熱処理バクテリンおよびそのような熱処理バクテリンから調製された乳剤ワクチン
熱処理バクテリン、熱処理バクテリンを産生する方法、およびそのような熱処理バクテリンから調製された乳剤ワクチンを開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概ねワクチンの分野、および乳剤ワクチンを安定化する方法に関する。詳細には、本発明は、熱処理バクテリン、熱処理バクテリンを産生する方法、およびそのような熱処理バクテリンから調製された乳剤ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
動物における感染症を制御するのに、ますます、ワクチン接種が使用されるようになっている。アジュバントは、抗原に対する液性および／または細胞性免疫応答を増強できるので、ワクチン中で頻繁に用いられる。乳剤はアジュバントとして作用でき、注射部位で蓄積所として抗原を保持する特性を有するので、ワクチンはしばしば乳剤として処方される。乳化剤は、乳剤ワクチンで一般的に使用されている。乳化剤の使用に加えて、機械的な手段による乳剤の液滴サイズの低減を介しても、乳剤ワクチンの安定性を得ることができる。
【０００３】
米国特許第５０８４２６９号は、鉱油と併用してレシチンを含有するアジュバント製剤に関し、これは、宿主動物の体内で生じる刺激感が、より少なく、同時に、より増強された全身性免疫を誘発する。米国特許第５０８４２６９号による組成物は、Ｐｆｉｚｅｒ社の商標であるＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）という商標で市販されている。
【０００４】
通常、細菌性抗原は加熱された場合に不安定であり、より高い温度への短時間の暴露でさえも抗原の活性を低減しうる。例えば、現在の炭疽ワクチンは、３７℃で４８時間ですべての生物活性を失いうる（Ｓ．Ｓｉｎｇ、Ｎ．Ａｈｕｊａ、Ｖ．Ｃｈａｕｈａｎ、Ｅ．Ｒａｊａｓｅｋａｒａｎ、Ｗ．Ｓ．Ｍｏｈｓｉｎ、Ｒ．Ｂｈａｔ、およびＲ．Ｂｈａｔｎａｇａｒ；Ｂｉｏｃｈｅ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．；２９５（５）：１０５８−６２、２００２年９月６日）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、熱処理バクテリン、熱処理バクテリンを産生する方法、およびそのような熱処理バクテリンから調製された乳剤ワクチンに関する。上記方法は、上記バクテリンを約３５℃から約８０℃の温度に加熱して、熱処理バクテリンを形成させることを含む。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
（定義）
許容できる抗原活性−「許容できる抗原活性」という用語は、同種の生存生物で攻撃された後に、ワクチン接種された動物で防御免疫応答を誘導する能力、または上記生物を用いた成文化された力価試験を合格することを意味する。
【０００８】
バクテリン−「バクテリン」という用語は、ワクチンの成分として使用できる死菌の懸濁液を意味する。
【０００９】
乳化剤−「乳化剤」という用語は、乳剤を、より安定にするのに使用される物質を意味する。
【００１０】
乳剤−「乳剤」という用語は、一方の液体の小さな液滴がもう一方の液体の連続相に懸濁されている、２種の混ざり合わない液体の組成物を意味する。
【００１１】
熱処理バクテリン−「熱処理バクテリン」という用語は、熱処理されており、かつ上記熱処理前のリパーゼ活性の５０％以下のリパーゼ活性を有し、かつ許容できる抗原活性を有するバクテリンを意味する。
【００１２】
逆相乳剤−「逆相乳剤」という用語は、油中水型乳剤を意味する。
【００１３】
リパーゼ−「リパーゼ」という用語は、乳剤ワクチン中で乳化剤の分解を引き起こすことができる酵素、エステラーゼ、リパーゼ、およびホスホリパーゼを意味する。
【００１４】
順相乳剤−「順相乳剤」という用語は、水中油型乳剤を意味する。
【００１５】
水中油型乳剤−「水中油型乳剤」という用語は、油の小さな液滴が、連続した水相中に懸濁されている乳剤を意味する。
【００１６】
室温−「室温」という用語は、１８℃から２５℃の温度を意味する。
【００１７】
油中水型乳剤−「油中水型乳剤」という用語は、水の液滴が、連続した油相中に懸濁されている乳剤を意味する。
【００１８】
（説明）
本発明は、リパーゼ活性が低減しているバクテリン、そのようなバクテリンから調製されたワクチン、およびバクテリンのリパーゼ活性を低減する方法に関する。抗原成分に加えて、一部のバクテリンは、リパーゼ活性を有する。リパーゼ活性を有するバクテリンが乳剤中に組み入れられた場合、上記乳剤を生成するのに使用された乳化剤が上記リパーゼによって破壊されうる。高いリパーゼ活性を有するバクテリンを含有する乳剤ワクチンは不安定な乳剤となる傾向があり、低レベルのリパーゼを有するバクテリンを含有するものは安定となる傾向がある。死菌にされた際に、リパーゼ活性を有するバクテリンを産生しうる細菌の例には、アシネトバクター・カルコアセティカス、アセトバクター・パセルイアヌス（ｐａｓｅｒｕｉａｎｕｓ）、アエロモナス・ハイドロフィラ、アリサイクロバシラス・アシドカルダリウス、アーケオグロバス・フルギダス、バシラス・プミラス、バシラス・ステアロサーモフィラス、枯草菌、バシラス・サーモケイトニュレイタス、セパシア菌、イネもみ枯細菌病菌、カンピロバクター・コリ、カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス、トラコーマ病原体、クロモバクテリウム・ビスコサム、ブタ丹毒菌、リステリア菌、大腸菌、インフルエンザ菌、ローソニア・イントラセルラリス、在郷軍人病菌、モラクセラ属諸種、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ、マイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＬＣ、ウェルシュ菌、フォトラブダス・ルミネスセンス、アクネ菌、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・ウィスコンシネンシス、緑膿菌、蛍光菌Ｃ９、蛍光菌ＳＩＫＷ１、シュードモナス・フラギ、シュードモナス・ルテオラ、シュードモナス・オレオボランス、シュードモナス属Ｂ１１−１種、アルカリゲネス・ユウトロファス、サイクロバクター・イモービリス（ｉｍｍｏｂｉｌｉｓ）、発疹チフスリケッチア、ネズミチフス菌、霊菌、スピルリナ・プラテンシス、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・ハイカス、ストレプトミセス・アルブス、ストレプトミセス・シンナモネウス、ストレプトミセス・エクスフォリエーテス、ストレプトミセス・スカビエス、スルフォロバス・アシドカルダリウス、シネコシスティス諸種、コレラ菌、ライム病菌、トレポネーマ・デンティコラ、トレポネーマ・ミヌツム、トレポネーマ・ファゲデニス、トレポネーマ・レフリンゲンス、トレポネーマ・ビンセンティ、トレポネーマ・パラジウム、ならびに既知病原体であるレプトスピラ・カニコーラ、レプトスピラ・グリポティポーサ、レプトスピラ・ハージョ、レプトスピラ・イクテロヘモリジア、およびレプトスピラ・ポモナなどのレプトスピラ属諸種が含まれる。
【００１９】
上記リパーゼは、乳剤を生成するのに使用された乳化剤を破壊し、それによって、乳剤の不安定化および分解を引き起こすことができるが、これには、エステラーゼ、リパーゼ、およびホスホリパーゼなどの１つまたは複数の乳剤破壊酵素が含まれうる。集合的に、これらの酵素、エステラーゼ、リパーゼ、およびホスホリパーゼをリパーゼと呼ぶ。バクテリンのリパーゼ活性は、Ｏ−ピバロイルオキシメチルウンベリフェロン（Ｃ−ＰＯＭ）と呼ばれる合成基質を用いて測定できる。リパーゼによって引き起こされる加水分解の速度がリパーゼ活性の尺度である。この反応でリパーゼによって引き起こされる加水分解の反応速度は、上記リパーゼ活性の産物の蛍光強度の増大によってモニターされる。上記反応速度は、選択された正確な加水分解試験条件に依存しており、それ故、加水分解速度によって測定されるリパーゼ活性レベルの比較は、同一の試験条件によって産生されたデータを用いて行うべきである。文献の方法は、Ｋｕｒｉｏｋａ Ｓ．およびＭａｔｓｕｄａ Ｍ．（１９７６年）、Ａｎａ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７５：２８１−２８９、Ｄｅ Ｓｉｌｖａ ＮＳおよびＱｕｉｎｎ ＰＡ．（１９８７年）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：７２９−７３１ならびにＧｒａｕ，Ａ．およびＯｒｔｉｚ，Ａ．（１９９８年）、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ．９１：１０９−１１８を含めたいくつかの論文に開示されている。
【００２０】
乳剤ワクチンでは、乳剤の分解によって、成分の相分離が引き起こされる。相分離がある場合には、容器から取り出される個々の用量に、同一レベルのワクチン成分が含有されていない可能性があるので、これは望ましくない。加えて、乳剤の減失は、乳化剤のアジュバント活性の減失をもたらし、さらに、ワクチンの抗原性効果の低減をもたらしうる。
【００２１】
弱毒生ウイルスは、バクテリンと共にしばしばワクチン中に含有される。そのようなワクチンは、単一のワクチンを用いて、１つのワクチンで異なった疾患に対する免疫を生成できるので有用である。バクテリンにリパーゼ活性が存在している場合には、それは、乳剤からの乳化剤の放出を引き起こすであろう。この遊離乳化剤は、生ワクチンウイルスを破壊および不活性化することができ、それによって、ウイルス感染性の減失をもたらす。
【００２２】
ワクチンで有用なバクテリンは、対象とする細菌を培養し、その後、細菌を殺して、細胞壁成分を含めた様々な細菌成分を含有するバクテリンを産生することによって形成させることができる。細菌は、Ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ（登録商標）、ホルマリン、ホルムアルデヒド、ジエチルアミン、バイナリーエチレンアミン（ＢＥＩ）、ベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、およびグルタルアルデヒドなどの化合物への暴露を含めた様々な方法で殺すことができる。これらの化合物の組合せを用いてもよい。加えて、殺菌放射線照射で細菌を殺すことが可能である。
【００２３】
いまでは、そのようなリパーゼ活性を有するバクテリンのリパーゼ活性を熱処理によって低減できることが見出されている。詳細には、バクテリンのリパーゼ活性は、約３５℃から約８０℃の温度にバクテリンを加熱して、許容できる抗原活性を有する熱処理バクテリンを形成させることによって低減できる。この熱処理は、熱処理バクテリンのリパーゼ活性がそのバクテリンで熱処理前に見出されたものの５０％以下となるのに十分な時間行われる。乳剤ワクチンの良好な安定性を得るには、リパーゼ活性をゼロにまで低減する必要はない。本発明者は、熱処理前のリパーゼ活性レベルの５０％以下であるリパーゼ活性レベルを有する熱処理バクテリンから、良好な貯蔵期間を有するワクチンを調製できることを見出した。
【００２４】
試験基質の加水分解速度をバクテリンのリパーゼ活性の尺度として使用する場合、熱処理前の試験基質の加水分解速度を熱処理後の加水分解速度と比較する。熱処理は、加水分解速度を、新鮮なバクテリンで観測される加水分解速度の５０％以下にまで低減するように行う。
【００２５】
熱処理前の活性と、熱処理後の活性とを測定するのに同じ方法を用いる限り、リパーゼ活性レベルを測定する正確な方法は重要でない。例えば、試験基質の加水分解速度をある基質を用いて測定した場合、別の基質は、異なった速度を生じうるであろう。しかし、初期活性測定および処理後の活性測定に同一の基質を用いた場合には、その相対速度は、依然として、熱処理の影響を示すであろう。
【００２６】
レプトスピラ・カニコーラ、レプトスピラ・イクテロヘモリジア、レプトスピラ・グリポティフォーサ、およびレプトスピラ・ポモナのうちの１つまたは複数を含むバクテリンに関しては、成文化された抗原活性試験が存在する（９ＣＦＲ§１１３．１０１、§１１３．１０２、§１１３．１０３、§１１３．１０４、および§１１３．１０５）。これらの種に関しては、同種の生バクテリアでハムスターが攻撃された場合に、非接種ハムスターの少なくとも８０％が生き残らないモデルにおいて、ワクチン接種されたハムスターの少なくとも７５％が生き残るような、ワクチン接種されたハムスターで防御免疫応答を誘導する能力として、許容できる抗原活性が定義される。レプトスピラ・ハージョが抗原である場合、細菌性抗原レプトスピラ・ハージョを含むワクチンでワクチン接種されているコウシにおいて、レプトスピラ・ハージョに対して、≧４０の血清学的凝集の相乗平均力価を誘導するワクチンの能力として、許容できる抗原活性が定義される。他のバクテリンに関しては、同種の生存生物で攻撃された後に、ワクチン接種された動物で防御免疫応答を誘導する能力として、または上記生物を用いた成文化された力価試験を合格することによって、許容できる抗原活性が定義される。
【００２７】
上記熱処理は、様々な温度にわたって、可変的な長さの時間行うことができる。通常、約３５℃から約８０℃の温度で、約２０分間から約２４時間、加熱を行うことができる。約７５℃から約８０℃など、より高い温度までバクテリンを加熱する場合には、加熱時間が上記時間範囲の下限となる。より低い温度で加熱する場合には、より長い時間加熱する。温度および時間の別の組合せは、約６０℃から約７０℃の温度に約９時間から約１０時間の加熱である。温度および時間の別の組合せは、約６５℃から約７０℃の温度に約５時間から約８時間の加熱である。温度および時間の別の組合せは、約６５℃から約７０℃の温度に約１時間の加熱である。温度および時間の別の組合せは、約５５℃から約６５℃の温度に約５時間から約８時間の加熱である。
【００２８】
上記バクテリンは、熱処理後に、新たに調製されたバクテリンより低いリパーゼ活性を有するが、それ以外では、新たに調製されたバクテリンと同じ方法で処方することができる。したがって、熱処理バクテリンは、ワクチン産生の通常の方法によってワクチンに組み入れることができる。これらの方法は当技術分野でよく知られている。
【００２９】
乳剤ワクチンは、望ましいバクテリンを油相および１または複数種の乳化剤と混合することによって形成させることができる。その後、この組合せを激しい撹拌にかけて、乳剤を形成させる。適した撹拌方法には、ホモジナイゼーションおよびそれに続く顕微溶液化が含まれる。乳化の前に、上記組合せに保存剤および賦形剤も含有させてよい。
【００３０】
バクテリンおよびウイルス抗原の両方をワクチンに含有させてもよい。バクテリンおよびウイルス抗原を含有しているワクチンを調製する際には、上記バクテリン、包含されるべき任意のウイルス抗原、上記１または複数種の乳化剤、ならびに場合により保存剤および賦形剤を油相と混合し、乳化させる。乳剤形成に続いて、ＮａＯＨ溶液またはＨＣｌ溶液のいずれかを用いて、この製剤のｐＨを適切なｐＨに調整することができる。ワクチン使用には、注射部位での刺激を避けるために、通常、上記ｐＨが中性近くであることが望ましい。約７．０から約７．３のｐＨが一般的である。
【００３１】
乳剤ワクチン形成に適した油相には、非代謝性油および代謝性油が含まれる。非代謝性油には、白色鉱油および軽油などの鉱油が含まれる。代謝性油には、植物油、魚油、および合成脂肪酸グリセリドが含まれる。
【００３２】
本発明の乳剤ワクチンを調製するのに使用できる乳化剤の例は、一般的なワクチン乳化剤である、リン脂質、ソルビタンエステル、ポリエトキシ化ソルビタンエステル、およびマンニトール誘導体である。リン脂質乳化剤には、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、およびレシチン（例えばＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）など）が含まれる。ソルビタンエステル乳化剤には、ソルビタンモノラウレート（例えばＳｐａｎ（登録商標）２０およびＡｒｌａｃｅｌ（登録商標）２０）、ソルビタンモノオレエート（例えばＳｐａｎ（登録商標）８０およびＡｒｌａｃｅｌ（登録商標）８０）、ソルビタンモノパルミテート（例えばＳｐａｎ（登録商標）４０およびＡｒｌａｃｅｌ（登録商標）４０）、およびソルビタンモノステアレート（例えばＳｐａｎ（登録商標）６０およびＡｒｌａｃｅｌ（登録商標）６０）が含まれる。ポリエトキシ化ソルビタンエステルには、ポリエトキシソルビタンモノラウレート（例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）２０およびＴｗｅｅｎ（登録商標）２１）、ポリエトキシソルビタンモノオレエート（例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）８０）、ポリエトキシソルビタンモノパルミテート（例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）４０）、およびポリエトキシソルビタンモノステアレート（例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）６０）が含まれる。マンニトール誘導体乳化剤には、マンニトールステアリン酸エーテルが含まれる。Ｓｐａｎ（登録商標）、Ａｒｌａｃｅｌ（登録商標）、およびＴｗｅｅｎ（登録商標）は、ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ社の商標である。ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）は、Ｐｆｉｚｅｒ社の商標である。通常、ワクチンは、順相の水中油型乳剤として処方されるが、逆相の油中水型乳剤を調製することも可能である。
【００３３】
Ｑｕｉｌ Ａ、コレステロール、リン酸アルミニウム、および水酸化アルミニウムなどの様々なアジュバント、ならびにＭｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ（登録商標）などの保存剤をワクチン中で用いることができる。Ｑｕｉｌ Ａは、南米産の樹木であるキラヤ・サポナリア・モリーナの樹皮から抽出されたキラヤサポニンの精製混合物である。Ｑｕｉｌ Ａは、免疫系に直接的に作用して、感受性の全身状態を活性化する。そうする際に、それは、液性応答および細胞性応答の両方を誘導する。親油性鎖は、内因性の経路で、プロセシングのために細胞質ゾルに送達されるために、抗原とアジュバントとの相互作用を可能にする。コレステロールは、適切な比率で添加された際に、望ましくない副作用を排除するので、Ｑｕｉｌ Ａは、しばしば、コレステロールと共に用いられる。コレステロールがＱｕｉｌ Ａと結合した際に、上記コレステロールはヘリックス様の構造を形成する不溶性複合体をＱｕｉｌ Ａと形成し、それによって、上記分子における、免疫応答の刺激を補助する糖単位を露出させる。
【００３４】
バクテリンを含有するワクチンには、ウイルス抗原を添加するのが一般的である。このアプローチの１つの利点は、いくつかの疾患に対する免疫を生み出すのに、同じ結果を実現するためにいくつかの異なったワクチンを複数用量必要とする代わりに、１つのワクチンが使用できることである。ワクチンには、死菌ウイルスと弱毒化生ウイルスとの両方が使用できる。使用できるウイルスには、トリヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス、イヌヘルペスウイルス、ウマヘルペスウイルス、ネコウイルス性鼻気管炎ウイルス、マレック病ウイルス、ヒツジヘルペスウイルス、ブタヘルペスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、トリパラミキソウイルス、ウシＲＳウイルス、イヌジステンパーウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、ウシパラインフルエンザ３、ヒツジパラインフルエンザ３、牛疫ウイルス、ボーダー病ウイルス、ウシウイルス性下痢（ＢＶＤ）ウイルス、ブタコレラウイルス、トリ白血病ウイルス、ウシ免疫不全症ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全症ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ヒツジ進行性肺炎ウイルス、ヒツジ肺腺癌ウイルス、イヌコロナウイルス、ウシコロナウイルス、ネコ腸コロナウイルス、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、ブタ伝染性下痢ウイルス、ブタ血球凝集脳脊髄炎ウイルス、ブタパルボウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、トルココロナウイルス、ウシ流行熱ウイルス、狂犬病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、トリインフルエンザ、ウマインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス、イヌインフルエンザウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、および西部ウマ脳炎ウイルスが含まれる。
【００３５】
上記バクテリンにリパーゼ活性が存在している場合、それは、乳剤からの乳化剤の放出を引き起こしうる。この遊離乳化剤は、生ウイルスエンベロープを破壊し、生ワクチンウイルスを不活性化し、それによって、ウイルス感染性の減失をもたらしうる。したがって、上記バクテリンの熱処理は、乳剤を安定化し、そのアジュバント効果を維持するのに加えて、上記ウイルスのウイルス感染性を維持する働きがある。
【００３６】
以下の実施例は、さらなる例証を目的として提供するものであって、特許請求の範囲に記載した発明の範囲の限定を意図したものではない。
【００３７】
（手順）
（手順１ 濁度の測定）
濁度は、光散乱法による比濁計単位（ＮＵ）で測定する。特定の条件下における試料によって散乱した光の強度を、標準参照懸濁液によって散乱した光の強度と比較する。散乱光の強度が高いほど、試料の濁度が高い。光源は試料の方向に向いており、散乱光は光源の方向に対して９０°で測定する。測定器は、ホルマジン懸濁液からの散乱光を測定することによって較正する。
【００３８】
（比濁計測定器の較正）
０．２μｍの孔径を有する濾過膜に通して、蒸留水を濾過することによって、超濾過水を調製する。第１の溶液は、１．００ｇの硫酸ヒドラジンすなわち（ＮＨ２）Ｈ２ＳＯ４を超濾過水に溶解させ、メスフラスコ内において超濾過水で１００ｍｌに希釈することによって調製する。第２の溶液は、１０．００ｇのヘキサメチレンテトラミンを超濾過水に溶解させ、メスフラスコ内において超濾過水で１００ｍｌに希釈することによって調製する。ホルマジン懸濁液は、５．０ｍｌの第１の溶液を５．０ｍｌの第２の溶液と混合することによって調製する。この混合物を約２４℃で２４時間静置する。この混合物を超濾過水で１００ｍｌに希釈して、４００ＮＵの濁度を有する保存濁度懸濁液を形成させる。４０ＮＵホルマジン濁度懸濁液は、１０．００ｍｌの保存濁度懸濁液を超濾過水で１００ｍｌに希釈することによって調製する。さらなる較正溶液は、この保存液を希釈することによって調製する。
【００３９】
（濁度の測定）
濁度が比濁計の較正された範囲内に入るように、測定するべき試料を超濾過水で希釈する。その濁度を測定し、次の式：
【００４０】
【化１】
［式中、Ｍは、希釈試料の濁度（ＮＵ）であり、
Ｄは、希釈水の容積（ｍＬ）であり、
Ｏは、試料原液の容積（ｍＬ）である。］
を用いて、原液の濁度を計算する。
【００４１】
（手順２ リパーゼの分析）
リパーゼ活性は、Ｏ−ピバロキシメチルウンベリフェロンを蛍光発生基質として用いて測定した。リパーゼに触媒された、この非蛍光基質の加水分解は、水性条件下で不安定であるヒドロキシメチルエーテルを産生する。この不安定なヒドロキシメチルエーテルの分解は、ホルムアルデヒドと、蛍光産物であるウンベリフェロンとを生成する。産生されたウンベリフェロンの蛍光強度を時間の関数としてモニターすることによって、リパーゼ酵素活性の高感度な速度測定が行われる。
【００４２】
Ｏ−ピバロキシメチルウンベリフェロン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製品番号Ｐ３５９０１）溶液は、純ＤＭＳＯ中に保存濃度５ｍＭで調製し、未使用の溶液は、光から保護して、−２０℃で保存した。５８ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、５ｍＭ Ｏ−ピバロキシメチルウンベリフェロン溶液を７５０μＭに希釈し、この結果得られた溶液を予め３７℃に暖めた。レプトスピラ試料または対照緩衝液／培地を、室温、６５００×重力で１０分間遠心処理して、ペレットおよび上清を形成させた。小容積９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製３３９３、黒色ポリスチレンの非結合表面、半分の領域）のアッセイウェル内で、１００ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）１５μＬを、レプトスピラ試料または対照緩衝液／培地から得られた上記上清１５μＬと室温で混合し、３７℃で、１０分間、プレインキュベートし、その後、７５０μＭ Ｏ−ピバロキシメチルウンベリフェロンまたは対照緩衝液／培地２０μＬを添加することによって反応を開始させることによって反応を行った。この結果得られた反応混合物は、５３ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）と、０μｍまたは３００μｍのＯ−ピバロキシメチルウンベリフェロンを含有していた。蛍光強度は、３０〜４５秒間隔で１時間にわたって測定した（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ（登録商標）Ｇｅｍｉｎｉ ＸＳ、３７℃、λｅｘ＝３６０ｎｍ、λｅｍ＝４６０ｎｍ、ＰＭＴ感度設定「ｍｅｄｉｕｍ」、１ウェルあたり６測定）。この結果得られたプログレス曲線の勾配から反応速度を決定した。
【実施例】
【００４３】
（実施例１）
熱処理によるリパーゼ活性の低減
以下の種、すなわち、レプトスピラ・カニコーラ、レプトスピラ・イクテロヘモリジア、レプトスピラ・グリポティフォーサ、レプトスピラ・ハージョ、およびレプトスピラ・ポモナを含有する、Ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ（登録商標）で殺したレプトスピラのプールを調製して、バクテリンを形成させた。上記バクテリンの６つの試料を４℃、３７℃、４５℃、５６℃、６５℃、および８０℃で終夜（約１２時間）保存した。４℃で保存された試料を未処理の対照として用いた。３７℃、４５℃、５６℃、６５℃、および８０℃で１２時間保存された試料が加熱処理試料となった。保存の後、各バクテリンの存在下で試験基質が加水分解された速度を手順２の方法に従って測定した。試料の加水分解速度を、４℃で保存された試料の加水分解速度で割って、１００を掛けたものが、保存後に残留していた各バクテリンの元のリパーゼ活性のパーセントである。次の表は、保存の温度と、保存後に残留していた元のリパーゼ活性のパーセントとを示す。
【００４４】
【表１】
【００４５】
（実施例２）
実験用ワクチン製剤の調製
レプトスピラ・カニコーラ、レプトスピラ・イクテロヘモリジア、レプトスピラ・グリポティフォーサ、レプトスピラ・ハージョ、およびレプトスピラ・ポモナの培養物を培養した。各培養物の濁度を比濁計単位（ＮＵ）で測定した。細菌をＭｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ（登録商標）で殺して、バクテリンを形成させた。リパーゼ活性を低減するために、各バクテリンを６５℃で８時間熱処理した。これらのバクテリンを混合し、その後、このワクチンの各５ｍｌ用量が次の表に記載の成分を含有するように、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）、アジュバント、保存剤、および希釈緩衝液と混合した。
【００４６】
【表２】
【００４７】
上記製剤を、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ社製ホモジナイザーを用いてホモジナイズし、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社製のマイクロフルイダイザーを用いて顕微溶液化した。ホモジナイゼーション処理および顕微溶液化の両方に続いて、上記製剤のｐＨを７．０から７．３のｐＨに調整した。
【００４８】
（実施例３）
ハムスターおよびウシでの効力試験
標準的な実験室および宿主動物モデルを用いて、効力があるかどうか試験するために、実施例２のワクチンをハムスターおよびウシに投与した。その後、１用量のレプトスピラ・カニコーラ、レプトスピラ・イクテロヘモリジア、レプトスピラ・グリポティフォーサ、またはレプトスピラ・ポモナで、試験ハムスターを攻撃して、ワクチンの効力を試験した。効力の実証として、生存者の数を測定した。ウシにおける、上記ワクチン画分の効力を実証するために、レプトスピラ・ハージョに対する、ウシの顕微鏡的凝集力価を測定した。下の表は、熱処理されたレプトスピラバクテリンから調製されたワクチンが効力判定規準を満たす抗原性反応を産生できることを示す。
【００４９】
【表３】
【００５０】
（実施例４）
ワクチンの生理化学的試験
ワクチンは、実施例２の方法に従って、熱処理されたレプトスピラバクテリンから調製した。熱処理されていないレプトスピラバクテリンから、同様なワクチンを実施例２の方法に従って調製した。両方のワクチン製剤を４℃で６０日間保存した。新たに調製した際に、０日目および再度６０日目に、レーザ回折計を用いて各ワクチンに関する粒径分析を行った。
【００５１】
下に示すグラフは、０日目および６０日間の貯蔵の前後における各ワクチンの粒径分布を示す。
【００５２】
【表４−１】
【００５３】
【表４−２】
【００５４】
熱処理されたレプトスピラバクテリンから調製されたワクチンは、乳剤の安定性を示す粒径の維持を示す。熱処理されていないレプトスピラバクテリンから調製されたワクチンは、乳剤の分解を示す粒径増大を示す。
【００５５】
（実施例５）
殺ウイルスアッセイ
実施例２の方法に従って、熱処理されたレプトスピラバクテリン、および熱処理されていないレプトスピラバクテリンからワクチンを調製した。５から６カ月間の時間を置いた後に、ＢＨＶ−１ウイルス、ＰＩ３ウイルス、およびＢＲＳＶウイルスに対する殺ウイルス活性があるかどうか、上記ワクチンを試験した。殺ウイルス活性試験は、試験するべき、アジュバント添加された希釈液で、一価の殺ウイルスアッセイ対照（ＶＡＣ）を再水和させることによって行った。２種の一価殺ウイルスアッセイ対照をそれぞれの用量容積で再水和させた。２種の再水和された一価ＶＡＣをプールし、２０〜２５℃で２時間インキュベートした後、ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）によって生ウイルス力価を決定するために細胞上で力価測定および接種を行った。０．７ ＴＣＩＤ５０／ｍｌを超えるウイルス力価減失を有することは不満足である。
【００５６】
ウイルス力価の減失を示す殺ウイルスアッセイの結果を下の表に示す。
【００５７】
【表５】
【００５８】
熱処理されていないレプトスピラバクテリンで作製されたワクチンは、高レベルの殺ウイルス活性を示す。熱処理されたレプトスピラバクテリンによって作製されたワクチンは、殺ウイルス性ではなかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概ねワクチンの分野、および乳剤ワクチンを安定化する方法に関する。詳細には、本発明は、熱処理バクテリン、熱処理バクテリンを産生する方法、およびそのような熱処理バクテリンから調製された乳剤ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
動物における感染症を制御するのに、ますます、ワクチン接種が使用されるようになっている。アジュバントは、抗原に対する液性および／または細胞性免疫応答を増強できるので、ワクチン中で頻繁に用いられる。乳剤はアジュバントとして作用でき、注射部位で蓄積所として抗原を保持する特性を有するので、ワクチンはしばしば乳剤として処方される。乳化剤は、乳剤ワクチンで一般的に使用されている。乳化剤の使用に加えて、機械的な手段による乳剤の液滴サイズの低減を介しても、乳剤ワクチンの安定性を得ることができる。
【０００３】
米国特許第５０８４２６９号は、鉱油と併用してレシチンを含有するアジュバント製剤に関し、これは、宿主動物の体内で生じる刺激感が、より少なく、同時に、より増強された全身性免疫を誘発する。米国特許第５０８４２６９号による組成物は、Ｐｆｉｚｅｒ社の商標であるＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）という商標で市販されている。
【０００４】
通常、細菌性抗原は加熱された場合に不安定であり、より高い温度への短時間の暴露でさえも抗原の活性を低減しうる。例えば、現在の炭疽ワクチンは、３７℃で４８時間ですべての生物活性を失いうる（Ｓ．Ｓｉｎｇ、Ｎ．Ａｈｕｊａ、Ｖ．Ｃｈａｕｈａｎ、Ｅ．Ｒａｊａｓｅｋａｒａｎ、Ｗ．Ｓ．Ｍｏｈｓｉｎ、Ｒ．Ｂｈａｔ、およびＲ．Ｂｈａｔｎａｇａｒ；Ｂｉｏｃｈｅ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．；２９５（５）：１０５８−６２、２００２年９月６日）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、熱処理バクテリン、熱処理バクテリンを産生する方法、およびそのような熱処理バクテリンから調製された乳剤ワクチンに関する。上記方法は、上記バクテリンを約３５℃から約８０℃の温度に加熱して、熱処理バクテリンを形成させることを含む。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
（定義）
許容できる抗原活性−「許容できる抗原活性」という用語は、同種の生存生物で攻撃された後に、ワクチン接種された動物で防御免疫応答を誘導する能力、または上記生物を用いた成文化された力価試験を合格することを意味する。
【０００８】
バクテリン−「バクテリン」という用語は、ワクチンの成分として使用できる死菌の懸濁液を意味する。
【０００９】
乳化剤−「乳化剤」という用語は、乳剤を、より安定にするのに使用される物質を意味する。
【００１０】
乳剤−「乳剤」という用語は、一方の液体の小さな液滴がもう一方の液体の連続相に懸濁されている、２種の混ざり合わない液体の組成物を意味する。
【００１１】
熱処理バクテリン−「熱処理バクテリン」という用語は、熱処理されており、かつ上記熱処理前のリパーゼ活性の５０％以下のリパーゼ活性を有し、かつ許容できる抗原活性を有するバクテリンを意味する。
【００１２】
逆相乳剤−「逆相乳剤」という用語は、油中水型乳剤を意味する。
【００１３】
リパーゼ−「リパーゼ」という用語は、乳剤ワクチン中で乳化剤の分解を引き起こすことができる酵素、エステラーゼ、リパーゼ、およびホスホリパーゼを意味する。
【００１４】
順相乳剤−「順相乳剤」という用語は、水中油型乳剤を意味する。
【００１５】
水中油型乳剤−「水中油型乳剤」という用語は、油の小さな液滴が、連続した水相中に懸濁されている乳剤を意味する。
【００１６】
室温−「室温」という用語は、１８℃から２５℃の温度を意味する。
【００１７】
油中水型乳剤−「油中水型乳剤」という用語は、水の液滴が、連続した油相中に懸濁されている乳剤を意味する。
【００１８】
（説明）
本発明は、リパーゼ活性が低減しているバクテリン、そのようなバクテリンから調製されたワクチン、およびバクテリンのリパーゼ活性を低減する方法に関する。抗原成分に加えて、一部のバクテリンは、リパーゼ活性を有する。リパーゼ活性を有するバクテリンが乳剤中に組み入れられた場合、上記乳剤を生成するのに使用された乳化剤が上記リパーゼによって破壊されうる。高いリパーゼ活性を有するバクテリンを含有する乳剤ワクチンは不安定な乳剤となる傾向があり、低レベルのリパーゼを有するバクテリンを含有するものは安定となる傾向がある。死菌にされた際に、リパーゼ活性を有するバクテリンを産生しうる細菌の例には、アシネトバクター・カルコアセティカス、アセトバクター・パセルイアヌス（ｐａｓｅｒｕｉａｎｕｓ）、アエロモナス・ハイドロフィラ、アリサイクロバシラス・アシドカルダリウス、アーケオグロバス・フルギダス、バシラス・プミラス、バシラス・ステアロサーモフィラス、枯草菌、バシラス・サーモケイトニュレイタス、セパシア菌、イネもみ枯細菌病菌、カンピロバクター・コリ、カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス、トラコーマ病原体、クロモバクテリウム・ビスコサム、ブタ丹毒菌、リステリア菌、大腸菌、インフルエンザ菌、ローソニア・イントラセルラリス、在郷軍人病菌、モラクセラ属諸種、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ、マイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＬＣ、ウェルシュ菌、フォトラブダス・ルミネスセンス、アクネ菌、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・ウィスコンシネンシス、緑膿菌、蛍光菌Ｃ９、蛍光菌ＳＩＫＷ１、シュードモナス・フラギ、シュードモナス・ルテオラ、シュードモナス・オレオボランス、シュードモナス属Ｂ１１−１種、アルカリゲネス・ユウトロファス、サイクロバクター・イモービリス（ｉｍｍｏｂｉｌｉｓ）、発疹チフスリケッチア、ネズミチフス菌、霊菌、スピルリナ・プラテンシス、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・ハイカス、ストレプトミセス・アルブス、ストレプトミセス・シンナモネウス、ストレプトミセス・エクスフォリエーテス、ストレプトミセス・スカビエス、スルフォロバス・アシドカルダリウス、シネコシスティス諸種、コレラ菌、ライム病菌、トレポネーマ・デンティコラ、トレポネーマ・ミヌツム、トレポネーマ・ファゲデニス、トレポネーマ・レフリンゲンス、トレポネーマ・ビンセンティ、トレポネーマ・パラジウム、ならびに既知病原体であるレプトスピラ・カニコーラ、レプトスピラ・グリポティポーサ、レプトスピラ・ハージョ、レプトスピラ・イクテロヘモリジア、およびレプトスピラ・ポモナなどのレプトスピラ属諸種が含まれる。
【００１９】
上記リパーゼは、乳剤を生成するのに使用された乳化剤を破壊し、それによって、乳剤の不安定化および分解を引き起こすことができるが、これには、エステラーゼ、リパーゼ、およびホスホリパーゼなどの１つまたは複数の乳剤破壊酵素が含まれうる。集合的に、これらの酵素、エステラーゼ、リパーゼ、およびホスホリパーゼをリパーゼと呼ぶ。バクテリンのリパーゼ活性は、Ｏ−ピバロイルオキシメチルウンベリフェロン（Ｃ−ＰＯＭ）と呼ばれる合成基質を用いて測定できる。リパーゼによって引き起こされる加水分解の速度がリパーゼ活性の尺度である。この反応でリパーゼによって引き起こされる加水分解の反応速度は、上記リパーゼ活性の産物の蛍光強度の増大によってモニターされる。上記反応速度は、選択された正確な加水分解試験条件に依存しており、それ故、加水分解速度によって測定されるリパーゼ活性レベルの比較は、同一の試験条件によって産生されたデータを用いて行うべきである。文献の方法は、Ｋｕｒｉｏｋａ Ｓ．およびＭａｔｓｕｄａ Ｍ．（１９７６年）、Ａｎａ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７５：２８１−２８９、Ｄｅ Ｓｉｌｖａ ＮＳおよびＱｕｉｎｎ ＰＡ．（１９８７年）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：７２９−７３１ならびにＧｒａｕ，Ａ．およびＯｒｔｉｚ，Ａ．（１９９８年）、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ．９１：１０９−１１８を含めたいくつかの論文に開示されている。
【００２０】
乳剤ワクチンでは、乳剤の分解によって、成分の相分離が引き起こされる。相分離がある場合には、容器から取り出される個々の用量に、同一レベルのワクチン成分が含有されていない可能性があるので、これは望ましくない。加えて、乳剤の減失は、乳化剤のアジュバント活性の減失をもたらし、さらに、ワクチンの抗原性効果の低減をもたらしうる。
【００２１】
弱毒生ウイルスは、バクテリンと共にしばしばワクチン中に含有される。そのようなワクチンは、単一のワクチンを用いて、１つのワクチンで異なった疾患に対する免疫を生成できるので有用である。バクテリンにリパーゼ活性が存在している場合には、それは、乳剤からの乳化剤の放出を引き起こすであろう。この遊離乳化剤は、生ワクチンウイルスを破壊および不活性化することができ、それによって、ウイルス感染性の減失をもたらす。
【００２２】
ワクチンで有用なバクテリンは、対象とする細菌を培養し、その後、細菌を殺して、細胞壁成分を含めた様々な細菌成分を含有するバクテリンを産生することによって形成させることができる。細菌は、Ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ（登録商標）、ホルマリン、ホルムアルデヒド、ジエチルアミン、バイナリーエチレンアミン（ＢＥＩ）、ベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、およびグルタルアルデヒドなどの化合物への暴露を含めた様々な方法で殺すことができる。これらの化合物の組合せを用いてもよい。加えて、殺菌放射線照射で細菌を殺すことが可能である。
【００２３】
いまでは、そのようなリパーゼ活性を有するバクテリンのリパーゼ活性を熱処理によって低減できることが見出されている。詳細には、バクテリンのリパーゼ活性は、約３５℃から約８０℃の温度にバクテリンを加熱して、許容できる抗原活性を有する熱処理バクテリンを形成させることによって低減できる。この熱処理は、熱処理バクテリンのリパーゼ活性がそのバクテリンで熱処理前に見出されたものの５０％以下となるのに十分な時間行われる。乳剤ワクチンの良好な安定性を得るには、リパーゼ活性をゼロにまで低減する必要はない。本発明者は、熱処理前のリパーゼ活性レベルの５０％以下であるリパーゼ活性レベルを有する熱処理バクテリンから、良好な貯蔵期間を有するワクチンを調製できることを見出した。
【００２４】
試験基質の加水分解速度をバクテリンのリパーゼ活性の尺度として使用する場合、熱処理前の試験基質の加水分解速度を熱処理後の加水分解速度と比較する。熱処理は、加水分解速度を、新鮮なバクテリンで観測される加水分解速度の５０％以下にまで低減するように行う。
【００２５】
熱処理前の活性と、熱処理後の活性とを測定するのに同じ方法を用いる限り、リパーゼ活性レベルを測定する正確な方法は重要でない。例えば、試験基質の加水分解速度をある基質を用いて測定した場合、別の基質は、異なった速度を生じうるであろう。しかし、初期活性測定および処理後の活性測定に同一の基質を用いた場合には、その相対速度は、依然として、熱処理の影響を示すであろう。
【００２６】
レプトスピラ・カニコーラ、レプトスピラ・イクテロヘモリジア、レプトスピラ・グリポティフォーサ、およびレプトスピラ・ポモナのうちの１つまたは複数を含むバクテリンに関しては、成文化された抗原活性試験が存在する（９ＣＦＲ§１１３．１０１、§１１３．１０２、§１１３．１０３、§１１３．１０４、および§１１３．１０５）。これらの種に関しては、同種の生バクテリアでハムスターが攻撃された場合に、非接種ハムスターの少なくとも８０％が生き残らないモデルにおいて、ワクチン接種されたハムスターの少なくとも７５％が生き残るような、ワクチン接種されたハムスターで防御免疫応答を誘導する能力として、許容できる抗原活性が定義される。レプトスピラ・ハージョが抗原である場合、細菌性抗原レプトスピラ・ハージョを含むワクチンでワクチン接種されているコウシにおいて、レプトスピラ・ハージョに対して、≧４０の血清学的凝集の相乗平均力価を誘導するワクチンの能力として、許容できる抗原活性が定義される。他のバクテリンに関しては、同種の生存生物で攻撃された後に、ワクチン接種された動物で防御免疫応答を誘導する能力として、または上記生物を用いた成文化された力価試験を合格することによって、許容できる抗原活性が定義される。
【００２７】
上記熱処理は、様々な温度にわたって、可変的な長さの時間行うことができる。通常、約３５℃から約８０℃の温度で、約２０分間から約２４時間、加熱を行うことができる。約７５℃から約８０℃など、より高い温度までバクテリンを加熱する場合には、加熱時間が上記時間範囲の下限となる。より低い温度で加熱する場合には、より長い時間加熱する。温度および時間の別の組合せは、約６０℃から約７０℃の温度に約９時間から約１０時間の加熱である。温度および時間の別の組合せは、約６５℃から約７０℃の温度に約５時間から約８時間の加熱である。温度および時間の別の組合せは、約６５℃から約７０℃の温度に約１時間の加熱である。温度および時間の別の組合せは、約５５℃から約６５℃の温度に約５時間から約８時間の加熱である。
【００２８】
上記バクテリンは、熱処理後に、新たに調製されたバクテリンより低いリパーゼ活性を有するが、それ以外では、新たに調製されたバクテリンと同じ方法で処方することができる。したがって、熱処理バクテリンは、ワクチン産生の通常の方法によってワクチンに組み入れることができる。これらの方法は当技術分野でよく知られている。
【００２９】
乳剤ワクチンは、望ましいバクテリンを油相および１または複数種の乳化剤と混合することによって形成させることができる。その後、この組合せを激しい撹拌にかけて、乳剤を形成させる。適した撹拌方法には、ホモジナイゼーションおよびそれに続く顕微溶液化が含まれる。乳化の前に、上記組合せに保存剤および賦形剤も含有させてよい。
【００３０】
バクテリンおよびウイルス抗原の両方をワクチンに含有させてもよい。バクテリンおよびウイルス抗原を含有しているワクチンを調製する際には、上記バクテリン、包含されるべき任意のウイルス抗原、上記１または複数種の乳化剤、ならびに場合により保存剤および賦形剤を油相と混合し、乳化させる。乳剤形成に続いて、ＮａＯＨ溶液またはＨＣｌ溶液のいずれかを用いて、この製剤のｐＨを適切なｐＨに調整することができる。ワクチン使用には、注射部位での刺激を避けるために、通常、上記ｐＨが中性近くであることが望ましい。約７．０から約７．３のｐＨが一般的である。
【００３１】
乳剤ワクチン形成に適した油相には、非代謝性油および代謝性油が含まれる。非代謝性油には、白色鉱油および軽油などの鉱油が含まれる。代謝性油には、植物油、魚油、および合成脂肪酸グリセリドが含まれる。
【００３２】
本発明の乳剤ワクチンを調製するのに使用できる乳化剤の例は、一般的なワクチン乳化剤である、リン脂質、ソルビタンエステル、ポリエトキシ化ソルビタンエステル、およびマンニトール誘導体である。リン脂質乳化剤には、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、およびレシチン（例えばＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）など）が含まれる。ソルビタンエステル乳化剤には、ソルビタンモノラウレート（例えばＳｐａｎ（登録商標）２０およびＡｒｌａｃｅｌ（登録商標）２０）、ソルビタンモノオレエート（例えばＳｐａｎ（登録商標）８０およびＡｒｌａｃｅｌ（登録商標）８０）、ソルビタンモノパルミテート（例えばＳｐａｎ（登録商標）４０およびＡｒｌａｃｅｌ（登録商標）４０）、およびソルビタンモノステアレート（例えばＳｐａｎ（登録商標）６０およびＡｒｌａｃｅｌ（登録商標）６０）が含まれる。ポリエトキシ化ソルビタンエステルには、ポリエトキシソルビタンモノラウレート（例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）２０およびＴｗｅｅｎ（登録商標）２１）、ポリエトキシソルビタンモノオレエート（例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）８０）、ポリエトキシソルビタンモノパルミテート（例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）４０）、およびポリエトキシソルビタンモノステアレート（例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）６０）が含まれる。マンニトール誘導体乳化剤には、マンニトールステアリン酸エーテルが含まれる。Ｓｐａｎ（登録商標）、Ａｒｌａｃｅｌ（登録商標）、およびＴｗｅｅｎ（登録商標）は、ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ社の商標である。ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）は、Ｐｆｉｚｅｒ社の商標である。通常、ワクチンは、順相の水中油型乳剤として処方されるが、逆相の油中水型乳剤を調製することも可能である。
【００３３】
Ｑｕｉｌ Ａ、コレステロール、リン酸アルミニウム、および水酸化アルミニウムなどの様々なアジュバント、ならびにＭｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ（登録商標）などの保存剤をワクチン中で用いることができる。Ｑｕｉｌ Ａは、南米産の樹木であるキラヤ・サポナリア・モリーナの樹皮から抽出されたキラヤサポニンの精製混合物である。Ｑｕｉｌ Ａは、免疫系に直接的に作用して、感受性の全身状態を活性化する。そうする際に、それは、液性応答および細胞性応答の両方を誘導する。親油性鎖は、内因性の経路で、プロセシングのために細胞質ゾルに送達されるために、抗原とアジュバントとの相互作用を可能にする。コレステロールは、適切な比率で添加された際に、望ましくない副作用を排除するので、Ｑｕｉｌ Ａは、しばしば、コレステロールと共に用いられる。コレステロールがＱｕｉｌ Ａと結合した際に、上記コレステロールはヘリックス様の構造を形成する不溶性複合体をＱｕｉｌ Ａと形成し、それによって、上記分子における、免疫応答の刺激を補助する糖単位を露出させる。
【００３４】
バクテリンを含有するワクチンには、ウイルス抗原を添加するのが一般的である。このアプローチの１つの利点は、いくつかの疾患に対する免疫を生み出すのに、同じ結果を実現するためにいくつかの異なったワクチンを複数用量必要とする代わりに、１つのワクチンが使用できることである。ワクチンには、死菌ウイルスと弱毒化生ウイルスとの両方が使用できる。使用できるウイルスには、トリヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス、イヌヘルペスウイルス、ウマヘルペスウイルス、ネコウイルス性鼻気管炎ウイルス、マレック病ウイルス、ヒツジヘルペスウイルス、ブタヘルペスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、トリパラミキソウイルス、ウシＲＳウイルス、イヌジステンパーウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、ウシパラインフルエンザ３、ヒツジパラインフルエンザ３、牛疫ウイルス、ボーダー病ウイルス、ウシウイルス性下痢（ＢＶＤ）ウイルス、ブタコレラウイルス、トリ白血病ウイルス、ウシ免疫不全症ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全症ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ヒツジ進行性肺炎ウイルス、ヒツジ肺腺癌ウイルス、イヌコロナウイルス、ウシコロナウイルス、ネコ腸コロナウイルス、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、ブタ伝染性下痢ウイルス、ブタ血球凝集脳脊髄炎ウイルス、ブタパルボウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、トルココロナウイルス、ウシ流行熱ウイルス、狂犬病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、トリインフルエンザ、ウマインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス、イヌインフルエンザウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、および西部ウマ脳炎ウイルスが含まれる。
【００３５】
上記バクテリンにリパーゼ活性が存在している場合、それは、乳剤からの乳化剤の放出を引き起こしうる。この遊離乳化剤は、生ウイルスエンベロープを破壊し、生ワクチンウイルスを不活性化し、それによって、ウイルス感染性の減失をもたらしうる。したがって、上記バクテリンの熱処理は、乳剤を安定化し、そのアジュバント効果を維持するのに加えて、上記ウイルスのウイルス感染性を維持する働きがある。
【００３６】
以下の実施例は、さらなる例証を目的として提供するものであって、特許請求の範囲に記載した発明の範囲の限定を意図したものではない。
【００３７】
（手順）
（手順１ 濁度の測定）
濁度は、光散乱法による比濁計単位（ＮＵ）で測定する。特定の条件下における試料によって散乱した光の強度を、標準参照懸濁液によって散乱した光の強度と比較する。散乱光の強度が高いほど、試料の濁度が高い。光源は試料の方向に向いており、散乱光は光源の方向に対して９０°で測定する。測定器は、ホルマジン懸濁液からの散乱光を測定することによって較正する。
【００３８】
（比濁計測定器の較正）
０．２μｍの孔径を有する濾過膜に通して、蒸留水を濾過することによって、超濾過水を調製する。第１の溶液は、１．００ｇの硫酸ヒドラジンすなわち（ＮＨ２）Ｈ２ＳＯ４を超濾過水に溶解させ、メスフラスコ内において超濾過水で１００ｍｌに希釈することによって調製する。第２の溶液は、１０．００ｇのヘキサメチレンテトラミンを超濾過水に溶解させ、メスフラスコ内において超濾過水で１００ｍｌに希釈することによって調製する。ホルマジン懸濁液は、５．０ｍｌの第１の溶液を５．０ｍｌの第２の溶液と混合することによって調製する。この混合物を約２４℃で２４時間静置する。この混合物を超濾過水で１００ｍｌに希釈して、４００ＮＵの濁度を有する保存濁度懸濁液を形成させる。４０ＮＵホルマジン濁度懸濁液は、１０．００ｍｌの保存濁度懸濁液を超濾過水で１００ｍｌに希釈することによって調製する。さらなる較正溶液は、この保存液を希釈することによって調製する。
【００３９】
（濁度の測定）
濁度が比濁計の較正された範囲内に入るように、測定するべき試料を超濾過水で希釈する。その濁度を測定し、次の式：
【００４０】
【化１】
［式中、Ｍは、希釈試料の濁度（ＮＵ）であり、
Ｄは、希釈水の容積（ｍＬ）であり、
Ｏは、試料原液の容積（ｍＬ）である。］
を用いて、原液の濁度を計算する。
【００４１】
（手順２ リパーゼの分析）
リパーゼ活性は、Ｏ−ピバロキシメチルウンベリフェロンを蛍光発生基質として用いて測定した。リパーゼに触媒された、この非蛍光基質の加水分解は、水性条件下で不安定であるヒドロキシメチルエーテルを産生する。この不安定なヒドロキシメチルエーテルの分解は、ホルムアルデヒドと、蛍光産物であるウンベリフェロンとを生成する。産生されたウンベリフェロンの蛍光強度を時間の関数としてモニターすることによって、リパーゼ酵素活性の高感度な速度測定が行われる。
【００４２】
Ｏ−ピバロキシメチルウンベリフェロン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製品番号Ｐ３５９０１）溶液は、純ＤＭＳＯ中に保存濃度５ｍＭで調製し、未使用の溶液は、光から保護して、−２０℃で保存した。５８ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、５ｍＭ Ｏ−ピバロキシメチルウンベリフェロン溶液を７５０μＭに希釈し、この結果得られた溶液を予め３７℃に暖めた。レプトスピラ試料または対照緩衝液／培地を、室温、６５００×重力で１０分間遠心処理して、ペレットおよび上清を形成させた。小容積９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製３３９３、黒色ポリスチレンの非結合表面、半分の領域）のアッセイウェル内で、１００ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）１５μＬを、レプトスピラ試料または対照緩衝液／培地から得られた上記上清１５μＬと室温で混合し、３７℃で、１０分間、プレインキュベートし、その後、７５０μＭ Ｏ−ピバロキシメチルウンベリフェロンまたは対照緩衝液／培地２０μＬを添加することによって反応を開始させることによって反応を行った。この結果得られた反応混合物は、５３ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）と、０μｍまたは３００μｍのＯ−ピバロキシメチルウンベリフェロンを含有していた。蛍光強度は、３０〜４５秒間隔で１時間にわたって測定した（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ（登録商標）Ｇｅｍｉｎｉ ＸＳ、３７℃、λｅｘ＝３６０ｎｍ、λｅｍ＝４６０ｎｍ、ＰＭＴ感度設定「ｍｅｄｉｕｍ」、１ウェルあたり６測定）。この結果得られたプログレス曲線の勾配から反応速度を決定した。
【実施例】
【００４３】
（実施例１）
熱処理によるリパーゼ活性の低減
以下の種、すなわち、レプトスピラ・カニコーラ、レプトスピラ・イクテロヘモリジア、レプトスピラ・グリポティフォーサ、レプトスピラ・ハージョ、およびレプトスピラ・ポモナを含有する、Ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ（登録商標）で殺したレプトスピラのプールを調製して、バクテリンを形成させた。上記バクテリンの６つの試料を４℃、３７℃、４５℃、５６℃、６５℃、および８０℃で終夜（約１２時間）保存した。４℃で保存された試料を未処理の対照として用いた。３７℃、４５℃、５６℃、６５℃、および８０℃で１２時間保存された試料が加熱処理試料となった。保存の後、各バクテリンの存在下で試験基質が加水分解された速度を手順２の方法に従って測定した。試料の加水分解速度を、４℃で保存された試料の加水分解速度で割って、１００を掛けたものが、保存後に残留していた各バクテリンの元のリパーゼ活性のパーセントである。次の表は、保存の温度と、保存後に残留していた元のリパーゼ活性のパーセントとを示す。
【００４４】
【表１】
【００４５】
（実施例２）
実験用ワクチン製剤の調製
レプトスピラ・カニコーラ、レプトスピラ・イクテロヘモリジア、レプトスピラ・グリポティフォーサ、レプトスピラ・ハージョ、およびレプトスピラ・ポモナの培養物を培養した。各培養物の濁度を比濁計単位（ＮＵ）で測定した。細菌をＭｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ（登録商標）で殺して、バクテリンを形成させた。リパーゼ活性を低減するために、各バクテリンを６５℃で８時間熱処理した。これらのバクテリンを混合し、その後、このワクチンの各５ｍｌ用量が次の表に記載の成分を含有するように、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）、アジュバント、保存剤、および希釈緩衝液と混合した。
【００４６】
【表２】
【００４７】
上記製剤を、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ社製ホモジナイザーを用いてホモジナイズし、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社製のマイクロフルイダイザーを用いて顕微溶液化した。ホモジナイゼーション処理および顕微溶液化の両方に続いて、上記製剤のｐＨを７．０から７．３のｐＨに調整した。
【００４８】
（実施例３）
ハムスターおよびウシでの効力試験
標準的な実験室および宿主動物モデルを用いて、効力があるかどうか試験するために、実施例２のワクチンをハムスターおよびウシに投与した。その後、１用量のレプトスピラ・カニコーラ、レプトスピラ・イクテロヘモリジア、レプトスピラ・グリポティフォーサ、またはレプトスピラ・ポモナで、試験ハムスターを攻撃して、ワクチンの効力を試験した。効力の実証として、生存者の数を測定した。ウシにおける、上記ワクチン画分の効力を実証するために、レプトスピラ・ハージョに対する、ウシの顕微鏡的凝集力価を測定した。下の表は、熱処理されたレプトスピラバクテリンから調製されたワクチンが効力判定規準を満たす抗原性反応を産生できることを示す。
【００４９】
【表３】
【００５０】
（実施例４）
ワクチンの生理化学的試験
ワクチンは、実施例２の方法に従って、熱処理されたレプトスピラバクテリンから調製した。熱処理されていないレプトスピラバクテリンから、同様なワクチンを実施例２の方法に従って調製した。両方のワクチン製剤を４℃で６０日間保存した。新たに調製した際に、０日目および再度６０日目に、レーザ回折計を用いて各ワクチンに関する粒径分析を行った。
【００５１】
下に示すグラフは、０日目および６０日間の貯蔵の前後における各ワクチンの粒径分布を示す。
【００５２】
【表４−１】
【００５３】
【表４−２】
【００５４】
熱処理されたレプトスピラバクテリンから調製されたワクチンは、乳剤の安定性を示す粒径の維持を示す。熱処理されていないレプトスピラバクテリンから調製されたワクチンは、乳剤の分解を示す粒径増大を示す。
【００５５】
（実施例５）
殺ウイルスアッセイ
実施例２の方法に従って、熱処理されたレプトスピラバクテリン、および熱処理されていないレプトスピラバクテリンからワクチンを調製した。５から６カ月間の時間を置いた後に、ＢＨＶ−１ウイルス、ＰＩ３ウイルス、およびＢＲＳＶウイルスに対する殺ウイルス活性があるかどうか、上記ワクチンを試験した。殺ウイルス活性試験は、試験するべき、アジュバント添加された希釈液で、一価の殺ウイルスアッセイ対照（ＶＡＣ）を再水和させることによって行った。２種の一価殺ウイルスアッセイ対照をそれぞれの用量容積で再水和させた。２種の再水和された一価ＶＡＣをプールし、２０〜２５℃で２時間インキュベートした後、ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）によって生ウイルス力価を決定するために細胞上で力価測定および接種を行った。０．７ ＴＣＩＤ５０／ｍｌを超えるウイルス力価減失を有することは不満足である。
【００５６】
ウイルス力価の減失を示す殺ウイルスアッセイの結果を下の表に示す。
【００５７】
【表５】
【００５８】
熱処理されていないレプトスピラバクテリンで作製されたワクチンは、高レベルの殺ウイルス活性を示す。熱処理されたレプトスピラバクテリンによって作製されたワクチンは、殺ウイルス性ではなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱処理前のバクテリンのリパーゼ活性の５０％以下のリパーゼ活性を有する死菌の懸濁液を含む熱処理バクテリン。
【請求項２】
前記熱処理が、リパーゼ活性を有するバクテリンを約３５℃から約８０℃の温度に約２０分間から約２４時間加熱することを含む、請求項１に記載の熱処理バクテリン。
【請求項３】
前記熱処理が、リパーゼ活性を有するバクテリンを約６０℃から約７０℃の温度に約９時間から約１０時間加熱することを含む、請求項１に記載の熱処理バクテリン。
【請求項４】
前記熱処理が、リパーゼ活性を有するバクテリンを約６５℃から約７０℃の温度に約５時間から約８時間加熱することを含む、請求項１に記載の熱処理バクテリン。
【請求項５】
前記熱処理が、リパーゼ活性を有するバクテリンを約６５℃から約７０℃の温度に約１時間加熱することを含む、請求項１に記載の死菌の懸濁液を含む熱処理バクテリン。
【請求項６】
前記熱処理が、リパーゼ活性を有するバクテリンを約５５℃から約６５℃の温度に約５時間から約８時間加熱することを含む、請求項１に記載の死菌の懸濁液を含む熱処理バクテリン。
【請求項７】
前記死菌が、レプトスピラ・カニコーラ、レプトスピラ・グリポティポーサ、レプトスピラ・ハージョ、レプトスピラ・イクテロヘモリジア、およびレプトスピラ・ポモナからなる群から選択された１から５つのレプトスピラ種である、請求項２に記載の死菌の懸濁液を含む熱処理バクテリン。
【請求項８】
乳剤と、請求項２に記載の熱処理バクテリンとを含むワクチン。
【請求項９】
生ウイルスをさらに含む、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
レシチン調製物、Ｑｕｉｌ Ａ、およびコレステロールをさらに含む、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１１】
死菌ウイルスをさらに含む、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１２】
死菌ウイルスをさらに含む、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記生ウイルスが、ウシ鼻気管炎（ＩＢＲ）ウイルス、パラインフルエンザ３（ＰＩ３）ウイルス、およびウシＲＳウイルス（ＢＲＳＶ）からなる群から選択された１から３種のウイルスである、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記生ウイルスが、ウシ鼻気管炎（ＩＢＲ）ウイルス、パラインフルエンザ３（ＰＩ３）ウイルス、およびウシＲＳウイルス（ＢＲＳＶ）からなる群から選択された１から３種のウイルスである、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記死菌ウイルスが、ウシウイルス性下痢（ＢＶＤ）１型およびウシウイルス性下痢（ＢＶＤ）２型からなる群から選択された１または２種のウイルスである、請求項１４に記載のワクチン。
【請求項１６】
油調製物中のレシチン、Ｑｕｉｌ Ａ、およびコレステロールをさらに含む、請求項１５に記載のワクチン。
【請求項１７】
熱処理バクテリンを調製する方法であって、リパーゼ活性を有するバクテリンを約３５℃から約８０℃の温度に約２０分間から約２４時間加熱することを含む方法。
【請求項１８】
熱処理バクテリンを調製する方法であって、
ａ）前記バクテリンのリパーゼ活性を測定すること、
ｂ）前記バクテリンを約３５℃から約８０℃の温度に約２０分間から約２４時間加熱すること、
ｃ）熱処理の後に前記バクテリンのリパーゼ活性を測定すること、
ｄ）前記加熱前のバクテリンのリパーゼ活性を、前記加熱後のバクテリンのリパーゼ活性と比較すること、
ｅ）前記熱処理後のリパーゼ活性が、前記熱処理前のバクテリンのリパーゼ活性の５０％以下である熱処理バクテリンを選択すること
を含む方法。
【請求項１９】
前記バクテリンが、レプトスピラ・カニコーラ、レプトスピラ・グリポティポーサ、レプトスピラ・ハージョ、レプトスピラ・イクテロヘモリジア、およびレプトスピラ・ポモナからなる群から選択された１から５つの死菌レプトスピラ種の懸濁液を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記バクテリンが、レプトスピラ・カニコーラ、レプトスピラ・グリポティポーサ、レプトスピラ・ハージョ、レプトスピラ・イクテロヘモリジア、およびレプトスピラ・ポモナからなる群から選択された１から５つの死菌レプトスピラ種の懸濁液を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ａ）リパーゼ活性を有するバクテリンを形成させること、
ｂ）前記リパーゼ活性を熱処理前のレベルの５０％以下のレベルにまで低減するのに十分な時間、前記バクテリンを約３５℃から約８０℃の温度に加熱すること
によって調製された熱処理バクテリン。
【請求項２２】
前記リパーゼ活性を熱処理前のレベルの５０％以下のレベルにまで低減するのに十分な時間が約２０分間から約２４時間である、請求項２１に記載のバクテリン。
【請求項１】
熱処理前のバクテリンのリパーゼ活性の５０％以下のリパーゼ活性を有する死菌の懸濁液を含む熱処理バクテリン。
【請求項２】
前記熱処理が、リパーゼ活性を有するバクテリンを約３５℃から約８０℃の温度に約２０分間から約２４時間加熱することを含む、請求項１に記載の熱処理バクテリン。
【請求項３】
前記熱処理が、リパーゼ活性を有するバクテリンを約６０℃から約７０℃の温度に約９時間から約１０時間加熱することを含む、請求項１に記載の熱処理バクテリン。
【請求項４】
前記熱処理が、リパーゼ活性を有するバクテリンを約６５℃から約７０℃の温度に約５時間から約８時間加熱することを含む、請求項１に記載の熱処理バクテリン。
【請求項５】
前記熱処理が、リパーゼ活性を有するバクテリンを約６５℃から約７０℃の温度に約１時間加熱することを含む、請求項１に記載の死菌の懸濁液を含む熱処理バクテリン。
【請求項６】
前記熱処理が、リパーゼ活性を有するバクテリンを約５５℃から約６５℃の温度に約５時間から約８時間加熱することを含む、請求項１に記載の死菌の懸濁液を含む熱処理バクテリン。
【請求項７】
前記死菌が、レプトスピラ・カニコーラ、レプトスピラ・グリポティポーサ、レプトスピラ・ハージョ、レプトスピラ・イクテロヘモリジア、およびレプトスピラ・ポモナからなる群から選択された１から５つのレプトスピラ種である、請求項２に記載の死菌の懸濁液を含む熱処理バクテリン。
【請求項８】
乳剤と、請求項２に記載の熱処理バクテリンとを含むワクチン。
【請求項９】
生ウイルスをさらに含む、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
レシチン調製物、Ｑｕｉｌ Ａ、およびコレステロールをさらに含む、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１１】
死菌ウイルスをさらに含む、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１２】
死菌ウイルスをさらに含む、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記生ウイルスが、ウシ鼻気管炎（ＩＢＲ）ウイルス、パラインフルエンザ３（ＰＩ３）ウイルス、およびウシＲＳウイルス（ＢＲＳＶ）からなる群から選択された１から３種のウイルスである、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記生ウイルスが、ウシ鼻気管炎（ＩＢＲ）ウイルス、パラインフルエンザ３（ＰＩ３）ウイルス、およびウシＲＳウイルス（ＢＲＳＶ）からなる群から選択された１から３種のウイルスである、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記死菌ウイルスが、ウシウイルス性下痢（ＢＶＤ）１型およびウシウイルス性下痢（ＢＶＤ）２型からなる群から選択された１または２種のウイルスである、請求項１４に記載のワクチン。
【請求項１６】
油調製物中のレシチン、Ｑｕｉｌ Ａ、およびコレステロールをさらに含む、請求項１５に記載のワクチン。
【請求項１７】
熱処理バクテリンを調製する方法であって、リパーゼ活性を有するバクテリンを約３５℃から約８０℃の温度に約２０分間から約２４時間加熱することを含む方法。
【請求項１８】
熱処理バクテリンを調製する方法であって、
ａ）前記バクテリンのリパーゼ活性を測定すること、
ｂ）前記バクテリンを約３５℃から約８０℃の温度に約２０分間から約２４時間加熱すること、
ｃ）熱処理の後に前記バクテリンのリパーゼ活性を測定すること、
ｄ）前記加熱前のバクテリンのリパーゼ活性を、前記加熱後のバクテリンのリパーゼ活性と比較すること、
ｅ）前記熱処理後のリパーゼ活性が、前記熱処理前のバクテリンのリパーゼ活性の５０％以下である熱処理バクテリンを選択すること
を含む方法。
【請求項１９】
前記バクテリンが、レプトスピラ・カニコーラ、レプトスピラ・グリポティポーサ、レプトスピラ・ハージョ、レプトスピラ・イクテロヘモリジア、およびレプトスピラ・ポモナからなる群から選択された１から５つの死菌レプトスピラ種の懸濁液を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記バクテリンが、レプトスピラ・カニコーラ、レプトスピラ・グリポティポーサ、レプトスピラ・ハージョ、レプトスピラ・イクテロヘモリジア、およびレプトスピラ・ポモナからなる群から選択された１から５つの死菌レプトスピラ種の懸濁液を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ａ）リパーゼ活性を有するバクテリンを形成させること、
ｂ）前記リパーゼ活性を熱処理前のレベルの５０％以下のレベルにまで低減するのに十分な時間、前記バクテリンを約３５℃から約８０℃の温度に加熱すること
によって調製された熱処理バクテリン。
【請求項２２】
前記リパーゼ活性を熱処理前のレベルの５０％以下のレベルにまで低減するのに十分な時間が約２０分間から約２４時間である、請求項２１に記載のバクテリン。
【公表番号】特表２０１０−５０２２３８（Ｐ２０１０−５０２２３８Ａ）
【公表日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２７９０７（Ｐ２００９−５２７９０７）
【出願日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／００２５５３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３２１５８
【国際公開日】平成２０年３月２０日（２００８．３．２０）
【出願人】（３９７０６７１５２）ファイザー・プロダクツ・インク (504)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／００２５５３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３２１５８
【国際公開日】平成２０年３月２０日（２００８．３．２０）
【出願人】（３９７０６７１５２）ファイザー・プロダクツ・インク (504)
【Ｆターム（参考）】
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