に対する親和性のいずれかを有する。または、その因子とＨＤＬとの結合を向上させるように、その因子を化学的に改変することができる。
【００１８】
本発明の一態様では、ＨＤＬはネイティブなＨＤＬである。本明細書に使用されるような「ネイティブなＨＤＬ」という用語は、健康なヒトドナーから精製されたＨＤＬを表す。典型的には、ＨＤＬは、二つの異なる方法：超遠心分離および免疫吸着（immunosorption）によって単離することができる。免疫吸着によるＨＤＬの単離は、アポＡ−Ｉに対するヤギポリクローナル抗体をSepharoseビーズに架橋結合させることによって調製された抗アポＡ−Ｉカラムを使用して行われる。超遠心分離によるＨＤＬの単離は、１．０６３〜１．２１０g/mlのＫＢｒ密度勾配間隔で古典的二段階超遠心分離することによって行われる。そのような方法を実施することは、技術者の能力の範囲内である。
【００１９】
本発明の別の態様では、ＨＤＬは、再構成されたＨＤＬである。本明細書に使用されるような「再構成されたＨＤＬ」、「ｒＨＤＬ」または「合成ＨＤＬ」は、ＨＤＬの少なくとも１種のタンパク質、好ましくはアポＡ−Ｉと結合した１種または複数種の脂質から構成される、ネイティブなＨＤＬに構造的に類似の粒子であって、ＨＤＬの公知の生理学的機能の全てを示す粒子を表す。典型的には、再構成されたＨＤＬの構成成分は、血液から得ることができるか、またはリコンビナント技法によって製造することができる。
【００２０】
典型的には、再構成されたＨＤＬは、リン脂質へのアポＡ−Ｉの複合体形成によって調製することができる。再構成されたＨＤＬを得るための方法は、EP 1 425 031および米国特許第５，６５２，３３９号に開示されている。
【００２１】
典型的には、ｒＨＤＬの調製に適した脂質は、リン脂質、好ましくはホスホチジル（phosphotidyl）コリン、例えば１−パルミトイル−２−リノレオイルホスファチジルコリン（ＰＣ）または１，２−ジパルミトイルＰＣである。場合により、ｒＨＤＬは、他の脂質、例えばコレステロール、コレステロールエステル、トリグリセリド、または他の脂質を含有する。脂質は、合成、天然脂質またはその組合せでありうる。
【００２２】
典型的には、ネイティブなＨＤＬまたは再構成されたＨＤＬは、２〜２５０、好ましくは１０〜２００、より好ましくは２０〜１００、より好ましくは２０〜５０、そして最も好ましくは３０〜４０のリン脂質／アポＡ−Ｉモル比を有する。
【００２３】
さらにｒＨＤＬは、場合によりコレステロール、コレステロールエステル、トリグリセリドおよび／またはスフィンゴ脂質などの追加的な脂質を、好ましくは最大２０の脂質／アポＡ−Ｉモル比で含有しうる。
【００２４】
典型的には、本発明によるＨＤＬは、注射によって、および／または例えば動脈内、腹腔内または好ましくは静脈内投与によって、所望の薬理効果を得るために十分な薬用量で投与することができる。
【００２５】
典型的には、アンチプロテアーゼ、抗酸化因子、有糸分裂阻害因子、鉄代謝に関与する因子、および抗アポトーシス因子から成る群より選択される因子を本発明によるＨＤＬにロードすることは、以下のように行うことができる：
− ＨＤＬを適切な濃度の該因子と共に静かに撹拌しながら３７℃で適切な時間インキュベーションすること（該濃度および時間は、ＨＤＬに対するその因子の親和性に依存する）；次に
− 密度の調整、ＫＢｒ溶液および最終的に食塩溶液を用いたオーバーレイ後に超遠心分離すること；ならびに
− 該因子が強化されたＨＤＬを収集し、食塩溶液に対して透析するか、または遠心装置を使用して濾過する。
【００２６】
または、アンチプロテアーゼ、抗酸化因子、有糸分裂阻害因子、鉄代謝に関与する因子、および抗アポトーシス因子から成る群より選択される因子を本発明によるＨＤＬにロードすることは、以下のように行うことができる：
− 該因子と共のＨＤＬのインキュベーションを、３７℃で適切な時間静かに撹拌しながら行い；そして
− カットオフ遠心装置を使用した濾過。遊離因子は通過画分に入り、一方で強化されたＨＤＬは、上の区画に残る。
【００２７】
当業者は、該ロードを実施するための条件を認識しているであろう。例えば、その因子がＨＤＬに対して低い親和性を有するならば、ＨＤＬは、その因子がＨＤＬに対して自然で高い親和性を有する場合よりも高い濃度の該因子と共により長い時間インキュベーションされよう。加えて、当業者は、上述の濾過を実施するために適切な分子量カットオフの遠心装置を選択可能である。
【００２８】
典型的には、ネイティブなＨＤＬの組成物中に自然に存在する因子をネイティブなＨＤＬにロードすることにより、それらの該因子の自然含量を５〜２０倍増加させることができる。そのようなロードは、本明細書下記に開示されるような様々な疾患の処置におけるＨＤＬの有効性を顕著に向上させる。
【００２９】
または、ネイティブなＨＤＬに、その組成物中に自然には存在しない因子をロードすることができる。そのようなロードは、本発明のＨＤＬに新しい性質を提供することから、本明細書下記に開示されるような様々な疾患の処置に有用である。
【００３０】
典型的には、本発明によるＨＤＬは、急性卒中時に再灌流のために行われる血栓摘除手技の間に動脈内注射によって投与することができる。血管内療法は、静脈内（ＩＶ）血栓溶解に不適当であるかまたは失敗した患者のための有望な代替となっている。（RG Nogueira, et al., Endovascular approaches to acute stroke, part 2: a comprehensive review of studies and trials, AJNR Am J Neuroradiol. 2009 May; 30(5):859-75 & M Mazighi, et al., Comparison of intravenous alteplase with a combined intravenous-endovascular approach in patients with stroke and confirmed arterial occlusion (RECANALISE study): a prospective cohort study, Lancet Neurol, 2009 Sep;8(9):802-9）。本発明によるＨＤＬは、また、エアロゾルによって投与することができる。
【００３１】
アンチプロテアーゼを含むＨＤＬ
本発明は、アンチプロテアーゼを含むＨＤＬに関する。典型的には、該アンチプロテアーゼは：
− エラスターゼ阻害因子であるα−１アンチトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ１、セルピンペプチダーゼ阻害因子クレードＡ−ＩＰＩ００３０５４５７、ＡＡＴ）；
− エラスターゼ阻害因子であるエラフィン（ＰＩ３：ペプチダーゼ阻害因子３）；
− トロンビン、プラスミンおよびプラスミノーゲン活性化因子の阻害因子であるプロテアーゼ−ネキシン１；
− プラスミン阻害因子であるα−２−アンチプラスミン（ＩＰＩ０００２９８６３）；
− エラスターゼ、プロテイナーゼ３およびカテプシンＧの阻害因子である単球／好中球エラスターゼ阻害因子（ＭＮＥＩ、セルピンＢ１）；
− インター−α−トリプシン阻害因子（ＩＰＩ００２１８１９２）；
− 組織性マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害因子；ならびに
− α−１ アンチキモトリプシン
から成る群より選択される。
【００３２】
本発明の一態様では、アンチプロテアーゼ／アポＡ−Ｉのモル比は、少なくとも０．１、好ましくは０．１〜２００、好ましくは０．１〜１００、より好ましくは１〜５０、最も好ましくは１０〜５０である。
【００３３】
特定の態様では、ネイティブなＨＤＬは、それらのアンチプロテアーゼ自然含量が５〜２０倍増加するなど、該アンチプロテアーゼが強化されている。
【００３４】
アポＡ−Ｉおよびアンチプロテアーゼレベルの決定は、当業者の能力の範囲内である。典型的には、該レベルは、市販のＥＬＩＳＡによって判定することができる。または、そして定性的な結果については、デンシトメトリー定量後に標準曲線を作成するために既知量のアポＡ−ＩおよびＡＡＴの両方を使用して、ウエスタンブロットによって両タンパク質を評価することができる。ＨＤＬ強化後にアンチプロテアーゼ活性を有するペプチドおよびタンパク質が存在することは、質量分析によってもモニターすることができる。
【００３５】
本発明の一態様では、アンチプロテアーゼを含むＨＤＬは、慢性閉塞性肺疾患、特に気腫の処置に使用される。ＡＡＴが気腫の処置に有用であることは、十分に確立されている。
【００３６】
気腫は、解剖学に基づき、終末細気管支から遠位の気腔のサイズに正常範囲を超えた増加を引き起こす、肺における構造変化を特徴とする疾患として定義される。本発明者らは、その疾患の臨床症状が、ＨＤＬまたはα−１アンチトリプシン強化ＨＤＬを投与することにより肺中のＡＡＴレベルを増大させることによって予防可能であることを示した。α−１アンチトリプシンは、特に好中球エラスターゼ活性による、肺における肺胞のタンパク質分解性損傷からの保護に有用である。
【００３７】
本発明者らは、単離されたヒトＨＤＬに精製ＡＡＴを強化してそれらのＡＡＴ自然含量を５〜２０倍増加させることが可能であることを示した。ＡＡＴの正常濃度は、１〜３g/Lの範囲であり、そのうち１％未満が循環ＨＤＬによって担持される。
【００３８】
好ましくは、アンチプロテアーゼをロードされた、本発明によるＨＤＬ中のアンチプロテアーゼ／アポＡ−Ｉのモル比は、１〜２００、好ましくは２〜１００、最も好ましくは１０〜５０である。
【００３９】
したがって、ＨＤＬへのα−１アンチトリプシンのロードは、より高いＡＡＴ濃度を提供し、慢性閉塞性肺疾患、特に気腫の処置における該ＨＤＬの有効性を向上させる。
【００４０】
典型的には、ＨＤＬへのＡＡＴのロードは、以下のように行うことができる：
− １mg/mLのＨＤＬをＡＡＴと共に静かに撹拌しながら３７℃で２時間インキュベーション；次に
− 適切な密度（ネイティブなＨＤＬについて１．２５）に調整ならびにＫＢｒ溶液および最終的に食塩溶液をオーバーレイ後に超遠心分離；ならびに
− ＡＡＴ強化ＨＤＬを収集し、食塩溶液に対して透析するか、または５kDaカットオフの遠心装置を使用して濾過する。
【００４１】
または、ＨＤＬのロードは、以下のように行うことができる：
− １mg/mLのＨＤＬをＡＡＴと共に静かに撹拌しながら３７℃で２時間インキュベーション；および
− １００kDaカットオフの遠心装置を使用して濾過。遊離ＡＡＴは通過画分に入り、一方で強化されたＨＤＬは、上の区画に残る。
【００４２】
本発明の別の態様では、アンチプロテアーゼを含むＨＤＬは、虚血性疾患、特に卒中、一過性虚血障害および心筋梗塞の処置に使用される。本発明者らは、アンチプロテアーゼを含むＨＤＬが虚血性疾患、特に卒中の処置に有用であることを示し、例示した。
【００４３】
本発明のなお別の態様では、アンチプロテアーゼを含むＨＤＬは、神経変性障害の処置に使用される。アンチプロテアーゼが神経変性障害の処置に有用であることは、周知である（S. Eriksson et al., Alpha1-antichymotrypsin regulates Alzheimer beta-amyloid peptide fibril formation, Proc. Natl. Acad. Sci. Vol 92, pp 2313-2317, 1995）。
【００４４】
本発明のさらに別の態様では、アンチプロテアーゼを含むＨＤＬは、アテローム血栓症、特に冠状動脈、頸動脈および末梢動脈疾患ならびに腹部大動脈瘤の処置に使用される。本発明者らは、エラスターゼ活性が増加しているアテローム血栓症の場合、ＨＤＬと結合しているＡＡＴが減少していることを示し、例示した。したがって、アンチプロテアーゼを含むＨＤＬは、アテローム血栓症の処置に有用である。
【００４５】
本発明のさらなる態様では、アンチプロテアーゼを含むＨＤＬは、ガンの処置に使用される。アンチプロテアーゼがガンの処置に有用であることは、周知である。（Li W et al., Matrix metalloproteinase-26 is associated with estrogen-dependent malignancies and targets alpha-1 antitrypsin serpin Cancer Res. 2004 Dec 1;64(23):8657-65; Uetsuji S et al, Effect of aprotinin on metastasis of Lewis lung tumor in mice, Surg Today. 1992; 22(5):439-42）。最近の研究は、エラスターゼが、細胞内基質を分解して腫瘍成長の増大につながることが可能なことを報告している（AM Houghton et al., Neutrophil elastase-mediated degradation of IRS-1 accelerates lung tumor growth, Nat Med. 2010 Feb;16(2):219-23）。本発明者らは、ＨＤＬおよびアンチプロテアーゼ強化ＨＤＬが、平滑筋細胞および内皮細胞を含めた、異なる細胞型によって取り込まれ、細胞内にアンチプロテアーゼを運搬（vectorize）することが可能であることを示した。
【００４６】
本発明のさらなる態様では、アンチプロテアーゼを含むＨＤＬは、ステント内再狭窄の処置に使用される。アンチプロテアーゼは、ステント内再狭窄の処置に有用である（Andrade-Gordon P et al., Administration of a potent antagonist of protease-activated receptor-1 (PAR-1) attenuates vascular restenosis following balloon angioplasty in rats, J Pharmacol Exp Ther. 2001 Jul; 298(1):34-42）。
【００４７】
なお別の態様では、アンチプロテアーゼを含むＨＤＬは、敗血症、または心筋梗塞および卒中を含めた虚血／再灌流状態などの、内皮機能不全を伴う病態の処置に使用される。本発明者らは、ネイティブなＨＤＬおよび再構成されたＨＤＬが血液脳関門（ＢＢＢ）に対して保護作用を提供することを実際に示し、例示した。
【００４８】
本発明は、さらに、アテローム血栓症、虚血性疾患、慢性閉塞性肺疾患、神経変性疾患、ガン、ステント内再狭窄、または内皮機能不全を伴う全ての病態を患う被験者を処置するための方法であって、アンチプロテアーゼを含むＨＤＬの有効量を該対象に投与するステップを含む方法に関する。
【００４９】
「ＨＤＬの有効量」によって、任意の医学的処置に適用可能な合理的な便益／リスク比で被験者を処置するために十分な量が意味される。しかしながら、ＨＤＬの合計１日使用量は、担当の医師によって健全な医学的判断の範囲内で決定されることが了解されている。それを必要とする任意の特定の被験者についての特異的治療有効用量レベルは、処置されている疾患または障害の病期ならびに特異的ＨＤＬの活性、被験者の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事、投与時間、投与経路、処置期間、その処置と組合せてまたは同時に使用される薬物を含めた多様な要因に依存する。
【００５０】
抗酸化因子を含むＨＤＬ
本発明は、抗酸化因子を含むＨＤＬに関する。典型的には、該抗酸化因子は：
− パラオキソナーゼ１、２または３（パラオキソナーゼ１、２または３は、細胞内酸化ストレスを抑制し、有機リン化合物を解毒させる）；
− カタラーゼ（カタラーゼは、Ｈ２Ｏ２解毒に関与する）；
− ビタミンＥ（ビタミンＥは親油性抗酸化因子である）；
− エイコサペンタエン酸、ＥＰＡ（Ｃ２０：５）およびドコサヘキサエン酸、ＤＨＡ（Ｃ２２：６）などのω−３脂肪酸；
− ブチルヒドロキシトルエン；
− Ｎ−アセチルシステイン；
− リポタンパク質の酸化を阻害するレスベラトロールおよびヒドロキシチロソールなどのポリフェノール；
− 気腫の発生を予防する抗酸化酵素ファミリーであるチオレドキシン；
− その抗酸化活性により内皮を保護することが報告されているエストロゲン（例えば、エストラジオールは、内皮の一酸化窒素およびプロスタサイクリン生成を増強する）；ならびに
− 赤ワインに含有されるポリフェノールなどの、抗酸化性およびアテローム産生抑制性を示す、エストロゲンレセプターαと結合可能な他の分子。
から成る群より選択される。
【００５１】
本発明の一態様では、抗酸化因子／アポＡ−Ｉのモル比は、少なくとも０．１、好ましくは０．１〜２００、好ましくは０．１〜１００、より好ましくは１〜５０、最も好ましくは１０〜５０である。
【００５２】
特定の態様では、ネイティブなＨＤＬは、それらの抗酸化因子自然含量が５〜２０倍増加するなど、該抗酸化因子が強化されている。
【００５３】
アポＡ−Ｉおよび抗酸化因子のレベルの決定は、当業者の能力の範囲内である。典型的には、アポＡ−Ｉのレベルは、市販のＥＬＩＳＡによって判定することができる。抗酸化因子がタンパク質の場合、そのレベルは、市販のＥＬＩＳＡによって判定することができる。抗酸化因子が脂質または別の種類の分子の場合、そのレベルは、質量分析によって判定することができる。または、抗酸化因子がタンパク質の場合、デンシトメトリー定量後に標準曲線を作成するために既知量のアポＡ−Ｉおよび抗酸化因子の両方を使用して、ウエスタンブロットによって両タンパク質を評価することができる。
【００５４】
本発明の一態様では、抗酸化因子を含むＨＤＬは、アテローム血栓症、特に冠状動脈、頸動脈および末梢動脈疾患ならびに腹部大動脈瘤の処置、ならびに虚血性疾患、特に卒中、一過性虚血障害および心筋梗塞の処置に使用される。酸化ストレスが血管機能障害およびアテローム血栓症のアテローム産生促進メカニズムに関与することは周知である（Z S Nedeljkovic et al., Mechanisms of oxidative stress and vascular dysfunction, Postgraduate Medical Journal 2003;79:195-200）。さらに、抗酸化因子は心保護作用を有する（N. Dhalla, A Elmoselhi, T Hata and N Makino, Status of myocardial antioxidants in ischemia-reperfusion injury, Cardiovascular Research 2000, 47(3):446-456）。したがって、抗酸化因子は、酸化ストレスを抑制することによってアテローム血栓症および虚血性疾患の処置に有用である。
【００５５】
本発明の別の態様では、抗酸化因子を含むＨＤＬは、慢性閉塞性肺疾患、特に気腫の処置に使用される。抗酸化因子が、慢性閉塞性肺疾患の処置、特に気腫の処置にも有用であることは、十分に立証されている（A Cantin et al., Oxidants, antioxidants and the pathogenesis of emphysema, Eur J Respir Dis Suppl., 1985;139:7-17）。
【００５６】
本発明のさらなる態様では、抗酸化因子を含むＨＤＬは、神経変性疾患の処置に使用される。抗酸化因子が神経変性障害の処置に有用であることは、周知である（B Moosmann et al., Antioxidants as treatment for neurodegenerative disorders, Expert Opinion on Investigational Drugs, October 2002, vol.11, No.10, pages 1407-1435）。
【００５７】
本発明のさらに別の態様では、抗酸化因子を含むＨＤＬは、ガンおよびステント内再狭窄の処置に使用される。抗酸化因子がガンの処置に有用であることは、十分に立証されている（Bardia A. et al, Anti-inflammatory drugs, antioxidants, and prostate cancer prevention, Curr Opin Pharmacol. 2009 Jun 30）。抗酸化因子がステント内再狭窄の処置に有用であることも、周知である。（JE Schneider et al., Probucol decreases neointimal formation in a swine model of coronary artery balloon injury: A possible role for antioxidants in restenosis, Circulation, Vol 88, 628-637）。
【００５８】
なお別の態様では、抗酸化因子を含むＨＤＬは、敗血症、または心筋梗塞および卒中を含めた虚血／再灌流状態などの内皮機能不全を伴う病態の処置に使用される。本発明者らは、ネイティブなＨＤＬが血液脳関門（ＢＢＢ）に対して保護作用を提供することを実際に示し、例示した。
【００５９】
本発明は、さらに、アテローム血栓症、虚血性疾患、慢性閉塞性肺疾患、神経変性疾患、ガン、ステント内再狭窄、または内皮機能不全を伴う全ての病態を患う被験者を処置するための方法であって、抗酸化因子を含むＨＤＬの有効量を該被験者に投与するステップを含む方法に関する。
【００６０】
有糸分裂阻害因子を含むＨＤＬ
本発明は、有糸分裂阻害因子を含むＨＤＬに関する。典型的には、該有糸分裂阻害因子は、ラパマイシンとも名付けられたシロミルス（Siromilus）である。
【００６１】
本発明の一態様では、有糸分裂阻害因子／アポＡ−Ｉのモル比は、少なくとも０．１、好ましくは０．１〜２００、好ましくは０．１〜１００、より好ましくは１〜５０、最も好ましくは１０〜５０である。
【００６２】
特定の態様では、ネイティブなＨＤＬは、それらの有糸分裂阻害因子自然含量が５〜２０倍増加するなど、該有糸分裂阻害因子が強化されている。
【００６３】
アポＡ−Ｉおよび有糸分裂阻害因子のレベルの決定は、当業者の能力の範囲内である。典型的には、該レベルは、市販のＥＬＩＳＡによって判定することができる。または、そして定性的な結果については、該レベルは、デンシトメトリー定量後に標準曲線を作成するために既知量の両タンパク質を使用して、ウエスタンブロットによって評価することができる。小分子による強化は、質量分析などの特異的方法によって評価すべきである。
【００６４】
本発明の一態様では、有糸分裂阻害因子を含むＨＤＬは、ガンおよびステント内再狭窄の処置に使用される。
【００６５】
タンパク質キナーゼは、増殖、浸潤、血管新生および転移を含めた、腫瘍の全ての局面の主要なレギュレーターとして出現した。ラパマイシン（シロミルス）およびその誘導体は、下流キナーゼである哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）を阻害する。ｍＴＯＲ阻害因子は、リンパ球およびある種の腫瘍細胞系の成長および増殖を強力に抑制する。したがって、シロミルスは、ガンの処置に有用である。（J Dancey et al., Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment, Nature Publishing Group, volume 2, April 2003, 293-313）。
【００６６】
シロミルスは、その抗増殖性に加えて抗遊走性を有する。シロミルスは、冠状動脈および潜在的に末梢動脈にステント留置後に、内膜肥厚からの保護を提供する。したがってシロミルスは、再狭窄の発生率を減少させるために有用である。（S Marx et al., The Development of Rapamycin and Its Application to Stent Restenosis; Circulation, 2001; 104:852）。
【００６７】
本発明は、さらに、ガンまたはステント再狭窄を患う被験者を処置するための方法であって、該被験者に有糸分裂阻害因子を含むＨＤＬの有効量を投与するステップを含む方法に関する。
【００６８】
鉄代謝に関与する因子を含むＨＤＬ
本発明は、鉄代謝に関与する因子を含むＨＤＬに関する。典型的には、鉄代謝に関与する該因子は：
− マクロファージによる鉄取込みに関与するトランスフェリン；
− マクロファージによるヘモグロビン取込みに関与するハプトグロビン；および
− 鉄代謝に関与するヘプシジン
から成る群より選択される。
【００６９】
本発明の一態様では、鉄代謝に関与する因子／アポＡ−Ｉのモル比は、少なくとも０．１、好ましくは０．１〜２００、好ましくは０．１〜１００、より好ましくは１〜５０、最も好ましくは１０〜５０である。
【００７０】
特定の態様では、ネイティブなＨＤＬは、それらの鉄代謝に関与する因子の自然含量が５〜２０倍増加するなど、該因子が強化されている。
【００７１】
アポＡ−Ｉのレベルおよび鉄代謝に関与する因子のレベルの決定は、当業者の能力の範囲内である。典型的には、該レベルは、市販のＥＬＩＳＡによって判定することができる。または、そして定性的な結果については、該レベルは、デンシトメトリー定量後に標準曲線を作成するために既知量の両タンパク質を使用して、ウエスタンブロットによって評価することができる。小分子による強化は、質量分析などの特異的方法によって評価すべきである。
【００７２】
一態様では、鉄代謝に関与する因子を含むＨＤＬは、アテローム血栓症、特に冠状動脈、頸動脈および末梢動脈疾患ならびに腹部大動脈瘤の処置に使用される。プラーク内出血がアテローム血栓プラークの易傷性の要因であることは、周知である。これには、酸化促進性の鉄を含有するヘモグロビンおよび結合したヘムの放出が含まれる。したがって、鉄代謝に関与する因子は、アテローム血栓症の処置に有用である（R.T. Calado et al., HFE gene mutations in coronary atherothrombotic disease, Braz J Med Biol Res. 2000 Mar; 33(3):301-6）。
【００７３】
別の態様では、鉄代謝に関与する因子を含むＨＤＬは、虚血性疾患、特に卒中、一過性虚血障害、および心筋梗塞の処置に使用される。トランスフェリンが急性卒中に保護的役割を果たすことは、周知である（C Altamura et al, Ceruloplasmin/Transferrin system is related to clinical status in acute stroke, Stroke. 2009 Apr; 40(4):1282-8. Epub 2009 Feb 19）。したがって、鉄代謝に関与する因子は、虚血性疾患の処置に有用である。
【００７４】
なお別の態様では、鉄代謝に関与する因子を含むＨＤＬは、慢性閉塞性肺疾患、特に気腫の処置に使用される。
【００７５】
さらなる態様では、鉄代謝に関与する因子を含むＨＤＬは、神経変性疾患の処置に使用される。鉄代謝がパーキンソン病およびアルツハイマー病などの神経変性障害に関与することは、立証されている（D Gerlach et al., Altered Brain Metabolism of Iron as a Cause of Neurodegenerative Diseases?, Volume 63 Issue 3, pages 793 - 807）。したがって、鉄代謝に関与する因子は、神経変性疾患の処置に有用である。
【００７６】
本発明は、さらに、アテローム血栓症、虚血性疾患、慢性閉塞性肺疾患または神経変性疾患を患う被験者を処置するための方法であって、該被験者に鉄代謝に関与する因子を含むＨＤＬの有効量を投与するステップを含む方法に関する。
【００７７】
抗アポトーシス因子を含むＨＤＬ
本発明は、抗アポトーシス因子を含むＨＤＬに関する。
【００７８】
典型的には、該抗アポトーシス因子は：
− 抗アポトーシス性であると報告された、細胞内膜においてスフィンゴミエリンの代謝から産生される生体活性脂質であるスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）（Morales A, Fernandez-Checa JC Pharmacological modulation of sphingolipids and role in disease and cancer cell biology. Mini Rev Med Chem. 2007. 7(4):371-82）；
− パラオキソナーゼ１および２；
− カタラーゼ；
− ω−３脂肪酸（アポトーシスをダウンレギュレーションし、そしてまた細胞生存を促進するω−３必須脂肪酸ファミリーのメンバーであってニューロプロテクチンＤ１前駆体であるドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ；２２：６ｎ−３）を含む）（Belayev L et al. Robust docosahexaenoic acid-mediated neuroprotection in a rat model of transient, focal cerebral ischemia. Stroke. 2009;40(9):3121-6）；
− エイコサペンタエン酸由来の抗炎症性メディエータであるレゾルビン（Resolvin）Ｅ１（ＲｖＥ１）（Keyes KT et al. Resolvin E1 protects the rat heart against reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2010;299(1):H153-64）；および
− ＨＤＬに自然に存在するクラスタリンまたはアポリポタンパク質Ｊ（Djeu JY, Wei S. Clusterin and chemoresistance Adv Cancer Res. 2009;105:77-92）
から成る群より選択される。
【００７９】
好ましくは、該抗アポトーシス因子はＳ１Ｐである。ＨＤＬ結合型Ｓ１Ｐは、血管弛緩、細胞生存、細胞接着性、血管新生、ならびに一酸化窒素（ＮＯ）およびプロスタサイクリン（ＰＧＩ２）などの二つの強力な内因性アテローム産生抑制抗血栓分子の合成に及ぼすＨＤＬの有益作用を担う（C Rodriguez et al. Sphingosine-1-phosphate: A bioactive lipid that confers high-density lipoprotein with vasculoprotection mediated by nitric oxide and prostacyclin. Thromb Haemost. 2009 Apr;101(4):665-73）。
【００８０】
本発明の一態様では、抗アポトーシス因子／アポＡ−Ｉのモル比は、少なくとも０．１、好ましくは０．１〜４００、好ましくは０．１〜２００、より好ましくは１〜１００、最も好ましくは１０〜５０である。
【００８１】
アポＡ−Ｉレベルおよび抗アポトーシス因子レベルの決定は、当業者の能力の範囲内である。典型的には、アポＡ−Ｉレベルは、市販のＥＬＩＳＡによって判定することができる。抗アポトーシス因子がタンパク質の場合、そのレベルは、市販のＥＬＩＳＡによって判定することができる。抗アポトーシス因子が脂質または別の小分子の場合、そのレベルは、質量分析によって判定することができる。または、抗アポトーシス因子がタンパク質の場合、デンシトメトリー定量後に標準曲線を作成するために既知量のアポＡ−Ｉおよび抗アポトーシス因子の両方を使用して、ウエスタンブロットによって両タンパク質を評価することができる。
【００８２】
特定の態様では、ネイティブなＨＤＬは、それらの抗アポトーシス因子自然含量が５〜２０倍増加するなど、ネイティブなＨＤＬの組成物中に自然に存在する該因子が強化されている。
【００８３】
別の態様では、ネイティブなＨＤＬは、抗アポトーシス因子／アポＡ−Ｉのモル比を１０〜２００倍増加させるように、ネイティブなＨＤＬの組成物中に自然には存在しない抗アポトーシス因子が強化されている。
【００８４】
一態様では、抗アポトーシス因子を含むＨＤＬは、アテローム血栓症、虚血性疾患、慢性閉塞性肺疾患および内皮機能不全を伴う全ての病態の処置に使用される。
【００８５】
本発明は、さらに、アテローム血栓症、虚血性疾患、慢性閉塞性肺疾患または内皮機能不全を伴う全ての病態を患う被験者を処置するための方法であって、該被験者に抗アポトーシス因子を含むＨＤＬの有効量を投与するステップを含む方法に関する。
【００８６】
以下において、以下の実施例および図面により本発明を例示する。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】超遠心分離により単離されたＨＤＬがα−１アンチトリプシンを含有することを示す図である。（Ａ）ヒト血漿由来ＨＤＬおよびＬＤＬは、ＫＢｒ勾配密度をかけた二段階超遠心分離によって単離した。α−１アンチトリプシン（ＡＡＴ、２００ng）抗体およびα−２−アンチプラスミン（ａ２ＡＰ、１００ng）抗体を用いて４個の異なるバッチのリポタンパク質（５μg）を免疫ブロッティングした。ＨＤＬは、ＡＡＴを含有したが、α２ＡＰを含有しなかった。（Ｂ）１００μｇのＨＤＬおよびＬＤＬを１００μgのＡＡＴと共に２００μLの合計体積で静かに振盪しながら３７℃一晩（１６時間）インキュベーションした。次に、両方のリポタンパク質を超遠心分離によって単離し、それぞれ１μｇをＡＡＴおよびアポＡ−Ｉに対するウエスタンブロット分析のためにロードした。結果は、３回の独立した実験の代表である。（Ｃ）超遠心分離によって単離されたＨＤＬ２画分およびＨＤＬ３画分を銀染色するか（上欄）または抗ＡＡＴ抗体を用いてウエスタンブロット分析に供するか（下欄）のいずれかとした。表示されたゲルは、４回の独立した実験の代表である。
【図２】ＬＤＬではなくＨＤＬが、アンチエラスターゼ活性を表すことを示す図である。（Ａ）５０μg/mL ＨＤＬ（４個の異なるバッチ）またはＬＤＬ（３個の異なるバッチ）の存在下または不在下で白血球エラスターゼ（１０nM）を発色性基質（ＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｐＮａ）と共にインキュベーションした。ＡＡＴ（１０nM）をエラスターゼ阻害の陽性対照として使用した。加水分解速度（mOD/min）のデータは、三つ組で行われた４回の実験の平均±ＳＤである（＊、エラスターゼ単独に比べてＰ＜０．０１）。（Ｂ）プラスミン活性は、ＨＤＬまたはＬＤＬ（５０μg/mL）と共のインキュベーションによって影響されない。Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓペプチド（ＶＦＫ）をプラスミン阻害因子として使用した。
【図３】ＨＤＬは、白血球エラスターゼによって誘導されたアノイキスを阻害することを示す図である。（Ａ〜Ｃ）培養ヒトＶＳＭＣの顕微鏡写真。（Ａ）未処置対照細胞。（Ｂ）エラスターゼ（１０nM）単独によって１６時間処置されたＶＳＭＣ、または（Ｃ）５０μg/mL ＨＤＬ存在下で処置されたＶＳＭＣ。（Ｄ）ＨＤＬと共のインキュベーションは、白血球エラスターゼによるフィブロネクチン分解を防止する。細胞培養上清中のフィブロネクチンを検出する代表的なウエスタンブロット。（Ｅ）生存接着ＶＳＭＣを、エラスターゼ（１０nM）による処理後にＭＴＴ試験を用いることによって定量した。結果を未処置対照細胞の率として表現する。各カラムは、三つ組で行われた４回の別々の実験の平均±ＳＤを表す（＊、エラスターゼに比べてＰ≦０．００５）。（Ｆ）それぞれ４人および３人の異なる被験者から１００μg/mLのＨＤＬまたはＬＤＬの存在下または不在下でＡＡＡ管腔内血栓の管腔層によって２４時間馴化された培地と共にインキュベーションされた細胞におけるアポトーシスの定量。結果を未処置細胞に対する率として表現する（対照吸光度：０．０８２±０．０２８nm）。各欄は、５人の異なる患者由来のＡＡＡ管腔内血栓によって馴化された培地を用いて二つ組で行われた２回の別々の実験の平均±ＳＤを表す（＊、ＨＤＬなしの処理に比べてＰ＜０．０５）。（Ｇ）ヒト胸動脈内膜を１０nMエラスターゼ±５０μg/mL ＨＤＬまたはＬＤＬと共に２４時間インキュベーション後の、Apostain（登録商標）によるアポトーシス核の検出（陽性の核は褐色に見える）。
【図４】細胞内ＨＤＬが、エラスターゼによって誘導されるアポトーシスを防止することを示す図である。（Ａ）ＭＴＴ試験。１００μg/mLのＨＤＬを４および１６時間予備インキュベーションし、次に細胞をすすいでから、１０nMエラスターゼと共に１６時間インキュベーションした。値は平均±ＳＤである（＊、エラスターゼ単独に比べてｐ＜０．００５）。（Ｂ）１００μg/mL ＨＤＬ（ＨＤＬは、ＤＩ−Ｃ１８カルボシアニンでラベルされている）をＶＳＭＣと共に８時間インキュベーションし、ＤＡＰＩで対比染色し、落射蛍光顕微鏡下で観察した。（Ｃ）５０μg/mL ＨＤＬと共に４時間インキュベーション後に、アポ−ＡＩおよびＡＡＴについて二重免疫染色を行った。共焦点顕微鏡法によって観察を行った（アポ−ＡＩ−緑、ＡＡＴ−赤、共局在は黄色）。
【図５】ＡＡＡを有する患者が、エラスターゼ活性に関連してより少ないα１ＡＴを保有することを示す図である。（Ａ）ＥＬＩＳＡによって測定されたアポＡ−Ｉレベルは、対照被験者（ｎ＝２３）に比べてＡＡＡを有する患者（ｎ＝１３）の血漿中で有意に減少している。データは、平均±ＳＤである（＊、健康対照に比べてＰ＜０．０００１）。（Ｂ）各被験者から個別に単離されたＨＤＬをＡＡＴの検出用に免疫ブロッティングした。バンドのデンシトメトリー分析によって得られた値を、ＨＤＬ−アポＡ−Ｉ濃度に対して基準化した。６人の患者および６人の対照のＨＤＬを示す、代表的なウエスタンブロット（分析した４３試料の合計からの結果を任意の単位/μg/μL（アポＡ−ＩのμL）で表現する。＊、対照に比べてｐ＜０．０００１）。（Ｃ）ＨＤＬのアンチエラスターゼ活性を判定するために、白血球エラスターゼ（１０nM）をＨＤＬと共にインキュベーションした。結果を（mOD/min)/μg/mLアポ−Ａ１で表現する。エラスターゼ阻害能は、ＡＡＡを有する患者由来のＨＤＬにおいて有意に減少している（＊、対照群に比べてＰ＜０．０００１）。（Ｄ）白血球エラスターゼを健康対照およびＡＡＡ患者由来の希釈血漿（１：１０００）と共にインキュベーションすることによって血漿アンチエラスターゼ活性をin vitroで試験した。結果をmOD/minで表現する。
【図６】ＡＡＴおよびアポリポタンパク質Ａ−Ｉのウエスタンブロット検出を示す図である。異なる量のＡＡＴおよび５または２０μgのＨＤＬをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（０．１〜１μg）にロードした。還元条件下で泳動後に、ゲルをニトロセルロース膜に転写（transblot）し、抗ＡＡＴ抗体および抗アポＡＩ抗体と共に古典的手順のウエスタンブロットを用いた）。
【図７】エラスターゼを点滴注入され、次に最初の１週間に食塩水、ＡＡＴ（３．５mg/kg）、ＨＤＬまたはＨＤＬ−ＡＡＴ（７５mg/kg）を４回注射されたマウスからの左肺の長軸矢状断（５μm）へのヘマトキシリン／エオシン染色を示す図である（左）。気腫発生の半定量（右）。
【図８】卒中の急性期におけるＨＤＬ療法の効果を示す図である。卒中開始の２４時間後のＴＴＣ染色を使用した脳梗塞の測定。梗塞は、赤色の正常脳の背景に白色に見える。図Ａ：ビヒクルによって処置されたラット。図Ｂ：卒中開始後にＨＤＬ注入（１０mgKg）によって処置されたラット。
【図９】代表的なゼラチンザイモグラムを示す図である。プロＭＭＰ９／ＭＭＰ９およびＭＭＰ２活性は、卒中開始の２４時間後に非梗塞領域（Ｃ）に比べて梗塞領域（Ｉ）で増加している。ＨＤＬ注入は、梗塞領域におけるプロＭＭＰ９／ＭＭＰ９活性化の顕著な減少と関連する。Ｒｅｆ．：プロＭＭＰ２／９および活性型ＭＭＰ２／９を含有する参照。Ｃ−Ｖ：ビヒクル群からの虚血と対側の半球。Ｉ−Ｖ：ビヒクル群からの梗塞領域。Ｃ−ＨＤＬＶ：ＨＤＬ群からの虚血と対側の半球。Ｉ−ＨＤＬ：ＨＤＬ群からの梗塞領域。
【図１０】正常または虚血条件下の血液脳関門（ＢＢＢ）の透過性に及ぼすエラスターゼおよび好中球の作用を示す図である。精製されたエラスターゼおよび好中球は、虚血条件下でのみＢＢＢの透過性増加を誘導した。ＨＤＬ（ヒト血漿から精製）は、ＢＢＢ透過性におけるこのプロテアーゼ介在性増加を有意に阻害することができた。
【図１１】ＨＤＬのＡＡＴ強化を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の硝酸銀染色を示す図である。
【図１２】卒中を患うラットにおけるリコンビナント組織プラスミノーゲン活性化因子（ｒｔＰＡ）を用いた処置後のＨＤＬの静脈内注射の保護作用を示す図である。Ａ：食塩水投与、リコンビナント組織プラスミノーゲン活性化因子（ｒｔＰＡ）、およびＨＤＬと一緒のｒｔＰＡで処置されたラットにおける梗塞体積（対側の半球に対する％）の測定。Ｂ：食塩水投与、リコンビナント組織プラスミノーゲン活性化因子（ｒｔＰＡ）、およびＨＤＬと一緒のｒｔＰＡで処置されたラットにおける出血の存在の肉眼的評価。
【００８８】
実施例
実施例１： ＨＤＬのアンチエラスターゼ活性は、平滑筋細胞アノイキスを防止する（新しいアテローム産生抑制性）
プロテオームアプローチを使用した様々な研究は、ＨＤＬがその構成的アポリポタンパク質Ａ−Ｉ以外の多数のタンパク質を担持しうることを示している。質量分析およびウエスタンブロットを使用して、本発明者らは、超遠心分離または抗アポＡ−Ｉカラムを使用した選択的アフィニティー免疫吸着のいずれかによって単離されたＨＤＬ中にα−１アンチトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ１、セルピンペプチダーゼ阻害因子クレードＡ、「ＡＡＴ」、エラスターゼ阻害因子）が存在することを示した。さらに、本発明者らは、ＨＤＬが強力なアンチエラスターゼ活性を有することを報告する。本発明者らは、また、ＬＤＬではなくＨＤＬだけがＡＡＴと結合可能であることを示した。ＨＤＬと結合したＡＡＴは、ヒト血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）およびex-vivoで培養された哺乳類動脈においてエラスターゼによって誘導される細胞外マトリックスの分解、細胞剥離およびアポトーシスを阻害可能であった。細胞周囲のタンパク質分解のマーカーとして使用されるエラスターゼによるフィブロネクチンの分解は、ＨＤＬの添加によって防止された。腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）血栓試料中に存在するエラスターゼは、培養ＶＳＭＣのアポトーシスを誘導することも可能であった。この現象は、ＬＤＬではなく、ＨＤＬの添加によって防止された。最終的に、本発明者らは、ＡＡＡを有する患者から単離されたＨＤＬ中のＡＡＴの比が、マッチした対照からの比よりも減少していることを報告するが、これは、これらの患者においてＨＤＬがエラスターゼを阻害する能力が減少していることを示している。結論として、本発明者らは、ＡＡＴおよびそのアンチエラスターゼ活性に起因しうるＨＤＬの新しい潜在的アテローム産生抑制性の証拠を提供する。
【００８９】
ＨＤＬ−コレステロールおよびその主要タンパク質であるアポＡ−Ｉの血漿中レベルは、観察研究において一貫してアテローム血栓リスクと逆相関している。ＨＤＬの有益作用は、抗酸化作用、抗炎症作用または抗血栓作用などの他のアテローム産生抑制性が十分に実証されているにもかかわらず、主としてコレステロールの逆輸送に起因するとされている。健康被験者からのＨＤＬに対するプロテオームアプローチを用いたいくつかの研究によって、ＨＤＬ２およびＨＤＬ３画分中にα−１アンチトリプシンが確認された。このセリンプロテアーゼ阻害因子は、好中球エラスターゼの天然循環阻害因子である。本発明者らは、アテローム血栓病変および循環白血球エラスターゼ−α−１アンチトリプシン複合体中に存在するこのプロテアーゼが、頸動脈狭窄ならびに心筋梗塞および卒中のリスクと相関したことを示した。加えて本発明者らは、腹部大動脈瘤の管腔内血栓中に存在する好中球エラスターゼが、動脈壁平滑筋細胞の消失およびその後の治癒不在に中心的な役割を果たすことを示した。病的動脈壁中に存在し、細胞外マトリックス分解に続いてアポトーシスを誘導可能であると報告されたプロテアーゼのうち、エラスターゼは、最も強力なもの一つである。多形核好中球（ＰＭＮ）は、腹部大動脈瘤またはプラーク内出血のいずれかにおいて血栓が形成する間に捕捉されると活性化する循環白血球の主要クラスを表し、破綻に向けたアテローム硬化性プラーク発展の推進力として最近記載された。ＰＭＮの脱顆粒は、細胞外区画におけるエラスターゼの放出へとつながり、エラスチン、フィブロネクチン、トロンボスポンジン、ビトロネクチンなどの多数の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を分解可能である。細胞外マトリックスのタンパク質分解は、機械抵抗を減少させることによって直接的に、および正常には生存シグナルを伝達する細胞−ＥＣＭ接触の破壊に続いて血管細胞のアポトーシスを誘導することによって間接的に、動脈壁を直接不安定化する。本研究において本発明者は、天然エラスターゼ阻害因子であるα−１アンチトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ１、セルピンペプチダーゼ阻害因子クレードＡ、「ＡＡＴ」）が、ＨＤＬおよびＨＤＬと結合していること、ならびにそれによりＨＤＬがエラスターゼ活性と、ＥＣＭ分解および平滑筋細胞アノイキスなどのin situ有害作用とを阻害することを示した。第二部では、本発明者らは、ＡＡＡを有するまたは有さない患者の血漿中のＨＤＬおよびＡＡＴ−ＨＤＬレベルを判定した。したがって、本発明者らは、本明細書においてＨＤＬのアテローム産生抑制能の原因となりうるＨＤＬの新しい機能、すなわち動脈壁安定化に有利になる可能性のあるアンチエラスターゼ活性を記載する。
【００９０】
材料および方法
反応物および細胞培養
ヒト好中球エラスターゼおよびα−１アンチトリプシンは、Calbiochem製であった。ヒト大動脈血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ、Promocell製）を、１０％ウシ胎児血清を含有する培地（Promocell SM2）中で培養した。
【００９１】
リポタンパク質の単離
ＥＤＴＡ上に採取された健康志願者の血漿から二つの異なる方法：超遠心分離および選択的アフィニティー免疫吸着によってリポタンパク質を単離した。免疫吸着によるＨＤＬの単離を行った。簡潔には、アポＡ−Ｉに対するウサギポリクローナル抗体をSepharoseビーズに架橋結合させることによって抗アポＡ−Ｉカラムを準備した。抗体を有さない模擬カラムおよび無関係な免疫グロブリンＧ（Innovative research）を使用してＩｇＧカラムを同条件で準備した。健康被験者由来の血漿（非喫煙者、年齢＞５０歳、インフォームドコンセントを得る）をアポＡ−Ｉ、疑似またはＩｇＧ Sepharoseビーズと共に（１２．５mLビーズに対してＥＤＴＡ−血漿１mL）静かに振盪しながら４℃で一晩インキュベーションした。次に、０．５Ｍ濃度に達するように追加的なＮａＣｌを含有する５容の食塩水（０．９％ ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、０．０２５％ ＮａＮ３）でカラムを３回すすいだ。食塩水で最後に洗浄した後に、０．２Ｍ酢酸、０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ３）を含有する溶液でカラムを溶出し、トリス塩基で直ちにｐＨ７．９に緩衝化した。次に、食塩水−ＥＤＴＡでＨＤＬを徹底的にすすぎ、遠心濃縮装置（カットオフ５kDa、Vivascience）を使用して濃縮した。または、血漿密度をＫＢｒでｄ＝１．０６３に調整し、ＫＢｒ食塩水溶液（ｄ＝１．０６３）をオーバーレイした。超遠心分離を１００，０００ｇ、１０℃で２０時間行った。ＬＤＬを含有する上のリポタンパク質画分をＫＢｒで密度１．２５g/mLに調整し、次に食塩水（ｄ＝１．００６）をオーバーレイしてから、１００，０００ｇ、１０℃で２０時間超遠心分離した。このステップの後に、ＬＤＬ画分（橙色の層）を単一バンドとして回収し、遠心濾過装置を使用した３回の洗浄ステップによってＫＢｒを除去した。最初の超遠心分離から生じ、ＨＤＬを含有する下の画分の密度をＫＢｒで１．２５ｇ／ｍＬに調整し、食塩水／ＫＢｒ溶液（ｄ＝１．２１）をオーバーレイした。２回目の超遠心分離および続く洗浄ステップは、ＨＤＬ画分がチューブの最上層となることを除き、ＬＤＬと同様である。記載した場合、ＨＤＬ２およびＨＤＬ３は別々に収集した。全ての画分は、生理食塩水で透析すること、または遠心分離を行い食塩水で３回洗浄することのいずれかによって脱塩した。
【００９２】
２Ｄ非変性電気泳動
正常リポタンパク質のヒト血漿から抗ＡＩ免疫吸着カラムクロマトグラフィーによってアポＡ−Ｉ含有リポタンパク質（ＬｐＡＩ）を精製した。抗ＨＳＡおよびプロテインＡセファロースカラムを通過させることによって、残留する血清アルブミンおよび免疫グロブリンを除去した。二次元アガロース×ＰＡＧ非変性電気泳動によってＬｐＡＩ画分を分析した。０．０６２Ｍトリス、０．０２７Ｍトリシン、０．００５Ｍ乳酸カルシウム（ｐＨ８．３）中に調製した０．８％アガロース（w/v）（Bio-Rad、カタログ番号162-0126）の中で１５V/cmの電場強度でＬｐＡＩを電気泳動した。ＰＡＧの直線勾配（０〜３０％ Ｔ）をかけた第二の方向にアガロース片を平衡になるまで５℃で電気泳動した（３０００V-h）。タンパク質混合物を使用して二次元ＰＡＧ（ストークス直径）を較正した。その混合物には：卵アルブミン（６．０nm）、ウシ血清アルブミン（７．１nm）、乳酸デヒドロゲナーゼ（８．１nm）、カタラーゼ（１０．４nm）、フェリチン（１２．２nm）、チログロブリン（１７．０nm）、低密度リポタンパク質（ｄ＝１．０３０〜１．０５０g/ml、２５nm）が含まれた。
【００９３】
２ＤＮゲルによって分離されたＨＤＬ種の質量分析
トリプシン（Promegaカタログ番号V5111）を用いたゲル内消化によって、２Ｄ ＰＡＧによって分離されたタンパク質を質量分析用に調製した。Ultimate ＨＰＬＣシステム（Dionex）を使用する逆相クロマトグラフィーによってペプチドを分離した。C18 Pepmap100カラム（７５um ＩＤ×１５cm）を採用して２〜３０％アセトニトリル／０．１％ギ酸の勾配を３８分間かけ、続いてさらに２分間かけて５０％アセトニトリル／０．１％ギ酸まで増加させた。溶出して来るペプチドをLTQ-Orbitrap（Thermo）に導入した。そこで以前にフラグメンテーションされた構成成分の動的排除（dynamic exclusion）を採用して、各サーベイスキャンで観察された６種の最も存在度の高い構成成分をデータ依存取得を用いてフラグメンテーションした。Mascot Distiller v2.1.1.0を使用して生データをピークリストに変換し、次にProtein Prospector v5.0（http://prospector2.ucsf.edu）を用いてデータベースのヒトのエントリーと照らし合わせて解析した。そのデータベースは、２００７年１２月４日にダウンロードされたUniprotデータベースから成り、そのデータベースの終わりに配列シャッフル／ランダム化されたデコイバージョンが連結され、合計１５２２４４個のエントリーが検索された。連結されたデータベースは、ペプチドの偽陽性率の推定を可能にした。検索パラメーターは、最大１個の切断ミスのトリプシン切断特異性、２０ppm以内のプリカーサー質量確度および０．６Da以内のフラグメント質量確度を必要とした。システインのカルバミドメチル化を、定常改変として検索し、メチオニン酸化、ペプチドＮ−末端グルタミンからのピログルタミン酸形成、およびタンパク質のＮ−末端アセチル化を可変改変として考慮した。受容基準は、最小ペプチドスコア１５、最小タンパク質スコア２２および最大期待値０．１であった。分析された全てのスポットについて、これらの閾値を超えて報告された合計１９９８種のペプチドがあり、それらには、データベースのデコイ部分との３個のマッチが含まれた。したがって、このデータセットに関する同定のペプチド偽陽性率は、約０．３％（（３×２）／１９９８）である。
【００９４】
２ＤＮゲルに関するウエスタンブロット
免疫ブロットについて、検量用タンパク質をビオチン化した（Bio-Rad、カタログ番号170-6529）。分離されたタンパク質をニトロセルロース膜（０．２μm, Bio-Rad、カタログ番号162-0212）上に電気泳動的に移動させた（５５Ｖ、１８ｈ、１０℃）。非特異的結合をカゼイン（２５mg/ml、０．０２Ｍトリス、ｐＨ８．５）でブロッキングした。アポＡ−Ｉに対する抗体（注文生産されたヤギポリクローナル抗体）およびα−１アンチトリプシンに対する抗体（Calbiochem、マウスモノクローナル抗体、カタログ番号178260)で膜を探索し、結合した抗体をビオチン化二次抗体であるアビジン−ビオチン−ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート(Pierce Chemical Co、カタログ番号1852410）、および０．１０Ｍイミダゾール（ｐＨ７．０）への３，３’−ジアミノベンジジン（０．０５％、w/v）／塩化ニッケル（２．５mM）／Ｈ２Ｏ２（０．０５％、v/v）を使用して明らかにした。
【００９５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のウエスタンブロット分析
それぞれ４個および３個の異なる調製物からのＨＤＬおよびＬＤＬ（５μg）をＳＤＳ−１２％ ＰＡＧＥによって分離した。電気泳動後に、タンパク質をニトロセルロース膜上に移動させ、ＴＢＳ−Ｔ（トリス緩衝食塩水、ｐＨ７．４、０．１％ Tween20）への５％粉乳でブロッキングし、次にウサギポリクローナル抗α−２−アンチプラスミン（α２ＡＰ）（１：１０００希釈、Calbiochem)またはウサギポリクローナル抗ＡＡＴ（１：１０００希釈、Dako）のいずれかと、ペルオキシダーゼコンジュゲート型二次抗体（１：２５００希釈、Jackson Immunoresearch laboratories）とを用いて探索した。精製ＡＡＴ（２００ng、Calbiochem）およびα２ＡＰ（１００ng、Calbiochem）を対照として使用した。細胞培養上清中のフィブロネクチンフラグメントを検出するために、馴化培地５μLをＳＤＳ−８％ＰＡＧＥによって分析した。次に、転写された膜を、ウサギポリクローナル抗ヒトフィブロネクチン（１：１０００希釈、Sigma製）を用いて探索した。全ての場合に、適切なペルオキシダーゼコンジュゲート型二次抗体を使用し（１：２５００希釈、Jackson Immunoresearch laboratories）、続いてＥＣＬ検出した。較正されたスキャナー（GS800 Bio-Rad）を使用してデンシトメトリー分析を行った。
【００９６】
エラスターゼおよびプラスミン活性の決定
ヒト好中球エラスターゼ（１０nM, Calbiochem）をＰＢＳ（終体積１００μl）中で１．５mMのエラスターゼ発色性基質ＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｐＮａ（Calbiochem）と共にインキュベーションした。プラスミン（１０nM, American Diagnostica）を５０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、８０mM ＮａＣｌ中で０．７５mMの選択的プラスミン発色性基質ＣＢＳ００６５（Diagnostica Stago, Asnieres, France）と共にインキュベーションした（終体積１００μl）。ＡＡＴ（４０nM）、ｄ−バニル−ｌ−フェニルアラニル−ｌ−リシンクロロメチルケトン（１０μM, VFK, Calbiochem）（プラスミンの選択的不可逆阻害剤）、ＨＤＬ（５０μgまたは用量反応実験については１〜４．５μg）およびＬＤＬ（５０μg）をエラスターゼまたはプラスミンと共に室温で１５分間予備インキュベーションしてから基質を添加した。ヒト血漿（１：１０００希釈）または患者由来のＨＤＬ（１：４希釈）を１０nMエラスターゼの存在下で同条件でインキュベーションした。４０５nmおよび４９０nmでの分光測定によって基質加水分解を３７℃で２時間モニターした。ＨＤＬアンチエラスターゼ活性をＨＤＬ−アポＡ−Ｉの量に対して基準化した。
【００９７】
細胞剥離アッセイおよびアポトーシス
ヒトＶＳＭＣを１２ウェルプレート中で集密になるまで成長させ、血清を２４時間欠乏させてから刺激した。次に、ＶＳＭＣを１０nMエラスターゼ（Calbiochem）またはヒトＡＡＡの管腔内血栓で馴化した培地（１：５希釈）と共に、ＨＤＬおよびＬＤＬ（１００μg/ml）の存在下または不在下で１６時間インキュベーションした。実験の終わりに、細胞上清を吸引し、３．０００ｇで５分間遠心分離し、ウエスタンブロットによりフィブロネクチンタンパク質分解フラグメントについて分析した。残りの生存接着細胞をＰＢＳで洗浄し、記載のようにＭＴＴ試験（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を用いて判定した。または、測光酵素イムノアッセイ（Cell death detection ELISAPLUS, Roche）を製造業者の説明書に従って用いてヒストン関連ＤＮＡフラグメントの定量によってアポトーシスを決定した。トリプシン化細胞にトリパンブルー排除試験を行うことによって、残りの接着細胞の９５％が膜透過化を示さなかったことを確認した。
【００９８】
アポトーシスのin situ検出
ヒト胸動脈は、Bichat病院（Paris, France）で心臓手術を受けている患者から得た。これらの組織は、フランス倫理法およびＩＮＳＥＲＭ倫理委員会により外科廃棄物として見なされる。外膜の除去によって得られた胸動脈の等しい区域（５mmの輪）を、無血清ＲＰＭＩ中でＨＤＬまたはＬＤＬ（それぞれ０．２mg/mL）の存在下または不在下で１０nMエラスターゼと共にまたはなしに３７℃（５％ ＣＯ２）で２４時間インキュベーションした。胸終動脈をエラスターゼと共にインキュベーション後に、組織を３．７％パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中に包埋した。アポトーシスのin situマーカーとして１本鎖ＤＮＡに対するモノクローナル抗体（Apostain, Alexis）を使用して、厚さ５μmの切片に免疫組織化学検査を行った。
【００９９】
ＡＡＡ由来馴化培地の調製
ＲＥＳＡＡプロトコール（REflet Sanguin de l'evolutivite des Anevrysmes de l'Aorte abdominale）に登録された手術を受けている患者から腹部大動脈瘤試料（ＡＡＡ）を得た。全ての患者から書面にてインフォームドコンセントを得て、そのプロトコールはフランス倫理委員会（CCPPRB, Cochin Hospital）によって承認された。手術の間に採取されたＡＡＡ管腔内血栓を１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）（２mL/g湿組織）と共に室温で２時間インキュベーションした。次に、エラスターゼを含有する抽出物を、培養アッセイのために以前に記載されたようにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で透析した。
【０１００】
カルボシアニンを用いたＨＤＬラベル化
ＨＤＬを１０μL/mL DiIC18カルボシアニン（Molecular Probes）と共に静かに振盪しながら３７℃で一晩インキュベーションし、次に上記のように超遠心分離によって分離した。ＶＳＭＣを１００μg/mLラベル化ＨＤＬと共に８時間インキュベーションした。ＰＢＳで３回洗浄後に、細胞をＤＡＰＩ（０．５μg/mL、１０分間）で対比染色し、落射蛍光顕微鏡下で視覚化した。
【０１０１】
免疫細胞蛍光
共焦点顕微鏡検査：ヒトＶＳＭＣをLabtekスライド上に蒔き、５０μg/mL ＨＤＬと共に４時間インキュベーションした。次に、このスライドをＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＳＢ−ＢＳＡ ４％に入れてブロッキングし、１：５０希釈のヤギ抗α−１アンチトリプシン抗体および抗アポＡＩ（Calbiochem）と共にインキュベーションした。次に、１：２００希釈された適切なフルオレセイン５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）ラベル化二次Ａｂ（Sigma）と共に、スライドを１時間インキュベーションした。
【０１０２】
Ａｍｅｔｈｙｓｔコホート
ＡＭＥＴＨＹＳＴ（動脈瘤メタロプロテイナーゼおよび高血圧の研究）は、１ヶ月以内に血管内修復を予定された無症候性ＡＡＡ（５cmよりも大きな大動脈直径を有する）の患者のコホートが参加している、Insermによって推進された進行中の研究である。これらの患者の年齢、性別を健康志願者とマッチさせた。全ての研究参加者からインフォームドコンセントを得た。研究は、倫理委員会によって承認された（Cochin Hospital Comite de Protection des Personnes se Pretant a la Recherche Biomedicale、承認番号1930 & 1931）。
【０１０３】
患者についての排除基準は、ガン、感染症、および任意の免疫介在疾患であった。予冷したＥＤＴＡチューブに最小限の血行静止で末梢血を標準条件（１０分間安静にした絶食中の被験者、午前８から１０時の間）で採血した。収集から３０分以内に２回の遠心分離（２５００rpm、１５min、１２℃および２５００rpm、１５min、４℃）を行って血球から血漿を分離した。使用まで血漿試料を−８０℃で保存した。
【０１０４】
アポＡ−Ｉ濃度の決定
アポリポタンパク質Ａ−Ｉ濃度は、Mabtech AB（Nacka Strand, Sweden）製ＥＬＩＳＡ試験を使用して製造業者の説明書に従って決定した。
【０１０５】
統計解析
GraphPAD InStat（GraphPAD Software）で統計解析を行った。ＡＡＡと年齢性別がマッチした対照との比較に関して、統計解析の間に、喫煙習慣についてのさらなる調整を行ったが、喫煙を調整していない比較の結果と変わらなかった。全ての実験を少なくとも３回行った。結果を平均±ＳＤとして表現し、ＡＮＯＶＡによって解析した（ｐ＜０．０５の場合に差が有意であると見なした）。
【０１０６】
結果
ＬＤＬではなくＨＤＬはα−１アンチトリプシンを含有する
本発明者らは、リポタンパク質のディファレンシャルな浮遊性を利用して、Karlssonらによって用いられた技法に類似する、ＫＢｒを用いた二段階超遠心分離技法によりＨＤＬを単離し、プロテオームアプローチによってＨＤＬ中からα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）を確認した。本発明者らは、４人の異なる被験者の血漿から単離されたＨＤＬがＡＡＴを含有するが、同条件で単離されたＬＤＬがこの主要血漿タンパク質を欠如することをウエスタンブロットによって示した（図１Ａ）。同じ試料について行われたα−２−アンチプラスミンに対するウエスタンブロットは、ＬＤＬにもＨＤＬにもこの別種の豊富な血漿タンパク質が存在することを示すことができなかった。血漿中のその高い濃度にもかかわらず、ＡＡＴは、ＨＤＬと同時に単離された混入物ではなさそうである。アポＡ−ＩまたはＡＡＴのいずれかをコーティングされたＥＬＩＳＡプレートで結合実験を行った。アポＡ−Ｉは、非飽和的であるがＡＡＴに結合可能であり、これは、低親和性または非特異的結合を示唆している。第二のステップで、本発明者らは、ＨＤＬがより多くのＡＡＴを捕捉する能力を試験した。このために、本発明者らは、ＨＤＬまたはＬＤＬのいずれかを精製ＡＡＴと共に（１mg：１mg）静かに撹拌しながら３７℃で１６時間インキュベーションし、次に遊離／未結合ＡＡＴを除去するために超遠心分離によって両リポタンパク質を再度単離した。本発明者らは、ＬＤＬではなくＨＤＬが追加的なＡＡＴと結合してそれを取込み可能であることをウエスタンブロットによって示した（図１Ｂ）。結果は、ＬＤＬとは対照的に、ＨＤＬがＡＡＴに対する親和性を有することを示している。最終的に本発明者らは、ＡＡＴがＨＤＬ２よりもＨＤＬ３画分に豊富に存在することを示した（図１Ｃ）。
【０１０７】
ＡＡＴはＨＤＬのα−１画分中に存在する
並行して、本発明者らは、抗アポリポタンパク質Ａ−Ｉカラムを使用する選択的アフィニティー免疫吸着によってＨＤＬを単離した。溶出はリポタンパク質ＡＩ含有画分（ＬｐＡＩ）の回収を可能にした。非変性二次元電気泳動ゲルによってＬｐＡＩ種を分離し、アポＡ−Ｉを含有する各粒子をその電荷と大きさに応じて泳動させた。ゲルをウエスタンブロット分析用に転写するか、または続くプロテオーム分析用にクマシーブルーによって染色した。十分なｙおよびｂ系列イオンを含有するスペクトルは、ＡＡＴおよびアポＡ−Ｉ由来のペプチドの同定を可能にした。コロイド状クマシーブルー染色によって検出された、種々のスポットに対して行われた質量分析から、直径７〜１０nmのStokes径の範囲のα−１粒子でのＡＡＴが確認され；予想どおりアポＡ−Ｉもこれらの粒子から確認された。２３種の独特なＡＡＴペプチドが最も小さな直径７nmの粒子から確認され、一方で３〜４種のペプチドが他方のより大きな８〜１０nmの粒子から確認されたが、これは、主なＬｐＡＩ ＡＡＴ質量が７nmのＬｐＡＩ粒子中に局在することを示唆している。これらの粒子中のアポＡ−Ｉ組成は変動し、７nmのＬｐＡＩ粒子から同定された独特なペプチドは、より大きな８〜１０nm粒子から同定されたペプチドよりも少なかった（それぞれ８種に対して１３〜１８種）。７nmのＬｐＡＩ粒子の組成には、より少ない量のパロキソナーゼ（paroxonase）、アポＡ−ＩＶ、アポＤ、アポＣ−ＩＩＩ、第Ｖ因子、およびα−１酸性糖タンパク質１が含まれた。ＡＡＴに関するウエスタンブロットから、α−１電気泳動移動度の７〜１０nmの粒子が抗アポＡ−Ｉ染色と共局在するＡＡＴを含有したことが示されたが、これは、質量分析によって得られた結果を確認している。ブロット上のアポＡ−Ｉに対する弱い免疫反応性は、アポＡ−Ｉに対する抗体が非変性条件下で２Ｄ電気泳動後のブロットとうまく反応しないという事実が原因でありそうである。ＡＡＴは、また、大型のα画分の方が検出される程度が少なかった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離後の通常のウエスタンブロットから、抗体なしの模擬カラムに比べて、抗ＡＩカラムによって単離されたＬｐＡＩ中にのみＡＡＴが存在することが確認された。同じ血漿からの超遠心分離によって単離されたＨＤＬもまた、ＡＡＴ陽性であった。
【０１０８】
ＨＤＬ結合型ＡＡＴはin vitroでアンチエラスターゼ活性を示す
第二のステップで、本発明者らは、ＨＤＬ結合型ＡＡＴがエラスターゼ活性を阻害する潜在性を試験した。健康な被験者から単離されたＨＤＬと共に白血球エラスターゼ（３０nM）をin vitroでインキュベーションし、その活性を発色性基質ＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｐＮａを使用して判定した。エラスターゼは、ＨＤＬによって用量依存的に阻害され、ＨＤＬのバッチ（異なる健康被験者から単離された）に応じて５〜２０μg/mL ＨＤＬの範囲でエラスターゼ活性のほぼ完全な阻害が達成された。対照的に、３人の異なる健康被験者からの５０μg/mLのＬＤＬは、全くアンチエラスターゼ活性を示さなかった（図２Ａ）。ヒトＡＡＡ管腔内血栓の管腔層からの馴化培地または白血球エラスターゼの供給源としての活性化好中球の上清を使用して類似の結果が得られた。ＨＤＬおよびＬＤＬの両方は、プラスミン活性を阻害することができなかった（図２Ｂ）。
【０１０９】
ＨＤＬはエラスターゼ誘導ＶＳＭＣアノイキスを防止する
以前に記載されたように、精製された白血球エラスターゼまたは腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）の血栓中に存在するエラスターゼは、細胞外マトリックスの分解によりヒト血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の剥離およびその後の死滅を誘導可能である（アノイキス）。本発明者らは、ＨＤＬが白血球エラスターゼにより誘導される剥離を防止する潜在性を試験するためにこのモデルを使用した。図３（Ａ〜Ｃ、Ｅ）において、本発明者らは、ＶＳＭＣの生存率が１０nMエラスターゼと共のインキュベーションによって減少したこと、およびこの作用がＨＤＬの存在下で用量依存的に防止されたことを示す（１００μg/mL ＨＤＬとの同時インキュベーションについて２４±９に対して９８±２％、ｐ＜０．００５）。しかしながら、ＬＤＬは、エラスターゼによって誘導されるＶＳＭＣ剥離に作用を有さなかった。ＬＤＬとは対照的に、ＨＤＬは、エラスターゼによって誘導されるフィブロネクチン分解をほぼ完全に防止することができ、これは、細胞周囲マトリックスタンパク質分解の直接阻害を示している（図３Ｄ）。次に、本発明者らは、ＡＡＡ管腔内血栓の管腔層によって馴化された培地と共にインキュベーションされた細胞に対するＨＤＬの保護作用を判定した。本発明者らは、白血球エラスターゼがＡＡＡ血栓の中間層および反管腔側層に比べて、主に管腔層に存在したこと、ならびにそれがＶＳＭＣの剥離を誘導可能であったことを以前に報告した。本発明者らは、ＨＤＬがこの現象を阻止することができ、ＡＡＡ血栓の管腔層からの馴化培地と共のインキュベーションによって誘導されるアポトーシスを阻害することを示す（図３Ｆ、ｐ＜０．０５）。最終的に、エラスターゼと共に胸終動脈をex vivoでインキュベーションすることは、組織内で検出可能なＶＳＭＣアポトーシスにつながり、この作用は、ＬＤＬではなく、ＨＤＬと共に同時インキュベーションすることによって阻害された。これは、ＨＤＬの存在下で胸動脈をエラスターゼと共にインキュベーションしたときの、アポスタイン（Apostain）陽性核の不在によって示される（図３Ｇ）。
【０１１０】
ＨＤＬは、ＡＡＴによって仲介されることが報告されていない、細胞内作用を含めた抗アポトーシス作用を示すことが公知であるので、本発明者らは、ＶＳＭＣをＨＤＬと共に予備インキュベーションすること（パルス−チェイス）がエラスターゼにより誘導されるアポトーシスを防止するために十分であるかどうかを試験した。細胞を１００μg/mL ＨＤＬと共に４または１６時間インキュベーションし、ＰＢＳで３回慎重にすすぎ、次に１０mMエラスターゼと共にインキュベーションした（図４Ａ）。本発明者らは、ＨＤＬによって１６時間前処理された細胞の場合にレムナント抗アポトーシス作用を観察できたことを示す（４１±８．２％の阻害）。本発明者らは、赤色カルボシアニン−ラベル化ＨＤＬを使用してＨＤＬが細胞によってインターナリゼーションされたことをチェックし（図４Ｂ）、アポＡＩが細胞内でＡＡＴと共局在したことを共焦点顕微鏡検査によって示した（図４Ｃ）。
【０１１１】
ＡＡＡ患者のＨＤＬは健康被験者由来のＨＤＬよりも少ないＡＡＴを担持する
他の形態のアテローム血栓症のように、正常な被験者よりもＡＡＡ患者の方がＨＤＬレベルが低いこと、および白血球エラスターゼがＡＡＡの病態生理に関与することが報告されている。本明細書で本発明者らは、ＡＡＡ患者が健康な被験者よりも有意に低いＨＤＬを有することを報告する（１．１１mmol/L±０．２３、ｎ＝１３対１．３５mmol/L±０．３、ｐ＝０．０１７、ｎ＝２３）。血漿アポＡ−Ｉレベルもまた、対照よりもＡＡＡ患者の方が６８±２．６％低かった（図５Ａ、ｐ＜０．０００１）。本発明者らは、ＡＡＡ患者由来のＨＤＬが対照被験者由来のＨＤＬよりも担持できるＡＡＴが少ないという仮説を検証した。このために、本発明者らは、各個体（ＡＡＡ患者またはマッチさせた対照）からＨＤＬを単離し、ウエスタンブロットによってＡＡＴの存在を判定し、それをＥＬＩＳＡによって定量されたアポＡＩ含量に対して基準化した（マッチさせた対照に比べて２９±０．５９％の減少、ｐ＜０．０００１）。図５Ｂに、直径＞５cmの動脈瘤を有する患者が、そのＨＤＬと結合したＡＡＴを対照群よりも有意に少なく有することを示す。したがって、ＨＤＬに関連するエラスターゼ阻害能は、対照よりも患者の方が低かった（図５Ｃ）が、全体的な血漿アンチエラスターゼ活性は、２群で類似しており（図５Ｄ）、血漿に比べて区画化組織が重要であることを強調している。
【０１１２】
結論として本発明者らは、本明細書において白血球エラスターゼおよび血管細胞に対するその関連する有害作用を阻害可能な、ＨＤＬについての新しいアンチプロテアーゼ活性を報告する。本発明者らは、ＡＡＡ患者におけるＨＤＬおよび結合したＡＡＴのレベル減少が、血管壁におけるエラスターゼに対する効果的な保護がより小さいことの原因となるおそれがあり、この疾患の進行に有利に働くことを示した。
【０１１３】
実施例２：ＡＡＴ強化ＨＤＬは正常マウスの肺に到達し気腫の発生を予防する
静脈内注射後の肺におけるＨＤＬのバイオアベイラビリティーを試験するために、ＨＤＬをカルボシアニン（赤色）（１０mg/kg）でラベル化した。注射の２時間後に、マウスを屠殺し；肺をＯＣＴ中に包埋し、凍結させてから切片にした。ＡＡＴについて免疫染色を行い（緑色）、核をＤＡＰＩで対比染色した。ヒト血漿から超遠心分離により精製されたＨＤＬを蛍光色素によってラベル化し、ＩＶ注射後に追跡した。注射されたＨＤＬは、肺に到達することができ、注射の２〜４８時間後に検出することができた。また、肺中ＨＤＬの検出が可能な最大注射後時間を検出した。マウスを屠殺した後で、肺および肝臓の両方を蛍光ＨＤＬの蓄積についてチェックした。
【０１１４】
方法
ａ／ ＨＤＬの精製、ＡＡＴの強化、品質管理
まず、同じバッチのＨＤＬおよびＡＡＴ強化ＨＤＬを用いて作業するために、超遠心分離によってヒト血漿から精製された大量のＨＤＬをプールした。ＡＡＴを静かに撹拌しながら３７℃で１６時間インキュベーションした。次に、それらのＨＤＬを超遠心分離によって再度精製し、遊離の未結合型ＡＡＴを除去した。ＨＤＬおよびＡＡＴをロードされたＨＤＬに関してＡＡＴおよびアポリポタンパク質Ａ−Ｉについてのウエスタンブロットを行った。正常ＨＤＬおよび強化ＨＤＬ中に存在するＡＡＴの量を判定するために、異なる量のＡＡＴもＷＢによって分析した（図６）。並行してアンチエラスターゼアッセイを行い、ＷＢによって得られた結果を裏付けた。これらの実験は、強化ＨＤＬ中のＡＡＴを定量するものである。次に、同量の遊離ＡＡＴを対照群に注射した。この実験の目的は、ＨＤＬ−ＡＡＴが単独で注射されたＡＡＴよりも気腫の発生を大きく予防するかどうかを試験することである。自然にＡＡＴを含有するＨＤＬもまた別の群に注射する
【０１１５】
実験スキーム
エラスターゼ処置マウスを４群に分け、食塩水、ＨＤＬ（７５mg/kg体重）、ＡＡＴ強化ＨＤＬ（７５mg/kg）またはＡＡＴ単独（３．７５mg/kg）単独を注射した。エラスターゼ注射の２時間後にＨＤＬ、ＨＤＬ−ＡＡＴ、ＡＡＴまたは食塩水を静脈内注射し、次にさらに３回、２４、４８および３６時間後に注射した。
【０１１６】
気管内点滴注入のために使用されたエラスターゼは、マウスによって迅速に排出された（１時間後に肺にエラスターゼの痕跡なし）。したがって、本発明によるアンチエラスターゼを含むＨＤＬの使用は、気腫の誘導に使用されるエラスターゼではなく、好中球浸潤に関連する内因性エラスターゼを阻害するためである。
【０１１７】
４５匹のマウスを気管内エラスターゼ点滴注入に供する。１週間目の間に１５匹のマウスに食塩水を４回注射し、続いてエラスターゼ処置を行い、次に各群の１０匹のマウスにＨＤＬ、ＡＡＴ強化ＨＤＬまたは同量のＡＡＴ単独を注射した。
【０１１８】
エラスターゼを最初に点滴注入した２８日後にマウスを屠殺し、肺胞破壊をスコア付けすることによって気腫を半定量した（２人の独立した病理学者による二重盲検判定）。
【０１１９】
平均±ＳＤを図７に示すが、これは、ＨＤＬ−ＡＡＴが気腫の発生を４０％保護するが、一方でＨＤＬおよびＡＡＴは軽度の保護作用だけを示すことを示している（ＨＤＬ−ＡＡＴ対食塩水：ｐ＜０．００１、ＨＤＬ−ＡＡＴ対ＨＤＬ：ｐ＝０．０１３、ＡＡＴ対食塩水：ｐ＝０．０９７、ＨＤＬ−ＡＡＴ対ＡＡＴ：ｐ＝０．１１２）。
【０１２０】
結論
本発明者らは、ＡＡＴ強化ＨＤＬが正常マウスの肺に到達し、気腫の発生を予防することを示した。
【０１２１】
実施例３：腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）におけるアンチプロテアーゼのベクターとしてのＨＤＬの評価
ＡＡＡは、腹部大動脈に局在する、アテローム血栓症の特定臨床症状であり、ＡＡＡではプロテアーゼ活性、特にエラスターゼが推進力であると示されている。いくつかの証拠は、ＨＤＬがアテローム硬化病変をターゲティングすることができ、そこでコレステロール浄化粒子として作用することを示している。ガドリニウム−ＨＤＬがアテローム硬化性プラークのイメージングのためのトレーサーとして使用されている。
【０１２２】
本発明者らは、アポＥ−／−マウスにおけるＤｉＩＣ１８ラベル化ＨＤＬの注射が大動脈洞からのアテローム硬化病変の脂質コアの強い染色を招くことを示す。
【０１２３】
以前の研究は、特にガンの分野においてリポタンパク質に薬物またはタンパク質をロードする実行可能性を実証してきた。本発明者らは、動脈瘤などの複雑アテローム血栓疾患の進行に二つの主なセリンプロテアーゼであるプラスミンおよびエラスターゼが関与するという証拠を提供した。
【０１２４】
本発明者らは、プラスミンおよびエラスターゼの阻害因子の運搬体としてＨＤＬを使用する。
【０１２５】
プラスミンは、プラスミノーゲンから、共に複雑プラークにおいて活性なその活性化因子（組織型（ｔＰＡ）またはウロキナーゼ（ｕＰＡ））によって産生される。ＨＤＬに以下の薬物およびタンパク質をロードしてから、アテローム血栓合併症に対するそれらの影響を評価するために動脈瘤性アポＥ欠損マウスモデルに注射する：
− α−１アンチトリプシン：好中球エラスターゼの自然阻害因子であり、ＨＤＬの一部であることが示されたもので、再構成されたＨＤＬ粒子に組込むことが容易である、
− トラネキサム酸：プラスミノーゲン上のリシン結合部位を可逆的にブロッキングすることによってそのアンチプラスミン作用を発揮する合成リシン誘導体である。これは、組織、フィブリンまたは細胞外マトリックスへのプラスミノーゲンの結合ならびにそれからプラスミンへのその後の変換を防止する。
【０１２６】
本発明者らは、実施例１においてＨＤＬにＡＡＴをロードできることを示した。
【０１２７】
アンジオテンシンＩＩを注入されたアポＥ欠損マウスモデルにおいて、ＨＤＬ介在性アンチプロテアーゼ療法を判定した。アポＥ−／−マウスは、アテローム血栓合併症なしに大動脈根に脂肪線条を発生する。
【０１２８】
いくつかのグループが、これらの高脂血症マウスにおけるＡｎｇ ＩＩ注入が急速に複雑病変の形成へとつながり、腹部大動脈瘤または複雑不安定プラークの発生を招くことを示している。
【０１２９】
マウスにおけるこれらの複雑病変は、中膜変性、外膜炎症、壁在血栓またはプラーク内出血を含めた、ヒト疾患の多数の局面を表す。
【０１３０】
このモデルにおいて、これらの不安定病変は、大動脈根ではなく下行大動脈に発生し、血管壁におけるタンパク質分解活性の増強の証拠を提供している。
【０１３１】
方法
アポＥ−／−−Ａｎｇ ＩＩマウスモデル
３〜６月齢雄性アポＥ−／−マウスを、皮下浸透圧ミニポンプを経由したＡｎｇ ＩＩ（１０００ng・kg-1・min-1）の４週間注入に供する（ｎ＝１０）。追加的な２群（ｎ＝１０）にＨＤＬまたはα−１アンチトリプシン強化ＨＤＬのいずれかを静脈内注射する。
【０１３２】
ＨＤＬへのα−１アンチトリプシンのロード
健康な個体から単離されたＨＤＬを、市販の精製α−１アンチトリプシン（１mg/mL）と共に静かに撹拌しながら３７℃で１６時間インキュベーションする。次に、ＨＤＬの密度をＫＢｒで１．２５g/mLに調整し、食塩水／ＫＢｒ溶液（ｄ＝１．２１）をオーバーレイした後に、ＨＤＬを超遠心分離（１００，０００ｇ、一晩）によって再度単離する。ＨＤＬ画分をチューブ最上部の単一バンドとして回収し、遠心フィルター装置を使用して３回の洗浄ステップによりＫＢｒを除去する。ウエスタンブロット分析は、α−１アンチトリプシン強化の効率を試験するものである。
【０１３３】
プラーク破綻および中膜変性の判定
動物を安楽死させ、腹腔および胸腔に入り、右心室から採血し、左心室を経由して大動脈をＰＢＳで洗浄する。腹部大動脈を解剖顕微鏡下で露出させ、外膜周囲組織を大動脈壁から慎重に切開する。デジタルノギスで最大大動脈直径を決定する。続いて大動脈根および心臓を切開する。腹部大動脈（最下位肋間動脈から回腸分岐部まで）および胸部大動脈を切断および秤量し、これらの組織の部分を凍結切片用にＯＣＴ中に包埋する（免疫組織化学検査および脂質の判定ためのオイルレッドＯ染色により判定される細胞組成の決定）か、または生化学アッセイのために均質化／超音波処理する（脂質含量の決定）。
【０１３４】
結論
ＨＤＬは、ＡＡＴを送達し、腹部大動脈瘤を予防することができる。
【０１３５】
実施例４：ラット卒中モデルにおけるＨＤＬの保護作用の評価
卒中は、西洋諸国における成人の罹患および死亡の主な原因である。急性期の卒中において現在承認されている唯一の薬物は、血小板溶解薬ｔＰＡである。ｔＰＡの使用は、非常に短期の治療ウインドウに限定され、症候性脳出血の１０倍増加も引き起こす。セリンプロテアーゼ（プラスミンおよびｔＰＡなど）およびマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ３、ＭＭＰ９）は、ｔＰＡ処置に関連してまたは関連せずに脳虚血損傷および出血性変化に決定的な役割を果たすことが示されている。
【０１３６】
他者によってすでに記載されたように、本発明者らは、ラット塞栓性卒中モデルにおいて虚血領域中のＭＭＰ９活性化を実証している。
【０１３７】
本発明者らは、卒中急性期の間のＨＤＬ注射が神経保護性でありうるという仮説を検証した。
【０１３８】
本発明者らは、ラット塞栓性卒中モデルを開発した（ex-vivoで作った血栓を中大脳動脈に注射）。
【０１３９】
卒中急性期におけるＨＤＬの静脈内注入は、その後の虚血性損傷に対して強い保護作用を招いた。
【０１４０】
卒中の２４時間後の死亡率は、プラセボ群で４１．６％であり、それに対してＨＤＬ処置群で１２．５％であった（１群ｎ＝１５）、ｐ＜０．０５。
【０１４１】
２４時間目に、脳梗塞体積の中央値はＨＤＬ群で９．２％（ＩＱＲ４．６〜１５．６）であり、それに対してプラセボ群では２９．５％（１２．９〜６６．６）であった（ｐ＜０．０５）。
【０１４２】
神経障害は、プラセボに比べてＨＤＬ群の方が減少し、ＭＭＰ９（プロ型および活性型の両方）は、ＨＤＬ治療後に虚血領域が有意に減少した（図８および９）。
【０１４３】
本発明者らの卒中モデルにおけるＨＤＬの神経保護メカニズムを解明するために、いくつかの仮説を検証し；特に本発明者らは、ＨＤＬに関連するアンチエラスターゼ活性の存在が、血栓によって誘導される脳損傷の予防に重要であるかどうかを評価する。本発明者らは、また、血液脳関門（ＢＢＢ）のin vitroモデルを使用して、ＢＢＢに対する血栓の細胞毒性およびその後の透過性を試験する。ＢＢＢに及ぼすＨＤＬの潜在的保護作用を試験する。
【０１４４】
ＨＤＬ粒子は、コレステロール輸送を逆転することに加えて、急性傷害から内皮細胞を保護しうる抗炎症作用、アンチプロテアーゼ作用、および抗血栓作用を発揮することが公知である。再構成されたＨＤＬの投与は、高コレステロール血症または低ＨＤＬレベルを有する患者における内皮機能不全を正常化することが示されている。多形核好中球（ＰＭＮ）は、急性虚血性脳損傷および虚血誘導ＢＢＢ破壊に主要な役割を果たし、ここで、それらに結合したマトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）は、ＢＢＢの分解に関与する。
【０１４５】
ＨＤＬは内皮接着分子のサイトカイン誘導発現を阻害することから、ＰＭＮの接着および遊出を減少させる。したがって、本発明者らは、卒中の開始後（０〜５時間）のＨＤＬ注射が虚血領域におけるＰＭＮの動員を、そしてまた卒中後の脳損傷に及ぼす有益作用を軽減しうるという仮説を立てた。
【０１４６】
材料および方法
塞栓性卒中モデル
動物の世話および実験プロトコールは、Animal Ethics Committee of the University Paris 7、認可番号75-214によって承認された。体重３００〜３５０gの雄性Sprague-Dawleyラットを、空気と混合されたイソフルラン（導入のために４％；手術中は１％）を用いて自然呼吸下で麻酔した。中大脳動脈中に前もって形成した血餅の塞栓によって局所脳虚血を誘導した。手術期間中に加熱パッドで体温を３７℃＿０．５に維持した。血糖、動脈血圧、および血液ガスもまた手術中にモニターした。
【０１４７】
標本サイズの計算
群間の脳梗塞体積における相対的な５０％の差（ＨＤＬ対プラセボ）の検出力が８０％となる研究を計画した。ｔ検定を用いて両側αレベル０．０５で統計検定を行った。卒中の２４時間後の梗塞体積が中央値４２．１であったことを示す予備データに基づいて（２５〜７５パーセンタイルを考慮する四分位間が１７．６〜６５．０）、本発明者らは、１群あたり１７匹のラットを使用した。
【０１４８】
実験プロトコール
ラットに卒中開始直後に精製ＨＤＬ（２または１０mgのアポＡ−Ｉ/kg体重）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ、１０mgアポＢ/kg体重）または食塩水を静脈内投与した（１群ｎ＝１７）。卒中開始の３または５時間後に追加の４群に食塩水またはＨＤＬ（１０mgアポＡ−Ｉ/kg体重）のいずれかを与えた。以前に報告された、ラットにおけるＨＤＬの薬物動態に従って、単回静脈内注射を行った。コンピューターベースの無作為化を用いて薬物治療方式を各群に割当てた。実験を盲検化し、作業者は手術および転帰判定の間に群の割当てを知らなかった。本発明者らは、卒中開始の２４時間後に運動、知覚およびバランス試験の複合である改変神経重症度スコア（modified Neurological Severity Score）を使用して死亡率および神経障害を評価した。
【０１４９】
除外基準
総病変体積が＿５％であった場合（生理食塩水群でｎ＝３、ＬＤＬ群でｎ＝２、ＨＤＬ群でｎ＝５）、またはくも膜下出血が存在した場合（ＨＤＬ群でｎ＝１）、動物を分析から除外した。塞栓性卒中誘導の３時間以内に麻酔または手術が原因の死亡は起こらなかった。
【０１５０】
梗塞体積および脳浮腫の測定
局所虚血誘導の２４時間後にラットを安楽死させた。脳の冠状切片７枚（厚さ２mm）を２％ ２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（Sigma-Aldrich）で室温で２０分間染色した。２４時間時点になる前に死亡した動物における梗塞体積も評価し、それを結果に含めた。次式を使用して浮腫を補正して体積計算を盲検的に行った：
１００×（対側性半球体積−非梗塞性同側性半球体積）／対側性半球体積
２個の半球の間の体積差を計算し、左半球の体積で除算することによって脳浮腫を決定した。酵素電気泳動（前記の２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド染色と適合性である）以外の全ての補助的実験（エバンスブルーおよび免疫染色）は、追加の動物に対して行った。
【０１５１】
ＨＤＬおよびＬＤＬの調製
以前に記載されたように超遠心分離によって健康志願者の血漿プールからＨＤＬおよびＬＤＬを単離した。免疫比濁法によって１４個のアポタンパク質Ｂおよびアポタンパク質Ａ１の濃度を決定したが、それらの濃度は、ＨＤＬおよびＬＤＬの相互混入を全く示さなかった。５個の異なるバッチのＨＤＬを研究のために使用した。ＬＤＬおよびＨＤＬ画分の純度（アルブミン混入の不在）は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に続くクマシーブルー染色によって検証した。
【０１５２】
カルボシアニンを用いたＨＤＬラベル化およびin vivoトラッキング
ＨＤＬを８．５g/mL DiIC18カルボシアニン（Molecular Probes Inc）と共に静かに振盪しながら３７℃で一晩インキュベーションし、次に超遠心分離によって分離した。卒中開始の直後にラベル化ＨＤＬ（１０mg アポＡ−Ｉ/kg）を静脈内投与し（ｎ＝６）、安楽死の直前にフルオレセインイソチオシアネート−デキストラン（２０００kDa; Sigma-Aldrich）を注射した（ｎ＝３）。断頭後に、脳切片を最適切削温度媒質中で包埋し、直ちに凍結した。クリオスタットを使用して冠状切片（８μm;ブレグマの０．７０mm後方）を調製した。細胞核を４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（０．５μg/mL、１０分間）で染色し、切片を落射蛍光顕微鏡下で観察した。
【０１５３】
肝機能の評価のためのアラニントランスアミナーゼおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの定量
各群からベースライン、卒中開始の１、３、および２４時間後に採血した（１群ｎ＝４）。アラニンおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの血漿活性を市販のキットによってOlympus AU400分光光度計を使用して測定した。
【０１５４】
エバンスブルーの血管外遊出
血管外遊出したエバンスブルー色素の蛍光検出を用いて、ＢＢＢの透過性を定量評価した。卒中誘導直後にラットをＨＤＬ（１０mg/kg）または食塩水で処置した（１群ｎ＝６）。次に、血餅注射の２４時間後に２％エバンスブルー食塩水溶液を注入した（４mL/kg静脈内）。３時間後に、ラットをペントバルビタールで深麻酔し、食塩水を経心的に灌流して血管内の色素を洗浄した。脳を取り出し、２mmの冠状切片にし、最適切削温度中で包埋し、凍結した。１０μm切片（ブレグマの０．７０mm後方）を調製した。エバンスブルーの血管外遊出を蛍光顕微鏡によって観察し、形態計測ソフトウェア（Histolab 6.1.5; Microvision Instruments）を用いて半自動的に定量した。
【０１５５】
免疫組織化学検査
凍結切片を３．７％パラホルムアルデヒドで固定し、１０％ヤギ血清でブロッキングした。切片を一次抗体と共に４℃で一晩インキュベーションした。マウス抗ラット内皮細胞抗原モノクローナル抗体（２．５μg/mL; Serotec）を使用して血管を検出し、ウサギ抗ミエロペルオキシダーゼポリクローナル抗体（１６．５μg/mL; Dako）を使用してＰＭＮを検出し、抗グリア線維性酸性タンパク質抗体（５．８μg/mL; Dakocytomation）を使用して星状細胞を検出し、抗ＮＦ２００抗体（１７μg/mL; Sigma-Aldrich）を使用してニューロンを視覚化した。マウス抗ラット細胞間接着分子−１モノクローナル抗体（１０μg/mL; Biolegend）も使用した。本発明者らは、各実験セットに一次抗体として非免疫性ＩｇＧを含めてシグナルの特異性を試験し、二次抗体としてAlexa-Fluor 488または555を使用した。デジタル取込みシステムをインターフェースで連結した蛍光顕微鏡を用いて免疫染色を分析した。形態計測ソフトウェア（Histolab 6.1.5; Microvision Instruments）を用いて免疫染色された細胞数を半自動的に決定した。全ての免疫組織学的評価は、処置を盲検化された観察者によって実施した。
【０１５６】
ゼラチン酵素電気泳動
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゼラチン酵素電気泳動
断頭および脳の取り出しの直後に、同側性虚血脳組織および対応する対側性非虚血領域を慎重に切開し、抗生物質および抗真菌剤を含有するＲＰＭＩ１６４０（１０μL/μg湿組織）（Gibco）中で３７℃で２４時間別々にインキュベーションし、脳組織によって放出されたプロテアーゼを収集した（ｎ＝７）。遠心分離（３０００ｇ、１０分間、２０℃）後に、等体積の馴化培地を、２．５mg/mLゼラチンを含有する１０％ポリアクリルアミドに溶かした０．２％ドデシル硫酸ナトリウムの存在下で非還元条件下で電気泳動した。National Institutes of Health Image 1.42qソフトウェアを使用したデンシトメトリーによってゼラチン溶解活性を定量した。
【０１５７】
In Situ酵素電気泳動
１０μm冠状切片（ブレグマの＋０．７０mm後方）をリン酸緩衝生理食塩水単独または１０mmol/L １，１０−フェナントロリン（広域ＭＭＰ阻害因子）のいずれかと共に室温で２時間予備インキュベーションした。次に、それらを蛍光発生基質ＤＱ−ゼラチン（４０μg/L; Molecular Probes）と共に酵素電気泳動緩衝液（５０mmol/L トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０mmol/L ＮａＣｌ、５mmol/L ＣａＣｌ２、２００μmol/L アジ化ナトリウム）中で３７℃で２時間インキュベーションし、続いて１０％中性ホルマリン固定を行った（１群ｎ＝４）。落射蛍光顕微鏡を使用してタンパク質分解活性を緑色蛍光として検出した。対照切片をＤＱ−ゼラチンなしに酵素電気泳動緩衝液中でインキュベーションして可能性のある組織自己蛍光を検出した。
【０１５８】
統計解析
データを連続変数については中央値（四分位）として、定性変数についてはパーセンテージとして表現する。本発明者らは、マン−ホイットニーのＵ検定によって、または＞１群が比較される場合にクルスカル−ワリス検定を行い、Ｐ＜０．０５ならば、続いてマン−ホイットニーのＵ検定を行うことによってのいずれかでデータを解析した。フィッシャー直接検定を用いて群間の死亡率の比較を行った。Ｐ＜０．０５の両側値を有意と見なした。JMP7.0.1を使用してデータを解析した。
【０１５９】
結果
体積および神経障害
生理食塩水注射に比べて、卒中の開始直後のＨＤＬの静脈内注射は、２４時間での卒中関連死を有意に減少させた。用量効果が観察され、用量１０mg/kgについて死亡率が６８．４％低下した（Ｐ＝０．０１５）。食塩水処置対照に比べて、ＨＤＬの投与は、卒中直後（Ｐ＝０．０００３）ならびに３および５時間後（それぞれＰ＝０．０１１およびＰ＝０．０１９）に梗塞サイズも有意に減少させた。この保護作用は用量依存的であった。したがって、ＨＤＬ処置群において卒中開始から２４時間後に神経障害が軽減した（Ｐ＝０．０１５）。精製ＬＤＬは、生理食塩水注射群に比べて梗塞サイズも卒中関連死も減少させなかった（それぞれＰ＝０．７５およびＰ＝０．６６）。ＨＤＬは肝損傷を誘導すると報告されているので、本発明者らは、循環肝臓酵素レベルを判定したが、ＨＤＬ注入後に卒中以来２４時間後に採取されたアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼおよびアラニンアミノトランスフェラーゼの血漿レベルは、ベースラインと異ならなかった。
【０１６０】
ＨＤＬはＢＢＢの破壊および脳浮腫を軽減した
本発明者らは、卒中開始から２４時間後での梗塞領域におけるエバンスブルーの血管外遊出を測定した。形態計測定量は、ＨＤＬ（１０mg/kg）が対照に比べてＢＢＢ透過性を６４％減少させたことを明らかにした（Ｐ＝０．００６６）。ＨＤＬ処置群（１０mg/kg）における脳浮腫は、食塩水処置群に比べて有意に軽減した（それぞれ１８．１％対５．７％；Ｐ＝０．０１）。
【０１６１】
ラベル化ＨＤＬは梗塞領域に浸透した
ＨＤＬ投与が梗塞領域に到達しうることで内皮に直接影響するかどうかを検証するために、本発明者らは、卒中の開始直後に蛍光ラベル化ＨＤＬを注射した。２４時間後に、ラットに血管マーカーであるフルオレセインイソチオシアネート−デキストランを静脈内注射し、それを１０秒間循環させてから安楽死させた。ＨＤＬは梗塞領域に浸透し、内皮細胞および星状細胞によって取込まれることができたが、ニューロンとの共局在は観察されなかった。
【０１６２】
ＨＤＬは梗塞領域におけるＰＭＮ動員および関連するＭＭＰゼラチナーゼ活性を減少させた
ミエロペルオキシダーゼ免疫染色に続く形態計測定量（ミエロペルオキシダーゼ陽性細胞数）によって、１０mg/kg ＨＤＬの注射がＰＭＮの動員を生理食塩水処置対照に比べて７０％減少させたことが明らかとなった（Ｐ＝０．０２７）。in situ酵素電気泳動によって、相同な対側性対照領域に比べて同側性梗塞領域における全体的なゼラチナーゼ活性の増加が示された。ＨＤＬ投与後に、このゼラチナーゼ活性増加は、食塩水処置群よりも重要ではないと思われた。卒中開始２４時間後に、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゼラチン酵素電気泳動は、対側性非梗塞領域よりも虚血領域の方がＭＭＰ−９の活性増加を示した。ＭＭＰ−９活性は、対照群よりもＨＤＬ処置群の方が梗塞領域中の活性が減少した。好中球関連ホモ二量体型ＭＭＰ−９について、類似の結果が得られた。
【０１６３】
ＨＤＬは梗塞領域における細胞間接着分子−１陽性血管を減少させた
本発明者らは、ＨＤＬ処置群におけるＰＭＮ動員減少が細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の発現減少に起因しうると仮定した。ＩＣＡＭ−１についての免疫染色によって、対照に比べてＨＤＬ処置群のＩＣＡＭ−１陽性血管における減少が明らかとなった。
【０１６４】
したがって本研究は、脳血管虚血に及ぼすＨＤＬの有益作用を示した。免疫染色によって示されたように、ＨＤＬは、ニューロンではなく内皮細胞およびグリア細胞によって取込まれる。本発明者らの知るところでは、ＨＤＬの神経保護作用が報告されているが、ＨＤＬが卒中開始の２時間前に注射されたことからこの作用は予防的であった。対照的に、本発明者らは、脳虚血開始の最大５時間後にＨＤＬを注射した。そのような注射は、治療的な神経および血管保護作用を提供した。
【０１６５】
実施例５：アテローム血栓症における新生血管の安定化におけるＨＤＬ
急性自然反応における最初の食細胞である好中球の蓄積が、プラーク破綻部位に報告されたが、好中球浸潤物は、急性冠症候群における責任病変に存在する。プラーク内出血は、プラーク中の好中球および好中球由来プロテアーゼの強化に関連すると示されている。この情報は、好中球がプラーク破綻につながるメカニズムに関与することを示す。好中球は、様々なメカニズムによってアテローム硬化性プラーク中の新生血管を不安定化する。好中球は、外来物質をエンドサイトーシスし、強力な活性酸素種を生成し、エラスターゼ、カテプシン、ＭＭＰ−８および−９、ならびにミエロペルオキシダーゼなどの、感染浄化を助けるだけでなく組織の分解および破壊にも関与する多様なタンパク質分解酵素を放出する。白血球由来セリンプロテアーゼ活性は、頸動脈内膜摘除標本における不安定領域から見出される。これは、過剰な白血球介在性ＥＣＭタンパク質分解が原因としてプラーク不安定化に関与することを示す。プラスミンおよびエラスターゼによる細胞外マトリックスのタンパク質分解は、プラークを安定化している重大な細胞である血管平滑筋細胞のアポトーシスを誘導する。
【０１６６】
白血球由来タンパク質分解活性は、間葉細胞の剥離および死滅（アノイキス）を誘発する能力に加えて、血管新生促進因子および血管新生抑制因子の分解によってアテローム血栓性プラーク中の新生血管の成熟も損なう。
【０１６７】
血管の成長および安定化に及ぼす好中球由来プロテアーゼの潜在的有害作用を検討するために、血管新生のin vitroおよびin vivoモデルを使用する。補充されたMatrigel中のラット大動脈輪およびヒト胸動脈からの毛細血管様構造の形成に及ぼす休止および活性化好中球の作用を、好中球由来プロテアーゼ阻害因子の存在下または不在下で比較する。
【０１６８】
いったん毛細血管様構造が既に形成した後の時点で、休止または活性化好中球をMatrigelに添加することによって、未熟血管の安定性および生存性に及ぼす好中球の作用を研究する。
【０１６９】
精製好中球の代わりに、ヒト頸動脈由来の複雑プラークまたは非複雑プラークのいずれかからの馴化培地を使用して類似の実験を行う。
【０１７０】
これらのin vitro研究と並行して、以下のようにin vivo実験を行う。成長因子をロードされたMatrigelを背側皮下チャンバー（dorsal skinfold chamber）に植込み、局所血管新生を誘導する。
【０１７１】
プロテアーゼ阻害因子の存在下または不在下で、新生血管を複雑プラークまたは非複雑プラーク由来の馴化培地で急性および局所的に刺激する。
【０１７２】
新生血管の透過性およびMatrigel中の出血発生率における改変を生体顕微鏡検査によって観察する。
【０１７３】
マウスプラーク破綻モデルが開発されたが、このモデルではアポＥ−／−マウスにおいて頸動脈上の血管周囲カフの留置と結紮を組合せる。この結果として、いくつかのマクロファージ、Ｔリンパ球、および平滑筋細胞を含有する、脂質およびコラーゲンに富む病変が生じる。続いて、カフの留置はフィブリン（フィブリノーゲン）陽性管腔血栓を伴うプラーク内出血およびプラーク破綻を誘発した。in vivoプラーク内出血に果たす好中球の役割を検討するために、好中球を枯渇させ、これらのマウスにおけるプラーク内出血およびプラーク破綻を予防する。
【０１７４】
両モデル（血管新生−皮下チャンバーおよびプラーク破綻モデル）においてＨＤＬ療法を試験する。
【０１７５】
まず、エラスターゼを注射してからの皮膚チャンバーモデルにおけるＨＤＬによる新生血管の潜在的安定化を試験し、アテローム血栓プラークからの馴化培地およびＨＤＬは、ずっとよくコントロールされる。
【０１７６】
エラスターゼ（好中球中またはプラーク中に含有される精製物）によって誘導される出血を予防する場合、α−１アンチトリプシンが強化されているか、または強化されていないＨＤＬの注射をマウスプラーク破綻モデルで試験する。
【０１７７】
結論
本発明者らは、この実験においてＨＤＬ療法が新生血管の安定化に有用なことを示す。
【０１７８】
実施例６：虚血条件下で好中球によって誘導される血液脳関門透過性にＨＤＬが及ぼす保護作用
ａ）健康被験者の血漿から単離されたＨＤＬの保護作用
血液脳関門（ＢＢＢ）は、内皮細胞が中心的な役割を果たす中枢神経系（ＣＮＳ）から血管区画を隔離するように設計された生体フィルターである。ＢＢＢの破壊または機能障害は、ＣＮＳのいくつかの血管疾患および変性疾患（腫瘍、てんかんまたは虚血性卒中）に関連する主なステップである。虚血によって誘導されるＢＢＢ破壊は、脳区画への循環白血球およびプロテアーゼを含めたそれらの分泌産物などの有害血液成分の進入を可能にし、出血性変化および／または脳浮腫のリスクを高めるおそれがある。本発明者らは、虚血条件下（ＯＧＤ：酸素およびグルコース欠乏）でＢＢＢに好中球およびエラスターゼが及ぼす効果、ならびにＨＤＬ（高密度リポタンパク質）の可能性のある保護作用を検討した。
【０１７９】
材料および方法
トランスウェル上で培養されたヒト不死化脳内皮細胞から成るヒト脳内皮細胞のin vitroモデルを使用して、上部区画にデキストラン−ＦＩＴＣ ７０kDaを添加すること、およびＯＧＤ条件で４時間後に下部区画における蛍光を測定することによって、ＢＢＢの透過性を試験した（BB Weksler et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line, FASEB J. 2005 Nov;19(13):1872-4）。
【０１８０】
透過性係数は、以前に報告されたように計算した（BB Weksler et al.）。そのような血液脳関門モデルは、エラスターゼおよび好中球が正常または虚血条件下で透過性に及ぼす作用の検討を可能にした。
【０１８１】
細胞間結合タンパク質または細胞外マトリックスタンパク質に対する特異的抗体を用いたウエスタンブロットは、ＨＤＬの存在下または不在下で好中球または精製エラスターゼによって誘導されたタンパク質分解の判定を可能にした。ＨＤＬを、超遠心分離によって健康志願者の血漿から単離した。
【０１８２】
結果
in vitro ＢＢＢモデルは、細胞間結合タンパク質（ＶＥ−カドヘリン）および密着結合タンパク質（ＪＡＭ−１、ＺＯ−１）を発現する。これらのタンパク質は、エラスターゼまたは活性化好中球の上清と共にインキュベーションされると分解され、ＢＢＢの透過性増加につながる。
【０１８３】
ＯＧＤ条件で４時間後に、透過性は有意には影響されなかった。ＯＧＤ条件下のエラスターゼおよび好中球と共のインキュベーションだけが、ＯＧＤ条件単独または正常酸素圧条件下のＯＧＤに比べて透過性を有意に増加させた。ＨＤＬの添加は、タンパク質分解を防止し、透過性を制限した（（図１０）。これらの結果は、エラスターゼ（精製物または好中球中に含有されるもの）およびＯＧＤ条件がＢＢＢに有害作用を有し、それをＨＤＬによって防止できることを示す。
【０１８４】
したがって本発明者らは、ＨＤＬ（ヒト血漿から精製）が虚血条件でのＢＢＢ透過性におけるこのプロテアーゼ介在性増加を有意に阻害可能であったことを示した。したがって本発明者らは、虚血が好中球の脱顆粒を促進すること、およびＨＤＬと結合したα−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）が、ＢＢＢにエラスターゼが及ぼす損傷を防止できたという事実に鑑みる。
【０１８５】
ｂ）ｒＨＤＬは、脳内皮細胞によって取込まれる
再構成されたＨＤＬ（ＣＳＬ１１１）または健康ドナーの血漿から単離されたＨＤＬ（ＨＤＬ）をＤｉＩＣ１８−カルボシアニンでラベル化し、次に脳内皮細胞と共に４時間インキュベーションした。本発明者らは、以下のように染色に着手した：
− 核をＤＡＰＩによって染色し；そして
− ＨＤＬをカルボシアニン（ＤｉＩＣ１８）でラベル化した。
【０１８６】
両方の種類のＨＤＬは、内皮細胞によって取り込まれたが、これは、虚血条件下でプロテアーゼによって誘導される透過性からの内皮細胞の保護に関連したＨＤＬの潜在的細胞内作用を示している。
【０１８７】
最近の研究は、エラスターゼが様々な細胞型にインターナリゼーションし、次にその細胞内の細胞内基質を分解可能であると報告している（AM Houghton et al., Neutrophil elastase-mediated degradation of IRS-1 accelerates lung tumor growth, Nat Med. 2010 Feb;16(2):219-23）。
【０１８８】
したがって、ＨＤＬまたはｒＨＤＬの使用は、エラスターゼの細胞内作用に対抗するための非常に有望な戦略である。
【０１８９】
実施例７：ロードされた再構成ＨＤＬ（ｒＨＤＬ）
ＡＡＴによるｒＨＤＬ強化の実行可能性をＣＳＬ１１１およびZemaira（CSL Behring）を使用して試験した。
【０１９０】
材料および方法
再構成されたＨＤＬ（ｒＨＤＬ）を、蛍光色素（ＤｉＩＣ１８「カルボシアニン」）存在下または不在下でＡＡＴと共に静かに撹拌しながら３７℃で２時間インキュベーションした。初期密度を１．１５に調整し、ｄ＝１．１で、最終的にｄ＝１でオーバーレイし、ＫＢｒ勾配をかけた超遠心分離後に、ｒＨＤＬを密度１．１で単離することができた（１００，０００ｇ、２０℃で１６時間）。
【０１９１】
結果
ＡＡＴの強化によって、超遠心分離後に、蛍光色素を有さない超遠心分離チューブから直接目に見え、ＡＡＴ単独（ｒＨＤＬと共にインキュベーションしない）では観察されない白色バンドが生じる。超遠心分離によってｒＨＤＬを再単離した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に硝酸銀染色を行う（図１１）。該染色は、超遠心分離によるｒＨＤＬの再単離後に、ＨＤＬにＡＡＴが強化されていること（中心のレーン）を示す。
【０１９２】
このように、本発明者らは、ｒＨＤＬにＡＡＴなどの因子を強化できるという事実を説明した。
【０１９３】
実施例８：卒中を患うラットにおけるｒｔＰＡ処置後の静脈内ＨＤＬ注射の保護作用
リコンビナント組織プラスミノーゲン活性化因子（ｒｔＰＡ）は、卒中において塞栓性血餅を溶解する、ヒトに唯一承認および使用されている薬物である。しかしながら、ｒｔＰＡは、出血合併症のリスクを増加させて血液脳関門（ＢＢＢ）に有害作用を示すと報告されているプロテアーゼである。本発明者らは、ＨＤＬがヒトにおける卒中の治療因子のために使用される場合に臨床状況を刺激するために、ＨＤＬがｒｔＰＡの存在下で梗塞体積を依然として減少可能であるかどうかを試験した。
【０１９４】
材料および方法
動物の世話および実験プロトコールは、INSERM-University Paris 7動物倫理委員会、認可番号75-214によって承認された。体重３００〜３５０ｇの雄性Sprague-Dawleyラット（Janvier, France）を、自然呼吸下で空気と混合したイソフルラン（導入のために４％；手術中は１％）で麻酔した。中大脳動脈の管腔内縫合閉塞によって局所脳虚血を４時間３０分間誘導した。リコンビナントｔＰＡ（１０mg/kg体重; Genetech）を有するかまたは有さない生理食塩水（２．０mL/kg体重）を右大腿静脈を経由してラットに投与した（１０％ボーラス、９０％連続注入）。ヒトにおける血栓溶解療法に類似した線維素溶解作用をラットにおいて達成するために、比較的高用量のｔＰＡが必要であった（W Liu W et al. Normobaric hyperoxia reduces the neurovascular complications associated with delayed tissue plasminogen activator treatment in a rat model of focal cerebral ischemia Stroke. 2009 Jul;40(7):2526-31）。再灌流の直前にｔＰＡまたは食塩水処置を開始し、縫合糸の抜き取りから３０分間継続した。この方式は、再灌流された組織がその因子に曝露されたことを保証した。食塩水またはｔＰＡ投与後に、ラットを自分のケージに戻した。
【０１９５】
動物を、対照（食塩水処置のみ）；ｔ−ＰＡ単独（１０mg/kg）；ＨＤＬ単独（１０mg/kg ＩＶ、頸静脈）；およびｔ−ＰＡ＋ＨＤＬの４群の一つに割当てた（１群ｎ＝１０）。ＨＤＬ １０mg/kg ＩＶを再灌流開始の５分前に注射した。梗塞測定のための屠殺は、卒中の２４時間後に起こった。手術が継続する間に加熱パッドで体温を３７℃±０．５に維持した。血糖、動脈血圧および血中ガスもまた、手術中にモニターした。
【０１９６】
結果
ｒｔＰＡの注射時点でＨＤＬによって処置されたラットの方が梗塞体積が有意に減少した（図１２Ａ）
出血の存在を肉眼で評価した。ｒｔ−ＰＡによって誘導される出血の発生率は、ｒｔＰＡ＋ＨＤＬによって同時処置されたラットの方が減少した（７５％対５０％）（図１２Ｂ）。
【０１９７】
したがって本発明者らは、ＨＤＬの注射がＢＢＢの保護を提供し、したがって出血性合併症のリスクを減少させることによってリコンビナント組織プラスミノーゲン活性化因子（ｒｔＰＡ）注射の有害作用を緩和することを示した。
【０１９８】
参考文献
本出願にわたり、本発明が属する技術分野の状況を様々な参考文献が説明している。これらの参考文献の開示は、本開示の参照により本明細書に組入れられる。
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬として使用するための、アンチプロテアーゼ、抗酸化因子、有糸分裂阻害因子、鉄代謝に関与する因子および抗アポトーシス因子から成る群より選択される因子を含むＨＤＬ。
【請求項２】
ネイティブであるか、または再構成されている、請求項１記載のＨＤＬ。
【請求項３】
因子が、α−１アンチトリプシン、エラフィン、プロテアーゼ−ネキシン１、α−２−アンチプラスミン、単球／好中球エラスターゼ阻害因子、インター−α−トリプシン阻害因子、組織性マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害因子およびα−１アンチキモトリプシンの組織阻害因子から成る群より選択されるアンチプロテアーゼである、請求項１または２記載のＨＤＬ。
【請求項４】
アンチプロテアーゼ／アポリポタンパク質Ａ−Ｉのモル比が、０．１から２００の間である、請求項３記載のＨＤＬ。
【請求項５】
アテローム血栓症、虚血性疾患、慢性閉塞性肺疾患、神経変性疾患、ガン、ステント内再狭窄、および内皮機能不全を伴う全ての病態の処置に使用するための、請求項３または４記載のＨＤＬ。
【請求項６】
因子が、パラオキソナーゼ１、２、３、カタラーゼ、ビタミンＥ、ω−３脂肪酸、ブチルヒドロキシトルエン、Ｎ−アセチルシステイン、ポリフェノール、チオレドキシン、およびエストロゲンから成る群より選択される抗酸化因子である、請求項１または２記載のＨＤＬ。
【請求項７】
抗酸化因子／アポリポタンパク質Ａ−Ｉのモル比が、０．１から２００の間である、請求項６記載のＨＤＬ。
【請求項８】
アテローム血栓症、虚血性疾患、慢性閉塞性肺疾患、神経変性疾患、ガン、ステント内再狭窄および内皮機能不全を伴う全ての病態の処置に使用するための、請求項６または７記載のＨＤＬ。
【請求項９】
有糸分裂阻害因子がシロミルス（Siromilus）である、請求項１または２記載のＨＤＬ。
【請求項１０】
有糸分裂阻害因子／アポリポタンパク質Ａ−Ｉのモル比が、０．１から２００の間である、請求項９記載のＨＤＬ。
【請求項１１】
ガンおよびステント内再狭窄の処置に使用するための、請求項９または１０記載のＨＤＬ。
【請求項１２】
因子が、トランスフェリン、ハプトグロビンおよびヘプシジンを含む群より選択される鉄代謝に関与する因子である、請求項１または２記載のＨＤＬ。
【請求項１３】
鉄代謝に関与する因子／アポリポタンパク質Ａ−Ｉのモル比が、０．１から２００の間である、請求項１２記載のＨＤＬ。
【請求項１４】
アテローム血栓症、虚血性疾患、慢性閉塞性肺疾患および神経変性疾患の処置に使用するための、請求項１２または１３記載のＨＤＬ。
【請求項１５】
因子が、スフィンゴシン−１−リン酸、パラオキソナーゼ１および２、カタラーゼ、ＤＨＡを含めたω−３脂肪酸、レゾルビン（Resolvin）Ｅ１ならびにクラスタリンを含む群より選択される抗アポトーシス因子である、請求項１または２記載のＨＤＬ。
【請求項１６】
抗アポトーシス因子／アポリポタンパク質Ａ−Ｉのモル比が、０．１から４００の間である、請求項１５記載のＨＤＬ。
【請求項１７】
アテローム血栓症、虚血性疾患、慢性閉塞性肺疾患および内皮機能不全を伴う全ての病態の処置に使用するための、請求項１５または１６記載のＨＤＬ。
【請求項１】
医薬として使用するための、アンチプロテアーゼ、抗酸化因子、有糸分裂阻害因子、鉄代謝に関与する因子および抗アポトーシス因子から成る群より選択される因子を含むＨＤＬ。
【請求項２】
ネイティブであるか、または再構成されている、請求項１記載のＨＤＬ。
【請求項３】
因子が、α−１アンチトリプシン、エラフィン、プロテアーゼ−ネキシン１、α−２−アンチプラスミン、単球／好中球エラスターゼ阻害因子、インター−α−トリプシン阻害因子、組織性マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害因子およびα−１アンチキモトリプシンの組織阻害因子から成る群より選択されるアンチプロテアーゼである、請求項１または２記載のＨＤＬ。
【請求項４】
アンチプロテアーゼ／アポリポタンパク質Ａ−Ｉのモル比が、０．１から２００の間である、請求項３記載のＨＤＬ。
【請求項５】
アテローム血栓症、虚血性疾患、慢性閉塞性肺疾患、神経変性疾患、ガン、ステント内再狭窄、および内皮機能不全を伴う全ての病態の処置に使用するための、請求項３または４記載のＨＤＬ。
【請求項６】
因子が、パラオキソナーゼ１、２、３、カタラーゼ、ビタミンＥ、ω−３脂肪酸、ブチルヒドロキシトルエン、Ｎ−アセチルシステイン、ポリフェノール、チオレドキシン、およびエストロゲンから成る群より選択される抗酸化因子である、請求項１または２記載のＨＤＬ。
【請求項７】
抗酸化因子／アポリポタンパク質Ａ−Ｉのモル比が、０．１から２００の間である、請求項６記載のＨＤＬ。
【請求項８】
アテローム血栓症、虚血性疾患、慢性閉塞性肺疾患、神経変性疾患、ガン、ステント内再狭窄および内皮機能不全を伴う全ての病態の処置に使用するための、請求項６または７記載のＨＤＬ。
【請求項９】
有糸分裂阻害因子がシロミルス（Siromilus）である、請求項１または２記載のＨＤＬ。
【請求項１０】
有糸分裂阻害因子／アポリポタンパク質Ａ−Ｉのモル比が、０．１から２００の間である、請求項９記載のＨＤＬ。
【請求項１１】
ガンおよびステント内再狭窄の処置に使用するための、請求項９または１０記載のＨＤＬ。
【請求項１２】
因子が、トランスフェリン、ハプトグロビンおよびヘプシジンを含む群より選択される鉄代謝に関与する因子である、請求項１または２記載のＨＤＬ。
【請求項１３】
鉄代謝に関与する因子／アポリポタンパク質Ａ−Ｉのモル比が、０．１から２００の間である、請求項１２記載のＨＤＬ。
【請求項１４】
アテローム血栓症、虚血性疾患、慢性閉塞性肺疾患および神経変性疾患の処置に使用するための、請求項１２または１３記載のＨＤＬ。
【請求項１５】
因子が、スフィンゴシン−１−リン酸、パラオキソナーゼ１および２、カタラーゼ、ＤＨＡを含めたω−３脂肪酸、レゾルビン（Resolvin）Ｅ１ならびにクラスタリンを含む群より選択される抗アポトーシス因子である、請求項１または２記載のＨＤＬ。
【請求項１６】
抗アポトーシス因子／アポリポタンパク質Ａ−Ｉのモル比が、０．１から４００の間である、請求項１５記載のＨＤＬ。
【請求項１７】
アテローム血栓症、虚血性疾患、慢性閉塞性肺疾患および内皮機能不全を伴う全ての病態の処置に使用するための、請求項１５または１６記載のＨＤＬ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１２−５３２９１９（Ｐ２０１２−５３２９１９Ａ）
【公表日】平成２４年１２月２０日（２０１２．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２００５３（Ｐ２０１２−５２００５３）
【出願日】平成２２年７月１６日（２０１０．７．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６０３３０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００６９９４
【国際公開日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【出願人】（５９１１００５９６）アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル (59)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月２０日（２０１２．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月１６日（２０１０．７．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６０３３０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００６９９４
【国際公開日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【出願人】（５９１１００５９６）アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル (59)
【Ｆターム（参考）】
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