生物兵器防衛のための免疫療法
ヒト中和抗体（全長または機能的フラグメント）は、例えば、炭疽菌、ボツリヌス菌、天然痘、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）などの感染性因子に対する、抗毒素剤または抗感染剤として有用である。ファージディスプレイ技術および予防接種したヒトまたは回復期のヒトのリンパ細胞由来のメッセンジャーＲＮＡを使用して、本明細書中に記載した方法に従って、感染性因子由来の抗原に結合する抗体フラグメント（Ｆａｂ）のパネルを迅速に同定することが可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、それぞれ２００２年２月１１日、２００２年４月２９日、２００２年１１月２５日に出願された、米国特許仮出願番号第６０／３５６，０８６号、６０／３７６，４０８号および６０／４２８，８０７号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
（技術分野）
本開示は、例えば、炭疽菌、ボツリヌス菌、痘瘡、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）などの感染性病原体に関して、抗毒素または抗感染薬として有用である、ヒト中和抗体（全長または機能性フラグンメント）に関連する。
【０００３】
（関連技術の背景）
米国における最近のテロ行為の活動を受けて、炭疽菌感染を防止し、および処置する我々の能力に対する懸念が高くなっている。炭疽菌のためのワクチンは存在するが、６回の間隔を開けた接種からなり、毎年の追加免疫を必要とし、ほとんどのワクチンにおいて不愉快な副作用を生じる。このことが、広く行き渡った使用を妨げ、そして、公衆に予防接種するためには、今でも大きな障害となっている。現在使用されている炭疽菌ワクチンは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓの溶解物由来の保護抗体の精製を包含するプロセスを介してＢｉｏｐｏｒｔ（Ｌａｎｓｉｎｇ、ＭＩ）により製造される。このワクチンを産生するために使用され得るＬＦおよびＥＦを欠如する他の株が存在し、ならびに使用され得る高産生組換えＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ株も存在するが、これは、さらに、スターン生存ワクチン株のようである。おそらく、このようなさらなるワクチンを試験することおよび比較することの困難性ならびに小さな市場が、実際の試験、使用許可、製造を妨げてきた。現在のワクチンの副作用は、湾岸戦争症候群と多くの点で関係していて、大規模のワクチン接種が、テロリストの脅しに直面して現在価値があり得る可能性は、現在のワクチンにおける改良が、現在追求されることを示唆している。適当なワクチンがない限りは、曝露に対する処置は、テロリズムの活動に対する主要な応答として残っている。
【０００４】
米国において、最近の、汚染された手紙由来の炭疽菌曝露は、全て抗生物質に対して感受性の炭疽菌の株が関与している。しかし、悲劇的に、多くの人々が診断の遅れのために死んでいる。このことをふまえて、疾患および死を防止し得、抗生物質治療および／または適応免疫性をさらなる時間効果的にすることを可能にする炭疽菌暴露に対する処置を有することが有用である。
【０００５】
炭疽菌に由来する死の第１の原因は、細菌により生成される２つの関連した毒素に対する身体の反応である。これらは、両方とも、ＰＡ６３にプロセスされるとすぐに、ＰＡ８３として細胞レセプターに結合するＰＡ６３と呼ばれるプロセスされたタンパク質を含む。炭疽菌毒素に対するヒト細胞上のレセプター、ＡＴＲ（炭疽菌毒素受容体（ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ））は、最近同定された。Ｂｒａｄｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ、４１４巻、２００１年１１月８日を参照のこと。次いで、ＰＡ６３は、ＥＦタンパク質（エデマ因子）かまたはＬＦタンパク質（致死因子）のいずれかに結合し得る七量体を生成する。七量体化ＰＡ６３ならびに結合ＥＦおよび／またはＬＦのエンドソーム内在化は、細胞内へＥＦ毒素およびＬＦ毒素の誘導を促進する。エンドソーム小胞の酸性化は、ＥＦおよび／またはＬＦが細胞質ゾルに入り得、そこでそれらの毒性効果を発揮する微細孔をＰＡ七量体が、形成することを誘導する。３つの成分、ＥＦ、ＬＦまたはＰＡのいずれもが、それ自体では、疾患を引き起こし得ない。
【０００６】
いくつかの連続した証拠は、ＰＡのレセプターへの結合の防止し得ること、またはＥＦおよびＬＦのＰＡとの相互作用を妨害し得ることを示している。ワクチンそれ自体は、防御的抗体を作製するために、精製ＰＡ部分のみを使用している。Ｌｉｔｔｌｅら（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：５１７１〜５１７５（１９９７））は、ＰＡ抗体をモルモットに受動的に投与した。次いで、モルモットは、後の炭疽菌感染に対する防御を示した（ポリクローナル抗体では、７０％の防御であり、１つのＰＡ６３モノクローナル抗体では、死が２日間遅れた）。単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖｓ）は、ＰＡによる受容体結合を阻害するために使用されてきた。Ｃｉｒｉｎｏら（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：２９５７〜２９６３（１９９９））は、ＰＡ８３に結合する未処置のヒトライブラリーから多くのｓｃＦｖｓを同定した。彼らは、次いで、これらを細胞に基づいたアッセイに使用し、ここで、ＰＡ３２（ＰＡ６３の短縮型）がＥＧＦＰに融合し、その後、ＰＡ６３と類似の方法で細胞に取り入れられた。次いで、細胞の吸収におけるＰＡ３２−ＥＧＦＰに対するこれらｓｃＦｖｓの効果をモニタリングするために、ＥＧＦＰの蛍光を使用し得た。細胞によるＰＡ３２−ＥＧＦＰの吸収を防止し得る１つのｓｃＦｖが、同定された。Ｍｏｕｒｅｚら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：９５８〜９６１（２００１））は、ＥＦ／ＬＦ部位においてまたは近辺でＰＡ６３七量体に結合する炭疽菌毒素に対する多価ペプチドインヒビターを作製した。彼らは、細胞に基づいたアッセイを使用して、このインヒビターが、ＰＡ／ＬＦ毒性に対して細胞を防御し得ることを示した。彼らはまた、インヒビターをチャレンジの３〜４分間後に導入した場合、ラットを最低致死用量のＰＡおよびＬＦの１０倍でチャレンジし、その後まだ防御されていることを示した。
【０００７】
これらのデータは全て、炭疽菌感染の遅れた診断を受ける患者に、抗生物質を用いた組み合わせ治療のための治療用ヒト組み合わせ抗体を開発することを可能とすることを示唆している。
【０００８】
ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＶＥＥＶ）は、ウマおよびヒト宿主の両方に運ばれ得る蚊運搬アルファウイルスである。ウマおよびロバの集団の感染が、高い死亡率を生じ得るのに対して、天然のヒト感染は、通常、発熱、悪寒、倦怠感および激しい頭痛からなり、１〜４％のヒトしか重度の脳炎には進行しない。しかし、ＶＥＥＶは、その低いヒト感染性用量、容易な作製およびエアゾール化し得ることのために、ＣＤＣにより、「区分Ｂ」重要生物学的病原体として分類されてきた。潜在的に、エアゾール化したＶＥＥＶは、高い感染性があるとして公知の、および嗅索による中枢神経系への直接的接近手段を容易に得ることができるＶＥＥＶの形態を使用して効果的な生物兵器として使用され得る。ウイルスの複製がＣＮＳ中で一旦生じると、脳炎は本格的なリスクになる。不幸にも、ＶＥＥＶ感染の処置は、対症的な治療に限定されている。
【０００９】
その使用は、危険に曝された研究所就業者および軍隊に限定されているが、ＶＥＥＶに対して利用可能な治験ワクチンがある。生存力を弱めたワクチン、ＴＣ−８３（ＦＤＡ治験新薬 ＃１４２）（Ｐｉｔｔｍａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ １４、ｐｐ３３７〜３４３（１９９６））は、これら双方の環境で使用されてきた。このワクチンは、組織培養中の、伝染性の強いトリニダードロバウイルスのいくつかの継代により樹立された。ＴＣ−８３ウイルスは、ほとんどのヒトおよびウマにおいて、ＶＥＥＶ特異的中和抗体を誘発させる（Ｋｉｎｎｅｙら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０、１９〜３０（１９８９））。実験動物では、ワクチンは、伝染性の強いＶＥＥＶ株を有する皮下のチャレンジまたは気中チャレンジに対する免疫性を産生し得た（Ｐｈｉｌｌｐｏｔｔｓ、Ｖａｃｃｉｎｅ １７、ｐｐ２４２９〜２４３５（１９９９））。しかし、ヒトワクチンの１８％までは、最初のワクチン接種から防御を発現しない。さらに、ワクチンは、比較的高い比率の反応性遺伝子（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）（２５％）を有する。最近の１つの報告は、ＴＣ−８３が、もはやヒト使用には利用不可能であると記載する（Ｐｈｉｌｌｐｏｔｔｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ ２０、ｐ１４９７〜１５０４（２００２））。ＴＣ−８３に関する関心事は、不活性化ワクチン、Ｃ−８４の開発を促進した。しかし、Ｃ−８４は、動物モデルにおけるウイルスの伝染性の強い株を用いたエアゾールチャレンジに対して防御を産生しなかった（Ｐｉｔｔｍａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１４、ｐｐ３３７〜３４３（１９９６））。結果として、Ｃ−８４は、初期免疫原としては、研究所就業者には使用されないが、ＴＣ−８３に対する非応答者のために引き続き行うワクチンとして、または追加免疫として、（ここで、それはリコール抗原（ｒｅｃａｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ）として作用する）かなり有用である。従って、抗ＶＥＥＶ治療（例えば、強い中和抗ＶＥＥＶ抗体）に対する切迫した需要がある。
【００１０】
ＶＥＥＶは、膜ウイルスであり、ここで、膜およびキャプシド構造は、脂質二重層により分離されていて、そして、Ｅ２糖タンパク質の膜貫通末端を介して相互作用していると考えられる。シンドビスウイルスと似て、ＶＥＥＶは、Ｅ１／Ｅ２ヘテロ二量体の三量体として組織化されたビリオンタンパク質鋭利部を有する（Ｐａｒｅｄｅｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７５、ｐｐｐ９５３２〜９５３７（２００１）；Ｐｈｉｎｎｅｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７４、ｐｐ５６６７〜５６７８（２０００））。Ｅ１（ｇｐ５０）およびＥ２（ｇｐ５６）に存在し、重要な中和部位に関与し得るエピトープは、モノクローナルＡｂｓを使用して研究されてきた（ＭａｔｈｅｗｓおよびＲｏｅｈｒｉｇ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｐｐ２７６３〜２７６７（１９８２））。部位Ｅ２Ｃは、Ｅ２鋭利部の先端に存在し、中和（Ｎ）エピトープになると考えられている。さらなるエピトープもまた、中和活性を示し、Ｅ２Ｃ部位と近接した構造関係を有し得る。
【００１１】
ＶＥＥＶ感染のマウスモデルは、ヒトにおける疾患の病原と類似した疾患の病原に従うと考えられる。ウイルスチャレンジ前のＡｂ中和の受動的な移動は、これらの通常のマウスにおいて、効果的に死を防止する（ＲｏｅｈｒｉｇおよびＭａｔｈｅｗｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８５）１４２、ｐｐ３４７〜３５６；Ｐｈｉｌｌｐｏｔｔｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００２）２０、１４９７〜１５０４）を参照のこと）。非中和Ａｂｓもまた、マウスの腹腔内または静脈内のウイルスチャレンジにおいて防御を示した（ＨｕｎｔおよびＲｏｅｈｒｉｇ、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９５）１３、ｐｐ２８１〜２８８；およびＨｕｎｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）１８５、２８１〜２９０）。非中和Ａｂのウイルスチャレンジからの防御機構は理解されていないが、それらは、ウイルスの複製を遅らせることにより作用し得、そしてそうすることで、宿主免疫系にウイルス感染に反応する時間およびウイルス感染を制御する時間を与えると推測される（Ｈｕｎｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）１８５、２８１−２９０）。ＶＥＥＶの気中浮遊曝露に対して、ヒトのための効果的な治療は、例えば、曝露の時間におけるまたは曝露の時間に近い時間でウイルスの直接的な中和のような処置の速いやり方を必要とし得る。Ａｂを中和する性能は、ＶＥＥＶの脳への拡散を防止することと特定の関係にある。この点で、気中ウイルスチャレンジ２４時間後までの中和Ａｂのマウスへの投与が、防御効果を示すことが重要である（Ｐｈｉｌｌｐｏｔｔｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０、１４９７〜１５０４（２００２））。
【００１２】
これらおよび類似の研究に記載されたマウス抗体は、ヒトにおけるＶＥＥＶ感染の防止および処置において使用される抗体であり得る。しかし、げっ歯類の抗体は、ヒトでは免疫原性が高く、従って、特に繰り返し投与が治療のために必要な場合には、それらの臨床的応用は限定される。抗体ヒト化と名づけられたプロセスは、元の抗原特異性を維持しようと努力するのに対して、げっ歯類抗体のほとんどをヒト抗体領域で置き換えることにより、げっ歯類抗体の免疫原性を減少するために使用され得る。しかし、この取り組みは、通常、時間およびコストがかかり、ヒト化Ａｂに対する免疫原性反応の可能性を除外しない。十分ヒト化し、ＶＥＥＶ上の中和エピトープを標的とする抗体は、ウイルス感染の効果的な阻害の最良の機会をもたらし、および免疫原性の最小限のリスクが存在する最も所望される治療候補である。
【００１３】
ボツリヌス神経毒は、公知の最も強力な細菌毒の１つであり、ヒトに対するＬＤ５０は、１ｎｇ／ｋｇである。この毒素は、細菌Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍにより産生され、他の数種のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種によってもまた産生され、そして、７つの毒素の抗原型（ＡからＧ）が認められている。分子レベルでは、毒素は、１５０ｋＤａのタンパク質として産生され、プロテアーゼに曝露されることにより切断され、結合を残した２つの鎖：約５０ｋＤａの軽鎖および１００ｋＤａの重鎖を生成する。重鎖は、神経細胞への結合に関与するドメインを含み、それに対して軽鎖は、神経細胞質ゾルに入る亜鉛依存性エンドプロテアーゼドメインを含む。一旦内側に入ると、このエンドプロテアーゼは、シナプスタンパク質（シナプトブレビン、シンタキシンおよびＳＮＡＰ−２５を含む）のタンパク質分解によりその毒性効果を発揮する。これらのタンパク質の分解は、神経伝達を阻害し、そして、進行性麻痺および死を生じる。
【００１４】
ボツリヌス神経毒に対する抗体は、受動的および能動的免疫モデルにおいて、防御的であることを示している。抗原型Ａ〜ＥからなるＰＢＴワクチンは、ボツリヌス神経毒に曝露される危険性がある人々に対して、現在、国防総省および疾病対策予防センターにより入手可能である。抗原型ＤおよびＧは、天然のヒト感染においては、めったに接触しない。しかし、抗原型Ｆは、一般的であり、ＰＢＴワクチンが欠如している。しかし、抗原型ＤおよびＧの生物テロリストの攻撃に使用される可能性は、見落とされるべきではない。天然の感染では、ポリクローナル抗体の調製は、免疫療法として首尾よく使用されているが、神経細胞への毒素の侵入を最小限にするために、感染の初期に与えられなければならない。いくつかのポリクローナル免疫グロブリンの調製物：ウマの三価（Ａ、ＢおよびＥ）調製物、免疫グロブリンのＦｃ部分がプロテイナーゼ切断により取り除かれたウマ七価調製物およびＰＢＴワクチンを予防接種したドナーから入手したヒト免疫グロブリン調製物（ｈＢＩＧ）が、免疫療法として利用可能である。ウマからの調製物はいずれも処置した個体に過敏な反応を伴う困難を有した。ヒトからの調製物は、耐用性良好であり、効果的であるが、供給不足であり、７つの抗原型の５つに対してしか有用ではない。天然感染に対してさえ、ボツリヌス神経毒の全ての抗原型に対する十分なヒト中和抗体を即時に供給することは有用である。２００１年の故意の炭疽菌の放出の後の生物学的テロリズムに対する私たちの無防備さへの増大する認識は、このような免疫療法の開発をさらに重要にする。
【００１５】
１９８０年５月の天然痘根絶の宣言（Ｆｅｎｎｅｒら、１９９８）およびワクチンプログラムの休止以来、予防注射された人の免疫性は衰えてきており、そして、１９８０年以降に出生した人は、予防注射されていない。世界的な免疫性の欠如は、痘瘡ウイルス、生物兵器としての天然痘の原因となる薬剤の故意の放出の脅威を劇的に増加した。痘瘡ウイルスは、それを生物学的戦争に特に適したものにする特徴を有している。ウイルスは、呼吸経路によるかまたは直接の接触により、人から人へ拡散し得る。ウイルスのエアゾール放出は、エアゾール形態中でのそのかなりの安定性のために、および伝染性用量がとても小さい（Ｗｈｅｒｌｅら、１９７０）ために広く散布し得る。疾患に対する特定の処置はない。大量の感染性ウイルスがなくなり得る脅威もまたある。Ａｌｉｂｅｋ、ソビエト連邦の民間生物兵器プログラムの前副長官は、１９８０年の初めにソビエト政府が生物兵器プログラムを開始し、爆弾および弾道ミサイルに輸送するために、毎年、多量の痘瘡ウイルスを作製する方法を開発したと報告した（Ａｌｉｂｅｋ、１９９９）。財政支援の減少および１９９２年のソビエトの民間生物戦争プログラムの中止とともに、熟練した科学者、設備および材料が、他の国に運ばれ得た。報告されたアジアでの流行は、３０％かまたはそれより高い死亡率を有した（Ｆｅｎｎｅｒら、１９９８）。現在、より感受性があり、移動も頻繁な集団が原因となり、ウイルスは、国および世界中に、非常に速くおよび広く拡散し得る。
【００１６】
痘瘡ウイルスは、ＤＮＡウイルスであり、ワクシニア、サル痘ウイルスおよび血清学的に交差反応するいくつかの他の動物のポックスウイルスを含むポックスウイルス科およびオルソポックスウイルス属のファミリーの一部である（Ｆｅｎｎｅｒら、１９８８）。痘瘡ウイルスのみが、すぐにヒトからヒトへ感染し得る（ＢｒｅｍａｎおよびＨｅｎｄｅｒｓｏｎにより総説される、２００２）。ＤＮＡ配列分析により、痘瘡およびワクシニアウイルスは近い関係にあることが明らかになった（Ｍａｓｓｕｎｇら、１９９４）。痘瘡ウイルスの感染用量は、非常に低く、たった数ビリオンであると考えられる（Ｗｈｅｒｌｅら、１９７０）。痘瘡ウイルスは、そのゲノムを転写し、および複製し、子孫ビリオンを感染細胞の細胞質内に完全に集める（Ｍｏｓｓにより総説される、１９９６）。４つの型の感染性の形態が産生される：細胞内成熟ウイルス（ＩＭＶ）、細胞内膜ウイルス（ＩＥＶ）、細胞結合型膜ウイルス（ＣＥＶ）および細胞外膜ウイルス（ＥＥＶ）（Ｍｏｓｓにより総説される、１９９６）。ＩＭＶは、細胞質に残る主要な形態である。ＥＥＶは、感染粒子の、より小さい画分を代表するが、インビトロおよびインビボのウイルスの長期的な蔓延および拡散の点で、生物学的に関連した形態である（Ｐａｙｎｅ、１９８０；ＳｍｉｔｈおよびＶａｎｄｅｒｐｌａｓｓｃｈｅｎ、１９９８；ＬａｗおよびＳｍｉｔｈ、２００１）。ＩＭＶではなく、ＥＥＶに対する免疫反応が、オルソポックスウイルス感染に対する防御のために必要であることが示された（Ａｐｐｌｅｙａｒｄら、１９７１；Ｂｏｕｌｔｅｒ、１９６９；ＢｏｕｌｔｅｒおよびＡｐｐｌｅｙａｒｄ、１９７３、Ｂｏｕｌｔｅｒら、１９７１；Ｉｃｈｉｈａｓｈｉら、１９７１；Ｍｏｒｇａｎ、１９７６；Ｐａｙｎｅ、１９８０；ＰａｙｎｅおよびＫｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ、１９８５；ＴｕｒｎｅｒおよびＳｑｕｉｒｅｓ、１９７１）。ＥＥＶの外膜のための１０個のタンパク質をコードする６個の遺伝子が報告されている（Ｐａｙｎｅ、１９７８；Ｐａｙｎｅ、１９７９）。それらは、Ａ３３Ｒ（ｇｐ２２〜２８）（Ｒｏｐｅｒら、１９９６）、Ａ３４Ｒ（ｇｐ２２〜２４）（ＤｕｎｃａｎおよびＳｍｉｔｈ、１９９２）、Ａ３６Ｒ（ｐ４５〜５０）（ＰａｒｋｉｎｓｏｎおよびＳｍｉｔｈ、１９９４）、Ａ５６Ｒ（ｇｐ８６、かなりグリコシル化した血液凝集素）（ＰａｙｎｅおよびＮｏｒｒｂｙ、１９７６；Ｓｈｉｄａ、１９８６）、Ｂ５Ｒ（ｇｐ４２）（Ｉｓａａｃｓら、１９９２；Ｅｎｇｌｅｓｔａｄら、１９９２）およびＦ１２ＬまたはＦ１３Ｌ（ｐ３７）（Ｈｉｒｔら、１９８６；ＢｌａｓｃｏおよびＭｏｓｓ、１９９１）である。最近、Ａ３６Ｒタンパク質が、ＣＥＶおよびＥＥＶ粒子には、存在しないことが発見された（ｖａｎ Ｅｉｊｌら、２０００）。ＩＭＶの膜タンパク質は、Ａ２７Ｌ（ｐ１４）（ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＥｓｔｅｂａｎ、１９８５）、Ｄ８Ｌ（ｐ３２）（Ｍａａら、１９９０；ＮｉｌｅｓおよびＳｅｔｏ、１９８８）、Ａ１７Ｌ（ｐ２１）（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、１９９５）およびＬ１Ｒ（Ｍ２５、ミリスチル化ビリオンタンパク質）（Ｆｒａｎｋｅら、１９９０）である。Ａ２７Ｌ、Ａ１７ＬおよびＬ１Ｒは、ＩＭＶの融合および侵入に関係する（ＩｃｈｉｈａｓｈｉおよびＯｉｅ、１９９６）。
【００１７】
ワクチンウイルスから製造された天然痘ワクチンは、これまでに製造された最初のワクチンであった。現在の備蓄は、子牛の皮膚で増殖された、生きているワクチンウイルスからなる。米国では、蓄えの供給は、限られている：６〜７百万人の人々に予防接種するために十分な量だけ存在する。他の国はどこも、発生した場合、その国の人口を網羅するために十分な量を有していない。天然痘の予防接種は、また、他の任意の型の予防接種よりも重篤な副作用と結びつき、それが、根絶後、予防接種を終らせた理由の一つである（Ｏｂｅｒら、２００２）。現在、世界保健機関および米国、疾病対策予防センターにより、疑わしい場合にのみ、使用が推奨され、大衆に対する予防接種は、推奨されていない（Ｓｍａｌｌｗｏｏｄら、２００２）。ワクチンウイルスを用いた予防接種は、少なくとも５年間は天然痘を予防する点で効果的であり、かなり長い期間、感染を予防し得るかまたは改変し得るが、この変動は、ヒトにより大きく異なる。
【００１８】
中和抗体が、オルソポックスウイルスに対する免疫性において、特に再感染の防止および感染の蔓延の予防において、重要な役割を演じるということには、一般的な合意がある。感染を防止するかまたは痘疹予防接種由来の副作用を制御する点における痘疹免疫グロブリン（ＶＩＧ）の利点は、明らかに実証された（Ｋｅｍｐｅ、１９６０、Ｋｅｍｐｅら、１９６１、Ｈｏｂｄａｙ、１９６２）。組換えＢ５Ｒタンパク質に対するポリクローナル抗血清は、ＥＥＶ感染を阻害した（Ｇａｌｍｉｃｈｅら、１９９９）。Ｂ５Ｒタンパク質を予防接種したマウスは、中和抗体により媒介されるようである痘疹ウイルスにより、致死性感染に対して保護された。タンパク質Ａ３４ＲでもＡ３６Ｒでもなく、Ａ３３Ｒが、能動免疫および受動免疫おいて保護的であるが、保護は、抗体の力価と関連せず、抗Ａ３３Ｒ抗体は、インビトロでＥＥＶを中和しなかった。著者らは、保護がおそらく単一の抗体結合とは異なる機構と関与していることを記載した（Ｇａｌｍｉｃｈｅら、１９９９、Ｓｃｈｍａｌｊｏｈｎら、１９９９）。ＩＭＶの膜に局在する痘疹ウイルスの１４ｋＤａ三量体タンパク質（Ａ２７Ｌ、ｐ１４）に対するマウス中和抗体の予防的投与ならびに治療的投与は、マウスにおけるウイルスの複製を効果的に制御する（Ｒａｍｉｒｅｚら、２００２）。Ｌ１ＲおよびＡ３３Ｒ遺伝子を有するＤＮＡワクチンは、Ｌ１ＲおよびＡ３３Ｒに対する中和抗体を用いて、致死ウイルス感染に対してマウスを保護した（Ｈｏｏｐｅｒら、２０００）。
【００１９】
新生感染性疾患の最近の論点（Ｃａｓａｄｅｖａｌ、２００２）で記載されたように、生物学的薬剤に対して即時の免疫性を提供し得る唯一の利用し得る対抗手段は、抗体を有する受動免疫である。ワクチンは、保護免疫性を誘導するために、時間を要し、宿主の免疫反応を組み込む能力に依存するが、受動免疫は、宿主の免疫状態に関わらず、理論上、保護を与え得る。低細胞毒性および高特異的活性は、曝露後の処置の他の測定に対する受動免疫の利点の内の一つである。
【００２０】
良好な血清中和活性およびこのようなドナーの骨髄由来のコンビナトリアル抗体ライブラリーの構築を用いた免疫ドナーの同定は、ウイルス感染に対する特異性の高い中和抗体の大きなパネルの単離のための論理的なアプローチである（Ｂｕｒｔｏｎら、１９９１；Ｂａｒｂａｓら、１９９２；Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、１９９３；Ｂｕｒｉｏｎｉら、１９９４；Ｍａｒｕｙａｍａら、１９９９；Ｍａｒｕｙａｍａら、２００２）。中和エピトープを含む組換えエンベロープタンパク質に関するライブラリーの選択は、直接的である。マウス抗体とは違って、ヒト抗体は、非免疫原性であり、一度その効力が、感受性のある動物で十分に特徴付けられると、それらは、患者に安全に投与され得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
生物兵器で使用され得る型の感染性因子を中和する抗体を同定することが好ましい。これらの生物保護抗体が単一の抗体ライブラリーに由来し得る場合もまた、好都合である。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
（要旨）
ファージディスプレイ技術および予防接種したヒトまたは回復期のヒトのリンパ細胞由来のメッセンジャーＲＮＡを使用して、本明細書中に記載した方法に従って、感染性因子由来の抗原に結合する抗体フラグメント（Ｆａｂ）のパネルを迅速に同定することが可能である。これらのＦａｂの抗原との相互作用の強さは、表面プラスモン共鳴を使用した結合動力学を研究することにより決定され得る。これらのヒトＦａｂは、残存する定常領域ドメインを含む、適切な哺乳動物の発現ベクター中にサブクローニングすることにより、容易に全長ＩｇＧに受理され得る。これらのパネル由来のＦａｂおよび抗体を、小動物モデルでのインビトロおよびインビボでウイルスまたは毒性阻害研究において試験することにより、前臨床試験および臨床試験の継続に適した中和抗体のサブセットを同定し得る。これらの抗体は、次いで、上記因子のいずれかに感染したかまたは曝露された個体の処置において、免疫治療剤として使用され得るか、または、曝露の危険が予想される個体に予防的に使用され得る。
【００２３】
従って、一つの局面では、抗体またはその機能性フラグメントが、感染性因子による感染を中和するかまたは予防するために、同定され得、単離され得、多量に産生され得る抗体ライブラリーが、記載される。
【００２４】
別の局面では、炭疽菌感染の処置に効果的なヘテロ二量体抗体が記載される。ヘテロ二量体抗体は、抗体ライブラリーから選択される。ライブラリーは、好ましくは、免疫したヒト供給源から生成される。ヘテロ二量体抗体は、炭疽菌感染に関与する分子（例えば、炭疽菌保護抗原またはＥＦタンパク質もしくはＬＦタンパク質）に結合し、その活性を無効にする。そして、その結果、細胞への毒素誘導に関与するプロセスを妨害することにより、毒素活性を阻害する。これらのプロセスとしては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ＰＡ８３のレセプターへの結合、ＰＡ８３のＰＡ６３へのプロセッシング、ＰＡ６３の前孔複合体形成への相互作用、ＥＦまたはＬＦの前孔への結合、ＥＦまたはＬＦの膜移行を可能にする前抗の立体配座の変化、またはＥＦもしくはＬＦの孔を通した移行。この妨害は、身体の細胞によるこれらのタンパク質の吸収と関連した毒性効果が遅くなるかまたは排除されるようなものである。特に有用な実施形態において、ヘテロ二量体抗体は、炭疽菌感染に関与する分子に対して少なくとも１×１０−８Ｍの親和性を有している。別の実施形態では、これらの抗体は、診断の試薬として使用され得る。
【００２５】
別の局面では、ボツリヌス菌を中和する抗体または抗体の機能性フラグメントが記載される。
【００２６】
別の局面では、痘瘡ウイルス（痘瘡）／痘疹ウイルスを中和する抗体または抗体の機能性フラグメントが記載される。
【００２７】
別の局面では、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＶＥＥＶ）を中和する抗体または抗体の機能性フラグメントが記載される。
【００２８】
別の局面では、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）を中和する抗体または抗体の機能性フラグメントが記載される。
【００２９】
別の局面では、デング熱を中和する抗体または抗体の機能性フラグメントが記載される。
【００３０】
別の局面では、感染性因子による感染を予防するために、抗体または抗体の機能性フラグメントを予防的に投与する方法が記載される。
【００３１】
別の局面では、感染性因子による感染を処置するために、抗体または抗体の機能性フラグメントを投与する方法が記載される。
【００３２】
（好ましい実施形態の詳細な記述）
本開示に従ってヒト抗体は、抗体全体かまたは抗体フラグメントであり得る。抗体は、ヘテロ二量体かまたは単鎖抗体であり得る。用語「ヘテロ二量体」とは、抗体または抗体フラグメントの軽鎖および重鎖が、天然に存在する抗体に見られるように、互いにジスルフィド結合により結合していることを意味する。単鎖抗体は、リンカー配列を介して結合した抗体の、軽鎖および重鎖可変領域を有する。
【００３３】
本発明のヒト抗体は、抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより同定される。抗体ライブラリーを生成し、そしてスクリーニングするための技術は、当業者の範囲内である。ＲａｄｅｒおよびＢａｒｂａｓ、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００）Ｌｅｒｎｅｒらに対する米国特許第６，２９１，１６１号および同時係属する米国仮出願番号第６０／３２３，４５５号および同６０／３２３，４００号を参照のこと。これらの出願の開示は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。
【００３４】
一般に、本発明の開示に従って、抗体ライブラリーを産生する第一工程は、一つ以上の感染性因子または感染性因子由来の抗原に対する抗体を産生する個体由来の細胞の回収を含む。代表的には、このような個体を、感染性因子および／または感染性因子由来の抗原に曝露する。特に有用な実施形態において、個体を、複数の感染性因子または生物兵器に関して戦略的に重要である感染性因子由来の抗原に曝露した。このような物質としては、炭疽菌、炭疽菌由来の抗原、ボツリヌス菌、ボツリヌス菌由来の抗原、天然痘、天然痘由来の抗原、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、ＶＥＥＶ由来の抗原、デング熱、デング熱由来の抗原、腸チフス、腸チフス由来の抗原、黄熱病、黄熱病由来の抗原、肝炎、肝炎由来の抗原、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、ＷＮＶ由来の抗原からなる群から選択される因子が挙げられる。図１は、本開示の好ましい実施形態に従った抗体ライブラリーの調製に使用するために適切な個体の曝露歴を要約する表である。抗体を産生するかまたは抗体を含む組織由来の細胞を、感染または免疫化の約７日後の個体から回収する。適切な組織は、血液および骨髄を含む。
【００３５】
一旦細胞を回収すると、当業者に公知の技術を使用してＲＮＡをそこから単離し、そして、コンビナトリアル抗体ライブラリーを調製する。一般に、コンビナトリアル抗体ライブラリーを調製するための技術は、抗体またはその一部（例えば、単離した抗体のＲＮＡを使用した軽鎖および／または重鎖）をコードする標的配列の増幅を含む。従って、例えば、もともと多様な抗体ｍＲＮＡの試料を用いて開始することで、テンプレートを提供するために、第１鎖ｃＤＮＡを産生し得る。次いで、ライブラリーを生成するために、従来的なＰＣＲまたは他の増幅技術を使用し得る。
【００３６】
抗体ライブラリーのスクリーニングを、例えば、所望のウイルス抗原に対してパンニングすることにより、任意の公知の技術を使用して達成し得る。ＲａｄｅｒおよびＢａｒｂａｓ、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００）を参照のこと。特定の抗原をクローニングし、免疫原として使用するために、組換え的に産生し得る。ウイルスの細胞レセプターへの結合をブロックする、抗体の能力を決定する細胞アッセイにおいて、中和能を評価し得る。一度、インビトロで中和能を有する抗体を同定すると、それらを動物モデルでインビボで試験し得る。
【００３７】
この様式で同定された抗体は、感染性因子による感染に対する効果的な処置を有利に提供する。本発明の抗体は、完全にヒト抗体であるので、それらは安全であり、容易に許容性を示す。さらに、急速な抗イディオタイプ反応をもたらすことなく、複数用量を与え得る。全長抗体を使用する場合、患者系内でより長い居留時間を提供するので、より高い親和力およびより大きなサイズ（単鎖抗体と比較して）が好ましい。
【００３８】
本開示に従って、抗体ライブラリーを生成し、本開示に従って抗体を同定し、特徴づけるための、特に有用な方法は、以下のとおりである。
【００３９】
（ライブラリー）
λ軽鎖またはκ軽鎖のいずれかおよびＩｇＧ重鎖フラグメント（Ｆｄ）を含む３つのＦａｂライブラリーは、種々の感染性因子に対して免疫化した現役の軍人ドナーの２つの骨髄試料（９５１および１０３７、および１血液サンプル（ＭＤ３）図１を参照のこと）のそれぞれに由来した。
【００４０】
ライブラリーに、種々の感染性因子（例えば、炭素菌、ベネズエラウマ脳脊髄炎およびボツリヌス、西ナイルウイルス、痘疹ウイルスおよびデング熱）に対して、選択およびスクリーニングを行い得る。
【００４１】
（ライブラリーの生成）
製造会社の指示書に従って、Ｔｒｉ試薬ＢＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ,Ｉｎｃ．）を使用して骨髄サンプルおよび血液サンプルから全ＲＮＡを得る。製造会社の指示書によって、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（Ｑｉａｇｅｎ）スピンカラムを使用してメッセンジャーＲＮＡを得る。抗体Ｆａｂフラグメント（ＩｇＧ重鎖フラグメント（Ｆｄ）に複合化したκ軽鎖またはλ軽鎖）を発現するファージライブラリーを、米国特許出願番号第１０／２５１，０８５号（この出願の開示は、その全体が、本明細書中に参考として援用される）に記載された方法を使用して、プラスミドベクター中に構築する。２つのＦａｂライブラリーを各ドナーに対して産生し、一つはκ軽鎖を発現し、一つはλ軽鎖を発現し、そして全てがγ重鎖を利用する。
【００４２】
（ライブラリーの選択）
使用した全てのライブラリー由来のＦａｂを有するファージを、選択したウイルス抗原および毒素に対して１〜４回の富化を介してパンニングした。パンニングを、第１に、いくつかのＩｍｍｕｌｏｎ ２ ＨＢマイクロタイターウェル中の５０μｌの溶液Ａ中で十分な量の組換え抗体（通常１〜２μｇ）を４℃で一晩培養することにより行う。溶液Ａは、０．０８％の煮沸したカゼイン溶液（ＢＣ）を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４である。ＢＣは、０．５％カゼイン、０．０１％チメロサールおよび０．００５％フェノールレッドを含むＰＢＳである。抗原溶液の除去後、ウェルを１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２５０μｌのＢＣで、３７℃で１時間ブロックする。ファージストックを、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＢＣからなる溶液Ｄ中に希釈し、５０μｌを各ウェルに添加し、そして３７℃で２時間インキュベートする。ウェルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを用いて１０回洗浄し、次いで、連続的により酸性になる一連の緩衝液：ｐＨ５．０、４．０および３．０のＴｒｉｓ緩衝食塩水（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で各２分間、１度ずつ洗浄した（Ｄ’Ｍｅｌｌｏら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈ ２４７：１９１〜２０３（２００１））。最終溶出液は、０．１ＭグリシンＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．２）、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む。溶離液を、２Ｍ Ｔｒｉｓ塩基を用いて中和し、対数期のＥＲ２７３８細胞に添加する。ヘルパーファージ（ＶＣＳＭ１３株）を感染細菌に添加することによりファージを産生する。個々のコロニーは、ファージストックでの感受性細菌の感染およびプレーティングにより産生した。
【００４３】
ファージ遺伝子ＩＩＩの一部との融合タンパク質としてＦａｂを含む上清を用いてスクリーニングを行う。スクリーニング後、陽性候補体を配列決定し、次いで、試験の間のＦａｂの産生の前に遺伝子ＩＩＩを除去するために、サブクローニングする。あるいは、遺伝子ＩＩＩ融合領域を除去するために、パンニングした各ライブラリー由来のＤＮＡをサブクローニングし、そして、インフルエンザ血球凝集素エピトープタグ（ＨＡ）からなる組み合わせエピトープタグを導入し得（Ｃｈｅｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：６５０８〜１２（１９９３））、そして、後の検出ならびに抗ＨＡおよびＮｉ−ＮＴＡによる精製に使用するために、６個のヒスチジンアミノ酸（Ｈｉｓタグ）を導入し得る。
【００４４】
（ライブラリースクリーニング）
スクリーニングでは、ＥＬＩＳＡアッセイで結合し得る能力により、選択した抗原に反応するＦａｂ構築物を同定した。溶液Ａ中の１００〜２５０ｎｇ／ウェルの組換え抗原をＩｍｍｕｌｏｎマイクロタイターディッシュ中で一晩インキュベートし、その後、上に記載したようにブロックする。スクリーニングを、Ｑ−ｐｉｘ機器を使用して１１５０コロニーを選択することにより、高処理能力で行い得、そして、Ｔｅｃａｎロボットを使用してＥＬＩＳＡを行い得る。個々のコロニーを一晩、Ｈｉ−Ｇｒｏ高速インキュベーターシェーカー中の、ディープウェルのマイクロタイターディッシュ中で培養する。アリコートを取り除き、１５％グリセロールかまたは１０％ＤＭＳＯでストックとして保存した。ディープウェルディッシュの遠心後、これらのストック由来のＦａｂを含む上清を、特定の抗原で被覆されたウェル中でインキュベートし、別に、コントロール抗原（例えば、カゼインまたは卵白アルブミン）で被覆されたウェル中でインキュベートする。ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）で標識したアルカリホスファターゼを、抗原に結合したＦａｂを検出するために使用する。陽性候補由来のＭｉｎｉｐｒｅｐ ＤＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を、これらのベクターに対するストックプライマーを使用して、軽鎖から重鎖にわたる９６ウェルフォーマット中で、自動化色素終止配列決定機（Ｒｅｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）により配列決定する。固有の候補を同定し、分類するために、配列を、ＤＮＡｓｔａｒソフトを使用して分析する。これらのデータから、使用した各組換え抗原に対する固有の改変体結合物のパネルを決定し、密接に関連した配列の群に分類する。
【００４５】
（パネル由来のＦａｂの産生および精製）
（Ｆａｂの精製）
可溶性Ｆａｂの発現および精製のために、遺伝子ＩＩＩ領域を固有の陽性候補体からサブクローニングにより除去する。この点では、抗ＨＡおよび／またはＮｉ−ＮＴＡを検出し、精製するために、インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）タグ（Ｃｈｅｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：６５０８〜１２（１９９３））および６個のヒスチジン残基（Ｈｉｓタグ）からなる組み合わせエピトープタグをコードするオリゴヌクレオチドを挿入することも可能である。
【００４６】
ＥＬＩＳＡに基づいたアッセイおよびより処理能力の高い形式でのインビトロ中和試験のために十分なＦａｂを精製するために、ニッケル−ＮＴＡカラムクロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ）を使用する。この場合、Ｈｉｓ標識を含むようにサブクローニングした（スクリーニングの前か後かのいずれかで）ＦａｂをＯＤ６００が０．８になるまで、１リッターのＳＢ中で培養し、３０℃で３〜４時間、１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて、最適量のＦａｂの生成を誘導する。周辺質の空間からＦａｂを単離するために、細胞ペレットを冷却した、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ（Ｒｏｃｈｅ）プロテアーゼインヒビターを添加した１×ＰＢＳに再懸濁し、Ｓｏｎｉｃｓ Ｖｉｂｒａ−ｃｅｌｌ ＶＣ７５０を使用して超音波処理する。次いで、細胞の破片をペレット化し、上清をＱｉａｇｅｎ Ｎｉ−ＮＴＡカラムに適用した。１６個のこれらのカラムを使用することにより、最初の試験で、候補体あたり７５μｇのＦａｂを得た。一つの９６ウェル形式で、Ｆａｂあたり１２個のカラムの列を使用することにより、８個のＦａｂを精製し得、最初のＰＲＮＴおよびＥＬＩＳＡアッセイのために十分な材料を提供する。エピトープ特異性試験は、標識されていないＦａｂもまた必要とする。これらのＦａｂは、上記のように９６ウェル形式中にあるタンパク質Ｇまたはタンパク質Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合したヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２（Ｐｉｅｒｃｅ）からなるカラムにより精製される。より大きい体積の任意の所望のＦａｂを、抗ヒトＦ（ａｂ’）２カラムかまたはニッケルカラムかのいずれかを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により精製し得る。この方法は、一般に約１５０〜１０００μｇの精製したＦａｂ／ｌを産生するが、これは、Ｆａｂにより異なる。
【００４７】
（精製したＦａｂの特徴付け）
（抗原に対する滴定）
配列決定により確立した関連群中で、Ｆａｂの抗原結合の特徴を比較するために、精製したＦａｂをＥＬＩＳＡアッセイにおける抗原に対して滴定する。
【００４８】
（エピトープ特異性を決定するためのアッセイ）
エピトープ特異性を、ＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイかまたは競合アッセイにより決定し得る。遺伝子ＩＩＩ（ファージの結合を有するかまたは有さない融合Ｆａｂ）またはタグに融合したＦａｂと遺伝子ＩＩＩを欠く精製されたＦａｂまたはタグとの間の競合を行い、エピトープ特異性を評価し得る。ＰＢＳ中で４μｇ／ｍｌの抗原５０μｌをマイクロタイターウェル中で、４℃で一晩インキュベートする。ＰＢＳによる洗浄後、ウェルを、室温で３０分間、ＰＢＳ中に１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＢＣを使用してブロックする。一つの精製されたＦａｂの希釈液を含む５０μｌのＰＢＳをウェルをブロックするために、添加し、３７℃で１時間インキュベートした。これに、第２のＦａｂを融合物として含む５０μｌの上清を添加し、さらに１時間、３７℃でインキュベーションを継続する。第２のＦａｂを、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合型抗Ｍ１３抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて検出する。リン酸クエン酸緩衝液ｐＨ５．０中の２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）錠剤を使用して、Ｓｉｇｍａ由来のＨＲＰ基質緩衝液を含むウェルを作成する。このアッセイのＨＡ／Ｈｉｓタグを有するＦａｂを使用するために、上記検出に使用した抗Ｍ１３抗体を、ＰＮＰＰアッセイで検出された、アルカリホスファターゼ標識した抗ＨＡかまたは抗Ｈｉｓ抗体のいずれかにより置き換える。
【００４９】
（中和として同定されたＦａｂ由来のＩｇＧの産生および精製）
Ｆａｂを、当業者に公知の技術を使用して、個々の疾患を中和する能力について試験する。
【００５０】
（Ｆａｂの全長ＩｇＧへの変換および安定な細胞株の産生）
Ｆａｂを２段階プロセスにより、哺乳動物発現ベクターにサブクローニングし、全長のＩｇＧ１重鎖を作成する。このベクターは、グルタミンのない培地においてトランスフェクトした細胞の増殖を可能にするグルタミンシンテターゼ遺伝子を選択マーカーとして使用する（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：６９〜７５、１９９２）。ベクターをエレクトロポレーションにより、標準的な方法を使用してＮＳ０マウス骨髄腫細胞株にトランスフェクトする。安定な細胞株をグルタミンのない培地で選択し、限界希釈により単離する。安定した細胞株を選択する前に、少量のＩｇＧを試験するために、ＮＳＯ細胞またはＣＨＯ−Ｋ１細胞中のこのベクターに、プールしたトランスフェクトも行い得る。首尾よくベクターに挿入した免疫グロブリンを決定するために、各クローン株から調製したＤＮＡを、制限酵素切断により解析した。全長ＩｇＧの産生を評価するために、各クローン株由来の培地のウエスタンブロット解析を使用し、そして、軽鎖を捕らえ、そして、適切な抗体で重鎖を検出することにより、定量的ＥＬＩＳＡ集合アッセイを行う。
【００５１】
ＩｇＧの精製のために、一時的に感染した細胞またはＩｇＧの候補体を発現する安定な細胞株を、ｍｉｎｉＰｅｒｍ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）かまたは中空の線維生物反応器中で増殖させる。上清をタンパク質Ｇまたはタンパク質Ａカラムを使用したＦＰＬＣにより精製する。疎水性相互作用カラムを使用して、さらなる精製を成し遂げ得る。
【００５２】
（ＩｇＧのインビトロ試験およびインビボ試験）
Ｆａｂに由来するＩｇＧを、以下に記載するように個々の疾患に特異的なインビトロおよびインビボのアッセイにおいて試験し得る。
【００５３】
炭疽菌およびＶＥＥＶの場合に、上記の技術を首尾よく使用した。同じライブラリーおよび／またはさらなるヒトドナーから作成されたライブラリーを、デング熱ウイルス、ＷＮＶおよび痘疹ウイルスに対してパンニングし得る。同じ技術を、Ｆａｂを全ＩｇＧおよびＩｇＧ精製物に変換するために使用し得る。
【００５４】
本発明の抗体または抗体フラグメントを、例えば、ヒトモノクローナル抗体かまたはヒト化したモノクローナルなどの他の抗体（または、その一部）と結合してかまたは、付着して使用し得る。これらの他の抗体は、触媒抗体であり得、そして／または抗体が関与するか、あるいは異なった特異性を有し得る疾患に特徴的な他のマーカー（エピトープ）と反応性であり得る。別々に投与される組成物としてか、または、従来的な化学的な方法かもしくは分子生物学的な方法により結合した二つの薬剤とともに一つの組成物として、抗体（または、その一部）を、このような抗体（または、その一部）とともに投与し得る。検出可能なシグナル（インビトロかまたはインビボのいずれかで）を産生する標識か、または、治療的特性を有する標識を用いて、抗体を標識することにより、さらに、抗体の、診断上および治療的な有用性を議論し得る。
【００５５】
本発明の抗体または本明細書中の抗体フラグメントは、代表的には、薬学的キャリアを含む組成物で患者に投与され得る。薬学的キャリアは、患者へモノクローナル抗体の送達に適した任意の適合性の非毒性物質であり得る。滅菌水、アルコール、脂肪、ワックスおよび不活性固体が、キャリア中に含まれ得る。薬学的に受容されるアジュバント（緩衝剤、分散剤）もまた、薬学的組成物に組み込まれ得る。組成物は、完全な抗体および抗体フラグメントの両方を含み得ることを理解すべきである。
【００５６】
抗体および／またはフラグメント組成物を、種々の方法にて患者に投与し得る。好ましくは、薬学的組成物を、非経口的に、例えば、皮下に、筋肉内に、硬膜外に、または静脈内に投与し得る。従って、非経口的に投与するための組成物は、抗体、抗体フラグメントの溶液、または受容可能なキャリア、好ましくは水性キャリアに溶解したそれらの反応混液を含み得る。種々の水性キャリア、例えば、水、緩衝化した水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなどを使用し得る。これらの溶液は、無菌であり、一般的に、粒子物質を含まない。これらの組成物を、従来的な周知の滅菌技術により、滅菌し得る。これらの組成物は、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤などの適切な生理学的条件のために必要な薬学的に受容可能な補助的な物質（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど）を含み得る。これらの処方物中の抗体または抗体フラグメントの濃度は、広く変動し得、例えば、約０．５重量％未満から１５重量％または２０重量％であり、通常は、約１重量％かまたは少なくとも約１重量％であり、選択した特定の投与法に従って、主に、液体の体積、粘度などに基づいて選択される。
【００５７】
非経口的に投与し得る組成物を調製する実際の方法および被験体への投与に必要な調整は、当業者には公知であるかまたは明白であり、より詳細には、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ 第１７版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ（１９８５）に記載され、本明細書に参考として援用される。
【実施例】
【００５８】
（実施例１−炭疽菌）
炭疽菌に対して予防接種を受けた現役の軍人ドナーの血液および骨髄から単離したメッセンジャーＲＮＡから、ファージライブラリーを作成した。回収の１週間前に、ＡＶＡ炭疽菌ワクチン追加免疫を受けた軍の医師有志ドナーから、血液サンプルを回収した。さらに、市販の供給源が、現役の軍人個人由来の適合した血清とともにコードした骨髄およびいくつかの免疫記録を供給した。数人の骨髄ドナーおよび全ての血液ドナーは、炭疽菌抗原ＰＡ８３に対する力価を有していた（図２）。ＰＡ８３（９５１）に対する最高の力価を有する骨髄ドナーは、血液回収の３週間前に炭疽菌に対して免疫化されていた。
【００５９】
Ｔｒｉ−ｒｅａｇｅｎｔ ＢＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を製造会社の指示書に従って使用して、骨髄サンプル９５１および１０３７ならびに血液サンプルＭＤ３から全ＲＮＡを得た。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（Ｑｉａｇｅｎ）スピンカラムを製造会社の指示書に従って使用して、メッセンジャーＲＮＡを得た。抗体Ｆａｂフラグメント（重鎖の可変領域および第１定常領域に複合化したκまたはλ軽鎖）を発現するファージライブラリーを米国特許仮出願番号第６０／２８７，３５５号および同６０／３２３，４５５号（これらの開示は、その全体が、本明細書中に参考として援用される）に記載される独自に開発した方法により、プラスミドｐＡＸ２４３ｈベクター中に構築した。２つのＦａｂライブラリーを各ドナーに対して作成し、一つはκ軽鎖を発現し、一つはλ軽鎖を発現し、そして全てがγ重鎖を活用した。６個のライブラリー由来のＦａｂを有するファージは、ＰＡ８３に対して４回の濃縮を介してパンニングした。９５１ライブラリーもまた、精製ＰＡ６３（Ｍｉｌｌｅｒらによって記載される（Ｍｉｌｌｅｒら、１９９９）ように、ＰＡ８３から産生した）に対して４回の濃縮を介して別々にパンニングした。ＰＡ８３と共有するＰＡ６３部位に結合するファージを取り除くために、可溶性ＰＡ８３を最初に３７℃で１時間、２０μｇ／ｍｌでファージに結合させ、その後に混合物を、マイクロタイタープレートウェルに結合したＰＡ６３とともにインキュベートした。
【００６０】
ＰＡ８３抗原に対して最も高い力価を有する、軍隊由来の炭疽菌予防注射した個体を同定するために、組換えＰＡ８３抗原を、Ｆｏｒｔ ＤｅｔｒｉｃｋにあるＵＳＡＭＲＩＩＤから入手し、ＥＬＩＳＡアッセイに使用した。それらの個体の骨髄または血液からＲＮＡを単離し、その後、このＲＮＡから組み合わせＦａｂライブラリーを得るために、制限酵素消化／入れ子にしたオリゴヌクレオチド伸張反応／単一プライマー増幅（ＲＥＤ／ＮＯＥＲ／ＳＰＡ）を使用した。図２を参照のこと。
【００６１】
増幅のＲＥＤ／ＮＯＥＲ／ＳＰＡ法を使用して、ライブラリーを構築するために、３人の最高の力価の個体由来のＲＮＡを使用した。２つのライブラリー、９５１および１０３７は、Ｐｏｉｅｔｉｃｓ（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）から受けた骨髄ドナーに由来した。第３のライブラリー、ＭＤ３は、予防接種した有志の血液に由来した。ライブラリー連結反応の有効性を以下の表１に示す。
【００６２】
【表１】
【００６３】
全てのライブラリーをＰＡ８３に対してパンニングし、および９５１ライブラリーをＰＡ６３に対してパンニングした。ＰＡ８３については、提示したＦａｂフラグメントを有するファージを添加する前に、抗原がウェルに結合し、ブロックした。ＰＡ６３については、ＰＡ８３およびＰＡ６３の両方により共有された抗原に反応するファージの回収を減少するために、ウェルに結合したＰＡ６３抗原と反応させる前に、提示ファージを最初にＰＡ８３と混合した。ＰＡ６３を、Ｍｉｌｌｅｒら（１９９９）に記載される方法に従って、ＰＡ８３から産生し、精製した。ライブラリーの２つのパンニングの結果およびＰＡ６３に対するパンニングの結果を以下の表に示す。
【００６４】
最初にＰＡ８３に対して９５１ライブラリーおよびＭＤ３ライブラリーを用いてパンニングを行い、そして、ＰＡ６３に対して９５１ライブラリーを用いてパンニングを行った。最初のＸＬ１−Ｂｌｕｅへのライブラリー形質転換とは別に、ＥＲ２７３８細胞を使用した。入力、出力および両方のパンニングラウンドについての最初のＥＬＩＳＡの結果のいくつかを以下の表に示す。
【００６５】
【表２】
【００６６】
ＰＡ８３でパンニングした全てのライブラリーに対して、富化は、明らかである。ＰＡ６３に対してパンニングしたライブラリーは、ＰＡ８３に非常に弱く反応するいくつかの候補体を示した。これらの候補体は、ＰＡ６３に対して試験した場合、陽性であった。陽性応答するもののＶＨ領域およびＶＫ領域またはＶＬ領域の配列決定解析を図３〜５に示す。特定の配列が、優勢であるが、多様性を示し得る。ＰＡ８３の前吸着とともにＰＡ６３に対してパンニングしたＦａｂは、ＰＡ８３に対してパンニングしたＦａｂとは違って、顕著に異なる配列群を含むようである。
【００６７】
パンニング後、４つのＰＡ−８３でパンニングしたライブラリーの種々のパンニング回由来の個々の候補体を、ＥＬＩＳＡによりＰＡ８３に対する反応性についてスクリーニングした。Ｆａｂフラグメントに結合するＰＡ６３を同定するために、ＰＡ６３に対してパンニングした９５１κライブラリーファージおよび９５１λライブラリーファージをまず、ＰＡ８３への結合についてスクリーニングし、最初にスクリーニングからＰＡ８３結合物を取り除いた。しかし、ＰＡ８３に良好に結合する候補体はみつからなかった。このことは、最初に可溶性ＰＡ８３とともにファージをインキュベートすることにより与えられた競合が効果的であったことを示している。両方の抗ＰＡ６３ライブラリーの４回のパンニングにおいて、少ない割合のクローンが、基質内での数時間のインキュベート後、非常に弱いＥＬＩＳＡ反応性を示した。これらのクローンをＰＡ６３に対してスクリーニングすると、多量のより強いシグナルを生じた。ＰＡ８３に対する弱い反応性は、ＰＡ８３との交差反応性のためか、または、精製または保存の間にフリンプロテアーゼ感受性部位でのＰＡ８３のプロテアーゼ切断（Ｋｌｉｍｐｅｌら、１９９２）から生じ得たＰＡ８３調製物における少量のＰＡ６３を反映し得るためであり得る。
【００６８】
６つの異なるパンニングライブラリーから選択した、強いＰＡ８３結合活性または強いＰＡ６３結合活性を有する１４４より多い個々の候補体を、配列決定し、全ての改変体候補のパネルを同定した。これは、３１個の独特のＰＡ８３結合物および６個の独特のＰＡ６３結合物を含む。２５個の独特のＰＡ８３結合物は、全て可変重鎖（ＶＨ）遺伝子座３−３０／３−３０．５．に由来した。ＰＡ６３結合物の重鎖の内、２つの関連する配列が、優勢であると考えられた。これらは、ＰＡ８３配列とは異なっていた。単一突然変異は、抗体の親和性を劇的に変え得るので、他の候補体と比較して、候補体が、それらの重鎖または軽鎖のいずれかにおいて一つのアミノ酸の差異を有する場合、候補体は独特であると考えた。
【００６９】
炭疽菌タンパク質ＰＡ８３およびＰＡ６３に対するさらなる抗体配列を、図６〜８Ｃに示す。図６に示したヒトκ軽鎖可変配列では、ＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）部位に由来する最初の２つのアミノ酸、Ｓ（セリン）およびＲ（アルギニン）をクローニングに使用した。図のアミノ酸番号３は、Ｋａｂａｔ番号付与系におけるヒトκ軽鎖に対するアミノ酸番号１に一致する（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｋａｂａｔら、１９９１）。最後の４つのアミノ酸（ＲＴＶＡ）は、ほとんどの配列で、Ｋａｂａｔ番号付与系では１０８から１１１と番号を付けられるヒトκ軽鎖定常領域の最初の４つのアミノ酸に一致する。示した２つの配列は、定常領域の始めの方に全く伸張しない。可変領域が、長さの多型を含むので、各配列の実際のアミノ酸の数は、１１３より大きくても小さくてもよい（２つの最初のアミノ酸＋１１１）。図７に示したヒトλ軽鎖可変配列では、最初の２つのアミノ酸、Ｓ（セリン）およびＲ（アルギニン）は、クローニングに使用したＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）部位に由来する。図中のアミノ酸番号３は、Ｋａｂａｔ番号付与系におけるヒトλ軽鎖についてのアミノ酸番号１に対応する。各配列に示した最後のアミノ酸は、Ｋａｂａｔ番号付与系におけるヒトλ軽鎖定常領域のアミノ酸１５５に対応する。可変領域は、長さの多型を含むので、各配列の実際のアミノ酸の数は、１５７より大きくもあり得るか、または小さくもあり得る。図８Ａ〜Ｃに示したヒトγ重鎖可変配列では、最初の２つのアミノ酸、Ｌ（ロイシン）およびＥ（グルタミン酸）は、クローニングに使用したＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）部位に由来する。図中のアミノ酸番号３は、Ｋａｂａｔ番号付与系におけるヒトγ重鎖に対するアミノ酸番号１に対応する。各配列について示した最後のアミノ酸は、Ｋａｂａｔ番号付与系におけるヒトγ重鎖定常領域のアミノ酸１１８に一致する。この可変領域は、長さの多型を含むので、各配列の実際のアミノ酸の数は、１２０より大きくあり得る。
【００７０】
ＥＦおよびＬＦ（軍人を免疫するために使用したＡＶＡワクチンにもまた、少量存在する）に対するパンニングを、本発明のライブラリーを用いて行う。他のライブラリーを使用して、ＰＡ６３に対するさらなるパンニングを行い得る。異なる抗体の親和性を評価するために、バイオコアアッセイを行う。同一エピトープ結合特性を共有する抗体の群を同定するために、競合実験を行う。細胞アッセイにおいて、ＥＦかまたはＬＦかのいずれかのレセプターとのＰＡの結合をブロックする性能について、候補を評価する。次いで、最良の候補体の、動物モデルにおけるインビボの毒性をブロックする性能を、ＰＡ、ＥＦおよびＬＦまたは実際の炭疽菌感染のいずれかを使用して試験する。１つ以上のこれらの試験において、必要に応じて、候補体を全長ヒト抗体に変換する。
【００７１】
さらなる試験のための精製したＦａｂを産生するために、このパネル由来の候補体は、Ｆａｂフラグメントの重鎖部分からの遺伝子ＩＩＩを取り除くために、サブクローニング工程を受けた。次いで、ヤギ抗ヒトＦａｂカラムを使用した高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）により、２〜４リットルの培養物からＦａｂを精製した。Ｌｉｔｔｌｅらの方法（Ｌｉｔｔｌｅら、１９９０）の後、マウスマクロファージ細胞株、Ｊ７７４Ａ．１を使用して、この精製したＦａｂを使用する中和アッセイを行った。毒性作用に対する反応の細胞死によって放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）をアッセイするために、Ｃｙｔｏｔｏｘ９６検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用する条件を確立した。Ｊ７７４Ａ．１細胞を９６ウェルディッシュ中に１４，０００細胞／ウェルで、一晩プレート培養した。４〜８ウェルを各点でアッセイした。Ｆａｂを５０ｎＭで使用した。毒素を以下のように産生した：ＰＡ８３を４００ｎｇ／ｍｌ（４．６ｎＭ）で、４０ｎｇ／ｍｌのＬＦとともに添加した。３７℃で４時間のインキュベート後、ウェルを顕微鏡で調べ、次いで培地を取り除き、遠心して、結合していない細胞をペレット化した。
【００７２】
多くの中和アッセイの結果を図９に要約した。理解され得るように、試験した１７個の抗ＰＡ Ｆａｂ（サンプルｅ〜ｕ）の内、１４個が、炭疽菌毒素の効果を中和し得、８０％の生存度を得た。５個のＦａｂは、この時間枠内で、この濃度で、十分に中和する。サンプル（ａ）および（ｂ）は、毒素を添加しない２つのＦａｂである：これらは、精製したサンプル中のエンドトキシンによって、この時間内で、細胞死が引き起こされないことを示している。サンプル（ｃ）は、毒素のみの効果を示す。サンプル（ｄ）は、炭疽菌の毒素の作用から細胞を有意には防御しない、不適切なＦａｂを含む。
【００７３】
インビトロにおける５０％防御値を決定するために、選択したＦａｂを滴定した（図１０）。Ｆａｂを連続的に希釈し、アリコートを、毒素を含む培地に添加した。これらの実験では、ＰＡを最終濃度４００ｎｇ／ｍｌとし、そして、ＬＦを最終濃度８０ｎｇ／ｍｌとした。次いで、これらのアリコートを４連とした細胞に添加し、３７℃で４時間インキュベートした。細胞毒性を視覚的に評価し、そして記載されるようにＣｙｔｏｔｏｘ９６アッセイを用いて定量的に測定した。本明細書に示した抗ＰＡ−８３Ｆａｂは、全て、このアッセイで使用したＰＡ８３の濃度と等モルに近い、５０％の中和値を有している。しかし、抗ＰＡ６３ Ｆａｂ９５１Ｌ６３１Ｄは、これらより約１／５〜１／７の、５０％の中和値を有している；すなわち、９５１Ｌ６３１Ｄの１分子は、ＰＡ８３の多数の分子を中和する。ＰＡ８３は、この実験では、Ｊ７７４Ａ．１細胞により、切断され、七量体孔に変換される。ＰＡ８３の不足当量を中和する９５１Ｌ６３１Ｄの性能に関する最も可能性のある説明は、それが七量体孔のレベルで作用し、一度に７個までのＰＡ８３分子を効果的に中和するということである。
【００７４】
最近、９５１Ｌ６３１ＤおよびＭＫ７Ｃを、インビボで試験した。ＰＢＳの全量２００μ中の４０μｇのＰＡ８３および８μｇのＬＦを受けた２匹のラットは、６０分および７１分で死亡した。同量の毒素および３１０μｇの９５１Ｌ６３１Ｄを受けた２匹のラットは、これらのラットが屠殺されるまでの２５時間生存した。約３〜５時間で、これらのラットは、疾患の症状をいくつか（例えば、不活発状態およびかすかな浅速呼吸）を示したが、１６時間では、これは一匹のラットでは消失し、もう一匹のラットでは、嗜眠状態となったが、正常な呼吸をしていた。２５時間までは、ラットは両方とも、ＰＢＳを注射したコントロールラットと比較して正常に見えた。従って、９５１Ｌ６３１Ｄは、ラットをインビボでの炭疽菌感染に対して防御し得るようである。ＭＫ７Ｃを１匹のラットにおいて、毒素とともに、３００μｇで試験した。このラットは、いずれの症状も示すことなく、生存した。
【００７５】
９Ｋ２Ｈ，９Ｌ６Ｒ２，ＭＫ７Ｃ，９Ｋ７Ｈ、ＭＬ８Ｅおよび９５１Ｌ６３１Ｄから産生したＦａｂを、直鎖状エピトープと反応するそれらの能力について試験した。ＰＡ８３およびＰＡ６３を、変性条件下（しかし還元条件でない）でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、ウエスタンブロッティングによりニトロセルロースフィルターに移した。ＰＡ６３かまたはＰＡ８３のいずれかを含むブロットから切り出したストリップを、これらの精製した抗体のそれぞれと、同濃度で一晩ハイブリダイズした。結合した抗体を、ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２（Ｐｉｅｒｃｅ）を接合したアルカリホスファターゼと反応させた。そして、その結果を図１１に示す。
【００７６】
試験した５つの抗ＰＡ８３Ｆａｂの全ては、ＰＡ８３上の直鎖状エピトープに結合するようである（図１２）。抗ＰＡ６３抗体は、対照的に、変性させたＰＡ６３には結合せず、ＰＡ８３に対する、僅かな、おそらく非特異的な結合に見えるものを示す。９Ｋ２Ｈおよび９Ｋ７Ｈは、変性させたＰＡ６３には結合を示さず、他方、ＭＫ７ＣおよびＭＬ８Ｅは強く結合し、９Ｌ６Ｒ２は弱い結合を示す。
【００７７】
いくつかのこれらのＦａｂのＰＡ８３およびＰＡ６３に対して結合する能力を、さらに、ＥＬＩＳＡ形式で抗原に対するＦａｂ滴定を行うことにより定量的に分析した。ＰＡ８３およびＰＡ６３を、Ｌｉｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、指示書に従って、水または５０％グリセロール中にそれぞれ再懸濁した。以下のグラフは、ＰＡ８３またはＰＡ６３に対する、４つのＦａｂフラグメントの滴定を示す。塗りつぶした記号は、ＰＡ８３に対する反応性を示し、白抜きの記号は、ＰＡ６３に対する反応性を示す。ＰＡ８３に対して産生した３つの抗体は、全て、予想通りＰＡ８３に対して強い反応性を示す。しかし、ＭＫ７Ｃのみが、ＰＡ６３に対して等しく良好に反応し、このことは、ＰＡ６３に対するＰＡ８３の切断が、９５１Ｌ６Ｒ２およびＭＬ８Ｅに観察されるエピトープを変換するかまたは取り除くことを示している。９５１Ｌ６３１Ｄは、ＰＡ８３とは反応しないが、ＰＡ６３と反応するＭＫ７Ｃで見られるよりも非常に低い飽和レベルで、ＰＡ６３と反応する。これらのアッセイを、同時間に同プレートで二連で行った。このことは、プレートに存在するＰＡ６３の一部分のみが、９５１Ｌ６３１Ｄへの結合に対する適切なエピトープを示すことを示唆し、これは、９５１Ｌ６３−１Ｄが、七量体孔構造中にのみ見出されるエピトープと反応すると予想され、それにより、プレート上で実際以下に評価され得る。
【００７８】
図１３において、ＦＭＬ８Ｅのｈｉｓタグ化バージョンを生成し、他のタグ化していないＦａｂと競合して、エピトープ特異性を評価するために使用した。ＦａｂであるＦ９Ｋ２Ｈ、Ｆ９Ｋ７ＨおよびＦＭＬ８Ｆは、ＦＭＬ８Ｅとの自己競合に類似して、競合する。このことは、これらのＦａｂが同じエピトープまたはＦＭＬ８Ｅに観察されるエピトープと近いエピトープを認識することを示唆している。しかし、Ｆ９５１Ｌ６Ｒ２は、異なり、競合する。このことは、競合を引き起こすのに十分近くあり得るけれども、このエピトープが同じではないことを示唆している。ＦＭＫ７Ｃは、競合にあまり効果がなく、このことは、おそらく離れた部位に結合することを示している。興味深いことに、上記のウエスタンブロットは、下の図が示すようにＰＡ６３に対する切断によって、Ｆ９Ｋ２ＨおよびＦ９Ｋ７Ｈによる結合が消滅し、他方、ウエスタンブロットにおける結合は、なおも、ＦＭＬ８ＥおよびＦ９５１Ｌ６Ｒ２に対して明白なものであり、そして、いくつかの反応性は、上記のＥＬＩＳＡ滴定において高濃度で見出される。このことは、エピトープが、Ｆ９Ｋ２Ｈ／Ｆ９Ｋ７Ｈの結合に関して、ＦＭＬ８Ｅ／ＦＭＬ８Ｆ、Ｆ９５１Ｌ６Ｒ２またはＦＭＫ７Ｃの結合とは、同じではないことを示唆している。示したＦａｂを、連続的に１：４に希釈し、２００ｎｇのＰＡ８３で一晩被覆したマイクロタイターウェルに３７℃で１時間結合した。次いで、Ｈｉｓタグ化したＦＭＬ８Ｅを、洗浄なしで、５μｇ／ｍｌで添加し、２時間反応させ、その後、プレートを洗浄し、ＰＮＰＰアッセイのために抗Ｈｉｓと結合体化したアルカリホスファターゼと反応させた。ＦＭＬ８ＥおよびＦＭＬ８Ｆは、類似の重鎖を有するが、異なる軽鎖を有することを注意すべきである。Ｆ９Ｋ２ＨおよびＦ９Ｋ７Ｈは互いに関連し、同じ重鎖生殖細胞系列遺伝子座をＦＭＬ８Ｅとして使用するが、ＭＬ８Ｅとは全く異なるＣＤＲ領域を有する。Ｆ９５１Ｌ６３１ＤおよびＦＭＫ７Ｃは重鎖生殖細胞遺伝子座とは異なる。
【００７９】
本開示は、ＡＶＡ免疫化したドナーから単離され得る、インビトロで高い親和性を有し、そして、強力に中和するヒト抗炭疽菌毒素抗体を、初めて示す。Ｌｉｔｔｌｅら（１９９０）は、炭疽菌毒素致死因子に対するネズミモノクローナル抗体のパネルを同定した。インビボの防御の評価に対してインビトロの防御の評価は、インビトロにおける防御の程度が、稀な場合を除いて、インビボにおける防御と相関し得ることを示唆している。試験した１９個から１５個の中和抗体を同定し、その内のいくつかが低濃度で十分に中和した。従って、これらの抗体のいくつかが、インビボで防御的であることが予想される。データは、さらに、ＡＶＡワクチンが、炭疽菌曝露に対するヒトの防御に効果的であることを示唆する。
【００８０】
抗ＰＡ８３活性および抗ＰＡ６３活性の両方の組み合わせが、インビボの治療目的では強力である。抗ＰＡ８３は、細胞レセプターに結合するＰＡ８３分子の数を制限する。次いで、それらの、破壊されず、七量体孔を形成するＰＡ８３分子は、炭疽菌感染の致死効果に対する強力な防御を提供する抗ＰＡ６３活性により中和される。この２個の抗体の組み合わせは、感染の開始時かまたは感染の過程の間のいずれかで新規の機能性孔構造の形成に対して即時の防御を提供し得る。
【００８１】
これら２個の抗体の使用は、疑わしい炭疽菌放出に曝露され得た、予防接種したかまたは予防接種していない人員にさらなる受動的防御を提供し得る。疾患に直面して防御し得る治療の利用可能性は、炭疽菌についての一般の不安を軽減するのに役立つ。さらに、このような治療薬剤は、生物テロの作用としての炭疽菌の故意の放出をあまり成功させなくし得、従って、このような攻撃の可能性を減少し得る。
【００８２】
（実施例２−ベネズエラウマ脳炎ウイルス）
（ヒト抗ＶＥＥＶ抗体）
実施例１と関連して上に記載したドナー血清を、標準的ＥＬＩＳＡアッセイを使用してＴＣ−８３抗原に対して試験した（図１４）。ドナー１０３７、８１１および９５１は、ＴＣ−８３に対して、顕著な血清反応性を有した。このことは、対応するドナーの骨髄から作成された抗体ライブラリーから、抗ＶＥＥＶ Ｆａｂを獲得した可能性が高いことを示した。１０３７および９５１の両方に対するＩｇＧ−κライブラリーおよびＩｇＧ−λライブラリー（合計４個のライブラリー）を、上に記載した炭疽菌の実施例であらかじめ構築した。次いで、これらのファージディスプレイ抗体ライブラリーを、ＴＣ−８３抗原を４回介してパンニングした。この実験由来の結果を以下に示す：
【００８３】
【化１】
【００８４】
高い処理能力の形式のＴｅｃａｎロボットプラットフォームを使用して、ＥＬＩＳＡにより、固定したＴＣ−８３に結合するＦａｂクローンのパネルを、４個全てのライブラリー（９５１Ｋ、９５１Ｌ、１０３７Ｋおよび１０３７Ｌ）から３回および４回のパンニングによりスクリーニングした。図１５Ａ〜Ｄに見られるように、ＴＣ−８３に顕著に結合したＦａｂ（アルカリホスファターゼが結合した抗ヒトＦａｂを使用して検出した）を、４個全てのライブラリーから入手した。ポジティブコントロールＨｙ４−２６Ａ（３Ｂ４Ｃ−４のヒト化改変体）およびネガティブコントロール抗破傷風類毒素Ｆａｂ（図１５中の各グラフ上のそれぞれ最後の隣および最後のサンプルである）と比較して、Ｆａｂクローンを、スクリーニングした。４個のライブラリーのそれぞれ由来の、最も高いＥＬＩＳＡシグナルを有する３個のＦａｂを、さらなる分析のために選択した。各クローンについてのＤＮＡを調製し、次いで、配列決定分析に供した。その配列の結果は、３個全ての９５１Ｋクローンが同一であることを示した。さらに、１２個のクローンの内１０個が、同じ可変重鎖領域（ＶＨ）を有するが、それらのＦａｂの多数は、異なる軽鎖配列を有した。全体で、３個の別の重鎖（ＨＣ）分類に、１０個の独特のクローンが存在する。
【００８５】
さらなる分析のために、４個のヒトＦａｂクローンを選択した。選択したＦａｂは、全て同定された３個の異なるＨＣ類を代表した。
【００８６】
【化２】
【００８７】
全てのＦａｂを、ＦＰＬＣ上で抗ヒトＦ（ａｂ’）２カラムを使用して、細菌の周辺質の調製物から精製した。Ｐ３Ｈ６ Ｆａｂは非常に収率が低いので、さらに続行しなかった。
【００８８】
図１６は、ＴＣ−８３に対する滴定ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、３つのヒト抗ＶＥＥＶ Ｆａｂの結合活性を示す。精製した抗ＶＥＥＶ Ｆａｂも競合ＥＬＩＳＡ実験において、ｍＨｙ４ Ｆａｂを競争相手として使用して、試験した。この実験の結果を図１７に示し、そして、この実験の結果は、３つのＶＥＥＶ Ｆａｂが、同じエピトープ（Ｅ２Ｃ）に対して、ｍＨｙ４ Ｆａｂと競合しないことを示している。
【００８９】
ヒトＦａｂは、Ｅ２Ｃエピトープとは、競合的ではなかったが、それらは、ＶＥＥＶ上で他の中和エピトープと結合し得る。このことを試験するために、各精製したＶＥＥＶ Ｆａｂのアリコートを、細胞に基づいたＶＥＥＶ中和アッセイにおいて使用するために、ＣＤＣで共同研究者に送った。２つの別の実験の結果は、ポジティブコントロール３Ｂ４Ｃ−４で観察された中和能と類似して、Ｐ３Ｆ５が非常に良い中和能を有することを示した。Ｐ３Ｇ１もまた、顕著な中和を示したが、それに対して、Ｐ３Ｆ２ Ｆａｂは、中和試験において明白な効果を有さなかった。
【００９０】
【表３】
【００９１】
表３は、ＶＥＥＶに対するインビトロの中和アッセイの結果を報告する。ＡｂまたはＦａｂの滴定は、ベロ細胞でのＶＥＥウイルスプラークの７０％の減少を与えることを必要とすることが報告されている。ネズミのＡｂ ３Ｂ４Ｃ−４（全ＩｇＧとして）をポジティブコントロールとして使用した。以前に、二価抗体が、ウイルスをより効果的に中和することが示されていて、従って、抗Ｆａｂ架橋結合したＡｂを各ウェルに添加した（非最適濃度で）。非結合ネガティブコントロールＦａｂは、試験したいずれの濃度でも中和を示さなかった。サンプルＰ３Ｆ５は、ネズミ３Ｂ４Ｃ−４の活性に近い活性を示した。
【００９２】
これらの予備的な結果は、十分なヒト中和抗ＶＥＥＶ抗体を単離したことを示す。図１８Ａおよび１８Ｂは、ＶＥＥＶを中和する本開示に従って産生した、全長ヒトＦａｂの配列を示す。これらの従来のヒト抗ＶＥＥＶ Ｆａｂを、上に記載したように、全ＩｇＧに変換し得、そしてさらなる特性決定のために精製した。
【００９３】
（ＶＥＥＶに対する抗体のエピトープ特異性試験）（Ｒｏｅｈｒｉｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８２）１１８、ｐｐ２６９〜２７８；およびＲｏｅｈｒｉｇおよびＭａｔｈｅｗｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８５）１４２、ｐｐ３４７〜３５６）。
【００９４】
どのＴＣ−８３ウイルスタンパク質がＦａｂにより認識されるか調べるために、ウエスタンブロットを行う。直線的エピトープが認識されるよりは、むしろ、高次構造が認識されるために、ウエスタンブロットでは反応しないＦａｂのために、天然のＥ１およびＥ２膜糖タンパク質を、前述のように、ＥＬＩＳＡアッセイまたは放射標識した免疫沈降アッセイによりウイルス溶解物から精製し得る。
【００９５】
以下の表２に列挙したように、各結合基に対する代表的なモノクローナル抗体を用いた競合ＥＬＩＳＡを使用して、ウイルスタンパク質上の反応性エピトープの同定を、位置付け得る。全ウイルスで被覆したマイクロタイターウェルを、最大約８０％の結合を与える量の代表的なＡｂとともにインキュベートする。ウェルはまた、試験Ｆａｂの増量を含む。抗マウスＩｇＧ Ｆｃ特異的アルカリホスファターゼ結合物を使用して、代表的なＡｂのウイルスに対する結合をモニタリングする。結合の喪失を、エピトープ特異性または空間的配置を示す、ヒトＦａｂを試験することによる競合的結合と判断する。
【００９６】
【表４】
【００９７】
代表的Ａｂ（ＣＤＣ、Ｆｔ．Ｃｏｌｌｉｎｓ、ＣｏｌｏｒａｄｏにあるＪｏｈｎ Ｒｏｅｈｒｉｇ由来）を、５０％硫酸アンモニウム沈殿およびタンパク質Ｇカラムを通したクロマトグラフィーを受けた腹水液から入手し得る。あるいは、Ａｂを、Ｉｇを含まない培地で増殖したそれらのハイブリドーマ細胞株の調整培地から精製し得る。
【００９８】
（試験ウイルス株交差反応性）（Ｒｏｅｈｒｉｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７）３５、ｐｐ１８８７〜１８９０：およびＲｏｅｈｒｉｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８２）１１８、ｐｐ２６９〜２７８）
ＶＥＥＶは、６個のサブタイプ（１〜６）から構成され、サブタイプ１は５個の改変体（１ＡＢ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅおよび１Ｆ）を有する。各サブタイプ由来のウイルス株を、以前記載されたように、ＥＬＩＳＡアッセイまたは間接的な蛍光抗体アッセイ（ＩＦＡ）により、各Ｆａｂ候補体との反応性を試験する。これらの分析に有用なプロトタイプウイルスを、以下の表５に列挙する。
【００９９】
【表５】
【０１００】
Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｏｒｎｅ Ｖｉｒａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ、 Ｃｏｌｏｒａｄｏで維持されたストック由来のウイルスを、ＢＨＫ２１細胞中で増殖し得る。
【０１０１】
（全ＩｇＧを用いたインビトロ中和試験の実施）
ベロ細胞中の５０〜１００ＰＦＵ／試験を使用して、以前記載されたように７０％終末点を記録して中和試験を行う（Ｒｏｅｈｒｉｇら、１９８２）。
【０１０２】
（ウイルス感染からマウスを防御するＡｂの試験性能）
ＰＢＳ中に希釈した精製したＩｇＧの公知の量を、若齢のマウス（例えば、３週齢のＮＩＨスイスマウス）に尾の静脈から静脈内接種する。２４時間後、マウスに、細胞培養培地で希釈したＶＥＥＶを腹腔内感染する。コントロールは、ＰＢＳを静脈内に受け、ウイルスかまたはウイルス希釈液のいずれかを受けた。さらなるコントロール群としては、以前防御の供給を示した、ネズミＡｂ １Ａ４Ａ−１または３Ｂ４Ｃ−４が挙げられる。マウスを２週間観察した。接種したマウス由来のヘパリン処理した血漿試料を、眼球の網膜細胞の静脈叢（ｒｅｔｏ−ｏｃｕｌａｒ ｖｅｎｏｕｓ ｐｌｅｘｕｓ）から出血することにより入手した。
【０１０３】
（さらなる抗ＶＥＥＶ Ｆａｂの単離）
ＴＣ−８３抗原に対して導いた、ヒトＦａｂの拡張したパネルを産生する。既にＴＣ−８３においてパンニングをされた、１０３７および９５１ライブラリー由来の１０００より大きい個体ＦａｂクローンのさらなるＥＬＩＳＡスクリーニングを行う。これは、それらのパンニングしたライブラリー由来の１９０のＦａｂクローンの元のスクリーニングを補充する。さらに、新規のファージディスプレイ抗体ライブラリーを、ＴＣ−８３に対する力価を有することが以前に示されているドナー（８１１）のＲＮＡから構築する。新しく構築した８１１ライブラリーを、固定したＴ−８３についてパンニングする。独特のＦａｂを、インビボで中和を提供し、動物モデルで致死ウイルス感染に対して防御を提供する能力について、上記のように特徴づけする。
【０１０４】
（実施例３−ボツリヌス菌）
上記のライブラリー作製およびパンニング技術を適用することにより、異なるボツリヌス菌毒素血清型の多くに結合する抗体を単離し、大量に産生する。炭疽菌およびＶＥＥＶに関して上に記載した中和抗体と同様に、ボツリヌス神経毒に対するこれらの十分なヒト抗体は、免疫学的予防のために、または免疫療法として適している。
【０１０５】
（実施例４−デング熱ウイルス）
ヒト全長中和抗体は、他の治療目的のために、安全であり、十分耐容性であることが既に証明されているので、道理にかなっている天然の抗毒性または抗感染性であるとして特に有用である。動物に予防接種することにより引き起こされるか、または、種々の動物宿主に受動的に投与された中和抗体は、いくつかの例で、デング熱に対する防御を提供することが示されている。しかし、ヒトにおけるデング熱の感染が、予防接種により増強されるという徴候があり、および、特異的デング熱抗原に対する抗体が、凝固およびインテグリン／付着因子タンパク質に関する一般的エピトープとの交差反応を介して、これら自身に出血を引き起こし得るという報告がある（Ｆａｌｃｏｎａｒ、１９９７）。
【０１０６】
異なる血清型のデング熱ウイルスに感染したかまたはそれらを予防接種した８人のヒトドナーの血液サンプルまたは骨髄サンプルからの１６の抗体ライブラリーを作成した。２つのライブラリーを各ドナーから産生し、１個はκ軽鎖を使用し、もう１個はλ軽鎖を使用した。８個のドナーは、４個の血清型のデング熱のそれぞれを１個ずつ感染したか予防接種した４個のドナー、複数のデング熱血清型で感染した個体由来の２個のライブラリーおよび４価のデング熱ワクチンを受けた個体由来の２個のライブラリーを含む。生きた細胞、生きたウイルスおよびウイルス溶解物ならびに４個のデング熱血清型由来の外皮およびＮＳ１タンパク質を含む組換えデング熱抗原に対する選択のために、１６個の抗体ライブラリーを使用する。
【０１０７】
同定したＦａｂ抗体を、他のＦａｂおよび抗体との特異性、親和性および競合性の特徴づけに使用するために精製する。
【０１０８】
中和について特徴付けた重要なデング熱抗体フラグメントを、コード領域を組織内の哺乳動物発現ベクター中にサブクローニングすることにより、全長ヒトＩｇＧ１に変換する。全長ＩｇＧコード配列を哺乳動物細胞中に含むプラスミドのトランスフェクトにより、特徴づけおよび受動的免疫治療に使用するためのＩｇＧの大量生産が可能になる。
【０１０９】
（実施例５−西ナイルウイルス）
上記のライブラリー作製およびパンニング技術を適用することにより、多くの異なる西ナイルウイルス株に結合する抗体が単離され、大量に産生される。炭疽菌およびＶＥＥＶに関して上に記載した中和抗体と同様に、西ナイルウイルスに対するこれらの完全なヒト抗体は、免疫学的予防のために、または免疫療法として適している。
【０１１０】
（実施例６−痘瘡／痘疹ウイルス）
痘疹の中和に関与する公知の個別の抗原に対して、前述の免疫化ヒトライブラリーをスクリーニングすることにより、抗原に結合する抗体の類似したパネルを入手し、そして、インビトロおよびインビボでウイルスの侵入および拡散を中和し得る抗体を同定する。さらに、本明細書に記載した技術により、類似の重鎖対／軽鎖対の多くの改変体を同定し、試験および開発のために最も好ましい特徴を有する候補を選択するための種々の親和性を提供する。例えば、感染細胞、溶解物、またはビリオンの選択のための、より複雑な抗原の混合物の使用もまた、代替アプローチとして企図される。この方法に従って誘導した高親和性候補を、他のいくつかのアプローチが必要とし得る親和性の成熟を必要とすることなく、免疫学的予防のために単独で使用し得る。あるいは、所望の場合、特異的抗原に対する抗体のカクテルを使用し得る。例えば、Ｈｏｏｐｅｒら（２０００）は、ワクチンの遺伝子Ｌ１ＲおよびＡ３３Ｒを使用したＤＮＡ予防接種が、それぞれ単独のものより効果的であることを発見した。このことは、これら２つの抗原に対して、両方に対して惹起された抗体が、１個に対する抗体よりも良い保護を与えることを示している。Ｎｏｗａｋｏｗｓｋｉら（Ｎｏｗａｋｏｗｓｋｉら、２００２）は、ファージディスプレイに由来する重複しないエピトープに対する３つの抗体の混合物が、各抗体のみではほとんど効果を示さなかった、ボツリヌス菌神経毒の強力な中和を生成したことを発見した。
【０１１１】
以下の参考文献は、その全体が、本明細書中に参考として援用される：
【０１１２】
【化３】
【０１１３】
本明細書に開示された実施形態に対して種々の改変がなされ得ることは理解されるべきである。例えば、当業者は、抗体または抗体フラグメントの機能性に必ずしも不利に影響させることなく、本明細書に記載した特定の配列をわずかに変化させ得ることを、理解する。例えば、抗体またはフラグメントの機能性を破壊することなく、抗体配列中の１個または複数のアミノ酸の置換が、頻繁になされ得る。従って、本明細書に記載された特定の抗体に、７０％より高い程度の相同性を有する抗体は、本開示の範囲内であることは理解されるべきである。特定の有用な実施形態において、本明細書に記載された特定の抗体に対して約８０％より高い相同性を有する抗体が、企図される。他の有用な実施形態において、本明細書に記載される特定の抗体に対して約９０％より高い相同性を有する抗体が、企図される。従って、上述の説明は、限定として解釈されるべきではなく、単に好ましい実施形態の例示である。当業者は、本発明の開示の範囲および精神内の他の改変を想定する。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】図１は、本開示の好ましい実施形態に従うライブラリー生成のための組織供給源として適切な個体の曝露歴を要約する表である。
【図２Ａ】図２は、炭疽菌のＰＡ８３抗原に対する骨髄ドナーおよび血液ドナーの力価を示す。
【図２Ｂ】図２は、炭疽菌のＰＡ８３抗原に対する骨髄ドナーおよび血液ドナーの力価を示す。
【図３】図３は、ＰＡ６３およびＰＡ８３に対するＶＨ陽性反応性の配列分析を示す。
【図４】図４は、ＰＡ６３およびＰＡ８３に対するＶＫ陽性反応性の配列分析を示す。
【図５】図５は、ＰＡ６３およびＰＡ８３に対するＶＬ陽性反応性の配列分析を示す。
【図６】図６は、炭疽菌タンパク質ＰＡ８３およびＰＡ６３に対する抗体の改変体ヒトκ軽鎖の配列を示す。
【図７】図７は、炭疽菌タンパク質ＰＡ８３およびＰＡ６３に対する抗体の改変体ヒトλ軽鎖の配列を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、炭疽菌タンパク質ＰＡ８３およびＰＡ６３に対する抗体の改変体ヒトκ重鎖の配列を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、炭疽菌タンパク質ＰＡ８３およびＰＡ６３に対する抗体の改変体ヒトκ重鎖の配列を示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、炭疽菌タンパク質ＰＡ８３およびＰＡ６３に対する抗体の改変体ヒトκ重鎖の配列を示す。
【図９】図９は、精製したＦａｂによる炭疽菌毒素活性の中和を示す。
【図１０】図１０は、７つの連続的に希釈したＦａｂの％保護（毒素単独と比較して）を示す。
【図１１】図１１は、本明細書に記載された方法に従って産生されたＦａｂの、ＰＡ６３および／またはＰＡ８３に対する直線的エピトープと反応する能力を実証するウエスタンブロットを示す。抗ＰＡ６３抗体が、対照的に、変性したＰＡ６３に結合しないのに対して、試験した５つの抗ＰＡ８３Ｆａｂは、全てＰＡ８３に対する直線的エピトープに結合するようであり、そして、ＰＡ６３に対する弱い、おそらく非特異的な結合に見えるものを示す。
【図１２】図１２は、ＰＡ８３およびＰＡ６３に対する選択されたＦａｂのＥＬＩＳＡ力価を示す。ＰＡ６３への切断は、ＦＭＬ８ＥおよびＦ９Ｌ６Ｒ２の結合を劇的に変えるが、ＦＭＫ７Ｃは、両方の形態に等しく良く結合する。Ｆ９５１Ｌ６３１Ｄは、ＰＡ６３にのみ結合する。観察された最大値の結合は、ＦＭＫ７Ｃのそれの１／４であり、このことは、ＰＡ６３物質の一部のみが、Ｆ９５１Ｌ６３１Ｄが相互作用し得る形態中にあることを示唆している。
【図１３】図１３は、エピトープ特異性を評価するために、Ｆａｂ ＦＭＬ８Ｅのそのタグ化されたバージョンを、他のタグ化されていないＦａｂと競合して使用した試験の結果を示す。
【図１４】図１４は、ＶＥＥＶの固定されたＴＣ−８３抗原に対する血清反応性を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜図１５Ｄは、ＶＥＥＶの固定されたＴＣ−８３への結合に関して、４つのライブラリー（９５１Ｋ、９５１Ｌ、１０３７Ｋおよび１０３７Ｌ）由来のＦａｂクローンのスクリーニングの結果を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜図１５Ｄは、ＶＥＥＶの固定されたＴＣ−８３への結合に関して、４つのライブラリー（９５１Ｋ、９５１Ｌ、１０３７Ｋおよび１０３７Ｌ）由来のＦａｂクローンのスクリーニングの結果を示す。
【図１５Ｃ】図１５Ａ〜図１５Ｄは、ＶＥＥＶの固定されたＴＣ−８３への結合に関して、４つのライブラリー（９５１Ｋ、９５１Ｌ、１０３７Ｋおよび１０３７Ｌ）由来のＦａｂクローンのスクリーニングの結果を示す。
【図１５Ｄ】図１５Ａ〜図１５Ｄは、ＶＥＥＶの固定されたＴＣ−８３への結合に関して、４つのライブラリー（９５１Ｋ、９５１Ｌ、１０３７Ｋおよび１０３７Ｌ）由来のＦａｂクローンのスクリーニングの結果を示す。
【図１６】図１６は、ＶＥＥＶの固定されたＴＣ−８３抗原に対する精製されたヒトＦａｂの直接滴定を示す。
【図１７】図１７は、ＶＥＥＶまたはＢＳＡの固定されたＴＣ−８３抗原への結合に関して、マウスＦａｂ ｍＨｙ４（３Ｂ４Ｃ−４）に対するヒトＦａｂの競合を示す。
【図１８Ａ】図１８Ａおよび図１８Ｂは、ＶＥＥＶを中和する本開示に従って産生された完全ヒトＦａｂ配列を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ａおよび図１８Ｂは、ＶＥＥＶを中和する本開示に従って産生された完全ヒトＦａｂ配列を示す。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、それぞれ２００２年２月１１日、２００２年４月２９日、２００２年１１月２５日に出願された、米国特許仮出願番号第６０／３５６，０８６号、６０／３７６，４０８号および６０／４２８，８０７号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
（技術分野）
本開示は、例えば、炭疽菌、ボツリヌス菌、痘瘡、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）などの感染性病原体に関して、抗毒素または抗感染薬として有用である、ヒト中和抗体（全長または機能性フラグンメント）に関連する。
【０００３】
（関連技術の背景）
米国における最近のテロ行為の活動を受けて、炭疽菌感染を防止し、および処置する我々の能力に対する懸念が高くなっている。炭疽菌のためのワクチンは存在するが、６回の間隔を開けた接種からなり、毎年の追加免疫を必要とし、ほとんどのワクチンにおいて不愉快な副作用を生じる。このことが、広く行き渡った使用を妨げ、そして、公衆に予防接種するためには、今でも大きな障害となっている。現在使用されている炭疽菌ワクチンは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓの溶解物由来の保護抗体の精製を包含するプロセスを介してＢｉｏｐｏｒｔ（Ｌａｎｓｉｎｇ、ＭＩ）により製造される。このワクチンを産生するために使用され得るＬＦおよびＥＦを欠如する他の株が存在し、ならびに使用され得る高産生組換えＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ株も存在するが、これは、さらに、スターン生存ワクチン株のようである。おそらく、このようなさらなるワクチンを試験することおよび比較することの困難性ならびに小さな市場が、実際の試験、使用許可、製造を妨げてきた。現在のワクチンの副作用は、湾岸戦争症候群と多くの点で関係していて、大規模のワクチン接種が、テロリストの脅しに直面して現在価値があり得る可能性は、現在のワクチンにおける改良が、現在追求されることを示唆している。適当なワクチンがない限りは、曝露に対する処置は、テロリズムの活動に対する主要な応答として残っている。
【０００４】
米国において、最近の、汚染された手紙由来の炭疽菌曝露は、全て抗生物質に対して感受性の炭疽菌の株が関与している。しかし、悲劇的に、多くの人々が診断の遅れのために死んでいる。このことをふまえて、疾患および死を防止し得、抗生物質治療および／または適応免疫性をさらなる時間効果的にすることを可能にする炭疽菌暴露に対する処置を有することが有用である。
【０００５】
炭疽菌に由来する死の第１の原因は、細菌により生成される２つの関連した毒素に対する身体の反応である。これらは、両方とも、ＰＡ６３にプロセスされるとすぐに、ＰＡ８３として細胞レセプターに結合するＰＡ６３と呼ばれるプロセスされたタンパク質を含む。炭疽菌毒素に対するヒト細胞上のレセプター、ＡＴＲ（炭疽菌毒素受容体（ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ））は、最近同定された。Ｂｒａｄｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ、４１４巻、２００１年１１月８日を参照のこと。次いで、ＰＡ６３は、ＥＦタンパク質（エデマ因子）かまたはＬＦタンパク質（致死因子）のいずれかに結合し得る七量体を生成する。七量体化ＰＡ６３ならびに結合ＥＦおよび／またはＬＦのエンドソーム内在化は、細胞内へＥＦ毒素およびＬＦ毒素の誘導を促進する。エンドソーム小胞の酸性化は、ＥＦおよび／またはＬＦが細胞質ゾルに入り得、そこでそれらの毒性効果を発揮する微細孔をＰＡ七量体が、形成することを誘導する。３つの成分、ＥＦ、ＬＦまたはＰＡのいずれもが、それ自体では、疾患を引き起こし得ない。
【０００６】
いくつかの連続した証拠は、ＰＡのレセプターへの結合の防止し得ること、またはＥＦおよびＬＦのＰＡとの相互作用を妨害し得ることを示している。ワクチンそれ自体は、防御的抗体を作製するために、精製ＰＡ部分のみを使用している。Ｌｉｔｔｌｅら（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：５１７１〜５１７５（１９９７））は、ＰＡ抗体をモルモットに受動的に投与した。次いで、モルモットは、後の炭疽菌感染に対する防御を示した（ポリクローナル抗体では、７０％の防御であり、１つのＰＡ６３モノクローナル抗体では、死が２日間遅れた）。単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖｓ）は、ＰＡによる受容体結合を阻害するために使用されてきた。Ｃｉｒｉｎｏら（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：２９５７〜２９６３（１９９９））は、ＰＡ８３に結合する未処置のヒトライブラリーから多くのｓｃＦｖｓを同定した。彼らは、次いで、これらを細胞に基づいたアッセイに使用し、ここで、ＰＡ３２（ＰＡ６３の短縮型）がＥＧＦＰに融合し、その後、ＰＡ６３と類似の方法で細胞に取り入れられた。次いで、細胞の吸収におけるＰＡ３２−ＥＧＦＰに対するこれらｓｃＦｖｓの効果をモニタリングするために、ＥＧＦＰの蛍光を使用し得た。細胞によるＰＡ３２−ＥＧＦＰの吸収を防止し得る１つのｓｃＦｖが、同定された。Ｍｏｕｒｅｚら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：９５８〜９６１（２００１））は、ＥＦ／ＬＦ部位においてまたは近辺でＰＡ６３七量体に結合する炭疽菌毒素に対する多価ペプチドインヒビターを作製した。彼らは、細胞に基づいたアッセイを使用して、このインヒビターが、ＰＡ／ＬＦ毒性に対して細胞を防御し得ることを示した。彼らはまた、インヒビターをチャレンジの３〜４分間後に導入した場合、ラットを最低致死用量のＰＡおよびＬＦの１０倍でチャレンジし、その後まだ防御されていることを示した。
【０００７】
これらのデータは全て、炭疽菌感染の遅れた診断を受ける患者に、抗生物質を用いた組み合わせ治療のための治療用ヒト組み合わせ抗体を開発することを可能とすることを示唆している。
【０００８】
ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＶＥＥＶ）は、ウマおよびヒト宿主の両方に運ばれ得る蚊運搬アルファウイルスである。ウマおよびロバの集団の感染が、高い死亡率を生じ得るのに対して、天然のヒト感染は、通常、発熱、悪寒、倦怠感および激しい頭痛からなり、１〜４％のヒトしか重度の脳炎には進行しない。しかし、ＶＥＥＶは、その低いヒト感染性用量、容易な作製およびエアゾール化し得ることのために、ＣＤＣにより、「区分Ｂ」重要生物学的病原体として分類されてきた。潜在的に、エアゾール化したＶＥＥＶは、高い感染性があるとして公知の、および嗅索による中枢神経系への直接的接近手段を容易に得ることができるＶＥＥＶの形態を使用して効果的な生物兵器として使用され得る。ウイルスの複製がＣＮＳ中で一旦生じると、脳炎は本格的なリスクになる。不幸にも、ＶＥＥＶ感染の処置は、対症的な治療に限定されている。
【０００９】
その使用は、危険に曝された研究所就業者および軍隊に限定されているが、ＶＥＥＶに対して利用可能な治験ワクチンがある。生存力を弱めたワクチン、ＴＣ−８３（ＦＤＡ治験新薬 ＃１４２）（Ｐｉｔｔｍａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ １４、ｐｐ３３７〜３４３（１９９６））は、これら双方の環境で使用されてきた。このワクチンは、組織培養中の、伝染性の強いトリニダードロバウイルスのいくつかの継代により樹立された。ＴＣ−８３ウイルスは、ほとんどのヒトおよびウマにおいて、ＶＥＥＶ特異的中和抗体を誘発させる（Ｋｉｎｎｅｙら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０、１９〜３０（１９８９））。実験動物では、ワクチンは、伝染性の強いＶＥＥＶ株を有する皮下のチャレンジまたは気中チャレンジに対する免疫性を産生し得た（Ｐｈｉｌｌｐｏｔｔｓ、Ｖａｃｃｉｎｅ １７、ｐｐ２４２９〜２４３５（１９９９））。しかし、ヒトワクチンの１８％までは、最初のワクチン接種から防御を発現しない。さらに、ワクチンは、比較的高い比率の反応性遺伝子（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）（２５％）を有する。最近の１つの報告は、ＴＣ−８３が、もはやヒト使用には利用不可能であると記載する（Ｐｈｉｌｌｐｏｔｔｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ ２０、ｐ１４９７〜１５０４（２００２））。ＴＣ−８３に関する関心事は、不活性化ワクチン、Ｃ−８４の開発を促進した。しかし、Ｃ−８４は、動物モデルにおけるウイルスの伝染性の強い株を用いたエアゾールチャレンジに対して防御を産生しなかった（Ｐｉｔｔｍａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１４、ｐｐ３３７〜３４３（１９９６））。結果として、Ｃ−８４は、初期免疫原としては、研究所就業者には使用されないが、ＴＣ−８３に対する非応答者のために引き続き行うワクチンとして、または追加免疫として、（ここで、それはリコール抗原（ｒｅｃａｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ）として作用する）かなり有用である。従って、抗ＶＥＥＶ治療（例えば、強い中和抗ＶＥＥＶ抗体）に対する切迫した需要がある。
【００１０】
ＶＥＥＶは、膜ウイルスであり、ここで、膜およびキャプシド構造は、脂質二重層により分離されていて、そして、Ｅ２糖タンパク質の膜貫通末端を介して相互作用していると考えられる。シンドビスウイルスと似て、ＶＥＥＶは、Ｅ１／Ｅ２ヘテロ二量体の三量体として組織化されたビリオンタンパク質鋭利部を有する（Ｐａｒｅｄｅｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７５、ｐｐｐ９５３２〜９５３７（２００１）；Ｐｈｉｎｎｅｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７４、ｐｐ５６６７〜５６７８（２０００））。Ｅ１（ｇｐ５０）およびＥ２（ｇｐ５６）に存在し、重要な中和部位に関与し得るエピトープは、モノクローナルＡｂｓを使用して研究されてきた（ＭａｔｈｅｗｓおよびＲｏｅｈｒｉｇ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｐｐ２７６３〜２７６７（１９８２））。部位Ｅ２Ｃは、Ｅ２鋭利部の先端に存在し、中和（Ｎ）エピトープになると考えられている。さらなるエピトープもまた、中和活性を示し、Ｅ２Ｃ部位と近接した構造関係を有し得る。
【００１１】
ＶＥＥＶ感染のマウスモデルは、ヒトにおける疾患の病原と類似した疾患の病原に従うと考えられる。ウイルスチャレンジ前のＡｂ中和の受動的な移動は、これらの通常のマウスにおいて、効果的に死を防止する（ＲｏｅｈｒｉｇおよびＭａｔｈｅｗｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８５）１４２、ｐｐ３４７〜３５６；Ｐｈｉｌｌｐｏｔｔｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００２）２０、１４９７〜１５０４）を参照のこと）。非中和Ａｂｓもまた、マウスの腹腔内または静脈内のウイルスチャレンジにおいて防御を示した（ＨｕｎｔおよびＲｏｅｈｒｉｇ、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９５）１３、ｐｐ２８１〜２８８；およびＨｕｎｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）１８５、２８１〜２９０）。非中和Ａｂのウイルスチャレンジからの防御機構は理解されていないが、それらは、ウイルスの複製を遅らせることにより作用し得、そしてそうすることで、宿主免疫系にウイルス感染に反応する時間およびウイルス感染を制御する時間を与えると推測される（Ｈｕｎｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）１８５、２８１−２９０）。ＶＥＥＶの気中浮遊曝露に対して、ヒトのための効果的な治療は、例えば、曝露の時間におけるまたは曝露の時間に近い時間でウイルスの直接的な中和のような処置の速いやり方を必要とし得る。Ａｂを中和する性能は、ＶＥＥＶの脳への拡散を防止することと特定の関係にある。この点で、気中ウイルスチャレンジ２４時間後までの中和Ａｂのマウスへの投与が、防御効果を示すことが重要である（Ｐｈｉｌｌｐｏｔｔｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０、１４９７〜１５０４（２００２））。
【００１２】
これらおよび類似の研究に記載されたマウス抗体は、ヒトにおけるＶＥＥＶ感染の防止および処置において使用される抗体であり得る。しかし、げっ歯類の抗体は、ヒトでは免疫原性が高く、従って、特に繰り返し投与が治療のために必要な場合には、それらの臨床的応用は限定される。抗体ヒト化と名づけられたプロセスは、元の抗原特異性を維持しようと努力するのに対して、げっ歯類抗体のほとんどをヒト抗体領域で置き換えることにより、げっ歯類抗体の免疫原性を減少するために使用され得る。しかし、この取り組みは、通常、時間およびコストがかかり、ヒト化Ａｂに対する免疫原性反応の可能性を除外しない。十分ヒト化し、ＶＥＥＶ上の中和エピトープを標的とする抗体は、ウイルス感染の効果的な阻害の最良の機会をもたらし、および免疫原性の最小限のリスクが存在する最も所望される治療候補である。
【００１３】
ボツリヌス神経毒は、公知の最も強力な細菌毒の１つであり、ヒトに対するＬＤ５０は、１ｎｇ／ｋｇである。この毒素は、細菌Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍにより産生され、他の数種のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種によってもまた産生され、そして、７つの毒素の抗原型（ＡからＧ）が認められている。分子レベルでは、毒素は、１５０ｋＤａのタンパク質として産生され、プロテアーゼに曝露されることにより切断され、結合を残した２つの鎖：約５０ｋＤａの軽鎖および１００ｋＤａの重鎖を生成する。重鎖は、神経細胞への結合に関与するドメインを含み、それに対して軽鎖は、神経細胞質ゾルに入る亜鉛依存性エンドプロテアーゼドメインを含む。一旦内側に入ると、このエンドプロテアーゼは、シナプスタンパク質（シナプトブレビン、シンタキシンおよびＳＮＡＰ−２５を含む）のタンパク質分解によりその毒性効果を発揮する。これらのタンパク質の分解は、神経伝達を阻害し、そして、進行性麻痺および死を生じる。
【００１４】
ボツリヌス神経毒に対する抗体は、受動的および能動的免疫モデルにおいて、防御的であることを示している。抗原型Ａ〜ＥからなるＰＢＴワクチンは、ボツリヌス神経毒に曝露される危険性がある人々に対して、現在、国防総省および疾病対策予防センターにより入手可能である。抗原型ＤおよびＧは、天然のヒト感染においては、めったに接触しない。しかし、抗原型Ｆは、一般的であり、ＰＢＴワクチンが欠如している。しかし、抗原型ＤおよびＧの生物テロリストの攻撃に使用される可能性は、見落とされるべきではない。天然の感染では、ポリクローナル抗体の調製は、免疫療法として首尾よく使用されているが、神経細胞への毒素の侵入を最小限にするために、感染の初期に与えられなければならない。いくつかのポリクローナル免疫グロブリンの調製物：ウマの三価（Ａ、ＢおよびＥ）調製物、免疫グロブリンのＦｃ部分がプロテイナーゼ切断により取り除かれたウマ七価調製物およびＰＢＴワクチンを予防接種したドナーから入手したヒト免疫グロブリン調製物（ｈＢＩＧ）が、免疫療法として利用可能である。ウマからの調製物はいずれも処置した個体に過敏な反応を伴う困難を有した。ヒトからの調製物は、耐用性良好であり、効果的であるが、供給不足であり、７つの抗原型の５つに対してしか有用ではない。天然感染に対してさえ、ボツリヌス神経毒の全ての抗原型に対する十分なヒト中和抗体を即時に供給することは有用である。２００１年の故意の炭疽菌の放出の後の生物学的テロリズムに対する私たちの無防備さへの増大する認識は、このような免疫療法の開発をさらに重要にする。
【００１５】
１９８０年５月の天然痘根絶の宣言（Ｆｅｎｎｅｒら、１９９８）およびワクチンプログラムの休止以来、予防注射された人の免疫性は衰えてきており、そして、１９８０年以降に出生した人は、予防注射されていない。世界的な免疫性の欠如は、痘瘡ウイルス、生物兵器としての天然痘の原因となる薬剤の故意の放出の脅威を劇的に増加した。痘瘡ウイルスは、それを生物学的戦争に特に適したものにする特徴を有している。ウイルスは、呼吸経路によるかまたは直接の接触により、人から人へ拡散し得る。ウイルスのエアゾール放出は、エアゾール形態中でのそのかなりの安定性のために、および伝染性用量がとても小さい（Ｗｈｅｒｌｅら、１９７０）ために広く散布し得る。疾患に対する特定の処置はない。大量の感染性ウイルスがなくなり得る脅威もまたある。Ａｌｉｂｅｋ、ソビエト連邦の民間生物兵器プログラムの前副長官は、１９８０年の初めにソビエト政府が生物兵器プログラムを開始し、爆弾および弾道ミサイルに輸送するために、毎年、多量の痘瘡ウイルスを作製する方法を開発したと報告した（Ａｌｉｂｅｋ、１９９９）。財政支援の減少および１９９２年のソビエトの民間生物戦争プログラムの中止とともに、熟練した科学者、設備および材料が、他の国に運ばれ得た。報告されたアジアでの流行は、３０％かまたはそれより高い死亡率を有した（Ｆｅｎｎｅｒら、１９９８）。現在、より感受性があり、移動も頻繁な集団が原因となり、ウイルスは、国および世界中に、非常に速くおよび広く拡散し得る。
【００１６】
痘瘡ウイルスは、ＤＮＡウイルスであり、ワクシニア、サル痘ウイルスおよび血清学的に交差反応するいくつかの他の動物のポックスウイルスを含むポックスウイルス科およびオルソポックスウイルス属のファミリーの一部である（Ｆｅｎｎｅｒら、１９８８）。痘瘡ウイルスのみが、すぐにヒトからヒトへ感染し得る（ＢｒｅｍａｎおよびＨｅｎｄｅｒｓｏｎにより総説される、２００２）。ＤＮＡ配列分析により、痘瘡およびワクシニアウイルスは近い関係にあることが明らかになった（Ｍａｓｓｕｎｇら、１９９４）。痘瘡ウイルスの感染用量は、非常に低く、たった数ビリオンであると考えられる（Ｗｈｅｒｌｅら、１９７０）。痘瘡ウイルスは、そのゲノムを転写し、および複製し、子孫ビリオンを感染細胞の細胞質内に完全に集める（Ｍｏｓｓにより総説される、１９９６）。４つの型の感染性の形態が産生される：細胞内成熟ウイルス（ＩＭＶ）、細胞内膜ウイルス（ＩＥＶ）、細胞結合型膜ウイルス（ＣＥＶ）および細胞外膜ウイルス（ＥＥＶ）（Ｍｏｓｓにより総説される、１９９６）。ＩＭＶは、細胞質に残る主要な形態である。ＥＥＶは、感染粒子の、より小さい画分を代表するが、インビトロおよびインビボのウイルスの長期的な蔓延および拡散の点で、生物学的に関連した形態である（Ｐａｙｎｅ、１９８０；ＳｍｉｔｈおよびＶａｎｄｅｒｐｌａｓｓｃｈｅｎ、１９９８；ＬａｗおよびＳｍｉｔｈ、２００１）。ＩＭＶではなく、ＥＥＶに対する免疫反応が、オルソポックスウイルス感染に対する防御のために必要であることが示された（Ａｐｐｌｅｙａｒｄら、１９７１；Ｂｏｕｌｔｅｒ、１９６９；ＢｏｕｌｔｅｒおよびＡｐｐｌｅｙａｒｄ、１９７３、Ｂｏｕｌｔｅｒら、１９７１；Ｉｃｈｉｈａｓｈｉら、１９７１；Ｍｏｒｇａｎ、１９７６；Ｐａｙｎｅ、１９８０；ＰａｙｎｅおよびＫｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ、１９８５；ＴｕｒｎｅｒおよびＳｑｕｉｒｅｓ、１９７１）。ＥＥＶの外膜のための１０個のタンパク質をコードする６個の遺伝子が報告されている（Ｐａｙｎｅ、１９７８；Ｐａｙｎｅ、１９７９）。それらは、Ａ３３Ｒ（ｇｐ２２〜２８）（Ｒｏｐｅｒら、１９９６）、Ａ３４Ｒ（ｇｐ２２〜２４）（ＤｕｎｃａｎおよびＳｍｉｔｈ、１９９２）、Ａ３６Ｒ（ｐ４５〜５０）（ＰａｒｋｉｎｓｏｎおよびＳｍｉｔｈ、１９９４）、Ａ５６Ｒ（ｇｐ８６、かなりグリコシル化した血液凝集素）（ＰａｙｎｅおよびＮｏｒｒｂｙ、１９７６；Ｓｈｉｄａ、１９８６）、Ｂ５Ｒ（ｇｐ４２）（Ｉｓａａｃｓら、１９９２；Ｅｎｇｌｅｓｔａｄら、１９９２）およびＦ１２ＬまたはＦ１３Ｌ（ｐ３７）（Ｈｉｒｔら、１９８６；ＢｌａｓｃｏおよびＭｏｓｓ、１９９１）である。最近、Ａ３６Ｒタンパク質が、ＣＥＶおよびＥＥＶ粒子には、存在しないことが発見された（ｖａｎ Ｅｉｊｌら、２０００）。ＩＭＶの膜タンパク質は、Ａ２７Ｌ（ｐ１４）（ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＥｓｔｅｂａｎ、１９８５）、Ｄ８Ｌ（ｐ３２）（Ｍａａら、１９９０；ＮｉｌｅｓおよびＳｅｔｏ、１９８８）、Ａ１７Ｌ（ｐ２１）（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、１９９５）およびＬ１Ｒ（Ｍ２５、ミリスチル化ビリオンタンパク質）（Ｆｒａｎｋｅら、１９９０）である。Ａ２７Ｌ、Ａ１７ＬおよびＬ１Ｒは、ＩＭＶの融合および侵入に関係する（ＩｃｈｉｈａｓｈｉおよびＯｉｅ、１９９６）。
【００１７】
ワクチンウイルスから製造された天然痘ワクチンは、これまでに製造された最初のワクチンであった。現在の備蓄は、子牛の皮膚で増殖された、生きているワクチンウイルスからなる。米国では、蓄えの供給は、限られている：６〜７百万人の人々に予防接種するために十分な量だけ存在する。他の国はどこも、発生した場合、その国の人口を網羅するために十分な量を有していない。天然痘の予防接種は、また、他の任意の型の予防接種よりも重篤な副作用と結びつき、それが、根絶後、予防接種を終らせた理由の一つである（Ｏｂｅｒら、２００２）。現在、世界保健機関および米国、疾病対策予防センターにより、疑わしい場合にのみ、使用が推奨され、大衆に対する予防接種は、推奨されていない（Ｓｍａｌｌｗｏｏｄら、２００２）。ワクチンウイルスを用いた予防接種は、少なくとも５年間は天然痘を予防する点で効果的であり、かなり長い期間、感染を予防し得るかまたは改変し得るが、この変動は、ヒトにより大きく異なる。
【００１８】
中和抗体が、オルソポックスウイルスに対する免疫性において、特に再感染の防止および感染の蔓延の予防において、重要な役割を演じるということには、一般的な合意がある。感染を防止するかまたは痘疹予防接種由来の副作用を制御する点における痘疹免疫グロブリン（ＶＩＧ）の利点は、明らかに実証された（Ｋｅｍｐｅ、１９６０、Ｋｅｍｐｅら、１９６１、Ｈｏｂｄａｙ、１９６２）。組換えＢ５Ｒタンパク質に対するポリクローナル抗血清は、ＥＥＶ感染を阻害した（Ｇａｌｍｉｃｈｅら、１９９９）。Ｂ５Ｒタンパク質を予防接種したマウスは、中和抗体により媒介されるようである痘疹ウイルスにより、致死性感染に対して保護された。タンパク質Ａ３４ＲでもＡ３６Ｒでもなく、Ａ３３Ｒが、能動免疫および受動免疫おいて保護的であるが、保護は、抗体の力価と関連せず、抗Ａ３３Ｒ抗体は、インビトロでＥＥＶを中和しなかった。著者らは、保護がおそらく単一の抗体結合とは異なる機構と関与していることを記載した（Ｇａｌｍｉｃｈｅら、１９９９、Ｓｃｈｍａｌｊｏｈｎら、１９９９）。ＩＭＶの膜に局在する痘疹ウイルスの１４ｋＤａ三量体タンパク質（Ａ２７Ｌ、ｐ１４）に対するマウス中和抗体の予防的投与ならびに治療的投与は、マウスにおけるウイルスの複製を効果的に制御する（Ｒａｍｉｒｅｚら、２００２）。Ｌ１ＲおよびＡ３３Ｒ遺伝子を有するＤＮＡワクチンは、Ｌ１ＲおよびＡ３３Ｒに対する中和抗体を用いて、致死ウイルス感染に対してマウスを保護した（Ｈｏｏｐｅｒら、２０００）。
【００１９】
新生感染性疾患の最近の論点（Ｃａｓａｄｅｖａｌ、２００２）で記載されたように、生物学的薬剤に対して即時の免疫性を提供し得る唯一の利用し得る対抗手段は、抗体を有する受動免疫である。ワクチンは、保護免疫性を誘導するために、時間を要し、宿主の免疫反応を組み込む能力に依存するが、受動免疫は、宿主の免疫状態に関わらず、理論上、保護を与え得る。低細胞毒性および高特異的活性は、曝露後の処置の他の測定に対する受動免疫の利点の内の一つである。
【００２０】
良好な血清中和活性およびこのようなドナーの骨髄由来のコンビナトリアル抗体ライブラリーの構築を用いた免疫ドナーの同定は、ウイルス感染に対する特異性の高い中和抗体の大きなパネルの単離のための論理的なアプローチである（Ｂｕｒｔｏｎら、１９９１；Ｂａｒｂａｓら、１９９２；Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、１９９３；Ｂｕｒｉｏｎｉら、１９９４；Ｍａｒｕｙａｍａら、１９９９；Ｍａｒｕｙａｍａら、２００２）。中和エピトープを含む組換えエンベロープタンパク質に関するライブラリーの選択は、直接的である。マウス抗体とは違って、ヒト抗体は、非免疫原性であり、一度その効力が、感受性のある動物で十分に特徴付けられると、それらは、患者に安全に投与され得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
生物兵器で使用され得る型の感染性因子を中和する抗体を同定することが好ましい。これらの生物保護抗体が単一の抗体ライブラリーに由来し得る場合もまた、好都合である。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
（要旨）
ファージディスプレイ技術および予防接種したヒトまたは回復期のヒトのリンパ細胞由来のメッセンジャーＲＮＡを使用して、本明細書中に記載した方法に従って、感染性因子由来の抗原に結合する抗体フラグメント（Ｆａｂ）のパネルを迅速に同定することが可能である。これらのＦａｂの抗原との相互作用の強さは、表面プラスモン共鳴を使用した結合動力学を研究することにより決定され得る。これらのヒトＦａｂは、残存する定常領域ドメインを含む、適切な哺乳動物の発現ベクター中にサブクローニングすることにより、容易に全長ＩｇＧに受理され得る。これらのパネル由来のＦａｂおよび抗体を、小動物モデルでのインビトロおよびインビボでウイルスまたは毒性阻害研究において試験することにより、前臨床試験および臨床試験の継続に適した中和抗体のサブセットを同定し得る。これらの抗体は、次いで、上記因子のいずれかに感染したかまたは曝露された個体の処置において、免疫治療剤として使用され得るか、または、曝露の危険が予想される個体に予防的に使用され得る。
【００２３】
従って、一つの局面では、抗体またはその機能性フラグメントが、感染性因子による感染を中和するかまたは予防するために、同定され得、単離され得、多量に産生され得る抗体ライブラリーが、記載される。
【００２４】
別の局面では、炭疽菌感染の処置に効果的なヘテロ二量体抗体が記載される。ヘテロ二量体抗体は、抗体ライブラリーから選択される。ライブラリーは、好ましくは、免疫したヒト供給源から生成される。ヘテロ二量体抗体は、炭疽菌感染に関与する分子（例えば、炭疽菌保護抗原またはＥＦタンパク質もしくはＬＦタンパク質）に結合し、その活性を無効にする。そして、その結果、細胞への毒素誘導に関与するプロセスを妨害することにより、毒素活性を阻害する。これらのプロセスとしては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ＰＡ８３のレセプターへの結合、ＰＡ８３のＰＡ６３へのプロセッシング、ＰＡ６３の前孔複合体形成への相互作用、ＥＦまたはＬＦの前孔への結合、ＥＦまたはＬＦの膜移行を可能にする前抗の立体配座の変化、またはＥＦもしくはＬＦの孔を通した移行。この妨害は、身体の細胞によるこれらのタンパク質の吸収と関連した毒性効果が遅くなるかまたは排除されるようなものである。特に有用な実施形態において、ヘテロ二量体抗体は、炭疽菌感染に関与する分子に対して少なくとも１×１０−８Ｍの親和性を有している。別の実施形態では、これらの抗体は、診断の試薬として使用され得る。
【００２５】
別の局面では、ボツリヌス菌を中和する抗体または抗体の機能性フラグメントが記載される。
【００２６】
別の局面では、痘瘡ウイルス（痘瘡）／痘疹ウイルスを中和する抗体または抗体の機能性フラグメントが記載される。
【００２７】
別の局面では、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＶＥＥＶ）を中和する抗体または抗体の機能性フラグメントが記載される。
【００２８】
別の局面では、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）を中和する抗体または抗体の機能性フラグメントが記載される。
【００２９】
別の局面では、デング熱を中和する抗体または抗体の機能性フラグメントが記載される。
【００３０】
別の局面では、感染性因子による感染を予防するために、抗体または抗体の機能性フラグメントを予防的に投与する方法が記載される。
【００３１】
別の局面では、感染性因子による感染を処置するために、抗体または抗体の機能性フラグメントを投与する方法が記載される。
【００３２】
（好ましい実施形態の詳細な記述）
本開示に従ってヒト抗体は、抗体全体かまたは抗体フラグメントであり得る。抗体は、ヘテロ二量体かまたは単鎖抗体であり得る。用語「ヘテロ二量体」とは、抗体または抗体フラグメントの軽鎖および重鎖が、天然に存在する抗体に見られるように、互いにジスルフィド結合により結合していることを意味する。単鎖抗体は、リンカー配列を介して結合した抗体の、軽鎖および重鎖可変領域を有する。
【００３３】
本発明のヒト抗体は、抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより同定される。抗体ライブラリーを生成し、そしてスクリーニングするための技術は、当業者の範囲内である。ＲａｄｅｒおよびＢａｒｂａｓ、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００）Ｌｅｒｎｅｒらに対する米国特許第６，２９１，１６１号および同時係属する米国仮出願番号第６０／３２３，４５５号および同６０／３２３，４００号を参照のこと。これらの出願の開示は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。
【００３４】
一般に、本発明の開示に従って、抗体ライブラリーを産生する第一工程は、一つ以上の感染性因子または感染性因子由来の抗原に対する抗体を産生する個体由来の細胞の回収を含む。代表的には、このような個体を、感染性因子および／または感染性因子由来の抗原に曝露する。特に有用な実施形態において、個体を、複数の感染性因子または生物兵器に関して戦略的に重要である感染性因子由来の抗原に曝露した。このような物質としては、炭疽菌、炭疽菌由来の抗原、ボツリヌス菌、ボツリヌス菌由来の抗原、天然痘、天然痘由来の抗原、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、ＶＥＥＶ由来の抗原、デング熱、デング熱由来の抗原、腸チフス、腸チフス由来の抗原、黄熱病、黄熱病由来の抗原、肝炎、肝炎由来の抗原、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、ＷＮＶ由来の抗原からなる群から選択される因子が挙げられる。図１は、本開示の好ましい実施形態に従った抗体ライブラリーの調製に使用するために適切な個体の曝露歴を要約する表である。抗体を産生するかまたは抗体を含む組織由来の細胞を、感染または免疫化の約７日後の個体から回収する。適切な組織は、血液および骨髄を含む。
【００３５】
一旦細胞を回収すると、当業者に公知の技術を使用してＲＮＡをそこから単離し、そして、コンビナトリアル抗体ライブラリーを調製する。一般に、コンビナトリアル抗体ライブラリーを調製するための技術は、抗体またはその一部（例えば、単離した抗体のＲＮＡを使用した軽鎖および／または重鎖）をコードする標的配列の増幅を含む。従って、例えば、もともと多様な抗体ｍＲＮＡの試料を用いて開始することで、テンプレートを提供するために、第１鎖ｃＤＮＡを産生し得る。次いで、ライブラリーを生成するために、従来的なＰＣＲまたは他の増幅技術を使用し得る。
【００３６】
抗体ライブラリーのスクリーニングを、例えば、所望のウイルス抗原に対してパンニングすることにより、任意の公知の技術を使用して達成し得る。ＲａｄｅｒおよびＢａｒｂａｓ、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００）を参照のこと。特定の抗原をクローニングし、免疫原として使用するために、組換え的に産生し得る。ウイルスの細胞レセプターへの結合をブロックする、抗体の能力を決定する細胞アッセイにおいて、中和能を評価し得る。一度、インビトロで中和能を有する抗体を同定すると、それらを動物モデルでインビボで試験し得る。
【００３７】
この様式で同定された抗体は、感染性因子による感染に対する効果的な処置を有利に提供する。本発明の抗体は、完全にヒト抗体であるので、それらは安全であり、容易に許容性を示す。さらに、急速な抗イディオタイプ反応をもたらすことなく、複数用量を与え得る。全長抗体を使用する場合、患者系内でより長い居留時間を提供するので、より高い親和力およびより大きなサイズ（単鎖抗体と比較して）が好ましい。
【００３８】
本開示に従って、抗体ライブラリーを生成し、本開示に従って抗体を同定し、特徴づけるための、特に有用な方法は、以下のとおりである。
【００３９】
（ライブラリー）
λ軽鎖またはκ軽鎖のいずれかおよびＩｇＧ重鎖フラグメント（Ｆｄ）を含む３つのＦａｂライブラリーは、種々の感染性因子に対して免疫化した現役の軍人ドナーの２つの骨髄試料（９５１および１０３７、および１血液サンプル（ＭＤ３）図１を参照のこと）のそれぞれに由来した。
【００４０】
ライブラリーに、種々の感染性因子（例えば、炭素菌、ベネズエラウマ脳脊髄炎およびボツリヌス、西ナイルウイルス、痘疹ウイルスおよびデング熱）に対して、選択およびスクリーニングを行い得る。
【００４１】
（ライブラリーの生成）
製造会社の指示書に従って、Ｔｒｉ試薬ＢＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ,Ｉｎｃ．）を使用して骨髄サンプルおよび血液サンプルから全ＲＮＡを得る。製造会社の指示書によって、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（Ｑｉａｇｅｎ）スピンカラムを使用してメッセンジャーＲＮＡを得る。抗体Ｆａｂフラグメント（ＩｇＧ重鎖フラグメント（Ｆｄ）に複合化したκ軽鎖またはλ軽鎖）を発現するファージライブラリーを、米国特許出願番号第１０／２５１，０８５号（この出願の開示は、その全体が、本明細書中に参考として援用される）に記載された方法を使用して、プラスミドベクター中に構築する。２つのＦａｂライブラリーを各ドナーに対して産生し、一つはκ軽鎖を発現し、一つはλ軽鎖を発現し、そして全てがγ重鎖を利用する。
【００４２】
（ライブラリーの選択）
使用した全てのライブラリー由来のＦａｂを有するファージを、選択したウイルス抗原および毒素に対して１〜４回の富化を介してパンニングした。パンニングを、第１に、いくつかのＩｍｍｕｌｏｎ ２ ＨＢマイクロタイターウェル中の５０μｌの溶液Ａ中で十分な量の組換え抗体（通常１〜２μｇ）を４℃で一晩培養することにより行う。溶液Ａは、０．０８％の煮沸したカゼイン溶液（ＢＣ）を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４である。ＢＣは、０．５％カゼイン、０．０１％チメロサールおよび０．００５％フェノールレッドを含むＰＢＳである。抗原溶液の除去後、ウェルを１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２５０μｌのＢＣで、３７℃で１時間ブロックする。ファージストックを、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＢＣからなる溶液Ｄ中に希釈し、５０μｌを各ウェルに添加し、そして３７℃で２時間インキュベートする。ウェルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを用いて１０回洗浄し、次いで、連続的により酸性になる一連の緩衝液：ｐＨ５．０、４．０および３．０のＴｒｉｓ緩衝食塩水（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で各２分間、１度ずつ洗浄した（Ｄ’Ｍｅｌｌｏら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈ ２４７：１９１〜２０３（２００１））。最終溶出液は、０．１ＭグリシンＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．２）、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む。溶離液を、２Ｍ Ｔｒｉｓ塩基を用いて中和し、対数期のＥＲ２７３８細胞に添加する。ヘルパーファージ（ＶＣＳＭ１３株）を感染細菌に添加することによりファージを産生する。個々のコロニーは、ファージストックでの感受性細菌の感染およびプレーティングにより産生した。
【００４３】
ファージ遺伝子ＩＩＩの一部との融合タンパク質としてＦａｂを含む上清を用いてスクリーニングを行う。スクリーニング後、陽性候補体を配列決定し、次いで、試験の間のＦａｂの産生の前に遺伝子ＩＩＩを除去するために、サブクローニングする。あるいは、遺伝子ＩＩＩ融合領域を除去するために、パンニングした各ライブラリー由来のＤＮＡをサブクローニングし、そして、インフルエンザ血球凝集素エピトープタグ（ＨＡ）からなる組み合わせエピトープタグを導入し得（Ｃｈｅｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：６５０８〜１２（１９９３））、そして、後の検出ならびに抗ＨＡおよびＮｉ−ＮＴＡによる精製に使用するために、６個のヒスチジンアミノ酸（Ｈｉｓタグ）を導入し得る。
【００４４】
（ライブラリースクリーニング）
スクリーニングでは、ＥＬＩＳＡアッセイで結合し得る能力により、選択した抗原に反応するＦａｂ構築物を同定した。溶液Ａ中の１００〜２５０ｎｇ／ウェルの組換え抗原をＩｍｍｕｌｏｎマイクロタイターディッシュ中で一晩インキュベートし、その後、上に記載したようにブロックする。スクリーニングを、Ｑ−ｐｉｘ機器を使用して１１５０コロニーを選択することにより、高処理能力で行い得、そして、Ｔｅｃａｎロボットを使用してＥＬＩＳＡを行い得る。個々のコロニーを一晩、Ｈｉ−Ｇｒｏ高速インキュベーターシェーカー中の、ディープウェルのマイクロタイターディッシュ中で培養する。アリコートを取り除き、１５％グリセロールかまたは１０％ＤＭＳＯでストックとして保存した。ディープウェルディッシュの遠心後、これらのストック由来のＦａｂを含む上清を、特定の抗原で被覆されたウェル中でインキュベートし、別に、コントロール抗原（例えば、カゼインまたは卵白アルブミン）で被覆されたウェル中でインキュベートする。ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）で標識したアルカリホスファターゼを、抗原に結合したＦａｂを検出するために使用する。陽性候補由来のＭｉｎｉｐｒｅｐ ＤＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を、これらのベクターに対するストックプライマーを使用して、軽鎖から重鎖にわたる９６ウェルフォーマット中で、自動化色素終止配列決定機（Ｒｅｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）により配列決定する。固有の候補を同定し、分類するために、配列を、ＤＮＡｓｔａｒソフトを使用して分析する。これらのデータから、使用した各組換え抗原に対する固有の改変体結合物のパネルを決定し、密接に関連した配列の群に分類する。
【００４５】
（パネル由来のＦａｂの産生および精製）
（Ｆａｂの精製）
可溶性Ｆａｂの発現および精製のために、遺伝子ＩＩＩ領域を固有の陽性候補体からサブクローニングにより除去する。この点では、抗ＨＡおよび／またはＮｉ−ＮＴＡを検出し、精製するために、インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）タグ（Ｃｈｅｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：６５０８〜１２（１９９３））および６個のヒスチジン残基（Ｈｉｓタグ）からなる組み合わせエピトープタグをコードするオリゴヌクレオチドを挿入することも可能である。
【００４６】
ＥＬＩＳＡに基づいたアッセイおよびより処理能力の高い形式でのインビトロ中和試験のために十分なＦａｂを精製するために、ニッケル−ＮＴＡカラムクロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ）を使用する。この場合、Ｈｉｓ標識を含むようにサブクローニングした（スクリーニングの前か後かのいずれかで）ＦａｂをＯＤ６００が０．８になるまで、１リッターのＳＢ中で培養し、３０℃で３〜４時間、１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて、最適量のＦａｂの生成を誘導する。周辺質の空間からＦａｂを単離するために、細胞ペレットを冷却した、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ（Ｒｏｃｈｅ）プロテアーゼインヒビターを添加した１×ＰＢＳに再懸濁し、Ｓｏｎｉｃｓ Ｖｉｂｒａ−ｃｅｌｌ ＶＣ７５０を使用して超音波処理する。次いで、細胞の破片をペレット化し、上清をＱｉａｇｅｎ Ｎｉ−ＮＴＡカラムに適用した。１６個のこれらのカラムを使用することにより、最初の試験で、候補体あたり７５μｇのＦａｂを得た。一つの９６ウェル形式で、Ｆａｂあたり１２個のカラムの列を使用することにより、８個のＦａｂを精製し得、最初のＰＲＮＴおよびＥＬＩＳＡアッセイのために十分な材料を提供する。エピトープ特異性試験は、標識されていないＦａｂもまた必要とする。これらのＦａｂは、上記のように９６ウェル形式中にあるタンパク質Ｇまたはタンパク質Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合したヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２（Ｐｉｅｒｃｅ）からなるカラムにより精製される。より大きい体積の任意の所望のＦａｂを、抗ヒトＦ（ａｂ’）２カラムかまたはニッケルカラムかのいずれかを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により精製し得る。この方法は、一般に約１５０〜１０００μｇの精製したＦａｂ／ｌを産生するが、これは、Ｆａｂにより異なる。
【００４７】
（精製したＦａｂの特徴付け）
（抗原に対する滴定）
配列決定により確立した関連群中で、Ｆａｂの抗原結合の特徴を比較するために、精製したＦａｂをＥＬＩＳＡアッセイにおける抗原に対して滴定する。
【００４８】
（エピトープ特異性を決定するためのアッセイ）
エピトープ特異性を、ＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイかまたは競合アッセイにより決定し得る。遺伝子ＩＩＩ（ファージの結合を有するかまたは有さない融合Ｆａｂ）またはタグに融合したＦａｂと遺伝子ＩＩＩを欠く精製されたＦａｂまたはタグとの間の競合を行い、エピトープ特異性を評価し得る。ＰＢＳ中で４μｇ／ｍｌの抗原５０μｌをマイクロタイターウェル中で、４℃で一晩インキュベートする。ＰＢＳによる洗浄後、ウェルを、室温で３０分間、ＰＢＳ中に１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＢＣを使用してブロックする。一つの精製されたＦａｂの希釈液を含む５０μｌのＰＢＳをウェルをブロックするために、添加し、３７℃で１時間インキュベートした。これに、第２のＦａｂを融合物として含む５０μｌの上清を添加し、さらに１時間、３７℃でインキュベーションを継続する。第２のＦａｂを、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合型抗Ｍ１３抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて検出する。リン酸クエン酸緩衝液ｐＨ５．０中の２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）錠剤を使用して、Ｓｉｇｍａ由来のＨＲＰ基質緩衝液を含むウェルを作成する。このアッセイのＨＡ／Ｈｉｓタグを有するＦａｂを使用するために、上記検出に使用した抗Ｍ１３抗体を、ＰＮＰＰアッセイで検出された、アルカリホスファターゼ標識した抗ＨＡかまたは抗Ｈｉｓ抗体のいずれかにより置き換える。
【００４９】
（中和として同定されたＦａｂ由来のＩｇＧの産生および精製）
Ｆａｂを、当業者に公知の技術を使用して、個々の疾患を中和する能力について試験する。
【００５０】
（Ｆａｂの全長ＩｇＧへの変換および安定な細胞株の産生）
Ｆａｂを２段階プロセスにより、哺乳動物発現ベクターにサブクローニングし、全長のＩｇＧ１重鎖を作成する。このベクターは、グルタミンのない培地においてトランスフェクトした細胞の増殖を可能にするグルタミンシンテターゼ遺伝子を選択マーカーとして使用する（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：６９〜７５、１９９２）。ベクターをエレクトロポレーションにより、標準的な方法を使用してＮＳ０マウス骨髄腫細胞株にトランスフェクトする。安定な細胞株をグルタミンのない培地で選択し、限界希釈により単離する。安定した細胞株を選択する前に、少量のＩｇＧを試験するために、ＮＳＯ細胞またはＣＨＯ−Ｋ１細胞中のこのベクターに、プールしたトランスフェクトも行い得る。首尾よくベクターに挿入した免疫グロブリンを決定するために、各クローン株から調製したＤＮＡを、制限酵素切断により解析した。全長ＩｇＧの産生を評価するために、各クローン株由来の培地のウエスタンブロット解析を使用し、そして、軽鎖を捕らえ、そして、適切な抗体で重鎖を検出することにより、定量的ＥＬＩＳＡ集合アッセイを行う。
【００５１】
ＩｇＧの精製のために、一時的に感染した細胞またはＩｇＧの候補体を発現する安定な細胞株を、ｍｉｎｉＰｅｒｍ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）かまたは中空の線維生物反応器中で増殖させる。上清をタンパク質Ｇまたはタンパク質Ａカラムを使用したＦＰＬＣにより精製する。疎水性相互作用カラムを使用して、さらなる精製を成し遂げ得る。
【００５２】
（ＩｇＧのインビトロ試験およびインビボ試験）
Ｆａｂに由来するＩｇＧを、以下に記載するように個々の疾患に特異的なインビトロおよびインビボのアッセイにおいて試験し得る。
【００５３】
炭疽菌およびＶＥＥＶの場合に、上記の技術を首尾よく使用した。同じライブラリーおよび／またはさらなるヒトドナーから作成されたライブラリーを、デング熱ウイルス、ＷＮＶおよび痘疹ウイルスに対してパンニングし得る。同じ技術を、Ｆａｂを全ＩｇＧおよびＩｇＧ精製物に変換するために使用し得る。
【００５４】
本発明の抗体または抗体フラグメントを、例えば、ヒトモノクローナル抗体かまたはヒト化したモノクローナルなどの他の抗体（または、その一部）と結合してかまたは、付着して使用し得る。これらの他の抗体は、触媒抗体であり得、そして／または抗体が関与するか、あるいは異なった特異性を有し得る疾患に特徴的な他のマーカー（エピトープ）と反応性であり得る。別々に投与される組成物としてか、または、従来的な化学的な方法かもしくは分子生物学的な方法により結合した二つの薬剤とともに一つの組成物として、抗体（または、その一部）を、このような抗体（または、その一部）とともに投与し得る。検出可能なシグナル（インビトロかまたはインビボのいずれかで）を産生する標識か、または、治療的特性を有する標識を用いて、抗体を標識することにより、さらに、抗体の、診断上および治療的な有用性を議論し得る。
【００５５】
本発明の抗体または本明細書中の抗体フラグメントは、代表的には、薬学的キャリアを含む組成物で患者に投与され得る。薬学的キャリアは、患者へモノクローナル抗体の送達に適した任意の適合性の非毒性物質であり得る。滅菌水、アルコール、脂肪、ワックスおよび不活性固体が、キャリア中に含まれ得る。薬学的に受容されるアジュバント（緩衝剤、分散剤）もまた、薬学的組成物に組み込まれ得る。組成物は、完全な抗体および抗体フラグメントの両方を含み得ることを理解すべきである。
【００５６】
抗体および／またはフラグメント組成物を、種々の方法にて患者に投与し得る。好ましくは、薬学的組成物を、非経口的に、例えば、皮下に、筋肉内に、硬膜外に、または静脈内に投与し得る。従って、非経口的に投与するための組成物は、抗体、抗体フラグメントの溶液、または受容可能なキャリア、好ましくは水性キャリアに溶解したそれらの反応混液を含み得る。種々の水性キャリア、例えば、水、緩衝化した水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなどを使用し得る。これらの溶液は、無菌であり、一般的に、粒子物質を含まない。これらの組成物を、従来的な周知の滅菌技術により、滅菌し得る。これらの組成物は、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤などの適切な生理学的条件のために必要な薬学的に受容可能な補助的な物質（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど）を含み得る。これらの処方物中の抗体または抗体フラグメントの濃度は、広く変動し得、例えば、約０．５重量％未満から１５重量％または２０重量％であり、通常は、約１重量％かまたは少なくとも約１重量％であり、選択した特定の投与法に従って、主に、液体の体積、粘度などに基づいて選択される。
【００５７】
非経口的に投与し得る組成物を調製する実際の方法および被験体への投与に必要な調整は、当業者には公知であるかまたは明白であり、より詳細には、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ 第１７版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ（１９８５）に記載され、本明細書に参考として援用される。
【実施例】
【００５８】
（実施例１−炭疽菌）
炭疽菌に対して予防接種を受けた現役の軍人ドナーの血液および骨髄から単離したメッセンジャーＲＮＡから、ファージライブラリーを作成した。回収の１週間前に、ＡＶＡ炭疽菌ワクチン追加免疫を受けた軍の医師有志ドナーから、血液サンプルを回収した。さらに、市販の供給源が、現役の軍人個人由来の適合した血清とともにコードした骨髄およびいくつかの免疫記録を供給した。数人の骨髄ドナーおよび全ての血液ドナーは、炭疽菌抗原ＰＡ８３に対する力価を有していた（図２）。ＰＡ８３（９５１）に対する最高の力価を有する骨髄ドナーは、血液回収の３週間前に炭疽菌に対して免疫化されていた。
【００５９】
Ｔｒｉ−ｒｅａｇｅｎｔ ＢＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を製造会社の指示書に従って使用して、骨髄サンプル９５１および１０３７ならびに血液サンプルＭＤ３から全ＲＮＡを得た。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（Ｑｉａｇｅｎ）スピンカラムを製造会社の指示書に従って使用して、メッセンジャーＲＮＡを得た。抗体Ｆａｂフラグメント（重鎖の可変領域および第１定常領域に複合化したκまたはλ軽鎖）を発現するファージライブラリーを米国特許仮出願番号第６０／２８７，３５５号および同６０／３２３，４５５号（これらの開示は、その全体が、本明細書中に参考として援用される）に記載される独自に開発した方法により、プラスミドｐＡＸ２４３ｈベクター中に構築した。２つのＦａｂライブラリーを各ドナーに対して作成し、一つはκ軽鎖を発現し、一つはλ軽鎖を発現し、そして全てがγ重鎖を活用した。６個のライブラリー由来のＦａｂを有するファージは、ＰＡ８３に対して４回の濃縮を介してパンニングした。９５１ライブラリーもまた、精製ＰＡ６３（Ｍｉｌｌｅｒらによって記載される（Ｍｉｌｌｅｒら、１９９９）ように、ＰＡ８３から産生した）に対して４回の濃縮を介して別々にパンニングした。ＰＡ８３と共有するＰＡ６３部位に結合するファージを取り除くために、可溶性ＰＡ８３を最初に３７℃で１時間、２０μｇ／ｍｌでファージに結合させ、その後に混合物を、マイクロタイタープレートウェルに結合したＰＡ６３とともにインキュベートした。
【００６０】
ＰＡ８３抗原に対して最も高い力価を有する、軍隊由来の炭疽菌予防注射した個体を同定するために、組換えＰＡ８３抗原を、Ｆｏｒｔ ＤｅｔｒｉｃｋにあるＵＳＡＭＲＩＩＤから入手し、ＥＬＩＳＡアッセイに使用した。それらの個体の骨髄または血液からＲＮＡを単離し、その後、このＲＮＡから組み合わせＦａｂライブラリーを得るために、制限酵素消化／入れ子にしたオリゴヌクレオチド伸張反応／単一プライマー増幅（ＲＥＤ／ＮＯＥＲ／ＳＰＡ）を使用した。図２を参照のこと。
【００６１】
増幅のＲＥＤ／ＮＯＥＲ／ＳＰＡ法を使用して、ライブラリーを構築するために、３人の最高の力価の個体由来のＲＮＡを使用した。２つのライブラリー、９５１および１０３７は、Ｐｏｉｅｔｉｃｓ（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）から受けた骨髄ドナーに由来した。第３のライブラリー、ＭＤ３は、予防接種した有志の血液に由来した。ライブラリー連結反応の有効性を以下の表１に示す。
【００６２】
【表１】
【００６３】
全てのライブラリーをＰＡ８３に対してパンニングし、および９５１ライブラリーをＰＡ６３に対してパンニングした。ＰＡ８３については、提示したＦａｂフラグメントを有するファージを添加する前に、抗原がウェルに結合し、ブロックした。ＰＡ６３については、ＰＡ８３およびＰＡ６３の両方により共有された抗原に反応するファージの回収を減少するために、ウェルに結合したＰＡ６３抗原と反応させる前に、提示ファージを最初にＰＡ８３と混合した。ＰＡ６３を、Ｍｉｌｌｅｒら（１９９９）に記載される方法に従って、ＰＡ８３から産生し、精製した。ライブラリーの２つのパンニングの結果およびＰＡ６３に対するパンニングの結果を以下の表に示す。
【００６４】
最初にＰＡ８３に対して９５１ライブラリーおよびＭＤ３ライブラリーを用いてパンニングを行い、そして、ＰＡ６３に対して９５１ライブラリーを用いてパンニングを行った。最初のＸＬ１−Ｂｌｕｅへのライブラリー形質転換とは別に、ＥＲ２７３８細胞を使用した。入力、出力および両方のパンニングラウンドについての最初のＥＬＩＳＡの結果のいくつかを以下の表に示す。
【００６５】
【表２】
【００６６】
ＰＡ８３でパンニングした全てのライブラリーに対して、富化は、明らかである。ＰＡ６３に対してパンニングしたライブラリーは、ＰＡ８３に非常に弱く反応するいくつかの候補体を示した。これらの候補体は、ＰＡ６３に対して試験した場合、陽性であった。陽性応答するもののＶＨ領域およびＶＫ領域またはＶＬ領域の配列決定解析を図３〜５に示す。特定の配列が、優勢であるが、多様性を示し得る。ＰＡ８３の前吸着とともにＰＡ６３に対してパンニングしたＦａｂは、ＰＡ８３に対してパンニングしたＦａｂとは違って、顕著に異なる配列群を含むようである。
【００６７】
パンニング後、４つのＰＡ−８３でパンニングしたライブラリーの種々のパンニング回由来の個々の候補体を、ＥＬＩＳＡによりＰＡ８３に対する反応性についてスクリーニングした。Ｆａｂフラグメントに結合するＰＡ６３を同定するために、ＰＡ６３に対してパンニングした９５１κライブラリーファージおよび９５１λライブラリーファージをまず、ＰＡ８３への結合についてスクリーニングし、最初にスクリーニングからＰＡ８３結合物を取り除いた。しかし、ＰＡ８３に良好に結合する候補体はみつからなかった。このことは、最初に可溶性ＰＡ８３とともにファージをインキュベートすることにより与えられた競合が効果的であったことを示している。両方の抗ＰＡ６３ライブラリーの４回のパンニングにおいて、少ない割合のクローンが、基質内での数時間のインキュベート後、非常に弱いＥＬＩＳＡ反応性を示した。これらのクローンをＰＡ６３に対してスクリーニングすると、多量のより強いシグナルを生じた。ＰＡ８３に対する弱い反応性は、ＰＡ８３との交差反応性のためか、または、精製または保存の間にフリンプロテアーゼ感受性部位でのＰＡ８３のプロテアーゼ切断（Ｋｌｉｍｐｅｌら、１９９２）から生じ得たＰＡ８３調製物における少量のＰＡ６３を反映し得るためであり得る。
【００６８】
６つの異なるパンニングライブラリーから選択した、強いＰＡ８３結合活性または強いＰＡ６３結合活性を有する１４４より多い個々の候補体を、配列決定し、全ての改変体候補のパネルを同定した。これは、３１個の独特のＰＡ８３結合物および６個の独特のＰＡ６３結合物を含む。２５個の独特のＰＡ８３結合物は、全て可変重鎖（ＶＨ）遺伝子座３−３０／３−３０．５．に由来した。ＰＡ６３結合物の重鎖の内、２つの関連する配列が、優勢であると考えられた。これらは、ＰＡ８３配列とは異なっていた。単一突然変異は、抗体の親和性を劇的に変え得るので、他の候補体と比較して、候補体が、それらの重鎖または軽鎖のいずれかにおいて一つのアミノ酸の差異を有する場合、候補体は独特であると考えた。
【００６９】
炭疽菌タンパク質ＰＡ８３およびＰＡ６３に対するさらなる抗体配列を、図６〜８Ｃに示す。図６に示したヒトκ軽鎖可変配列では、ＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）部位に由来する最初の２つのアミノ酸、Ｓ（セリン）およびＲ（アルギニン）をクローニングに使用した。図のアミノ酸番号３は、Ｋａｂａｔ番号付与系におけるヒトκ軽鎖に対するアミノ酸番号１に一致する（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｋａｂａｔら、１９９１）。最後の４つのアミノ酸（ＲＴＶＡ）は、ほとんどの配列で、Ｋａｂａｔ番号付与系では１０８から１１１と番号を付けられるヒトκ軽鎖定常領域の最初の４つのアミノ酸に一致する。示した２つの配列は、定常領域の始めの方に全く伸張しない。可変領域が、長さの多型を含むので、各配列の実際のアミノ酸の数は、１１３より大きくても小さくてもよい（２つの最初のアミノ酸＋１１１）。図７に示したヒトλ軽鎖可変配列では、最初の２つのアミノ酸、Ｓ（セリン）およびＲ（アルギニン）は、クローニングに使用したＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）部位に由来する。図中のアミノ酸番号３は、Ｋａｂａｔ番号付与系におけるヒトλ軽鎖についてのアミノ酸番号１に対応する。各配列に示した最後のアミノ酸は、Ｋａｂａｔ番号付与系におけるヒトλ軽鎖定常領域のアミノ酸１５５に対応する。可変領域は、長さの多型を含むので、各配列の実際のアミノ酸の数は、１５７より大きくもあり得るか、または小さくもあり得る。図８Ａ〜Ｃに示したヒトγ重鎖可変配列では、最初の２つのアミノ酸、Ｌ（ロイシン）およびＥ（グルタミン酸）は、クローニングに使用したＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）部位に由来する。図中のアミノ酸番号３は、Ｋａｂａｔ番号付与系におけるヒトγ重鎖に対するアミノ酸番号１に対応する。各配列について示した最後のアミノ酸は、Ｋａｂａｔ番号付与系におけるヒトγ重鎖定常領域のアミノ酸１１８に一致する。この可変領域は、長さの多型を含むので、各配列の実際のアミノ酸の数は、１２０より大きくあり得る。
【００７０】
ＥＦおよびＬＦ（軍人を免疫するために使用したＡＶＡワクチンにもまた、少量存在する）に対するパンニングを、本発明のライブラリーを用いて行う。他のライブラリーを使用して、ＰＡ６３に対するさらなるパンニングを行い得る。異なる抗体の親和性を評価するために、バイオコアアッセイを行う。同一エピトープ結合特性を共有する抗体の群を同定するために、競合実験を行う。細胞アッセイにおいて、ＥＦかまたはＬＦかのいずれかのレセプターとのＰＡの結合をブロックする性能について、候補を評価する。次いで、最良の候補体の、動物モデルにおけるインビボの毒性をブロックする性能を、ＰＡ、ＥＦおよびＬＦまたは実際の炭疽菌感染のいずれかを使用して試験する。１つ以上のこれらの試験において、必要に応じて、候補体を全長ヒト抗体に変換する。
【００７１】
さらなる試験のための精製したＦａｂを産生するために、このパネル由来の候補体は、Ｆａｂフラグメントの重鎖部分からの遺伝子ＩＩＩを取り除くために、サブクローニング工程を受けた。次いで、ヤギ抗ヒトＦａｂカラムを使用した高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）により、２〜４リットルの培養物からＦａｂを精製した。Ｌｉｔｔｌｅらの方法（Ｌｉｔｔｌｅら、１９９０）の後、マウスマクロファージ細胞株、Ｊ７７４Ａ．１を使用して、この精製したＦａｂを使用する中和アッセイを行った。毒性作用に対する反応の細胞死によって放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）をアッセイするために、Ｃｙｔｏｔｏｘ９６検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用する条件を確立した。Ｊ７７４Ａ．１細胞を９６ウェルディッシュ中に１４，０００細胞／ウェルで、一晩プレート培養した。４〜８ウェルを各点でアッセイした。Ｆａｂを５０ｎＭで使用した。毒素を以下のように産生した：ＰＡ８３を４００ｎｇ／ｍｌ（４．６ｎＭ）で、４０ｎｇ／ｍｌのＬＦとともに添加した。３７℃で４時間のインキュベート後、ウェルを顕微鏡で調べ、次いで培地を取り除き、遠心して、結合していない細胞をペレット化した。
【００７２】
多くの中和アッセイの結果を図９に要約した。理解され得るように、試験した１７個の抗ＰＡ Ｆａｂ（サンプルｅ〜ｕ）の内、１４個が、炭疽菌毒素の効果を中和し得、８０％の生存度を得た。５個のＦａｂは、この時間枠内で、この濃度で、十分に中和する。サンプル（ａ）および（ｂ）は、毒素を添加しない２つのＦａｂである：これらは、精製したサンプル中のエンドトキシンによって、この時間内で、細胞死が引き起こされないことを示している。サンプル（ｃ）は、毒素のみの効果を示す。サンプル（ｄ）は、炭疽菌の毒素の作用から細胞を有意には防御しない、不適切なＦａｂを含む。
【００７３】
インビトロにおける５０％防御値を決定するために、選択したＦａｂを滴定した（図１０）。Ｆａｂを連続的に希釈し、アリコートを、毒素を含む培地に添加した。これらの実験では、ＰＡを最終濃度４００ｎｇ／ｍｌとし、そして、ＬＦを最終濃度８０ｎｇ／ｍｌとした。次いで、これらのアリコートを４連とした細胞に添加し、３７℃で４時間インキュベートした。細胞毒性を視覚的に評価し、そして記載されるようにＣｙｔｏｔｏｘ９６アッセイを用いて定量的に測定した。本明細書に示した抗ＰＡ−８３Ｆａｂは、全て、このアッセイで使用したＰＡ８３の濃度と等モルに近い、５０％の中和値を有している。しかし、抗ＰＡ６３ Ｆａｂ９５１Ｌ６３１Ｄは、これらより約１／５〜１／７の、５０％の中和値を有している；すなわち、９５１Ｌ６３１Ｄの１分子は、ＰＡ８３の多数の分子を中和する。ＰＡ８３は、この実験では、Ｊ７７４Ａ．１細胞により、切断され、七量体孔に変換される。ＰＡ８３の不足当量を中和する９５１Ｌ６３１Ｄの性能に関する最も可能性のある説明は、それが七量体孔のレベルで作用し、一度に７個までのＰＡ８３分子を効果的に中和するということである。
【００７４】
最近、９５１Ｌ６３１ＤおよびＭＫ７Ｃを、インビボで試験した。ＰＢＳの全量２００μ中の４０μｇのＰＡ８３および８μｇのＬＦを受けた２匹のラットは、６０分および７１分で死亡した。同量の毒素および３１０μｇの９５１Ｌ６３１Ｄを受けた２匹のラットは、これらのラットが屠殺されるまでの２５時間生存した。約３〜５時間で、これらのラットは、疾患の症状をいくつか（例えば、不活発状態およびかすかな浅速呼吸）を示したが、１６時間では、これは一匹のラットでは消失し、もう一匹のラットでは、嗜眠状態となったが、正常な呼吸をしていた。２５時間までは、ラットは両方とも、ＰＢＳを注射したコントロールラットと比較して正常に見えた。従って、９５１Ｌ６３１Ｄは、ラットをインビボでの炭疽菌感染に対して防御し得るようである。ＭＫ７Ｃを１匹のラットにおいて、毒素とともに、３００μｇで試験した。このラットは、いずれの症状も示すことなく、生存した。
【００７５】
９Ｋ２Ｈ，９Ｌ６Ｒ２，ＭＫ７Ｃ，９Ｋ７Ｈ、ＭＬ８Ｅおよび９５１Ｌ６３１Ｄから産生したＦａｂを、直鎖状エピトープと反応するそれらの能力について試験した。ＰＡ８３およびＰＡ６３を、変性条件下（しかし還元条件でない）でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、ウエスタンブロッティングによりニトロセルロースフィルターに移した。ＰＡ６３かまたはＰＡ８３のいずれかを含むブロットから切り出したストリップを、これらの精製した抗体のそれぞれと、同濃度で一晩ハイブリダイズした。結合した抗体を、ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２（Ｐｉｅｒｃｅ）を接合したアルカリホスファターゼと反応させた。そして、その結果を図１１に示す。
【００７６】
試験した５つの抗ＰＡ８３Ｆａｂの全ては、ＰＡ８３上の直鎖状エピトープに結合するようである（図１２）。抗ＰＡ６３抗体は、対照的に、変性させたＰＡ６３には結合せず、ＰＡ８３に対する、僅かな、おそらく非特異的な結合に見えるものを示す。９Ｋ２Ｈおよび９Ｋ７Ｈは、変性させたＰＡ６３には結合を示さず、他方、ＭＫ７ＣおよびＭＬ８Ｅは強く結合し、９Ｌ６Ｒ２は弱い結合を示す。
【００７７】
いくつかのこれらのＦａｂのＰＡ８３およびＰＡ６３に対して結合する能力を、さらに、ＥＬＩＳＡ形式で抗原に対するＦａｂ滴定を行うことにより定量的に分析した。ＰＡ８３およびＰＡ６３を、Ｌｉｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、指示書に従って、水または５０％グリセロール中にそれぞれ再懸濁した。以下のグラフは、ＰＡ８３またはＰＡ６３に対する、４つのＦａｂフラグメントの滴定を示す。塗りつぶした記号は、ＰＡ８３に対する反応性を示し、白抜きの記号は、ＰＡ６３に対する反応性を示す。ＰＡ８３に対して産生した３つの抗体は、全て、予想通りＰＡ８３に対して強い反応性を示す。しかし、ＭＫ７Ｃのみが、ＰＡ６３に対して等しく良好に反応し、このことは、ＰＡ６３に対するＰＡ８３の切断が、９５１Ｌ６Ｒ２およびＭＬ８Ｅに観察されるエピトープを変換するかまたは取り除くことを示している。９５１Ｌ６３１Ｄは、ＰＡ８３とは反応しないが、ＰＡ６３と反応するＭＫ７Ｃで見られるよりも非常に低い飽和レベルで、ＰＡ６３と反応する。これらのアッセイを、同時間に同プレートで二連で行った。このことは、プレートに存在するＰＡ６３の一部分のみが、９５１Ｌ６３１Ｄへの結合に対する適切なエピトープを示すことを示唆し、これは、９５１Ｌ６３−１Ｄが、七量体孔構造中にのみ見出されるエピトープと反応すると予想され、それにより、プレート上で実際以下に評価され得る。
【００７８】
図１３において、ＦＭＬ８Ｅのｈｉｓタグ化バージョンを生成し、他のタグ化していないＦａｂと競合して、エピトープ特異性を評価するために使用した。ＦａｂであるＦ９Ｋ２Ｈ、Ｆ９Ｋ７ＨおよびＦＭＬ８Ｆは、ＦＭＬ８Ｅとの自己競合に類似して、競合する。このことは、これらのＦａｂが同じエピトープまたはＦＭＬ８Ｅに観察されるエピトープと近いエピトープを認識することを示唆している。しかし、Ｆ９５１Ｌ６Ｒ２は、異なり、競合する。このことは、競合を引き起こすのに十分近くあり得るけれども、このエピトープが同じではないことを示唆している。ＦＭＫ７Ｃは、競合にあまり効果がなく、このことは、おそらく離れた部位に結合することを示している。興味深いことに、上記のウエスタンブロットは、下の図が示すようにＰＡ６３に対する切断によって、Ｆ９Ｋ２ＨおよびＦ９Ｋ７Ｈによる結合が消滅し、他方、ウエスタンブロットにおける結合は、なおも、ＦＭＬ８ＥおよびＦ９５１Ｌ６Ｒ２に対して明白なものであり、そして、いくつかの反応性は、上記のＥＬＩＳＡ滴定において高濃度で見出される。このことは、エピトープが、Ｆ９Ｋ２Ｈ／Ｆ９Ｋ７Ｈの結合に関して、ＦＭＬ８Ｅ／ＦＭＬ８Ｆ、Ｆ９５１Ｌ６Ｒ２またはＦＭＫ７Ｃの結合とは、同じではないことを示唆している。示したＦａｂを、連続的に１：４に希釈し、２００ｎｇのＰＡ８３で一晩被覆したマイクロタイターウェルに３７℃で１時間結合した。次いで、Ｈｉｓタグ化したＦＭＬ８Ｅを、洗浄なしで、５μｇ／ｍｌで添加し、２時間反応させ、その後、プレートを洗浄し、ＰＮＰＰアッセイのために抗Ｈｉｓと結合体化したアルカリホスファターゼと反応させた。ＦＭＬ８ＥおよびＦＭＬ８Ｆは、類似の重鎖を有するが、異なる軽鎖を有することを注意すべきである。Ｆ９Ｋ２ＨおよびＦ９Ｋ７Ｈは互いに関連し、同じ重鎖生殖細胞系列遺伝子座をＦＭＬ８Ｅとして使用するが、ＭＬ８Ｅとは全く異なるＣＤＲ領域を有する。Ｆ９５１Ｌ６３１ＤおよびＦＭＫ７Ｃは重鎖生殖細胞遺伝子座とは異なる。
【００７９】
本開示は、ＡＶＡ免疫化したドナーから単離され得る、インビトロで高い親和性を有し、そして、強力に中和するヒト抗炭疽菌毒素抗体を、初めて示す。Ｌｉｔｔｌｅら（１９９０）は、炭疽菌毒素致死因子に対するネズミモノクローナル抗体のパネルを同定した。インビボの防御の評価に対してインビトロの防御の評価は、インビトロにおける防御の程度が、稀な場合を除いて、インビボにおける防御と相関し得ることを示唆している。試験した１９個から１５個の中和抗体を同定し、その内のいくつかが低濃度で十分に中和した。従って、これらの抗体のいくつかが、インビボで防御的であることが予想される。データは、さらに、ＡＶＡワクチンが、炭疽菌曝露に対するヒトの防御に効果的であることを示唆する。
【００８０】
抗ＰＡ８３活性および抗ＰＡ６３活性の両方の組み合わせが、インビボの治療目的では強力である。抗ＰＡ８３は、細胞レセプターに結合するＰＡ８３分子の数を制限する。次いで、それらの、破壊されず、七量体孔を形成するＰＡ８３分子は、炭疽菌感染の致死効果に対する強力な防御を提供する抗ＰＡ６３活性により中和される。この２個の抗体の組み合わせは、感染の開始時かまたは感染の過程の間のいずれかで新規の機能性孔構造の形成に対して即時の防御を提供し得る。
【００８１】
これら２個の抗体の使用は、疑わしい炭疽菌放出に曝露され得た、予防接種したかまたは予防接種していない人員にさらなる受動的防御を提供し得る。疾患に直面して防御し得る治療の利用可能性は、炭疽菌についての一般の不安を軽減するのに役立つ。さらに、このような治療薬剤は、生物テロの作用としての炭疽菌の故意の放出をあまり成功させなくし得、従って、このような攻撃の可能性を減少し得る。
【００８２】
（実施例２−ベネズエラウマ脳炎ウイルス）
（ヒト抗ＶＥＥＶ抗体）
実施例１と関連して上に記載したドナー血清を、標準的ＥＬＩＳＡアッセイを使用してＴＣ−８３抗原に対して試験した（図１４）。ドナー１０３７、８１１および９５１は、ＴＣ−８３に対して、顕著な血清反応性を有した。このことは、対応するドナーの骨髄から作成された抗体ライブラリーから、抗ＶＥＥＶ Ｆａｂを獲得した可能性が高いことを示した。１０３７および９５１の両方に対するＩｇＧ−κライブラリーおよびＩｇＧ−λライブラリー（合計４個のライブラリー）を、上に記載した炭疽菌の実施例であらかじめ構築した。次いで、これらのファージディスプレイ抗体ライブラリーを、ＴＣ−８３抗原を４回介してパンニングした。この実験由来の結果を以下に示す：
【００８３】
【化１】
【００８４】
高い処理能力の形式のＴｅｃａｎロボットプラットフォームを使用して、ＥＬＩＳＡにより、固定したＴＣ−８３に結合するＦａｂクローンのパネルを、４個全てのライブラリー（９５１Ｋ、９５１Ｌ、１０３７Ｋおよび１０３７Ｌ）から３回および４回のパンニングによりスクリーニングした。図１５Ａ〜Ｄに見られるように、ＴＣ−８３に顕著に結合したＦａｂ（アルカリホスファターゼが結合した抗ヒトＦａｂを使用して検出した）を、４個全てのライブラリーから入手した。ポジティブコントロールＨｙ４−２６Ａ（３Ｂ４Ｃ−４のヒト化改変体）およびネガティブコントロール抗破傷風類毒素Ｆａｂ（図１５中の各グラフ上のそれぞれ最後の隣および最後のサンプルである）と比較して、Ｆａｂクローンを、スクリーニングした。４個のライブラリーのそれぞれ由来の、最も高いＥＬＩＳＡシグナルを有する３個のＦａｂを、さらなる分析のために選択した。各クローンについてのＤＮＡを調製し、次いで、配列決定分析に供した。その配列の結果は、３個全ての９５１Ｋクローンが同一であることを示した。さらに、１２個のクローンの内１０個が、同じ可変重鎖領域（ＶＨ）を有するが、それらのＦａｂの多数は、異なる軽鎖配列を有した。全体で、３個の別の重鎖（ＨＣ）分類に、１０個の独特のクローンが存在する。
【００８５】
さらなる分析のために、４個のヒトＦａｂクローンを選択した。選択したＦａｂは、全て同定された３個の異なるＨＣ類を代表した。
【００８６】
【化２】
【００８７】
全てのＦａｂを、ＦＰＬＣ上で抗ヒトＦ（ａｂ’）２カラムを使用して、細菌の周辺質の調製物から精製した。Ｐ３Ｈ６ Ｆａｂは非常に収率が低いので、さらに続行しなかった。
【００８８】
図１６は、ＴＣ−８３に対する滴定ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、３つのヒト抗ＶＥＥＶ Ｆａｂの結合活性を示す。精製した抗ＶＥＥＶ Ｆａｂも競合ＥＬＩＳＡ実験において、ｍＨｙ４ Ｆａｂを競争相手として使用して、試験した。この実験の結果を図１７に示し、そして、この実験の結果は、３つのＶＥＥＶ Ｆａｂが、同じエピトープ（Ｅ２Ｃ）に対して、ｍＨｙ４ Ｆａｂと競合しないことを示している。
【００８９】
ヒトＦａｂは、Ｅ２Ｃエピトープとは、競合的ではなかったが、それらは、ＶＥＥＶ上で他の中和エピトープと結合し得る。このことを試験するために、各精製したＶＥＥＶ Ｆａｂのアリコートを、細胞に基づいたＶＥＥＶ中和アッセイにおいて使用するために、ＣＤＣで共同研究者に送った。２つの別の実験の結果は、ポジティブコントロール３Ｂ４Ｃ−４で観察された中和能と類似して、Ｐ３Ｆ５が非常に良い中和能を有することを示した。Ｐ３Ｇ１もまた、顕著な中和を示したが、それに対して、Ｐ３Ｆ２ Ｆａｂは、中和試験において明白な効果を有さなかった。
【００９０】
【表３】
【００９１】
表３は、ＶＥＥＶに対するインビトロの中和アッセイの結果を報告する。ＡｂまたはＦａｂの滴定は、ベロ細胞でのＶＥＥウイルスプラークの７０％の減少を与えることを必要とすることが報告されている。ネズミのＡｂ ３Ｂ４Ｃ−４（全ＩｇＧとして）をポジティブコントロールとして使用した。以前に、二価抗体が、ウイルスをより効果的に中和することが示されていて、従って、抗Ｆａｂ架橋結合したＡｂを各ウェルに添加した（非最適濃度で）。非結合ネガティブコントロールＦａｂは、試験したいずれの濃度でも中和を示さなかった。サンプルＰ３Ｆ５は、ネズミ３Ｂ４Ｃ−４の活性に近い活性を示した。
【００９２】
これらの予備的な結果は、十分なヒト中和抗ＶＥＥＶ抗体を単離したことを示す。図１８Ａおよび１８Ｂは、ＶＥＥＶを中和する本開示に従って産生した、全長ヒトＦａｂの配列を示す。これらの従来のヒト抗ＶＥＥＶ Ｆａｂを、上に記載したように、全ＩｇＧに変換し得、そしてさらなる特性決定のために精製した。
【００９３】
（ＶＥＥＶに対する抗体のエピトープ特異性試験）（Ｒｏｅｈｒｉｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８２）１１８、ｐｐ２６９〜２７８；およびＲｏｅｈｒｉｇおよびＭａｔｈｅｗｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８５）１４２、ｐｐ３４７〜３５６）。
【００９４】
どのＴＣ−８３ウイルスタンパク質がＦａｂにより認識されるか調べるために、ウエスタンブロットを行う。直線的エピトープが認識されるよりは、むしろ、高次構造が認識されるために、ウエスタンブロットでは反応しないＦａｂのために、天然のＥ１およびＥ２膜糖タンパク質を、前述のように、ＥＬＩＳＡアッセイまたは放射標識した免疫沈降アッセイによりウイルス溶解物から精製し得る。
【００９５】
以下の表２に列挙したように、各結合基に対する代表的なモノクローナル抗体を用いた競合ＥＬＩＳＡを使用して、ウイルスタンパク質上の反応性エピトープの同定を、位置付け得る。全ウイルスで被覆したマイクロタイターウェルを、最大約８０％の結合を与える量の代表的なＡｂとともにインキュベートする。ウェルはまた、試験Ｆａｂの増量を含む。抗マウスＩｇＧ Ｆｃ特異的アルカリホスファターゼ結合物を使用して、代表的なＡｂのウイルスに対する結合をモニタリングする。結合の喪失を、エピトープ特異性または空間的配置を示す、ヒトＦａｂを試験することによる競合的結合と判断する。
【００９６】
【表４】
【００９７】
代表的Ａｂ（ＣＤＣ、Ｆｔ．Ｃｏｌｌｉｎｓ、ＣｏｌｏｒａｄｏにあるＪｏｈｎ Ｒｏｅｈｒｉｇ由来）を、５０％硫酸アンモニウム沈殿およびタンパク質Ｇカラムを通したクロマトグラフィーを受けた腹水液から入手し得る。あるいは、Ａｂを、Ｉｇを含まない培地で増殖したそれらのハイブリドーマ細胞株の調整培地から精製し得る。
【００９８】
（試験ウイルス株交差反応性）（Ｒｏｅｈｒｉｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７）３５、ｐｐ１８８７〜１８９０：およびＲｏｅｈｒｉｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８２）１１８、ｐｐ２６９〜２７８）
ＶＥＥＶは、６個のサブタイプ（１〜６）から構成され、サブタイプ１は５個の改変体（１ＡＢ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅおよび１Ｆ）を有する。各サブタイプ由来のウイルス株を、以前記載されたように、ＥＬＩＳＡアッセイまたは間接的な蛍光抗体アッセイ（ＩＦＡ）により、各Ｆａｂ候補体との反応性を試験する。これらの分析に有用なプロトタイプウイルスを、以下の表５に列挙する。
【００９９】
【表５】
【０１００】
Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｏｒｎｅ Ｖｉｒａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ、 Ｃｏｌｏｒａｄｏで維持されたストック由来のウイルスを、ＢＨＫ２１細胞中で増殖し得る。
【０１０１】
（全ＩｇＧを用いたインビトロ中和試験の実施）
ベロ細胞中の５０〜１００ＰＦＵ／試験を使用して、以前記載されたように７０％終末点を記録して中和試験を行う（Ｒｏｅｈｒｉｇら、１９８２）。
【０１０２】
（ウイルス感染からマウスを防御するＡｂの試験性能）
ＰＢＳ中に希釈した精製したＩｇＧの公知の量を、若齢のマウス（例えば、３週齢のＮＩＨスイスマウス）に尾の静脈から静脈内接種する。２４時間後、マウスに、細胞培養培地で希釈したＶＥＥＶを腹腔内感染する。コントロールは、ＰＢＳを静脈内に受け、ウイルスかまたはウイルス希釈液のいずれかを受けた。さらなるコントロール群としては、以前防御の供給を示した、ネズミＡｂ １Ａ４Ａ−１または３Ｂ４Ｃ−４が挙げられる。マウスを２週間観察した。接種したマウス由来のヘパリン処理した血漿試料を、眼球の網膜細胞の静脈叢（ｒｅｔｏ−ｏｃｕｌａｒ ｖｅｎｏｕｓ ｐｌｅｘｕｓ）から出血することにより入手した。
【０１０３】
（さらなる抗ＶＥＥＶ Ｆａｂの単離）
ＴＣ−８３抗原に対して導いた、ヒトＦａｂの拡張したパネルを産生する。既にＴＣ−８３においてパンニングをされた、１０３７および９５１ライブラリー由来の１０００より大きい個体ＦａｂクローンのさらなるＥＬＩＳＡスクリーニングを行う。これは、それらのパンニングしたライブラリー由来の１９０のＦａｂクローンの元のスクリーニングを補充する。さらに、新規のファージディスプレイ抗体ライブラリーを、ＴＣ−８３に対する力価を有することが以前に示されているドナー（８１１）のＲＮＡから構築する。新しく構築した８１１ライブラリーを、固定したＴ−８３についてパンニングする。独特のＦａｂを、インビボで中和を提供し、動物モデルで致死ウイルス感染に対して防御を提供する能力について、上記のように特徴づけする。
【０１０４】
（実施例３−ボツリヌス菌）
上記のライブラリー作製およびパンニング技術を適用することにより、異なるボツリヌス菌毒素血清型の多くに結合する抗体を単離し、大量に産生する。炭疽菌およびＶＥＥＶに関して上に記載した中和抗体と同様に、ボツリヌス神経毒に対するこれらの十分なヒト抗体は、免疫学的予防のために、または免疫療法として適している。
【０１０５】
（実施例４−デング熱ウイルス）
ヒト全長中和抗体は、他の治療目的のために、安全であり、十分耐容性であることが既に証明されているので、道理にかなっている天然の抗毒性または抗感染性であるとして特に有用である。動物に予防接種することにより引き起こされるか、または、種々の動物宿主に受動的に投与された中和抗体は、いくつかの例で、デング熱に対する防御を提供することが示されている。しかし、ヒトにおけるデング熱の感染が、予防接種により増強されるという徴候があり、および、特異的デング熱抗原に対する抗体が、凝固およびインテグリン／付着因子タンパク質に関する一般的エピトープとの交差反応を介して、これら自身に出血を引き起こし得るという報告がある（Ｆａｌｃｏｎａｒ、１９９７）。
【０１０６】
異なる血清型のデング熱ウイルスに感染したかまたはそれらを予防接種した８人のヒトドナーの血液サンプルまたは骨髄サンプルからの１６の抗体ライブラリーを作成した。２つのライブラリーを各ドナーから産生し、１個はκ軽鎖を使用し、もう１個はλ軽鎖を使用した。８個のドナーは、４個の血清型のデング熱のそれぞれを１個ずつ感染したか予防接種した４個のドナー、複数のデング熱血清型で感染した個体由来の２個のライブラリーおよび４価のデング熱ワクチンを受けた個体由来の２個のライブラリーを含む。生きた細胞、生きたウイルスおよびウイルス溶解物ならびに４個のデング熱血清型由来の外皮およびＮＳ１タンパク質を含む組換えデング熱抗原に対する選択のために、１６個の抗体ライブラリーを使用する。
【０１０７】
同定したＦａｂ抗体を、他のＦａｂおよび抗体との特異性、親和性および競合性の特徴づけに使用するために精製する。
【０１０８】
中和について特徴付けた重要なデング熱抗体フラグメントを、コード領域を組織内の哺乳動物発現ベクター中にサブクローニングすることにより、全長ヒトＩｇＧ１に変換する。全長ＩｇＧコード配列を哺乳動物細胞中に含むプラスミドのトランスフェクトにより、特徴づけおよび受動的免疫治療に使用するためのＩｇＧの大量生産が可能になる。
【０１０９】
（実施例５−西ナイルウイルス）
上記のライブラリー作製およびパンニング技術を適用することにより、多くの異なる西ナイルウイルス株に結合する抗体が単離され、大量に産生される。炭疽菌およびＶＥＥＶに関して上に記載した中和抗体と同様に、西ナイルウイルスに対するこれらの完全なヒト抗体は、免疫学的予防のために、または免疫療法として適している。
【０１１０】
（実施例６−痘瘡／痘疹ウイルス）
痘疹の中和に関与する公知の個別の抗原に対して、前述の免疫化ヒトライブラリーをスクリーニングすることにより、抗原に結合する抗体の類似したパネルを入手し、そして、インビトロおよびインビボでウイルスの侵入および拡散を中和し得る抗体を同定する。さらに、本明細書に記載した技術により、類似の重鎖対／軽鎖対の多くの改変体を同定し、試験および開発のために最も好ましい特徴を有する候補を選択するための種々の親和性を提供する。例えば、感染細胞、溶解物、またはビリオンの選択のための、より複雑な抗原の混合物の使用もまた、代替アプローチとして企図される。この方法に従って誘導した高親和性候補を、他のいくつかのアプローチが必要とし得る親和性の成熟を必要とすることなく、免疫学的予防のために単独で使用し得る。あるいは、所望の場合、特異的抗原に対する抗体のカクテルを使用し得る。例えば、Ｈｏｏｐｅｒら（２０００）は、ワクチンの遺伝子Ｌ１ＲおよびＡ３３Ｒを使用したＤＮＡ予防接種が、それぞれ単独のものより効果的であることを発見した。このことは、これら２つの抗原に対して、両方に対して惹起された抗体が、１個に対する抗体よりも良い保護を与えることを示している。Ｎｏｗａｋｏｗｓｋｉら（Ｎｏｗａｋｏｗｓｋｉら、２００２）は、ファージディスプレイに由来する重複しないエピトープに対する３つの抗体の混合物が、各抗体のみではほとんど効果を示さなかった、ボツリヌス菌神経毒の強力な中和を生成したことを発見した。
【０１１１】
以下の参考文献は、その全体が、本明細書中に参考として援用される：
【０１１２】
【化３】
【０１１３】
本明細書に開示された実施形態に対して種々の改変がなされ得ることは理解されるべきである。例えば、当業者は、抗体または抗体フラグメントの機能性に必ずしも不利に影響させることなく、本明細書に記載した特定の配列をわずかに変化させ得ることを、理解する。例えば、抗体またはフラグメントの機能性を破壊することなく、抗体配列中の１個または複数のアミノ酸の置換が、頻繁になされ得る。従って、本明細書に記載された特定の抗体に、７０％より高い程度の相同性を有する抗体は、本開示の範囲内であることは理解されるべきである。特定の有用な実施形態において、本明細書に記載された特定の抗体に対して約８０％より高い相同性を有する抗体が、企図される。他の有用な実施形態において、本明細書に記載される特定の抗体に対して約９０％より高い相同性を有する抗体が、企図される。従って、上述の説明は、限定として解釈されるべきではなく、単に好ましい実施形態の例示である。当業者は、本発明の開示の範囲および精神内の他の改変を想定する。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】図１は、本開示の好ましい実施形態に従うライブラリー生成のための組織供給源として適切な個体の曝露歴を要約する表である。
【図２Ａ】図２は、炭疽菌のＰＡ８３抗原に対する骨髄ドナーおよび血液ドナーの力価を示す。
【図２Ｂ】図２は、炭疽菌のＰＡ８３抗原に対する骨髄ドナーおよび血液ドナーの力価を示す。
【図３】図３は、ＰＡ６３およびＰＡ８３に対するＶＨ陽性反応性の配列分析を示す。
【図４】図４は、ＰＡ６３およびＰＡ８３に対するＶＫ陽性反応性の配列分析を示す。
【図５】図５は、ＰＡ６３およびＰＡ８３に対するＶＬ陽性反応性の配列分析を示す。
【図６】図６は、炭疽菌タンパク質ＰＡ８３およびＰＡ６３に対する抗体の改変体ヒトκ軽鎖の配列を示す。
【図７】図７は、炭疽菌タンパク質ＰＡ８３およびＰＡ６３に対する抗体の改変体ヒトλ軽鎖の配列を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、炭疽菌タンパク質ＰＡ８３およびＰＡ６３に対する抗体の改変体ヒトκ重鎖の配列を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、炭疽菌タンパク質ＰＡ８３およびＰＡ６３に対する抗体の改変体ヒトκ重鎖の配列を示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、炭疽菌タンパク質ＰＡ８３およびＰＡ６３に対する抗体の改変体ヒトκ重鎖の配列を示す。
【図９】図９は、精製したＦａｂによる炭疽菌毒素活性の中和を示す。
【図１０】図１０は、７つの連続的に希釈したＦａｂの％保護（毒素単独と比較して）を示す。
【図１１】図１１は、本明細書に記載された方法に従って産生されたＦａｂの、ＰＡ６３および／またはＰＡ８３に対する直線的エピトープと反応する能力を実証するウエスタンブロットを示す。抗ＰＡ６３抗体が、対照的に、変性したＰＡ６３に結合しないのに対して、試験した５つの抗ＰＡ８３Ｆａｂは、全てＰＡ８３に対する直線的エピトープに結合するようであり、そして、ＰＡ６３に対する弱い、おそらく非特異的な結合に見えるものを示す。
【図１２】図１２は、ＰＡ８３およびＰＡ６３に対する選択されたＦａｂのＥＬＩＳＡ力価を示す。ＰＡ６３への切断は、ＦＭＬ８ＥおよびＦ９Ｌ６Ｒ２の結合を劇的に変えるが、ＦＭＫ７Ｃは、両方の形態に等しく良く結合する。Ｆ９５１Ｌ６３１Ｄは、ＰＡ６３にのみ結合する。観察された最大値の結合は、ＦＭＫ７Ｃのそれの１／４であり、このことは、ＰＡ６３物質の一部のみが、Ｆ９５１Ｌ６３１Ｄが相互作用し得る形態中にあることを示唆している。
【図１３】図１３は、エピトープ特異性を評価するために、Ｆａｂ ＦＭＬ８Ｅのそのタグ化されたバージョンを、他のタグ化されていないＦａｂと競合して使用した試験の結果を示す。
【図１４】図１４は、ＶＥＥＶの固定されたＴＣ−８３抗原に対する血清反応性を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜図１５Ｄは、ＶＥＥＶの固定されたＴＣ−８３への結合に関して、４つのライブラリー（９５１Ｋ、９５１Ｌ、１０３７Ｋおよび１０３７Ｌ）由来のＦａｂクローンのスクリーニングの結果を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜図１５Ｄは、ＶＥＥＶの固定されたＴＣ−８３への結合に関して、４つのライブラリー（９５１Ｋ、９５１Ｌ、１０３７Ｋおよび１０３７Ｌ）由来のＦａｂクローンのスクリーニングの結果を示す。
【図１５Ｃ】図１５Ａ〜図１５Ｄは、ＶＥＥＶの固定されたＴＣ−８３への結合に関して、４つのライブラリー（９５１Ｋ、９５１Ｌ、１０３７Ｋおよび１０３７Ｌ）由来のＦａｂクローンのスクリーニングの結果を示す。
【図１５Ｄ】図１５Ａ〜図１５Ｄは、ＶＥＥＶの固定されたＴＣ−８３への結合に関して、４つのライブラリー（９５１Ｋ、９５１Ｌ、１０３７Ｋおよび１０３７Ｌ）由来のＦａｂクローンのスクリーニングの結果を示す。
【図１６】図１６は、ＶＥＥＶの固定されたＴＣ−８３抗原に対する精製されたヒトＦａｂの直接滴定を示す。
【図１７】図１７は、ＶＥＥＶまたはＢＳＡの固定されたＴＣ−８３抗原への結合に関して、マウスＦａｂ ｍＨｙ４（３Ｂ４Ｃ−４）に対するヒトＦａｂの競合を示す。
【図１８Ａ】図１８Ａおよび図１８Ｂは、ＶＥＥＶを中和する本開示に従って産生された完全ヒトＦａｂ配列を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ａおよび図１８Ｂは、ＶＥＥＶを中和する本開示に従って産生された完全ヒトＦａｂ配列を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトヘテロ二量体抗体または抗体フラグメントであって、炭疽菌の保護抗原に対して少なくとも１×１０−８Ｍの結合親和性を有し、かつ細胞レセプター、浮腫因子および致死性因子からなる群の一つ以上のメンバーに対する保護抗原の結合をブロックする能力を有する、ヒトヘテロ二量体抗体または抗体フラグメント。
【請求項２】
ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメントであって、炭疽菌感染に関与する分子に対して少なくとも１×１０−８Ｍの結合親和性を有し、かつ細胞レセプター、ＰＡ６３、ＰＡ６３七量体、ＰＡ８３、浮腫因子および致死性因子からなる群の一つ以上のメンバーに対する、炭疽菌感染に関与する該分子の結合をブロックする能力を有する、ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメント。
【請求項３】
請求項１に記載のヒトヘテロ二量体抗体または抗体フラグメントであって、ＰＡ６３が七量体を形成するのを防ぐ、ヒトヘテロ二量体抗体または抗体フラグメント。
【請求項４】
請求項１に記載のヒトヘテロ二量体抗体または抗体フラグメントであって、ＰＡ６３が、ＥＦまたはＬＦへ結合するのを防ぐ、ヒトヘテロ二量体抗体または抗体フラグメント。
【請求項５】
請求項１に記載のヒトヘテロ二量体抗体または抗体フラグメントであって、ＥＦおよび／またはＬＦが、ＰＡ６３七量体へ結合するのを防ぐ、ヒトヘテロ二量体抗体または抗体フラグメント。
【請求項６】
ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメントであって、配列番号１〜１８からなる群から選択される配列を有する重鎖可変領域を含む、ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメント。
【請求項７】
ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメントであって、配列番号１９〜２６からなる群から選択される配列を有する軽鎖κ領域を含む、ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメント。
【請求項８】
ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメントであって、配列番号２７〜３８からなる群から選択される配列を有する軽鎖λ領域を含む、ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメント。
【請求項９】
ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメントであって、配列番号３９〜６１からなる群から選択される配列を有する軽鎖κ領域を含む、ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメント。
【請求項１０】
ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメントであって、配列番号６２〜７７からなる群から選択される配列を有する軽鎖λ領域を含む、ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメント。
【請求項１１】
ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメントであって、配列番号７８〜１１２からなる群から選択された配列を有する重鎖可変領域を含む、ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメント。
【請求項１２】
抗体をスクリーニングする方法であって、
炭疽菌感染に関与する一つ以上の分子に対して抗体を産生するヒト被験体から得た細胞から単離されたＲＮＡを使用して、コンビナトリアルライブラリーを調製する工程；ならびに
炭疽菌感染に関与する分子に対して少なくとも１×１０−８Ｍの結合親和性を有し、かつ細胞レセプター、ＰＡ６３、ＰＡ６３七量体、ＰＡ８３、浮腫因子および致死性因子からなる群の一つ以上のメンバーに対する、炭疽菌感染に関与する該分子の結合をブロックする能力を有する抗体について、該コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする工程、
を包含する、方法。
【請求項１３】
方法であって、以下：
複数の感染性因子に対して予防接種されたかまたは複数の感染性因子に暴露された、ヒト被験体から得た細胞から単離されたＲＮＡを使用して、コンビナトリアルライブラリーを調製する工程；および
少なくとも一つの感染性因子による感染に関与する分子に対して結合親和性を各々有する複数の抗体について、該組み合わせライブラリーをスクリーニングする工程、
を包含する、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、ここで、前記スクリーニングの工程で同定された複数の抗体のうちの一つが、炭疽菌感染に関与する分子に対して少なくとも１×１０−８Ｍの結合親和性を有し、かつ細胞レセプター、ＰＡ６３、ＰＡ６３七量体、ＰＡ８３、浮腫因子および致死性因子からなる群の一つ以上のメンバーに対する炭疽菌感染に関与する該分子の結合をブロックする能力を有する抗体である、方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法であって、ここで、前記スクリーニングの工程で同定された複数の抗体のうちの一つが、抗ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス抗体である、方法。
【請求項１６】
請求項１３に記載の方法であって、ここで、前記スクリーニングの工程で同定された複数の抗体のうちの一つが、抗ボツリヌス菌抗体である、方法。
【請求項１７】
請求項１３に記載の方法であって、ここで、前記スクリーニングの工程で同定された複数の抗体のうちの一つが、抗西ナイルウイルス抗体である、方法。
【請求項１８】
請求項１３に記載の方法であって、ここで、前記スクリーニングの工程で同定された複数の抗体のうちの一つが、抗オルソポックス抗体である、方法。
【請求項１９】
請求項１３に記載の方法であって、ここで、前記スクリーニングの工程で同定された複数の抗体のうちの一つが、抗デング熱抗体である、方法。
【請求項２０】
請求項１３に記載の方法であって、ここで、前記コンビナトリアルライブラリーを調製する工程が、炭疽菌、ボツリヌス菌、天然痘、デング熱、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスおよび西ナイルウイルスからなる群から選択される一つ以上の感染性因子に対して予防接種されたかまたは暴露された、ヒト被験体から得た細胞から単離されたＲＮＡの使用を含む、方法。
【請求項２１】
請求項１３に記載の方法であって、ここで、前記コンビナトリアルライブラリーを調製する工程が、炭疽菌、ボツリヌス菌、天然痘、デング熱、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスおよび西ナイルウイルスからなる群から選択される二つ以上の感染性因子に対して予防接種されたかまたは暴露された、ヒト被験体から得た細胞から単離されたＲＮＡの使用を含む、方法。
【請求項２２】
請求項１３に記載の方法であって、ここで、前記スクリーニングの工程において同定された複数の抗体のうちの一つが、抗痘瘡抗体、抗サル痘ウイルス抗体および抗ワクシニアウイルス抗体からなる群から選択される、方法。
【請求項２３】
ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメントであって、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス感染に関与する分子に対する結合親和性およびベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスを中和する能力を有する、ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメント。
【請求項２４】
ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメントであって、配列番号１１６〜１１８からなる群から選択される配列を含む重鎖を含む、ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメント。
【請求項２５】
ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメントであって、配列番号１１３〜１１５からなる群から選択された配列を含む軽鎖を含む、ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメント。
【請求項１】
ヒトヘテロ二量体抗体または抗体フラグメントであって、炭疽菌の保護抗原に対して少なくとも１×１０−８Ｍの結合親和性を有し、かつ細胞レセプター、浮腫因子および致死性因子からなる群の一つ以上のメンバーに対する保護抗原の結合をブロックする能力を有する、ヒトヘテロ二量体抗体または抗体フラグメント。
【請求項２】
ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメントであって、炭疽菌感染に関与する分子に対して少なくとも１×１０−８Ｍの結合親和性を有し、かつ細胞レセプター、ＰＡ６３、ＰＡ６３七量体、ＰＡ８３、浮腫因子および致死性因子からなる群の一つ以上のメンバーに対する、炭疽菌感染に関与する該分子の結合をブロックする能力を有する、ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメント。
【請求項３】
請求項１に記載のヒトヘテロ二量体抗体または抗体フラグメントであって、ＰＡ６３が七量体を形成するのを防ぐ、ヒトヘテロ二量体抗体または抗体フラグメント。
【請求項４】
請求項１に記載のヒトヘテロ二量体抗体または抗体フラグメントであって、ＰＡ６３が、ＥＦまたはＬＦへ結合するのを防ぐ、ヒトヘテロ二量体抗体または抗体フラグメント。
【請求項５】
請求項１に記載のヒトヘテロ二量体抗体または抗体フラグメントであって、ＥＦおよび／またはＬＦが、ＰＡ６３七量体へ結合するのを防ぐ、ヒトヘテロ二量体抗体または抗体フラグメント。
【請求項６】
ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメントであって、配列番号１〜１８からなる群から選択される配列を有する重鎖可変領域を含む、ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメント。
【請求項７】
ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメントであって、配列番号１９〜２６からなる群から選択される配列を有する軽鎖κ領域を含む、ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメント。
【請求項８】
ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメントであって、配列番号２７〜３８からなる群から選択される配列を有する軽鎖λ領域を含む、ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメント。
【請求項９】
ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメントであって、配列番号３９〜６１からなる群から選択される配列を有する軽鎖κ領域を含む、ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメント。
【請求項１０】
ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメントであって、配列番号６２〜７７からなる群から選択される配列を有する軽鎖λ領域を含む、ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメント。
【請求項１１】
ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメントであって、配列番号７８〜１１２からなる群から選択された配列を有する重鎖可変領域を含む、ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメント。
【請求項１２】
抗体をスクリーニングする方法であって、
炭疽菌感染に関与する一つ以上の分子に対して抗体を産生するヒト被験体から得た細胞から単離されたＲＮＡを使用して、コンビナトリアルライブラリーを調製する工程；ならびに
炭疽菌感染に関与する分子に対して少なくとも１×１０−８Ｍの結合親和性を有し、かつ細胞レセプター、ＰＡ６３、ＰＡ６３七量体、ＰＡ８３、浮腫因子および致死性因子からなる群の一つ以上のメンバーに対する、炭疽菌感染に関与する該分子の結合をブロックする能力を有する抗体について、該コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする工程、
を包含する、方法。
【請求項１３】
方法であって、以下：
複数の感染性因子に対して予防接種されたかまたは複数の感染性因子に暴露された、ヒト被験体から得た細胞から単離されたＲＮＡを使用して、コンビナトリアルライブラリーを調製する工程；および
少なくとも一つの感染性因子による感染に関与する分子に対して結合親和性を各々有する複数の抗体について、該組み合わせライブラリーをスクリーニングする工程、
を包含する、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、ここで、前記スクリーニングの工程で同定された複数の抗体のうちの一つが、炭疽菌感染に関与する分子に対して少なくとも１×１０−８Ｍの結合親和性を有し、かつ細胞レセプター、ＰＡ６３、ＰＡ６３七量体、ＰＡ８３、浮腫因子および致死性因子からなる群の一つ以上のメンバーに対する炭疽菌感染に関与する該分子の結合をブロックする能力を有する抗体である、方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法であって、ここで、前記スクリーニングの工程で同定された複数の抗体のうちの一つが、抗ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス抗体である、方法。
【請求項１６】
請求項１３に記載の方法であって、ここで、前記スクリーニングの工程で同定された複数の抗体のうちの一つが、抗ボツリヌス菌抗体である、方法。
【請求項１７】
請求項１３に記載の方法であって、ここで、前記スクリーニングの工程で同定された複数の抗体のうちの一つが、抗西ナイルウイルス抗体である、方法。
【請求項１８】
請求項１３に記載の方法であって、ここで、前記スクリーニングの工程で同定された複数の抗体のうちの一つが、抗オルソポックス抗体である、方法。
【請求項１９】
請求項１３に記載の方法であって、ここで、前記スクリーニングの工程で同定された複数の抗体のうちの一つが、抗デング熱抗体である、方法。
【請求項２０】
請求項１３に記載の方法であって、ここで、前記コンビナトリアルライブラリーを調製する工程が、炭疽菌、ボツリヌス菌、天然痘、デング熱、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスおよび西ナイルウイルスからなる群から選択される一つ以上の感染性因子に対して予防接種されたかまたは暴露された、ヒト被験体から得た細胞から単離されたＲＮＡの使用を含む、方法。
【請求項２１】
請求項１３に記載の方法であって、ここで、前記コンビナトリアルライブラリーを調製する工程が、炭疽菌、ボツリヌス菌、天然痘、デング熱、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスおよび西ナイルウイルスからなる群から選択される二つ以上の感染性因子に対して予防接種されたかまたは暴露された、ヒト被験体から得た細胞から単離されたＲＮＡの使用を含む、方法。
【請求項２２】
請求項１３に記載の方法であって、ここで、前記スクリーニングの工程において同定された複数の抗体のうちの一つが、抗痘瘡抗体、抗サル痘ウイルス抗体および抗ワクシニアウイルス抗体からなる群から選択される、方法。
【請求項２３】
ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメントであって、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス感染に関与する分子に対する結合親和性およびベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスを中和する能力を有する、ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメント。
【請求項２４】
ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメントであって、配列番号１１６〜１１８からなる群から選択される配列を含む重鎖を含む、ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメント。
【請求項２５】
ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメントであって、配列番号１１３〜１１５からなる群から選択された配列を含む軽鎖を含む、ヒトへテロ二量体抗体または抗体フラグメント。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【図１５Ｄ】
【図１６】
【図１７】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【図１５Ｄ】
【図１６】
【図１７】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【公表番号】特表２００６−５０３５４７（Ｐ２００６−５０３５４７Ａ）
【公表日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００３−５７４７７５（Ｐ２００３−５７４７７５）
【出願日】平成１５年２月１１日（２００３．２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／００４２０６
【国際公開番号】ＷＯ２００３／０７６５６８
【国際公開日】平成１５年９月１８日（２００３．９．１８）
【出願人】（５０３１０２６７４）アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (51)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年２月１１日（２００３．２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／００４２０６
【国際公開番号】ＷＯ２００３／０７６５６８
【国際公開日】平成１５年９月１８日（２００３．９．１８）
【出願人】（５０３１０２６７４）アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (51)
【Ｆターム（参考）】
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