環状ペンタデプシペプチドおよびそれを生産するフザリウム属微生物
【課題】新規の環状ペンタデプシペプチドを生産するフザリウム属微生物などを提供すること。
【解決手段】本発明のフザリウム属微生物が生産する環状ペンタデプシペプチドは、薬剤耐性抑制活性および癌細胞増殖抑制活性に優れるので、抗生剤耐性菌の治療および癌治療用医薬として利用できる。
【解決手段】本発明のフザリウム属微生物が生産する環状ペンタデプシペプチドは、薬剤耐性抑制活性および癌細胞増殖抑制活性に優れるので、抗生剤耐性菌の治療および癌治療用医薬として利用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬およびそれを生産する微生物に関する。本発明の医薬は、薬剤耐性抑制活性および癌細胞増殖抑制活性に優れた環状ペンタデプシペプチドであり、これは土壌由来のフザリウム属微生物から生産される。
【背景技術】
【０００２】
海洋植物に関連したフザリウム属カビは、サンサルバミド（Ｓａｎｓａｌｖａｍｉｄｅ）など、細胞毒性を有する新規の環状ペンタデプシペプチドを生産する源泉であることが明らかにされている。
【０００３】
サンサルバミドＡは、海洋微生物の一種であるＨａｌｏｄｕｌｅ ｗｒｉｇｈｔｉｉから生産されることが最初に報告された［Ｂｅｌｏｆｓｋｙ ＧＮ， Ｊｅｎｓｅｎ ＰＲ， Ｆｅｎｉｃａｌ Ｗ．（１９９９） Ｓａｎｓａｌｖａｍｉｄｅ： Ａ ｎｅｗ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｙｃｌｉｃ ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ ｍａｒｉｎｅ ｆｕｎｇｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｆｕｓａｒｉｕｍ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ４０， ２９１３−２９１６］。サンサルバミドＡは、４つの疎水性アミノ酸（フェニルアラニン、２つのロイシンおよびバリン）と１つのヒドロキシ酸（（Ｓ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ；ＯＬｅｕ）からなり、５つの立体中心（ｓｔｅｒｅｏｇｅｎｉｃ ｃｅｎｔｅｒ）が全てＳ型である。サンサルバミドＡは、米国国立癌センターの６０個の細胞株に対して顕著な増殖阻害効果を示し、トポイソメラーゼＩの阻害剤であることが解明された。サンサルバミドＡの抗癌活性は、少なくとも部分的にはトポイソメラーゼＩの阻害に関連したメカニズムによるものである。また、図１に示したサンサルバミドＡにＮ−メチル化またはｐ−臭化による同族体もサンサルバミドＡと同様にヒト膵臓癌細胞に対して顕著な細胞毒性を示すという事実は、これらの化合物が非常に優れた抗癌剤として活用できることを示唆する［Ｕｊｉｋｉ ＭＢ， Ｍｉｌａｍ Ｂ， Ｄｉｎｇ ＸＺ， Ｒｏｇｉｎｓｋｙ ＡＢ， Ｓａｌａｂａｔ ＭＲ， Ｔａｌａｍｏｎｔｉ ＭＳ， Ｂｅｌｌ ＲＨ， Ｇｕ Ｗ， Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ＲＢ， Ａｄｒｉａｎ ＴＥ．（２００６） Ａ ｎｏｖｅｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓａｎｓａｌｖａｍｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈｔｈｒｏｕｇｈ Ｇ０／Ｇ１ ｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈ． Ｒｅｓ． Ｃｏ． ３４０， １２２４−１２２８］。
【０００４】
最近では、緑藻類から分離されたフザリウム種からサンサルバミドのＮ−メチル同族体としてのＮ−メチルサンサルバミドが生産された。Ｎ−メチルサンサルバミドは、４つのアミノ酸（フェニルアラニン、ロイシン、Ｎ−メチルロイシンおよびバリン）と１つのヒドロキシ酸（ＯＬｅｕ）からなり、米国国立癌センターのヒト癌細胞株スクリーニングにおける試験管内細胞毒性が報告された［Ｃｕｅｔｏ Ｍ， Ｊｅｎｓｅｎ ＰＲ， Ｆｅｎｉｃａｌ Ｗ．（２０００） Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｓａｎｓａｌｖａｍｉｄｅ， ａ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｙｃｌｉｃ ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ａ ｍａｒｉｎｅ ｆｕｎｇｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ ＦｕｓａｒｉｕｍＰｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．５５， ２２３−２２６］。
【０００５】
多薬剤耐性（Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ＭＤＲ）は化学療法剤による成功的な癌治療の主要障害物の一つであり、最近、これを克服するための多様な生化学的、医薬学的および臨床学的試みが考案されている［Ｔｅｏｄｏｒｉ Ｅ， Ｄｅｉ Ｓ， Ｓｃａｐｅｃｃｈｉ Ｓ， Ｇｕａｌｔｉｅｒｉ Ｆ．（２００２） Ｔｈｅ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（ＭＤＲ） ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ ｄｒｕｇｓ．ＩＩ Ｆａｒｍａｃｏ ５７， ３８５−４１５］。多薬剤耐性には様々なメカニズムが関連しているが、Ｐ−糖タンパク質および多薬剤耐性関連タンパク質の過剰発現が癌細胞の多薬剤耐性の原因として示されている［Ｔｈｏｍａｓ Ｈ， Ｃｏｌｅｙ ＨＭ．（２００３） Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ： ａｎ ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ １０， １５９−１６５； Ｐｅｒｅｚ−Ｔｏｍａｓ Ｒ．（２００６） Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ： ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｉｎ ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ． Ｃｕｒｒ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １３， １８５９−１８７６］。
サンサルバミドＡは、プロテアーゼ耐性および細胞膜透過性を有する親脂性の環状デプシペプチドであって、他の薬剤に比べて経口投与が容易であり且つ４つのアミノ酸および１つのヒドロキシ酸が結合しているコア構造は、結合の回転が制限されてさらに硬い配列を形成するので、生体内における親和性に優れるうえ、半減期が長いという利点がある。
【０００６】
このような構造的な利点とサンサルバビドＡまたはＮ−メチル酸サンサルバミドが有する癌細胞に対する細胞毒性を癌治療に用いるために、これまでこれらを変形させた数多くの同族体が有機合成されたが、本発明で分離された環状ペンタデプシペプチドに対しては報告されたことがなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、新規の環状ペンタデプシペプチドを生産するフザリウム属菌株を提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、フザリウム属菌株を培養して新規の環状ペンタデプシペプチドを生産する方法を提供することにある。
【０００９】
本発明の別の目的は、新規の環状ペンタデプシペプチドを提供することにある。
【００１０】
本発明の別の目的は、薬剤耐性抑制用薬学組成物を提供することにある。
【００１１】
本発明の別の目的は、癌治療用薬学組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、新規の化合物である下記化学式１の環状ペンタデプシペプチドまたは下記化学式２の環状ペンタデプシペプチドを生産するフザリウム属菌株を提供する。
【化１】
化学式１
【化２】
化学式２
【００１３】
前記化学式１および前記化学式２の環状ペンタデプシペプチドは、従来報告されたサンサルバミドＡおよびＮ−メチルサンサルバミドと構成アミノ酸およびヒドロキシ酸の結合順序に差異がある１５員環原子の環状ペンタデプシペプチドであって、新規化合物として判明された。また、図１に例示したように、従来のサンサルバミドＡのコア構造を用いて有機合成された多様な同族体は、フェニルアラニンのベンゼン環の臭化またはロイシンまたはバリンのＮ−メチル化による細胞毒性の増大のみを念頭に入れたばかりで、構成アミノサンおよびヒドロキシ酸の結合順序を変更した試みは報告されたことがない。ひいては、人為的な有機合成によって構成アミノサンおよびヒドロキシ酸の結合順序を変更しようとする場合には、コア構造に含まれたヒドロキシ酸（（Ｓ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ；ＯＬｅｕ）とフェニルアラニン間のエステル結合が破壊されるという問題がある。
【００１４】
化学式１および化学式２の環状ペントデプシペプチドは、サンサルバミドＡおよびＮ−メチル酸サンサルバミドと４つの構成アミノ酸および１つのヒドロキシ酸の結合順序が異なる新規の環状ペンタデプシペプチドであって、多様な癌細胞株に対してサンサルバミドＡと同等水準の細胞毒性を示す。特に化学式１および化学式２の環状ペプタデプシペプチドは、サンサルバミドＡ、Ｎ−メチルサンサルバミドおよびこれらを基本環構造として用いて有機合成された同族体において報告されたことのない細胞の薬剤耐性の抑制活性を有する。好ましくは化学式１の環状ペンタデプシペプチドにおいて薬剤耐性抑制活性に優れる。本発明において、薬剤耐性の抑制活性とは、化学療法剤に細胞が露出される場合、構造的に関連のない多数の薬剤に対して耐性を有する細胞が発生するが、このような薬剤耐性の発生を抑制し或いは薬剤に対する敏感性を維持させる場合は勿論のこと、既に薬剤耐性を有する細胞の薬剤に対する敏感性を増加または回復させる活性の意味としても使用される。
【００１５】
したがって、本発明の化学式１および化学式２の環状ペンタデプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩は、薬剤耐性を有する細胞を治療し、薬剤耐性の発現を抑制し、特に多薬剤耐性癌の治療に特に適切に使用できる。
【００１６】
好ましくは、本発明の化学式１、化学式２の環状ペンタデプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩は、従来知られている薬剤耐性抑制剤、すなわちサイクロスポリンおよびその類似体、フェノチアジン、チオキサンテン誘導体（ｔｈｉｏｘａｎｔｈｅｎｅｓ）、ベラパミルなどと組み合わせて使用できる。
【００１７】
また、好ましくは、本発明の化学式１、化学式２の環状ペンタデプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩は、抗癌剤、すなわち標準化学療法剤と組み合わせて腫瘍の治療に使用でき、特に好ましくは先天的にまたは後天的に薬剤に耐性がある腫瘍の治療に使用できる。
【００１８】
本発明は、化学式１または化学式２の環状ペンタデプシペプチドを生産するフザリウム属菌株を提供する。前記フザリウム属菌株はフザリウムソラニであることを特徴とする。前記フザリウムソラニはフザリウムソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）ＫＣＣＭ９００４０［寄託番号：ＫＣＣＭ１０８８１Ｐ］であることを特徴とする。
【００１９】
本発明は、前記菌株を培養して化学式１または化学式２の環状ペンタデプシペプチドを生産する方法を提供する。前記培養は、穀類を用いた固体培養であることを特徴とする。前記穀類は、米、小麦、トウモロコシ、ライ麦、唐黍、大麦などを少なくとも１種用いることができ、好ましくは米、小麦、トウモロコシ、ライ麦、さらに好ましくは米または小麦、最も好ましくは米を用いる。
【００２０】
サンサルバミドは、海水基材培地（ｓｅａｗａｔｅｒ−ｂａｓｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）で海洋フザリウム菌株を培養したときに０．６４２ｇ／１７Ｌ生産されるものと報告された［Ｂｅｌｏｆｓｋｙ ＧＮ， Ｊｅｎｓｅｎ ＰＲ， Ｆｅｎｉｃａｌ Ｗ．（１９９９） Ｓａｎｓａｌｖａｍｉｄｅ： Ａ ｎｅｗ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｙｃｌｉｃ ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ ｍａｒｉｎｅ ｆｕｎｇｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｆｕｓａｒｉｕｍ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ４０， ２９１３−２９１６］。また、Ｎ−メチルサンサルバミドは、海水基材培地でフザリウムＣＮＬ−６１９菌株を培養したときに３．１ｍｇ／Ｌ生産されるものと報告された［Ｃｕｅｔｏ Ｍ， Ｊｅｎｓｅｎ ＰＲ， Ｆｅｎｉｃａｌ Ｗ．（２０００） Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｓａｎｓａｌｖａｍｉｄｅ， ａ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｙｃｌｉｃ ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ａ ｍａｒｉｎｅ ｆｕｎｇｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ ＦｕｓａｒｉｕｍＰｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ５５， ２２３−２２６］。
【００２１】
上述したようにサンサルバミドまたはＮ−メチルサンサルバミドは、海洋由来フザリウムから生産されるものである。サンサルバミドまたはＮ−メチルサンサルバミドの生産のために海水基材培地が用いられる。単位培地当たり生産量が極めて低かったが、本発明のフザリウム菌株は、土壌に由来した菌株であって、穀類を用いた固体培養によって高濃度で化学式１または化学式２の化合物を生産する。
【００２２】
前記培養に用いられる穀類は、好ましくは米であり、化学式１および化学式２の化合物を生産するのに適した培養条件は、温度２０〜３０℃、湿度２０〜５０％、培養期間１０〜２０日であり、最適条件は２５．８４℃、湿度３７．９９％、培養期間１６．０３日である。
【００２３】
韓国ムンキョンのジャガイモから環状デプシペプチド生産菌株を分離した。分離された菌株はフザリウムソラニと同定された。前記菌株はフザリウムソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）ＫＣＣＭ９００４０と命名し、韓国微生物保存センターに２００８年１月１５日に寄託番号ＫＣＣＭ１０８８１Ｐでブダペスト条約に基づいて国際寄託した。
【００２４】
前記菌株は化学式１の環状ペンタデプシペプチドおよび化学式２の環状ペンタデプシペプチドを生産した。化学式１および２の環状ペンタデプシペプチドは、従来報告されたＮ−メチルサンサルバミドとは構成アミノ酸およびヒドロキシ酸の結合順序が異なる１５員環原子の環状ペンタデプシペプチドであって、新規化合物と判明された。
【００２５】
本発明の化学式１の環状ペンタデプシペプチド、化学式２の環状デプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩は、細胞の薬剤耐性抑制用薬学組成物の有効成分として利用できる。前記細胞は腫瘍細胞または抗生剤耐性菌である。
【００２６】
また、本発明の化学式１の環状ペンタデプシペプチド、化学式２の環状デプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩は、腫瘍細胞増殖抑制活性を有する癌治療用薬学組成物の有効成分として利用できる。
【００２７】
薬学的に許容される塩とは、塩基化合物の無毒性有機または無機酸付加塩を意味する。適切な塩を形成する無機酸の例としては塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸および酸金属塩（例えば、オルトリン酸一水素ナトリウムおよび硫酸水素カリウム）がある。適切な塩を形成する有機酸の例としてはモノ−、ジ−およびトリカルボン酸がある。このような酸の例としては酢酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、桂皮酸、サリチル酸および２−フェノキシ安息香酸がある。その他に、適切な塩を形成する有機酸としてはメタンスルホン酸および２−ヒドロキシエタンスルホン酸などのスルホン酸がある。これらの塩および塩基化合物は、水和された形態またはほぼ無水物の形態で存在しうる。酸性塩は、水溶液またはアルコール水溶液または適当な酸を含有する他の適した溶媒中に遊離塩基を溶解させ、溶液を蒸発させて単離させる方法、または有機溶媒中で遊離塩基を反応させる方法（この場合、塩は直接分離されるか、或いは溶液を濃縮させて得られる）などの通常の技術によって製造される。一般に、本発明に係る化合物の酸付加塩は水および各種親水性有機溶媒に溶解される結晶性物質であって、これはこれらの遊離塩基形態に比べて融点および溶解度がさらに高い。
【００２８】
本明細書において、「患者」とは、ヒトを含む霊長類と塩素、馬、牛、豚、犬、猫、ラットおよびマウスなどの哺乳動物を意味する。
【００２９】
化学式１の環状ペンタデプシペプチド、化学式２の環状デプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩の投与量は、使用される特定の投薬単位、治療期間、患者の年齢および性別、治療する腫瘍の特性および薬剤耐性度に応じて幅広く可変する。
【００３０】
化学式１の環状ペンタデプシペプチド、化学式２の環状デプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩は、腫瘍の治療に有用なものと知られている他の抗癌剤、特に化学療法剤と併用して使用される。薬剤耐性を反転させるための化学式１の環状ペンタデプシペプチド、化学式２の環状デプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩の有効量は、一般に約１５ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲である。単位投与量は２５〜５００ｍｇの化学式１の環状ペプタデプシペプチド、化学式２の環状デプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩を含有することができ、毎日１回以上にわたって投与できる。化学式１の環状ペプタデプシペプチド、化学式２の環状デプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩は、通常の投薬単位形態で製薬学的担体と共に経口または非経口投与できる。
【００３１】
本発明の化学式１の環状ペンタデプシペプチド、化学式２の環状デプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩を用いた腫瘍の治療には、腫瘍抑制に有効な容量の抗癌剤、特に化学療法剤を化学式１の環状ペンタデプシペプチド、化学式２の環状デプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩と共に投与しなければならない。
【００３２】
本発明の方法によって治療できる腫瘍としては、陽性および悪性腫瘍または新生物のみならず、黒色腫、リンパ腫、白血病および肉腫を挙げることができる。このような腫瘍の例としては皮膚腫瘍（例えば、悪性黒色腫および菌状息肉腫）、白血病などの血液腫瘍（例えば、急性リンパ球白血病、急性または慢性骨髄白血病）、リンパ腫（例えば、ホジキン病または悪性リンパ腫）、婦人科腫瘍（例えば、卵巣腫瘍および子宮腫瘍）、泌尿器腫瘍（例えば、前立腺腫瘍、膀胱または睾丸腫瘍）、軟組織肉腫、骨性または非骨性肉腫、乳房腫瘍、脳下垂体腫瘍、甲状腺腫瘍、副腎皮質腫瘍、胃腸腫瘍（例えば、食道腫瘍、胃腫瘍、腸腫瘍および結腸腫瘍）、膵臓腫瘍、肝腫瘍、喉頭腫瘍、乳頭腫および肺腫瘍がある。勿論、典型的に多薬剤耐性があり或いは多薬剤耐性を持つことになる腫瘍が本発明の方法によって最も効果的に治療される。このような腫瘍には結腸腫瘍、肺腫瘍、胃腫瘍および肝腫瘍がある。
【００３３】
化学式１の環状ペンタデプシペプチド、化学式２の環状デプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩と共に使用される化学療法剤には、腫瘍の治療に通常用いられる細胞毒素剤がある。化学療法剤の例としては、シクロホスファミド、メトトレキサート、プレドニゾン、６−メルカプトプリン、プロカルバジン、ジウノルビシン、ダウノルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、クロラムブシル、シトシン、アラビノシド、６−チオグアニン、チオＴＥＰＡ、５−フルオロウラシル、５−フルオロ−２−デオキシウリジン、５−アザシチジン、ナイトロジェンマスタード、１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソウレア（ＢＣＮＵ）、（１−（２−クロロエチル）−３−シクロヘキシル−１−ニトロソウレア）（ＣＣＮＵ）、ブスルファン、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンデシン、シクロロイシン、またはメチルグリオキサルビス（グアニルヒドラゾン）（すなわち、ＭＧＢＧ）などがある。本発明の方法に用いられる化学療法剤の有効量は、患者、腫瘍組織の形態および大きさ、並びに使用される特定化学療法剤などの要因によって左右され、幅広く可変する。その量は効果のある任意量であり、当業界における熟練者はその量を容易に決定することができる。一般に化学療法剤が単独で投与されるときに比べて、化学療法剤が化学式１の環状ペンタデプシペプチド、化学式２の環状デプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩と共に投与されるときに少量で必要である。その主な理由は、化学療法剤を多量添加して薬剤耐性の問題を起こす必要がないためである。勿論、化学療法剤の混合物を使用することができ、手術による切除または放射線治療などの補助手段も腫瘍治療に有用である。上述では、化学式１の環状デプシペプチドまたはその塩および化学療法剤が共に投与されるものと記載したが、これらが同じ投薬形態で製剤されるか或いは同時投与されることを必ずしも意味するのではない。ここで、「共に」という表現は、化学式１の環状ペンタデプシペプチド、化学式２の環状デプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩および化学療法剤が、混合された投薬形態で投与されるか或いは治療過程中に分けられて投与されることを意味する。
【００３４】
好ましい投与経路は経口投与である。経口投与用化学式１の環状ペンタデプシペプチド、化学式２の環状デプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩は、固状または液状製剤、例えばカプセル剤、丸薬、錠剤、トローチ剤、ローゼンジ、メルト剤、粉剤、液剤、懸濁液剤または乳剤に剤形化できる。固状単位投与剤形は、通常の硬質または軟質ゼラチン外皮形態で構成できるカプセルを挙げることができる。このカプセルは、例えば界面活性剤、潤滑剤、および例えばラクトース、スクロース、リン酸カルシウムおよびコーンスターチなどの不活性充填剤を含有する。別の実施態様において、本発明の化合物は、通常の錠剤ベース（例えば、ラクトース、スクロースおよびコーンスターチ）を結合剤（例えば、アカシア、コーンスターチまたはゼラチン）、投与後の錠剤の分解および溶解を助けるための崩解剤（例えば、ジャガイモ澱粉、アルギン酸、コーンスターチおよびグアーガム）、精製顆粒の流出を向上させ且つ打錠用ダイおよびパンチの表面に錠剤の薬物が接着されることを防止するための潤滑剤（例えば、タルク、ステアリン酸またはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムまたはステアリン酸亜鉛）、錠剤の美的特性を向上させ且つ患者にさらに適するようにするための染料、着色剤および風味剤と共に混合させて錠剤に剤形化できる。経口用液状投与剤形に有用な適切な賦形剤には、製薬上許容される界面活性剤、懸濁剤または乳剤を添加しており或いは添加していない水およびアルコール（例えば、エタノール、ベンジルアルコールおよびポリエチレンアルコール）などの希釈剤が含まれる。
【００３５】
また、本発明の化学式１の環状ペンタデプシペプチド、化学式２の環状デプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩は、製薬学的担体と共に生理学的に許容される希釈剤に溶解させた注射剤として非経口経路、すなわち皮下、静脈内、筋肉内または腹膜内に投与できる。前記担体としては、製薬上許容される界面活性剤（例えば、石鹸または洗剤）、懸濁剤（例えば、ぺプチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロース）または乳化剤および他の製薬学的補助剤を添加しており或いは添加していない水、塩水、デキストロースおよびその類似糖水溶液、アルコール（例えば、エタノール、イソプロパノールまたはヘキサデシルアルコール）、グリコール（例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）、グリセロールケタール（例えば、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール）、エーテル（例えば、ポリ（エチレン−グリコール）４００）、オイル、脂肪酸、脂肪酸エステルまたはグリセリドまたはアセチル化脂肪酸グリセリドなどの無菌液または混合液を使用できる。本発明の非経口剤形に使用できるオイルの例には、石油、動物性油、例えば落花生油、大豆油、ゴマ油、棉花油、トウモロコシ油、オリーブ油などの植物性油または合成油、鉱油および無機油がある。適当な脂肪酸にはオレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルがある。適当な界面活性剤には脂肪酸アルカリ金属塩、アンモニウム塩およびトリエタノールアミン塩があり、適当な洗剤には陽イオン性洗剤（例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハライド、アルキルピリジニウムハライドおよびアルキルアミンアセテート）、陰イオン性洗剤（例えば、アルキル、アリールおよびオレフィンスルホネート、アルキル、オレフィン、エーテルおよびモノグリセリドスルフェートおよびスルホスクシネート）、非イオン性洗剤（例えば、脂肪アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミドおよびポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマー）、陽性洗剤（例えば、アルキル−β−アミノプロピオネートおよび２−アルキルイミダゾリン４級アンモニウム塩）、およびその混合物が含まれる。通常、本発明の非経口組成物は、化学式１の環状ペンタデプシペプチド、化学式２の環状デプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩を溶液の約０．５〜約２５重量％で含有する。また、防腐剤および緩衝剤を使用することが有利でありうる。注射部位の刺激を減少または除去するために、前記組成物は、約１２〜１７の親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）値を有する非イオン性界面活性剤を含有することができる。このような組成物中の界面活性剤の量は約５〜約１５重量％の範囲である。界面活性剤は、前記ＨＬＢを有する単一成分、或いは所望のＨＬＢを有する２種以上の成分の混合物であってもよい。非経口組成物に使用された界面活性剤の例は、ポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、例えばソルビタンモノオレートおよびプロピレンオキシドとプロピレングリコールの縮合によって形成された疎水性塩基を有する酸化エチレンの高分子量付加物である。
【００３６】
本発明の化学式１または化学式２の環状ペンタデプシペプチドを生産するためには、フザリウム属菌株、好ましくはフザリウムソラニ、さらに好ましくはフザリウムソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）ＫＣＣＭ９００４０［寄託番号：ＫＣＣＭ１０８８１Ｐ］を培養する方法、生合成または有機合成を用いた合成法のいずれも利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１はサンサルバミドＡ同族体の化学構造を示す。
【図２】図２は本発明の菌株の小型分生子を示す写真である。
【図３】図３は本発明の菌株の分生子柄を示す写真である。
【図４】図４は本発明の菌株の斜面培養による表面と裏面の様子を示す写真である。
【図５】図５はフザリウム菌株を確認するためのフザリウム特異プライマーを用いたＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電気泳動写真である。Ｍは１００ｂｐ単位からなるＤＮＡマーカーを示し、Ｆは本発明の菌株のＰＣＲ増幅産物を示し、Ｓ−１およびＳ−２はそれぞれフザリウムモニリフォルメＮＲＲＬ１３５６９およびフザリウムオキシスポラムＫＴＣＣ１６９０９の増幅産物を示す。
【図６】図６は本発明の菌株（サンプル）のフザリウムソラニのＩＴＳ−５．８ｒＤＮＡ配列の相同性を比較したものである。
【図７】図７は本発明の菌株をフザリウム制限培地で浸漬培養した後、培養液から抽出した抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図８】図８は本発明の菌株を穀類培地で固体培養した後、培養液から抽出した抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図９】図９は本発明の菌株から生産された化合物Ａのエレクトロスプレイイオン化質量分析器を用いて分子量を測定した結果である。
【図１０】図１０は本発明の菌株から生産された化合物Ｂのエレクトロスプレイイオン化質量分析器を用いて分子量を測定した結果である。
【図１１】図１１は化合物ＡのＦＴ ＩＲ−８４００Ｓ赤外線分光器で測定したＩＲスペクトルである。
【図１２】図１２は化合物ＡのＨＭＢＣ相関関係データを分析したものである。
【図１３】図１３は化合物ＢのＦＴ ＩＲ−８４００Ｓ赤外線分光器で測定したＩＲスペクトルである。
【図１４】図１４は化合物ＢのＨＭＢＣ相関関係データを分析したものである。
【図１５】図１５は化合物Ａに含まれたアミノ酸の立体化学構造を確認するためのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１６】図１６は化合物Ｂに含まれたアミノ酸の立体化学構造を確認するためのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１７】図１７は多薬剤耐性のない癌細胞株に対する化学式１の化合物の細胞毒性を示すグラフである。
【図１８】図１８は多薬剤耐性を持つ癌細胞株に対する化学式１の化合物の細胞毒性を示すグラフである。
【図１９】図１９は多薬剤耐性のない癌細胞株に対する化学式２の化合物の細胞毒性を示すグラフである。
【図２０】図２０は多薬剤耐性を持つ癌細胞株に対する化学式２の化合物の細胞毒性を示すグラフである。
【図２１】図２１は化学式１および化学式２の化合物のＨＣＴ１５細胞株に対する多薬剤耐性抑制活性を示すグラフである。
【図２２】図２２は化学式１および化学式２の化合物のＨＣＴ１５／ＣＬ０２に対する多薬剤耐性抑制活性を示すグラフである。
【図２３】図２３は化学式１および化学式２の化合物のＭＥＡ−ＳＡ細胞株に対する多薬剤耐性抑制活性を示すグラフである。
【図２４】図２４は化学式１および化学式２の化合物のＭＥＡ−ＳＡ／ＤＸ５細胞株に対する多薬剤耐性抑制活性を示すグラフである。
【図２５】図２５は化学式１および２の化合物の１０ｍＭ濃度におけるムコールルキシー（Ｍｕｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ）に対する抗カビ活性を示す写真である。
【図２６】図２６は化学式１および２の化合物の１０ｍＭ濃度におけるフザリウムオキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）に対する抗カビ活性を示す写真である。
【図２７】図２７は６つの相異なる固体穀類培地で培養したときの培養期間による化学式１の化合物の生産量を示すグラフである。
【図２８】図２８は６つの相異なる固体穀類培地で培養したときの培養期間による化学式２の化合物の生産量を示すグラフである。
【図２９】図２９は化学式１および２の化合物の生産のための培養条件を示すもので、培養期間による生産量の変化を示すグラフである。
【図３０】図３０は化学式１および２の化合物の生産のための培養条件を示すもので、温度による生産量の変化を示すグラフである。
【図３１】図３１は化学式１および２の化合物の生産のための培養条件を示すもので、湿度による生産量の変化を示すグラフである。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例および実験例によって詳細に説明する。但し、下記実施例および実験例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。
【００３９】
実施例１：菌株の分離および同定
（１）分離および形態学的同定
韓国ムンキョウのジャガイモから、環状デプシペプチドを生産するフザリウム属菌株を分離した。分離された菌株はＳａｍｓｏｎ等およびＮｅｌｓｏｎ等の方法で同定した［Ｓａｍｓｏｎ ＲＡ， Ｈｏｅｋｓｔｒａ ＥＳ， Ｏｏｒｓｃｈｏｔ Ｖ， Ｃｏｎｎｉｅ ＡＮ．（１９８１） Ｉｎｔｒｏｄｕｔｉｏｎ ｔｏ ｆｏｏｄ−ｂｏｒｎｅ ｆｕｎｇｉ． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ａｎｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｂｙ Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ； Ｎｅｌｓｏｎ ＰＥ， Ｔｏｕｓｓｏｕｎ ＴＡ， Ｍａｒａｓａｓ ＷＦ．（１９８３） Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ： Ａｎ ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ． Ｐｒｅｓｓ］。
【００４０】
分離されたフザリウム属菌株はＣＬＡ（ｃａｒｎａｔｉｏｎ ｌｅａｆ ａｇａｒ）およびＲＰＤＡ（ｒｅａｌ ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｇａｒ）で形態学的特性を調査した。
【００４１】
小型分生子は、多量で存在し、一般に単細胞であって、卵型から腎臓型であった（図２）。分生子柄は図３のように枝を伸びていた。フザリウムソラニの小型分生子および分生子柄は、フザリウムオキシスポラムで発見されたものと類似である。但し、フザリウムオキシスポラムの小型分生子はソラニのものに比べてさらに大きくて厚い細胞壁を持っており、その分生子病は短いモノフィアライド（ｍｏｎｏｐｈｉａｌｉｄｅ）を形成している（Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８３）。分離されたフザリウム属菌株の成長は速く、斜面培養の表面は白色菌糸体で大部分覆われており、その裏面は暗いクリーム形態であった（図４）。
このような形態学的特性によって分離されたフザリウム属菌株はフザリウムソラニと同定された。
【００４２】
（２）分子生物学的同定
Ａ．ＤＮＡ抽出
本発明の分離されたフザリウムソラニ菌株の全体ゲノムＤＮＡをポテトデキストロースアガ培地で育てた菌糸体からＣｏｒｒｅｌｌ等の方法で抽出した［Ｃｏｒｒｅｌｌ ＪＣ， Ｋｌｉｔｔｉｃｈ ＣＪＲ， Ｌｅｓｌｉｅ ＪＦ．（１９８７） Ｎｉｔｒａｔｅ ｎｏｎｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ｉｎ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｓ． Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ７７， １６４０−１６４６］。
【００４３】
本発明のフザリウムソラニ菌株を培養して、菌糸の覆われている培地に液体窒素を充填した後、常温で液体窒素を蒸発させる。液体窒素が蒸発した後、もう１回入れて前記過程を繰返し行う。液体窒素が全て蒸発した後、６５℃の溶菌液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、３％ ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ）、１％２−メルカプトエタノールおよび０．１ ｍ／ｍＬのプロテイナーゼＫ］を添加し、しかる後に、６５℃で１時間反応させる。反応の後、０．５ｍＬのフェノール溶液を入れて穏やかに振とうした後、８０００ｒｐｍの速度で５分間遠心分離してフェノール層と水溶液層を分離する。水溶液層を丁寧に他のチューブに移した後、水溶液層に残っているフェノール層を除去するために、クロロホルムおよびイソアミルアルコールが２４：１の比率で混ざっている溶液０．４ｍＬを入れて振とうした後、遠心分離して水溶液層を新しいチューブに移す。ここに０．０５ｍＬの７．５Ｍ酢酸アンモニウム溶液を入れてて丁寧に混ぜる。その後、−２０℃の９５％エタノールを０．８８ｍＬ入れた後、１３０００ｒｐｍの速度で２０分間遠心分離してＤＮＡを沈殿させる。上澄み液を捨て、７０％エタノールを入れてＤＮＡを洗浄し、さらに遠心分離してＤＮＡを沈殿させて７０％エタノールを捨て、ＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を入れて保管する。
【００４４】
Ｂ．ＤＮＡ電気泳動および相同性を用いた同定
Ｈｕｅ等により提案されたフザリウム特異プライマーである、配列番号１のＰ２８ＳＬ（５’−ＡＣＡ ＡＡＴ ＴＡＣ ＡＡＣ ＴＣＧ ＧＧＣ ＣＣＧ ＡＧＡ−３’）と配列番号２のＰ５８ＳＬ（５’−ＡＧＴ ＡＴＴ ＣＴＧ ＧＣＧ ＧＧＣ ＡＴＧ ＣＣＴ ＧＴ−３’）を用いた対照群ＰＣＲ分析が利用された［Ｈｕｅ， Ｆ．Ｘ．， Ｍ．Ｈｕｅｒｒｅ， Ｍ．Ａ． Ｒｏｕｆｆａｕｌｔ， ａｎｄ Ｃ．Ｄ． Ｂｉｅｖｒｅ． Ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅｓ ｂｙ ａ ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ３７： ２４３４−２４３８． １９９９］。前記フザリウム特異プライマー対は、ＰＣＲによってフザリウム属菌株のｒＤＮＡをコードする遺伝子の断片を増幅させる。前記Ｐ２８ＳＬおよびＰ５８ＳＬプライマー対の結合部位はｒＤＮＡのＩＴＳ２および５．８Ｓと２８Ｓ部分であって、フザリウム菌株で保存される部分である。
【００４５】
前記Ａ．で抽出した１ｎｇのＤＮＡ、前記Ｐ２８ＳＬおよびＰ５８ＳＬプライマー対、並びにプロメガより購入したＰＣＲプリミクスチャー（ｐｒｅ−ｍｉｘｔｕｒｅ）を使用した。初期変性は９４℃で１０分間反応させた。その後、９４℃１分間変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）、６０℃で１分間アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、７２℃で１分間伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）反応を１サイクルとして、ＰＣＲを４０サイクル繰返し行い、ＤＮＡ断片を増幅した。増幅の後、最終伸長を７２℃で１０分間反応させた。
【００４６】
前記ＰＣＲ反応産物は２％アガロースゲルを製造してＴｒｉｓ−アセテート−ＥＤＴＡ（Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ−ＥＤＴＡ）緩衝液で電気泳動した。電気泳動が済んだ後、臭化エチジウム（ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）溶液に入れて染色し、染色されたゲルを紫外線に照らすと、増幅されたバンドを確認することができた。
【００４７】
本発明のフザリウム菌株のＰＣＲ増幅産物（Ｆ）は、対照群として使用されたフザリウムモニリフォルメＮＲＲＬ１３５６９（Ｓ−２）およびフザリウムオキシスポラムＫＴＣＣ１６９０９（Ｓ−１）と同様に、３００〜４００ｂｐのＤＮＡ断片サイズを示した（図５）。
本発明のフザリウム菌株のＰＣＲ増幅産物を精製した後、マクロジェン（韓国）でその配列を分析し、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのＢＬＡＳＴ検索によって相同性を調査した。本発明のフザリウム菌株のＩＴＳ−５．８ｒＤＮＡ配列は配列番号３に示した。本発明のフザリウム菌株のＩＴＳ−５．８ｒＤＮＡ配列はフザリウムソラニのものと９８％以上の相同性を示した（図６）。
【００４８】
よって、本発明の菌株はフザリウムソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）ＫＣＣＭ９００４０と命名し、韓国微生物保存センターに２００８年１月１５日に寄託番号ＫＣＣＭ１０８８１Ｐでブダペスト条約に基づいて国際寄託した。
【００４９】
実施例２：環状デプシペプチドの生産および分離
（１）フザリウム制限培地ブロスにおける培養
１×１０５ｓｐｏｒｅ／ｍＬのフザリウムソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）ＫＣＣＭ９００４０をフザリウム制限培地ブロス（ＦＤＭ ｂｒｏｔｈ；リットル当り２５ｇのスクロース、４．２５ｇのＮａＮＯ３、５ｇのＮａＣｌ、２．５ｇのＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ、１．３６ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．０１ｇのＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ、および０．００２９ｇのＺｎＳＯ４７Ｈ２Ｏ）１００ｍＬに接種して２５℃で７日間培養した。
【００５０】
（２）穀類培地における培養
１×１０５ｓｐｏｒｅ／ｍＬのフザリウムソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）ＫＣＣＭ９００４０を、５０ｇの米を滅菌蒸留水で４０重量％の水分含量に調整した米培地に接種して２５℃で７日間培養した。
【００５１】
（３）培養物からの環状デプシペプチドの抽出
前記（１）の菌糸体を含んでいる培養液に、培養液の２倍に相当するクロロホルムを入れて激烈に振とうした後、下層のクロロホルム層を取り、これを乾燥させた後、メタノールでさらに溶解させた。
前記（２）のフザリウムが培養された穀類培地は１２時間常温で乾燥させる。乾燥した菌糸体は、均質にした後、アセトニトリル：メタノール：水を１６：３：１の体積比で混合した溶媒７５ｍＬで一晩抽出し、しかる後に、滅菌濾過紙で濾過した。濾液は２５ｍＬのｎ−ヘプタンで２回脂肪を除去し、下層を乾燥させた後、さらにメタノール：水を５５：４５の体積比で混合した溶媒５０ｍＬに溶解させ、４５ｍＬの二塩化メタンで２回抽出した。二塩化メタン層を乾燥させた後、メタノールでさらに溶解させた。
【００５２】
（４）抽出物からの環状デプシペプチドの分離
前記（１）および（２）の培養物から製造された（３）の抽出物それぞれを、シセイドパックＣ１８カラム（０．４６×２５ｃｍ）［資生党、日本］を用いて、アセトニトリル：水を７０：３０の体積比で混合した溶液とともに分当り１ｍＬの流速で４０分間溶出させた。ピークは２１０ｎｍで検出された。
【００５３】
前記（１）のフザリウム制限培地ブロスから抽出した抽出液に対しては２次代謝産物を確認することができなかった（図７）。ところが、前記（２）の穀類培地から抽出した抽出液では９．７分と１３．４分にそれぞれピークを確認することができた（図８）。図６において、９．７分に溶出した化合物は化合物Ａと命名し、１３．４分に溶出した化合物は化合物Ｂと命名して区分した。
【００５４】
Ｇｒｏｍ−ｓｉｌ ｐａｃｋ ＯＤＳ ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｕｍｎ（１．０×２５ｃｍ）を用いて、アセトニトリル：水を６５：３５の体積比で混合した溶液を分当り３ｍＬの流速にして前記化合物ＡおよびＢを分離し、これらの化合物それぞれを、さらにシセイドパックＣ１８カラムを用いて、アセトニトリル：水を７０：３０の体積比で混合した溶液とともに分当り１ｍＬの流速で精製した。
【００５５】
（５）分子量の確認
前記（４）の化合物ＡおよびＢはエレクトロスプレイイオン化質量分析器（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＥＳＩ−ＭＳ）を用いて分子量を測定した結果、その分子量はそれぞれ５８６．３６および６００．３６ｍ／ｚであることを確認することができた（図９および図１０）。
化合物ＡおよびＢは、既存に報告された環状デプシペプチドの分子量と非常に類似であった。報告された化合物の由来、分子量および文献をまとめて表１に示した。
【００５６】
【表１】
Ｓｏｎｇ等（２００６）：Ｓｏｎｇ ＨＨ， Ａｈｎ ＪＨ， Ｌｉｍ ＹＨ， Ｌｅｅ Ｃ， （２００６） Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｅａｕｖｅｒｉｃｉｎ ａｎｄ ｕｎｕｓｕａｌ ｅｎｎｉａｔｉｎｓ ｃｏ−ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ＦＢ１５０１ （ＫＦＣＣ １１３６３Ｐ）． Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６， １１１１１１１９
Ｂｅｌｏｆｓｋｙ等（１９９９）：Ｂｅｌｏｆｓｋｙ ＧＮ， Ｊｅｎｓｅｎ ＰＲ， Ｆｅｎｉｃａｌ Ｗ． （１９９９） Ｓａｎｓａｌｖａｍｉｄｅ： Ａ ｎｅｗ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｙｃｌｉｃ ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ ｍａｒｉｎｅ ｆｕｎｇｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｆｕｓａｒｉｕｍ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ４０， ２９１３−２９１６
Ｃｕｅｔｏ等（２０００）： Ｃｕｅｔｏ Ｍ， Ｊｅｎｓｅｎ ＰＲ， Ｆｅｎｉｃａｌ Ｗ． （２０００） Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｓａｎｓａｌｖａｍｉｄｅ， ａ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｙｃｌｉｃ ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ａ ｍａｒｉｎｅ ｆｕｎｇｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｆｕｓａｒｉｕｍ． Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ５５， ２２３−２２６
Ｏｈ等（２００６）：Ｏｈ ＤＣ， Ｊｅｎｓｅｎ ＰＲ， Ｆｅｎｉｃａｌ Ｗ． （２００６） Ｚｙｇｏｓｐｏｒａｍｉｄｅ， ａ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｙｃｌｉｃ ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍａｒｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｕｎｇｕｓ Ｚｙｇｏｓｐｏｒｉｕｍ ｍａｓｏｎｉｉ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ４７， ８６２５−８６２８
【００５７】
実施例３：環状デプシペプチドの構造分析
（Ａ）化合物Ａ
化合物Ａの機能基確認のためにＦＴ ＩＲ−８４００Ｓ赤外線分光器（ＳＨＩＭＡＤＺＵ、日本）を用いた。化合物ＡはＩＲ分析の結果、アミド結合（１６５４．４２ｃｍ−１）およびエステル結合（１７４５．５２ｃｍ−１）を持っていた（図１１）。最大ＵＶスペクトルはメタノールで２８７ｎｍであり、融解点測定器（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．Ｗａｌｔｈａｍ、米国）で測定した融解点は８２℃であった。
ＩＤ−ＮＭＲ（１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲおよびＤＥＰＴ）測定は、Ｂｒｕｋｅｒ ＤＭＸ ６００スペクトロメーターシステムを用い、２Ｄ−ＮＭＲ（ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣ）はＢｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ８００スペクトロメーターシステムを用いてメタノール（ＣＤ３ＯＤ）で測定した。
１Ｈ ＮＭＲおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトル結果は、化合物Ａが典型的な環状デプシペプチドであることを示した（表２）。
【００５８】
【表２】
【００５９】
ＤＥＰＴおよび２Ｄ−ＮＭＲスペクトル結果（ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣ）は、化合物Ａがロイシン酸（ＯＬｅｕ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、バリン（Ｖａｌ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）およびロイシン（Ｌｅｕ）の５個単位からなっていることを確認可能にした。化合物Ａにおいて、前記５個単位の順序はＨＭＢＣ相関関係データ分析によって決定した（図１２）。
【００６０】
これにより、化合物Ａは化学式２の環状ペンタデプシペプチドであることを確認することができた。
【化３】
化学式２
【００６１】
前記化学式２の化合物は、サンサルバミドとは４つのアミノ酸および１つのヒドロキシ酸の結合順序において差異を示す新規の環状ペンタデプシペプチドであって、ネオ−サンサルバミドと命名した。
【００６２】
（２）化合物Ｂ
化合物Ｂは、ＩＲ分析の結果、アミド結合（１６５３．２４ｃｍ−１）およびエステル結合（１７４２．６５ｃｍ−１）を持っていた（図１３）。最大ＵＶスペクトルはメタノールで２１３ｎｍであり、融解点は８２℃であった。
１Ｄ−ＮＭＲ（１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ、およびＤＥＰＴ）測定は、Ｂｒｕｋｅｒ ＤＭＸ ６００スペクトロメーターシステムを用い、２Ｄ−ＮＭＲ（ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣ）はＢｒｕｋｅｒ ＤＭＸ ６００ スペクトロメーターシステムを用いてＣＤＣｌ３で測定した。
１Ｈ ＮＭＲおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトル結果は、化合物Ｂが典型的な環状デプシペプチドであることを示した（表３）。
【００６３】
【表３】
【００６４】
ＤＥＰＴおよび２Ｄ−ＮＭＲスペクトル結果（ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣ）は、化合物Ｂがロイシン酸（ＯＬｅｕ）、Ｎ−メチルロイシン（Ｎ−ＭｅＬｅｕ）、バリン（Ｖａｌ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）およびロイシン（Ｌｅｕ）の５個単位からなっていることを確認可能にした。化合物Ｂにおいて、前記５個単位の順序はＨＭＢＣ相関関係データ分析によって決定した（図１４）。
【００６５】
これにより、化合物Ｂは化学式１の環状ペンタデプシペプチドであることを確認することができた。
【化４】
化学式１
【００６６】
前記化学式１の化合物は、Ｎ−メチルサンサルバミドとは４つのアミノ酸および１つのヒドロキシ酸の結合順序において差異を示す新規の環状ペンタデプシペプチドであって、ネオ−Ｎ−メチルサンサルバミドと命名した。
【００６７】
（３）立体化学構造の決定
化合物ＡおよびＢに含まれたアミノ酸の立体化学構造を確認するために酸加水分解した後、Ｍａｒｆｅｙ試薬によって各アミノ酸を誘導体化させた後、対照群と共にＨＰＬＣで分析し、その分析結果を図１５（化合物Ａ）および図１６（化合物Ｂ）にそれぞれ示した。化合物ＡびＢに含まれた全てのアミノ酸はＬ型であることを確認することができた。
【００６８】
実施例４：細胞毒性の測定
公知の環状ヘキサデプシペプチド（ビューベリシン、エンニアチンＨ、ＩおよびＭＫ１６８８）と化学式１および２の化合物の多薬剤耐性がない癌細胞株および多薬剤耐性を持つ癌細胞株を対象としてＳＲＢ方法で細胞毒性を測定した。
【００６９】
肺癌細胞株（Ａ５４９）、卵巣癌細胞株（ＳＫ−ＯＶ−３）および皮膚癌細胞株（ＳＫ−ＭＥＬ−２）、子宮肉腫細胞株（ＭＥＡ−ＳＡ）およびその多薬剤耐性癌細胞株（ＭＥＳ−ＳＡ／ＤＸ５）はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国）より購入し、大腸癌細胞株（ＨＣＴ１５）は米国国立癌センターから供給を受け、ＨＣＴ１５の多薬剤耐性癌細胞株（ＨＣＴ１５／ＣＬ０２）はＨＣＴ１５をドキソルビシンに連続的および階段式で露出させて製造された細胞株の供給を韓国化学研究院から受けた。ＥＣ５０は分析条件で５０％の細胞成長が阻害される濃度に決定した。対照群としてドキソルビシンが共に使用された。
【００７０】
【表４】
【００７１】
【表５】
【００７２】
サンサルバミドの粗抽出物が大部分の癌細胞に対して試験管内細胞毒性を示し、大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６に対してＩＣ５０値が９．８μｇ／ｍＬであるとＢｅｌｏｆｓｋｙ等によって報告された［Ｂｅｌｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， １９９９］。また、Ｎ−メチルサンサルバミドの米国国立癌センターの癌細胞株に対する試験管内細胞毒性試験結果においてもＧＩ５０８．３μＭであることがＣｅｕｔｏ等によって報告された［Ｃｅｕｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０００］。表４および表５の結果によれば、化学式１および化学式２の環状ペンタデプシペプチドは、多薬剤耐性の保有有無を問わずに大部分の癌細胞株に対してサンサルバミドＡまたはＮ−メチルサンサルバミドと同等水準の細胞毒性を示した。また、化学式１の環状ペンタデプシペプチドは、化学式２の環状ペンタデプシペプチドに比べて多薬剤耐性癌細胞株に対する増殖抑制活性が優れた（図１７および図２０）。
【００７３】
実施例５：多薬剤耐性抑制活性の測定
化学式１および２の環状ペンタデプシペプチドの多薬剤耐性抑制活性を多薬剤耐性のない癌細胞株（ＭＥＳ−ＳＡおよびＨＣＴ１５）と比較して多薬剤耐性を持つ癌細胞、すなわちＭＥＳ−ＳＡ／ＤＸ５およびＨＣＴ１５／ＣＬ０２で確認した。多薬剤耐性癌細胞株に対するパクリタキセル（ＴＡＸ）の細胞毒性に対する化学式１および２の環状ペンタデプシペプチドの多薬剤耐性の逆転効果を測定した（表６）。対照群としてＰ−糖タンパク質阻害活性を有し、多薬剤耐性抑制剤として用いられているベラパミル（ＶＥＲ）を用いた。
【００７４】
【表６】
【００７５】
化学式２の環状ペンタデプシペプチドは、多薬剤耐性を有する癌細胞株に対するパクリタキセルの細胞毒性に対して若干増進させたが、その幅は大きくなかった。これとは異なり、化学式１の環状ペンタデプシペプチドはパクリタキセルの細胞毒性を顕著に増進させた（図２１〜図２４）。よって、化学式１の環状ペンタデプシペプチドにおいて、Ｎ−メチル基は多薬剤耐性抑制活性の発現に重要な因子であると推定される。化学式１の環状ペンタデプシペプチドは陽性対照群として使用されたベラパミルと類似の多薬剤耐性抑制活性を示した。
【００７６】
実施例６：抗バクテリア活性および抗カビ活性の測定
（１）抗バクテリア活性
３種のグラム陽性菌（Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ １４０２８；Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ３５５５６；Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １３０６１ ）、３種のグラム陰性菌（Ｅ． ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ８７３９；Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ９０２６；Ｓ． ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＡＴＣＣ１４０２８）に対する抗バクテリア活性を測定した。化学式１および化学式２の化合物をそれぞれ０．１、０．５、１および２ｍＭの濃度でＤＭＳＯに溶解させた後、滅菌ペーパーディスク（直径５ｍｍ）に滴下し、ＤＭＳＯは蒸発させた。ＴＳＡ（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ａｇａｒ）に１×１０７ＣＦＵ／ｍＬ濃度のバクテリアを接種し、前記ペーパーディスクをのせて３７℃で２４時間培養した後、クリアゾーンおよびその直径を観察した。
【００７７】
化学式１および２の化合物を試験したバクテリア全体に対して抗バクテリア活性は示していない。
【００７８】
（２）抗カビ活性
４種のカビ菌株（Ｍｕｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）に対する抗カビ活性を測定した。
【００７９】
化学式１および２の化合物をそれぞれ１および１０ｍＭの濃度でメタノールに溶解させた後、滅菌ペーパーディスク（直径８ｍｍ）に滴下し、メタノールは蒸発させた。ポテトデキストロースアガで培養されたカビ菌糸体上に前記ペーパーディスクをのせて２５℃で４８時間培養した後、クリアゾーンとその直径を観察した。対照群として、メタノールのみを滴下したペーパーディスクが使用された。
【００８０】
化学式１および２の化合物は、４種のカビ菌株に対して１ｍＭの濃度では阻害活性を示さなかった。ところが、化学式１および２の化合物は、ムコールルキシー（Ｍｕｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ）に対して、１０ｍＭの濃度ではクリアゾーンが観察されていないが、菌糸成長の阻害は確認することができた（図２５）。化学式２の化合物はフザリウムオキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）に対してクリアゾーンが現れてていないが、化学式１の化合物は弱い阻害活性を示した（図２６）。
【００８１】
実施例７：培地の選定
１×１０５ｓｐｏｒｅ／ｍＬのフザリウムソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）ＫＣＣＭ９００４０を、５０ｇの穀類を滅菌させた後で蒸留水で４０重量％の水分含量に調整した穀類培地に接種し、２５℃で培養しながら一日に一回攪拌して培養した。６種の異なる固体穀類培地で培養したとき、培養期間によって生産される化学式１および２の化合物の生産量をそれぞれ図２７および図２８に示した。
【００８２】
化学式２の化合物は、米培地を用いて２週培養したときに最大生産量（平均０．３７５ｇ／ｋｇ）を示した。米をトウモロコシ、小麦および唐黍に変更すると、生産量は米における生産量に比べて約８０％に減少した。大麦培地では特に０．１１２ｇ／ｋｇと生産量が低かった。
【００８３】
化学式１の化合物も、米培地を用いて２週培養したときに最大生産量（平均０．６８９ｇ／ｋｇ）を示し、小麦培地を用いて３週培養したときに０．６７２ｇ／ｋｇを示した。米をトウモロコシおよびライ麦で代替したとき、化学式１の化合物の生産は約２５％減少した。化学式１の化合物の最終生産量はライ麦または大麦に比べて２倍程度であった。
【００８４】
実施例８：培養条件の選定
本発明のフザリウムソラニＫＣＣＭ９００４０菌株において、化学式１および２の化合物を生産するための培養条件の実験結果は表７に示した。
【表７】
【００８５】
サンサルバミドは海水基材培地で海洋フザリウム菌株を培養したときに０．６４２ｇ／１７Ｌ生産されると報告された［Ｂｅｌｏｆｓｋｙ ＧＮ， Ｊｅｎｓｅｎ ＰＲ， Ｆｅｎｉｃａｌ Ｗ．（１９９９） Ｓａｎｓａｌｖａｍｉｄｅ： Ａ ｎｅｗ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｙｃｌｉｃ ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ ｍａｒｉｎｅ ｆｕｎｇｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｆｕｓａｒｉｕｍ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ４０， ２９１３−２９１６］。また、Ｎ−メチルサンサルバミドは海水基材培地でフザリウムＣＮＬ−６１９菌株を培養したときに３．１ｍｇ／Ｌ生産されると報告された［Ｃｅｕｔｏ Ｍ， Ｊｅｎｓｅｎ ＰＲ， Ｆｅｎｉｃａｌ Ｗ．（２０００） Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｓａｎｓａｌｖａｍｉｄｅ， ａ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｙｃｌｉｃ ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ａ ｍａｒｉｎｅ ｆｕｎｇｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｆｕｓａｒｉｕｍ Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ５５， ２２３−２２６］。
【００８６】
本発明のフザリウム菌株を米培地で培養したとき、化学式１と２の化合物を生産するのに適した培養条件は温度２０〜３０℃、湿度２０〜５０％、培養期間１０〜２０日であり、さらに好ましい培養条件は温度２３〜２８℃、湿度３５〜４５％、培養期間１３〜１８日であり、最適条件は、化学式１の環状ペンタデプシペプチドの場合、温度２５．８４℃、湿度３７．９９％、培養期間１６．０３日である（図２９〜図３１）。化学式２の環状ペンタデプシペプチドの場合は、温度２５．８７℃、湿度３３．８７％、培養期間１５．５８日が最適条件であった。前記最適条件で培養したとき、化学式１の環状ペンタデプシペプチドは０．７ｇ／ｋｇ生産され、化学式２の環状ペンタデプシペプチドは０．４ｇ／ｋｇ生産された。
【００８７】
製剤例１：錠剤の製造
成分含量
化学式１または化学式２の環状ペンタデプシペプチド １００ｍｇ
コーンスターチ ６８ｍｇ
ラクトース ９０ｍｇ
微細結晶質セルロース ４０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
【００８８】
通常の錠剤の製造方法によって、前記成分を提示された含量で添加して均一に混合し、攪拌した後、顆粒化した。次いで、乾燥の後、打錠器を用いて、１錠当り有効成分として化学式１または化学式２の環状ペンタデプシペプチドが１００ｍｇ含有された錠剤を製造した。
【００８９】
製剤例２：注射剤の製造
成分含量
化学式１または化学式２の環状ペンタデプシペプチド ５０ｍｇ
メタ重亜硫酸ナトリウム １．５ｍｇ
メチルパラベン １．０ｍｇ
プロピルパラベン ０．１ｍｇ
注射用精製水 適量
【００９０】
通常の注射剤の製造方法によって、前記成分を提示された含量で沸騰水に攪拌しながら溶解させた後、冷却させて２ｍＬ容量の滅菌バイアルに充填し、適量の注射用精製水を２ｍＬとなるように補充してバイアル１個当り５０ｍｇの化学式１または化学式２の環状ペンタデプシペプチドを含む注射剤を製造した。
【００９１】
製剤例３：シロップ剤の製造
成分含量
化学式１または化学式２の環状ペンタデプシペプチド ２００ｍｇ
濃縮果汁 ２ｇ
スクロース ５ｇ
クエン酸ナトリウム １００ｍｇ
香料 ７０ｍｇ
水 適量
【００９２】
通常のシロップの製造方法によって、前記成分を提示された含量で適量の水に混合し、加熱して溶解させた後、冷却させ、容器に充填して２００ｍＬ容量の飲料１瓶当り２００ｍｇの化学式１または化学式２の環状ペンタデプシペプチドを含むシロップ剤を製造した。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明の環状ペンタデプシペプチドは、多様な癌細胞に対して細胞毒性を示すので、腫瘍治療剤として使用でき、ひいては細胞の薬剤耐性抑制剤として使用できる。また、本発明のフザリウム菌株は、癌細胞に対する細胞毒性および薬剤耐性抑制活性を示す環状ペンタデプシペプチドを生産する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬およびそれを生産する微生物に関する。本発明の医薬は、薬剤耐性抑制活性および癌細胞増殖抑制活性に優れた環状ペンタデプシペプチドであり、これは土壌由来のフザリウム属微生物から生産される。
【背景技術】
【０００２】
海洋植物に関連したフザリウム属カビは、サンサルバミド（Ｓａｎｓａｌｖａｍｉｄｅ）など、細胞毒性を有する新規の環状ペンタデプシペプチドを生産する源泉であることが明らかにされている。
【０００３】
サンサルバミドＡは、海洋微生物の一種であるＨａｌｏｄｕｌｅ ｗｒｉｇｈｔｉｉから生産されることが最初に報告された［Ｂｅｌｏｆｓｋｙ ＧＮ， Ｊｅｎｓｅｎ ＰＲ， Ｆｅｎｉｃａｌ Ｗ．（１９９９） Ｓａｎｓａｌｖａｍｉｄｅ： Ａ ｎｅｗ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｙｃｌｉｃ ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ ｍａｒｉｎｅ ｆｕｎｇｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｆｕｓａｒｉｕｍ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ４０， ２９１３−２９１６］。サンサルバミドＡは、４つの疎水性アミノ酸（フェニルアラニン、２つのロイシンおよびバリン）と１つのヒドロキシ酸（（Ｓ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ；ＯＬｅｕ）からなり、５つの立体中心（ｓｔｅｒｅｏｇｅｎｉｃ ｃｅｎｔｅｒ）が全てＳ型である。サンサルバミドＡは、米国国立癌センターの６０個の細胞株に対して顕著な増殖阻害効果を示し、トポイソメラーゼＩの阻害剤であることが解明された。サンサルバミドＡの抗癌活性は、少なくとも部分的にはトポイソメラーゼＩの阻害に関連したメカニズムによるものである。また、図１に示したサンサルバミドＡにＮ−メチル化またはｐ−臭化による同族体もサンサルバミドＡと同様にヒト膵臓癌細胞に対して顕著な細胞毒性を示すという事実は、これらの化合物が非常に優れた抗癌剤として活用できることを示唆する［Ｕｊｉｋｉ ＭＢ， Ｍｉｌａｍ Ｂ， Ｄｉｎｇ ＸＺ， Ｒｏｇｉｎｓｋｙ ＡＢ， Ｓａｌａｂａｔ ＭＲ， Ｔａｌａｍｏｎｔｉ ＭＳ， Ｂｅｌｌ ＲＨ， Ｇｕ Ｗ， Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ＲＢ， Ａｄｒｉａｎ ＴＥ．（２００６） Ａ ｎｏｖｅｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓａｎｓａｌｖａｍｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈｔｈｒｏｕｇｈ Ｇ０／Ｇ１ ｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈ． Ｒｅｓ． Ｃｏ． ３４０， １２２４−１２２８］。
【０００４】
最近では、緑藻類から分離されたフザリウム種からサンサルバミドのＮ−メチル同族体としてのＮ−メチルサンサルバミドが生産された。Ｎ−メチルサンサルバミドは、４つのアミノ酸（フェニルアラニン、ロイシン、Ｎ−メチルロイシンおよびバリン）と１つのヒドロキシ酸（ＯＬｅｕ）からなり、米国国立癌センターのヒト癌細胞株スクリーニングにおける試験管内細胞毒性が報告された［Ｃｕｅｔｏ Ｍ， Ｊｅｎｓｅｎ ＰＲ， Ｆｅｎｉｃａｌ Ｗ．（２０００） Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｓａｎｓａｌｖａｍｉｄｅ， ａ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｙｃｌｉｃ ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ａ ｍａｒｉｎｅ ｆｕｎｇｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ ＦｕｓａｒｉｕｍＰｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．５５， ２２３−２２６］。
【０００５】
多薬剤耐性（Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ＭＤＲ）は化学療法剤による成功的な癌治療の主要障害物の一つであり、最近、これを克服するための多様な生化学的、医薬学的および臨床学的試みが考案されている［Ｔｅｏｄｏｒｉ Ｅ， Ｄｅｉ Ｓ， Ｓｃａｐｅｃｃｈｉ Ｓ， Ｇｕａｌｔｉｅｒｉ Ｆ．（２００２） Ｔｈｅ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（ＭＤＲ） ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ ｄｒｕｇｓ．ＩＩ Ｆａｒｍａｃｏ ５７， ３８５−４１５］。多薬剤耐性には様々なメカニズムが関連しているが、Ｐ−糖タンパク質および多薬剤耐性関連タンパク質の過剰発現が癌細胞の多薬剤耐性の原因として示されている［Ｔｈｏｍａｓ Ｈ， Ｃｏｌｅｙ ＨＭ．（２００３） Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ： ａｎ ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ １０， １５９−１６５； Ｐｅｒｅｚ−Ｔｏｍａｓ Ｒ．（２００６） Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ： ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｉｎ ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ． Ｃｕｒｒ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １３， １８５９−１８７６］。
サンサルバミドＡは、プロテアーゼ耐性および細胞膜透過性を有する親脂性の環状デプシペプチドであって、他の薬剤に比べて経口投与が容易であり且つ４つのアミノ酸および１つのヒドロキシ酸が結合しているコア構造は、結合の回転が制限されてさらに硬い配列を形成するので、生体内における親和性に優れるうえ、半減期が長いという利点がある。
【０００６】
このような構造的な利点とサンサルバビドＡまたはＮ−メチル酸サンサルバミドが有する癌細胞に対する細胞毒性を癌治療に用いるために、これまでこれらを変形させた数多くの同族体が有機合成されたが、本発明で分離された環状ペンタデプシペプチドに対しては報告されたことがなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、新規の環状ペンタデプシペプチドを生産するフザリウム属菌株を提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、フザリウム属菌株を培養して新規の環状ペンタデプシペプチドを生産する方法を提供することにある。
【０００９】
本発明の別の目的は、新規の環状ペンタデプシペプチドを提供することにある。
【００１０】
本発明の別の目的は、薬剤耐性抑制用薬学組成物を提供することにある。
【００１１】
本発明の別の目的は、癌治療用薬学組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、新規の化合物である下記化学式１の環状ペンタデプシペプチドまたは下記化学式２の環状ペンタデプシペプチドを生産するフザリウム属菌株を提供する。
【化１】
化学式１
【化２】
化学式２
【００１３】
前記化学式１および前記化学式２の環状ペンタデプシペプチドは、従来報告されたサンサルバミドＡおよびＮ−メチルサンサルバミドと構成アミノ酸およびヒドロキシ酸の結合順序に差異がある１５員環原子の環状ペンタデプシペプチドであって、新規化合物として判明された。また、図１に例示したように、従来のサンサルバミドＡのコア構造を用いて有機合成された多様な同族体は、フェニルアラニンのベンゼン環の臭化またはロイシンまたはバリンのＮ−メチル化による細胞毒性の増大のみを念頭に入れたばかりで、構成アミノサンおよびヒドロキシ酸の結合順序を変更した試みは報告されたことがない。ひいては、人為的な有機合成によって構成アミノサンおよびヒドロキシ酸の結合順序を変更しようとする場合には、コア構造に含まれたヒドロキシ酸（（Ｓ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ；ＯＬｅｕ）とフェニルアラニン間のエステル結合が破壊されるという問題がある。
【００１４】
化学式１および化学式２の環状ペントデプシペプチドは、サンサルバミドＡおよびＮ−メチル酸サンサルバミドと４つの構成アミノ酸および１つのヒドロキシ酸の結合順序が異なる新規の環状ペンタデプシペプチドであって、多様な癌細胞株に対してサンサルバミドＡと同等水準の細胞毒性を示す。特に化学式１および化学式２の環状ペプタデプシペプチドは、サンサルバミドＡ、Ｎ−メチルサンサルバミドおよびこれらを基本環構造として用いて有機合成された同族体において報告されたことのない細胞の薬剤耐性の抑制活性を有する。好ましくは化学式１の環状ペンタデプシペプチドにおいて薬剤耐性抑制活性に優れる。本発明において、薬剤耐性の抑制活性とは、化学療法剤に細胞が露出される場合、構造的に関連のない多数の薬剤に対して耐性を有する細胞が発生するが、このような薬剤耐性の発生を抑制し或いは薬剤に対する敏感性を維持させる場合は勿論のこと、既に薬剤耐性を有する細胞の薬剤に対する敏感性を増加または回復させる活性の意味としても使用される。
【００１５】
したがって、本発明の化学式１および化学式２の環状ペンタデプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩は、薬剤耐性を有する細胞を治療し、薬剤耐性の発現を抑制し、特に多薬剤耐性癌の治療に特に適切に使用できる。
【００１６】
好ましくは、本発明の化学式１、化学式２の環状ペンタデプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩は、従来知られている薬剤耐性抑制剤、すなわちサイクロスポリンおよびその類似体、フェノチアジン、チオキサンテン誘導体（ｔｈｉｏｘａｎｔｈｅｎｅｓ）、ベラパミルなどと組み合わせて使用できる。
【００１７】
また、好ましくは、本発明の化学式１、化学式２の環状ペンタデプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩は、抗癌剤、すなわち標準化学療法剤と組み合わせて腫瘍の治療に使用でき、特に好ましくは先天的にまたは後天的に薬剤に耐性がある腫瘍の治療に使用できる。
【００１８】
本発明は、化学式１または化学式２の環状ペンタデプシペプチドを生産するフザリウム属菌株を提供する。前記フザリウム属菌株はフザリウムソラニであることを特徴とする。前記フザリウムソラニはフザリウムソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）ＫＣＣＭ９００４０［寄託番号：ＫＣＣＭ１０８８１Ｐ］であることを特徴とする。
【００１９】
本発明は、前記菌株を培養して化学式１または化学式２の環状ペンタデプシペプチドを生産する方法を提供する。前記培養は、穀類を用いた固体培養であることを特徴とする。前記穀類は、米、小麦、トウモロコシ、ライ麦、唐黍、大麦などを少なくとも１種用いることができ、好ましくは米、小麦、トウモロコシ、ライ麦、さらに好ましくは米または小麦、最も好ましくは米を用いる。
【００２０】
サンサルバミドは、海水基材培地（ｓｅａｗａｔｅｒ−ｂａｓｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）で海洋フザリウム菌株を培養したときに０．６４２ｇ／１７Ｌ生産されるものと報告された［Ｂｅｌｏｆｓｋｙ ＧＮ， Ｊｅｎｓｅｎ ＰＲ， Ｆｅｎｉｃａｌ Ｗ．（１９９９） Ｓａｎｓａｌｖａｍｉｄｅ： Ａ ｎｅｗ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｙｃｌｉｃ ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ ｍａｒｉｎｅ ｆｕｎｇｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｆｕｓａｒｉｕｍ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ４０， ２９１３−２９１６］。また、Ｎ−メチルサンサルバミドは、海水基材培地でフザリウムＣＮＬ−６１９菌株を培養したときに３．１ｍｇ／Ｌ生産されるものと報告された［Ｃｕｅｔｏ Ｍ， Ｊｅｎｓｅｎ ＰＲ， Ｆｅｎｉｃａｌ Ｗ．（２０００） Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｓａｎｓａｌｖａｍｉｄｅ， ａ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｙｃｌｉｃ ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ａ ｍａｒｉｎｅ ｆｕｎｇｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ ＦｕｓａｒｉｕｍＰｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ５５， ２２３−２２６］。
【００２１】
上述したようにサンサルバミドまたはＮ−メチルサンサルバミドは、海洋由来フザリウムから生産されるものである。サンサルバミドまたはＮ−メチルサンサルバミドの生産のために海水基材培地が用いられる。単位培地当たり生産量が極めて低かったが、本発明のフザリウム菌株は、土壌に由来した菌株であって、穀類を用いた固体培養によって高濃度で化学式１または化学式２の化合物を生産する。
【００２２】
前記培養に用いられる穀類は、好ましくは米であり、化学式１および化学式２の化合物を生産するのに適した培養条件は、温度２０〜３０℃、湿度２０〜５０％、培養期間１０〜２０日であり、最適条件は２５．８４℃、湿度３７．９９％、培養期間１６．０３日である。
【００２３】
韓国ムンキョンのジャガイモから環状デプシペプチド生産菌株を分離した。分離された菌株はフザリウムソラニと同定された。前記菌株はフザリウムソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）ＫＣＣＭ９００４０と命名し、韓国微生物保存センターに２００８年１月１５日に寄託番号ＫＣＣＭ１０８８１Ｐでブダペスト条約に基づいて国際寄託した。
【００２４】
前記菌株は化学式１の環状ペンタデプシペプチドおよび化学式２の環状ペンタデプシペプチドを生産した。化学式１および２の環状ペンタデプシペプチドは、従来報告されたＮ−メチルサンサルバミドとは構成アミノ酸およびヒドロキシ酸の結合順序が異なる１５員環原子の環状ペンタデプシペプチドであって、新規化合物と判明された。
【００２５】
本発明の化学式１の環状ペンタデプシペプチド、化学式２の環状デプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩は、細胞の薬剤耐性抑制用薬学組成物の有効成分として利用できる。前記細胞は腫瘍細胞または抗生剤耐性菌である。
【００２６】
また、本発明の化学式１の環状ペンタデプシペプチド、化学式２の環状デプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩は、腫瘍細胞増殖抑制活性を有する癌治療用薬学組成物の有効成分として利用できる。
【００２７】
薬学的に許容される塩とは、塩基化合物の無毒性有機または無機酸付加塩を意味する。適切な塩を形成する無機酸の例としては塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸および酸金属塩（例えば、オルトリン酸一水素ナトリウムおよび硫酸水素カリウム）がある。適切な塩を形成する有機酸の例としてはモノ−、ジ−およびトリカルボン酸がある。このような酸の例としては酢酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、桂皮酸、サリチル酸および２−フェノキシ安息香酸がある。その他に、適切な塩を形成する有機酸としてはメタンスルホン酸および２−ヒドロキシエタンスルホン酸などのスルホン酸がある。これらの塩および塩基化合物は、水和された形態またはほぼ無水物の形態で存在しうる。酸性塩は、水溶液またはアルコール水溶液または適当な酸を含有する他の適した溶媒中に遊離塩基を溶解させ、溶液を蒸発させて単離させる方法、または有機溶媒中で遊離塩基を反応させる方法（この場合、塩は直接分離されるか、或いは溶液を濃縮させて得られる）などの通常の技術によって製造される。一般に、本発明に係る化合物の酸付加塩は水および各種親水性有機溶媒に溶解される結晶性物質であって、これはこれらの遊離塩基形態に比べて融点および溶解度がさらに高い。
【００２８】
本明細書において、「患者」とは、ヒトを含む霊長類と塩素、馬、牛、豚、犬、猫、ラットおよびマウスなどの哺乳動物を意味する。
【００２９】
化学式１の環状ペンタデプシペプチド、化学式２の環状デプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩の投与量は、使用される特定の投薬単位、治療期間、患者の年齢および性別、治療する腫瘍の特性および薬剤耐性度に応じて幅広く可変する。
【００３０】
化学式１の環状ペンタデプシペプチド、化学式２の環状デプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩は、腫瘍の治療に有用なものと知られている他の抗癌剤、特に化学療法剤と併用して使用される。薬剤耐性を反転させるための化学式１の環状ペンタデプシペプチド、化学式２の環状デプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩の有効量は、一般に約１５ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲である。単位投与量は２５〜５００ｍｇの化学式１の環状ペプタデプシペプチド、化学式２の環状デプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩を含有することができ、毎日１回以上にわたって投与できる。化学式１の環状ペプタデプシペプチド、化学式２の環状デプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩は、通常の投薬単位形態で製薬学的担体と共に経口または非経口投与できる。
【００３１】
本発明の化学式１の環状ペンタデプシペプチド、化学式２の環状デプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩を用いた腫瘍の治療には、腫瘍抑制に有効な容量の抗癌剤、特に化学療法剤を化学式１の環状ペンタデプシペプチド、化学式２の環状デプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩と共に投与しなければならない。
【００３２】
本発明の方法によって治療できる腫瘍としては、陽性および悪性腫瘍または新生物のみならず、黒色腫、リンパ腫、白血病および肉腫を挙げることができる。このような腫瘍の例としては皮膚腫瘍（例えば、悪性黒色腫および菌状息肉腫）、白血病などの血液腫瘍（例えば、急性リンパ球白血病、急性または慢性骨髄白血病）、リンパ腫（例えば、ホジキン病または悪性リンパ腫）、婦人科腫瘍（例えば、卵巣腫瘍および子宮腫瘍）、泌尿器腫瘍（例えば、前立腺腫瘍、膀胱または睾丸腫瘍）、軟組織肉腫、骨性または非骨性肉腫、乳房腫瘍、脳下垂体腫瘍、甲状腺腫瘍、副腎皮質腫瘍、胃腸腫瘍（例えば、食道腫瘍、胃腫瘍、腸腫瘍および結腸腫瘍）、膵臓腫瘍、肝腫瘍、喉頭腫瘍、乳頭腫および肺腫瘍がある。勿論、典型的に多薬剤耐性があり或いは多薬剤耐性を持つことになる腫瘍が本発明の方法によって最も効果的に治療される。このような腫瘍には結腸腫瘍、肺腫瘍、胃腫瘍および肝腫瘍がある。
【００３３】
化学式１の環状ペンタデプシペプチド、化学式２の環状デプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩と共に使用される化学療法剤には、腫瘍の治療に通常用いられる細胞毒素剤がある。化学療法剤の例としては、シクロホスファミド、メトトレキサート、プレドニゾン、６−メルカプトプリン、プロカルバジン、ジウノルビシン、ダウノルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、クロラムブシル、シトシン、アラビノシド、６−チオグアニン、チオＴＥＰＡ、５−フルオロウラシル、５−フルオロ−２−デオキシウリジン、５−アザシチジン、ナイトロジェンマスタード、１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソウレア（ＢＣＮＵ）、（１−（２−クロロエチル）−３−シクロヘキシル−１−ニトロソウレア）（ＣＣＮＵ）、ブスルファン、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンデシン、シクロロイシン、またはメチルグリオキサルビス（グアニルヒドラゾン）（すなわち、ＭＧＢＧ）などがある。本発明の方法に用いられる化学療法剤の有効量は、患者、腫瘍組織の形態および大きさ、並びに使用される特定化学療法剤などの要因によって左右され、幅広く可変する。その量は効果のある任意量であり、当業界における熟練者はその量を容易に決定することができる。一般に化学療法剤が単独で投与されるときに比べて、化学療法剤が化学式１の環状ペンタデプシペプチド、化学式２の環状デプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩と共に投与されるときに少量で必要である。その主な理由は、化学療法剤を多量添加して薬剤耐性の問題を起こす必要がないためである。勿論、化学療法剤の混合物を使用することができ、手術による切除または放射線治療などの補助手段も腫瘍治療に有用である。上述では、化学式１の環状デプシペプチドまたはその塩および化学療法剤が共に投与されるものと記載したが、これらが同じ投薬形態で製剤されるか或いは同時投与されることを必ずしも意味するのではない。ここで、「共に」という表現は、化学式１の環状ペンタデプシペプチド、化学式２の環状デプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩および化学療法剤が、混合された投薬形態で投与されるか或いは治療過程中に分けられて投与されることを意味する。
【００３４】
好ましい投与経路は経口投与である。経口投与用化学式１の環状ペンタデプシペプチド、化学式２の環状デプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩は、固状または液状製剤、例えばカプセル剤、丸薬、錠剤、トローチ剤、ローゼンジ、メルト剤、粉剤、液剤、懸濁液剤または乳剤に剤形化できる。固状単位投与剤形は、通常の硬質または軟質ゼラチン外皮形態で構成できるカプセルを挙げることができる。このカプセルは、例えば界面活性剤、潤滑剤、および例えばラクトース、スクロース、リン酸カルシウムおよびコーンスターチなどの不活性充填剤を含有する。別の実施態様において、本発明の化合物は、通常の錠剤ベース（例えば、ラクトース、スクロースおよびコーンスターチ）を結合剤（例えば、アカシア、コーンスターチまたはゼラチン）、投与後の錠剤の分解および溶解を助けるための崩解剤（例えば、ジャガイモ澱粉、アルギン酸、コーンスターチおよびグアーガム）、精製顆粒の流出を向上させ且つ打錠用ダイおよびパンチの表面に錠剤の薬物が接着されることを防止するための潤滑剤（例えば、タルク、ステアリン酸またはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムまたはステアリン酸亜鉛）、錠剤の美的特性を向上させ且つ患者にさらに適するようにするための染料、着色剤および風味剤と共に混合させて錠剤に剤形化できる。経口用液状投与剤形に有用な適切な賦形剤には、製薬上許容される界面活性剤、懸濁剤または乳剤を添加しており或いは添加していない水およびアルコール（例えば、エタノール、ベンジルアルコールおよびポリエチレンアルコール）などの希釈剤が含まれる。
【００３５】
また、本発明の化学式１の環状ペンタデプシペプチド、化学式２の環状デプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩は、製薬学的担体と共に生理学的に許容される希釈剤に溶解させた注射剤として非経口経路、すなわち皮下、静脈内、筋肉内または腹膜内に投与できる。前記担体としては、製薬上許容される界面活性剤（例えば、石鹸または洗剤）、懸濁剤（例えば、ぺプチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロース）または乳化剤および他の製薬学的補助剤を添加しており或いは添加していない水、塩水、デキストロースおよびその類似糖水溶液、アルコール（例えば、エタノール、イソプロパノールまたはヘキサデシルアルコール）、グリコール（例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）、グリセロールケタール（例えば、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール）、エーテル（例えば、ポリ（エチレン−グリコール）４００）、オイル、脂肪酸、脂肪酸エステルまたはグリセリドまたはアセチル化脂肪酸グリセリドなどの無菌液または混合液を使用できる。本発明の非経口剤形に使用できるオイルの例には、石油、動物性油、例えば落花生油、大豆油、ゴマ油、棉花油、トウモロコシ油、オリーブ油などの植物性油または合成油、鉱油および無機油がある。適当な脂肪酸にはオレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルがある。適当な界面活性剤には脂肪酸アルカリ金属塩、アンモニウム塩およびトリエタノールアミン塩があり、適当な洗剤には陽イオン性洗剤（例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハライド、アルキルピリジニウムハライドおよびアルキルアミンアセテート）、陰イオン性洗剤（例えば、アルキル、アリールおよびオレフィンスルホネート、アルキル、オレフィン、エーテルおよびモノグリセリドスルフェートおよびスルホスクシネート）、非イオン性洗剤（例えば、脂肪アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミドおよびポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマー）、陽性洗剤（例えば、アルキル−β−アミノプロピオネートおよび２−アルキルイミダゾリン４級アンモニウム塩）、およびその混合物が含まれる。通常、本発明の非経口組成物は、化学式１の環状ペンタデプシペプチド、化学式２の環状デプシペプチドまたはこれらの薬学的に許容される塩を溶液の約０．５〜約２５重量％で含有する。また、防腐剤および緩衝剤を使用することが有利でありうる。注射部位の刺激を減少または除去するために、前記組成物は、約１２〜１７の親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）値を有する非イオン性界面活性剤を含有することができる。このような組成物中の界面活性剤の量は約５〜約１５重量％の範囲である。界面活性剤は、前記ＨＬＢを有する単一成分、或いは所望のＨＬＢを有する２種以上の成分の混合物であってもよい。非経口組成物に使用された界面活性剤の例は、ポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、例えばソルビタンモノオレートおよびプロピレンオキシドとプロピレングリコールの縮合によって形成された疎水性塩基を有する酸化エチレンの高分子量付加物である。
【００３６】
本発明の化学式１または化学式２の環状ペンタデプシペプチドを生産するためには、フザリウム属菌株、好ましくはフザリウムソラニ、さらに好ましくはフザリウムソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）ＫＣＣＭ９００４０［寄託番号：ＫＣＣＭ１０８８１Ｐ］を培養する方法、生合成または有機合成を用いた合成法のいずれも利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１はサンサルバミドＡ同族体の化学構造を示す。
【図２】図２は本発明の菌株の小型分生子を示す写真である。
【図３】図３は本発明の菌株の分生子柄を示す写真である。
【図４】図４は本発明の菌株の斜面培養による表面と裏面の様子を示す写真である。
【図５】図５はフザリウム菌株を確認するためのフザリウム特異プライマーを用いたＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電気泳動写真である。Ｍは１００ｂｐ単位からなるＤＮＡマーカーを示し、Ｆは本発明の菌株のＰＣＲ増幅産物を示し、Ｓ−１およびＳ−２はそれぞれフザリウムモニリフォルメＮＲＲＬ１３５６９およびフザリウムオキシスポラムＫＴＣＣ１６９０９の増幅産物を示す。
【図６】図６は本発明の菌株（サンプル）のフザリウムソラニのＩＴＳ−５．８ｒＤＮＡ配列の相同性を比較したものである。
【図７】図７は本発明の菌株をフザリウム制限培地で浸漬培養した後、培養液から抽出した抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図８】図８は本発明の菌株を穀類培地で固体培養した後、培養液から抽出した抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図９】図９は本発明の菌株から生産された化合物Ａのエレクトロスプレイイオン化質量分析器を用いて分子量を測定した結果である。
【図１０】図１０は本発明の菌株から生産された化合物Ｂのエレクトロスプレイイオン化質量分析器を用いて分子量を測定した結果である。
【図１１】図１１は化合物ＡのＦＴ ＩＲ−８４００Ｓ赤外線分光器で測定したＩＲスペクトルである。
【図１２】図１２は化合物ＡのＨＭＢＣ相関関係データを分析したものである。
【図１３】図１３は化合物ＢのＦＴ ＩＲ−８４００Ｓ赤外線分光器で測定したＩＲスペクトルである。
【図１４】図１４は化合物ＢのＨＭＢＣ相関関係データを分析したものである。
【図１５】図１５は化合物Ａに含まれたアミノ酸の立体化学構造を確認するためのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１６】図１６は化合物Ｂに含まれたアミノ酸の立体化学構造を確認するためのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１７】図１７は多薬剤耐性のない癌細胞株に対する化学式１の化合物の細胞毒性を示すグラフである。
【図１８】図１８は多薬剤耐性を持つ癌細胞株に対する化学式１の化合物の細胞毒性を示すグラフである。
【図１９】図１９は多薬剤耐性のない癌細胞株に対する化学式２の化合物の細胞毒性を示すグラフである。
【図２０】図２０は多薬剤耐性を持つ癌細胞株に対する化学式２の化合物の細胞毒性を示すグラフである。
【図２１】図２１は化学式１および化学式２の化合物のＨＣＴ１５細胞株に対する多薬剤耐性抑制活性を示すグラフである。
【図２２】図２２は化学式１および化学式２の化合物のＨＣＴ１５／ＣＬ０２に対する多薬剤耐性抑制活性を示すグラフである。
【図２３】図２３は化学式１および化学式２の化合物のＭＥＡ−ＳＡ細胞株に対する多薬剤耐性抑制活性を示すグラフである。
【図２４】図２４は化学式１および化学式２の化合物のＭＥＡ−ＳＡ／ＤＸ５細胞株に対する多薬剤耐性抑制活性を示すグラフである。
【図２５】図２５は化学式１および２の化合物の１０ｍＭ濃度におけるムコールルキシー（Ｍｕｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ）に対する抗カビ活性を示す写真である。
【図２６】図２６は化学式１および２の化合物の１０ｍＭ濃度におけるフザリウムオキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）に対する抗カビ活性を示す写真である。
【図２７】図２７は６つの相異なる固体穀類培地で培養したときの培養期間による化学式１の化合物の生産量を示すグラフである。
【図２８】図２８は６つの相異なる固体穀類培地で培養したときの培養期間による化学式２の化合物の生産量を示すグラフである。
【図２９】図２９は化学式１および２の化合物の生産のための培養条件を示すもので、培養期間による生産量の変化を示すグラフである。
【図３０】図３０は化学式１および２の化合物の生産のための培養条件を示すもので、温度による生産量の変化を示すグラフである。
【図３１】図３１は化学式１および２の化合物の生産のための培養条件を示すもので、湿度による生産量の変化を示すグラフである。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例および実験例によって詳細に説明する。但し、下記実施例および実験例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。
【００３９】
実施例１：菌株の分離および同定
（１）分離および形態学的同定
韓国ムンキョウのジャガイモから、環状デプシペプチドを生産するフザリウム属菌株を分離した。分離された菌株はＳａｍｓｏｎ等およびＮｅｌｓｏｎ等の方法で同定した［Ｓａｍｓｏｎ ＲＡ， Ｈｏｅｋｓｔｒａ ＥＳ， Ｏｏｒｓｃｈｏｔ Ｖ， Ｃｏｎｎｉｅ ＡＮ．（１９８１） Ｉｎｔｒｏｄｕｔｉｏｎ ｔｏ ｆｏｏｄ−ｂｏｒｎｅ ｆｕｎｇｉ． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ａｎｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｂｙ Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ； Ｎｅｌｓｏｎ ＰＥ， Ｔｏｕｓｓｏｕｎ ＴＡ， Ｍａｒａｓａｓ ＷＦ．（１９８３） Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ： Ａｎ ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ． Ｐｒｅｓｓ］。
【００４０】
分離されたフザリウム属菌株はＣＬＡ（ｃａｒｎａｔｉｏｎ ｌｅａｆ ａｇａｒ）およびＲＰＤＡ（ｒｅａｌ ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｇａｒ）で形態学的特性を調査した。
【００４１】
小型分生子は、多量で存在し、一般に単細胞であって、卵型から腎臓型であった（図２）。分生子柄は図３のように枝を伸びていた。フザリウムソラニの小型分生子および分生子柄は、フザリウムオキシスポラムで発見されたものと類似である。但し、フザリウムオキシスポラムの小型分生子はソラニのものに比べてさらに大きくて厚い細胞壁を持っており、その分生子病は短いモノフィアライド（ｍｏｎｏｐｈｉａｌｉｄｅ）を形成している（Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８３）。分離されたフザリウム属菌株の成長は速く、斜面培養の表面は白色菌糸体で大部分覆われており、その裏面は暗いクリーム形態であった（図４）。
このような形態学的特性によって分離されたフザリウム属菌株はフザリウムソラニと同定された。
【００４２】
（２）分子生物学的同定
Ａ．ＤＮＡ抽出
本発明の分離されたフザリウムソラニ菌株の全体ゲノムＤＮＡをポテトデキストロースアガ培地で育てた菌糸体からＣｏｒｒｅｌｌ等の方法で抽出した［Ｃｏｒｒｅｌｌ ＪＣ， Ｋｌｉｔｔｉｃｈ ＣＪＲ， Ｌｅｓｌｉｅ ＪＦ．（１９８７） Ｎｉｔｒａｔｅ ｎｏｎｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ｉｎ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｓ． Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ７７， １６４０−１６４６］。
【００４３】
本発明のフザリウムソラニ菌株を培養して、菌糸の覆われている培地に液体窒素を充填した後、常温で液体窒素を蒸発させる。液体窒素が蒸発した後、もう１回入れて前記過程を繰返し行う。液体窒素が全て蒸発した後、６５℃の溶菌液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、３％ ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ）、１％２−メルカプトエタノールおよび０．１ ｍ／ｍＬのプロテイナーゼＫ］を添加し、しかる後に、６５℃で１時間反応させる。反応の後、０．５ｍＬのフェノール溶液を入れて穏やかに振とうした後、８０００ｒｐｍの速度で５分間遠心分離してフェノール層と水溶液層を分離する。水溶液層を丁寧に他のチューブに移した後、水溶液層に残っているフェノール層を除去するために、クロロホルムおよびイソアミルアルコールが２４：１の比率で混ざっている溶液０．４ｍＬを入れて振とうした後、遠心分離して水溶液層を新しいチューブに移す。ここに０．０５ｍＬの７．５Ｍ酢酸アンモニウム溶液を入れてて丁寧に混ぜる。その後、−２０℃の９５％エタノールを０．８８ｍＬ入れた後、１３０００ｒｐｍの速度で２０分間遠心分離してＤＮＡを沈殿させる。上澄み液を捨て、７０％エタノールを入れてＤＮＡを洗浄し、さらに遠心分離してＤＮＡを沈殿させて７０％エタノールを捨て、ＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を入れて保管する。
【００４４】
Ｂ．ＤＮＡ電気泳動および相同性を用いた同定
Ｈｕｅ等により提案されたフザリウム特異プライマーである、配列番号１のＰ２８ＳＬ（５’−ＡＣＡ ＡＡＴ ＴＡＣ ＡＡＣ ＴＣＧ ＧＧＣ ＣＣＧ ＡＧＡ−３’）と配列番号２のＰ５８ＳＬ（５’−ＡＧＴ ＡＴＴ ＣＴＧ ＧＣＧ ＧＧＣ ＡＴＧ ＣＣＴ ＧＴ−３’）を用いた対照群ＰＣＲ分析が利用された［Ｈｕｅ， Ｆ．Ｘ．， Ｍ．Ｈｕｅｒｒｅ， Ｍ．Ａ． Ｒｏｕｆｆａｕｌｔ， ａｎｄ Ｃ．Ｄ． Ｂｉｅｖｒｅ． Ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅｓ ｂｙ ａ ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ３７： ２４３４−２４３８． １９９９］。前記フザリウム特異プライマー対は、ＰＣＲによってフザリウム属菌株のｒＤＮＡをコードする遺伝子の断片を増幅させる。前記Ｐ２８ＳＬおよびＰ５８ＳＬプライマー対の結合部位はｒＤＮＡのＩＴＳ２および５．８Ｓと２８Ｓ部分であって、フザリウム菌株で保存される部分である。
【００４５】
前記Ａ．で抽出した１ｎｇのＤＮＡ、前記Ｐ２８ＳＬおよびＰ５８ＳＬプライマー対、並びにプロメガより購入したＰＣＲプリミクスチャー（ｐｒｅ−ｍｉｘｔｕｒｅ）を使用した。初期変性は９４℃で１０分間反応させた。その後、９４℃１分間変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）、６０℃で１分間アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、７２℃で１分間伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）反応を１サイクルとして、ＰＣＲを４０サイクル繰返し行い、ＤＮＡ断片を増幅した。増幅の後、最終伸長を７２℃で１０分間反応させた。
【００４６】
前記ＰＣＲ反応産物は２％アガロースゲルを製造してＴｒｉｓ−アセテート−ＥＤＴＡ（Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ−ＥＤＴＡ）緩衝液で電気泳動した。電気泳動が済んだ後、臭化エチジウム（ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）溶液に入れて染色し、染色されたゲルを紫外線に照らすと、増幅されたバンドを確認することができた。
【００４７】
本発明のフザリウム菌株のＰＣＲ増幅産物（Ｆ）は、対照群として使用されたフザリウムモニリフォルメＮＲＲＬ１３５６９（Ｓ−２）およびフザリウムオキシスポラムＫＴＣＣ１６９０９（Ｓ−１）と同様に、３００〜４００ｂｐのＤＮＡ断片サイズを示した（図５）。
本発明のフザリウム菌株のＰＣＲ増幅産物を精製した後、マクロジェン（韓国）でその配列を分析し、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのＢＬＡＳＴ検索によって相同性を調査した。本発明のフザリウム菌株のＩＴＳ−５．８ｒＤＮＡ配列は配列番号３に示した。本発明のフザリウム菌株のＩＴＳ−５．８ｒＤＮＡ配列はフザリウムソラニのものと９８％以上の相同性を示した（図６）。
【００４８】
よって、本発明の菌株はフザリウムソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）ＫＣＣＭ９００４０と命名し、韓国微生物保存センターに２００８年１月１５日に寄託番号ＫＣＣＭ１０８８１Ｐでブダペスト条約に基づいて国際寄託した。
【００４９】
実施例２：環状デプシペプチドの生産および分離
（１）フザリウム制限培地ブロスにおける培養
１×１０５ｓｐｏｒｅ／ｍＬのフザリウムソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）ＫＣＣＭ９００４０をフザリウム制限培地ブロス（ＦＤＭ ｂｒｏｔｈ；リットル当り２５ｇのスクロース、４．２５ｇのＮａＮＯ３、５ｇのＮａＣｌ、２．５ｇのＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ、１．３６ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．０１ｇのＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ、および０．００２９ｇのＺｎＳＯ４７Ｈ２Ｏ）１００ｍＬに接種して２５℃で７日間培養した。
【００５０】
（２）穀類培地における培養
１×１０５ｓｐｏｒｅ／ｍＬのフザリウムソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）ＫＣＣＭ９００４０を、５０ｇの米を滅菌蒸留水で４０重量％の水分含量に調整した米培地に接種して２５℃で７日間培養した。
【００５１】
（３）培養物からの環状デプシペプチドの抽出
前記（１）の菌糸体を含んでいる培養液に、培養液の２倍に相当するクロロホルムを入れて激烈に振とうした後、下層のクロロホルム層を取り、これを乾燥させた後、メタノールでさらに溶解させた。
前記（２）のフザリウムが培養された穀類培地は１２時間常温で乾燥させる。乾燥した菌糸体は、均質にした後、アセトニトリル：メタノール：水を１６：３：１の体積比で混合した溶媒７５ｍＬで一晩抽出し、しかる後に、滅菌濾過紙で濾過した。濾液は２５ｍＬのｎ−ヘプタンで２回脂肪を除去し、下層を乾燥させた後、さらにメタノール：水を５５：４５の体積比で混合した溶媒５０ｍＬに溶解させ、４５ｍＬの二塩化メタンで２回抽出した。二塩化メタン層を乾燥させた後、メタノールでさらに溶解させた。
【００５２】
（４）抽出物からの環状デプシペプチドの分離
前記（１）および（２）の培養物から製造された（３）の抽出物それぞれを、シセイドパックＣ１８カラム（０．４６×２５ｃｍ）［資生党、日本］を用いて、アセトニトリル：水を７０：３０の体積比で混合した溶液とともに分当り１ｍＬの流速で４０分間溶出させた。ピークは２１０ｎｍで検出された。
【００５３】
前記（１）のフザリウム制限培地ブロスから抽出した抽出液に対しては２次代謝産物を確認することができなかった（図７）。ところが、前記（２）の穀類培地から抽出した抽出液では９．７分と１３．４分にそれぞれピークを確認することができた（図８）。図６において、９．７分に溶出した化合物は化合物Ａと命名し、１３．４分に溶出した化合物は化合物Ｂと命名して区分した。
【００５４】
Ｇｒｏｍ−ｓｉｌ ｐａｃｋ ＯＤＳ ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｕｍｎ（１．０×２５ｃｍ）を用いて、アセトニトリル：水を６５：３５の体積比で混合した溶液を分当り３ｍＬの流速にして前記化合物ＡおよびＢを分離し、これらの化合物それぞれを、さらにシセイドパックＣ１８カラムを用いて、アセトニトリル：水を７０：３０の体積比で混合した溶液とともに分当り１ｍＬの流速で精製した。
【００５５】
（５）分子量の確認
前記（４）の化合物ＡおよびＢはエレクトロスプレイイオン化質量分析器（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＥＳＩ−ＭＳ）を用いて分子量を測定した結果、その分子量はそれぞれ５８６．３６および６００．３６ｍ／ｚであることを確認することができた（図９および図１０）。
化合物ＡおよびＢは、既存に報告された環状デプシペプチドの分子量と非常に類似であった。報告された化合物の由来、分子量および文献をまとめて表１に示した。
【００５６】
【表１】
Ｓｏｎｇ等（２００６）：Ｓｏｎｇ ＨＨ， Ａｈｎ ＪＨ， Ｌｉｍ ＹＨ， Ｌｅｅ Ｃ， （２００６） Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｅａｕｖｅｒｉｃｉｎ ａｎｄ ｕｎｕｓｕａｌ ｅｎｎｉａｔｉｎｓ ｃｏ−ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ＦＢ１５０１ （ＫＦＣＣ １１３６３Ｐ）． Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６， １１１１１１１９
Ｂｅｌｏｆｓｋｙ等（１９９９）：Ｂｅｌｏｆｓｋｙ ＧＮ， Ｊｅｎｓｅｎ ＰＲ， Ｆｅｎｉｃａｌ Ｗ． （１９９９） Ｓａｎｓａｌｖａｍｉｄｅ： Ａ ｎｅｗ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｙｃｌｉｃ ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ ｍａｒｉｎｅ ｆｕｎｇｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｆｕｓａｒｉｕｍ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ４０， ２９１３−２９１６
Ｃｕｅｔｏ等（２０００）： Ｃｕｅｔｏ Ｍ， Ｊｅｎｓｅｎ ＰＲ， Ｆｅｎｉｃａｌ Ｗ． （２０００） Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｓａｎｓａｌｖａｍｉｄｅ， ａ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｙｃｌｉｃ ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ａ ｍａｒｉｎｅ ｆｕｎｇｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｆｕｓａｒｉｕｍ． Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ５５， ２２３−２２６
Ｏｈ等（２００６）：Ｏｈ ＤＣ， Ｊｅｎｓｅｎ ＰＲ， Ｆｅｎｉｃａｌ Ｗ． （２００６） Ｚｙｇｏｓｐｏｒａｍｉｄｅ， ａ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｙｃｌｉｃ ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍａｒｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｕｎｇｕｓ Ｚｙｇｏｓｐｏｒｉｕｍ ｍａｓｏｎｉｉ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ４７， ８６２５−８６２８
【００５７】
実施例３：環状デプシペプチドの構造分析
（Ａ）化合物Ａ
化合物Ａの機能基確認のためにＦＴ ＩＲ−８４００Ｓ赤外線分光器（ＳＨＩＭＡＤＺＵ、日本）を用いた。化合物ＡはＩＲ分析の結果、アミド結合（１６５４．４２ｃｍ−１）およびエステル結合（１７４５．５２ｃｍ−１）を持っていた（図１１）。最大ＵＶスペクトルはメタノールで２８７ｎｍであり、融解点測定器（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．Ｗａｌｔｈａｍ、米国）で測定した融解点は８２℃であった。
ＩＤ−ＮＭＲ（１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲおよびＤＥＰＴ）測定は、Ｂｒｕｋｅｒ ＤＭＸ ６００スペクトロメーターシステムを用い、２Ｄ−ＮＭＲ（ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣ）はＢｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ８００スペクトロメーターシステムを用いてメタノール（ＣＤ３ＯＤ）で測定した。
１Ｈ ＮＭＲおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトル結果は、化合物Ａが典型的な環状デプシペプチドであることを示した（表２）。
【００５８】
【表２】
【００５９】
ＤＥＰＴおよび２Ｄ−ＮＭＲスペクトル結果（ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣ）は、化合物Ａがロイシン酸（ＯＬｅｕ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、バリン（Ｖａｌ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）およびロイシン（Ｌｅｕ）の５個単位からなっていることを確認可能にした。化合物Ａにおいて、前記５個単位の順序はＨＭＢＣ相関関係データ分析によって決定した（図１２）。
【００６０】
これにより、化合物Ａは化学式２の環状ペンタデプシペプチドであることを確認することができた。
【化３】
化学式２
【００６１】
前記化学式２の化合物は、サンサルバミドとは４つのアミノ酸および１つのヒドロキシ酸の結合順序において差異を示す新規の環状ペンタデプシペプチドであって、ネオ−サンサルバミドと命名した。
【００６２】
（２）化合物Ｂ
化合物Ｂは、ＩＲ分析の結果、アミド結合（１６５３．２４ｃｍ−１）およびエステル結合（１７４２．６５ｃｍ−１）を持っていた（図１３）。最大ＵＶスペクトルはメタノールで２１３ｎｍであり、融解点は８２℃であった。
１Ｄ−ＮＭＲ（１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ、およびＤＥＰＴ）測定は、Ｂｒｕｋｅｒ ＤＭＸ ６００スペクトロメーターシステムを用い、２Ｄ−ＮＭＲ（ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣ）はＢｒｕｋｅｒ ＤＭＸ ６００ スペクトロメーターシステムを用いてＣＤＣｌ３で測定した。
１Ｈ ＮＭＲおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトル結果は、化合物Ｂが典型的な環状デプシペプチドであることを示した（表３）。
【００６３】
【表３】
【００６４】
ＤＥＰＴおよび２Ｄ−ＮＭＲスペクトル結果（ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣ）は、化合物Ｂがロイシン酸（ＯＬｅｕ）、Ｎ−メチルロイシン（Ｎ−ＭｅＬｅｕ）、バリン（Ｖａｌ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）およびロイシン（Ｌｅｕ）の５個単位からなっていることを確認可能にした。化合物Ｂにおいて、前記５個単位の順序はＨＭＢＣ相関関係データ分析によって決定した（図１４）。
【００６５】
これにより、化合物Ｂは化学式１の環状ペンタデプシペプチドであることを確認することができた。
【化４】
化学式１
【００６６】
前記化学式１の化合物は、Ｎ−メチルサンサルバミドとは４つのアミノ酸および１つのヒドロキシ酸の結合順序において差異を示す新規の環状ペンタデプシペプチドであって、ネオ−Ｎ−メチルサンサルバミドと命名した。
【００６７】
（３）立体化学構造の決定
化合物ＡおよびＢに含まれたアミノ酸の立体化学構造を確認するために酸加水分解した後、Ｍａｒｆｅｙ試薬によって各アミノ酸を誘導体化させた後、対照群と共にＨＰＬＣで分析し、その分析結果を図１５（化合物Ａ）および図１６（化合物Ｂ）にそれぞれ示した。化合物ＡびＢに含まれた全てのアミノ酸はＬ型であることを確認することができた。
【００６８】
実施例４：細胞毒性の測定
公知の環状ヘキサデプシペプチド（ビューベリシン、エンニアチンＨ、ＩおよびＭＫ１６８８）と化学式１および２の化合物の多薬剤耐性がない癌細胞株および多薬剤耐性を持つ癌細胞株を対象としてＳＲＢ方法で細胞毒性を測定した。
【００６９】
肺癌細胞株（Ａ５４９）、卵巣癌細胞株（ＳＫ−ＯＶ−３）および皮膚癌細胞株（ＳＫ−ＭＥＬ−２）、子宮肉腫細胞株（ＭＥＡ−ＳＡ）およびその多薬剤耐性癌細胞株（ＭＥＳ−ＳＡ／ＤＸ５）はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国）より購入し、大腸癌細胞株（ＨＣＴ１５）は米国国立癌センターから供給を受け、ＨＣＴ１５の多薬剤耐性癌細胞株（ＨＣＴ１５／ＣＬ０２）はＨＣＴ１５をドキソルビシンに連続的および階段式で露出させて製造された細胞株の供給を韓国化学研究院から受けた。ＥＣ５０は分析条件で５０％の細胞成長が阻害される濃度に決定した。対照群としてドキソルビシンが共に使用された。
【００７０】
【表４】
【００７１】
【表５】
【００７２】
サンサルバミドの粗抽出物が大部分の癌細胞に対して試験管内細胞毒性を示し、大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６に対してＩＣ５０値が９．８μｇ／ｍＬであるとＢｅｌｏｆｓｋｙ等によって報告された［Ｂｅｌｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， １９９９］。また、Ｎ−メチルサンサルバミドの米国国立癌センターの癌細胞株に対する試験管内細胞毒性試験結果においてもＧＩ５０８．３μＭであることがＣｅｕｔｏ等によって報告された［Ｃｅｕｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０００］。表４および表５の結果によれば、化学式１および化学式２の環状ペンタデプシペプチドは、多薬剤耐性の保有有無を問わずに大部分の癌細胞株に対してサンサルバミドＡまたはＮ−メチルサンサルバミドと同等水準の細胞毒性を示した。また、化学式１の環状ペンタデプシペプチドは、化学式２の環状ペンタデプシペプチドに比べて多薬剤耐性癌細胞株に対する増殖抑制活性が優れた（図１７および図２０）。
【００７３】
実施例５：多薬剤耐性抑制活性の測定
化学式１および２の環状ペンタデプシペプチドの多薬剤耐性抑制活性を多薬剤耐性のない癌細胞株（ＭＥＳ−ＳＡおよびＨＣＴ１５）と比較して多薬剤耐性を持つ癌細胞、すなわちＭＥＳ−ＳＡ／ＤＸ５およびＨＣＴ１５／ＣＬ０２で確認した。多薬剤耐性癌細胞株に対するパクリタキセル（ＴＡＸ）の細胞毒性に対する化学式１および２の環状ペンタデプシペプチドの多薬剤耐性の逆転効果を測定した（表６）。対照群としてＰ−糖タンパク質阻害活性を有し、多薬剤耐性抑制剤として用いられているベラパミル（ＶＥＲ）を用いた。
【００７４】
【表６】
【００７５】
化学式２の環状ペンタデプシペプチドは、多薬剤耐性を有する癌細胞株に対するパクリタキセルの細胞毒性に対して若干増進させたが、その幅は大きくなかった。これとは異なり、化学式１の環状ペンタデプシペプチドはパクリタキセルの細胞毒性を顕著に増進させた（図２１〜図２４）。よって、化学式１の環状ペンタデプシペプチドにおいて、Ｎ−メチル基は多薬剤耐性抑制活性の発現に重要な因子であると推定される。化学式１の環状ペンタデプシペプチドは陽性対照群として使用されたベラパミルと類似の多薬剤耐性抑制活性を示した。
【００７６】
実施例６：抗バクテリア活性および抗カビ活性の測定
（１）抗バクテリア活性
３種のグラム陽性菌（Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ １４０２８；Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ３５５５６；Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １３０６１ ）、３種のグラム陰性菌（Ｅ． ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ８７３９；Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ９０２６；Ｓ． ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＡＴＣＣ１４０２８）に対する抗バクテリア活性を測定した。化学式１および化学式２の化合物をそれぞれ０．１、０．５、１および２ｍＭの濃度でＤＭＳＯに溶解させた後、滅菌ペーパーディスク（直径５ｍｍ）に滴下し、ＤＭＳＯは蒸発させた。ＴＳＡ（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ａｇａｒ）に１×１０７ＣＦＵ／ｍＬ濃度のバクテリアを接種し、前記ペーパーディスクをのせて３７℃で２４時間培養した後、クリアゾーンおよびその直径を観察した。
【００７７】
化学式１および２の化合物を試験したバクテリア全体に対して抗バクテリア活性は示していない。
【００７８】
（２）抗カビ活性
４種のカビ菌株（Ｍｕｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）に対する抗カビ活性を測定した。
【００７９】
化学式１および２の化合物をそれぞれ１および１０ｍＭの濃度でメタノールに溶解させた後、滅菌ペーパーディスク（直径８ｍｍ）に滴下し、メタノールは蒸発させた。ポテトデキストロースアガで培養されたカビ菌糸体上に前記ペーパーディスクをのせて２５℃で４８時間培養した後、クリアゾーンとその直径を観察した。対照群として、メタノールのみを滴下したペーパーディスクが使用された。
【００８０】
化学式１および２の化合物は、４種のカビ菌株に対して１ｍＭの濃度では阻害活性を示さなかった。ところが、化学式１および２の化合物は、ムコールルキシー（Ｍｕｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ）に対して、１０ｍＭの濃度ではクリアゾーンが観察されていないが、菌糸成長の阻害は確認することができた（図２５）。化学式２の化合物はフザリウムオキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）に対してクリアゾーンが現れてていないが、化学式１の化合物は弱い阻害活性を示した（図２６）。
【００８１】
実施例７：培地の選定
１×１０５ｓｐｏｒｅ／ｍＬのフザリウムソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）ＫＣＣＭ９００４０を、５０ｇの穀類を滅菌させた後で蒸留水で４０重量％の水分含量に調整した穀類培地に接種し、２５℃で培養しながら一日に一回攪拌して培養した。６種の異なる固体穀類培地で培養したとき、培養期間によって生産される化学式１および２の化合物の生産量をそれぞれ図２７および図２８に示した。
【００８２】
化学式２の化合物は、米培地を用いて２週培養したときに最大生産量（平均０．３７５ｇ／ｋｇ）を示した。米をトウモロコシ、小麦および唐黍に変更すると、生産量は米における生産量に比べて約８０％に減少した。大麦培地では特に０．１１２ｇ／ｋｇと生産量が低かった。
【００８３】
化学式１の化合物も、米培地を用いて２週培養したときに最大生産量（平均０．６８９ｇ／ｋｇ）を示し、小麦培地を用いて３週培養したときに０．６７２ｇ／ｋｇを示した。米をトウモロコシおよびライ麦で代替したとき、化学式１の化合物の生産は約２５％減少した。化学式１の化合物の最終生産量はライ麦または大麦に比べて２倍程度であった。
【００８４】
実施例８：培養条件の選定
本発明のフザリウムソラニＫＣＣＭ９００４０菌株において、化学式１および２の化合物を生産するための培養条件の実験結果は表７に示した。
【表７】
【００８５】
サンサルバミドは海水基材培地で海洋フザリウム菌株を培養したときに０．６４２ｇ／１７Ｌ生産されると報告された［Ｂｅｌｏｆｓｋｙ ＧＮ， Ｊｅｎｓｅｎ ＰＲ， Ｆｅｎｉｃａｌ Ｗ．（１９９９） Ｓａｎｓａｌｖａｍｉｄｅ： Ａ ｎｅｗ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｙｃｌｉｃ ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ ｍａｒｉｎｅ ｆｕｎｇｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｆｕｓａｒｉｕｍ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ４０， ２９１３−２９１６］。また、Ｎ−メチルサンサルバミドは海水基材培地でフザリウムＣＮＬ−６１９菌株を培養したときに３．１ｍｇ／Ｌ生産されると報告された［Ｃｅｕｔｏ Ｍ， Ｊｅｎｓｅｎ ＰＲ， Ｆｅｎｉｃａｌ Ｗ．（２０００） Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｓａｎｓａｌｖａｍｉｄｅ， ａ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｙｃｌｉｃ ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ａ ｍａｒｉｎｅ ｆｕｎｇｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｆｕｓａｒｉｕｍ Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ５５， ２２３−２２６］。
【００８６】
本発明のフザリウム菌株を米培地で培養したとき、化学式１と２の化合物を生産するのに適した培養条件は温度２０〜３０℃、湿度２０〜５０％、培養期間１０〜２０日であり、さらに好ましい培養条件は温度２３〜２８℃、湿度３５〜４５％、培養期間１３〜１８日であり、最適条件は、化学式１の環状ペンタデプシペプチドの場合、温度２５．８４℃、湿度３７．９９％、培養期間１６．０３日である（図２９〜図３１）。化学式２の環状ペンタデプシペプチドの場合は、温度２５．８７℃、湿度３３．８７％、培養期間１５．５８日が最適条件であった。前記最適条件で培養したとき、化学式１の環状ペンタデプシペプチドは０．７ｇ／ｋｇ生産され、化学式２の環状ペンタデプシペプチドは０．４ｇ／ｋｇ生産された。
【００８７】
製剤例１：錠剤の製造
成分含量
化学式１または化学式２の環状ペンタデプシペプチド １００ｍｇ
コーンスターチ ６８ｍｇ
ラクトース ９０ｍｇ
微細結晶質セルロース ４０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
【００８８】
通常の錠剤の製造方法によって、前記成分を提示された含量で添加して均一に混合し、攪拌した後、顆粒化した。次いで、乾燥の後、打錠器を用いて、１錠当り有効成分として化学式１または化学式２の環状ペンタデプシペプチドが１００ｍｇ含有された錠剤を製造した。
【００８９】
製剤例２：注射剤の製造
成分含量
化学式１または化学式２の環状ペンタデプシペプチド ５０ｍｇ
メタ重亜硫酸ナトリウム １．５ｍｇ
メチルパラベン １．０ｍｇ
プロピルパラベン ０．１ｍｇ
注射用精製水 適量
【００９０】
通常の注射剤の製造方法によって、前記成分を提示された含量で沸騰水に攪拌しながら溶解させた後、冷却させて２ｍＬ容量の滅菌バイアルに充填し、適量の注射用精製水を２ｍＬとなるように補充してバイアル１個当り５０ｍｇの化学式１または化学式２の環状ペンタデプシペプチドを含む注射剤を製造した。
【００９１】
製剤例３：シロップ剤の製造
成分含量
化学式１または化学式２の環状ペンタデプシペプチド ２００ｍｇ
濃縮果汁 ２ｇ
スクロース ５ｇ
クエン酸ナトリウム １００ｍｇ
香料 ７０ｍｇ
水 適量
【００９２】
通常のシロップの製造方法によって、前記成分を提示された含量で適量の水に混合し、加熱して溶解させた後、冷却させ、容器に充填して２００ｍＬ容量の飲料１瓶当り２００ｍｇの化学式１または化学式２の環状ペンタデプシペプチドを含むシロップ剤を製造した。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明の環状ペンタデプシペプチドは、多様な癌細胞に対して細胞毒性を示すので、腫瘍治療剤として使用でき、ひいては細胞の薬剤耐性抑制剤として使用できる。また、本発明のフザリウム菌株は、癌細胞に対する細胞毒性および薬剤耐性抑制活性を示す環状ペンタデプシペプチドを生産する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１または下記化学式２の環状ペンタデプシペプチドを生産するフザリウム属菌株。
【化１】
化学式１
【化２】
化学式２
【請求項２】
フザリウムソラニであることを特徴とする、請求項１に記載の菌株。
【請求項３】
前記フザリウムソラニがフザリウムソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）ＫＣＣＭ９００４０［寄託番号ＫＣＣＭ１０８８１Ｐ］であることを特徴とする、請求項２に記載の菌株。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項の菌株を培養して請求項１の化学式１または化学式２の環状ペンタデプシペプチドを生産する方法。
【請求項５】
前記培養は穀類を用いた固体培養であることを特徴とする、請求項４に記載の環状ペンタデプシペプチドを生産する方法。
【請求項６】
前記穀類が米であることを特徴とする、請求項５に記載の環状ペンタデプシペプチドを生産する方法。
【請求項７】
前記培養条件は温度２０〜３０℃、湿度２０〜５０％、培養期間１０〜２０日であることを特徴とする、請求項５に記載の環状ペンタデプシペプチドを生産する方法。
【請求項８】
下記化学式１の環状ペンタデプシペプチド。
【化３】
化学式１
【請求項９】
下記化学式２の環状ペンタデプシペプチド。
【化４】
化学式２
【請求項１０】
下記化学式１の環状ペンタデプシペプチド、下記化学式２の環状ペンタデプシペプチドおよびこれらの薬学的に許容される塩よりなる群から選ばれる少なくとも一つを有効成分として含有する、薬剤耐性抑制用薬学組成物。
【化５】
化学式１
【化６】
化学式２
【請求項１１】
腫瘍細胞の薬剤耐性抑制用であることを特徴とする、請求項１０に記載の薬剤耐性抑制用薬学組成物。
【請求項１２】
下記化学式１の環状ペンタデプシペプチド、下記化学式２の環状ペンタデプシペプチドおよびこれらの薬学的に許容される塩よりなる群から選ばれる少なくとも一つを有効成分として含有する、腫瘍細胞増殖抑制活性を有する癌治療用薬学組成物。
【化７】
化学式１
【化８】
化学式２
【請求項１】
下記化学式１または下記化学式２の環状ペンタデプシペプチドを生産するフザリウム属菌株。
【化１】
化学式１
【化２】
化学式２
【請求項２】
フザリウムソラニであることを特徴とする、請求項１に記載の菌株。
【請求項３】
前記フザリウムソラニがフザリウムソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）ＫＣＣＭ９００４０［寄託番号ＫＣＣＭ１０８８１Ｐ］であることを特徴とする、請求項２に記載の菌株。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項の菌株を培養して請求項１の化学式１または化学式２の環状ペンタデプシペプチドを生産する方法。
【請求項５】
前記培養は穀類を用いた固体培養であることを特徴とする、請求項４に記載の環状ペンタデプシペプチドを生産する方法。
【請求項６】
前記穀類が米であることを特徴とする、請求項５に記載の環状ペンタデプシペプチドを生産する方法。
【請求項７】
前記培養条件は温度２０〜３０℃、湿度２０〜５０％、培養期間１０〜２０日であることを特徴とする、請求項５に記載の環状ペンタデプシペプチドを生産する方法。
【請求項８】
下記化学式１の環状ペンタデプシペプチド。
【化３】
化学式１
【請求項９】
下記化学式２の環状ペンタデプシペプチド。
【化４】
化学式２
【請求項１０】
下記化学式１の環状ペンタデプシペプチド、下記化学式２の環状ペンタデプシペプチドおよびこれらの薬学的に許容される塩よりなる群から選ばれる少なくとも一つを有効成分として含有する、薬剤耐性抑制用薬学組成物。
【化５】
化学式１
【化６】
化学式２
【請求項１１】
腫瘍細胞の薬剤耐性抑制用であることを特徴とする、請求項１０に記載の薬剤耐性抑制用薬学組成物。
【請求項１２】
下記化学式１の環状ペンタデプシペプチド、下記化学式２の環状ペンタデプシペプチドおよびこれらの薬学的に許容される塩よりなる群から選ばれる少なくとも一つを有効成分として含有する、腫瘍細胞増殖抑制活性を有する癌治療用薬学組成物。
【化７】
化学式１
【化８】
化学式２
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【公表番号】特表２０１１−５０５８７７（Ｐ２０１１−５０５８７７Ａ）
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４４８８０（Ｐ２０１０−５４４８８０）
【出願日】平成２１年１月２日（２００９．１．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／０００００５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７６９０５
【国際公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【出願人】（５０７４１５３０３）チュン−アン ユニバーシティー インダストリー−アカデミー コーポレーション ファンデーション (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月２日（２００９．１．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／０００００５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７６９０５
【国際公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【出願人】（５０７４１５３０３）チュン−アン ユニバーシティー インダストリー−アカデミー コーポレーション ファンデーション (4)
【Ｆターム（参考）】
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