活性物質としてオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物におけるまたはそれに関する改善
活性物質としてオリゴヌクレオチドと、賦形剤としてリポソームと、を含み、該オリゴヌクレオチドが、ＣＤ４０をコードする核酸を標的にすることによって哺乳類細胞におけるＣＤ４０の発現を調節するように構成される、医薬組成物が開示される。該リポソームは両性リポソームである。さらに、かかる組成物の治療的または予防的有効量を該患者に投与することによる、ヒトもしくは非ヒト動物患者におけるＣＤ４０の発現に関連した疾患または症状を治療あるいは予防するための方法が開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性物質としてオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物に関し、特にＣＤ４０をコードする核酸を標的にするように適用され、そのことにより哺乳類細胞におけるＣＤ４０の発現を調節するオリゴヌクレオチドを含むかかる組成物について言及している。本発明は、全身送達または局所適用に適合した組成物を含む。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ４０については、非特許文献１によって最初に記載された。タンパク質は、主に樹状細胞およびＢ−細胞に関して示され、Ｔ−細胞上のそのリガンド（ＣＤ４０リガンドまたはＣＤ１５４）と相互作用する。ＣＤ４０とＣＤ１５４の間のシグナル伝達は液性免疫応答の発現にとって重要である。経路の過剰刺激は免疫学的な不均衡や、その結果として、移植片拒絶、対宿主移植片病、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、喘息、炎症性腸疾患、乾癬および甲状腺炎を含む種々の免疫関連障害を招く可能性がある。ＣＤ４０の過剰発現が生じるならば、それは腫瘍成長（非特許文献２）にも関与する可能性がある。ＮＦ−κＢ経路へのＣＤ４０シグナルは、結果として転写因子の活性化および最終的にＩＬ−Ｉ、ＴＮＦαおよびＩＦＮγなどのサイトカインの放出をもたらし、次いで他の細胞を活性化することによって正のフィードバック機構を用いて炎症を促進する。
【０００３】
免疫障害または炎症プロセスを阻害するための有効な戦略として、上記の経路における初期事象の阻害が提案されている。例として、抗体を用いたＴＮＦαの競合的結合、ＴＮＦα−受容体に対する抗体を用いた受容体遮断およびＮＦ−κＢ結合の競合的阻害が挙げられる。ＣＤ４０がその三量体リガンドＣＤ１５４との相互作用を介してシグナル伝達することから、小分子阻害剤によるシグナル伝達事象の阻害は起こりにくく、治療法の開発では遮断抗体の利用に焦点が当てられている。より詳細には、非特許文献３または非特許文献４に記載のように、ＣＤ４０／ＣＤ１５４相互作用は一成分に特異的な抗体を使用して遮断されうる。しかし、開発中のＣＤ４０抗体は副反応を生じることから、このポイントで炎症性フィードバックループを切るための別の手段が求められている。
【０００４】
ＣＤ４０のｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドは、シグナル伝達カスケードを遮断するための別のアプローチを提供する。タンパク質の発現は、例えば、様々な化学物質のアンチセンス、固定化核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸（モルホリノ）および短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などのオリゴヌクレオチドを用いて特異的に下方制御されうる。
【０００５】
これまで、ＣＤ４０ ｍＲＮＡに特異的な多数の配列はインビトロで確認されている。例えば、特許文献１および特許文献２（いずれもベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）ら）では、アンチセンス機構に基づくかかるオリゴヌクレオチドに関する詳細な説明が示される。非特許文献５では、ヒト標的に対してｓｉＲＮＡを用いたＣＤ４０の下方制御について最初に記載された。さらに、特許文献３（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ））では、ＣＤ４０タンパク質の発現を阻害するための新規のオリゴヌクレオチドの適用可能性について記載される。特許文献４（ヘッカー（Ｈｅｃｋｅｒ）およびワグナー（Ｗａｇｎｅｒ））では、転写因子ＩＦＲ−１の阻害を用い、ＣＤ４０の発現を下方制御するための間接的手段が記載されている。
【０００６】
しかし、インビボにおけるその概念を証拠立てるものは過去に開示されておらず、活性を示すオリゴヌクレオチドの送達が不十分であることが最も考えられる理由であると見なされる。オリゴヌクレオチドでは、その実際の化学的原因（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｏｒｉｇｉｎ）とは無関係に、体液中でのその不安定性または細胞への効率の悪い取り込みまたはそれら双方が理由で、治療有効性が不十分でありうることは当該技術では既知である。例えば、上記の変異体またはリガンドもしくはポリマーとの抱合体などの化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドは、実用上の制限を克服するための１つの戦略を示す。第２のまとまった戦略としては、オリゴヌクレオチドの保護、ターゲティングおよび細胞への取り込み促進を目的とした担体系、特にリポソームの使用が包含される。
【０００７】
リポソームは、かかる担体系として使用される場合、望ましくは高いカプセル化効率を示しかつ作製が経済的である必要があり、優れたコロイド安定性を有しかつ薬剤の細胞への取り込み促進をもたらす必要があり、さらにその毒性も免疫原性も低い必要がある。全身送達用のリポソームは、ヒト血清中でも安定である必要がある。血清成分、特に補体は、脂質膜をせん孔することによってカプセル化薬剤の放出をもたらす可能性があることは知られている。かかる放出が生じる範囲は、関与する膜の組成物およびその中でカプセル化された薬剤の分子サイズに依存する。したがって、小分子が速やかに放出されうる一方、プラスミドなどの大分子が作用を受ける可能性は全くない。
【０００８】
アニオンまたは中性リポソームは、担体と環境の間に凝集が全く生じないことから優れたコロイド安定性を有することが多い。その結果、それらの生体内分布は優れ、かつそれらの炎症および細胞毒性に対する潜在性は低い。しかし、かかる担体におけるカプセル化効率が不十分であることが多く、細胞へのさらなる取り込みを促進するエンドソーム溶解性（ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ）シグナルをもたらすことがない（非特許文献６）。
【０００９】
非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９を例とする極めて多数の出版物がカチオン性リポソーム系を扱っている。カチオン系は、高い帯電効率をもたらす可能性があるが、特に体液との接触後にコロイド安定性が低下する。タンパク質および／または他の生体高分子とのイオン相互作用により、ｉｎ ｓｉｔｕで細胞外マトリックスまたは細胞表面との凝集体形成が起こりうる。非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２によって示されるように、カチオン脂質が有毒であると認められることも多かった。
【００１０】
担体を立体的に安定化する成分の添加により、かかる制限を克服する試みがなされてきた。例えば、様々な鎖長のポリエチレングリコールは体液中でのカチオン成分の使用に関連した凝集問題を改善することが知られており、ＰＥＧ化したカチオン性リポソームがインビボで循環時間の増大を示す（非特許文献１３）。にもかかわらず、ＰＥＧを使用してもカチオン脂質に関連した特有の毒性問題を解決することはない。ＰＥＧがかかるリポソームの細胞への積極的侵入（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｅｎｔｒｙ）または細胞内送達を実質的に阻害しうることも知られている（非特許文献１４）。
【００１１】
両性リポソームは、ｐＨ７．５でアニオンまたは中性電荷およびｐＨ４でカチオン電荷を有する、最近記載されたリポソーム類である。ここでは特許文献５、特許文献６および特許文献７（すべてパンツナー（Ｐａｎｚｎｅｒ）ら）に対して参照がなされ、それらは参照により本明細書中に援用され、両性リポソームに関して詳細な説明を提示している。さらに、特許文献８および特許文献７（同様にパンツナー（Ｐａｎｚｎｅｒ）ら）において開示がなされ、それらは参照により本明細書中に援用され、かかる両性リポソームの作製におけるｐＨに感受性を示す脂質の使用についてさらに記載している。両性リポソームは優れた生体内分布を有し、動物において十分な耐容性を示す。それらは核酸分子を高効率にカプセル化することが可能である。
【００１２】
要するに、ＣＤ４０は、例えばアンチセンスまたはｓｉＲＮＡ分子などのオリゴヌクレオチド阻害剤を使用して潜在的に軽減可能な炎症性または免疫障害の治療における好ましい標的を示す。しかし、これまではかかる活性オリゴヌクレオチドをインビボでうまく利用することができなかった。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／０１８６０７１号明細書
【特許文献２】米国特許第６，１９７，５８４号明細書
【特許文献３】国際公開第２００４／０９０１０８号パンフレット
【特許文献４】ＤＥ１００４９５４９号明細書
【特許文献５】国際公開第０２／０６６４９０号パンフレット
【特許文献６】国際公開第０２／０６６０１２号パンフレット
【特許文献７】国際公開第０３／０７０７３５号パンフレット
【特許文献８】国際公開第０３／０７０２２０号パンフレット
【非特許文献１】パウリ（Ｐａｕｌｉ）ら、１９８４年（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ １７：１７３−１７９頁）
【非特許文献２】グラス（Ｇｒｕｓｓ）ら、１９９７年、Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．２４（５−６）：３９３−４２２頁
【非特許文献３】ホルステージャー（Ｈｏｌｓｔａｇｅｒ）ら、２０００年（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１５３９２−１５３９８頁）
【非特許文献４】バッカム（Ｂａｃｃａｍ）およびビショップ（Ｂｉｓｈｏｐ） １９９９年（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：３８５５−３８６６頁）
【非特許文献５】プルビネ（Ｐｌｕｖｉｎｅｔ）ら、Ｂｌｏｏｄ、２００４年
【非特許文献６】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ （２０００年）、２９２、４８０−４８８頁、クリムク（Ｋｌｉｍｕｋ）ら
【非特許文献７】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９年）、１６、１２９−１４０頁、マウラー（Ｍａｕｒｅｒ）ら
【非特許文献８】ＢＢＡ（２０００年）１４６４、２５１−２６１頁、メイダン（Ｍｅｉｄａｎ）ら
【非特許文献９】Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００１年）、１（２）、２７−３３頁、フィゼ（Ｆｉｓｅｔ）およびガウニ（Ｇｏｕｎｎｉ）
【非特許文献１０】フィリオン（Ｆｉｌｉｏｎ）ら、ＢＢＡ（１９９７年）、１３２９（２）、３４５−３５６頁
【非特許文献１１】ダス（Ｄａｓｓ）、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００２年）、５４（５）、５９３−６０１頁
【非特許文献１２】ヒルコ（Ｈｉｒｋｏ）ら、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１０（１４）、１１８５−１１９３頁
【非特許文献１３】ＢＢＡ（２００１年）１５１０、１５２−１６６頁、センプル（Ｓｅｍｐｌｅ）ら
【非特許文献１４】ソン（Ｓｏｎｇ）ら、ＢＢＡ（２００２年）、１５５８（１）、１−１３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明の目的は、ＣＤ４０に特異的なオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を提供することである。
【００１４】
本発明の特定の目的は、局所治療に対してかかる組成物を提供することである。
【００１５】
本発明の別の特定の目的は、全身投与されうるかかる組成物を提供することである。望ましくは、かかる組成物は、血清との接触時にそのオリゴヌクレオチドを時期を早めて放出するべきでなく、あるいは少なくともその含有物を単に緩徐に放出するべきである。
【００１６】
本発明の異なる目的は、ヒトもしくは非ヒト動物における炎症性、免疫または自己免疫疾患を治療あるいは予防する方法を提供することである。
【００１７】
さらに本発明の別の目的は、移植片拒絶、対宿主移植片病、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、喘息、炎症性腸疾患、乾癬または甲状腺炎を予防あるいは治療する方法を提供することである。
【００１８】
さらに本発明の別の目的は、移植片拒絶、対宿主移植片病、炎症性腸疾患、クローン病（Ｍｏｒｂｕｓ Ｃｒｏｈｎ）または潰瘍性大腸炎を予防あるいは治療する方法を提供することである。
【００１９】
さらに本発明の別の目的は、腸、肺または皮膚の炎症性部位の局所治療に適する医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
したがって、本発明の一態様によると、活性物質としてのオリゴヌクレオチドおよび賦形剤としてのリポソームを含む医薬組成物であって、該オリゴヌクレオチドが、ＣＤ４０をコードする核酸を標的にするように適用され、そのことにより哺乳類細胞におけるＣＤ４０の発現を調節するものである医薬組成物であって、該リポソームが両性リポソームであることを特徴とする医薬組成物が提供される。
【００２１】
好ましくは、該オリゴヌクレオチドはヒトＣＤ４０に特異的である。
【００２２】
本発明の医薬組成物は、一般に局所投与に適し、かつ担体をさらに含み、局所投与のために調合されうる。血清が安定した実施形態は全身送達にも用いることが可能であり、かかる実施形態では、該組成物は担体をさらに含み、かつ全身送達のために調合されうる。
【００２３】
該両性リポソームは、負に帯電されるかまたはｐＨ７．４で中性かつｐＨ４でカチオン性でありうる。好ましくは、該オリゴヌクレオチドの実質的割合またはすべては物理的に両性リポソーム内に捕捉される。リポソームの大きさは、５０〜５００ｎｍ、好ましくは１００〜５００ｎｍ、より好ましくは１５０〜３００ｎｍの範囲内にありうる。
【００２４】
本発明の異なる態様では、ヒトもしくは非ヒト動物患者におけるＣＤ４０の発現に関連した疾患または症状を、本発明に記載の組成物の治療的または予防的有効量を該患者に投与することによって治療あるいは予防するための方法が提供される。
【００２５】
本明細書における「両性」とは、リポソームがアニオンとカチオンの双方の性質を有する電荷群を含むことを意味し、
（ｉ）電荷群の少なくとも一方が４〜７．４のｐＫを有し、
（ｉｉ）カチオン電荷がｐＨ４で優勢となり、かつ
（ｉｉｉ）アニオン電荷がｐＨ７．４で優勢となり、
それによってリポソームはｐＨ４〜ｐＨ７．４でゼロ正味電荷の等電点を有する。この定義により、両性イオンが上記の範囲内のｐＫを有しないことから、両性の性質は「両性イオンの性質」とは異なる。結果として、両性イオンはｐＨ値の範囲を超えて本質的に中性である。例えば、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンは、両性イオンの性質を有する中性脂質である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態では、該両性リポソームは両性脂質を含有する脂質相から形成されうる。該脂質相は、５〜３０モル％、好ましくは１０〜２５モル％の該両性脂質を含有しうる。
【００２７】
適切な両性脂質が国際公開第０２／０６６４８９号パンフレットおよび国際公開第０３／０７０７３５号パンフレットにおいて開示されている。好ましくは、該両性脂質は、ＨｉｓｔＣｈｏｌ、ＨｉｓｔＤＧ、ｉｓｏＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ、アシルカルノシンおよびＨＣＣｈｏｌからなる群から選択される。（本明細書中で参照される脂質の参照を容易にするために、かかる略式名称の用語集が下記に含められる。かかる多数の略語は当業者によって共通に用いられるものである）。
【００２８】
特に好ましい両性脂質はＨｉｓｔＣｈｏｌである。
【００２９】
あるいは、該両性リポソームは、両性の特性を有する脂質成分の混合物を含有する脂質相から形成されうる。かかる両性リポソームは、例えば国際公開第０２／０６６０１２号パンフレットに開示されたｐＨ応答性のアニオンおよび／またはカチオン成分から形成されうる。ｐＨに感受性を示すカチオン脂質は、国際公開第０２／０６６４８９号パンフレットおよび国際公開第０３／０７０２２０号パンフレットおよびそれらの中でなされた参照、特にブドカー（Ｂｕｄｋｅｒ）ら、１９９６年、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（６）：７６０−４頁において開示され、構成的に帯電されたアニオン脂質またはｐＨに感受性を示すアニオン脂質と組み合わせて使用されうる。
【００３０】
あるいは、カチオン電荷は、ｐＨに感受性を示すアニオン脂質と組み合わせた当業者には既知の構成的に帯電された脂質から導入されうる。ＤＯＴＡＰおよびＤＰＰＧを例とする構成的に帯電されたアニオンおよびカチオン脂質の組み合わせは好ましくない。したがって、本発明の一部のここでの好ましい実施形態では、脂質成分の該混合物は、（ｉ）安定なカチオン脂質および帯電可能なアニオン脂質、（ｉｉ）帯電可能なカチオン脂質および帯電可能なアニオン脂質または（ｉｉｉ）安定なアニオン脂質および帯電可能なカチオン脂質を含みうる。
【００３１】
好ましいカチオン成分は、ＤＰＩＭ、ＣＨＩＭ、ＤＯＲＩＥ、ＤＤＡＢ、ＤＡＣ−Ｃｈｏｌ、ＴＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＧＳ、（Ｃ１８）２Ｇｌｙ＋Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルアミド−グリシン、ＣＴＡＢ、ＣＰｙＣ、ＤＯＤＡＰおよびＤＯＥＰＣを含む。
【００３２】
さらに好ましいカチオン脂質は、ＤＭＴＡＰ、ＤＰＴＡＰ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＭｏＣｈｏｌおよびＨｉｓＣｈｏｌである。
【００３３】
本発明での使用にとって好ましいアニオン脂質は、ＤＯＧＳｕｃｃ、ＰＯＧＳｕｃｃ、ＤＭＧＳｕｃｃ、ＤＰＧＳｕｃｃ、ＤＭＰＳ、ＤＰＰＳ、ＤＯＰＳ、ＰＯＰＳ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＯＰＧ、ＰＯＰＧ、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＯＰＡ、ＰＯＰＡ、ＣＨＥＭＳおよびＣｅｔｙｌ−Ｐを含む。
【００３４】
特に好ましいアニオン脂質は、ＤＯＧＳｕｃｃ、ＤＭＧＳｕｃｃ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＯＰＧ、ＰＯＰＧ、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＯＰＡ、ＰＯＰＡ、ＣＨＥＭＳおよびＣｅｔｙｌ−Ｐである。
【００３５】
好ましくは、脂質のかかる両性混合物は、脂質相の約７０モル％以下を構成する。いくつかの実施形態では、該混合物は脂質相の５０モル％以下、好ましくは該脂質相はかかる混合物の約２０〜約４０モル％を構成しうる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、該脂質相は、中性脂質、好ましくはホスファチジルコリンなどの中性リン脂質をさらに含有しうる。ここでの好ましいホスファチジルコリンは、ＰＯＰＣ、天然もしくは水素化大豆ＰＣ、天然もしくは水素化卵ＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣおよびＤＯＰＣを含む。
【００３７】
より好ましくは、該ホスファチジルコリンは、ＰＯＰＣ、非水素化大豆ＰＣまたは非水素化卵ＰＣを含む。
【００３８】
脂質相は、少なくとも１５モル％、好ましくは少なくとも２０モル％の該ホスファチジルコリンを含有しうる。いくつかの実施形態では、該脂質相は約２５モル％以上のホスファチジルコリンを含有しうる。あるいは、該脂質相は約４０モル％以上のホスファチジルコリンを含有しうる。
【００３９】
本発明に記載のここで好ましい組成物は、６０モル％のＰＯＰＣ、約１０モル％のＤＯＴＡＰおよび約３０モル％のＣＨＥＭＳである調合物を有するリポソームを含む。
【００４０】
該中性脂質は、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミンの混合物を含みうる。該中性のホスファチジルコリンもしくはホスファチジルエタノールアミンまたはこれら２つの混合物は、脂質相の他の成分によって構成されずに少なくとも２０モル％のモル量（モル％）で脂質相中に存在しうる（脂質相における全体が１００モル％である）。
【００４１】
好ましいホスファチジルエタノールアミンはＤＯＰＥ、ＤＭＰＥおよびＤＰＰＥを含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、該中性脂質はＰＯＰＣおよびＤＯＰＥを含みうる。
【００４３】
有利にも、該脂質相は、両性の特性を有するアニオンおよびカチオン脂質の混合物、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含有しうる。かかる脂質相から形成された両性リポソームが血清安定性を示すことから全身送達に適しうることが認められている。好ましくは該脂質相がカチオン脂質としてＭｏＣｈｏｌおよびアニオン脂質としてＣＨＥＭＳまたはＤＭＧ−Ｓｕｃｃを含有する。
【００４４】
さらに、ここで好ましい両性リポソームは、本発明の組成物における賦形剤として使用される場合に
（ａ）約１５モル％のＰＯＰＣ、約４５モル％のＤＯＰＥ、約２０モル％のＭｏＣｈｏｌおよび約２０モル％のＣＨＥＭＳ；
（ｂ）約１０モル％のＰＯＰＣ、約３０モル％のＤＯＰＥ、約３０モル％のＭｏＣｈｏｌおよび約３０モル％のＣＨＥＭＳ；
（ｃ）約１０モル％のＰＯＰＣ、約３０モル％のＤＯＰＥ、約２０モル％のＭｏＣｈｏｌおよび約４０モル％のＣＨＥＭＳ；
（ｄ）約６モル％のＰＯＰＣ、約２４モル％のＤＯＰＥ、約４７モル％のＭｏＣｈｏｌおよび約２３モル％のＣＨＥＭＳ
といった調合物を含有する。
【００４５】
いくつかの実施形態では、該リポソームは、中性のホスファチジルコリンおよびコレステロールをさらに含有しうる。かかるリポソームは血清安定性も示しうる。
【００４６】
あるいは、全身送達に適する血清安定性を示すリポソームは、両性脂質または両性の特性を有する脂質成分すなわちコレステロールとホスファチジルコリンなどの中性脂質の混合物を含有しうる。いくつかの実施形態では、該脂質相は、３０モル％〜５０モル％、好ましくは約３５モル％〜約４５モル％のコレステロールを含有しうる。あるいは、該脂質相は、ホスファチジルコリンと、１０モル％〜２５モル％、好ましくは約１５モル％〜約２５モル％のコレステロールを含有しうる。
【００４７】
ここで好ましい調合物は、ＨｉｓｔＣｈｏｌ、ＨｉｓｔＤＧまたはアシルカルノシンを例とする１０〜２５モル％の両性脂質、１５〜２５モル％のコレステロール、および残りとしてＰＯＰＣ、大豆ＰＣ、卵ＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣまたはＤＯＰＣ、好ましくはＰＯＰＣを含有し、例えば約６０モル％のＰＯＰＣ、約２０モル％のＨｉｓｔＣｈｏｌおよび約２０モル％のＣｈｏｌを含有する。
【００４８】
本発明に記載の別のここで好ましい組成物は、両性の特性を有する脂質成分の混合物を含有しかつ約３０モル％のＰＯＰＣ、約１０モル％のＤＯＴＡＰ、約２０モル％のＣＨＥＭＳおよび約４０モル％のＣｈｏｌといった調合物を含有するリポソームを含む。
【００４９】
本発明の医薬組成物がＣＤ４０をコードする核酸を標的にするオリゴヌクレオチドを含むことにより、哺乳類細胞内でのかかるＣＤ４０の発現が弱まる。本明細書では「ＣＤ４０をコードする核酸」とは、ＣＤ４０をコードするＤＮＡおよびかかるＤＮＡ由来のプレ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡといったＲＮＡを意味する。標的核酸と、活性物質としてかかる配列に特異的な１種もしくは複数種のオリゴヌクレオチドとの間の特異的なハイブリダイゼーションを行う結果、ＣＤ４０の発現が阻害されうる。かかる特異的なターゲティングを行うため、該オリゴヌクレオチドは、好ましくは標的核酸の配列に相補的なヌクレオチドの連続ストレッチを含む必要がある。オリゴヌクレオチドは、１０程度、好ましくは１５、およびさらにより好ましくは１８ヌクレオチドから５０、好ましくは３０、およびより好ましくは２５ヌクレオチドの間で長さを変更しうる。オリゴヌクレオチドと標的配列の間の適合性は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの各塩基が上記オリゴヌクレオチド数の連続ストレッチを上回る標的核酸上のその相補的塩基と塩基対を形成することによって完全である。いくつかの実施形態では、あまり好ましくないが、配列対は、塩基対の該連続ストレッチ内に１個もしくは数個のミスマッチを含みうる。
【００５０】
上記基準を満たすオリゴヌクレオチドは、ある範囲の異なる化学物質および／またはトポロジーを有しうる。オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖でありうる。一本鎖オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして周知であるＤＮＡに基づくオリゴヌクレオチド、固定化核酸および２’−修飾オリゴヌクレオチドを含むがこれらに限定されない。骨格または塩基修飾は、ホスホチオエートＤＮＡ（ＰＴＯ）、２’Ｏ−メチルＲＮＡ（２’Ｏｍｅ）、２’Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（２’ＭＯＥ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホアミデート（ＮＰ）、２’フルオロアラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、固定化核酸（ＬＮＡ）、モルホリンホスホアミデート（モルホリノ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）およびトリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）を含むがこれらに限定されない。さらに、混合化学物質は当該技術では既知であり、例えば共重合体、ブロック共重合体およびギャップマーなど、単一のヌクレオチドよりも多くの種から構成される。
【００５１】
上記オリゴヌクレオチドに加え、ＣＤ４０の発現は、相補配列モチーフを含む二本鎖ＲＮＡ分子を用いても阻害されうる。かかるＲＮＡ分子は、当該技術ではｓｉＲＮＡ分子として知られている。この場合にも様々な化学物質がこのクラスのオリゴヌクレオチドに適合される。さらにＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド系が当該技術では既知である。
【００５２】
より詳細には、本明細書では、かかるオリゴヌクレオチドに有用な配列および化学物質について述べた米国特許第６，１９７，５８４号明細書および米国特許出願公開第２００４／０１８６０７１号明細書（いずれもベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ））が参照される。ＣＤ４０の阻害のためのｓｉＲＮＡ配列モチーフについて述べたプルビネ（Ｐｌｕｖｉｎｅｔ）ら、Ｂｌｏｏｄ、２００４年もまた参照される。さらに、ｓｉＲＮＡモチーフは公開されており、例えばサンタクルース・バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（サンタクルース（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、米国）から入手してもよい。
【００５３】
本発明の医薬組成物は、適切な医薬的に許容できる担体中のコロイドとして使用する場合に調合されうる。この目的のための水、生理食塩水、リン酸塩緩衝生理食塩水などの担体は当業者に周知である。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は約７〜約８の生理的ｐＨで投与されうる。このため、活性物質、賦形剤および担体を含有する組成物を調合することでこの範囲のｐＨが得られる。
【００５５】
当業者に既知の適切な方法を用い、本発明の組成物を製造することが可能である。かかる方法には、所定の孔径の膜を介した押し出し、エタノール中の脂質溶媒のカーゴを含有する水相への注入によるカプセル化、または高圧均一化が含まれるがこれらに限定されない。
【００５６】
オリゴヌクレオチドの溶液を中性ｐＨで該賦形剤と接触させることにより、溶液のうちの特定の百分率を占める大量の封入体が生成されうる。活性物質の実質上のカプセル化を行うためには、約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭの範囲の高濃度の賦形剤が好ましい。
【００５７】
本発明に記載の賦形剤として使用される両性リポソームは、それらの等電点またはその近傍でオリゴヌクレオチドと結合することによって該活性物質をリポソーム表面に集結させるという確かな利点をもたらす。このプロセスは、国際公開第０２／０６６０１２号パンフレット中により詳細に記載されている。
【００５８】
本発明の組成物を作製するために用いられる実際の作製プロセスとは無関係に、いくつかの実施形態では、リポソームが密度の高い容器として形成される初期作製ステップの後に、非カプセル化オリゴヌクレオチドがリポソームから除去されうる。この場合も、技術文献および本明細書中に含められる参考文献ではかかる方法について詳細に記載され、かつ適切なプロセスステップには、サイズ排除クロマトグラフィー、沈降、透析、限界濾過およびダイアフィルトレーションが含まれうるがこれらに限定されない。
【００５９】
しかし、任意の非カプセル化オリゴヌクレオチドの除去は本発明の実施において必要ではなく、いくつかの実施形態では、組成物は遊離および捕捉薬剤を含みうる。
【００６０】
本発明の異なる実施形態では、医薬組成物の調製において有利に用いられうるプロセスステップの特定の組み合わせについて以下に示す。
【００６１】
（Ａ）
Ｉ．約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約１〜約２０ｍｇ／ｍＬの該活性物質濃度、および約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭの賦形剤濃度を用いた、中性ｐＨでの活性物質のカプセル化
ＩＩ．該担体は水、生理食塩水または緩衝化生理食塩水でありうる
ＩＩＩ．実際のリポソーム形成およびサイジングステップ
ＩＶ．捕捉されなかった活性物質が除去されない
Ｖ．選択的な凍結乾燥および水を用いた再構成
ＶＩ．保存形態：懸濁液または凍結乾燥された粉末
ＶＩＩ．中性ｐＨでの投与
【００６２】
（Ｂ）
Ｉ．約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約１〜約２０ｍｇ／ｍＬの活性物質濃度、および約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭの賦形剤濃度を用いた、中性ｐＨでの活性物質のカプセル化
ＩＩ．担体は水、生理食塩水または緩衝化生理食塩水でありうる
ＩＩＩ．実際のリポソーム形成およびサイジングステップ
ＩＶ．捕捉されなかった薬剤が除去される
Ｖ．保存形態：懸濁液
ＶＩ．中性ｐＨでの投与
【００６３】
したがって、本発明は、活性物質としてのＣＤ４０に特異的なオリゴヌクレオチドおよび賦形剤としての両性リポソームを含む医薬組成物を包含する。かかる調合物は炎症および自己免疫疾患の治療において治療的活性を示すことが認められており、それ故、本発明は、移植片拒絶、対宿主移植片病、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、喘息、気管支喘息、炎症性腸疾患、乾癬、甲状腺炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、ＣＯＰＤおよびアトピー性皮膚炎を含む炎症、免疫または自己免疫疾患の予防あるいは治療における本発明の組成物の使用をさらに包含する。
【００６４】
上記のように、いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、血清において実質的に安定であり、それ故、かかる実施形態では、組成物は動物、特にヒトにおいて全身的に送達されうる。
【００６５】
局所治療、例えば炎症性粘膜の治療においても、本発明の医薬組成物を使用することが可能である。特に、炎症性腸疾患もしくは移植片拒絶の治療または予防において本発明の組成物を使用しうる。本発明の組成物は、皮膚または肺への局所適用においても適合しうる。
【００６６】
医薬組成物の投与は、当業者の技能の範囲内にある。投与は、治療されるべき疾患の重症度および／または応答性、数日から数か月にかけて持続する治療の治療単位、あるいは治療が有効となっているかまたは疾患の徴候の減少が得られているまでの時間に依存しうる。至適な投与計画は、患者体内の薬剤蓄積の測定値から算出されうる。当業者であれば、至適用量、投与方法および反復率を容易に判定できる。至適用量は本発明の組成物における個々のオリゴヌクレオチドの相対効力に依存して変更され、かつ一般に、動物モデルにおいて有効であることが認められたＥＣ５０値に基づいて評価される場合がある。一般に、単位用量はｋｇ体重の約０．０１μｇ〜約２０ｍｇのオリゴヌクレオチドであり、かつ毎日、週１回、月１回または年１回与えられるかあるいはより不規則に与えられる場合さえある。当業者であれば、体液中または組織内での薬剤の測定された滞留時間および濃度に基づく投与における反復率を容易に評価することができる。治療が成功した後、患者に維持療法を受けさせることで疾患状態の再発を予防することが望ましい場合があり、ここでは調合物が体重のｋｇ当たりのオリゴヌクレオチドで約０．０１μｇ〜約２０ｍｇの範囲の維持用量で１日に１回もしくは複数回から１年に１回まで投与されうる。
【００６７】
以下は、添付図面をあくまでも参考として、本発明の実施形態について説明するものである。
【実施例】
【００６８】
実施例１：ＣＤ４０−ＯＤＮを含有するリポソームの調製
８５μモルのＰＯＰＣ、４２μモルのＣＨＥＭＳおよび１４μモルのＤＯＴＡＰの混合物をクロロホルムに溶解し、丸底フラスコ内で蒸発させ真空下で乾燥させた。アスタリスクがヌクレオチド間のホスホロチオエート連結を示す場合の配列Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊ＴＡＧＡＴＧＧＡＣＣＧＣＴ＊Ｇ＊Ｔを有するＯＤＮを用いた（ガオ（Ｇａｏ）、博士論文、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ ２００３年、ｒＡＳ３を参照）。
【００６９】
脂質膜を緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ４．５）１ｍＬ中の１ｍｇのＯＤＮで水和した。懸濁液を水槽内、室温で２５分間水和させ、５分間超音波処理し、最終的に−７０℃で冷凍した。解凍後、リポソーム懸濁液を孔径４００ｎｍのポリカーボネート膜を介して１５回押し出した。リポソーム懸濁液を１Ｍヘペス緩衝液を使用してｐＨ７．５にし、ストック溶液を使用して０．８Ｍスクロースにした。非カプセル化ＯＤＮを１０ｍＭヘペス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５で重層させた０．５Ｍスクロースを介した浮遊により押し出した試料から除去し、リポソーム懸濁液を４℃で保存した。得られたリポソームを動的光散乱によって特徴づけると、大きさが２２０〜２５０ｎｍであることがわかった。
【００７０】
実施例２：結腸炎の誘発
２０ｍｇのＴＮＢＳを１５０ｍＭのＮａＣｌ中３５％エタノール１３５μｌに添加することによって調製した２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）の単一の結腸内部への適用を用いることにより、結腸炎を誘発した。光エーテル麻酔下で雄ウィスターラット（２００〜２５０ｇ）を置いて、肛門管を通して下行結腸に挿入された８ｃｍ長のカテーテルを使用して混合物を投与した。カテーテルを取り出した後、ラットを頭を下にした姿勢に３０秒間保って腸からの流出を回避し、以後はラットを通常の状態で保持した。
【００７１】
実施例３：治療および分析
結腸炎誘発の４時間前または３日後に、ラットを実施例１から得たＣＤ４０アンチセンスで治療した。実施例１から得たアンチセンス懸濁液を１Ｍ緩衝酢酸／酢酸ナトリウム ｐＨ４．０を使用してｐＨ４．５にし、２．７μｇのＣＤ４０アンチセンスを含有する全体で１００μｌの懸濁液を実施例２に記載の結腸に適用した。
【００７２】
結腸炎の誘発の７日後、動物を殺した。結腸を摘出し、縦方向に開いた。４％のホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中に結腸試料を固定した。パラフィン包埋切片（５μｍ）をヘマトキシリン／エオシンで染色してから顕微鏡検査した。
【００７３】
結腸障害を以下の基準によってスコアリングした。
【００７４】
【表１】
【００７５】
図１および図２に示す結果は、スクランブルした対照アンチセンスではなくＣＤ４０に特異的なアンチセンスで治療した場合に実験結腸炎が顕著に減少することを示している。かなり意外なことに、３日目で完全に発症した結腸炎に対してたとえ単回治療であっても、炎症が著しくほぼ完全に減少するに至った。それに対する確認として、疾患の開始前に調合物を予防的様式で適用した場合、結腸炎の予防も実現した。
【００７６】
実施例４：別の調合物
６０モル％のＰＯＰＣ、２０モル％のＨｉｓｔＣｈｏｌおよび２０モル％のコレステロールの混合物を賦形剤として使用した場合でも実験結腸炎の治療が奏功するに至った。
【００７７】
実施例５：ノンリムーバル（ｎｏｎ−ｒｅｍｏｖａｌ）の外部アンチセンス
ノンリムーバルの非カプセル化アンチセンスを調合物として使用した場合でも安定なコロイド状の担体系が生成した。
【００７８】
実施例６：小腸移植治療
免疫抑制剤治療を施さずに、同種のブラウンノルウェー（Ｂｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙ）（ＲＴ１ｎ）からルイス（ＲＴ１１）株を組み合わせた雄ラットにおいて異所性の小腸移植を行った。
【００７９】
小腸の外植およびリンガー溶液での移植片管の洗浄を行った後、１群の動物（ｎ＝３）は、実施例１に記載の賦形剤において調合されたＣＤ４０アンチセンスＯＤＮ（群Ａ）またはそれに対応するスクランブルした対照ＯＤＮ（群Ｂ）で前治療したドナーの小腸移植を受けた。実施例１から得たアンチセンス懸濁液を、１Ｍ緩衝酢酸／酢酸ナトリウム ｐＨ４．０を用いてｐＨ４．５にした。
【００８０】
ドナー血管を、ＣＤ４０アンチセンスまたはスクランブルした対照ＯＤＮを含有するリンガー溶液２ｍｌ（全容量１００μｌ中２．７μｇのＤＮＡ）で前治療した。腸内腔をＵＷ（ウィスコンシン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ））溶液ですすいだ。虚血の２時間後、ＤＮＡ溶液を流し出し、移植片を移植し、組織学的に分析した。
【００８１】
分析
粘膜灌流全体を特徴づけるため、式
ＰＩ（％）＝Ｖｐ＋０．５×Ｖｉｐ）／Ｖｔ
（式中、Ｖｐは灌流された絨毛の数、Ｖｉｐはすべての不規則に灌流された絨毛の数およびＶｔは観察された絨毛の総数を示す）
を用いることにより灌流指数（ＰＩ）を算出した。
【００８２】
粘膜灌流障害全体を特徴づけるため、鬱血指数（ＳＩ）を
ＳＩ（％）＝Ｖｎｐ／Ｖｔ
（式中、Ｖｎｐは灌流されなかった絨毛の数およびＶｔは観察された全絨毛の総数を示す）
にしたがって算出した。
【００８３】
粘膜および筋肉層における微小循環パラメータのさらなる分析として、機能的毛細血管密度（ＦＣＤ、倍率４７６倍での絨毛面積当たりの潅流される毛細血管の長さ（１／ｃｍ））および赤血球速度（倍率９３３倍でのｍｍ／秒単位のＲＢＣＶ）の評価を含めた。ＣＡＰＩＭＡＧＥソフトウェア（ザイントル（Ｚｅｉｎｔｌ）、ハイデルベルク（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、ドイツ）を使用して機能性毛細血管密度および赤血球速度の分析を行い、ラインシフト（ｌｉｎｅ−ｔｏ−ｓｈｉｆｔ）分析によって赤血球速度を判定した。さらに、蛍光マーカーローダミン６Ｇを使用して各管セグメント（１００μｍ）における癒着性の白血球を同定し、観察期間３０秒以内に動かないかまたは内皮から離れなかった細胞として計数した。それらの数を血管の直径および長さから算出して円筒の形状を推定し、ｍｍ２当たりの細胞数として表した。
【００８４】
結果
移植片粘膜内部の絨毛でのマイクロキャピラリー灌流
ＣＤ４０アンチセンスＯＤＮで治療した移植物では、治療していない対照またはスクランブルした対照ＯＤＮの場合とそれぞれ比較した場合、移植片粘膜における絨毛灌流全体が顕著に改善した。観察フィールド当たりの観察された絨毛に対する灌流された絨毛の百分率を表す灌流指数によってこれを示した（図３）。逆に、観察フィールド当たりの絨毛の総数に対する灌流されなかった絨毛の百分率の指標である鬱血指数は、ＣＤ４０アンチセンスＯＤＮで治療した移植片では、治療していない対照およびスクランブルした対照ＯＤＮの場合とそれぞれ比較した場合、顕著に低下した（図３）。
【００８５】
絨毛面積当たりの１本の絨毛内部の機能的毛細血管密度の測定による、１本の絨毛の灌流に関するより詳細な分析によると、ＣＤ４０アンチセンスＯＤＮで治療した動物では、治療していない対照およびスクランブルした対照ＯＤＮの場合とそれぞれ比較した場合、灌流された毛細血管の密度が顕著に高まることが再び示された（図４）。これは、より良好に保護された絨毛灌流や、それによるより優れた粘膜機能を有するＣＤ４０アンチセンスＯＤＮで治療された動物について明らかにしている。
【００８６】
したがって、絨毛の毛細血管内での赤血球速度の測定によると、ＣＤ４０アンチセンスＯＤＮで治療された移植物では、治療していない対照およびスクランブルした対照ＯＤＮの場合とそれぞれ比較した場合、顕著な速度増加が示された（図５）。
【００８７】
白血球−内皮細胞の相互作用
それに対し、粘膜下後毛細血管細静脈内での白血球−内皮細胞の相互作用の評価によると、白血球の内皮表面への付着数において異なる治療群と対照群の間に大した差異が示されなかった（図６）。
【００８８】
実施例７：ＣＤ４０−ＯＤＮを含有するリポソームの調製
３０モル％のＰＯＰＣ、１０モル％のＤＯＴＡＰ、２０モル％のＣｈｅｍｓおよび４０モル％のＣｈｏｌの混合物をクロロホルムに溶解し、丸底フラスコ内で蒸発させ真空下で乾燥させた。
【００８９】
配列ＴＣＣＴＡＧＡＴＧＧＡＣＣＧＣＴＧＴを有するＯＤＮを、完全なホスホロチオエートヌクレオチド物質を保有するバイオグノスティックＧｍｂＨ（Ｂｉｏｇｎｏｓｔｉｋ ＧｍｂＨ）、ドイツから購入した（ガオ（Ｇａｏ）、博士論文、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ ２００３年、ｒＡＳ３を参照）。
【００９０】
脂質膜を、最終脂質濃度が懸濁液中で１００ｍＭである程度の量のＯＤＮ溶液（１０ｍＭヘペス中、２０ｍｇ／ｍｌ ＣＤ４０ ＯＤＮ（１８ｍｅｒ、完全ホスホチオエート化）、１２５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５）で水和した。懸濁液を水槽内、５０℃で４５分間水和させ、１５分間超音波処理した。次いで懸濁液を−７０℃で３０分間、３回冷凍し、５０℃で１５分間解凍した。
【００９１】
リポソーム懸濁液を孔径４００ｎｍを有するポリカーボネート膜を介して１９回押し出した。非カプセル化ＯＤＮを、３５０００ｒｐｍ、１５℃で１５時間にわたる沈降により、水で希釈した後の押し出した試料から取り出した。
カプセル化ＣＤ４０ ＯＤＮを有する他の調合物を同一条件を用いて調製した。
【００９２】
【表２】
【００９３】
２６０ｎｍによる光学密度（ＯＤ）を調べることによってカプセル化ＯＤＮの量を測定した。異なるＳｍａｒｔｉｃｌｅ調合物において以下のＯＤＮ量をカプセル化した。
【００９４】
【表３】
【００９５】
実施例８：関節炎における治療有効性
関節炎の誘発の２１日前および１４日前に完全フロインドアジュバント中のメチル化ウシ血清アルブミン（ｍＢＳＡ）の皮下注射によって雌ルイスラットを免疫した。０日目、生理緩衝液中の抗原（ｍＢＳＡ）を右膝関節に関節内注射することによって関節炎を誘発する一方、左膝関節を注射されない正常な対照関節として用いた。
【００９６】
治療試験のため、関節炎の誘発の６、４８および９６時間後に、確立されたＡＩＡを用い、遊離（非カプセル化）ＣＤ４０−ＯＤＮまたはリポソームＣＤ４０−ＯＤＮ（上記実施例７の調合物１：ＰＯＰＣ／ＤＯＴＡＰ／Ｃｈｅｍｓ／Ｃｈｏｌが３０：１０：２０：４０）をラットの尾静脈に静脈内注射した。各用量は、１ｋｇ体重当たり３ｍｇのＣＤ４０−ＯＤＮ（カプセル化ＣＤ４０−ＯＤＮ）または１ｋｇ体重当たり３および１５ｍｇのＣＤ４０−ＯＤＮ（それぞれ遊離ＣＤ４０−ＯＤＮ９および遊離ＣＤ４０−ＯＤＮ４５）を含有した。
【００９７】
実験の間、関節の腫脹および動物の体重を観察した。カプセル化ＣＤ４０−ＯＤＮ（リポソーム−ＯＤＮ、図７）による治療後の２１日間にわたり、膝関節の腫脹が顕著に低下した（ｐ＜０．０５）。それに対し、高用量の遊離ＣＤ４０−ＯＤＮ（ＣＤ４０−ＯＤＮ４５、図７）による治療の結果、生理食塩水の対照と比較し、関節炎の急性期および慢性期において膝関節の炎症が悪化した。全動物群の体重では、生理食塩水の対照と比べて何の相違点も示されていない（図８）。
【００９８】
実施例９：耐容性
実施例２に記載のように動物を治療し、炎症の発症の２１日後に殺した。顕微鏡検査では、調合物に対する不耐性の徴候を全く呈することなく、対照群と区別できないことが判明した。さらに、肝臓、脾臓、胸腺および腎臓における個々の器官重量を測定した。リポソームＣＤ４０−ＯＤＮによって治療した群の場合、肝臓重量における若干の低下が観察され、他のすべての器官重量では影響を認めなかった（図９および図１０）。
【００９９】
実施例１０：材料
この実施例は、ＣＤ４０の発現を調節しかつ本発明に記載の組成物における使用に適するオリゴヌクレオチドによって標的にされうるＣＤ４０ヌクレオチド配列の限定されない例を提供する。
【０１００】
ヒトＣＤ４０ ｍＲＮＡ（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号Ｘ６０５９２）
本発明における標的対象のヒトＣＤ４０ ｍＲＮＡ配列を配列番号１に示す。関連配列情報が、ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）ら、米国特許出願公開第２００４／０１８６０７１号明細書（すなわち配列番号８５）、ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）ら、米国特許第６，１９７，５８４号明細書（すなわち配列番号８５）およびプルビネ（Ｐｌｕｖｉｎｅｔ）ら、Ｂｌｏｏｄ、２００４年、１０４（１２）、３６４２−３６４６頁の中に認められ、それらの内容は参照により本明細書中に援用される。
（配列番号１）：
【０１０１】
ハツカネズミＣＤ４０ ｍＲＮＡ
本発明における標的対象のマウスＣＤ４０ ｍＲＮＡ配列を配列番号２に示す。関連配列情報が、ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）ら、米国特許出願公開第２００４／０１８６０７１号明細書（すなわち配列番号１３２）中に認められ、その内容は参照により本明細書中に援用される。
（配列番号２）：
【０１０２】
ラットＣＤ４０ ｍＲＮＡ（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号ＡＦ２４１２３１）
本発明における標的対象のラットＣＤ４０ ｍＲＮＡ配列を配列番号３に示す（ガオ（Ｇａｏ）、博士論文、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ ２００３年を参照）。
（配列番号３）：
【０１０３】
ブタＣＤ４０ ｃＤＮＡ
本発明における標的対象のブタＣＤ４０ ｃＤＮＡ配列を配列番号４に示す（図１１）。関連配列情報が、ラッシュワース（Ｒｕｓｈｗｏｒｔｈ）ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００２年、７３（４）、６３５−６４２頁の中に認められ、その内容は参照により本明細書中に援用される。
【０１０４】
さらに以下に、本発明における使用に適する、アンチセンスＣＤ４０核酸配列を例とする抗−ＣＤ４０オリゴヌクレオチドの限定されない例を提供する。
【０１０５】
ヒトＣＤ４０に対するオリゴヌクレオチド
ヒトアンチセンスＣＤ４０オリゴヌクレオチドの例を下記に示す。さらに、配列情報が、ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）ら、米国特許出願公開第２００４／０１８６０７１号明細書中および米国特許第６，１９７，５８４号明細書中に認められ、それらの内容は参照により本明細書中に提供される。ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）らによって示された配列番号を右側に示す。
【０１０６】
以下のｓｉＲＮＡ配列は本発明における使用に適し（例えば、プルビネ（Ｐｌｕｖｉｎｅｔ）ら、Ｂｌｏｏｄ、２００４年、１０４（１２）、３６４２−３６４６頁を参照）、その内容は参照により本明細書中に援用される。
【０１０７】
すべてのｓｉＲＮＡは、３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを含む。
【０１０８】
マウスＣＤ４０に対するオリゴヌクレオチド
マウスアンチセンスＣＤ４０オリゴヌクレオチドの例を下記に示す。さらに、配列情報が、ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）ら、米国特許出願公開第２００４／０１８６０７１号明細書中に認められ、これによってその内容は参照により本明細書中に援用される。ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）らによって示された配列番号を右側に示す。
マウス
【０１０９】
ラットＣＤ４０に対するオリゴヌクレオチド
ラットアンチセンスＣＤ４０オリゴヌクレオチドの例を下記に示す（ガオ（Ｇａｏ）、博士論文、２００３年、ゲッチンゲン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）、ドイツを参照）。
【０１１０】
ブタＣＤ４０に対するオリゴヌクレオチド
ブタアンチセンスＣＤ４０オリゴヌクレオチドの例を下記に示す。ラッシュワース（Ｒｕｓｈｗｏｒｔｈ）ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００２年、７３（４）、６３５−６４２頁を参照のこと。その内容は参照により本明細書中に援用される。
【０１１１】
脂質における共通の略称の用語集
ＤＭＰＣ ジミリストイルホスファチジルコリン
ＤＰＰＣ ジパルミトイルホスファチジルコリン
ＤＳＰＣ ジステアロイルホスファチジルコリン
ＰＯＰＣ パルミトイル−オレオイルホスファチジルコリン
ＤＯＰＣ ジオレオイルホスファチジルコリン
ＤＯＰＥ ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
ＤＭＰＥ ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン
ＤＰＰＥ ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン
ＤＯＰＧ ジオレオイルホスファチジルグリセロール
ＰＯＰＧ パルミトイル−オレオイルホスファチジルグリセロール
ＤＭＰＧ ジミリストイルホスファチジルグリセロール
ＤＰＰＧ ジパルミトイルホスファチジルグリセロール
ＤＭＰＳ ジミリストイルホスファチジルセリン
ＤＰＰＳ ジパルミトイルホスファチジルセリン
ＤＯＰＳ ジオレオイルホスファチジルセリン
ＰＯＰＳ パルミトイル−オレオイルホスファチジルセリン
ＤＭＰＡ ジミリストイルホスファチジン酸
ＤＰＰＡ ジパルミトイルホスファチジン酸
ＤＯＰＡ ジオレオイルホスファチジン酸
ＰＯＰＡ パルミトイル−オレオイルホスファチジン酸
ＣＨＥＭＳ コレステロールヘミサクシネート
ＤＣ−Ｃｈｏｌ ３−β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルエタン）カルバモイル］コレステロール
Ｃｅｔｙｌ−Ｐ セチルリン酸
ＤＯＤＡＰ （ｌ，２）−ジオレオイルオキシプロピル）−Ｎ，Ｎ−塩化ジメチルアンモニウム
ＤＯＥＰＣ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン
ＤＡＣ−Ｃｈｏｌ ３−β−［Ｎ−（Ｎ，Ｎ’−ジメチルエタン）カルバモイル］コレステロール
ＴＣ−Ｃｈｏｌ ３−β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−トリメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール
ＤＯＴＭＡ （ｌ，２−ジオレイルオキシプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標））
ＤＯＧＳ （（Ｃ１８）２ＧｌｙＳｐｅｒ３＋）Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルアミド−グリシル−スペルミン（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標））
ＣＴＡＢ セチル−トリメチルアンモニウムブロマイド
ＣＰｙＣ セチル−ピリジニウムクロライド
ＤＯＴＡＰ （ｌ，２−ジオレオイルオキシプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩
ＤＭＴＡＰ （１，２−ジミリストイルオキシプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩
ＤＰＴＡＰ （１，２−ジパルミトイルオキシプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩
ＤＯＴＭＡ （ｌ，２−ジオレイルオキシプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド）
ＤＯＲＩＥ （ｌ，２−ジオレイルオキシプロピル）−３ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド）
ＤＤＡＢ ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド
ＤＰＩＭ ４−（２，３−ビス−パルミトイルオキシ−プロピル）−ｌ−メチル−ｌＨ−イミダゾール
ＣＨＩＭ ヒスタミニル−コレステロールカルバメート
ＭｏＣｈｏｌ ４−（２−アミノエチル）−モルホリノ−コレステロールヘミサクシネート
ＨｉｓＣｈｏｌ ヒスタミニル−コレステロールヘミサクシネート
ＨＣＣｈｏｌ Ｎα−ヒスチジニル−コレステロールカルバメート
ＨｉｓｔＣｈｏｌ Ｎα−ヒスチジニル−コレステロール−ヘミサクシネート
ＡＣ アシルカルノシン、ステアリル−＆パルミトイルカルノシン
ＨｉｓｔＤＧ １，２−ジパルミトイルグリセロール−ヘミサクシネート−Ｎα−ヒスチジニル−ヘミサクシネート、＆ジステアロイル−ジミリストイル、ジオレオイルまたはパルミトイル−オレオイル誘導体
ＩｓｏＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ １，２−ジパルミトイルグリセロール−Ｏａ−ヒスチジニル−Ｎα−ヘミサクシネート、＆ジステアロイル−、ジミリストイル、ジオレオイルまたはパルミトイル−オレオイル誘導体
ＤＧＳｕｃｃ １，２−ジパルミトイルグリセロール−３−ヘミサクシネート＆ジステアロイル−、ジミリストイル−ジオレオイルまたはパルミトイル−オレオイル誘導体
【化１】
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】結腸障害の顕微鏡スコアリング（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｓｃｏｒｉｎｇ） 対照 対照動物、ＰＢＳで処理 ＣＤ４０／０ 誘発の０日目、４時間前に治療 ＣＤ４０／０＿３ 誘発の０日目、４時間前に治療および３日目に治療 ＳＣＲ／０ スクランブルした対照で誘発の４時間前に治療 ＣＤ４０／３ ３日目のみ治療 ＳＣＲ／３ ３日目にスクランブルした対照で治療
【図２Ａ】治療後の結腸切片（正常、非罹患腸壁）
【図２Ｂ】治療後の結腸切片（炎症性を示すが治療されていない腸壁）
【図２Ｃ】治療後の結腸切片（スクランブルした対照を用いた結腸炎誘発前の治療）
【図２Ｄ】治療後の結腸切片（特異的なＣＤ４０アンチセンスを用いた結腸炎誘発前の治療）
【図３】同種対照（対照）、移植の７日後でのＣＤ４０アンチセンスＯＤＮ（ＡＳ）またはスクランブルした対照ＯＤＮ（ＳＣＲ）で治療された移植片（ｎ＝３）における灌流指数（塗りつぶしたカラム）および鬱血指数（白カラム）。＊ｐ＜０．０５対対照、＃ｐ＜０．０５ＡＳ対ＳＣＲ。
【図４】同種対照（対照）、移植の７日後でのＣＤ４０アンチセンスＯＤＮ（ＡＳ）またはスクランブルした対照ＯＤＮ（ＳＣＲ）で治療された移植片（ｎ＝３）における粘膜内での機能的毛細血管密度（ＦＣＤ）。＊ｐ＜０．０５対対照、＃ｐ＜０．０５ＡＳ対ＳＣＲ。
【図５】同種対照（対照）、移植の７日後でのＣＤ４０アンチセンスＯＤＮ（ＡＳ）またはスクランブルした対照ＯＤＮ（ＳＣＲ）で治療された移植片（ｎ＝３）における小腸移植物の粘膜下管内での赤血球速度（ＲＢＣＶ）。＊ｐ＜０．０５対対照、＃ｐ＜０．０５ＡＳ対ＳＣＲ。
【図６】同種対照（対照）、移植の７日後でのＣＤ４０アンチセンスＯＤＮ（ＡＳ）またはスクランブルした対照ＯＤＮ（ＳＣＲ）で治療された移植片（ｎ＝３）における白血球−内皮細胞の相互作用。＊ｐ＜０．０５対対照、＃ｐ＜０．０５ＡＳ対ＳＣＲ。
【図７】遊離またはリポソームＣＤ４０−ＯＤＮによる治療後でのラットの関節腫脹。腫脹は左右の膝関節の間の大きさの差異として表される。記載のように動物が治療され、６、４８および９６時間後に３回の注射がなされた。
【図８】遊離ＣＤ４０−ＯＤＮまたはリポソームＣＤ４０−ＯＤＮの適用の２１日後でのラットの体重［ｇ］。記載のように動物が治療され、６、４８および９６時間後に３回の注射がなされた。
【図９】遊離ＣＤ４０−ＯＤＮまたはリポソームＣＤ４０−ＯＤＮの適用の２１日後でのラットの脾臓および胸腺の器官重量［ｇ］。
【図１０】遊離ＣＤ４０−ＯＤＮまたはリポソームＣＤ４０−ＯＤＮの適用の２１日後でのラットの肝臓重量［ｇ］。
【図１１】本発明に記載のターゲティングを目的としたブタＣＤ４０ ｃＤＮＡ配列（配列番号４）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性物質としてオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物に関し、特にＣＤ４０をコードする核酸を標的にするように適用され、そのことにより哺乳類細胞におけるＣＤ４０の発現を調節するオリゴヌクレオチドを含むかかる組成物について言及している。本発明は、全身送達または局所適用に適合した組成物を含む。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ４０については、非特許文献１によって最初に記載された。タンパク質は、主に樹状細胞およびＢ−細胞に関して示され、Ｔ−細胞上のそのリガンド（ＣＤ４０リガンドまたはＣＤ１５４）と相互作用する。ＣＤ４０とＣＤ１５４の間のシグナル伝達は液性免疫応答の発現にとって重要である。経路の過剰刺激は免疫学的な不均衡や、その結果として、移植片拒絶、対宿主移植片病、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、喘息、炎症性腸疾患、乾癬および甲状腺炎を含む種々の免疫関連障害を招く可能性がある。ＣＤ４０の過剰発現が生じるならば、それは腫瘍成長（非特許文献２）にも関与する可能性がある。ＮＦ−κＢ経路へのＣＤ４０シグナルは、結果として転写因子の活性化および最終的にＩＬ−Ｉ、ＴＮＦαおよびＩＦＮγなどのサイトカインの放出をもたらし、次いで他の細胞を活性化することによって正のフィードバック機構を用いて炎症を促進する。
【０００３】
免疫障害または炎症プロセスを阻害するための有効な戦略として、上記の経路における初期事象の阻害が提案されている。例として、抗体を用いたＴＮＦαの競合的結合、ＴＮＦα−受容体に対する抗体を用いた受容体遮断およびＮＦ−κＢ結合の競合的阻害が挙げられる。ＣＤ４０がその三量体リガンドＣＤ１５４との相互作用を介してシグナル伝達することから、小分子阻害剤によるシグナル伝達事象の阻害は起こりにくく、治療法の開発では遮断抗体の利用に焦点が当てられている。より詳細には、非特許文献３または非特許文献４に記載のように、ＣＤ４０／ＣＤ１５４相互作用は一成分に特異的な抗体を使用して遮断されうる。しかし、開発中のＣＤ４０抗体は副反応を生じることから、このポイントで炎症性フィードバックループを切るための別の手段が求められている。
【０００４】
ＣＤ４０のｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドは、シグナル伝達カスケードを遮断するための別のアプローチを提供する。タンパク質の発現は、例えば、様々な化学物質のアンチセンス、固定化核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸（モルホリノ）および短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などのオリゴヌクレオチドを用いて特異的に下方制御されうる。
【０００５】
これまで、ＣＤ４０ ｍＲＮＡに特異的な多数の配列はインビトロで確認されている。例えば、特許文献１および特許文献２（いずれもベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）ら）では、アンチセンス機構に基づくかかるオリゴヌクレオチドに関する詳細な説明が示される。非特許文献５では、ヒト標的に対してｓｉＲＮＡを用いたＣＤ４０の下方制御について最初に記載された。さらに、特許文献３（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ））では、ＣＤ４０タンパク質の発現を阻害するための新規のオリゴヌクレオチドの適用可能性について記載される。特許文献４（ヘッカー（Ｈｅｃｋｅｒ）およびワグナー（Ｗａｇｎｅｒ））では、転写因子ＩＦＲ−１の阻害を用い、ＣＤ４０の発現を下方制御するための間接的手段が記載されている。
【０００６】
しかし、インビボにおけるその概念を証拠立てるものは過去に開示されておらず、活性を示すオリゴヌクレオチドの送達が不十分であることが最も考えられる理由であると見なされる。オリゴヌクレオチドでは、その実際の化学的原因（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｏｒｉｇｉｎ）とは無関係に、体液中でのその不安定性または細胞への効率の悪い取り込みまたはそれら双方が理由で、治療有効性が不十分でありうることは当該技術では既知である。例えば、上記の変異体またはリガンドもしくはポリマーとの抱合体などの化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドは、実用上の制限を克服するための１つの戦略を示す。第２のまとまった戦略としては、オリゴヌクレオチドの保護、ターゲティングおよび細胞への取り込み促進を目的とした担体系、特にリポソームの使用が包含される。
【０００７】
リポソームは、かかる担体系として使用される場合、望ましくは高いカプセル化効率を示しかつ作製が経済的である必要があり、優れたコロイド安定性を有しかつ薬剤の細胞への取り込み促進をもたらす必要があり、さらにその毒性も免疫原性も低い必要がある。全身送達用のリポソームは、ヒト血清中でも安定である必要がある。血清成分、特に補体は、脂質膜をせん孔することによってカプセル化薬剤の放出をもたらす可能性があることは知られている。かかる放出が生じる範囲は、関与する膜の組成物およびその中でカプセル化された薬剤の分子サイズに依存する。したがって、小分子が速やかに放出されうる一方、プラスミドなどの大分子が作用を受ける可能性は全くない。
【０００８】
アニオンまたは中性リポソームは、担体と環境の間に凝集が全く生じないことから優れたコロイド安定性を有することが多い。その結果、それらの生体内分布は優れ、かつそれらの炎症および細胞毒性に対する潜在性は低い。しかし、かかる担体におけるカプセル化効率が不十分であることが多く、細胞へのさらなる取り込みを促進するエンドソーム溶解性（ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ）シグナルをもたらすことがない（非特許文献６）。
【０００９】
非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９を例とする極めて多数の出版物がカチオン性リポソーム系を扱っている。カチオン系は、高い帯電効率をもたらす可能性があるが、特に体液との接触後にコロイド安定性が低下する。タンパク質および／または他の生体高分子とのイオン相互作用により、ｉｎ ｓｉｔｕで細胞外マトリックスまたは細胞表面との凝集体形成が起こりうる。非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２によって示されるように、カチオン脂質が有毒であると認められることも多かった。
【００１０】
担体を立体的に安定化する成分の添加により、かかる制限を克服する試みがなされてきた。例えば、様々な鎖長のポリエチレングリコールは体液中でのカチオン成分の使用に関連した凝集問題を改善することが知られており、ＰＥＧ化したカチオン性リポソームがインビボで循環時間の増大を示す（非特許文献１３）。にもかかわらず、ＰＥＧを使用してもカチオン脂質に関連した特有の毒性問題を解決することはない。ＰＥＧがかかるリポソームの細胞への積極的侵入（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｅｎｔｒｙ）または細胞内送達を実質的に阻害しうることも知られている（非特許文献１４）。
【００１１】
両性リポソームは、ｐＨ７．５でアニオンまたは中性電荷およびｐＨ４でカチオン電荷を有する、最近記載されたリポソーム類である。ここでは特許文献５、特許文献６および特許文献７（すべてパンツナー（Ｐａｎｚｎｅｒ）ら）に対して参照がなされ、それらは参照により本明細書中に援用され、両性リポソームに関して詳細な説明を提示している。さらに、特許文献８および特許文献７（同様にパンツナー（Ｐａｎｚｎｅｒ）ら）において開示がなされ、それらは参照により本明細書中に援用され、かかる両性リポソームの作製におけるｐＨに感受性を示す脂質の使用についてさらに記載している。両性リポソームは優れた生体内分布を有し、動物において十分な耐容性を示す。それらは核酸分子を高効率にカプセル化することが可能である。
【００１２】
要するに、ＣＤ４０は、例えばアンチセンスまたはｓｉＲＮＡ分子などのオリゴヌクレオチド阻害剤を使用して潜在的に軽減可能な炎症性または免疫障害の治療における好ましい標的を示す。しかし、これまではかかる活性オリゴヌクレオチドをインビボでうまく利用することができなかった。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／０１８６０７１号明細書
【特許文献２】米国特許第６，１９７，５８４号明細書
【特許文献３】国際公開第２００４／０９０１０８号パンフレット
【特許文献４】ＤＥ１００４９５４９号明細書
【特許文献５】国際公開第０２／０６６４９０号パンフレット
【特許文献６】国際公開第０２／０６６０１２号パンフレット
【特許文献７】国際公開第０３／０７０７３５号パンフレット
【特許文献８】国際公開第０３／０７０２２０号パンフレット
【非特許文献１】パウリ（Ｐａｕｌｉ）ら、１９８４年（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ １７：１７３−１７９頁）
【非特許文献２】グラス（Ｇｒｕｓｓ）ら、１９９７年、Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．２４（５−６）：３９３−４２２頁
【非特許文献３】ホルステージャー（Ｈｏｌｓｔａｇｅｒ）ら、２０００年（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１５３９２−１５３９８頁）
【非特許文献４】バッカム（Ｂａｃｃａｍ）およびビショップ（Ｂｉｓｈｏｐ） １９９９年（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：３８５５−３８６６頁）
【非特許文献５】プルビネ（Ｐｌｕｖｉｎｅｔ）ら、Ｂｌｏｏｄ、２００４年
【非特許文献６】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ （２０００年）、２９２、４８０−４８８頁、クリムク（Ｋｌｉｍｕｋ）ら
【非特許文献７】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９年）、１６、１２９−１４０頁、マウラー（Ｍａｕｒｅｒ）ら
【非特許文献８】ＢＢＡ（２０００年）１４６４、２５１−２６１頁、メイダン（Ｍｅｉｄａｎ）ら
【非特許文献９】Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００１年）、１（２）、２７−３３頁、フィゼ（Ｆｉｓｅｔ）およびガウニ（Ｇｏｕｎｎｉ）
【非特許文献１０】フィリオン（Ｆｉｌｉｏｎ）ら、ＢＢＡ（１９９７年）、１３２９（２）、３４５−３５６頁
【非特許文献１１】ダス（Ｄａｓｓ）、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００２年）、５４（５）、５９３−６０１頁
【非特許文献１２】ヒルコ（Ｈｉｒｋｏ）ら、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１０（１４）、１１８５−１１９３頁
【非特許文献１３】ＢＢＡ（２００１年）１５１０、１５２−１６６頁、センプル（Ｓｅｍｐｌｅ）ら
【非特許文献１４】ソン（Ｓｏｎｇ）ら、ＢＢＡ（２００２年）、１５５８（１）、１−１３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明の目的は、ＣＤ４０に特異的なオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を提供することである。
【００１４】
本発明の特定の目的は、局所治療に対してかかる組成物を提供することである。
【００１５】
本発明の別の特定の目的は、全身投与されうるかかる組成物を提供することである。望ましくは、かかる組成物は、血清との接触時にそのオリゴヌクレオチドを時期を早めて放出するべきでなく、あるいは少なくともその含有物を単に緩徐に放出するべきである。
【００１６】
本発明の異なる目的は、ヒトもしくは非ヒト動物における炎症性、免疫または自己免疫疾患を治療あるいは予防する方法を提供することである。
【００１７】
さらに本発明の別の目的は、移植片拒絶、対宿主移植片病、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、喘息、炎症性腸疾患、乾癬または甲状腺炎を予防あるいは治療する方法を提供することである。
【００１８】
さらに本発明の別の目的は、移植片拒絶、対宿主移植片病、炎症性腸疾患、クローン病（Ｍｏｒｂｕｓ Ｃｒｏｈｎ）または潰瘍性大腸炎を予防あるいは治療する方法を提供することである。
【００１９】
さらに本発明の別の目的は、腸、肺または皮膚の炎症性部位の局所治療に適する医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
したがって、本発明の一態様によると、活性物質としてのオリゴヌクレオチドおよび賦形剤としてのリポソームを含む医薬組成物であって、該オリゴヌクレオチドが、ＣＤ４０をコードする核酸を標的にするように適用され、そのことにより哺乳類細胞におけるＣＤ４０の発現を調節するものである医薬組成物であって、該リポソームが両性リポソームであることを特徴とする医薬組成物が提供される。
【００２１】
好ましくは、該オリゴヌクレオチドはヒトＣＤ４０に特異的である。
【００２２】
本発明の医薬組成物は、一般に局所投与に適し、かつ担体をさらに含み、局所投与のために調合されうる。血清が安定した実施形態は全身送達にも用いることが可能であり、かかる実施形態では、該組成物は担体をさらに含み、かつ全身送達のために調合されうる。
【００２３】
該両性リポソームは、負に帯電されるかまたはｐＨ７．４で中性かつｐＨ４でカチオン性でありうる。好ましくは、該オリゴヌクレオチドの実質的割合またはすべては物理的に両性リポソーム内に捕捉される。リポソームの大きさは、５０〜５００ｎｍ、好ましくは１００〜５００ｎｍ、より好ましくは１５０〜３００ｎｍの範囲内にありうる。
【００２４】
本発明の異なる態様では、ヒトもしくは非ヒト動物患者におけるＣＤ４０の発現に関連した疾患または症状を、本発明に記載の組成物の治療的または予防的有効量を該患者に投与することによって治療あるいは予防するための方法が提供される。
【００２５】
本明細書における「両性」とは、リポソームがアニオンとカチオンの双方の性質を有する電荷群を含むことを意味し、
（ｉ）電荷群の少なくとも一方が４〜７．４のｐＫを有し、
（ｉｉ）カチオン電荷がｐＨ４で優勢となり、かつ
（ｉｉｉ）アニオン電荷がｐＨ７．４で優勢となり、
それによってリポソームはｐＨ４〜ｐＨ７．４でゼロ正味電荷の等電点を有する。この定義により、両性イオンが上記の範囲内のｐＫを有しないことから、両性の性質は「両性イオンの性質」とは異なる。結果として、両性イオンはｐＨ値の範囲を超えて本質的に中性である。例えば、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンは、両性イオンの性質を有する中性脂質である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態では、該両性リポソームは両性脂質を含有する脂質相から形成されうる。該脂質相は、５〜３０モル％、好ましくは１０〜２５モル％の該両性脂質を含有しうる。
【００２７】
適切な両性脂質が国際公開第０２／０６６４８９号パンフレットおよび国際公開第０３／０７０７３５号パンフレットにおいて開示されている。好ましくは、該両性脂質は、ＨｉｓｔＣｈｏｌ、ＨｉｓｔＤＧ、ｉｓｏＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ、アシルカルノシンおよびＨＣＣｈｏｌからなる群から選択される。（本明細書中で参照される脂質の参照を容易にするために、かかる略式名称の用語集が下記に含められる。かかる多数の略語は当業者によって共通に用いられるものである）。
【００２８】
特に好ましい両性脂質はＨｉｓｔＣｈｏｌである。
【００２９】
あるいは、該両性リポソームは、両性の特性を有する脂質成分の混合物を含有する脂質相から形成されうる。かかる両性リポソームは、例えば国際公開第０２／０６６０１２号パンフレットに開示されたｐＨ応答性のアニオンおよび／またはカチオン成分から形成されうる。ｐＨに感受性を示すカチオン脂質は、国際公開第０２／０６６４８９号パンフレットおよび国際公開第０３／０７０２２０号パンフレットおよびそれらの中でなされた参照、特にブドカー（Ｂｕｄｋｅｒ）ら、１９９６年、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（６）：７６０−４頁において開示され、構成的に帯電されたアニオン脂質またはｐＨに感受性を示すアニオン脂質と組み合わせて使用されうる。
【００３０】
あるいは、カチオン電荷は、ｐＨに感受性を示すアニオン脂質と組み合わせた当業者には既知の構成的に帯電された脂質から導入されうる。ＤＯＴＡＰおよびＤＰＰＧを例とする構成的に帯電されたアニオンおよびカチオン脂質の組み合わせは好ましくない。したがって、本発明の一部のここでの好ましい実施形態では、脂質成分の該混合物は、（ｉ）安定なカチオン脂質および帯電可能なアニオン脂質、（ｉｉ）帯電可能なカチオン脂質および帯電可能なアニオン脂質または（ｉｉｉ）安定なアニオン脂質および帯電可能なカチオン脂質を含みうる。
【００３１】
好ましいカチオン成分は、ＤＰＩＭ、ＣＨＩＭ、ＤＯＲＩＥ、ＤＤＡＢ、ＤＡＣ−Ｃｈｏｌ、ＴＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＧＳ、（Ｃ１８）２Ｇｌｙ＋Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルアミド−グリシン、ＣＴＡＢ、ＣＰｙＣ、ＤＯＤＡＰおよびＤＯＥＰＣを含む。
【００３２】
さらに好ましいカチオン脂質は、ＤＭＴＡＰ、ＤＰＴＡＰ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＭｏＣｈｏｌおよびＨｉｓＣｈｏｌである。
【００３３】
本発明での使用にとって好ましいアニオン脂質は、ＤＯＧＳｕｃｃ、ＰＯＧＳｕｃｃ、ＤＭＧＳｕｃｃ、ＤＰＧＳｕｃｃ、ＤＭＰＳ、ＤＰＰＳ、ＤＯＰＳ、ＰＯＰＳ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＯＰＧ、ＰＯＰＧ、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＯＰＡ、ＰＯＰＡ、ＣＨＥＭＳおよびＣｅｔｙｌ−Ｐを含む。
【００３４】
特に好ましいアニオン脂質は、ＤＯＧＳｕｃｃ、ＤＭＧＳｕｃｃ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＯＰＧ、ＰＯＰＧ、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＯＰＡ、ＰＯＰＡ、ＣＨＥＭＳおよびＣｅｔｙｌ−Ｐである。
【００３５】
好ましくは、脂質のかかる両性混合物は、脂質相の約７０モル％以下を構成する。いくつかの実施形態では、該混合物は脂質相の５０モル％以下、好ましくは該脂質相はかかる混合物の約２０〜約４０モル％を構成しうる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、該脂質相は、中性脂質、好ましくはホスファチジルコリンなどの中性リン脂質をさらに含有しうる。ここでの好ましいホスファチジルコリンは、ＰＯＰＣ、天然もしくは水素化大豆ＰＣ、天然もしくは水素化卵ＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣおよびＤＯＰＣを含む。
【００３７】
より好ましくは、該ホスファチジルコリンは、ＰＯＰＣ、非水素化大豆ＰＣまたは非水素化卵ＰＣを含む。
【００３８】
脂質相は、少なくとも１５モル％、好ましくは少なくとも２０モル％の該ホスファチジルコリンを含有しうる。いくつかの実施形態では、該脂質相は約２５モル％以上のホスファチジルコリンを含有しうる。あるいは、該脂質相は約４０モル％以上のホスファチジルコリンを含有しうる。
【００３９】
本発明に記載のここで好ましい組成物は、６０モル％のＰＯＰＣ、約１０モル％のＤＯＴＡＰおよび約３０モル％のＣＨＥＭＳである調合物を有するリポソームを含む。
【００４０】
該中性脂質は、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミンの混合物を含みうる。該中性のホスファチジルコリンもしくはホスファチジルエタノールアミンまたはこれら２つの混合物は、脂質相の他の成分によって構成されずに少なくとも２０モル％のモル量（モル％）で脂質相中に存在しうる（脂質相における全体が１００モル％である）。
【００４１】
好ましいホスファチジルエタノールアミンはＤＯＰＥ、ＤＭＰＥおよびＤＰＰＥを含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、該中性脂質はＰＯＰＣおよびＤＯＰＥを含みうる。
【００４３】
有利にも、該脂質相は、両性の特性を有するアニオンおよびカチオン脂質の混合物、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含有しうる。かかる脂質相から形成された両性リポソームが血清安定性を示すことから全身送達に適しうることが認められている。好ましくは該脂質相がカチオン脂質としてＭｏＣｈｏｌおよびアニオン脂質としてＣＨＥＭＳまたはＤＭＧ−Ｓｕｃｃを含有する。
【００４４】
さらに、ここで好ましい両性リポソームは、本発明の組成物における賦形剤として使用される場合に
（ａ）約１５モル％のＰＯＰＣ、約４５モル％のＤＯＰＥ、約２０モル％のＭｏＣｈｏｌおよび約２０モル％のＣＨＥＭＳ；
（ｂ）約１０モル％のＰＯＰＣ、約３０モル％のＤＯＰＥ、約３０モル％のＭｏＣｈｏｌおよび約３０モル％のＣＨＥＭＳ；
（ｃ）約１０モル％のＰＯＰＣ、約３０モル％のＤＯＰＥ、約２０モル％のＭｏＣｈｏｌおよび約４０モル％のＣＨＥＭＳ；
（ｄ）約６モル％のＰＯＰＣ、約２４モル％のＤＯＰＥ、約４７モル％のＭｏＣｈｏｌおよび約２３モル％のＣＨＥＭＳ
といった調合物を含有する。
【００４５】
いくつかの実施形態では、該リポソームは、中性のホスファチジルコリンおよびコレステロールをさらに含有しうる。かかるリポソームは血清安定性も示しうる。
【００４６】
あるいは、全身送達に適する血清安定性を示すリポソームは、両性脂質または両性の特性を有する脂質成分すなわちコレステロールとホスファチジルコリンなどの中性脂質の混合物を含有しうる。いくつかの実施形態では、該脂質相は、３０モル％〜５０モル％、好ましくは約３５モル％〜約４５モル％のコレステロールを含有しうる。あるいは、該脂質相は、ホスファチジルコリンと、１０モル％〜２５モル％、好ましくは約１５モル％〜約２５モル％のコレステロールを含有しうる。
【００４７】
ここで好ましい調合物は、ＨｉｓｔＣｈｏｌ、ＨｉｓｔＤＧまたはアシルカルノシンを例とする１０〜２５モル％の両性脂質、１５〜２５モル％のコレステロール、および残りとしてＰＯＰＣ、大豆ＰＣ、卵ＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣまたはＤＯＰＣ、好ましくはＰＯＰＣを含有し、例えば約６０モル％のＰＯＰＣ、約２０モル％のＨｉｓｔＣｈｏｌおよび約２０モル％のＣｈｏｌを含有する。
【００４８】
本発明に記載の別のここで好ましい組成物は、両性の特性を有する脂質成分の混合物を含有しかつ約３０モル％のＰＯＰＣ、約１０モル％のＤＯＴＡＰ、約２０モル％のＣＨＥＭＳおよび約４０モル％のＣｈｏｌといった調合物を含有するリポソームを含む。
【００４９】
本発明の医薬組成物がＣＤ４０をコードする核酸を標的にするオリゴヌクレオチドを含むことにより、哺乳類細胞内でのかかるＣＤ４０の発現が弱まる。本明細書では「ＣＤ４０をコードする核酸」とは、ＣＤ４０をコードするＤＮＡおよびかかるＤＮＡ由来のプレ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡといったＲＮＡを意味する。標的核酸と、活性物質としてかかる配列に特異的な１種もしくは複数種のオリゴヌクレオチドとの間の特異的なハイブリダイゼーションを行う結果、ＣＤ４０の発現が阻害されうる。かかる特異的なターゲティングを行うため、該オリゴヌクレオチドは、好ましくは標的核酸の配列に相補的なヌクレオチドの連続ストレッチを含む必要がある。オリゴヌクレオチドは、１０程度、好ましくは１５、およびさらにより好ましくは１８ヌクレオチドから５０、好ましくは３０、およびより好ましくは２５ヌクレオチドの間で長さを変更しうる。オリゴヌクレオチドと標的配列の間の適合性は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの各塩基が上記オリゴヌクレオチド数の連続ストレッチを上回る標的核酸上のその相補的塩基と塩基対を形成することによって完全である。いくつかの実施形態では、あまり好ましくないが、配列対は、塩基対の該連続ストレッチ内に１個もしくは数個のミスマッチを含みうる。
【００５０】
上記基準を満たすオリゴヌクレオチドは、ある範囲の異なる化学物質および／またはトポロジーを有しうる。オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖でありうる。一本鎖オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして周知であるＤＮＡに基づくオリゴヌクレオチド、固定化核酸および２’−修飾オリゴヌクレオチドを含むがこれらに限定されない。骨格または塩基修飾は、ホスホチオエートＤＮＡ（ＰＴＯ）、２’Ｏ−メチルＲＮＡ（２’Ｏｍｅ）、２’Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（２’ＭＯＥ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホアミデート（ＮＰ）、２’フルオロアラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、固定化核酸（ＬＮＡ）、モルホリンホスホアミデート（モルホリノ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）およびトリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）を含むがこれらに限定されない。さらに、混合化学物質は当該技術では既知であり、例えば共重合体、ブロック共重合体およびギャップマーなど、単一のヌクレオチドよりも多くの種から構成される。
【００５１】
上記オリゴヌクレオチドに加え、ＣＤ４０の発現は、相補配列モチーフを含む二本鎖ＲＮＡ分子を用いても阻害されうる。かかるＲＮＡ分子は、当該技術ではｓｉＲＮＡ分子として知られている。この場合にも様々な化学物質がこのクラスのオリゴヌクレオチドに適合される。さらにＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド系が当該技術では既知である。
【００５２】
より詳細には、本明細書では、かかるオリゴヌクレオチドに有用な配列および化学物質について述べた米国特許第６，１９７，５８４号明細書および米国特許出願公開第２００４／０１８６０７１号明細書（いずれもベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ））が参照される。ＣＤ４０の阻害のためのｓｉＲＮＡ配列モチーフについて述べたプルビネ（Ｐｌｕｖｉｎｅｔ）ら、Ｂｌｏｏｄ、２００４年もまた参照される。さらに、ｓｉＲＮＡモチーフは公開されており、例えばサンタクルース・バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（サンタクルース（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、米国）から入手してもよい。
【００５３】
本発明の医薬組成物は、適切な医薬的に許容できる担体中のコロイドとして使用する場合に調合されうる。この目的のための水、生理食塩水、リン酸塩緩衝生理食塩水などの担体は当業者に周知である。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は約７〜約８の生理的ｐＨで投与されうる。このため、活性物質、賦形剤および担体を含有する組成物を調合することでこの範囲のｐＨが得られる。
【００５５】
当業者に既知の適切な方法を用い、本発明の組成物を製造することが可能である。かかる方法には、所定の孔径の膜を介した押し出し、エタノール中の脂質溶媒のカーゴを含有する水相への注入によるカプセル化、または高圧均一化が含まれるがこれらに限定されない。
【００５６】
オリゴヌクレオチドの溶液を中性ｐＨで該賦形剤と接触させることにより、溶液のうちの特定の百分率を占める大量の封入体が生成されうる。活性物質の実質上のカプセル化を行うためには、約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭの範囲の高濃度の賦形剤が好ましい。
【００５７】
本発明に記載の賦形剤として使用される両性リポソームは、それらの等電点またはその近傍でオリゴヌクレオチドと結合することによって該活性物質をリポソーム表面に集結させるという確かな利点をもたらす。このプロセスは、国際公開第０２／０６６０１２号パンフレット中により詳細に記載されている。
【００５８】
本発明の組成物を作製するために用いられる実際の作製プロセスとは無関係に、いくつかの実施形態では、リポソームが密度の高い容器として形成される初期作製ステップの後に、非カプセル化オリゴヌクレオチドがリポソームから除去されうる。この場合も、技術文献および本明細書中に含められる参考文献ではかかる方法について詳細に記載され、かつ適切なプロセスステップには、サイズ排除クロマトグラフィー、沈降、透析、限界濾過およびダイアフィルトレーションが含まれうるがこれらに限定されない。
【００５９】
しかし、任意の非カプセル化オリゴヌクレオチドの除去は本発明の実施において必要ではなく、いくつかの実施形態では、組成物は遊離および捕捉薬剤を含みうる。
【００６０】
本発明の異なる実施形態では、医薬組成物の調製において有利に用いられうるプロセスステップの特定の組み合わせについて以下に示す。
【００６１】
（Ａ）
Ｉ．約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約１〜約２０ｍｇ／ｍＬの該活性物質濃度、および約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭの賦形剤濃度を用いた、中性ｐＨでの活性物質のカプセル化
ＩＩ．該担体は水、生理食塩水または緩衝化生理食塩水でありうる
ＩＩＩ．実際のリポソーム形成およびサイジングステップ
ＩＶ．捕捉されなかった活性物質が除去されない
Ｖ．選択的な凍結乾燥および水を用いた再構成
ＶＩ．保存形態：懸濁液または凍結乾燥された粉末
ＶＩＩ．中性ｐＨでの投与
【００６２】
（Ｂ）
Ｉ．約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約１〜約２０ｍｇ／ｍＬの活性物質濃度、および約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭの賦形剤濃度を用いた、中性ｐＨでの活性物質のカプセル化
ＩＩ．担体は水、生理食塩水または緩衝化生理食塩水でありうる
ＩＩＩ．実際のリポソーム形成およびサイジングステップ
ＩＶ．捕捉されなかった薬剤が除去される
Ｖ．保存形態：懸濁液
ＶＩ．中性ｐＨでの投与
【００６３】
したがって、本発明は、活性物質としてのＣＤ４０に特異的なオリゴヌクレオチドおよび賦形剤としての両性リポソームを含む医薬組成物を包含する。かかる調合物は炎症および自己免疫疾患の治療において治療的活性を示すことが認められており、それ故、本発明は、移植片拒絶、対宿主移植片病、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、喘息、気管支喘息、炎症性腸疾患、乾癬、甲状腺炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、ＣＯＰＤおよびアトピー性皮膚炎を含む炎症、免疫または自己免疫疾患の予防あるいは治療における本発明の組成物の使用をさらに包含する。
【００６４】
上記のように、いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、血清において実質的に安定であり、それ故、かかる実施形態では、組成物は動物、特にヒトにおいて全身的に送達されうる。
【００６５】
局所治療、例えば炎症性粘膜の治療においても、本発明の医薬組成物を使用することが可能である。特に、炎症性腸疾患もしくは移植片拒絶の治療または予防において本発明の組成物を使用しうる。本発明の組成物は、皮膚または肺への局所適用においても適合しうる。
【００６６】
医薬組成物の投与は、当業者の技能の範囲内にある。投与は、治療されるべき疾患の重症度および／または応答性、数日から数か月にかけて持続する治療の治療単位、あるいは治療が有効となっているかまたは疾患の徴候の減少が得られているまでの時間に依存しうる。至適な投与計画は、患者体内の薬剤蓄積の測定値から算出されうる。当業者であれば、至適用量、投与方法および反復率を容易に判定できる。至適用量は本発明の組成物における個々のオリゴヌクレオチドの相対効力に依存して変更され、かつ一般に、動物モデルにおいて有効であることが認められたＥＣ５０値に基づいて評価される場合がある。一般に、単位用量はｋｇ体重の約０．０１μｇ〜約２０ｍｇのオリゴヌクレオチドであり、かつ毎日、週１回、月１回または年１回与えられるかあるいはより不規則に与えられる場合さえある。当業者であれば、体液中または組織内での薬剤の測定された滞留時間および濃度に基づく投与における反復率を容易に評価することができる。治療が成功した後、患者に維持療法を受けさせることで疾患状態の再発を予防することが望ましい場合があり、ここでは調合物が体重のｋｇ当たりのオリゴヌクレオチドで約０．０１μｇ〜約２０ｍｇの範囲の維持用量で１日に１回もしくは複数回から１年に１回まで投与されうる。
【００６７】
以下は、添付図面をあくまでも参考として、本発明の実施形態について説明するものである。
【実施例】
【００６８】
実施例１：ＣＤ４０−ＯＤＮを含有するリポソームの調製
８５μモルのＰＯＰＣ、４２μモルのＣＨＥＭＳおよび１４μモルのＤＯＴＡＰの混合物をクロロホルムに溶解し、丸底フラスコ内で蒸発させ真空下で乾燥させた。アスタリスクがヌクレオチド間のホスホロチオエート連結を示す場合の配列Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊ＴＡＧＡＴＧＧＡＣＣＧＣＴ＊Ｇ＊Ｔを有するＯＤＮを用いた（ガオ（Ｇａｏ）、博士論文、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ ２００３年、ｒＡＳ３を参照）。
【００６９】
脂質膜を緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ４．５）１ｍＬ中の１ｍｇのＯＤＮで水和した。懸濁液を水槽内、室温で２５分間水和させ、５分間超音波処理し、最終的に−７０℃で冷凍した。解凍後、リポソーム懸濁液を孔径４００ｎｍのポリカーボネート膜を介して１５回押し出した。リポソーム懸濁液を１Ｍヘペス緩衝液を使用してｐＨ７．５にし、ストック溶液を使用して０．８Ｍスクロースにした。非カプセル化ＯＤＮを１０ｍＭヘペス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５で重層させた０．５Ｍスクロースを介した浮遊により押し出した試料から除去し、リポソーム懸濁液を４℃で保存した。得られたリポソームを動的光散乱によって特徴づけると、大きさが２２０〜２５０ｎｍであることがわかった。
【００７０】
実施例２：結腸炎の誘発
２０ｍｇのＴＮＢＳを１５０ｍＭのＮａＣｌ中３５％エタノール１３５μｌに添加することによって調製した２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）の単一の結腸内部への適用を用いることにより、結腸炎を誘発した。光エーテル麻酔下で雄ウィスターラット（２００〜２５０ｇ）を置いて、肛門管を通して下行結腸に挿入された８ｃｍ長のカテーテルを使用して混合物を投与した。カテーテルを取り出した後、ラットを頭を下にした姿勢に３０秒間保って腸からの流出を回避し、以後はラットを通常の状態で保持した。
【００７１】
実施例３：治療および分析
結腸炎誘発の４時間前または３日後に、ラットを実施例１から得たＣＤ４０アンチセンスで治療した。実施例１から得たアンチセンス懸濁液を１Ｍ緩衝酢酸／酢酸ナトリウム ｐＨ４．０を使用してｐＨ４．５にし、２．７μｇのＣＤ４０アンチセンスを含有する全体で１００μｌの懸濁液を実施例２に記載の結腸に適用した。
【００７２】
結腸炎の誘発の７日後、動物を殺した。結腸を摘出し、縦方向に開いた。４％のホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中に結腸試料を固定した。パラフィン包埋切片（５μｍ）をヘマトキシリン／エオシンで染色してから顕微鏡検査した。
【００７３】
結腸障害を以下の基準によってスコアリングした。
【００７４】
【表１】
【００７５】
図１および図２に示す結果は、スクランブルした対照アンチセンスではなくＣＤ４０に特異的なアンチセンスで治療した場合に実験結腸炎が顕著に減少することを示している。かなり意外なことに、３日目で完全に発症した結腸炎に対してたとえ単回治療であっても、炎症が著しくほぼ完全に減少するに至った。それに対する確認として、疾患の開始前に調合物を予防的様式で適用した場合、結腸炎の予防も実現した。
【００７６】
実施例４：別の調合物
６０モル％のＰＯＰＣ、２０モル％のＨｉｓｔＣｈｏｌおよび２０モル％のコレステロールの混合物を賦形剤として使用した場合でも実験結腸炎の治療が奏功するに至った。
【００７７】
実施例５：ノンリムーバル（ｎｏｎ−ｒｅｍｏｖａｌ）の外部アンチセンス
ノンリムーバルの非カプセル化アンチセンスを調合物として使用した場合でも安定なコロイド状の担体系が生成した。
【００７８】
実施例６：小腸移植治療
免疫抑制剤治療を施さずに、同種のブラウンノルウェー（Ｂｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙ）（ＲＴ１ｎ）からルイス（ＲＴ１１）株を組み合わせた雄ラットにおいて異所性の小腸移植を行った。
【００７９】
小腸の外植およびリンガー溶液での移植片管の洗浄を行った後、１群の動物（ｎ＝３）は、実施例１に記載の賦形剤において調合されたＣＤ４０アンチセンスＯＤＮ（群Ａ）またはそれに対応するスクランブルした対照ＯＤＮ（群Ｂ）で前治療したドナーの小腸移植を受けた。実施例１から得たアンチセンス懸濁液を、１Ｍ緩衝酢酸／酢酸ナトリウム ｐＨ４．０を用いてｐＨ４．５にした。
【００８０】
ドナー血管を、ＣＤ４０アンチセンスまたはスクランブルした対照ＯＤＮを含有するリンガー溶液２ｍｌ（全容量１００μｌ中２．７μｇのＤＮＡ）で前治療した。腸内腔をＵＷ（ウィスコンシン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ））溶液ですすいだ。虚血の２時間後、ＤＮＡ溶液を流し出し、移植片を移植し、組織学的に分析した。
【００８１】
分析
粘膜灌流全体を特徴づけるため、式
ＰＩ（％）＝Ｖｐ＋０．５×Ｖｉｐ）／Ｖｔ
（式中、Ｖｐは灌流された絨毛の数、Ｖｉｐはすべての不規則に灌流された絨毛の数およびＶｔは観察された絨毛の総数を示す）
を用いることにより灌流指数（ＰＩ）を算出した。
【００８２】
粘膜灌流障害全体を特徴づけるため、鬱血指数（ＳＩ）を
ＳＩ（％）＝Ｖｎｐ／Ｖｔ
（式中、Ｖｎｐは灌流されなかった絨毛の数およびＶｔは観察された全絨毛の総数を示す）
にしたがって算出した。
【００８３】
粘膜および筋肉層における微小循環パラメータのさらなる分析として、機能的毛細血管密度（ＦＣＤ、倍率４７６倍での絨毛面積当たりの潅流される毛細血管の長さ（１／ｃｍ））および赤血球速度（倍率９３３倍でのｍｍ／秒単位のＲＢＣＶ）の評価を含めた。ＣＡＰＩＭＡＧＥソフトウェア（ザイントル（Ｚｅｉｎｔｌ）、ハイデルベルク（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、ドイツ）を使用して機能性毛細血管密度および赤血球速度の分析を行い、ラインシフト（ｌｉｎｅ−ｔｏ−ｓｈｉｆｔ）分析によって赤血球速度を判定した。さらに、蛍光マーカーローダミン６Ｇを使用して各管セグメント（１００μｍ）における癒着性の白血球を同定し、観察期間３０秒以内に動かないかまたは内皮から離れなかった細胞として計数した。それらの数を血管の直径および長さから算出して円筒の形状を推定し、ｍｍ２当たりの細胞数として表した。
【００８４】
結果
移植片粘膜内部の絨毛でのマイクロキャピラリー灌流
ＣＤ４０アンチセンスＯＤＮで治療した移植物では、治療していない対照またはスクランブルした対照ＯＤＮの場合とそれぞれ比較した場合、移植片粘膜における絨毛灌流全体が顕著に改善した。観察フィールド当たりの観察された絨毛に対する灌流された絨毛の百分率を表す灌流指数によってこれを示した（図３）。逆に、観察フィールド当たりの絨毛の総数に対する灌流されなかった絨毛の百分率の指標である鬱血指数は、ＣＤ４０アンチセンスＯＤＮで治療した移植片では、治療していない対照およびスクランブルした対照ＯＤＮの場合とそれぞれ比較した場合、顕著に低下した（図３）。
【００８５】
絨毛面積当たりの１本の絨毛内部の機能的毛細血管密度の測定による、１本の絨毛の灌流に関するより詳細な分析によると、ＣＤ４０アンチセンスＯＤＮで治療した動物では、治療していない対照およびスクランブルした対照ＯＤＮの場合とそれぞれ比較した場合、灌流された毛細血管の密度が顕著に高まることが再び示された（図４）。これは、より良好に保護された絨毛灌流や、それによるより優れた粘膜機能を有するＣＤ４０アンチセンスＯＤＮで治療された動物について明らかにしている。
【００８６】
したがって、絨毛の毛細血管内での赤血球速度の測定によると、ＣＤ４０アンチセンスＯＤＮで治療された移植物では、治療していない対照およびスクランブルした対照ＯＤＮの場合とそれぞれ比較した場合、顕著な速度増加が示された（図５）。
【００８７】
白血球−内皮細胞の相互作用
それに対し、粘膜下後毛細血管細静脈内での白血球−内皮細胞の相互作用の評価によると、白血球の内皮表面への付着数において異なる治療群と対照群の間に大した差異が示されなかった（図６）。
【００８８】
実施例７：ＣＤ４０−ＯＤＮを含有するリポソームの調製
３０モル％のＰＯＰＣ、１０モル％のＤＯＴＡＰ、２０モル％のＣｈｅｍｓおよび４０モル％のＣｈｏｌの混合物をクロロホルムに溶解し、丸底フラスコ内で蒸発させ真空下で乾燥させた。
【００８９】
配列ＴＣＣＴＡＧＡＴＧＧＡＣＣＧＣＴＧＴを有するＯＤＮを、完全なホスホロチオエートヌクレオチド物質を保有するバイオグノスティックＧｍｂＨ（Ｂｉｏｇｎｏｓｔｉｋ ＧｍｂＨ）、ドイツから購入した（ガオ（Ｇａｏ）、博士論文、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ ２００３年、ｒＡＳ３を参照）。
【００９０】
脂質膜を、最終脂質濃度が懸濁液中で１００ｍＭである程度の量のＯＤＮ溶液（１０ｍＭヘペス中、２０ｍｇ／ｍｌ ＣＤ４０ ＯＤＮ（１８ｍｅｒ、完全ホスホチオエート化）、１２５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５）で水和した。懸濁液を水槽内、５０℃で４５分間水和させ、１５分間超音波処理した。次いで懸濁液を−７０℃で３０分間、３回冷凍し、５０℃で１５分間解凍した。
【００９１】
リポソーム懸濁液を孔径４００ｎｍを有するポリカーボネート膜を介して１９回押し出した。非カプセル化ＯＤＮを、３５０００ｒｐｍ、１５℃で１５時間にわたる沈降により、水で希釈した後の押し出した試料から取り出した。
カプセル化ＣＤ４０ ＯＤＮを有する他の調合物を同一条件を用いて調製した。
【００９２】
【表２】
【００９３】
２６０ｎｍによる光学密度（ＯＤ）を調べることによってカプセル化ＯＤＮの量を測定した。異なるＳｍａｒｔｉｃｌｅ調合物において以下のＯＤＮ量をカプセル化した。
【００９４】
【表３】
【００９５】
実施例８：関節炎における治療有効性
関節炎の誘発の２１日前および１４日前に完全フロインドアジュバント中のメチル化ウシ血清アルブミン（ｍＢＳＡ）の皮下注射によって雌ルイスラットを免疫した。０日目、生理緩衝液中の抗原（ｍＢＳＡ）を右膝関節に関節内注射することによって関節炎を誘発する一方、左膝関節を注射されない正常な対照関節として用いた。
【００９６】
治療試験のため、関節炎の誘発の６、４８および９６時間後に、確立されたＡＩＡを用い、遊離（非カプセル化）ＣＤ４０−ＯＤＮまたはリポソームＣＤ４０−ＯＤＮ（上記実施例７の調合物１：ＰＯＰＣ／ＤＯＴＡＰ／Ｃｈｅｍｓ／Ｃｈｏｌが３０：１０：２０：４０）をラットの尾静脈に静脈内注射した。各用量は、１ｋｇ体重当たり３ｍｇのＣＤ４０−ＯＤＮ（カプセル化ＣＤ４０−ＯＤＮ）または１ｋｇ体重当たり３および１５ｍｇのＣＤ４０−ＯＤＮ（それぞれ遊離ＣＤ４０−ＯＤＮ９および遊離ＣＤ４０−ＯＤＮ４５）を含有した。
【００９７】
実験の間、関節の腫脹および動物の体重を観察した。カプセル化ＣＤ４０−ＯＤＮ（リポソーム−ＯＤＮ、図７）による治療後の２１日間にわたり、膝関節の腫脹が顕著に低下した（ｐ＜０．０５）。それに対し、高用量の遊離ＣＤ４０−ＯＤＮ（ＣＤ４０−ＯＤＮ４５、図７）による治療の結果、生理食塩水の対照と比較し、関節炎の急性期および慢性期において膝関節の炎症が悪化した。全動物群の体重では、生理食塩水の対照と比べて何の相違点も示されていない（図８）。
【００９８】
実施例９：耐容性
実施例２に記載のように動物を治療し、炎症の発症の２１日後に殺した。顕微鏡検査では、調合物に対する不耐性の徴候を全く呈することなく、対照群と区別できないことが判明した。さらに、肝臓、脾臓、胸腺および腎臓における個々の器官重量を測定した。リポソームＣＤ４０−ＯＤＮによって治療した群の場合、肝臓重量における若干の低下が観察され、他のすべての器官重量では影響を認めなかった（図９および図１０）。
【００９９】
実施例１０：材料
この実施例は、ＣＤ４０の発現を調節しかつ本発明に記載の組成物における使用に適するオリゴヌクレオチドによって標的にされうるＣＤ４０ヌクレオチド配列の限定されない例を提供する。
【０１００】
ヒトＣＤ４０ ｍＲＮＡ（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号Ｘ６０５９２）
本発明における標的対象のヒトＣＤ４０ ｍＲＮＡ配列を配列番号１に示す。関連配列情報が、ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）ら、米国特許出願公開第２００４／０１８６０７１号明細書（すなわち配列番号８５）、ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）ら、米国特許第６，１９７，５８４号明細書（すなわち配列番号８５）およびプルビネ（Ｐｌｕｖｉｎｅｔ）ら、Ｂｌｏｏｄ、２００４年、１０４（１２）、３６４２−３６４６頁の中に認められ、それらの内容は参照により本明細書中に援用される。
（配列番号１）：
【０１０１】
ハツカネズミＣＤ４０ ｍＲＮＡ
本発明における標的対象のマウスＣＤ４０ ｍＲＮＡ配列を配列番号２に示す。関連配列情報が、ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）ら、米国特許出願公開第２００４／０１８６０７１号明細書（すなわち配列番号１３２）中に認められ、その内容は参照により本明細書中に援用される。
（配列番号２）：
【０１０２】
ラットＣＤ４０ ｍＲＮＡ（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号ＡＦ２４１２３１）
本発明における標的対象のラットＣＤ４０ ｍＲＮＡ配列を配列番号３に示す（ガオ（Ｇａｏ）、博士論文、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ ２００３年を参照）。
（配列番号３）：
【０１０３】
ブタＣＤ４０ ｃＤＮＡ
本発明における標的対象のブタＣＤ４０ ｃＤＮＡ配列を配列番号４に示す（図１１）。関連配列情報が、ラッシュワース（Ｒｕｓｈｗｏｒｔｈ）ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００２年、７３（４）、６３５−６４２頁の中に認められ、その内容は参照により本明細書中に援用される。
【０１０４】
さらに以下に、本発明における使用に適する、アンチセンスＣＤ４０核酸配列を例とする抗−ＣＤ４０オリゴヌクレオチドの限定されない例を提供する。
【０１０５】
ヒトＣＤ４０に対するオリゴヌクレオチド
ヒトアンチセンスＣＤ４０オリゴヌクレオチドの例を下記に示す。さらに、配列情報が、ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）ら、米国特許出願公開第２００４／０１８６０７１号明細書中および米国特許第６，１９７，５８４号明細書中に認められ、それらの内容は参照により本明細書中に提供される。ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）らによって示された配列番号を右側に示す。
【０１０６】
以下のｓｉＲＮＡ配列は本発明における使用に適し（例えば、プルビネ（Ｐｌｕｖｉｎｅｔ）ら、Ｂｌｏｏｄ、２００４年、１０４（１２）、３６４２−３６４６頁を参照）、その内容は参照により本明細書中に援用される。
【０１０７】
すべてのｓｉＲＮＡは、３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを含む。
【０１０８】
マウスＣＤ４０に対するオリゴヌクレオチド
マウスアンチセンスＣＤ４０オリゴヌクレオチドの例を下記に示す。さらに、配列情報が、ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）ら、米国特許出願公開第２００４／０１８６０７１号明細書中に認められ、これによってその内容は参照により本明細書中に援用される。ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）らによって示された配列番号を右側に示す。
マウス
【０１０９】
ラットＣＤ４０に対するオリゴヌクレオチド
ラットアンチセンスＣＤ４０オリゴヌクレオチドの例を下記に示す（ガオ（Ｇａｏ）、博士論文、２００３年、ゲッチンゲン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）、ドイツを参照）。
【０１１０】
ブタＣＤ４０に対するオリゴヌクレオチド
ブタアンチセンスＣＤ４０オリゴヌクレオチドの例を下記に示す。ラッシュワース（Ｒｕｓｈｗｏｒｔｈ）ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００２年、７３（４）、６３５−６４２頁を参照のこと。その内容は参照により本明細書中に援用される。
【０１１１】
脂質における共通の略称の用語集
ＤＭＰＣ ジミリストイルホスファチジルコリン
ＤＰＰＣ ジパルミトイルホスファチジルコリン
ＤＳＰＣ ジステアロイルホスファチジルコリン
ＰＯＰＣ パルミトイル−オレオイルホスファチジルコリン
ＤＯＰＣ ジオレオイルホスファチジルコリン
ＤＯＰＥ ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
ＤＭＰＥ ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン
ＤＰＰＥ ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン
ＤＯＰＧ ジオレオイルホスファチジルグリセロール
ＰＯＰＧ パルミトイル−オレオイルホスファチジルグリセロール
ＤＭＰＧ ジミリストイルホスファチジルグリセロール
ＤＰＰＧ ジパルミトイルホスファチジルグリセロール
ＤＭＰＳ ジミリストイルホスファチジルセリン
ＤＰＰＳ ジパルミトイルホスファチジルセリン
ＤＯＰＳ ジオレオイルホスファチジルセリン
ＰＯＰＳ パルミトイル−オレオイルホスファチジルセリン
ＤＭＰＡ ジミリストイルホスファチジン酸
ＤＰＰＡ ジパルミトイルホスファチジン酸
ＤＯＰＡ ジオレオイルホスファチジン酸
ＰＯＰＡ パルミトイル−オレオイルホスファチジン酸
ＣＨＥＭＳ コレステロールヘミサクシネート
ＤＣ−Ｃｈｏｌ ３−β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルエタン）カルバモイル］コレステロール
Ｃｅｔｙｌ−Ｐ セチルリン酸
ＤＯＤＡＰ （ｌ，２）−ジオレオイルオキシプロピル）−Ｎ，Ｎ−塩化ジメチルアンモニウム
ＤＯＥＰＣ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン
ＤＡＣ−Ｃｈｏｌ ３−β−［Ｎ−（Ｎ，Ｎ’−ジメチルエタン）カルバモイル］コレステロール
ＴＣ−Ｃｈｏｌ ３−β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−トリメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール
ＤＯＴＭＡ （ｌ，２−ジオレイルオキシプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標））
ＤＯＧＳ （（Ｃ１８）２ＧｌｙＳｐｅｒ３＋）Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルアミド−グリシル−スペルミン（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標））
ＣＴＡＢ セチル−トリメチルアンモニウムブロマイド
ＣＰｙＣ セチル−ピリジニウムクロライド
ＤＯＴＡＰ （ｌ，２−ジオレオイルオキシプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩
ＤＭＴＡＰ （１，２−ジミリストイルオキシプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩
ＤＰＴＡＰ （１，２−ジパルミトイルオキシプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩
ＤＯＴＭＡ （ｌ，２−ジオレイルオキシプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド）
ＤＯＲＩＥ （ｌ，２−ジオレイルオキシプロピル）−３ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド）
ＤＤＡＢ ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド
ＤＰＩＭ ４−（２，３−ビス−パルミトイルオキシ−プロピル）−ｌ−メチル−ｌＨ−イミダゾール
ＣＨＩＭ ヒスタミニル−コレステロールカルバメート
ＭｏＣｈｏｌ ４−（２−アミノエチル）−モルホリノ−コレステロールヘミサクシネート
ＨｉｓＣｈｏｌ ヒスタミニル−コレステロールヘミサクシネート
ＨＣＣｈｏｌ Ｎα−ヒスチジニル−コレステロールカルバメート
ＨｉｓｔＣｈｏｌ Ｎα−ヒスチジニル−コレステロール−ヘミサクシネート
ＡＣ アシルカルノシン、ステアリル−＆パルミトイルカルノシン
ＨｉｓｔＤＧ １，２−ジパルミトイルグリセロール−ヘミサクシネート−Ｎα−ヒスチジニル−ヘミサクシネート、＆ジステアロイル−ジミリストイル、ジオレオイルまたはパルミトイル−オレオイル誘導体
ＩｓｏＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ １，２−ジパルミトイルグリセロール−Ｏａ−ヒスチジニル−Ｎα−ヘミサクシネート、＆ジステアロイル−、ジミリストイル、ジオレオイルまたはパルミトイル−オレオイル誘導体
ＤＧＳｕｃｃ １，２−ジパルミトイルグリセロール−３−ヘミサクシネート＆ジステアロイル−、ジミリストイル−ジオレオイルまたはパルミトイル−オレオイル誘導体
【化１】
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】結腸障害の顕微鏡スコアリング（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｓｃｏｒｉｎｇ） 対照 対照動物、ＰＢＳで処理 ＣＤ４０／０ 誘発の０日目、４時間前に治療 ＣＤ４０／０＿３ 誘発の０日目、４時間前に治療および３日目に治療 ＳＣＲ／０ スクランブルした対照で誘発の４時間前に治療 ＣＤ４０／３ ３日目のみ治療 ＳＣＲ／３ ３日目にスクランブルした対照で治療
【図２Ａ】治療後の結腸切片（正常、非罹患腸壁）
【図２Ｂ】治療後の結腸切片（炎症性を示すが治療されていない腸壁）
【図２Ｃ】治療後の結腸切片（スクランブルした対照を用いた結腸炎誘発前の治療）
【図２Ｄ】治療後の結腸切片（特異的なＣＤ４０アンチセンスを用いた結腸炎誘発前の治療）
【図３】同種対照（対照）、移植の７日後でのＣＤ４０アンチセンスＯＤＮ（ＡＳ）またはスクランブルした対照ＯＤＮ（ＳＣＲ）で治療された移植片（ｎ＝３）における灌流指数（塗りつぶしたカラム）および鬱血指数（白カラム）。＊ｐ＜０．０５対対照、＃ｐ＜０．０５ＡＳ対ＳＣＲ。
【図４】同種対照（対照）、移植の７日後でのＣＤ４０アンチセンスＯＤＮ（ＡＳ）またはスクランブルした対照ＯＤＮ（ＳＣＲ）で治療された移植片（ｎ＝３）における粘膜内での機能的毛細血管密度（ＦＣＤ）。＊ｐ＜０．０５対対照、＃ｐ＜０．０５ＡＳ対ＳＣＲ。
【図５】同種対照（対照）、移植の７日後でのＣＤ４０アンチセンスＯＤＮ（ＡＳ）またはスクランブルした対照ＯＤＮ（ＳＣＲ）で治療された移植片（ｎ＝３）における小腸移植物の粘膜下管内での赤血球速度（ＲＢＣＶ）。＊ｐ＜０．０５対対照、＃ｐ＜０．０５ＡＳ対ＳＣＲ。
【図６】同種対照（対照）、移植の７日後でのＣＤ４０アンチセンスＯＤＮ（ＡＳ）またはスクランブルした対照ＯＤＮ（ＳＣＲ）で治療された移植片（ｎ＝３）における白血球−内皮細胞の相互作用。＊ｐ＜０．０５対対照、＃ｐ＜０．０５ＡＳ対ＳＣＲ。
【図７】遊離またはリポソームＣＤ４０−ＯＤＮによる治療後でのラットの関節腫脹。腫脹は左右の膝関節の間の大きさの差異として表される。記載のように動物が治療され、６、４８および９６時間後に３回の注射がなされた。
【図８】遊離ＣＤ４０−ＯＤＮまたはリポソームＣＤ４０−ＯＤＮの適用の２１日後でのラットの体重［ｇ］。記載のように動物が治療され、６、４８および９６時間後に３回の注射がなされた。
【図９】遊離ＣＤ４０−ＯＤＮまたはリポソームＣＤ４０−ＯＤＮの適用の２１日後でのラットの脾臓および胸腺の器官重量［ｇ］。
【図１０】遊離ＣＤ４０−ＯＤＮまたはリポソームＣＤ４０−ＯＤＮの適用の２１日後でのラットの肝臓重量［ｇ］。
【図１１】本発明に記載のターゲティングを目的としたブタＣＤ４０ ｃＤＮＡ配列（配列番号４）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性物質としてのオリゴヌクレオチドおよび賦形剤としてのリポソームを含む医薬組成物であって、前記オリゴヌクレオチドが、ＣＤ４０をコードする核酸を標的にするように適用され、そのことにより哺乳類細胞におけるＣＤ４０の発現を調節するものであり、前記リポソームが両性リポソームである、医薬組成物。
【請求項２】
前記リポソームが４〜７．４の等電点を有することを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記両性リポソームがｐＨ７．４で負に帯電するかまたは中性であり、かつｐＨ４でカチオン性であることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記両性リポソームが両性脂質を含有する脂質相から形成されることを特徴とする、請求項１、請求項２または請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記脂質相が５〜３０モル％の前記両性脂質を含有することを特徴とする、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記両性脂質がＨｉｓｔＣｈｏｌ、ＨｉｓｔＤＧ、ｉｓｏＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ、アシルカルノシンおよびＨＣＣＨｏｌからなる群から選択されることを特徴とする、請求項４または請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記両性リポソームが両性の特性を有する脂質成分の混合物を含有する脂質相から形成されることを特徴とする、請求項１、請求項２または請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項８】
脂質成分の前記混合物がアニオンまたはカチオン成分を含み、少なくとも１種のかかる成分がｐＨ応答性を示すことを特徴とする、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
脂質成分の前記混合物が、（ｉ）安定なカチオン脂質および帯電可能なアニオン脂質、（ｉｉ）帯電可能なカチオン脂質および帯電可能なアニオン脂質または（ｉｉｉ）安定なアニオン脂質および帯電可能なカチオン脂質を含むことを特徴とする、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記脂質成分が、ＤＧＳｕｃｃ、ＤＭＰＳ、ＤＰＰＳ、ＤＯＰＳ、ＰＯＰＳ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＯＰＧ、ＰＯＰＧ、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＯＰＡ、ＰＯＰＡ、ＣＨＥＭＳおよびＣｅｔｙｌ−Ｐからなる群から選択される１種もしくは複数種のアニオン脂質を含むことを特徴とする、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記脂質成分が、ＤＧＳｕｃｃ、ＤＯＰＡ、ＣＨＥＭＳおよびＣｅｔｙｌ−Ｐからなる群から選択される１種もしくは複数種のアニオン脂質を含むことを特徴とする、請求項９または請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記脂質成分が、ＤＭＴＡＰ、ＤＰＴＡＰ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＭｏＣｈｏｌ、ＨｉｓＣｈｏｌ、ＤＰＩＭ、ＣＨＩＭ、ＤＯＲＩＥ、ＤＤＡＢ、ＤＡＣ−Ｃｈｏｌ、ＴＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＧＳ、（Ｃ１８）２Ｇｌｙ＋Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルアミド−グリシン、ＣＴＡＰ、ＣＰｙＣ、ＤＯＤＡＰおよびＤＯＥＰＣからなる群から選択される１種もしくは複数種のカチオン脂質を含むことを特徴とする、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記脂質成分が、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＭｏＣｈｏｌおよびＨｉｓＣｈｏｌからなる群から選択される１種もしくは複数種のカチオン脂質を含むことを特徴とする、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記脂質相が、中性リン脂質をさらに含有することを特徴とする、請求項４〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記脂質相が中性ホスファチジルコリンを含有することを特徴とする、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記中性ホスファチジルコリンが、ＰＯＰＣ、天然もしくは水素化大豆ＰＣ、天然もしくは水素化卵ＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣおよびＤＯＰＣからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記ホスファチジルコリンが、ＰＯＰＣ、非水素化大豆ＰＣまたは非水素化卵ＰＣを含むことを特徴とする、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記脂質相が、少なくとも１５モル％の前記ホスファチジルコリンを含有することを特徴とする、請求項１５、請求項１６または請求項１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記脂質相が、約６０モル％のＰＯＰＣ、約１０モル％のＤＯＴＡＰおよび約３０モル％のＣＨＥＭＳを含有することを特徴とする、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記中性脂質がホスファチジルエタノールアミンを含むことを特徴とする、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記ホスファチジルエタノールアミンが、ＤＯＰＥ、ＤＭＰＥおよびＤＰＰＥから選択されることを特徴とする、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記脂質相が少なくとも２０モル％の前記ホスファチジルコリンおよび前記ホスファチジルエタノールアミンを含有することを特徴とする、請求項２０または請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記脂質相が両性の特性を有するアニオン脂質とカチオン脂質、ホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミンの混合物を含有することを特徴とする、請求項２０または請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記カチオン脂質がＭｏＣｈｏｌを含み、かつ前記アニオン脂質がＣＨＥＭＳまたはＤＭＧＳｕｃｃを含むことを特徴とする、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記脂質相が、
（ａ）約１５モル％のＰＯＰＣ、約４５モル％のＤＯＰＥ、約２０モル％のＭｏＣｈｏｌおよび約２０モル％のＣＨＥＭＳ、
（ｂ）約１０モル％のＰＯＰＣ、約３０モル％のＤＯＰＥ、約３０モル％のＭｏＣｈｏｌおよび約３０モル％のＣＨＥＭＳ、
（ｃ）約１０モル％のＰＯＰＣ、約３０モル％のＤＯＰＥ、約２０モル％のＭｏＣｈｏｌおよび約４０モル％のＣＨＥＭＳ、または
（ｄ）約６モル％のＰＯＰＣ、約２４モル％のＤＯＰＥ、約４７モル％のＭｏＣｈｏｌおよび約２３モル％のＣＨＥＭＳ
を含有することを特徴とする、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記脂質相がＤＯＰＥおよびＰＯＰＣを含有することを特徴とする、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記脂質相がコレステロールをさらに含有することを特徴とする、請求項１４、請求項１５または請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記脂質相が３０モル％〜５０モル％のコレステロールを含有することを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記脂質相が約３０モル％のＰＯＰＣ、約１０モル％のＤＯＴＡＰ、約２０モル％のＣＨＥＭＳおよび約４０モル％のＣｈｏｌを含有することを特徴とする、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記脂質相が約６０モル％のＰＯＰＣ、約２０モル％のＨｉｓｔＣｈｏｌおよび約２０モル％のＣｈｏｌを含有することを特徴とする、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記組成物が担体をさらに含有し、かつ全身送達のために調合される、請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記組成物が担体をさらに含有し、かつ局所投与のために調合される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記リポソームが５０〜１０００ｎｍの範囲内の大きさを有することを特徴とする、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記オリゴヌクレオチドが１５〜５０塩基対の長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記オリゴヌクレオチドが、ホスホチオエート結合、２’ＭＯＥ修飾核酸塩基、ＬＮＡ核酸塩基、ＦＡＮＡ核酸塩基または天然のリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記オリゴヌクレオチドが１５〜５０塩基対の長さのｓｉＲＮＡであることを特徴とする、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記オリゴヌクレオチドが前記ヒトＣＤ４０遺伝子を標的にすることを特徴とする、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
ヒトもしくは非ヒト動物の炎症性、免疫または自己免疫疾患の予防あるいは治療のための、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３９】
移植片拒絶、対宿主移植片病、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、喘息、炎症性腸疾患、乾癬または甲状腺炎の予防あるいは治療のための、請求項３１に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４０】
移植片拒絶、対宿主移植片病、炎症性腸疾患、クローン病および潰瘍性大腸炎の予防あるいは治療のための、請求項３２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１】
活性物質としてのオリゴヌクレオチドおよび賦形剤としてのリポソームを含む医薬組成物であって、前記オリゴヌクレオチドが、ＣＤ４０をコードする核酸を標的にするように適用され、そのことにより哺乳類細胞におけるＣＤ４０の発現を調節するものであり、前記リポソームが両性リポソームである、医薬組成物。
【請求項２】
前記リポソームが４〜７．４の等電点を有することを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記両性リポソームがｐＨ７．４で負に帯電するかまたは中性であり、かつｐＨ４でカチオン性であることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記両性リポソームが両性脂質を含有する脂質相から形成されることを特徴とする、請求項１、請求項２または請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記脂質相が５〜３０モル％の前記両性脂質を含有することを特徴とする、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記両性脂質がＨｉｓｔＣｈｏｌ、ＨｉｓｔＤＧ、ｉｓｏＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ、アシルカルノシンおよびＨＣＣＨｏｌからなる群から選択されることを特徴とする、請求項４または請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記両性リポソームが両性の特性を有する脂質成分の混合物を含有する脂質相から形成されることを特徴とする、請求項１、請求項２または請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項８】
脂質成分の前記混合物がアニオンまたはカチオン成分を含み、少なくとも１種のかかる成分がｐＨ応答性を示すことを特徴とする、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
脂質成分の前記混合物が、（ｉ）安定なカチオン脂質および帯電可能なアニオン脂質、（ｉｉ）帯電可能なカチオン脂質および帯電可能なアニオン脂質または（ｉｉｉ）安定なアニオン脂質および帯電可能なカチオン脂質を含むことを特徴とする、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記脂質成分が、ＤＧＳｕｃｃ、ＤＭＰＳ、ＤＰＰＳ、ＤＯＰＳ、ＰＯＰＳ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＯＰＧ、ＰＯＰＧ、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＯＰＡ、ＰＯＰＡ、ＣＨＥＭＳおよびＣｅｔｙｌ−Ｐからなる群から選択される１種もしくは複数種のアニオン脂質を含むことを特徴とする、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記脂質成分が、ＤＧＳｕｃｃ、ＤＯＰＡ、ＣＨＥＭＳおよびＣｅｔｙｌ−Ｐからなる群から選択される１種もしくは複数種のアニオン脂質を含むことを特徴とする、請求項９または請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記脂質成分が、ＤＭＴＡＰ、ＤＰＴＡＰ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＭｏＣｈｏｌ、ＨｉｓＣｈｏｌ、ＤＰＩＭ、ＣＨＩＭ、ＤＯＲＩＥ、ＤＤＡＢ、ＤＡＣ−Ｃｈｏｌ、ＴＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＧＳ、（Ｃ１８）２Ｇｌｙ＋Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルアミド−グリシン、ＣＴＡＰ、ＣＰｙＣ、ＤＯＤＡＰおよびＤＯＥＰＣからなる群から選択される１種もしくは複数種のカチオン脂質を含むことを特徴とする、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記脂質成分が、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＭｏＣｈｏｌおよびＨｉｓＣｈｏｌからなる群から選択される１種もしくは複数種のカチオン脂質を含むことを特徴とする、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記脂質相が、中性リン脂質をさらに含有することを特徴とする、請求項４〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記脂質相が中性ホスファチジルコリンを含有することを特徴とする、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記中性ホスファチジルコリンが、ＰＯＰＣ、天然もしくは水素化大豆ＰＣ、天然もしくは水素化卵ＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣおよびＤＯＰＣからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記ホスファチジルコリンが、ＰＯＰＣ、非水素化大豆ＰＣまたは非水素化卵ＰＣを含むことを特徴とする、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記脂質相が、少なくとも１５モル％の前記ホスファチジルコリンを含有することを特徴とする、請求項１５、請求項１６または請求項１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記脂質相が、約６０モル％のＰＯＰＣ、約１０モル％のＤＯＴＡＰおよび約３０モル％のＣＨＥＭＳを含有することを特徴とする、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記中性脂質がホスファチジルエタノールアミンを含むことを特徴とする、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記ホスファチジルエタノールアミンが、ＤＯＰＥ、ＤＭＰＥおよびＤＰＰＥから選択されることを特徴とする、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記脂質相が少なくとも２０モル％の前記ホスファチジルコリンおよび前記ホスファチジルエタノールアミンを含有することを特徴とする、請求項２０または請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記脂質相が両性の特性を有するアニオン脂質とカチオン脂質、ホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミンの混合物を含有することを特徴とする、請求項２０または請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記カチオン脂質がＭｏＣｈｏｌを含み、かつ前記アニオン脂質がＣＨＥＭＳまたはＤＭＧＳｕｃｃを含むことを特徴とする、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記脂質相が、
（ａ）約１５モル％のＰＯＰＣ、約４５モル％のＤＯＰＥ、約２０モル％のＭｏＣｈｏｌおよび約２０モル％のＣＨＥＭＳ、
（ｂ）約１０モル％のＰＯＰＣ、約３０モル％のＤＯＰＥ、約３０モル％のＭｏＣｈｏｌおよび約３０モル％のＣＨＥＭＳ、
（ｃ）約１０モル％のＰＯＰＣ、約３０モル％のＤＯＰＥ、約２０モル％のＭｏＣｈｏｌおよび約４０モル％のＣＨＥＭＳ、または
（ｄ）約６モル％のＰＯＰＣ、約２４モル％のＤＯＰＥ、約４７モル％のＭｏＣｈｏｌおよび約２３モル％のＣＨＥＭＳ
を含有することを特徴とする、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記脂質相がＤＯＰＥおよびＰＯＰＣを含有することを特徴とする、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記脂質相がコレステロールをさらに含有することを特徴とする、請求項１４、請求項１５または請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記脂質相が３０モル％〜５０モル％のコレステロールを含有することを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記脂質相が約３０モル％のＰＯＰＣ、約１０モル％のＤＯＴＡＰ、約２０モル％のＣＨＥＭＳおよび約４０モル％のＣｈｏｌを含有することを特徴とする、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記脂質相が約６０モル％のＰＯＰＣ、約２０モル％のＨｉｓｔＣｈｏｌおよび約２０モル％のＣｈｏｌを含有することを特徴とする、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記組成物が担体をさらに含有し、かつ全身送達のために調合される、請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記組成物が担体をさらに含有し、かつ局所投与のために調合される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記リポソームが５０〜１０００ｎｍの範囲内の大きさを有することを特徴とする、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記オリゴヌクレオチドが１５〜５０塩基対の長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記オリゴヌクレオチドが、ホスホチオエート結合、２’ＭＯＥ修飾核酸塩基、ＬＮＡ核酸塩基、ＦＡＮＡ核酸塩基または天然のリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記オリゴヌクレオチドが１５〜５０塩基対の長さのｓｉＲＮＡであることを特徴とする、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記オリゴヌクレオチドが前記ヒトＣＤ４０遺伝子を標的にすることを特徴とする、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
ヒトもしくは非ヒト動物の炎症性、免疫または自己免疫疾患の予防あるいは治療のための、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３９】
移植片拒絶、対宿主移植片病、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、喘息、炎症性腸疾患、乾癬または甲状腺炎の予防あるいは治療のための、請求項３１に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４０】
移植片拒絶、対宿主移植片病、炎症性腸疾患、クローン病および潰瘍性大腸炎の予防あるいは治療のための、請求項３２に記載の医薬組成物の使用。
【図１】
【図２Ａ−Ｄ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２Ａ−Ｄ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２００８−５１８９９８（Ｐ２００８−５１８９９８Ａ）
【公表日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３９５４８（Ｐ２００７−５３９５４８）
【出願日】平成１７年１１月４日（２００５．１１．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１１９０５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４８３２９
【国際公開日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【出願人】（５０３３００３０６）ノヴォソム アクチェンゲゼルシャフト (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月４日（２００５．１１．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１１９０５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４８３２９
【国際公開日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【出願人】（５０３３００３０６）ノヴォソム アクチェンゲゼルシャフト (8)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]