環状マルトシルマルトース及び環状マルトシルマルトース生成酵素とそれらの製造方法並びに用途
【課題】 グルコースを構成糖とする新規な非還元性糖質を提供し、非還元性糖質の選択の幅を広げるとともに当該非還元性糖質を生成する新規酵素と、それらの生成方法及び製造方法、当該酵素をコードするＤＮＡ、これを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換体、並びに当該非還元性糖質を含んでなる組成物とその用途を提供することを課題とする。
【解決手段】 サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する新規な環状糖質、すなわち、環状マルトシルマルトースとそれを生成する新規な環状マルトシルマルトース生成酵素とそれらの生成方法及び製造方法、さらには当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換体、並びに環状マルトシルマルトース又はこれを含む糖質を含んでなる組成物とその用途を提供することによって上記課題を解決する。
【解決手段】 サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する新規な環状糖質、すなわち、環状マルトシルマルトースとそれを生成する新規な環状マルトシルマルトース生成酵素とそれらの生成方法及び製造方法、さらには当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換体、並びに環状マルトシルマルトース又はこれを含む糖質を含んでなる組成物とその用途を提供することによって上記課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状マルトシルマルトース（以下、本明細書では単に「環状マルトシルマルトース」と略称することもある。）及び環状マルトシルマルトース生成酵素とそれらの製造方法と用途並びに当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡに関し、詳細には、環状マルトシルマルトース及び環状マルトシルマルトース生成酵素とその製造方法、環状マルトシルマルトース生成酵素を産生する微生物、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡと形質転換体、当該酵素を用いた環状マルトシルマルトースの生成方法及び製造方法、並びに環状マルトシルマルトースを含有せしめた組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコースを構成糖とする糖質としては、例えば、澱粉を原料として製造される澱粉部分分解物であるアミロース、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖などが知られている。これらの糖質は、通常、分子の両端に非還元性末端と還元性末端を有し、還元性を示すことが知られている。一般に、澱粉部分分解物は、その固形物当りの還元力の大きさをデキストロース・エクイバレント（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ、ＤＥ）として表される。この値の大きいものは、通常、分子が小さく低粘度で、甘味が強いものの、反応性が強く、アミノ酸や蛋白質などのアミノ基を持つ物質とアミノカルボニル反応を起こし易く、褐変し、悪臭を発生して、品質を劣化し易い性質のあることが知られている。斯かる欠点を改善するために、澱粉部分分解物の構成糖であるグルコースを変えることなく、その還元力を低減、若しくは消滅させる方法が古くから望まれていた。例えば、非特許文献１で開示されているように、澱粉にマセランス アミラーゼ（ｍａｃｅｒａｎｓ ａｍｙｌａｓｅ）を作用させることにより、６乃至８分子のグルコースがα−１，４グルコシド結合したα−、β−又はγ−サイクロデキストリンを生成させる方法が知られている。現在では、澱粉からこれらサイクロデキストリンが工業的規模で生産され、これらサイクロデキストリンは、それらが有する、非還元性で、無味であり、包接能を有するなどの特性を生かした用途に利用されている。また、先に、本出願人が、特許文献１、特許文献２などで開示したように、マルトオリゴ糖など澱粉部分分解物に非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素を作用させることにより、２分子のグルコースがα，α−１，１結合したトレハロースを生成させる方法も知られている。現在では、澱粉からトレハロースが工業的規模で生産され、その非還元性や温和で高品質な甘味特性などを生かした用途に利用されている。さらに、先に、本出願人が、特許文献３乃至特許文献５などで開示したように、澱粉又はその部分分解物にα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素を作用させることにより、４分子のグルコースがα−１，３グルコシド結合及びα−１，６グルコシド結合で交互に結合した構造、すなわち、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖を生成させる方法も知られている。この環状四糖は、環状構造を有することから包接能を有し、揮発性有機物を安定化する作用を示すとともに、非還元性の糖質であるため、アミノカルボニル反応を起こさず、褐変、劣化を懸念することなく利用、加工できることが期待される。
【０００３】
このように、グルコースを構成糖とする非還元性糖質として、グルコース重合度が６乃至８のα−、β−、γ−サイクロデキストリン、グルコース重合度が２のα，α−トレハロース及びグルコース重合度が４のサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖は、それぞれの特性を生かして種々の分野に利用されているものの、これら糖質以外にもグルコースを構成糖とする非還元性糖質が提供されれば非還元性糖質の選択の幅が広がり、更に多様な用途への利用が期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平７−１４３８７６号公報
【特許文献２】特開平７−２１３２８３号公報
【特許文献３】国際公開 ＷＯ ０１／９０３３８ Ａ１号明細書
【特許文献４】国際公開 ＷＯ ０２／０５５７０８ Ａ１号明細書
【特許文献５】国際公開 ＷＯ ０２／４０６５９ Ａ１号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】「ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）」、米国、１９４９年、第７１巻、３５３乃至３５８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、グルコースを構成糖とする新規な非還元性糖質を提供し、非還元性糖質の選択の幅を広げるとともに当該非還元性糖質を生成する新規酵素と、それらの生成方法及び製造方法、当該酵素をコードするＤＮＡ、これを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換体、並びに当該非還元性糖質を含んでなる組成物とその用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、上記課題を解決するために、澱粉部分分解物から新規な非還元性糖質を生成する全く新しい酵素に期待を込めて、このような酵素を産生する微生物を広く検索してきた。その結果、岡山県岡山市の土壌から、新たに分離した新規微生物、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する新規微生物Ｍ６株が新規な酵素を産生し、この新規酵素の作用により、澱粉又はその部分分解物などのα−１，４グルカンからサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する新規な環状糖質、すなわち環状マルトシルマルトースを著量生成することを見出した。また、環状マルトシルマルトース生成酵素の諸性質を明らかにするとともに、その製造方法を確立し、また、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換体を確立し、さらに、本酵素による環状マルトシルマルトース生成方法、及び本酵素を用いた環状マルトシルマルトース又はこれを含む糖質の製造方法を確立した。さらには、環状マルトシルマルトースはその過飽和水溶液から結晶を容易に晶出し、採取できることを見出し、さらに、環状マルトシルマルトースがメチルアルコール、エチルアルコールや酢酸など揮発成分を包接する作用を有すること、アミノカルボニル反応を起こさず、褐変や劣化が少ないこと、熱やｐＨに対し安定であること、難消化性・難発酵性であることなど有用な特性を有していることを見出し、環状マルトシルマルトース、又はこれを含む糖質を含有せしめた組成物、例えば、風味良好な高品質の食品、低カロリー又はダイエット食品、安定で高品質な化粧品、更には、高活性で安定な医薬品などを容易に製造し得ることを見出して、本発明を完成した。
【０００８】
本発明は、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する新規な環状糖質、すなわち、環状マルトシルマルトースとそれを生成する新規な環状マルトシルマルトース生成酵素とそれらの生成方法及び製造方法、さらには当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換体、並びに環状マルトシルマルトース又はこれを含む糖質を含んでなる組成物とその用途を提供することによって上記課題を解決するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、グルコースを構成糖とする非還元性糖質の選択の幅が広がる上に、従来未知であった新規環状糖質、環状マルトシルマルトースが大量に供給できることとなり、飲食物、化粧品、医薬品をはじめとする様々な分野における利用が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】非還元糖質標品のＨＰＬＣ溶出パターンを示す図である。
【図２】単離した非還元性糖質の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図３】単離した非還元性糖質の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図４】本発明の環状マルトシルマルトースの構造を示す図である。
【図５】環状マルトシルマルトース生成酵素の至適温度を示す図である。
【図６】環状マルトシルマルトース生成酵素の至適ｐＨを示す図である。
【図７】環状マルトシルマルトース生成酵素の温度安定性を示す図である。
【図８】環状マルトシルマルトース生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図９】組換えＤＮＡ、ｐＢＭＢ１を示す図である。図中、黒い太線で示した部分は、アルスロバクター・グロビホルミス Ｍ６（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４８）由来の本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素をコードするＤＮＡである。
【図１０】結晶環状マルトシルマルトースの粉末Ｘ線回折図を示す図である。
【図１１】結晶環状マルトシルマルトースの熱重量曲線を示す図である。
【符号の説明】
【００１１】
ａ：１位がα−１，４グルコシド結合しているグルコース残基
ｂ：１位がα−１，６グルコシド結合しているグルコース残基
ｆ１（＋）ｏｒｉ：ｆ１ファージ複製起点
Ａｍｐ：アンピシリン耐性遺伝子
ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ：コリシンＥ１複製起点
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明でいう環状マルトシルマルトースとは、４分子のグルコースがα−１，４グルコシド結合及びα−１，６グルコシド結合で交互に結合した環状の四糖、すなわち、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状の四糖を意味する。本糖質は、土壌より得た微生物の培養液中に本発明者らが初めて見出した従来未知の新規糖質であり、グルコースを構成糖とする環状の四糖は上記構造を有しているかぎり、その給源、形態、純度、製造方法を問わず本発明に包含される。
【００１３】
本発明でいう環状マルトシルマルトース生成酵素とは、グルコース重合度３以上のα−１，４グルカンに作用し、マルトースを他のα−１，４グルカンの非還元末端グルコースの６位にα−１，６転移することにより６−α−マルトシルα−１，４グルカンを生成し、次いで、これを環状化反応によりサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状マルトシルマルトースを生成する酵素全般を意味する。上記の反応を触媒する酵素はその給源、形態、粗酵素又は精製酵素の区別なく本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素に包含される。
【００１４】
本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素の酵素活性は、次のようにして測定することができる。可溶性澱粉を濃度２ｗ／ｖ％となるよう２ｍＭ塩化カルシウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させ基質液とし、その基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌを加えて、４０℃で３０分間酵素反応し、その反応液を１０分間、約１００℃で加熱して反応を停止させた後、残存可溶性澱粉や夾雑オリゴ糖を分解するためにα−グルコシダーゼを固形物１グラム当り４０００単位とグルコアミラーゼを固形物１グラム当り２５０単位添加して５０℃、１時間処理し、その処理液中の環状マルトシルマルトース量を、後述する実験１に記載のＨＰＬＣ法で定量する。環状マルトシルマルトース生成酵素の活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルの環状マルトシルマルトースを生成する酵素量と定義する。
【００１５】
本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素の具体例としては、例えば、下記の理化学的性質を有する環状マルトシルマルトース生成酵素が挙げられる。
（１）分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法において、７２，０００±２０，０００ダルトン。
（２）等電点
アンフォライン含有等電点電気泳動法において、ｐＩ３．６±０．５。
（３）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、５０℃乃至５５℃。
（４）至適ｐＨ
４０℃、３０分間反応の条件下で、ｐＨ５．５乃至６．５。
（５）温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で、３０℃まで安定。
１ｍＭカルシウムイオン存在下では、５０℃まで安定。
（６）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下で、ｐＨ５．０乃至９．０で安定。
【００１６】
また、上記理化学的性質を有する本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素の一つは、上記理化学的性質のみならず、そのＮ末端配列として、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列を有している場合がある。
【００１７】
本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素は、通常、所定のアミノ酸配列を有しており、その一例としては、例えば、配列表における配列番号２で示されるアミノ酸配列又はそれに相同的なアミノ酸配列が挙げられる。配列表における配列番号２で示されるアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有する変異体酵素としては、グルコース重合度３以上のα−１，４グルカンに作用し、環状マルトシルマルトースを生成するという酵素活性を保持する範囲で、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有するものが挙げられ、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対し、通常、６０％以上、望ましくは、７０％以上、さらに望ましくは、８０％以上、よりさらに望ましくは、９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものが好適である。
【００１８】
しかしながら、上記理化学的性質又はアミノ酸配列を有する環状マルトシルマルトース生成酵素はあくまで一例であって、上記と異なる理化学的性質又はアミノ酸配列を有する酵素も、環状マルトシルマルトースを生成するかぎり本発明に包含されることはいうまでもない。
【００１９】
本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素はその給源によって制限されないものの、好ましい給源として、微生物が挙げられ、とりわけ本発明者らが土壌より単離した微生物Ｍ６株が好適に用いられる。以下、環状マルトシルマルトース生成酵素産生能を有する微生物Ｍ６株の同定試験結果を示す。なお、同定試験は、『微生物の分類と同定』（長谷川武治編、学会出版センター、１９８５年）に準じて行った。
【００２０】
＜Ａ：細胞形態＞
（１）肉汁寒天培養、２７℃
通常０．４×１．０乃至０．８×３．０μｍの短桿菌〜球菌。多形性あり。
運動性あり。無胞子。グラム陽性。
（２）ＥＹＧ寒天培地、２７℃
桿菌−球菌の生育サイクルを示す。
【００２１】
＜Ｂ：培養性質＞
（１） 肉汁寒天平板培養、２７℃
形状： 円形 大きさは３日間で１乃至２ｍｍ。
周縁： 全縁
隆起： 半レンズ状
光沢： 鈍光
表面： 平滑
色調： 不透明、淡い黄色
（２） 肉汁寒天斜面培養、２７℃
生育： 中程度
形状： 糸状
（３） 肉汁ゼラチン穿刺培養、２７℃
液化しない。
【００２２】
＜Ｃ：生理学的性質＞
（１） ＶＰ試験： 陰性
（２） インドールの生成： 陰性
（３） 澱粉の加水分解： 陽性
（５） 色素の生成： 可溶性色素の生成はない
（６） ウレアーゼ： 陰性
（７） オキシダーゼ： 陽性
（８） カタラーゼ： 陽性
（９） 生育の範囲： ｐＨ５．５乃至１０．０、温度 １５乃至３７℃
（１０） 酸素に対する態度： 好気性
（１１） 細胞壁の主要ジアミノ酸： リジン
（１２） 細胞壁のペプチドグリカン型： リジン−アラニン
（１３） 細胞壁のＮ−アシル型： アセチル
（１４） 細胞壁の構成糖： ガラクトース、グルコース、ラムノース
（１５） ビタミンの要求性： なし
（１６） ＤＮＡのＧＣ含量： ７０％
（１７） ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジー：アルスロバクター・グロビホルミス（ＡＴＣＣ８０１０）との間で、６９．３％のＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーを示す。
【００２３】
以上の菌学的性質に基づいて、『バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第２巻（１９８６年）を参考にして、公知菌との異同を検討した。その結果、本菌は、アルスロバクター・グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）に属する微生物であることが判明した。これらの結果より本発明者等は、本菌を新規微生物アルスロバクター・グロビホルミス Ｍ６と命名し、平成１５年８月６日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託し、受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４８として受託された。
【００２４】
本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素産生能を有する微生物には、上記菌はもとより、その変異株、更には、環状マルトシルマルトース生成酵素産生能を有する組換え体微生物を含む他の微生物、及び、それらの変異株なども包含される。
【００２５】
本発明のＤＮＡとは、上記環状マルトシルマルトース生成酵素をコードするもの全般を意味する。本発明のＤＮＡは、環状マルトシルマルトース生成酵素をコードするものである限り、それが天然由来のものであっても、人為的に合成されたものであってもよい。天然の給源としては、例えば、アルスロバクター・グロビホルミス Ｍ６（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４８）を含むアルスロバクター属の微生物が挙げられ、これらの菌体から本発明のＤＮＡを含む遺伝子ＤＮＡを得ることができる。すなわち、斯かる微生物を栄養培地に接種し、好気的条件下で約１乃至３日間培養後、培養物から菌体を採取し、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素や超音波で処理することにより当該ＤＮＡを含む遺伝子ＤＮＡを菌体外に溶出させる。このとき、プロテアーゼなどの蛋白質分解酵素を併用したり、ＳＤＳなどの界面活性剤を共存させたり凍結融解してもよい。斯くして得られる処理物に、例えば、フェノール抽出、アルコール沈殿、遠心分離、リボヌクレアーゼ処理などの常法を適用すれば目的の遺伝子ＤＮＡが得られる。本発明のＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、配列表における配列番号２で示されるアミノ酸配列に基づいて化学合成すればよい。また、当該ＤＮＡを含む遺伝子ＤＮＡを鋳型として、適当なプライマーとなる化学合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ合成することも有利に実施できる。
【００２６】
本発明のＤＮＡは、通常、所定の塩基配列を有しており、その一例としては、例えば、配列表における配列番号３で示される塩基配列又はそれに相同的な塩基配列が挙げられる。配列表における配列番号３で示される塩基配列に相同的な塩基配列を有する変異体ＤＮＡとしては、コードする酵素の活性を保持する範囲で、配列番号３で示される塩基配列において１個又は２個以上の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列を有するものが挙げられ、配列番号３で示される塩基配列に対し、通常、６０％以上、望ましくは、７０％以上、さらに望ましくは、８０％以上、よりさらに望ましくは、９０％以上の相同性を有する塩基配列を有するものが好適である。また、遺伝子コードの縮重に基づき、そのコードする酵素のアミノ酸配列を変えることなく塩基の１個又は２個以上を他の塩基に置換したものも当然、本発明のＤＮＡに包含される。
【００２７】
本発明のＤＮＡを、自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとすることも有利に実施できる。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡと自律複製可能なベクターとからなり、ＤＮＡが入手できれば、常法の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。斯かるベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７などのプラスミドベクターやλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、ρ１１、φ１、φ１０５などのファージベクターが挙げられる。この内、本発明のＤＮＡを大腸菌で発現させるには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、λｇｔ・λＣ及びλｇｔ・λＢが好適であり、一方、枯草菌で発現させるには、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１及びφ１０５が好適である。ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７は、組換えＤＮＡを二種以上の宿主内で複製させる場合に有用である。ＤＮＡを斯かるベクターに挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、まず、ＤＮＡを含む遺伝子ＤＮＡと自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。遺伝子ＤＮＡ及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけＩＩ型の制限酵素、詳細には、Ｓａｕ ３ＡＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｂａｍ ＨＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉなどを使用すれば、ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結するのが容易である。必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培養することにより無限に複製可能である。
【００２８】
このようにして得られる組換えＤＮＡは、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母をはじめとする適宜の宿主微生物に導入することができる。形質転換体を取得するには、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、グルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンを含む栄養培地で培養し、該糖質より環状マルトシルマルトースを生成するものを選択すればよい。
【００２９】
本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素産生能を有する形質転換体も含めた微生物の培養に用いる培地は、微生物が生育でき、環状マルトシルマルトース生成酵素を産生しうる栄養培地であればよく、合成培地および天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、微生物が生育に利用できる物であればよく、例えば、植物由来の澱粉やフィトグリコーゲン、動物や微生物由来のグリコーゲンやプルラン、また、これらの部分分解物やグルコース、フラクトース、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、糖蜜などの糖質、また、クエン酸、コハク酸などの有機酸も使用することができる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の種類により適宜選択できる。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物および、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物を適宜用いることができる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などの塩類を適宜用いることができる。更に、必要に応じて、アミノ酸、ビタミンなども適宜用いることができる。
【００３０】
培養は、通常、温度１５乃至３７℃でｐＨ５．５乃至１０の範囲、好ましくは温度２０乃至３４℃でｐＨ５．５乃至８．５の範囲から選ばれる条件で好気的に行われる。培養時間は当該微生物が増殖し得る時間であればよく、好ましくは１０時間乃至１５０時間である。また、培養条件における培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、０．５乃至２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通気量を調節したり、攪拌したりするなどの手段を適宜採用する。また、培養方式は、回分培養または連続培養のいずれでもよい。
【００３１】
このようにして環状マルトシルマルトース生成酵素産生能を有する微生物を培養した後、本発明の酵素を含む培養物を回収する。環状マルトシルマルトース生成酵素活性は、培養微生物がアルスロバクター・グロビホルミス Ｍ６（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４８）の場合、主に培養物の除菌液に認められ、除菌液を粗酵素液として採取することも、培養物全体を粗酵素液として用いることもできる。培養物から菌体を除去するには常法の固液分離法が採用される。例えば、培養物そのものを遠心分離する方法、あるいは、プレコートフィルターなどを用いて濾過分離する方法、平膜、中空糸膜などの膜濾過により分離する方法などが適宜採用される。除菌液をそのまま粗酵素液として用いることができるものの、一般的には、濃縮して用いられる。濃縮法としては、硫安塩析法、アセトン及びアルコール沈殿法、平膜、中空膜などを用いた膜濃縮法などを採用することができる。
【００３２】
更に、環状マルトシルマルトース生成酵素活性を有する除菌液及びその濃縮液を用いて、環状マルトシルマルトース生成酵素を斯界において常用されている適宜の方法により固定化することもできる。例えば、イオン交換体への結合法、樹脂及び膜などとの共有結合法・吸着法、高分子物質を用いた包括法などを適宜採用できる。
【００３３】
上記のように本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素は、粗酵素液をそのまま又は濃縮して用いることができるものの、必要に応じて、斯界において常用されている適宜の方法によって、さらに分離・精製して利用することもできる。例えば、培養液の上清又は破砕処理物を硫安塩析して濃縮した酵素標品を透析後、『ＤＥＡＥ−トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｓ』樹脂を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、続いて、『フェニル−トヨパール（Ｐｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』樹脂を用いた疎水クロマトグラフィーを用いて精製することにより、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素を、電気泳動的に単一バンドを示す精製酵素として得ることができる。
【００３４】
環状マルトシルマルトース生成酵素が組換え型酵素である場合には、宿主の種類によっては菌体内に酵素が蓄積することがある。このような場合には、菌体又は培養物をそのまま使用することも可能であるものの、通常は使用に先立ち、必要に応じて、浸透圧ショックや界面活性剤により菌体から抽出した後、又は、超音波や細胞壁溶解酵素により菌体を破砕した後、濾過、遠心分離などにより組換え型酵素を菌体又は菌体破砕物から分離して用いることも有利に実施できる。
【００３５】
このようにして得られる本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素は、グルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用し、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状マルトシルマルトースを生成する。本酵素はグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用し、分子間でα−マルトシル転移反応することによって、非還元性末端グルコースの６位にα−マルトシル残基が結合した６−α−マルトシル−α−１，４グルカンを生成し、これを環状化することによって、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状マルトシルマルトースを生成すると推察される。本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素は、具体的には、下記の理化学的性質を有する場合がある。
（１）分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法において、７２，０００±２０，０００ダルトン。
（２）等電点
アンフォライン含有等電点電気泳動法において、ｐＩ３．６±０．５。
（３）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、５０℃乃至５５℃。
（４）至適ｐＨ
４０℃、３０分間反応の条件下で、ｐＨ５．５乃至６．５。
（５）温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で、３０℃まで安定。
１ｍＭカルシウムイオン存在下では、５０℃まで安定。
（６）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下で、ｐＨ５．０乃至９．０で安定。
（７）Ｎ末端アミノ酸配列
配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列、すなわち、アスパラギン酸―プロリン−スレオニン−スレオニン−セリンのアミノ酸配列を有する。
【００３６】
本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素の基質となるグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンとしては、澱粉、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲンなどや、それらをアミラーゼまたは酸などによって部分的に加水分解して得られるアミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトオリゴ糖などの部分分解物が挙げられる。アミラーゼで分解した部分分解物としては、例えば、『ハンドブック・オブ・アミレーシズ・アンド・リレイテッド・エンザイム（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ａｍｙｌａｓｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ）（１９８８年）パーガモン・プレス社（東京）に記載されている、α−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１）、マルトテトラオース生成アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．６０）、マルトペンタオース生成アミラーゼ、マルトヘキサオース生成アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．９８）などのアミラーゼを用いて澱粉、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲンなどを分解して得られる部分分解物を用いることができる。更には、部分分解物を調製する際、プルラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．４１）、イソアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．６８）などの澱粉枝切り酵素を作用させることも随意である。
【００３７】
基質としての澱粉は、例えば、とうもろこし、小麦、米など由来の地上澱粉であっても、また、馬鈴薯、さつまいも、タピオカなど由来の地下澱粉であってもよく、好ましくは、澱粉を糊化及び／又は液化した溶液として用いられる。その澱粉の部分分解の程度は低い程、環状マルトシルマルトース生成率が高くなることから、ＤＥ約２０以下、望ましくは約１２以下、更に望ましくは約５以下の部分分解物が好適である。なお、本明細書でいう環状マルトシルマルトース生成率とは、式、環状マルトシルマルトース生成率（％）＝｛（生成した環状マルトシルマルトースの質量）／（反応液中の全糖質の質量）｝×１００で算出される値を意味する。
【００３８】
本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素を基質に作用させるに際し、その基質濃度は特に限定されず、例えば、基質濃度０．１％（ｗ／ｖ）の比較的低濃度の溶液を用いた場合でも、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素の反応は進行して環状マルトシルマルトースを生成する。工業的には、基質濃度１％（ｗ／ｖ）以上が好適であり、この条件下で、環状マルトシルマルトースを有利に生成できる。また、基質溶液としては、完全に溶けきらない不溶性の基質を含有する高濃度の基質溶液であっても良い。反応温度は反応が進行する温度、即ち６０℃付近までで行えばよい。好ましくは３０乃至５０℃付近の温度を用いる。反応ｐＨは、通常、５乃至９の範囲、好ましくはｐＨ５乃至７の範囲に調整するのがよい。酵素の使用量と反応時間とは密接に関係しており、目的とする酵素反応の進行により適宜選択すればよい。
【００３９】
例えば、基質濃度１％（ｗ／ｖ）の澱粉又はその部分分解物やアミロースの水溶液に本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素を作用させることにより、澱粉又はその部分分解物からは約３０％以上、アミロースからは約４４％の高い環状マルトシルマルトース生成率で本発明の環状マルトシルマルトースを得ることができる。この環状マルトシルマルトース生成酵素による環状マルトシルマルトースの生成メカニズムは、以下のように推察される。
１） 本酵素は、基質としてグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用し、その非還元性末端のマルトシル残基を他の分子の非還元性末端グルコース残基の６位水酸基に転移する分子間の６−α−マルトシル転移を触媒して、非還元末端に６−α−マルトシル基を有するグルコース重合度が２増加した６−α−マルトシル−α−１，４グルカンと、グルコース重合度が２減じたα−１，４グルカンとを生成する。
２） 本酵素はさらに、６−α−マルトシル−α−１，４グルカンに作用し、環状化反応を触媒して、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状マルトシルマルトースと、６−α−マルトシル−α−１，４グルカンから数えてグルコース重合度が４減じたα−１，４グルカンを生成する。
３） １）及び２）で新たに生じたα−１，４グルカンは、再度、１）から２）の反応を受けることによって、環状マルトシルマルトースを生成する。
【００４０】
また、この環状マルトシルマルトース生成反応の際、他の酵素を更に同時併用して、環状マルトシルマルトース生成率を向上させることも有利に実施できる。例えば、澱粉に、環状マルトシルマルトース生成酵素とイソアミラーゼなどの澱粉枝切り酵素を同時併用して作用させることにより、環状マルトシルマルトースの生成率をさらに向上させることも有利に実施できる。
【００４１】
上記の反応によって得られた反応液は、そのまま環状マルトシルマルトース含有糖液として用いることもできる。また、必要に応じて、環状マルトシルマルトース含有糖液に、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ及びα−グルコシダーゼから選ばれる１種又は２種以上を作用させて、夾雑するオリゴ糖を加水分解した環状マルトシルマルトース含有糖液として用いることもできる。一般的には、環状マルトシルマルトース含有糖液はさらに精製して用いられる。精製方法としては、糖の精製に用いられる通常の方法を適宜採用すればよく、例えば、活性炭による脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂による脱塩、イオン交換カラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーによる分画、アルコールおよびアセトンなど有機溶媒による分別、適度な分離性能を有する膜による分離、更には、環状マルトシルマルトースを利用せず夾雑糖質を資化、分解する微生物、例えば酵母などによる発酵処理や、アルカリ処理などにより残存している還元性糖質を分解除去するなどの１種または２種以上の精製方法が適宜採用できる。
【００４２】
とりわけ、工業的大量生産方法としては、イオン交換カラムクロマトグラフィーの採用が好適であり、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５８−７２５９８号公報などに開示されている強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより夾雑糖類を除去し、目的物の含量を向上させた環状マルトシルマルトース、又はこれを含む糖質を有利に製造することができる。この際、固定床方式、移動床方式、疑似移動床方式のいずれの方式を採用することも随意である。
【００４３】
このようにして得られた環状マルトシルマルトースを含む水溶液、又はその含量を向上させた糖質水溶液は、通常、環状マルトシルマルトースを、固形物当たり、１０質量％以上、望ましくは４０質量％以上含有する糖質水溶液で、通常、これを濃縮し、シラップ状製品とする。このシラップ状製品は、更に、乾燥して粉末状製品にすることも随意である。
【００４４】
環状マルトシルマルトースの結晶を製造するには、例えば、固形物当たりの環状マルトシルマルトース純度約５０％以上、濃度約５乃至９０質量％の環状マルトシルマルトース含有液を助晶缶にとり、固形物当たり０．１乃至２０質量％の種結晶共存下で、温度９５℃以下、望ましくは１０乃至９０℃の範囲で、攪拌しつつ徐冷し、環状マルトシルマルトースの結晶を含有するマスキットを製造する。マスキットから環状マルトシルマルトースの結晶を製造する方法としては分蜜が挙げられ、また、環状マルトシルマルトースの含蜜結晶を製造する方法としては、例えば、ブロック粉砕、流動造粒、噴霧乾燥など公知の方法が挙げられる。このようにして製造される本発明の環状マルトシルマルトースの結晶又は含蜜結晶は、上品で低甘味を有する非還元性の白色粉末で、安定な糖質であり、他の素材、特にアミノ酸、オリゴペプチド、蛋白質などのアミノ酸を有する物質と混合、加工しても、褐変することも、異臭を発生することもなく、混合した他の素材を損なうことも少ない。
【００４５】
また、本発明の環状マルトシルマルトースは包接能を有しており、包接した香気成分、有効成分などの揮散、品質劣化を防止することから、香気成分、有効成分の安定化保持に極めて優れている。この際、必要に応じて、サイクロデキストリン類、分岐サイクロデキストリン類、本出願人が特許文献３乃至５で開示したサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖、分岐環状四糖類、サイクロデキストラン類、サイクロフラクタン類など他の環状糖質を併用することで、包接能による安定化を強化することも有利に実施できる。サイクロデキストリン類など環状糖質としては、高純度のものに限る必要はなく、低純度の環状糖質、例えば、多量のマルトデキストリンとともに各種の環状糖質を含有した澱粉部分分解物なども有利に利用できる。
【００４６】
更に、本発明の環状マルトシルマルトースはアミラーゼやα−グルコシダーゼによって実質的に分解されないことから、経口摂取しても消化吸収されず、また、腸内細菌によって発酵されにくく、極めて低カロリーの糖質であって、水溶性食物繊維様の物質として利用することができる。本発明の環状マルトシルマルトースが粉末製品の場合には、これ自体の吸湿性が低く、付着、固結しにくいのみならず、他の粉末と混合して得られる粉末状物の付着、固結を防止することもできる。更に、環状マルトシルマルトース自体は、無毒、無害の新規な甘味料である。
【００４７】
また、本発明の環状マルトシルマルトースは安定な甘味料であることより、結晶製品の場合には、プルラン、ヒドロキシエチルスターチ、ポリビニルピロリドンなどの結合剤と併用して錠剤や糖衣錠として利用することも有利に実施できる。また、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、他の糖の結晶防止性、難発酵性などの性質を具備している。
【００４８】
従って、本発明の環状マルトシルマルトース、又はこれを含む糖質は、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤などとして、飲食物、嗜好物、飼料、餌料、化粧品、医薬品などの各種組成物に有利に利用できる。
【００４９】
本発明の環状マルトシルマルトース、又はこれを含む糖質は、そのまま甘味付のための調味料として使用できる。必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、異性化糖、砂糖、麦芽糖、トレハロース、蜂蜜、メープルシュガー、ソルビトール、マルチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシド、ラカンカ甘味物、グリチルリチン、ソーマチン、スクラロース、Ｌ−アスパラチルフェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、グリシン、アラニンなどのような他の甘味料と、また、デキストリン、澱粉、乳糖などのような増量剤と混合して使用することもできる。
【００５０】
また、本発明の環状マルトシルマルトース、又はこれを含む糖質の粉末状製品は、そのままで、または必要に応じて、増量剤、賦形剤、結合剤などと混合して、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体、錠剤など各種形状に成形して使用することも随意である。
【００５１】
また、本発明の環状マルトシルマルトース、又はこれを含む糖質の甘味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他の呈味を有する各種の物質とよく調和し、耐酸性、耐熱性も大きいので、一般の飲食物の甘味付、呈味改良に、また品質改良などに有利に利用できる。
【００５２】
例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、フリカケ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、焼き肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなどの各種調味料への甘味料、更には、呈味改良剤、品質改良剤などとして使用することも有利に実施できる。また、例えば、せんべい、あられ、おこし、求肥、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羹、水羊羹、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、ヌガー、キャンディーなどの各種洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペーストなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬け、べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、たくあん漬の素、白菜漬の素などの漬物の素、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、カマボコ、チクワ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酢コンブ、さきするめ、ふぐのみりん干し、タラ、タイ、エビなどの田麩などの各種珍味類、海苔、山菜、するめ、小魚、貝などで製造される佃煮類、煮豆、ポテトサラダ、コンブ巻などの惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜の瓶詰、缶詰類、合成酒、増醸酒、清酒、果実酒、発泡酒、ビールなどの酒類、珈琲、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席ジュース、即席コーヒー、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤、ペプチド食品、冷凍食品などの各種飲食物への甘味付に、呈味改良に、品質改良などに有利に実施できる。
【００５３】
また、家畜、家禽、その他は蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物のための飼料、餌料など嗜好性を向上させる目的で使用することもできる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤など各種の固形物、ペースト状、液状などで嗜好物、化粧品、医薬品などの各種組成物への甘味剤として、または呈味改良剤、矯味剤として、さらに品質改良剤、安定剤などとして有利に利用できる。
【００５４】
品質改良剤、安定剤としては、有効成分、活性など失い易い各種生理活性物質またはこれを含む健康食品、機能性食品、医薬品などに有利に適用できる。例えば、インターフェロン−α、−β、−γ、ツモア・ネクロシス・ファクター−α、−β、マクロファージ遊走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、インターロイキンＩＩなどのリンホカイン含有液、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエチン、卵細胞刺激ホルモンなどのホルモン含有液、ＢＣＧワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤含有液、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質含有液、チアミン、リボフラビン、Ｌ−アスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エルゴステロール、トコフェロールなどのビタミン含有液、ＥＰＡ、ＤＨＡ、アラキドン酸、などの高度不飽和脂肪酸又はそのエステル誘導体、リパーゼ、エステラーゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼなどの酵素含有液、薬用人参エキス、スッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポリスエキスなどのエキス類、ウイルス、乳酸菌、酵母などの生菌ペースト、ローヤルゼリーなどの各種生理活性物質も、その有効成分、活性を失うことなく、安定で高品質の液状、ペースト状または固状の健康食品、機能性食品や医薬品などを容易に製造できることとなる。
【００５５】
以上述べたような各種組成物に、環状マルトシルマルトース、又はこれを含む糖質を含有させる方法としては、その製品が完成するまでの工程に含有せしめればよく、例えば、混和、混捏、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、晶析、固化など公知の方法が適宜選ばれる。その量は、通常０．１質量％以上、望ましくは１質量％以上含有せしめるのが好適である。
【００５６】
以下、実験により本発明を詳細に説明する。
【００５７】
＜実験１：非還元性糖質の調製＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学工業株式会社製造）１．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『ポリペプトン』、日本製薬株式会社製造）０．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『酵母エキスＳ』、日本製薬株式会社製造）０．１ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・２水和物０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５ｗ／ｖ％、炭酸カルシウム０．３ｗ／ｖ％、及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコ１２本に１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却した。次いで、アルスロバクター・グロビホルミス Ｍ６（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４８）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで１２０時間回転振盪培養した。培養後、培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）して菌体を除き、培養上清（約１．１Ｌ）を得た。得られた培養上清の１Ｌを酵素液として用いて、これを２ｗ／ｖ％可溶性澱粉及び２ｍＭ塩化カルシウムを含有する５０ｍＭ酢酸緩衝液１Ｌに添加し、２４時間、４０℃で反応させた後、約１００℃で１０分間、熱処理することによって反応を停止した。
【００５８】
得られた反応物中の糖質を調べるため、展開溶媒としてｎ−ブタノール、ピリジン、水混液（容量比６：４：１）を、また、薄層プレートとしてメルク社製『キーゼルゲル６０』（アルミプレート、１０×２０ｃｍ）を用い、２回展開するシリカゲル薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと略す）を行い、糖質を分離した。硫酸−メタノール法にて発色させ、分離した糖質を検出したところ、グルコース（Ｒｇ値として１．００）、マルトース（Ｒｇ値として０．８２）のほかに、Ｒｇ値が約０．４４の糖質及びＲｇ値が約０．２１の糖質が検出された。これらの糖質は、アルスロバクター・グロビホルミス Ｍ６の培養上清中の酵素が可溶性澱粉に作用し生成したものと考えられた。なお、ここでいうＲｇ値とは、ＴＬＣにおいてグルコースの移動距離に対する溶質の移動距離の比を表したもので、式、Ｒｇ値＝（溶質の原点からの移動距離）／（グルコースの原点からの移動距離）で算出される。
【００５９】
続いて、上述の反応物を塩酸でｐＨ５．０に調整した後、α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」』、天野エンザイム株式会社製造）を固形物１グラム当り４０００単位及びグルコアミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社販売）を固形物１グラム当り２５０単位添加して５０℃、１６時間反応させた。反応後、約１００℃で１０分間、熱処理して反応を停止させた。得られた反応液中の糖質をＴＬＣで分析したところ、グルコース及びＲｇ値約０．４４の糖質のみが検出され、マルトース、Ｒｇ値約０．２１の糖質は検出されなかった。これらの結果から、マルトース及びＲｇ値約０．２１の糖質はα−グルコシダーゼとグルコアミラーゼによってグルコースに分解されるが、Ｒｇ値約０．４４の糖質はこれら酵素によって分解されないことが判明した。
【００６０】
続いて、上述の反応液に水酸化ナトリウムを添加してｐＨを１２に調整し、９８℃で１時間保持することにより還元糖を分解した。不溶物を濾過して除去した後、三菱化学製イオン交換樹脂『ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ』と『ダイヤイオンＷＡ３０』及びオルガノ製アニオン交換樹脂『ＩＲＡ４１１』を用いて脱色、脱塩し、精密濾過した後、エバポレーターで濃縮し、真空乾燥して固形物として約４．０ｇの糖質粉末を得た。
【００６１】
得られた糖質の組成を高速液体クロマトグラフィー法（以下、ＨＰＬＣと略称する。）で調べたところ、図１に示すように、溶出時間１０．６１分にピークが検出され、純度は９７％以上で極めて高純度であることが判明した。なお、ＨＰＬＣは、カラムに『Ｓｈｏｄｅｘ ＳＵＧＡＲ ＫＳ−８０１』（昭和電工株式会社製造）を用い、溶離液に水を用いて、カラム温度６０℃、流速０．５ｍｌ／分の条件で行い、検出は示差屈折計ＲＩ−８０１２（東ソー株式会社製造）を用いて行った。
【００６２】
得られた糖質の還元力をソモギー・ネルソン法で測定したところ、その還元力は検出限界以下であり、本標品は実質的に非還元性糖質であると判断された。
【００６３】
＜実験２：非還元性糖質の構造解析＞
【００６４】
＜実験２−１：質量分析＞
実験１の方法で得られた非還元性糖質について、質量分析装置『ＬＣＱ Ａｄｖａｎｔａｇｅ』（サーモエレクトロン社製）を用いて質量分析したところ、質量数６７１のナトリウム付加分子イオンが顕著に検出され、本発明の非還元性糖質の質量数は６４８であることが判明した。
【００６５】
＜実験２−２：構成糖分析＞
実験１の方法で得られた非還元性糖質について、常法に従って、硫酸を用いて単糖にまで加水分解し、ガスクロマトグラフィー法で構成糖を調べたところ、Ｄ−グルコースのみが検出され、本発明の非還元性糖質の構成糖はＤ−グルコースであることが判明した。上述の質量数を考慮すると、本発明の非還元性糖質はＤ−グルコース４分子からなる環状糖質であることがわかった。
【００６６】
＜実験２−３：メチル化分析＞
実験１の方法で得られた非還元性糖質について、常法に従って、メチル化分析を行いガスクロマトグラフィー法でメチル化物を調べた。結果を表１にまとめた。
【００６７】
【表１】
【００６８】
表１の結果から明らかなように、２，３，４−トリメチル化物と２，３，６−トリメチル化物がほぼ等量であることから、本発明の非還元性糖質を構成するＤ−グルコース４分子のうち、２分子は１位と６位でグルコシド結合しており、また、他の２分子は1位と４位でグルコシド結合していることが判明した。
【００６９】
＜実験２−４：核磁気共鳴分析＞
実験１の方法で得られた非還元性糖質について、常法に従って、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析を行った。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図３に示した。実験２−１及び２−２の結果から本非還元性糖質は４分子のグルコースからなる糖質であることが判明したものの、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいて炭素シグナルが１２本しか認められないことから、本非還元性糖質は対称な構造を有している環状の四糖であることが判明した。また、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおける約４．９３ｐｐｍのシグナル及び約５．２６ｐｐｍのシグナルはＤ−グルコース残基の１位プロトンに帰属され、そのスピン−スピン結合定数を求めたところ、約３．３０９Ｈｚ（約４．９３ｐｐｍのシグナル）及び約３．６７７Ｈｚ（約５．２６ｐｐｍのシグナル）であったことから、１，４グルコシド結合しているＤ−グルコース残基の１位のアノマー型及び１，６グルコシド結合しているＤ−グルコース残基の１位のアノマー型は両方ともα型であることが判明した。
【００７０】
以上の結果から、本発明の非還元性糖質は、図４に示す環状マルトシルマルトース、即ち、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状の四糖であることが判明した。この構造を有する糖質はこれまで全く知られておらず、本発明の環状マルトシルマルトースは新規な環状糖質である。
【００７１】
＜実験３：環状マルトシルマルトース生成酵素の生産＞
実験１に記載の液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコ２本に１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、アルスロバクター・グロビホルミス Ｍ６（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４８）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。
【００７２】
容量３０Ｌのファーメンターに種培養と同じ組成の液体培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液約２００ｍｌを接種し、温度２７℃、ｐＨ５．５乃至８．０に保ちつつ、９６時間通気攪拌培養した。培養後、ファーメンターから培養液を抜き出し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）して菌体を除き、培養上清約１８Ｌを得た。培養液及び培養上清について、環状マルトシルマルトース生成酵素活性を測定したところ、培養液中には該酵素活性を約０．０２８単位／ｍｌ含み、上清中には該酵素活性を約０．０２６単位／ｍｌ含むことがわかり、アルスロバクター・グロビホルミス Ｍ６によって生産される本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素はその大部分が菌体外に存在することが判明した。
【００７３】
＜実験４：環状マルトシルマルトース生成酵素の精製＞
実験３で得た培養上清のうち、約９．２Ｌ（総活性約２４０単位）に、最終濃度６０％飽和となるように硫安を添加し、４℃、２４時間放置することにより塩析した。生成した塩析沈殿物を遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、３０分間）にて回収し、これを１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、粗酵素液として約２４０ｍｌを得た。粗酵素液中の環状マルトシルマルトース生成酵素活性は約０．８３単位／ｍｌであった（総活性約２００単位）。この粗酵素液を東ソー株式会社製『ＤＥＡＥ−トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ） ６５０Ｓ』ゲルを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー（ゲル容量１００ｍｌ）に供した。環状マルトシルマルトース生成酵素活性は、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した『ＤＥＡＥ−トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ） ６５０Ｓ』ゲルに吸着し、食塩濃度０Ｍから０．４Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、食塩濃度約０．２２Ｍ付近に溶出した。この活性画分を回収し、終濃度１Ｍとなるように硫安を添加して４℃、２４時間放置した後、遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『フェニル−トヨパール（Ｐｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ） ６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル容量１０ｍｌ）に供した。本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素活性は、１Ｍ硫安を含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した『フェニル−トヨパール（Ｐｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ） ６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安濃度１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．１Ｍ付近に溶出した。この精製の各ステップにおける環状マルトシルマルトース生成酵素活性量、環状マルトシルマルトース生成酵素比活性及び収率を表２に示す。
【００７４】
【表２】
【００７５】
疎水クロマトグラフィー後の精製した環状マルトシルマルトース生成酵素標品を５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一であり、純度の高い標品であった。
【００７６】
＜実験５：環状マルトシルマルトース生成酵素の性質＞
【００７７】
＜実験５−１：分子量＞
実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して分子量を測定したところ、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素の分子量は７２，０００±２０，０００ダルトンであることが判明した。
【００７８】
＜実験５−２：等電点＞
実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素標品を２．２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・バイオサイエンス社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、同時に泳動した等電点マーカー（アマシャム・バイオサイエンス社製）と比較して等電点を求めたところ、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素の等電点はｐＩ３．６±０．５であることが判明した。
【００７９】
＜実験５−３：酵素反応の至適温度及び至適ｐＨ＞
実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素標品を用いて、酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を本酵素の活性測定法における温度、ｐＨをそれぞれ変化させて測定した。これらの結果を図５（至適温度）、図６（至適ｐＨ）に示した。本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、５０乃至５５℃であり、至適ｐＨは、４０℃、３０分間反応の条件下で５．５乃至６．５であることが判明した。
【００８０】
＜実験５−４：酵素の温度安定性及びｐＨ安定性＞
実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素標品を用いて、本酵素の温度安定性及びｐＨ安定性を調べた。温度安定性は、酵素溶液（１０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を塩化カルシウム非存在下または１ｍＭ存在下で各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ１００ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。これらの結果を図７（温度安定性）、図８（ｐＨ安定性）に示した。図７から明らかなように、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素の温度安定性は、塩化カルシウム非存在下で３０℃まで、塩化カルシウム１ｍＭ存在下で５０℃までであることが判明し、カルシウムイオンによって本酵素の温度安定性が向上することがわかった。また、図８から明らかなように、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素のｐＨ安定性はｐＨ５．０乃至９．０の範囲であることが判明した。
【００８１】
＜実験５−５：酵素活性に及ぼす金属塩の影響＞
実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素標品を用いて、酵素活性に及ぼす金属塩の影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表３に示す。
【００８２】
【表３】
【００８３】
表３の結果から明らかなように、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素活性は、Ｃｕ２＋及びＨｇ２＋イオンで著しく阻害され、Ａｌ３＋、Ｆｅ３＋及びＰｂ２＋イオンで阻害されることも判明した。また、金属イオンのキレート剤であるＥＤＴＡによっても阻害されることも判明した。
【００８４】
＜実験５−６：Ｎ末端アミノ酸配列＞
実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素標品を用いて、本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサー モデル４９２ＨＴ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列、すなわち、アスパラギン酸−プロリン−スレオニン−スレオニン−セリンのＮ末端アミノ酸配列を有していることが判明した。
【００８５】
＜実験５−７：部分アミノ酸配列＞
実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素標品を適量とり、１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して４℃で１８時間透析した後、同緩衝液を加えて蛋白濃度約１ｍｇ／ｍｌとした。この溶液を約１ｍｌとり、リジルエンドペプチダーゼ（和光純薬株式会社販売）２０μｇを加えて、３０℃、１６時間保持して酵素蛋白を加水分解した。加水分解物を予め８％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸で平衡化させておいたＨＰＬＣ用カラム（商品名『マイクロボンダパックＣ１８』、直径３．９ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウォーターズ社製）に注入し、流速０．９ｍｌ／分、室温の条件下、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸−８％（ｖ／ｖ）アセトニトリル溶液から０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸−４０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル溶液の１２０分間のリニアグラジエントで通液し、ペプチド断片を分画した。カラムから溶出したペプチド断片は波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。通液開始から約１２分、約１８分、約２０分、約３６分、約３９分及び約６６分に溶出した６種のペプチド断片のアミノ酸配列を、それぞれ実験５−６と同じ方法で分析したところ、それぞれ配列表における配列番号４乃至９に示されるアミノ酸配列を有していた。
【００８６】
＜実験６：環状マルトシルマルトース生成酵素をコードするＤＮＡのクローニング及びこれを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製＞
環状マルトシルマルトース生成酵素をコードするＤＮＡをアルスロバクター・グロビホルミス Ｍ６（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４８）からクローニングし、自律複製可能な組換えＤＮＡの作製、酵素をコードするＤＮＡの塩基配列の決定、及び形質転換体の調製を行った。
【００８７】
＜実験６−１：染色体ＤＮＡの調製＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学工業株式会社製造）２．０ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『アサヒミースト』、アサヒフードアンドヘルスケア株式会社販売）１．０ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、アルスロバクター・グロビホルミス Ｍ６（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４８）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで２４時間回転振盪培養した。
【００８８】
遠心分離により培養物から採取した菌体をＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に浮遊させ、リゾチームを０．０５％（ｗ／ｖ）加え、３７℃で３０分間インキュベートした。処理物を−８０℃で１時間凍結後、ＴＳＳ緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて６０℃に加温し、ＴＥＳ緩衝液／フェノール混液を加え、氷水中で冷却しながら５分間激しく振盪した後、遠心分離により上清を採取した。この上清に２倍容の冷エタノールを加え、沈殿した粗染色体ＤＮＡを採取し、ＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解後、リボヌクレアーゼとプロテイナーゼをそれぞれ７．５μｇと１２５μｇ加え、３７℃で１時間保持して反応させた。反応物にクロロホルム／イソアミルアルコール混液を加えて染色体ＤＮＡを抽出し、冷エタノールを加え、生成した染色体ＤＮＡを含む沈殿を採取した。このようにして得た精製染色体ＤＮＡを濃度約１ｍｇ／ｍｌになるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、−８０℃で凍結した。
【００８９】
＜実験６−２：組換えＤＮＡ ｐＢＭＢ１と形質転換体ＢＭＢ１の調製＞
実験６−１で調製した精製染色体ＤＮＡ溶液を０．１ｍｌとり、これに制限酵素Ｂａｍ ＨＩを約１００単位加え、３７℃で１時間反応させて染色体ＤＮＡを加水分解した後、アガロース電気泳動法により約３，０００乃至６，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。別途、プラスミドベクター（ストラタジーン・クローニング・システム製、登録商標『Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）』）を常法により制限酵素Ｂａｍ ＨＩを作用させ完全に切断した後、その切断されたプラスミドベクター０．５μｇと先に得たＤＮＡ断片約５μｇとを市販のキット（宝酒造製、商品名『ＤＮＡライゲーション・キット』）を用いて、添付の説明書に従って操作し、連結した。得られた組換えＤＮＡを用いて、通常のコンピテントセル法によりコンピテントセル（商品名『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ』、ストラタジーン・クローニング・システム製）１００μｌを形質転換して遺伝子ライブラリーを作製した。
【００９０】
このようにして得た遺伝子ライブラリーとしての形質転換体を、常法により調製した、１０ｇ／ｌトリプトン、５ｇ／ｌ酵母エキス、５ｇ／ｌ塩化ナトリウム、１００ｍｇ／ｌアンピシリンナトリウム塩、５０ｍｇ／ｌ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシドを含む寒天平板培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間培養後、培地上で形成された白色コロニー約４，０００個をナイロン膜（商品名『Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋』、アマシャム製）上に固定した。別途、実験５−７の方法で明らかにした、配列表における配列番号７で示されるアミノ酸配列における第４より１３番目までのアミノ酸配列に基づき５′−ＧＡＣＧＴＳＧＴＳＣＣＳＡＡＣＣＡＣＡＣＳＧＣＳＧＡＣＴＡＣ−３′で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを化学合成し、常法に従い［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて同位体標識して、プローブ１としての合成ＤＮＡを得た。先に得たナイロン膜上に固定したコロニーのうち、プローブ１と顕著な会合を示すコロニーを通常のコロニーハイブリダイゼーション法を適用して選択し、５種類の形質転換体を得た。
【００９１】
次いで、配列表における配列番号８で示されるアミノ酸配列における第１より１０番目までのアミノ酸配列に基づき、５′−ＧＡＣＴＧＧＧＴＳＧＡＣＡＴＧＧＧＳＴＴＣＧＡＣＧＧＳＡＴＣ−３′で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを化学合成し、上記と同様に同位体標識してプローブ２としての合成ＤＮＡを得た。常法により、上記５種類の形質転換体から組換えＤＮＡを採取し、通常のサザーン・ハイブリダイゼーションを適用して、プローブ２と顕著な会合を示した組換えＤＮＡを選択し、当該組換えＤＮＡを有する形質転換体を『ＢＭＢ１』と命名した。
【００９２】
この形質転換体ＢＭＢ１を、常法に従い１００μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウム塩を含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを抽出した。この組換えＤＮＡの塩基配列を、通常のジデオキシ法により分析したところ、当該組換えＤＮＡは、アルスロバクター・グロビホルミス Ｍ６（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４８）に由来する、配列表における配列番号１０で示される鎖長４４６７塩基対の塩基配列を有するＤＮＡを含んでいた。図９に示すように、この組換えＤＮＡにおいて、当該ＤＮＡは、制限酵素Ｂａｍ ＨＩによる認識部位の下流に連結されていた。一方、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、その配列番号１０に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と、実験５−６の方法で確認された本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素のＮ末端アミノ酸配列及び実験５−７の方法で明らかにされた部分アミノ酸配列である、配列表における配列番号１及び配列番号４乃至９で示されるアミノ酸配列と比較したところ、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列は、配列表における配列番号１０に併記したアミノ酸配列における第４１乃至４５番目のアミノ酸配列と完全に一致した。また、配列表における配列番号４、５、６、７、８及び９に示されるアミノ酸配列は、それぞれ、配列表における配列番号１０で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列における第４１８乃至４２６番目、第４０５乃至４１７番目、第３２３乃至３３２番目、第１６４乃至１９０番目、第２４１乃至２６５番目及び第３３３乃至３６２番目のアミノ酸配列と完全に一致した。以上のことは、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素が、配列表における配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むものであり、当該酵素はアルスロバクター・グロビホルミス Ｍ６（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４８）においては、配列表における配列番号３に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示している。また、配列表における配列番号１０に併記したアミノ酸配列における第１乃至４０番目のアミノ酸配列は、当該酵素の分泌シグナル配列と推定された。これらのことから、当該酵素の分泌前の前駆体は、配列表における配列番号１０に併記されたアミノ酸配列からなり、そのアミノ酸配列は、配列表における配列番号１０に示す塩基配列にコードされていることが判明した。以上のようにして調製し、塩基配列を確認した組換えＤＮＡを『ｐＢＭＢ１』と命名した。
【００９３】
＜実験７：形質転換体による環状マルトシルマルトース生成酵素の産生＞
１０ｇ／ｌ澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学工業株式会社販売）、２０ｇ／ｌポリペプトン、２０ｇ／ｌ酵母エキス及び１ｇ／ｌリン酸一水素ナトリウム・１２水塩及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、無菌的にｐＨ７．０に調整した後、アンピシリンナトリウム塩１０ｍｇを無菌的に添加して液体培地を調製した。この液体培地に実験６−２の方法で得た形質転換体ＢＭＢ１を接種し、２７℃で約４８時間回転振盪培養した。得られた培養物を、常法に従い、遠心分離して培養上清と菌体とに分離して回収した。菌体については、超音波破砕法により細胞からの全抽出物を調製した。超音波破砕法は、菌体を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、その菌体懸濁液を氷水中で冷却しながら超音波ホモジナイザー（モデルＵＨ−６００、株式会社エスエムテー製）で細胞破砕することによって行い、その破砕物を全細胞抽出物とした。
【００９４】
このようにして調製した培養上清と全細胞抽出物とについて、それぞれの環状マルトシルマルトース生成酵素活性を測定し、それぞれの活性値を培養物１ｍｌ当りに換算した。なお、対照として大腸菌ＸＬ２−Ｂｌｕｅ株を上述の形質転換体の場合と同一条件で培養し、培養物から培養上清と全細胞抽出物を調製し、同様に環状マルトシルマルトース生成酵素活性を測定した。これらの結果を表４に示す。
【００９５】
【表４】
【００９６】
表４の結果から明らかなように、形質転換体ＢＭＢ１は、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素を細胞内に産生することが判明した。宿主である対照の大腸菌では培養上清、全細胞抽出物のいずれにも当該酵素活性は全く認められなかった。
【００９７】
この実験７の方法で得た全細胞抽出物を、さらに実験４に示した方法に準じて、塩析、透析し、ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｓゲル、フェニル−トヨパール ６５０Ｍゲルを用いたカラムクロマトグラフィーに供して精製し、さらにこの精製酵素標品を実験５に示した方法に準じて分析した。その結果、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量は約７２，０００±２０，０００ダルトン、等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による等電点は約３．６±０．５、環状マルトシルマルトース生成酵素活性の至適温度は約５０乃至５５℃、至適ｐＨは約５．５乃至６．５、温度安定性は、塩化カルシウム非存在下で３０℃まで、１ｍＭ塩化カルシウム存在下で約５０℃まで安定であり、ｐＨ安定性は約５．０乃至９．０の範囲で安定であった。これらの理化学的性質は、実験４に示された方法で調製された当該酵素のそれと実質的に同一であった。以上の結果は、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素は、組換えＤＮＡ技術によって良好に製造でき、なお且つ酵素の生産性も有意に向上することを示している。
【００９８】
＜実験８：各種糖質への作用＞
各種糖質を用いて、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素の基質特異性を調べた。マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、ネオトレハロース、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、イソマルトース、イソマルトトリオース、パノース、イソパノース、マルチトール、マルトトリイトール、α−、β−又はγ−サイクロデキストリン、アミロース、可溶性澱粉、グリコーゲン、プルラン又はデキストランを含む水溶液を調製した。これらの基質溶液に、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）と最終濃度１ｍＭ塩化カルシウムを加えた後、実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素標品を基質固形物１グラム当たりそれぞれ１単位ずつ加え、基質濃度を２ｗ／ｖ％になるように調整し、これを４０℃、ｐＨ６．０で２４時間作用させた。酵素反応前後の反応液を、実験１記載のＴＬＣ法で分析し、それぞれの糖質に対する酵素作用の有無又は強さの程度を確認した。結果を表５に示す。
【００９９】
【表５】
【０１００】
表５の結果から明らかなように、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素は、試験した糖質のうち、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースによく作用し、また、マルトトリオースに僅かに作用した。さらに、アミロース、澱粉、グリコーゲンにも、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素はよく作用した。これらの結果より、本酵素はグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用することが判明した。
【０１０１】
＜実験９：作用メカニズム＞
【０１０２】
＜実験９−１：マルトテトラオースからの生成物＞
最終濃度１ｗ／ｖ％のマルトテトラオース水溶液に、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）と最終濃度１ｍＭ塩化カルシウムを加えた後、実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素を、基質固形物１グラム当たり１単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で作用させ、経時的にサンプリングを行い、１００℃で１０分間保持して反応を停止した。その酵素反応液の糖組成を、ＨＰＬＣ法を用いて測定した。ＨＰＬＣは、カラムに『ＹＭＣ Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＱ３０３
』（株式会社ワイ・エム・シー製造）を用い、溶離液に水を用いて、カラム温度４０℃、流速０．５ｍｌ／分の条件で行い、検出は示差屈折計ＲＩＤ−１０Ａ（株式会社島津製作所製造）を用いて行った。その結果を表６に示す。
【０１０３】
【表６】
【０１０４】
表６の結果から明らかなように、本酵素の作用の結果、基質マルトテトラオースから、反応初期（反応1時間）において、マルトースと糖質Ｘが顕著に生成することが判明した。また、少量ながら、マルトヘキサオース、環状マルトシルマルトース及びマルトシルマルトース（６２−α−マルトシルマルトース、非環状）が生成することもわかった。さらに、反応の進行とともに、これら生成糖質のうち、マルトースと環状マルトシルマルトースとが著量蓄積し、少量ながらマルトシルマルトース量も増加した。一方、糖質Ｘ及びマルトヘキサオースの生成量は、反応４時間まで増加したものの、それ以降は減少することが判明した。これらの結果から推察すると、反応初期において、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素はマルトテトラオースに作用し、主にマルトースと糖質Ｘを生成し、さらに反応が進むとともに、本酵素は糖質Ｘに作用し、環状マルトシルマルトースを生成すると推定され、糖質Ｘが、マルトテトラオースからの環状マルトシルマルトース生成反応の中間体であると考えられた。また、マルトシルマルトースやマルトヘキサオースが同時に生成することから本酵素はマルトース単位での糖転移を触媒する酵素であり、糖質Ｘもマルトシル転移による生成物と推定された。
【０１０５】
＜実験９−２：糖質Ｘの単離＞
マルトテトラオースから環状マルトシルマルトースを生成する反応における反応中間体と考えられる糖質Ｘの単離を行った。最終濃度１ｗ／ｖ％のマルトテトラオース水溶液２Ｌに、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）と最終濃度１ｍＭ塩化カルシウムを加えた後、実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素を、基質固形物１グラム当たり１単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で４時間作用させた後、１００℃で１０分間保持して反応を停止させた。次いで、予備試験により糖質Ｘがβ−アミラーゼによって分解されないことを確認した後、上記で得られた反応液をｐＨ５．５に調整し、β−アミラーゼ（シグマ社製）を基質固形物１グラム当り５単位添加して５０℃、１６時間処理することにより、反応液中の残存するマルトテトラオースをマルトースに分解した。反応液を１００℃で１０分間保持して反応を停止させ、不溶物を濾過して除去した後、三菱化学製イオン交換樹脂『ダイヤイオンＷＡ３０』を用いて脱色、脱塩し、さらに、三菱化学製カチオン交換樹脂『ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ』とオルガノ製アニオン交換樹脂『ＩＲＡ４１１Ｓ』を用いて脱色、脱塩し、精密濾過した後、エバポレーターで濃縮し、分画原料とした。これを、分取用ＨＰＬＣカラム『ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ Ｒ３５５−１５Ｓ−１５ １２Ａ』（株式会社ワイ・エム・シイ製）に供して精製し、上記のマルトテトラオースからの反応物から、純度９９．３％以上の糖質Ｘ標品を固形物収率約６．７％で得た。
【０１０６】
＜実験９−３：糖質Ｘの構造解析＞
【０１０７】
＜実験９−３−１：環状マルトシルマルトースの生成試験＞
実験９−２の方法で得た糖質Ｘ精製標品の水溶液（最終濃度１ｗ／ｖ％）に、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）と最終濃度１ｍＭ塩化カルシウムを加えた後、実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素を基質固形物１グラム当たり１単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で２４時間作用させ、１００℃で１０分間保持して反応を停止した後、実験１記載のＴＬＣ法及びＨＰＬＣ法で分析し、生成物を調べたところ、主にマルトースと環状マルトシルマルトースが生成することが判明し、糖質Ｘが環状マルトシルマルトース生成反応の中間体であることが確認された。
【０１０８】
＜実験９−３−２：質量分析＞
実験９−２の方法で得た糖質Ｘ精製標品について、実験２−１に記載した方法で質量分析を行ったところ、質量数１０１３のナトリウム付加分子イオンが顕著に検出され、糖質Ｘの質量数が９９０であることが判明し、この質量数から、糖質ＸはＤ−グルコース６分子で構成されていることがわかった。
【０１０９】
＜実験９−３−３：プルラナーゼによる分解試験＞
実験９−２の方法で得た糖質Ｘ精製標品の水溶液（最終濃度１ｗ／ｖ％）にプルラナーゼ（株式会社林原生物化学研究所製造）を作用させ分解試験を行った。基質固形物１グラム当たりプルラナーゼを１単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で２４時間作用させ、１００℃で１０分間保持して反応を停止した後、実験１記載のＴＬＣ法及びＨＰＬＣ法で分析し、生成物を調べたところ、マルトースとマルトテトラオースが生成することが判明した。即ち、糖質Ｘは、マルトース分子とマルトテトラオース分子がα−１，６グルコシド結合した構造を有することが判明した。
【０１１０】
＜実験９−３−４：メチル化分析＞
実験９−２の方法で得た糖質Ｘ標品を用いて、常法に従ってメチル化分析を行い、ガスクロマトグラフィー法でメチル化物を調べた。結果を表７にまとめた。
【０１１１】
【表７】
【０１１２】
表７の結果から明らかなように、２，３，４−トリメチル化物と２，３，６−トリメチル化物と２，３，４，６−テトラメチル化物が約１：４：１の比率であることから、糖質Ｘを構成するグルコース６分子のうち、１分子は１位と６位でグルコシド結合しているグルコースであり、４分子は１位と４位でグルコシド結合しているグルコースであり、他の１分子は１位のみがグルコシル結合したグルコースであることが判明した。また、この結果から、マルトースとマルトテトラオースがα−１，６結合した糖質Ｘにおける１，６グルコシド結合は非還元末端グルコース残基に存在することが判明した。
【０１１３】
以上の結果から、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素によってマルトテトラオースから生成する糖質Ｘは、環状マルトシルマルトース生成反応の中間体であり、その構造はマルトテトラオースの非還元末端グルコース残基の６位水酸基にマルトース基がα結合した６糖で、構造式１で表されるα−マルトシルマルトテトラオース（６４−α−マルトシルマルトテトラオース）であることが判明した。
【０１１４】
構造式１：
【化１】
【０１１５】
以上のことから、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素による環状マルトシルマルトース生成の反応メカニズムは以下のように考えられた。
１）本酵素は、基質としてグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用し、その非還元性末端のマルトシル残基を他のα−１，４グルカン分子の非還元性末端グルコース残基の６位水酸基に転移する分子間の６−α−マルトシル転移を触媒することにより、非還元末端に６−α−マルトシル基を有するグルコース重合度が２増加した６−α−マルトシル−マルトオリゴ糖と、グルコース重合度が２減じたマルトオリゴ糖とを生成する。
２）本酵素はさらに、６−α−マルトシル−マルトオリゴ糖に作用し、分子内α−マルトシル転移することにより環状化し、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状マルトシルマルトースと、グルコース重合度が４減じたマルトオリゴ糖を生成する。
３）本酵素は、僅かながら分子間の４−α−マルトシル転移も触媒し、マルトオリゴ糖から、グルコース重合度が２増加したマルトオリゴ糖と、グルコース重合度が２減じたマルトオリゴ糖とを僅かに生成する。
【０１１６】
＜実験１０：各種基質からの環状マルトシルマルトースの生成＞
各種糖質を用いて、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素の作用による環状マルトシルマルトースの生成を試験した。マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、アミロース、可溶性澱粉、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学工業株式会社製）、グリコーゲン（トウモロコシ由来、キューピー株式会社製）の溶液を調製した。
【０１１７】
これらの水溶液（最終濃度１．０ｗ／ｖ％）に、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）と最終濃度１ｍＭ塩化カルシウムを加えた後、実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位加え、これらを４０℃、ｐＨ６．０で４８時間作用させた後、その反応液を１００℃で１０分間加熱して反応を停止させた。実験１と同様にα−グルコシダーゼ・グルコアミラーゼ処理した後、ＨＰＬＣ法で環状マルトシルマルトースを定量し、環状マルトシルマルトースの生成率を求めた。それらの結果を表８に示す。
【０１１８】
【表８】
【０１１９】
表８の結果から明らかなように、試験したいずれの糖質からも、環状マルトシルマルトース生成酵素の作用によって環状マルトシルマルトースが生成した。その生成率は、基質がマルトトリオースの場合約０．６％と低いのに対して、基質がアミロースの場合約４２％と最も高く、次いでマルトヘキサオース、マルトへプタオースの順であった。可溶性澱粉、澱粉部分分解物及びグリコーゲンからも３０％程度の生成率で環状マルトシルマルトースが生成した。
【０１２０】
＜実験１１：環状マルトシルマルトース生成反応と反応産物の還元力＞
可溶性澱粉の水溶液（最終濃度１．０ｗ／ｖ％）に、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）と最終濃度１ｍＭ塩化カルシウムを加えた後、実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位加え、これらを４０℃、ｐＨ６．０で反応させ、酵素添加直後にサンプリングし、直ちに約１００℃で１０分間加熱して反応を停止し、水冷し、反応０時間の反応液を得た。続いて、反応１、２、３、４時間、それぞれの時点でサンプリングし、直ちに約１００℃で１０分間加熱して反応を停止し、水冷し、反応１時間、反応２時間、反応３時間、反応４時間のそれぞれの反応液を得た。得られた反応液の還元糖量をソモギー・ネルソン法で、全糖量をアンスロン法で測定し、全糖量に占める還元糖量の割合を百分率（％）で表し、還元力とした。また、反応液を実験１と同様にα−グルコシダーゼ・グルコアミラーゼ処理した後、ＨＰＬＣ法で環状マルトシルマルトースを定量し、環状マルトシルマルトースの生成率を求めた。これらの結果を表９にまとめた。
【０１２１】
【表９】
【０１２２】
表９の結果から明らかなように、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素を可溶性澱粉に作用させ、環状マルトシルマルトースを生成させたところ、環状マルトシルマルトースの生成率が１０％以上の場合でも、還元力の増加は０．２％程度とごく僅かであることが判明した。このことは、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素が本質的に転移・環状化反応を触媒する酵素であり、それら反応に際してはほとんど加水分解を伴わないことを意味している。澱粉やその分解物などに本酵素を作用させ、環状マルトシルマルトースを生成させる際、反応前の澱粉やその分解物の還元力、即ち、ＤＥを低くしておけば、増加する還元力が僅かなため、還元力が低い生成物が得られることがわかった。
【０１２３】
＜実験１２：環状マルトシルマルトースの生成に及ぼすイソアミラーゼの添加効果＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学工業株式会社製）水溶液（最終濃度１ｗ／ｖ％）を調製し、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）と最終濃度１ｍＭ塩化カルシウムを加えた後、実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位と、イソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を固形物１グラム当りそれぞれ０、１２５、２５０、５００、１２５０又は２５００単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で４８時間作用させた後、１００℃で１０分間熱処理して酵素を失活させた。続いて、反応液を実験１と同様にα−グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼで処理した後、ＨＰＬＣ法で環状マルトシルマルトースを定量し、環状マルトシルマルトース生成率を求めた。それらの結果を表１０に示す。
【０１２４】
【表１０】
【０１２５】
表１０の結果から明らかなように、イソアミラーゼを添加することによって、環状マルトシルマルトースの生成率が増加することが判明した。
【０１２６】
＜実験１２：環状マルトシルマルトースの生成に及ぼす液化澱粉ＤＥの影響＞
とうもろこし澱粉を濃度２質量％澱粉乳とし、これに炭酸カルシウムを０．１質量％加えてｐＨ６．０に調整し、α−アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』、ノボ社製造）を澱粉グラム当り０．２、０．４、０．６、１．０、１．５又は２．０質量％加え、それぞれ９５℃で１０分間反応させ、次いで、１２０℃にオートクレーブし、約４０℃に急冷して、ＤＥ３．１乃至２０．４の表１１に示す６種類の澱粉液化液を得た。これらの澱粉液化液（最終濃度１質量％）に、実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で４８時間作用させた後、その反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた。これら熱失活させた反応液中の環状マルトシルマルトースの生成量を調べるために、実験１と同様にα−グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼを添加し反応させた後、ＨＰＬＣ法で環状マルトシルマルトースを定量し、環状マルトシルマルトース生成率を求めた。それらの結果を表１１に示す。
【０１２７】
【表１１】
【０１２８】
表１１の結果から明らかなように、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素による環状マルトシルマルトースの生成率は、液化澱粉のＤＥによって影響をうけ、ＤＥが低値であるほど、環状マルトシルマルトースの生成率は高く、逆に、ＤＥが高値であるほど、環状マルトシルマルトースの生成率が低いことが判明した。具体的には、液化澱粉のＤＥは約２０以下、望ましくは、ＤＥ約８以下、更に望ましくは、ＤＥ約５以下が適していることが判明した。
【０１２９】
＜実験１４：結晶環状マルトシルマルトースの調製＞
アミロース（株式会社林原生物化学研究所製）、酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）、及び塩化カルシウムを、最終濃度として、それぞれ、１．２５ｗ／ｖ％、２０ｍＭ、１ｍＭ含む水溶液１６Ｌに、実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位加え、これを４０℃、ｐＨ６．０で９０時間作用させた後、反応液を約９８℃で１０分間加熱し反応を停止させた。得られた反応液を、実験１に記載の方法でグルコアミラーゼ処理し、水酸化ナトリウムにてアルカリ処理することにより還元糖を分解した後、濾過脱色、脱塩、精密濾過、濃縮、真空乾燥して、固形物として約８０．５ｇの環状マルトシルマルトース粉末を得た。ＨＰＬＣ法で分析したところ、環状マルトシルマルトースの純度は９８．９％であった。
【０１３０】
得られた環状マルトシルマルトース粉末（固形物として３６ｇ）を１４４ｇの水に加え、約９０℃に加温して環状マルトシルマルトースを完全に溶解させた後、約２５℃で２日間静置したところ、結晶状の物質が生成した。得られた結晶状物質を含む液を濾過し、濾紙上に結晶状物質を回収し、続いて、少量の水で洗浄した後、結晶状物質を集め、常温常圧で風乾し、２１．８ｇの結晶状粉末を得た。ＨＰＬＣ法で分析したところ、環状マルトシルマルトースの純度は９９．９％以上で、極めて高純度であった。
【０１３１】
得られた環状マルトシルマルトースの結晶状粉末について、Ｘ線回折装置ＲＡＤ−ＩＩＸ（株式会社リガク製）を用いて粉末Ｘ線回折測定を行ったところ、図１０に示すように、主な回折角（２θ）として、５．６°、９．３°、１６．５°及び２７．１°を特徴とする粉末Ｘ線回折図が得られた。また、この結晶状粉末の水分をカールフィッシャー法で測定したところ、水分は１２．８質量％であることがわかり、環状マルトシルマルトース１分子当り５分子の水を含む含水結晶であることが判明した。
【０１３２】
さらに、この環状マルトシルマルトースの結晶粉末を熱重量測定したところ、図１１に示す熱重量曲線が得られ、その重量変化と温度との関係から、温度約１００℃までの上昇で５分子の水に相当する重量減少が認められ、さらに、温度約２８０℃付近から環状マルトシルマルトース自体の熱分解と考えられる重量減少が認められた。これらのことから、本発明の環状マルトシルマルトース含水結晶は、常圧において、温度を１００℃まで上昇させることにより結晶分子当り５分子の水が離脱して無水物になることが判明した。
【０１３３】
＜実験１５：環状マルトシルマルトースの水に対する飽和濃度＞
温度２５℃での水に対する環状マルトシルマルトースの飽和濃度を調べるため、密栓付きガラス製容器に水１０ｍｌを入れ、それに実験１４の方法で得られる環状マルトシルマルトース含水結晶粉末を、完全に溶解する量以上の量を加えた後、ガラス容器を密封し、飽和に達するまで温度２５℃で保温しながら２日間攪拌した。この環状マルトシルマルトース飽和溶液を精密濾過して溶けていない環状マルトシルマルトースを除いた後、その濾液の水分を乾燥減量法で調べ飽和濃度を求めたところ、温度２５℃での水に対する環状マルトシルマルトースの飽和濃度は約８．０質量％であることが判明した。
【０１３４】
＜実験１６：環状マルトシルマルトースの甘味度＞
実験１４の方法で得られる環状マルトシルマルトース含水結晶粉末を脱イオン水に溶かして、固形物濃度５質量％の水溶液とし、この水溶液を甘味度試験溶液とした。一方、蔗糖（市販グラニュー糖）０．５乃至５質量％水溶液を調製し、対照とした。パネラー５名で官能試験を行ったところ、環状マルトシルマルトースの甘味度は蔗糖の約２０％であると推定され、環状マルトシルマルトースが低甘味の糖質であることが判明した。
【０１３５】
＜実験１７：環状マルトシルマルトースの熱安定性＞
実験１４の方法で得られる環状マルトシルマルトース含水結晶粉末を水に溶解し濃度７ｗ／ｖ％の環状マルトシルマルトース水溶液を調製し、その溶液８ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１２０℃で３０乃至９０分間加熱した。放冷後、それら溶液の着色度の測定と、ＨＰＬＣ法による環状マルトシルマルトースの純度測定を行った。着色度は、４８０ｎｍにおける１ｃｍセルでの吸光度とした。結果を表１２に示した。
【０１３６】
【表１２】
【０１３７】
表１２の結果から明らかなように、環状マルトシルマルトース水溶液は１２０℃の高温加熱でも着色はなく、分解による純度低下も認められず、環状マルトシルマルトースは熱に対して安定な糖質であることが判明した。
【０１３８】
＜実験１８：環状マルトシルマルトースのｐＨ安定性＞
実験１４の方法で得られる環状マルトシルマルトース含水結晶粉末を各種の緩衝液（２０ｍＭ）に溶解し、環状マルトシルマルトースを濃度４ｗ／ｖ％、ｐＨを２乃至９に調整した表１３に記載の８種類の環状マルトシルマルトース水溶液を調製した。それぞれの溶液８ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１００℃で２４時間加熱した。放冷後、実験１７と同様にそれら溶液の着色度の測定と、ＨＰＬＣ法による環状マルトシルマルトースの純度測定を行った。結果を表１３に示した。
【０１３９】
【表１３】
【０１４０】
表１３の結果から明らかなように、環状マルトシルマルトース水溶液は１００℃の高温で２４時間加熱しても、ｐＨ２乃至９の広範囲で着色はなく、ｐＨ２において環状マルトシルマルトースは僅かに分解され、純度低下が認められたものの、ｐＨ３乃至９の範囲では全く分解されず、環状マルトシルマルトースは広いｐＨ範囲で煮沸してもきわめて安定な糖質であることが判明した。
【０１４１】
＜実験１９：アミノカルボニル反応＞
実験１４の方法で得られる環状マルトシルマルトース含水結晶粉末を水に溶解し、さらに、市販試薬特級のグリシン及びリン酸緩衝液を加え、５０ｍＭリン酸緩衝液でｐＨ８．０に調整した０．５ｗ／ｖ％グリシンを含む２．５ｗ／ｖ％環状マルトシルマルトース水溶液を調製した。対照として、環状マルトシルマルトース含水結晶粉末の代わりにマルトースを用いた以外は上記と同様にしてマルトース水溶液を調製した。それぞれの溶液４ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１００℃で３０乃至９０分間加熱した。室内で放冷後、それらの着色度を測定しアミノカルボニル反応性を調べた。着色度は、１ｃｍセルでの４８０ｎｍにおける吸光度とした。結果を表１４に示す。
【０１４２】
【表１４】
【０１４３】
表１４の結果から明らかなように、対照のマルトースはグリシン共存下で加熱すると着色し、褐変を引き起こした。一方、本発明の環状マルトシルマルトースは、グリシン共存下で加熱しても着色せず、褐変を引き起こさない、アミノカルボニル反応（メイラード反応）を起こしにくい安定な糖質であることが判明した。
【０１４４】
＜実験２０：アミノカルボニル反応＞
実験１４の方法で得られる環状マルトシルマルトース含水結晶粉末と市販ポリペプトン（日本製薬製）とを脱イオン水に溶かし、５ｗ／ｖ％ポリペプトンを含む５ｗ／ｖ％環状マルトシルマルトース溶液を調製した。対照として、環状マルトシルマルトース含水結晶粉末の代わりにマルトースを用いた以外は上記と同様にしてマルトース水溶液を調製した。それぞれの溶液４ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１２０℃で３０乃至９０分間加熱した。室内で放冷後、それらの着色度を測定しアミノカルボニル反応性を調べた。同時に、ポリペプトンのみを含む溶液をブランクとして同様に加熱した。着色度は、４８０ｎｍにおける１ｃｍセルでの吸光度とし、ブランクの吸光度を差し引いた値とした。結果を表１５に示す。
【０１４５】
【表１５】
【０１４６】
表１５の結果から明らかなように、対照のマルトースはポリペプトン共存下で加熱すると着色し、褐変を引き起こした。一方、環状マルトシルマルトースは、ポリペプトン共存下で加熱しても着色せず、褐変を引き起こさない、アミノカルボニル反応を起こしにくい安定な糖質であることが判明した。
【０１４７】
＜実験２１：環状マルトシルマルトースの包接作用＞
実験１４の方法で得られる環状マルトシルマルトース含水結晶粉末を脱イオン水に溶かし、８質量％水溶液を調製した。その水溶液１００ｇ当たりに、香気成分の具体例として、メタノール１．２ｇ、エタノール１．７ｇ又は酢酸２．２ｇをそれぞれ加えて包接を行なった。その後、それぞれを濾過し濾液を凍結乾燥し、未包接物を除去した。対照として、包接能を有することが知られている分岐サイクロデキストリン（商品名イソエリートＰ、マルハ株式会社販売）を用いて同様の操作を行なった。凍結乾燥粉末中の包接物量を測定するために、それぞれの凍結乾燥粉末１ｇを５ｍｌの水に溶かし、それに５ｍｌのジエチルエーテルを加えて抽出を行い、再度、抽出を繰返した後、ジエチルエーテル中の抽出物をガスクロマトグラフィー法で定量した。結果を表１６に示す。
【０１４８】
【表１６】
【０１４９】
表１６の結果から明らかなように、環状マルトシルマルトースは包接能を有していることが判明し、その包接能は、分岐サイクロデキストリンのものと比べ、メタノールでは重量当たり約１．３倍、エタノールでは約０．５倍、酢酸では約０．８倍の強さであった。
【０１５０】
＜実験２２：環状マルトシルマルトースの消化性試験＞
実験１４の方法で得た環状マルトシルマルトース含水結晶粉末を用いて、日本栄養食糧学会誌、第４３巻、第２３乃至２９頁（１９９０）に記載の岡田らの方法に準じて、試験管内での唾液アミラーゼ、人工胃液、膵液アミラーゼ、小腸粘膜酵素による環状マルトシルマルトースの消化性を調べた。対照として、難消化性糖質として知られているマルチトールを用いて行った。結果を表１７に示す。
【０１５１】
【表１７】
【０１５２】
表１７の結果から明らかなように、環状マルトシルマルトースは、唾液アミラーゼ、人工胃液、膵液アミラーゼ及び小腸粘膜酵素のいずれによっても全く消化されないことがわかり、極めて消化されにくい糖質であることが判明した。
【０１５３】
＜実験２３：環状マルトシルマルトースの発酵性試験＞
実験１４の方法で得られる環状マルトシルマルトース含水結晶粉末を用いて、『ジャーナル・オブ・ニュートリション・サイエンス・アンド・ビタミノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖｉｔａｍｉｎｏｌｏｇｙ）』、第３７巻、５２９乃至５４４頁（１９９１年）に記載の奥らの方法に準じて、ラット盲腸内容物による環状マルトシルマルトースの発酵性を調べた。盲腸内容物は、ウィスター系雄ラットをエーテル麻酔下で屠殺し嫌気的に採取し、４倍量の０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液に懸濁したものを用いた。環状マルトシルマルトースは盲腸内容物重量当り約７質量％を添加し、添加直後および１２時間後に残存する環状マルトシルマルトース量をガスクロマトグラフィー法で定量した。その結果、添加直後の環状マルトシルマルトース濃度は盲腸内容物１グラム当り６８．５ｍｇ、１２時後の環状マルトシルマルトース濃度は盲腸内容物１グラム当り６３．０ｍｇであり、約９２％が発酵されずに残存していることがわかり、環状マルトシルマルトースは極めて発酵されにくい糖質であることが判明した。
【０１５４】
＜実験２４：急性毒性試験＞
マウスを使用して、実験１４の方法で得た環状マルトシルマルトースを経口投与して急性毒性試験を行なった。その結果、環状マルトシルマルトースは低毒性の物質で、投与可能な最大投与量においても死亡例は認められず、そのＬＤ５０値は、５ｇ／ｋｇ−マウス体重以上であった。
【０１５５】
以上の実験２２乃至２４の結果から、環状マルトシルマルトースは、経口摂取しても、消化、吸収されにくく、無カロリー乃至低カロリーの可食素材として、ダイエット甘味料、高甘味度甘味料の賦形剤、ダイエット飲食物の増粘剤、増量剤、賦形剤、更には、食物繊維、脂肪代替食品材料などとして有利に利用できる。
【０１５６】
以下、本発明の環状マルトシルマルトース及びそれを含む糖質の製造方法を実施例１乃至６で、環状マルトシルマルトース及びそれを含む糖質を含有せしめた組成物を実施例７乃至２３で示す。
【実施例１】
【０１５７】
アルスロバクター・グロビホルミス Ｍ６（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４８）を実験３の方法に準じて、種培養した。続いて、容量３０Ｌのファーメンターに、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学工業株式会社製造）３．０ｗ／ｖ％、大豆ペプチド（商品名『ハイニュートＳＭＳ』、不二製油株式会社製造）３．６ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％、炭酸カルシウム０．３ｗ／ｖ％、及び水からなる液体培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度２７℃、ｐＨ５．５乃至８．０に保ちつつ、９６時間通気培養した。培養後、ＳＦ膜を用いて除菌濾過し、約１８Ｌの培養濾液を回収し、更に、その濾液をＵＦ膜濃縮し、３．８単位／ｍｌの本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素を含む濃縮酵素液約１Ｌを回収した。
【実施例２】
【０１５８】
馬鈴薯澱粉乳を濃度約１質量％澱粉乳とし、これに最終濃度１ｍＭとなるように塩化カルシウムを加え、ｐＨ６．０に調整し、９５℃に約２０分間加熱して糊化を行い、次いで約４０℃に冷却し、これに実施例１の方法で得た環状マルトシルマルトース生成酵素を含む濃縮酵素液を澱粉固形物１グラム当り０．２６ｍｌ（約１単位）の割合になるように加え、ｐＨ６．０、温度４０℃で４８時間反応させた。その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に、濃縮して濃度６５質量％の環状マルトシルマルトース含有シラップを固形物当たり収率約９０％で得た。本品は、固形物当たり、環状マルトシルマルトース３１．４質量％、マルトース２．２質量％、マルトトリオース１．５質量％、及びその他の糖質を６５．９質量％含有しており、低還元性で、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例３】
【０１５９】
タピオカ澱粉を濃度約１質量％澱粉乳とし、これに濃度０．１質量％となるように炭酸カルシウムを加え、ｐＨ６．０に調整し、これにα−アミラーゼ（ノボ社製造、商品名『ターマミール６０Ｌ』を澱粉固形物グラム当り０．２質量％になるように加え、９５℃で１０分間反応させ、次いで１２０℃に２０分間オートクレーブし、更に約４０℃に急冷してＤＥ約３の液化溶液を得、これに実施例１の方法で得た環状マルトシルマルトース生成酵素を含む濃縮液を澱粉固形物１グラム当り０．２６ｍｌ（約１単位）とイソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製造）を澱粉固形物１グラム当り１０００単位の割合になるように加え、ｐＨ６．０、温度４０℃で４８時間反応させた。その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して、固形物当り環状マルトシルマルトースを４１．１％含む濃度６０質量％のシラップを得た。得られたシラップを糖液として、強酸性カチオン交換樹脂（アンバーライトＣＲ−１３１０、Ｎａ型、オルガノ株式会社製造）を用いたカラム分画を行なった。樹脂を内径５．４ｃｍのジャケット付きステンレス製カラム４本に充填し、直列につなぎ樹脂層全長２０ｍとした。カラム内温度６０℃に維持しつつ、糖液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、これに６０℃の温水をＳＶ０．１３で流して分画し、溶出液の糖組成をＨＰＬＣ法でモニターし、環状マルトシルマルトース含有画分を含む低分子画分を採取し、精製し、濃縮し、噴霧乾燥して、環状マルトシルマルトース含有粉末を固形物当たり収率約５４％で得た。本品は、固形物当たり、環状マルトシルマルトース６３．２質量％、マルトース７．４質量％、マルトトリオース６．２質量％、及びその他の糖質を２３．２質量％含有しており、低還元性で、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例４】
【０１６０】
トウモロコシ澱粉を濃度約１質量％澱粉乳とし、これに濃度０．１質量％となるように炭酸カルシウムを加え、ｐＨ６．０に調整し、これにα−アミラーゼ（商品名『ネオスピターゼ』、ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉固形物グラム当り０．２％になるように加え、８５乃至９０℃で２０分間反応させ、次いで１２０℃に２０分間オートクレーブし、更に約４０℃に急冷してＤＥ約３の液化溶液を得、これに実施例１の方法で得た環状マルトシルマルトース生成酵素を含む濃縮液を澱粉固形物１グラム当り０．２６ｍｌ（約１単位）とイソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製造）を澱粉固形物１グラム当り１０００単位の割合になるように加え、ｐＨ６．０、温度４０℃で４８時間反応させた。その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、ｐＨ５．０、温度５０℃にし、それにグルコアミラーゼ（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉１グラム当り１００単位の割合になるように加え、ｐＨ５．０、温度５０℃で１６時間反応させた。その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して、濃度６０質量％の環状マルトシルマルトース含有シラップを固形物当たり収率約９５％で得た。本品は、固形物当たり、環状マルトシルマルトース４２．６質量％、グルコース５３．０質量％、及びその他の糖質を４．４質量％含有しており、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例５】
【０１６１】
実施例４の方法で得た環状マルトシルマルトース含有シラップを、常法に従って、水素添加して還元性糖質を糖アルコール化し、精製し、濃縮し、真空乾燥し、粉砕して、環状マルトシルマルトース含有粉末を固形物当たり収率約９０％で得た。本品は、固形物当たり、環状マルトシルマルトース４２．６質量％、ソルビトール５３．２質量％、及びその他の糖アルコールを４．２質量％含有しており、実質的に還元力を示さず、アミノカルボニル反応を起こしにくく、低還元性で、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例６】
【０１６２】
実施例４の方法で得た環状マルトシルマルトース含有シラップを原糖液とし、環状マルトシルマルトースの含量を高めるため、実施例３の方法に準じて塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを行なって、環状マルトシルマルトース高含有画分を採取し、精製して、固形物当たり約９０質量％の環状マルトシルマルトースを含有している環状マルトシルマルトース高含有液を固形物当たり収率約４０％で得た。本溶液を濃縮しながら連続晶析させ、得られるマスキットをバスケット型遠心分離機で分蜜し、結晶を少量の水でスプレーし洗浄し、温風乾燥して、高純度の環状マルトシルマルトース含水結晶を固形物当たり約２５％の収率で得た。本品は、純度９９％以上の極めて純度の高い環状マルトシルマルトース含水結晶であって、還元性が極めて低く、アミノカルボニル反応を起こしにくく、吸湿性も示さず、取扱いが容易であり、温和な低甘味、適度の粘度、保湿性、包接性、難消化性、を有し、甘味料、低カロリー食品素材、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物、更には、工業試薬、化学原料などにも有利に利用できる。
【実施例７】
【０１６３】
＜甘味料＞
実施例６の方法で得た環状マルトシルマルトース含水結晶０．８質量部に、トレハロース含水結晶（株式会社林原商事販売、登録商標『トレハ』）０．２質量部、α−グリコシルステビオシド（東洋精糖株式会社販売、商品名『αＧスィート』）０．０１質量部、およびＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（商品名『アスパルテーム』）０．０１質量部を均一に混合し、顆粒成型機にかけて顆粒状甘味料を得た。本品は、甘味の質が優れ、蔗糖の約２倍の甘味度を有している。本品のカロリーは、環状マルトシルマルトースが難消化性、難発酵性で実質的に無乃至低カロリーである。しかも、室温保存下、変質劣化の懸念も無く安定である。従って、本品は、高品質の低カロリー、低う蝕性甘味料として好適である。
【実施例８】
【０１６４】
＜ハードキャンディー＞
濃度５５％蔗糖溶液１００質量部に実施例４の方法で得た環状マルトシルマルトース含有シラップ５０質量部を加熱混合し、次いで減圧下で水分２％未満になるまで加熱濃縮し、これにクエン酸０．６質量部および適量のレモン香料と着色料とを混和し、常法に従って成型し、製品を得た。本品は歯切れ、呈味、風味とも良好で、蔗糖の晶出も起こさず、吸湿性少なく、ダレも起こさない安定で高品質のハードキャンディーである。
【実施例９】
【０１６５】
＜チューイングガム＞
ガムベース３質量部を柔らかくなる程度に加熱溶融し、これに無水マルチトール２質量部、キシリトール２質量部、実施例６の方法で得た環状マルトシルマルトース含水結晶２質量部、およびトレハロース含水結晶１質量部とを加え、更に適量の香料と着色料とを混合し、常法に従って、ロールにより練り合わせ、成型、包装して製品を得た。本品は、テクスチャー、呈味、風味良好で、低う蝕性、低カロリーのチューイングガムとして好適である。
【実施例１０】
【０１６６】
＜加糖練乳＞
原乳１００質量部に実施例２の方法で得た環状マルトシルマルトース含有シラップ４質量部および蔗糖２重量を溶解し、プレートヒーターで加熱殺菌し、次いで濃度７０％に濃縮し、無菌状態で缶詰して製品を得た。本品は、温和な甘味で風味も良く、フルーツ、コーヒー、ココア、紅茶などの調味用に有利に利用できる。
【実施例１１】
【０１６７】
＜乳酸菌飲料＞
脱脂粉乳１７５質量部、実施例３の方法で得た環状マルトシルマルトース含有粉末１００質量部およびラクトスクロース高含有粉末（株式会社林原商事販売、登録商標『乳果オリゴ』）を水１、５００質量部に溶解し、６５℃で３０分間殺菌し、４０℃に冷却後、これに、常法に従って、乳酸菌のスターターを３０質量部植菌し、３７℃で８時間培養して乳酸菌飲料を得た。本品は、風味良好で、オリゴ糖、環状マルトシルマルトースを含有し、乳酸菌を安定に保つだけでなく、ビフィズス菌増殖促進作用、整腸作用を有する乳酸菌飲料として好適である。
【実施例１２】
【０１６８】
＜粉末ジュース＞
噴霧乾燥により製造したオレンジ果汁粉末３３質量部に対して、実施例６の方法で得た環状マルトシルマルトース含水結晶粉末５０質量部、無水結晶マルチトール１０質量部、無水クエン酸０．６５質量部、リンゴ酸０．１質量部、２−Ｏ−α−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸０．２質量部、クエン酸ソーダ０．１質量部、プルラン０．５質量部および粉末香料の適量をよく混合攪拌し、粉砕し微粉末にして、これを流動層造粒機に仕込み、排風温度４０℃とし、これに実施例２の方法で得た環状マルトシルマルトース含有シラップをバインダーとして適量スプレーし、３０分間造粒し、計量し、包装して製品を得た。本品は、果汁含有率約３０％の粉末ジュースである。又、本品は、異味、異臭がなく、高品質で、低カロリーのジュースとして商品価値の高いものである。
【実施例１３】
【０１６９】
＜カスタードクリーム＞
コーンスターチ１００質量部、実施例２の方法で得た環状マルトシルマルトース含有シラップ１００質量部、トレハロース含水結晶６０質量部、蔗糖４０質量部、および食塩１質量部を充分に混合し、鶏卵２８０質量部を加えて攪拌し、これに沸騰した牛乳１、０００質量部を徐々に加え、更に火にかけて攪拌を続け、コーンスターチが完全に糊化して全体が半透明になった時に火を止め、これを冷却して適量のバニラ香料を加え、計量、充填、包装して製品を得た。本品は、なめらかな光沢を有し、風味良好で、澱粉の老化も抑制され、高品質のカスタードクリームである。
【実施例１４】
【０１７０】
＜ういろうの素＞
米粉９０質量部に、コーンスターチ２０質量部、無水結晶マルチトール７０質量部、実施例５の方法で得た環状マルトシルマルトース含有粉末５０質量部、およびプルラン４質量部を均一に混合してういろうの素を製造した。ういろうの素と適量の抹茶と水とを混練し、これを容器に入れて６０分間蒸し上げて抹茶ういろうを製造した。本品は、照り、口当たりも良好で、風味も良い。又、澱粉の老化も抑制され、日持ちも良く、低カロリーのういろうとしても好適である。
【実施例１５】
【０１７１】
＜あん＞
原料あずき１０質量部に、常法に従って、水を加えて煮沸し、渋切り、あく抜きし、水溶性夾雑物を除去して、あずきつぶあん約２１質量部を得た。この生あんに蔗糖１４質量部、実施例２の方法で得た環状マルトシルマルトース含有シラップ５質量部と水４質量部を加えて煮沸し、これに少量のサラダオイルを加えてつぶあんを壊さないように練り上げ、製品のあんを約３５質量部得た。本品は、色焼け、離水もなく安定で、舌触り、風味良好で、あんパン、まんじゅう、団子、最中、氷菓などの製菓材料として好適である。
【実施例１６】
【０１７２】
＜パン＞
小麦粉１００質量部、イースト菌２質量部、蔗糖５質量部、実施例３の方法で得た環状マルトシルマルトース含有粉末１質量部および無機フード０．１質量部を、常法に従って、水でこね、中種を２６℃で２時間発酵させ、その後３０分間熟成、焼き上げた。本品は、色相、すだちとも良好で、適度の弾力、温和な甘味を有する高品質のパンである。
【実施例１７】
【０１７３】
＜ハム＞
豚もも肉１、０００質量部に食塩１５質量部および硝酸カリウム３質量部を均一にすり込んで、冷室に１昼夜堆積する。これを水５００質量部、食塩１００質量部、硝酸カリウム３質量部、実施例５の方法で得た環状マルトシルマルトース含有粉末４０質量部および香辛料からなる塩漬液に冷室で７日間漬け込み、次いで、常法に従い、冷水で洗浄し、ひもで巻き締め、薫煙し、クッキングし、冷却、包装して製品を得た。本品は、色合いもよく、風味良好な高品質のハムである。
【実施例１８】
【０１７４】
＜粉末ペプチド＞
４０％食品用大豆ペプチド溶液（不二製油株式会社販売、商品名『ハイニュートＳ』）１質量部に、実施例６の方法で得た環状マルトシルマルトース含水結晶粉末２質量部を混合し、プラスチック製バットに入れ、５０℃で減圧乾燥し、粉砕して粉末ペプチドを得た。本品は風味良好で、プレミックス、冷菓などの低カロリー製菓材料として有用であるのみならず、経口流動食、経管流動食のための難消化性の食物繊維、整腸剤量としても有用である。
【実施例１９】
【０１７５】
＜化粧用クリーム＞
モノステアリン酸ポリオキシエチレングリコール２質量部、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン５質量部、実施例６の方法で得た環状マルトシルマルトース含水結晶粉末２質量部、α−グルコシル ルチン（株式会社林原販売、商品名αＧルチン）１質量部、流動パラフィン１質量部、トリオクタン酸グリセリン１０質量部および防腐剤の適量を常法に従って加熱溶解し、これにＬ−乳酸２質量部、１、３−ブチレングリコール５質量部および精製水６６質量部を加え、ホモゲナイザーにかけ乳化し、更に香料の適量を加えて攪拌混合し、化粧用クリームを製造した。本品は、抗酸化性を有し、安定性は高く、高品質の日焼け止め、美肌剤、色白剤などとして有利に利用できる。
【実施例２０】
【０１７６】
＜練歯磨＞
第二リン酸カルシウム４５質量部、ラウリル硫酸ナトリウム１．５質量部、グリセリン２５質量部、ポリオキシエチレンソルビタンラウレート０．５質量部、実施例５の方法で得た環状マルトシルマルトース含有粉末１０質量部、サッカリン０．０２質量部を水１８質量部と混合して練歯磨を得た。本品は、界面活性剤の洗浄力を落とすことなく、嫌味を改良し、使用後感も良好である。
【実施例２１】
【０１７７】
＜流動食用固体製剤＞
実施例３の方法で得た環状マルトシルマルトース含有粉末１００質量部、トレハロース含水結晶２００質量部、マルトテトラオース高含有粉末２００質量部、粉末卵黄２７０質量部、脱脂粉乳２０９質量部、塩化ナトリウム４．４質量部、塩化カリウム１．８質量部、硫酸マグネシウム４質量部、チアミン０．０１質量部、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム０．１質量部、ビタミンＥアセテート０．６質量部およびニコチン酸アミド０．０４質量部からなる配合物を調製し、この配合物２５グラムずつ防湿性ラミネート小袋に充填し、ヒートシールして製品を得た。本品は、環状マルトシルマルトースにより難消化性の食物繊維を強化し、整腸作用に優れた流動食とし、経口的、または鼻腔、胃、腸などへ経管的使用方法により利用され、生体へのエネルギー補給用に有利に利用できる。
【実施例２２】
【０１７８】
＜錠剤＞
アスピリン５０質量部に実施例６の方法で得た環状マルトシルマルトース含水結晶粉末１４質量部、コーンスターチ４質量部を充分に混合した後、常法に従って打錠機により打錠して厚さ５．２５ｍｍ、１錠６８０ｍｇの錠剤を製造した。本品は、環状マルトシルマルトースの賦形性を利用したもので、吸湿性がなく、物理的強度も充分にあり、しかも水中での崩壊はきわめて良好である。
【実施例２３】
【０１７９】
＜外傷治療用膏薬＞
実施例６の方法で得た環状マルトシルマルトース含水結晶粉末１００質量部およびマルトース３００質量部に、ヨウ素３質量部を溶解したメタノール５０質量部を加え混合し、更に１０ｗ／ｖ％プルラン水溶液２００質量部を加えて混合し、適度の延び、付着性を示す外傷治療用膏薬を得た。本品は、環状マルトシルマルトースによりヨウ素、メタノールの揮散を防止し、経時変化が少ない商品価値の高い膏薬である。又、本品は、ヨウ素による殺菌作用のみならず、マルトースによる細胞へのエネルギー補給剤としても作用することから治癒期間が短縮され、創面もきれいに治る。
【産業上の利用可能性】
【０１８０】
本発明によれば、従来未知であったサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する新規環状糖質、すなわち、環状マルトシルマルトースを、環状マルトシルマルトース生成酵素を用いて大量に製造し、提供することが可能となる。本糖質は非還元性であることから、アミノ化合物との間でアミノカルボニル反応（メイラード反応）を起こして褐変することなく、また、環状糖質であることから、包接能を有しており、包接した化合物の揮散を抑制し、安定化することができる。新たな環状マルトシルマルトースの提供を可能とする本発明は、飲食物、化粧品、医薬品など種々の利用分野に貢献することとなり、その産業的意義はきわめて大きい。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状マルトシルマルトース（以下、本明細書では単に「環状マルトシルマルトース」と略称することもある。）及び環状マルトシルマルトース生成酵素とそれらの製造方法と用途並びに当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡに関し、詳細には、環状マルトシルマルトース及び環状マルトシルマルトース生成酵素とその製造方法、環状マルトシルマルトース生成酵素を産生する微生物、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡと形質転換体、当該酵素を用いた環状マルトシルマルトースの生成方法及び製造方法、並びに環状マルトシルマルトースを含有せしめた組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコースを構成糖とする糖質としては、例えば、澱粉を原料として製造される澱粉部分分解物であるアミロース、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖などが知られている。これらの糖質は、通常、分子の両端に非還元性末端と還元性末端を有し、還元性を示すことが知られている。一般に、澱粉部分分解物は、その固形物当りの還元力の大きさをデキストロース・エクイバレント（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ、ＤＥ）として表される。この値の大きいものは、通常、分子が小さく低粘度で、甘味が強いものの、反応性が強く、アミノ酸や蛋白質などのアミノ基を持つ物質とアミノカルボニル反応を起こし易く、褐変し、悪臭を発生して、品質を劣化し易い性質のあることが知られている。斯かる欠点を改善するために、澱粉部分分解物の構成糖であるグルコースを変えることなく、その還元力を低減、若しくは消滅させる方法が古くから望まれていた。例えば、非特許文献１で開示されているように、澱粉にマセランス アミラーゼ（ｍａｃｅｒａｎｓ ａｍｙｌａｓｅ）を作用させることにより、６乃至８分子のグルコースがα−１，４グルコシド結合したα−、β−又はγ−サイクロデキストリンを生成させる方法が知られている。現在では、澱粉からこれらサイクロデキストリンが工業的規模で生産され、これらサイクロデキストリンは、それらが有する、非還元性で、無味であり、包接能を有するなどの特性を生かした用途に利用されている。また、先に、本出願人が、特許文献１、特許文献２などで開示したように、マルトオリゴ糖など澱粉部分分解物に非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素を作用させることにより、２分子のグルコースがα，α−１，１結合したトレハロースを生成させる方法も知られている。現在では、澱粉からトレハロースが工業的規模で生産され、その非還元性や温和で高品質な甘味特性などを生かした用途に利用されている。さらに、先に、本出願人が、特許文献３乃至特許文献５などで開示したように、澱粉又はその部分分解物にα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル転移酵素を作用させることにより、４分子のグルコースがα−１，３グルコシド結合及びα−１，６グルコシド結合で交互に結合した構造、すなわち、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖を生成させる方法も知られている。この環状四糖は、環状構造を有することから包接能を有し、揮発性有機物を安定化する作用を示すとともに、非還元性の糖質であるため、アミノカルボニル反応を起こさず、褐変、劣化を懸念することなく利用、加工できることが期待される。
【０００３】
このように、グルコースを構成糖とする非還元性糖質として、グルコース重合度が６乃至８のα−、β−、γ−サイクロデキストリン、グルコース重合度が２のα，α−トレハロース及びグルコース重合度が４のサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖は、それぞれの特性を生かして種々の分野に利用されているものの、これら糖質以外にもグルコースを構成糖とする非還元性糖質が提供されれば非還元性糖質の選択の幅が広がり、更に多様な用途への利用が期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平７−１４３８７６号公報
【特許文献２】特開平７−２１３２８３号公報
【特許文献３】国際公開 ＷＯ ０１／９０３３８ Ａ１号明細書
【特許文献４】国際公開 ＷＯ ０２／０５５７０８ Ａ１号明細書
【特許文献５】国際公開 ＷＯ ０２／４０６５９ Ａ１号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】「ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）」、米国、１９４９年、第７１巻、３５３乃至３５８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、グルコースを構成糖とする新規な非還元性糖質を提供し、非還元性糖質の選択の幅を広げるとともに当該非還元性糖質を生成する新規酵素と、それらの生成方法及び製造方法、当該酵素をコードするＤＮＡ、これを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換体、並びに当該非還元性糖質を含んでなる組成物とその用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、上記課題を解決するために、澱粉部分分解物から新規な非還元性糖質を生成する全く新しい酵素に期待を込めて、このような酵素を産生する微生物を広く検索してきた。その結果、岡山県岡山市の土壌から、新たに分離した新規微生物、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する新規微生物Ｍ６株が新規な酵素を産生し、この新規酵素の作用により、澱粉又はその部分分解物などのα−１，４グルカンからサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する新規な環状糖質、すなわち環状マルトシルマルトースを著量生成することを見出した。また、環状マルトシルマルトース生成酵素の諸性質を明らかにするとともに、その製造方法を確立し、また、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換体を確立し、さらに、本酵素による環状マルトシルマルトース生成方法、及び本酵素を用いた環状マルトシルマルトース又はこれを含む糖質の製造方法を確立した。さらには、環状マルトシルマルトースはその過飽和水溶液から結晶を容易に晶出し、採取できることを見出し、さらに、環状マルトシルマルトースがメチルアルコール、エチルアルコールや酢酸など揮発成分を包接する作用を有すること、アミノカルボニル反応を起こさず、褐変や劣化が少ないこと、熱やｐＨに対し安定であること、難消化性・難発酵性であることなど有用な特性を有していることを見出し、環状マルトシルマルトース、又はこれを含む糖質を含有せしめた組成物、例えば、風味良好な高品質の食品、低カロリー又はダイエット食品、安定で高品質な化粧品、更には、高活性で安定な医薬品などを容易に製造し得ることを見出して、本発明を完成した。
【０００８】
本発明は、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する新規な環状糖質、すなわち、環状マルトシルマルトースとそれを生成する新規な環状マルトシルマルトース生成酵素とそれらの生成方法及び製造方法、さらには当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換体、並びに環状マルトシルマルトース又はこれを含む糖質を含んでなる組成物とその用途を提供することによって上記課題を解決するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、グルコースを構成糖とする非還元性糖質の選択の幅が広がる上に、従来未知であった新規環状糖質、環状マルトシルマルトースが大量に供給できることとなり、飲食物、化粧品、医薬品をはじめとする様々な分野における利用が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】非還元糖質標品のＨＰＬＣ溶出パターンを示す図である。
【図２】単離した非還元性糖質の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図３】単離した非還元性糖質の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図４】本発明の環状マルトシルマルトースの構造を示す図である。
【図５】環状マルトシルマルトース生成酵素の至適温度を示す図である。
【図６】環状マルトシルマルトース生成酵素の至適ｐＨを示す図である。
【図７】環状マルトシルマルトース生成酵素の温度安定性を示す図である。
【図８】環状マルトシルマルトース生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図９】組換えＤＮＡ、ｐＢＭＢ１を示す図である。図中、黒い太線で示した部分は、アルスロバクター・グロビホルミス Ｍ６（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４８）由来の本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素をコードするＤＮＡである。
【図１０】結晶環状マルトシルマルトースの粉末Ｘ線回折図を示す図である。
【図１１】結晶環状マルトシルマルトースの熱重量曲線を示す図である。
【符号の説明】
【００１１】
ａ：１位がα−１，４グルコシド結合しているグルコース残基
ｂ：１位がα−１，６グルコシド結合しているグルコース残基
ｆ１（＋）ｏｒｉ：ｆ１ファージ複製起点
Ａｍｐ：アンピシリン耐性遺伝子
ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ：コリシンＥ１複製起点
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明でいう環状マルトシルマルトースとは、４分子のグルコースがα−１，４グルコシド結合及びα−１，６グルコシド結合で交互に結合した環状の四糖、すなわち、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状の四糖を意味する。本糖質は、土壌より得た微生物の培養液中に本発明者らが初めて見出した従来未知の新規糖質であり、グルコースを構成糖とする環状の四糖は上記構造を有しているかぎり、その給源、形態、純度、製造方法を問わず本発明に包含される。
【００１３】
本発明でいう環状マルトシルマルトース生成酵素とは、グルコース重合度３以上のα−１，４グルカンに作用し、マルトースを他のα−１，４グルカンの非還元末端グルコースの６位にα−１，６転移することにより６−α−マルトシルα−１，４グルカンを生成し、次いで、これを環状化反応によりサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状マルトシルマルトースを生成する酵素全般を意味する。上記の反応を触媒する酵素はその給源、形態、粗酵素又は精製酵素の区別なく本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素に包含される。
【００１４】
本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素の酵素活性は、次のようにして測定することができる。可溶性澱粉を濃度２ｗ／ｖ％となるよう２ｍＭ塩化カルシウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させ基質液とし、その基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌを加えて、４０℃で３０分間酵素反応し、その反応液を１０分間、約１００℃で加熱して反応を停止させた後、残存可溶性澱粉や夾雑オリゴ糖を分解するためにα−グルコシダーゼを固形物１グラム当り４０００単位とグルコアミラーゼを固形物１グラム当り２５０単位添加して５０℃、１時間処理し、その処理液中の環状マルトシルマルトース量を、後述する実験１に記載のＨＰＬＣ法で定量する。環状マルトシルマルトース生成酵素の活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルの環状マルトシルマルトースを生成する酵素量と定義する。
【００１５】
本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素の具体例としては、例えば、下記の理化学的性質を有する環状マルトシルマルトース生成酵素が挙げられる。
（１）分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法において、７２，０００±２０，０００ダルトン。
（２）等電点
アンフォライン含有等電点電気泳動法において、ｐＩ３．６±０．５。
（３）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、５０℃乃至５５℃。
（４）至適ｐＨ
４０℃、３０分間反応の条件下で、ｐＨ５．５乃至６．５。
（５）温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で、３０℃まで安定。
１ｍＭカルシウムイオン存在下では、５０℃まで安定。
（６）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下で、ｐＨ５．０乃至９．０で安定。
【００１６】
また、上記理化学的性質を有する本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素の一つは、上記理化学的性質のみならず、そのＮ末端配列として、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列を有している場合がある。
【００１７】
本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素は、通常、所定のアミノ酸配列を有しており、その一例としては、例えば、配列表における配列番号２で示されるアミノ酸配列又はそれに相同的なアミノ酸配列が挙げられる。配列表における配列番号２で示されるアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有する変異体酵素としては、グルコース重合度３以上のα−１，４グルカンに作用し、環状マルトシルマルトースを生成するという酵素活性を保持する範囲で、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有するものが挙げられ、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対し、通常、６０％以上、望ましくは、７０％以上、さらに望ましくは、８０％以上、よりさらに望ましくは、９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものが好適である。
【００１８】
しかしながら、上記理化学的性質又はアミノ酸配列を有する環状マルトシルマルトース生成酵素はあくまで一例であって、上記と異なる理化学的性質又はアミノ酸配列を有する酵素も、環状マルトシルマルトースを生成するかぎり本発明に包含されることはいうまでもない。
【００１９】
本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素はその給源によって制限されないものの、好ましい給源として、微生物が挙げられ、とりわけ本発明者らが土壌より単離した微生物Ｍ６株が好適に用いられる。以下、環状マルトシルマルトース生成酵素産生能を有する微生物Ｍ６株の同定試験結果を示す。なお、同定試験は、『微生物の分類と同定』（長谷川武治編、学会出版センター、１９８５年）に準じて行った。
【００２０】
＜Ａ：細胞形態＞
（１）肉汁寒天培養、２７℃
通常０．４×１．０乃至０．８×３．０μｍの短桿菌〜球菌。多形性あり。
運動性あり。無胞子。グラム陽性。
（２）ＥＹＧ寒天培地、２７℃
桿菌−球菌の生育サイクルを示す。
【００２１】
＜Ｂ：培養性質＞
（１） 肉汁寒天平板培養、２７℃
形状： 円形 大きさは３日間で１乃至２ｍｍ。
周縁： 全縁
隆起： 半レンズ状
光沢： 鈍光
表面： 平滑
色調： 不透明、淡い黄色
（２） 肉汁寒天斜面培養、２７℃
生育： 中程度
形状： 糸状
（３） 肉汁ゼラチン穿刺培養、２７℃
液化しない。
【００２２】
＜Ｃ：生理学的性質＞
（１） ＶＰ試験： 陰性
（２） インドールの生成： 陰性
（３） 澱粉の加水分解： 陽性
（５） 色素の生成： 可溶性色素の生成はない
（６） ウレアーゼ： 陰性
（７） オキシダーゼ： 陽性
（８） カタラーゼ： 陽性
（９） 生育の範囲： ｐＨ５．５乃至１０．０、温度 １５乃至３７℃
（１０） 酸素に対する態度： 好気性
（１１） 細胞壁の主要ジアミノ酸： リジン
（１２） 細胞壁のペプチドグリカン型： リジン−アラニン
（１３） 細胞壁のＮ−アシル型： アセチル
（１４） 細胞壁の構成糖： ガラクトース、グルコース、ラムノース
（１５） ビタミンの要求性： なし
（１６） ＤＮＡのＧＣ含量： ７０％
（１７） ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジー：アルスロバクター・グロビホルミス（ＡＴＣＣ８０１０）との間で、６９．３％のＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーを示す。
【００２３】
以上の菌学的性質に基づいて、『バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第２巻（１９８６年）を参考にして、公知菌との異同を検討した。その結果、本菌は、アルスロバクター・グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）に属する微生物であることが判明した。これらの結果より本発明者等は、本菌を新規微生物アルスロバクター・グロビホルミス Ｍ６と命名し、平成１５年８月６日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託し、受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４８として受託された。
【００２４】
本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素産生能を有する微生物には、上記菌はもとより、その変異株、更には、環状マルトシルマルトース生成酵素産生能を有する組換え体微生物を含む他の微生物、及び、それらの変異株なども包含される。
【００２５】
本発明のＤＮＡとは、上記環状マルトシルマルトース生成酵素をコードするもの全般を意味する。本発明のＤＮＡは、環状マルトシルマルトース生成酵素をコードするものである限り、それが天然由来のものであっても、人為的に合成されたものであってもよい。天然の給源としては、例えば、アルスロバクター・グロビホルミス Ｍ６（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４８）を含むアルスロバクター属の微生物が挙げられ、これらの菌体から本発明のＤＮＡを含む遺伝子ＤＮＡを得ることができる。すなわち、斯かる微生物を栄養培地に接種し、好気的条件下で約１乃至３日間培養後、培養物から菌体を採取し、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素や超音波で処理することにより当該ＤＮＡを含む遺伝子ＤＮＡを菌体外に溶出させる。このとき、プロテアーゼなどの蛋白質分解酵素を併用したり、ＳＤＳなどの界面活性剤を共存させたり凍結融解してもよい。斯くして得られる処理物に、例えば、フェノール抽出、アルコール沈殿、遠心分離、リボヌクレアーゼ処理などの常法を適用すれば目的の遺伝子ＤＮＡが得られる。本発明のＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、配列表における配列番号２で示されるアミノ酸配列に基づいて化学合成すればよい。また、当該ＤＮＡを含む遺伝子ＤＮＡを鋳型として、適当なプライマーとなる化学合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ合成することも有利に実施できる。
【００２６】
本発明のＤＮＡは、通常、所定の塩基配列を有しており、その一例としては、例えば、配列表における配列番号３で示される塩基配列又はそれに相同的な塩基配列が挙げられる。配列表における配列番号３で示される塩基配列に相同的な塩基配列を有する変異体ＤＮＡとしては、コードする酵素の活性を保持する範囲で、配列番号３で示される塩基配列において１個又は２個以上の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列を有するものが挙げられ、配列番号３で示される塩基配列に対し、通常、６０％以上、望ましくは、７０％以上、さらに望ましくは、８０％以上、よりさらに望ましくは、９０％以上の相同性を有する塩基配列を有するものが好適である。また、遺伝子コードの縮重に基づき、そのコードする酵素のアミノ酸配列を変えることなく塩基の１個又は２個以上を他の塩基に置換したものも当然、本発明のＤＮＡに包含される。
【００２７】
本発明のＤＮＡを、自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとすることも有利に実施できる。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡと自律複製可能なベクターとからなり、ＤＮＡが入手できれば、常法の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。斯かるベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７などのプラスミドベクターやλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、ρ１１、φ１、φ１０５などのファージベクターが挙げられる。この内、本発明のＤＮＡを大腸菌で発現させるには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、λｇｔ・λＣ及びλｇｔ・λＢが好適であり、一方、枯草菌で発現させるには、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１及びφ１０５が好適である。ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７は、組換えＤＮＡを二種以上の宿主内で複製させる場合に有用である。ＤＮＡを斯かるベクターに挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、まず、ＤＮＡを含む遺伝子ＤＮＡと自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。遺伝子ＤＮＡ及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけＩＩ型の制限酵素、詳細には、Ｓａｕ ３ＡＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｂａｍ ＨＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉなどを使用すれば、ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結するのが容易である。必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培養することにより無限に複製可能である。
【００２８】
このようにして得られる組換えＤＮＡは、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母をはじめとする適宜の宿主微生物に導入することができる。形質転換体を取得するには、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、グルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンを含む栄養培地で培養し、該糖質より環状マルトシルマルトースを生成するものを選択すればよい。
【００２９】
本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素産生能を有する形質転換体も含めた微生物の培養に用いる培地は、微生物が生育でき、環状マルトシルマルトース生成酵素を産生しうる栄養培地であればよく、合成培地および天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、微生物が生育に利用できる物であればよく、例えば、植物由来の澱粉やフィトグリコーゲン、動物や微生物由来のグリコーゲンやプルラン、また、これらの部分分解物やグルコース、フラクトース、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、糖蜜などの糖質、また、クエン酸、コハク酸などの有機酸も使用することができる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の種類により適宜選択できる。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物および、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物を適宜用いることができる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などの塩類を適宜用いることができる。更に、必要に応じて、アミノ酸、ビタミンなども適宜用いることができる。
【００３０】
培養は、通常、温度１５乃至３７℃でｐＨ５．５乃至１０の範囲、好ましくは温度２０乃至３４℃でｐＨ５．５乃至８．５の範囲から選ばれる条件で好気的に行われる。培養時間は当該微生物が増殖し得る時間であればよく、好ましくは１０時間乃至１５０時間である。また、培養条件における培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、０．５乃至２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通気量を調節したり、攪拌したりするなどの手段を適宜採用する。また、培養方式は、回分培養または連続培養のいずれでもよい。
【００３１】
このようにして環状マルトシルマルトース生成酵素産生能を有する微生物を培養した後、本発明の酵素を含む培養物を回収する。環状マルトシルマルトース生成酵素活性は、培養微生物がアルスロバクター・グロビホルミス Ｍ６（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４８）の場合、主に培養物の除菌液に認められ、除菌液を粗酵素液として採取することも、培養物全体を粗酵素液として用いることもできる。培養物から菌体を除去するには常法の固液分離法が採用される。例えば、培養物そのものを遠心分離する方法、あるいは、プレコートフィルターなどを用いて濾過分離する方法、平膜、中空糸膜などの膜濾過により分離する方法などが適宜採用される。除菌液をそのまま粗酵素液として用いることができるものの、一般的には、濃縮して用いられる。濃縮法としては、硫安塩析法、アセトン及びアルコール沈殿法、平膜、中空膜などを用いた膜濃縮法などを採用することができる。
【００３２】
更に、環状マルトシルマルトース生成酵素活性を有する除菌液及びその濃縮液を用いて、環状マルトシルマルトース生成酵素を斯界において常用されている適宜の方法により固定化することもできる。例えば、イオン交換体への結合法、樹脂及び膜などとの共有結合法・吸着法、高分子物質を用いた包括法などを適宜採用できる。
【００３３】
上記のように本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素は、粗酵素液をそのまま又は濃縮して用いることができるものの、必要に応じて、斯界において常用されている適宜の方法によって、さらに分離・精製して利用することもできる。例えば、培養液の上清又は破砕処理物を硫安塩析して濃縮した酵素標品を透析後、『ＤＥＡＥ−トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｓ』樹脂を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、続いて、『フェニル−トヨパール（Ｐｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』樹脂を用いた疎水クロマトグラフィーを用いて精製することにより、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素を、電気泳動的に単一バンドを示す精製酵素として得ることができる。
【００３４】
環状マルトシルマルトース生成酵素が組換え型酵素である場合には、宿主の種類によっては菌体内に酵素が蓄積することがある。このような場合には、菌体又は培養物をそのまま使用することも可能であるものの、通常は使用に先立ち、必要に応じて、浸透圧ショックや界面活性剤により菌体から抽出した後、又は、超音波や細胞壁溶解酵素により菌体を破砕した後、濾過、遠心分離などにより組換え型酵素を菌体又は菌体破砕物から分離して用いることも有利に実施できる。
【００３５】
このようにして得られる本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素は、グルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用し、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状マルトシルマルトースを生成する。本酵素はグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用し、分子間でα−マルトシル転移反応することによって、非還元性末端グルコースの６位にα−マルトシル残基が結合した６−α−マルトシル−α−１，４グルカンを生成し、これを環状化することによって、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状マルトシルマルトースを生成すると推察される。本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素は、具体的には、下記の理化学的性質を有する場合がある。
（１）分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法において、７２，０００±２０，０００ダルトン。
（２）等電点
アンフォライン含有等電点電気泳動法において、ｐＩ３．６±０．５。
（３）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、５０℃乃至５５℃。
（４）至適ｐＨ
４０℃、３０分間反応の条件下で、ｐＨ５．５乃至６．５。
（５）温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で、３０℃まで安定。
１ｍＭカルシウムイオン存在下では、５０℃まで安定。
（６）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下で、ｐＨ５．０乃至９．０で安定。
（７）Ｎ末端アミノ酸配列
配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列、すなわち、アスパラギン酸―プロリン−スレオニン−スレオニン−セリンのアミノ酸配列を有する。
【００３６】
本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素の基質となるグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンとしては、澱粉、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲンなどや、それらをアミラーゼまたは酸などによって部分的に加水分解して得られるアミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトオリゴ糖などの部分分解物が挙げられる。アミラーゼで分解した部分分解物としては、例えば、『ハンドブック・オブ・アミレーシズ・アンド・リレイテッド・エンザイム（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ａｍｙｌａｓｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ）（１９８８年）パーガモン・プレス社（東京）に記載されている、α−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１）、マルトテトラオース生成アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．６０）、マルトペンタオース生成アミラーゼ、マルトヘキサオース生成アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．９８）などのアミラーゼを用いて澱粉、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲンなどを分解して得られる部分分解物を用いることができる。更には、部分分解物を調製する際、プルラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．４１）、イソアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．６８）などの澱粉枝切り酵素を作用させることも随意である。
【００３７】
基質としての澱粉は、例えば、とうもろこし、小麦、米など由来の地上澱粉であっても、また、馬鈴薯、さつまいも、タピオカなど由来の地下澱粉であってもよく、好ましくは、澱粉を糊化及び／又は液化した溶液として用いられる。その澱粉の部分分解の程度は低い程、環状マルトシルマルトース生成率が高くなることから、ＤＥ約２０以下、望ましくは約１２以下、更に望ましくは約５以下の部分分解物が好適である。なお、本明細書でいう環状マルトシルマルトース生成率とは、式、環状マルトシルマルトース生成率（％）＝｛（生成した環状マルトシルマルトースの質量）／（反応液中の全糖質の質量）｝×１００で算出される値を意味する。
【００３８】
本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素を基質に作用させるに際し、その基質濃度は特に限定されず、例えば、基質濃度０．１％（ｗ／ｖ）の比較的低濃度の溶液を用いた場合でも、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素の反応は進行して環状マルトシルマルトースを生成する。工業的には、基質濃度１％（ｗ／ｖ）以上が好適であり、この条件下で、環状マルトシルマルトースを有利に生成できる。また、基質溶液としては、完全に溶けきらない不溶性の基質を含有する高濃度の基質溶液であっても良い。反応温度は反応が進行する温度、即ち６０℃付近までで行えばよい。好ましくは３０乃至５０℃付近の温度を用いる。反応ｐＨは、通常、５乃至９の範囲、好ましくはｐＨ５乃至７の範囲に調整するのがよい。酵素の使用量と反応時間とは密接に関係しており、目的とする酵素反応の進行により適宜選択すればよい。
【００３９】
例えば、基質濃度１％（ｗ／ｖ）の澱粉又はその部分分解物やアミロースの水溶液に本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素を作用させることにより、澱粉又はその部分分解物からは約３０％以上、アミロースからは約４４％の高い環状マルトシルマルトース生成率で本発明の環状マルトシルマルトースを得ることができる。この環状マルトシルマルトース生成酵素による環状マルトシルマルトースの生成メカニズムは、以下のように推察される。
１） 本酵素は、基質としてグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用し、その非還元性末端のマルトシル残基を他の分子の非還元性末端グルコース残基の６位水酸基に転移する分子間の６−α−マルトシル転移を触媒して、非還元末端に６−α−マルトシル基を有するグルコース重合度が２増加した６−α−マルトシル−α−１，４グルカンと、グルコース重合度が２減じたα−１，４グルカンとを生成する。
２） 本酵素はさらに、６−α−マルトシル−α−１，４グルカンに作用し、環状化反応を触媒して、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状マルトシルマルトースと、６−α−マルトシル−α−１，４グルカンから数えてグルコース重合度が４減じたα−１，４グルカンを生成する。
３） １）及び２）で新たに生じたα−１，４グルカンは、再度、１）から２）の反応を受けることによって、環状マルトシルマルトースを生成する。
【００４０】
また、この環状マルトシルマルトース生成反応の際、他の酵素を更に同時併用して、環状マルトシルマルトース生成率を向上させることも有利に実施できる。例えば、澱粉に、環状マルトシルマルトース生成酵素とイソアミラーゼなどの澱粉枝切り酵素を同時併用して作用させることにより、環状マルトシルマルトースの生成率をさらに向上させることも有利に実施できる。
【００４１】
上記の反応によって得られた反応液は、そのまま環状マルトシルマルトース含有糖液として用いることもできる。また、必要に応じて、環状マルトシルマルトース含有糖液に、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ及びα−グルコシダーゼから選ばれる１種又は２種以上を作用させて、夾雑するオリゴ糖を加水分解した環状マルトシルマルトース含有糖液として用いることもできる。一般的には、環状マルトシルマルトース含有糖液はさらに精製して用いられる。精製方法としては、糖の精製に用いられる通常の方法を適宜採用すればよく、例えば、活性炭による脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂による脱塩、イオン交換カラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーによる分画、アルコールおよびアセトンなど有機溶媒による分別、適度な分離性能を有する膜による分離、更には、環状マルトシルマルトースを利用せず夾雑糖質を資化、分解する微生物、例えば酵母などによる発酵処理や、アルカリ処理などにより残存している還元性糖質を分解除去するなどの１種または２種以上の精製方法が適宜採用できる。
【００４２】
とりわけ、工業的大量生産方法としては、イオン交換カラムクロマトグラフィーの採用が好適であり、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５８−７２５９８号公報などに開示されている強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより夾雑糖類を除去し、目的物の含量を向上させた環状マルトシルマルトース、又はこれを含む糖質を有利に製造することができる。この際、固定床方式、移動床方式、疑似移動床方式のいずれの方式を採用することも随意である。
【００４３】
このようにして得られた環状マルトシルマルトースを含む水溶液、又はその含量を向上させた糖質水溶液は、通常、環状マルトシルマルトースを、固形物当たり、１０質量％以上、望ましくは４０質量％以上含有する糖質水溶液で、通常、これを濃縮し、シラップ状製品とする。このシラップ状製品は、更に、乾燥して粉末状製品にすることも随意である。
【００４４】
環状マルトシルマルトースの結晶を製造するには、例えば、固形物当たりの環状マルトシルマルトース純度約５０％以上、濃度約５乃至９０質量％の環状マルトシルマルトース含有液を助晶缶にとり、固形物当たり０．１乃至２０質量％の種結晶共存下で、温度９５℃以下、望ましくは１０乃至９０℃の範囲で、攪拌しつつ徐冷し、環状マルトシルマルトースの結晶を含有するマスキットを製造する。マスキットから環状マルトシルマルトースの結晶を製造する方法としては分蜜が挙げられ、また、環状マルトシルマルトースの含蜜結晶を製造する方法としては、例えば、ブロック粉砕、流動造粒、噴霧乾燥など公知の方法が挙げられる。このようにして製造される本発明の環状マルトシルマルトースの結晶又は含蜜結晶は、上品で低甘味を有する非還元性の白色粉末で、安定な糖質であり、他の素材、特にアミノ酸、オリゴペプチド、蛋白質などのアミノ酸を有する物質と混合、加工しても、褐変することも、異臭を発生することもなく、混合した他の素材を損なうことも少ない。
【００４５】
また、本発明の環状マルトシルマルトースは包接能を有しており、包接した香気成分、有効成分などの揮散、品質劣化を防止することから、香気成分、有効成分の安定化保持に極めて優れている。この際、必要に応じて、サイクロデキストリン類、分岐サイクロデキストリン類、本出願人が特許文献３乃至５で開示したサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖、分岐環状四糖類、サイクロデキストラン類、サイクロフラクタン類など他の環状糖質を併用することで、包接能による安定化を強化することも有利に実施できる。サイクロデキストリン類など環状糖質としては、高純度のものに限る必要はなく、低純度の環状糖質、例えば、多量のマルトデキストリンとともに各種の環状糖質を含有した澱粉部分分解物なども有利に利用できる。
【００４６】
更に、本発明の環状マルトシルマルトースはアミラーゼやα−グルコシダーゼによって実質的に分解されないことから、経口摂取しても消化吸収されず、また、腸内細菌によって発酵されにくく、極めて低カロリーの糖質であって、水溶性食物繊維様の物質として利用することができる。本発明の環状マルトシルマルトースが粉末製品の場合には、これ自体の吸湿性が低く、付着、固結しにくいのみならず、他の粉末と混合して得られる粉末状物の付着、固結を防止することもできる。更に、環状マルトシルマルトース自体は、無毒、無害の新規な甘味料である。
【００４７】
また、本発明の環状マルトシルマルトースは安定な甘味料であることより、結晶製品の場合には、プルラン、ヒドロキシエチルスターチ、ポリビニルピロリドンなどの結合剤と併用して錠剤や糖衣錠として利用することも有利に実施できる。また、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、他の糖の結晶防止性、難発酵性などの性質を具備している。
【００４８】
従って、本発明の環状マルトシルマルトース、又はこれを含む糖質は、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤などとして、飲食物、嗜好物、飼料、餌料、化粧品、医薬品などの各種組成物に有利に利用できる。
【００４９】
本発明の環状マルトシルマルトース、又はこれを含む糖質は、そのまま甘味付のための調味料として使用できる。必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、異性化糖、砂糖、麦芽糖、トレハロース、蜂蜜、メープルシュガー、ソルビトール、マルチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシド、ラカンカ甘味物、グリチルリチン、ソーマチン、スクラロース、Ｌ−アスパラチルフェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、グリシン、アラニンなどのような他の甘味料と、また、デキストリン、澱粉、乳糖などのような増量剤と混合して使用することもできる。
【００５０】
また、本発明の環状マルトシルマルトース、又はこれを含む糖質の粉末状製品は、そのままで、または必要に応じて、増量剤、賦形剤、結合剤などと混合して、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体、錠剤など各種形状に成形して使用することも随意である。
【００５１】
また、本発明の環状マルトシルマルトース、又はこれを含む糖質の甘味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他の呈味を有する各種の物質とよく調和し、耐酸性、耐熱性も大きいので、一般の飲食物の甘味付、呈味改良に、また品質改良などに有利に利用できる。
【００５２】
例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、フリカケ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、焼き肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなどの各種調味料への甘味料、更には、呈味改良剤、品質改良剤などとして使用することも有利に実施できる。また、例えば、せんべい、あられ、おこし、求肥、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羹、水羊羹、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、ヌガー、キャンディーなどの各種洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペーストなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬け、べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、たくあん漬の素、白菜漬の素などの漬物の素、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、カマボコ、チクワ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酢コンブ、さきするめ、ふぐのみりん干し、タラ、タイ、エビなどの田麩などの各種珍味類、海苔、山菜、するめ、小魚、貝などで製造される佃煮類、煮豆、ポテトサラダ、コンブ巻などの惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜の瓶詰、缶詰類、合成酒、増醸酒、清酒、果実酒、発泡酒、ビールなどの酒類、珈琲、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席ジュース、即席コーヒー、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤、ペプチド食品、冷凍食品などの各種飲食物への甘味付に、呈味改良に、品質改良などに有利に実施できる。
【００５３】
また、家畜、家禽、その他は蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物のための飼料、餌料など嗜好性を向上させる目的で使用することもできる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤など各種の固形物、ペースト状、液状などで嗜好物、化粧品、医薬品などの各種組成物への甘味剤として、または呈味改良剤、矯味剤として、さらに品質改良剤、安定剤などとして有利に利用できる。
【００５４】
品質改良剤、安定剤としては、有効成分、活性など失い易い各種生理活性物質またはこれを含む健康食品、機能性食品、医薬品などに有利に適用できる。例えば、インターフェロン−α、−β、−γ、ツモア・ネクロシス・ファクター−α、−β、マクロファージ遊走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、インターロイキンＩＩなどのリンホカイン含有液、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエチン、卵細胞刺激ホルモンなどのホルモン含有液、ＢＣＧワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤含有液、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質含有液、チアミン、リボフラビン、Ｌ−アスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エルゴステロール、トコフェロールなどのビタミン含有液、ＥＰＡ、ＤＨＡ、アラキドン酸、などの高度不飽和脂肪酸又はそのエステル誘導体、リパーゼ、エステラーゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼなどの酵素含有液、薬用人参エキス、スッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポリスエキスなどのエキス類、ウイルス、乳酸菌、酵母などの生菌ペースト、ローヤルゼリーなどの各種生理活性物質も、その有効成分、活性を失うことなく、安定で高品質の液状、ペースト状または固状の健康食品、機能性食品や医薬品などを容易に製造できることとなる。
【００５５】
以上述べたような各種組成物に、環状マルトシルマルトース、又はこれを含む糖質を含有させる方法としては、その製品が完成するまでの工程に含有せしめればよく、例えば、混和、混捏、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、晶析、固化など公知の方法が適宜選ばれる。その量は、通常０．１質量％以上、望ましくは１質量％以上含有せしめるのが好適である。
【００５６】
以下、実験により本発明を詳細に説明する。
【００５７】
＜実験１：非還元性糖質の調製＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学工業株式会社製造）１．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『ポリペプトン』、日本製薬株式会社製造）０．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『酵母エキスＳ』、日本製薬株式会社製造）０．１ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・２水和物０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５ｗ／ｖ％、炭酸カルシウム０．３ｗ／ｖ％、及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコ１２本に１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却した。次いで、アルスロバクター・グロビホルミス Ｍ６（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４８）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで１２０時間回転振盪培養した。培養後、培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）して菌体を除き、培養上清（約１．１Ｌ）を得た。得られた培養上清の１Ｌを酵素液として用いて、これを２ｗ／ｖ％可溶性澱粉及び２ｍＭ塩化カルシウムを含有する５０ｍＭ酢酸緩衝液１Ｌに添加し、２４時間、４０℃で反応させた後、約１００℃で１０分間、熱処理することによって反応を停止した。
【００５８】
得られた反応物中の糖質を調べるため、展開溶媒としてｎ−ブタノール、ピリジン、水混液（容量比６：４：１）を、また、薄層プレートとしてメルク社製『キーゼルゲル６０』（アルミプレート、１０×２０ｃｍ）を用い、２回展開するシリカゲル薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと略す）を行い、糖質を分離した。硫酸−メタノール法にて発色させ、分離した糖質を検出したところ、グルコース（Ｒｇ値として１．００）、マルトース（Ｒｇ値として０．８２）のほかに、Ｒｇ値が約０．４４の糖質及びＲｇ値が約０．２１の糖質が検出された。これらの糖質は、アルスロバクター・グロビホルミス Ｍ６の培養上清中の酵素が可溶性澱粉に作用し生成したものと考えられた。なお、ここでいうＲｇ値とは、ＴＬＣにおいてグルコースの移動距離に対する溶質の移動距離の比を表したもので、式、Ｒｇ値＝（溶質の原点からの移動距離）／（グルコースの原点からの移動距離）で算出される。
【００５９】
続いて、上述の反応物を塩酸でｐＨ５．０に調整した後、α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」』、天野エンザイム株式会社製造）を固形物１グラム当り４０００単位及びグルコアミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社販売）を固形物１グラム当り２５０単位添加して５０℃、１６時間反応させた。反応後、約１００℃で１０分間、熱処理して反応を停止させた。得られた反応液中の糖質をＴＬＣで分析したところ、グルコース及びＲｇ値約０．４４の糖質のみが検出され、マルトース、Ｒｇ値約０．２１の糖質は検出されなかった。これらの結果から、マルトース及びＲｇ値約０．２１の糖質はα−グルコシダーゼとグルコアミラーゼによってグルコースに分解されるが、Ｒｇ値約０．４４の糖質はこれら酵素によって分解されないことが判明した。
【００６０】
続いて、上述の反応液に水酸化ナトリウムを添加してｐＨを１２に調整し、９８℃で１時間保持することにより還元糖を分解した。不溶物を濾過して除去した後、三菱化学製イオン交換樹脂『ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ』と『ダイヤイオンＷＡ３０』及びオルガノ製アニオン交換樹脂『ＩＲＡ４１１』を用いて脱色、脱塩し、精密濾過した後、エバポレーターで濃縮し、真空乾燥して固形物として約４．０ｇの糖質粉末を得た。
【００６１】
得られた糖質の組成を高速液体クロマトグラフィー法（以下、ＨＰＬＣと略称する。）で調べたところ、図１に示すように、溶出時間１０．６１分にピークが検出され、純度は９７％以上で極めて高純度であることが判明した。なお、ＨＰＬＣは、カラムに『Ｓｈｏｄｅｘ ＳＵＧＡＲ ＫＳ−８０１』（昭和電工株式会社製造）を用い、溶離液に水を用いて、カラム温度６０℃、流速０．５ｍｌ／分の条件で行い、検出は示差屈折計ＲＩ−８０１２（東ソー株式会社製造）を用いて行った。
【００６２】
得られた糖質の還元力をソモギー・ネルソン法で測定したところ、その還元力は検出限界以下であり、本標品は実質的に非還元性糖質であると判断された。
【００６３】
＜実験２：非還元性糖質の構造解析＞
【００６４】
＜実験２−１：質量分析＞
実験１の方法で得られた非還元性糖質について、質量分析装置『ＬＣＱ Ａｄｖａｎｔａｇｅ』（サーモエレクトロン社製）を用いて質量分析したところ、質量数６７１のナトリウム付加分子イオンが顕著に検出され、本発明の非還元性糖質の質量数は６４８であることが判明した。
【００６５】
＜実験２−２：構成糖分析＞
実験１の方法で得られた非還元性糖質について、常法に従って、硫酸を用いて単糖にまで加水分解し、ガスクロマトグラフィー法で構成糖を調べたところ、Ｄ−グルコースのみが検出され、本発明の非還元性糖質の構成糖はＤ−グルコースであることが判明した。上述の質量数を考慮すると、本発明の非還元性糖質はＤ−グルコース４分子からなる環状糖質であることがわかった。
【００６６】
＜実験２−３：メチル化分析＞
実験１の方法で得られた非還元性糖質について、常法に従って、メチル化分析を行いガスクロマトグラフィー法でメチル化物を調べた。結果を表１にまとめた。
【００６７】
【表１】
【００６８】
表１の結果から明らかなように、２，３，４−トリメチル化物と２，３，６−トリメチル化物がほぼ等量であることから、本発明の非還元性糖質を構成するＤ−グルコース４分子のうち、２分子は１位と６位でグルコシド結合しており、また、他の２分子は1位と４位でグルコシド結合していることが判明した。
【００６９】
＜実験２−４：核磁気共鳴分析＞
実験１の方法で得られた非還元性糖質について、常法に従って、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析を行った。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２に、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図３に示した。実験２−１及び２−２の結果から本非還元性糖質は４分子のグルコースからなる糖質であることが判明したものの、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいて炭素シグナルが１２本しか認められないことから、本非還元性糖質は対称な構造を有している環状の四糖であることが判明した。また、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおける約４．９３ｐｐｍのシグナル及び約５．２６ｐｐｍのシグナルはＤ−グルコース残基の１位プロトンに帰属され、そのスピン−スピン結合定数を求めたところ、約３．３０９Ｈｚ（約４．９３ｐｐｍのシグナル）及び約３．６７７Ｈｚ（約５．２６ｐｐｍのシグナル）であったことから、１，４グルコシド結合しているＤ−グルコース残基の１位のアノマー型及び１，６グルコシド結合しているＤ−グルコース残基の１位のアノマー型は両方ともα型であることが判明した。
【００７０】
以上の結果から、本発明の非還元性糖質は、図４に示す環状マルトシルマルトース、即ち、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状の四糖であることが判明した。この構造を有する糖質はこれまで全く知られておらず、本発明の環状マルトシルマルトースは新規な環状糖質である。
【００７１】
＜実験３：環状マルトシルマルトース生成酵素の生産＞
実験１に記載の液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコ２本に１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、アルスロバクター・グロビホルミス Ｍ６（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４８）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。
【００７２】
容量３０Ｌのファーメンターに種培養と同じ組成の液体培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液約２００ｍｌを接種し、温度２７℃、ｐＨ５．５乃至８．０に保ちつつ、９６時間通気攪拌培養した。培養後、ファーメンターから培養液を抜き出し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）して菌体を除き、培養上清約１８Ｌを得た。培養液及び培養上清について、環状マルトシルマルトース生成酵素活性を測定したところ、培養液中には該酵素活性を約０．０２８単位／ｍｌ含み、上清中には該酵素活性を約０．０２６単位／ｍｌ含むことがわかり、アルスロバクター・グロビホルミス Ｍ６によって生産される本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素はその大部分が菌体外に存在することが判明した。
【００７３】
＜実験４：環状マルトシルマルトース生成酵素の精製＞
実験３で得た培養上清のうち、約９．２Ｌ（総活性約２４０単位）に、最終濃度６０％飽和となるように硫安を添加し、４℃、２４時間放置することにより塩析した。生成した塩析沈殿物を遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、３０分間）にて回収し、これを１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、粗酵素液として約２４０ｍｌを得た。粗酵素液中の環状マルトシルマルトース生成酵素活性は約０．８３単位／ｍｌであった（総活性約２００単位）。この粗酵素液を東ソー株式会社製『ＤＥＡＥ−トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ） ６５０Ｓ』ゲルを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー（ゲル容量１００ｍｌ）に供した。環状マルトシルマルトース生成酵素活性は、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した『ＤＥＡＥ−トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ） ６５０Ｓ』ゲルに吸着し、食塩濃度０Ｍから０．４Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、食塩濃度約０．２２Ｍ付近に溶出した。この活性画分を回収し、終濃度１Ｍとなるように硫安を添加して４℃、２４時間放置した後、遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『フェニル−トヨパール（Ｐｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ） ６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル容量１０ｍｌ）に供した。本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素活性は、１Ｍ硫安を含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した『フェニル−トヨパール（Ｐｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ） ６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安濃度１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．１Ｍ付近に溶出した。この精製の各ステップにおける環状マルトシルマルトース生成酵素活性量、環状マルトシルマルトース生成酵素比活性及び収率を表２に示す。
【００７４】
【表２】
【００７５】
疎水クロマトグラフィー後の精製した環状マルトシルマルトース生成酵素標品を５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一であり、純度の高い標品であった。
【００７６】
＜実験５：環状マルトシルマルトース生成酵素の性質＞
【００７７】
＜実験５−１：分子量＞
実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して分子量を測定したところ、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素の分子量は７２，０００±２０，０００ダルトンであることが判明した。
【００７８】
＜実験５−２：等電点＞
実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素標品を２．２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・バイオサイエンス社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、同時に泳動した等電点マーカー（アマシャム・バイオサイエンス社製）と比較して等電点を求めたところ、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素の等電点はｐＩ３．６±０．５であることが判明した。
【００７９】
＜実験５−３：酵素反応の至適温度及び至適ｐＨ＞
実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素標品を用いて、酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を本酵素の活性測定法における温度、ｐＨをそれぞれ変化させて測定した。これらの結果を図５（至適温度）、図６（至適ｐＨ）に示した。本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、５０乃至５５℃であり、至適ｐＨは、４０℃、３０分間反応の条件下で５．５乃至６．５であることが判明した。
【００８０】
＜実験５−４：酵素の温度安定性及びｐＨ安定性＞
実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素標品を用いて、本酵素の温度安定性及びｐＨ安定性を調べた。温度安定性は、酵素溶液（１０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を塩化カルシウム非存在下または１ｍＭ存在下で各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨ１００ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。これらの結果を図７（温度安定性）、図８（ｐＨ安定性）に示した。図７から明らかなように、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素の温度安定性は、塩化カルシウム非存在下で３０℃まで、塩化カルシウム１ｍＭ存在下で５０℃までであることが判明し、カルシウムイオンによって本酵素の温度安定性が向上することがわかった。また、図８から明らかなように、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素のｐＨ安定性はｐＨ５．０乃至９．０の範囲であることが判明した。
【００８１】
＜実験５−５：酵素活性に及ぼす金属塩の影響＞
実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素標品を用いて、酵素活性に及ぼす金属塩の影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表３に示す。
【００８２】
【表３】
【００８３】
表３の結果から明らかなように、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素活性は、Ｃｕ２＋及びＨｇ２＋イオンで著しく阻害され、Ａｌ３＋、Ｆｅ３＋及びＰｂ２＋イオンで阻害されることも判明した。また、金属イオンのキレート剤であるＥＤＴＡによっても阻害されることも判明した。
【００８４】
＜実験５−６：Ｎ末端アミノ酸配列＞
実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素標品を用いて、本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサー モデル４９２ＨＴ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列、すなわち、アスパラギン酸−プロリン−スレオニン−スレオニン−セリンのＮ末端アミノ酸配列を有していることが判明した。
【００８５】
＜実験５−７：部分アミノ酸配列＞
実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素標品を適量とり、１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して４℃で１８時間透析した後、同緩衝液を加えて蛋白濃度約１ｍｇ／ｍｌとした。この溶液を約１ｍｌとり、リジルエンドペプチダーゼ（和光純薬株式会社販売）２０μｇを加えて、３０℃、１６時間保持して酵素蛋白を加水分解した。加水分解物を予め８％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸で平衡化させておいたＨＰＬＣ用カラム（商品名『マイクロボンダパックＣ１８』、直径３．９ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウォーターズ社製）に注入し、流速０．９ｍｌ／分、室温の条件下、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸−８％（ｖ／ｖ）アセトニトリル溶液から０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸−４０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル溶液の１２０分間のリニアグラジエントで通液し、ペプチド断片を分画した。カラムから溶出したペプチド断片は波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。通液開始から約１２分、約１８分、約２０分、約３６分、約３９分及び約６６分に溶出した６種のペプチド断片のアミノ酸配列を、それぞれ実験５−６と同じ方法で分析したところ、それぞれ配列表における配列番号４乃至９に示されるアミノ酸配列を有していた。
【００８６】
＜実験６：環状マルトシルマルトース生成酵素をコードするＤＮＡのクローニング及びこれを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製＞
環状マルトシルマルトース生成酵素をコードするＤＮＡをアルスロバクター・グロビホルミス Ｍ６（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４８）からクローニングし、自律複製可能な組換えＤＮＡの作製、酵素をコードするＤＮＡの塩基配列の決定、及び形質転換体の調製を行った。
【００８７】
＜実験６−１：染色体ＤＮＡの調製＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学工業株式会社製造）２．０ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『アサヒミースト』、アサヒフードアンドヘルスケア株式会社販売）１．０ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、アルスロバクター・グロビホルミス Ｍ６（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４８）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで２４時間回転振盪培養した。
【００８８】
遠心分離により培養物から採取した菌体をＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に浮遊させ、リゾチームを０．０５％（ｗ／ｖ）加え、３７℃で３０分間インキュベートした。処理物を−８０℃で１時間凍結後、ＴＳＳ緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて６０℃に加温し、ＴＥＳ緩衝液／フェノール混液を加え、氷水中で冷却しながら５分間激しく振盪した後、遠心分離により上清を採取した。この上清に２倍容の冷エタノールを加え、沈殿した粗染色体ＤＮＡを採取し、ＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解後、リボヌクレアーゼとプロテイナーゼをそれぞれ７．５μｇと１２５μｇ加え、３７℃で１時間保持して反応させた。反応物にクロロホルム／イソアミルアルコール混液を加えて染色体ＤＮＡを抽出し、冷エタノールを加え、生成した染色体ＤＮＡを含む沈殿を採取した。このようにして得た精製染色体ＤＮＡを濃度約１ｍｇ／ｍｌになるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、−８０℃で凍結した。
【００８９】
＜実験６−２：組換えＤＮＡ ｐＢＭＢ１と形質転換体ＢＭＢ１の調製＞
実験６−１で調製した精製染色体ＤＮＡ溶液を０．１ｍｌとり、これに制限酵素Ｂａｍ ＨＩを約１００単位加え、３７℃で１時間反応させて染色体ＤＮＡを加水分解した後、アガロース電気泳動法により約３，０００乃至６，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。別途、プラスミドベクター（ストラタジーン・クローニング・システム製、登録商標『Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）』）を常法により制限酵素Ｂａｍ ＨＩを作用させ完全に切断した後、その切断されたプラスミドベクター０．５μｇと先に得たＤＮＡ断片約５μｇとを市販のキット（宝酒造製、商品名『ＤＮＡライゲーション・キット』）を用いて、添付の説明書に従って操作し、連結した。得られた組換えＤＮＡを用いて、通常のコンピテントセル法によりコンピテントセル（商品名『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ』、ストラタジーン・クローニング・システム製）１００μｌを形質転換して遺伝子ライブラリーを作製した。
【００９０】
このようにして得た遺伝子ライブラリーとしての形質転換体を、常法により調製した、１０ｇ／ｌトリプトン、５ｇ／ｌ酵母エキス、５ｇ／ｌ塩化ナトリウム、１００ｍｇ／ｌアンピシリンナトリウム塩、５０ｍｇ／ｌ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシドを含む寒天平板培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間培養後、培地上で形成された白色コロニー約４，０００個をナイロン膜（商品名『Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋』、アマシャム製）上に固定した。別途、実験５−７の方法で明らかにした、配列表における配列番号７で示されるアミノ酸配列における第４より１３番目までのアミノ酸配列に基づき５′−ＧＡＣＧＴＳＧＴＳＣＣＳＡＡＣＣＡＣＡＣＳＧＣＳＧＡＣＴＡＣ−３′で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを化学合成し、常法に従い［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて同位体標識して、プローブ１としての合成ＤＮＡを得た。先に得たナイロン膜上に固定したコロニーのうち、プローブ１と顕著な会合を示すコロニーを通常のコロニーハイブリダイゼーション法を適用して選択し、５種類の形質転換体を得た。
【００９１】
次いで、配列表における配列番号８で示されるアミノ酸配列における第１より１０番目までのアミノ酸配列に基づき、５′−ＧＡＣＴＧＧＧＴＳＧＡＣＡＴＧＧＧＳＴＴＣＧＡＣＧＧＳＡＴＣ−３′で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを化学合成し、上記と同様に同位体標識してプローブ２としての合成ＤＮＡを得た。常法により、上記５種類の形質転換体から組換えＤＮＡを採取し、通常のサザーン・ハイブリダイゼーションを適用して、プローブ２と顕著な会合を示した組換えＤＮＡを選択し、当該組換えＤＮＡを有する形質転換体を『ＢＭＢ１』と命名した。
【００９２】
この形質転換体ＢＭＢ１を、常法に従い１００μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウム塩を含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを抽出した。この組換えＤＮＡの塩基配列を、通常のジデオキシ法により分析したところ、当該組換えＤＮＡは、アルスロバクター・グロビホルミス Ｍ６（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４８）に由来する、配列表における配列番号１０で示される鎖長４４６７塩基対の塩基配列を有するＤＮＡを含んでいた。図９に示すように、この組換えＤＮＡにおいて、当該ＤＮＡは、制限酵素Ｂａｍ ＨＩによる認識部位の下流に連結されていた。一方、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、その配列番号１０に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と、実験５−６の方法で確認された本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素のＮ末端アミノ酸配列及び実験５−７の方法で明らかにされた部分アミノ酸配列である、配列表における配列番号１及び配列番号４乃至９で示されるアミノ酸配列と比較したところ、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列は、配列表における配列番号１０に併記したアミノ酸配列における第４１乃至４５番目のアミノ酸配列と完全に一致した。また、配列表における配列番号４、５、６、７、８及び９に示されるアミノ酸配列は、それぞれ、配列表における配列番号１０で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列における第４１８乃至４２６番目、第４０５乃至４１７番目、第３２３乃至３３２番目、第１６４乃至１９０番目、第２４１乃至２６５番目及び第３３３乃至３６２番目のアミノ酸配列と完全に一致した。以上のことは、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素が、配列表における配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むものであり、当該酵素はアルスロバクター・グロビホルミス Ｍ６（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４８）においては、配列表における配列番号３に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示している。また、配列表における配列番号１０に併記したアミノ酸配列における第１乃至４０番目のアミノ酸配列は、当該酵素の分泌シグナル配列と推定された。これらのことから、当該酵素の分泌前の前駆体は、配列表における配列番号１０に併記されたアミノ酸配列からなり、そのアミノ酸配列は、配列表における配列番号１０に示す塩基配列にコードされていることが判明した。以上のようにして調製し、塩基配列を確認した組換えＤＮＡを『ｐＢＭＢ１』と命名した。
【００９３】
＜実験７：形質転換体による環状マルトシルマルトース生成酵素の産生＞
１０ｇ／ｌ澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学工業株式会社販売）、２０ｇ／ｌポリペプトン、２０ｇ／ｌ酵母エキス及び１ｇ／ｌリン酸一水素ナトリウム・１２水塩及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、無菌的にｐＨ７．０に調整した後、アンピシリンナトリウム塩１０ｍｇを無菌的に添加して液体培地を調製した。この液体培地に実験６−２の方法で得た形質転換体ＢＭＢ１を接種し、２７℃で約４８時間回転振盪培養した。得られた培養物を、常法に従い、遠心分離して培養上清と菌体とに分離して回収した。菌体については、超音波破砕法により細胞からの全抽出物を調製した。超音波破砕法は、菌体を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、その菌体懸濁液を氷水中で冷却しながら超音波ホモジナイザー（モデルＵＨ−６００、株式会社エスエムテー製）で細胞破砕することによって行い、その破砕物を全細胞抽出物とした。
【００９４】
このようにして調製した培養上清と全細胞抽出物とについて、それぞれの環状マルトシルマルトース生成酵素活性を測定し、それぞれの活性値を培養物１ｍｌ当りに換算した。なお、対照として大腸菌ＸＬ２−Ｂｌｕｅ株を上述の形質転換体の場合と同一条件で培養し、培養物から培養上清と全細胞抽出物を調製し、同様に環状マルトシルマルトース生成酵素活性を測定した。これらの結果を表４に示す。
【００９５】
【表４】
【００９６】
表４の結果から明らかなように、形質転換体ＢＭＢ１は、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素を細胞内に産生することが判明した。宿主である対照の大腸菌では培養上清、全細胞抽出物のいずれにも当該酵素活性は全く認められなかった。
【００９７】
この実験７の方法で得た全細胞抽出物を、さらに実験４に示した方法に準じて、塩析、透析し、ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｓゲル、フェニル−トヨパール ６５０Ｍゲルを用いたカラムクロマトグラフィーに供して精製し、さらにこの精製酵素標品を実験５に示した方法に準じて分析した。その結果、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量は約７２，０００±２０，０００ダルトン、等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による等電点は約３．６±０．５、環状マルトシルマルトース生成酵素活性の至適温度は約５０乃至５５℃、至適ｐＨは約５．５乃至６．５、温度安定性は、塩化カルシウム非存在下で３０℃まで、１ｍＭ塩化カルシウム存在下で約５０℃まで安定であり、ｐＨ安定性は約５．０乃至９．０の範囲で安定であった。これらの理化学的性質は、実験４に示された方法で調製された当該酵素のそれと実質的に同一であった。以上の結果は、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素は、組換えＤＮＡ技術によって良好に製造でき、なお且つ酵素の生産性も有意に向上することを示している。
【００９８】
＜実験８：各種糖質への作用＞
各種糖質を用いて、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素の基質特異性を調べた。マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、ネオトレハロース、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、イソマルトース、イソマルトトリオース、パノース、イソパノース、マルチトール、マルトトリイトール、α−、β−又はγ−サイクロデキストリン、アミロース、可溶性澱粉、グリコーゲン、プルラン又はデキストランを含む水溶液を調製した。これらの基質溶液に、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）と最終濃度１ｍＭ塩化カルシウムを加えた後、実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素標品を基質固形物１グラム当たりそれぞれ１単位ずつ加え、基質濃度を２ｗ／ｖ％になるように調整し、これを４０℃、ｐＨ６．０で２４時間作用させた。酵素反応前後の反応液を、実験１記載のＴＬＣ法で分析し、それぞれの糖質に対する酵素作用の有無又は強さの程度を確認した。結果を表５に示す。
【００９９】
【表５】
【０１００】
表５の結果から明らかなように、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素は、試験した糖質のうち、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースによく作用し、また、マルトトリオースに僅かに作用した。さらに、アミロース、澱粉、グリコーゲンにも、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素はよく作用した。これらの結果より、本酵素はグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用することが判明した。
【０１０１】
＜実験９：作用メカニズム＞
【０１０２】
＜実験９−１：マルトテトラオースからの生成物＞
最終濃度１ｗ／ｖ％のマルトテトラオース水溶液に、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）と最終濃度１ｍＭ塩化カルシウムを加えた後、実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素を、基質固形物１グラム当たり１単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で作用させ、経時的にサンプリングを行い、１００℃で１０分間保持して反応を停止した。その酵素反応液の糖組成を、ＨＰＬＣ法を用いて測定した。ＨＰＬＣは、カラムに『ＹＭＣ Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＱ３０３
』（株式会社ワイ・エム・シー製造）を用い、溶離液に水を用いて、カラム温度４０℃、流速０．５ｍｌ／分の条件で行い、検出は示差屈折計ＲＩＤ−１０Ａ（株式会社島津製作所製造）を用いて行った。その結果を表６に示す。
【０１０３】
【表６】
【０１０４】
表６の結果から明らかなように、本酵素の作用の結果、基質マルトテトラオースから、反応初期（反応1時間）において、マルトースと糖質Ｘが顕著に生成することが判明した。また、少量ながら、マルトヘキサオース、環状マルトシルマルトース及びマルトシルマルトース（６２−α−マルトシルマルトース、非環状）が生成することもわかった。さらに、反応の進行とともに、これら生成糖質のうち、マルトースと環状マルトシルマルトースとが著量蓄積し、少量ながらマルトシルマルトース量も増加した。一方、糖質Ｘ及びマルトヘキサオースの生成量は、反応４時間まで増加したものの、それ以降は減少することが判明した。これらの結果から推察すると、反応初期において、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素はマルトテトラオースに作用し、主にマルトースと糖質Ｘを生成し、さらに反応が進むとともに、本酵素は糖質Ｘに作用し、環状マルトシルマルトースを生成すると推定され、糖質Ｘが、マルトテトラオースからの環状マルトシルマルトース生成反応の中間体であると考えられた。また、マルトシルマルトースやマルトヘキサオースが同時に生成することから本酵素はマルトース単位での糖転移を触媒する酵素であり、糖質Ｘもマルトシル転移による生成物と推定された。
【０１０５】
＜実験９−２：糖質Ｘの単離＞
マルトテトラオースから環状マルトシルマルトースを生成する反応における反応中間体と考えられる糖質Ｘの単離を行った。最終濃度１ｗ／ｖ％のマルトテトラオース水溶液２Ｌに、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）と最終濃度１ｍＭ塩化カルシウムを加えた後、実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素を、基質固形物１グラム当たり１単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で４時間作用させた後、１００℃で１０分間保持して反応を停止させた。次いで、予備試験により糖質Ｘがβ−アミラーゼによって分解されないことを確認した後、上記で得られた反応液をｐＨ５．５に調整し、β−アミラーゼ（シグマ社製）を基質固形物１グラム当り５単位添加して５０℃、１６時間処理することにより、反応液中の残存するマルトテトラオースをマルトースに分解した。反応液を１００℃で１０分間保持して反応を停止させ、不溶物を濾過して除去した後、三菱化学製イオン交換樹脂『ダイヤイオンＷＡ３０』を用いて脱色、脱塩し、さらに、三菱化学製カチオン交換樹脂『ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ』とオルガノ製アニオン交換樹脂『ＩＲＡ４１１Ｓ』を用いて脱色、脱塩し、精密濾過した後、エバポレーターで濃縮し、分画原料とした。これを、分取用ＨＰＬＣカラム『ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ Ｒ３５５−１５Ｓ−１５ １２Ａ』（株式会社ワイ・エム・シイ製）に供して精製し、上記のマルトテトラオースからの反応物から、純度９９．３％以上の糖質Ｘ標品を固形物収率約６．７％で得た。
【０１０６】
＜実験９−３：糖質Ｘの構造解析＞
【０１０７】
＜実験９−３−１：環状マルトシルマルトースの生成試験＞
実験９−２の方法で得た糖質Ｘ精製標品の水溶液（最終濃度１ｗ／ｖ％）に、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）と最終濃度１ｍＭ塩化カルシウムを加えた後、実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素を基質固形物１グラム当たり１単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で２４時間作用させ、１００℃で１０分間保持して反応を停止した後、実験１記載のＴＬＣ法及びＨＰＬＣ法で分析し、生成物を調べたところ、主にマルトースと環状マルトシルマルトースが生成することが判明し、糖質Ｘが環状マルトシルマルトース生成反応の中間体であることが確認された。
【０１０８】
＜実験９−３−２：質量分析＞
実験９−２の方法で得た糖質Ｘ精製標品について、実験２−１に記載した方法で質量分析を行ったところ、質量数１０１３のナトリウム付加分子イオンが顕著に検出され、糖質Ｘの質量数が９９０であることが判明し、この質量数から、糖質ＸはＤ−グルコース６分子で構成されていることがわかった。
【０１０９】
＜実験９−３−３：プルラナーゼによる分解試験＞
実験９−２の方法で得た糖質Ｘ精製標品の水溶液（最終濃度１ｗ／ｖ％）にプルラナーゼ（株式会社林原生物化学研究所製造）を作用させ分解試験を行った。基質固形物１グラム当たりプルラナーゼを１単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で２４時間作用させ、１００℃で１０分間保持して反応を停止した後、実験１記載のＴＬＣ法及びＨＰＬＣ法で分析し、生成物を調べたところ、マルトースとマルトテトラオースが生成することが判明した。即ち、糖質Ｘは、マルトース分子とマルトテトラオース分子がα−１，６グルコシド結合した構造を有することが判明した。
【０１１０】
＜実験９−３−４：メチル化分析＞
実験９−２の方法で得た糖質Ｘ標品を用いて、常法に従ってメチル化分析を行い、ガスクロマトグラフィー法でメチル化物を調べた。結果を表７にまとめた。
【０１１１】
【表７】
【０１１２】
表７の結果から明らかなように、２，３，４−トリメチル化物と２，３，６−トリメチル化物と２，３，４，６−テトラメチル化物が約１：４：１の比率であることから、糖質Ｘを構成するグルコース６分子のうち、１分子は１位と６位でグルコシド結合しているグルコースであり、４分子は１位と４位でグルコシド結合しているグルコースであり、他の１分子は１位のみがグルコシル結合したグルコースであることが判明した。また、この結果から、マルトースとマルトテトラオースがα−１，６結合した糖質Ｘにおける１，６グルコシド結合は非還元末端グルコース残基に存在することが判明した。
【０１１３】
以上の結果から、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素によってマルトテトラオースから生成する糖質Ｘは、環状マルトシルマルトース生成反応の中間体であり、その構造はマルトテトラオースの非還元末端グルコース残基の６位水酸基にマルトース基がα結合した６糖で、構造式１で表されるα−マルトシルマルトテトラオース（６４−α−マルトシルマルトテトラオース）であることが判明した。
【０１１４】
構造式１：
【化１】
【０１１５】
以上のことから、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素による環状マルトシルマルトース生成の反応メカニズムは以下のように考えられた。
１）本酵素は、基質としてグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用し、その非還元性末端のマルトシル残基を他のα−１，４グルカン分子の非還元性末端グルコース残基の６位水酸基に転移する分子間の６−α−マルトシル転移を触媒することにより、非還元末端に６−α−マルトシル基を有するグルコース重合度が２増加した６−α−マルトシル−マルトオリゴ糖と、グルコース重合度が２減じたマルトオリゴ糖とを生成する。
２）本酵素はさらに、６−α−マルトシル−マルトオリゴ糖に作用し、分子内α−マルトシル転移することにより環状化し、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状マルトシルマルトースと、グルコース重合度が４減じたマルトオリゴ糖を生成する。
３）本酵素は、僅かながら分子間の４−α−マルトシル転移も触媒し、マルトオリゴ糖から、グルコース重合度が２増加したマルトオリゴ糖と、グルコース重合度が２減じたマルトオリゴ糖とを僅かに生成する。
【０１１６】
＜実験１０：各種基質からの環状マルトシルマルトースの生成＞
各種糖質を用いて、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素の作用による環状マルトシルマルトースの生成を試験した。マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、アミロース、可溶性澱粉、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学工業株式会社製）、グリコーゲン（トウモロコシ由来、キューピー株式会社製）の溶液を調製した。
【０１１７】
これらの水溶液（最終濃度１．０ｗ／ｖ％）に、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）と最終濃度１ｍＭ塩化カルシウムを加えた後、実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位加え、これらを４０℃、ｐＨ６．０で４８時間作用させた後、その反応液を１００℃で１０分間加熱して反応を停止させた。実験１と同様にα−グルコシダーゼ・グルコアミラーゼ処理した後、ＨＰＬＣ法で環状マルトシルマルトースを定量し、環状マルトシルマルトースの生成率を求めた。それらの結果を表８に示す。
【０１１８】
【表８】
【０１１９】
表８の結果から明らかなように、試験したいずれの糖質からも、環状マルトシルマルトース生成酵素の作用によって環状マルトシルマルトースが生成した。その生成率は、基質がマルトトリオースの場合約０．６％と低いのに対して、基質がアミロースの場合約４２％と最も高く、次いでマルトヘキサオース、マルトへプタオースの順であった。可溶性澱粉、澱粉部分分解物及びグリコーゲンからも３０％程度の生成率で環状マルトシルマルトースが生成した。
【０１２０】
＜実験１１：環状マルトシルマルトース生成反応と反応産物の還元力＞
可溶性澱粉の水溶液（最終濃度１．０ｗ／ｖ％）に、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）と最終濃度１ｍＭ塩化カルシウムを加えた後、実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位加え、これらを４０℃、ｐＨ６．０で反応させ、酵素添加直後にサンプリングし、直ちに約１００℃で１０分間加熱して反応を停止し、水冷し、反応０時間の反応液を得た。続いて、反応１、２、３、４時間、それぞれの時点でサンプリングし、直ちに約１００℃で１０分間加熱して反応を停止し、水冷し、反応１時間、反応２時間、反応３時間、反応４時間のそれぞれの反応液を得た。得られた反応液の還元糖量をソモギー・ネルソン法で、全糖量をアンスロン法で測定し、全糖量に占める還元糖量の割合を百分率（％）で表し、還元力とした。また、反応液を実験１と同様にα−グルコシダーゼ・グルコアミラーゼ処理した後、ＨＰＬＣ法で環状マルトシルマルトースを定量し、環状マルトシルマルトースの生成率を求めた。これらの結果を表９にまとめた。
【０１２１】
【表９】
【０１２２】
表９の結果から明らかなように、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素を可溶性澱粉に作用させ、環状マルトシルマルトースを生成させたところ、環状マルトシルマルトースの生成率が１０％以上の場合でも、還元力の増加は０．２％程度とごく僅かであることが判明した。このことは、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素が本質的に転移・環状化反応を触媒する酵素であり、それら反応に際してはほとんど加水分解を伴わないことを意味している。澱粉やその分解物などに本酵素を作用させ、環状マルトシルマルトースを生成させる際、反応前の澱粉やその分解物の還元力、即ち、ＤＥを低くしておけば、増加する還元力が僅かなため、還元力が低い生成物が得られることがわかった。
【０１２３】
＜実験１２：環状マルトシルマルトースの生成に及ぼすイソアミラーゼの添加効果＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学工業株式会社製）水溶液（最終濃度１ｗ／ｖ％）を調製し、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）と最終濃度１ｍＭ塩化カルシウムを加えた後、実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位と、イソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を固形物１グラム当りそれぞれ０、１２５、２５０、５００、１２５０又は２５００単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で４８時間作用させた後、１００℃で１０分間熱処理して酵素を失活させた。続いて、反応液を実験１と同様にα−グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼで処理した後、ＨＰＬＣ法で環状マルトシルマルトースを定量し、環状マルトシルマルトース生成率を求めた。それらの結果を表１０に示す。
【０１２４】
【表１０】
【０１２５】
表１０の結果から明らかなように、イソアミラーゼを添加することによって、環状マルトシルマルトースの生成率が増加することが判明した。
【０１２６】
＜実験１２：環状マルトシルマルトースの生成に及ぼす液化澱粉ＤＥの影響＞
とうもろこし澱粉を濃度２質量％澱粉乳とし、これに炭酸カルシウムを０．１質量％加えてｐＨ６．０に調整し、α−アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』、ノボ社製造）を澱粉グラム当り０．２、０．４、０．６、１．０、１．５又は２．０質量％加え、それぞれ９５℃で１０分間反応させ、次いで、１２０℃にオートクレーブし、約４０℃に急冷して、ＤＥ３．１乃至２０．４の表１１に示す６種類の澱粉液化液を得た。これらの澱粉液化液（最終濃度１質量％）に、実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で４８時間作用させた後、その反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた。これら熱失活させた反応液中の環状マルトシルマルトースの生成量を調べるために、実験１と同様にα−グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼを添加し反応させた後、ＨＰＬＣ法で環状マルトシルマルトースを定量し、環状マルトシルマルトース生成率を求めた。それらの結果を表１１に示す。
【０１２７】
【表１１】
【０１２８】
表１１の結果から明らかなように、本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素による環状マルトシルマルトースの生成率は、液化澱粉のＤＥによって影響をうけ、ＤＥが低値であるほど、環状マルトシルマルトースの生成率は高く、逆に、ＤＥが高値であるほど、環状マルトシルマルトースの生成率が低いことが判明した。具体的には、液化澱粉のＤＥは約２０以下、望ましくは、ＤＥ約８以下、更に望ましくは、ＤＥ約５以下が適していることが判明した。
【０１２９】
＜実験１４：結晶環状マルトシルマルトースの調製＞
アミロース（株式会社林原生物化学研究所製）、酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）、及び塩化カルシウムを、最終濃度として、それぞれ、１．２５ｗ／ｖ％、２０ｍＭ、１ｍＭ含む水溶液１６Ｌに、実験４の方法で得た精製環状マルトシルマルトース生成酵素標品を固形物１グラム当たり１単位加え、これを４０℃、ｐＨ６．０で９０時間作用させた後、反応液を約９８℃で１０分間加熱し反応を停止させた。得られた反応液を、実験１に記載の方法でグルコアミラーゼ処理し、水酸化ナトリウムにてアルカリ処理することにより還元糖を分解した後、濾過脱色、脱塩、精密濾過、濃縮、真空乾燥して、固形物として約８０．５ｇの環状マルトシルマルトース粉末を得た。ＨＰＬＣ法で分析したところ、環状マルトシルマルトースの純度は９８．９％であった。
【０１３０】
得られた環状マルトシルマルトース粉末（固形物として３６ｇ）を１４４ｇの水に加え、約９０℃に加温して環状マルトシルマルトースを完全に溶解させた後、約２５℃で２日間静置したところ、結晶状の物質が生成した。得られた結晶状物質を含む液を濾過し、濾紙上に結晶状物質を回収し、続いて、少量の水で洗浄した後、結晶状物質を集め、常温常圧で風乾し、２１．８ｇの結晶状粉末を得た。ＨＰＬＣ法で分析したところ、環状マルトシルマルトースの純度は９９．９％以上で、極めて高純度であった。
【０１３１】
得られた環状マルトシルマルトースの結晶状粉末について、Ｘ線回折装置ＲＡＤ−ＩＩＸ（株式会社リガク製）を用いて粉末Ｘ線回折測定を行ったところ、図１０に示すように、主な回折角（２θ）として、５．６°、９．３°、１６．５°及び２７．１°を特徴とする粉末Ｘ線回折図が得られた。また、この結晶状粉末の水分をカールフィッシャー法で測定したところ、水分は１２．８質量％であることがわかり、環状マルトシルマルトース１分子当り５分子の水を含む含水結晶であることが判明した。
【０１３２】
さらに、この環状マルトシルマルトースの結晶粉末を熱重量測定したところ、図１１に示す熱重量曲線が得られ、その重量変化と温度との関係から、温度約１００℃までの上昇で５分子の水に相当する重量減少が認められ、さらに、温度約２８０℃付近から環状マルトシルマルトース自体の熱分解と考えられる重量減少が認められた。これらのことから、本発明の環状マルトシルマルトース含水結晶は、常圧において、温度を１００℃まで上昇させることにより結晶分子当り５分子の水が離脱して無水物になることが判明した。
【０１３３】
＜実験１５：環状マルトシルマルトースの水に対する飽和濃度＞
温度２５℃での水に対する環状マルトシルマルトースの飽和濃度を調べるため、密栓付きガラス製容器に水１０ｍｌを入れ、それに実験１４の方法で得られる環状マルトシルマルトース含水結晶粉末を、完全に溶解する量以上の量を加えた後、ガラス容器を密封し、飽和に達するまで温度２５℃で保温しながら２日間攪拌した。この環状マルトシルマルトース飽和溶液を精密濾過して溶けていない環状マルトシルマルトースを除いた後、その濾液の水分を乾燥減量法で調べ飽和濃度を求めたところ、温度２５℃での水に対する環状マルトシルマルトースの飽和濃度は約８．０質量％であることが判明した。
【０１３４】
＜実験１６：環状マルトシルマルトースの甘味度＞
実験１４の方法で得られる環状マルトシルマルトース含水結晶粉末を脱イオン水に溶かして、固形物濃度５質量％の水溶液とし、この水溶液を甘味度試験溶液とした。一方、蔗糖（市販グラニュー糖）０．５乃至５質量％水溶液を調製し、対照とした。パネラー５名で官能試験を行ったところ、環状マルトシルマルトースの甘味度は蔗糖の約２０％であると推定され、環状マルトシルマルトースが低甘味の糖質であることが判明した。
【０１３５】
＜実験１７：環状マルトシルマルトースの熱安定性＞
実験１４の方法で得られる環状マルトシルマルトース含水結晶粉末を水に溶解し濃度７ｗ／ｖ％の環状マルトシルマルトース水溶液を調製し、その溶液８ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１２０℃で３０乃至９０分間加熱した。放冷後、それら溶液の着色度の測定と、ＨＰＬＣ法による環状マルトシルマルトースの純度測定を行った。着色度は、４８０ｎｍにおける１ｃｍセルでの吸光度とした。結果を表１２に示した。
【０１３６】
【表１２】
【０１３７】
表１２の結果から明らかなように、環状マルトシルマルトース水溶液は１２０℃の高温加熱でも着色はなく、分解による純度低下も認められず、環状マルトシルマルトースは熱に対して安定な糖質であることが判明した。
【０１３８】
＜実験１８：環状マルトシルマルトースのｐＨ安定性＞
実験１４の方法で得られる環状マルトシルマルトース含水結晶粉末を各種の緩衝液（２０ｍＭ）に溶解し、環状マルトシルマルトースを濃度４ｗ／ｖ％、ｐＨを２乃至９に調整した表１３に記載の８種類の環状マルトシルマルトース水溶液を調製した。それぞれの溶液８ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１００℃で２４時間加熱した。放冷後、実験１７と同様にそれら溶液の着色度の測定と、ＨＰＬＣ法による環状マルトシルマルトースの純度測定を行った。結果を表１３に示した。
【０１３９】
【表１３】
【０１４０】
表１３の結果から明らかなように、環状マルトシルマルトース水溶液は１００℃の高温で２４時間加熱しても、ｐＨ２乃至９の広範囲で着色はなく、ｐＨ２において環状マルトシルマルトースは僅かに分解され、純度低下が認められたものの、ｐＨ３乃至９の範囲では全く分解されず、環状マルトシルマルトースは広いｐＨ範囲で煮沸してもきわめて安定な糖質であることが判明した。
【０１４１】
＜実験１９：アミノカルボニル反応＞
実験１４の方法で得られる環状マルトシルマルトース含水結晶粉末を水に溶解し、さらに、市販試薬特級のグリシン及びリン酸緩衝液を加え、５０ｍＭリン酸緩衝液でｐＨ８．０に調整した０．５ｗ／ｖ％グリシンを含む２．５ｗ／ｖ％環状マルトシルマルトース水溶液を調製した。対照として、環状マルトシルマルトース含水結晶粉末の代わりにマルトースを用いた以外は上記と同様にしてマルトース水溶液を調製した。それぞれの溶液４ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１００℃で３０乃至９０分間加熱した。室内で放冷後、それらの着色度を測定しアミノカルボニル反応性を調べた。着色度は、１ｃｍセルでの４８０ｎｍにおける吸光度とした。結果を表１４に示す。
【０１４２】
【表１４】
【０１４３】
表１４の結果から明らかなように、対照のマルトースはグリシン共存下で加熱すると着色し、褐変を引き起こした。一方、本発明の環状マルトシルマルトースは、グリシン共存下で加熱しても着色せず、褐変を引き起こさない、アミノカルボニル反応（メイラード反応）を起こしにくい安定な糖質であることが判明した。
【０１４４】
＜実験２０：アミノカルボニル反応＞
実験１４の方法で得られる環状マルトシルマルトース含水結晶粉末と市販ポリペプトン（日本製薬製）とを脱イオン水に溶かし、５ｗ／ｖ％ポリペプトンを含む５ｗ／ｖ％環状マルトシルマルトース溶液を調製した。対照として、環状マルトシルマルトース含水結晶粉末の代わりにマルトースを用いた以外は上記と同様にしてマルトース水溶液を調製した。それぞれの溶液４ｍｌをガラス製試験管に採り、密封した後、１２０℃で３０乃至９０分間加熱した。室内で放冷後、それらの着色度を測定しアミノカルボニル反応性を調べた。同時に、ポリペプトンのみを含む溶液をブランクとして同様に加熱した。着色度は、４８０ｎｍにおける１ｃｍセルでの吸光度とし、ブランクの吸光度を差し引いた値とした。結果を表１５に示す。
【０１４５】
【表１５】
【０１４６】
表１５の結果から明らかなように、対照のマルトースはポリペプトン共存下で加熱すると着色し、褐変を引き起こした。一方、環状マルトシルマルトースは、ポリペプトン共存下で加熱しても着色せず、褐変を引き起こさない、アミノカルボニル反応を起こしにくい安定な糖質であることが判明した。
【０１４７】
＜実験２１：環状マルトシルマルトースの包接作用＞
実験１４の方法で得られる環状マルトシルマルトース含水結晶粉末を脱イオン水に溶かし、８質量％水溶液を調製した。その水溶液１００ｇ当たりに、香気成分の具体例として、メタノール１．２ｇ、エタノール１．７ｇ又は酢酸２．２ｇをそれぞれ加えて包接を行なった。その後、それぞれを濾過し濾液を凍結乾燥し、未包接物を除去した。対照として、包接能を有することが知られている分岐サイクロデキストリン（商品名イソエリートＰ、マルハ株式会社販売）を用いて同様の操作を行なった。凍結乾燥粉末中の包接物量を測定するために、それぞれの凍結乾燥粉末１ｇを５ｍｌの水に溶かし、それに５ｍｌのジエチルエーテルを加えて抽出を行い、再度、抽出を繰返した後、ジエチルエーテル中の抽出物をガスクロマトグラフィー法で定量した。結果を表１６に示す。
【０１４８】
【表１６】
【０１４９】
表１６の結果から明らかなように、環状マルトシルマルトースは包接能を有していることが判明し、その包接能は、分岐サイクロデキストリンのものと比べ、メタノールでは重量当たり約１．３倍、エタノールでは約０．５倍、酢酸では約０．８倍の強さであった。
【０１５０】
＜実験２２：環状マルトシルマルトースの消化性試験＞
実験１４の方法で得た環状マルトシルマルトース含水結晶粉末を用いて、日本栄養食糧学会誌、第４３巻、第２３乃至２９頁（１９９０）に記載の岡田らの方法に準じて、試験管内での唾液アミラーゼ、人工胃液、膵液アミラーゼ、小腸粘膜酵素による環状マルトシルマルトースの消化性を調べた。対照として、難消化性糖質として知られているマルチトールを用いて行った。結果を表１７に示す。
【０１５１】
【表１７】
【０１５２】
表１７の結果から明らかなように、環状マルトシルマルトースは、唾液アミラーゼ、人工胃液、膵液アミラーゼ及び小腸粘膜酵素のいずれによっても全く消化されないことがわかり、極めて消化されにくい糖質であることが判明した。
【０１５３】
＜実験２３：環状マルトシルマルトースの発酵性試験＞
実験１４の方法で得られる環状マルトシルマルトース含水結晶粉末を用いて、『ジャーナル・オブ・ニュートリション・サイエンス・アンド・ビタミノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖｉｔａｍｉｎｏｌｏｇｙ）』、第３７巻、５２９乃至５４４頁（１９９１年）に記載の奥らの方法に準じて、ラット盲腸内容物による環状マルトシルマルトースの発酵性を調べた。盲腸内容物は、ウィスター系雄ラットをエーテル麻酔下で屠殺し嫌気的に採取し、４倍量の０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液に懸濁したものを用いた。環状マルトシルマルトースは盲腸内容物重量当り約７質量％を添加し、添加直後および１２時間後に残存する環状マルトシルマルトース量をガスクロマトグラフィー法で定量した。その結果、添加直後の環状マルトシルマルトース濃度は盲腸内容物１グラム当り６８．５ｍｇ、１２時後の環状マルトシルマルトース濃度は盲腸内容物１グラム当り６３．０ｍｇであり、約９２％が発酵されずに残存していることがわかり、環状マルトシルマルトースは極めて発酵されにくい糖質であることが判明した。
【０１５４】
＜実験２４：急性毒性試験＞
マウスを使用して、実験１４の方法で得た環状マルトシルマルトースを経口投与して急性毒性試験を行なった。その結果、環状マルトシルマルトースは低毒性の物質で、投与可能な最大投与量においても死亡例は認められず、そのＬＤ５０値は、５ｇ／ｋｇ−マウス体重以上であった。
【０１５５】
以上の実験２２乃至２４の結果から、環状マルトシルマルトースは、経口摂取しても、消化、吸収されにくく、無カロリー乃至低カロリーの可食素材として、ダイエット甘味料、高甘味度甘味料の賦形剤、ダイエット飲食物の増粘剤、増量剤、賦形剤、更には、食物繊維、脂肪代替食品材料などとして有利に利用できる。
【０１５６】
以下、本発明の環状マルトシルマルトース及びそれを含む糖質の製造方法を実施例１乃至６で、環状マルトシルマルトース及びそれを含む糖質を含有せしめた組成物を実施例７乃至２３で示す。
【実施例１】
【０１５７】
アルスロバクター・グロビホルミス Ｍ６（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４８）を実験３の方法に準じて、種培養した。続いて、容量３０Ｌのファーメンターに、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学工業株式会社製造）３．０ｗ／ｖ％、大豆ペプチド（商品名『ハイニュートＳＭＳ』、不二製油株式会社製造）３．６ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％、炭酸カルシウム０．３ｗ／ｖ％、及び水からなる液体培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度２７℃、ｐＨ５．５乃至８．０に保ちつつ、９６時間通気培養した。培養後、ＳＦ膜を用いて除菌濾過し、約１８Ｌの培養濾液を回収し、更に、その濾液をＵＦ膜濃縮し、３．８単位／ｍｌの本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素を含む濃縮酵素液約１Ｌを回収した。
【実施例２】
【０１５８】
馬鈴薯澱粉乳を濃度約１質量％澱粉乳とし、これに最終濃度１ｍＭとなるように塩化カルシウムを加え、ｐＨ６．０に調整し、９５℃に約２０分間加熱して糊化を行い、次いで約４０℃に冷却し、これに実施例１の方法で得た環状マルトシルマルトース生成酵素を含む濃縮酵素液を澱粉固形物１グラム当り０．２６ｍｌ（約１単位）の割合になるように加え、ｐＨ６．０、温度４０℃で４８時間反応させた。その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に、濃縮して濃度６５質量％の環状マルトシルマルトース含有シラップを固形物当たり収率約９０％で得た。本品は、固形物当たり、環状マルトシルマルトース３１．４質量％、マルトース２．２質量％、マルトトリオース１．５質量％、及びその他の糖質を６５．９質量％含有しており、低還元性で、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例３】
【０１５９】
タピオカ澱粉を濃度約１質量％澱粉乳とし、これに濃度０．１質量％となるように炭酸カルシウムを加え、ｐＨ６．０に調整し、これにα−アミラーゼ（ノボ社製造、商品名『ターマミール６０Ｌ』を澱粉固形物グラム当り０．２質量％になるように加え、９５℃で１０分間反応させ、次いで１２０℃に２０分間オートクレーブし、更に約４０℃に急冷してＤＥ約３の液化溶液を得、これに実施例１の方法で得た環状マルトシルマルトース生成酵素を含む濃縮液を澱粉固形物１グラム当り０．２６ｍｌ（約１単位）とイソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製造）を澱粉固形物１グラム当り１０００単位の割合になるように加え、ｐＨ６．０、温度４０℃で４８時間反応させた。その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して、固形物当り環状マルトシルマルトースを４１．１％含む濃度６０質量％のシラップを得た。得られたシラップを糖液として、強酸性カチオン交換樹脂（アンバーライトＣＲ−１３１０、Ｎａ型、オルガノ株式会社製造）を用いたカラム分画を行なった。樹脂を内径５．４ｃｍのジャケット付きステンレス製カラム４本に充填し、直列につなぎ樹脂層全長２０ｍとした。カラム内温度６０℃に維持しつつ、糖液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、これに６０℃の温水をＳＶ０．１３で流して分画し、溶出液の糖組成をＨＰＬＣ法でモニターし、環状マルトシルマルトース含有画分を含む低分子画分を採取し、精製し、濃縮し、噴霧乾燥して、環状マルトシルマルトース含有粉末を固形物当たり収率約５４％で得た。本品は、固形物当たり、環状マルトシルマルトース６３．２質量％、マルトース７．４質量％、マルトトリオース６．２質量％、及びその他の糖質を２３．２質量％含有しており、低還元性で、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例４】
【０１６０】
トウモロコシ澱粉を濃度約１質量％澱粉乳とし、これに濃度０．１質量％となるように炭酸カルシウムを加え、ｐＨ６．０に調整し、これにα−アミラーゼ（商品名『ネオスピターゼ』、ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉固形物グラム当り０．２％になるように加え、８５乃至９０℃で２０分間反応させ、次いで１２０℃に２０分間オートクレーブし、更に約４０℃に急冷してＤＥ約３の液化溶液を得、これに実施例１の方法で得た環状マルトシルマルトース生成酵素を含む濃縮液を澱粉固形物１グラム当り０．２６ｍｌ（約１単位）とイソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製造）を澱粉固形物１グラム当り１０００単位の割合になるように加え、ｐＨ６．０、温度４０℃で４８時間反応させた。その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、ｐＨ５．０、温度５０℃にし、それにグルコアミラーゼ（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉１グラム当り１００単位の割合になるように加え、ｐＨ５．０、温度５０℃で１６時間反応させた。その反応液を９５℃に加熱し３０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して、濃度６０質量％の環状マルトシルマルトース含有シラップを固形物当たり収率約９５％で得た。本品は、固形物当たり、環状マルトシルマルトース４２．６質量％、グルコース５３．０質量％、及びその他の糖質を４．４質量％含有しており、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例５】
【０１６１】
実施例４の方法で得た環状マルトシルマルトース含有シラップを、常法に従って、水素添加して還元性糖質を糖アルコール化し、精製し、濃縮し、真空乾燥し、粉砕して、環状マルトシルマルトース含有粉末を固形物当たり収率約９０％で得た。本品は、固形物当たり、環状マルトシルマルトース４２．６質量％、ソルビトール５３．２質量％、及びその他の糖アルコールを４．２質量％含有しており、実質的に還元力を示さず、アミノカルボニル反応を起こしにくく、低還元性で、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例６】
【０１６２】
実施例４の方法で得た環状マルトシルマルトース含有シラップを原糖液とし、環状マルトシルマルトースの含量を高めるため、実施例３の方法に準じて塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを行なって、環状マルトシルマルトース高含有画分を採取し、精製して、固形物当たり約９０質量％の環状マルトシルマルトースを含有している環状マルトシルマルトース高含有液を固形物当たり収率約４０％で得た。本溶液を濃縮しながら連続晶析させ、得られるマスキットをバスケット型遠心分離機で分蜜し、結晶を少量の水でスプレーし洗浄し、温風乾燥して、高純度の環状マルトシルマルトース含水結晶を固形物当たり約２５％の収率で得た。本品は、純度９９％以上の極めて純度の高い環状マルトシルマルトース含水結晶であって、還元性が極めて低く、アミノカルボニル反応を起こしにくく、吸湿性も示さず、取扱いが容易であり、温和な低甘味、適度の粘度、保湿性、包接性、難消化性、を有し、甘味料、低カロリー食品素材、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物、更には、工業試薬、化学原料などにも有利に利用できる。
【実施例７】
【０１６３】
＜甘味料＞
実施例６の方法で得た環状マルトシルマルトース含水結晶０．８質量部に、トレハロース含水結晶（株式会社林原商事販売、登録商標『トレハ』）０．２質量部、α−グリコシルステビオシド（東洋精糖株式会社販売、商品名『αＧスィート』）０．０１質量部、およびＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（商品名『アスパルテーム』）０．０１質量部を均一に混合し、顆粒成型機にかけて顆粒状甘味料を得た。本品は、甘味の質が優れ、蔗糖の約２倍の甘味度を有している。本品のカロリーは、環状マルトシルマルトースが難消化性、難発酵性で実質的に無乃至低カロリーである。しかも、室温保存下、変質劣化の懸念も無く安定である。従って、本品は、高品質の低カロリー、低う蝕性甘味料として好適である。
【実施例８】
【０１６４】
＜ハードキャンディー＞
濃度５５％蔗糖溶液１００質量部に実施例４の方法で得た環状マルトシルマルトース含有シラップ５０質量部を加熱混合し、次いで減圧下で水分２％未満になるまで加熱濃縮し、これにクエン酸０．６質量部および適量のレモン香料と着色料とを混和し、常法に従って成型し、製品を得た。本品は歯切れ、呈味、風味とも良好で、蔗糖の晶出も起こさず、吸湿性少なく、ダレも起こさない安定で高品質のハードキャンディーである。
【実施例９】
【０１６５】
＜チューイングガム＞
ガムベース３質量部を柔らかくなる程度に加熱溶融し、これに無水マルチトール２質量部、キシリトール２質量部、実施例６の方法で得た環状マルトシルマルトース含水結晶２質量部、およびトレハロース含水結晶１質量部とを加え、更に適量の香料と着色料とを混合し、常法に従って、ロールにより練り合わせ、成型、包装して製品を得た。本品は、テクスチャー、呈味、風味良好で、低う蝕性、低カロリーのチューイングガムとして好適である。
【実施例１０】
【０１６６】
＜加糖練乳＞
原乳１００質量部に実施例２の方法で得た環状マルトシルマルトース含有シラップ４質量部および蔗糖２重量を溶解し、プレートヒーターで加熱殺菌し、次いで濃度７０％に濃縮し、無菌状態で缶詰して製品を得た。本品は、温和な甘味で風味も良く、フルーツ、コーヒー、ココア、紅茶などの調味用に有利に利用できる。
【実施例１１】
【０１６７】
＜乳酸菌飲料＞
脱脂粉乳１７５質量部、実施例３の方法で得た環状マルトシルマルトース含有粉末１００質量部およびラクトスクロース高含有粉末（株式会社林原商事販売、登録商標『乳果オリゴ』）を水１、５００質量部に溶解し、６５℃で３０分間殺菌し、４０℃に冷却後、これに、常法に従って、乳酸菌のスターターを３０質量部植菌し、３７℃で８時間培養して乳酸菌飲料を得た。本品は、風味良好で、オリゴ糖、環状マルトシルマルトースを含有し、乳酸菌を安定に保つだけでなく、ビフィズス菌増殖促進作用、整腸作用を有する乳酸菌飲料として好適である。
【実施例１２】
【０１６８】
＜粉末ジュース＞
噴霧乾燥により製造したオレンジ果汁粉末３３質量部に対して、実施例６の方法で得た環状マルトシルマルトース含水結晶粉末５０質量部、無水結晶マルチトール１０質量部、無水クエン酸０．６５質量部、リンゴ酸０．１質量部、２−Ｏ−α−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸０．２質量部、クエン酸ソーダ０．１質量部、プルラン０．５質量部および粉末香料の適量をよく混合攪拌し、粉砕し微粉末にして、これを流動層造粒機に仕込み、排風温度４０℃とし、これに実施例２の方法で得た環状マルトシルマルトース含有シラップをバインダーとして適量スプレーし、３０分間造粒し、計量し、包装して製品を得た。本品は、果汁含有率約３０％の粉末ジュースである。又、本品は、異味、異臭がなく、高品質で、低カロリーのジュースとして商品価値の高いものである。
【実施例１３】
【０１６９】
＜カスタードクリーム＞
コーンスターチ１００質量部、実施例２の方法で得た環状マルトシルマルトース含有シラップ１００質量部、トレハロース含水結晶６０質量部、蔗糖４０質量部、および食塩１質量部を充分に混合し、鶏卵２８０質量部を加えて攪拌し、これに沸騰した牛乳１、０００質量部を徐々に加え、更に火にかけて攪拌を続け、コーンスターチが完全に糊化して全体が半透明になった時に火を止め、これを冷却して適量のバニラ香料を加え、計量、充填、包装して製品を得た。本品は、なめらかな光沢を有し、風味良好で、澱粉の老化も抑制され、高品質のカスタードクリームである。
【実施例１４】
【０１７０】
＜ういろうの素＞
米粉９０質量部に、コーンスターチ２０質量部、無水結晶マルチトール７０質量部、実施例５の方法で得た環状マルトシルマルトース含有粉末５０質量部、およびプルラン４質量部を均一に混合してういろうの素を製造した。ういろうの素と適量の抹茶と水とを混練し、これを容器に入れて６０分間蒸し上げて抹茶ういろうを製造した。本品は、照り、口当たりも良好で、風味も良い。又、澱粉の老化も抑制され、日持ちも良く、低カロリーのういろうとしても好適である。
【実施例１５】
【０１７１】
＜あん＞
原料あずき１０質量部に、常法に従って、水を加えて煮沸し、渋切り、あく抜きし、水溶性夾雑物を除去して、あずきつぶあん約２１質量部を得た。この生あんに蔗糖１４質量部、実施例２の方法で得た環状マルトシルマルトース含有シラップ５質量部と水４質量部を加えて煮沸し、これに少量のサラダオイルを加えてつぶあんを壊さないように練り上げ、製品のあんを約３５質量部得た。本品は、色焼け、離水もなく安定で、舌触り、風味良好で、あんパン、まんじゅう、団子、最中、氷菓などの製菓材料として好適である。
【実施例１６】
【０１７２】
＜パン＞
小麦粉１００質量部、イースト菌２質量部、蔗糖５質量部、実施例３の方法で得た環状マルトシルマルトース含有粉末１質量部および無機フード０．１質量部を、常法に従って、水でこね、中種を２６℃で２時間発酵させ、その後３０分間熟成、焼き上げた。本品は、色相、すだちとも良好で、適度の弾力、温和な甘味を有する高品質のパンである。
【実施例１７】
【０１７３】
＜ハム＞
豚もも肉１、０００質量部に食塩１５質量部および硝酸カリウム３質量部を均一にすり込んで、冷室に１昼夜堆積する。これを水５００質量部、食塩１００質量部、硝酸カリウム３質量部、実施例５の方法で得た環状マルトシルマルトース含有粉末４０質量部および香辛料からなる塩漬液に冷室で７日間漬け込み、次いで、常法に従い、冷水で洗浄し、ひもで巻き締め、薫煙し、クッキングし、冷却、包装して製品を得た。本品は、色合いもよく、風味良好な高品質のハムである。
【実施例１８】
【０１７４】
＜粉末ペプチド＞
４０％食品用大豆ペプチド溶液（不二製油株式会社販売、商品名『ハイニュートＳ』）１質量部に、実施例６の方法で得た環状マルトシルマルトース含水結晶粉末２質量部を混合し、プラスチック製バットに入れ、５０℃で減圧乾燥し、粉砕して粉末ペプチドを得た。本品は風味良好で、プレミックス、冷菓などの低カロリー製菓材料として有用であるのみならず、経口流動食、経管流動食のための難消化性の食物繊維、整腸剤量としても有用である。
【実施例１９】
【０１７５】
＜化粧用クリーム＞
モノステアリン酸ポリオキシエチレングリコール２質量部、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン５質量部、実施例６の方法で得た環状マルトシルマルトース含水結晶粉末２質量部、α−グルコシル ルチン（株式会社林原販売、商品名αＧルチン）１質量部、流動パラフィン１質量部、トリオクタン酸グリセリン１０質量部および防腐剤の適量を常法に従って加熱溶解し、これにＬ−乳酸２質量部、１、３−ブチレングリコール５質量部および精製水６６質量部を加え、ホモゲナイザーにかけ乳化し、更に香料の適量を加えて攪拌混合し、化粧用クリームを製造した。本品は、抗酸化性を有し、安定性は高く、高品質の日焼け止め、美肌剤、色白剤などとして有利に利用できる。
【実施例２０】
【０１７６】
＜練歯磨＞
第二リン酸カルシウム４５質量部、ラウリル硫酸ナトリウム１．５質量部、グリセリン２５質量部、ポリオキシエチレンソルビタンラウレート０．５質量部、実施例５の方法で得た環状マルトシルマルトース含有粉末１０質量部、サッカリン０．０２質量部を水１８質量部と混合して練歯磨を得た。本品は、界面活性剤の洗浄力を落とすことなく、嫌味を改良し、使用後感も良好である。
【実施例２１】
【０１７７】
＜流動食用固体製剤＞
実施例３の方法で得た環状マルトシルマルトース含有粉末１００質量部、トレハロース含水結晶２００質量部、マルトテトラオース高含有粉末２００質量部、粉末卵黄２７０質量部、脱脂粉乳２０９質量部、塩化ナトリウム４．４質量部、塩化カリウム１．８質量部、硫酸マグネシウム４質量部、チアミン０．０１質量部、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム０．１質量部、ビタミンＥアセテート０．６質量部およびニコチン酸アミド０．０４質量部からなる配合物を調製し、この配合物２５グラムずつ防湿性ラミネート小袋に充填し、ヒートシールして製品を得た。本品は、環状マルトシルマルトースにより難消化性の食物繊維を強化し、整腸作用に優れた流動食とし、経口的、または鼻腔、胃、腸などへ経管的使用方法により利用され、生体へのエネルギー補給用に有利に利用できる。
【実施例２２】
【０１７８】
＜錠剤＞
アスピリン５０質量部に実施例６の方法で得た環状マルトシルマルトース含水結晶粉末１４質量部、コーンスターチ４質量部を充分に混合した後、常法に従って打錠機により打錠して厚さ５．２５ｍｍ、１錠６８０ｍｇの錠剤を製造した。本品は、環状マルトシルマルトースの賦形性を利用したもので、吸湿性がなく、物理的強度も充分にあり、しかも水中での崩壊はきわめて良好である。
【実施例２３】
【０１７９】
＜外傷治療用膏薬＞
実施例６の方法で得た環状マルトシルマルトース含水結晶粉末１００質量部およびマルトース３００質量部に、ヨウ素３質量部を溶解したメタノール５０質量部を加え混合し、更に１０ｗ／ｖ％プルラン水溶液２００質量部を加えて混合し、適度の延び、付着性を示す外傷治療用膏薬を得た。本品は、環状マルトシルマルトースによりヨウ素、メタノールの揮散を防止し、経時変化が少ない商品価値の高い膏薬である。又、本品は、ヨウ素による殺菌作用のみならず、マルトースによる細胞へのエネルギー補給剤としても作用することから治癒期間が短縮され、創面もきれいに治る。
【産業上の利用可能性】
【０１８０】
本発明によれば、従来未知であったサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する新規環状糖質、すなわち、環状マルトシルマルトースを、環状マルトシルマルトース生成酵素を用いて大量に製造し、提供することが可能となる。本糖質は非還元性であることから、アミノ化合物との間でアミノカルボニル反応（メイラード反応）を起こして褐変することなく、また、環状糖質であることから、包接能を有しており、包接した化合物の揮散を抑制し、安定化することができる。新たな環状マルトシルマルトースの提供を可能とする本発明は、飲食物、化粧品、医薬品など種々の利用分野に貢献することとなり、その産業的意義はきわめて大きい。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンを含む溶液に、グルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用し、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状マルトシルマルトースを生成する作用を有する環状マルトシルマルトース生成酵素を作用させる工程と、反応液中に生成する、α−１，４グルカンの非還元末端にα−１，６結合を介してマルトースが連結した６−α−マルトシル分岐α−グルカンを採取する工程を含んでなる６−α−マルトシル分岐α−グルカンの製造方法。
【請求項２】
環状マルトシルマルトース生成酵素がアルスロバクター属微生物由来である請求項１記載の６−α−マルトシル分岐α−グルカンの製造方法。
【請求項３】
アルスロバクター属微生物が、アルスロバクター・グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ） Ｍ６（独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４８）又はその変異株である請求項２記載の６−α−マルトシル分岐α−グルカンの製造方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに記載の製造方法により得られる６−α−マルトシル分岐α−グルカン。
【請求項１】
グルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンを含む溶液に、グルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用し、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状マルトシルマルトースを生成する作用を有する環状マルトシルマルトース生成酵素を作用させる工程と、反応液中に生成する、α−１，４グルカンの非還元末端にα−１，６結合を介してマルトースが連結した６−α−マルトシル分岐α−グルカンを採取する工程を含んでなる６−α−マルトシル分岐α−グルカンの製造方法。
【請求項２】
環状マルトシルマルトース生成酵素がアルスロバクター属微生物由来である請求項１記載の６−α−マルトシル分岐α−グルカンの製造方法。
【請求項３】
アルスロバクター属微生物が、アルスロバクター・グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ） Ｍ６（独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４８）又はその変異株である請求項２記載の６−α−マルトシル分岐α−グルカンの製造方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに記載の製造方法により得られる６−α−マルトシル分岐α−グルカン。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１０−１９５８３０（Ｐ２０１０−１９５８３０Ａ）
【公開日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１２７３９０（Ｐ２０１０−１２７３９０）
【出願日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【分割の表示】特願２００４−１７４８８０（Ｐ２００４−１７４８８０）の分割
【原出願日】平成１６年６月１４日（２００４．６．１４）
【出願人】（０００１５５９０８）株式会社林原生物化学研究所 (168)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【分割の表示】特願２００４−１７４８８０（Ｐ２００４−１７４８８０）の分割
【原出願日】平成１６年６月１４日（２００４．６．１４）
【出願人】（０００１５５９０８）株式会社林原生物化学研究所 (168)
【Ｆターム（参考）】
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