液滴分光システムと分光法
【課題】計測の微量化とキュベット化のニーズに応えるため、また、微量化に伴う問題点を解決するために極微量な分光システムと分光法を提案すること。
【解決手段】疎水性の基板上に液滴を生成し、この液滴の移動をガイドする親水性のラインを設けて、ライン上を順次液滴を搬送する。親水性のラインと交差する形で検出システムを構成し、液滴が検出システムを横切るときに吸光度や蛍光強度を測定する。親水性のライン上の液滴に白色光あるいは励起光を照射し、透過してくる光を分光あるいは蛍光を検出する。
【解決手段】疎水性の基板上に液滴を生成し、この液滴の移動をガイドする親水性のラインを設けて、ライン上を順次液滴を搬送する。親水性のラインと交差する形で検出システムを構成し、液滴が検出システムを横切るときに吸光度や蛍光強度を測定する。親水性のライン上の液滴に白色光あるいは励起光を照射し、透過してくる光を分光あるいは蛍光を検出する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、撥水基板上に水を溶媒とする試料を極微量滴下すると、撥水基板上で液滴となる現象を利用し、極微量の液量での分光的溶質の測定とその装置システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
溶媒中に含まれる溶質の量を測定する方法に分光吸光光度計や蛍光光度計などの光計測を用いる方法がある。分光吸光光度計においては、溶媒に含まれる溶質が光を吸収する波長の光を照射し、その波長の光が溶質に吸収されて減少した量を吸光度として測定する。蛍光光度計においては、特定の波長の光を溶質に吸収させて溶質分子を励起状態にし、励起状態から基底状態に電子状態が変化するときに発する光の強度を検出する。いずれにせよ、一定の光路長のキュベットに試料用液を入れて測定を行う。光路長が変動すると光の吸収量が変化するので、吸光度測定や蛍光測定では一定の光路長を確保することが重要となる。分光吸光光度計を用いた溶液での吸光度測定では、一般的には１ｃｍの光路長を有するキュベットを用いる。
【０００３】
最近では、試料用液の微量化に対応するために、５μｌの微量試料用液での吸光度測定が可能な微量キュベットがすでに市販されている。微量キュベットでは、光路長を０．５ｍｍ程度の箔層にして用いるが、キュベットの洗浄がし難い、操作性が悪い、多検体の計測に時間がかかる等の問題がある。スループットをあげるために、フローセルを用いて、試料を連続的に投入して測定する方法もとられるが、キュベットの洗浄が不十分だと前の試料が次の試料に影響するキャリーオーバーが起きる。また、基本的にシリアルに試料を測定するので、スループットはさほどあがらない。
【０００４】
パラレル処理でスループットを上げる技術としては、マイクロプレートを用いる技術が確立している。これは９６ウェルや３８４ウェルの各ウェルをキュベットとして用いる。これらの各ウェルに試料用液を一定量入れて吸光度を測定するのでスループットの観点からは優れた技術である。
【０００５】
蛍光光度計においても状況は吸光度測定と同様である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
吸光度測定にせよ、蛍光強度測定にせよ、試料の微量化とハイスループット化に対応することが重要な課題である。近年の生化学分野では、反応の微量化が進み、ほとんどの酵素反応は数μｌから多くても数十μｌで反応が行われるようになってきた。生化学分野では、反応させたい試料の組み合わせが多岐にわたり、反応の微量化と、マルチ同時反応によるハイスループット化が主流である。
【０００７】
さらに、微量化が進むと試料の容積に対するキュベットの表面積の比が大きくなる点も問題である。キュベットの表面積が大きくなると、溶質が壁に吸着する現象が顕著になる場合が多々ある。また、溶液と壁での光の散乱が散乱光として測定に影響するケースもある。また、分光測定や蛍光測定は測定の前に別の容器で種々反応を行ったものを測定用のキュベットに移し変えて測定を行うのが一般的である。検体数が多くなると移し変えの操作だけでも大変である上に、移し変えの間違いなど人為的なミスが発生する恐れを排除できない点が、特に医療用の生体物質検査において問題となっている。ロボットを用いた自動化によって解決できる問題ではあるが、装置が大掛かりとなり、コストもかかる。
【０００８】
本発明は、計測の微量化とキュベット化のニーズに応えるため、また、上記のように微量化に伴う問題点を解決するために極微量な分光システムと分光法を提案する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、撥水基板上で水を主体とする溶媒がほぼ真円に近い液滴となる現象を利用する。疎水性の基板上に液滴を生成し、この液滴の移動をガイドする親水性のラインを設けて、ライン上を順次液滴を搬送する。親水性のラインと交差する形で検出システムを構成し、液滴が検出システムを横切るときに吸光度や蛍光強度を測定する。親水性のライン上の液滴に白色光あるいは励起光を照射し、透過してくる光を分光し吸光度を測定する、あるいは蛍光を検出する。吸光度測定や蛍光測定に必要となる光路長については、液滴の大きさを測定することにより光路長を導き出す。
すなわち、本発明は、下記のシステムおよび方法を提供する。
（１）溶質を含む液滴を基板上に形成させる手段、上記液滴を光線を横切って移動させる手段、上記光線の光源と上記液滴が光線を横切ることで得られる信号を検出する光検出器を有する吸光分光システム。
（２）溶質を含む液滴を基板上に形成させる手段、液滴に光線を集光させる手段、上記集光光線が液滴に入射し、液滴を通り抜ける光の強度を検出する光検出器を有する吸光分光システム。
（３）溶質を含む液滴を基板上に形成させる手段、上記液滴を光線を横切って移動させる手段、上記光線の光源と上記液滴が光線を横切ることで得られる信号を検出する光検出器を有する蛍光分光システム。
（４）撥水性面に液滴を保持する親水性のパターンを配した基板、該基板上に形成した液滴を上記親水性のパターン上で光線を横切って移動させる手段、上記光線の光源と上記液滴が光線を横切ることで得られる信号を検出する光検出器を有する吸光分光システムであって、上記親水性のパターン上で光線を横切って移動する液滴の大きさを測定する測定手段、測定した液滴の大きさをもとに光路長を演算する演算装置とを有する吸光分光システム。
（５）撥水性面に液滴を保持する親水性のパターンを配した基板、該基板上に形成した液滴を表面弾性波を用いて上記親水性のパターン上で光線を横切って移動させる手段、上記光線の光源と上記液滴が光線を横切ることで得られる信号を検出する光検出器を有する吸光分光システム、液滴の位置の時間変化から液滴の大きさを推定し光路長を演算する演算装置とを有する分光システム。
（６）表面弾性波を発生させる手段が、液滴搬送路に配した圧電基板と４硼酸リチウムあるいはタンタル酸リチウムあるいはニオブ酸リチウムのくし型電極であることを特徴とする上記（５）記載の分光システム。
（７）上記基板が、基板に接する温調板を備える上記（４）記載の吸光分光システム。
（８）撥水性面に液滴を保持する親水性のラインパターンを配した基板のライン上に液滴を配し、親水性のラインパターンに従い液滴を移動させ、上記液滴が移動時に光源から照射される光を横切ることで液滴の情報を含む信号を光検出器で検出し、上記信号から液滴の大きさを測定し、測定した液滴の大きさをもとに上記液滴を通る光の光路長を演算し、上記液滴の光吸収あるいは蛍光を測定する分光法。
（９）上記親水性のラインパターンが複数の親水性のラインが一つに合流するパターンを有するものであり、複数の親水性のラインに保持されたそれぞれの液滴をパターンの合流点で混合させる上記（５）記載の液滴の光吸収あるいは蛍光を測定する分光システム。
（１０）上記複数の親水性のラインが一つに合流するパターンを有するとともに、更なる合流点が合流点の下流側にあり、複数の親水性のラインに保持されたそれぞれの液滴の合流点での混合を時系列的に複数回行えるパターンを有する上記（６）記載の液滴の光吸収あるいは蛍光を測定する分光法。
【発明の効果】
【００１０】
近代生化学で必須となっているサブマイクロリットルオーダーでのハイスループットな吸光度計測や蛍光強度計測が可能となる。試料の液量が極微量なので貴重な試料の使用量を少なくできる。さらに、チップを使い捨てとし、液滴を親水性ラインに沿ってころがすことができ、ラインの終点に回収用のエリアを設けておくことで、貴重な試料用液を回収することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（実施例１）
タンパク質の濃度測定を行うことを例に説明する。ここでは一般的なタンパク質吸収帯である２８０ｎｍの波長でのタンパク質定量を試みる。タンパク質としてはニワトリ卵白リゾチームで分子吸光係数はＥ１％２８０＝２６．６である。濃度はあらかじめ、０．０５ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌに調製した希釈列として用いる。
【００１２】
図１（Ａ）は、実施例１に好適な測定基板１００の平面図と、この測定基板を基礎として構成される計測システムの概念図、（Ｂ）は測定基板１００の平面図のＡ−Ａ位置で矢印方向に見たときの測定基板１００の断面図である。１はシリコン基板であり、例えば、その厚さは１ｍｍ、大きさは４０ｍｍ×４０ｍｍである。シリコン基板１の表面は疎水性領域２とされ、そのなかに、親水性ライン４が設けられる。親水性ライン４の長さは、例えば、２０ｍｍ、幅は０．１ｍｍである。親水性ライン４の終点には液溜３が形成されている。５は位置決め用のマーカーであり、シリコン基板１の一面に形成される。後述するように、親水性ライン４の左端に液滴が形成されて、この液滴は、所定の速度で親水性ライン４上を液溜３まで移動させられる。図面のサイズは説明のためデフォルメされている。
【００１３】
親水性ライン４のほぼ中央位置に、親水性ライン４と交差する形で計測システム５０が設けられる。計測システム５０は、紫外域から可視域まで発光する広域光源１０、該広域光源１０の白色光を導いて親水性ライン４上を移動する液滴の近傍で測定基板１００の面と平行に前記白色光を液滴に照射する光ファイバー１１、親水性ライン４を挟んで光ファイバー１１と対向して設けられ前記液滴を透過した白色光を受ける光ファイバー１２、および、光ファイバー１２で導かれる液滴を透過した白色光を入力とする検出器１３から構成される。ここで、親水性ライン４を挟んで対向して配置される光ファイバー１１と１２の先端は、親水性ライン４上を移動する液滴と接触しないように配置されるのは言うまでもない。検出器１３は、分光器１４とＣＣＤラインセンサー１５とから構成される。
【００１４】
計測システム５０の左側に、親水性ライン４と交差する形で測定基板１００の面と平行にレーザービーム２０が照射される。２１はレーザー源、２２，２３はレーザービーム２０の反射ミラー、２４はレーザービーム２０の検出器である。このレーザービーム２０は親水性ライン４上を移動する液滴径の測定用である。したがって、レーザービーム２０の照射は計測システム５０の右側で行われても良い。
【００１５】
図１（Ｂ）において、断面位置が親水性ライン４の位置であるため、基板１の中央部の全部が親水性領域となっている。この親水性ライン４の右端部に液溜３が設けられている。
【００１６】
親水性ライン４（親水性領域）と疎水性領域の作成方法は、例えば、疎水性のシリコン基板１の上面を酸化して、一旦、全領域を親水性のＳｉＯ２薄膜とする。その後、疎水性とすべき領域のＳｉＯ２薄膜をフッ酸で溶解除去して疎水性領域を作成すれば良い。あるいは、基板１の材質が表面があらかじめＳiＯ2薄膜形成してある親水性表面の場合、フッ素系樹脂，シリコン系樹脂等の疎水性材料を、その上に配置することで、疎水性領域を形成すれば良い。この場合は、疎水性領域中に存在する親水性領域が、疎水性材料の厚さだけ低くなったものとなる。図１の例は後者方法によって疎水性領域３、親水性ライン４を形成した例である。
【００１７】
実施例１では、予め、親水性ライン４の左端に、測定対象となる液の液滴を形成しておき、親水性ライン４上を所定の速度で右側に移動させ、その過程で液滴の大きさを測定し、液滴の分析を行う。
【００１８】
図２は、本発明の実施に好適な測定基板１００の親水性ライン４の左端に液滴を構成し、これを計測するシステム構成の例を説明する概念図である。
【００１９】
まず、測定基板１００の親水性ライン４の左端に測定対象となる液の液滴３６を形成する操作について以下説明する。システムが起動されると、使用者は、図１（Ａ）で説明したマーカー５に着目して、測定基板１００が所定の起動位置にあるように、パソコン２６に操作信号２８を与え、駆動装置２７によりステージ１９を操作して位置決めする。ステージ１９は信号に応じてＸＹ方向に駆動されるものである。次に、測定対象となる液の液滴３６の載置位置（親水性ライン４の左端）が、ピペット３３の先端部に対応する位置になるように、パソコン２６に操作信号２８を与え、駆動装置２７によりステージ１９を操作して位置決めする。この際、必要なら、ピペット３３の先端部を光学系でモニターしながら、位置信号をパソコン２６にフィードバックして精度よく合わせることができる。なお、ピペット３３には、あらかじめ、測定対象となる液を吸引しておく。
【００２０】
測定基板１００が所定の位置まで来る、すなわち、親水性ライン４の左端とピペット３３の先端部が対応する位置になると、これを検出し、あるいは、操作者の指示で、パソコン２６から駆動装置３２に測定対象となる液３４を排出する信号を送り、シリンジポンプ３１を駆動して、ピペット３３内の測定対象となる液を排出し、ピペット３３の先端に液滴３６を形成する。ピペット３３の先端に形成される液滴３６の大きさは、測定対象となる液の密度、比重およびピペット３３の先端のサイズ等によって定まり、ある大きさになれば自ずと親水性ライン４の左端に落下するので、シリンジポンプ３１の停止はパソコンにプログラムをしておくだけで、必ずしも制御する必要は無い。
【００２１】
制御する方がよければ、ピペット３３の先端部に形成された液滴３６を光学系によってモニターし、これの与える信号に応じて、駆動装置３２を制御し、所定の大きさとなったところで、これを検出し、あるいは、操作者の指示で、シリンジポンプ３１を停止し、ピペット３３を押し下げる操作（図示しないが、このために、後述するロッド４１の制御のための駆動装置３７と同様な駆動装置が必要である）をして、ピペット３３の先端部に形成された液滴３６を測定基板１００の親水性ライン４の左端に接触させ、親水性ライン４上に移せばよい。なお、ピペット３３の根元部とチューブ３０との接続部が離れたように図示されているのは、ピペット３３を拡大して表示するためである。
【００２２】
次に、測定基板１００の親水性ライン４の左端に載置された測定対象となる液の液滴３５の計測について説明する。ここでは、タンパク質を含む１μｌの溶液（溶媒：１５０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸緩衝液）を測定対象となる液とする。次に、直径が０．１ｍｍで先端が親水性のガラス、側面が疎水性のポリイミドでできたロッド４１を液滴３５の上部に接触させる。ここで、ロッド４１は、ロッド４１を上下動させるとともに、親水性ライン４上を水平に移動させる駆動装置３７に連係するものとする。ロッド４１を親水性ライン４の左端に位置させ、使用者により、パソコン２６にロッド４１を下げる信号が与えられると、動駆動装置３７により、ロッド４１は下に動く。ロッド４１の先端が液滴３５に接触した段階で動駆動装置３７を停止させ、次いで、ロッド４１を親水性ライン４上を所定の速度で水平に右側に移動させる。したがって、測定基板１００の親水性ライン４上の液滴３５は親水性ライン４上を、これに沿って、所定の速度で水平に右側に移動し、液溜３に落ちる。
【００２３】
液滴３５は親水性ライン４上を所定の速度で水平に右側に移動する過程で、レーザービーム２０を通過し、液滴３５の直径が計測される。例えば、ロッド４１を２ｍｍ／秒の速度で移動させると、液滴３５はロッド４１の先端にまとわりついて、同じ速度で移動する。すなわち、液滴３５もロッド４１の移動速度で２ｍｍ／秒で移動する。液滴３５がレーザービーム２０を横切ると、液滴３５の界面で光が屈折し、検出器２４に到達する光量が変化する。液滴３５がレーザービーム２０を通り過ぎると、検出器２４に到達する光量は元の光量に戻る。レーザービームを横切る時間が１．２２秒であれば、液滴３５の直径はレーザービームを横切る位置で０．６１（＝１．２２／２）ｍｍと計算される。この場合、レーザービーム２０の測定基板１００からの高さは液滴３５の直径の半分であることが前提である。従って、液滴３５の直径が大きく変わるときは、レーザービーム２０の測定基板１００からの高さも、これに合わせて調整する必要がある。
【００２４】
液滴３５は、次に、検出器系の光ファイバー１１と１２が対向している位置を通過する。この場合、光ファイバー１１と１２の測定基板１００からの高さも、レーザービーム２０の測定基板１００からの高さと等しく設定されるので、測定対象となる液の光路長も０．６１ｍｍとなる。検出器系の光ファイバー１１と１２の間を通り抜けたときの最大吸光度を測定し、光路長が１ｃｍのときの値に換算する。
【００２５】
図３は、実施例１による測定吸光度をプロットしたときの特性図である。図に示すような直線部分２１と非直線部分２２とからなる特性が得られる。非直線部分２２はリゾチーム濃度が高すぎるために一般的におきる現象である。この計測結果を、既知のタンパク質濃度に対する公知の値と比較すると、良く一致する。
【００２６】
液溜３に落ちた液滴３５は、実施例１の計測では、レーザービーム２０が透過し、検出器系の光ファイバー１１から照射される白色光が透過しているにすぎず、化学的な変化を伴う操作を受けていない。したがって、液溜３に落ちた液滴３５を吸引して、他の計測に使用することができる。
【００２７】
さらに、実施例１の計測では、計測により汚染されるのは、測定基板１００の親水性ライン４のみである。従って、親水性ライン４の左端に、新しい試料の液滴を滴下させて、計測を繰り返しても、新しい試料の液滴が、先の計測の試料により汚染されることは無いから、希釈列すべての試料を測定基板１００の親水性ライン４上に順次滴下し、測定を行うことができ、スループットをあげることができる。
【００２８】
本発明による計測は、瞬時にスペクトルを測定することができるものであるとともに、当てる光は経時的に波長成分の強度に変動が無いものであれば良く、オープンスペースでの測定も可能である。もちろん、単一波長に分光した光を液滴に照射し、吸光度を測定する従来の分光光学系を採用しても良い。この場合はオープンスペースでの使用ができず、暗箱中での測定となる。
【００２９】
さらに、実質的にキュベットを用いないため、液滴と空気にしか光が当たらない。このため、キュベットが光を吸収するような波長でも分光測定ができるメリットがある。たとえば、２１０ｎｍの光吸収でタンパク質の量を測定しようとすると、通常のガラスキュベットやプラスチックキュベットは使用できない。高価な溶融石英でできたキュベットを使用すれば良いが、本発明を用いることで高価な溶融石英キュベットを排除できる。
【００３０】
（実施例２）
実施例２は蛍光測定を行う例である。測定の前に測定対象となる液に試薬を混合し、反応を行う前処理を含む例である。
【００３１】
図４（Ａ）は、実施例２に好適な測定基板２００の平面図と、この測定基板を基礎として構成される計測システムの概念図、（Ｂ）は測定基板２００の平面図のＡ−Ａ位置で矢印方向に見たときの測定基板１００の断面図である。図面のサイズは説明のためデフォルメされている。
【００３２】
測定基板２００は、実施例１の測定基板１００と同様、１はシリコン基板であり、例えば、その厚さは１ｍｍ、大きさは４０ｍｍ×４０ｍｍである。シリコン基板１の表面は疎水性領域２とされ、そのなかに、液滴の保持のための親水性領域５２−５４と親水性ライン５６−５９が設けられる。親水性ライン５９の末端（右端）には液溜３が形成されている。親水性領域５２−５５の大きさは、この領域に保持する液滴の大きさによって決定されるが、例えば、４００μｍ×４００μｍ程度である。親水性ライン５６−５９の幅は０．１ｍｍ程度である。５は位置決め用のマーカーであり、シリコン基板１の一面に形成される。８は温調板であり、シリコン基板１の裏面に設けられる。図面のサイズは説明のためデフォルメされている。
【００３３】
親水性ライン５９と交差する形で計測システム５１が設けられる。計測システム５１は、蛍光励起用レーザー源２１’、該レーザー源２１’のレーザービームを導いて親水性ライン５９上を移動する液滴の近傍で測定基板１００の面と平行に前記レーザービームを液滴に照射する光ファイバー１１、親水性ライン５９を挟んで光ファイバー１１と対向して設けられ前記液滴の発する蛍光を受ける光ファイバー１２、および、光ファイバー１２で導かれる液滴の発する蛍光を入力とする検出器１３’から構成される。光ファイバー１２は、液滴に照射されるレーザービームの液滴表面の反射光が入らないように、光ファイバー１１と１２０度の角度をなすように設置されている。ここでも、光ファイバー１１と対向して設けられる光ファイバー１２とは、その先端が、親水性ライン５９上を移動する液滴に接触しないだけの距離を置いて設けられる。
【００３４】
実施例１で、図２を参照して説明したと同様に、親水性領域５２−５４に液滴が形成される。親水性領域５４にはｍＲＮＡより逆転写した１本鎖ｃＤＮＡ混合物を含む液滴を、親水性領域５３には特定ｃＤＮＡにハイブリダイズする６０塩基のプローブ溶液からなる液滴を、親水性領域５２には２本鎖に特異的にインターカレートするサイバーグリーンＩ溶液からなる液滴を、それぞれ、形成する。それぞれの液滴は、０．５μｌである。ここではモデル系として、ｃＤＮＡ０．２ｐｍｏｌ／μｌに対し、５ｐｍｏｌ／μｌの相補プローブと比相補プローブで検討する。溶媒は、５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）である。
【００３５】
まず親水性領域５４に形成した液滴と親水性領域５３に形成した液滴とを、実施例１と同様な方法で親水性領域５５に移動させ、ここで混合する。混合は液滴の搬送に使用したロッド４１を軸方向に回転させて行うことができる。もちろん、親水性領域５５が形成されている位置のシリコン基板１の背面に、ピエゾ素子を設けておき、これによる超音波を親水性領域５５に置かれた液滴に作用させて比接触で攪拌してもよい。３０秒間の攪拌の後、親水性領域５２に形成した液滴を親水性領域５５で攪拌された液滴に加え、再度攪拌する。３０秒間の攪拌の後、親水性領域５５で攪拌された３液滴からなる液滴を、親水性ライン５９上を、所定の速度、例えば、２ｍｍ／秒の速度で移動させる。親水性ライン５９上を移動する液滴は、光ファイバー１１と対向して設けられる光ファイバー１２の先端の間を通過するとき、レーザー源２１’のレーザービームを受け蛍光を発する。このときの蛍光強度を光ファイバー１２を介して、検出器１３’で測定する。
【００３６】
試料用液中にプローブと相補的なｃＤＮＡが存在するとその量に応じた強度の蛍光が得られる。相補なｃＤＮＡが無いと、蛍光強度は１／２０の強度以下である。
【００３７】
実施例２では、実施例１よりも、液滴の大きさを厳密に管理した方が良いので、図２で説明した液滴の形成時に、図示しない光学系を利用してＣＣＤカメラで測定して、パソコン２６に入力し、所定の処理をして、シリンジポンプ３１の駆動装置３２を制御するのが良い。この光学系は、簡単に言えば、ピペット３３の先端部をモニターするものであれば良い。また、測定基板２００の背面に設けられた温調板８を制御して、測定基板２００の温度を４２℃から４６℃、雰囲気を４５℃で湿潤状態として操作を行うのが良い。液滴の移動や攪拌後の液滴サイズを、光学系のＣＣＤカメラでモニターしながら、液滴径に変化がある場合は、温調板８にフィードバック制御をかけ、液滴径が１０％以上変動しないようにコントロールするのが良い。
実施例２では、親水性領域５４に形成した液滴と親水性領域５３に形成した液滴とを、実施例１と同様な方法で親水性領域５５に移動させ、ここで混合することにより反応前処理を実行し、次いで、この混合液滴に、親水性領域５２に形成した液滴を反応させることで、処理を一体化することができるので、上記人為的なミスを防ぐことができる。なお、この処理を、一つの測定基板２００上で行わせるので、コンタミを防ぐために、反応後、直ちに測定する一回使用使いきりのチップとするのが良い。
【００３８】
色々な反応と組み合わせて反応生成物を検出する目的に利用でき、試料反応と検出を一体としたシステムオンチップとすることで解決できる。反応前駆体をいくつかの液滴に分けておき、親水性のライン上を各液滴を所定の順序で衝突合体させて反応を行う。反応時間は、たとえば、親水性ライン上にライン幅の２〜４倍程の径の親水性領域を設けてそこに液滴が滞在するようにしても良いし、わずかにへこみのある部位をもうけ、そこに所定の時間だけ液滴を滞在させることで解決できる。
【００３９】
（その他の実施例）
本発明は、上述の実施例の構成に限らず、種々の形で実施できる。
【００４０】
例えば、図２を参照して説明したロッド４１による液滴の移動は、ガスの噴射に置き換えることができる。例えば、親水性ライン４の延長線上にガス噴射ノズルを配置し、ガス噴射ノズルには、ガス圧力タンクに接続されたチューブと、バルブを設け、バルブ開閉により、ガス噴射ノズルによる噴射ガスで液滴３５の移動を制御しても良い。液滴のサイズ、質量を考慮したガス噴射とすれば、液滴３５は、親水性ライン４にガイドされて所定の速度で親水性ライン４上を移動し、液溜３に落ちる。実施例２でも、親水性領域５５から液溜３への移動は同様にすることができる。このようにガス噴射とするときは、測定基板２００の上面を移動する構造物が減るので、装置の構成が簡単になる。
【００４１】
液滴の移動に表面弾性波を用いることができる。図５は、親水性ライン４の左端に液滴を構成し、これを表面弾性波を用いて移動させて計測するシステム構成の例を説明する概念図である。基板１の液滴が移動する疎水性ライン４の下に圧電素子２０５とくし型電極２０６からなる表面弾性波発生器を配する。くし型電極としては、４硼酸リチウムあるいはタンタル酸リチウムあるいはニオブ酸リチウムなどのリチウム化合物を用いることができる。これら圧電素子２０５と電極２０６の表面は疎水性コーティングがなされ、液滴搬送方向に親水性のライン４が設置されているのは上記実施例１で説明したとおりである。くし型電極２０６の対向電極間に電圧をかけることにより位相のそろった表面弾性波を親水性ライン４にそって発生させることができる。液滴２０２は表面弾性波に乗り移動する。ここでくし型デバイスは液滴を作成する親水性ライン４の上流部に設置する。圧電基板部は基板１の親水性ライン全体に設置していてもよいし、図５のように液滴２０２を滴下する部位近傍のみに設置してもよい。くし型電極間に電圧をかけることにより表面弾性波が発生し液滴が矢印２０４方向に打ち出され移動する。
【００４２】
一般に従来吸光度測定に使用した試料はそのまま破棄される。このため測定に使用する液量が多いと試料が無駄になる。
【００４３】
例えば、図１で説明した、親水性ライン４と液溜３の系統を複数個並列に設け、それぞれの親水性ライン４の左端に測定したい試料の溶液を液滴にして配置し、これをガス噴射により、順次検出部に転がして測定を行うことでハイスループット化を達成できる。この場合、ガス噴射系は一つとし、ステージ１９を移動させることが現実的である。
【００４４】
液滴を移動させる力としては、その他、微小磁石を液滴に一個入れ、微小磁石を基板の裏から磁場で動かすことで液滴を動かすことができる。この場合、微小磁石は親水性とし、液滴がまとわりつくようにする。微小磁石は液滴径の半分以下の大きさとすることで後の吸光度測定を妨害しないようにすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】（Ａ）は、実施例１に好適な測定基板１００の平面図と、この測定基板を基礎として構成される計測システムの概念図、（Ｂ）は測定基板１００の平面図のＡ−Ａ位置で矢印方向に見たときの測定基板１００の断面図である。
【図２】本発明の実施に好適な測定基板１００の親水性ライン４の左端に液滴を構成し、これを計測するシステム構成の例を説明する概念図である。
【図３】実施例１による測定吸光度をプロットしたときの特性図である。
【図４】（Ａ）は、実施例２に好適な測定基板２００の平面図と、この測定基板を基礎として構成される計測システムの概念図、（Ｂ）は測定基板２００の平面図のＡ−Ａ位置で矢印方向に見たときの測定基板１００の断面図である。
【図５】親水性ライン４の左端に液滴を構成し、これを表面弾性波を用いて移動させて計測するシステム構成の例を説明する概念図である。
【符号の説明】
【００４６】
１…シリコン基板、２…疎水性領域、３…液溜、４…親水性ライン、５…位置決め用のマーカー、８…温調板、１０…広域光源、１０’…レーザー源、１１，１２…光ファイバー、１３，１３’…検出器、１４…分光器、１５…ＣＣＤラインセンサー、２０…レーザービーム、２１…レーザー源、２２，２３…反射ミラー、２６…パソコン、２７，３２，３７…駆動装置、２８…操作信号、３３…ピペット、３４…測定対象となる液、３１…シリンジポンプ、３５，３６，２０２…液滴、５２−５５…親水性領域、５６−５９…親水性ライン、５０，５１…計測システム、１００，２００…測定基板、２０５…圧電素子、２０６…くし型電極。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、撥水基板上に水を溶媒とする試料を極微量滴下すると、撥水基板上で液滴となる現象を利用し、極微量の液量での分光的溶質の測定とその装置システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
溶媒中に含まれる溶質の量を測定する方法に分光吸光光度計や蛍光光度計などの光計測を用いる方法がある。分光吸光光度計においては、溶媒に含まれる溶質が光を吸収する波長の光を照射し、その波長の光が溶質に吸収されて減少した量を吸光度として測定する。蛍光光度計においては、特定の波長の光を溶質に吸収させて溶質分子を励起状態にし、励起状態から基底状態に電子状態が変化するときに発する光の強度を検出する。いずれにせよ、一定の光路長のキュベットに試料用液を入れて測定を行う。光路長が変動すると光の吸収量が変化するので、吸光度測定や蛍光測定では一定の光路長を確保することが重要となる。分光吸光光度計を用いた溶液での吸光度測定では、一般的には１ｃｍの光路長を有するキュベットを用いる。
【０００３】
最近では、試料用液の微量化に対応するために、５μｌの微量試料用液での吸光度測定が可能な微量キュベットがすでに市販されている。微量キュベットでは、光路長を０．５ｍｍ程度の箔層にして用いるが、キュベットの洗浄がし難い、操作性が悪い、多検体の計測に時間がかかる等の問題がある。スループットをあげるために、フローセルを用いて、試料を連続的に投入して測定する方法もとられるが、キュベットの洗浄が不十分だと前の試料が次の試料に影響するキャリーオーバーが起きる。また、基本的にシリアルに試料を測定するので、スループットはさほどあがらない。
【０００４】
パラレル処理でスループットを上げる技術としては、マイクロプレートを用いる技術が確立している。これは９６ウェルや３８４ウェルの各ウェルをキュベットとして用いる。これらの各ウェルに試料用液を一定量入れて吸光度を測定するのでスループットの観点からは優れた技術である。
【０００５】
蛍光光度計においても状況は吸光度測定と同様である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
吸光度測定にせよ、蛍光強度測定にせよ、試料の微量化とハイスループット化に対応することが重要な課題である。近年の生化学分野では、反応の微量化が進み、ほとんどの酵素反応は数μｌから多くても数十μｌで反応が行われるようになってきた。生化学分野では、反応させたい試料の組み合わせが多岐にわたり、反応の微量化と、マルチ同時反応によるハイスループット化が主流である。
【０００７】
さらに、微量化が進むと試料の容積に対するキュベットの表面積の比が大きくなる点も問題である。キュベットの表面積が大きくなると、溶質が壁に吸着する現象が顕著になる場合が多々ある。また、溶液と壁での光の散乱が散乱光として測定に影響するケースもある。また、分光測定や蛍光測定は測定の前に別の容器で種々反応を行ったものを測定用のキュベットに移し変えて測定を行うのが一般的である。検体数が多くなると移し変えの操作だけでも大変である上に、移し変えの間違いなど人為的なミスが発生する恐れを排除できない点が、特に医療用の生体物質検査において問題となっている。ロボットを用いた自動化によって解決できる問題ではあるが、装置が大掛かりとなり、コストもかかる。
【０００８】
本発明は、計測の微量化とキュベット化のニーズに応えるため、また、上記のように微量化に伴う問題点を解決するために極微量な分光システムと分光法を提案する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、撥水基板上で水を主体とする溶媒がほぼ真円に近い液滴となる現象を利用する。疎水性の基板上に液滴を生成し、この液滴の移動をガイドする親水性のラインを設けて、ライン上を順次液滴を搬送する。親水性のラインと交差する形で検出システムを構成し、液滴が検出システムを横切るときに吸光度や蛍光強度を測定する。親水性のライン上の液滴に白色光あるいは励起光を照射し、透過してくる光を分光し吸光度を測定する、あるいは蛍光を検出する。吸光度測定や蛍光測定に必要となる光路長については、液滴の大きさを測定することにより光路長を導き出す。
すなわち、本発明は、下記のシステムおよび方法を提供する。
（１）溶質を含む液滴を基板上に形成させる手段、上記液滴を光線を横切って移動させる手段、上記光線の光源と上記液滴が光線を横切ることで得られる信号を検出する光検出器を有する吸光分光システム。
（２）溶質を含む液滴を基板上に形成させる手段、液滴に光線を集光させる手段、上記集光光線が液滴に入射し、液滴を通り抜ける光の強度を検出する光検出器を有する吸光分光システム。
（３）溶質を含む液滴を基板上に形成させる手段、上記液滴を光線を横切って移動させる手段、上記光線の光源と上記液滴が光線を横切ることで得られる信号を検出する光検出器を有する蛍光分光システム。
（４）撥水性面に液滴を保持する親水性のパターンを配した基板、該基板上に形成した液滴を上記親水性のパターン上で光線を横切って移動させる手段、上記光線の光源と上記液滴が光線を横切ることで得られる信号を検出する光検出器を有する吸光分光システムであって、上記親水性のパターン上で光線を横切って移動する液滴の大きさを測定する測定手段、測定した液滴の大きさをもとに光路長を演算する演算装置とを有する吸光分光システム。
（５）撥水性面に液滴を保持する親水性のパターンを配した基板、該基板上に形成した液滴を表面弾性波を用いて上記親水性のパターン上で光線を横切って移動させる手段、上記光線の光源と上記液滴が光線を横切ることで得られる信号を検出する光検出器を有する吸光分光システム、液滴の位置の時間変化から液滴の大きさを推定し光路長を演算する演算装置とを有する分光システム。
（６）表面弾性波を発生させる手段が、液滴搬送路に配した圧電基板と４硼酸リチウムあるいはタンタル酸リチウムあるいはニオブ酸リチウムのくし型電極であることを特徴とする上記（５）記載の分光システム。
（７）上記基板が、基板に接する温調板を備える上記（４）記載の吸光分光システム。
（８）撥水性面に液滴を保持する親水性のラインパターンを配した基板のライン上に液滴を配し、親水性のラインパターンに従い液滴を移動させ、上記液滴が移動時に光源から照射される光を横切ることで液滴の情報を含む信号を光検出器で検出し、上記信号から液滴の大きさを測定し、測定した液滴の大きさをもとに上記液滴を通る光の光路長を演算し、上記液滴の光吸収あるいは蛍光を測定する分光法。
（９）上記親水性のラインパターンが複数の親水性のラインが一つに合流するパターンを有するものであり、複数の親水性のラインに保持されたそれぞれの液滴をパターンの合流点で混合させる上記（５）記載の液滴の光吸収あるいは蛍光を測定する分光システム。
（１０）上記複数の親水性のラインが一つに合流するパターンを有するとともに、更なる合流点が合流点の下流側にあり、複数の親水性のラインに保持されたそれぞれの液滴の合流点での混合を時系列的に複数回行えるパターンを有する上記（６）記載の液滴の光吸収あるいは蛍光を測定する分光法。
【発明の効果】
【００１０】
近代生化学で必須となっているサブマイクロリットルオーダーでのハイスループットな吸光度計測や蛍光強度計測が可能となる。試料の液量が極微量なので貴重な試料の使用量を少なくできる。さらに、チップを使い捨てとし、液滴を親水性ラインに沿ってころがすことができ、ラインの終点に回収用のエリアを設けておくことで、貴重な試料用液を回収することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（実施例１）
タンパク質の濃度測定を行うことを例に説明する。ここでは一般的なタンパク質吸収帯である２８０ｎｍの波長でのタンパク質定量を試みる。タンパク質としてはニワトリ卵白リゾチームで分子吸光係数はＥ１％２８０＝２６．６である。濃度はあらかじめ、０．０５ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌに調製した希釈列として用いる。
【００１２】
図１（Ａ）は、実施例１に好適な測定基板１００の平面図と、この測定基板を基礎として構成される計測システムの概念図、（Ｂ）は測定基板１００の平面図のＡ−Ａ位置で矢印方向に見たときの測定基板１００の断面図である。１はシリコン基板であり、例えば、その厚さは１ｍｍ、大きさは４０ｍｍ×４０ｍｍである。シリコン基板１の表面は疎水性領域２とされ、そのなかに、親水性ライン４が設けられる。親水性ライン４の長さは、例えば、２０ｍｍ、幅は０．１ｍｍである。親水性ライン４の終点には液溜３が形成されている。５は位置決め用のマーカーであり、シリコン基板１の一面に形成される。後述するように、親水性ライン４の左端に液滴が形成されて、この液滴は、所定の速度で親水性ライン４上を液溜３まで移動させられる。図面のサイズは説明のためデフォルメされている。
【００１３】
親水性ライン４のほぼ中央位置に、親水性ライン４と交差する形で計測システム５０が設けられる。計測システム５０は、紫外域から可視域まで発光する広域光源１０、該広域光源１０の白色光を導いて親水性ライン４上を移動する液滴の近傍で測定基板１００の面と平行に前記白色光を液滴に照射する光ファイバー１１、親水性ライン４を挟んで光ファイバー１１と対向して設けられ前記液滴を透過した白色光を受ける光ファイバー１２、および、光ファイバー１２で導かれる液滴を透過した白色光を入力とする検出器１３から構成される。ここで、親水性ライン４を挟んで対向して配置される光ファイバー１１と１２の先端は、親水性ライン４上を移動する液滴と接触しないように配置されるのは言うまでもない。検出器１３は、分光器１４とＣＣＤラインセンサー１５とから構成される。
【００１４】
計測システム５０の左側に、親水性ライン４と交差する形で測定基板１００の面と平行にレーザービーム２０が照射される。２１はレーザー源、２２，２３はレーザービーム２０の反射ミラー、２４はレーザービーム２０の検出器である。このレーザービーム２０は親水性ライン４上を移動する液滴径の測定用である。したがって、レーザービーム２０の照射は計測システム５０の右側で行われても良い。
【００１５】
図１（Ｂ）において、断面位置が親水性ライン４の位置であるため、基板１の中央部の全部が親水性領域となっている。この親水性ライン４の右端部に液溜３が設けられている。
【００１６】
親水性ライン４（親水性領域）と疎水性領域の作成方法は、例えば、疎水性のシリコン基板１の上面を酸化して、一旦、全領域を親水性のＳｉＯ２薄膜とする。その後、疎水性とすべき領域のＳｉＯ２薄膜をフッ酸で溶解除去して疎水性領域を作成すれば良い。あるいは、基板１の材質が表面があらかじめＳiＯ2薄膜形成してある親水性表面の場合、フッ素系樹脂，シリコン系樹脂等の疎水性材料を、その上に配置することで、疎水性領域を形成すれば良い。この場合は、疎水性領域中に存在する親水性領域が、疎水性材料の厚さだけ低くなったものとなる。図１の例は後者方法によって疎水性領域３、親水性ライン４を形成した例である。
【００１７】
実施例１では、予め、親水性ライン４の左端に、測定対象となる液の液滴を形成しておき、親水性ライン４上を所定の速度で右側に移動させ、その過程で液滴の大きさを測定し、液滴の分析を行う。
【００１８】
図２は、本発明の実施に好適な測定基板１００の親水性ライン４の左端に液滴を構成し、これを計測するシステム構成の例を説明する概念図である。
【００１９】
まず、測定基板１００の親水性ライン４の左端に測定対象となる液の液滴３６を形成する操作について以下説明する。システムが起動されると、使用者は、図１（Ａ）で説明したマーカー５に着目して、測定基板１００が所定の起動位置にあるように、パソコン２６に操作信号２８を与え、駆動装置２７によりステージ１９を操作して位置決めする。ステージ１９は信号に応じてＸＹ方向に駆動されるものである。次に、測定対象となる液の液滴３６の載置位置（親水性ライン４の左端）が、ピペット３３の先端部に対応する位置になるように、パソコン２６に操作信号２８を与え、駆動装置２７によりステージ１９を操作して位置決めする。この際、必要なら、ピペット３３の先端部を光学系でモニターしながら、位置信号をパソコン２６にフィードバックして精度よく合わせることができる。なお、ピペット３３には、あらかじめ、測定対象となる液を吸引しておく。
【００２０】
測定基板１００が所定の位置まで来る、すなわち、親水性ライン４の左端とピペット３３の先端部が対応する位置になると、これを検出し、あるいは、操作者の指示で、パソコン２６から駆動装置３２に測定対象となる液３４を排出する信号を送り、シリンジポンプ３１を駆動して、ピペット３３内の測定対象となる液を排出し、ピペット３３の先端に液滴３６を形成する。ピペット３３の先端に形成される液滴３６の大きさは、測定対象となる液の密度、比重およびピペット３３の先端のサイズ等によって定まり、ある大きさになれば自ずと親水性ライン４の左端に落下するので、シリンジポンプ３１の停止はパソコンにプログラムをしておくだけで、必ずしも制御する必要は無い。
【００２１】
制御する方がよければ、ピペット３３の先端部に形成された液滴３６を光学系によってモニターし、これの与える信号に応じて、駆動装置３２を制御し、所定の大きさとなったところで、これを検出し、あるいは、操作者の指示で、シリンジポンプ３１を停止し、ピペット３３を押し下げる操作（図示しないが、このために、後述するロッド４１の制御のための駆動装置３７と同様な駆動装置が必要である）をして、ピペット３３の先端部に形成された液滴３６を測定基板１００の親水性ライン４の左端に接触させ、親水性ライン４上に移せばよい。なお、ピペット３３の根元部とチューブ３０との接続部が離れたように図示されているのは、ピペット３３を拡大して表示するためである。
【００２２】
次に、測定基板１００の親水性ライン４の左端に載置された測定対象となる液の液滴３５の計測について説明する。ここでは、タンパク質を含む１μｌの溶液（溶媒：１５０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸緩衝液）を測定対象となる液とする。次に、直径が０．１ｍｍで先端が親水性のガラス、側面が疎水性のポリイミドでできたロッド４１を液滴３５の上部に接触させる。ここで、ロッド４１は、ロッド４１を上下動させるとともに、親水性ライン４上を水平に移動させる駆動装置３７に連係するものとする。ロッド４１を親水性ライン４の左端に位置させ、使用者により、パソコン２６にロッド４１を下げる信号が与えられると、動駆動装置３７により、ロッド４１は下に動く。ロッド４１の先端が液滴３５に接触した段階で動駆動装置３７を停止させ、次いで、ロッド４１を親水性ライン４上を所定の速度で水平に右側に移動させる。したがって、測定基板１００の親水性ライン４上の液滴３５は親水性ライン４上を、これに沿って、所定の速度で水平に右側に移動し、液溜３に落ちる。
【００２３】
液滴３５は親水性ライン４上を所定の速度で水平に右側に移動する過程で、レーザービーム２０を通過し、液滴３５の直径が計測される。例えば、ロッド４１を２ｍｍ／秒の速度で移動させると、液滴３５はロッド４１の先端にまとわりついて、同じ速度で移動する。すなわち、液滴３５もロッド４１の移動速度で２ｍｍ／秒で移動する。液滴３５がレーザービーム２０を横切ると、液滴３５の界面で光が屈折し、検出器２４に到達する光量が変化する。液滴３５がレーザービーム２０を通り過ぎると、検出器２４に到達する光量は元の光量に戻る。レーザービームを横切る時間が１．２２秒であれば、液滴３５の直径はレーザービームを横切る位置で０．６１（＝１．２２／２）ｍｍと計算される。この場合、レーザービーム２０の測定基板１００からの高さは液滴３５の直径の半分であることが前提である。従って、液滴３５の直径が大きく変わるときは、レーザービーム２０の測定基板１００からの高さも、これに合わせて調整する必要がある。
【００２４】
液滴３５は、次に、検出器系の光ファイバー１１と１２が対向している位置を通過する。この場合、光ファイバー１１と１２の測定基板１００からの高さも、レーザービーム２０の測定基板１００からの高さと等しく設定されるので、測定対象となる液の光路長も０．６１ｍｍとなる。検出器系の光ファイバー１１と１２の間を通り抜けたときの最大吸光度を測定し、光路長が１ｃｍのときの値に換算する。
【００２５】
図３は、実施例１による測定吸光度をプロットしたときの特性図である。図に示すような直線部分２１と非直線部分２２とからなる特性が得られる。非直線部分２２はリゾチーム濃度が高すぎるために一般的におきる現象である。この計測結果を、既知のタンパク質濃度に対する公知の値と比較すると、良く一致する。
【００２６】
液溜３に落ちた液滴３５は、実施例１の計測では、レーザービーム２０が透過し、検出器系の光ファイバー１１から照射される白色光が透過しているにすぎず、化学的な変化を伴う操作を受けていない。したがって、液溜３に落ちた液滴３５を吸引して、他の計測に使用することができる。
【００２７】
さらに、実施例１の計測では、計測により汚染されるのは、測定基板１００の親水性ライン４のみである。従って、親水性ライン４の左端に、新しい試料の液滴を滴下させて、計測を繰り返しても、新しい試料の液滴が、先の計測の試料により汚染されることは無いから、希釈列すべての試料を測定基板１００の親水性ライン４上に順次滴下し、測定を行うことができ、スループットをあげることができる。
【００２８】
本発明による計測は、瞬時にスペクトルを測定することができるものであるとともに、当てる光は経時的に波長成分の強度に変動が無いものであれば良く、オープンスペースでの測定も可能である。もちろん、単一波長に分光した光を液滴に照射し、吸光度を測定する従来の分光光学系を採用しても良い。この場合はオープンスペースでの使用ができず、暗箱中での測定となる。
【００２９】
さらに、実質的にキュベットを用いないため、液滴と空気にしか光が当たらない。このため、キュベットが光を吸収するような波長でも分光測定ができるメリットがある。たとえば、２１０ｎｍの光吸収でタンパク質の量を測定しようとすると、通常のガラスキュベットやプラスチックキュベットは使用できない。高価な溶融石英でできたキュベットを使用すれば良いが、本発明を用いることで高価な溶融石英キュベットを排除できる。
【００３０】
（実施例２）
実施例２は蛍光測定を行う例である。測定の前に測定対象となる液に試薬を混合し、反応を行う前処理を含む例である。
【００３１】
図４（Ａ）は、実施例２に好適な測定基板２００の平面図と、この測定基板を基礎として構成される計測システムの概念図、（Ｂ）は測定基板２００の平面図のＡ−Ａ位置で矢印方向に見たときの測定基板１００の断面図である。図面のサイズは説明のためデフォルメされている。
【００３２】
測定基板２００は、実施例１の測定基板１００と同様、１はシリコン基板であり、例えば、その厚さは１ｍｍ、大きさは４０ｍｍ×４０ｍｍである。シリコン基板１の表面は疎水性領域２とされ、そのなかに、液滴の保持のための親水性領域５２−５４と親水性ライン５６−５９が設けられる。親水性ライン５９の末端（右端）には液溜３が形成されている。親水性領域５２−５５の大きさは、この領域に保持する液滴の大きさによって決定されるが、例えば、４００μｍ×４００μｍ程度である。親水性ライン５６−５９の幅は０．１ｍｍ程度である。５は位置決め用のマーカーであり、シリコン基板１の一面に形成される。８は温調板であり、シリコン基板１の裏面に設けられる。図面のサイズは説明のためデフォルメされている。
【００３３】
親水性ライン５９と交差する形で計測システム５１が設けられる。計測システム５１は、蛍光励起用レーザー源２１’、該レーザー源２１’のレーザービームを導いて親水性ライン５９上を移動する液滴の近傍で測定基板１００の面と平行に前記レーザービームを液滴に照射する光ファイバー１１、親水性ライン５９を挟んで光ファイバー１１と対向して設けられ前記液滴の発する蛍光を受ける光ファイバー１２、および、光ファイバー１２で導かれる液滴の発する蛍光を入力とする検出器１３’から構成される。光ファイバー１２は、液滴に照射されるレーザービームの液滴表面の反射光が入らないように、光ファイバー１１と１２０度の角度をなすように設置されている。ここでも、光ファイバー１１と対向して設けられる光ファイバー１２とは、その先端が、親水性ライン５９上を移動する液滴に接触しないだけの距離を置いて設けられる。
【００３４】
実施例１で、図２を参照して説明したと同様に、親水性領域５２−５４に液滴が形成される。親水性領域５４にはｍＲＮＡより逆転写した１本鎖ｃＤＮＡ混合物を含む液滴を、親水性領域５３には特定ｃＤＮＡにハイブリダイズする６０塩基のプローブ溶液からなる液滴を、親水性領域５２には２本鎖に特異的にインターカレートするサイバーグリーンＩ溶液からなる液滴を、それぞれ、形成する。それぞれの液滴は、０．５μｌである。ここではモデル系として、ｃＤＮＡ０．２ｐｍｏｌ／μｌに対し、５ｐｍｏｌ／μｌの相補プローブと比相補プローブで検討する。溶媒は、５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）である。
【００３５】
まず親水性領域５４に形成した液滴と親水性領域５３に形成した液滴とを、実施例１と同様な方法で親水性領域５５に移動させ、ここで混合する。混合は液滴の搬送に使用したロッド４１を軸方向に回転させて行うことができる。もちろん、親水性領域５５が形成されている位置のシリコン基板１の背面に、ピエゾ素子を設けておき、これによる超音波を親水性領域５５に置かれた液滴に作用させて比接触で攪拌してもよい。３０秒間の攪拌の後、親水性領域５２に形成した液滴を親水性領域５５で攪拌された液滴に加え、再度攪拌する。３０秒間の攪拌の後、親水性領域５５で攪拌された３液滴からなる液滴を、親水性ライン５９上を、所定の速度、例えば、２ｍｍ／秒の速度で移動させる。親水性ライン５９上を移動する液滴は、光ファイバー１１と対向して設けられる光ファイバー１２の先端の間を通過するとき、レーザー源２１’のレーザービームを受け蛍光を発する。このときの蛍光強度を光ファイバー１２を介して、検出器１３’で測定する。
【００３６】
試料用液中にプローブと相補的なｃＤＮＡが存在するとその量に応じた強度の蛍光が得られる。相補なｃＤＮＡが無いと、蛍光強度は１／２０の強度以下である。
【００３７】
実施例２では、実施例１よりも、液滴の大きさを厳密に管理した方が良いので、図２で説明した液滴の形成時に、図示しない光学系を利用してＣＣＤカメラで測定して、パソコン２６に入力し、所定の処理をして、シリンジポンプ３１の駆動装置３２を制御するのが良い。この光学系は、簡単に言えば、ピペット３３の先端部をモニターするものであれば良い。また、測定基板２００の背面に設けられた温調板８を制御して、測定基板２００の温度を４２℃から４６℃、雰囲気を４５℃で湿潤状態として操作を行うのが良い。液滴の移動や攪拌後の液滴サイズを、光学系のＣＣＤカメラでモニターしながら、液滴径に変化がある場合は、温調板８にフィードバック制御をかけ、液滴径が１０％以上変動しないようにコントロールするのが良い。
実施例２では、親水性領域５４に形成した液滴と親水性領域５３に形成した液滴とを、実施例１と同様な方法で親水性領域５５に移動させ、ここで混合することにより反応前処理を実行し、次いで、この混合液滴に、親水性領域５２に形成した液滴を反応させることで、処理を一体化することができるので、上記人為的なミスを防ぐことができる。なお、この処理を、一つの測定基板２００上で行わせるので、コンタミを防ぐために、反応後、直ちに測定する一回使用使いきりのチップとするのが良い。
【００３８】
色々な反応と組み合わせて反応生成物を検出する目的に利用でき、試料反応と検出を一体としたシステムオンチップとすることで解決できる。反応前駆体をいくつかの液滴に分けておき、親水性のライン上を各液滴を所定の順序で衝突合体させて反応を行う。反応時間は、たとえば、親水性ライン上にライン幅の２〜４倍程の径の親水性領域を設けてそこに液滴が滞在するようにしても良いし、わずかにへこみのある部位をもうけ、そこに所定の時間だけ液滴を滞在させることで解決できる。
【００３９】
（その他の実施例）
本発明は、上述の実施例の構成に限らず、種々の形で実施できる。
【００４０】
例えば、図２を参照して説明したロッド４１による液滴の移動は、ガスの噴射に置き換えることができる。例えば、親水性ライン４の延長線上にガス噴射ノズルを配置し、ガス噴射ノズルには、ガス圧力タンクに接続されたチューブと、バルブを設け、バルブ開閉により、ガス噴射ノズルによる噴射ガスで液滴３５の移動を制御しても良い。液滴のサイズ、質量を考慮したガス噴射とすれば、液滴３５は、親水性ライン４にガイドされて所定の速度で親水性ライン４上を移動し、液溜３に落ちる。実施例２でも、親水性領域５５から液溜３への移動は同様にすることができる。このようにガス噴射とするときは、測定基板２００の上面を移動する構造物が減るので、装置の構成が簡単になる。
【００４１】
液滴の移動に表面弾性波を用いることができる。図５は、親水性ライン４の左端に液滴を構成し、これを表面弾性波を用いて移動させて計測するシステム構成の例を説明する概念図である。基板１の液滴が移動する疎水性ライン４の下に圧電素子２０５とくし型電極２０６からなる表面弾性波発生器を配する。くし型電極としては、４硼酸リチウムあるいはタンタル酸リチウムあるいはニオブ酸リチウムなどのリチウム化合物を用いることができる。これら圧電素子２０５と電極２０６の表面は疎水性コーティングがなされ、液滴搬送方向に親水性のライン４が設置されているのは上記実施例１で説明したとおりである。くし型電極２０６の対向電極間に電圧をかけることにより位相のそろった表面弾性波を親水性ライン４にそって発生させることができる。液滴２０２は表面弾性波に乗り移動する。ここでくし型デバイスは液滴を作成する親水性ライン４の上流部に設置する。圧電基板部は基板１の親水性ライン全体に設置していてもよいし、図５のように液滴２０２を滴下する部位近傍のみに設置してもよい。くし型電極間に電圧をかけることにより表面弾性波が発生し液滴が矢印２０４方向に打ち出され移動する。
【００４２】
一般に従来吸光度測定に使用した試料はそのまま破棄される。このため測定に使用する液量が多いと試料が無駄になる。
【００４３】
例えば、図１で説明した、親水性ライン４と液溜３の系統を複数個並列に設け、それぞれの親水性ライン４の左端に測定したい試料の溶液を液滴にして配置し、これをガス噴射により、順次検出部に転がして測定を行うことでハイスループット化を達成できる。この場合、ガス噴射系は一つとし、ステージ１９を移動させることが現実的である。
【００４４】
液滴を移動させる力としては、その他、微小磁石を液滴に一個入れ、微小磁石を基板の裏から磁場で動かすことで液滴を動かすことができる。この場合、微小磁石は親水性とし、液滴がまとわりつくようにする。微小磁石は液滴径の半分以下の大きさとすることで後の吸光度測定を妨害しないようにすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】（Ａ）は、実施例１に好適な測定基板１００の平面図と、この測定基板を基礎として構成される計測システムの概念図、（Ｂ）は測定基板１００の平面図のＡ−Ａ位置で矢印方向に見たときの測定基板１００の断面図である。
【図２】本発明の実施に好適な測定基板１００の親水性ライン４の左端に液滴を構成し、これを計測するシステム構成の例を説明する概念図である。
【図３】実施例１による測定吸光度をプロットしたときの特性図である。
【図４】（Ａ）は、実施例２に好適な測定基板２００の平面図と、この測定基板を基礎として構成される計測システムの概念図、（Ｂ）は測定基板２００の平面図のＡ−Ａ位置で矢印方向に見たときの測定基板１００の断面図である。
【図５】親水性ライン４の左端に液滴を構成し、これを表面弾性波を用いて移動させて計測するシステム構成の例を説明する概念図である。
【符号の説明】
【００４６】
１…シリコン基板、２…疎水性領域、３…液溜、４…親水性ライン、５…位置決め用のマーカー、８…温調板、１０…広域光源、１０’…レーザー源、１１，１２…光ファイバー、１３，１３’…検出器、１４…分光器、１５…ＣＣＤラインセンサー、２０…レーザービーム、２１…レーザー源、２２，２３…反射ミラー、２６…パソコン、２７，３２，３７…駆動装置、２８…操作信号、３３…ピペット、３４…測定対象となる液、３１…シリンジポンプ、３５，３６，２０２…液滴、５２−５５…親水性領域、５６−５９…親水性ライン、５０，５１…計測システム、１００，２００…測定基板、２０５…圧電素子、２０６…くし型電極。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶質を含む液滴を基板上に形成させる手段、液滴に光線を集光させる手段、前記集光光線が液滴に入射し、液滴を通り抜ける光の強度を検出する光検出器を有する吸光分光システム。
【請求項２】
溶質を含む液滴を基板上に形成させる手段、前記液滴を光線を横切って移動させる手段、前記光線の光源と前記液滴が光線を横切ることで得られる信号を検出する光検出器を有する蛍光分光システム。
【請求項１】
溶質を含む液滴を基板上に形成させる手段、液滴に光線を集光させる手段、前記集光光線が液滴に入射し、液滴を通り抜ける光の強度を検出する光検出器を有する吸光分光システム。
【請求項２】
溶質を含む液滴を基板上に形成させる手段、前記液滴を光線を横切って移動させる手段、前記光線の光源と前記液滴が光線を横切ることで得られる信号を検出する光検出器を有する蛍光分光システム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００８−２５６７１２（Ｐ２００８−２５６７１２Ａ）
【公開日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１５４１７８（Ｐ２００８−１５４１７８）
【出願日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【分割の表示】特願２００４−２９７１８４（Ｐ２００４−２９７１８４）の分割
【原出願日】平成１６年１０月１２日（２００４．１０．１２）
【出願人】（５０４２９６０２４）有限責任中間法人 オンチップ・セロミクス・コンソーシアム (39)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【分割の表示】特願２００４−２９７１８４（Ｐ２００４−２９７１８４）の分割
【原出願日】平成１６年１０月１２日（２００４．１０．１２）
【出願人】（５０４２９６０２４）有限責任中間法人 オンチップ・セロミクス・コンソーシアム (39)
【Ｆターム（参考）】
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