生体成分含有溶液の前処理方法および分析溶液精製方法
【課題】臨床プロテオーム解析をする際に微量成分の検出に対して妨害となる物質を取り除かれた溶液を得る方法を提供する。
【解決手段】原液が分画溶液循環回路内で過剰に濃縮、希釈されないようにし、濃度分極を適正な範囲に保持することによって、分子量の高い妨害物質を効率よく除去する。本分離膜により得られた溶液は、質量分析、電気泳動、液体クロマトグラフィー等のタンパク質分析に用いられ、高感度の分析が可能になる。
【解決手段】原液が分画溶液循環回路内で過剰に濃縮、希釈されないようにし、濃度分極を適正な範囲に保持することによって、分子量の高い妨害物質を効率よく除去する。本分離膜により得られた溶液は、質量分析、電気泳動、液体クロマトグラフィー等のタンパク質分析に用いられ、高感度の分析が可能になる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体成分含有溶液、特にヒトの血液、尿等から特定の生体成分を分離して分析用溶液を得るにあたって好適に用いることができる生体成分含有溶液の前処理方法および分析溶液精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ポストゲノム研究として、プロテオーム解析研究（プロテオミクス）が注目され始めた。遺伝子産物であるタンパク質は遺伝子よりも疾患の病態に直接リンクしていると考えられることから、タンパク質を網羅的に調べるプロテオーム解析の研究成果は診断と治療に広く応用できると期待されている。しかも、ゲノム解析では発見できなかった病因タンパク質や疾患関連因子を多く発見できる可能性が高い。
【０００３】
プロテオーム解析が急速に進展しだしたのは、質量分析装置（mass spectrometer: MS）による高速構造分析が可能となってきたことが大きく影響している。たとえば、MALDI-TOF-MS (matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry) 等の実用化によって、ポリペプチドのハイスルースループット超微量分析が可能となり、従来検出し得なかった微量タンパク質までもが同定可能となり、疾患関連因子の探索に強力なツールとなってきている。
【０００４】
ところで、プロテオーム解析の臨床応用の第一目的は、疾患によって誘導あるいは消失するバイオマーカータンパク質の発見である。バイオマーカータンパク質は、病態に関連して挙動するため、診断のマーカーとなり得るほか、創薬ターゲットとなる可能性も高い。すなわち、プロテオーム解析の成果は、特定遺伝子よりも診断マーカーや創薬ターゲットとなる可能性が高いため、ポストゲノム時代の診断と治療の切り札技術となり、同定されたバイオマーカータンパク質は患者の薬剤応答性評価や副作用発現予測という直接的に患者が享受しえる利益につながることから、いわゆるテーラーメード医療の推進に大きな役割を果たすといえる。
【０００５】
しかしながら、臨床研究にプロテオーム解析を導入する場合には、大量の検体を迅速、確実に解析することが求められており、しかも個々の臨床検体（生体成分含有溶液）は微量で貴重なために高感度な測定を迅速に行う必要がある。そのため、超高感度でハイスループットの特性を有する質量分析装置が急速に改良されてきてはいるものの、プロテオーム解析が臨床現場で簡便かつ迅速に実施できる状況には、まだない。
【０００６】
すなわち、質量分析にかける前には臨床検体（生体成分含有溶液）中のタンパク質やペプチド等を分画し精製することが必要で、この処理には数日かかるうえに、この前処理の操作は煩雑で経験も必要とされる。
さらに、血液や体液などの生体成分含有溶液に含まれるタンパク質やペプチドは、多様なために分画精製が容易でないといった問題もある。たとえば、ヒト・タンパク質は10万種以上とも推定されているが、血清中に含まれるタンパク質だけでも約1万種類にものぼるといわれ、タンパク質総量の血清中濃度は約60〜80mg/mLである。そして、ヒト血清中の高含量のタンパク質は、アルブミン(分子量67kDa)、免疫グロブリン(150〜190kDa)、トランスフェリン(80kDa)、ハプトグロビン(>85kDa)、リポタンパク質(数100kDa)等であり、いずれも１mg/mLを超える程度に大量に存在する。一方、病態のバイオマーカーや病因関連因子と考えられているペプチドホルモン、インターロイキン、サイトカイン等の生理活性タンパク質の多くは、１ng/mL未満という極微量にしか存在せず。その含有量比は高分子の高含量成分に比べて、実にnanoからpicoレベルである。また、タンパク質の大きさという点では、タンパク質全種類の70％以下は分子量６．７６万（6.760kDa）以下（であり、上記の極微量なバイオマーカータンパク質はいずれもこの領域に含まれる場合がほとんどである(例えば非特許文献１)。したがって、これらを分離膜によって分離精製することは容易ではない。
【０００７】
血液や体液などの生体成分含有溶液から高分子量のタンパク質を分離・除去する手段としては、高速液体クロマトグラフィー(liquid chromatography: LC) や二次元電気泳動(2 dimensional-polyacrylamide gel electrophoresis: 2D-PAGE) もあるが、これら、LCや2D-PAGEの作業も結局のところ1〜2日を要するものである。そのため、できるだけ短時間に分析結果がほしいという医療現場での診断や治療のためには実用性に乏しいといわざるを得ない。
【０００８】
また、血液や体液などの生体成分含有溶液から主としてアルブミンを除去するために、ブルー色素などのアフィニティーリガンドを固定化した担体（非特許文献２）、高分子量成分を遠心分離ろ過によって分画する遠心管形式の装置（製品化されている。）、電気泳動原理によって分画する方法（非特許文献３）、Cohnのエタノール沈澱などの伝統的な沈殿法やクロマトグラフィーによって分画する方法（例えば非特許文献４）なども開示されている。しかしながら、これらはいずれも分離性能が十分ではなかったり、微量試料には不適当であったり、あるいは質量分析等に障害となる薬剤が混入したりするなどの問題点がある。特に、アルブミンをターゲットとして吸着だけで分離する方法は、アルブミンは分離できても免疫グロブリンなどの他の６万以上の高分子成分を分離する事は困難である。
【０００９】
また、人工腎臓、人工肺、血漿分離装置などにはその用途に応じて様々な孔径の分離膜が使用されており、生体成分との適合性（たとえば血液が異物である装置に接触した際に凝固活性や免疫活性が生じないような状態）を向上させるような改善もされているが（特許文献１）、アルブミンなどの高分子量タンパク質を高効率にて取り除くという臨床プロテオームが抱えている課題を解決するものではない。
【非特許文献１】アンダーソン・ＮＬ(Anderson NL),アンダーソン・ＮＧ( Anderson NG)著，「ザ・ヒューマン・プラズマ・プロテオーム：ヒストリー・キャラクター・アンド・ダイアグノスティック・プロスペクツ (The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects)」，モレキュラー・アンド・セルラー・プロテオミクス(Molecular & Cellular Proteomics)，（米国）、ザ・アメリカン・ソサエティー・フォー・バイオケミストリー・アンド・モレキュラー・バイオロジー・インコーポレーテッド(The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.),２００２年，第１巻，p845-867.
【非特許文献２】細胞工学別冊，「バイオ実験イラストレイテッド５」, 秀潤社, 2001年
【非特許文献３】N. Ahmed et al., Proteomics, On-line版, 2003年06月23日
【非特許文献４】日本生化学会編，「新生化学実験講座（第１巻）タンパク質(1)分離・精製・性質」, 東京化学同人, 1990年
【特許文献１】特許３２９７７０７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明が解決しようとする課題は、たとえば臨床プロテオーム解析をする際に血液や尿などの生体成分含有溶液から余分な高分子量のタンパク質を除去し、低分子量のタンパク質やペプチドを高速かつより確実に分離精製することができる生体成分含有溶液の前処理方法および分析溶液精製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を克服するための本発明は以下の（１）〜（５）のような構成をとる。
（１）生体成分含有溶液中のタンパク質および／またはペプチドを分析するに際して、該生体成分含有溶液を、分子量６．７万のデキストランのふるい係数が０．１以下である分離膜に循環供給して前処理し、かつ、該生体成分含有溶液は、液中の総アルブミン量／供給側流路容量の比が６〜６０ｍｇ／ｍｌの範囲内になるように調整して前記分離膜に供給することを特徴とする生体成分含有溶液の前処理方法。
（２）前記生体成分含有溶液を閉鎖系回路内で循環することを特徴とする上記（１）に記載の生体成分含有溶液の前処理方法。
（３）前記分離膜として中空糸膜を用いることを特徴とする上記（１）または（２）に記載の生体成分含有溶液の前処理分離精製方法。
（４）前記生体成分含有溶液が、血液由来物、尿、腹水、唾液、涙液、脳脊髄液、胸水および細胞からタンパク質を抽出した溶液からなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の生体成分含有溶液の前処理方法。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載された前処理方法を用いてタンパク質および／またはペプチドの分析溶液を精製する分析溶液精製方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、血液、血清、血漿をはじめとする生体成分含有溶液から、従来検出が困難であった微量のタンパク質やペプチドをより確実に検出できる分析溶液を、短期間で精製することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の分析溶液精製方法は、血液などの生体由来の溶液すなわち生体成分含有溶液を原液として処理を行いタンパク質やペプチドの組成を変化させるものであり、たとえば図１の概念図に示すように行われるものである。なお、矢印は液体の流れである。
【００１４】
図１において、血液など生体成分含有溶液は、注入用ポンプ１００から、原液槽１０１に送られる。生体成分含有溶液は、あらかじめ原液槽に入ってあっても良い。そして、生体成分含有溶液は、循環用ポンプ１０３によって送液され、チューブからなる溶液循環回路１０２を介して後述のふるい係数を有する分離膜を内蔵する分離膜モジュール１０５に注入される。その後、分離膜を透過した透過液は、ポンプ１０７にて送液されて透過液の出口である処理液回収口１０４から取り出され、プロテオーム解析などに供される。一方、分離膜を透過しなかった濃縮液（生体成分含有溶液）は再度原液槽１０１に送液され、分離膜モジュール１０５へと循環供給される。
【００１５】
また、本発明はたとえば図２に示すように変更してもよい。図２は、図１における原液槽１０１を用いず、原液入口と原液出口とを直接連結した分離システムの概念図である。液の流れを矢印で示してある。この態様において、生体成分含有溶液は、注入用ポンプ２００から、三方バルブ２０１を通じて、分離膜を内蔵する分離膜モジュール２０５に注入され、チューブからなる溶液循環回路２０２の中を循環用ポンプ２０３によって送液せられ、循環する。分離膜を透過した透過液は、透過液の出口である処理液回収口１０４から取り出され、プロテオーム解析などに供される。
【００１６】
ここで、本発明は、生体成分含有溶液中のタンパク質やペプチドを分析するに際して、生体成分含有溶液を、分子量６．７万のデキストランのふるい係数が０．１以下である分離膜に循環供給して前処理を行うことを特徴とするものである。このとき、生体成分含有溶液は、液中の総アルブミン量／供給側流路容量の比が６〜６０ｍｇ／ｍｌの範囲内になるように調整して分離膜に供給される。
【００１７】
本発明における「生体成分含有溶液」とは、血液由来物の他、尿、唾液、涙液、脳脊髄液、腹水、胸水もしくは細胞からのタンパク質を抽出した溶液など生体関連の物質でタンパク質やペプチドを含む溶液が例示される。そして、「血液由来物」とは、ヒトなどの動物血液に由来する物であり、血液はもちろん、血清、血漿など血液中の一部の成分からなる溶液も含まれる。
【００１８】
また本発明で言う「分離膜」とは、多孔性の分離膜のことであり、平面フィルター、カートリッジ式フィルター等の平膜型分離膜、中空糸膜等の中空状分離膜のいずれも用いることができる。平膜型分離膜は製膜が容易で安価に作成することができると言う利点がある。一方、中空糸膜は、同一体積における充填膜面積が大きく、圧損も少なくできるため、効率よく用いることができる。中空糸膜を用いたモジュールにおいて充填膜面積を大きくするためには、中空糸膜の充填本数を増やす必要がある。したがって、外径は小さいほうがいいが、径が小さすぎると一本一本の膜面積が小さくなってしまううえに圧力損失が大きくなりやすい。そこで、中空糸膜は内径が５０〜１０００μｍの範囲、外径が６０〜１１００μｍの範囲のものを用いることが好ましい。
【００１９】
膜素材としては、たとえば、セルロース、セルロースアセテート、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリメチルメタクリレート等のポリメタクリル酸エステル、ポリアクリル酸エステル、ポリアミド、ポリ弗化ビニリデン、ポリアクリロニトリル、ポリエステル、ポリエチレンおよびポリプロピレンおよびこれらの誘導体からなる群より選択される。この中でも近年透析器などに良く用いられているポリスルホンは分画特性が良好であるために好ましい素材である。
【００２０】
膜面にはできるだけタンパク質が吸着しないことが好ましく、そのため親水性の膜が好ましい。具体的には、親水性の単量体と疎水性の単量体を共重合させたものや、親水性の高分子と疎水性の高分子をブレンド製膜したもの、あるいは疎水性の高分子からなる膜の表面に親水性ポリマーを結合、付着させたもの、疎水性の高分子からなる膜の表面を化学処理、プラズマ処理、放射線処理したものなどが挙げられる。親水性成分としては特に限定しないが、必要とするタンパク質が膜面に吸着してしまうのをより防ぐためにポリエチレングリコールなどのポリアルキレンオキサイド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシエチルメタクリレートなどの親水性高分子が好ましい。また親水性成分は、膜中に１wt％以上含まれていることが好ましい。
【００２１】
そして、本発明において、分離膜は分子量６．７万のデキストランのふるい係数が０．１以下のものを用いるが、０．０１以下であることが好ましい、下限値については、この値があまりにも小さいと、分子量１〜３万程度の低分子のタンパク質を回収することが難しくなるため、０．００１以上である方がよい。
【００２２】
上述の分離膜は、ハウジング内に収納して分離膜モジュールとして用いられる。ハウジングには、分離される生体成分含有溶液が流入する入口及び流出する出口と、分離膜を透過して分離された溶液が流出する透過液流出口とが備えられる。上記ハウジングの素材は特に限定しないが、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン等のプラスチック製のものを挙げることができる。
【００２３】
分離膜モジュールは、透水性能が１００ｍｌ／ｈｒ／ｍｍＨｇ／ｍ２であることが好ましい。透水性能が十分に無い場合、濾過速度が得られず、分離速度が遅くなる。また、濾過速度を早くするために充填膜面積を大きくした場合、膜面へのタンパク質吸着量が増加し、十分なタンパク質の回収量が得られない。従って、透水性能は高い方が望ましく１００ｍｌ／ｈｒ／ｍｍＨｇ／ｍ２以上、更には３００ｍｌ／ｈｒ／ｍｍＨｇ／ｍ２であることが好ましい。
【００２４】
例えば卓上サイズの装置で本発明を実施する場合、用いる生体成分含有溶液の量として好ましいのは血漿で１〜４００ｍｌ、より好ましくは１〜１００ｍｌ、更に好ましくは１〜１０ｍｌである。また、好ましい濾過流速は０．１〜２０ｍｌ／ｍｉｎ、さらに好ましくは０．２〜１０ｍｌ／ｍｉｎで行われる。充填膜面積は、大きすぎるとタンパク質の吸着量が増加し、小さすぎると濾過を行う際に膜間圧力差が大きくなりすぎる。従って充填膜面積は検体量に応じて大きさを決める必要があり、より多量の検体を処理する場合にはより大きな膜面積の分離膜で実施した方が好ましい。血漿１ｍｌに対しては、１０〜１０００ｃｍ２が好ましく、より好ましくは１０〜１００ｃｍ２で実施される。
【００２５】
そして、本発明において、血液などの生体成分含有溶液は、液中の総アルブミン量／供給側流路容量の比が６〜６０ｍｇ／ｍｌの範囲内になるように調整されて分離膜に供給されるが、この比が６〜６０ｍｇ／ｍｌの範囲内になるように調整するにあたっては、血液などの生体成分含有溶液とともに希釈液を分離膜モジュール内に流入させるなどする。なお、図２のような閉鎖系回路で原液を徐々に注入する場合、液中の総アルブミン量／供給側流路容量の比は徐々に高くなる。したがって、注入開始時点ではこの範囲を下回る可能性があるが、本発明においては原液注入完了時を処理開始とみなす。また、「液中の総アルブミン量」とは、膜面に循環供給される生体成分含有溶液中に含まれる総アルブミン量であり、また「供給側流路容量」とは、分離膜に供給される溶液が循環する流路の容量である。
【００２６】
希釈液には生理食塩水または「緩衝溶液」を用いることが好ましい。「緩衝溶液」としては、ＭＥＳ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ ＰＲＯＰＡＮＥ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＲＩＺＭＡ、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＴＥＡ、ＥＰＰＳ、ＴＲＩＣＩＮＥ、ＧＬＹ−ＧＬＹ、ＢＩＣＩＮＥ、ＰＢＳ、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＤ、ＴＡＢＳ、ＡＭＰＳＯ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＡＭＰ、ＣＡＰＳ、ＣＡＢＳ等を挙げることができる。上記緩衝溶液は略称で示してあるが、詳細な内容は和光純薬工業（株）、シグマアルドリッチジャパン（株）などの試薬メーカーのカタログやＭＳＤＳ（安全性データシート）を参照すれば理解できる。
【００２７】
そして、上記比を調整するにあたっては、希釈液を加える以外に、希釈されていない生体成分含有溶液そのものの量を調製したり、分離膜に供給される溶液が循環する流路の容積を調製する方法などが挙げられる。
【００２８】
このように希釈液を加えるなどして液中の総アルブミン量／供給側流路容量の比を６〜６０ｍｇ／ｍｌの範囲内に保つことで、分離膜表面での過剰な濃縮が防止され、分離膜の透過比率の悪化が防止されるからである。
【００２９】
そして、分離膜表面での濃縮防止、膜表面への堆積物の積層防止、膜孔の目詰まり防止の観点から、分離膜モジュールに供給される供給液の流量Ｑ１、分離された透過液の流量Ｑ２の比率Ｑ２／Ｑ１は、０．５以下にすることが望ましい。さらに、分離膜を透過した透過液の流量Ｑ２と、分離膜モジュールに供給される希釈液の流量Ｑ３とは０．５≦Ｑ２／Ｑ３≦１．５の関係にあることが望ましく、さらにＱ２／Ｑ３が０．９〜１．１、すなわちおよそ１であることが好ましい。
【００３０】
本発明によって得られる生体成分含有溶液の組成が変化した溶液は、タンパク質分析やペプチド分析、特にプロテオーム解析に好ましく用いられる。分析法としては特に限定しないがLCや2D-PAGE、核磁気共鳴(NMR)、MALDI-TOF-MSやESI-MS等を例示することができる。
【００３１】
本発明の方法によって得られた溶液を用いて上記の分析を行えば、もともとの生体成分含有液に微量にしか含まれていなかったタンパク質成分やペプチド成分の構造情報を集めることができる。それらはペプチド・マスフィンガープリント(peptide-mass fingerprint: PMF)のみならず、各ペプチドの一次構造情報（アミノ酸配列）も含まれる。
【００３２】
なお、本発明は必要に応じて分離膜モジュールを複数個配置してもよく、また、上述の行程から得られる透過液から水分などの溶媒を取り除きタンパク質を濃縮する工程をさらに付加してもよい。
【実施例】
【００３３】
（透過比率の測定方法）
内径200μmの中空糸膜100本を、直径約5mm、長さ12cmのガラス製ハウジングに充填し、分離される溶液が流入する入口及び流出する出口をコニシ（株）製エポキシ樹脂系化学反応形接着剤“クイックメンダー”でポッティングすることによって、分離膜モジュールを作製する。次いで、該モジュールの中空糸およびモジュール内部を蒸留水にて、１時間洗浄する。
【００３４】
ＦＵＬＫＡ社製デキストラン 平均分子量〜1500(No.31394)、平均分子量〜6000(No.31388)、平均分子量15000〜20000(No.31387)、平均分子量〜40000(No.31389)、平均分子量〜60000(No.31397)、平均分子量〜200000(No.31398)を各々0.5mg/mL（溶質全体では3.0mg/mL）になるように蒸留水で溶解し、デキストラン水溶液（原液）を作成する。モジュールに対して、原液側の液を循環するポンプと濾過をかけるポンプを準備し、限外濾過水を用いて、原液循環流量が5ml/min、濾過流量が0.2mL/minになるように流速を調整する。次いで、充填している限外濾過水を原液に置換した後、室温（25℃）にて濾過を開始する。この時、モジュール出口の原液および濾液は戻さずに廃棄する。その後、６０分経過した後に１５分間液を採取し、モジュール原液入口、出口および濾液中のデキストランの示差屈折率を測定し、これらの測定値からデキストランのふるい係数を算出する。デキストラン濃度の測定は、次のように行った。サンプリングした溶液を細孔径0.5ミクロンのフィルターで濾過し、その濾液をＧＰＣ用カラム(東ソーTSK-gel-G3000PWＸＬ)、カラム温度40℃、移動相を液クロ用蒸留水1mL/min、サンプル打ち込み量100μlで分析を行い、示差屈折率計(東ソー社製 RI-8020)にてslice time 0.02min、base-line-range 4.5〜11.0minで測定する。カラムのキャリブレーションは、測定直前に単分散のデキストラン（Ｆｌｕｋａ社製デキストランスタンダード No.31416,No.31417,No.31418,No.31420,No.31422）を用いて行う。キャリブレーションでは、各デキストランスタンダードをNo.31416,No.31418,No.31422とNo.31417,No.31420に分けて、各々0.5mg/mLに溶解し、各々のピークトップのretention timeと重量平均分子量をプロットし、指数近似曲線を求めることでretention timeと重量平均分子量の関係を求めた。ふるい係数は、モジュール原液入口の示差屈折率値（Ｃｉ）、出口の示差屈折率値（Ｃｏ）、濾液の示差屈折率値（Ｃｆ）を測定し、以下の式によりふるい係数（ＳＣ）を算出することができる。
【００３５】
ＳＣ＝２Ｃｆ／（Ｃｉ＋Ｃｏ）
得られたデキストラン重量平均分子量１．５万のふるい係数をデキストラン重量平均分子量６万のふるい係数で除した値を透過比率とする。
（実施例１）
東レ株式会社製透析器ＴＳ２．１ＭＬの両端の樹脂接着部分を切り、中空糸膜を得た。得られた中空糸膜の寸法は、内直径200μm膜厚40μmであり、中空糸膜の構造を電子顕微鏡（日立社製Ｓ８００）にて確認したところ非対称構造を有していた。
【００３６】
該中空糸膜を100本束ね、中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で両末端をポリカーボネート製モジュールケースに固定し、ミニモジュールを作成した。該ミニモジュールの内直径は約5mm、長さは約12cmであり、一般的な中空糸膜型透析器同様に中空糸の内側のポート（血液ポート）を２個と外側のポート（透析液ポート）を２個有していた。該ミニモジュールの中空糸およびモジュール内部を蒸留水にて洗浄した。
【００３７】
このようなミニモジュールを２本作成し、一本にはPBS（日水製薬社製ダルベッコPBS（−））水溶液を充填し、残りの１本には蒸留水を充填した。そして、蒸留水を充填した１本のデキストランのふるい係数を測定したところ、分子量１１０００のふるい係数は０．５４２、分子量６７０００のふるい係数は０．０１４５であった。残りの１本（PBS水溶液を充填したもの）は以下の実験に用いた。
【００３８】
ヒト血清（SIGMA社、H1388、 Lot 122K0424）を3000rpm、15分の条件にて遠心処理を行い濾液および沈殿物を取り除いた後0.45μｍのフィルター処理を行った。
【００３９】
一方、上述のミニモジュール１個を用いて図１に示すような装置を準備した。まず、ミニモジュールの中空糸膜の外側のポートの一つをキャップし、もう一つはシリコーンチューブをつなぎ、途中に濾過を行うためのペリスターポンプを設けた。中空糸膜内側のポートについては各々シリコーンチューブをつなぎ原液槽に入れ、入口側のシリコーンチューブの途中にはペリスターポンプを設けて原液を循環できるようにした。原液槽にPBS水溶液を入れ、ペリスターポンプにて回路内をPBS水溶液で充填した。
【００４０】
次に、PBS水溶液が入っていた原液槽を一旦空にしてヒト血清1mlを入れ、このヒト血清を原液として、温度25℃、原液側循環回路の流量を3.0mL/min、濾過流速を0.6mL/minに保って中空糸膜内側に循環供給し、4時間の濾過を実施した。なお、濾過された容量分のPBS水溶液を原液槽に0.6ml/minで加えて循環することで、循環する液量を一定に保った。
【００４１】
そして、4時間経過後の濾液すなわち生体成分の組成が変化した溶液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度と、さらには4時間経過した後に循環回路内に残存していた溶液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度とを測定した。なお、アルブミン濃度はHuman Albumin ELISA Quantitation Kit (BETHYL社製Cat No. E80-129)にて測定し、β２−ミクログロブリン濃度は三洋化成工業株式会社製グラザイムβ２-Microglobulin-EIA TESTにて測定した。結果を表１に示す。また、循環処理開始時の循環回路内の液中のアルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度については、もともとの溶液量が少量であるためサンプリングが難しく測定ができないが、実測値と実質的に同じ値となる計算値を示す。なお、本実施例では、アルブミンの透過率が低い膜を使用しているため、循環開始時にはアルブミンの透過がほとんど起きていないと考えられる。したがって、全てのアルブミンが循環回路中に存在すると仮定して計算を行った。この結果、中空糸膜に供給されていた溶液中（血清＋ＰＢＳ水溶液）の総アルブミン量／供給側流路容量は、最も大きくなると考えられる処理開始時で11.5mg/ml、最も数値が小さくなると考えられる４時間経過後で10.3mg/mlであった。
【００４２】
また、各タンパク質の回収率を次のように求めた。
【００４３】
タンパク質の回収率（％）＝ （濾液液量×濾液中のタンパク質濃度）
（原液液量×原液中のタンパク質濃度）
上記のように計算した結果、アルブミンの回収率は、0.075%、β２−ミクログロブリンの回収率は100%であり、β２−ミクログロブリン量を維持しながら、アルブミンを大幅に除去することができた。
【００４４】
【表１】
【００４５】
（実施例２）
実施例１と同様にミニモジュールを１個作成し、図２に示すような装置を準備した。ミニモジュールは、外側ポートの一つをキャップし、他の一つはシリコーンチューブをつなぎ、透過用ペリスターポンプに接続した。一方、中空糸膜内側の液はモジュールの原液入口と原液出口をシリコーンチューブでつなぎ溶液循環回路となし、ペリスターポンプを用いて血清を循環できるようにした。また、溶液循環回路の途中には追加のＰＢＳ水溶液を投入する入口を設け、溶液循環回路内をPBS水溶液で充填した。
【００４６】
また、ヒト血清（SIGMA社、H1388、 Lot 122K0424）は、3000rpm、15分の条件にて遠心処理を行い濾液および沈殿物を取り除いた後0.45μｍのフィルター処理を行った。
【００４７】
次に、この血清をＰＢＳ水溶液にて３倍に希釈した溶液4mlを用いて、循環流量3ml/min、濾過流量0.6ml/minの流速で25℃、60分間濾過を実施した。この時、３倍希釈血清を0.6ml/minで溶液循環回路に流入させた後、濾過の容量分はPBS水溶液を0.6ml/minで溶液循環回路内に加えて、循環する液量を一定に保った。
【００４８】
そして、６０分経過後の濾液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度と、さらには６０分経過した後に循環回路内に残存していた溶液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度とを測定した。この結果を表１に示す。また、循環処理開始時の循環回路内の液中のアルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度については計算値を示す。この結果、中空糸膜に供給されていた溶液中の総アルブミン量／供給側流路容量は、最も大きくなると考えられる処理開始時で36.2mg/ml、最も数値が小さくなると考えられる６０分経過後で35.9mg/mlであった。さらに、各タンパク質の回収率を求めた結果、アルブミンの回収率は、0.408%、β２−ミクログロブリンの回収率は100%であり、β２−ミクログロブリン量を維持しながら、アルブミンを大幅に除去することができた。
【００４９】
（実施例３）
血清をＰＢＳ水溶液にて４倍に希釈した溶液4mlを用いた以外は、実施例２と同様に装置を準備し濾過を行った。
【００５０】
そして、６０分経過後の濾液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度と、さらには６０分経過した後に循環回路内に残存していた溶液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度とを測定した。この結果を表１に示す。また、循環処理開始時の循環回路内の液中のアルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度については計算値を示す。この結果、中空糸膜に供給されていた溶液中の総アルブミン量／供給側流路容量は、最も大きくなると考えられる処理開始時で22.5mg/ml、最も数値が小さくなると考えられる６０分経過後で22.3mg/mlであった。さらに、各タンパク質の回収率を求めた結果、アルブミンの回収率は、0.229%、β２−ミクログロブリンの回収率は76.0%であり、β２−ミクログロブリン量を維持しながら、アルブミンを大幅に除去することができた。
【００５１】
（実施例４）
血清をＰＢＳ水溶液にて８倍に希釈した溶液4mlを用いた以外は実施例２と同様に装置を準備し濾過を行った。
【００５２】
そして、６０分経過後の濾液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度と、さらには６０分経過した後に循環回路内に残存していた溶液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度とを測定した。この結果を表１に示す。また、循環処理開始時の循環回路内の液中のアルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度については計算値を示す。この結果、中空糸膜に供給されていた溶液中の総アルブミン量／供給側流路容量は、最も大きくなると考えられる処理開始時で11.8mg/ml、最も数値が小さくなると考えられる６０分経過後で11.6mg/mlであった。さらに、各タンパク質の回収率を求めた結果、アルブミンの回収率は、0.245%、β２−ミクログロブリンの回収率は100%であり、β２−ミクログロブリン量を維持しながら、アルブミンを大幅に除去することができた。
【００５３】
（実施例５）
血清をＰＢＳ水溶液にて１６倍に希釈した溶液4mlを用いた以外は、実施例２と同様に装置を準備し濾過を行った。
【００５４】
そして、６０分経過後の濾液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度と、さらには６０分経過した後に循環回路内に残存していた溶液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度とを測定した。この結果を表１に示す。また、循環処理開始時の循環回路内の液中のアルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度については計算値を示す。この結果、中空糸膜に供給されていた溶液中の総アルブミン量／供給側流路容量は、最も大きくなると考えられる処理開始時で6.7mg/ml、最も数値が小さくなると考えられる６０分経過後でも6.7mg/mlであった。さらに、各タンパク質の回収率を求めた結果、アルブミンの回収率は、0.169%、β２−ミクログロブリンの回収率は94%であり、β２−ミクログロブリン量を維持しながら、アルブミンを大幅に除去することができた。
（実施例６）
希釈していない血清4mlを用い、供給液流路径を大きくして供給液流路容量を変更した以外は、実施例２と同様に装置を準備し濾過を行った。
【００５５】
そして、６０分経過後の濾液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度と、さらには６０分経過した後に循環回路内に残存していた溶液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度とを測定した。この結果を表１に示す。また、循環処理開始時の循環回路内の液中のアルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度については計算値を示す。この結果、中空糸膜に供給されていた溶液中の総アルブミン量／供給側流路容量は、最も大きくなると考えられる処理開始時で35.9mg/ml、最も数値が小さくなると考えられる６０分経過後で35.7mg/mlであった。さらに、各タンパク質の回収率を求めた結果、アルブミンの回収率は、0.032%、β２−ミクログロブリンの回収率は87%であり、β２−ミクログロブリン量を維持しながら、アルブミンを大幅に除去することができた。
【００５６】
（実施例７）
血清をＰＢＳ水溶液にて４倍に希釈した溶液4mlを用い、供給液流路径を大きくして供給液流路容量を変更した以外は、実施例２と同様に装置を準備し濾過を行った。
【００５７】
そして、６０分経過後の濾液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度と、さらには６０分経過した後に循環回路内に残存していた溶液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度とを測定した。この結果を表１に示す。また、循環処理開始時の循環回路内の液中のアルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度については計算値を示す。この結果、中空糸膜に供給されていた溶液中の総アルブミン量／供給側流路容量は、最も大きくなると考えられる処理開始時で15.0mg/ml、最も数値が小さくなると考えられる６０分経過後で14.9mg/mlであった。さらに、各タンパク質の回収率を求めた結果、アルブミンの回収率は、0.063%、β２−ミクログロブリンの回収率は90%であり、β２−ミクログロブリン量を維持しながら、アルブミンを大幅に除去することができた。
（実施例８）
血清をＰＢＳ水溶液にて４倍に希釈した溶液4mlを用い、供給液流路径を大きくして供給液流路容量を変更した以外は、実施例２と同様に装置を準備し濾過を行った。
【００５８】
そして、６０分経過後の濾液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度と、さらには６０分経過した後に循環回路内に残存していた溶液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度とを測定した。この結果を表１に示す。また、循環処理開始時の循環回路内の液中のアルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度については計算値を示す。この結果、中空糸膜に供給されていた溶液中の総アルブミン量／供給側流路容量は、最も大きくなると考えられる処理開始時で7.5mg/ml、最も数値が小さくなると考えられる６０分経過後でも7.5mg/mlであった。さらに、各タンパク質の回収率を求めた結果、アルブミンの回収率は、0.039%、β２−ミクログロブリンの回収率は84%であり、β２−ミクログロブリン量を維持しながら、アルブミンを大幅に除去することができた。
【００５９】
（比較例１）
希釈していない血清4mlを用いた以外は、実施例２と同様に装置を準備し濾過を行った。
【００６０】
そして、６０分経過後の濾液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度と、さらには６０分経過した後に循環回路内に残存していた溶液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度とを測定した。この結果を表２に示す。また、循環処理開始時の循環回路内の液中のアルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度については計算値を示す。この結果、中空糸膜に供給されていた溶液中の総アルブミン量／供給側流路容量は、最も大きくなると考えられる処理開始時で105.0mg/ml、最も数値が小さくなると考えられる６０分経過後で99.8mg/mlであった。さらに、各タンパク質の回収率を求めた結果、アルブミンの回収率は、3.81%、β２−ミクログロブリンの回収率は84%であった。すなわち、アルブミンとβ２−ミクログロブリンとを十分に分離できなかった。
【００６１】
【表２】
【００６２】
（比較例２）
血清をＰＢＳ水溶液にて２倍に希釈した溶液4mlを用いた以外は、実施例２と同様に装置を準備し濾過を行った。
【００６３】
そして、６０分経過後の濾液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度と、さらには６０分経過した後に循環回路内に残存していた溶液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度とを測定した。この結果を表２に示す。また、循環処理開始時の循環回路内の液中のアルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度については計算値を示す。この結果、中空糸膜に供給されていた溶液中の総アルブミン量／供給側流路容量は、最も大きくなると考えられる処理開始時で64.9mg/ml、最も数値が小さくなると考えられる６０分経過後で63.6mg/mlであった。さらに、各タンパク質の回収率を求めた結果、アルブミンの回収率は、1.34%、β２−ミクログロブリンの回収率は99%であった。すなわち、アルブミンとβ２−ミクログロブリンとを十分に分離できなかった。
（比較例３）
血清をＰＢＳ水溶液にて４０倍に希釈した溶液4mlを用いた以外は、実施例２と同様に装置を準備し濾過を行った。
そして、６０分経過後の濾液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度と、さらには６０分経過した後に循環回路内に残存していた溶液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度とを測定した。この結果を表２に示す。また、循環処理開始時の循環回路内の液中のアルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度については計算値を示す。この結果、中空糸膜に供給されていた溶液中の総アルブミン量／供給側流路容量は、最も大きくなると考えられる処理開始時で2.3mg/ml、最も数値が小さくなると考えられる６０分経過後で2.2mg/mlであった。さらに、各タンパク質の回収率を求めた結果、アルブミンの回収率は、1.13%、β２−ミクログロブリンの回収率は79%であった。すなわち、アルブミンとβ２−ミクログロブリンとを十分に分離できなかった。
（比較例４）
血清をＰＢＳ水溶液にて４倍に希釈した溶液4mlを用い、供給液流路径を大きくして供給液流路容量を変更した以外は、実施例２と同様に装置を準備し濾過を行った。
【００６４】
そして、６０分経過後の濾液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度と、さらには６０分経過した後に循環回路内に残存していた溶液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度とを測定した。この結果を表２に示す。また、循環処理開始時の循環回路内の液中のアルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度については計算値を示す。この結果、中空糸膜に供給されていた溶液中の総アルブミン量／供給側流路容量は、最も大きくなると考えられる処理開始時で5.0mg/ml、最も数値が小さくなると考えられる６０分経過後で5.08mg/mlであった。さらに、各タンパク質の回収率を求めた結果、アルブミンの回収率は、0.021%、β２−ミクログロブリンの回収率は67%であった。すなわち、アルブミンとβ２−ミクログロブリンとを十分に分離できなかった。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】実施例１で用いた分離システムの概念図である。
【図２】実施例２〜８および比較例１〜４で用いた分離システムの概念図である。
【符号の説明】
【００６６】
１００ 注入用ポンプ
１０１ 原液槽
１０２ 溶液循環回路
１０３ 循環用ポンプ
１０４ 処理液回収口
１０５ 分離膜モジュール
１０６ モジュールの下部ポート
１０７ 濾過用ポンプ
２００ 注入用ポンプ
２０１ 三方バルブ
２０２ 溶液循環回路
２０３ 循環用ポンプ
２０４ 膜分離ユニット処理液回収口
２０５ 分離膜モジュール
２０６ モジュールの下部ポート
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体成分含有溶液、特にヒトの血液、尿等から特定の生体成分を分離して分析用溶液を得るにあたって好適に用いることができる生体成分含有溶液の前処理方法および分析溶液精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ポストゲノム研究として、プロテオーム解析研究（プロテオミクス）が注目され始めた。遺伝子産物であるタンパク質は遺伝子よりも疾患の病態に直接リンクしていると考えられることから、タンパク質を網羅的に調べるプロテオーム解析の研究成果は診断と治療に広く応用できると期待されている。しかも、ゲノム解析では発見できなかった病因タンパク質や疾患関連因子を多く発見できる可能性が高い。
【０００３】
プロテオーム解析が急速に進展しだしたのは、質量分析装置（mass spectrometer: MS）による高速構造分析が可能となってきたことが大きく影響している。たとえば、MALDI-TOF-MS (matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry) 等の実用化によって、ポリペプチドのハイスルースループット超微量分析が可能となり、従来検出し得なかった微量タンパク質までもが同定可能となり、疾患関連因子の探索に強力なツールとなってきている。
【０００４】
ところで、プロテオーム解析の臨床応用の第一目的は、疾患によって誘導あるいは消失するバイオマーカータンパク質の発見である。バイオマーカータンパク質は、病態に関連して挙動するため、診断のマーカーとなり得るほか、創薬ターゲットとなる可能性も高い。すなわち、プロテオーム解析の成果は、特定遺伝子よりも診断マーカーや創薬ターゲットとなる可能性が高いため、ポストゲノム時代の診断と治療の切り札技術となり、同定されたバイオマーカータンパク質は患者の薬剤応答性評価や副作用発現予測という直接的に患者が享受しえる利益につながることから、いわゆるテーラーメード医療の推進に大きな役割を果たすといえる。
【０００５】
しかしながら、臨床研究にプロテオーム解析を導入する場合には、大量の検体を迅速、確実に解析することが求められており、しかも個々の臨床検体（生体成分含有溶液）は微量で貴重なために高感度な測定を迅速に行う必要がある。そのため、超高感度でハイスループットの特性を有する質量分析装置が急速に改良されてきてはいるものの、プロテオーム解析が臨床現場で簡便かつ迅速に実施できる状況には、まだない。
【０００６】
すなわち、質量分析にかける前には臨床検体（生体成分含有溶液）中のタンパク質やペプチド等を分画し精製することが必要で、この処理には数日かかるうえに、この前処理の操作は煩雑で経験も必要とされる。
さらに、血液や体液などの生体成分含有溶液に含まれるタンパク質やペプチドは、多様なために分画精製が容易でないといった問題もある。たとえば、ヒト・タンパク質は10万種以上とも推定されているが、血清中に含まれるタンパク質だけでも約1万種類にものぼるといわれ、タンパク質総量の血清中濃度は約60〜80mg/mLである。そして、ヒト血清中の高含量のタンパク質は、アルブミン(分子量67kDa)、免疫グロブリン(150〜190kDa)、トランスフェリン(80kDa)、ハプトグロビン(>85kDa)、リポタンパク質(数100kDa)等であり、いずれも１mg/mLを超える程度に大量に存在する。一方、病態のバイオマーカーや病因関連因子と考えられているペプチドホルモン、インターロイキン、サイトカイン等の生理活性タンパク質の多くは、１ng/mL未満という極微量にしか存在せず。その含有量比は高分子の高含量成分に比べて、実にnanoからpicoレベルである。また、タンパク質の大きさという点では、タンパク質全種類の70％以下は分子量６．７６万（6.760kDa）以下（であり、上記の極微量なバイオマーカータンパク質はいずれもこの領域に含まれる場合がほとんどである(例えば非特許文献１)。したがって、これらを分離膜によって分離精製することは容易ではない。
【０００７】
血液や体液などの生体成分含有溶液から高分子量のタンパク質を分離・除去する手段としては、高速液体クロマトグラフィー(liquid chromatography: LC) や二次元電気泳動(2 dimensional-polyacrylamide gel electrophoresis: 2D-PAGE) もあるが、これら、LCや2D-PAGEの作業も結局のところ1〜2日を要するものである。そのため、できるだけ短時間に分析結果がほしいという医療現場での診断や治療のためには実用性に乏しいといわざるを得ない。
【０００８】
また、血液や体液などの生体成分含有溶液から主としてアルブミンを除去するために、ブルー色素などのアフィニティーリガンドを固定化した担体（非特許文献２）、高分子量成分を遠心分離ろ過によって分画する遠心管形式の装置（製品化されている。）、電気泳動原理によって分画する方法（非特許文献３）、Cohnのエタノール沈澱などの伝統的な沈殿法やクロマトグラフィーによって分画する方法（例えば非特許文献４）なども開示されている。しかしながら、これらはいずれも分離性能が十分ではなかったり、微量試料には不適当であったり、あるいは質量分析等に障害となる薬剤が混入したりするなどの問題点がある。特に、アルブミンをターゲットとして吸着だけで分離する方法は、アルブミンは分離できても免疫グロブリンなどの他の６万以上の高分子成分を分離する事は困難である。
【０００９】
また、人工腎臓、人工肺、血漿分離装置などにはその用途に応じて様々な孔径の分離膜が使用されており、生体成分との適合性（たとえば血液が異物である装置に接触した際に凝固活性や免疫活性が生じないような状態）を向上させるような改善もされているが（特許文献１）、アルブミンなどの高分子量タンパク質を高効率にて取り除くという臨床プロテオームが抱えている課題を解決するものではない。
【非特許文献１】アンダーソン・ＮＬ(Anderson NL),アンダーソン・ＮＧ( Anderson NG)著，「ザ・ヒューマン・プラズマ・プロテオーム：ヒストリー・キャラクター・アンド・ダイアグノスティック・プロスペクツ (The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects)」，モレキュラー・アンド・セルラー・プロテオミクス(Molecular & Cellular Proteomics)，（米国）、ザ・アメリカン・ソサエティー・フォー・バイオケミストリー・アンド・モレキュラー・バイオロジー・インコーポレーテッド(The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.),２００２年，第１巻，p845-867.
【非特許文献２】細胞工学別冊，「バイオ実験イラストレイテッド５」, 秀潤社, 2001年
【非特許文献３】N. Ahmed et al., Proteomics, On-line版, 2003年06月23日
【非特許文献４】日本生化学会編，「新生化学実験講座（第１巻）タンパク質(1)分離・精製・性質」, 東京化学同人, 1990年
【特許文献１】特許３２９７７０７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明が解決しようとする課題は、たとえば臨床プロテオーム解析をする際に血液や尿などの生体成分含有溶液から余分な高分子量のタンパク質を除去し、低分子量のタンパク質やペプチドを高速かつより確実に分離精製することができる生体成分含有溶液の前処理方法および分析溶液精製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を克服するための本発明は以下の（１）〜（５）のような構成をとる。
（１）生体成分含有溶液中のタンパク質および／またはペプチドを分析するに際して、該生体成分含有溶液を、分子量６．７万のデキストランのふるい係数が０．１以下である分離膜に循環供給して前処理し、かつ、該生体成分含有溶液は、液中の総アルブミン量／供給側流路容量の比が６〜６０ｍｇ／ｍｌの範囲内になるように調整して前記分離膜に供給することを特徴とする生体成分含有溶液の前処理方法。
（２）前記生体成分含有溶液を閉鎖系回路内で循環することを特徴とする上記（１）に記載の生体成分含有溶液の前処理方法。
（３）前記分離膜として中空糸膜を用いることを特徴とする上記（１）または（２）に記載の生体成分含有溶液の前処理分離精製方法。
（４）前記生体成分含有溶液が、血液由来物、尿、腹水、唾液、涙液、脳脊髄液、胸水および細胞からタンパク質を抽出した溶液からなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の生体成分含有溶液の前処理方法。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載された前処理方法を用いてタンパク質および／またはペプチドの分析溶液を精製する分析溶液精製方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、血液、血清、血漿をはじめとする生体成分含有溶液から、従来検出が困難であった微量のタンパク質やペプチドをより確実に検出できる分析溶液を、短期間で精製することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の分析溶液精製方法は、血液などの生体由来の溶液すなわち生体成分含有溶液を原液として処理を行いタンパク質やペプチドの組成を変化させるものであり、たとえば図１の概念図に示すように行われるものである。なお、矢印は液体の流れである。
【００１４】
図１において、血液など生体成分含有溶液は、注入用ポンプ１００から、原液槽１０１に送られる。生体成分含有溶液は、あらかじめ原液槽に入ってあっても良い。そして、生体成分含有溶液は、循環用ポンプ１０３によって送液され、チューブからなる溶液循環回路１０２を介して後述のふるい係数を有する分離膜を内蔵する分離膜モジュール１０５に注入される。その後、分離膜を透過した透過液は、ポンプ１０７にて送液されて透過液の出口である処理液回収口１０４から取り出され、プロテオーム解析などに供される。一方、分離膜を透過しなかった濃縮液（生体成分含有溶液）は再度原液槽１０１に送液され、分離膜モジュール１０５へと循環供給される。
【００１５】
また、本発明はたとえば図２に示すように変更してもよい。図２は、図１における原液槽１０１を用いず、原液入口と原液出口とを直接連結した分離システムの概念図である。液の流れを矢印で示してある。この態様において、生体成分含有溶液は、注入用ポンプ２００から、三方バルブ２０１を通じて、分離膜を内蔵する分離膜モジュール２０５に注入され、チューブからなる溶液循環回路２０２の中を循環用ポンプ２０３によって送液せられ、循環する。分離膜を透過した透過液は、透過液の出口である処理液回収口１０４から取り出され、プロテオーム解析などに供される。
【００１６】
ここで、本発明は、生体成分含有溶液中のタンパク質やペプチドを分析するに際して、生体成分含有溶液を、分子量６．７万のデキストランのふるい係数が０．１以下である分離膜に循環供給して前処理を行うことを特徴とするものである。このとき、生体成分含有溶液は、液中の総アルブミン量／供給側流路容量の比が６〜６０ｍｇ／ｍｌの範囲内になるように調整して分離膜に供給される。
【００１７】
本発明における「生体成分含有溶液」とは、血液由来物の他、尿、唾液、涙液、脳脊髄液、腹水、胸水もしくは細胞からのタンパク質を抽出した溶液など生体関連の物質でタンパク質やペプチドを含む溶液が例示される。そして、「血液由来物」とは、ヒトなどの動物血液に由来する物であり、血液はもちろん、血清、血漿など血液中の一部の成分からなる溶液も含まれる。
【００１８】
また本発明で言う「分離膜」とは、多孔性の分離膜のことであり、平面フィルター、カートリッジ式フィルター等の平膜型分離膜、中空糸膜等の中空状分離膜のいずれも用いることができる。平膜型分離膜は製膜が容易で安価に作成することができると言う利点がある。一方、中空糸膜は、同一体積における充填膜面積が大きく、圧損も少なくできるため、効率よく用いることができる。中空糸膜を用いたモジュールにおいて充填膜面積を大きくするためには、中空糸膜の充填本数を増やす必要がある。したがって、外径は小さいほうがいいが、径が小さすぎると一本一本の膜面積が小さくなってしまううえに圧力損失が大きくなりやすい。そこで、中空糸膜は内径が５０〜１０００μｍの範囲、外径が６０〜１１００μｍの範囲のものを用いることが好ましい。
【００１９】
膜素材としては、たとえば、セルロース、セルロースアセテート、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリメチルメタクリレート等のポリメタクリル酸エステル、ポリアクリル酸エステル、ポリアミド、ポリ弗化ビニリデン、ポリアクリロニトリル、ポリエステル、ポリエチレンおよびポリプロピレンおよびこれらの誘導体からなる群より選択される。この中でも近年透析器などに良く用いられているポリスルホンは分画特性が良好であるために好ましい素材である。
【００２０】
膜面にはできるだけタンパク質が吸着しないことが好ましく、そのため親水性の膜が好ましい。具体的には、親水性の単量体と疎水性の単量体を共重合させたものや、親水性の高分子と疎水性の高分子をブレンド製膜したもの、あるいは疎水性の高分子からなる膜の表面に親水性ポリマーを結合、付着させたもの、疎水性の高分子からなる膜の表面を化学処理、プラズマ処理、放射線処理したものなどが挙げられる。親水性成分としては特に限定しないが、必要とするタンパク質が膜面に吸着してしまうのをより防ぐためにポリエチレングリコールなどのポリアルキレンオキサイド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシエチルメタクリレートなどの親水性高分子が好ましい。また親水性成分は、膜中に１wt％以上含まれていることが好ましい。
【００２１】
そして、本発明において、分離膜は分子量６．７万のデキストランのふるい係数が０．１以下のものを用いるが、０．０１以下であることが好ましい、下限値については、この値があまりにも小さいと、分子量１〜３万程度の低分子のタンパク質を回収することが難しくなるため、０．００１以上である方がよい。
【００２２】
上述の分離膜は、ハウジング内に収納して分離膜モジュールとして用いられる。ハウジングには、分離される生体成分含有溶液が流入する入口及び流出する出口と、分離膜を透過して分離された溶液が流出する透過液流出口とが備えられる。上記ハウジングの素材は特に限定しないが、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン等のプラスチック製のものを挙げることができる。
【００２３】
分離膜モジュールは、透水性能が１００ｍｌ／ｈｒ／ｍｍＨｇ／ｍ２であることが好ましい。透水性能が十分に無い場合、濾過速度が得られず、分離速度が遅くなる。また、濾過速度を早くするために充填膜面積を大きくした場合、膜面へのタンパク質吸着量が増加し、十分なタンパク質の回収量が得られない。従って、透水性能は高い方が望ましく１００ｍｌ／ｈｒ／ｍｍＨｇ／ｍ２以上、更には３００ｍｌ／ｈｒ／ｍｍＨｇ／ｍ２であることが好ましい。
【００２４】
例えば卓上サイズの装置で本発明を実施する場合、用いる生体成分含有溶液の量として好ましいのは血漿で１〜４００ｍｌ、より好ましくは１〜１００ｍｌ、更に好ましくは１〜１０ｍｌである。また、好ましい濾過流速は０．１〜２０ｍｌ／ｍｉｎ、さらに好ましくは０．２〜１０ｍｌ／ｍｉｎで行われる。充填膜面積は、大きすぎるとタンパク質の吸着量が増加し、小さすぎると濾過を行う際に膜間圧力差が大きくなりすぎる。従って充填膜面積は検体量に応じて大きさを決める必要があり、より多量の検体を処理する場合にはより大きな膜面積の分離膜で実施した方が好ましい。血漿１ｍｌに対しては、１０〜１０００ｃｍ２が好ましく、より好ましくは１０〜１００ｃｍ２で実施される。
【００２５】
そして、本発明において、血液などの生体成分含有溶液は、液中の総アルブミン量／供給側流路容量の比が６〜６０ｍｇ／ｍｌの範囲内になるように調整されて分離膜に供給されるが、この比が６〜６０ｍｇ／ｍｌの範囲内になるように調整するにあたっては、血液などの生体成分含有溶液とともに希釈液を分離膜モジュール内に流入させるなどする。なお、図２のような閉鎖系回路で原液を徐々に注入する場合、液中の総アルブミン量／供給側流路容量の比は徐々に高くなる。したがって、注入開始時点ではこの範囲を下回る可能性があるが、本発明においては原液注入完了時を処理開始とみなす。また、「液中の総アルブミン量」とは、膜面に循環供給される生体成分含有溶液中に含まれる総アルブミン量であり、また「供給側流路容量」とは、分離膜に供給される溶液が循環する流路の容量である。
【００２６】
希釈液には生理食塩水または「緩衝溶液」を用いることが好ましい。「緩衝溶液」としては、ＭＥＳ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ ＰＲＯＰＡＮＥ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＲＩＺＭＡ、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＴＥＡ、ＥＰＰＳ、ＴＲＩＣＩＮＥ、ＧＬＹ−ＧＬＹ、ＢＩＣＩＮＥ、ＰＢＳ、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＤ、ＴＡＢＳ、ＡＭＰＳＯ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＡＭＰ、ＣＡＰＳ、ＣＡＢＳ等を挙げることができる。上記緩衝溶液は略称で示してあるが、詳細な内容は和光純薬工業（株）、シグマアルドリッチジャパン（株）などの試薬メーカーのカタログやＭＳＤＳ（安全性データシート）を参照すれば理解できる。
【００２７】
そして、上記比を調整するにあたっては、希釈液を加える以外に、希釈されていない生体成分含有溶液そのものの量を調製したり、分離膜に供給される溶液が循環する流路の容積を調製する方法などが挙げられる。
【００２８】
このように希釈液を加えるなどして液中の総アルブミン量／供給側流路容量の比を６〜６０ｍｇ／ｍｌの範囲内に保つことで、分離膜表面での過剰な濃縮が防止され、分離膜の透過比率の悪化が防止されるからである。
【００２９】
そして、分離膜表面での濃縮防止、膜表面への堆積物の積層防止、膜孔の目詰まり防止の観点から、分離膜モジュールに供給される供給液の流量Ｑ１、分離された透過液の流量Ｑ２の比率Ｑ２／Ｑ１は、０．５以下にすることが望ましい。さらに、分離膜を透過した透過液の流量Ｑ２と、分離膜モジュールに供給される希釈液の流量Ｑ３とは０．５≦Ｑ２／Ｑ３≦１．５の関係にあることが望ましく、さらにＱ２／Ｑ３が０．９〜１．１、すなわちおよそ１であることが好ましい。
【００３０】
本発明によって得られる生体成分含有溶液の組成が変化した溶液は、タンパク質分析やペプチド分析、特にプロテオーム解析に好ましく用いられる。分析法としては特に限定しないがLCや2D-PAGE、核磁気共鳴(NMR)、MALDI-TOF-MSやESI-MS等を例示することができる。
【００３１】
本発明の方法によって得られた溶液を用いて上記の分析を行えば、もともとの生体成分含有液に微量にしか含まれていなかったタンパク質成分やペプチド成分の構造情報を集めることができる。それらはペプチド・マスフィンガープリント(peptide-mass fingerprint: PMF)のみならず、各ペプチドの一次構造情報（アミノ酸配列）も含まれる。
【００３２】
なお、本発明は必要に応じて分離膜モジュールを複数個配置してもよく、また、上述の行程から得られる透過液から水分などの溶媒を取り除きタンパク質を濃縮する工程をさらに付加してもよい。
【実施例】
【００３３】
（透過比率の測定方法）
内径200μmの中空糸膜100本を、直径約5mm、長さ12cmのガラス製ハウジングに充填し、分離される溶液が流入する入口及び流出する出口をコニシ（株）製エポキシ樹脂系化学反応形接着剤“クイックメンダー”でポッティングすることによって、分離膜モジュールを作製する。次いで、該モジュールの中空糸およびモジュール内部を蒸留水にて、１時間洗浄する。
【００３４】
ＦＵＬＫＡ社製デキストラン 平均分子量〜1500(No.31394)、平均分子量〜6000(No.31388)、平均分子量15000〜20000(No.31387)、平均分子量〜40000(No.31389)、平均分子量〜60000(No.31397)、平均分子量〜200000(No.31398)を各々0.5mg/mL（溶質全体では3.0mg/mL）になるように蒸留水で溶解し、デキストラン水溶液（原液）を作成する。モジュールに対して、原液側の液を循環するポンプと濾過をかけるポンプを準備し、限外濾過水を用いて、原液循環流量が5ml/min、濾過流量が0.2mL/minになるように流速を調整する。次いで、充填している限外濾過水を原液に置換した後、室温（25℃）にて濾過を開始する。この時、モジュール出口の原液および濾液は戻さずに廃棄する。その後、６０分経過した後に１５分間液を採取し、モジュール原液入口、出口および濾液中のデキストランの示差屈折率を測定し、これらの測定値からデキストランのふるい係数を算出する。デキストラン濃度の測定は、次のように行った。サンプリングした溶液を細孔径0.5ミクロンのフィルターで濾過し、その濾液をＧＰＣ用カラム(東ソーTSK-gel-G3000PWＸＬ)、カラム温度40℃、移動相を液クロ用蒸留水1mL/min、サンプル打ち込み量100μlで分析を行い、示差屈折率計(東ソー社製 RI-8020)にてslice time 0.02min、base-line-range 4.5〜11.0minで測定する。カラムのキャリブレーションは、測定直前に単分散のデキストラン（Ｆｌｕｋａ社製デキストランスタンダード No.31416,No.31417,No.31418,No.31420,No.31422）を用いて行う。キャリブレーションでは、各デキストランスタンダードをNo.31416,No.31418,No.31422とNo.31417,No.31420に分けて、各々0.5mg/mLに溶解し、各々のピークトップのretention timeと重量平均分子量をプロットし、指数近似曲線を求めることでretention timeと重量平均分子量の関係を求めた。ふるい係数は、モジュール原液入口の示差屈折率値（Ｃｉ）、出口の示差屈折率値（Ｃｏ）、濾液の示差屈折率値（Ｃｆ）を測定し、以下の式によりふるい係数（ＳＣ）を算出することができる。
【００３５】
ＳＣ＝２Ｃｆ／（Ｃｉ＋Ｃｏ）
得られたデキストラン重量平均分子量１．５万のふるい係数をデキストラン重量平均分子量６万のふるい係数で除した値を透過比率とする。
（実施例１）
東レ株式会社製透析器ＴＳ２．１ＭＬの両端の樹脂接着部分を切り、中空糸膜を得た。得られた中空糸膜の寸法は、内直径200μm膜厚40μmであり、中空糸膜の構造を電子顕微鏡（日立社製Ｓ８００）にて確認したところ非対称構造を有していた。
【００３６】
該中空糸膜を100本束ね、中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で両末端をポリカーボネート製モジュールケースに固定し、ミニモジュールを作成した。該ミニモジュールの内直径は約5mm、長さは約12cmであり、一般的な中空糸膜型透析器同様に中空糸の内側のポート（血液ポート）を２個と外側のポート（透析液ポート）を２個有していた。該ミニモジュールの中空糸およびモジュール内部を蒸留水にて洗浄した。
【００３７】
このようなミニモジュールを２本作成し、一本にはPBS（日水製薬社製ダルベッコPBS（−））水溶液を充填し、残りの１本には蒸留水を充填した。そして、蒸留水を充填した１本のデキストランのふるい係数を測定したところ、分子量１１０００のふるい係数は０．５４２、分子量６７０００のふるい係数は０．０１４５であった。残りの１本（PBS水溶液を充填したもの）は以下の実験に用いた。
【００３８】
ヒト血清（SIGMA社、H1388、 Lot 122K0424）を3000rpm、15分の条件にて遠心処理を行い濾液および沈殿物を取り除いた後0.45μｍのフィルター処理を行った。
【００３９】
一方、上述のミニモジュール１個を用いて図１に示すような装置を準備した。まず、ミニモジュールの中空糸膜の外側のポートの一つをキャップし、もう一つはシリコーンチューブをつなぎ、途中に濾過を行うためのペリスターポンプを設けた。中空糸膜内側のポートについては各々シリコーンチューブをつなぎ原液槽に入れ、入口側のシリコーンチューブの途中にはペリスターポンプを設けて原液を循環できるようにした。原液槽にPBS水溶液を入れ、ペリスターポンプにて回路内をPBS水溶液で充填した。
【００４０】
次に、PBS水溶液が入っていた原液槽を一旦空にしてヒト血清1mlを入れ、このヒト血清を原液として、温度25℃、原液側循環回路の流量を3.0mL/min、濾過流速を0.6mL/minに保って中空糸膜内側に循環供給し、4時間の濾過を実施した。なお、濾過された容量分のPBS水溶液を原液槽に0.6ml/minで加えて循環することで、循環する液量を一定に保った。
【００４１】
そして、4時間経過後の濾液すなわち生体成分の組成が変化した溶液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度と、さらには4時間経過した後に循環回路内に残存していた溶液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度とを測定した。なお、アルブミン濃度はHuman Albumin ELISA Quantitation Kit (BETHYL社製Cat No. E80-129)にて測定し、β２−ミクログロブリン濃度は三洋化成工業株式会社製グラザイムβ２-Microglobulin-EIA TESTにて測定した。結果を表１に示す。また、循環処理開始時の循環回路内の液中のアルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度については、もともとの溶液量が少量であるためサンプリングが難しく測定ができないが、実測値と実質的に同じ値となる計算値を示す。なお、本実施例では、アルブミンの透過率が低い膜を使用しているため、循環開始時にはアルブミンの透過がほとんど起きていないと考えられる。したがって、全てのアルブミンが循環回路中に存在すると仮定して計算を行った。この結果、中空糸膜に供給されていた溶液中（血清＋ＰＢＳ水溶液）の総アルブミン量／供給側流路容量は、最も大きくなると考えられる処理開始時で11.5mg/ml、最も数値が小さくなると考えられる４時間経過後で10.3mg/mlであった。
【００４２】
また、各タンパク質の回収率を次のように求めた。
【００４３】
タンパク質の回収率（％）＝ （濾液液量×濾液中のタンパク質濃度）
（原液液量×原液中のタンパク質濃度）
上記のように計算した結果、アルブミンの回収率は、0.075%、β２−ミクログロブリンの回収率は100%であり、β２−ミクログロブリン量を維持しながら、アルブミンを大幅に除去することができた。
【００４４】
【表１】
【００４５】
（実施例２）
実施例１と同様にミニモジュールを１個作成し、図２に示すような装置を準備した。ミニモジュールは、外側ポートの一つをキャップし、他の一つはシリコーンチューブをつなぎ、透過用ペリスターポンプに接続した。一方、中空糸膜内側の液はモジュールの原液入口と原液出口をシリコーンチューブでつなぎ溶液循環回路となし、ペリスターポンプを用いて血清を循環できるようにした。また、溶液循環回路の途中には追加のＰＢＳ水溶液を投入する入口を設け、溶液循環回路内をPBS水溶液で充填した。
【００４６】
また、ヒト血清（SIGMA社、H1388、 Lot 122K0424）は、3000rpm、15分の条件にて遠心処理を行い濾液および沈殿物を取り除いた後0.45μｍのフィルター処理を行った。
【００４７】
次に、この血清をＰＢＳ水溶液にて３倍に希釈した溶液4mlを用いて、循環流量3ml/min、濾過流量0.6ml/minの流速で25℃、60分間濾過を実施した。この時、３倍希釈血清を0.6ml/minで溶液循環回路に流入させた後、濾過の容量分はPBS水溶液を0.6ml/minで溶液循環回路内に加えて、循環する液量を一定に保った。
【００４８】
そして、６０分経過後の濾液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度と、さらには６０分経過した後に循環回路内に残存していた溶液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度とを測定した。この結果を表１に示す。また、循環処理開始時の循環回路内の液中のアルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度については計算値を示す。この結果、中空糸膜に供給されていた溶液中の総アルブミン量／供給側流路容量は、最も大きくなると考えられる処理開始時で36.2mg/ml、最も数値が小さくなると考えられる６０分経過後で35.9mg/mlであった。さらに、各タンパク質の回収率を求めた結果、アルブミンの回収率は、0.408%、β２−ミクログロブリンの回収率は100%であり、β２−ミクログロブリン量を維持しながら、アルブミンを大幅に除去することができた。
【００４９】
（実施例３）
血清をＰＢＳ水溶液にて４倍に希釈した溶液4mlを用いた以外は、実施例２と同様に装置を準備し濾過を行った。
【００５０】
そして、６０分経過後の濾液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度と、さらには６０分経過した後に循環回路内に残存していた溶液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度とを測定した。この結果を表１に示す。また、循環処理開始時の循環回路内の液中のアルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度については計算値を示す。この結果、中空糸膜に供給されていた溶液中の総アルブミン量／供給側流路容量は、最も大きくなると考えられる処理開始時で22.5mg/ml、最も数値が小さくなると考えられる６０分経過後で22.3mg/mlであった。さらに、各タンパク質の回収率を求めた結果、アルブミンの回収率は、0.229%、β２−ミクログロブリンの回収率は76.0%であり、β２−ミクログロブリン量を維持しながら、アルブミンを大幅に除去することができた。
【００５１】
（実施例４）
血清をＰＢＳ水溶液にて８倍に希釈した溶液4mlを用いた以外は実施例２と同様に装置を準備し濾過を行った。
【００５２】
そして、６０分経過後の濾液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度と、さらには６０分経過した後に循環回路内に残存していた溶液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度とを測定した。この結果を表１に示す。また、循環処理開始時の循環回路内の液中のアルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度については計算値を示す。この結果、中空糸膜に供給されていた溶液中の総アルブミン量／供給側流路容量は、最も大きくなると考えられる処理開始時で11.8mg/ml、最も数値が小さくなると考えられる６０分経過後で11.6mg/mlであった。さらに、各タンパク質の回収率を求めた結果、アルブミンの回収率は、0.245%、β２−ミクログロブリンの回収率は100%であり、β２−ミクログロブリン量を維持しながら、アルブミンを大幅に除去することができた。
【００５３】
（実施例５）
血清をＰＢＳ水溶液にて１６倍に希釈した溶液4mlを用いた以外は、実施例２と同様に装置を準備し濾過を行った。
【００５４】
そして、６０分経過後の濾液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度と、さらには６０分経過した後に循環回路内に残存していた溶液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度とを測定した。この結果を表１に示す。また、循環処理開始時の循環回路内の液中のアルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度については計算値を示す。この結果、中空糸膜に供給されていた溶液中の総アルブミン量／供給側流路容量は、最も大きくなると考えられる処理開始時で6.7mg/ml、最も数値が小さくなると考えられる６０分経過後でも6.7mg/mlであった。さらに、各タンパク質の回収率を求めた結果、アルブミンの回収率は、0.169%、β２−ミクログロブリンの回収率は94%であり、β２−ミクログロブリン量を維持しながら、アルブミンを大幅に除去することができた。
（実施例６）
希釈していない血清4mlを用い、供給液流路径を大きくして供給液流路容量を変更した以外は、実施例２と同様に装置を準備し濾過を行った。
【００５５】
そして、６０分経過後の濾液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度と、さらには６０分経過した後に循環回路内に残存していた溶液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度とを測定した。この結果を表１に示す。また、循環処理開始時の循環回路内の液中のアルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度については計算値を示す。この結果、中空糸膜に供給されていた溶液中の総アルブミン量／供給側流路容量は、最も大きくなると考えられる処理開始時で35.9mg/ml、最も数値が小さくなると考えられる６０分経過後で35.7mg/mlであった。さらに、各タンパク質の回収率を求めた結果、アルブミンの回収率は、0.032%、β２−ミクログロブリンの回収率は87%であり、β２−ミクログロブリン量を維持しながら、アルブミンを大幅に除去することができた。
【００５６】
（実施例７）
血清をＰＢＳ水溶液にて４倍に希釈した溶液4mlを用い、供給液流路径を大きくして供給液流路容量を変更した以外は、実施例２と同様に装置を準備し濾過を行った。
【００５７】
そして、６０分経過後の濾液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度と、さらには６０分経過した後に循環回路内に残存していた溶液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度とを測定した。この結果を表１に示す。また、循環処理開始時の循環回路内の液中のアルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度については計算値を示す。この結果、中空糸膜に供給されていた溶液中の総アルブミン量／供給側流路容量は、最も大きくなると考えられる処理開始時で15.0mg/ml、最も数値が小さくなると考えられる６０分経過後で14.9mg/mlであった。さらに、各タンパク質の回収率を求めた結果、アルブミンの回収率は、0.063%、β２−ミクログロブリンの回収率は90%であり、β２−ミクログロブリン量を維持しながら、アルブミンを大幅に除去することができた。
（実施例８）
血清をＰＢＳ水溶液にて４倍に希釈した溶液4mlを用い、供給液流路径を大きくして供給液流路容量を変更した以外は、実施例２と同様に装置を準備し濾過を行った。
【００５８】
そして、６０分経過後の濾液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度と、さらには６０分経過した後に循環回路内に残存していた溶液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度とを測定した。この結果を表１に示す。また、循環処理開始時の循環回路内の液中のアルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度については計算値を示す。この結果、中空糸膜に供給されていた溶液中の総アルブミン量／供給側流路容量は、最も大きくなると考えられる処理開始時で7.5mg/ml、最も数値が小さくなると考えられる６０分経過後でも7.5mg/mlであった。さらに、各タンパク質の回収率を求めた結果、アルブミンの回収率は、0.039%、β２−ミクログロブリンの回収率は84%であり、β２−ミクログロブリン量を維持しながら、アルブミンを大幅に除去することができた。
【００５９】
（比較例１）
希釈していない血清4mlを用いた以外は、実施例２と同様に装置を準備し濾過を行った。
【００６０】
そして、６０分経過後の濾液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度と、さらには６０分経過した後に循環回路内に残存していた溶液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度とを測定した。この結果を表２に示す。また、循環処理開始時の循環回路内の液中のアルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度については計算値を示す。この結果、中空糸膜に供給されていた溶液中の総アルブミン量／供給側流路容量は、最も大きくなると考えられる処理開始時で105.0mg/ml、最も数値が小さくなると考えられる６０分経過後で99.8mg/mlであった。さらに、各タンパク質の回収率を求めた結果、アルブミンの回収率は、3.81%、β２−ミクログロブリンの回収率は84%であった。すなわち、アルブミンとβ２−ミクログロブリンとを十分に分離できなかった。
【００６１】
【表２】
【００６２】
（比較例２）
血清をＰＢＳ水溶液にて２倍に希釈した溶液4mlを用いた以外は、実施例２と同様に装置を準備し濾過を行った。
【００６３】
そして、６０分経過後の濾液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度と、さらには６０分経過した後に循環回路内に残存していた溶液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度とを測定した。この結果を表２に示す。また、循環処理開始時の循環回路内の液中のアルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度については計算値を示す。この結果、中空糸膜に供給されていた溶液中の総アルブミン量／供給側流路容量は、最も大きくなると考えられる処理開始時で64.9mg/ml、最も数値が小さくなると考えられる６０分経過後で63.6mg/mlであった。さらに、各タンパク質の回収率を求めた結果、アルブミンの回収率は、1.34%、β２−ミクログロブリンの回収率は99%であった。すなわち、アルブミンとβ２−ミクログロブリンとを十分に分離できなかった。
（比較例３）
血清をＰＢＳ水溶液にて４０倍に希釈した溶液4mlを用いた以外は、実施例２と同様に装置を準備し濾過を行った。
そして、６０分経過後の濾液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度と、さらには６０分経過した後に循環回路内に残存していた溶液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度とを測定した。この結果を表２に示す。また、循環処理開始時の循環回路内の液中のアルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度については計算値を示す。この結果、中空糸膜に供給されていた溶液中の総アルブミン量／供給側流路容量は、最も大きくなると考えられる処理開始時で2.3mg/ml、最も数値が小さくなると考えられる６０分経過後で2.2mg/mlであった。さらに、各タンパク質の回収率を求めた結果、アルブミンの回収率は、1.13%、β２−ミクログロブリンの回収率は79%であった。すなわち、アルブミンとβ２−ミクログロブリンとを十分に分離できなかった。
（比較例４）
血清をＰＢＳ水溶液にて４倍に希釈した溶液4mlを用い、供給液流路径を大きくして供給液流路容量を変更した以外は、実施例２と同様に装置を準備し濾過を行った。
【００６４】
そして、６０分経過後の濾液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度と、さらには６０分経過した後に循環回路内に残存していた溶液の容量、アルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度とを測定した。この結果を表２に示す。また、循環処理開始時の循環回路内の液中のアルブミン濃度およびβ２−ミクログロブリン濃度については計算値を示す。この結果、中空糸膜に供給されていた溶液中の総アルブミン量／供給側流路容量は、最も大きくなると考えられる処理開始時で5.0mg/ml、最も数値が小さくなると考えられる６０分経過後で5.08mg/mlであった。さらに、各タンパク質の回収率を求めた結果、アルブミンの回収率は、0.021%、β２−ミクログロブリンの回収率は67%であった。すなわち、アルブミンとβ２−ミクログロブリンとを十分に分離できなかった。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】実施例１で用いた分離システムの概念図である。
【図２】実施例２〜８および比較例１〜４で用いた分離システムの概念図である。
【符号の説明】
【００６６】
１００ 注入用ポンプ
１０１ 原液槽
１０２ 溶液循環回路
１０３ 循環用ポンプ
１０４ 処理液回収口
１０５ 分離膜モジュール
１０６ モジュールの下部ポート
１０７ 濾過用ポンプ
２００ 注入用ポンプ
２０１ 三方バルブ
２０２ 溶液循環回路
２０３ 循環用ポンプ
２０４ 膜分離ユニット処理液回収口
２０５ 分離膜モジュール
２０６ モジュールの下部ポート
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体成分含有溶液中のタンパク質および／またはペプチドを分析するに際して、該生体成分含有溶液を、分子量６．７万のデキストランのふるい係数が０．１以下である分離膜に循環供給して前処理し、かつ、該生体成分含有溶液は、液中の総アルブミン量／供給側流路容量の比が６〜６０ｍｇ／ｍｌの範囲内になるように調整して前記分離膜に供給することを特徴とする生体成分含有溶液の前処理方法。
【請求項２】
前記生体成分含有溶液を閉鎖系回路内で循環することを特徴とする請求項１に記載の生体成分含有溶液の前処理方法。
【請求項３】
前記分離膜として中空糸膜を用いることを特徴とする請求項１または２に記載の生体成分含有溶液の前処理分離精製方法。
【請求項４】
前記生体成分含有溶液が、血液由来物、尿、腹水、唾液、涙液、脳脊髄液、胸水および細胞からタンパク質を抽出した溶液からなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の生体成分含有溶液の前処理方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載された前処理方法を用いてタンパク質および／またはペプチドの分析溶液を精製する分析溶液精製方法。
【請求項１】
生体成分含有溶液中のタンパク質および／またはペプチドを分析するに際して、該生体成分含有溶液を、分子量６．７万のデキストランのふるい係数が０．１以下である分離膜に循環供給して前処理し、かつ、該生体成分含有溶液は、液中の総アルブミン量／供給側流路容量の比が６〜６０ｍｇ／ｍｌの範囲内になるように調整して前記分離膜に供給することを特徴とする生体成分含有溶液の前処理方法。
【請求項２】
前記生体成分含有溶液を閉鎖系回路内で循環することを特徴とする請求項１に記載の生体成分含有溶液の前処理方法。
【請求項３】
前記分離膜として中空糸膜を用いることを特徴とする請求項１または２に記載の生体成分含有溶液の前処理分離精製方法。
【請求項４】
前記生体成分含有溶液が、血液由来物、尿、腹水、唾液、涙液、脳脊髄液、胸水および細胞からタンパク質を抽出した溶液からなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の生体成分含有溶液の前処理方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載された前処理方法を用いてタンパク質および／またはペプチドの分析溶液を精製する分析溶液精製方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−３４３２２０（Ｐ２００６−３４３２２０Ａ）
【公開日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１６９２２１（Ｐ２００５−１６９２２１）
【出願日】平成１７年６月９日（２００５．６．９）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月９日（２００５．６．９）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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