環状ホスファチジン酸の製造方法
【課題】不純物となるリゾホスファチジン酸を高度に除去することができる環状ホスファチジン酸の製造方法を提供する。
【解決手段】リゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させることによる環状ホスファチジン酸の製造方法において、リゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させることにより産生したリゾホスファチジン酸にホスファチジン酸ホスファターゼを作用させることを特徴とする環状ホスファチジン酸の製造方法。
【解決手段】リゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させることによる環状ホスファチジン酸の製造方法において、リゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させることにより産生したリゾホスファチジン酸にホスファチジン酸ホスファターゼを作用させることを特徴とする環状ホスファチジン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホリパーゼＤ及びホスファチジン酸ホスファターゼを用いた環状ホスファチジン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環状ホスファチジン酸（以下、ｃＰＡと略すこともある）は、癌細胞の転移及び浸潤を阻害する等の生理活性を有することが知られ（非特許文献１を参照）、抗腫瘍剤を含む医薬品や機能性食品としての用途が期待されている。また、環状ホスファチジン酸の誘導体は、神経細胞の生存細胞の生存促進、伸張促進等の効果を有し、痴呆やアルツハイマー病等の神経障害治療剤としての用途が期待されている（特許文献１を参照）。
【０００３】
従来、このような環状ホスファチジン酸の調整方法としては、化学的に合成する方法（例えば、特許文献２〜５参照）や、リゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させることによる酵素を用いた方法（特許文献６を参照）が知られている。この酵素的方法は、ホスホリパーゼＤが、リン脂質に作用した場合に、リン酸と塩基部分のエステル結合を加水分解する活性の他に、同時にホスファチジル基をＯＨ基へ転移する反応（ホスファチジル転移反応）をも触媒することを利用したものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−３０８７７８
【特許文献２】特開平５−２３００８８
【特許文献３】特開平７−１４９７７２
【特許文献４】特開平７−２５８２７８
【特許文献５】特開平９−２５２３５
【特許文献６】特開２００１−１７８４８９
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １５２８ （２００２）、ｐ．１−７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
環状ホスファチジン酸は不安定であることから、上述の化学的合成法では高収率で目的物である環状ホスファチジン酸を得ることが困難であるという問題があった。また、上述のリゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させることによる酵素的製法は簡便で低コストではあるが、ホスホリパーゼＤが、リゾ型リン脂質のリン酸部分とコリン部分とのエステル結合を加水分解する活性を有することから、環状ホスファチジン酸を含む最終産物に加水分解生成物であるリゾホスファチジン酸（以下、ＬＰＡと称すことがある）が相当量混入してしまうという問題があった。そこで、本発明は、環状ホスファチジン酸を高収率かつ高純度に製造することができる簡易な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、係る従来技術の問題点を解決するために、環状ホスファチジン酸の製造方法について鋭意検討した結果、リゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させた場合に生じるリゾホスファチジン酸に、さらに特定の放線菌由来のホスファチジン酸ホスファターゼを作用させると、リゾホスファチジン酸を中性脂質に変換することができることを見出した。本発明は係る知見に基づいてなされたものである。
【０００８】
すなわち、本発明の態様は以下に関する。
（１） リゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させることによる環状ホスファチジン酸の製造方法において、リゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させることにより産生したリゾホスファチジン酸にホスファチジン酸ホスファターゼを作用させることを特徴とする環状ホスファチジン酸の製造方法。
（２） 前記リゾ型リン脂質が、一般式（Ｉ）：
【化１】
（式中、Ｒは、炭素数１〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基、又は炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基であり、これらの基はシクロアルカン環又は芳香環を含んでいてもよく、Ｃｈｏは、コリンを示す。）で表されるリゾホスファチジルコリンである（１）に記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
（３） 前記ホスホリパーゼＤが、キャベツ、落花生、ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ.）及びアクチノマデュラ エスピー．（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｌａ ｓｐ．）からなる群から選択される少なくとも一に由来する（１）又は（２）に記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
（４） 前記ホスホリパーゼＤが、アクチノマデュラ エスピー．（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｌａ ｓｐ．）に由来する（１）〜（３）のいずれかに記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
（５） 前記ホスファチジン酸ホスファターゼが、ストレプトマイセス(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ)属に属する菌株に由来するものである（１）〜（４）のいずれかに記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
（６） 前記ホスファチジン酸ホスファターゼが、ストレプトマイセス・ミラビリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）に由来するものである（１）〜（５）のいずれかに記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
（７） 前記リゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させて得られる産物に、前記ホスファチジン酸ホスファターゼを作用させる（１）〜（６）のいずれかに記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
（８） 前記ホスホリパーゼＤをリゾホスファチジルコリンに作用させた後に、反応液を有機溶媒で抽出する（１）〜（７）のいずれかに記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
（９） 前記ホスホリパーゼＤをリゾホスファチジルコリンに作用させた後に、低ｐH処理あるいは加熱処理によってホスホリパーゼDを失活させる（１）〜（７）のいずれかに記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
（１０） （１）〜（９）のいずれか１項に記載の環状ホスファチジン酸の製造方法により製造された環状ホスファチジン酸を含有してなる組成物。
（１１） 環状ホスファチジン酸を構成する脂肪酸が、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸の一種または二種以上からなることを特徴とする（１０）に記載の環状ホスファチジン酸を含有してなる組成物。
（１２） 組成物が、医薬品、医薬部外品、化粧品または飲食品である、（１０）または（１１）に記載の環状ホスファチジン酸を含有してなる組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ホスホリパーゼＤとリゾ型リン脂質を反応させることにより環状ホスファチジン酸を生産するとともに、副産物であるリゾホスファチジン酸にホスファチジン酸ホスファターゼを作用させて除去することができることから、高純度かつ高収率で環状ホスファチジン酸を製造することが可能である。また、本発明は、酵素を用いた方法であることから、簡便に環状ホスファチジン酸を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例において精製したホスファチジン酸ホスファターゼの活性に対するｐＨの影響を示すグラフである。
【図２】実施例において精製したホスファチジン酸ホスファターゼの活性に対するＣａ２＋、Ｍｇ２＋及びＭｎ２＋の影響を示すグラフである。
【図３】リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）とホスホリパーゼＤとの反応を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明は、リゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させることにより環状ホスファチジン酸の製造方法において、リゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させたことにより産生されたリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）にホスファチジン酸ホスファターゼを作用させることを特徴とする。リゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させると、その主要生成物である環状ホスファチジン酸（ｃＰＡ）が産生されるとともに、副産物としてリゾホスファチジン酸も高い割合で生成される。本発明では、この副産物にホスファチジン酸ホスファターゼを作用させることにより、ＬＰＡを１−モノアシルグリセロールに変換して、これを除去することにより、高い純度のｃＰＡを得ることが可能となる。
【００１２】
本発明において、リゾ型リン脂質とは、ホスホリパーゼＤが作用し得るものであれば特に限定されない。リゾ型リン脂質は既に多種多様のものが知られており、脂肪酸種の異なるもの、エーテル又はビニルエーテル結合をもった分子種などが知られている。これらは市販品としても入手可能である。
【００１３】
本発明において用いられるリゾ型リン脂質は、ホスホリパーゼＤの基質特異性を考慮すると、一般式（Ｉ）で表されるリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）であることが好ましい。
【化２】
（式中、Ｒは、炭素数１〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基、又は炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基であり、これらの基はシクロアルカン環又は芳香環を含んでいてもよく、Ｃｈｏは、コリンを示す。）
【００１４】
一般式（Ｉ）において、置換基Ｒが示す炭素数１〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキル基の具体例としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ペンタデシル基、オクタデシル基などが挙げられる。
【００１５】
置換基Ｒが示す炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基の具体例としては、例えば、アリル基、ブテニル基、オクテニル基、デセニル基、ドデカジエニル基、ヘキサデカトリエニル基などが挙げられ、より具体的には、８−デセニル基、８−ウンデセニル基、８−ドデセニル基、８−トリデセニル基、８−テトラデセニル基、８−ペンタデセニル基、８−ヘキサデセニル基、８−ヘプタデセニル基、８−オクタデセニル基、８−イコセニル基、８−ドコセニル基、ヘプタデカ−８，１１−ジエニル基、ヘプタデカ−８，１１，１４−トリエニル基、ノナデカ−４，７，１０，１３−テトラエニル基、ノナデカ−４，７，１０，１３，１６−ペンタエニル基、ヘニコサ−３，６，９，１２，１５，１８−ヘキサエニル基などが挙げられる。
【００１６】
置換基Ｒが示す炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基の具体例としては、例えば、８−デシニル基、８−ウンデシニル基、８−ドデシニル基、８−トリデシニル基、８−テトラデシニル基、８−ペンタデシニル基、８−ヘキサデシニル基、８−ヘプタデシニル基、８−オクタデシニル基、８−イコシニル基、８−ドコシニル基、ヘプタデカ−８，１１−ジイニル基などが挙げられる。
【００１７】
上記のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基に含有されうるシクロアルカン環の具体例としては、例えば、シクロプロパン環、シクロブタン環、シクロペンタン環、シクロヘキサン環、シクロオクタン環などが挙げられる。シクロアルカン環は、1個以上のヘテロ原子を含んでいてもよく、そのような例としては、例えば、オキシラン環、オキセタン環、テトラヒドロフラン環、Ｎ−メチルプロリジン環などが挙げられる。上記のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基に含有されうる芳香環の具体例としては、例えば、ベンゼン環、ナフタレン環、ピリジン環、フラン環、チオフェン環などが挙げられる。従って、置換基Ｒがシクロアルカン環によって置換されたアルキル基である場合の具体例としては、例えば、シクロプロピルメチル基、シクロヘキシルエチル基、８，９−メタノペンタデシル基などが挙げられる。置換基Ｒが芳香環によって置換されたアルキル基である場合の具体例としては、ベンジル基、フェネチル基、ｐ−ペンチルフェニルオクチル基などが挙げられる。
【００１８】
本発明において用いられるホスホリパーゼＤは、上記リゾ型リン脂質に作用させた場合に、ｃＰＡを生成するものであれば特に限定されるものではない。具体的には、キャベツや落花生などの高等植物由来のものやストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ sp.）、アクチノマデュラ エスピー．（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｌａ ｓｐ．）などの微生物由来のものが市販試薬として入手可能である。このうち、ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ.）又はアクチノマデュラ エスピー．（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｌａ ｓｐ．）に由来するホスホリパーゼＤが好ましく、アクチノマデュラ エスピー．（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｌａ ｓｐ．）Ｎｏ．３６２由来のホスホリパーゼＤがより好ましく用いられる。
【００１９】
リゾ型リン脂質とホスホリパーゼＤとの反応は、酵素が活性を発現できる条件であれば特に限定されず、公知の反応条件により行うことができる。具体的には、塩化カルシウムを含有する酢酸緩衝液（ｐＨ５〜６程度）中で室温から加温下（例えば、２５〜４５℃、好ましくは３０〜４３℃、より好ましくは３０〜４３℃）で１〜３０時間程度反応させることにより行う。
【００２０】
上述の通り、リゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させることにより、ｃＰＡが産生されると同時に、相当量のＬＰＡも産生されることになる。本発明では、このＬＰＡにホスファチジン酸ホスファターゼを作用させ脱リン酸化させる。
【００２１】
本発明で用いられるホスファチジン酸ホスファターゼは、上述のＬＰＡに作用し得るものであれば特に限定されるものではない。具体的には、放線菌由来のものが挙げられ、ストレプトマイセス(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ)属に属する菌株に由来のものが好ましく用いられる。より好ましくは、ストレプトマイセス・ミラビリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）に由来するホスファチジン酸ホスファターゼを用いることが好ましい。
【００２２】
ホスファチジン酸ホスファターゼとＬＰＡとの反応条件は、酵素が活性を発現できる条件であれば特に限定されない。具体的には、酢酸緩衝液中で例えば、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン等を添加した酢酸緩衝液中で室温から加温下（例えば、２５〜４５℃、好ましくは３０〜４３℃、より好ましくは３０〜４３℃）で１〜３０時間程度反応させることにより行う。特に、塩化カルシウムを用いることが好ましく、緩衝液中の最終濃度で０．０１〜３０ｍＭの範囲で加えることができる。反応溶液（緩衝液）のｐＨは、通常４〜７の範囲に調整することが可能であり、好ましくは４．５〜６、より好ましくは５〜６の範囲に調整することができる。
【００２３】
本発明では、出発材料となるＬＰＣを含む反応系に最初にホスホリパーゼＤを添加し、その後、ホスファチジン酸ホスファターゼを添加しても良いし、当該反応系にホスホリパーゼＤとホスファチジン酸ホスファターゼとを同時に添加しても良い。ホスホリパーゼＤとホスファチジン酸ホスファターゼを同時に反応系に添加した場合には、上述のホスファチジン酸ホスファターゼの反応条件により、両酵素の反応を行うことができる。
【００２４】
また、本発明では、ホスホリパーゼＤとホスファチジン酸ホスファターゼとを同一の反応系に添加することも可能であるが、ホスホリパーゼＤをＬＰＣに作用させた後、低ｐH処理あるいは加熱処理によるホスフォリパーゼDを失活させた後ホスファチジン酸ホスファターゼ反応に供するか、一旦反応産物を抽出／精製してもよい。さらに、本発明では、ホスファチジン酸ホスファターゼをＬＰＡに作用させた後、反応液に対して抽出／精製操作を行うことにより、最終産物として環状ホスファチジン酸を得ることができる。
【００２５】
上述の抽出／精製は、有機溶媒を用いた抽出、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）等により行うことができ、目的とする精製度等に応じて適宜これらを組合せてもよい。これらの方法のうち、好ましい方法としては、有機溶媒による抽出である。用いられる有機溶媒は、目的となるｃＰＡを抽出できるものであれば、特に限定されない。例えば、ヘキサン、エチルアルコール、メチルアルコール、酢酸エチル、エチルエーテル、トルエン、クロロホルムとメタノールの混合液を用いて抽出することができる。クロロホルムとメタノールとの比は、２：1が好ましい。
【００２６】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
【００２７】
１． ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）活性測定
0.１M酢酸緩衝液（ｐH5.5）、１ｍMホスファチジン酸、１ｍM塩化カルシウムから成る反応液１ｍｌに０．０５ｍｌの酵素液を添加し正確に１０分間反応させた後、１０％トリクロロ酢酸０．２５ｍｌ、次いで１０％牛血清アルブミン溶液０．２５ｍｌを添加し混合した。濾紙で濾過した濾液１ｍｌに無機リン発色試薬（モリブデン溶液）を添加して発色させ、６５０nmにおける吸光度を測定した。１分間１マイクロモルの無機リンを遊離する活性を１単位とした。
【００２８】
２．ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）の精製
ストレプトマイセス・ミラビリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）を、１％ペプトン、０．５％酵母エキス、0.3％食塩、0.1％硫酸マグネシウムからなる培地で、２８℃、１２０時間の条件で通気攪拌培養した。以下の手順により、菌体から培養液中に分泌されたＰＡＰを精製した。
【００２９】
培養後の培養液を６０００回転１０分間遠心分離して得られた上清液をアセトン沈殿に供し、沈殿物を１０ｍMトリス‐塩酸緩衝液（ｐH7.2）に溶解した。この溶液について、オクチルセファロース（ファルマシア社製）を用いた疎水性アフィニティクロマトグラフィを利用して精製し、ＰＡＰの活性を有する溶出画分をセントリフロー（アミコン社製）を用いて濃縮し、さらに、アセトン沈殿処理を施し、得られた沈殿物を１０ｍMトリス‐塩酸緩衝液（ｐH7.2）に溶解した。該溶液について、ＤＥＡＥ−セファデックスA25（ファルマシア社製）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、次いでセファデックスＧ−７５（ファルマシア社製）、Ｇ−１００（ファルマシア社製）によるゲル濾過クロマトグラフィーによる各精製工程を経てＰＡＰを精製した。
【００３０】
また、各精製工程における、総タンパク質、ＰＡＰの全活性、比活性及び回収率を求めた。その結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】
３．ＰＡＰの諸物性の解析
（１）等電点及び分子量
キャリア・アンフォライトを用いた電気泳動の結果、上記精製したＰＡＰの等電点はｐＨ４．８であった。
また、ゲル濾過法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によりＰＡＰの分子量を分析した結果は、それぞれ、１８０００Ｄａ、１７５００Ｄａであった。本酵素は、比較的小さい分子量を有しており、ホスホリパーゼＤと同様に単量体で存在するものと考えられた。
【００３３】
（２）ＰＡＰ反応へのｐＨの影響
ホスファチジン酸（ＰＡ）を基質として、上記精製したＰＡＰによる反応への反応液のｐＨの影響を分析した。ｐH３．０はグリシン‐塩酸緩衝液、ｐH４．０〜６．０は酢酸緩衝液を用いて、ｐH7.0〜１０．０はトリス‐塩酸緩衝液を用いた。
ＰＡＰによる反応は、ｐＨ４．０〜７．０の範囲でホスファチジン酸（ＰＡ）に作用し、ｐＨ５．５付近で最大の活性を示した（図１を参照）。
【００３４】
（３）ＰＡＰ反応への陽イオンの影響
ＰＡを基質として、上記精製したＰＡＰによる反応液への陽イオン添加の影響について調べた。その結果を表２に示す。
ＰＡＰ反応は一価の陽イオン（Ｎａ+、Ｋ+、Ｌｉ+、ＮＨ4+）により２０〜４０％活性化された。二価の陽イオンについては、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、Ｍｎ2+は１．５〜２倍に活性化するが、Ｚｎ2+、Ｃｕ2+、Ｂａ2+では阻害が見られた（表２を参照）。活性化作用のあるものについて、濃度依存性を調べてみると、Ｃａ2+及びＭｇ2+は類似した挙動を示した。図２に示されるように、Ｃａ2+及びＭｇ2+では、１ｍＭが至適濃度であり、最大１．５倍に活性化された。また、Ｍｎ2+では１０ｍＭが最適濃度であり、約２．３倍に活性化された。
【００３５】
【表２】
【００３６】
ＥＤＴＡによりＰＡＰ反応は完全に阻害された（表２参照）ことと、ＰＡＰ中にＣａ2+、Ｍｇ2+の存在が確かめられ（ＰＡＰ１１．６μＭに対しＣａ７．７３μＭ、Ｍｇ５．７５μＭ）ことから、ＰＡＰ反応は二価の陽イオンを必須の因子とするものと考えられた。
【００３７】
（４）ＰＡＰ反応への界面活性剤の影響
ＰＡに対するＰＡＰの作用は非イオン性界面活性剤（トリトンＸ−１００、アデカトールＳＯ−１２０、ツイーン２０）により、わずかに活性化されたが、ＤＯＣを除く陰イオン性界面活性剤や陽イオン性界面活性剤で阻害された（表３参照）。
【００３８】
【表３】
【００３９】
（４）基質特異性
次に、上記精製したＰＡＰの基質特異性について調べた。その結果を表４に示す。
本酵素はＰＡに対し最も良く作用するが、本発明においてターゲットとなるＬＰＡ、セラミドリン酸（ＣＥＰ）等の脂溶性のリン酸モノエステル化合物にも作用することが判明した。しかし、グリセロリン酸やコリンリン酸の様な水溶性リン酸モノエステル及びＧＰＣのようなリン酸ジエステル化合物には全く作用しなかった（表４を参照）。
【００４０】
【表４】
【００４１】
（実施例１）
リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ；シグマ社製）１ｇに、反応溶媒として１０ｍＭ塩化カルシウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）２０ｍＬを添加し、４０℃に加温して溶解させた。その後、ホスホリパーゼＤ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｓｐ.由来、名糖産業社製）の酵素液（１００Ｕ／ｍＬ）５ｍＬを加えて、４０℃で連続攪拌しながら１８時間反応させた。反応の進行度は薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと称すことがある）で確認した。ＴＬＣは、Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０(メルク社製)を用いて、展開溶媒はクロロホルム：メタノール：酢酸：５％二亜硫酸ナトリウム水溶液（＝１００：４０：１２：５、Ｖ／Ｖ）で展開した。Ｒｆ値は、ＬＰＣが約０．１、環状ホスファチジン酸（ｃＰＡ）が約０．５、副産物であるリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が約０．３であった。反応終了後、クロロホルム：メタノール（２：１）２０ｍＬを添加し、十分攪拌した後、３０００ｒｐｍ、２分間で遠心分離し、クロロホルム層（下層）を集めた。さらに、残った水層にクロロホルム：メタノール（２：１）２０ｍＬを添加して十分攪拌した後、同条件で遠心分離し、クロロホルム層（下層）を集めた。１回目のクロロホルム層と２回目のクロロホルム層とを合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮して脂質成分８２０ｍｇを得た。
【００４２】
得られた脂質８２０ｍｇに、反応溶媒として２０ｍＭ塩化カルシウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）２０ｍＬを添加し、４０℃に加温して溶解させた。その後、上記の精製したホスファチジン酸ホスファターゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ由来）酵素液（２５Ｕ／ｍＬ）５ｍＬを添加し、４０℃で連続攪拌して１８時間反応させた。反応液に、クロロホルム：メタノール（２：１）２０ｍＬを添加し、十分に攪拌した後、３０００ｒｐｍ、２分間で遠心分離し、クロロホルム層（下層）を集めた。さらに、残った水槽にクロロホルム：メタノール（２：１）２０ｍＬを添加し、十分に攪拌した後、同条件で遠心分離し、クロロホルム層（下層）を集めた。１回目のクロロホルム層と２回目のクロロホルム層とを合わせて、ロータリーエバポレーターで濃縮し、８１０ｍｇの脂質成分を得た。固形分に２０ｍＬのアセトンを添加し、攪拌し、３０００ｒｐｍ、２分間で遠心分離して上清（可溶性成分）を除去した。不溶性成分を減圧乾固させＣＰＡ粉末４８７ｍｇを得た。
【００４３】
（比較例１）
リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ；シグマ社製）１．５ｇに、反応溶媒として１０ｍＭ塩化カルシウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）３０ｍＬを添加し、４０℃に加温して溶解させた。その後、ホスホリパーゼＤ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｓｐ.由来、名糖産業社製）の酵素液（１００Ｕ／ｍＬ）７．５ｍＬを加えて、４０℃で連続攪拌しながら１８時間反応させた。反応終了後、クロロホルム：メタノール（２：１）３０ｍＬを添加し十分に攪拌した後、３０００ｒｐｍ、２分間の条件で遠心分離し、クロロホルム層（下層）を集めた。さらに、残った水層にクロロホルム：メタノール（２：１）３０ｍＬを添加して、十分に攪拌した後、遠心分離によりクロロホルム層（下層）を集めた。１回目のクロロホルム層と２回目のクロロホルム層とを合わせてロータリーエバポレーターで濃縮し、脂質成分１．３５ｇを得た。
【００４４】
＜成分分析＞
実施例１及び比較例１で得られた脂質の試料にし、ＴＬＣ後のクロマトグラフをスキャニング法で成分分析を行った。
その成分分析の結果を以下の表５に示す。
【００４５】
【表５】
【００４６】
上記表５に示す通り、ホスファチジン酸ホスファターゼの処理工程が設けられた実施例１では、副産物のＬＰＡが最終産物に混入しておらず、高純度のｃＰＡが得られた。一方、ホスファチジン酸ホスファターゼの処理工程を設けなかった比較例１の最終産物には、高い割合でＬＰＡが混入していることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明によれば、高純度かつ多量の環状ホスファチジン酸を簡便に製造することができるので、本発明は、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品等の分野において高い産業上の利用可能性を有する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホリパーゼＤ及びホスファチジン酸ホスファターゼを用いた環状ホスファチジン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環状ホスファチジン酸（以下、ｃＰＡと略すこともある）は、癌細胞の転移及び浸潤を阻害する等の生理活性を有することが知られ（非特許文献１を参照）、抗腫瘍剤を含む医薬品や機能性食品としての用途が期待されている。また、環状ホスファチジン酸の誘導体は、神経細胞の生存細胞の生存促進、伸張促進等の効果を有し、痴呆やアルツハイマー病等の神経障害治療剤としての用途が期待されている（特許文献１を参照）。
【０００３】
従来、このような環状ホスファチジン酸の調整方法としては、化学的に合成する方法（例えば、特許文献２〜５参照）や、リゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させることによる酵素を用いた方法（特許文献６を参照）が知られている。この酵素的方法は、ホスホリパーゼＤが、リン脂質に作用した場合に、リン酸と塩基部分のエステル結合を加水分解する活性の他に、同時にホスファチジル基をＯＨ基へ転移する反応（ホスファチジル転移反応）をも触媒することを利用したものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−３０８７７８
【特許文献２】特開平５−２３００８８
【特許文献３】特開平７−１４９７７２
【特許文献４】特開平７−２５８２７８
【特許文献５】特開平９−２５２３５
【特許文献６】特開２００１−１７８４８９
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １５２８ （２００２）、ｐ．１−７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
環状ホスファチジン酸は不安定であることから、上述の化学的合成法では高収率で目的物である環状ホスファチジン酸を得ることが困難であるという問題があった。また、上述のリゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させることによる酵素的製法は簡便で低コストではあるが、ホスホリパーゼＤが、リゾ型リン脂質のリン酸部分とコリン部分とのエステル結合を加水分解する活性を有することから、環状ホスファチジン酸を含む最終産物に加水分解生成物であるリゾホスファチジン酸（以下、ＬＰＡと称すことがある）が相当量混入してしまうという問題があった。そこで、本発明は、環状ホスファチジン酸を高収率かつ高純度に製造することができる簡易な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、係る従来技術の問題点を解決するために、環状ホスファチジン酸の製造方法について鋭意検討した結果、リゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させた場合に生じるリゾホスファチジン酸に、さらに特定の放線菌由来のホスファチジン酸ホスファターゼを作用させると、リゾホスファチジン酸を中性脂質に変換することができることを見出した。本発明は係る知見に基づいてなされたものである。
【０００８】
すなわち、本発明の態様は以下に関する。
（１） リゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させることによる環状ホスファチジン酸の製造方法において、リゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させることにより産生したリゾホスファチジン酸にホスファチジン酸ホスファターゼを作用させることを特徴とする環状ホスファチジン酸の製造方法。
（２） 前記リゾ型リン脂質が、一般式（Ｉ）：
【化１】
（式中、Ｒは、炭素数１〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基、又は炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基であり、これらの基はシクロアルカン環又は芳香環を含んでいてもよく、Ｃｈｏは、コリンを示す。）で表されるリゾホスファチジルコリンである（１）に記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
（３） 前記ホスホリパーゼＤが、キャベツ、落花生、ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ.）及びアクチノマデュラ エスピー．（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｌａ ｓｐ．）からなる群から選択される少なくとも一に由来する（１）又は（２）に記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
（４） 前記ホスホリパーゼＤが、アクチノマデュラ エスピー．（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｌａ ｓｐ．）に由来する（１）〜（３）のいずれかに記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
（５） 前記ホスファチジン酸ホスファターゼが、ストレプトマイセス(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ)属に属する菌株に由来するものである（１）〜（４）のいずれかに記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
（６） 前記ホスファチジン酸ホスファターゼが、ストレプトマイセス・ミラビリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）に由来するものである（１）〜（５）のいずれかに記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
（７） 前記リゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させて得られる産物に、前記ホスファチジン酸ホスファターゼを作用させる（１）〜（６）のいずれかに記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
（８） 前記ホスホリパーゼＤをリゾホスファチジルコリンに作用させた後に、反応液を有機溶媒で抽出する（１）〜（７）のいずれかに記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
（９） 前記ホスホリパーゼＤをリゾホスファチジルコリンに作用させた後に、低ｐH処理あるいは加熱処理によってホスホリパーゼDを失活させる（１）〜（７）のいずれかに記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
（１０） （１）〜（９）のいずれか１項に記載の環状ホスファチジン酸の製造方法により製造された環状ホスファチジン酸を含有してなる組成物。
（１１） 環状ホスファチジン酸を構成する脂肪酸が、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸の一種または二種以上からなることを特徴とする（１０）に記載の環状ホスファチジン酸を含有してなる組成物。
（１２） 組成物が、医薬品、医薬部外品、化粧品または飲食品である、（１０）または（１１）に記載の環状ホスファチジン酸を含有してなる組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ホスホリパーゼＤとリゾ型リン脂質を反応させることにより環状ホスファチジン酸を生産するとともに、副産物であるリゾホスファチジン酸にホスファチジン酸ホスファターゼを作用させて除去することができることから、高純度かつ高収率で環状ホスファチジン酸を製造することが可能である。また、本発明は、酵素を用いた方法であることから、簡便に環状ホスファチジン酸を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例において精製したホスファチジン酸ホスファターゼの活性に対するｐＨの影響を示すグラフである。
【図２】実施例において精製したホスファチジン酸ホスファターゼの活性に対するＣａ２＋、Ｍｇ２＋及びＭｎ２＋の影響を示すグラフである。
【図３】リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）とホスホリパーゼＤとの反応を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明は、リゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させることにより環状ホスファチジン酸の製造方法において、リゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させたことにより産生されたリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）にホスファチジン酸ホスファターゼを作用させることを特徴とする。リゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させると、その主要生成物である環状ホスファチジン酸（ｃＰＡ）が産生されるとともに、副産物としてリゾホスファチジン酸も高い割合で生成される。本発明では、この副産物にホスファチジン酸ホスファターゼを作用させることにより、ＬＰＡを１−モノアシルグリセロールに変換して、これを除去することにより、高い純度のｃＰＡを得ることが可能となる。
【００１２】
本発明において、リゾ型リン脂質とは、ホスホリパーゼＤが作用し得るものであれば特に限定されない。リゾ型リン脂質は既に多種多様のものが知られており、脂肪酸種の異なるもの、エーテル又はビニルエーテル結合をもった分子種などが知られている。これらは市販品としても入手可能である。
【００１３】
本発明において用いられるリゾ型リン脂質は、ホスホリパーゼＤの基質特異性を考慮すると、一般式（Ｉ）で表されるリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）であることが好ましい。
【化２】
（式中、Ｒは、炭素数１〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基、又は炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基であり、これらの基はシクロアルカン環又は芳香環を含んでいてもよく、Ｃｈｏは、コリンを示す。）
【００１４】
一般式（Ｉ）において、置換基Ｒが示す炭素数１〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキル基の具体例としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ペンタデシル基、オクタデシル基などが挙げられる。
【００１５】
置換基Ｒが示す炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基の具体例としては、例えば、アリル基、ブテニル基、オクテニル基、デセニル基、ドデカジエニル基、ヘキサデカトリエニル基などが挙げられ、より具体的には、８−デセニル基、８−ウンデセニル基、８−ドデセニル基、８−トリデセニル基、８−テトラデセニル基、８−ペンタデセニル基、８−ヘキサデセニル基、８−ヘプタデセニル基、８−オクタデセニル基、８−イコセニル基、８−ドコセニル基、ヘプタデカ−８，１１−ジエニル基、ヘプタデカ−８，１１，１４−トリエニル基、ノナデカ−４，７，１０，１３−テトラエニル基、ノナデカ−４，７，１０，１３，１６−ペンタエニル基、ヘニコサ−３，６，９，１２，１５，１８−ヘキサエニル基などが挙げられる。
【００１６】
置換基Ｒが示す炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基の具体例としては、例えば、８−デシニル基、８−ウンデシニル基、８−ドデシニル基、８−トリデシニル基、８−テトラデシニル基、８−ペンタデシニル基、８−ヘキサデシニル基、８−ヘプタデシニル基、８−オクタデシニル基、８−イコシニル基、８−ドコシニル基、ヘプタデカ−８，１１−ジイニル基などが挙げられる。
【００１７】
上記のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基に含有されうるシクロアルカン環の具体例としては、例えば、シクロプロパン環、シクロブタン環、シクロペンタン環、シクロヘキサン環、シクロオクタン環などが挙げられる。シクロアルカン環は、1個以上のヘテロ原子を含んでいてもよく、そのような例としては、例えば、オキシラン環、オキセタン環、テトラヒドロフラン環、Ｎ−メチルプロリジン環などが挙げられる。上記のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基に含有されうる芳香環の具体例としては、例えば、ベンゼン環、ナフタレン環、ピリジン環、フラン環、チオフェン環などが挙げられる。従って、置換基Ｒがシクロアルカン環によって置換されたアルキル基である場合の具体例としては、例えば、シクロプロピルメチル基、シクロヘキシルエチル基、８，９−メタノペンタデシル基などが挙げられる。置換基Ｒが芳香環によって置換されたアルキル基である場合の具体例としては、ベンジル基、フェネチル基、ｐ−ペンチルフェニルオクチル基などが挙げられる。
【００１８】
本発明において用いられるホスホリパーゼＤは、上記リゾ型リン脂質に作用させた場合に、ｃＰＡを生成するものであれば特に限定されるものではない。具体的には、キャベツや落花生などの高等植物由来のものやストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ sp.）、アクチノマデュラ エスピー．（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｌａ ｓｐ．）などの微生物由来のものが市販試薬として入手可能である。このうち、ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ.）又はアクチノマデュラ エスピー．（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｌａ ｓｐ．）に由来するホスホリパーゼＤが好ましく、アクチノマデュラ エスピー．（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｌａ ｓｐ．）Ｎｏ．３６２由来のホスホリパーゼＤがより好ましく用いられる。
【００１９】
リゾ型リン脂質とホスホリパーゼＤとの反応は、酵素が活性を発現できる条件であれば特に限定されず、公知の反応条件により行うことができる。具体的には、塩化カルシウムを含有する酢酸緩衝液（ｐＨ５〜６程度）中で室温から加温下（例えば、２５〜４５℃、好ましくは３０〜４３℃、より好ましくは３０〜４３℃）で１〜３０時間程度反応させることにより行う。
【００２０】
上述の通り、リゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させることにより、ｃＰＡが産生されると同時に、相当量のＬＰＡも産生されることになる。本発明では、このＬＰＡにホスファチジン酸ホスファターゼを作用させ脱リン酸化させる。
【００２１】
本発明で用いられるホスファチジン酸ホスファターゼは、上述のＬＰＡに作用し得るものであれば特に限定されるものではない。具体的には、放線菌由来のものが挙げられ、ストレプトマイセス(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ)属に属する菌株に由来のものが好ましく用いられる。より好ましくは、ストレプトマイセス・ミラビリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）に由来するホスファチジン酸ホスファターゼを用いることが好ましい。
【００２２】
ホスファチジン酸ホスファターゼとＬＰＡとの反応条件は、酵素が活性を発現できる条件であれば特に限定されない。具体的には、酢酸緩衝液中で例えば、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン等を添加した酢酸緩衝液中で室温から加温下（例えば、２５〜４５℃、好ましくは３０〜４３℃、より好ましくは３０〜４３℃）で１〜３０時間程度反応させることにより行う。特に、塩化カルシウムを用いることが好ましく、緩衝液中の最終濃度で０．０１〜３０ｍＭの範囲で加えることができる。反応溶液（緩衝液）のｐＨは、通常４〜７の範囲に調整することが可能であり、好ましくは４．５〜６、より好ましくは５〜６の範囲に調整することができる。
【００２３】
本発明では、出発材料となるＬＰＣを含む反応系に最初にホスホリパーゼＤを添加し、その後、ホスファチジン酸ホスファターゼを添加しても良いし、当該反応系にホスホリパーゼＤとホスファチジン酸ホスファターゼとを同時に添加しても良い。ホスホリパーゼＤとホスファチジン酸ホスファターゼを同時に反応系に添加した場合には、上述のホスファチジン酸ホスファターゼの反応条件により、両酵素の反応を行うことができる。
【００２４】
また、本発明では、ホスホリパーゼＤとホスファチジン酸ホスファターゼとを同一の反応系に添加することも可能であるが、ホスホリパーゼＤをＬＰＣに作用させた後、低ｐH処理あるいは加熱処理によるホスフォリパーゼDを失活させた後ホスファチジン酸ホスファターゼ反応に供するか、一旦反応産物を抽出／精製してもよい。さらに、本発明では、ホスファチジン酸ホスファターゼをＬＰＡに作用させた後、反応液に対して抽出／精製操作を行うことにより、最終産物として環状ホスファチジン酸を得ることができる。
【００２５】
上述の抽出／精製は、有機溶媒を用いた抽出、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）等により行うことができ、目的とする精製度等に応じて適宜これらを組合せてもよい。これらの方法のうち、好ましい方法としては、有機溶媒による抽出である。用いられる有機溶媒は、目的となるｃＰＡを抽出できるものであれば、特に限定されない。例えば、ヘキサン、エチルアルコール、メチルアルコール、酢酸エチル、エチルエーテル、トルエン、クロロホルムとメタノールの混合液を用いて抽出することができる。クロロホルムとメタノールとの比は、２：1が好ましい。
【００２６】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
【００２７】
１． ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）活性測定
0.１M酢酸緩衝液（ｐH5.5）、１ｍMホスファチジン酸、１ｍM塩化カルシウムから成る反応液１ｍｌに０．０５ｍｌの酵素液を添加し正確に１０分間反応させた後、１０％トリクロロ酢酸０．２５ｍｌ、次いで１０％牛血清アルブミン溶液０．２５ｍｌを添加し混合した。濾紙で濾過した濾液１ｍｌに無機リン発色試薬（モリブデン溶液）を添加して発色させ、６５０nmにおける吸光度を測定した。１分間１マイクロモルの無機リンを遊離する活性を１単位とした。
【００２８】
２．ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）の精製
ストレプトマイセス・ミラビリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）を、１％ペプトン、０．５％酵母エキス、0.3％食塩、0.1％硫酸マグネシウムからなる培地で、２８℃、１２０時間の条件で通気攪拌培養した。以下の手順により、菌体から培養液中に分泌されたＰＡＰを精製した。
【００２９】
培養後の培養液を６０００回転１０分間遠心分離して得られた上清液をアセトン沈殿に供し、沈殿物を１０ｍMトリス‐塩酸緩衝液（ｐH7.2）に溶解した。この溶液について、オクチルセファロース（ファルマシア社製）を用いた疎水性アフィニティクロマトグラフィを利用して精製し、ＰＡＰの活性を有する溶出画分をセントリフロー（アミコン社製）を用いて濃縮し、さらに、アセトン沈殿処理を施し、得られた沈殿物を１０ｍMトリス‐塩酸緩衝液（ｐH7.2）に溶解した。該溶液について、ＤＥＡＥ−セファデックスA25（ファルマシア社製）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、次いでセファデックスＧ−７５（ファルマシア社製）、Ｇ−１００（ファルマシア社製）によるゲル濾過クロマトグラフィーによる各精製工程を経てＰＡＰを精製した。
【００３０】
また、各精製工程における、総タンパク質、ＰＡＰの全活性、比活性及び回収率を求めた。その結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】
３．ＰＡＰの諸物性の解析
（１）等電点及び分子量
キャリア・アンフォライトを用いた電気泳動の結果、上記精製したＰＡＰの等電点はｐＨ４．８であった。
また、ゲル濾過法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によりＰＡＰの分子量を分析した結果は、それぞれ、１８０００Ｄａ、１７５００Ｄａであった。本酵素は、比較的小さい分子量を有しており、ホスホリパーゼＤと同様に単量体で存在するものと考えられた。
【００３３】
（２）ＰＡＰ反応へのｐＨの影響
ホスファチジン酸（ＰＡ）を基質として、上記精製したＰＡＰによる反応への反応液のｐＨの影響を分析した。ｐH３．０はグリシン‐塩酸緩衝液、ｐH４．０〜６．０は酢酸緩衝液を用いて、ｐH7.0〜１０．０はトリス‐塩酸緩衝液を用いた。
ＰＡＰによる反応は、ｐＨ４．０〜７．０の範囲でホスファチジン酸（ＰＡ）に作用し、ｐＨ５．５付近で最大の活性を示した（図１を参照）。
【００３４】
（３）ＰＡＰ反応への陽イオンの影響
ＰＡを基質として、上記精製したＰＡＰによる反応液への陽イオン添加の影響について調べた。その結果を表２に示す。
ＰＡＰ反応は一価の陽イオン（Ｎａ+、Ｋ+、Ｌｉ+、ＮＨ4+）により２０〜４０％活性化された。二価の陽イオンについては、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、Ｍｎ2+は１．５〜２倍に活性化するが、Ｚｎ2+、Ｃｕ2+、Ｂａ2+では阻害が見られた（表２を参照）。活性化作用のあるものについて、濃度依存性を調べてみると、Ｃａ2+及びＭｇ2+は類似した挙動を示した。図２に示されるように、Ｃａ2+及びＭｇ2+では、１ｍＭが至適濃度であり、最大１．５倍に活性化された。また、Ｍｎ2+では１０ｍＭが最適濃度であり、約２．３倍に活性化された。
【００３５】
【表２】
【００３６】
ＥＤＴＡによりＰＡＰ反応は完全に阻害された（表２参照）ことと、ＰＡＰ中にＣａ2+、Ｍｇ2+の存在が確かめられ（ＰＡＰ１１．６μＭに対しＣａ７．７３μＭ、Ｍｇ５．７５μＭ）ことから、ＰＡＰ反応は二価の陽イオンを必須の因子とするものと考えられた。
【００３７】
（４）ＰＡＰ反応への界面活性剤の影響
ＰＡに対するＰＡＰの作用は非イオン性界面活性剤（トリトンＸ−１００、アデカトールＳＯ−１２０、ツイーン２０）により、わずかに活性化されたが、ＤＯＣを除く陰イオン性界面活性剤や陽イオン性界面活性剤で阻害された（表３参照）。
【００３８】
【表３】
【００３９】
（４）基質特異性
次に、上記精製したＰＡＰの基質特異性について調べた。その結果を表４に示す。
本酵素はＰＡに対し最も良く作用するが、本発明においてターゲットとなるＬＰＡ、セラミドリン酸（ＣＥＰ）等の脂溶性のリン酸モノエステル化合物にも作用することが判明した。しかし、グリセロリン酸やコリンリン酸の様な水溶性リン酸モノエステル及びＧＰＣのようなリン酸ジエステル化合物には全く作用しなかった（表４を参照）。
【００４０】
【表４】
【００４１】
（実施例１）
リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ；シグマ社製）１ｇに、反応溶媒として１０ｍＭ塩化カルシウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）２０ｍＬを添加し、４０℃に加温して溶解させた。その後、ホスホリパーゼＤ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｓｐ.由来、名糖産業社製）の酵素液（１００Ｕ／ｍＬ）５ｍＬを加えて、４０℃で連続攪拌しながら１８時間反応させた。反応の進行度は薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと称すことがある）で確認した。ＴＬＣは、Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０(メルク社製)を用いて、展開溶媒はクロロホルム：メタノール：酢酸：５％二亜硫酸ナトリウム水溶液（＝１００：４０：１２：５、Ｖ／Ｖ）で展開した。Ｒｆ値は、ＬＰＣが約０．１、環状ホスファチジン酸（ｃＰＡ）が約０．５、副産物であるリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が約０．３であった。反応終了後、クロロホルム：メタノール（２：１）２０ｍＬを添加し、十分攪拌した後、３０００ｒｐｍ、２分間で遠心分離し、クロロホルム層（下層）を集めた。さらに、残った水層にクロロホルム：メタノール（２：１）２０ｍＬを添加して十分攪拌した後、同条件で遠心分離し、クロロホルム層（下層）を集めた。１回目のクロロホルム層と２回目のクロロホルム層とを合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮して脂質成分８２０ｍｇを得た。
【００４２】
得られた脂質８２０ｍｇに、反応溶媒として２０ｍＭ塩化カルシウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）２０ｍＬを添加し、４０℃に加温して溶解させた。その後、上記の精製したホスファチジン酸ホスファターゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ由来）酵素液（２５Ｕ／ｍＬ）５ｍＬを添加し、４０℃で連続攪拌して１８時間反応させた。反応液に、クロロホルム：メタノール（２：１）２０ｍＬを添加し、十分に攪拌した後、３０００ｒｐｍ、２分間で遠心分離し、クロロホルム層（下層）を集めた。さらに、残った水槽にクロロホルム：メタノール（２：１）２０ｍＬを添加し、十分に攪拌した後、同条件で遠心分離し、クロロホルム層（下層）を集めた。１回目のクロロホルム層と２回目のクロロホルム層とを合わせて、ロータリーエバポレーターで濃縮し、８１０ｍｇの脂質成分を得た。固形分に２０ｍＬのアセトンを添加し、攪拌し、３０００ｒｐｍ、２分間で遠心分離して上清（可溶性成分）を除去した。不溶性成分を減圧乾固させＣＰＡ粉末４８７ｍｇを得た。
【００４３】
（比較例１）
リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ；シグマ社製）１．５ｇに、反応溶媒として１０ｍＭ塩化カルシウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）３０ｍＬを添加し、４０℃に加温して溶解させた。その後、ホスホリパーゼＤ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｓｐ.由来、名糖産業社製）の酵素液（１００Ｕ／ｍＬ）７．５ｍＬを加えて、４０℃で連続攪拌しながら１８時間反応させた。反応終了後、クロロホルム：メタノール（２：１）３０ｍＬを添加し十分に攪拌した後、３０００ｒｐｍ、２分間の条件で遠心分離し、クロロホルム層（下層）を集めた。さらに、残った水層にクロロホルム：メタノール（２：１）３０ｍＬを添加して、十分に攪拌した後、遠心分離によりクロロホルム層（下層）を集めた。１回目のクロロホルム層と２回目のクロロホルム層とを合わせてロータリーエバポレーターで濃縮し、脂質成分１．３５ｇを得た。
【００４４】
＜成分分析＞
実施例１及び比較例１で得られた脂質の試料にし、ＴＬＣ後のクロマトグラフをスキャニング法で成分分析を行った。
その成分分析の結果を以下の表５に示す。
【００４５】
【表５】
【００４６】
上記表５に示す通り、ホスファチジン酸ホスファターゼの処理工程が設けられた実施例１では、副産物のＬＰＡが最終産物に混入しておらず、高純度のｃＰＡが得られた。一方、ホスファチジン酸ホスファターゼの処理工程を設けなかった比較例１の最終産物には、高い割合でＬＰＡが混入していることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明によれば、高純度かつ多量の環状ホスファチジン酸を簡便に製造することができるので、本発明は、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品等の分野において高い産業上の利用可能性を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させることによる環状ホスファチジン酸の製造方法において、リゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させることにより産生したリゾホスファチジン酸にホスファチジン酸ホスファターゼを作用させることを特徴とする環状ホスファチジン酸の製造方法。
【請求項２】
前記リゾ型リン脂質が、一般式（Ｉ）：
【化１】
（式中、Ｒは、炭素数１〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基、又は炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基であり、これらの基はシクロアルカン環又は芳香環を含んでいてもよく、Ｃｈｏは、コリンを示す。）で表されるリゾホスファチジルコリンである請求項１に記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
【請求項３】
前記ホスホリパーゼＤが、キャベツ、落花生、ストレプトマイセス・エスピー（Sｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ sp.）及びアクチノマデュラ エスピー．（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｌａ ｓｐ．）からなる群から選択される少なくとも一に由来する請求項１又は２に記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
【請求項４】
前記ホスホリパーゼＤが、アクチノマデュラ エスピー．（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｌａ ｓｐ．）に由来する請求項１〜３のいずれか１項に記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
【請求項５】
前記ホスファチジン酸ホスファターゼが、ストレプトマイセス(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ)属に属する菌株に由来するものである請求項１〜４のいずれか１項に記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
【請求項６】
前記ホスファチジン酸ホスファターゼが、ストレプトマイセス・ミラビリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）に由来するものである請求項１〜５のいずれか１項に記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
【請求項７】
前記リゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させて得られる産物に、前記ホスファチジン酸ホスファターゼを作用させる請求項１〜６のいずれか１項に記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
【請求項８】
前記ホスホリパーゼＤをリゾホスファチジルコリンに作用させた後に、反応液を有機溶媒で抽出する請求項１〜７のいずれか１項に記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
【請求項９】
前記ホスホリパーゼＤをリゾホスファチジルコリンに作用させた後に、低ｐH処理あるいは加熱処理によってホスホリパーゼDを失活させる請求項１〜７のいずれか１項に記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の環状ホスファチジン酸の製造方法により製造された環状ホスファチジン酸を含有してなる組成物。
【請求項１１】
環状ホスファチジン酸を構成する脂肪酸が、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸の一種または二種以上からなることを特徴とする請求項１０に記載の環状ホスファチジン酸を含有してなる組成物。
【請求項１２】
組成物が、医薬品、医薬部外品、化粧品または飲食品である、請求項１０または１１に記載の環状ホスファチジン酸を含有してなる組成物。
【請求項１】
リゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させることによる環状ホスファチジン酸の製造方法において、リゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させることにより産生したリゾホスファチジン酸にホスファチジン酸ホスファターゼを作用させることを特徴とする環状ホスファチジン酸の製造方法。
【請求項２】
前記リゾ型リン脂質が、一般式（Ｉ）：
【化１】
（式中、Ｒは、炭素数１〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基、又は炭素数２〜３０の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基であり、これらの基はシクロアルカン環又は芳香環を含んでいてもよく、Ｃｈｏは、コリンを示す。）で表されるリゾホスファチジルコリンである請求項１に記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
【請求項３】
前記ホスホリパーゼＤが、キャベツ、落花生、ストレプトマイセス・エスピー（Sｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ sp.）及びアクチノマデュラ エスピー．（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｌａ ｓｐ．）からなる群から選択される少なくとも一に由来する請求項１又は２に記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
【請求項４】
前記ホスホリパーゼＤが、アクチノマデュラ エスピー．（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｌａ ｓｐ．）に由来する請求項１〜３のいずれか１項に記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
【請求項５】
前記ホスファチジン酸ホスファターゼが、ストレプトマイセス(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ)属に属する菌株に由来するものである請求項１〜４のいずれか１項に記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
【請求項６】
前記ホスファチジン酸ホスファターゼが、ストレプトマイセス・ミラビリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）に由来するものである請求項１〜５のいずれか１項に記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
【請求項７】
前記リゾ型リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させて得られる産物に、前記ホスファチジン酸ホスファターゼを作用させる請求項１〜６のいずれか１項に記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
【請求項８】
前記ホスホリパーゼＤをリゾホスファチジルコリンに作用させた後に、反応液を有機溶媒で抽出する請求項１〜７のいずれか１項に記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
【請求項９】
前記ホスホリパーゼＤをリゾホスファチジルコリンに作用させた後に、低ｐH処理あるいは加熱処理によってホスホリパーゼDを失活させる請求項１〜７のいずれか１項に記載の環状ホスファチジン酸の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の環状ホスファチジン酸の製造方法により製造された環状ホスファチジン酸を含有してなる組成物。
【請求項１１】
環状ホスファチジン酸を構成する脂肪酸が、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸の一種または二種以上からなることを特徴とする請求項１０に記載の環状ホスファチジン酸を含有してなる組成物。
【請求項１２】
組成物が、医薬品、医薬部外品、化粧品または飲食品である、請求項１０または１１に記載の環状ホスファチジン酸を含有してなる組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１１−２１１９２１（Ｐ２０１１−２１１９２１Ａ）
【公開日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−８０９６４（Ｐ２０１０−８０９６４）
【出願日】平成２２年３月３１日（２０１０．３．３１）
【出願人】（５０８１０４８８０）ＳＡＮＳＨＯ株式会社 (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３１日（２０１０．３．３１）
【出願人】（５０８１０４８８０）ＳＡＮＳＨＯ株式会社 (5)
【Ｆターム（参考）】
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