生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法及び評価用キット、並びに、物質のスクリーニング方法
【課題】被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を評価する方法等を提供する。
【解決手段】被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物から採取した体液における８種のマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較することにより、前記被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を評価する。マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体にマーカー物質を捕捉して、体液中のマーカー物質の濃度を算出する構成が推奨される。該評価方法を用いる物質のスクリーニング方法、該評価方法を簡便に行うことができるキットも提供される。
【解決手段】被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物から採取した体液における８種のマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較することにより、前記被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を評価する。マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体にマーカー物質を捕捉して、体液中のマーカー物質の濃度を算出する構成が推奨される。該評価方法を用いる物質のスクリーニング方法、該評価方法を簡便に行うことができるキットも提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法及び評価用キット、並びに、物質のスクリーニング方法に関し、さらに詳細には、被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物から採取した体液における特定のマーカー物質を指標として、被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を評価する生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法、該評価方法を簡便に行うことができる生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価用キット、並びに、該評価方法を用いて生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する物質をスクリーニングする物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ストレスに起因する症状・疾患が増大しており、現代社会における大きな問題となっている。一般に、「ストレス」という用語は２つの意味で使われている。１つは主に生体レベルにおける意味であり、生体において誘起有害作用因子（ストレッサー）に反応する「生体内緊張状態」を指す。もう１つは主に細胞レベルにおける意味であり、作用因子そのものを指す（例：高温ストレス、酸化ストレス）。
【０００３】
生体内緊張状態（生体におけるストレス）を緩和したり、その誘導を抑制したりすることが、ストレスに起因する疾患の予防や治療に有用である。そのために、生体内緊張状態を反映するバイオマーカーに注目が集まっている。すなわち、そのようなバイオマーカーを用いることにより、被験物質が生体内緊張状態を緩和したり、誘導を抑制する効果を有するか否かを容易に調べることが可能となり、食品素材等のスクリーニングに有用である。そして、そのような評価・スクリーニング系で選抜された食品素材を日常的に摂取することで、無用の生体内緊張状態を回避することが可能となる。
【０００４】
生体内緊張状態を反映する血中のマーカーとしては、グルタチオンやコルチゾールが古くから知られている。ただし、これらは低分子化合物であるため代謝が早く、ストレスのない状態における血中濃度の変動が大きい。そこで、ストレスのない状態における変動がより小さいタンパク質のマーカーが探索されており、いくつかのタンパク性ストレスマーカーが見出されている（特許文献１，２）。
【特許文献１】特開平７−１８１１８０号公報
【特許文献２】特開２００７−２２５６０６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、生体内緊張状態を反映するバイオマーカーを新たに特定し、当該バイオマーカーを用いて被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を評価するための一連の技術を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記した課題を解決するための請求項１に記載の発明は、被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物から採取した体液における下記マーカー物質（Ｍ１）〜（Ｍ８）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較することにより、前記被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を評価することを特徴とする生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法である。
（Ｍ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６０２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９３１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３８００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１７７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１９６００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３９９００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ８）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７７０００のイオンピークを生じるタンパク質。
【０００７】
本発明は生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法に係るものであり、被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物から採取した体液における上記（Ｍ１）〜（Ｍ８）の８種のマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、当該被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を評価するものである。上記マーカー物質（Ｍ１）〜（Ｍ９）は、いずれも体液中に存在するタンパク質であり、生体内緊張状態を反映するものである。本発明によれば、被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を、容易かつ高精度に評価することができる。なお、「動物」には、マウス等の飼育可能な動物の他、ヒトも含むものとする。
【０００８】
ここで「生体内緊張状態の緩和効果」とは、緊張状態にある生体に対して緊張を緩和、軽減、抑制等する効果を指し、当該効果によって生体は緊張状態から解放される方向に向かう。また「生体内緊張状態の誘導抑制効果」とは、平静状態にある生体に対して緊張状態が誘導されることを抑制、阻止する効果を指す。当該効果によって、生体は平静状態を維持する方向に向かう。そして本発明では、被験物質が有する「生体内緊張状態の緩和効果」又は「生体内緊張状態の誘導抑制効果」を評価する。
【０００９】
ここで、各マーカー物質における質量／電荷比（以下、「ｍ／ｚ」と略記することもある。）の「約６０２０」、「約１７７００」、「約７７０００」等の値は、質量分析における測定値の誤差範囲を考慮した値であり、概ね±０．２％の幅を有する。すなわち、約６０２０は概ね６０２０±０．２％、約１７７００は概ね１７７００±０．２％、約７７０００は概ね７７０００±０．２％を表す。他の質量／電荷比についても全く同様に、概ね±０．２％の幅を有する。また、これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質である。被験物質が生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する場合、動物の体液中のマーカー物質（Ｍ３）及び（Ｍ４）の濃度はより低値を示し、マーカー物質（Ｍ１）、（Ｍ２）、（Ｍ５）、（Ｍ６）、（Ｍ７）、及び（Ｍ８）の濃度はより高値を示す。
【００１０】
請求項２に記載の発明は、下記（１）〜（５）の少なくとも１つを満たすことを特徴とする請求項１に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法である。
（１）マーカー物質（Ｍ１）は血清アルブミン又はその修飾体である、
（２）マーカー物質（Ｍ２）はプロアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（３）マーカー物質（Ｍ３）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（４）マーカー物質（Ｍ４）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（５）マーカー物質（Ｍ８）はトランスフェリン又はその修飾体である。
【００１１】
血清アルブミン（Serum Albumin）、プロアポリポタンパク質Ａ２（Pro-Apolipoprotein A2）、トランスサイレチン（Transthyretin）、トランスフェリン（Transferrin）はいずれも物理化学的性質がよく知られているので、本発明によればマーカー物質（Ｍ１）、（Ｍ２）、（Ｍ３）、（Ｍ４）、（Ｍ８）の解析が容易である。
【００１２】
「タンパク質の修飾体」の代表例は、当該タンパク質を構成するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されたタンパク質である。「修飾」には化合物や官能基の付加（例：リン酸化）のみならず、脱離（例：脱リン酸化）も含まれる。また「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォームが含まれる。さらに「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質が含まれる。またさらに、「タンパク質又はその修飾体」には、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
【００１３】
同様の課題を解決するための請求項３に記載の発明は、被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物から採取した体液における下記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）のいずれかに属する少なくとも１つの濃度を基準値と比較することにより、前記被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を評価することを特徴とする生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法である。
（Ａ１）血清アルブミン又はその修飾体、
（Ａ２）プロアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ａ３）トランスサイレチン又はその修飾体、
（Ａ４）トランスフェリン又はその修飾体。
【００１４】
本発明も生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法に係るものであり、被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物から採取した体液における上記（Ａ１）〜（Ａ４）のいずれかに属するマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、当該被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を評価するものである。上記（Ａ１）〜（Ａ４）に属するマーカー物質は、いずれも体液中に存在するタンパク質であり、生体内緊張状態を反映するものである。本発明によれば、被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を、容易かつ高精度に評価することができる。特に、血清アルブミン、プロアポリポタンパク質Ａ２、トランスサイレチン、トランスフェリンはいずれも物理化学的性質がよく知られているので、解析が容易である。なお本発明においても、「動物」には、マウス等の飼育可能な動物の他、ヒトも含むものとする。
【００１５】
本発明においても「タンパク質の修飾体」の代表例は、当該タンパク質を構成するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されたタンパク質であり、「修飾」には化合物や官能基の付加のみならず、脱離も含まれる。また「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォーム、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質、並びに、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。さらに、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
【００１６】
前記動物は、被験物質を投与した後にストレスを与えた動物であることが好ましい（請求項４）。
【００１７】
請求項５に記載の発明は、前記基準値は、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有さない既知物質を投与すると共にストレスを与えた動物の体液中における前記マーカー物質の濃度であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法である。
【００１８】
かかる構成により、被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を、より容易かつ高精度に評価することができる。
【００１９】
請求項６に記載の発明は、前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法である。
【００２０】
かかる構成により、測定試料となる体液を簡単に採取でき、より簡便かつ迅速に、被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を評価することができる。
【００２１】
請求項７に記載の発明は、前記被験物質は、食品素材又は医薬品素材であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法である。
【００２２】
かかる構成により、機能性食品又は医薬品の開発を目的として、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を評価することができる。
【００２３】
請求項８に記載の発明は、前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法である。
【００２４】
本発明の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を使用する。そして、該担体に体液又は体液成分を接触させて、体液又は体液成分に含まれるマーカー物質を、マーカー物質に対する親和性を有する物質を介して担体上に捕捉し、捕捉されたマーカー物質の量に基づいて体液中のマーカー物質の濃度を算出する。本発明によれば、担体上に捕捉されたマーカー物質を測定対象とするので、測定試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、体液成分の例としては、体液が血液である場合の血清又は血漿が挙げられる。
【００２５】
請求項９に記載の発明は、前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項８に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法である。
【００２６】
本発明の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法では、平面部分を有する担体を用い、マーカー物質に対する親和性を有する物質は該平面部分の一部に固定化されている。かかる構成により、マーカー物質に対する親和性を有する物質を、担体上の複数箇所にスポット的に固定化することができる。その結果、１個の担体で複数の測定試料を同時処理することや、１個の担体で複数のマーカー物質の濃度を同時測定することが可能となり、作業効率がよい。さらに、各スポットの面積を小さくすることにより、微量の測定試料からでもマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、平面部分を有する担体の例としては、チップ等の基板が挙げられる。
【００２７】
請求項１０に記載の発明は、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項８又は９に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法である。
【００２８】
本発明の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質としてイオン交換体又は抗体を用い、イオン交換体又は抗体を介して測定試料中のマーカー物質を担体上に捕捉する。当該物質がイオン交換体の場合は各種のものが入手容易であり、マーカー物質を捕捉するための担体を容易に調製することができる。また、当該物質が抗体の場合は、より特異的にマーカー物質を捕捉することができる。捕捉されたマーカー物質の量を測定する方法としては、質量分析、イムノアッセイ（抗体の場合）が挙げられる。
【００２９】
請求項１１に記載の発明は、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法によって被験物質を評価し、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法である。
【００３０】
本発明は物質のスクリーニング方法にかかり、動物の体液中における上記（Ｍ１）〜（Ｍ８）の各マーカー物質および上記（Ａ１）〜（Ａ４）に属する各マーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する物質をスクリーニングするものである。上記（Ｍ１）〜（Ｍ８）の各マーカー物質および上記（Ａ１）〜（Ａ４）に属する各マーカー物質は、いずれも体液中に存在するタンパク質であり、生体内緊張状態を反映するものである。本発明の物質のスクリーニング方法によれば、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する物質を、容易かつ高精度にスクリーニングすることができる。例えば、被験物質が食品素材の場合は、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する機能性食品の開発に有用な食品素材をスクリーニングすることができる。
【００３１】
請求項１２に記載の発明は、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とする生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価用キットである。
【００３２】
本発明の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価用キットは、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含む。かかる構成により、マーカー物質の濃度測定に際して当該担体を別途用意する必要がなく、きわめて簡便にマーカー物質の濃度を測定することができる。
【００３３】
請求項１３に記載の発明は、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体であることを特徴とする請求項１２に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価用キットである。
【００３４】
かかる構成により、マーカー物質をより確実に担体上に捕捉することができる。
【００３５】
生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する物質をスクリーニングするために使用される構成が推奨される（請求項１４）。
【発明の効果】
【００３６】
本発明の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法によれば、被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を、容易かつ高精度に評価することができる。
【００３７】
本発明の物質のスクリーニング方法によれば、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する物質を、容易かつ高精度にスクリーニングすることができる。
【００３８】
本発明の生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果の評価用キットによれば、マーカー物質の濃度測定に際して当該担体を別途用意する必要がなく、きわめて簡便にマーカー物質の濃度を測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
以下、本発明を実施するための最良の形態について詳細に説明する。
【００４０】
本発明の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法は２つの様相を含む。１つの様相では、被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物から採取した体液における下記マーカー物質（Ｍ１）〜（Ｍ８）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較することにより、前記被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を評価する。
（Ｍ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６０２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９３１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３８００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１７７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１９６００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３９９００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ８）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７７０００のイオンピークを生じるタンパク質。
【００４１】
これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質であり、生体内緊張状態を反映するものである。なお、（Ｍ３）及び（Ｍ４）の各マーカー物質（以下、これらのマーカー物質からなるグループを「グループ１」と称することがある。）は、生体が緊張状態にある場合により高値を示すものであるので、被験物質が生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する場合には、当該被験物質を投与した動物においてより低値を示す。一方、（Ｍ１）、（Ｍ２）、（Ｍ５）、（Ｍ６）、（Ｍ７）、及び（Ｍ８）の各マーカー物質（以下、これらのマーカー物質からなるグループを「グループ２」と称することがある。）は、生体が緊張状態にある場合により低値を示すものであるので、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する場合には、当該被験物質を投与した動物においてより高値を示す。
【００４２】
ある条件のペプチドマッピングによれば、マーカー物質（Ｍ１）は血清アルブミン、マーカー物質（Ｍ３）と（Ｍ４）はトランスサイレチン、マーカー物質（Ｍ５）はトランスフェリン、と同定され得る。また、ある条件のペプチドマッピングと分子量、等電点の情報から、マーカー物質（Ｍ２）はプロアポリポタンパク質Ａ２と同定され得る。すなわち、ある実施形態では、下記（１）〜（５）の少なくとも１つを満たす。
（１）マーカー物質（Ｍ１）は血清アルブミン又はその修飾体である、
（２）マーカー物質（Ｍ２）はプロアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（３）マーカー物質（Ｍ３）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（４）マーカー物質（Ｍ４）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（５）マーカー物質（Ｍ８）はトランスフェリン又はその修飾体である。
【００４３】
本発明の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法の他の様相では、被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物から採取した体液における下記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）のいずれかに属する少なくとも１つの濃度を基準値と比較することにより、前記被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を評価する。
（Ａ１）血清アルブミン又はその修飾体、
（Ａ２）プロアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ａ３）トランスサイレチン又はその修飾体、
（Ａ４）トランスフェリン又はその修飾体。
【００４４】
なお、マウス由来の血清アルブミン、プロアポリポタンパク質Ａ２、トランスサイレチン、及びトランスフェリンのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１〜４に示すとおりである。
【００４５】
タンパク質の修飾の例としては、Ｎ末端αアミノ基やリジンεアミノ基のメチル化、アセチル化、アデニリル化、ミリスチル化等；セリン・スレオニン・アスパラギンへの糖又は糖鎖の付加；セリン・スレオニン・チロシン・アルギニン・ヒスチジンのリン酸化；システインのシステイニル化、ホモシステイニル化、スルホニル化等；グルタミン酸のγ−カルボキシル化；Ｎ末端グルタミン酸のピログルタミン酸への変換、等が挙げられる。また、これらの修飾の脱離（脱メチル化、糖又は糖鎖の脱離、脱リン酸化等）も「修飾」に含まれる。
【００４６】
「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォームが含まれる。アイソフォームとしては、前記した各種の修飾の他、選択的スプライシングによって生じたタンパク質が挙げられる。さらに、「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質が含まれる。またさらに、「タンパク質又はその修飾体」には、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。例えば、当該タンパク質由来と認められうる長さのタンパク質断片、例えば２０個以上のアミノ酸残基からなるタンパク質断片、分子量が２千以上のタンパク質断片、等が挙げられる。また、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
【００４７】
例えば、血清アルブミン（配列番号１）のアミノ酸番号５５３（Ａｌａ）〜６０８（Ａｌａ）に相当する５５アミノ酸からなるタンパク質断片（配列番号５）は「血清アルブミンの修飾体」に含まれる。
【００４８】
プロアポリポタンパク質Ａ２（配列番号２）のＣ末端アミノ酸残基（Ｌｙｓ）が欠損したタンパク質断片（配列番号６）は、「プロアポリポタンパク質Ａ２の修飾体」に含まれる。
【００４９】
トランスサイレチン（プレアルブミンとも呼ばれる）は分子量約１万４千のサブユニット４個からなる複合タンパク質である。トランスサイレチンについては、その唯一のＣｙｓ残基が修飾を受けた種々の修飾トランスサイレチンが見出されている（Amareth Lim et al., J. Biol. Chem., vol. 258, No. 50, 2003）。後述の実施例４に示したように、マウス由来トランスサイレチン（配列番号３）のＣｙｓ残基にスルホン酸が付加したＳ−スルホン化トランスサイレチンは「トランスサイレチンの修飾体」に含まれる。
【００５０】
本発明の生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果の評価方法では、（Ｍ１）〜（Ｍ８）の各マーカー物質並びに（Ａ１）〜（Ａ４）に属する各マーカー物質の１つだけを用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。複数を用いる場合の組み合わせ方については特に限定はないが、例えば、グループ１から選択したマーカー物質（１つ又は複数）とグループ２から選択したマーカー物質（１つ又は複数）とを組み合わせることができる。
【００５１】
本発明の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法における好ましい実施形態では、上記基準値として、「生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有さない既知物質」（以下、「効果のない既知物質」と称する。）を投与すると共にストレスを与えた動物の体液中における上記マーカー物質の濃度を用いる。すなわち、動物に、効果のない既知物質を投与すると共にストレスを与えた場合、その体液中の上記マーカー物質の濃度は「異常値」となる。そして、被験物質を投与した上記動物における値（測定値）と当該基準値（異常値）とを比較し、測定値が基準値と有意に差がありかつ正常側である場合（正常側に維持された場合）に、当該被験物質が生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有すると評価することができる。具体的には、グループ１に属するマーカー物質を指標とする場合は、測定値が当該基準値に比べて有意に低いときに、一方、グループ２に属するマーカー物質を指標とする場合は、測定値が基準値に比べて有意に高いときに、当該被験物質が生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有すると評価することができる。
【００５２】
さらに、基準値は複数あってもよい。例えば、上記の異常値に加え、ストレスを与えない動物における値（正常値。陰性対照。）を基準値に加えることができる。具体的には、（１）効果のない既知物質又は被験物質を投与すると共にストレスを与えない群（正常値を示す群）、（２）効果のない既知物質を投与すると共にストレスを与える群（異常値を示す群）、及び、（３）被験物質を投与すると共にストレスを与える群、の計３群を設定し、動物を飼育する。そして、各動物の体液中の上記マーカー物質を測定し、各測定値を比較する。このとき、（１）と（２）とで有意差があり、（３）と（２）とで有意差があり、かつ（３）が（２）に比べて正常側（（１）に近い側）である場合（正常側に維持された場合）に、当該被験物質が生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有すると評価することができる。
【００５３】
さらに、基準値として、（４）「生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する既知物質」（効果のある既知物質）を投与すると共にストレスを与える群、における値（陽性対照）を加えることもできる。具体的には、上記（１）〜（３）に加えて、上記（４）の群を設定し、動物を飼育する。このとき、（１）と（２）とで有意差があり、（３）と（２）とで有意差があり、かつ（３）が（２）に比べて正常側（（１）及び（４）に近い側）である場合に、当該被験物質が生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有すると評価することができる。すなわち、このような被験物質は、（４）で採用した上記既知物質と同様の挙動を示し、同様の作用を有する物質といえる。
【００５４】
ここで「生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する既知物質」（効果のある既知物質）を含む素材の例としては、ケツメイシが挙げられる。ケツメイシには血中グルタチオン濃度を増加させる効果があることが知られている（例えば、特開２００４−２２３１号公報）。また、拘束ストレスによって血中グルタチオン濃度が減少することが知られている（道解公一ら，「拘束ストレスによる脳および血液中グルタチオンの応答性」，産業衛生学雑誌，社団法人日本産業衛生学会，２００２年，第４４巻，ｐ．２６２）。
【００５５】
本発明では「被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物」を用いるが、被験物質の投与とストレス付与の順番については特に限定はない。例えば、被験物質の投与後にストレスを与えてもよいし、ストレスを先に与えてから被験物質を投与してもよい。被験物質の投与と並行してストレスを与えてもよい。被験物質の投与経路としては、経口投与が代表的であるが、他の経路によって投与してもよい。
【００５６】
動物に与えるストレス（作用因子）の種類としては特に限定はなく、例えば、拘束、行動制限、騒音、寒冷のような物理的ストレス、薬物投与のような化学的ストレス、炎症、感染のような生物的ストレス、不安、怒りのような心理的ストレス、を挙げることができる。
【００５７】
「被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物」における動物の種類には特に限定はなく、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ等を採用することができる。さらに、動物としてヒトを採用することもできる。この場合には、臨床試験の結果によって被験物質が有する効果を評価することになる。
【００５８】
本発明の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法において使用する動物の体液としては、血液が好ましく用いられる。特に、血液から調製した血清又は血漿（体液成分）を測定試料とすることが好ましい。血清又は血漿は遠心分離等の公知の方法で血液から調製することができる。
【００５９】
本発明の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法における被験物質としては、食品素材、医薬品素材などが挙げられる。例えば、食品素材を評価対象とする場合は、機能性食品の開発に役立てることができる。
【００６０】
本発明の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法において、マーカー物質の濃度を測定する方法は、そのマーカー物質の濃度を特異的に測定できる方法であれば、タンパク質の定量に一般に用いられている方法をそのまま用いることができる。例えば、各種のイムノアッセイ、質量分析（ＭＳ）、クロマトグラフィー、電気泳動等を用いることができる。
【００６１】
イムノアッセイによれば、夾雑物質の多い試料のままでも正確にマーカー物質の濃度を測定することができる。イムノアッセイの例としては、抗原抗体結合物を直接的又は間接的に測定する沈降反応、凝集反応、溶血反応などの古典的な方法や、標識法と組み合わせて検出感度を高めたエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）等の方法が挙げられる。なお、これらのイムノアッセイに用いるマーカー物質に特異的な抗体は、モノクローナルでもよいし、ポリクローナルでもよい。
【００６２】
質量分析によれば、各マーカー物質由来のイオンピークを特定し、そのイオンピーク強度をもって各マーカー物質の量（濃度）を測定することができる。質量分析によってマーカー物質の濃度を測定する場合のイオン化の方法としては、マトリクス支援レーザーイオン化（matrix-assisted laser desorption/ionization、ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化（electrospray ionization、ＥＳＩ）のいずれも適用可能であるが、多価イオンの生成が少ないＭＡＬＤＩが好ましい。特に、飛行時間質量分析計（time-of-flight mass spectrometer、ＴＯＦ）と組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによれば、より正確にマーカー物質由来のイオンピークを特定することができる。
【００６３】
電気泳動によりマーカー物質の濃度を測定する場合は、例えば、検査材料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供して目的のマーカー物質を分離し、適宜の色素や蛍光物質でゲルを染色し、目的のマーカー物質に相当するバンドの濃さや蛍光強度を測定すればよい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥだけではマーカー物質の分離が不十分な場合は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）と組み合わせた２次元電気泳動を用いることもできる。さらに、ゲルから直接検出するのではなく、ウエスタンブロッティングを行って膜上のマーカー物質の量を測定することもできる。
【００６４】
クロマトグラフィーによってマーカー物質の濃度を測定する場合は、例えば、液体高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法を用いることができる。すなわち、試料をＨＰＬＣに供して目的のマーカー物質を分離し、そのクロマトグラムのピーク面積を測定することにより試料中のマーカー物質の濃度を測定することができる。
【００６５】
好ましい実施形態では、マーカー物質を担体上に捕捉し、その捕捉されたマーカー物質を測定対象とする。すなわち、マーカー物質に対する親和性を有する物質を担体に固定化し、その親和性を有する物質を介してマーカー物質を担体上に捕捉する。そして、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出する。本実施形態によれば、試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。本実施形態において用いることができる担体の例としては、ビーズ、金属、ガラス、樹脂等のような一般的なものの他、基板のような、平面部分を有する担体を用いることができる。基板を用いる場合は、その平面部分の一部にマーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化することが好ましい。例としては、基板としてチップを用い、その表面の複数箇所にスポット的にマーカー物質に親和性を有する物質を固定化した担体が挙げられる。なお「親和性」の例としては、イオン結合、金属キレート体とタンパク質中のヒスチジン残基等とのアフィニティ、抗原と抗体、酵素と基質、若しくはホルモンとレセプターのようなバイオアフィニティ、及び、疎水性相互作用のような化学的な相互作用、が挙げられる。
【００６６】
イオン結合によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、イオン交換体を担体に固定化する。この場合、イオン交換体には陽イオン交換体、陰イオン交換体のいずれも用いることができ、さらに、強陽イオン交換体、弱陽イオン交換体、強陰イオン交換体、弱陰イオン交換体のいずれも用いることができるが、強陰イオン交換体と弱陽イオン交換体が好ましく用いられる。強陰イオン交換体の例としては、４級アンモニウム（トリメチルアミノメチル）（ＱＡ）、４級アミノエチル（ジエチル，モノ・２−ヒドロキシブチルアミノエチル）（ＱＡＥ）、４級アンモニウム（トリメチルアンモニウム）（ＱＭＡ）等の強陰イオン交換基を有するものが挙げられる。また、弱陽イオン交換体の例としては、カルボキシメチル（ＣＭ）等の弱陽イオン交換基を有するものが挙げられる。また、強陽イオン交換体の例としては、スルホプロピル（ＳＰ）等の強陽イオン交換基を有するものが挙げられる。さらに、弱陰イオン交換体の例としては、ジメチルアミノエチル（ＤＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）等の弱陰イオン交換基を有するものが挙げられる。
【００６７】
金属キレート体を介してマーカー物質を捕捉する場合は、例えば、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、Ｎｉ2+、Ｃｏ2+、Ａｌ3+、Ｆｅ3+、Ｇａ3+等の金属キレート体を固定化した担体を用いることができる。
【００６８】
抗体によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、マーカー物質に特異的な抗体を担体に固定化すればよい。
【００６９】
疎水性相互作用によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、担体に疎水基をもつ物質を固定化する。疎水基の例としては、Ｃ４〜Ｃ２０のアルキル基、フェニル基等が挙げられる。
【００７０】
本実施形態においてマーカー物質の測定方法にイムノアッセイを用いる場合は、抗体を固定化した担体を用いることが好ましい。このようにすれば、担体に固定化された抗体を１次抗体としたイムノアッセイの系を簡単に構築することができる。例えば、マーカー物質に特異的でエピトープの異なる２種類の抗体を用意し、一方を１次抗体として担体に固定化し、他方を２次抗体として酵素標識し、サンドイッチＥＩＡの系を構築することができる。その他、結合阻止法や競合法によるイムノアッセイの系も構築可能である。さらに、担体として基板を用いる場合は、抗体チップによるイムノアッセイが可能である。抗体チップによれば、複数のマーカー物質の濃度を同時に測定でき、迅速な測定が可能である。
【００７１】
一方、本実施形態において質量分析を用いる場合は、例えば、抗体の他、イオン交換体、金属キレート体又は疎水基を固定化した担体を用いることができる。なお、これらの物質による結合は抗原と抗体等のバイオアフィニティほどの特異性がないので、これらの物質を固定化した担体を用いる場合はマーカー物質以外の物質も担体上に捕捉されうるが、質量分析によれば分子量を反映した質量分析計スペクトルによって定量するので、問題はない。特に、担体として基板を用い、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化（surface-enhanced laser desorption/ionization）−飛行時間質量分析（time-of-flight mass spectrometry）（以下、「ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ」と称する）を行うことにより、マーカー物質の濃度をより正確に測定することができる。使用できる基板の種類としては、陽イオン交換基板、陰イオン交換基板、順相基板、逆相基板、金属イオン基板、抗体基板等を用いることができるが、陽イオン交換基板、特に弱陽イオン交換基板と、陰イオン交換基板、特に強陰イオン交換基板が好ましく用いられる。
【００７２】
本発明の物質のスクリーニング方法は、本発明の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法によって被験物質を評価し、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する物質をスクリーニングするものである。本発明の物質のスクリーニング方法においても、上記した本発明の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法の実施形態と全く同様の実施形態をとることができる。
【００７３】
本発明の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法を簡便に行なうために、必要な試薬類をまとめて評価用キットを構築することができる。当該評価用キットとしては、例えば、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むものが挙げられる。特に、担体として、ＣＭ等の弱陽イオン交換体、あるいはＱＡやＱＡＥ等の強陰イオン交換体を固定化した基板を含めた評価用キットによれば、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ等を簡便に行なうことができる。本キット中には他の試薬類、例えば、標準物質、前処理用の各種緩衝液等を含めてもよい。なお本キットは、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する物質をスクリーニングするためのキットとしても使用できる。本発明のキットの構成例を以下に挙げる。
【００７４】
〔キットの構成例〕
（１）弱陽イオン交換基板：１枚
（２）強陰イオン交換基板：１枚
（３）基板洗浄用バッファーＡ（ｐＨ３．０）：適量
（４）基板洗浄用バッファーＢ（ｐＨ９．０）：適量
（５）各マーカー物質の標準品：各適量
【００７５】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７６】
１．動物の飼育と体液試料の調製
予備飼育を終えたＣ５７ＢＬ／６マウス（雄、６週齢）を、与える飲水の種類と拘束ストレス付加の有無の組み合わせが異なる以下の４群に分けた。各群の個体数は８以上とした。
【００７７】
第１群：通常飲水（１週間）＋拘束ストレス負荷なし（１７時間）
第２群：通常飲水（１週間）＋拘束ストレス負荷あり（１７時間）
第３群：ケツメイシ抽出物飲水（１週間）＋拘束ストレス負荷あり（１７時間）
第４群：ケツメイシ抽出物飲水（１週間）＋拘束ストレス負荷なし（１７時間）
すなわち、第１群はストレスに起因する症状が発症しない群、第２群はストレスに起因する症状が発症する群、第３群はストレスに起因する症状が抑制される群、に相当する。第４群はケツメイシの作用検証用の群である。
【００７８】
各群について通常飲水（第１群、第２群）又はケツメイシ抽出物飲水（第３群、第４群）を１週間与え、その後１７時間は絶飲絶食すると共に第２群と第３群にのみ拘束ストレス負荷を与えた。第３群と第４群のケツメイシ摂取量は１日１匹あたり２ｍｇ（０．１ｇ／ｋｇ／日）となるようにした。１７時間の拘束ストレス付与又は非付与の後、第１群と第４群について各８匹、第２群と第３群について各９匹のマウスを屠殺した。各マウスから血液を採取し、血漿サンプルを調製した。
【００７９】
２．プロテインチップによる解析とイオンピークの選抜
採取した各血漿サンプル２０μＬに、変性バッファー（９Ｍ 尿素、２％ ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））３０μＬを加えて前処理を行い、タンパク質を変性させた。次に、前処理した各体液試料を強陰イオン交換樹脂カラム（Q-Sepharose、ＧＥヘルスケア社）にアプライした。次いで、ｐＨ９．０の緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％（ｗ／ｖ）１−ｏ−Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、「ＯＧＰ」と称する。））、ｐＨ５．０の緩衝液（１００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、ｐＨ３．０の緩衝液（５０ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、及び有機溶媒（０．１％トリフルオロ酢酸、５０．０％アセトニトリルからなる混合液）各２００μＬで順に溶出させ、画分１（ｐＨ９．０で溶出、素通り）、画分２（ｐＨ５．０で溶出）、画分３（ｐＨ３．０で溶出）、画分４（有機溶媒で溶出）の４つの粗分画画分を得た。
【００８０】
得られた各画分１０μＬをｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファー（５０ｍＭ クエン酸ナトリウム）で１０倍希釈した後、弱陽イオン交換チップＣＭ１０（バイオラッド社）に添加した。同様に、得られた各画分１０μＬをｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））で１０倍希釈した後、強陰イオン交換チップＱ１０（バイオラッド社）に添加した。各チップを各結合バッファーで３回洗浄した後に脱イオン水で１回洗浄し、乾燥させた。次に、エネルギー吸収分子であるシナピン酸（ＳＰＡ−Ｈ、ＳＰＡ−Ｌ）又はα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を添加し、プロテインチップリーダーＭｏｄｅｌ ＰＢＳ ＩＩｃ（バイオラッド社）を用いて、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった。なお、測定分子量範囲（ｍ／ｚ）は、３０００〜２０００００の範囲で行なった。また、測定は２連で行い、ｍ／ｚの平均値を算出した。データ解析は、Protein Chip Software、CiphergenExpress Data Manager、及びBiomarker Patterns Software（いずれもバイオラッド社）を用いて行なった。具体的には、ベースライン補正、分子量校正、スペクトルの正規化処理を行なった後、シングルマーカー解析及び数本のマーカーを組み合わせたマルチフロー解析を行なった。その結果、粗分画画分の種類、プロテインチップの種類、チップの洗浄条件等の組み合わせによって多数のピークが検出された。各ピークについて、ｐ値（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定法）、ＲＯＣ面積、及びイオンピーク強度を算出し、さらに、以下の（１）〜（３）の条件を指標として８個の候補ピークを選抜した。
【００８１】
（１）候補ピーク探索（基本）
第１群と第２群との間でイオン強度に有意差がある（ｐ＜０．０５）。
（２）ケツメイシ効果検証
第２群と第３群との間でイオン強度に有意差があり（ｐ＜０．０５又は０．１）、かつ第３群の値の方が第２群の値よりも第１群の値に近い（第３群の値が第１群側に復帰している）。
（３）増減パターン解析
第２群のみが高値または低値を示し、第１群、第３群および第４群の間ではあまり差がない。なお、第３群と第４群との間に差があっても、第４群の値の方が第３群の値よりも第２群から離れている場合には本条件を満たすものとして取り扱う。
【００８２】
３．マーカー物質（Ｍ１）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が６０２０（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図１に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。図中、髭の上端と下端はそれぞれ最大値と最小値、箱の上辺と下辺はそれぞれ第３四分位（７５パーセンタイル）と第１四分位（２５パーセンタイル）、箱の中の線は中央値である（図２以降も同じ）。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
【００８３】
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．７１２
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．０３２４
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．７４４
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．００８６
【００８４】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約６０２０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ１））が、生体内緊張状態を反映するマーカーとなり得ることがわかった。これにより、「被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物」の体液中におけるマーカー物質（Ｍ１）の濃度を指標として、被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果の評価、並びに、当該効果を有する物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約６０２０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有すると評価することができる。
【００８５】
４．マーカー物質（Ｍ２）の特定
画分１（ｐＨ９．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が９３１２（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図２に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
【００８６】
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．７７１
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．００５８
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．７０１
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０４６２
【００８７】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約９３１０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ２））が、生体内緊張状態を反映するマーカーとなり得ることがわかった。これにより、「被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物」の体液中におけるマーカー物質（Ｍ２）の濃度を指標として、被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果の評価、並びに、当該効果を有する物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約９３１０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有すると評価することができる。
【００８８】
５．マーカー物質（Ｍ３）の特定
画分２（ｐＨ５．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が１３６６４（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図３に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
【００８９】
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．８１９
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．００１３
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．７４４
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．００７２
【００９０】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１３７００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ３））が、生体内緊張状態を反映するマーカーとなり得ることがわかった。これにより、「被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物」の体液中におけるマーカー物質（Ｍ３）の濃度を指標として、被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果の評価、並びに、当該効果を有する物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１３７００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有すると評価することができる。
【００９１】
６．マーカー物質（Ｍ４）の特定
画分２（ｐＨ５．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が１３７６２（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図４に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
【００９２】
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．７７８
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．００５８
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．７０１
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０２９０
【００９３】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１３８００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ４））が、生体内緊張状態を反映するマーカーとなり得ることがわかった。これにより、「被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物」の体液中におけるマーカー物質（Ｍ４）の濃度を指標として、被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果の評価、並びに、当該効果を有する物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１３８００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有すると評価することができる。
【００９４】
７．マーカー物質（Ｍ５）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が１７７２４（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図５に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
【００９５】
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．７９２
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．００５２
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．７０１
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０２６８
【００９６】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１７７００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ５））が、生体内緊張状態を反映するマーカーとなり得ることがわかった。これにより、「被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物」の体液中におけるマーカー物質（Ｍ５）の濃度を指標として、被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果の評価、並びに、当該効果を有する物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１７７００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有すると評価することができる。
【００９７】
８．マーカー物質（Ｍ６）の特定
画分４（有機溶媒）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が１９６３２（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図６に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
【００９８】
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．７５３
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．００７１
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．７０１
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０２９０
【００９９】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１９６００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ６））が、生体内緊張状態を反映するマーカーとなり得ることがわかった。これにより、「被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物」の体液中におけるマーカー物質（Ｍ６）の濃度を指標として、被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果の評価、並びに、当該効果を有する物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１９６００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有すると評価することができる。
【０１００】
９．マーカー物質（Ｍ７）の特定
画分２（ｐＨ５．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が３９９２２（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図７に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
【０１０１】
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．７３６
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．０２２８
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．６６７
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０６１９
【０１０２】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約３９９００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ７））が、生体内緊張状態を反映するマーカーとなり得ることがわかった。これにより、「被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物」の体液中におけるマーカー物質（Ｍ７）の濃度を指標として、被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果の評価、並びに、当該効果を有する物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約３９９００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有すると評価することができる。
【０１０３】
１０．マーカー物質（Ｍ８）の特定
画分１（ｐＨ９．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が７６９５９（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図８に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
【０１０４】
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．７９５
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．００３４
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．６５７
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０６６５
【０１０５】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約７７０００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ８））が、生体内緊張状態を反映するマーカーとなり得ることがわかった。これにより、「被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物」の体液中におけるマーカー物質（Ｍ８）の濃度を指標として、被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果の評価、並びに、当該効果を有する物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約７７０００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有すると評価することができる。
【０１０６】
なお、ヒトの体液中にもマーカー物質（Ｍ１）〜（Ｍ８）と同等のタンパク質が存在する場合には、ヒトの体液中における当該タンパク質の濃度を指標として、生体における緊張状態を診断できる可能性も示唆された。
【実施例２】
【０１０７】
マーカー物質（Ｍ１）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Q-Sepharose HP（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（１ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。ＩＣＲマウスヘパリン血漿（清水実験材料社）５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて変性処理した後、平衡化した前記カラムに添加した。２．５カラム体積（ＣＶ）の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、５ＣＶの１００ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）、及び５ＣＶの５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）で順に洗浄した後、５ＣＶの３３．３％ イソプロパノール／１６．７ アセトニトリル／０．１％ ＴＦＡで溶出した。回収した溶出画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ１）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１０８】
弱陽イオン交換カラムHiTrap CM FF 1mL（ＧＥヘルスケア社）を５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）にて平衡化し、前記溶出画分を添加した。５ＣＶの５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）でカラムを洗浄した後、５ＣＶの５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）／１００ｍＭ ＮａＣｌで溶出し、ピーク画分を分取した。分取した画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ１）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１０９】
分取した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ２Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図９）。図９中、レーン１〜３はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約６．０ｋＤａのバンド（図９の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ１）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１０の矢印）。
【０１１０】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約６．０ｋＤａのバンドを切り出し、還元アルキル化処理した後、０．０１μｇ／μＬのトリプシン溶液（５０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．０）に溶解）を作用させてゲル内で消化した。消化したサンプル１μＬを金属プレート上に滴下し、飽和ＣＨＣＡ溶液０．４μＬをさらに滴下して乾燥させた後、質量分析計Proteomics Analyzer 4700（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも２個のピークが検出され、それらの精密質量は、「１８５０．８４」及び「１９８１．９９」と算出された。これらのデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号８，９で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「血清アルブミン」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第１表に示す。既報の血清アルブミンのアミノ酸配列を配列番号１に示す。さらに、血清アルブミン（配列番号１）のＮ末端側５５アミノ酸に相当するタンパク質断片（配列番号５）の予想される等電点が５．６５、分子量が６０１９であり、これらの値がマーカー物質（Ｍ１）の物性とよく一致した。これにより、マーカー物質（Ｍ１）は血清アルブミンの断片（配列番号５）と最終的に同定された。
【０１１１】
【表１】
【実施例３】
【０１１２】
マーカー物質（Ｍ２）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Q-Ceramic Hyper DF（日本ポール社）を充填したスピンカラム（１ｍＬ）を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。マウス標準血漿（Pel-Freez社）３００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を４５０μＬ加えて変性処理し、平衡化した前記カラムに添加した。素通り画分を回収した。回収した画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ２）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１１３】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、２次元電気泳動（１次元目：Immobiline DryStrip pH6-11, 7cm（ＧＥヘルスケア社）、２次元目：ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ２Ｔ（ＤＲＣ社））を行った（図１１）。矢印で示したスポット（質量：約９．３ｋＤａ、等電点：約５．８）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ２）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１２の矢印）。
【０１１４】
あらためて同様の２次元電気泳動を行って同様のスポットを切り出し、実施例２と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも３個のピークが検出され、それらの精密質量は「１１９３．６６」、「１６５７．７９」、及び「１８３１．９７」と算出された。これらのデータを元に実施例２と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号１０〜１２で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ａ２」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第２表に示す。既報のアポリポタンパク質Ａ２のアミノ酸配列を配列番号７に示す。
【０１１５】
【表２】
【０１１６】
成熟型のアポリポタンパク質Ａ２（配列番号７、分子量：８７３６、等電点：４．９４）は、プロアポリポタンパク質Ａ２（配列番号２）のＮ末端側５アミノ酸からなるプロペプチド（ＡＬＶＫＲ）が切断されて生成される。また、プロアポリポタンパク質Ａ２のＣ末端のＬｙｓは切断され得ることが知られている（Yamagishi et al., Nucleic Acids Research, vol. 14, No. 14, 1986）。プロアポリポタンパク質Ａ２のＣ末端のＬｙｓが脱落したタンパク質断片（配列番号６；プロアポリポタンパク質Ａ２の修飾体）の予想される等電点が５．７６、分子量が９３０４であり、これらの値がマーカー物質（Ｍ２）の物性とよく一致した。これにより、マーカー物質（Ｍ２）はプロアポリポタンパク質Ａ２の断片（配列番号６）と最終的に同定された。
【実施例４】
【０１１７】
マーカー物質（Ｍ３）と（Ｍ４）の精製と同定
強陰イオン交換カラムHiTrap Q HP 1mL（ＧＥヘルスケア社）を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。マウス標準血漿（Pel-Freez社）１ｍＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を１．５ｍＬ加えて変性処理し、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で順に洗浄した後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）／５０ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。溶出画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ３）、（Ｍ４）と同等の質量／電荷比を示す各ピークを確認した。
【０１１８】
分取した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図１３）。図１３中、レーン１〜６はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約１３．８ｋＤａのバンド（図１３の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ３）と同等の質量／電荷比を示すピーク（図１４の矢印ａ）並びにマーカー物質（Ｍ４）と同等の質量／電荷比を示すピーク（図１４の矢印ｂ）を確認した。
【０１１９】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約１３．８ｋＤａのバンドを切り出し、実施例２と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも８個のピークが検出され、それらの精密質量は「１５１０．７５」、「１３８２．６５」、「１５８７．７９」、「２４３８．２５」、「８６９．４６」、「１５５４．８５」、「２５１７．２８」、及び「２５９７．３８」と算出された。これらのデータを元に実施例２と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号１３〜２０で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「トランスサイレチン」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第３表に示す。既報のトランスサイレチンのアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【０１２０】
【表３】
【０１２１】
上述したように、トランスサイレチンについては、その唯一のＣｙｓ残基が修飾を受けた種々の修飾トランスサイレチンが見出されている。その電荷／質量比から、マーカー物質（Ｍ３）は非修飾トランスサイレチン、マーカー物質（Ｍ４）はＳ−スルホン化トランスサイレチンであると考えられた。
【実施例５】
【０１２２】
マーカー物質（Ｍ８）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Q-Sepharose HP（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（８０μＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。マウス標準血漿（Pel-Freez社）４０μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を６０μＬ加えて変性処理した後、平衡化した前記カラムに添加した。素通り画分を回収した。回収した溶出画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ８）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１２３】
溶出画分の一部をアセトン沈殿処理した後、７．５％ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図１５）。図１５中、レーン１，２はいずれも溶出画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約７７ｋＤａのバンド（図１５の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ１）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１６の矢印）。
【０１２４】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約７７ｋＤａのバンドを切り出し、実施例２と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも８個のピークが検出され、それらの精密質量は「８７８．４８」、「９５１．５３」、「１１７１．５８」、「１４１９．７９」、「１５７９．７２」、「１６３９．７８」、「２００８．００」、及び「２７４１．２２」と算出された。これらのデータを元に実施例２と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号２１〜２８で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「トランスフェリン」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第４表に示す。既報のトランスサイレチンのアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【０１２５】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】質量／電荷比が６０２０（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図２】質量／電荷比が９３１２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図３】質量／電荷比が１３６６４（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図４】質量／電荷比が１３７６２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図５】質量／電荷比が１７７２４（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図６】質量／電荷比が１９６３２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図７】質量／電荷比が３９９２２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図８】質量／電荷比が７６９５９（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図９】実施例２で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図１０】実施例２で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図１１】実施例３で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図１２】実施例３で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図１３】実施例４で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図１４】実施例４で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図１５】実施例５で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図１６】実施例６で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法及び評価用キット、並びに、物質のスクリーニング方法に関し、さらに詳細には、被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物から採取した体液における特定のマーカー物質を指標として、被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を評価する生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法、該評価方法を簡便に行うことができる生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価用キット、並びに、該評価方法を用いて生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する物質をスクリーニングする物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ストレスに起因する症状・疾患が増大しており、現代社会における大きな問題となっている。一般に、「ストレス」という用語は２つの意味で使われている。１つは主に生体レベルにおける意味であり、生体において誘起有害作用因子（ストレッサー）に反応する「生体内緊張状態」を指す。もう１つは主に細胞レベルにおける意味であり、作用因子そのものを指す（例：高温ストレス、酸化ストレス）。
【０００３】
生体内緊張状態（生体におけるストレス）を緩和したり、その誘導を抑制したりすることが、ストレスに起因する疾患の予防や治療に有用である。そのために、生体内緊張状態を反映するバイオマーカーに注目が集まっている。すなわち、そのようなバイオマーカーを用いることにより、被験物質が生体内緊張状態を緩和したり、誘導を抑制する効果を有するか否かを容易に調べることが可能となり、食品素材等のスクリーニングに有用である。そして、そのような評価・スクリーニング系で選抜された食品素材を日常的に摂取することで、無用の生体内緊張状態を回避することが可能となる。
【０００４】
生体内緊張状態を反映する血中のマーカーとしては、グルタチオンやコルチゾールが古くから知られている。ただし、これらは低分子化合物であるため代謝が早く、ストレスのない状態における血中濃度の変動が大きい。そこで、ストレスのない状態における変動がより小さいタンパク質のマーカーが探索されており、いくつかのタンパク性ストレスマーカーが見出されている（特許文献１，２）。
【特許文献１】特開平７−１８１１８０号公報
【特許文献２】特開２００７−２２５６０６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、生体内緊張状態を反映するバイオマーカーを新たに特定し、当該バイオマーカーを用いて被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を評価するための一連の技術を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記した課題を解決するための請求項１に記載の発明は、被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物から採取した体液における下記マーカー物質（Ｍ１）〜（Ｍ８）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較することにより、前記被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を評価することを特徴とする生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法である。
（Ｍ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６０２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９３１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３８００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１７７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１９６００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３９９００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ８）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７７０００のイオンピークを生じるタンパク質。
【０００７】
本発明は生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法に係るものであり、被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物から採取した体液における上記（Ｍ１）〜（Ｍ８）の８種のマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、当該被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を評価するものである。上記マーカー物質（Ｍ１）〜（Ｍ９）は、いずれも体液中に存在するタンパク質であり、生体内緊張状態を反映するものである。本発明によれば、被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を、容易かつ高精度に評価することができる。なお、「動物」には、マウス等の飼育可能な動物の他、ヒトも含むものとする。
【０００８】
ここで「生体内緊張状態の緩和効果」とは、緊張状態にある生体に対して緊張を緩和、軽減、抑制等する効果を指し、当該効果によって生体は緊張状態から解放される方向に向かう。また「生体内緊張状態の誘導抑制効果」とは、平静状態にある生体に対して緊張状態が誘導されることを抑制、阻止する効果を指す。当該効果によって、生体は平静状態を維持する方向に向かう。そして本発明では、被験物質が有する「生体内緊張状態の緩和効果」又は「生体内緊張状態の誘導抑制効果」を評価する。
【０００９】
ここで、各マーカー物質における質量／電荷比（以下、「ｍ／ｚ」と略記することもある。）の「約６０２０」、「約１７７００」、「約７７０００」等の値は、質量分析における測定値の誤差範囲を考慮した値であり、概ね±０．２％の幅を有する。すなわち、約６０２０は概ね６０２０±０．２％、約１７７００は概ね１７７００±０．２％、約７７０００は概ね７７０００±０．２％を表す。他の質量／電荷比についても全く同様に、概ね±０．２％の幅を有する。また、これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質である。被験物質が生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する場合、動物の体液中のマーカー物質（Ｍ３）及び（Ｍ４）の濃度はより低値を示し、マーカー物質（Ｍ１）、（Ｍ２）、（Ｍ５）、（Ｍ６）、（Ｍ７）、及び（Ｍ８）の濃度はより高値を示す。
【００１０】
請求項２に記載の発明は、下記（１）〜（５）の少なくとも１つを満たすことを特徴とする請求項１に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法である。
（１）マーカー物質（Ｍ１）は血清アルブミン又はその修飾体である、
（２）マーカー物質（Ｍ２）はプロアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（３）マーカー物質（Ｍ３）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（４）マーカー物質（Ｍ４）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（５）マーカー物質（Ｍ８）はトランスフェリン又はその修飾体である。
【００１１】
血清アルブミン（Serum Albumin）、プロアポリポタンパク質Ａ２（Pro-Apolipoprotein A2）、トランスサイレチン（Transthyretin）、トランスフェリン（Transferrin）はいずれも物理化学的性質がよく知られているので、本発明によればマーカー物質（Ｍ１）、（Ｍ２）、（Ｍ３）、（Ｍ４）、（Ｍ８）の解析が容易である。
【００１２】
「タンパク質の修飾体」の代表例は、当該タンパク質を構成するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されたタンパク質である。「修飾」には化合物や官能基の付加（例：リン酸化）のみならず、脱離（例：脱リン酸化）も含まれる。また「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォームが含まれる。さらに「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質が含まれる。またさらに、「タンパク質又はその修飾体」には、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
【００１３】
同様の課題を解決するための請求項３に記載の発明は、被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物から採取した体液における下記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）のいずれかに属する少なくとも１つの濃度を基準値と比較することにより、前記被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を評価することを特徴とする生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法である。
（Ａ１）血清アルブミン又はその修飾体、
（Ａ２）プロアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ａ３）トランスサイレチン又はその修飾体、
（Ａ４）トランスフェリン又はその修飾体。
【００１４】
本発明も生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法に係るものであり、被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物から採取した体液における上記（Ａ１）〜（Ａ４）のいずれかに属するマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、当該被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を評価するものである。上記（Ａ１）〜（Ａ４）に属するマーカー物質は、いずれも体液中に存在するタンパク質であり、生体内緊張状態を反映するものである。本発明によれば、被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を、容易かつ高精度に評価することができる。特に、血清アルブミン、プロアポリポタンパク質Ａ２、トランスサイレチン、トランスフェリンはいずれも物理化学的性質がよく知られているので、解析が容易である。なお本発明においても、「動物」には、マウス等の飼育可能な動物の他、ヒトも含むものとする。
【００１５】
本発明においても「タンパク質の修飾体」の代表例は、当該タンパク質を構成するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されたタンパク質であり、「修飾」には化合物や官能基の付加のみならず、脱離も含まれる。また「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォーム、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質、並びに、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。さらに、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
【００１６】
前記動物は、被験物質を投与した後にストレスを与えた動物であることが好ましい（請求項４）。
【００１７】
請求項５に記載の発明は、前記基準値は、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有さない既知物質を投与すると共にストレスを与えた動物の体液中における前記マーカー物質の濃度であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法である。
【００１８】
かかる構成により、被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を、より容易かつ高精度に評価することができる。
【００１９】
請求項６に記載の発明は、前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法である。
【００２０】
かかる構成により、測定試料となる体液を簡単に採取でき、より簡便かつ迅速に、被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を評価することができる。
【００２１】
請求項７に記載の発明は、前記被験物質は、食品素材又は医薬品素材であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法である。
【００２２】
かかる構成により、機能性食品又は医薬品の開発を目的として、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を評価することができる。
【００２３】
請求項８に記載の発明は、前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法である。
【００２４】
本発明の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を使用する。そして、該担体に体液又は体液成分を接触させて、体液又は体液成分に含まれるマーカー物質を、マーカー物質に対する親和性を有する物質を介して担体上に捕捉し、捕捉されたマーカー物質の量に基づいて体液中のマーカー物質の濃度を算出する。本発明によれば、担体上に捕捉されたマーカー物質を測定対象とするので、測定試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、体液成分の例としては、体液が血液である場合の血清又は血漿が挙げられる。
【００２５】
請求項９に記載の発明は、前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項８に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法である。
【００２６】
本発明の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法では、平面部分を有する担体を用い、マーカー物質に対する親和性を有する物質は該平面部分の一部に固定化されている。かかる構成により、マーカー物質に対する親和性を有する物質を、担体上の複数箇所にスポット的に固定化することができる。その結果、１個の担体で複数の測定試料を同時処理することや、１個の担体で複数のマーカー物質の濃度を同時測定することが可能となり、作業効率がよい。さらに、各スポットの面積を小さくすることにより、微量の測定試料からでもマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、平面部分を有する担体の例としては、チップ等の基板が挙げられる。
【００２７】
請求項１０に記載の発明は、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項８又は９に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法である。
【００２８】
本発明の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質としてイオン交換体又は抗体を用い、イオン交換体又は抗体を介して測定試料中のマーカー物質を担体上に捕捉する。当該物質がイオン交換体の場合は各種のものが入手容易であり、マーカー物質を捕捉するための担体を容易に調製することができる。また、当該物質が抗体の場合は、より特異的にマーカー物質を捕捉することができる。捕捉されたマーカー物質の量を測定する方法としては、質量分析、イムノアッセイ（抗体の場合）が挙げられる。
【００２９】
請求項１１に記載の発明は、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法によって被験物質を評価し、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法である。
【００３０】
本発明は物質のスクリーニング方法にかかり、動物の体液中における上記（Ｍ１）〜（Ｍ８）の各マーカー物質および上記（Ａ１）〜（Ａ４）に属する各マーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する物質をスクリーニングするものである。上記（Ｍ１）〜（Ｍ８）の各マーカー物質および上記（Ａ１）〜（Ａ４）に属する各マーカー物質は、いずれも体液中に存在するタンパク質であり、生体内緊張状態を反映するものである。本発明の物質のスクリーニング方法によれば、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する物質を、容易かつ高精度にスクリーニングすることができる。例えば、被験物質が食品素材の場合は、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する機能性食品の開発に有用な食品素材をスクリーニングすることができる。
【００３１】
請求項１２に記載の発明は、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とする生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価用キットである。
【００３２】
本発明の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価用キットは、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含む。かかる構成により、マーカー物質の濃度測定に際して当該担体を別途用意する必要がなく、きわめて簡便にマーカー物質の濃度を測定することができる。
【００３３】
請求項１３に記載の発明は、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体であることを特徴とする請求項１２に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価用キットである。
【００３４】
かかる構成により、マーカー物質をより確実に担体上に捕捉することができる。
【００３５】
生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する物質をスクリーニングするために使用される構成が推奨される（請求項１４）。
【発明の効果】
【００３６】
本発明の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法によれば、被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を、容易かつ高精度に評価することができる。
【００３７】
本発明の物質のスクリーニング方法によれば、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する物質を、容易かつ高精度にスクリーニングすることができる。
【００３８】
本発明の生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果の評価用キットによれば、マーカー物質の濃度測定に際して当該担体を別途用意する必要がなく、きわめて簡便にマーカー物質の濃度を測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
以下、本発明を実施するための最良の形態について詳細に説明する。
【００４０】
本発明の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法は２つの様相を含む。１つの様相では、被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物から採取した体液における下記マーカー物質（Ｍ１）〜（Ｍ８）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較することにより、前記被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を評価する。
（Ｍ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６０２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９３１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３８００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１７７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１９６００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３９９００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ８）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７７０００のイオンピークを生じるタンパク質。
【００４１】
これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質であり、生体内緊張状態を反映するものである。なお、（Ｍ３）及び（Ｍ４）の各マーカー物質（以下、これらのマーカー物質からなるグループを「グループ１」と称することがある。）は、生体が緊張状態にある場合により高値を示すものであるので、被験物質が生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する場合には、当該被験物質を投与した動物においてより低値を示す。一方、（Ｍ１）、（Ｍ２）、（Ｍ５）、（Ｍ６）、（Ｍ７）、及び（Ｍ８）の各マーカー物質（以下、これらのマーカー物質からなるグループを「グループ２」と称することがある。）は、生体が緊張状態にある場合により低値を示すものであるので、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する場合には、当該被験物質を投与した動物においてより高値を示す。
【００４２】
ある条件のペプチドマッピングによれば、マーカー物質（Ｍ１）は血清アルブミン、マーカー物質（Ｍ３）と（Ｍ４）はトランスサイレチン、マーカー物質（Ｍ５）はトランスフェリン、と同定され得る。また、ある条件のペプチドマッピングと分子量、等電点の情報から、マーカー物質（Ｍ２）はプロアポリポタンパク質Ａ２と同定され得る。すなわち、ある実施形態では、下記（１）〜（５）の少なくとも１つを満たす。
（１）マーカー物質（Ｍ１）は血清アルブミン又はその修飾体である、
（２）マーカー物質（Ｍ２）はプロアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（３）マーカー物質（Ｍ３）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（４）マーカー物質（Ｍ４）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（５）マーカー物質（Ｍ８）はトランスフェリン又はその修飾体である。
【００４３】
本発明の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法の他の様相では、被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物から採取した体液における下記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）のいずれかに属する少なくとも１つの濃度を基準値と比較することにより、前記被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を評価する。
（Ａ１）血清アルブミン又はその修飾体、
（Ａ２）プロアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ａ３）トランスサイレチン又はその修飾体、
（Ａ４）トランスフェリン又はその修飾体。
【００４４】
なお、マウス由来の血清アルブミン、プロアポリポタンパク質Ａ２、トランスサイレチン、及びトランスフェリンのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１〜４に示すとおりである。
【００４５】
タンパク質の修飾の例としては、Ｎ末端αアミノ基やリジンεアミノ基のメチル化、アセチル化、アデニリル化、ミリスチル化等；セリン・スレオニン・アスパラギンへの糖又は糖鎖の付加；セリン・スレオニン・チロシン・アルギニン・ヒスチジンのリン酸化；システインのシステイニル化、ホモシステイニル化、スルホニル化等；グルタミン酸のγ−カルボキシル化；Ｎ末端グルタミン酸のピログルタミン酸への変換、等が挙げられる。また、これらの修飾の脱離（脱メチル化、糖又は糖鎖の脱離、脱リン酸化等）も「修飾」に含まれる。
【００４６】
「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォームが含まれる。アイソフォームとしては、前記した各種の修飾の他、選択的スプライシングによって生じたタンパク質が挙げられる。さらに、「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質が含まれる。またさらに、「タンパク質又はその修飾体」には、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。例えば、当該タンパク質由来と認められうる長さのタンパク質断片、例えば２０個以上のアミノ酸残基からなるタンパク質断片、分子量が２千以上のタンパク質断片、等が挙げられる。また、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
【００４７】
例えば、血清アルブミン（配列番号１）のアミノ酸番号５５３（Ａｌａ）〜６０８（Ａｌａ）に相当する５５アミノ酸からなるタンパク質断片（配列番号５）は「血清アルブミンの修飾体」に含まれる。
【００４８】
プロアポリポタンパク質Ａ２（配列番号２）のＣ末端アミノ酸残基（Ｌｙｓ）が欠損したタンパク質断片（配列番号６）は、「プロアポリポタンパク質Ａ２の修飾体」に含まれる。
【００４９】
トランスサイレチン（プレアルブミンとも呼ばれる）は分子量約１万４千のサブユニット４個からなる複合タンパク質である。トランスサイレチンについては、その唯一のＣｙｓ残基が修飾を受けた種々の修飾トランスサイレチンが見出されている（Amareth Lim et al., J. Biol. Chem., vol. 258, No. 50, 2003）。後述の実施例４に示したように、マウス由来トランスサイレチン（配列番号３）のＣｙｓ残基にスルホン酸が付加したＳ−スルホン化トランスサイレチンは「トランスサイレチンの修飾体」に含まれる。
【００５０】
本発明の生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果の評価方法では、（Ｍ１）〜（Ｍ８）の各マーカー物質並びに（Ａ１）〜（Ａ４）に属する各マーカー物質の１つだけを用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。複数を用いる場合の組み合わせ方については特に限定はないが、例えば、グループ１から選択したマーカー物質（１つ又は複数）とグループ２から選択したマーカー物質（１つ又は複数）とを組み合わせることができる。
【００５１】
本発明の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法における好ましい実施形態では、上記基準値として、「生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有さない既知物質」（以下、「効果のない既知物質」と称する。）を投与すると共にストレスを与えた動物の体液中における上記マーカー物質の濃度を用いる。すなわち、動物に、効果のない既知物質を投与すると共にストレスを与えた場合、その体液中の上記マーカー物質の濃度は「異常値」となる。そして、被験物質を投与した上記動物における値（測定値）と当該基準値（異常値）とを比較し、測定値が基準値と有意に差がありかつ正常側である場合（正常側に維持された場合）に、当該被験物質が生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有すると評価することができる。具体的には、グループ１に属するマーカー物質を指標とする場合は、測定値が当該基準値に比べて有意に低いときに、一方、グループ２に属するマーカー物質を指標とする場合は、測定値が基準値に比べて有意に高いときに、当該被験物質が生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有すると評価することができる。
【００５２】
さらに、基準値は複数あってもよい。例えば、上記の異常値に加え、ストレスを与えない動物における値（正常値。陰性対照。）を基準値に加えることができる。具体的には、（１）効果のない既知物質又は被験物質を投与すると共にストレスを与えない群（正常値を示す群）、（２）効果のない既知物質を投与すると共にストレスを与える群（異常値を示す群）、及び、（３）被験物質を投与すると共にストレスを与える群、の計３群を設定し、動物を飼育する。そして、各動物の体液中の上記マーカー物質を測定し、各測定値を比較する。このとき、（１）と（２）とで有意差があり、（３）と（２）とで有意差があり、かつ（３）が（２）に比べて正常側（（１）に近い側）である場合（正常側に維持された場合）に、当該被験物質が生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有すると評価することができる。
【００５３】
さらに、基準値として、（４）「生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する既知物質」（効果のある既知物質）を投与すると共にストレスを与える群、における値（陽性対照）を加えることもできる。具体的には、上記（１）〜（３）に加えて、上記（４）の群を設定し、動物を飼育する。このとき、（１）と（２）とで有意差があり、（３）と（２）とで有意差があり、かつ（３）が（２）に比べて正常側（（１）及び（４）に近い側）である場合に、当該被験物質が生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有すると評価することができる。すなわち、このような被験物質は、（４）で採用した上記既知物質と同様の挙動を示し、同様の作用を有する物質といえる。
【００５４】
ここで「生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する既知物質」（効果のある既知物質）を含む素材の例としては、ケツメイシが挙げられる。ケツメイシには血中グルタチオン濃度を増加させる効果があることが知られている（例えば、特開２００４−２２３１号公報）。また、拘束ストレスによって血中グルタチオン濃度が減少することが知られている（道解公一ら，「拘束ストレスによる脳および血液中グルタチオンの応答性」，産業衛生学雑誌，社団法人日本産業衛生学会，２００２年，第４４巻，ｐ．２６２）。
【００５５】
本発明では「被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物」を用いるが、被験物質の投与とストレス付与の順番については特に限定はない。例えば、被験物質の投与後にストレスを与えてもよいし、ストレスを先に与えてから被験物質を投与してもよい。被験物質の投与と並行してストレスを与えてもよい。被験物質の投与経路としては、経口投与が代表的であるが、他の経路によって投与してもよい。
【００５６】
動物に与えるストレス（作用因子）の種類としては特に限定はなく、例えば、拘束、行動制限、騒音、寒冷のような物理的ストレス、薬物投与のような化学的ストレス、炎症、感染のような生物的ストレス、不安、怒りのような心理的ストレス、を挙げることができる。
【００５７】
「被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物」における動物の種類には特に限定はなく、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ等を採用することができる。さらに、動物としてヒトを採用することもできる。この場合には、臨床試験の結果によって被験物質が有する効果を評価することになる。
【００５８】
本発明の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法において使用する動物の体液としては、血液が好ましく用いられる。特に、血液から調製した血清又は血漿（体液成分）を測定試料とすることが好ましい。血清又は血漿は遠心分離等の公知の方法で血液から調製することができる。
【００５９】
本発明の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法における被験物質としては、食品素材、医薬品素材などが挙げられる。例えば、食品素材を評価対象とする場合は、機能性食品の開発に役立てることができる。
【００６０】
本発明の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法において、マーカー物質の濃度を測定する方法は、そのマーカー物質の濃度を特異的に測定できる方法であれば、タンパク質の定量に一般に用いられている方法をそのまま用いることができる。例えば、各種のイムノアッセイ、質量分析（ＭＳ）、クロマトグラフィー、電気泳動等を用いることができる。
【００６１】
イムノアッセイによれば、夾雑物質の多い試料のままでも正確にマーカー物質の濃度を測定することができる。イムノアッセイの例としては、抗原抗体結合物を直接的又は間接的に測定する沈降反応、凝集反応、溶血反応などの古典的な方法や、標識法と組み合わせて検出感度を高めたエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）等の方法が挙げられる。なお、これらのイムノアッセイに用いるマーカー物質に特異的な抗体は、モノクローナルでもよいし、ポリクローナルでもよい。
【００６２】
質量分析によれば、各マーカー物質由来のイオンピークを特定し、そのイオンピーク強度をもって各マーカー物質の量（濃度）を測定することができる。質量分析によってマーカー物質の濃度を測定する場合のイオン化の方法としては、マトリクス支援レーザーイオン化（matrix-assisted laser desorption/ionization、ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化（electrospray ionization、ＥＳＩ）のいずれも適用可能であるが、多価イオンの生成が少ないＭＡＬＤＩが好ましい。特に、飛行時間質量分析計（time-of-flight mass spectrometer、ＴＯＦ）と組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによれば、より正確にマーカー物質由来のイオンピークを特定することができる。
【００６３】
電気泳動によりマーカー物質の濃度を測定する場合は、例えば、検査材料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供して目的のマーカー物質を分離し、適宜の色素や蛍光物質でゲルを染色し、目的のマーカー物質に相当するバンドの濃さや蛍光強度を測定すればよい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥだけではマーカー物質の分離が不十分な場合は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）と組み合わせた２次元電気泳動を用いることもできる。さらに、ゲルから直接検出するのではなく、ウエスタンブロッティングを行って膜上のマーカー物質の量を測定することもできる。
【００６４】
クロマトグラフィーによってマーカー物質の濃度を測定する場合は、例えば、液体高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法を用いることができる。すなわち、試料をＨＰＬＣに供して目的のマーカー物質を分離し、そのクロマトグラムのピーク面積を測定することにより試料中のマーカー物質の濃度を測定することができる。
【００６５】
好ましい実施形態では、マーカー物質を担体上に捕捉し、その捕捉されたマーカー物質を測定対象とする。すなわち、マーカー物質に対する親和性を有する物質を担体に固定化し、その親和性を有する物質を介してマーカー物質を担体上に捕捉する。そして、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出する。本実施形態によれば、試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。本実施形態において用いることができる担体の例としては、ビーズ、金属、ガラス、樹脂等のような一般的なものの他、基板のような、平面部分を有する担体を用いることができる。基板を用いる場合は、その平面部分の一部にマーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化することが好ましい。例としては、基板としてチップを用い、その表面の複数箇所にスポット的にマーカー物質に親和性を有する物質を固定化した担体が挙げられる。なお「親和性」の例としては、イオン結合、金属キレート体とタンパク質中のヒスチジン残基等とのアフィニティ、抗原と抗体、酵素と基質、若しくはホルモンとレセプターのようなバイオアフィニティ、及び、疎水性相互作用のような化学的な相互作用、が挙げられる。
【００６６】
イオン結合によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、イオン交換体を担体に固定化する。この場合、イオン交換体には陽イオン交換体、陰イオン交換体のいずれも用いることができ、さらに、強陽イオン交換体、弱陽イオン交換体、強陰イオン交換体、弱陰イオン交換体のいずれも用いることができるが、強陰イオン交換体と弱陽イオン交換体が好ましく用いられる。強陰イオン交換体の例としては、４級アンモニウム（トリメチルアミノメチル）（ＱＡ）、４級アミノエチル（ジエチル，モノ・２−ヒドロキシブチルアミノエチル）（ＱＡＥ）、４級アンモニウム（トリメチルアンモニウム）（ＱＭＡ）等の強陰イオン交換基を有するものが挙げられる。また、弱陽イオン交換体の例としては、カルボキシメチル（ＣＭ）等の弱陽イオン交換基を有するものが挙げられる。また、強陽イオン交換体の例としては、スルホプロピル（ＳＰ）等の強陽イオン交換基を有するものが挙げられる。さらに、弱陰イオン交換体の例としては、ジメチルアミノエチル（ＤＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）等の弱陰イオン交換基を有するものが挙げられる。
【００６７】
金属キレート体を介してマーカー物質を捕捉する場合は、例えば、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、Ｎｉ2+、Ｃｏ2+、Ａｌ3+、Ｆｅ3+、Ｇａ3+等の金属キレート体を固定化した担体を用いることができる。
【００６８】
抗体によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、マーカー物質に特異的な抗体を担体に固定化すればよい。
【００６９】
疎水性相互作用によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、担体に疎水基をもつ物質を固定化する。疎水基の例としては、Ｃ４〜Ｃ２０のアルキル基、フェニル基等が挙げられる。
【００７０】
本実施形態においてマーカー物質の測定方法にイムノアッセイを用いる場合は、抗体を固定化した担体を用いることが好ましい。このようにすれば、担体に固定化された抗体を１次抗体としたイムノアッセイの系を簡単に構築することができる。例えば、マーカー物質に特異的でエピトープの異なる２種類の抗体を用意し、一方を１次抗体として担体に固定化し、他方を２次抗体として酵素標識し、サンドイッチＥＩＡの系を構築することができる。その他、結合阻止法や競合法によるイムノアッセイの系も構築可能である。さらに、担体として基板を用いる場合は、抗体チップによるイムノアッセイが可能である。抗体チップによれば、複数のマーカー物質の濃度を同時に測定でき、迅速な測定が可能である。
【００７１】
一方、本実施形態において質量分析を用いる場合は、例えば、抗体の他、イオン交換体、金属キレート体又は疎水基を固定化した担体を用いることができる。なお、これらの物質による結合は抗原と抗体等のバイオアフィニティほどの特異性がないので、これらの物質を固定化した担体を用いる場合はマーカー物質以外の物質も担体上に捕捉されうるが、質量分析によれば分子量を反映した質量分析計スペクトルによって定量するので、問題はない。特に、担体として基板を用い、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化（surface-enhanced laser desorption/ionization）−飛行時間質量分析（time-of-flight mass spectrometry）（以下、「ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ」と称する）を行うことにより、マーカー物質の濃度をより正確に測定することができる。使用できる基板の種類としては、陽イオン交換基板、陰イオン交換基板、順相基板、逆相基板、金属イオン基板、抗体基板等を用いることができるが、陽イオン交換基板、特に弱陽イオン交換基板と、陰イオン交換基板、特に強陰イオン交換基板が好ましく用いられる。
【００７２】
本発明の物質のスクリーニング方法は、本発明の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法によって被験物質を評価し、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する物質をスクリーニングするものである。本発明の物質のスクリーニング方法においても、上記した本発明の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法の実施形態と全く同様の実施形態をとることができる。
【００７３】
本発明の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法を簡便に行なうために、必要な試薬類をまとめて評価用キットを構築することができる。当該評価用キットとしては、例えば、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むものが挙げられる。特に、担体として、ＣＭ等の弱陽イオン交換体、あるいはＱＡやＱＡＥ等の強陰イオン交換体を固定化した基板を含めた評価用キットによれば、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ等を簡便に行なうことができる。本キット中には他の試薬類、例えば、標準物質、前処理用の各種緩衝液等を含めてもよい。なお本キットは、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する物質をスクリーニングするためのキットとしても使用できる。本発明のキットの構成例を以下に挙げる。
【００７４】
〔キットの構成例〕
（１）弱陽イオン交換基板：１枚
（２）強陰イオン交換基板：１枚
（３）基板洗浄用バッファーＡ（ｐＨ３．０）：適量
（４）基板洗浄用バッファーＢ（ｐＨ９．０）：適量
（５）各マーカー物質の標準品：各適量
【００７５】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７６】
１．動物の飼育と体液試料の調製
予備飼育を終えたＣ５７ＢＬ／６マウス（雄、６週齢）を、与える飲水の種類と拘束ストレス付加の有無の組み合わせが異なる以下の４群に分けた。各群の個体数は８以上とした。
【００７７】
第１群：通常飲水（１週間）＋拘束ストレス負荷なし（１７時間）
第２群：通常飲水（１週間）＋拘束ストレス負荷あり（１７時間）
第３群：ケツメイシ抽出物飲水（１週間）＋拘束ストレス負荷あり（１７時間）
第４群：ケツメイシ抽出物飲水（１週間）＋拘束ストレス負荷なし（１７時間）
すなわち、第１群はストレスに起因する症状が発症しない群、第２群はストレスに起因する症状が発症する群、第３群はストレスに起因する症状が抑制される群、に相当する。第４群はケツメイシの作用検証用の群である。
【００７８】
各群について通常飲水（第１群、第２群）又はケツメイシ抽出物飲水（第３群、第４群）を１週間与え、その後１７時間は絶飲絶食すると共に第２群と第３群にのみ拘束ストレス負荷を与えた。第３群と第４群のケツメイシ摂取量は１日１匹あたり２ｍｇ（０．１ｇ／ｋｇ／日）となるようにした。１７時間の拘束ストレス付与又は非付与の後、第１群と第４群について各８匹、第２群と第３群について各９匹のマウスを屠殺した。各マウスから血液を採取し、血漿サンプルを調製した。
【００７９】
２．プロテインチップによる解析とイオンピークの選抜
採取した各血漿サンプル２０μＬに、変性バッファー（９Ｍ 尿素、２％ ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））３０μＬを加えて前処理を行い、タンパク質を変性させた。次に、前処理した各体液試料を強陰イオン交換樹脂カラム（Q-Sepharose、ＧＥヘルスケア社）にアプライした。次いで、ｐＨ９．０の緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％（ｗ／ｖ）１−ｏ−Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、「ＯＧＰ」と称する。））、ｐＨ５．０の緩衝液（１００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、ｐＨ３．０の緩衝液（５０ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、及び有機溶媒（０．１％トリフルオロ酢酸、５０．０％アセトニトリルからなる混合液）各２００μＬで順に溶出させ、画分１（ｐＨ９．０で溶出、素通り）、画分２（ｐＨ５．０で溶出）、画分３（ｐＨ３．０で溶出）、画分４（有機溶媒で溶出）の４つの粗分画画分を得た。
【００８０】
得られた各画分１０μＬをｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファー（５０ｍＭ クエン酸ナトリウム）で１０倍希釈した後、弱陽イオン交換チップＣＭ１０（バイオラッド社）に添加した。同様に、得られた各画分１０μＬをｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））で１０倍希釈した後、強陰イオン交換チップＱ１０（バイオラッド社）に添加した。各チップを各結合バッファーで３回洗浄した後に脱イオン水で１回洗浄し、乾燥させた。次に、エネルギー吸収分子であるシナピン酸（ＳＰＡ−Ｈ、ＳＰＡ−Ｌ）又はα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を添加し、プロテインチップリーダーＭｏｄｅｌ ＰＢＳ ＩＩｃ（バイオラッド社）を用いて、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった。なお、測定分子量範囲（ｍ／ｚ）は、３０００〜２０００００の範囲で行なった。また、測定は２連で行い、ｍ／ｚの平均値を算出した。データ解析は、Protein Chip Software、CiphergenExpress Data Manager、及びBiomarker Patterns Software（いずれもバイオラッド社）を用いて行なった。具体的には、ベースライン補正、分子量校正、スペクトルの正規化処理を行なった後、シングルマーカー解析及び数本のマーカーを組み合わせたマルチフロー解析を行なった。その結果、粗分画画分の種類、プロテインチップの種類、チップの洗浄条件等の組み合わせによって多数のピークが検出された。各ピークについて、ｐ値（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定法）、ＲＯＣ面積、及びイオンピーク強度を算出し、さらに、以下の（１）〜（３）の条件を指標として８個の候補ピークを選抜した。
【００８１】
（１）候補ピーク探索（基本）
第１群と第２群との間でイオン強度に有意差がある（ｐ＜０．０５）。
（２）ケツメイシ効果検証
第２群と第３群との間でイオン強度に有意差があり（ｐ＜０．０５又は０．１）、かつ第３群の値の方が第２群の値よりも第１群の値に近い（第３群の値が第１群側に復帰している）。
（３）増減パターン解析
第２群のみが高値または低値を示し、第１群、第３群および第４群の間ではあまり差がない。なお、第３群と第４群との間に差があっても、第４群の値の方が第３群の値よりも第２群から離れている場合には本条件を満たすものとして取り扱う。
【００８２】
３．マーカー物質（Ｍ１）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が６０２０（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図１に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。図中、髭の上端と下端はそれぞれ最大値と最小値、箱の上辺と下辺はそれぞれ第３四分位（７５パーセンタイル）と第１四分位（２５パーセンタイル）、箱の中の線は中央値である（図２以降も同じ）。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
【００８３】
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．７１２
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．０３２４
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．７４４
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．００８６
【００８４】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約６０２０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ１））が、生体内緊張状態を反映するマーカーとなり得ることがわかった。これにより、「被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物」の体液中におけるマーカー物質（Ｍ１）の濃度を指標として、被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果の評価、並びに、当該効果を有する物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約６０２０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有すると評価することができる。
【００８５】
４．マーカー物質（Ｍ２）の特定
画分１（ｐＨ９．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が９３１２（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図２に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
【００８６】
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．７７１
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．００５８
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．７０１
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０４６２
【００８７】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約９３１０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ２））が、生体内緊張状態を反映するマーカーとなり得ることがわかった。これにより、「被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物」の体液中におけるマーカー物質（Ｍ２）の濃度を指標として、被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果の評価、並びに、当該効果を有する物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約９３１０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有すると評価することができる。
【００８８】
５．マーカー物質（Ｍ３）の特定
画分２（ｐＨ５．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が１３６６４（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図３に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
【００８９】
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．８１９
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．００１３
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．７４４
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．００７２
【００９０】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１３７００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ３））が、生体内緊張状態を反映するマーカーとなり得ることがわかった。これにより、「被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物」の体液中におけるマーカー物質（Ｍ３）の濃度を指標として、被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果の評価、並びに、当該効果を有する物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１３７００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有すると評価することができる。
【００９１】
６．マーカー物質（Ｍ４）の特定
画分２（ｐＨ５．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が１３７６２（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図４に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
【００９２】
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．７７８
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．００５８
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．７０１
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０２９０
【００９３】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１３８００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ４））が、生体内緊張状態を反映するマーカーとなり得ることがわかった。これにより、「被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物」の体液中におけるマーカー物質（Ｍ４）の濃度を指標として、被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果の評価、並びに、当該効果を有する物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１３８００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有すると評価することができる。
【００９４】
７．マーカー物質（Ｍ５）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が１７７２４（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図５に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
【００９５】
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．７９２
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．００５２
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．７０１
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０２６８
【００９６】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１７７００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ５））が、生体内緊張状態を反映するマーカーとなり得ることがわかった。これにより、「被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物」の体液中におけるマーカー物質（Ｍ５）の濃度を指標として、被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果の評価、並びに、当該効果を有する物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１７７００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有すると評価することができる。
【００９７】
８．マーカー物質（Ｍ６）の特定
画分４（有機溶媒）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が１９６３２（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図６に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
【００９８】
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．７５３
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．００７１
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．７０１
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０２９０
【００９９】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１９６００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ６））が、生体内緊張状態を反映するマーカーとなり得ることがわかった。これにより、「被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物」の体液中におけるマーカー物質（Ｍ６）の濃度を指標として、被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果の評価、並びに、当該効果を有する物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１９６００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有すると評価することができる。
【０１００】
９．マーカー物質（Ｍ７）の特定
画分２（ｐＨ５．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が３９９２２（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図７に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
【０１０１】
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．７３６
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．０２２８
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．６６７
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０６１９
【０１０２】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約３９９００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ７））が、生体内緊張状態を反映するマーカーとなり得ることがわかった。これにより、「被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物」の体液中におけるマーカー物質（Ｍ７）の濃度を指標として、被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果の評価、並びに、当該効果を有する物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約３９９００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有すると評価することができる。
【０１０３】
１０．マーカー物質（Ｍ８）の特定
画分１（ｐＨ９．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が７６９５９（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図８に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
【０１０４】
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．７９５
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．００３４
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．６５７
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０６６５
【０１０５】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約７７０００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍ８））が、生体内緊張状態を反映するマーカーとなり得ることがわかった。これにより、「被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物」の体液中におけるマーカー物質（Ｍ８）の濃度を指標として、被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果の評価、並びに、当該効果を有する物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約７７０００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有すると評価することができる。
【０１０６】
なお、ヒトの体液中にもマーカー物質（Ｍ１）〜（Ｍ８）と同等のタンパク質が存在する場合には、ヒトの体液中における当該タンパク質の濃度を指標として、生体における緊張状態を診断できる可能性も示唆された。
【実施例２】
【０１０７】
マーカー物質（Ｍ１）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Q-Sepharose HP（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（１ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。ＩＣＲマウスヘパリン血漿（清水実験材料社）５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて変性処理した後、平衡化した前記カラムに添加した。２．５カラム体積（ＣＶ）の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、５ＣＶの１００ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）、及び５ＣＶの５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）で順に洗浄した後、５ＣＶの３３．３％ イソプロパノール／１６．７ アセトニトリル／０．１％ ＴＦＡで溶出した。回収した溶出画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ１）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１０８】
弱陽イオン交換カラムHiTrap CM FF 1mL（ＧＥヘルスケア社）を５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）にて平衡化し、前記溶出画分を添加した。５ＣＶの５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）でカラムを洗浄した後、５ＣＶの５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）／１００ｍＭ ＮａＣｌで溶出し、ピーク画分を分取した。分取した画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ１）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１０９】
分取した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ２Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図９）。図９中、レーン１〜３はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約６．０ｋＤａのバンド（図９の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ１）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１０の矢印）。
【０１１０】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約６．０ｋＤａのバンドを切り出し、還元アルキル化処理した後、０．０１μｇ／μＬのトリプシン溶液（５０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．０）に溶解）を作用させてゲル内で消化した。消化したサンプル１μＬを金属プレート上に滴下し、飽和ＣＨＣＡ溶液０．４μＬをさらに滴下して乾燥させた後、質量分析計Proteomics Analyzer 4700（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも２個のピークが検出され、それらの精密質量は、「１８５０．８４」及び「１９８１．９９」と算出された。これらのデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号８，９で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「血清アルブミン」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第１表に示す。既報の血清アルブミンのアミノ酸配列を配列番号１に示す。さらに、血清アルブミン（配列番号１）のＮ末端側５５アミノ酸に相当するタンパク質断片（配列番号５）の予想される等電点が５．６５、分子量が６０１９であり、これらの値がマーカー物質（Ｍ１）の物性とよく一致した。これにより、マーカー物質（Ｍ１）は血清アルブミンの断片（配列番号５）と最終的に同定された。
【０１１１】
【表１】
【実施例３】
【０１１２】
マーカー物質（Ｍ２）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Q-Ceramic Hyper DF（日本ポール社）を充填したスピンカラム（１ｍＬ）を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。マウス標準血漿（Pel-Freez社）３００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を４５０μＬ加えて変性処理し、平衡化した前記カラムに添加した。素通り画分を回収した。回収した画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ２）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１１３】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、２次元電気泳動（１次元目：Immobiline DryStrip pH6-11, 7cm（ＧＥヘルスケア社）、２次元目：ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ２Ｔ（ＤＲＣ社））を行った（図１１）。矢印で示したスポット（質量：約９．３ｋＤａ、等電点：約５．８）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ２）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１２の矢印）。
【０１１４】
あらためて同様の２次元電気泳動を行って同様のスポットを切り出し、実施例２と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも３個のピークが検出され、それらの精密質量は「１１９３．６６」、「１６５７．７９」、及び「１８３１．９７」と算出された。これらのデータを元に実施例２と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号１０〜１２で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ａ２」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第２表に示す。既報のアポリポタンパク質Ａ２のアミノ酸配列を配列番号７に示す。
【０１１５】
【表２】
【０１１６】
成熟型のアポリポタンパク質Ａ２（配列番号７、分子量：８７３６、等電点：４．９４）は、プロアポリポタンパク質Ａ２（配列番号２）のＮ末端側５アミノ酸からなるプロペプチド（ＡＬＶＫＲ）が切断されて生成される。また、プロアポリポタンパク質Ａ２のＣ末端のＬｙｓは切断され得ることが知られている（Yamagishi et al., Nucleic Acids Research, vol. 14, No. 14, 1986）。プロアポリポタンパク質Ａ２のＣ末端のＬｙｓが脱落したタンパク質断片（配列番号６；プロアポリポタンパク質Ａ２の修飾体）の予想される等電点が５．７６、分子量が９３０４であり、これらの値がマーカー物質（Ｍ２）の物性とよく一致した。これにより、マーカー物質（Ｍ２）はプロアポリポタンパク質Ａ２の断片（配列番号６）と最終的に同定された。
【実施例４】
【０１１７】
マーカー物質（Ｍ３）と（Ｍ４）の精製と同定
強陰イオン交換カラムHiTrap Q HP 1mL（ＧＥヘルスケア社）を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。マウス標準血漿（Pel-Freez社）１ｍＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を１．５ｍＬ加えて変性処理し、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で順に洗浄した後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）／５０ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。溶出画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ３）、（Ｍ４）と同等の質量／電荷比を示す各ピークを確認した。
【０１１８】
分取した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図１３）。図１３中、レーン１〜６はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約１３．８ｋＤａのバンド（図１３の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ３）と同等の質量／電荷比を示すピーク（図１４の矢印ａ）並びにマーカー物質（Ｍ４）と同等の質量／電荷比を示すピーク（図１４の矢印ｂ）を確認した。
【０１１９】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約１３．８ｋＤａのバンドを切り出し、実施例２と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも８個のピークが検出され、それらの精密質量は「１５１０．７５」、「１３８２．６５」、「１５８７．７９」、「２４３８．２５」、「８６９．４６」、「１５５４．８５」、「２５１７．２８」、及び「２５９７．３８」と算出された。これらのデータを元に実施例２と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号１３〜２０で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「トランスサイレチン」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第３表に示す。既報のトランスサイレチンのアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【０１２０】
【表３】
【０１２１】
上述したように、トランスサイレチンについては、その唯一のＣｙｓ残基が修飾を受けた種々の修飾トランスサイレチンが見出されている。その電荷／質量比から、マーカー物質（Ｍ３）は非修飾トランスサイレチン、マーカー物質（Ｍ４）はＳ−スルホン化トランスサイレチンであると考えられた。
【実施例５】
【０１２２】
マーカー物質（Ｍ８）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Q-Sepharose HP（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（８０μＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。マウス標準血漿（Pel-Freez社）４０μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を６０μＬ加えて変性処理した後、平衡化した前記カラムに添加した。素通り画分を回収した。回収した溶出画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ８）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１２３】
溶出画分の一部をアセトン沈殿処理した後、７．５％ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図１５）。図１５中、レーン１，２はいずれも溶出画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約７７ｋＤａのバンド（図１５の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍ１）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１６の矢印）。
【０１２４】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約７７ｋＤａのバンドを切り出し、実施例２と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも８個のピークが検出され、それらの精密質量は「８７８．４８」、「９５１．５３」、「１１７１．５８」、「１４１９．７９」、「１５７９．７２」、「１６３９．７８」、「２００８．００」、及び「２７４１．２２」と算出された。これらのデータを元に実施例２と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号２１〜２８で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「トランスフェリン」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第４表に示す。既報のトランスサイレチンのアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【０１２５】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】質量／電荷比が６０２０（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図２】質量／電荷比が９３１２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図３】質量／電荷比が１３６６４（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図４】質量／電荷比が１３７６２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図５】質量／電荷比が１７７２４（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図６】質量／電荷比が１９６３２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図７】質量／電荷比が３９９２２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図８】質量／電荷比が７６９５９（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図９】実施例２で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図１０】実施例２で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図１１】実施例３で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図１２】実施例３で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図１３】実施例４で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図１４】実施例４で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図１５】実施例５で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図１６】実施例６で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物から採取した体液における下記マーカー物質（Ｍ１）〜（Ｍ８）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較することにより、前記被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を評価することを特徴とする生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法。
（Ｍ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６０２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９３１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３８００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１７７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１９６００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３９９００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ８）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７７０００のイオンピークを生じるタンパク質。
【請求項２】
下記（１）〜（５）の少なくとも１つを満たすことを特徴とする請求項１に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法。
（１）マーカー物質（Ｍ１）は血清アルブミン又はその修飾体である、
（２）マーカー物質（Ｍ２）はプロアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（３）マーカー物質（Ｍ３）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（４）マーカー物質（Ｍ４）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（５）マーカー物質（Ｍ８）はトランスフェリン又はその修飾体である。
【請求項３】
被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物から採取した体液における下記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）のいずれかに属する少なくとも１つの濃度を基準値と比較することにより、前記被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を評価することを特徴とする生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法。
（Ａ１）血清アルブミン又はその修飾体、
（Ａ２）プロアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ａ３）トランスサイレチン又はその修飾体、
（Ａ４）トランスフェリン又はその修飾体。
【請求項４】
前記動物は、被験物質を投与した後にストレスを与えた動物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法。
【請求項５】
前記基準値は、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有さない既知物質を投与すると共にストレスを与えた動物の体液中における前記マーカー物質の濃度であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法。
【請求項６】
前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法。
【請求項７】
前記被験物質は、食品素材又は医薬品素材であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法。
【請求項８】
前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法。
【請求項９】
前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項８に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法。
【請求項１０】
前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項８又は９に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法によって被験物質を評価し、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とする生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価用キット。
【請求項１３】
前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体であることを特徴とする請求項１２に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価用キット。
【請求項１４】
生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する物質をスクリーニングするために使用されることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価用キット。
【請求項１】
被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物から採取した体液における下記マーカー物質（Ｍ１）〜（Ｍ８）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較することにより、前記被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を評価することを特徴とする生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法。
（Ｍ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６０２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９３１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３８００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１７７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１９６００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３９９００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍ８）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７７０００のイオンピークを生じるタンパク質。
【請求項２】
下記（１）〜（５）の少なくとも１つを満たすことを特徴とする請求項１に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法。
（１）マーカー物質（Ｍ１）は血清アルブミン又はその修飾体である、
（２）マーカー物質（Ｍ２）はプロアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（３）マーカー物質（Ｍ３）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（４）マーカー物質（Ｍ４）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（５）マーカー物質（Ｍ８）はトランスフェリン又はその修飾体である。
【請求項３】
被験物質を投与すると共にストレスを与えた動物から採取した体液における下記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）のいずれかに属する少なくとも１つの濃度を基準値と比較することにより、前記被験物質が有する生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を評価することを特徴とする生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法。
（Ａ１）血清アルブミン又はその修飾体、
（Ａ２）プロアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ａ３）トランスサイレチン又はその修飾体、
（Ａ４）トランスフェリン又はその修飾体。
【請求項４】
前記動物は、被験物質を投与した後にストレスを与えた動物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法。
【請求項５】
前記基準値は、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有さない既知物質を投与すると共にストレスを与えた動物の体液中における前記マーカー物質の濃度であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法。
【請求項６】
前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法。
【請求項７】
前記被験物質は、食品素材又は医薬品素材であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法。
【請求項８】
前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法。
【請求項９】
前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項８に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法。
【請求項１０】
前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項８又は９に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法によって被験物質を評価し、生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とする生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価用キット。
【請求項１３】
前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体であることを特徴とする請求項１２に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価用キット。
【請求項１４】
生体内緊張状態の緩和効果又は誘導抑制効果を有する物質をスクリーニングするために使用されることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の生体内緊張状態の緩和・誘導抑制効果の評価用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１０】
【図１２】
【図１４】
【図１６】
【図９】
【図１１】
【図１３】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１０】
【図１２】
【図１４】
【図１６】
【図９】
【図１１】
【図１３】
【図１５】
【公開番号】特開２０１０−５４２４５（Ｐ２０１０−５４２４５Ａ）
【公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２１７２０４（Ｐ２００８−２１７２０４）
【出願日】平成２０年８月２６日（２００８．８．２６）
【出願人】（３０３０５８７０８）株式会社バイオマーカーサイエンス (27)
【出願人】（５９６１５６１７４）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月２６日（２００８．８．２６）
【出願人】（３０３０５８７０８）株式会社バイオマーカーサイエンス (27)
【出願人】（５９６１５６１７４）
【Ｆターム（参考）】
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