液体成分を分離する方法及び装置
【課題】身体組織を再生するための製剤の製造方法およびその製剤の提供。
【解決手段】血液を患者から吸引すること、血液から血漿を分離すること、およびこの血漿にカルシウム凝固活性剤を接触させること、そして同時的に凝固および軸方向に遠心分離して固体フィブリン網を形成することによる、固体フィブリン網または自己由来のフィブリングルーの製造方法であり、この固体フィブリン網または自己由来のフィブリングルーは身体組織の再生に使用できる。
【解決手段】血液を患者から吸引すること、血液から血漿を分離すること、およびこの血漿にカルシウム凝固活性剤を接触させること、そして同時的に凝固および軸方向に遠心分離して固体フィブリン網を形成することによる、固体フィブリン網または自己由来のフィブリングルーの製造方法であり、この固体フィブリン網または自己由来のフィブリングルーは身体組織の再生に使用できる。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００２年６月２７日付けで出願された、米国仮出願第６０／３９２，６６９号に基づき、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）による優先権を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、固体フィブリン網又は自己由来フィブリングルーを製造するシステム、キットおよび方法に関する。
フィブリングルーは、主として、局所的外科用接着剤又は止血剤として使用される血液誘導物として知られる。異種起源のフィブリングルーを得るため、トロンビン又はバトロキソビンのようなヒト又は動物由来のタンパク質活性剤と関連して、ドナーからの濃縮されたフィブリノーゲンを含有する幾つかのキットが市場にて入手可能である。
【０００３】
そのような既知のキットは、ヒト又は動物由来の材料を使用することを伴い、その由来のため、フィブリングルーの受け手に対し、ウィルス汚染および重篤なリスクを生じる可能性がある。過去、管轄当局は、ヒト又は動物由来の材料を使用して得られた血液誘導物の取引の中止又は禁止さえも余儀なくされていた。更に、ヒト又は動物のタンパク質を使用して生産されたフィブリンを再移植することに起因する、患者における拒絶症例が文献から知られている。そのような症例は、実に、再移植されたシーラントタンパク質又はその製造に使用される成分の幾つかが、受け手生物体に対し異質起源の由来であることに起因する。
【０００４】
自己由来のフィブリングルー、すなわち患者自身の血液から自己由来的に得られたフィブリングルーは、拒絶及び／又は感染リスクに対しより信頼性が高い。即席の自己由来のフィブリングルーを得るための幾つかの方法は既に記述されているが、「直ちに使用可能な」キットは、特許文献にて幾つかの関連参照文献を見出すことができるにも関わらず、市場にて入手可能でない。
【０００５】
米国特許第５，７３３，５４５号は、血漿−軟膜濃縮物とフィブリノーゲン活性剤とを組み合わせ、血小板グルーによる傷口シーラントを形成することを開示する。本特許に開示された方法では、自己由来のフィブリングルーを得るため患者の血液を処理することを許容するが、本方法は、フィブリノーゲン活性剤としてトロンビン又はバトロキソビンを使用する。これらの活性剤は、ヒト又は動物性のものであり、このため、依然として、患者に対する拒絶及び／又はウィルス感染のリスクを伴う。
【０００６】
米国特許第５，５５５，００７号は、組織シーラントとして使用する濃縮血漿を作製するための方法及び器具を開示する。該方法は、血漿を全血から分離すること、および濃縮剤と接触させることにより水を該血漿から除去して濃縮した血漿を提供することから成り、この濃縮した血漿は、その後、トロンビン及びカルシウムを含有する溶液により凝固させることができる。該器具は、第一のチャンバ内の第一の遠心分離機、第一のチャンバと連通する第二のチャンバ内に包含される濃縮剤（例えば、デキストラノマー（ｄｅｘｔｒａｎｏｍｅｒ）又はポリアクリルアミド）、および第二の分離機を含む。本参考文献に開示された方法は、自己由来のフィブリングルーをその後に製造するのに必要な血漿濃縮物を得るため長時間を必要とし、また、器具は高価であり且つ、使い捨て型ではない。この方法は、カルシウム凝固活性剤の使用については開示せず、また、事前の濃縮ステップを必要とする。
【０００７】
多くの方法及びシステムは、流体を１つの容器から別の容器に移すことを必要とする。例えば、多くの化学的及び医療用装置は、色々な試薬及び特定体積のアリコートと逐次反応する必須体積の液体を移すことを必要とする。一般的な方法は、２つの容器の蓋を外し、１つの容器の液体を別の容器にピペットで移すことである。しかし、この方法では、試料を環境的汚染に曝露することになる。例えば、この技術は、血液試料中の赤血球細胞から分離した血漿を移すために使用される。しかし、界面メニスカスにて血漿を除去するため特殊な技術が必要とされる。しばしば、高密度の望ましくない下部分画の赤血球細胞が吸引試料を汚染する。この問題点を回避するため、ピペットは、しばしばメニスカス（すなわち、血漿と赤血球細胞との間の分離体）から安全な距離に保たれ、このため、試料の移しが不完全となる。望ましい分画の移しが不完全である結果、容積収率は最適なものより低くなり、また、試料試薬と第二の容器内の試薬の比が化学量論値でなくなる。この第二の状態は、製品の性能が変動する重大な原因となる可能性がある。これは、特定の化学量論比のとき反応率が最大となり、より大きい比又は小さい比のとき急激に減少するような、多くの酵素反応におけるケースである。
【０００８】
医療において、特に、慢性的潰瘍、ろう孔等の場合、傷口の手当ては最も重要な事項の一つである。この事項は、管理コストが高いのみならず、成功率が低いことからも重要である。傷口の手当て及び火傷の手当てに関連したその他の問題点には、液体の損失及び感染症が生じる可能性が包含される。再骨化の過程において、骨キャビティを軟組織から分離するため、合成膜又は動物由来膜が使用されている。
【０００９】
傷口を手当てする１つの処置は、例えば、コラーゲン、フィブリン、アルブミンのような、動物由来の生物組織又はスポンジ（一般に、タンパク質ベース）を傷口箇所に当てがうことを含み得る。しかし、こうした適用は、一般的にアレルギー及び免疫学的応答を伴う。これら症例の５０％は、１回の適用では解決しない。２０％以上は、２回の適用後も解決しないことがある。
【００１０】
別の処置は、最も困難な症例に対して行われる皮膚移植を含む。しかし、皮膚移植は費用がかかり、１回の適用に約６００〜７００ドルかかり得る。改変を加えた馬コラーゲンメッシュを、新しい自己由来組織を支持するために使用する。この適用は、試料を汚染する可能性とともに、面積に関係して、皮膚組織の培養に２０日までもかかる難しいプロセスである。
【００１１】
全体として、生きた生物内で組織を再生することのできる、自己由来のフィブリングルー又は固体フィブリンを製造する方法及びシステムが望まれる。
【発明の開示】
【００１２】
本発明の１つの実施形態について詳細に説明する前に、本発明は、以下の説明に記載し又は図面に示した構成要素の構造及び配置の詳細にのみその適用が限定されるものではないことを理解すべきである。本発明は、その他の実施形態が可能であり、また、多様な方法にて具体化し又は実施することができる。また、本明細書にて使用した表現及び専門用語は、説明の目的のためであり、限定するものであると見なすべきではないことが理解される。
【００１３】
発明の詳細な説明
本出願は、２００２年４月９日付けにて発行された、米国特許第６，３６８，２９８号の主題を引用することにより組み入れる。本出願は、また、２００２年１月１５日付けにて出願された、米国特許出願第１０／０５３，２４７号、及び２００２年６月２７日付けにて出願された、米国特許出願第６０／３９２，６６９号の主題を引用することにより組み入れる。
【００１４】
本発明は、外科手術にて使用したとき、ウィルス感染及び／又は拒絶症例を少なくとも部分的に緩和し、自己由来のフィブリングルーを迅速に得ることを許容する、直ちに使用可能なキットを提供することができる。
【００１５】
これは、ヒト又は動物何れの由来でもなく、無機化合物であり、このため、感染せず且つ拒絶反応を生じない凝固活性剤を使用することにより実現することができる。
本発明による「直ちに使用可能な」キットは、凝固活性剤として塩化カルシウムを含有する密封した容器を含み得る。塩化カルシウムは、患者の血漿が密封した容器内に導入されたとき、患者の血漿中に存在するフィブリノーゲンを活性化する。
【００１６】
本発明によるシステム及びキットは、ウィルス感染又は拒絶症例のリスクを伴わずに使用し得る自己由来のフィブリングルーの製造を許容するという非常に有利な効果がある。本発明によるキットは、また、極めて短時間に、並びに凝血塊若しくは膜を形成する間又は噴霧の間に、自己由来のフィブリングルーを患者の血漿から製造することも許容し得る。本発明による直ちに使用可能なキットは、また、自己由来のフィブリングルーを既知のシステムと比べてより低コストにて得ることも許容し得る。また、この直ちに使用可能なキットは、迅速な組織再生のための血小板及びその関連した成長因子を提供し得る。
【００１７】
本発明によるキットの更なる有利な効果は、その幾つかの実施形態に関する以下の詳細な説明から当該技術分野の当業者に明らかになるであろう。
本発明によるキットに適した容器は、実施例１にて以下に説明するように、抗生物質用のガラス容器を包含する。ガラス又はプラスチック製の試験管もまた使用し得る。容器の好ましい容積は、５〜１５ｍｌである。試験管は、好ましくは直径１２〜１６ｍｍの範囲及び高さ７５〜１００ｍｍの範囲である。容器は、容器が排気されたとき、その内側空間と大気との間の圧力差に起因する圧力に耐え得るよう適切な厚さでなければならない。好ましくは、底が半球状又は円錐形の試験管は厚さ０．７ｍｍ、底が平坦な試験管は厚さ１ｍｍである。プラスチック製容器は、生産後少なくとも１２ヶ月真空圧を保つことを保証し得るよう、好ましくは０．２〜０．８ｍｍ厚の透明なポリエステル樹脂製である。製造後、プラスチック製試験管は、使用日まで完全な気密性を保証するため、好ましくは熱密封した内側ポリエチレン層を有する錫箔真空気密容器内に入れる。
【００１８】
容器又は試験管を排気することが得策であるが、本発明を具体化するのに必須ではないことを理解すべきである。
容器又は試験管は、容器が完全に気密であることを保証するため、並びに化学成分を導入した後及び蒸気又は放射線滅菌処理ステップの前に真空栓をすることを許容するために適した、ゴム又はシリコーンの穿刺可能なキャップにより密封し得る。
【００１９】
密封後、容器を、３０分間、１２１℃の蒸気にて滅菌処理し得る。滅菌処理は、ガンマ線又は電子ビームの照射によっても行い得る。
フィブリン安定剤であるトラネキサム酸を使用することができるが、純粋な結晶性ε−アミノカプロン酸もまた適する。２０ｍｌの血漿の量に適した２５ｍｌの容器を使用するとき、その量は、約１ｇである。フィブリン安定剤を使用する必要がない場合もある。フィブリン及び血小板のネットワークに包含させるために、性能を向上させるその他の治癒剤を第二の容器に追加し得る。その例として、非限定的に、骨及び軟組織移植片、足場材料、抗生物質、鎮痛剤、幹細胞、癌治癒用の化学毒性剤、免疫抑制剤、所望の分子を発現するよう設計した細胞、及びそれらの組み合わせを包含する。
【００２０】
凝固活性剤として、固体ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ又はカルシウムを含有する液体溶液を本発明によるキットにて使用し得るが、他の凝固活性剤（以下に列記）を使用することもで
きる。例えば、精密薬量計（最大誤差：１〜２ｍｇ）を使用して、１１．７６ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを５ｍｌの容器内に導入し、汚染外部成分が導入されるのを防止することができる。これと代替的に、例えばマグネシウム、マンガン又は亜鉛イオンのような他のカチオン種であって、抗凝固剤に対し内因性カルシウムよりも大きな親和力を有するものを、二価カルシウムカチオン類に代えて使用することができる。抗凝固多血小板血漿（ＰＲＰ）を添加したとき、内因性カルシウムイオン類は、より大きい親和力のカチオン種によって抗凝固剤から置き換えられ、当初の内因性カルシウムイオン類は、凝血活性化のため利用可能になる。
【００２１】
血漿量１２ｍｌに対する１５ｍｌの容器の場合、導入すべき固体無水塩化カルシウム量は３５．２８ｍｇであり、一方トラネキサム酸量は、これに対して３００ｍｇもの結晶となろう。
【００２２】
血漿量２０ｍｌに対する２５ｍｌの容器の場合、導入すべき無水塩化カルシウム量は、５８．８ｍｇであり、一方トラネキサム酸量は、これに対して５００ｍｇもの結晶となろう。
【００２３】
塩化カルシウムは、実施例に使用される無水の形態のほか、例えば、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏのような市場にて入手可能な任意のその他の適した形態とし得る。また、以下の実施例１に説明するように、この塩の溶液を使用することもできる。
【００２４】
本発明はまた、生きた生物にて組織を再生させることのできる固体フィブリン網又は自己由来グルーを形成するシステム及び方法を提供する。これらの方法及びシステムにおいて、血液試料を遠心分離することにより抗凝固血漿が得られる。本明細書に記載した移し装置は、安定的で濃密な自己由来フィブリン及び血小板ネットワークを得る目的で、カルシウム凝血剤を含有する第二の容器に血漿を移し、次いで直ちに遠心分離することを可能にする。本明細書に記載した移し装置は、また、他の用途にて他の液体を移すために使用し得る。換言すれば、本明細書に記載した方法、移し装置及びシステムは、同時的な遠心分離及び凝固を可能にする。これらのシステム及び方法を使用することにより、次の：１）滅菌状態が維持されるような仕方にて試料を操作すること；２）血漿の全量を移して凝血塊の全収率を最大にすること；３）凝血時間を最小にするよう、抗凝固剤とカルシウム凝血剤との化学量論値の比が狭い範囲に維持されること；４）移しが、迅速に完了し、血小板由来成長因子の半減期内で有効なうちに行うことができること；５）通常こうした作業を行わないヘルスケア提供者（例えば、歯科医）が、容易にこれらの方法を行い、システムを作動させることができること；６）装置は、再使用及び血液中に含まれる病原体による汚染の可能性を防止し得るよう単回使用型であること、のうち少なくとも１つを実現することができる。
【００２５】
一般的に述べるならば、本発明は、生きた生物にて組織を再生させるために使用することができる固体フィブリン網又は自己由来グルーを製造するための統合システム及び方法を提供する。ある実施形態（図１に図示）において、システムは、一次容器１０、二次容器１４、及び移し装置１８を備える。好ましくは、一次容器１０及び二次容器１４は管であり、より特定すれば、試験管であるが、流体又は液体を保持することができ且つ、遠心分離可能である任意の容器が本発明の使用に適する。好ましくは、容器１０、１４は、ガラス又はプラスチックで出来ている。
【００２６】
一次容器１０は、標準的な静脈穿刺技術を使用してその内部に血液を吸引し得るものでなければならない。好ましくは、該一次容器１０は、血液が吸引される間、汚染を防止するためシール２２にて密封されるが、容器１０を、その直後に密封してもよい。例えば、ゴムストッパ、キャップ、発泡材、エラストマー又はその他の複合材のような、多様なシ
ール２２を使用して一次容器１０を密封することができる。シール２２は、突き刺せる又は穴を開けられるものでなければならず、このため、ゴム及びシリコーンがシールを作る好ましい材料であるが、シールを提供し且つ、突き刺し可能な任意の材料を使用することができる。一次容器１０は、抗凝固溶液２５を含有し得る。溶液中の抗凝固剤２５は、好ましくは、カルシウム結合剤を含む。より特定すれば、抗凝固剤２５は、クエン酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩、エチレンジアミン四酢酸二カリウム塩及び三カリウム並びにそれらの組み合わせを含み得る。好ましくは、一次容器１０は、クエン酸ナトリウム溶液を含有する。抗凝固剤２５は、該血液を遠心分離の状態に置く目的で、一次容器１０内に採取された血液を薄める傾向にある。更に、一次容器は、密度勾配分離媒体２６、空気２７、並びに高粘度低密度流体２８を包含する（以下に更に説明するキットを示す、図１０を参照）。
【００２７】
密度勾配分離媒体２６は、異なる密度を有する、一次容器１０内の特定の液体又は流体の異なる分画を分離し得るものでなければならない。分離媒体２６は、液体の濃密な望ましくない分画を遠心分離により分離し、その後、除去することを許容する。例えば、分離媒体２６は、血液試料を遠心分離する間に、赤血球細胞３０を多血小板血漿３４から分離し得る。一例において、分離媒体２６は、一次容器１０の底部に見られ得る。他の例において、分離媒体２６は、一次容器１０の内部の周りにリングとして又は他の任意の適した内側の位置に取り付け得る。遠心分離する間、異なる密度を有する液体を分離可能である任意の密度勾配分離媒体２６が本発明と共に使用するのに適しているが、好ましくは、媒体２６はゲルであり、より好ましくは、チキソトロピックゲルである。図２は、血液試料の遠心分離後の一次容器１０を示し、また、ゲル分離媒体２６も示す。好ましくは、チキソトロピックゲルは、該ゲルが通常の周囲状態にて一次容器１０内で流れ又は容器１０の周りで動くことはないが、遠心分離間に遭遇するより大きい遠心分離力にて流れるのに充分な降伏点を有する。最も好ましくは、不要な赤血球細胞の分画３０の高い密度よりも小さいが、望ましい血漿分画３４の密度よりも大きい密度を有するゲルであることが好ましい。換言すれば、血液試料を遠心分離後、赤血球細胞３０を血漿３４から分離することのできるゲル又は他の媒体が最も好ましい。かかる媒体２６は、遠心分離の間容器内にて動き又は流れるが、その後は流れず、これにより遠心分離が完了したとき、分離した分画の間に半恒久的な障壁を形成する。
【００２８】
図３に示すように、一次容器１０内で採用可能な他の適切な密度勾配分離媒体２６は、分画を分離するのに望ましい密度を保持する複数のプラスチックビーズ２６である。該ビーズは、その後に移し装置３８を密封するため必要とされる高粘度、低密度の流体中に懸濁させ得る。遠心分離の間、ビーズ２６は、２つの分画３０、３４の間の境界部に移行し、焼結（ｓｉｎｔｅｒｉｎｇ）と極めて類似する状態にて密集化し、異なる密度を有する分画（すなわち赤血球細胞３０及び血漿３４）の間に安定な障壁を形成する。ペレットを被覆する残留高粘度低密度流体は、密集化した層の安定化に寄与する。
【００２９】
その他の適切な密度勾配分離媒体は、引用することにより本明細書中に組み入れる、コールマン（Ｃｏｌｅｍａｎ）に対して発行された米国特許第５，５６０，８３０号及び米国特許第５，７３６，０３３号に開示されたもののような重合系フロート装置を含む。図４は、重合系フロート装置２６を示す。
【００３０】
一次容器内の低粘度高密度の混和しない流体２８（「ＬＤＨＶ流体」）は、一般的に不活性油を含む。最も好ましくは、ＬＤＨＶ流体は、ポリエステル、シリコーン又は他の不活性流体を含み、置換又は圧力ポンプにより一次容器のゲルの上方の位置に供給される。ＬＤＨＶ流体は、以下に更に説明するように、その内部に入ったとき、移し装置１８のカニューレ３８を通る流れをブロックし又は除去することができなければならない。
【００３１】
二次容器１４（図１及び図１０にとりわけ図示）は、特定の反応に必要な化学試薬を含有する。二次容器１４は、一次容器１０の場合と同様の仕方にて、すなわち、ゴムストッパ、キャップ、発泡材、エラストマー又は他の複合材により、シール２４にて密封される。以下に説明する本発明の１つの適用例において、二次管は、カルシウム凝固活性剤３６を含有し得る。適切なカルシウム凝固活性剤の例は、非限定的に、塩化カルシウム、フッ化カルシウム、炭酸カルシウム及びそれらの組み合わせを包含するが、カルシウムを含む任意の塩であればカルシウム凝固活性剤として充分であろう。更に、その他の活性剤は、グルコン酸カルシウム、フマル酸カルシウム、ピルビン酸カルシウム及び水に溶解し、ヒトと適合する他の有機カルシウム塩を包含する。凝固活性剤は、該活性剤が血漿と接触したとき、血漿を凝固させる。二次容器１４は、内部圧力が実質的にゼロとなるように完全に排気することができる。二次容器１４を排気すると、流体を一次容器１０から移し装置１８を通じて二次容器１４に移すことが容易になる。二次容器１４は、移す間充填される際、気体分子が全く存在しないから、残留する気体が圧縮され圧力が上昇することはない。その結果、流量は最大となり、完全な移しが促進され、排気が不要になることで滅菌性が維持され、また、望ましい反応に対する望ましい化学量論値の比が維持される。
【００３２】
別の実施形態において、二次容器は、また、抗生物質、鎮痛剤、癌治癒剤、血小板成長因子、骨形成タンパク質、幹細胞、骨移植片材料、軟組織移植片及び細胞培養材料、免疫抑制剤及びそれらの組み合わせのような１つ又はそれ以上の治癒増進剤を含有し得る。局所的に投与できる他の治療剤もまた、包含し得る。抗生物質の例は、非限定的に、アンピシリン、エリスロマイシン、トブラマイシン及びそれらの組み合わせを包含する。鎮痛剤は、非限定的に、アスピリン、コデイン及びそれらの組み合わせを包含する。癌治癒剤は、非限定的に、５−フルオロウラシルを包含する。骨移植片材料は、非限定的に、自己由来骨、死体からの同種異系移植片（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）又は同種移植片（ｈｏｍｏｇｒａｆｔ）、動物由来骨（異質移植片（ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ）又は異種移植片（ｈｅｔｅｒｏｇｒａｆｔ）；例えば、羊、ウシ、豚、馬）、合成骨移植片（リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、硫酸カルシウムセラミック）、正生物性（ｏｒｔｈｏｂｉｏｌｏｇｉｃ）化合物（血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ））、骨形成因子（ＢＭＰ）、組み換えヒト骨形成因子（ｒｈＢＭＰ）、及びそれらの組み合わせを包含する。軟組織移植片及び細胞培養材料は、非限定的に、皮膚、皮膚移植片材料（オルガノジェネシス（Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）が販売するアプリグラフ（Ａｐｌｉｇｒａｆ））、歯肉移植片（例えば、柔軟なパレット（ｐａｌｅｔｔｅ）からのもの）、コラーゲン、生物吸収性移植片、脈管移植片、ＰＤＧＦ、血小板因子４（ＰＦ４）、トロンボグロブリン、トロンボスポンジン、デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）社のテフロン（ＴＥＦＬＯＮ）（登録商標名）及びダクロン（ＤＡＣＲＯＮ）（登録商標名）及びそれらの組み合わせを包含する。免疫抑制剤は、非限定的に、臓器移植用の免疫抑制剤（例えば、コルチコステロイド、カルシン（ｃａｌｃｉｎ）ノイリンブロッカー（サイクロスポリン、タクロリムス、ＳＫ５０６）、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン）及び皮膚免疫抑制剤（セロリムス（ｓｅｒｏｌｉｍｕｓ）、スピンゴシン（ｓｐｉｎｇｏｓｉｎｅ）１−リン酸レセプターアゴニスト（ＳＴＹ７２０））を包含する。望ましい分子の発現及び遺伝子治療用の生きた細胞も包含し得る。
【００３３】
移し装置１８は、例えば、図１に示すような２つの部分を含むことができ、又は、これと代替的に、例えば、図１７及び図１８に示すような単一部分とし得る。図５及び図６並びに図１７及び図１８に最も良く示すように、移し装置１８は、第一の開口部４６を有する第一の端部４２と、第二の開口部５４を有する第二の端部５０とを有するカニューレ３８を含む。カニューレ３８の端部４２、５０は、一次容器１０及び二次容器１４のシール２２、２４に穴を開け又は該シールを貫通し得るように鋭角又は尖ったものである（または、これら端部に斜角面をも有する）。容器を操作する間、指が偶発的に付着するのを防止する目的で、カニューレ３８を、ハウジング５８に引っ込ませ且つ、同軸状に取り付け
る。ハウジング５８は、カニューレ３８に対し中央方向及び軸方向に向き決めされた２つの円筒状の対向した案内部６２、６４を有する。案内部６２及び６４は、一次容器１０及び二次容器１４を、移し装置１８の第一の端部４２及び第二の端部５０まで案内する機能を果たす。図５及び図６は、容器１０、１４を第一の端部４２及び第二の端部５０まで案内する案内部６２、６４を示す。
【００３４】
カニューレ３８の端部４２、５０は、密閉シールを形成する安全弁、鞘又はエラストマー性スリーブ６８、７２にて取り囲み又は覆い得る。安全鞘６８、７２は、また、第一及び第二の開口部４６、５４を覆う。第一及び第二の端部４２、５０がエラストマー性スリーブ６８、７２に穴を開けると、これに応じて、スリーブ６８、７２は引っ込む。図５は、第一の端部４２が一次容器１０のシール２２に穴を開け始め、これに応じてスリーブ６８が後退し、一方、スリーブ７２は依然として第二の端部５０を完全に覆う状態を示す。端部４２、５０は充分に伸びてシール２２、２４に完全に穴を開けるが、更に容器１０、１４内に伸びることはない（図６に示すように）。このことは、逆さの一次容器１０の液体容積を二次容器１４に最大量移すことを許容する。図６はまた、第一及び第二の端部４２、５０が第一及び第二の容器１０、１４のシール２２、２４に完全に穴を開け、また、スリーブ６８、７２の双方が完全に後退した状態を示す。エラストマー性スリーブ６８、７２は、穴が開いていないときの気体又は液体の流れを阻止する。スリーブ６８、７２の適切な材料は、非限定的に、多様なゴム類及び熱可塑性エラストマー類を包含する。
【００３５】
第一の実施形態の操作について説明すると、血液が標準的な静脈穿刺技術を使用して一次容器１０内に吸引されたならば、血液は、その内部の抗凝固剤２５によって抗凝固化される。典型的には、一次容器１０は、血液が吸引される間密封されているが、その後に該一次容器を密封してもよい。一次容器１０を密封することは、その内容物の汚染を防止する。その後、一次容器及びその内容物１０（例えば、血液、抗凝固剤２５、分離媒体２６及びＬＤＨＶ流体２８）を遠心分離する。許容可能な遠心分離は、５〜１５分間、９００〜３，５００ｘＧの重力にて行うことができる。好ましい実施形態において、一次容器を、約１０分間、約１，０００ｘＧの重力にて遠心分離する。この最初の遠心分離は、一次容器の内容物又は分画を、例えば、図２に示すような、複数の層に分離する。該層は、（遠心分離後の、一次容器１０の底部から容器の頂部への順序にて）、赤血球細胞層３０、分離媒体２６、多血小板血漿層３４、ＬＤＨＶ流体層２８及び最後に残留気体２７の容積を大気と等しい圧力で包含する。これらの層の比率は、用途毎に様々であり得るため、単に説明の目的にのみこれら比率を示してある。遠心分離に次いで、移し装置１８を使用してシール２２に穴を開ける前に、密封した一次ホルダ１０を逆さにする。換言すれば、図７に示すように、密封された開口部が最下方の垂直位置となるよう一次容器１０を逆さにする。一次容器を逆さにすると層が配置される順序が変わる。シール２２の上方には、底部から頂部への順序にて次の層：多血小板血漿３４、高粘度低密度の混和しない流体２８、残留気体２７、分離媒体２６及び赤血球細胞３０がある。
【００３６】
次に、図８に最も良く示すように、二次容器１４をその密封した開口部２４が最上方の位置にある状態に垂直位置に配置する。これにより、二次容器１４が一次ホルダの内容物を移し得るように配置される。図８は、移すための適正の位置である、二次容器１４の上方にある移し装置１８の上方の逆さの位置にある遠心分離後の一次容器１０を示す。次に、移し装置の案内部６４を二次容器１４の上方に配置して、その二次容器１４を案内する一方、逆さの一次容器１０を他方の案内部６２内に配置する（又は、その逆）。換言すれば、シール２２、２４のどちらに穴を開けるためにも、カニューレ３８の端部４２、５０のいずれもを使用できる。移し装置１８は両端にて対称であるから、ユーザは、ある程度の間違えようのない操作が可能となる。次に、ユーザは、容器を互いに押し付けて、シール２２、２４の双方に、それぞれのカニューレ端部４２、５０の各々で穴を開ける。端部４２、５０を覆う２つの弁スリーブ６８、７２は、更に操作を間違えようのないものにす
る。まず、第一の端部４２が一次シール２２に穴を開けるならば（この場合にも、どちらのシールに穴を開けるためもいずれの端を使用できる）、他端５０を覆う穴が開いていないスリーブ７２は流体を保持し、これにより、流体の流出を阻止する。一方、他端５０が他方のシール２４（従って、スリーブ７２）に最初に穴を開けるならば、第一の端部４２を覆うスリーブ６８により真空が維持される。
【００３７】
図６及び図９に示すように、端部４２、５０が双方のスリーブ６８、７２及びシール２２、２４に穴を開けると、望ましい流体は、差圧により一次容器１０から二次容器１４へ移される。換言すれば、二次容器１４内の圧力は排気されているから、一次容器１０の内容物（より特定すれば血漿３４）は、二次容器１４内に流れる。当初、周囲圧力に等しい一次容器１０内の圧力は、液体量が低下し、気体の容積が膨張するに伴って、降下する。しかし、圧力がゼロとなる時はない。二次容器１４は、ゼロ又はゼロよりも僅かに高い圧力に完全に排気されるから、管が充填されるとき、圧縮すべき気体は殆ど又は全くないため、その内部の圧力は上昇しない。従って、器具１８は、多様な液体及び溶液を１つの管から別の管へ移すために使用することができ、また、血液を移すことにのみ制限されると解釈されてはならない。
【００３８】
一次容器１０内での層の特定順序の配置により、多血小板血漿３４は容易に移される。更に、一次容器１０は、排気レベルに予め設定されるから、容器は、血液を採取した後、部分的にのみ充填する。このことは、移す間、気体の容積が膨張したとき、「上部空間」の気体が有意にゼロ以上に止まることを許容し、これにより、二次容器１４に迅速且つ完全に移すことを許容する。このことは、理想気体の法則及びポアズイユ−ハーゲンの方程式によるものである。
【００３９】
一次容器の内容物又は部分（すなわち多血小板血漿）の移しは、ＬＤＨＶ流体２８がカニューレ３８に入るまで続く。ＬＤＨＶ流体の高粘度は、カニューレ３８の狭小な管腔を詰まらせ、これにより流れは中断する。これにより、汚染された血液移し装置を除去しようとするとき特に重要な移し装置１８の再使用を妨げ、また、その前の使用もしくは別の患者における使用に伴う血液中の病原体による偶発的な汚染も防止する。
【００４０】
二次容器１４への血漿分画３４の移しが完了し、これにより最大の収率が許容され且つ、試薬の適正な化学量論比を保つことが許容される。次に、血漿３４が、二次容器１４内の凝固活性剤３６に接触し、これにより混合体６０を形成し、この混合体は直ちに遠心分離して固体フィブリン網を形成することができる。一次容器１０と二次容器１４との間の差圧は、移しの間ずっと実質的に維持され、迅速な移しを許容する。移し装置１８は、管がかみ合う順序の影響を受けず、装置を実質的に間違えようのないものにする。最後に、移しは排気なしに行われ、試料の滅菌性及び汚染の無い状態を維持する。
【００４１】
全体として、移し装置１８は、固体フィブリン網を形成する目的で、血漿３４をカルシウム凝固活性剤３６と接触させ、その直後、血漿の同時的な凝固及び遠心分離を行うことができる、迅速且つ効率的な方法を提供する。固体フィブリン網は、生きた生物にて身体組織を再生するのに適する。かかる方法は、血漿がカルシウム凝固活性剤３６と接触する前に、その水を除去することにより、まず血漿を前濃縮化する必要性を緩和する。更に、移し装置１８は、多様な用途で血液又は他の流体を移すために使用することができる。
【００４２】
本発明はまた、図１０に示すような直ちに使用可能なキットを提供する。該キットは、一次容器１０、二次容器１４、及び移し装置１８を含む。キットの１つの実施形態において、キットは、包装体に載せる２つのトレー７０、７４を有し得る。第一のトレー７０はステップ１に必要な構成要素の全てを有し、第二のトレー７４はステップ２に必要とされる全ての構成要素を有する。勿論、構成要素は、様々な仕様にて配置することができる。
【００４３】
ステップ１は、血液を一次容器１０に採取し、その後、遠心分離して多血小板血漿を得ることを含む。第一のトレー７０の構成要素は、静脈穿刺箇所を清浄にするアルコール綿棒７８、多数試料血液採取針８２（２１ゲージ×２５．４ｍｍ（１インチ））、安全ホルダ８６、抗凝固剤（例えば、クエン酸塩）を含有する一次容器１０、ゲル、ＬＤＨＶ流体、及び静脈穿刺箇所を覆う包帯９０を含む。静脈穿刺箇所を、滅菌アルコール綿棒７８にて清浄にする。針カートリッジ８４を開け、安全ホルダ８６内にねじ込む。次に、針８２を患者の静脈に挿入し、容器１０をホルダ８６に接続する。次いで、血液が容器に充填し、また、針８２は引き抜かれ且つ、ホルダ８６内に引っ込む。ホルダの端部はヒンジ止めフラップにより閉じられる。静脈を包帯９０にて閉じる。容器１０を約１０分間、約１０００ｘＧにて遠心分離し、血漿を赤血球細胞から分離する。
【００４４】
二次トレーの構成要素は、ステップ２にて使用する構成要素であり、ＡＦ管（自己由来フィブリン管）又は二次容器１４、及び移し装置１８を包含する。ステップ２は、一次容器１０を逆さの位置且つ、移し装置１８内に配置することを含む。二次容器１４は、凝固剤を含有し、移し装置の他端により穴が開けられる。容器１０、１４は、接続され、多血小板血漿は、一次容器１０から二次容器１４へ流れる。次に、二次容器を、直ちに約３０分間２３００ｘＧにて遠心分離し、血小板を有する濃密なフィブリン又は固体フィブリン網を得る。
【００４５】
本発明の第二の実施形態は、図１１〜図１４に示すような、固体フィブリン網を製造する別の統合システムを提供する。該システムは、第一の実施形態の一次容器１０と極めて類似した一次採取装置１０を含む。採取装置１０は、密度勾配細胞分離媒体２６（上述の通り）及び抗凝固剤（図示せず）、並びに、一次採取装置１０に接続若しくは統合できるリザーバ９４とを含有し得る。本発明の第一の実施形態に関して、より特定すれば、分離媒体２６に関して上述したことは、本発明の第二の実施形態にも当てはまる。換言すれば、分離媒体２６に対し同一の材料を使用でき、また、同一の材料が好ましい。例えば、最も好ましくは、分離媒体２６はチキソトロピックゲルを含み、該ゲルの降伏点は、該ゲルが通常の周囲状態にて流れるのを阻止するが、ゲルが遠心分離の間に遭遇するようなより大きい遠心分離力では流れることを許容する。分離媒体２６は、図１１に示すように、一次採取装置の底部（すなわち、開口部の他端）に配置し得る。これと代替的に、分離媒体は、一次採取装置の内部の周りにリングを形成し得る。該一次採取装置１０は、一次採取装置が高密度低粘度の流体を保持しなくてもよい点を除いて、上述した一次容器１０と本質的に同一である。好ましくは、一次採取装置１０は、ゴムストッパ又はキャップのような（上述したような）シール２２を有する。
【００４６】
リザーバ９４は、チャンバ９６、及び該チャンバと流体的に連通したカニューレ１００を含む。チャンバ９６は、液体試薬１０４、最も好ましくは、カルシウム凝固活性剤を含有する。好ましくは、カルシウム凝固活性剤は、塩化カルシウム、フッ化カルシウム、炭酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、フマル酸カルシウム、ピルビン酸カルシウム及びそれらの組み合わせである。カニューレ９６は、一次採取装置１０のシール２２に穴を開けることが可能でなければならない。ある好ましい実施形態において、カニューレは、周囲状態下、チャンバ９６内の試薬１０４がカニューレ１００から流れ出るのを阻止する降伏点のゲルのような、ブロッキング媒体１０８を含有する。他の適切なブロッキング媒体は、非限定的に、ばねつきボール、弁、ばね負荷式弁、穿刺可能な膜、及びアンプル（すなわち、流体又は粉体にて充填された中空の膜）のような力作動式の機械的システムを包含する。ゲル１０８の降伏点は、チャンバ９６と一次収集装置１０とが係合している場合、これらが連通することを許容するように、特に大きい重力にて遠心分離したときにゲル１０８が動くようなものとする。リザーバ９４は、また、リザーバを採取装置１０まで案内するために使用される案内ハウジング１１０を有し得る。カニューレ１００は、その滅
菌性を保つため、エラストマー性スリーブ１１２により取り囲まれ又は覆われ得る。スリーブ１１２については、第一の実施形態に関して上述した通りである。
【００４７】
他の実施形態において、チャンバ９６は、また、抗生物質、鎮痛剤、癌治癒剤、血小板成長因子、遺伝子治療用の骨形成タンパク質、追加的な使用のための幹細胞、及びその他のホルモン剤のうち１つ又はそれ以上を含有し得る。投与可能なその他の治癒剤もまた包含し得る。抗生物質の例は、非限定的に、アンピシリン、エリスロマイシン及びトブラマイシンを包含する。鎮痛剤は、非限定的に、アスピリン及びコデインを包含する。癌治癒剤は、非限定的に、５−フルオロウラシルを包含する。
【００４８】
実施時、患者の血液１１６を、上述した従来の静脈穿刺技術によって一次採取装置１０内に採取する。一次採取装置１０内の抗凝固剤は、遠心分離前に、血液を薄める。その後、図１３及び図１４に示すように、リザーバ９４のカニューレ１００を一次採取装置１０のシール２２を通じて穿刺することにより、リザーバ９４を一次採取装置１０に結びつける。カニューレ１００がシール２２を穿刺するとき、スリーブ１１２は後退する。カニューレ１００の長さは、シール２２に穴を開けるのに充分であるが、カニューレは、可能ではあっても、採取装置１０内に更に伸長しないことが好ましい。
【００４９】
次に、採取装置１０及びリザーバ９４を遠心分離する。管に加わる遠心力は、等式Ｆ＝ｍω２ｒにて表わされ、ここで；Ｆ＝力、ｍ＝システムの質量、ｒ＝ロータの中心からの半径方向距離、ω＝回転角度率である。リザーバは、一次管のゲルよりもｒが小さいため、発生するせん断応力が充分でないから、リザーバのカニューレ内のゲルは動けない。一次管１０を、細胞が分離し、ゲル２６が図１３に示すような細胞／血漿の境界に動くまで、低重力にて旋回する。換言すれば、第一の実施形態と同様に、約１０分間、約１０００ｘＧの最初の遠心分離後、分離媒体２６は赤血球細胞３０を多血小板血漿３４から分離する。最初の遠心分離には、約５〜１５分間、約９００〜１５００ｘＧの遠心力での遠心分離も許容可能である。
【００５０】
その後、遠心分離速度を増し、リザーバは充分に大きい遠心力を受け、このため、カニューレ１００内のブロッキング媒体１０８は、一次採取装置１０内に排出され、液体試薬１０８（例えば、カルシウム凝固活性剤）は、図１４に示すように、リザーバから排出される。その後、内容物を、約１５〜４０分間、約２３００〜６０００ｘＧにて遠心分離し得る。カルシウム凝固活性剤が一次採取装置内で血漿に接触する際、試料は依然として遠心分離されているから、即時的且つ同時的な凝固及び遠心分離が起こる。その結果、組織の再生に適した固体フィブリン網が形成される。一次管の細胞分離の実施及びその後の適正な化学量論値比における液体凝血剤の添加は、移しなしに、１つの管内で行われる。速度及び時間に関して遠心分離機をプログラムすることにより、本発明は、簡単で間違えようのない方法を提供する。
【００５１】
ある代替的な実施形態において、単一の採取装置１０は、図１５及び図１６に示すように、内側区画室１１９及びリザーバ９４を有する。リザーバ９４は、一次採取装置１０と統合又は接続し、該区画室と流体的に連通する。管、導管又は開口部１２０は、区画室１１９とリザーバ９４との間の流体的連通状態を提供し、ブロッキング媒体１０８にて密封される。この場合にも、ブロッキング媒体１０８は、上述したように、特に大きい重力に曝されたとき、活性化し、動いてリザーバ９４と一次採取装置１０との間の連通を許容する降伏点を有する。ゲル又は媒体の降伏点は、血液細胞を血漿から分離するための最初の遠心分離の間、動かないようなものである。第三の実施形態において、装置の各々の端部は開口部を有し、各々の端部は、ゴムストッパ、キャップ、発泡材、エラストマー又はその他の複合材のような取り外し可能又は取り外し不可能なシール２２、１２２により密封されている。ストッパ１２２を有するリザーバ９４は、採取装置のシール２２及び開口部
の他端に配置する。
【００５２】
別の実施形態において、リザーバ９４は、抗生物質、鎮痛剤、癌治癒剤、血小板成長因子及び骨形成タンパク質のうち１つ又はそれ以上を含有し得る。投与可能なその他の治癒剤もまた含有し得る。抗生物質の例は、非限定的に、アンピシリン、エリスロマイシン及びトブラマイシンを包含する。鎮痛剤は、非限定的に、アスピリン及びコデインを包含する。癌治癒剤は、非限定的に、５−フルオロウラシルを包含する。
【００５３】
第二の実施形態に関して上述したのと同一の方法にて、代替的な実施形態が使用される。すなわち、遠心分離装置が２つの異なる遠心力にて制御される：１）第一のものは、血漿を赤血球細胞から分離するのに充分な力であり；２）第二のものは、リザーバと装置との間の管、導管又は開口部１２０内のブロッキング媒体１０８を、主要本体内に動かすのに充分な力である。その結果、カルシウム凝固活性剤が装置の内部に入ることが許容される。このことは一方、遠心分離が第二のより大きい重力にて進行する際、固体フィブリン網を形成する目的で、血漿の同時的な遠心分離及び凝固を行うことを可能にする。固体フィブリン網又は自己由来グルーを得るために、シール１２２を取り外し得る。好ましい実施形態において、シール１２２は突き通して装着され、図１６に示すように装置１０からねじ抜きすることができる。
【００５４】
１つの側面において、本発明は、生きた生物にて組織を再生するのに適した自己由来固体フィブリン網を製造するシステムを提供する。該システムは、分離媒体及び低密度高粘度液体を含有する、密封した一次容器を含む。分離媒体は、容器が血液を含有し、遠心分離され、一次容器が第一の圧力を有するとき、赤血球細胞を血漿から分離することができる。該システムは更に、カルシウム凝固活性剤を含有する密封した第二の容器を含む。第二の容器は、第一の圧力より低い第二の圧力を有する。該システムはまた、第一の端部及び第二の端部を有するカニューレを包含する移し装置を含む。第一及び第二の端部は、第一の容器と第二の容器との間に流体的連通状態を提供する目的で、密封した一次及び二次容器に穴を開けることができる。一次容器の低密度高粘度液体は、カニューレ内に入ったとき、カニューレを通る流れをブロックすることができる。
【００５５】
別の側面において、本発明は、生きた生物で組織を再生することのできる固体フィブリン網を製造する別のシステムを提供する。該システムは、第一の圧力を有し、その中に吸引して血液を有することのできる、密封した一次容器を含む。該システムは更に、第二の圧力を有し、カルシウム凝固活性剤を含有する、密封した第二の容器を含む。第二の圧力は第一の圧力よりも低い。該システムはまた、第一の端部及び第二の端部を有するカニューレを包含する移し装置を含む。第一及び第二の端部は、密封した容器に穴を開けることができ、移し装置は、一次容器内に吸引された血液の部分を差圧によって第二の容器に移すことができる。該システムはまた、一次容器から移し装置を通じて二次容器に移された血液であって、生きた生物の組織を再生することのできる固体フィブリン網を形成する目的で、カルシウム凝固活性剤と接触させる血液の部分を、同時的に遠心分離及び凝固するための、遠心分離装置を包含する。
【００５６】
別の側面において、本発明は、生きた生物で身体組織を再生するための固体フィブリン網の製造方法を提供する。該方法は、血液を患者から一次容器内に吸引し、一次容器内で血漿を血液から分離することを含む。一次容器からの血漿を、血漿とカルシウム凝固活性剤とを接触させる目的で、第一の端部及び第二の端部を有するカニューレを含む移し装置を使用して、カルシウム凝固活性剤を含有する二次容器に移す。血漿及びカルシウム凝固活性剤を、固体−フィブリン網を形成する目的で、二次容器内で同時的に凝固及び遠心分離する。固体フィブリン網は、生きた生物で身体組織を再生するのに適する。
【００５７】
別の側面において、本発明は、生きた生物で組織を再生するのに適した固体フィブリン網を製造する別のシステムを提供する。該システムは、内部を有し、分離媒体を含有する密封した一次採取装置を含む。該一次採取装置は、血液を内部に吸引して有することができ、分離媒体は、一次採取装置が血液を含有し遠心分離されるとき、血漿を赤血球細胞から分離することができる。該システムは更に、チャンバと、該チャンバと流体的に連通した導管とを有するリザーバを含む。チャンバは内部にカルシウム凝固活性剤を有し、また、導管はブロッキング媒体にて少なくとも部分的に充填され、活性剤が周囲状態下にてチャンバ外に流れ出るのを防止する。
【００５８】
別の側面において、本発明は、生きた生物にて組織を再生することのできる固体フィブリン網を製造する別の方法を提供する。該方法は、シールを有する一次採取装置内に患者から血液を吸引すること、及びチャンバと、該チャンバと流体的に連通した導管とを有するリザーバを提供することを含む。該チャンバは、カルシウム凝固活性剤にて少なくとも部分的に充填されており、また、導管はブロッキング媒体にて少なくとも部分的に充填され、活性剤が周囲状態下にてチャンバから流れ出るのを阻止する。チャンバ、導管及び採取装置は、ブロッキング媒体がなければ流体的に連通するように、リザーバは一次採取装置に接続する。次に、一次採取装置を第一の速度にて遠心分離する。第一の速度は、血漿を血液から分離するのに充分であるが、導管内のブロッキング媒体を一次採取装置内に動かすのには充分でない。次に、一次採取装置を第二の速度にて遠心分離する。第二の速度は、ブロッキング媒体の少なくとも一部分を導管から一次採取装置内に動かすことを許容するのに充分であり、これによりカルシウム凝固活性剤が採取装置内に流れ血漿と接触することを許容し、これにより生きた生物の組織を再生するのに適した固体フィブリン網を形成する。
【００５９】
上述したシステムの殆どは、凝血塊を圧縮する目的の、第二の遠心分離の間、半径方向遠心分離（すなわち、管の軸線が遠心分離装置の軸線に対し垂直な位置の配置）を採る。しかし、これらのシステム及び装置が使用されるとき、遠心分離工程は、滅菌上の懸念のため、手術室内で行うことはできない場合がある。このため、別の側面において、本発明は、手術室内へ伸びる滅菌管外側部を提供し、標本を滅菌状態下にて採取し、その標本を手術室外に運び、その標本を遠心分離装置内で処理し、このようにして、手術室内に再度導入されるとき、管外側が滅菌状態にあることを保証する。
【００６０】
よって、上述した任意の２管システムと共に、一次及び二次管の双方は、除去容易なフィルム又はこれと代替的に、成形した運搬体にて包装し得る。図５２は、剥ぎ取り片を有するシュリンクラップ、又は剥ぎ取り容易な底部を有するギザギザ付き端部を有するシュリンクラップを包含し得るフィルムの設計を示す。図５２は、一次又は二次容器を手術室のような滅菌された場に導入することを許容する滅菌管運搬体を示す。該運搬体は、図５３に示すように、取り扱いの更なる水準に合うようシュリンクラップし得る。組立体は、放射線により滅菌処理し得る。組立体をその後手術室内で開け、管の内側及び外側は滅菌状態に保たれる。図５３は、運搬体の設計を示す。包装は、一般的に製造中、最小の厚さのものである。管及びラップの双方を放射線により滅菌処理することができ、内面及び外面の滅菌性を提供する。手術室内に入れる直前に、フィルム又は運搬体を一次管から除去し、滅菌した外側管が手術室に入るようにする。更に、フィルムの外面、包まれた管又は運搬体は、手術室内に導入する前に、当該技術分野にて既知の適当な化学物質を使用して汚染除去又は滅菌処理し得る。このことは、フィルム、包み又は運搬体を手術室内で開けることを許容し、これにより、製品の絶対的な滅菌性が保証される。血液を採取し、管を手術室から出し、遠心分離する。滅菌状態の血漿を、フィルム又は容器内にある間に、活性剤を有する第二の管に移し、遠心分離する。手術室に再度入る直前に、外側の包みを除去し、滅菌状態の製品が手術室に入る。この設計の改良点は、除去可能な接着フィルムを一次管のストッパに追加することであり、これにより、移す操作の間の、滅菌表面が許容
される。
【００６１】
更に、上述した１管システムの任意のものを使用するとき、管は、製造中予め組み立てた、フィルム又は運搬体を有し得る。組立体を密閉袋内に配置し、組立体を滅菌処理する。袋を、手術室に入る直前に開ける。その後、針が管のストッパ及びフィルムに穿刺し、血液を採取する。接着フィルムを管のストッパに追加することもできる。管は、手術室から出て、活性剤又は他の物質を有する液体リザーバを組立体に追加する。２段階遠心分離を行い、手術室に再導入する直前に、運搬体を除去する。
【００６２】
全体として、一次及び二次管の双方を、処理する間、滅菌性フィルム又は運搬体内に維持することができ、滅菌状態の外側部分と共に手術室内に再度導入することができる。フィルム又は運搬体を管に予め組み立て、その使用状態は、通常の血液採取管の採取及び遠心分離をするときに見える。フィルム又は運搬体は、気体及び水蒸気に対する透過障壁を提供することにより管の貯蔵寿命及び信頼性を向上させる材料、特に、プラスチック管に有用な材料にて製造することができる。
【００６３】
上記の説明は、濃密なフィブリン及び血小板ネットワーク、及び固体フィブリン網を同時的な遠心分離及び凝固により形成するために使用される多様な方法及び装置を確立する。これら装置及び方法の多くは、管の軸線が遠心分離装置の軸線に対し実質的に垂直の位置に配置し得る、半径方向遠心分離を採る。例えば、管は、遠心分離装置の半径に配置され、ストッパを中心付近に、及び管の底部を遠心分離装置の外端縁に向けて有し得る。上述した適用例の殆どにおいて、第二の遠心分離サイクル中に凝血塊が圧縮する。その結果、遠心力は、管の長さに沿って直線状に変化する。試薬の追加分を活性化するために遠心分離装置の相違する速度を使用することにより、遠心分離力の違いを有益に使用することができる。半径方向遠心分離装置は、商業的用途にて見られる最も一般的な型式であり、その順応性のある使用方法は、特に、その広範囲な利用可能性に着目するとき、製品の設計者にとって有益である。
【００６４】
固体フィブリン網又はフィブリン血小板ネットワークは、血漿、又はより特定すれば、多血小板血漿の、同時的な遠心分離及び凝固により形成された物質を意味し得る。上述したように、固体フィブリン網は、制限のない組織の再生用途にて使用可能である。血漿中のフィブリノーゲンは、フィブリンストランドに変換され、血小板の沈積と同時に沈積する。凝固カスケードの最終的なステップにおいて、フィブリンストランドは、ランダムな方向に架橋し、その結果、ゲル状のコンシステンシーとなる。極めて大きい遠心分離力が加わったならば、フィブリンは高強度の膜内に圧縮される。従って、膜は、より大きい遠心分離力又は重力（上述したような力）にて更に圧縮された固体フィブリン網を意味し得る。
【００６５】
しかしながら、半径方向遠心分離の一つの代替例は、軸方向遠心分離である。軸方向遠心分離を使用するとき、液体を保持する容器はその中心軸線上で回転する。換言すれば、容器は、要するに、ロータのように作動する。その結果、遠心分離装置内に重いロータは最早、不要である。軸方向遠心分離型容器は、一般的に、半径方向ロータよりも半径が小さくなり得るので、等価なｇ力を実現するために、より大きいｒｐｍを必要とする。例えば、遠心分離装置を１０，０００ｒｐｍまで旋回する代わりに、遠心分離装置を２００，０００ｒｐｍまで旋回し得る。必要とされるｒｐｍはより大きいが、重量が顕著に減少すれば安全上の危険が最小になり、モータのコストを不釣合いな程に低減する。換言すれば、ロータを取り除くことにより遠心分離装置の重量が著しく減少する結果、遠心分離装置を、より大きなｒｐｍにて旋回させ得る。
【００６６】
一般的に、遠心分離力は、半径にｒｐｍの２乗（ｒｐｍ２）を掛けた値に比例する。実
際、この方法により著しく大きいｇ力を得ることができる。極めて均一な遠心分離場の強さにて著しく大きい円筒面積が得られる。容器は一般的にロータであるから、軸方向遠心分離は、通常、バッチよりも、単一容器の作動を採用する。このため、細い管が使用され且つ、その軸線の周りで旋回する場合でさえ、膜は、管の外側の大部分以上を覆う。より特定すれば、覆われた円筒体の表面積は、約２πｒｌと定義することができ、ここで、ｒは円筒体の半径、ｌは円筒体の長さである。これに反して、半径方向遠心分離を使用するとき、表面積は、実質的に管の直径になるであろう。このため、半径方向遠心分離を使用すれば２πｒｌに等しい膜が製造され、一方、軸方向遠心分離ではπｒ２に等しい膜が製造される。
【００６７】
軸方向遠心分離の形態は、多様な仕方で実現し得る。例えば、異なるカートリッジを改変した既存のロータ内に配置し得る。これと代替的に、ロータを除去し、そこに使い捨て型カートリッジ又は容器を挿入してもよい。典型的には、軸方向遠心分離と共に使用するシステムは２つのチャンバ、すなわち血液が赤血球細胞と多血小板血漿とに分離される細胞分離チャンバ、及び多血小板血漿が凝固活性剤と接触し、同時的な遠心分離及び凝固が行われて膜を形成する高密度化チャンバを採用することになろう。この場合にも、膜は、多様な組織再生及び傷口のシーラントの用途にて使用することができる。
【００６８】
１つの実施形態において、例えば図１９及び図２０に示すように、滅菌性ドラムロータ使い捨て型カートリッジ２００が提供される。該カートリッジ２００は、例えば、多様なセラミック、ガラス及びプラスチックのような、多様な材料から形成し得る。特定しない限り、本発明にて形成される装置及びシステムは、多様なセラミック、プラスチック、ガラス又はその他の適切な材料から製造し得る。カートリッジ２００は、一般的に、遠心分離装置のドラムロータ内に装着し得るようにした円形の王冠の断面形状とすることができるが、以下に説明するように、ろ過装置により分離した２つのチャンバを有することに比して該形状は重要でない。断面の形状は、フィブリン多血小板膜を回収するためその後に除去することが出来るようなものとする。１つの実施形態において、カートリッジ２００は、中央壁２０８、側壁２１２、頂部壁及び底部壁２１６、２２０及びろ過装置２２４により輪郭が定められた内側チャンバ２０４を有する。内側チャンバ２０４は、上述した細胞分離チャンバとして作用する。頂部壁２１６は、穿刺可能な装填ポート２２８を有することができ、該装填ポートを通じて患者からの血液を内側チャンバ２０４内に導入又は注入し得る。ろ過装置２２４は、別個の量の全血を受け入れる、選択的な遠心分離可能（機械的に支持された）フィルタで出来たものとし得る。ろ過装置２２４は、非限定的に、ポリカーボネート、セルロース、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン又はテフロン（登録商標）を含む多様な材料にて形成し得る。フィルタは、約４〜９ミクロンの孔サイズを有し得る。内側チャンバ２０４は、例えば、１つ又はそれ以上の、半径方向遠心分離法及び装置に関して上記に説明した抗凝固剤のような、抗凝固剤２３２を含有し得る。抗凝固剤２３２は、内側チャンバ２０４に入る血液が凝血するのを防止する。
【００６９】
カートリッジ２００はまた、内側チャンバ２０４よりも一般的に小さい容積の外側チャンバ２３６を有している。外側チャンバ２３６又は周縁タンクは、図２０に示すように、ろ過装置２２４及び周壁２４０、並びに頂部壁及び底部壁２１６、２２０により輪郭が定められる。外側チャンバ２３６は、１つ又はそれ以上の、上述したカルシウム凝固活性剤のような、凝固活性剤２４４を包含し得る。外側チャンバ２３６は、高密度化チャンバとして作用し、ここで、多血小板血漿は凝固活性剤２４４により活性化する。これらの物質は、膜を形成するために同時的に遠心分離及び凝固が行われる。高密度化チャンバ２３６はまた、１つ又はそれ以上の二次活性剤２４８又は治癒増進剤を含有し得る。二次活性剤２４８は、非限定的に、１つ又はそれ以上の、抗生物質、鎮痛剤、癌治癒剤、血小板成長因子、骨形成タンパク質、遺伝子治療用の細胞、更なる用途用の幹細胞、その他のホルモン及びそれらの組み合わせを包含する。投与可能な他の治癒剤もまた包含し得る。抗生物
質の例は、非限定的に、アンピシリン、エリスロマイシン及びトブラマイシンを包含する。鎮痛剤は、非限定的に、アスピリン及びコデインを包含する。癌治癒剤は、非限定的に、５−フルオロウラシルを包含する。二次剤は、ここにおいて、更に、以下に、より特定して説明する、任意の高密度化チャンバに包含し得る。二次活性剤又は治癒増進剤については、上記により詳細に説明してある。
【００７０】
作用時、カートリッジ２００を遠心分離のためドラムロータ（図示せず）に挿入する。内側チャンバ２０４は、既に血液を含有していても、ドラムロータ内に挿入した後にポート２２８を通じて血液を注入してもよい。血液の内側チャンバ２０４内への注入は、標準的な静脈穿刺法を使用して行われる。換言すれば、内側チャンバ２０４を真空状態に保ち得る。血液の凝血を防止するため、内側チャンバ２０４内に抗凝固剤２３２を使用し得る。ポート２２８は内側チャンバ２０４の滅菌状態を維持し、閉システムを提供する。ドラムロータは、幾つかの異なるカートリッジを収容し得る。一般的に、カートリッジ２００の各々は、同様のカートリッジ又は釣合い重りをロータ内の反対側に配置することにより、ロータ内で釣合わせる必要がある。血液試料を遠心分離するとき、フィルタ２２４は、赤血球及び白血球細胞を内側チャンバ２０４内に保持するが、所定の時間、適正な遠心分離力の下で、血漿及び血小板が外部チャンバ２３６まで貫通して流れることを許容する。適正な遠心分離力は、１０００〜１５，０００ｘｇの範囲内であり、また、所定の時間は、５分以上であり得、より特定すれば、５分〜６０分又は５分〜３０分の範囲であり得る。多血小板血漿が二次チャンバ２３６内に入ったならば、カートリッジ内で、凝固活性剤２４４に接触する。
【００７１】
本実施形態及び以下の実施形態に関して説明するように、上述した任意の凝固活性剤２４４が使用に適する。活性剤２２４と接触したとき、血漿は同時的に遠心分離及び凝固され、これにより固体フィブリン網又は膜を形成する。ロータの混合動作を提供することは、凝固プロセスを開始するために血漿及び活性剤２４４を完全に混合するのに役立つ。混合後、ロータを、１０分以上、より特定すれば約２０分以上、約３０００〜１５０００ｘｇにて旋回させて、第二のチャンバ２３６の周壁２４０に白血球抵抗性（ｗｈｉｔｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）のフィブリン多血小板膜を得ることができる。使用すべく膜を取り出す目的で、膜をカートリッジ２００から引き出すため、装置は、２つの部分に壊し又は開けることができる。これと代替的に、そこから膜を得ることができるように壁の一方が取り外し可能な部分又はその他のアクセス領域を有し得る。膜をカートリッジから除去するその他の方法は、膜を巻く及び折り畳むことを包含する。衛生上の目的のため、カートリッジ２００は使い捨て型とし得る。膜は、非限定的に、傷口の手当て及び火傷の手当てを含む、多様な用途を有する。より一般的には、膜は限定されない数の組織再生の用途にて使用し得る。
【００７２】
大型軸方向旋回として知られる本発明の他の実施形態において、例えば、非限定的に、直径１０００ｍｍまでの膜のような膜を得ることができる。図２１〜図２５は、この実施形態を示す。膜のサイズはロータのサイズに依存する。従って、膜のサイズは、どのロータが商業的に利用可能であるかに依存する。本実施形態において、半径方向遠心分離及び装置に関して上記に説明した一次及び二次遠心分離装置の作動の双方は、１つの軸方向旋回容器内で行われる。二次チャンバは、大きい面積の、多数の別個面積の膜を与え得るように仕切ることができる。この仕切りについては、以下により詳細に説明する。
【００７３】
このシステムは、遠心分離装置（図示せず）及びその内部に挿入することが出来る図２１〜図２５に示した装置２５２を含む。装置２５２は、２つのチャンバ、すなわち、互いに流体的に連通した一次又は上側チャンバ２５６及び二次又は下側チャンバ２６０を有する。一次又は上側チャンバ２５６は細胞分離チャンバとして機能する一方、二次又は下側チャンバ２６０は高密度化チャンバとして機能する。装置２５２はまた、図２１〜図２５
に示すように、図中に輪郭を示した少なくとも１つの開口部、開口又は通気口を有する隔板２６４を有する。該隔板２６４は、２つのチャンバ２５６、２６０を分離する。開口部、開口又は通気口２６８は、一次チャンバ２５６と二次チャンバ２６０との間の流体的連通状態を提供する。隔板２６４は、例えば、プラスチック、セラミック又はガラスで出来たものとし得る。
【００７４】
一次チャンバ２５６は、分離媒体２７２を含有し得る。上述した任意の分離媒体２７２をシステムと共に使用することができるが、分離媒体２７２の特定の例は、シリコーンゲル、ポリエステルゲル、チキソトロピックゲル及びそれらの組み合わせのうち少なくとも１つを包含し得る。より具体的には、隔板２６４の、１つ又は複数の通気口２６８を、１つ又は複数の通気口２６８をブロックし且つ、最初の遠心分離後赤血球細胞を血漿から分離するのに充分な量の分離媒体２７２（例えば、ゲル）で栓閉じし得る。一次チャンバ２５６は、通常、穿刺可能なストッパ２７６又はボトルキャップのように裏当てしたねじキャップのような他の適切な装置を通じ、患者から全血を受け取る。図２１〜図２５において、システムは、血液を上側チャンバ２５６内に導入するために使用される穿刺可能なストッパ２７６を有するものとして示される。一次チャンバ２５６はまた、抗凝固剤２３２を含有し得る。チャンバ２５６はまた、標準的な静脈穿刺法による標本の真空採取を許容し得るよう排気し得る。二次チャンバ２６０は、凝固活性剤２４４を包含することができ、上述した二次活性剤２４８の１つ又はそれ以上を包含することができる。
【００７５】
血液２８０が、図２２に示すように、上側チャンバ２５６内に採取された後、装置２５２を適宜なｇ力にて軸方向に遠心分離し、細胞の分離、すなわち、赤血球細胞２８８の多血小板血漿２８４からの分離を行う。細胞分離するために使用される典型的なｇ力は、例えば、５分以上のような所定の時間の５００〜１５，０００ｘｇを包含し得る。好ましくは、最初の遠心分離は、約５〜１５分間、約１０００〜１５００ｘｇにて行われる。これは、本明細書に記載した膜に関係する全ての実施形態に当てはまる。最初の遠心分離は、分離媒体２７２を、通気口２６８をブロッキングする位置から境界面まで動かす。例えば、チキソトロピックゲル２７２は、一次チャンバ２５６を血液２８０にて充填する間、２つのチャンバ２５６、２６０の分離状態を維持し得るが、最初の遠心分離の間に動いて細胞の分離を行い、２つのチャンバ２５６、２６０を分離する接続流体路を開放する。ゲル２７２は、半径方向、外方及び上方に流れ、ゲル２７２が底部チャンバ２６０内に落下することはない。最初の遠心分離の結果を、図２３に示す。多血小板血漿２８４、分離媒体２７２及び赤血球細胞２８８の相対的密度のため、遠心分離により、図２３に示すように、これら３つの物質は一次チャンバ２５６の内側から一次チャンバ２５６の外側まで上述した順序にて配置する。図面及び本明細書にて使用するように、ＰＲＰは多血小板血漿を表わし、ＲＢＣは赤血球細胞を表わす。
【００７６】
その後、最初の遠心分離を停止し、その結果を、図２４に示す。遠心分離を停止したとき、多血小板血漿２８４は重力によって下側チャンバ２６０内に通気口２６８を通じて排出され、該下側チャンバにて多血小板血漿は凝血活性剤２４４及び二次活性剤２４８（存在するならば）と混合する。しかし、分離媒体２７２は、所定位置に止まり、これにより赤血球細胞２８８が通気口２６８を通って第二のチャンバ２６０に入るのを阻止する。通気口２６８は、加えられたｇ力によって多血小板血漿２８４の全てが二次的な高密度化チャンバ２６０内に流れるのを保証するために、漏斗状形状であり得る。
【００７７】
図２５に示すように、遠心分離を、例えば、５００〜１５，０００ｘｇのような適正なｇ力にて再開し、大きい膜２９２が下側チャンバ２６０の外周に形成される。好ましくは、遠心分離は、実現しようとする膜の密度に依存して、約２０分〜１時間、約２５００〜１０，０００ｘｇにて行われる。このことは、本明細書に記載した膜形成に使用される全ての実施形態に当てはまる。分離媒体２７２及び赤血球細胞２８８は、２回目の遠心分離
の間、同一の位置に止まる傾向があることを認識すべきである。このシステムは、同時的な遠心分離及び凝固を許容し、その結果、大きい血小板／フィブリン膜２９２となる。装置２５２はまた、取り外し可能であることができ、これにより膜を装置から容易に引き出すことを許容する底部２９４を有する。
【００７８】
以下のシステム及び装置は、図２１〜図２５に示した基本的システムの変形例である。例えば、細胞分離チャンバすなわち一次チャンバ２５６は、高密度化チャンバすなわち二次チャンバ２６０と異なる半径を有し得る。図２６により詳細に示すように、上側及び下側チャンバの半径は、異なるものであることが可能で、このことは、周壁にて異なるｇ力を加えることを許容する。その結果、１つの速度ｒｐｍが２つの異なるｇ力を生じ、これによりモータ及びプログラミングを簡略化する。より特定すれば、チャンバに異なる半径を提供すると、同一のｒｐｍにて異なるｇ力となるため、多数速度のプログラミングが必要なくなる。
【００７９】
図２７〜図３０は、同心状の円筒体が使用される、図２１〜図２５に示したシステムの１つの変更例を示す。システム２９６は、隔板又はその他の分離体３０９によって下側部分３０８から分離された上側部分３０４を有する一次管３００を包含する。一次管３００は、細胞分離チャンバとして機能する。少なくとも１つの通気口、穴又は開口３１２は、一次管３００の上側部分３０４と下側部分３０８との間の流体的連通を提供する。この場合にも、血液は、１つ又はそれ以上の穿刺可能なストッパ３１６又は上述したその他の適切な装置を通じて一次管３００内に導入し得る。一次管３００は、血液の過早の凝血を防止すべく抗凝固剤２３２を保持し得る。分離媒体２７２は、血液が少なくとも１つの通気口３１２を通じて一次管３００の上側部分３０４から下側部分３０８内に流れるのを阻止する。下側部分３０８はまた、液体が流れ得る空隙、穴又は開口３１０を有し得る。多血小板血漿３８４の高密度化は、二次的な同心状管３２０内で行われる。二次管３２０は、上述した凝固活性剤２４４の１つ又はそれ以上及び／又は１つ又はそれ以上の二次活性剤を含有し得る。
【００８０】
最初に、システムの遠心分離により血液が血漿及び赤血球細胞に分離され、該血漿及び赤血球細胞は、上述し且つ図２８に示した分離媒体によって分離する。最初の遠心分離は、一般的に、約１０分間以上、約１０００ｘｇ以上にて行われる。図２９に示すように、遠心分離が停止したならば、多血小板血漿２８４は、１つ又はそれ以上の通気口３１２を通って一次管３００の下側部分３０８内に落下し、赤血球細胞２８８は、分離媒体２７２により一次管３００の上側部分３０４内に捕らえられることになろう。一次管３００の下側部分３０８の壁には、少なくとも１つの通気口３１０が設けられる。システムは、その後、図３０に示すように遠心分離され、これにより多血小板血漿２８４の少なくとも一部分は、一次管３００の空隙３１０を通って下側部分３０８から去って二次管３２０に入る。この場合にも、赤血球細胞２８８は、分離媒体２７２により一次管３００の上側部分３０４内に捕らえられたままであろう。図２７〜図３０に示すように、二次管は、少なくとも１つの凝血活性剤２４４を含有し、そこで多血小板血漿２８４が該凝血活性剤と接触する。その後、この変更例は、膜２９２を形成する同時的な凝固及び遠心分離を提供する。この変更例は、より小型のユニットを許容し、プラスチックの使用量を削減する。装置２９６はまた、膜の除去を容易にし得るよう取り外し可能な底部３２４を有し得る。
【００８１】
別のある代替例として、分離媒体に代えて疎水性膜３２５を採用し得る。疎水性膜３２５は、分離媒体を使用する任意のシステムに代えて使用し得る。疎水性膜３２５は、所定のｇ力にて多血小板血漿が流れることのみを許容し、分離媒体を不要にする。換言すれば、ゲルによってブロックされた穴を有する隔板を使用することに代えて、図３１及び図３２に示すように疎水性膜を使用し得る。膜を使用するとき、下側チャンバ及び上側チャンバは、図２１に示すように同一の半径を有するか、又は該２つのチャンバはその一例を図
２６に示すように異なる半径を有し得る。更に、疎水性膜は、図２７に示した同心状の設計のものに使用し得る。
【００８２】
疎水性膜３２５は、多血小板血漿のような水溶液体がそのポアを通って流れるのを、所定の静水圧に達する迄、実質的に阻止する。疎水性膜３２５の例は、非限定的に、ポリプロピレン、ポリカーボネート、セルロース、ポリエチレン、デュポンのテフロン（登録商標名）及びそれらの組み合わせを包含し得る。その他の例は、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）製造のミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）（登録商標名）膜及びスクリーン、又はヌクレオポア（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）製造のヌクレオポア（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）（登録商標名）膜及びスクリーンを包含する。これと代替的に、レーザにて精密穴が穿孔されたプラスチック隔板を使用してもよい。疎水性膜を使用すると、血液を、細胞分離チャンバ内に導入することができるが、高密度化チャンバ内に落下することはない。最初に、赤血球細胞を低いｒｐｍにて血漿から分離することにより、適正な静水圧圧力を実現し得る。その後、遠心分離速度を増して、所望の圧力を実現し、流動圧力を規定する表面エネルギー／表面張力の制約に打ち勝つ。換言すれば、重力は、遠心分離の速度に伴って増大し、その結果、多血小板血漿は膜を通って流れるが、赤血球細胞は流れない。膜は、赤血球細胞を実質的にブロックする。
【００８３】
上記のシステムに対する別の形態変更は、本明細書に記載した任意の実施形態の、二次すなわち高密度化チャンバの形態を変更することを含む。これらの改変高密度化チャンバは、システム内で使用することができ、ここで、一次チャンバ及び二次チャンバは、同一又は異なる半径を有し、チャンバは同心状であり、及び／又は分離媒体又は疎水性膜が使用される。高密度化チャンバは、膜の除去を容易にし且つ、膜の最大程度の回収を保証する、異なる内壁を有し得る。例えば、高密度化チャンバは、体内に最初に配置するための膜のはがし強度を向上させ、その後に分解する、織った生物分解性織地（例えばゴアテックス（Ｇｏｒｅｔｅｘ）が製造するゴアテックス（Ｇｏｒｅｔｅｘ）（登録商標名））を含有し得る。チャンバの外壁は、また、織地を均一な長さにて壁から離して支持しする成形した張出し部又は溝を含有することができ、織地の両側部にて所望の寸法のフィブリン及び血小板の厚さを実現する。
【００８４】
より特定すれば、図３９に示すように、高密度化チャンバ３１８の内壁又は側壁は、円筒体ではなく平坦な薄板の形態の膜を除去することを許容するための、１つ又はそれ以上の中実な又は鋸歯状リブ３１９を包含し得る。穴をあけたリブは、膜のエアレーションを促進する。チャンバの内壁は、形成される膜に孔を提供し、はがしを容易にする形態とし得る。図３９は、内壁の１つ又はそれ以上の、中実なリブの底面図を示す。
【００８５】
図３３は、高密度化チャンバ３２６の内部に見ることのできる織った生体適合性織地３２８を示す。かかる織物は、膜２９２を壁自体から離れた状態に保つ。織地３２８は、平坦な膜を得るために膜を円筒体から分離することを容易にし、特定の用途のために膜のはがし強度を増大させる。織地３２８は膜２９２内に埋め込まれた状態となる。更に、図３４及び図３５にそれぞれ示すように、張出し部３３２又は溝３４０をチャンバ３２６の壁３３６に成形し、織地の両側部におけるフィブリン層の厚さを制御し得る。これらは、織地を壁から隔てた状態に保つ小形の支持リブとして機能する。要するに、図３３は、織地３２８自体が、膜の壁３３６への付着を防止することを示し；図３４は、膜３２４の除去を容易にする壁３３６の張出し部３３２を示し；図３５は、膜２９２を壁から離れた状態に保つ溝又は成形した支持リブ３４０を示す。張出し部３３２又は溝３４０を有する壁は、織地３２８と独立的に採用し得る。
【００８６】
これと代替的に、図３６に示すように、高密度化チャンバは、膜２９２の除去を容易にするために除去可能なフィルム３４４にて裏当てし得る。該フィルム３４４は、ポリエチ
レン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、又はテフロン（登録商標名）を含む、ポリオレフィンのような、プラスチックを含み得る。フィルム３４４は、操作が容易であるようにタブ３４８を有することができ、また、膜２９２を着色し、フィルム３４８から区別するのを助けることができる。更に、フィルム３４８を処理して、ガラス様接触活性のような望ましい性質を得ることができる。タブ３４８を操作することにより、膜２９２を上に有するフィルム３４４の全体を除去し得る。例えば、高密度化チャンバ３２６は、凝固及び成長因子放出のための血小板の活性化及び膜の操作の容易化の双方を提供するような処理フィルムにて裏当てし得る。これと代替的に、ＰＲＰ又はＰＰＰを高表面エネルギー細管を通じて流動させＰＲＰ又はＰＰＰを凝血のために活性化し、フィブリン密封層又は接着層として使用するための急速凝血接着を可能にするようにしてもよい。
【００８７】
チャンバ内の他の面に関して、プラスチック面は有効であり得るが、凝血活性化及び血小板成長因子の放出のために理想的でないことがある。その結果、プラスチックの代替例を図５０及び図５１に概略示する。例えば、多血小板血漿は、下側チャンバ内でガラスに接触し得る。換言すれば、図５０に示すようにガラスを底部キャップに取り付けるか、又は図５１に示すようにガラス球を底部に接着し又は熱によりつなげることができる。ガラスはまた、加熱しプラスチック上に落下するようにしてもよい。これと代替的に、表面は、酸素又は亜酸化窒素のような活性化気体を採用するグロー放電プロセスを使用してプラズマ処理し得る。より特定すれば、表面は、プラズマ化学気相成長法を使用して処理することができる。これと代替的に、表面は、例えば、シリコーン界面活性剤又はＰＶＰｙｒのような多様な化学的被覆を使用して改変し得る。プラスチックを改変する別の方法は、小寸法のシリカビーズ又は粒子を上側チャンバ内のクエン酸塩溶液に添加することである。ゲル及び赤血球細胞に比してシリカは高密度であるから、シリカの殆どは、ゲルの下方又はゲル内に埋め込まれた状態で上側チャンバ内に止まる。従って、これらのプラスチック改変法を使用してシステムの一部分を、また、より特定すれば、本明細書に記載した実施形態の任意の高密度化チャンバの一部分を、被覆し得る。
【００８８】
異なる側面において、本発明は、傷口の手当てに関連して使用される四角形の多血小板フィブリン膜を生産することを可能にし、このことは、血小板の細胞分裂促進性の特徴を活用し、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）及びベータトロンボグロブリン（ＢＴＧ）、及び固体フィブリンフィルムの保護作用を提供する。成長因子、ＢＴＧ、血小板因子４（ＰＴ４）及びトロンボスポンジンは、全て、固体フィブリン網にて細胞増殖を増進し得る因子である。より特定すれば、保護作用は、微好気性の環境、消毒的作用、及び分離作用を含む。同時的な遠心分離及び凝固を行うために使用することのできる装置は、図３８に示したロータ医療装置を含む。該装置は、プラスチック又はその他の何らかの適切な材料で出来たものとし得る使い捨て型カートリッジ３５２を含む。この場合にも、上述したプラスチック改変技術は、本明細書に記載した任意の実施形態に適用される。円筒状のカートリッジは、２つの同心状チャンバ、すなわち内側チャンバ３５６及び外側チャンバ３６０を有する。
【００８９】
内側チャンバ３５６は、円筒状であり、図３８及び図３９に示すように内側ろ過壁３６４により輪郭を定められる。本明細書に記載した任意のフィルタ又はろ過装置がこの実施形態と共に使用するのに適する。内側チャンバ３５６は、頂端部３６８及び底端部３７２を有し、これら端部の各々は、該端部に取り付けられたロータ軸３７６を有する。ロータ軸３７６は、カートリッジ３５２を遠心分離装置内に挿入し、使用することを許容する（図示せず）。内側チャンバ３５６のこれら端部３６８、３７２の少なくとも一方は、患者からの血液が導入又は注射されるときに通る、ポート又は適切な開口３８０を有し得る。上述したように、１つの実施形態において、内側チャンバ３５６は、標準的な静脈穿刺を容易にできるように真空圧に保ち得る。内側チャンバ３５６は抗凝固剤２３２を含有し、その内部に入る血液の凝固を防止し得る。内側チャンバ３５６は、細胞分離チャンバとし
て機能する。内側ろ過壁３６４は、個別の量の全血を受け入れる、選択的に遠心分離可能な（機械的に支持された）フィルタである。ろ過壁のろ過機能は、赤血球及び白血球細胞が貫通して流れるのを実質的に防止する。しかし、フィルタは、例えば、１０分以上の所定の時間、例えば、１０００ｘｇ以上の所定の遠心分離力が加えられたとき、血漿及び血小板が第二のチャンバ３６０まで流れるのを許容する。
【００９０】
第二のチャンバ３６０は、外壁３８４、内側ろ過壁３６４、並びに頂部壁及び底部壁により輪郭を定められる。第二の外側チャンバ３８４は、上述した１つ又はそれ以上の凝固活性剤２４４並びに１つ又はそれ以上の二次活性剤２４８を含有し得る。第二のチャンバ３６０は、高密度化チャンバとして機能する。図３８及び図３９に示すように、内側チャンバ３５６及び外側チャンバ３６０は同心状である。
【００９１】
作動時、血液が内側チャンバ３５６内に導入された後、装置３５２を遠心分離する。上述したように、遠心分離は、血液が血漿及び赤血球細胞に分離するような所定の時間、所定の力にて行われる。この場合にも、ろ過壁３６４は、多血小板血漿が貫通するのを許容する一方、赤血球細胞はフィルタに詰まる。フィルタ３６４を通過したならば、血漿は、凝固活性剤２４４及び／又は二次活性剤２４８に接触し、その結果、同時的な凝固及び遠心分離が行われ、膜が形成される。凝固を増進するため、混合動作を提供することが役立ち得る。血漿が第二のチャンバに入った後に為される遠心分離は、白血球抵抗性のフィブリン多血小板膜を得るため、通常、１０分以上、約１５００〜１５，０００ｘｇにて行われる。該膜は、本明細書に記載した任意の組織再生用途に使用することができるが、傷口又は火傷の手当てに関連して特に有用である。
【００９２】
外側チャンバ３６０の内側部分には１つ又はそれ以上のピン３８８が存在し、膜を装置の頂部から垂直方向に引き出すことを可能にし得る。高密度化チャンバの表面に関して説明した全てのもの（例えば、織地、張出し部、溝を使用すること等）は、この場合、外側チャンバ３６０に当てはまる。更に、プラスチック表面の改変に関する説明もこの場合にも当てはまる。膜は、装置を壊し又は２つの部分に開けることにより引き出すことができる。典型的には、衛生上の理由のため、装置は使い捨て型である。装置は、操作し易く、また、安全で滅菌性の状態を提供する。
【００９３】
本発明の別の側面は、半径方向及び軸方向遠心分離により、成形した高密度のフィブリン及び血小板ネットワークを形成するために使用することができる、装置及び方法、並びに該装置及び方法の改変に関する。本側面は、多数のネットワークを同時に成形すべく、計測した液体を多数のアリコートに分割する方法にも関する。自己由来のフィブリン及び血小板のネットワークの、臨床的効率及び使用の容易さは、上記に説明した。移植前に、上述したネットワーク又は膜を特定の形状に形成することが望ましいような、軟組織を再生するための幾つかの臨床的適用例がある（例えば、膝の半月の修復）。半月軟骨の場合、理想的な形状は、著しく損傷した半月を置換するために使用することができる部分と同様である、半円形の楔形の形状であろう。存在する血小板は、組織を再生するのに必要な脈管組織形成を提供し、フィブリンは、荷重に耐えるための吸収クッションを提供する。
【００９４】
軟骨のような軟組織の修復の現在の実施では、症例の僅か２０％の治療が可能である。多くの場合、残りの症例において、軟組織は恒久的に除去され、患者の動作は損なわれる。この症候群は、プロスポーツ選手にて顕著であり、スポーツ医学にて大きな関心事である。新たな組織が成長するための足場を形成すべく合成材料が利用可能ではあるが、合成材料は、好ましくない免疫応答性を生じ、脈管形成機能の欠如により成功率が低いという不利益な点がある。成功可能な方法は、所定の方法に使用される多数の形態及び形状を同時に形成するために、多血小板血漿を、制御した容積に分離し得るであろう。
【００９５】
成形システムは、上述した任意の遠心分離の容器中で、遠心分離力が最大となる時点にて所望の部分の形状により輪郭を定めた、形成したキャビティを含み得る。該キャビティは、遠心分離が半径方向遠心分離装置内で行われるとき、容器の底部に形成し得る。これと代替的に、キャビティは、軸方向に遠心分離される容器の円筒壁中で輪郭を定められ得る。図４０は、図４０（ａ）に示すように半径方向遠心分離にて使用し得るよう向き決めされた鋳型、及び図４０（ｂ）に示すように軸方向遠心分離にて使用し得るよう向き決めされた鋳型の例を示す。鋳型は、図４３〜図４６に示すように、容器と一体にし、又は別個の部品を容器に接続し、結合し、伸長させ又は付加することができる。キャビティは、一体型でないならば、割型の設計で、複雑な形状物の成形を許容し、容易に除去することを可能にし得る。キャビティはまた、図４１に示すように、キャビティ内へのフィブリン／血小板の混合物の流れを向けるため漏斗型特長を含有し得る。より特定すれば、図４１は、物質がキャビティ４０４内に流れるのを許容するランナー４００に達するような、漏斗３９６を有する鋳型３９２を示す。漏斗開口部３９６の断面積は、フィブリン／血小板モノフィラメントの濃縮の相対量を決定する。ランナー４００はまた、図４１に示すように、漏斗３９６及びキャビティ４０４に接続することができ、これによりキャビティ４０４内に直接流れること、及び成形した部分のトリミング処理を最小にすることを許容する。図４２に示すように、侵入するフィブリンによる置換によって、気体及び／又は液体がキャビティ４０４から押し出されることを許容するために、通気穴又は通路４０８を鋳型フレーム３９２内に包含し得る。換言すれば、通気穴４０８は、気体及び液体を放出することを許容する。
【００９６】
多数のインプラントを必要とする方法、特に、異なる容積及び密度を必要とする方法において、図４３〜図４７に示すように、垂直方向羽根を底部に含めることにより、上述した軸方向遠心分離装置を制御された容積に分割することができる。換言すれば、上述した装置の１つ、例えば、同心状のチャンバの実施形態を採用することができるが、多数のキャビティを遠心分離容器の各々に使用して多数形状の物体を同時に提供することができる。軸方向旋回設計の鋳型の各々に送るべき多血小板血漿の相対量は、図４３〜図４７に示すように垂直方向羽根４１２を含めることで得ることができる。羽根４１２は、装置の高さまで伸びるものとしてもよいが、必ずしもそうする必要はなく、中心軸線に向けて突き出すものの中心軸線に接触せず、これにより羽根により輪郭を定められた容積の間で多血小板血漿が自由に流れるのを許容する。
【００９７】
図４４は、羽根Ｂ１、Ｂ２を示す平面図である。羽根Ｂ１、Ｂ２は接触せず、流体が最初に追加され遠心分離装置が休止しているとき、通気口４１６は、チャンバＷ１、Ｗ２間の流体的接続を許容する。チャンバＷ１、Ｗ２の断面積は、鋳型の各々に送るべき流体の容積に比例するものとすることができる。最初の休止状態にある液体の液位は全ての区画室にて等しく、このため、相対容積は、羽根の位置決めにより輪郭を定めた断面積に比例する。従って、羽根の位置は、各区画室における容積を決定することになる。その結果、より深い鋳型に対し、より大きい「パイ・ピース（ｐｉｅ ｐｉｅｃｅｓ）」を採用することができる。
【００９８】
遠心分離したならば、各区画室内の容積は、目標の鋳型まで半径方向に移動する。図４５は、同等でない「パイ・ピース」を有する３チャンバ装置を示す。図４７は、異なる半径に設定された各鋳型４２０を有し、これにより、各鋳型４２０の内容物に対しその半径に比例するｇ力が加える、３チャンバ装置を示す。チャンバの数は、特定の用途に依存する。形成された材料は、鋳型４２０の半径に依存して異なる密度を有する。図４６は、３つの異なる位置、すなわち、一体の位置、接続された位置及び装置から伸びる位置にある鋳型を示す。鋳型の位置決めは、形成される膜の密度に影響を与える。各アリコートの相対的容積及びキャビティの位置は予め設定されるから、成形された釣合い重りを追加して適正な釣合いをとることができる。この特徴の有用な適用例は、高密度で膜を、低密度で
ペーストを成形する場合であろう。
【００９９】
作動時、多血小板血漿を上述したような容器に添加し、又は、全血を前処理チャンバに添加して多血小板血漿を適切な凝血活性剤を含有する第二の容器に移すことにより該多血小板血漿を製造する。容器を遠心分離装置内に迅速に配置し、その用途に必要とされる所望のｇ力にて旋回させる。これにより、同時的な遠心分離及び凝固が提供される。フィブリンストランド及び血小板は、キャビティに向けて迅速に沈積し、該キャビティを充填する。次に、フィブリンストランドは、架橋結合し、安定的なネットワークを形成する。遠心分離装置から除去したとき、成形した部分を除去し、全ての余剰部分をトリミング処理することができる。より複雑な形状の場合、割型キャビティ鋳型を採用し得る。上述し且つ図４１に示すように、漏斗状の前処理装置をこの設計にて採用し、必要とされる血液量を最小にし且つ、効率を高めることができる。図４１及び図４２に示すように、キャビティを完全に充填し且つ、複雑な形状物の取り扱いを容易にするために、趣味愛好家のプラスチックモデルキットにて採用されるランナーシステムと極めて類似した、ランナー及び通気穴を含めることが出来る。
【０１００】
図４７〜図４９は、作動中の装置の断面図を示す。図４７には休止状態の装置を示す；単一の水平な流体表面が実現され、流体がチャンバ間で適正に釣合った状態となるまで、多血小板血漿２８４及び凝固活性剤２４４の混合体が、チャンバの間を流れる。図４８は、遠心分離が開始したときの装置を示す；液体は、軸方向回転により旋回流の形状に形成される。遠心分離の間、羽根４１２はチャネル間の連通を防止し、これにより鋳型の各々に対する適正な供給状態を維持する。壁４２８は鋳型に向けて徐々に薄くなって、濃縮漏斗として機能し得る。遠心分離装置の速度及びそれに伴うｇ力が増すと、全ての流体が鋳型に搬送される迄、放物線状旋回流が増大する。図４９は、完全な遠心分離状態にある装置を示し、この時点にて鋳型は、充填されている。
【０１０１】
このシステムは、フィブリンを含む物質を形成するために、少血小板血漿（ＰＰＰ）に対して使用することもできる。換言すれば、該システムは、血小板を必要としない用途にて使用することができる。少血小板血漿は、第一の管を、例えば、１，０００ｘｇの代わりに５，０００ｘｇ以上のようなより大きいｇ力にて遠心分離することにより形成し得る。また、この設計は、ドナー及び受け手の適合性が確立された場合に、非自己由来の所望のフィブリン又はフィブリン／血小板ネットワークの形成に使用することもできる。
【０１０２】
全体として、鋳型は、完全で、自己由来の患者の適合性を提供する。その結果、フィブリン−血小板ネットワークを、精密な成形形状及び密度にて形成することができる。膝の左側及び右側半月のような、複数の形状物を同時に形成することができる。更に、内耳に対する成形ツチ骨、キヌタ骨及びアブミ骨、並びに肩に対する回旋腱を、これらの鋳型を使用して形成することが出来る。更に、肘軟骨、エテピ関節丘（ｅｔｅｐｉｃｏｎｄｙｌｅ）の部分、指の部分、足首及び手首の軟骨を形成することもできる。形成された膜又はネットワークは、吸収可能で、安定で、成長因子を有し、治癒を促進する。複数形状の用途の場合、部分の密度は、鋳型の半径を設定することにより変化させることができる。
【０１０３】
本発明の別の側面は、異なる遠心分離の沈積を利用してフィブリン／血小板ネットワークにおける血小板の分布状態を制御する装置及び方法に関する。自己由来のフィブリン及び血小板ネットワークの臨床的効率及び使用の容易さは、上記に説明した通りである。フィブリンは、傷口を安定化し、細胞が成長及び動くための媒体を提供する。血小板は、最初、傷口の安定化に寄与する一方、多様な抗炎症剤、成長剤及び脈管組織形成剤を含有する。従って、多くの治癒方法において、フィブリン連続体中の血小板の位置を集中させることが有益である。例えば、慢性的な傷口の場合、傷口に接触する膜の側に血小板を集中させることは、傷口に対する膜の接着力を増し、皮下層の脈管組織形成を増大することに
なろう。半月の修復の場合、形成された半月の最外側領域、すなわち「レッドゾーン」に血小板を集中させ、この領域の脈管組織形成を増大させることが有益であろう。骨セメントの場合、血小板が連続体の全体に均一に分配されることが好ましい。それ故、本発明のこの側面は、遠心分離力を使用して血小板をフィブリン基質内に好ましいように配置するための方法を提供する。
【０１０４】
フィブリンの形成がｇ力と独立した速度にて進行するのに対し、血小板の沈積はｇ力の関数である。より特定すれば、血小板は一定の速度にて沈積し、その結果、血小板は、その全てが沈積する迄、一定の速度にて堆積する。血小板は多血小板血漿の全体に均一に分配する。血漿に重力が加わると、血小板は、重力の増加に伴って増大する一定の速度にて沈積する。沈積を完了する時間は、最上方の血小板が縦断しなければならない多血小板血漿の高さに比例する。よって、高さ１００ｍｍ円柱の血小板の場合、沈積を完了する時間は、６０００ｘｇにて約５分又は２０００ｘｇにて１５分である。
【０１０５】
他方、フィブリンモノマーは、重力と独立的な速度にて形成する。通常の患者の場合、この過程は、約３０分にて完了する。よって、ここに示す方法は、２つの異なる沈積速度に対応し、これによりネットワーク内での血小板の好ましい位置を実現するような、遠心力プロフィールを実現するという問題を解決する。血小板が好ましい位置にあることは、特定の適用例の各々に合うように組織の再生を最適化し、その方法についてのより迅速な治癒及び高い成功率を提供する。血小板を好ましいように配置する方法は、血小板の沈積速度及び形成及びその後のフィブリンの沈積の速度の違いを考慮し、沈積プロセスの間のｇ力を調節することを伴う。
【０１０６】
１つの実施例において、多血小板血漿を凝固活性剤に曝し、次いで、直ちに約４０００〜６０００ｘｇにて遠心分離することができる。これにより、血小板は、約５〜１０分にて迅速に沈積し、次に、その後の２５〜３５分にて形成されるフィブリンがその上の層となる。形成される構造体は、その表面に、最初に形成された血小板が集中し、その後に形成された層内で血小板が減少する。この適用例は、半月の修復及び慢性的な傷口に対し特に有用である。
【０１０７】
別の実施例において、多血小板血漿を凝固活性剤に曝し、次いで、直ちに２０００ｘｇ以上にて遠心分離することができる。血小板の沈積及びフィブリンの形成は等価的速度にて進行し得る。これにより、形成されるネットワークは、該ネットワークの全体に均一に分配した血小板を有する。この適用例は、骨セメント及び軟組織の成長（歯周病学の）にとって特に有益である。
【０１０８】
更に別の実施例において、多血小板血漿を凝固活性剤に曝し、直ちに遠心分離することができる。しかし、遠心分離速度は、約１〜２分間、約４０００〜６０００ｘｇの速度と、その後の、５〜１０分間、１０００〜２０００ｘｇの速度との間にて繰り返す。約５〜１０回の繰り返しにより、高濃度血小板及び低濃度血小板の別個の層を１０〜２０有するサンドイッチ構造体が得られる。この適用例は、骨が互いに擦り合うのを防止する、関節の軟骨の修復にとって特に有益である。
【０１０９】
したがって、多血小板血漿及び凝固活性剤を遠心分離する速度並びに遠心分離時間を制御する結果、血小板は好ましい位置に配置される。血小板の位置を制御することは、特定の用途に対し組織の再生を最適化し、これにより、その方法のより迅速な治癒及びより高い成功率を提供する。
【０１１０】
図５６は、鋳型の設計の別の実施形態を示す。成形した挿入体４２４は、一般的に、プラスチック又はゴム材料で出来ている。挿入体は、図５６に示すように、容器４２６内に
導入し且つ、該容器から取り外し可能である。多血小板血漿が容器４２６内に配置されたならば、凝固活性剤を容器に添加することができる。これと代替的に、導入に際し、既に血漿内に凝固活性剤が存在していてもよい。挿入体は、図４２〜図４９のものと同様の羽根４２８を有する。羽根４２８は、突き出してチャンバ４３０の輪郭を形成し、遠心分離に際し、膜を該チャンバ内で成形し又は形成し得る。換言すれば、羽根は、挿入体が挿入されたとき、挿入体のコア４３２と容器との間に空間を残し、半径方向遠心分離装置を使用して円筒状膜を形成し得る。挿入体は、３つの羽根を有するものとして示されているが、１つ又はそれ以上の羽根を有する挿入体を製造することもできる。これと代替的に、挿入体は、割型とし、２つの挿入体の間にて長方形の膜が形成されるようにしてもよい。成形した挿入体４２４を使用することの利点は、旋回ヘッド遠心分離装置を備える平坦な底部の容器が不要となる点である。
【０１１１】
本発明の別の実施形態において、軟骨の疾病に苦しむ人を治療するために使用される方法及び装置が提供される。繊維状軟骨組織は、非結晶の繊維状組織内に封入された軟骨細胞の多層構成の複雑な構造を有し、該非結晶の繊維状組織の主成分は、ヒアルロン酸及びポリサッカリドの加わったコラーゲンである。内層は、最も緻密な層であり（すなわち、内層は、外層よりも２５倍まで硬い場合がある）、一方、他の２つの柔軟な層が表面に向けて認められる。感染、自己免疫疾患（関節炎など）、年令に関係した変性、及び外傷に起因する、関節の軟骨組織に伴う病的症状は、ヒト及び動物にてよく見られる。今日の手当て法は、感染を止めるため、炎症を軽減するため、又は自己軟骨組織の自然再生を刺激するための、患者の薬理学的治療に重点を置いている。膝の半月損傷の治療のような痛みを伴う症例において外科的治療法が行われて置換されない軟骨が除去され、患者の骨は保護されないままになる。この実施形態は、軟骨の疾患を治療する方法を提供する。
【０１１２】
膜及びフィブリンは、軟骨細胞を培養する足場として使用し得る。より特定すれば、これらの方法をヒト及び動物の細胞に適用し、生物学的に活性な硬い固体フィブリンクッション（自己由来の軟骨細胞を含む）を形成し、損傷した生体の軟骨を置換して機械的ストレスを支え、組織の生物学的回復を開始することができる。１つの特定の実施形態において、当該技術分野の当業者に既知であるように、酵素によ消化される軟骨組織のバイオプシイから開始し、軟骨細胞を、ＣＯ２インキュベータ内で従来のプロトコルに従って単層に培養する。支持体から慎重に分離された軟骨細胞は、生体の損傷した軟骨の部分を置換するために使用することができる「配向した」強い膜を得る目的で、容器を約４，０００〜１０，０００ｘｇにて旋回させる直前に、ＰＲＰと混合することが出来る。付与された遠心分離力は、異なる種類の軟骨内の軟骨細胞に差異を生じさせ得る。
【０１１３】
軟骨細胞を有するフィブリンの足場は、滅菌状態下、特殊なバイオリアクター内で、数日間培養することができる（ドルトムンド大学、動物細胞培養グループ、Ｒ．Ｐｏｒｔｎｅｒが記載するように）。この装置において、血清、ＴＧＦ（形質転換成長因子−Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｃｅｐｔ）、ＩＧＦ（インシュリン様成長因子−Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｃｅｐｔ）を添加したＤＭＥＭ（インビトロゲン）培地を、フローチャンバ内にて足場上に連続的に補給する。この方法は、１９日間行い得る。その目的は、当初のフィブリンの基盤及び形状の上に、真の軟骨をインビトロで生産することである。この新しい軟骨は、インビトロで、損傷した軟骨を置換するために使用し得る。
【０１１４】
１つの方法において、上述した同時的な凝固及び遠心分離方法を使用して極めて丈夫な自己由来の膜を形成し得る。より特定すれば、以下の実施例５に従って厚い膜（例えば、厚さ３ｍｍ及び直径２４ｍｍ）を製造し得る。勿論、上述した装置又は方法の任意のものを使用して多様な寸法の膜を形成し得る。１つの特定の膜は、滅菌性容器（例えば、自己由来の多血小板血漿（ＰＲＰ）約２０ｍｌにて充填され且つ、３０分間、約４５００〜５０００ｘｇにて旋回させる平坦な底部の２５ｍｌガラスフラスコ）内にて形成し得る。こ
のステップにおいて、少血小板血漿（ＰＰＰ）を使用してもよい。上述したその他の任意の膜形成技術採用することも可能である。
【０１１５】
この膜又は本発明の任意の他の膜が形成された後、その膜を滅菌性の生理溶液にて完全に洗浄し、活性剤を含有するより大形の滅菌性フラスコに入れ、多血小板フィブリン（ＰＲＦ）の第二の層を製造することが出来る。このステップにおいて、完全な滅菌状態にて、強い膜を含有する新たなフラスコ内に、新たな量の多血小板血漿を導入する。３層の膜を得る目的で、第二のフラスコに対し、第二の遠心分離ステップを行い得る。１つの特定の実施例において、この遠心分離を、２０分間、１０００ｘｇの速度にて行い、直径３０ｍｍのものを形成することができる。遠心分離は、上述した任意の速度にて行うことができる（すなわち、１０分間以上、５００〜１５，０００ｘｇにて）。形成される膜は、軟骨を置換すべき箇所に移植するために使用できる。この場合にも、膜の厚さ及び寸法は、上述した状態によって決まる。血液の量及びフラスコの型もこれに応じて変更することになろう。重要なことは、滅菌膜（上述した方法の任意のものにより形成されたもの）を追加的な凝固活性剤に曝し、その後、多血漿フィブリンの第二の層を形成するためにその内容物を遠心分離することである。これと代替的に、追加的な凝固及び遠心分離は、膜の第三の層を形成することができ、その後も同様である。
【０１１６】
１つの関連する方法において、当該技術分野の当業者に周知であるアルギン酸塩再生軟骨細胞（ＡＲＣ）法に従い、軟骨組織（自己由来）をゲル中のＩＮ ＶＩＴＲＯ培養に配置する。ＡＲＣ法におけるゲルは、上述した方法及び装置に従って製造した自己由来のフィブリンにて置換してもよい。より具体的には、多血漿フィブリンの製造の第二のステップの間、選択した軟骨細胞株を自己由来のフィブリンと共に二次容器に添加し、混合物を、低い遠心分離速度で、又は、遠心分離力を全く加えずに、ゼリー状にしてもよい。
【０１１７】
ゼリー化が行われる容器の形態及び寸法は、「人工軟骨」のその後の用途（すなわち、置換すべき軟骨の形態）に従って選ぶことができる。ゼリー化は、上記の文節に従って作製された強い膜の周りにゲルが形成されるような仕方にて行うことができる。これは、新たなゲルが当初の強い膜を実質的に取り囲み、軟骨細胞がゲル中に含まれるよう、第二の凝血が行われている容器内に強い膜を配置することで実現することができる。自己由来の軟骨細胞、ゼリー状した自己由来の多血小板フィブリン及び最終的に内側の強い膜を有する滅菌性容器は、インビトロで軟骨細胞を成長させる知識を有する人に既知であるように、適切な雰囲気（温度、Ｏ２、ＣＯ２及びＲ．Ｈ．レベル）下で培養するよう配置することができる。これにより、インビトロでフィブリンゲル足場上にて新たな組織を成長させることができる。組織培養が、軟骨細胞及び繊維状組織の的確な密度を有するならば、３層組織は、内部が極めて丈夫で、柔軟で且つ、宿主の病的組織を直ちに置換できる膜となる。該方法の収率を最適化するため、適切な添加剤を培地に追加することができる。幹細胞は身体の全細胞の起源であり、当業者に既知であるように適切に処理されたならば新たな軟骨細胞をインビトロにて発現させることが可能であるから、幹細胞の使用もまた予想される。
【０１１８】
全体として、この実施形態は、合成又は異種起源の材料を使用する場合に関連するリスクを軽減する一方で、上述した疾患を治療するためのインプラントを生産するものである。自己由来の軟骨細胞は血小板が高濃度化した膜内に見られ、該膜はインビトロ及びインビボで増殖するための適切な足場となり、また、新たな軟骨を生産するための基本である軟骨細胞基質を生産する。形成される膜は、滅菌性キャビネット内で容易に製造することができ、また、該膜は、手術後の再生時間を短縮すること、及び新たな軟骨を構築する軟骨細胞の移動を促進することを目的として、所要位置への直接の移植を可能にする物理的性質を有する。
【０１１９】
本明細書に記載した実施形態及び方法は、また、ＰＲＰを血漿分離交換機械から採取することに関連して使用することもできる。外科手術の間、外科手術箇所に溜まった血液を吸引し、細胞を分離し、細胞を患者の体内に再注入することによって血液を節約するために、細胞セイバー又は分離交換機械が何度も使用される。「非観血手術」と呼ばれることもあるこの技術は、失われた血液を置換するための輸血を最小限にし又は不要にし、その手術をより安全で且つ経済的なものにする。かかる装置は、ヘモネティックス（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ）（マサチューセッツ州、ブレインツリー）及びコベ（Ｃｏｂｅ）（コロラド州）が製造している。これらの分離交換機械は、時には、血小板及び血漿を赤血球細胞から分離するために使用される。これら機械の血小板及び血漿ポートにアクセスすることでＰＲＰを採取することが可能となる。ＰＲＰが第二の管に添加されるならば、ＰＲＰは再石灰化され、上述した方法により同時的な遠心分離及び凝固を行うことができる。このことは、第一の遠心分離ステップ及び採取装置を不要にしつつ、より多量のＰＲＰを得ることを可能にする。この方法からも、多様な固体フィブリン網及び膜を得ることができ、また、本明細書中の適用にて使用することができる。
【０１２０】
遠心分離装置の大多数は、採取血液又は直径約１６ｍｍ×１２５ｍｍの第二のフィブリン／血小板ネットワーク管を処理し得る設計とされている。これら寸法の管は、１５ｍｌｓの最大容量を保持する傾向にある。これらの管は、清浄化目的のため取り外し可能な遠心分離装置カップ内に入れ子式に収納される。カップは、管形であり、また、カラーを有して高速度遠心分離を行う間、管及びカップを支持することができる（図５２）。金属の加工又はポリマー系材料の射出成形によって管にカラーを一体的に形成することができる。該カラーは、また、別個に形成し、接着剤、超音波溶接、スピン溶接、誘導溶接又はその他の材料接着方法により管に接着させてもよい。これらの方法においては、カラーと管との材料が同一である必要はなく、広範囲の材料の選択を許容する。これと代替的に、管が閉じた下端に向けて狭小となる先細りの外径部を有し、また、カラーがその内径部に合わさる裏返しの先細りを有するようにしてもよく、管がカラー内に挿入されたとき、管の外径部及びカラーの内径部がかみ合う箇所までのみ進むことができ、成形工程の間の管の開放端からの距離が予め設定されるようにしてもよい。カラーは管との充分な接触を許容する内径を有して遠心分離時に発生する大きなせん断力が加わる間、管を支持する必要がある。カラーの厚さ、すなわち高さの低い円筒体の高さは、カラーの材料の性質及び遠心分離の間にカラーに加わる力によって決まる。カラーの外径は、遠心分離の間、管が半径方向外方に動くのを阻止するのに充分でなければならない。カラーの寸法は、工学コンピューター操作又はコンピュータ化した有限要素解析により容易に計算し得る。
【０１２１】
構造材料は、典型的には、高強度のスチール又はエンジニアリングプラスチックである。脊柱融合及び形成外科手術のような、フィブリン及び血小板ネットワークの多くの適用例には、１６×１２５ｍｍの管にて得られるものよりもより多量のＰＲＰ及び／又はフィブリン血小板ネットワークが望まれる。著しく多量の採取血液又はフィブリン／血小板を得る方法は、支持カラーを取り付けるか又はカラーを一体に形成することにより採取又は受け入れ管を大きく形成することを含む。管は、支持カップを除去した後、遠心分離装置のロータ内に直接配置することができる。管の構造材料は、真空圧を保持し、ストッパを受け入れ、血液と適合可能であり且つ、遠心分離に耐えるのに充分な強度を有するものとし得る。適切な材料は、非限定的に、金属、接着剤により支持カラーが取り付けられたガラス、又はポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）若しくはポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）のような高強度バリアプラスチックを含む。かかる管は、約２０〜３０ｍｍ（例えば、２５ｍｍ）の直径及び１１０〜１４０ｍｍ（例えば、１２５ｍｍ）の長さを有し、２０〜３０ｍｌ以上を保持し得る。ロータの形態を改変することによりより太い管を形成し、より大きな径の管を受け入れることができる。このことは、標準寸法の管にて得られるものよりも多量の標本が望まれる診断試験及び他の方法にも有用である。
【０１２２】
ＰＲＰを移した後、遠心分離及び／又はカルシウム再沈着を遅らせることは、移植片内へのフィブリン、血小板及び成長因子の組み込みを向上させ得る。遠心分離及び／又はカルシウム再沈着を遅らせることは、同時的な凝固及び遠心分離が行われないことを意味するものではない。第二の管に移した後、小さい粒径の移植片材料をＰＲＰに添加するか、又は、製造過程中に、二次管に予め充填するものの少なくとも１つとすることができる。これらの移植片材料は、自己由来の骨、ドナー骨、動物骨、合成骨、三カルシウムリン酸塩、カーボネート、硫酸塩及びそれらの組み合わせを含み得る。移植片材料の密度及びその小さな粒径のため、移植片を、フィブリン血小板ネットワーク又は固体フィブリン網内に均一に組み込むことは困難である。このことは、移植片の密度がＰＲＰの密度よりも遥かに高くなり、また、移植片材料が、遠心分離間に管の底部内に迅速に詰め込まれる結果を生じ得る。詰め込まれる移植片材料の小さな粒径は、その後の遠心分離サイクル中に下降するフィブリン及び血小板が、詰め込まれた移植片材料の間隙間に容易に侵入することを常には許容し得ない。迅速な遠心分離に対する１つの代替的な方法は、遠心分離をある時間遅らせ、その後の架橋結合が生じる前に、フィブリンモノマー、血小板及び成長因子が移植片材料の穴のあいた表面を取り巻き、侵入することを許容することである。混合体は、遅れ期間の間、周期的又は連続的に混合して各移植片粒子の分散及び被覆を向上させ得る。移植片材料の粒径により決まる適切な時間の経過後、フィブリン形成の架橋結合ステップの間にネットワークを圧縮することで移植片を詰め込み、フィブリン血小板のネットワークを安定化するために、遠心分離を開始することができる。
【０１２３】
骨移植片材料の粒径に依存して、遅れは広範囲のものとすることが可能である。粒子が大きければ大きい程、遅れに伴う有利な効果は少なくなる。３ｍｍ以上の自己由来並びにヒト及び動物の移植片の場合、移植片をフィブリン血小板ネットワーク内に組み込むのに遅れは全く不要であり得る。０．５ｍｍ以上３ｍｍ以下の移植片の場合、１〜２０分（例えば、３分の遅れ）が、架橋結合過程の間の遠心分離を許容しつつ、移植片材料を充分に組み込むことを可能にする。０．５ｍｍ以下の移植片材料の場合、３〜２５分の遅れ（例えば、５分の遅れ）が、架橋結合する間の、充分な組み込み及び圧縮を可能にする。この場合にも、ＰＲＰのカルシウム再沈着を遅らせることは、凝固の開始前に、ＰＲＰを移植片内に吸収させることを許容する。１つの実施例において、カルシウムは、第二の管内に予め充填されず、１〜３０分、理想的には、５〜１５分の浸漬時間の後、添加される。
【０１２４】
その他の場合、脊柱癒合用の骨ロッドのような大容積の移植片材料が採用される。これらの場合、凝固前に、血漿、血小板及び／又は成長因子を多孔質表面内により深く侵入させるべく移植片材料をＰＲＰ内に浸漬し、これによりその後のフィブリン−血小板ネットワークの移植片材料中への組み込みを向上させることが望ましい場合がある。このことは、第二の管に移した後に、ＰＲＰに対する抗凝固剤であるキレート剤と結合した内因性カルシウムと置換するであろう、カルシウム又はその他のカチオン系種の添加を遅くすることで実現することができる。カルシウム凝固活性剤は、移植片材料の性質及びその後凝固中の遠心分離によって決まる、適切な時間的遅れの後、管に直接添加することができる。これと代替的に、第二の管に接続し且つ、遠心分離速度を増すことにより作動するカルシウム溶液を保持するリザーバを使用して、単一管システムの実施形態の方法と同様の方法にて、カルシウム凝固活性剤を添加してもよい。
【０１２５】
ＰＲＰを傷口の表面に吹き付け、インシトゥーでフィブリン−血小板ネットワークを形成することも望ましい。この方法は、治癒効果を向上させる。フィブリンは接着剤として機能し、一方、血小板は、その成長因子を添加することにより治癒を向上させる。この技術を採用する方法の例は：皮膚移植片を火傷又は慢性的な傷口に接着すること；フェイスリフトのような形成手術の間、皮膚を皮下層に接着すること；火傷の創面切除の後、液体が滲み出る傷口をシーリングすること；及び局所的な止血剤を施すことを包含し得る。望ましい効果を実現する１つの方法は、ＰＲＰを再石灰化する管すなわち二次管に移し、そ
の後、ポンプ型エアゾールスプレー又は空気支援型スプレーを管に付け、再石灰化したＰＲＰを傷口箇所に施すことである。その後、ＰＲＰは、インシトゥーでフィブリン血小板ネットワークを形成することになろう。
【０１２６】
１つの代替的な方法は、赤血球細胞の分離後、第一の管から直接圧送するか、又はカルシウム凝固活性剤若しくはその他のカチオン系種を保持しない管内にＰＲＰを移すことであろう。別個の流体多岐管を利用することにより、又はカルシウム結晶を含有するチャンバを通じてＰＲＰを流すことにより、圧送する間に溶液を流体経路に添加することでカルシウムを添加することができる。
【０１２７】
１つの代替的な方法は、移した後、ＰＲＰを遠心分離することにより、カルシウム溶液無しで血小板を第二の管の底部内に濃縮することである。圧送システムに対する吸引部は、管の底部から吸引し、多量の成長因子に対し血小板をより高濃度にて作用させる。吸引ステムは、隔板の下方に血小板濃縮液を閉じ込めるスライド式隔板を有することができる。吸引ステムは、隔板の最初の位置を制限し、これにより分配すべき容積中の血小板の濃度を所望の値に設定するようなストッパを有することができる（図５３参照）。該ストッパは、隔板の下方の血漿の容積中の血小板に所望の濃度を与えるであろう、吸引口の底部から予め設定した距離に配置される。ストッパが吸引ステムにて上方位置に配置されればされるほど、血小板の濃度は低くなるであろう。別の実施形態は、高エネルギの凝血活性化表面を噴霧システムの流体路中に配置する。該表面は、血漿を活性化して、架橋結合密度がより高い凝血塊を形成し、これにより機械的強度を増大し、凝血時間を短縮することになろう。
【０１２８】
移植片材料と共に及び移植片材料無しで二次管からのフィブリン−血小板ネットワークの除去を容易にするため、その他の装置を採用することができる。第二の遠心分離ステップの完了後、フィブリン−血小板ネットワークを第二の管の底部に詰め込み得る。通常、管は、滅菌性カップ内に上澄みを静かに注ぐことができ、ネットワークは、カップ内に自在に流動する。より濃密なネットワークに対し要求される、より高速度の遠心分離速度のとき、上澄みを静かに注ぐことが容易であるように凝血塊をきつく詰め込むことができる。この詰め込みは、管の壁に対して密閉的シールを形成し、このため、上下逆さにしたときに凝血塊が動く際に真空圧が形成され、更なる流れを阻止する。この状態は、遠心分離の間に圧縮される移植片材料を添加することで悪化し、金属粉体の焼結の場合のような、詰め込まれた濃密な基質を形成する。このため、骨キャビティのような傷口箇所にネットワークを添加し得るよう、好ましくは供給システムの一部として、管の底部からネットワークを除去することが望ましい。
【０１２９】
ネットワークの除去を容易にする１つの方法は、穴を設けた底部を有するカップを製造時に第二の管に含めることである（図５４参照）。管からカップを除去する間、遠心分離中に発生した血清の排出を許容するように、底部に穴を設ける（図５４ａ）。カップの壁は、浅い外観のもの（図５４ａ）から管の全長（図５４ｂ）の範囲まで、高さが様々であり得る。カップのリップ部は、供給装置に連結する手段を含有し得る。連結手段は、ねじ、差込ネジロック、クリップ又は同様の機構とし得る。カップの壁は、過度の除去力が回避されるように、除去する間、真空圧を防止し得るための溝を、その壁に有し得る（図５４ｄ）。カップの壁は、凝血塊の上方の血清が、溝に沿って、カップを管から除去する間に形成された下方の容積内に流れることができるような穴部分を有し得る。カップの頂部はまた、カップの円筒状部分を通じたピストンの確実な置換により作動する、供給システムに連結することもできる；この作用は、注射器（図５４ｅ）又は歯止め式「コーキングガン」機構（図５４ｆ）を模したものとし得る。カップ又は供給シリンダの円筒状部分の材料は、蛍光計測技術を使用して正確に供給することを許容し得るよう放射線不透過性とし得る。図５５において、第二の管は、円筒状であり、また、円筒体のどちらかの端にス
トッパを有する。遠心分離後、ストッパを除去し、ピストンが形成されたネットワークを置換する。このことは、カートリッジシステムを構成することになる。これと代替的に、カップを繊維によってストッパに取り付け、ストッパが除去されるとき、カップが引き出されるようにしてもよい。
【０１３０】
本明細書に開示された方法により生産された膜及びフィブリンは、上述したように、細胞を培養するために使用すべき足場として機能することが可能である。フィブリン基質は、足場として機能するのに充分に濃密であり得る。基質は、コラーゲンスポンジのようにゆっくりと吸収される足場材料、生物分解性ポリマー又は腹部大動脈動脈瘤移植片のような生物非分解性ポリマーにて形成することができる。これらの組み合わせ足場は、現在の足場材料と比べ、更なる機械的強度及びより均一な組織再生を供与し得る。ある実施例において、例えば、約４，０００〜１０，０００ｘｇのような大きい遠心分離力を加えることにより得られた膜は、表皮細胞の生体外での接着培養のための足場として機能し得る。これらの培養物は、本来の組織の火傷又は機械的剥離に起因する、皮膚の重度の損傷を修復するめに特に有用である。これらのフィブリン足場は、通常、培養物中の細胞に対し、血小板により成長因子を供与し、また、固体フィブリン網により接着因子を供与する。インビトロで良好な培養物を得るためには、培地中で充分な密度の上皮細胞から開始することが望ましい。
【０１３１】
本明細書に記載した膜及び固体フィブリン網はまた、幹細胞をその上にて融合するために使用し得る。より特定すれば、膜及び固体フィブリン網は、単層又は幾つかの層の細胞又は膜内の幹細胞と共に膵細胞を培養するために使用し得る。例えば、英国、エジンバラ大学のメドヴィンスキー（Ｍｅｄｖｉｎｓｋｙ）及びオレゴン州、ポートランド大学のＸ・ワン（Ｗａｎｇ）は、最近、糖尿病マウスの膵臓内に注射した幹細胞は、そのゲノムを病変膵細胞と融合させ、再度、インシュリン生産活性のある、いくつかの程度の倍数体を生成させることを実証している。本明細書に記載した足場及び支持体中に存在する活性成長因子は、従来の媒体を使用して細胞を成長させることを可能にし、また、融合、生化学的特性及び細胞学的特性を研究することも可能にする。
【０１３２】
異なる適用において、単層培養物から得た軟骨細胞は、当該技術分野の当業者に既知であるように、アルギン酸塩ビーズ内で固定される。これらの固体ビーズは、遠心分離力を使用してより大きい「組織様」凝集物となるように圧縮され、空気圧を調整し、インビボで生理学的応力に従って「組織」を刺激する目的で、これら凝集物は「圧縮」される（ドイツ、ギーセン、応用科学大学、チェルマック（Ｃｚｅｒｍａｋ） Ｐ．））。遠心分離の間、ＰＲＰをアルギン酸塩ビーズに添加して、損傷した軟骨に代えて植え込む用意ができるように、又は軟骨の成長を誘導し得るように数日間生物反応器内で培養する用意ができるように、濃密な生物活性凝集物を製造することができる。
【０１３３】
実施例
【実施例１】
【０１３４】
真空状態で密封可能で、透明な白色ガラスで出来ており、不活性で且つ厚さ１ｍｍの抗生物質用の５ｍｌガラス容器内に、フィブリン安定化剤として機能するトラネキサム酸１００ｍｇを導入した。純度９８％以上である合成トラネキサム酸は、アメリカの会社であるシグマ（Ｓｉｇｍａ）インコーポレーテッドにより市販されている。これと別個に、同一のアメリカの会社シグマインコーポレーテッドからのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（純度＞９９％）を精密はかりにて１４７．０ｇ計量することにより、１ＭのＣａＣｌ２溶液を作製した。
【０１３５】
この塩を、頻繁に攪拌下、数分間、室温にて、正確に１リットルの超高純度非発熱性蒸
留水中に溶解させた。±５％の供給精度（エッペンドルフのような）を有する精密ピストンディスペンサを使用して、８０μＬの活性剤溶液をガラス容器中に導入した。このステップにおいて、供給と同時に、あらゆる粉体又はフィラメントによる汚染の可能性を慎重に防止しつつ、０．２２μｍのミリポア滅菌処理用フィルタを使用してろ過を行った。最後に、その後の真空栓止め、及び気体を使用することによる更なる滅菌処理の可能性を許容し得るように、容器を完全に栓をしないよう注意しつつ、穿刺可能且つ真空圧下にて栓止め可能なゴムストッパにてガラス容器に栓をした。次に、雰囲気中の固体粒子による汚染の可能性を防止しつつ（滅菌チャンバ内のＵＬＰＡ又はＨＥＰＡろ過）、真空栓止めするための適切な装置内に容器を導入した。膜真空ポンプ及び測微制御装置を使用することにより、４ｍｌの真空圧を装置の内部雰囲気に加えた。内部雰囲気中の真空レベルを制御するため、精密真空計測器を使用した（精度＃１ｍバール）。最後に、装置を排出せずに、その後に以下の実施例で説明するように使用すべく回収し得るよう、容器を真空圧下にて栓止めした。
【実施例２】
【０１３６】
例えば、０．１０６Ｍクエン酸ナトリウム溶液を添加したベクトン−ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のバキュテイナ（ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ）（登録商標名）滅菌試験管を使用して、臨床分析のための定量標準に従って、患者から１０ｍｌの静脈血液を吸引した。この目的のために、二ナトリウム又は二カリウムエチレンジアミンテトラアセテートを添加した試験管を使用することもできる。血液を吸引する間、試料を慎重に滅菌状態に保った。最後に、成分を完全に混合し、これによりクエン酸ナトリウムの抗凝固作用を保証すべく、試料を静かに振った。次に、遠心分離装置の損傷を防止するためロータの重量を慎重に釣り合わせつつ、試験管を適切な遠心分離装置内に導入した。蓋が密封されたならば、試料を１５分間、３５００ｒｐｍにて遠心分離し、これにより赤血球細胞（高濃度）をクエン酸添加血漿（上澄み液）から分離した。この場合、主としてドナーの血液の特徴に依存する血漿の収率は、５５％の高さであった。分離した血漿を含有する試験管を滅菌状態下で栓止めした状態に保ち、血漿自体を回収すべくスタンド内に垂直に配置したが、遠心分離中に分離した２相の混合を防止するため、このステップ中試験管を振らないように注意した。次に、変性アルコールを使用して試験管キャップの外側部分を滅菌処理し、次に、滅菌注射器に接続した滅菌針を試験管キャップに導入した。針を２相の分離メニスカスから３〜４ｍｍだけ離し、４ｍｌの血漿を吸引した。実施例１にて説明したように調整した、本発明による容器のキャップを事前にアルコールを使用して滅菌し、同一の針を使用することにより穿刺した。針がキャップを穿刺すると直ちに、注射器内に保持されたクエン酸塩添加血漿を、完全に容器内に吸引した。容器を静かに振り、３７℃にて約２分後、直ちに使用できる滅菌性の自己由来フィブリングルーの凝血塊を得た。
【実施例３】
【０１３７】
５ｍｌのクエン酸ナトリウムバキュテイナ（登録商標名）試験管（ベクトン−ディキンソン）を使用して４９歳の患者から約１８ｍｌの静脈血液を吸引し、試料を吸引した直後に、静かに振るよう注意した。このように採取した血液を、血漿を分離すべく直ちに遠心分離した（２５００ｒｐｍにて１５分間）。実施例１にて説明したように調整した（ただしトラネキサム酸は使用せず）各々１２０μＬのＣａＣｌ２（１０ｇ／１００ｍｌ）を含有する２つの１０ｍｌ試験管に、血漿（１２ｍｌ）を慎重に移した。血漿を活性剤と混合した後、試験管を３０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離し、最終的に、２つの大きいフィブリン試料が得られ、これらフィブリン試料を、滅菌性に対するあらゆる注意を払って、製造後２〜３時間以内に、大きい小嚢状の下顎骨キャビティ内に挿入した。該キャビティは、埋伏した左犬歯及び右側の第二の門歯の抜歯により、及び門歯の歯の中央領域に存在するシストを切除することにより形成されたものである。最後に、歯肉端縁を８回縫って閉じた。１５日後の放射線写真チェックは、フィブリンが外見上無傷のままでその所要位
置に留まっていることを示した。７ヶ月後の組織構造は、フィブリンが骨組織にて完全に置換されたことを明らかにし、同一の結果を実現するのに１２ヶ月以上必要とする従来の方法よりも優れた術後経過であった。自己由来のフィブリンの製造のため何ら抗フィブリン溶解剤が使用されないから、この場合、特定の目的のため上記添加剤が有用であると説明することができる。
【実施例４】
【０１３８】
接着フィブリングルーを生産するため、実施例３のように得られた１２ｍｌの血漿を、滅菌性を保つための全ての措置を採って、実施例１にて説明したように調整した、本発明による２０ｍｌの容器に移した。
【０１３９】
慎重に攪拌した後、混合した血漿を化学実験室にて使用される型式の滅菌性ガラススライドに注ぎ、ここで、血漿を、滅菌性且つ非常に純粋な珊瑚由来の炭酸カルシウム（フランス、ノーテブス（ＮＯＴＥＢＳ）Ｓ．Ａ．のバイオコーラル（ＢＩＯＣＯＲＡＬ）（登録商標名））又はフッ化カルシウム（＞９８％、シグマインコーポレーテッド）と混合した。これらのカルシウム塩は、共に、線維芽細胞の刺激剤として当該技術分野の当業者に周知である。
【０１４０】
血漿の一部分を炭酸カルシウムの一部分と（例えば、２ｍｌ対５００ｍｇで）混合させることにより、柔軟で滅菌性の接着ペーストが得られ、感染した粘液質の嚢を切除した後の歯肉下空間又は異なるキャビティに対するフィラーとして使用した。ペーストは、空の空間を充填するように配置され、止血栓として機能する固体フィブリン網を数分にて形成し、また、粘液質の端縁を所要位置に支持し、後に結合性細胞の移行が開始する箇所に、自己由来の生物学的基層を形成した。
【実施例５】
【０１４１】
フィブリングルーの膜を得るため、実施例３のように得られた２０ｍｌの血漿を、実施例１のように調整した本発明による２５ｍｌの平坦底部の容器に入れた。通常の慎重な攪拌の後、容器を旋回ロータにて４０分間、４０００ｒｐｍにて遠心分離した。遠心分離工程の終了時、試験管の底部から、白色の極めて濃密で且つ引張り強度の大きい膜が回収され、その寸法は試験管の底部と等しく（直径２４ｍｍ）、厚さは３ｍｍであった。この自己由来の膜は、その濃密さ及び強度のため、多孔質合成膜の置換品として、歯科及び一般的な外科手術における保持膜及び分離膜として使用した。得られた膜は、数日間、４℃にて滅菌状態にて保存することができる。
【実施例６】
【０１４２】
大きい寸法のフィブリングルーの膜を得るため、約２００ｍｌのクエン酸添加血漿を患者から吸引し、二重輸血バッグ内に集め分離した。血漿に対し１２時間、−８０℃にて凍結することにより寒冷沈降反応を行い、解凍は４℃にて一昼夜行った（この方法は、当該技術分野の当業者に周知である）。同日の朝、この方法により得られた血漿に対し１５分間、４℃にて５０００ｒｐｍの遠心分離を行い、約２０ｍｌの寒冷沈降物を得た。加圧装置（例えば、フランスの会社、ジョアン（Ｊｏｕａｎ）Ｓ．Ａ．のＸＰ１００）を使用することにより上澄み液を慎重に除去した後、寒冷沈降物を同一患者の２０ｍｌの全血漿と共に取り出した。得られた４０ｍｌを、実施例１のように適切な量の活性剤を含有する本発明による直径３５ｍｍの平坦な底部の滅菌性ポリプロピレン容器に入れた。慎重に振った後、容器を４０分、５０００ｒｐｍにて遠心分離し、実施例５におけると同様ではあるが、フィブリンの含有量がより多量であるために、より濃密で引張り強度の大きい膜が得られた。上記膜もまた、４℃にて数日間、滅菌形態にて保存することができる。
【０１４３】
実施例５にて説明した方法にて得られた膜は、実施例４にて記載した利用に加えて、極
めて重篤な湯症の症例に移植すべき移植片を得るために、同一患者の表皮細胞のインビトロ培養のための基質として使用することができる。
【０１４４】
上述した目的に有用な良好な品質の膜はまた、本発明による容器内に直接移した全分離血漿からも得ることができる。得られた膜は、上述したものよりも薄いが、外科手術用及び細胞成長のための基質として依然として有用である。
【実施例７】
【０１４５】
実施例５における寒冷析出物から開始して噴霧フィブリンを得るため、２０ｍｌの寒冷析出物を室温にて１０ｍｌの全血漿と共に取り出し、静かに振って完全に溶解させた。得られる血漿を、実施例１のように調整した本発明による５０ｍｌの容器内に慎重に移し、成分が完全に混合するように静かに振った。１２０秒後、室温にて、該試験管を当該技術分野の当業者に既知のベンチュリ型滅菌空気コンプレッサに接続して、外科手術が行われる出血器官（肺、心臓、脾臓、動脈吻合）の表面に均一に分配した。濃縮フィブリノーゲン、トロンビン、カルシウムイオン及び他の凝固酵素を含有する濃縮血漿を器官上に分配すると、患者の内皮内に存在する組織性凝固活性化酵素もあるため、数秒にて凝固し、保護止血作用を有するフィブリンフィルムを形成した。これにより、外科手術の内部出血が減少し、故に、更なる輸血又は合併症が回避された。
【実施例８】
【０１４６】
実施例５にて説明した方法により得られた膜はまた、多血小板血漿（ＰＲＰ）を開始血液成分として使用するならば、自己由来の血小板を組み入れることになろう。全血からＰＲＰを得るため、血液試料を１０〜１５分間、１０００ｘｇにて遠心分離し得る。続くステップは、上述した実施例にて説明したものと同様である。
【０１４７】
この適用方法により得られた膜は、ワン及びヴァッシロポウルス（Ｖａｓｓｉｌｌｏｐｏｕｌｏｓ）が記載した（ネイチャー、４２２巻−２００３、４月２４日）幹細胞の融合現象をインビトロで研究するための活性基質として使用することができる。この研究は、マウスの肝臓内で肝細胞の存在下にて成長する幹細胞の使用を開示し、損傷し又は欠陥のある組織を再生することのできる新たな種類の細胞を形成するためにそれらのゲノムを融合させている。
【０１４８】
上述したように得られた膜は、成長因子及び他の刺激剤の提供物である血小板が存在するため、この極めて重要な現象をインビトロにて研究するための支持体として使用することができ、また、最終的に得られた新たな細胞の世代を、インビボに導入すべく使用することができる（軟骨細胞又は上皮細胞に対して行ったものと同様）。
【実施例９】
【０１４９】
以下の方法は全て、滅菌状態にて層流キャビネット下にて操作した。固体の生検試料から開始して表皮組織をホモジェナイザーにて処理し、その単一細胞の完全な状態を保持しつつ、小さな細胞凝集物を分離した。ホモジネートを、４０ｍＭの滅菌ＰＢＳ（リン酸塩緩衝溶液Ｐｈ７．３−ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））にて洗浄後、細胞をＰＰ管内で７〜１５分間、５００〜１０００ｘｇにて遠心分離し、ペレットを回収した。洗浄は２回繰り返した。次に、得られた細胞を０．０５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡの溶液にて２０分間、３７℃にて消化し、細胞を支えるコラーゲン構造体を除去した。
【０１５０】
その後、細胞を滅菌ＰＢＳにて充分に洗浄し、コラゲナーゼを除去した。次に、細胞を培地（例えば、Ｍ１９９、ＨＡＭ−Ｆ１２、又は当該技術分野の当業者に既知のその他のもの）内に再懸濁させ、フィブリン膜の表面に均質に分配した。フィブリン足場の表面における細胞の密度は、上皮細胞の培養結果を良好なものとするために重要である。例えば
、最良の結果は、１〜３×１０４細胞／ｃｍ２の密度の膜にて得ることができ、この場合、細胞は、通常、分配後１５〜６０分で接着し、２〜５時間後、これら細胞は完全に平坦になる。培養物を、３７℃にて５％ＣＯ２及び、Ｒ．Ｈ．９８％の制御された雰囲気内に保ち、培養物の発達を定期的に制御し、結果として、必要ならば、培地を２〜３日毎に交換し、５日間保つことができる。円筒状容器の場合、ＣＯ２培養器内にて、適正なローラシステムを２４時間ベースにて使用し、培地が膜表面を絶えず洗浄して培養中の細胞に栄養を供給するようにした。
【０１５１】
培養は、気体の交換を許容するが内部の滅菌性を保つ通気システムを有する、適正な滅菌性容器内で行う必要がある。フィブリン膜は、容器の内側に形成され、培養時間の全体を通してフラスコの内面に完全に接着する必要がある。
【０１５２】
インビトロで培養物の発達を確認した後（例えば、位相差顕微鏡を使用して）、上面に細胞を有する膜を慎重に除去し、この膜は、滅菌状態下で患者の傷口又は火傷に移植する用意ができており、最終的に、該膜を縫うことで所要位置に保たれる。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】本発明の第一の実施形態を示す斜視図である。
【図２】図１に示した第一の実施形態の一次容器を示す断面図である。
【図３】図２の一次容器の異なる実施形態を示す断面図である。
【図４】図２の一次容器の異なる実施形態を示す断面図である。
【図５】密封した一次容器に穴を開け始める移し装置の第一の端部を示す、図１の第一の実施形態による一部分の拡大部分断面図である。
【図６】密封した一次容器に完全に穴を開ける移し装置の第一の端部、及び密封した第二の一次容器に完全に穴を開ける移し装置の第二の端部を示す、図５に示したものと同様の図である。
【図７】上下逆さにした一次管及びその内容物を示す、図２と同様の図である。
【図８】図１に示した第一の実施形態の平面図である。
【図９】連動した一次容器、二次容器及び移し装置、並びに第一の容器の内容物が第二の容器に移されることを示す、図８の部分断面図である。
【図１０】本発明を具体化するキットの平面図である。
【図１１】本発明の第二の実施形態の斜視図である。
【図１２】図１１に示した本発明の第二の実施形態の断面図である。
【図１３】リザーバ及び一次採取装置を穿刺する一次採取装置を示す、図１２と同様の断面図である。
【図１４】一次採取装置を穿刺し、その内容物を装置内に空けるリザーバを示す、図１２と同様の断面図である。
【図１５】本発明の第三の実施形態を示す斜視図である。
【図１６】図１５に示した本発明の第三の実施形態を示す断面図である。
【図１７】本発明を具体化する移し装置の斜視図である。
【図１８】図１７中の線１８−１８に沿った断面図である。
【図１９】本発明の１つの側面を具体化するカートリッジの斜視図である。
【図２０】図１９のカートリッジの断面側面図である。
【図２１】本発明の別の側面を具体化する軸方向遠心分離システムにて採用し得る装置の斜視図である。
【図２２】図２１に示した装置及び内容物の断面図である。
【図２３】図２１に示した装置及び内容物の、最初の遠心分離の間の断面図である。
【図２４】図２１に示した装置及び内容物の、最初の遠心分離が停止した後の断面図である。
【図２５】図２１に示した装置及び内容物の、２回目の遠心分離の間の断面図である。
【図２６】二次高密度化チャンバの半径が一次細胞分離チャンバの半径よりも大きい、図２１に示した装置の１つの変更例の斜視図である。
【図２７】同心状チャンバが採用される、図２１に示したシステムの１つの変更例の断面図である。
【図２８】図２７に示した装置及び内容物の、最初の遠心分離の間の断面図である。
【図２９】図２７に示した装置及び内容物の、最初の遠心分離が停止した後の断面図である。
【図３０】図２７に示した装置及び内容物の、２回目の遠心分離の間の断面図である。
【図３１】疎水性膜を採用するシステムの断面図である。
【図３２】図３１の拡大部分の図である。
【図３３】織地補強材を有する高密度化チャンバの壁の一部分の、断面図である。
【図３４】壁に張出し部が設けられた、図３３の壁の１つの変更例の断面図である。
【図３５】壁に溝が設けられた、図３３の壁の１つの変更例の断面図である。
【図３６】膜の除去を容易にする、タブを有した取り外し可能なフィルムにて裏当てされた高密度化チャンバを示す図である。
【図３７】はがしを容易にするように孔を有する膜を示す図である。
【図３８】本発明の別の側面を具体化するロータ医療装置の部分断面斜視図である。
【図３９】内壁に１つ又はそれ以上の中実なリブを有する高密度化チャンバの底面図である。
【図４０】半径方向遠心分離システムにて使用するために配向された鋳型（図４０（ａ）にて図示）及び軸方向遠心分離システムにて使用するために配向された鋳型（図４０（ｂ）にて図示）の例を示す図である。
【図４１】漏斗及びランナーがキャビティの充填を促進するように採用される、鋳型を有する装置の一部分の図である。
【図４２】気体及び液体が適正に漏れ出るのを許容すべく通気穴が採用される、鋳型を有する装置の一部分を示す図である。
【図４３】鋳型、２つのチャンバを分割する羽根及び通気口を有する装置を部分断面図で示した斜視図である。
【図４４】図４３の装置の平面図である。
【図４５】鋳型、３つの不同のチャンバを分割する羽根及び通気口を有する装置の平面図である。
【図４６】一体に接続され、装置から伸びる鋳型が示され、羽根が３つの等しいチャンバに分割する、図４５の装置を改変したときの平面図である。
【図４７】多血小板血漿が少なくとも１つのチャンバに導入された後であるが、装置が遠心分離される前の、図４３〜図４６に示した装置の任意のものの一部分の断面側面図である。
【図４８】装置が遠心分離された直後の、図４７に示した装置の一部分の断面側面図である。
【図４９】多血小板血漿が少なくとも１つの鋳型に入った、完全な遠心分離状態にある、図４７に示した装置の一部分の断面側面図である。
【図５０】プラスチック代替品、例えば底部に固定されたガラスを示す、断面図である。
【図５１】プラスチック代替品、例えば底部に接着又は熱によりつないだガラス玉を示す、断面図である。
【図５２】５２ａは、滅菌性フィルムにて包まれ、キャリヤにより収容された一次容器の斜視図である。５２ｂは、一次管におけるカラーを示す、図５４ａの分解図である。
【図５３】本発明のある実施形態と共に採用可能である供給／圧送システムの部分断面図である。
【図５４−１】５４ａは、有孔底部を有し、二次容器により収容されたカップの断面図である。５４ｂは、図５４ａに示したカップの代替的な実施形態を示す断面図である。５４ｃは、図５４ｂの線５４ｃ−５４ｃに沿った断面図である。
【図５４−２】５４ｄは、その長さに沿って孔を有する、図５４ｂに示したカップの代替的な実施形態を示す断面図である。５４ｅは、図５４ａ〜図５４ｄの任意のカップと共に確実な置き換えにより作動する供給システムを示す部分断面図である。
【図５４−３】５４ｆは、コーキングガン機構が利用される、図５４ｅと同様の供給システムを示す部分断面図である。
【図５５】二次管が２つのストッパを有する、供給システムを示す一連の部分断面図である。
【図５６】本発明を具体化する成形可能な挿入体の斜視図である。
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００２年６月２７日付けで出願された、米国仮出願第６０／３９２，６６９号に基づき、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）による優先権を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、固体フィブリン網又は自己由来フィブリングルーを製造するシステム、キットおよび方法に関する。
フィブリングルーは、主として、局所的外科用接着剤又は止血剤として使用される血液誘導物として知られる。異種起源のフィブリングルーを得るため、トロンビン又はバトロキソビンのようなヒト又は動物由来のタンパク質活性剤と関連して、ドナーからの濃縮されたフィブリノーゲンを含有する幾つかのキットが市場にて入手可能である。
【０００３】
そのような既知のキットは、ヒト又は動物由来の材料を使用することを伴い、その由来のため、フィブリングルーの受け手に対し、ウィルス汚染および重篤なリスクを生じる可能性がある。過去、管轄当局は、ヒト又は動物由来の材料を使用して得られた血液誘導物の取引の中止又は禁止さえも余儀なくされていた。更に、ヒト又は動物のタンパク質を使用して生産されたフィブリンを再移植することに起因する、患者における拒絶症例が文献から知られている。そのような症例は、実に、再移植されたシーラントタンパク質又はその製造に使用される成分の幾つかが、受け手生物体に対し異質起源の由来であることに起因する。
【０００４】
自己由来のフィブリングルー、すなわち患者自身の血液から自己由来的に得られたフィブリングルーは、拒絶及び／又は感染リスクに対しより信頼性が高い。即席の自己由来のフィブリングルーを得るための幾つかの方法は既に記述されているが、「直ちに使用可能な」キットは、特許文献にて幾つかの関連参照文献を見出すことができるにも関わらず、市場にて入手可能でない。
【０００５】
米国特許第５，７３３，５４５号は、血漿−軟膜濃縮物とフィブリノーゲン活性剤とを組み合わせ、血小板グルーによる傷口シーラントを形成することを開示する。本特許に開示された方法では、自己由来のフィブリングルーを得るため患者の血液を処理することを許容するが、本方法は、フィブリノーゲン活性剤としてトロンビン又はバトロキソビンを使用する。これらの活性剤は、ヒト又は動物性のものであり、このため、依然として、患者に対する拒絶及び／又はウィルス感染のリスクを伴う。
【０００６】
米国特許第５，５５５，００７号は、組織シーラントとして使用する濃縮血漿を作製するための方法及び器具を開示する。該方法は、血漿を全血から分離すること、および濃縮剤と接触させることにより水を該血漿から除去して濃縮した血漿を提供することから成り、この濃縮した血漿は、その後、トロンビン及びカルシウムを含有する溶液により凝固させることができる。該器具は、第一のチャンバ内の第一の遠心分離機、第一のチャンバと連通する第二のチャンバ内に包含される濃縮剤（例えば、デキストラノマー（ｄｅｘｔｒａｎｏｍｅｒ）又はポリアクリルアミド）、および第二の分離機を含む。本参考文献に開示された方法は、自己由来のフィブリングルーをその後に製造するのに必要な血漿濃縮物を得るため長時間を必要とし、また、器具は高価であり且つ、使い捨て型ではない。この方法は、カルシウム凝固活性剤の使用については開示せず、また、事前の濃縮ステップを必要とする。
【０００７】
多くの方法及びシステムは、流体を１つの容器から別の容器に移すことを必要とする。例えば、多くの化学的及び医療用装置は、色々な試薬及び特定体積のアリコートと逐次反応する必須体積の液体を移すことを必要とする。一般的な方法は、２つの容器の蓋を外し、１つの容器の液体を別の容器にピペットで移すことである。しかし、この方法では、試料を環境的汚染に曝露することになる。例えば、この技術は、血液試料中の赤血球細胞から分離した血漿を移すために使用される。しかし、界面メニスカスにて血漿を除去するため特殊な技術が必要とされる。しばしば、高密度の望ましくない下部分画の赤血球細胞が吸引試料を汚染する。この問題点を回避するため、ピペットは、しばしばメニスカス（すなわち、血漿と赤血球細胞との間の分離体）から安全な距離に保たれ、このため、試料の移しが不完全となる。望ましい分画の移しが不完全である結果、容積収率は最適なものより低くなり、また、試料試薬と第二の容器内の試薬の比が化学量論値でなくなる。この第二の状態は、製品の性能が変動する重大な原因となる可能性がある。これは、特定の化学量論比のとき反応率が最大となり、より大きい比又は小さい比のとき急激に減少するような、多くの酵素反応におけるケースである。
【０００８】
医療において、特に、慢性的潰瘍、ろう孔等の場合、傷口の手当ては最も重要な事項の一つである。この事項は、管理コストが高いのみならず、成功率が低いことからも重要である。傷口の手当て及び火傷の手当てに関連したその他の問題点には、液体の損失及び感染症が生じる可能性が包含される。再骨化の過程において、骨キャビティを軟組織から分離するため、合成膜又は動物由来膜が使用されている。
【０００９】
傷口を手当てする１つの処置は、例えば、コラーゲン、フィブリン、アルブミンのような、動物由来の生物組織又はスポンジ（一般に、タンパク質ベース）を傷口箇所に当てがうことを含み得る。しかし、こうした適用は、一般的にアレルギー及び免疫学的応答を伴う。これら症例の５０％は、１回の適用では解決しない。２０％以上は、２回の適用後も解決しないことがある。
【００１０】
別の処置は、最も困難な症例に対して行われる皮膚移植を含む。しかし、皮膚移植は費用がかかり、１回の適用に約６００〜７００ドルかかり得る。改変を加えた馬コラーゲンメッシュを、新しい自己由来組織を支持するために使用する。この適用は、試料を汚染する可能性とともに、面積に関係して、皮膚組織の培養に２０日までもかかる難しいプロセスである。
【００１１】
全体として、生きた生物内で組織を再生することのできる、自己由来のフィブリングルー又は固体フィブリンを製造する方法及びシステムが望まれる。
【発明の開示】
【００１２】
本発明の１つの実施形態について詳細に説明する前に、本発明は、以下の説明に記載し又は図面に示した構成要素の構造及び配置の詳細にのみその適用が限定されるものではないことを理解すべきである。本発明は、その他の実施形態が可能であり、また、多様な方法にて具体化し又は実施することができる。また、本明細書にて使用した表現及び専門用語は、説明の目的のためであり、限定するものであると見なすべきではないことが理解される。
【００１３】
発明の詳細な説明
本出願は、２００２年４月９日付けにて発行された、米国特許第６，３６８，２９８号の主題を引用することにより組み入れる。本出願は、また、２００２年１月１５日付けにて出願された、米国特許出願第１０／０５３，２４７号、及び２００２年６月２７日付けにて出願された、米国特許出願第６０／３９２，６６９号の主題を引用することにより組み入れる。
【００１４】
本発明は、外科手術にて使用したとき、ウィルス感染及び／又は拒絶症例を少なくとも部分的に緩和し、自己由来のフィブリングルーを迅速に得ることを許容する、直ちに使用可能なキットを提供することができる。
【００１５】
これは、ヒト又は動物何れの由来でもなく、無機化合物であり、このため、感染せず且つ拒絶反応を生じない凝固活性剤を使用することにより実現することができる。
本発明による「直ちに使用可能な」キットは、凝固活性剤として塩化カルシウムを含有する密封した容器を含み得る。塩化カルシウムは、患者の血漿が密封した容器内に導入されたとき、患者の血漿中に存在するフィブリノーゲンを活性化する。
【００１６】
本発明によるシステム及びキットは、ウィルス感染又は拒絶症例のリスクを伴わずに使用し得る自己由来のフィブリングルーの製造を許容するという非常に有利な効果がある。本発明によるキットは、また、極めて短時間に、並びに凝血塊若しくは膜を形成する間又は噴霧の間に、自己由来のフィブリングルーを患者の血漿から製造することも許容し得る。本発明による直ちに使用可能なキットは、また、自己由来のフィブリングルーを既知のシステムと比べてより低コストにて得ることも許容し得る。また、この直ちに使用可能なキットは、迅速な組織再生のための血小板及びその関連した成長因子を提供し得る。
【００１７】
本発明によるキットの更なる有利な効果は、その幾つかの実施形態に関する以下の詳細な説明から当該技術分野の当業者に明らかになるであろう。
本発明によるキットに適した容器は、実施例１にて以下に説明するように、抗生物質用のガラス容器を包含する。ガラス又はプラスチック製の試験管もまた使用し得る。容器の好ましい容積は、５〜１５ｍｌである。試験管は、好ましくは直径１２〜１６ｍｍの範囲及び高さ７５〜１００ｍｍの範囲である。容器は、容器が排気されたとき、その内側空間と大気との間の圧力差に起因する圧力に耐え得るよう適切な厚さでなければならない。好ましくは、底が半球状又は円錐形の試験管は厚さ０．７ｍｍ、底が平坦な試験管は厚さ１ｍｍである。プラスチック製容器は、生産後少なくとも１２ヶ月真空圧を保つことを保証し得るよう、好ましくは０．２〜０．８ｍｍ厚の透明なポリエステル樹脂製である。製造後、プラスチック製試験管は、使用日まで完全な気密性を保証するため、好ましくは熱密封した内側ポリエチレン層を有する錫箔真空気密容器内に入れる。
【００１８】
容器又は試験管を排気することが得策であるが、本発明を具体化するのに必須ではないことを理解すべきである。
容器又は試験管は、容器が完全に気密であることを保証するため、並びに化学成分を導入した後及び蒸気又は放射線滅菌処理ステップの前に真空栓をすることを許容するために適した、ゴム又はシリコーンの穿刺可能なキャップにより密封し得る。
【００１９】
密封後、容器を、３０分間、１２１℃の蒸気にて滅菌処理し得る。滅菌処理は、ガンマ線又は電子ビームの照射によっても行い得る。
フィブリン安定剤であるトラネキサム酸を使用することができるが、純粋な結晶性ε−アミノカプロン酸もまた適する。２０ｍｌの血漿の量に適した２５ｍｌの容器を使用するとき、その量は、約１ｇである。フィブリン安定剤を使用する必要がない場合もある。フィブリン及び血小板のネットワークに包含させるために、性能を向上させるその他の治癒剤を第二の容器に追加し得る。その例として、非限定的に、骨及び軟組織移植片、足場材料、抗生物質、鎮痛剤、幹細胞、癌治癒用の化学毒性剤、免疫抑制剤、所望の分子を発現するよう設計した細胞、及びそれらの組み合わせを包含する。
【００２０】
凝固活性剤として、固体ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ又はカルシウムを含有する液体溶液を本発明によるキットにて使用し得るが、他の凝固活性剤（以下に列記）を使用することもで
きる。例えば、精密薬量計（最大誤差：１〜２ｍｇ）を使用して、１１．７６ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを５ｍｌの容器内に導入し、汚染外部成分が導入されるのを防止することができる。これと代替的に、例えばマグネシウム、マンガン又は亜鉛イオンのような他のカチオン種であって、抗凝固剤に対し内因性カルシウムよりも大きな親和力を有するものを、二価カルシウムカチオン類に代えて使用することができる。抗凝固多血小板血漿（ＰＲＰ）を添加したとき、内因性カルシウムイオン類は、より大きい親和力のカチオン種によって抗凝固剤から置き換えられ、当初の内因性カルシウムイオン類は、凝血活性化のため利用可能になる。
【００２１】
血漿量１２ｍｌに対する１５ｍｌの容器の場合、導入すべき固体無水塩化カルシウム量は３５．２８ｍｇであり、一方トラネキサム酸量は、これに対して３００ｍｇもの結晶となろう。
【００２２】
血漿量２０ｍｌに対する２５ｍｌの容器の場合、導入すべき無水塩化カルシウム量は、５８．８ｍｇであり、一方トラネキサム酸量は、これに対して５００ｍｇもの結晶となろう。
【００２３】
塩化カルシウムは、実施例に使用される無水の形態のほか、例えば、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏのような市場にて入手可能な任意のその他の適した形態とし得る。また、以下の実施例１に説明するように、この塩の溶液を使用することもできる。
【００２４】
本発明はまた、生きた生物にて組織を再生させることのできる固体フィブリン網又は自己由来グルーを形成するシステム及び方法を提供する。これらの方法及びシステムにおいて、血液試料を遠心分離することにより抗凝固血漿が得られる。本明細書に記載した移し装置は、安定的で濃密な自己由来フィブリン及び血小板ネットワークを得る目的で、カルシウム凝血剤を含有する第二の容器に血漿を移し、次いで直ちに遠心分離することを可能にする。本明細書に記載した移し装置は、また、他の用途にて他の液体を移すために使用し得る。換言すれば、本明細書に記載した方法、移し装置及びシステムは、同時的な遠心分離及び凝固を可能にする。これらのシステム及び方法を使用することにより、次の：１）滅菌状態が維持されるような仕方にて試料を操作すること；２）血漿の全量を移して凝血塊の全収率を最大にすること；３）凝血時間を最小にするよう、抗凝固剤とカルシウム凝血剤との化学量論値の比が狭い範囲に維持されること；４）移しが、迅速に完了し、血小板由来成長因子の半減期内で有効なうちに行うことができること；５）通常こうした作業を行わないヘルスケア提供者（例えば、歯科医）が、容易にこれらの方法を行い、システムを作動させることができること；６）装置は、再使用及び血液中に含まれる病原体による汚染の可能性を防止し得るよう単回使用型であること、のうち少なくとも１つを実現することができる。
【００２５】
一般的に述べるならば、本発明は、生きた生物にて組織を再生させるために使用することができる固体フィブリン網又は自己由来グルーを製造するための統合システム及び方法を提供する。ある実施形態（図１に図示）において、システムは、一次容器１０、二次容器１４、及び移し装置１８を備える。好ましくは、一次容器１０及び二次容器１４は管であり、より特定すれば、試験管であるが、流体又は液体を保持することができ且つ、遠心分離可能である任意の容器が本発明の使用に適する。好ましくは、容器１０、１４は、ガラス又はプラスチックで出来ている。
【００２６】
一次容器１０は、標準的な静脈穿刺技術を使用してその内部に血液を吸引し得るものでなければならない。好ましくは、該一次容器１０は、血液が吸引される間、汚染を防止するためシール２２にて密封されるが、容器１０を、その直後に密封してもよい。例えば、ゴムストッパ、キャップ、発泡材、エラストマー又はその他の複合材のような、多様なシ
ール２２を使用して一次容器１０を密封することができる。シール２２は、突き刺せる又は穴を開けられるものでなければならず、このため、ゴム及びシリコーンがシールを作る好ましい材料であるが、シールを提供し且つ、突き刺し可能な任意の材料を使用することができる。一次容器１０は、抗凝固溶液２５を含有し得る。溶液中の抗凝固剤２５は、好ましくは、カルシウム結合剤を含む。より特定すれば、抗凝固剤２５は、クエン酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩、エチレンジアミン四酢酸二カリウム塩及び三カリウム並びにそれらの組み合わせを含み得る。好ましくは、一次容器１０は、クエン酸ナトリウム溶液を含有する。抗凝固剤２５は、該血液を遠心分離の状態に置く目的で、一次容器１０内に採取された血液を薄める傾向にある。更に、一次容器は、密度勾配分離媒体２６、空気２７、並びに高粘度低密度流体２８を包含する（以下に更に説明するキットを示す、図１０を参照）。
【００２７】
密度勾配分離媒体２６は、異なる密度を有する、一次容器１０内の特定の液体又は流体の異なる分画を分離し得るものでなければならない。分離媒体２６は、液体の濃密な望ましくない分画を遠心分離により分離し、その後、除去することを許容する。例えば、分離媒体２６は、血液試料を遠心分離する間に、赤血球細胞３０を多血小板血漿３４から分離し得る。一例において、分離媒体２６は、一次容器１０の底部に見られ得る。他の例において、分離媒体２６は、一次容器１０の内部の周りにリングとして又は他の任意の適した内側の位置に取り付け得る。遠心分離する間、異なる密度を有する液体を分離可能である任意の密度勾配分離媒体２６が本発明と共に使用するのに適しているが、好ましくは、媒体２６はゲルであり、より好ましくは、チキソトロピックゲルである。図２は、血液試料の遠心分離後の一次容器１０を示し、また、ゲル分離媒体２６も示す。好ましくは、チキソトロピックゲルは、該ゲルが通常の周囲状態にて一次容器１０内で流れ又は容器１０の周りで動くことはないが、遠心分離間に遭遇するより大きい遠心分離力にて流れるのに充分な降伏点を有する。最も好ましくは、不要な赤血球細胞の分画３０の高い密度よりも小さいが、望ましい血漿分画３４の密度よりも大きい密度を有するゲルであることが好ましい。換言すれば、血液試料を遠心分離後、赤血球細胞３０を血漿３４から分離することのできるゲル又は他の媒体が最も好ましい。かかる媒体２６は、遠心分離の間容器内にて動き又は流れるが、その後は流れず、これにより遠心分離が完了したとき、分離した分画の間に半恒久的な障壁を形成する。
【００２８】
図３に示すように、一次容器１０内で採用可能な他の適切な密度勾配分離媒体２６は、分画を分離するのに望ましい密度を保持する複数のプラスチックビーズ２６である。該ビーズは、その後に移し装置３８を密封するため必要とされる高粘度、低密度の流体中に懸濁させ得る。遠心分離の間、ビーズ２６は、２つの分画３０、３４の間の境界部に移行し、焼結（ｓｉｎｔｅｒｉｎｇ）と極めて類似する状態にて密集化し、異なる密度を有する分画（すなわち赤血球細胞３０及び血漿３４）の間に安定な障壁を形成する。ペレットを被覆する残留高粘度低密度流体は、密集化した層の安定化に寄与する。
【００２９】
その他の適切な密度勾配分離媒体は、引用することにより本明細書中に組み入れる、コールマン（Ｃｏｌｅｍａｎ）に対して発行された米国特許第５，５６０，８３０号及び米国特許第５，７３６，０３３号に開示されたもののような重合系フロート装置を含む。図４は、重合系フロート装置２６を示す。
【００３０】
一次容器内の低粘度高密度の混和しない流体２８（「ＬＤＨＶ流体」）は、一般的に不活性油を含む。最も好ましくは、ＬＤＨＶ流体は、ポリエステル、シリコーン又は他の不活性流体を含み、置換又は圧力ポンプにより一次容器のゲルの上方の位置に供給される。ＬＤＨＶ流体は、以下に更に説明するように、その内部に入ったとき、移し装置１８のカニューレ３８を通る流れをブロックし又は除去することができなければならない。
【００３１】
二次容器１４（図１及び図１０にとりわけ図示）は、特定の反応に必要な化学試薬を含有する。二次容器１４は、一次容器１０の場合と同様の仕方にて、すなわち、ゴムストッパ、キャップ、発泡材、エラストマー又は他の複合材により、シール２４にて密封される。以下に説明する本発明の１つの適用例において、二次管は、カルシウム凝固活性剤３６を含有し得る。適切なカルシウム凝固活性剤の例は、非限定的に、塩化カルシウム、フッ化カルシウム、炭酸カルシウム及びそれらの組み合わせを包含するが、カルシウムを含む任意の塩であればカルシウム凝固活性剤として充分であろう。更に、その他の活性剤は、グルコン酸カルシウム、フマル酸カルシウム、ピルビン酸カルシウム及び水に溶解し、ヒトと適合する他の有機カルシウム塩を包含する。凝固活性剤は、該活性剤が血漿と接触したとき、血漿を凝固させる。二次容器１４は、内部圧力が実質的にゼロとなるように完全に排気することができる。二次容器１４を排気すると、流体を一次容器１０から移し装置１８を通じて二次容器１４に移すことが容易になる。二次容器１４は、移す間充填される際、気体分子が全く存在しないから、残留する気体が圧縮され圧力が上昇することはない。その結果、流量は最大となり、完全な移しが促進され、排気が不要になることで滅菌性が維持され、また、望ましい反応に対する望ましい化学量論値の比が維持される。
【００３２】
別の実施形態において、二次容器は、また、抗生物質、鎮痛剤、癌治癒剤、血小板成長因子、骨形成タンパク質、幹細胞、骨移植片材料、軟組織移植片及び細胞培養材料、免疫抑制剤及びそれらの組み合わせのような１つ又はそれ以上の治癒増進剤を含有し得る。局所的に投与できる他の治療剤もまた、包含し得る。抗生物質の例は、非限定的に、アンピシリン、エリスロマイシン、トブラマイシン及びそれらの組み合わせを包含する。鎮痛剤は、非限定的に、アスピリン、コデイン及びそれらの組み合わせを包含する。癌治癒剤は、非限定的に、５−フルオロウラシルを包含する。骨移植片材料は、非限定的に、自己由来骨、死体からの同種異系移植片（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）又は同種移植片（ｈｏｍｏｇｒａｆｔ）、動物由来骨（異質移植片（ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ）又は異種移植片（ｈｅｔｅｒｏｇｒａｆｔ）；例えば、羊、ウシ、豚、馬）、合成骨移植片（リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、硫酸カルシウムセラミック）、正生物性（ｏｒｔｈｏｂｉｏｌｏｇｉｃ）化合物（血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ））、骨形成因子（ＢＭＰ）、組み換えヒト骨形成因子（ｒｈＢＭＰ）、及びそれらの組み合わせを包含する。軟組織移植片及び細胞培養材料は、非限定的に、皮膚、皮膚移植片材料（オルガノジェネシス（Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）が販売するアプリグラフ（Ａｐｌｉｇｒａｆ））、歯肉移植片（例えば、柔軟なパレット（ｐａｌｅｔｔｅ）からのもの）、コラーゲン、生物吸収性移植片、脈管移植片、ＰＤＧＦ、血小板因子４（ＰＦ４）、トロンボグロブリン、トロンボスポンジン、デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）社のテフロン（ＴＥＦＬＯＮ）（登録商標名）及びダクロン（ＤＡＣＲＯＮ）（登録商標名）及びそれらの組み合わせを包含する。免疫抑制剤は、非限定的に、臓器移植用の免疫抑制剤（例えば、コルチコステロイド、カルシン（ｃａｌｃｉｎ）ノイリンブロッカー（サイクロスポリン、タクロリムス、ＳＫ５０６）、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン）及び皮膚免疫抑制剤（セロリムス（ｓｅｒｏｌｉｍｕｓ）、スピンゴシン（ｓｐｉｎｇｏｓｉｎｅ）１−リン酸レセプターアゴニスト（ＳＴＹ７２０））を包含する。望ましい分子の発現及び遺伝子治療用の生きた細胞も包含し得る。
【００３３】
移し装置１８は、例えば、図１に示すような２つの部分を含むことができ、又は、これと代替的に、例えば、図１７及び図１８に示すような単一部分とし得る。図５及び図６並びに図１７及び図１８に最も良く示すように、移し装置１８は、第一の開口部４６を有する第一の端部４２と、第二の開口部５４を有する第二の端部５０とを有するカニューレ３８を含む。カニューレ３８の端部４２、５０は、一次容器１０及び二次容器１４のシール２２、２４に穴を開け又は該シールを貫通し得るように鋭角又は尖ったものである（または、これら端部に斜角面をも有する）。容器を操作する間、指が偶発的に付着するのを防止する目的で、カニューレ３８を、ハウジング５８に引っ込ませ且つ、同軸状に取り付け
る。ハウジング５８は、カニューレ３８に対し中央方向及び軸方向に向き決めされた２つの円筒状の対向した案内部６２、６４を有する。案内部６２及び６４は、一次容器１０及び二次容器１４を、移し装置１８の第一の端部４２及び第二の端部５０まで案内する機能を果たす。図５及び図６は、容器１０、１４を第一の端部４２及び第二の端部５０まで案内する案内部６２、６４を示す。
【００３４】
カニューレ３８の端部４２、５０は、密閉シールを形成する安全弁、鞘又はエラストマー性スリーブ６８、７２にて取り囲み又は覆い得る。安全鞘６８、７２は、また、第一及び第二の開口部４６、５４を覆う。第一及び第二の端部４２、５０がエラストマー性スリーブ６８、７２に穴を開けると、これに応じて、スリーブ６８、７２は引っ込む。図５は、第一の端部４２が一次容器１０のシール２２に穴を開け始め、これに応じてスリーブ６８が後退し、一方、スリーブ７２は依然として第二の端部５０を完全に覆う状態を示す。端部４２、５０は充分に伸びてシール２２、２４に完全に穴を開けるが、更に容器１０、１４内に伸びることはない（図６に示すように）。このことは、逆さの一次容器１０の液体容積を二次容器１４に最大量移すことを許容する。図６はまた、第一及び第二の端部４２、５０が第一及び第二の容器１０、１４のシール２２、２４に完全に穴を開け、また、スリーブ６８、７２の双方が完全に後退した状態を示す。エラストマー性スリーブ６８、７２は、穴が開いていないときの気体又は液体の流れを阻止する。スリーブ６８、７２の適切な材料は、非限定的に、多様なゴム類及び熱可塑性エラストマー類を包含する。
【００３５】
第一の実施形態の操作について説明すると、血液が標準的な静脈穿刺技術を使用して一次容器１０内に吸引されたならば、血液は、その内部の抗凝固剤２５によって抗凝固化される。典型的には、一次容器１０は、血液が吸引される間密封されているが、その後に該一次容器を密封してもよい。一次容器１０を密封することは、その内容物の汚染を防止する。その後、一次容器及びその内容物１０（例えば、血液、抗凝固剤２５、分離媒体２６及びＬＤＨＶ流体２８）を遠心分離する。許容可能な遠心分離は、５〜１５分間、９００〜３，５００ｘＧの重力にて行うことができる。好ましい実施形態において、一次容器を、約１０分間、約１，０００ｘＧの重力にて遠心分離する。この最初の遠心分離は、一次容器の内容物又は分画を、例えば、図２に示すような、複数の層に分離する。該層は、（遠心分離後の、一次容器１０の底部から容器の頂部への順序にて）、赤血球細胞層３０、分離媒体２６、多血小板血漿層３４、ＬＤＨＶ流体層２８及び最後に残留気体２７の容積を大気と等しい圧力で包含する。これらの層の比率は、用途毎に様々であり得るため、単に説明の目的にのみこれら比率を示してある。遠心分離に次いで、移し装置１８を使用してシール２２に穴を開ける前に、密封した一次ホルダ１０を逆さにする。換言すれば、図７に示すように、密封された開口部が最下方の垂直位置となるよう一次容器１０を逆さにする。一次容器を逆さにすると層が配置される順序が変わる。シール２２の上方には、底部から頂部への順序にて次の層：多血小板血漿３４、高粘度低密度の混和しない流体２８、残留気体２７、分離媒体２６及び赤血球細胞３０がある。
【００３６】
次に、図８に最も良く示すように、二次容器１４をその密封した開口部２４が最上方の位置にある状態に垂直位置に配置する。これにより、二次容器１４が一次ホルダの内容物を移し得るように配置される。図８は、移すための適正の位置である、二次容器１４の上方にある移し装置１８の上方の逆さの位置にある遠心分離後の一次容器１０を示す。次に、移し装置の案内部６４を二次容器１４の上方に配置して、その二次容器１４を案内する一方、逆さの一次容器１０を他方の案内部６２内に配置する（又は、その逆）。換言すれば、シール２２、２４のどちらに穴を開けるためにも、カニューレ３８の端部４２、５０のいずれもを使用できる。移し装置１８は両端にて対称であるから、ユーザは、ある程度の間違えようのない操作が可能となる。次に、ユーザは、容器を互いに押し付けて、シール２２、２４の双方に、それぞれのカニューレ端部４２、５０の各々で穴を開ける。端部４２、５０を覆う２つの弁スリーブ６８、７２は、更に操作を間違えようのないものにす
る。まず、第一の端部４２が一次シール２２に穴を開けるならば（この場合にも、どちらのシールに穴を開けるためもいずれの端を使用できる）、他端５０を覆う穴が開いていないスリーブ７２は流体を保持し、これにより、流体の流出を阻止する。一方、他端５０が他方のシール２４（従って、スリーブ７２）に最初に穴を開けるならば、第一の端部４２を覆うスリーブ６８により真空が維持される。
【００３７】
図６及び図９に示すように、端部４２、５０が双方のスリーブ６８、７２及びシール２２、２４に穴を開けると、望ましい流体は、差圧により一次容器１０から二次容器１４へ移される。換言すれば、二次容器１４内の圧力は排気されているから、一次容器１０の内容物（より特定すれば血漿３４）は、二次容器１４内に流れる。当初、周囲圧力に等しい一次容器１０内の圧力は、液体量が低下し、気体の容積が膨張するに伴って、降下する。しかし、圧力がゼロとなる時はない。二次容器１４は、ゼロ又はゼロよりも僅かに高い圧力に完全に排気されるから、管が充填されるとき、圧縮すべき気体は殆ど又は全くないため、その内部の圧力は上昇しない。従って、器具１８は、多様な液体及び溶液を１つの管から別の管へ移すために使用することができ、また、血液を移すことにのみ制限されると解釈されてはならない。
【００３８】
一次容器１０内での層の特定順序の配置により、多血小板血漿３４は容易に移される。更に、一次容器１０は、排気レベルに予め設定されるから、容器は、血液を採取した後、部分的にのみ充填する。このことは、移す間、気体の容積が膨張したとき、「上部空間」の気体が有意にゼロ以上に止まることを許容し、これにより、二次容器１４に迅速且つ完全に移すことを許容する。このことは、理想気体の法則及びポアズイユ−ハーゲンの方程式によるものである。
【００３９】
一次容器の内容物又は部分（すなわち多血小板血漿）の移しは、ＬＤＨＶ流体２８がカニューレ３８に入るまで続く。ＬＤＨＶ流体の高粘度は、カニューレ３８の狭小な管腔を詰まらせ、これにより流れは中断する。これにより、汚染された血液移し装置を除去しようとするとき特に重要な移し装置１８の再使用を妨げ、また、その前の使用もしくは別の患者における使用に伴う血液中の病原体による偶発的な汚染も防止する。
【００４０】
二次容器１４への血漿分画３４の移しが完了し、これにより最大の収率が許容され且つ、試薬の適正な化学量論比を保つことが許容される。次に、血漿３４が、二次容器１４内の凝固活性剤３６に接触し、これにより混合体６０を形成し、この混合体は直ちに遠心分離して固体フィブリン網を形成することができる。一次容器１０と二次容器１４との間の差圧は、移しの間ずっと実質的に維持され、迅速な移しを許容する。移し装置１８は、管がかみ合う順序の影響を受けず、装置を実質的に間違えようのないものにする。最後に、移しは排気なしに行われ、試料の滅菌性及び汚染の無い状態を維持する。
【００４１】
全体として、移し装置１８は、固体フィブリン網を形成する目的で、血漿３４をカルシウム凝固活性剤３６と接触させ、その直後、血漿の同時的な凝固及び遠心分離を行うことができる、迅速且つ効率的な方法を提供する。固体フィブリン網は、生きた生物にて身体組織を再生するのに適する。かかる方法は、血漿がカルシウム凝固活性剤３６と接触する前に、その水を除去することにより、まず血漿を前濃縮化する必要性を緩和する。更に、移し装置１８は、多様な用途で血液又は他の流体を移すために使用することができる。
【００４２】
本発明はまた、図１０に示すような直ちに使用可能なキットを提供する。該キットは、一次容器１０、二次容器１４、及び移し装置１８を含む。キットの１つの実施形態において、キットは、包装体に載せる２つのトレー７０、７４を有し得る。第一のトレー７０はステップ１に必要な構成要素の全てを有し、第二のトレー７４はステップ２に必要とされる全ての構成要素を有する。勿論、構成要素は、様々な仕様にて配置することができる。
【００４３】
ステップ１は、血液を一次容器１０に採取し、その後、遠心分離して多血小板血漿を得ることを含む。第一のトレー７０の構成要素は、静脈穿刺箇所を清浄にするアルコール綿棒７８、多数試料血液採取針８２（２１ゲージ×２５．４ｍｍ（１インチ））、安全ホルダ８６、抗凝固剤（例えば、クエン酸塩）を含有する一次容器１０、ゲル、ＬＤＨＶ流体、及び静脈穿刺箇所を覆う包帯９０を含む。静脈穿刺箇所を、滅菌アルコール綿棒７８にて清浄にする。針カートリッジ８４を開け、安全ホルダ８６内にねじ込む。次に、針８２を患者の静脈に挿入し、容器１０をホルダ８６に接続する。次いで、血液が容器に充填し、また、針８２は引き抜かれ且つ、ホルダ８６内に引っ込む。ホルダの端部はヒンジ止めフラップにより閉じられる。静脈を包帯９０にて閉じる。容器１０を約１０分間、約１０００ｘＧにて遠心分離し、血漿を赤血球細胞から分離する。
【００４４】
二次トレーの構成要素は、ステップ２にて使用する構成要素であり、ＡＦ管（自己由来フィブリン管）又は二次容器１４、及び移し装置１８を包含する。ステップ２は、一次容器１０を逆さの位置且つ、移し装置１８内に配置することを含む。二次容器１４は、凝固剤を含有し、移し装置の他端により穴が開けられる。容器１０、１４は、接続され、多血小板血漿は、一次容器１０から二次容器１４へ流れる。次に、二次容器を、直ちに約３０分間２３００ｘＧにて遠心分離し、血小板を有する濃密なフィブリン又は固体フィブリン網を得る。
【００４５】
本発明の第二の実施形態は、図１１〜図１４に示すような、固体フィブリン網を製造する別の統合システムを提供する。該システムは、第一の実施形態の一次容器１０と極めて類似した一次採取装置１０を含む。採取装置１０は、密度勾配細胞分離媒体２６（上述の通り）及び抗凝固剤（図示せず）、並びに、一次採取装置１０に接続若しくは統合できるリザーバ９４とを含有し得る。本発明の第一の実施形態に関して、より特定すれば、分離媒体２６に関して上述したことは、本発明の第二の実施形態にも当てはまる。換言すれば、分離媒体２６に対し同一の材料を使用でき、また、同一の材料が好ましい。例えば、最も好ましくは、分離媒体２６はチキソトロピックゲルを含み、該ゲルの降伏点は、該ゲルが通常の周囲状態にて流れるのを阻止するが、ゲルが遠心分離の間に遭遇するようなより大きい遠心分離力では流れることを許容する。分離媒体２６は、図１１に示すように、一次採取装置の底部（すなわち、開口部の他端）に配置し得る。これと代替的に、分離媒体は、一次採取装置の内部の周りにリングを形成し得る。該一次採取装置１０は、一次採取装置が高密度低粘度の流体を保持しなくてもよい点を除いて、上述した一次容器１０と本質的に同一である。好ましくは、一次採取装置１０は、ゴムストッパ又はキャップのような（上述したような）シール２２を有する。
【００４６】
リザーバ９４は、チャンバ９６、及び該チャンバと流体的に連通したカニューレ１００を含む。チャンバ９６は、液体試薬１０４、最も好ましくは、カルシウム凝固活性剤を含有する。好ましくは、カルシウム凝固活性剤は、塩化カルシウム、フッ化カルシウム、炭酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、フマル酸カルシウム、ピルビン酸カルシウム及びそれらの組み合わせである。カニューレ９６は、一次採取装置１０のシール２２に穴を開けることが可能でなければならない。ある好ましい実施形態において、カニューレは、周囲状態下、チャンバ９６内の試薬１０４がカニューレ１００から流れ出るのを阻止する降伏点のゲルのような、ブロッキング媒体１０８を含有する。他の適切なブロッキング媒体は、非限定的に、ばねつきボール、弁、ばね負荷式弁、穿刺可能な膜、及びアンプル（すなわち、流体又は粉体にて充填された中空の膜）のような力作動式の機械的システムを包含する。ゲル１０８の降伏点は、チャンバ９６と一次収集装置１０とが係合している場合、これらが連通することを許容するように、特に大きい重力にて遠心分離したときにゲル１０８が動くようなものとする。リザーバ９４は、また、リザーバを採取装置１０まで案内するために使用される案内ハウジング１１０を有し得る。カニューレ１００は、その滅
菌性を保つため、エラストマー性スリーブ１１２により取り囲まれ又は覆われ得る。スリーブ１１２については、第一の実施形態に関して上述した通りである。
【００４７】
他の実施形態において、チャンバ９６は、また、抗生物質、鎮痛剤、癌治癒剤、血小板成長因子、遺伝子治療用の骨形成タンパク質、追加的な使用のための幹細胞、及びその他のホルモン剤のうち１つ又はそれ以上を含有し得る。投与可能なその他の治癒剤もまた包含し得る。抗生物質の例は、非限定的に、アンピシリン、エリスロマイシン及びトブラマイシンを包含する。鎮痛剤は、非限定的に、アスピリン及びコデインを包含する。癌治癒剤は、非限定的に、５−フルオロウラシルを包含する。
【００４８】
実施時、患者の血液１１６を、上述した従来の静脈穿刺技術によって一次採取装置１０内に採取する。一次採取装置１０内の抗凝固剤は、遠心分離前に、血液を薄める。その後、図１３及び図１４に示すように、リザーバ９４のカニューレ１００を一次採取装置１０のシール２２を通じて穿刺することにより、リザーバ９４を一次採取装置１０に結びつける。カニューレ１００がシール２２を穿刺するとき、スリーブ１１２は後退する。カニューレ１００の長さは、シール２２に穴を開けるのに充分であるが、カニューレは、可能ではあっても、採取装置１０内に更に伸長しないことが好ましい。
【００４９】
次に、採取装置１０及びリザーバ９４を遠心分離する。管に加わる遠心力は、等式Ｆ＝ｍω２ｒにて表わされ、ここで；Ｆ＝力、ｍ＝システムの質量、ｒ＝ロータの中心からの半径方向距離、ω＝回転角度率である。リザーバは、一次管のゲルよりもｒが小さいため、発生するせん断応力が充分でないから、リザーバのカニューレ内のゲルは動けない。一次管１０を、細胞が分離し、ゲル２６が図１３に示すような細胞／血漿の境界に動くまで、低重力にて旋回する。換言すれば、第一の実施形態と同様に、約１０分間、約１０００ｘＧの最初の遠心分離後、分離媒体２６は赤血球細胞３０を多血小板血漿３４から分離する。最初の遠心分離には、約５〜１５分間、約９００〜１５００ｘＧの遠心力での遠心分離も許容可能である。
【００５０】
その後、遠心分離速度を増し、リザーバは充分に大きい遠心力を受け、このため、カニューレ１００内のブロッキング媒体１０８は、一次採取装置１０内に排出され、液体試薬１０８（例えば、カルシウム凝固活性剤）は、図１４に示すように、リザーバから排出される。その後、内容物を、約１５〜４０分間、約２３００〜６０００ｘＧにて遠心分離し得る。カルシウム凝固活性剤が一次採取装置内で血漿に接触する際、試料は依然として遠心分離されているから、即時的且つ同時的な凝固及び遠心分離が起こる。その結果、組織の再生に適した固体フィブリン網が形成される。一次管の細胞分離の実施及びその後の適正な化学量論値比における液体凝血剤の添加は、移しなしに、１つの管内で行われる。速度及び時間に関して遠心分離機をプログラムすることにより、本発明は、簡単で間違えようのない方法を提供する。
【００５１】
ある代替的な実施形態において、単一の採取装置１０は、図１５及び図１６に示すように、内側区画室１１９及びリザーバ９４を有する。リザーバ９４は、一次採取装置１０と統合又は接続し、該区画室と流体的に連通する。管、導管又は開口部１２０は、区画室１１９とリザーバ９４との間の流体的連通状態を提供し、ブロッキング媒体１０８にて密封される。この場合にも、ブロッキング媒体１０８は、上述したように、特に大きい重力に曝されたとき、活性化し、動いてリザーバ９４と一次採取装置１０との間の連通を許容する降伏点を有する。ゲル又は媒体の降伏点は、血液細胞を血漿から分離するための最初の遠心分離の間、動かないようなものである。第三の実施形態において、装置の各々の端部は開口部を有し、各々の端部は、ゴムストッパ、キャップ、発泡材、エラストマー又はその他の複合材のような取り外し可能又は取り外し不可能なシール２２、１２２により密封されている。ストッパ１２２を有するリザーバ９４は、採取装置のシール２２及び開口部
の他端に配置する。
【００５２】
別の実施形態において、リザーバ９４は、抗生物質、鎮痛剤、癌治癒剤、血小板成長因子及び骨形成タンパク質のうち１つ又はそれ以上を含有し得る。投与可能なその他の治癒剤もまた含有し得る。抗生物質の例は、非限定的に、アンピシリン、エリスロマイシン及びトブラマイシンを包含する。鎮痛剤は、非限定的に、アスピリン及びコデインを包含する。癌治癒剤は、非限定的に、５−フルオロウラシルを包含する。
【００５３】
第二の実施形態に関して上述したのと同一の方法にて、代替的な実施形態が使用される。すなわち、遠心分離装置が２つの異なる遠心力にて制御される：１）第一のものは、血漿を赤血球細胞から分離するのに充分な力であり；２）第二のものは、リザーバと装置との間の管、導管又は開口部１２０内のブロッキング媒体１０８を、主要本体内に動かすのに充分な力である。その結果、カルシウム凝固活性剤が装置の内部に入ることが許容される。このことは一方、遠心分離が第二のより大きい重力にて進行する際、固体フィブリン網を形成する目的で、血漿の同時的な遠心分離及び凝固を行うことを可能にする。固体フィブリン網又は自己由来グルーを得るために、シール１２２を取り外し得る。好ましい実施形態において、シール１２２は突き通して装着され、図１６に示すように装置１０からねじ抜きすることができる。
【００５４】
１つの側面において、本発明は、生きた生物にて組織を再生するのに適した自己由来固体フィブリン網を製造するシステムを提供する。該システムは、分離媒体及び低密度高粘度液体を含有する、密封した一次容器を含む。分離媒体は、容器が血液を含有し、遠心分離され、一次容器が第一の圧力を有するとき、赤血球細胞を血漿から分離することができる。該システムは更に、カルシウム凝固活性剤を含有する密封した第二の容器を含む。第二の容器は、第一の圧力より低い第二の圧力を有する。該システムはまた、第一の端部及び第二の端部を有するカニューレを包含する移し装置を含む。第一及び第二の端部は、第一の容器と第二の容器との間に流体的連通状態を提供する目的で、密封した一次及び二次容器に穴を開けることができる。一次容器の低密度高粘度液体は、カニューレ内に入ったとき、カニューレを通る流れをブロックすることができる。
【００５５】
別の側面において、本発明は、生きた生物で組織を再生することのできる固体フィブリン網を製造する別のシステムを提供する。該システムは、第一の圧力を有し、その中に吸引して血液を有することのできる、密封した一次容器を含む。該システムは更に、第二の圧力を有し、カルシウム凝固活性剤を含有する、密封した第二の容器を含む。第二の圧力は第一の圧力よりも低い。該システムはまた、第一の端部及び第二の端部を有するカニューレを包含する移し装置を含む。第一及び第二の端部は、密封した容器に穴を開けることができ、移し装置は、一次容器内に吸引された血液の部分を差圧によって第二の容器に移すことができる。該システムはまた、一次容器から移し装置を通じて二次容器に移された血液であって、生きた生物の組織を再生することのできる固体フィブリン網を形成する目的で、カルシウム凝固活性剤と接触させる血液の部分を、同時的に遠心分離及び凝固するための、遠心分離装置を包含する。
【００５６】
別の側面において、本発明は、生きた生物で身体組織を再生するための固体フィブリン網の製造方法を提供する。該方法は、血液を患者から一次容器内に吸引し、一次容器内で血漿を血液から分離することを含む。一次容器からの血漿を、血漿とカルシウム凝固活性剤とを接触させる目的で、第一の端部及び第二の端部を有するカニューレを含む移し装置を使用して、カルシウム凝固活性剤を含有する二次容器に移す。血漿及びカルシウム凝固活性剤を、固体−フィブリン網を形成する目的で、二次容器内で同時的に凝固及び遠心分離する。固体フィブリン網は、生きた生物で身体組織を再生するのに適する。
【００５７】
別の側面において、本発明は、生きた生物で組織を再生するのに適した固体フィブリン網を製造する別のシステムを提供する。該システムは、内部を有し、分離媒体を含有する密封した一次採取装置を含む。該一次採取装置は、血液を内部に吸引して有することができ、分離媒体は、一次採取装置が血液を含有し遠心分離されるとき、血漿を赤血球細胞から分離することができる。該システムは更に、チャンバと、該チャンバと流体的に連通した導管とを有するリザーバを含む。チャンバは内部にカルシウム凝固活性剤を有し、また、導管はブロッキング媒体にて少なくとも部分的に充填され、活性剤が周囲状態下にてチャンバ外に流れ出るのを防止する。
【００５８】
別の側面において、本発明は、生きた生物にて組織を再生することのできる固体フィブリン網を製造する別の方法を提供する。該方法は、シールを有する一次採取装置内に患者から血液を吸引すること、及びチャンバと、該チャンバと流体的に連通した導管とを有するリザーバを提供することを含む。該チャンバは、カルシウム凝固活性剤にて少なくとも部分的に充填されており、また、導管はブロッキング媒体にて少なくとも部分的に充填され、活性剤が周囲状態下にてチャンバから流れ出るのを阻止する。チャンバ、導管及び採取装置は、ブロッキング媒体がなければ流体的に連通するように、リザーバは一次採取装置に接続する。次に、一次採取装置を第一の速度にて遠心分離する。第一の速度は、血漿を血液から分離するのに充分であるが、導管内のブロッキング媒体を一次採取装置内に動かすのには充分でない。次に、一次採取装置を第二の速度にて遠心分離する。第二の速度は、ブロッキング媒体の少なくとも一部分を導管から一次採取装置内に動かすことを許容するのに充分であり、これによりカルシウム凝固活性剤が採取装置内に流れ血漿と接触することを許容し、これにより生きた生物の組織を再生するのに適した固体フィブリン網を形成する。
【００５９】
上述したシステムの殆どは、凝血塊を圧縮する目的の、第二の遠心分離の間、半径方向遠心分離（すなわち、管の軸線が遠心分離装置の軸線に対し垂直な位置の配置）を採る。しかし、これらのシステム及び装置が使用されるとき、遠心分離工程は、滅菌上の懸念のため、手術室内で行うことはできない場合がある。このため、別の側面において、本発明は、手術室内へ伸びる滅菌管外側部を提供し、標本を滅菌状態下にて採取し、その標本を手術室外に運び、その標本を遠心分離装置内で処理し、このようにして、手術室内に再度導入されるとき、管外側が滅菌状態にあることを保証する。
【００６０】
よって、上述した任意の２管システムと共に、一次及び二次管の双方は、除去容易なフィルム又はこれと代替的に、成形した運搬体にて包装し得る。図５２は、剥ぎ取り片を有するシュリンクラップ、又は剥ぎ取り容易な底部を有するギザギザ付き端部を有するシュリンクラップを包含し得るフィルムの設計を示す。図５２は、一次又は二次容器を手術室のような滅菌された場に導入することを許容する滅菌管運搬体を示す。該運搬体は、図５３に示すように、取り扱いの更なる水準に合うようシュリンクラップし得る。組立体は、放射線により滅菌処理し得る。組立体をその後手術室内で開け、管の内側及び外側は滅菌状態に保たれる。図５３は、運搬体の設計を示す。包装は、一般的に製造中、最小の厚さのものである。管及びラップの双方を放射線により滅菌処理することができ、内面及び外面の滅菌性を提供する。手術室内に入れる直前に、フィルム又は運搬体を一次管から除去し、滅菌した外側管が手術室に入るようにする。更に、フィルムの外面、包まれた管又は運搬体は、手術室内に導入する前に、当該技術分野にて既知の適当な化学物質を使用して汚染除去又は滅菌処理し得る。このことは、フィルム、包み又は運搬体を手術室内で開けることを許容し、これにより、製品の絶対的な滅菌性が保証される。血液を採取し、管を手術室から出し、遠心分離する。滅菌状態の血漿を、フィルム又は容器内にある間に、活性剤を有する第二の管に移し、遠心分離する。手術室に再度入る直前に、外側の包みを除去し、滅菌状態の製品が手術室に入る。この設計の改良点は、除去可能な接着フィルムを一次管のストッパに追加することであり、これにより、移す操作の間の、滅菌表面が許容
される。
【００６１】
更に、上述した１管システムの任意のものを使用するとき、管は、製造中予め組み立てた、フィルム又は運搬体を有し得る。組立体を密閉袋内に配置し、組立体を滅菌処理する。袋を、手術室に入る直前に開ける。その後、針が管のストッパ及びフィルムに穿刺し、血液を採取する。接着フィルムを管のストッパに追加することもできる。管は、手術室から出て、活性剤又は他の物質を有する液体リザーバを組立体に追加する。２段階遠心分離を行い、手術室に再導入する直前に、運搬体を除去する。
【００６２】
全体として、一次及び二次管の双方を、処理する間、滅菌性フィルム又は運搬体内に維持することができ、滅菌状態の外側部分と共に手術室内に再度導入することができる。フィルム又は運搬体を管に予め組み立て、その使用状態は、通常の血液採取管の採取及び遠心分離をするときに見える。フィルム又は運搬体は、気体及び水蒸気に対する透過障壁を提供することにより管の貯蔵寿命及び信頼性を向上させる材料、特に、プラスチック管に有用な材料にて製造することができる。
【００６３】
上記の説明は、濃密なフィブリン及び血小板ネットワーク、及び固体フィブリン網を同時的な遠心分離及び凝固により形成するために使用される多様な方法及び装置を確立する。これら装置及び方法の多くは、管の軸線が遠心分離装置の軸線に対し実質的に垂直の位置に配置し得る、半径方向遠心分離を採る。例えば、管は、遠心分離装置の半径に配置され、ストッパを中心付近に、及び管の底部を遠心分離装置の外端縁に向けて有し得る。上述した適用例の殆どにおいて、第二の遠心分離サイクル中に凝血塊が圧縮する。その結果、遠心力は、管の長さに沿って直線状に変化する。試薬の追加分を活性化するために遠心分離装置の相違する速度を使用することにより、遠心分離力の違いを有益に使用することができる。半径方向遠心分離装置は、商業的用途にて見られる最も一般的な型式であり、その順応性のある使用方法は、特に、その広範囲な利用可能性に着目するとき、製品の設計者にとって有益である。
【００６４】
固体フィブリン網又はフィブリン血小板ネットワークは、血漿、又はより特定すれば、多血小板血漿の、同時的な遠心分離及び凝固により形成された物質を意味し得る。上述したように、固体フィブリン網は、制限のない組織の再生用途にて使用可能である。血漿中のフィブリノーゲンは、フィブリンストランドに変換され、血小板の沈積と同時に沈積する。凝固カスケードの最終的なステップにおいて、フィブリンストランドは、ランダムな方向に架橋し、その結果、ゲル状のコンシステンシーとなる。極めて大きい遠心分離力が加わったならば、フィブリンは高強度の膜内に圧縮される。従って、膜は、より大きい遠心分離力又は重力（上述したような力）にて更に圧縮された固体フィブリン網を意味し得る。
【００６５】
しかしながら、半径方向遠心分離の一つの代替例は、軸方向遠心分離である。軸方向遠心分離を使用するとき、液体を保持する容器はその中心軸線上で回転する。換言すれば、容器は、要するに、ロータのように作動する。その結果、遠心分離装置内に重いロータは最早、不要である。軸方向遠心分離型容器は、一般的に、半径方向ロータよりも半径が小さくなり得るので、等価なｇ力を実現するために、より大きいｒｐｍを必要とする。例えば、遠心分離装置を１０，０００ｒｐｍまで旋回する代わりに、遠心分離装置を２００，０００ｒｐｍまで旋回し得る。必要とされるｒｐｍはより大きいが、重量が顕著に減少すれば安全上の危険が最小になり、モータのコストを不釣合いな程に低減する。換言すれば、ロータを取り除くことにより遠心分離装置の重量が著しく減少する結果、遠心分離装置を、より大きなｒｐｍにて旋回させ得る。
【００６６】
一般的に、遠心分離力は、半径にｒｐｍの２乗（ｒｐｍ２）を掛けた値に比例する。実
際、この方法により著しく大きいｇ力を得ることができる。極めて均一な遠心分離場の強さにて著しく大きい円筒面積が得られる。容器は一般的にロータであるから、軸方向遠心分離は、通常、バッチよりも、単一容器の作動を採用する。このため、細い管が使用され且つ、その軸線の周りで旋回する場合でさえ、膜は、管の外側の大部分以上を覆う。より特定すれば、覆われた円筒体の表面積は、約２πｒｌと定義することができ、ここで、ｒは円筒体の半径、ｌは円筒体の長さである。これに反して、半径方向遠心分離を使用するとき、表面積は、実質的に管の直径になるであろう。このため、半径方向遠心分離を使用すれば２πｒｌに等しい膜が製造され、一方、軸方向遠心分離ではπｒ２に等しい膜が製造される。
【００６７】
軸方向遠心分離の形態は、多様な仕方で実現し得る。例えば、異なるカートリッジを改変した既存のロータ内に配置し得る。これと代替的に、ロータを除去し、そこに使い捨て型カートリッジ又は容器を挿入してもよい。典型的には、軸方向遠心分離と共に使用するシステムは２つのチャンバ、すなわち血液が赤血球細胞と多血小板血漿とに分離される細胞分離チャンバ、及び多血小板血漿が凝固活性剤と接触し、同時的な遠心分離及び凝固が行われて膜を形成する高密度化チャンバを採用することになろう。この場合にも、膜は、多様な組織再生及び傷口のシーラントの用途にて使用することができる。
【００６８】
１つの実施形態において、例えば図１９及び図２０に示すように、滅菌性ドラムロータ使い捨て型カートリッジ２００が提供される。該カートリッジ２００は、例えば、多様なセラミック、ガラス及びプラスチックのような、多様な材料から形成し得る。特定しない限り、本発明にて形成される装置及びシステムは、多様なセラミック、プラスチック、ガラス又はその他の適切な材料から製造し得る。カートリッジ２００は、一般的に、遠心分離装置のドラムロータ内に装着し得るようにした円形の王冠の断面形状とすることができるが、以下に説明するように、ろ過装置により分離した２つのチャンバを有することに比して該形状は重要でない。断面の形状は、フィブリン多血小板膜を回収するためその後に除去することが出来るようなものとする。１つの実施形態において、カートリッジ２００は、中央壁２０８、側壁２１２、頂部壁及び底部壁２１６、２２０及びろ過装置２２４により輪郭が定められた内側チャンバ２０４を有する。内側チャンバ２０４は、上述した細胞分離チャンバとして作用する。頂部壁２１６は、穿刺可能な装填ポート２２８を有することができ、該装填ポートを通じて患者からの血液を内側チャンバ２０４内に導入又は注入し得る。ろ過装置２２４は、別個の量の全血を受け入れる、選択的な遠心分離可能（機械的に支持された）フィルタで出来たものとし得る。ろ過装置２２４は、非限定的に、ポリカーボネート、セルロース、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン又はテフロン（登録商標）を含む多様な材料にて形成し得る。フィルタは、約４〜９ミクロンの孔サイズを有し得る。内側チャンバ２０４は、例えば、１つ又はそれ以上の、半径方向遠心分離法及び装置に関して上記に説明した抗凝固剤のような、抗凝固剤２３２を含有し得る。抗凝固剤２３２は、内側チャンバ２０４に入る血液が凝血するのを防止する。
【００６９】
カートリッジ２００はまた、内側チャンバ２０４よりも一般的に小さい容積の外側チャンバ２３６を有している。外側チャンバ２３６又は周縁タンクは、図２０に示すように、ろ過装置２２４及び周壁２４０、並びに頂部壁及び底部壁２１６、２２０により輪郭が定められる。外側チャンバ２３６は、１つ又はそれ以上の、上述したカルシウム凝固活性剤のような、凝固活性剤２４４を包含し得る。外側チャンバ２３６は、高密度化チャンバとして作用し、ここで、多血小板血漿は凝固活性剤２４４により活性化する。これらの物質は、膜を形成するために同時的に遠心分離及び凝固が行われる。高密度化チャンバ２３６はまた、１つ又はそれ以上の二次活性剤２４８又は治癒増進剤を含有し得る。二次活性剤２４８は、非限定的に、１つ又はそれ以上の、抗生物質、鎮痛剤、癌治癒剤、血小板成長因子、骨形成タンパク質、遺伝子治療用の細胞、更なる用途用の幹細胞、その他のホルモン及びそれらの組み合わせを包含する。投与可能な他の治癒剤もまた包含し得る。抗生物
質の例は、非限定的に、アンピシリン、エリスロマイシン及びトブラマイシンを包含する。鎮痛剤は、非限定的に、アスピリン及びコデインを包含する。癌治癒剤は、非限定的に、５−フルオロウラシルを包含する。二次剤は、ここにおいて、更に、以下に、より特定して説明する、任意の高密度化チャンバに包含し得る。二次活性剤又は治癒増進剤については、上記により詳細に説明してある。
【００７０】
作用時、カートリッジ２００を遠心分離のためドラムロータ（図示せず）に挿入する。内側チャンバ２０４は、既に血液を含有していても、ドラムロータ内に挿入した後にポート２２８を通じて血液を注入してもよい。血液の内側チャンバ２０４内への注入は、標準的な静脈穿刺法を使用して行われる。換言すれば、内側チャンバ２０４を真空状態に保ち得る。血液の凝血を防止するため、内側チャンバ２０４内に抗凝固剤２３２を使用し得る。ポート２２８は内側チャンバ２０４の滅菌状態を維持し、閉システムを提供する。ドラムロータは、幾つかの異なるカートリッジを収容し得る。一般的に、カートリッジ２００の各々は、同様のカートリッジ又は釣合い重りをロータ内の反対側に配置することにより、ロータ内で釣合わせる必要がある。血液試料を遠心分離するとき、フィルタ２２４は、赤血球及び白血球細胞を内側チャンバ２０４内に保持するが、所定の時間、適正な遠心分離力の下で、血漿及び血小板が外部チャンバ２３６まで貫通して流れることを許容する。適正な遠心分離力は、１０００〜１５，０００ｘｇの範囲内であり、また、所定の時間は、５分以上であり得、より特定すれば、５分〜６０分又は５分〜３０分の範囲であり得る。多血小板血漿が二次チャンバ２３６内に入ったならば、カートリッジ内で、凝固活性剤２４４に接触する。
【００７１】
本実施形態及び以下の実施形態に関して説明するように、上述した任意の凝固活性剤２４４が使用に適する。活性剤２２４と接触したとき、血漿は同時的に遠心分離及び凝固され、これにより固体フィブリン網又は膜を形成する。ロータの混合動作を提供することは、凝固プロセスを開始するために血漿及び活性剤２４４を完全に混合するのに役立つ。混合後、ロータを、１０分以上、より特定すれば約２０分以上、約３０００〜１５０００ｘｇにて旋回させて、第二のチャンバ２３６の周壁２４０に白血球抵抗性（ｗｈｉｔｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）のフィブリン多血小板膜を得ることができる。使用すべく膜を取り出す目的で、膜をカートリッジ２００から引き出すため、装置は、２つの部分に壊し又は開けることができる。これと代替的に、そこから膜を得ることができるように壁の一方が取り外し可能な部分又はその他のアクセス領域を有し得る。膜をカートリッジから除去するその他の方法は、膜を巻く及び折り畳むことを包含する。衛生上の目的のため、カートリッジ２００は使い捨て型とし得る。膜は、非限定的に、傷口の手当て及び火傷の手当てを含む、多様な用途を有する。より一般的には、膜は限定されない数の組織再生の用途にて使用し得る。
【００７２】
大型軸方向旋回として知られる本発明の他の実施形態において、例えば、非限定的に、直径１０００ｍｍまでの膜のような膜を得ることができる。図２１〜図２５は、この実施形態を示す。膜のサイズはロータのサイズに依存する。従って、膜のサイズは、どのロータが商業的に利用可能であるかに依存する。本実施形態において、半径方向遠心分離及び装置に関して上記に説明した一次及び二次遠心分離装置の作動の双方は、１つの軸方向旋回容器内で行われる。二次チャンバは、大きい面積の、多数の別個面積の膜を与え得るように仕切ることができる。この仕切りについては、以下により詳細に説明する。
【００７３】
このシステムは、遠心分離装置（図示せず）及びその内部に挿入することが出来る図２１〜図２５に示した装置２５２を含む。装置２５２は、２つのチャンバ、すなわち、互いに流体的に連通した一次又は上側チャンバ２５６及び二次又は下側チャンバ２６０を有する。一次又は上側チャンバ２５６は細胞分離チャンバとして機能する一方、二次又は下側チャンバ２６０は高密度化チャンバとして機能する。装置２５２はまた、図２１〜図２５
に示すように、図中に輪郭を示した少なくとも１つの開口部、開口又は通気口を有する隔板２６４を有する。該隔板２６４は、２つのチャンバ２５６、２６０を分離する。開口部、開口又は通気口２６８は、一次チャンバ２５６と二次チャンバ２６０との間の流体的連通状態を提供する。隔板２６４は、例えば、プラスチック、セラミック又はガラスで出来たものとし得る。
【００７４】
一次チャンバ２５６は、分離媒体２７２を含有し得る。上述した任意の分離媒体２７２をシステムと共に使用することができるが、分離媒体２７２の特定の例は、シリコーンゲル、ポリエステルゲル、チキソトロピックゲル及びそれらの組み合わせのうち少なくとも１つを包含し得る。より具体的には、隔板２６４の、１つ又は複数の通気口２６８を、１つ又は複数の通気口２６８をブロックし且つ、最初の遠心分離後赤血球細胞を血漿から分離するのに充分な量の分離媒体２７２（例えば、ゲル）で栓閉じし得る。一次チャンバ２５６は、通常、穿刺可能なストッパ２７６又はボトルキャップのように裏当てしたねじキャップのような他の適切な装置を通じ、患者から全血を受け取る。図２１〜図２５において、システムは、血液を上側チャンバ２５６内に導入するために使用される穿刺可能なストッパ２７６を有するものとして示される。一次チャンバ２５６はまた、抗凝固剤２３２を含有し得る。チャンバ２５６はまた、標準的な静脈穿刺法による標本の真空採取を許容し得るよう排気し得る。二次チャンバ２６０は、凝固活性剤２４４を包含することができ、上述した二次活性剤２４８の１つ又はそれ以上を包含することができる。
【００７５】
血液２８０が、図２２に示すように、上側チャンバ２５６内に採取された後、装置２５２を適宜なｇ力にて軸方向に遠心分離し、細胞の分離、すなわち、赤血球細胞２８８の多血小板血漿２８４からの分離を行う。細胞分離するために使用される典型的なｇ力は、例えば、５分以上のような所定の時間の５００〜１５，０００ｘｇを包含し得る。好ましくは、最初の遠心分離は、約５〜１５分間、約１０００〜１５００ｘｇにて行われる。これは、本明細書に記載した膜に関係する全ての実施形態に当てはまる。最初の遠心分離は、分離媒体２７２を、通気口２６８をブロッキングする位置から境界面まで動かす。例えば、チキソトロピックゲル２７２は、一次チャンバ２５６を血液２８０にて充填する間、２つのチャンバ２５６、２６０の分離状態を維持し得るが、最初の遠心分離の間に動いて細胞の分離を行い、２つのチャンバ２５６、２６０を分離する接続流体路を開放する。ゲル２７２は、半径方向、外方及び上方に流れ、ゲル２７２が底部チャンバ２６０内に落下することはない。最初の遠心分離の結果を、図２３に示す。多血小板血漿２８４、分離媒体２７２及び赤血球細胞２８８の相対的密度のため、遠心分離により、図２３に示すように、これら３つの物質は一次チャンバ２５６の内側から一次チャンバ２５６の外側まで上述した順序にて配置する。図面及び本明細書にて使用するように、ＰＲＰは多血小板血漿を表わし、ＲＢＣは赤血球細胞を表わす。
【００７６】
その後、最初の遠心分離を停止し、その結果を、図２４に示す。遠心分離を停止したとき、多血小板血漿２８４は重力によって下側チャンバ２６０内に通気口２６８を通じて排出され、該下側チャンバにて多血小板血漿は凝血活性剤２４４及び二次活性剤２４８（存在するならば）と混合する。しかし、分離媒体２７２は、所定位置に止まり、これにより赤血球細胞２８８が通気口２６８を通って第二のチャンバ２６０に入るのを阻止する。通気口２６８は、加えられたｇ力によって多血小板血漿２８４の全てが二次的な高密度化チャンバ２６０内に流れるのを保証するために、漏斗状形状であり得る。
【００７７】
図２５に示すように、遠心分離を、例えば、５００〜１５，０００ｘｇのような適正なｇ力にて再開し、大きい膜２９２が下側チャンバ２６０の外周に形成される。好ましくは、遠心分離は、実現しようとする膜の密度に依存して、約２０分〜１時間、約２５００〜１０，０００ｘｇにて行われる。このことは、本明細書に記載した膜形成に使用される全ての実施形態に当てはまる。分離媒体２７２及び赤血球細胞２８８は、２回目の遠心分離
の間、同一の位置に止まる傾向があることを認識すべきである。このシステムは、同時的な遠心分離及び凝固を許容し、その結果、大きい血小板／フィブリン膜２９２となる。装置２５２はまた、取り外し可能であることができ、これにより膜を装置から容易に引き出すことを許容する底部２９４を有する。
【００７８】
以下のシステム及び装置は、図２１〜図２５に示した基本的システムの変形例である。例えば、細胞分離チャンバすなわち一次チャンバ２５６は、高密度化チャンバすなわち二次チャンバ２６０と異なる半径を有し得る。図２６により詳細に示すように、上側及び下側チャンバの半径は、異なるものであることが可能で、このことは、周壁にて異なるｇ力を加えることを許容する。その結果、１つの速度ｒｐｍが２つの異なるｇ力を生じ、これによりモータ及びプログラミングを簡略化する。より特定すれば、チャンバに異なる半径を提供すると、同一のｒｐｍにて異なるｇ力となるため、多数速度のプログラミングが必要なくなる。
【００７９】
図２７〜図３０は、同心状の円筒体が使用される、図２１〜図２５に示したシステムの１つの変更例を示す。システム２９６は、隔板又はその他の分離体３０９によって下側部分３０８から分離された上側部分３０４を有する一次管３００を包含する。一次管３００は、細胞分離チャンバとして機能する。少なくとも１つの通気口、穴又は開口３１２は、一次管３００の上側部分３０４と下側部分３０８との間の流体的連通を提供する。この場合にも、血液は、１つ又はそれ以上の穿刺可能なストッパ３１６又は上述したその他の適切な装置を通じて一次管３００内に導入し得る。一次管３００は、血液の過早の凝血を防止すべく抗凝固剤２３２を保持し得る。分離媒体２７２は、血液が少なくとも１つの通気口３１２を通じて一次管３００の上側部分３０４から下側部分３０８内に流れるのを阻止する。下側部分３０８はまた、液体が流れ得る空隙、穴又は開口３１０を有し得る。多血小板血漿３８４の高密度化は、二次的な同心状管３２０内で行われる。二次管３２０は、上述した凝固活性剤２４４の１つ又はそれ以上及び／又は１つ又はそれ以上の二次活性剤を含有し得る。
【００８０】
最初に、システムの遠心分離により血液が血漿及び赤血球細胞に分離され、該血漿及び赤血球細胞は、上述し且つ図２８に示した分離媒体によって分離する。最初の遠心分離は、一般的に、約１０分間以上、約１０００ｘｇ以上にて行われる。図２９に示すように、遠心分離が停止したならば、多血小板血漿２８４は、１つ又はそれ以上の通気口３１２を通って一次管３００の下側部分３０８内に落下し、赤血球細胞２８８は、分離媒体２７２により一次管３００の上側部分３０４内に捕らえられることになろう。一次管３００の下側部分３０８の壁には、少なくとも１つの通気口３１０が設けられる。システムは、その後、図３０に示すように遠心分離され、これにより多血小板血漿２８４の少なくとも一部分は、一次管３００の空隙３１０を通って下側部分３０８から去って二次管３２０に入る。この場合にも、赤血球細胞２８８は、分離媒体２７２により一次管３００の上側部分３０４内に捕らえられたままであろう。図２７〜図３０に示すように、二次管は、少なくとも１つの凝血活性剤２４４を含有し、そこで多血小板血漿２８４が該凝血活性剤と接触する。その後、この変更例は、膜２９２を形成する同時的な凝固及び遠心分離を提供する。この変更例は、より小型のユニットを許容し、プラスチックの使用量を削減する。装置２９６はまた、膜の除去を容易にし得るよう取り外し可能な底部３２４を有し得る。
【００８１】
別のある代替例として、分離媒体に代えて疎水性膜３２５を採用し得る。疎水性膜３２５は、分離媒体を使用する任意のシステムに代えて使用し得る。疎水性膜３２５は、所定のｇ力にて多血小板血漿が流れることのみを許容し、分離媒体を不要にする。換言すれば、ゲルによってブロックされた穴を有する隔板を使用することに代えて、図３１及び図３２に示すように疎水性膜を使用し得る。膜を使用するとき、下側チャンバ及び上側チャンバは、図２１に示すように同一の半径を有するか、又は該２つのチャンバはその一例を図
２６に示すように異なる半径を有し得る。更に、疎水性膜は、図２７に示した同心状の設計のものに使用し得る。
【００８２】
疎水性膜３２５は、多血小板血漿のような水溶液体がそのポアを通って流れるのを、所定の静水圧に達する迄、実質的に阻止する。疎水性膜３２５の例は、非限定的に、ポリプロピレン、ポリカーボネート、セルロース、ポリエチレン、デュポンのテフロン（登録商標名）及びそれらの組み合わせを包含し得る。その他の例は、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）製造のミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）（登録商標名）膜及びスクリーン、又はヌクレオポア（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）製造のヌクレオポア（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）（登録商標名）膜及びスクリーンを包含する。これと代替的に、レーザにて精密穴が穿孔されたプラスチック隔板を使用してもよい。疎水性膜を使用すると、血液を、細胞分離チャンバ内に導入することができるが、高密度化チャンバ内に落下することはない。最初に、赤血球細胞を低いｒｐｍにて血漿から分離することにより、適正な静水圧圧力を実現し得る。その後、遠心分離速度を増して、所望の圧力を実現し、流動圧力を規定する表面エネルギー／表面張力の制約に打ち勝つ。換言すれば、重力は、遠心分離の速度に伴って増大し、その結果、多血小板血漿は膜を通って流れるが、赤血球細胞は流れない。膜は、赤血球細胞を実質的にブロックする。
【００８３】
上記のシステムに対する別の形態変更は、本明細書に記載した任意の実施形態の、二次すなわち高密度化チャンバの形態を変更することを含む。これらの改変高密度化チャンバは、システム内で使用することができ、ここで、一次チャンバ及び二次チャンバは、同一又は異なる半径を有し、チャンバは同心状であり、及び／又は分離媒体又は疎水性膜が使用される。高密度化チャンバは、膜の除去を容易にし且つ、膜の最大程度の回収を保証する、異なる内壁を有し得る。例えば、高密度化チャンバは、体内に最初に配置するための膜のはがし強度を向上させ、その後に分解する、織った生物分解性織地（例えばゴアテックス（Ｇｏｒｅｔｅｘ）が製造するゴアテックス（Ｇｏｒｅｔｅｘ）（登録商標名））を含有し得る。チャンバの外壁は、また、織地を均一な長さにて壁から離して支持しする成形した張出し部又は溝を含有することができ、織地の両側部にて所望の寸法のフィブリン及び血小板の厚さを実現する。
【００８４】
より特定すれば、図３９に示すように、高密度化チャンバ３１８の内壁又は側壁は、円筒体ではなく平坦な薄板の形態の膜を除去することを許容するための、１つ又はそれ以上の中実な又は鋸歯状リブ３１９を包含し得る。穴をあけたリブは、膜のエアレーションを促進する。チャンバの内壁は、形成される膜に孔を提供し、はがしを容易にする形態とし得る。図３９は、内壁の１つ又はそれ以上の、中実なリブの底面図を示す。
【００８５】
図３３は、高密度化チャンバ３２６の内部に見ることのできる織った生体適合性織地３２８を示す。かかる織物は、膜２９２を壁自体から離れた状態に保つ。織地３２８は、平坦な膜を得るために膜を円筒体から分離することを容易にし、特定の用途のために膜のはがし強度を増大させる。織地３２８は膜２９２内に埋め込まれた状態となる。更に、図３４及び図３５にそれぞれ示すように、張出し部３３２又は溝３４０をチャンバ３２６の壁３３６に成形し、織地の両側部におけるフィブリン層の厚さを制御し得る。これらは、織地を壁から隔てた状態に保つ小形の支持リブとして機能する。要するに、図３３は、織地３２８自体が、膜の壁３３６への付着を防止することを示し；図３４は、膜３２４の除去を容易にする壁３３６の張出し部３３２を示し；図３５は、膜２９２を壁から離れた状態に保つ溝又は成形した支持リブ３４０を示す。張出し部３３２又は溝３４０を有する壁は、織地３２８と独立的に採用し得る。
【００８６】
これと代替的に、図３６に示すように、高密度化チャンバは、膜２９２の除去を容易にするために除去可能なフィルム３４４にて裏当てし得る。該フィルム３４４は、ポリエチ
レン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、又はテフロン（登録商標名）を含む、ポリオレフィンのような、プラスチックを含み得る。フィルム３４４は、操作が容易であるようにタブ３４８を有することができ、また、膜２９２を着色し、フィルム３４８から区別するのを助けることができる。更に、フィルム３４８を処理して、ガラス様接触活性のような望ましい性質を得ることができる。タブ３４８を操作することにより、膜２９２を上に有するフィルム３４４の全体を除去し得る。例えば、高密度化チャンバ３２６は、凝固及び成長因子放出のための血小板の活性化及び膜の操作の容易化の双方を提供するような処理フィルムにて裏当てし得る。これと代替的に、ＰＲＰ又はＰＰＰを高表面エネルギー細管を通じて流動させＰＲＰ又はＰＰＰを凝血のために活性化し、フィブリン密封層又は接着層として使用するための急速凝血接着を可能にするようにしてもよい。
【００８７】
チャンバ内の他の面に関して、プラスチック面は有効であり得るが、凝血活性化及び血小板成長因子の放出のために理想的でないことがある。その結果、プラスチックの代替例を図５０及び図５１に概略示する。例えば、多血小板血漿は、下側チャンバ内でガラスに接触し得る。換言すれば、図５０に示すようにガラスを底部キャップに取り付けるか、又は図５１に示すようにガラス球を底部に接着し又は熱によりつなげることができる。ガラスはまた、加熱しプラスチック上に落下するようにしてもよい。これと代替的に、表面は、酸素又は亜酸化窒素のような活性化気体を採用するグロー放電プロセスを使用してプラズマ処理し得る。より特定すれば、表面は、プラズマ化学気相成長法を使用して処理することができる。これと代替的に、表面は、例えば、シリコーン界面活性剤又はＰＶＰｙｒのような多様な化学的被覆を使用して改変し得る。プラスチックを改変する別の方法は、小寸法のシリカビーズ又は粒子を上側チャンバ内のクエン酸塩溶液に添加することである。ゲル及び赤血球細胞に比してシリカは高密度であるから、シリカの殆どは、ゲルの下方又はゲル内に埋め込まれた状態で上側チャンバ内に止まる。従って、これらのプラスチック改変法を使用してシステムの一部分を、また、より特定すれば、本明細書に記載した実施形態の任意の高密度化チャンバの一部分を、被覆し得る。
【００８８】
異なる側面において、本発明は、傷口の手当てに関連して使用される四角形の多血小板フィブリン膜を生産することを可能にし、このことは、血小板の細胞分裂促進性の特徴を活用し、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）及びベータトロンボグロブリン（ＢＴＧ）、及び固体フィブリンフィルムの保護作用を提供する。成長因子、ＢＴＧ、血小板因子４（ＰＴ４）及びトロンボスポンジンは、全て、固体フィブリン網にて細胞増殖を増進し得る因子である。より特定すれば、保護作用は、微好気性の環境、消毒的作用、及び分離作用を含む。同時的な遠心分離及び凝固を行うために使用することのできる装置は、図３８に示したロータ医療装置を含む。該装置は、プラスチック又はその他の何らかの適切な材料で出来たものとし得る使い捨て型カートリッジ３５２を含む。この場合にも、上述したプラスチック改変技術は、本明細書に記載した任意の実施形態に適用される。円筒状のカートリッジは、２つの同心状チャンバ、すなわち内側チャンバ３５６及び外側チャンバ３６０を有する。
【００８９】
内側チャンバ３５６は、円筒状であり、図３８及び図３９に示すように内側ろ過壁３６４により輪郭を定められる。本明細書に記載した任意のフィルタ又はろ過装置がこの実施形態と共に使用するのに適する。内側チャンバ３５６は、頂端部３６８及び底端部３７２を有し、これら端部の各々は、該端部に取り付けられたロータ軸３７６を有する。ロータ軸３７６は、カートリッジ３５２を遠心分離装置内に挿入し、使用することを許容する（図示せず）。内側チャンバ３５６のこれら端部３６８、３７２の少なくとも一方は、患者からの血液が導入又は注射されるときに通る、ポート又は適切な開口３８０を有し得る。上述したように、１つの実施形態において、内側チャンバ３５６は、標準的な静脈穿刺を容易にできるように真空圧に保ち得る。内側チャンバ３５６は抗凝固剤２３２を含有し、その内部に入る血液の凝固を防止し得る。内側チャンバ３５６は、細胞分離チャンバとし
て機能する。内側ろ過壁３６４は、個別の量の全血を受け入れる、選択的に遠心分離可能な（機械的に支持された）フィルタである。ろ過壁のろ過機能は、赤血球及び白血球細胞が貫通して流れるのを実質的に防止する。しかし、フィルタは、例えば、１０分以上の所定の時間、例えば、１０００ｘｇ以上の所定の遠心分離力が加えられたとき、血漿及び血小板が第二のチャンバ３６０まで流れるのを許容する。
【００９０】
第二のチャンバ３６０は、外壁３８４、内側ろ過壁３６４、並びに頂部壁及び底部壁により輪郭を定められる。第二の外側チャンバ３８４は、上述した１つ又はそれ以上の凝固活性剤２４４並びに１つ又はそれ以上の二次活性剤２４８を含有し得る。第二のチャンバ３６０は、高密度化チャンバとして機能する。図３８及び図３９に示すように、内側チャンバ３５６及び外側チャンバ３６０は同心状である。
【００９１】
作動時、血液が内側チャンバ３５６内に導入された後、装置３５２を遠心分離する。上述したように、遠心分離は、血液が血漿及び赤血球細胞に分離するような所定の時間、所定の力にて行われる。この場合にも、ろ過壁３６４は、多血小板血漿が貫通するのを許容する一方、赤血球細胞はフィルタに詰まる。フィルタ３６４を通過したならば、血漿は、凝固活性剤２４４及び／又は二次活性剤２４８に接触し、その結果、同時的な凝固及び遠心分離が行われ、膜が形成される。凝固を増進するため、混合動作を提供することが役立ち得る。血漿が第二のチャンバに入った後に為される遠心分離は、白血球抵抗性のフィブリン多血小板膜を得るため、通常、１０分以上、約１５００〜１５，０００ｘｇにて行われる。該膜は、本明細書に記載した任意の組織再生用途に使用することができるが、傷口又は火傷の手当てに関連して特に有用である。
【００９２】
外側チャンバ３６０の内側部分には１つ又はそれ以上のピン３８８が存在し、膜を装置の頂部から垂直方向に引き出すことを可能にし得る。高密度化チャンバの表面に関して説明した全てのもの（例えば、織地、張出し部、溝を使用すること等）は、この場合、外側チャンバ３６０に当てはまる。更に、プラスチック表面の改変に関する説明もこの場合にも当てはまる。膜は、装置を壊し又は２つの部分に開けることにより引き出すことができる。典型的には、衛生上の理由のため、装置は使い捨て型である。装置は、操作し易く、また、安全で滅菌性の状態を提供する。
【００９３】
本発明の別の側面は、半径方向及び軸方向遠心分離により、成形した高密度のフィブリン及び血小板ネットワークを形成するために使用することができる、装置及び方法、並びに該装置及び方法の改変に関する。本側面は、多数のネットワークを同時に成形すべく、計測した液体を多数のアリコートに分割する方法にも関する。自己由来のフィブリン及び血小板のネットワークの、臨床的効率及び使用の容易さは、上記に説明した。移植前に、上述したネットワーク又は膜を特定の形状に形成することが望ましいような、軟組織を再生するための幾つかの臨床的適用例がある（例えば、膝の半月の修復）。半月軟骨の場合、理想的な形状は、著しく損傷した半月を置換するために使用することができる部分と同様である、半円形の楔形の形状であろう。存在する血小板は、組織を再生するのに必要な脈管組織形成を提供し、フィブリンは、荷重に耐えるための吸収クッションを提供する。
【００９４】
軟骨のような軟組織の修復の現在の実施では、症例の僅か２０％の治療が可能である。多くの場合、残りの症例において、軟組織は恒久的に除去され、患者の動作は損なわれる。この症候群は、プロスポーツ選手にて顕著であり、スポーツ医学にて大きな関心事である。新たな組織が成長するための足場を形成すべく合成材料が利用可能ではあるが、合成材料は、好ましくない免疫応答性を生じ、脈管形成機能の欠如により成功率が低いという不利益な点がある。成功可能な方法は、所定の方法に使用される多数の形態及び形状を同時に形成するために、多血小板血漿を、制御した容積に分離し得るであろう。
【００９５】
成形システムは、上述した任意の遠心分離の容器中で、遠心分離力が最大となる時点にて所望の部分の形状により輪郭を定めた、形成したキャビティを含み得る。該キャビティは、遠心分離が半径方向遠心分離装置内で行われるとき、容器の底部に形成し得る。これと代替的に、キャビティは、軸方向に遠心分離される容器の円筒壁中で輪郭を定められ得る。図４０は、図４０（ａ）に示すように半径方向遠心分離にて使用し得るよう向き決めされた鋳型、及び図４０（ｂ）に示すように軸方向遠心分離にて使用し得るよう向き決めされた鋳型の例を示す。鋳型は、図４３〜図４６に示すように、容器と一体にし、又は別個の部品を容器に接続し、結合し、伸長させ又は付加することができる。キャビティは、一体型でないならば、割型の設計で、複雑な形状物の成形を許容し、容易に除去することを可能にし得る。キャビティはまた、図４１に示すように、キャビティ内へのフィブリン／血小板の混合物の流れを向けるため漏斗型特長を含有し得る。より特定すれば、図４１は、物質がキャビティ４０４内に流れるのを許容するランナー４００に達するような、漏斗３９６を有する鋳型３９２を示す。漏斗開口部３９６の断面積は、フィブリン／血小板モノフィラメントの濃縮の相対量を決定する。ランナー４００はまた、図４１に示すように、漏斗３９６及びキャビティ４０４に接続することができ、これによりキャビティ４０４内に直接流れること、及び成形した部分のトリミング処理を最小にすることを許容する。図４２に示すように、侵入するフィブリンによる置換によって、気体及び／又は液体がキャビティ４０４から押し出されることを許容するために、通気穴又は通路４０８を鋳型フレーム３９２内に包含し得る。換言すれば、通気穴４０８は、気体及び液体を放出することを許容する。
【００９６】
多数のインプラントを必要とする方法、特に、異なる容積及び密度を必要とする方法において、図４３〜図４７に示すように、垂直方向羽根を底部に含めることにより、上述した軸方向遠心分離装置を制御された容積に分割することができる。換言すれば、上述した装置の１つ、例えば、同心状のチャンバの実施形態を採用することができるが、多数のキャビティを遠心分離容器の各々に使用して多数形状の物体を同時に提供することができる。軸方向旋回設計の鋳型の各々に送るべき多血小板血漿の相対量は、図４３〜図４７に示すように垂直方向羽根４１２を含めることで得ることができる。羽根４１２は、装置の高さまで伸びるものとしてもよいが、必ずしもそうする必要はなく、中心軸線に向けて突き出すものの中心軸線に接触せず、これにより羽根により輪郭を定められた容積の間で多血小板血漿が自由に流れるのを許容する。
【００９７】
図４４は、羽根Ｂ１、Ｂ２を示す平面図である。羽根Ｂ１、Ｂ２は接触せず、流体が最初に追加され遠心分離装置が休止しているとき、通気口４１６は、チャンバＷ１、Ｗ２間の流体的接続を許容する。チャンバＷ１、Ｗ２の断面積は、鋳型の各々に送るべき流体の容積に比例するものとすることができる。最初の休止状態にある液体の液位は全ての区画室にて等しく、このため、相対容積は、羽根の位置決めにより輪郭を定めた断面積に比例する。従って、羽根の位置は、各区画室における容積を決定することになる。その結果、より深い鋳型に対し、より大きい「パイ・ピース（ｐｉｅ ｐｉｅｃｅｓ）」を採用することができる。
【００９８】
遠心分離したならば、各区画室内の容積は、目標の鋳型まで半径方向に移動する。図４５は、同等でない「パイ・ピース」を有する３チャンバ装置を示す。図４７は、異なる半径に設定された各鋳型４２０を有し、これにより、各鋳型４２０の内容物に対しその半径に比例するｇ力が加える、３チャンバ装置を示す。チャンバの数は、特定の用途に依存する。形成された材料は、鋳型４２０の半径に依存して異なる密度を有する。図４６は、３つの異なる位置、すなわち、一体の位置、接続された位置及び装置から伸びる位置にある鋳型を示す。鋳型の位置決めは、形成される膜の密度に影響を与える。各アリコートの相対的容積及びキャビティの位置は予め設定されるから、成形された釣合い重りを追加して適正な釣合いをとることができる。この特徴の有用な適用例は、高密度で膜を、低密度で
ペーストを成形する場合であろう。
【００９９】
作動時、多血小板血漿を上述したような容器に添加し、又は、全血を前処理チャンバに添加して多血小板血漿を適切な凝血活性剤を含有する第二の容器に移すことにより該多血小板血漿を製造する。容器を遠心分離装置内に迅速に配置し、その用途に必要とされる所望のｇ力にて旋回させる。これにより、同時的な遠心分離及び凝固が提供される。フィブリンストランド及び血小板は、キャビティに向けて迅速に沈積し、該キャビティを充填する。次に、フィブリンストランドは、架橋結合し、安定的なネットワークを形成する。遠心分離装置から除去したとき、成形した部分を除去し、全ての余剰部分をトリミング処理することができる。より複雑な形状の場合、割型キャビティ鋳型を採用し得る。上述し且つ図４１に示すように、漏斗状の前処理装置をこの設計にて採用し、必要とされる血液量を最小にし且つ、効率を高めることができる。図４１及び図４２に示すように、キャビティを完全に充填し且つ、複雑な形状物の取り扱いを容易にするために、趣味愛好家のプラスチックモデルキットにて採用されるランナーシステムと極めて類似した、ランナー及び通気穴を含めることが出来る。
【０１００】
図４７〜図４９は、作動中の装置の断面図を示す。図４７には休止状態の装置を示す；単一の水平な流体表面が実現され、流体がチャンバ間で適正に釣合った状態となるまで、多血小板血漿２８４及び凝固活性剤２４４の混合体が、チャンバの間を流れる。図４８は、遠心分離が開始したときの装置を示す；液体は、軸方向回転により旋回流の形状に形成される。遠心分離の間、羽根４１２はチャネル間の連通を防止し、これにより鋳型の各々に対する適正な供給状態を維持する。壁４２８は鋳型に向けて徐々に薄くなって、濃縮漏斗として機能し得る。遠心分離装置の速度及びそれに伴うｇ力が増すと、全ての流体が鋳型に搬送される迄、放物線状旋回流が増大する。図４９は、完全な遠心分離状態にある装置を示し、この時点にて鋳型は、充填されている。
【０１０１】
このシステムは、フィブリンを含む物質を形成するために、少血小板血漿（ＰＰＰ）に対して使用することもできる。換言すれば、該システムは、血小板を必要としない用途にて使用することができる。少血小板血漿は、第一の管を、例えば、１，０００ｘｇの代わりに５，０００ｘｇ以上のようなより大きいｇ力にて遠心分離することにより形成し得る。また、この設計は、ドナー及び受け手の適合性が確立された場合に、非自己由来の所望のフィブリン又はフィブリン／血小板ネットワークの形成に使用することもできる。
【０１０２】
全体として、鋳型は、完全で、自己由来の患者の適合性を提供する。その結果、フィブリン−血小板ネットワークを、精密な成形形状及び密度にて形成することができる。膝の左側及び右側半月のような、複数の形状物を同時に形成することができる。更に、内耳に対する成形ツチ骨、キヌタ骨及びアブミ骨、並びに肩に対する回旋腱を、これらの鋳型を使用して形成することが出来る。更に、肘軟骨、エテピ関節丘（ｅｔｅｐｉｃｏｎｄｙｌｅ）の部分、指の部分、足首及び手首の軟骨を形成することもできる。形成された膜又はネットワークは、吸収可能で、安定で、成長因子を有し、治癒を促進する。複数形状の用途の場合、部分の密度は、鋳型の半径を設定することにより変化させることができる。
【０１０３】
本発明の別の側面は、異なる遠心分離の沈積を利用してフィブリン／血小板ネットワークにおける血小板の分布状態を制御する装置及び方法に関する。自己由来のフィブリン及び血小板ネットワークの臨床的効率及び使用の容易さは、上記に説明した通りである。フィブリンは、傷口を安定化し、細胞が成長及び動くための媒体を提供する。血小板は、最初、傷口の安定化に寄与する一方、多様な抗炎症剤、成長剤及び脈管組織形成剤を含有する。従って、多くの治癒方法において、フィブリン連続体中の血小板の位置を集中させることが有益である。例えば、慢性的な傷口の場合、傷口に接触する膜の側に血小板を集中させることは、傷口に対する膜の接着力を増し、皮下層の脈管組織形成を増大することに
なろう。半月の修復の場合、形成された半月の最外側領域、すなわち「レッドゾーン」に血小板を集中させ、この領域の脈管組織形成を増大させることが有益であろう。骨セメントの場合、血小板が連続体の全体に均一に分配されることが好ましい。それ故、本発明のこの側面は、遠心分離力を使用して血小板をフィブリン基質内に好ましいように配置するための方法を提供する。
【０１０４】
フィブリンの形成がｇ力と独立した速度にて進行するのに対し、血小板の沈積はｇ力の関数である。より特定すれば、血小板は一定の速度にて沈積し、その結果、血小板は、その全てが沈積する迄、一定の速度にて堆積する。血小板は多血小板血漿の全体に均一に分配する。血漿に重力が加わると、血小板は、重力の増加に伴って増大する一定の速度にて沈積する。沈積を完了する時間は、最上方の血小板が縦断しなければならない多血小板血漿の高さに比例する。よって、高さ１００ｍｍ円柱の血小板の場合、沈積を完了する時間は、６０００ｘｇにて約５分又は２０００ｘｇにて１５分である。
【０１０５】
他方、フィブリンモノマーは、重力と独立的な速度にて形成する。通常の患者の場合、この過程は、約３０分にて完了する。よって、ここに示す方法は、２つの異なる沈積速度に対応し、これによりネットワーク内での血小板の好ましい位置を実現するような、遠心力プロフィールを実現するという問題を解決する。血小板が好ましい位置にあることは、特定の適用例の各々に合うように組織の再生を最適化し、その方法についてのより迅速な治癒及び高い成功率を提供する。血小板を好ましいように配置する方法は、血小板の沈積速度及び形成及びその後のフィブリンの沈積の速度の違いを考慮し、沈積プロセスの間のｇ力を調節することを伴う。
【０１０６】
１つの実施例において、多血小板血漿を凝固活性剤に曝し、次いで、直ちに約４０００〜６０００ｘｇにて遠心分離することができる。これにより、血小板は、約５〜１０分にて迅速に沈積し、次に、その後の２５〜３５分にて形成されるフィブリンがその上の層となる。形成される構造体は、その表面に、最初に形成された血小板が集中し、その後に形成された層内で血小板が減少する。この適用例は、半月の修復及び慢性的な傷口に対し特に有用である。
【０１０７】
別の実施例において、多血小板血漿を凝固活性剤に曝し、次いで、直ちに２０００ｘｇ以上にて遠心分離することができる。血小板の沈積及びフィブリンの形成は等価的速度にて進行し得る。これにより、形成されるネットワークは、該ネットワークの全体に均一に分配した血小板を有する。この適用例は、骨セメント及び軟組織の成長（歯周病学の）にとって特に有益である。
【０１０８】
更に別の実施例において、多血小板血漿を凝固活性剤に曝し、直ちに遠心分離することができる。しかし、遠心分離速度は、約１〜２分間、約４０００〜６０００ｘｇの速度と、その後の、５〜１０分間、１０００〜２０００ｘｇの速度との間にて繰り返す。約５〜１０回の繰り返しにより、高濃度血小板及び低濃度血小板の別個の層を１０〜２０有するサンドイッチ構造体が得られる。この適用例は、骨が互いに擦り合うのを防止する、関節の軟骨の修復にとって特に有益である。
【０１０９】
したがって、多血小板血漿及び凝固活性剤を遠心分離する速度並びに遠心分離時間を制御する結果、血小板は好ましい位置に配置される。血小板の位置を制御することは、特定の用途に対し組織の再生を最適化し、これにより、その方法のより迅速な治癒及びより高い成功率を提供する。
【０１１０】
図５６は、鋳型の設計の別の実施形態を示す。成形した挿入体４２４は、一般的に、プラスチック又はゴム材料で出来ている。挿入体は、図５６に示すように、容器４２６内に
導入し且つ、該容器から取り外し可能である。多血小板血漿が容器４２６内に配置されたならば、凝固活性剤を容器に添加することができる。これと代替的に、導入に際し、既に血漿内に凝固活性剤が存在していてもよい。挿入体は、図４２〜図４９のものと同様の羽根４２８を有する。羽根４２８は、突き出してチャンバ４３０の輪郭を形成し、遠心分離に際し、膜を該チャンバ内で成形し又は形成し得る。換言すれば、羽根は、挿入体が挿入されたとき、挿入体のコア４３２と容器との間に空間を残し、半径方向遠心分離装置を使用して円筒状膜を形成し得る。挿入体は、３つの羽根を有するものとして示されているが、１つ又はそれ以上の羽根を有する挿入体を製造することもできる。これと代替的に、挿入体は、割型とし、２つの挿入体の間にて長方形の膜が形成されるようにしてもよい。成形した挿入体４２４を使用することの利点は、旋回ヘッド遠心分離装置を備える平坦な底部の容器が不要となる点である。
【０１１１】
本発明の別の実施形態において、軟骨の疾病に苦しむ人を治療するために使用される方法及び装置が提供される。繊維状軟骨組織は、非結晶の繊維状組織内に封入された軟骨細胞の多層構成の複雑な構造を有し、該非結晶の繊維状組織の主成分は、ヒアルロン酸及びポリサッカリドの加わったコラーゲンである。内層は、最も緻密な層であり（すなわち、内層は、外層よりも２５倍まで硬い場合がある）、一方、他の２つの柔軟な層が表面に向けて認められる。感染、自己免疫疾患（関節炎など）、年令に関係した変性、及び外傷に起因する、関節の軟骨組織に伴う病的症状は、ヒト及び動物にてよく見られる。今日の手当て法は、感染を止めるため、炎症を軽減するため、又は自己軟骨組織の自然再生を刺激するための、患者の薬理学的治療に重点を置いている。膝の半月損傷の治療のような痛みを伴う症例において外科的治療法が行われて置換されない軟骨が除去され、患者の骨は保護されないままになる。この実施形態は、軟骨の疾患を治療する方法を提供する。
【０１１２】
膜及びフィブリンは、軟骨細胞を培養する足場として使用し得る。より特定すれば、これらの方法をヒト及び動物の細胞に適用し、生物学的に活性な硬い固体フィブリンクッション（自己由来の軟骨細胞を含む）を形成し、損傷した生体の軟骨を置換して機械的ストレスを支え、組織の生物学的回復を開始することができる。１つの特定の実施形態において、当該技術分野の当業者に既知であるように、酵素によ消化される軟骨組織のバイオプシイから開始し、軟骨細胞を、ＣＯ２インキュベータ内で従来のプロトコルに従って単層に培養する。支持体から慎重に分離された軟骨細胞は、生体の損傷した軟骨の部分を置換するために使用することができる「配向した」強い膜を得る目的で、容器を約４，０００〜１０，０００ｘｇにて旋回させる直前に、ＰＲＰと混合することが出来る。付与された遠心分離力は、異なる種類の軟骨内の軟骨細胞に差異を生じさせ得る。
【０１１３】
軟骨細胞を有するフィブリンの足場は、滅菌状態下、特殊なバイオリアクター内で、数日間培養することができる（ドルトムンド大学、動物細胞培養グループ、Ｒ．Ｐｏｒｔｎｅｒが記載するように）。この装置において、血清、ＴＧＦ（形質転換成長因子−Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｃｅｐｔ）、ＩＧＦ（インシュリン様成長因子−Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｃｅｐｔ）を添加したＤＭＥＭ（インビトロゲン）培地を、フローチャンバ内にて足場上に連続的に補給する。この方法は、１９日間行い得る。その目的は、当初のフィブリンの基盤及び形状の上に、真の軟骨をインビトロで生産することである。この新しい軟骨は、インビトロで、損傷した軟骨を置換するために使用し得る。
【０１１４】
１つの方法において、上述した同時的な凝固及び遠心分離方法を使用して極めて丈夫な自己由来の膜を形成し得る。より特定すれば、以下の実施例５に従って厚い膜（例えば、厚さ３ｍｍ及び直径２４ｍｍ）を製造し得る。勿論、上述した装置又は方法の任意のものを使用して多様な寸法の膜を形成し得る。１つの特定の膜は、滅菌性容器（例えば、自己由来の多血小板血漿（ＰＲＰ）約２０ｍｌにて充填され且つ、３０分間、約４５００〜５０００ｘｇにて旋回させる平坦な底部の２５ｍｌガラスフラスコ）内にて形成し得る。こ
のステップにおいて、少血小板血漿（ＰＰＰ）を使用してもよい。上述したその他の任意の膜形成技術採用することも可能である。
【０１１５】
この膜又は本発明の任意の他の膜が形成された後、その膜を滅菌性の生理溶液にて完全に洗浄し、活性剤を含有するより大形の滅菌性フラスコに入れ、多血小板フィブリン（ＰＲＦ）の第二の層を製造することが出来る。このステップにおいて、完全な滅菌状態にて、強い膜を含有する新たなフラスコ内に、新たな量の多血小板血漿を導入する。３層の膜を得る目的で、第二のフラスコに対し、第二の遠心分離ステップを行い得る。１つの特定の実施例において、この遠心分離を、２０分間、１０００ｘｇの速度にて行い、直径３０ｍｍのものを形成することができる。遠心分離は、上述した任意の速度にて行うことができる（すなわち、１０分間以上、５００〜１５，０００ｘｇにて）。形成される膜は、軟骨を置換すべき箇所に移植するために使用できる。この場合にも、膜の厚さ及び寸法は、上述した状態によって決まる。血液の量及びフラスコの型もこれに応じて変更することになろう。重要なことは、滅菌膜（上述した方法の任意のものにより形成されたもの）を追加的な凝固活性剤に曝し、その後、多血漿フィブリンの第二の層を形成するためにその内容物を遠心分離することである。これと代替的に、追加的な凝固及び遠心分離は、膜の第三の層を形成することができ、その後も同様である。
【０１１６】
１つの関連する方法において、当該技術分野の当業者に周知であるアルギン酸塩再生軟骨細胞（ＡＲＣ）法に従い、軟骨組織（自己由来）をゲル中のＩＮ ＶＩＴＲＯ培養に配置する。ＡＲＣ法におけるゲルは、上述した方法及び装置に従って製造した自己由来のフィブリンにて置換してもよい。より具体的には、多血漿フィブリンの製造の第二のステップの間、選択した軟骨細胞株を自己由来のフィブリンと共に二次容器に添加し、混合物を、低い遠心分離速度で、又は、遠心分離力を全く加えずに、ゼリー状にしてもよい。
【０１１７】
ゼリー化が行われる容器の形態及び寸法は、「人工軟骨」のその後の用途（すなわち、置換すべき軟骨の形態）に従って選ぶことができる。ゼリー化は、上記の文節に従って作製された強い膜の周りにゲルが形成されるような仕方にて行うことができる。これは、新たなゲルが当初の強い膜を実質的に取り囲み、軟骨細胞がゲル中に含まれるよう、第二の凝血が行われている容器内に強い膜を配置することで実現することができる。自己由来の軟骨細胞、ゼリー状した自己由来の多血小板フィブリン及び最終的に内側の強い膜を有する滅菌性容器は、インビトロで軟骨細胞を成長させる知識を有する人に既知であるように、適切な雰囲気（温度、Ｏ２、ＣＯ２及びＲ．Ｈ．レベル）下で培養するよう配置することができる。これにより、インビトロでフィブリンゲル足場上にて新たな組織を成長させることができる。組織培養が、軟骨細胞及び繊維状組織の的確な密度を有するならば、３層組織は、内部が極めて丈夫で、柔軟で且つ、宿主の病的組織を直ちに置換できる膜となる。該方法の収率を最適化するため、適切な添加剤を培地に追加することができる。幹細胞は身体の全細胞の起源であり、当業者に既知であるように適切に処理されたならば新たな軟骨細胞をインビトロにて発現させることが可能であるから、幹細胞の使用もまた予想される。
【０１１８】
全体として、この実施形態は、合成又は異種起源の材料を使用する場合に関連するリスクを軽減する一方で、上述した疾患を治療するためのインプラントを生産するものである。自己由来の軟骨細胞は血小板が高濃度化した膜内に見られ、該膜はインビトロ及びインビボで増殖するための適切な足場となり、また、新たな軟骨を生産するための基本である軟骨細胞基質を生産する。形成される膜は、滅菌性キャビネット内で容易に製造することができ、また、該膜は、手術後の再生時間を短縮すること、及び新たな軟骨を構築する軟骨細胞の移動を促進することを目的として、所要位置への直接の移植を可能にする物理的性質を有する。
【０１１９】
本明細書に記載した実施形態及び方法は、また、ＰＲＰを血漿分離交換機械から採取することに関連して使用することもできる。外科手術の間、外科手術箇所に溜まった血液を吸引し、細胞を分離し、細胞を患者の体内に再注入することによって血液を節約するために、細胞セイバー又は分離交換機械が何度も使用される。「非観血手術」と呼ばれることもあるこの技術は、失われた血液を置換するための輸血を最小限にし又は不要にし、その手術をより安全で且つ経済的なものにする。かかる装置は、ヘモネティックス（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ）（マサチューセッツ州、ブレインツリー）及びコベ（Ｃｏｂｅ）（コロラド州）が製造している。これらの分離交換機械は、時には、血小板及び血漿を赤血球細胞から分離するために使用される。これら機械の血小板及び血漿ポートにアクセスすることでＰＲＰを採取することが可能となる。ＰＲＰが第二の管に添加されるならば、ＰＲＰは再石灰化され、上述した方法により同時的な遠心分離及び凝固を行うことができる。このことは、第一の遠心分離ステップ及び採取装置を不要にしつつ、より多量のＰＲＰを得ることを可能にする。この方法からも、多様な固体フィブリン網及び膜を得ることができ、また、本明細書中の適用にて使用することができる。
【０１２０】
遠心分離装置の大多数は、採取血液又は直径約１６ｍｍ×１２５ｍｍの第二のフィブリン／血小板ネットワーク管を処理し得る設計とされている。これら寸法の管は、１５ｍｌｓの最大容量を保持する傾向にある。これらの管は、清浄化目的のため取り外し可能な遠心分離装置カップ内に入れ子式に収納される。カップは、管形であり、また、カラーを有して高速度遠心分離を行う間、管及びカップを支持することができる（図５２）。金属の加工又はポリマー系材料の射出成形によって管にカラーを一体的に形成することができる。該カラーは、また、別個に形成し、接着剤、超音波溶接、スピン溶接、誘導溶接又はその他の材料接着方法により管に接着させてもよい。これらの方法においては、カラーと管との材料が同一である必要はなく、広範囲の材料の選択を許容する。これと代替的に、管が閉じた下端に向けて狭小となる先細りの外径部を有し、また、カラーがその内径部に合わさる裏返しの先細りを有するようにしてもよく、管がカラー内に挿入されたとき、管の外径部及びカラーの内径部がかみ合う箇所までのみ進むことができ、成形工程の間の管の開放端からの距離が予め設定されるようにしてもよい。カラーは管との充分な接触を許容する内径を有して遠心分離時に発生する大きなせん断力が加わる間、管を支持する必要がある。カラーの厚さ、すなわち高さの低い円筒体の高さは、カラーの材料の性質及び遠心分離の間にカラーに加わる力によって決まる。カラーの外径は、遠心分離の間、管が半径方向外方に動くのを阻止するのに充分でなければならない。カラーの寸法は、工学コンピューター操作又はコンピュータ化した有限要素解析により容易に計算し得る。
【０１２１】
構造材料は、典型的には、高強度のスチール又はエンジニアリングプラスチックである。脊柱融合及び形成外科手術のような、フィブリン及び血小板ネットワークの多くの適用例には、１６×１２５ｍｍの管にて得られるものよりもより多量のＰＲＰ及び／又はフィブリン血小板ネットワークが望まれる。著しく多量の採取血液又はフィブリン／血小板を得る方法は、支持カラーを取り付けるか又はカラーを一体に形成することにより採取又は受け入れ管を大きく形成することを含む。管は、支持カップを除去した後、遠心分離装置のロータ内に直接配置することができる。管の構造材料は、真空圧を保持し、ストッパを受け入れ、血液と適合可能であり且つ、遠心分離に耐えるのに充分な強度を有するものとし得る。適切な材料は、非限定的に、金属、接着剤により支持カラーが取り付けられたガラス、又はポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）若しくはポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）のような高強度バリアプラスチックを含む。かかる管は、約２０〜３０ｍｍ（例えば、２５ｍｍ）の直径及び１１０〜１４０ｍｍ（例えば、１２５ｍｍ）の長さを有し、２０〜３０ｍｌ以上を保持し得る。ロータの形態を改変することによりより太い管を形成し、より大きな径の管を受け入れることができる。このことは、標準寸法の管にて得られるものよりも多量の標本が望まれる診断試験及び他の方法にも有用である。
【０１２２】
ＰＲＰを移した後、遠心分離及び／又はカルシウム再沈着を遅らせることは、移植片内へのフィブリン、血小板及び成長因子の組み込みを向上させ得る。遠心分離及び／又はカルシウム再沈着を遅らせることは、同時的な凝固及び遠心分離が行われないことを意味するものではない。第二の管に移した後、小さい粒径の移植片材料をＰＲＰに添加するか、又は、製造過程中に、二次管に予め充填するものの少なくとも１つとすることができる。これらの移植片材料は、自己由来の骨、ドナー骨、動物骨、合成骨、三カルシウムリン酸塩、カーボネート、硫酸塩及びそれらの組み合わせを含み得る。移植片材料の密度及びその小さな粒径のため、移植片を、フィブリン血小板ネットワーク又は固体フィブリン網内に均一に組み込むことは困難である。このことは、移植片の密度がＰＲＰの密度よりも遥かに高くなり、また、移植片材料が、遠心分離間に管の底部内に迅速に詰め込まれる結果を生じ得る。詰め込まれる移植片材料の小さな粒径は、その後の遠心分離サイクル中に下降するフィブリン及び血小板が、詰め込まれた移植片材料の間隙間に容易に侵入することを常には許容し得ない。迅速な遠心分離に対する１つの代替的な方法は、遠心分離をある時間遅らせ、その後の架橋結合が生じる前に、フィブリンモノマー、血小板及び成長因子が移植片材料の穴のあいた表面を取り巻き、侵入することを許容することである。混合体は、遅れ期間の間、周期的又は連続的に混合して各移植片粒子の分散及び被覆を向上させ得る。移植片材料の粒径により決まる適切な時間の経過後、フィブリン形成の架橋結合ステップの間にネットワークを圧縮することで移植片を詰め込み、フィブリン血小板のネットワークを安定化するために、遠心分離を開始することができる。
【０１２３】
骨移植片材料の粒径に依存して、遅れは広範囲のものとすることが可能である。粒子が大きければ大きい程、遅れに伴う有利な効果は少なくなる。３ｍｍ以上の自己由来並びにヒト及び動物の移植片の場合、移植片をフィブリン血小板ネットワーク内に組み込むのに遅れは全く不要であり得る。０．５ｍｍ以上３ｍｍ以下の移植片の場合、１〜２０分（例えば、３分の遅れ）が、架橋結合過程の間の遠心分離を許容しつつ、移植片材料を充分に組み込むことを可能にする。０．５ｍｍ以下の移植片材料の場合、３〜２５分の遅れ（例えば、５分の遅れ）が、架橋結合する間の、充分な組み込み及び圧縮を可能にする。この場合にも、ＰＲＰのカルシウム再沈着を遅らせることは、凝固の開始前に、ＰＲＰを移植片内に吸収させることを許容する。１つの実施例において、カルシウムは、第二の管内に予め充填されず、１〜３０分、理想的には、５〜１５分の浸漬時間の後、添加される。
【０１２４】
その他の場合、脊柱癒合用の骨ロッドのような大容積の移植片材料が採用される。これらの場合、凝固前に、血漿、血小板及び／又は成長因子を多孔質表面内により深く侵入させるべく移植片材料をＰＲＰ内に浸漬し、これによりその後のフィブリン−血小板ネットワークの移植片材料中への組み込みを向上させることが望ましい場合がある。このことは、第二の管に移した後に、ＰＲＰに対する抗凝固剤であるキレート剤と結合した内因性カルシウムと置換するであろう、カルシウム又はその他のカチオン系種の添加を遅くすることで実現することができる。カルシウム凝固活性剤は、移植片材料の性質及びその後凝固中の遠心分離によって決まる、適切な時間的遅れの後、管に直接添加することができる。これと代替的に、第二の管に接続し且つ、遠心分離速度を増すことにより作動するカルシウム溶液を保持するリザーバを使用して、単一管システムの実施形態の方法と同様の方法にて、カルシウム凝固活性剤を添加してもよい。
【０１２５】
ＰＲＰを傷口の表面に吹き付け、インシトゥーでフィブリン−血小板ネットワークを形成することも望ましい。この方法は、治癒効果を向上させる。フィブリンは接着剤として機能し、一方、血小板は、その成長因子を添加することにより治癒を向上させる。この技術を採用する方法の例は：皮膚移植片を火傷又は慢性的な傷口に接着すること；フェイスリフトのような形成手術の間、皮膚を皮下層に接着すること；火傷の創面切除の後、液体が滲み出る傷口をシーリングすること；及び局所的な止血剤を施すことを包含し得る。望ましい効果を実現する１つの方法は、ＰＲＰを再石灰化する管すなわち二次管に移し、そ
の後、ポンプ型エアゾールスプレー又は空気支援型スプレーを管に付け、再石灰化したＰＲＰを傷口箇所に施すことである。その後、ＰＲＰは、インシトゥーでフィブリン血小板ネットワークを形成することになろう。
【０１２６】
１つの代替的な方法は、赤血球細胞の分離後、第一の管から直接圧送するか、又はカルシウム凝固活性剤若しくはその他のカチオン系種を保持しない管内にＰＲＰを移すことであろう。別個の流体多岐管を利用することにより、又はカルシウム結晶を含有するチャンバを通じてＰＲＰを流すことにより、圧送する間に溶液を流体経路に添加することでカルシウムを添加することができる。
【０１２７】
１つの代替的な方法は、移した後、ＰＲＰを遠心分離することにより、カルシウム溶液無しで血小板を第二の管の底部内に濃縮することである。圧送システムに対する吸引部は、管の底部から吸引し、多量の成長因子に対し血小板をより高濃度にて作用させる。吸引ステムは、隔板の下方に血小板濃縮液を閉じ込めるスライド式隔板を有することができる。吸引ステムは、隔板の最初の位置を制限し、これにより分配すべき容積中の血小板の濃度を所望の値に設定するようなストッパを有することができる（図５３参照）。該ストッパは、隔板の下方の血漿の容積中の血小板に所望の濃度を与えるであろう、吸引口の底部から予め設定した距離に配置される。ストッパが吸引ステムにて上方位置に配置されればされるほど、血小板の濃度は低くなるであろう。別の実施形態は、高エネルギの凝血活性化表面を噴霧システムの流体路中に配置する。該表面は、血漿を活性化して、架橋結合密度がより高い凝血塊を形成し、これにより機械的強度を増大し、凝血時間を短縮することになろう。
【０１２８】
移植片材料と共に及び移植片材料無しで二次管からのフィブリン−血小板ネットワークの除去を容易にするため、その他の装置を採用することができる。第二の遠心分離ステップの完了後、フィブリン−血小板ネットワークを第二の管の底部に詰め込み得る。通常、管は、滅菌性カップ内に上澄みを静かに注ぐことができ、ネットワークは、カップ内に自在に流動する。より濃密なネットワークに対し要求される、より高速度の遠心分離速度のとき、上澄みを静かに注ぐことが容易であるように凝血塊をきつく詰め込むことができる。この詰め込みは、管の壁に対して密閉的シールを形成し、このため、上下逆さにしたときに凝血塊が動く際に真空圧が形成され、更なる流れを阻止する。この状態は、遠心分離の間に圧縮される移植片材料を添加することで悪化し、金属粉体の焼結の場合のような、詰め込まれた濃密な基質を形成する。このため、骨キャビティのような傷口箇所にネットワークを添加し得るよう、好ましくは供給システムの一部として、管の底部からネットワークを除去することが望ましい。
【０１２９】
ネットワークの除去を容易にする１つの方法は、穴を設けた底部を有するカップを製造時に第二の管に含めることである（図５４参照）。管からカップを除去する間、遠心分離中に発生した血清の排出を許容するように、底部に穴を設ける（図５４ａ）。カップの壁は、浅い外観のもの（図５４ａ）から管の全長（図５４ｂ）の範囲まで、高さが様々であり得る。カップのリップ部は、供給装置に連結する手段を含有し得る。連結手段は、ねじ、差込ネジロック、クリップ又は同様の機構とし得る。カップの壁は、過度の除去力が回避されるように、除去する間、真空圧を防止し得るための溝を、その壁に有し得る（図５４ｄ）。カップの壁は、凝血塊の上方の血清が、溝に沿って、カップを管から除去する間に形成された下方の容積内に流れることができるような穴部分を有し得る。カップの頂部はまた、カップの円筒状部分を通じたピストンの確実な置換により作動する、供給システムに連結することもできる；この作用は、注射器（図５４ｅ）又は歯止め式「コーキングガン」機構（図５４ｆ）を模したものとし得る。カップ又は供給シリンダの円筒状部分の材料は、蛍光計測技術を使用して正確に供給することを許容し得るよう放射線不透過性とし得る。図５５において、第二の管は、円筒状であり、また、円筒体のどちらかの端にス
トッパを有する。遠心分離後、ストッパを除去し、ピストンが形成されたネットワークを置換する。このことは、カートリッジシステムを構成することになる。これと代替的に、カップを繊維によってストッパに取り付け、ストッパが除去されるとき、カップが引き出されるようにしてもよい。
【０１３０】
本明細書に開示された方法により生産された膜及びフィブリンは、上述したように、細胞を培養するために使用すべき足場として機能することが可能である。フィブリン基質は、足場として機能するのに充分に濃密であり得る。基質は、コラーゲンスポンジのようにゆっくりと吸収される足場材料、生物分解性ポリマー又は腹部大動脈動脈瘤移植片のような生物非分解性ポリマーにて形成することができる。これらの組み合わせ足場は、現在の足場材料と比べ、更なる機械的強度及びより均一な組織再生を供与し得る。ある実施例において、例えば、約４，０００〜１０，０００ｘｇのような大きい遠心分離力を加えることにより得られた膜は、表皮細胞の生体外での接着培養のための足場として機能し得る。これらの培養物は、本来の組織の火傷又は機械的剥離に起因する、皮膚の重度の損傷を修復するめに特に有用である。これらのフィブリン足場は、通常、培養物中の細胞に対し、血小板により成長因子を供与し、また、固体フィブリン網により接着因子を供与する。インビトロで良好な培養物を得るためには、培地中で充分な密度の上皮細胞から開始することが望ましい。
【０１３１】
本明細書に記載した膜及び固体フィブリン網はまた、幹細胞をその上にて融合するために使用し得る。より特定すれば、膜及び固体フィブリン網は、単層又は幾つかの層の細胞又は膜内の幹細胞と共に膵細胞を培養するために使用し得る。例えば、英国、エジンバラ大学のメドヴィンスキー（Ｍｅｄｖｉｎｓｋｙ）及びオレゴン州、ポートランド大学のＸ・ワン（Ｗａｎｇ）は、最近、糖尿病マウスの膵臓内に注射した幹細胞は、そのゲノムを病変膵細胞と融合させ、再度、インシュリン生産活性のある、いくつかの程度の倍数体を生成させることを実証している。本明細書に記載した足場及び支持体中に存在する活性成長因子は、従来の媒体を使用して細胞を成長させることを可能にし、また、融合、生化学的特性及び細胞学的特性を研究することも可能にする。
【０１３２】
異なる適用において、単層培養物から得た軟骨細胞は、当該技術分野の当業者に既知であるように、アルギン酸塩ビーズ内で固定される。これらの固体ビーズは、遠心分離力を使用してより大きい「組織様」凝集物となるように圧縮され、空気圧を調整し、インビボで生理学的応力に従って「組織」を刺激する目的で、これら凝集物は「圧縮」される（ドイツ、ギーセン、応用科学大学、チェルマック（Ｃｚｅｒｍａｋ） Ｐ．））。遠心分離の間、ＰＲＰをアルギン酸塩ビーズに添加して、損傷した軟骨に代えて植え込む用意ができるように、又は軟骨の成長を誘導し得るように数日間生物反応器内で培養する用意ができるように、濃密な生物活性凝集物を製造することができる。
【０１３３】
実施例
【実施例１】
【０１３４】
真空状態で密封可能で、透明な白色ガラスで出来ており、不活性で且つ厚さ１ｍｍの抗生物質用の５ｍｌガラス容器内に、フィブリン安定化剤として機能するトラネキサム酸１００ｍｇを導入した。純度９８％以上である合成トラネキサム酸は、アメリカの会社であるシグマ（Ｓｉｇｍａ）インコーポレーテッドにより市販されている。これと別個に、同一のアメリカの会社シグマインコーポレーテッドからのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（純度＞９９％）を精密はかりにて１４７．０ｇ計量することにより、１ＭのＣａＣｌ２溶液を作製した。
【０１３５】
この塩を、頻繁に攪拌下、数分間、室温にて、正確に１リットルの超高純度非発熱性蒸
留水中に溶解させた。±５％の供給精度（エッペンドルフのような）を有する精密ピストンディスペンサを使用して、８０μＬの活性剤溶液をガラス容器中に導入した。このステップにおいて、供給と同時に、あらゆる粉体又はフィラメントによる汚染の可能性を慎重に防止しつつ、０．２２μｍのミリポア滅菌処理用フィルタを使用してろ過を行った。最後に、その後の真空栓止め、及び気体を使用することによる更なる滅菌処理の可能性を許容し得るように、容器を完全に栓をしないよう注意しつつ、穿刺可能且つ真空圧下にて栓止め可能なゴムストッパにてガラス容器に栓をした。次に、雰囲気中の固体粒子による汚染の可能性を防止しつつ（滅菌チャンバ内のＵＬＰＡ又はＨＥＰＡろ過）、真空栓止めするための適切な装置内に容器を導入した。膜真空ポンプ及び測微制御装置を使用することにより、４ｍｌの真空圧を装置の内部雰囲気に加えた。内部雰囲気中の真空レベルを制御するため、精密真空計測器を使用した（精度＃１ｍバール）。最後に、装置を排出せずに、その後に以下の実施例で説明するように使用すべく回収し得るよう、容器を真空圧下にて栓止めした。
【実施例２】
【０１３６】
例えば、０．１０６Ｍクエン酸ナトリウム溶液を添加したベクトン−ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のバキュテイナ（ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ）（登録商標名）滅菌試験管を使用して、臨床分析のための定量標準に従って、患者から１０ｍｌの静脈血液を吸引した。この目的のために、二ナトリウム又は二カリウムエチレンジアミンテトラアセテートを添加した試験管を使用することもできる。血液を吸引する間、試料を慎重に滅菌状態に保った。最後に、成分を完全に混合し、これによりクエン酸ナトリウムの抗凝固作用を保証すべく、試料を静かに振った。次に、遠心分離装置の損傷を防止するためロータの重量を慎重に釣り合わせつつ、試験管を適切な遠心分離装置内に導入した。蓋が密封されたならば、試料を１５分間、３５００ｒｐｍにて遠心分離し、これにより赤血球細胞（高濃度）をクエン酸添加血漿（上澄み液）から分離した。この場合、主としてドナーの血液の特徴に依存する血漿の収率は、５５％の高さであった。分離した血漿を含有する試験管を滅菌状態下で栓止めした状態に保ち、血漿自体を回収すべくスタンド内に垂直に配置したが、遠心分離中に分離した２相の混合を防止するため、このステップ中試験管を振らないように注意した。次に、変性アルコールを使用して試験管キャップの外側部分を滅菌処理し、次に、滅菌注射器に接続した滅菌針を試験管キャップに導入した。針を２相の分離メニスカスから３〜４ｍｍだけ離し、４ｍｌの血漿を吸引した。実施例１にて説明したように調整した、本発明による容器のキャップを事前にアルコールを使用して滅菌し、同一の針を使用することにより穿刺した。針がキャップを穿刺すると直ちに、注射器内に保持されたクエン酸塩添加血漿を、完全に容器内に吸引した。容器を静かに振り、３７℃にて約２分後、直ちに使用できる滅菌性の自己由来フィブリングルーの凝血塊を得た。
【実施例３】
【０１３７】
５ｍｌのクエン酸ナトリウムバキュテイナ（登録商標名）試験管（ベクトン−ディキンソン）を使用して４９歳の患者から約１８ｍｌの静脈血液を吸引し、試料を吸引した直後に、静かに振るよう注意した。このように採取した血液を、血漿を分離すべく直ちに遠心分離した（２５００ｒｐｍにて１５分間）。実施例１にて説明したように調整した（ただしトラネキサム酸は使用せず）各々１２０μＬのＣａＣｌ２（１０ｇ／１００ｍｌ）を含有する２つの１０ｍｌ試験管に、血漿（１２ｍｌ）を慎重に移した。血漿を活性剤と混合した後、試験管を３０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離し、最終的に、２つの大きいフィブリン試料が得られ、これらフィブリン試料を、滅菌性に対するあらゆる注意を払って、製造後２〜３時間以内に、大きい小嚢状の下顎骨キャビティ内に挿入した。該キャビティは、埋伏した左犬歯及び右側の第二の門歯の抜歯により、及び門歯の歯の中央領域に存在するシストを切除することにより形成されたものである。最後に、歯肉端縁を８回縫って閉じた。１５日後の放射線写真チェックは、フィブリンが外見上無傷のままでその所要位
置に留まっていることを示した。７ヶ月後の組織構造は、フィブリンが骨組織にて完全に置換されたことを明らかにし、同一の結果を実現するのに１２ヶ月以上必要とする従来の方法よりも優れた術後経過であった。自己由来のフィブリンの製造のため何ら抗フィブリン溶解剤が使用されないから、この場合、特定の目的のため上記添加剤が有用であると説明することができる。
【実施例４】
【０１３８】
接着フィブリングルーを生産するため、実施例３のように得られた１２ｍｌの血漿を、滅菌性を保つための全ての措置を採って、実施例１にて説明したように調整した、本発明による２０ｍｌの容器に移した。
【０１３９】
慎重に攪拌した後、混合した血漿を化学実験室にて使用される型式の滅菌性ガラススライドに注ぎ、ここで、血漿を、滅菌性且つ非常に純粋な珊瑚由来の炭酸カルシウム（フランス、ノーテブス（ＮＯＴＥＢＳ）Ｓ．Ａ．のバイオコーラル（ＢＩＯＣＯＲＡＬ）（登録商標名））又はフッ化カルシウム（＞９８％、シグマインコーポレーテッド）と混合した。これらのカルシウム塩は、共に、線維芽細胞の刺激剤として当該技術分野の当業者に周知である。
【０１４０】
血漿の一部分を炭酸カルシウムの一部分と（例えば、２ｍｌ対５００ｍｇで）混合させることにより、柔軟で滅菌性の接着ペーストが得られ、感染した粘液質の嚢を切除した後の歯肉下空間又は異なるキャビティに対するフィラーとして使用した。ペーストは、空の空間を充填するように配置され、止血栓として機能する固体フィブリン網を数分にて形成し、また、粘液質の端縁を所要位置に支持し、後に結合性細胞の移行が開始する箇所に、自己由来の生物学的基層を形成した。
【実施例５】
【０１４１】
フィブリングルーの膜を得るため、実施例３のように得られた２０ｍｌの血漿を、実施例１のように調整した本発明による２５ｍｌの平坦底部の容器に入れた。通常の慎重な攪拌の後、容器を旋回ロータにて４０分間、４０００ｒｐｍにて遠心分離した。遠心分離工程の終了時、試験管の底部から、白色の極めて濃密で且つ引張り強度の大きい膜が回収され、その寸法は試験管の底部と等しく（直径２４ｍｍ）、厚さは３ｍｍであった。この自己由来の膜は、その濃密さ及び強度のため、多孔質合成膜の置換品として、歯科及び一般的な外科手術における保持膜及び分離膜として使用した。得られた膜は、数日間、４℃にて滅菌状態にて保存することができる。
【実施例６】
【０１４２】
大きい寸法のフィブリングルーの膜を得るため、約２００ｍｌのクエン酸添加血漿を患者から吸引し、二重輸血バッグ内に集め分離した。血漿に対し１２時間、−８０℃にて凍結することにより寒冷沈降反応を行い、解凍は４℃にて一昼夜行った（この方法は、当該技術分野の当業者に周知である）。同日の朝、この方法により得られた血漿に対し１５分間、４℃にて５０００ｒｐｍの遠心分離を行い、約２０ｍｌの寒冷沈降物を得た。加圧装置（例えば、フランスの会社、ジョアン（Ｊｏｕａｎ）Ｓ．Ａ．のＸＰ１００）を使用することにより上澄み液を慎重に除去した後、寒冷沈降物を同一患者の２０ｍｌの全血漿と共に取り出した。得られた４０ｍｌを、実施例１のように適切な量の活性剤を含有する本発明による直径３５ｍｍの平坦な底部の滅菌性ポリプロピレン容器に入れた。慎重に振った後、容器を４０分、５０００ｒｐｍにて遠心分離し、実施例５におけると同様ではあるが、フィブリンの含有量がより多量であるために、より濃密で引張り強度の大きい膜が得られた。上記膜もまた、４℃にて数日間、滅菌形態にて保存することができる。
【０１４３】
実施例５にて説明した方法にて得られた膜は、実施例４にて記載した利用に加えて、極
めて重篤な湯症の症例に移植すべき移植片を得るために、同一患者の表皮細胞のインビトロ培養のための基質として使用することができる。
【０１４４】
上述した目的に有用な良好な品質の膜はまた、本発明による容器内に直接移した全分離血漿からも得ることができる。得られた膜は、上述したものよりも薄いが、外科手術用及び細胞成長のための基質として依然として有用である。
【実施例７】
【０１４５】
実施例５における寒冷析出物から開始して噴霧フィブリンを得るため、２０ｍｌの寒冷析出物を室温にて１０ｍｌの全血漿と共に取り出し、静かに振って完全に溶解させた。得られる血漿を、実施例１のように調整した本発明による５０ｍｌの容器内に慎重に移し、成分が完全に混合するように静かに振った。１２０秒後、室温にて、該試験管を当該技術分野の当業者に既知のベンチュリ型滅菌空気コンプレッサに接続して、外科手術が行われる出血器官（肺、心臓、脾臓、動脈吻合）の表面に均一に分配した。濃縮フィブリノーゲン、トロンビン、カルシウムイオン及び他の凝固酵素を含有する濃縮血漿を器官上に分配すると、患者の内皮内に存在する組織性凝固活性化酵素もあるため、数秒にて凝固し、保護止血作用を有するフィブリンフィルムを形成した。これにより、外科手術の内部出血が減少し、故に、更なる輸血又は合併症が回避された。
【実施例８】
【０１４６】
実施例５にて説明した方法により得られた膜はまた、多血小板血漿（ＰＲＰ）を開始血液成分として使用するならば、自己由来の血小板を組み入れることになろう。全血からＰＲＰを得るため、血液試料を１０〜１５分間、１０００ｘｇにて遠心分離し得る。続くステップは、上述した実施例にて説明したものと同様である。
【０１４７】
この適用方法により得られた膜は、ワン及びヴァッシロポウルス（Ｖａｓｓｉｌｌｏｐｏｕｌｏｓ）が記載した（ネイチャー、４２２巻−２００３、４月２４日）幹細胞の融合現象をインビトロで研究するための活性基質として使用することができる。この研究は、マウスの肝臓内で肝細胞の存在下にて成長する幹細胞の使用を開示し、損傷し又は欠陥のある組織を再生することのできる新たな種類の細胞を形成するためにそれらのゲノムを融合させている。
【０１４８】
上述したように得られた膜は、成長因子及び他の刺激剤の提供物である血小板が存在するため、この極めて重要な現象をインビトロにて研究するための支持体として使用することができ、また、最終的に得られた新たな細胞の世代を、インビボに導入すべく使用することができる（軟骨細胞又は上皮細胞に対して行ったものと同様）。
【実施例９】
【０１４９】
以下の方法は全て、滅菌状態にて層流キャビネット下にて操作した。固体の生検試料から開始して表皮組織をホモジェナイザーにて処理し、その単一細胞の完全な状態を保持しつつ、小さな細胞凝集物を分離した。ホモジネートを、４０ｍＭの滅菌ＰＢＳ（リン酸塩緩衝溶液Ｐｈ７．３−ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））にて洗浄後、細胞をＰＰ管内で７〜１５分間、５００〜１０００ｘｇにて遠心分離し、ペレットを回収した。洗浄は２回繰り返した。次に、得られた細胞を０．０５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡの溶液にて２０分間、３７℃にて消化し、細胞を支えるコラーゲン構造体を除去した。
【０１５０】
その後、細胞を滅菌ＰＢＳにて充分に洗浄し、コラゲナーゼを除去した。次に、細胞を培地（例えば、Ｍ１９９、ＨＡＭ−Ｆ１２、又は当該技術分野の当業者に既知のその他のもの）内に再懸濁させ、フィブリン膜の表面に均質に分配した。フィブリン足場の表面における細胞の密度は、上皮細胞の培養結果を良好なものとするために重要である。例えば
、最良の結果は、１〜３×１０４細胞／ｃｍ２の密度の膜にて得ることができ、この場合、細胞は、通常、分配後１５〜６０分で接着し、２〜５時間後、これら細胞は完全に平坦になる。培養物を、３７℃にて５％ＣＯ２及び、Ｒ．Ｈ．９８％の制御された雰囲気内に保ち、培養物の発達を定期的に制御し、結果として、必要ならば、培地を２〜３日毎に交換し、５日間保つことができる。円筒状容器の場合、ＣＯ２培養器内にて、適正なローラシステムを２４時間ベースにて使用し、培地が膜表面を絶えず洗浄して培養中の細胞に栄養を供給するようにした。
【０１５１】
培養は、気体の交換を許容するが内部の滅菌性を保つ通気システムを有する、適正な滅菌性容器内で行う必要がある。フィブリン膜は、容器の内側に形成され、培養時間の全体を通してフラスコの内面に完全に接着する必要がある。
【０１５２】
インビトロで培養物の発達を確認した後（例えば、位相差顕微鏡を使用して）、上面に細胞を有する膜を慎重に除去し、この膜は、滅菌状態下で患者の傷口又は火傷に移植する用意ができており、最終的に、該膜を縫うことで所要位置に保たれる。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】本発明の第一の実施形態を示す斜視図である。
【図２】図１に示した第一の実施形態の一次容器を示す断面図である。
【図３】図２の一次容器の異なる実施形態を示す断面図である。
【図４】図２の一次容器の異なる実施形態を示す断面図である。
【図５】密封した一次容器に穴を開け始める移し装置の第一の端部を示す、図１の第一の実施形態による一部分の拡大部分断面図である。
【図６】密封した一次容器に完全に穴を開ける移し装置の第一の端部、及び密封した第二の一次容器に完全に穴を開ける移し装置の第二の端部を示す、図５に示したものと同様の図である。
【図７】上下逆さにした一次管及びその内容物を示す、図２と同様の図である。
【図８】図１に示した第一の実施形態の平面図である。
【図９】連動した一次容器、二次容器及び移し装置、並びに第一の容器の内容物が第二の容器に移されることを示す、図８の部分断面図である。
【図１０】本発明を具体化するキットの平面図である。
【図１１】本発明の第二の実施形態の斜視図である。
【図１２】図１１に示した本発明の第二の実施形態の断面図である。
【図１３】リザーバ及び一次採取装置を穿刺する一次採取装置を示す、図１２と同様の断面図である。
【図１４】一次採取装置を穿刺し、その内容物を装置内に空けるリザーバを示す、図１２と同様の断面図である。
【図１５】本発明の第三の実施形態を示す斜視図である。
【図１６】図１５に示した本発明の第三の実施形態を示す断面図である。
【図１７】本発明を具体化する移し装置の斜視図である。
【図１８】図１７中の線１８−１８に沿った断面図である。
【図１９】本発明の１つの側面を具体化するカートリッジの斜視図である。
【図２０】図１９のカートリッジの断面側面図である。
【図２１】本発明の別の側面を具体化する軸方向遠心分離システムにて採用し得る装置の斜視図である。
【図２２】図２１に示した装置及び内容物の断面図である。
【図２３】図２１に示した装置及び内容物の、最初の遠心分離の間の断面図である。
【図２４】図２１に示した装置及び内容物の、最初の遠心分離が停止した後の断面図である。
【図２５】図２１に示した装置及び内容物の、２回目の遠心分離の間の断面図である。
【図２６】二次高密度化チャンバの半径が一次細胞分離チャンバの半径よりも大きい、図２１に示した装置の１つの変更例の斜視図である。
【図２７】同心状チャンバが採用される、図２１に示したシステムの１つの変更例の断面図である。
【図２８】図２７に示した装置及び内容物の、最初の遠心分離の間の断面図である。
【図２９】図２７に示した装置及び内容物の、最初の遠心分離が停止した後の断面図である。
【図３０】図２７に示した装置及び内容物の、２回目の遠心分離の間の断面図である。
【図３１】疎水性膜を採用するシステムの断面図である。
【図３２】図３１の拡大部分の図である。
【図３３】織地補強材を有する高密度化チャンバの壁の一部分の、断面図である。
【図３４】壁に張出し部が設けられた、図３３の壁の１つの変更例の断面図である。
【図３５】壁に溝が設けられた、図３３の壁の１つの変更例の断面図である。
【図３６】膜の除去を容易にする、タブを有した取り外し可能なフィルムにて裏当てされた高密度化チャンバを示す図である。
【図３７】はがしを容易にするように孔を有する膜を示す図である。
【図３８】本発明の別の側面を具体化するロータ医療装置の部分断面斜視図である。
【図３９】内壁に１つ又はそれ以上の中実なリブを有する高密度化チャンバの底面図である。
【図４０】半径方向遠心分離システムにて使用するために配向された鋳型（図４０（ａ）にて図示）及び軸方向遠心分離システムにて使用するために配向された鋳型（図４０（ｂ）にて図示）の例を示す図である。
【図４１】漏斗及びランナーがキャビティの充填を促進するように採用される、鋳型を有する装置の一部分の図である。
【図４２】気体及び液体が適正に漏れ出るのを許容すべく通気穴が採用される、鋳型を有する装置の一部分を示す図である。
【図４３】鋳型、２つのチャンバを分割する羽根及び通気口を有する装置を部分断面図で示した斜視図である。
【図４４】図４３の装置の平面図である。
【図４５】鋳型、３つの不同のチャンバを分割する羽根及び通気口を有する装置の平面図である。
【図４６】一体に接続され、装置から伸びる鋳型が示され、羽根が３つの等しいチャンバに分割する、図４５の装置を改変したときの平面図である。
【図４７】多血小板血漿が少なくとも１つのチャンバに導入された後であるが、装置が遠心分離される前の、図４３〜図４６に示した装置の任意のものの一部分の断面側面図である。
【図４８】装置が遠心分離された直後の、図４７に示した装置の一部分の断面側面図である。
【図４９】多血小板血漿が少なくとも１つの鋳型に入った、完全な遠心分離状態にある、図４７に示した装置の一部分の断面側面図である。
【図５０】プラスチック代替品、例えば底部に固定されたガラスを示す、断面図である。
【図５１】プラスチック代替品、例えば底部に接着又は熱によりつないだガラス玉を示す、断面図である。
【図５２】５２ａは、滅菌性フィルムにて包まれ、キャリヤにより収容された一次容器の斜視図である。５２ｂは、一次管におけるカラーを示す、図５４ａの分解図である。
【図５３】本発明のある実施形態と共に採用可能である供給／圧送システムの部分断面図である。
【図５４−１】５４ａは、有孔底部を有し、二次容器により収容されたカップの断面図である。５４ｂは、図５４ａに示したカップの代替的な実施形態を示す断面図である。５４ｃは、図５４ｂの線５４ｃ−５４ｃに沿った断面図である。
【図５４−２】５４ｄは、その長さに沿って孔を有する、図５４ｂに示したカップの代替的な実施形態を示す断面図である。５４ｅは、図５４ａ〜図５４ｄの任意のカップと共に確実な置き換えにより作動する供給システムを示す部分断面図である。
【図５４−３】５４ｆは、コーキングガン機構が利用される、図５４ｅと同様の供給システムを示す部分断面図である。
【図５５】二次管が２つのストッパを有する、供給システムを示す一連の部分断面図である。
【図５６】本発明を具体化する成形可能な挿入体の斜視図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体フィブリン網の製造方法であって：
血液を患者から吸引すること；
血液から血漿を分離すること；および
血漿を同時的に凝固および遠心分離して固体フィブリン網を形成することを含み、前記固体フィブリン網が生きた生物内で身体組織を再生するために適する、前記方法。
【請求項２】
血液から分離した血漿が内因性カルシウムを含有する、請求項１の方法であって、さらに：
血漿と抗凝固剤とを接触させること；および
血漿と、内因性カルシウムに対するのと比べて抗凝固剤に対して同等または高い親和性を有するカチオン種を含む凝固剤とを接触せることを含む、前記方法。
【請求項３】
カチオン種が、マグネシウム、マンガン、亜鉛およびそれら組み合わせのうち少なくとも１つを含む、請求項２の方法。
【請求項４】
カチオン種がカルシウムを含む、請求項２の方法。
【請求項５】
カチオン種が、塩化カルシウム、フッ化カルシウム、炭酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、フマル酸カルシウム、ピルビン酸カルシウムおよびそれらの組み合わせのうち少なくとも１つを含む、請求項２の方法。
【請求項６】
固体フィブリン網が治癒増進剤をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項７】
治癒増進剤が、抗生物質、鎮痛剤、癌治癒剤、血小板成長因子、骨形成タンパク質、幹細胞、骨移植片材料、軟組織移植片、細胞培養材料、免疫抑制剤、インプラントおよびそれらの組み合わせのうち少なくとも１つを含む、請求項６の方法。
【請求項８】
治癒増進剤が抗生物質を含み、該抗生物質がアンピシリン、エリスロマイシン、トブラマイシンおよびそれらの組み合わせのうち少なくとも１つを含む、請求項７の方法。
【請求項９】
治癒増進剤が鎮痛剤を含み、該鎮痛剤がアスピリン、コデインおよびそれらの組み合わせのうち少なくとも１つを含む、請求項７の方法。
【請求項１０】
治癒増進剤が骨移植片材料を含み、該骨移植片材料が自己由来骨、死体からの同種異系移植片、死体からの同種移植片、動物由来骨、合成骨移植片、正生物性化合物、骨形成因子（ＢＭＰ）、組み換えヒト骨形成因子（ｒｈＢＭＰ）およびそれらの組み合わせのうち少なくとも１つを含む、請求項７の方法。
【請求項１１】
治癒増進剤が、皮膚、皮膚移植片材料、歯肉移植片、コラーゲン、生物吸収性移植片、脈管移植片、血小板由来成長因子、血小板因子４（ＰＦ４）、トロンボグロブリン、トロンボスポンジンおよびそれらの組み合わせのうち少なくとも１つを含む、請求項７の方法。
【請求項１２】
治癒増進剤が、器官移植用の免疫抑制剤および皮膚免疫抑制剤のうち少なくとも１つを含む、請求項７の方法。
【請求項１３】
固体フィブリン膜が、所望の分子発現、遺伝子治療および細胞治療のための生きた細胞を含む、請求項１の方法。
【請求項１４】
患者にて固体フィブリン網を使用することをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項１５】
遠心分離が軸方向型である、請求項１の方法。
【請求項１６】
軸方向遠心分離に使用する装置であって、該装置が：
一次チャンバ；
凝固剤を含有する二次チャンバ；および
一次チャンバを二次チャンバから分離する媒体を含む、軸方向遠心分離に使用する装置。
【請求項１７】
一次チャンバが抗凝固剤を含有する、請求項１６の装置。
【請求項１８】
凝固剤が、マグネシウム、マンガン、亜鉛およびそれらの組み合わせのうち少なくとも１つを含む、請求項１６の装置。
【請求項１９】
凝固剤がカルシウムを含む、請求項１６の装置。
【請求項２０】
凝固剤が、塩化カルシウム、フッ化カルシウム、炭酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、フマル酸カルシウム、ピルビン酸カルシウム、有機カルシウム塩およびそれらの組み合わせのうち少なくとも１つを含む、請求項１９の装置。
【請求項２１】
媒体がフィルターを含み、該フィルターが、一次チャンバ内に吸引された血液に由来する赤血球および白血球細胞が約１０００ｘＧまたはそれ以上の遠心分離力の下で二次チャンバに入るのを実質的に阻止するが、該血液に由来する血漿および血小板が約１０００ｘＧまたはそれ以上の遠心分離力の下で二次チャンバに流れるのを実質的に許容する、請求項１６の装置。
【請求項２２】
媒体が分離媒体を含む、請求項１６の装置。
【請求項２３】
分離媒体が、遠心分離前の一次チャンバと二次チャンバとの間の流体的連通を実質的に阻止し、且つ、約１０００ｘＧまたはそれ以上での遠心分離の間は一次チャンバと二次チャンバとの間に流体的連通を提供するよう動く、請求項２２の装置。
【請求項２４】
分離媒体が、一次チャンバ内に吸引された血液に由来する赤血球および白血球細胞が二次チャンバに入ることを遠心分離の後実質的に阻止する、請求項２３の装置。
【請求項２５】
分離媒体が、シリコーンゲル、ポリエステルゲル、チキソトロピックゲルおよびそれらの組み合わせのうち少なくとも１つを含む、請求項２２の装置。
【請求項２６】
一次チャンバが、遠心分離の間、二次チャンバの上方にある、請求項１６の装置。
【請求項２７】
一次チャンバが第一の外周を有し、二次チャンバが第二の外周を有し、該第一の外周および第二の外周が、実質的に同一である、請求項１６の装置。
【請求項２８】
一次チャンバが第一の外周を有し、二次チャンバが第二の外周を有し、該第一の外周が第二の外周よりも小さい、請求項１６の装置。
【請求項２９】
一次チャンバおよび二次チャンバのうち少なくとも一方が治癒増進剤を含有する、請求項１６の装置。
【請求項３０】
治癒増進剤が、抗生物質、鎮痛剤、癌治癒剤、血小板成長因子、骨形成タンパク質、幹細胞、骨移植片材料、軟組織移植片、血小板由来成長因子細胞培養材料、免疫抑制剤およびそれらの組み合わせのうち少なくとも１つを含む、請求項２９の装置。
【請求項３１】
軸方向遠心分離に使用する装置であって、該装置が：
第一の外周を有する第一のチャンバ；および
第二の外周を有し、凝固剤を含有する第二のチャンバを含み、該第二の外周が第一の外周よりも大きい、軸方向遠心分離に使用する装置。
【請求項３２】
凝固剤が、マグネシウム、マンガン、亜鉛およびそれらの組み合わせのうち少なくとも１つを含む、請求項３１の装置。
【請求項３３】
凝固剤がカルシウムを含む、請求項３１の装置。
【請求項３４】
活性剤が、塩化カルシウム、フッ化カルシウム、炭酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、フマル酸カルシウム、ピルビン酸カルシウム、有機カルシウム塩およびそれらの組み合わせのうち少なくとも１つを含む、請求項３３の装置。
【請求項３５】
第一のチャンバが、上側部分と下側部分とを含む、請求項３１の装置。
【請求項３６】
上側部分と下側部分が、それらの間の流体的連通を実質的に阻止する媒体により分離する、請求項３５の装置。
【請求項３７】
約１０００ｘＧまたはそれ以上で遠心分離するとき、上側部分と下側部分との間の流体的連通が提供される、請求項３６の装置。
【請求項３８】
第一のチャンバの下側部分が、第二のチャンバと流体的に連通している、請求項３７の装置。
【請求項３９】
治癒剤をさらに含む、請求項３１の装置。
【請求項４０】
第一のチャンバが抗凝固剤を含有する、請求項３１の装置。
【請求項１】
固体フィブリン網の製造方法であって：
血液を患者から吸引すること；
血液から血漿を分離すること；および
血漿を同時的に凝固および遠心分離して固体フィブリン網を形成することを含み、前記固体フィブリン網が生きた生物内で身体組織を再生するために適する、前記方法。
【請求項２】
血液から分離した血漿が内因性カルシウムを含有する、請求項１の方法であって、さらに：
血漿と抗凝固剤とを接触させること；および
血漿と、内因性カルシウムに対するのと比べて抗凝固剤に対して同等または高い親和性を有するカチオン種を含む凝固剤とを接触せることを含む、前記方法。
【請求項３】
カチオン種が、マグネシウム、マンガン、亜鉛およびそれら組み合わせのうち少なくとも１つを含む、請求項２の方法。
【請求項４】
カチオン種がカルシウムを含む、請求項２の方法。
【請求項５】
カチオン種が、塩化カルシウム、フッ化カルシウム、炭酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、フマル酸カルシウム、ピルビン酸カルシウムおよびそれらの組み合わせのうち少なくとも１つを含む、請求項２の方法。
【請求項６】
固体フィブリン網が治癒増進剤をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項７】
治癒増進剤が、抗生物質、鎮痛剤、癌治癒剤、血小板成長因子、骨形成タンパク質、幹細胞、骨移植片材料、軟組織移植片、細胞培養材料、免疫抑制剤、インプラントおよびそれらの組み合わせのうち少なくとも１つを含む、請求項６の方法。
【請求項８】
治癒増進剤が抗生物質を含み、該抗生物質がアンピシリン、エリスロマイシン、トブラマイシンおよびそれらの組み合わせのうち少なくとも１つを含む、請求項７の方法。
【請求項９】
治癒増進剤が鎮痛剤を含み、該鎮痛剤がアスピリン、コデインおよびそれらの組み合わせのうち少なくとも１つを含む、請求項７の方法。
【請求項１０】
治癒増進剤が骨移植片材料を含み、該骨移植片材料が自己由来骨、死体からの同種異系移植片、死体からの同種移植片、動物由来骨、合成骨移植片、正生物性化合物、骨形成因子（ＢＭＰ）、組み換えヒト骨形成因子（ｒｈＢＭＰ）およびそれらの組み合わせのうち少なくとも１つを含む、請求項７の方法。
【請求項１１】
治癒増進剤が、皮膚、皮膚移植片材料、歯肉移植片、コラーゲン、生物吸収性移植片、脈管移植片、血小板由来成長因子、血小板因子４（ＰＦ４）、トロンボグロブリン、トロンボスポンジンおよびそれらの組み合わせのうち少なくとも１つを含む、請求項７の方法。
【請求項１２】
治癒増進剤が、器官移植用の免疫抑制剤および皮膚免疫抑制剤のうち少なくとも１つを含む、請求項７の方法。
【請求項１３】
固体フィブリン膜が、所望の分子発現、遺伝子治療および細胞治療のための生きた細胞を含む、請求項１の方法。
【請求項１４】
患者にて固体フィブリン網を使用することをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項１５】
遠心分離が軸方向型である、請求項１の方法。
【請求項１６】
軸方向遠心分離に使用する装置であって、該装置が：
一次チャンバ；
凝固剤を含有する二次チャンバ；および
一次チャンバを二次チャンバから分離する媒体を含む、軸方向遠心分離に使用する装置。
【請求項１７】
一次チャンバが抗凝固剤を含有する、請求項１６の装置。
【請求項１８】
凝固剤が、マグネシウム、マンガン、亜鉛およびそれらの組み合わせのうち少なくとも１つを含む、請求項１６の装置。
【請求項１９】
凝固剤がカルシウムを含む、請求項１６の装置。
【請求項２０】
凝固剤が、塩化カルシウム、フッ化カルシウム、炭酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、フマル酸カルシウム、ピルビン酸カルシウム、有機カルシウム塩およびそれらの組み合わせのうち少なくとも１つを含む、請求項１９の装置。
【請求項２１】
媒体がフィルターを含み、該フィルターが、一次チャンバ内に吸引された血液に由来する赤血球および白血球細胞が約１０００ｘＧまたはそれ以上の遠心分離力の下で二次チャンバに入るのを実質的に阻止するが、該血液に由来する血漿および血小板が約１０００ｘＧまたはそれ以上の遠心分離力の下で二次チャンバに流れるのを実質的に許容する、請求項１６の装置。
【請求項２２】
媒体が分離媒体を含む、請求項１６の装置。
【請求項２３】
分離媒体が、遠心分離前の一次チャンバと二次チャンバとの間の流体的連通を実質的に阻止し、且つ、約１０００ｘＧまたはそれ以上での遠心分離の間は一次チャンバと二次チャンバとの間に流体的連通を提供するよう動く、請求項２２の装置。
【請求項２４】
分離媒体が、一次チャンバ内に吸引された血液に由来する赤血球および白血球細胞が二次チャンバに入ることを遠心分離の後実質的に阻止する、請求項２３の装置。
【請求項２５】
分離媒体が、シリコーンゲル、ポリエステルゲル、チキソトロピックゲルおよびそれらの組み合わせのうち少なくとも１つを含む、請求項２２の装置。
【請求項２６】
一次チャンバが、遠心分離の間、二次チャンバの上方にある、請求項１６の装置。
【請求項２７】
一次チャンバが第一の外周を有し、二次チャンバが第二の外周を有し、該第一の外周および第二の外周が、実質的に同一である、請求項１６の装置。
【請求項２８】
一次チャンバが第一の外周を有し、二次チャンバが第二の外周を有し、該第一の外周が第二の外周よりも小さい、請求項１６の装置。
【請求項２９】
一次チャンバおよび二次チャンバのうち少なくとも一方が治癒増進剤を含有する、請求項１６の装置。
【請求項３０】
治癒増進剤が、抗生物質、鎮痛剤、癌治癒剤、血小板成長因子、骨形成タンパク質、幹細胞、骨移植片材料、軟組織移植片、血小板由来成長因子細胞培養材料、免疫抑制剤およびそれらの組み合わせのうち少なくとも１つを含む、請求項２９の装置。
【請求項３１】
軸方向遠心分離に使用する装置であって、該装置が：
第一の外周を有する第一のチャンバ；および
第二の外周を有し、凝固剤を含有する第二のチャンバを含み、該第二の外周が第一の外周よりも大きい、軸方向遠心分離に使用する装置。
【請求項３２】
凝固剤が、マグネシウム、マンガン、亜鉛およびそれらの組み合わせのうち少なくとも１つを含む、請求項３１の装置。
【請求項３３】
凝固剤がカルシウムを含む、請求項３１の装置。
【請求項３４】
活性剤が、塩化カルシウム、フッ化カルシウム、炭酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、フマル酸カルシウム、ピルビン酸カルシウム、有機カルシウム塩およびそれらの組み合わせのうち少なくとも１つを含む、請求項３３の装置。
【請求項３５】
第一のチャンバが、上側部分と下側部分とを含む、請求項３１の装置。
【請求項３６】
上側部分と下側部分が、それらの間の流体的連通を実質的に阻止する媒体により分離する、請求項３５の装置。
【請求項３７】
約１０００ｘＧまたはそれ以上で遠心分離するとき、上側部分と下側部分との間の流体的連通が提供される、請求項３６の装置。
【請求項３８】
第一のチャンバの下側部分が、第二のチャンバと流体的に連通している、請求項３７の装置。
【請求項３９】
治癒剤をさらに含む、請求項３１の装置。
【請求項４０】
第一のチャンバが抗凝固剤を含有する、請求項３１の装置。
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図１５】
【図１６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３７】
【図３９】
【図４１】
【図４２】
【図４４】
【図４５】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図１】
【図５】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図３６】
【図３８】
【図４０】
【図４３】
【図４６】
【図５０】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５４−１】
【図５４−２】
【図５４−３】
【図５５】
【図５６】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図１５】
【図１６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３７】
【図３９】
【図４１】
【図４２】
【図４４】
【図４５】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図１】
【図５】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図３６】
【図３８】
【図４０】
【図４３】
【図４６】
【図５０】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５４−１】
【図５４−２】
【図５４−３】
【図５５】
【図５６】
【公開番号】特開２０１２−６９３７（Ｐ２０１２−６９３７Ａ）
【公開日】平成２４年１月１２日（２０１２．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１６１３８１（Ｐ２０１１−１６１３８１）
【出願日】平成２３年７月２２日（２０１１．７．２２）
【分割の表示】特願２００４−５５７０９９（Ｐ２００４−５５７０９９）の分割
【原出願日】平成１５年６月２６日（２００３．６．２６）
【出願人】（５０４２７２４６４）
【出願人】（５０４２７２１９８）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月１２日（２０１２．１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月２２日（２０１１．７．２２）
【分割の表示】特願２００４−５５７０９９（Ｐ２００４−５５７０９９）の分割
【原出願日】平成１５年６月２６日（２００３．６．２６）
【出願人】（５０４２７２４６４）
【出願人】（５０４２７２１９８）
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]