生物学的に活性なペプチドおよび組成物ならびにこれらの使用
【課題】新規な生物学的に活性な化合物および組成物、これらの使用および誘導の提供。
【解決手段】治療および抗有糸分裂試薬としてのヘミアスターリン化合物、および出発物質として合成される、下式ＩＶで示される、ゲオディアモリド化合物（Ｒ５１はアルキル基、Ｒ５２は水素原子またはアルキル基、Ａはハロゲン原子）。
【解決手段】治療および抗有糸分裂試薬としてのヘミアスターリン化合物、および出発物質として合成される、下式ＩＶで示される、ゲオディアモリド化合物（Ｒ５１はアルキル基、Ｒ５２は水素原子またはアルキル基、Ａはハロゲン原子）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な生物学的に活性な化合物および組成物、これらの使用および誘導に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、海綿からの新規な生物学的に活性な化合物の抽出を包含する。
【０００３】
他に記すことがなければ、本明細書中において、全てのアルキル基は、８個まで、特に６個まで、最も好ましくは４個までの炭素原子を持ち、直鎖または可能であれば分岐鎖の構造を持つものであってよい。通常は、メチルが好ましいアルキル基である。ハロゲン原子は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素であってよい。好ましいアシル基は、アルキルカルボニル、特にアセチルである。
【０００４】
他に記すことがなければ、本明細書中において、アルキル基の所望による置換基には、ハロゲン原子、例えばフッ素、塩素、臭素およびヨウ素原子、ならびに、ニトロ、シアノ、アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、スルフィニル、アルキルスルフィニル、スルホニル、アルキルスルホニル、アミド、アルキルアミド、アルコキシカルボニル、ハロアルコキシカルボニルおよびハロアルキル基が含まれる。好ましくは、所望により置換されたアルキル基は未置換である。
【０００５】
他に記すことがなければ、本明細書中において、化合物についての記述は、これら化合物に付与された構造式の範囲内で可能な全ての可能な異性体(特に、幾何および光学異性体)を意味する。他に記すことがなければ、定義は、異性体の混合物(ラセミ混合物を含む)および個々の異性体(分割可能であるとき)を包含するものとみなすべきである。
【０００６】
他に記すことがなければ、本明細書中における化合物の定義は、化合物の全ての可能な塩を包含するものとみなすべきである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、新規な生物学的に活性な化合物および組成物、これらの使用および誘導を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１の態様に係る化合物は、驚くべきことに、インビボでの癌治療に有効であることがわかった。
本発明の１つの態様によれば、後記の一般式Ｉで示されるヘミアスターリン(hemiasterlin)化合物が提供される。
本発明の別の態様によれば、後記の一般式IVで示されるゲオディアモリド(geodiamolide)化合物が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の第１の態様は、治療に使用する薬物を製造するための、以下の一般式で示されるヘミアスターリン(hemiasterlin)化合物の使用を提供する：
【化１】
[式中、Ｒ１およびＲ７０は、独立して、水素原子または所望により置換されたアルキルもしくはアシル基であり；
Ｒ２は、水素原子または所望により置換されたアルキルもしくはアシル基であるか、または、Ｒ６が以下で説明する−ＣＨ＝基であるときには存在せず；
Ｒ７３は、水素原子または所望による置換基であるか、または、Ｒ６が以下で説明する−ＣＨ＝基またはメチレン基であるときには存在せず；
Ｙは、所望による置換基であり；
ｎは、０、１、２、３または４であり；
Ｒ３は、水素原子または所望により置換されたアルキル基であり；
Ｒ７４は、水素原子、ヒドロキシ基、または所望により置換されたアルキルもしくはアシル基であり；
Ｒ７は、水素原子またはアルキル基であり；
Ｒ７５は、所望により置換されたアルキル基であり；そして
(ｉ)Ｒ６およびＲ７１が、独立して、水素原子または所望により置換されたアルキルもしくはアシル基であり；そして
Ｒ７２が水素原子であるか；または
(ii)Ｒ７１が水素原子または所望により置換されたアルキルもしくはアシル基であり、Ｒ７２が水素原子であるか、または、Ｒ７１およびＲ７２のそれぞれがラジカルであってそれらが結合している炭素原子間で二重結合が形成されており；そして
Ｒ６がインドール部分に結合した所望により置換されたメチレン基であって、三環式部分を形成しているか；または
Ｒ６がインドール部分に結合した所望により置換された−ＣＨ＝基であって、芳香族の三環式部分を形成している]。
【００１０】
好ましくは、Ｒ１は水素原子またはアルキル基、特にメチル基である。より好ましくは、Ｒ１は水素原子である。
Ｒ２は水素原子またはアシル基であるのが適当である。アシル基はベンゾイル基であってもよいが、好ましくはアルキルカルボニル基である。特に好ましいアシル基はアセチル基である。好ましくは、Ｒ２は水素原子である。
Ｙおよび／またはＲ７３が所望による置換基である場合、これら置換基は、ハロゲン、特にフッ素、塩素、臭素およびヨウ素原子、ならびに、アルキル、アシル、−ＯＨ、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アシル、−ＮＨ２、−ＮＨ−アルキル、−Ｎ(アルキル)２、−ＮＨ−アシル、−ＮＯ２、−ＳＨ、−Ｓ−アルキルおよび−Ｓ−アシル(ここで、これら置換基のアルキルおよびアシル基は所望により置換されている)から独立して選択することができる。
Ｙおよび／またはＲ７３で示される所望による置換基は、アルキル基であるのが好ましい。
【００１１】
好ましくは、Ｒ７３は水素原子である。
好ましくは、ｎは０、１または２である。より好ましくは、ｎは０である。
Ｒ３はアルキル基であるのが適当である。好ましくは、Ｒ３はＣ３−６、特にＣ３−４の分岐アルキル基、例えばｔ-ブチルまたはイソプロピルである。
Ｒ７４は水素原子またはメチル基、特に水素原子であるのが適当である。
Ｒ７はアルキル基であるのが適当であり、好ましくはメチル基である。
好ましくは、Ｒ６は水素原子または所望により置換されたアルキル基、または三環式部分を形成するようにインドール部分と結合しているメチレン基である。より好ましくは、Ｒ６はアルキル基である。
好ましくは、Ｒ７１は独立して水素原子または所望により置換されたアルキルもしくはアシル基である。より好ましくは、Ｒ７１はアルキル基、特にメチル基である。
好ましくは、Ｒ６およびＲ７１は、上記(ｉ)に記載した通りである。
【００１２】
Ｒ７５は、以下の一般式で示される基であってよい：
【化２】
[式中、Ｑは、所望により置換された−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨＣＨ−、−ＣＨ２Ｃ.Ｃ.−またはフェニレン基であり；
Ｘは、−ＯＲ８、−ＳＲ８または−ＮＲ９Ｒ１０基である(ここで、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は独立して水素原子または所望により置換されたアルキル基である)]。
【００１３】
Ｑが上記の所望により置換された非環式基のいずれかであるときには、この基は１またはそれ以上のアルキル基で置換されていてもよい。フェニレン基は、１またはそれ以上の上記の置換基Ｙで置換されていてもよい。
Ｘが−ＯＲ８基であるときには、適当なＲ８は水素原子またはメチル基である。好ましくは、Ｒ８は水素原子である。
Ｘが−ＮＲ９Ｒ１０基であるときには、適当なＲ９は水素原子またはアルキル基(例えば、メチル基)であり、Ｒ１０は置換されたアルキル基である。
Ｒ１０が置換されたアルキル基であるときには、該基は、一般式：−ＣＨＲ２１ＣＯＯＨ(式中、Ｒ２１は所望により置換されたアルキル基である)で示される基であるのが好ましい。好ましくは、Ｒ２１は少なくとも１個の窒素原子を含有する基である。好ましくは、Ｒ２１は、一般式：−(ＣＨ２)ｘＮＲ２２Ｒ２３(式中、ｘは好ましくは１〜４の範囲内の整数であり、Ｒ２２およびＲ２３は独立して水素原子または所望により置換されたアルキル、アルケニルもしくはイミン基である)で示される基である。好ましくは、Ｒ２２は水素原子であり、Ｒ２３はイミン基：−Ｃ(ＮＨ)ＮＨ２である。
好ましくは、Ｘは、−ＯＲ８基である(ここで、Ｒ８は水素原子である)。
【００１４】
好ましくは、Ｒ７５は、以下の一般式で示される基である：
【化３】
[式中、Ｒ４およびＲ５は、独立して水素原子または所望により置換されたアルキル基であり；
Ｒ７６およびＲ７７は、それぞれ水素原子またはラジカル(従って、これらが結合している炭素原子間で二重結合が形成される)であり；
Ｘは上記の通りである]。
【００１５】
一般式Ｉで示される化合物が、有糸分裂抑制および異常な有糸分裂紡錘体の生成を引き起こしうることを発見した。従って、本発明は、第２の態様において、抗有糸分裂化合物としての一般式Ｉの化合物の使用を包含する。
この化合物を、例えば、有糸分裂細胞における微小管機能のプローブおよび核型分析のための有糸分裂展開物の調製などの、有糸分裂において細胞のブロックを必要とする方法における抗有糸分裂化合物として、インビボまたはインビトロで使用することができる。
【００１６】
第３の態様において、本発明は、本明細書中に記載した一般式Ｉで示される新規化合物を提供するものであるが、一般式ＩにおいてＲ１がメチルであり、Ｒ２が水素であり、Ｒ７０がメチルであり、Ｒ７１がメチルであり、Ｒ７３が水素であり、ｎが０であり、Ｒ３がｔ-ブチルであり、Ｒ７４が水素であり、Ｒ６がメチルであり、Ｒ７がメチルであり、Ｒ７２が水素であり、そして、Ｒ７５が−ＣＨ(ＣＨ(ＣＨ３)２)ＣＨ.ＣＣＨ３.ＣＯＯＨである１つの化合物は除外する。この除外した化合物はヘミアスターリンである。
【００１７】
好ましくは、Ｒ１がメチル基である化合物を除外した本明細書中に記載の一般式Ｉの化合物が提供される。
好ましくは、Ｒ２が水素原子である化合物を除外した本明細書中に記載の一般式Ｉの化合物が提供される。
【００１８】
好ましい新規化合物の１つの群には、一般式Ｉで示されるヘミアスターリン(hemiasterlin)であって、
Ｒ１が水素原子であり；
Ｒ２が水素原子、アルキル基またはアシル基であり；
Ｒ３が水素原子または所望により置換されたアルキル基であり；
ｎが０であり；
Ｒ７０およびＲ７１が独立して水素原子または所望により置換されたアルキル基であり、好ましくはそれぞれがメチル基であり；
Ｒ７２、Ｒ７３およびＲ７４が水素原子であり；
Ｒ７が水素原子またはアルキル基であり；
Ｒ６が水素原子または所望により置換されたアルキル基であるか、またはインドール部分に結合したメチレン基であって三環式部分を形成しており；
Ｒ７５が上記一般式III[式中、Ｒ４は水素原子または所望により置換されたアルキル基であり；Ｒ５は水素原子またはアルキル基であり；Ｒ７６およびＲ７７は記載した通りのラジカルであり；Ｘは−ＯＲ８基または−ＮＲ９Ｒ１０基である(ここで、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は独立して水素原子または所望により置換されたアルキル基である)]で示される基である；
ヘミアスターリンが含まれる。
【００１９】
好ましい新規化合物の別の群には、一般式Ｉで示されるヘミアスターリンであって、
Ｒ１が水素原子またはアルキル基であり；
Ｒ２がアシル基であり；
Ｒ３が水素原子または所望により置換されたアルキル基であり；
ｎが０であり；
Ｒ７０およびＲ７１が独立して水素原子または所望により置換されたアルキル基であり、好ましくはそれぞれがメチル基であり；
Ｒ７２、Ｒ７３およびＲ７４が水素原子であり；
Ｒ７が水素原子またはアルキル基であり；
Ｒ６が水素原子または所望により置換されたアルキル基であるか、またはインドール部分に結合したメチレン基であって三環式部分を形成しており；
Ｒ７５が上記一般式III[式中、Ｒ４は水素原子または所望により置換されたアルキル基であり；Ｒ５は水素原子またはアルキル基であり；Ｒ７６およびＲ７７は記載した通りのラジカルであり；Ｘは−ＯＲ８基または−ＮＲ９Ｒ１０基である(ここで、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は独立して水素原子または所望により置換されたアルキル基である)]で示される基である；
ヘミアスターリンが含まれる。
【００２０】
好ましい新規化合物の別の群には、一般式Ｉで示されるクリアミド(criamide)であって、
Ｒ１が水素原子またはアルキル基であり；
Ｒ２が水素原子、アルキル基またはアシル基であり；
Ｒ３が水素原子または所望により置換されたアルキル基であり；
ｎが０であり；
Ｒ７０およびＲ７１が独立して水素原子または所望により置換されたアルキル基であり、好ましくはそれぞれがメチル基であり；
Ｒ７２、Ｒ７３およびＲ７４が水素原子であり；
Ｒ６が水素原子または所望により置換されたアルキル基であるか、またはインドール部分に結合したメチレン基であって三環式部分を形成しており；
Ｒ７５が上記一般式III[式中、Ｒ４は水素原子または所望により置換されたアルキル基であり；Ｒ５は水素原子またはアルキル基であり；Ｒ７６およびＲ７７は記載した通りのラジカルであり；Ｘは−ＮＲ９Ｒ１０基である(ここで、Ｒ９およびＲ１０は独立して水素原子または所望により置換されたアルキル基である)]で示される基である；
クリアミドが含まれる。
【００２１】
上記の式ＩおよびIIIにおいて、波線で示した結合は、光学中心であるかまたは光学中心になりうる炭素原子からのものである。
好ましくは、一般式Ｉで示される化合物においては、以下の光学立体配置が多い：
【化４】
【００２２】
本発明のさらに別の態様によれば、以下の一般式で示されるゲオディアモリド(geodiamolide)化合物が提供される：
【化５】
[式中、Ｒ５１はアルキル基であり；
Ｒ５２は水素原子またはアルキル基であり；
Ａはハロゲン原子である]。
好ましくは、Ｒ５１はメチル基である。
Ｒ５２は水素原子であるのが適当であるか、または好ましくはメチル基である。
Ａは塩素、臭素、または好ましくはヨウ素原子であるのが適当である。
【００２３】
上記の式IVにおいて、波線で示した結合は、水素原子であるＲ５１およびＲ５２基を保持する場合の炭素原子を除き、光学中心である炭素原子からのものである。好ましくは、以下の光学立体配置が多い。
【化６】
【００２４】
上に定義した一般式ＩおよびIVで示される化合物の一部は、海綿シンバステラ(Cymbastela)種[以前はシューダキシニッサ(Pseudaxinyssa)種と分類されていた]から得ることができるか、または、これから得られる化合物の誘導体化によって得ることができる。一般式Ｉで示される化合物の誘導体化には、抽出した化合物の通常のアシル化(所望により、通常のエステル化による)が含まれるであろう。また、一般式ＩおよびIVで示される化合物を、全合成経路により調製することもできる。
本発明は、治療に使用する薬物の製造のための一般式IVで示される化合物の使用を包含する。
【００２５】
一般式Ｉで示される化合物は、以下に示すアミノ酸部分Ａ、ＢおよびＣ：
【化７】
をカップリングさせることによって製造することができる。
このカップリング反応は、通常の方法で行ってよい。アミノ酸部分Ａ、ＢおよびＣは、通常の方法により、または後記実施例に記載した方法と同様の方法によって調製することができる。
【００２６】
一般式Ｉで示される化合物の一部を製造するための一般法の１つを以下に挙げる。
Ｒ７５が、
【化８】
である一般式Ｉで示される化合物は、一般式：
【化９】
で示される化合物を、一般式：
【化１０】
で示される化合物と反応させることによって調製することができる。
【００２７】
カップリング剤、例えばＮ,Ｎ'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(ＤＣＣ)をこの反応に用いるのが好都合である。この反応は、カップリング剤、塩基[トリエタノールアミン(ＴＥＡ)など]および有機溶媒(アセトニトリルなど)の存在下に低温で、化合物ＶとVIを接触させることからなるのが好都合である。一定時間の後に、無機塩基(例えば、水酸化ナトリウム)を加え、次いで温度を周囲温度まで上昇させ、トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)を加えてよい。次いで、一般式Ｉで示される所望の化合物を常法により単離することができる。
【００２８】
一般式VIで示される化合物は、一般式：
【化１１】
[式中、ＢＯＣ(ｔ-ブトキシカルボニル)は保護基である]
で示される化合物を、例えば、式：(Ｐh)３＝ＣＲ５ＣＯ２Ｒ８で示されるイリドと反応させることによって調製することができる。この反応は、ロイド(R.Lloyd)の博士論文(ケンブリッジ大学、1994年)に記載されているように、ＴＨＦ／水の１：１混合液中、炭酸カリウムの存在下に行うのが好都合である。保護基ＢＯＣは、ＴＦＡ中、周囲温度で約２時間の反応によって、必要なときに除去するのが好都合である。
【００２９】
一般式VIIで示される化合物は、一般式：
【化１２】
で示される化合物を、テトラヒドロフラン中で還元剤(例えば、水素化アルミニウムリチウム)と反応させることによって調製することができる。
【００３０】
一般式VIIIで示される化合物は、文献[Synthesis 1983, 676]に記載された方法を用いて、一般式：
【化１３】
で示される化合物から調製することができる。
【００３１】
一般式IXで示される化合物は、文献[Can.J.Chem. 1973, 51, 1915]に記載された方法を用いて、一般式：
【化１４】
で示される化合物から、ＴＨＦ中、水素化アルカリ金属の存在下、一般式：Ｒ７Ｉで示される化合物との反応によって調製することができる。
【００３２】
一般式Ｖで示される化合物は、一般式：
【化１５】
で示される化合物を、初めに塩基(例えば、希水酸化ナトリウム溶液)と反応させ、次いで約ｐＨ６まで酸性化することによって調製することができる。ある種の状況下では、−ＮＲ６Ｒ２基を反応から保護するのが望ましく、これを、ＢＯＣなどの保護剤を用いて行うのが好都合である。
【００３３】
一般式XIで示される化合物は、一般式：
【化１６】
で示される化合物を塩基と反応させ、次いでアジド化合物で処理することによって調製することができる。次いで、この化合物XIIのアジド誘導体を還元してアミン誘導体を得る。次いで、この化合物を塩基(例えば、水素化ナトリウム)の存在下にＲ６１および／またはＲ２１基で処理して、式XIで示される化合物中のＲ６Ｒ２Ｎ−基を生成させる。
【００３４】
一般式XIIで示される化合物は、一般式：
【化１７】
および
【化１８】
で示される化合物を、カップリング剤(ＤＣＣなど)および塩基(ＴＥＡなど)を用い、有機溶媒(アセトニトリルなど)中、好都合には約０℃でカップリングさせることによって調製することができる。
【００３５】
一般式XIIIで示される化合物は、当業者には周知の方法により、一般式：
【化１９】
で示される化合物から調製することができる。
一般式XIVおよびXVで示される化合物は、当業者には周知の方法によって調製することができる。
【００３６】
Ｒ７５が、
【化２０】
である一般式Ｉで示される化合物は、上記の一般式Ｉで示される化合物を、一般式：Ｒ９Ｒ１０ＮＨで示されるアミンと反応させることによって調製することができる。この反応は、カップリング剤(ＤＣＣなど)および塩基(ＴＥＡなど)の存在下に、有機溶媒(アセトニトリルなど)中、低温で行うのが好都合である。ある種の状況下では、−ＮＲ６Ｒ２基を所望ではない反応から保護することが必要になることもあり、これを、ＢＯＣなどの保護剤を用いて行うのが好都合である。
【００３７】
本発明の別の態様によれば、一般式Ｉで示される化合物を得る方法であって、シンバステラ(Cymbastela)種から一般式Ｉで示される化合物を抽出することによる方法が提供される。この方法は、分離および精製工程、ならびに該化合物を所望により誘導体化して、一般式Ｉの別化合物を得る工程を包含する。
一般式Ｉで示される化合物の誘導体化には、アシル化および／またはエステル化工程が含まれるであろう。エステル化および／またはアシル化工程は、通常の条件下で行ってよい。
【００３８】
本発明のさらに別の態様によれば、一般式IVで示される化合物を得る方法であって、シンバステラ種から一般式IVで示される化合物を抽出することによる方法が提供される。この方法は、分離および精製工程、ならびに該化合物を所望により誘導体化して、一般式IVの別化合物を得る工程を包含する。
【００３９】
一般式ＩおよびIVで示される化合物は生物学的に活性である。本発明は、一般式ＩまたはIVで示される化合物の生物学的使用にも関する。一般式ＩまたはIVで示される化合物は、殺虫活性、例えば殺昆虫活性を有しているであろう。しかし、この使用は、好ましくは獣医学分野であり、最も好ましくは医薬分野である。
本明細書中に記載した化合物は、特に抗細菌および／または抗ウイルス剤として、および／またはとりわけ細胞毒性剤としての用途を有しているであろう。
さらに本発明は、哺乳動物の癌または腫瘍の治療に使用する薬物の製造のための、一般式ＩまたはIVで示されるいずれかの化合物の使用を提供する。
【００４０】
本明細書中に記載した一般式ＩまたはIVで示される化合物を使用する際には、この化合物を、薬学的または獣医学的に許容しうる担体および所望による１またはそれ以上の他の生物学的に活性な成分をも含有する医薬または獣医学組成物として患者に投与するのが好ましい。このような組成物は、医薬物質を投与するために使用する任意の形態、例えば、経口、局所、腟、非経口、直腸および吸入で使用するのに適する任意の形態であってよい。これら組成物は、独立した投与単位で供してよい。担体は粒子状であってよく、組成物は、例えば錠剤、粉末または液体であり、組成物は、例えば経口シロップまたは注射用液体であるか、または吸入使用のためにガス状である。
【００４１】
経口投与のためには、賦形剤および／または結合剤が存在していてもよい。その例は、スクロース、カオリン、グリセリン、デンプンデキストリン、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースおよびエチルセルロースである。着色剤および／または香味剤が存在していてもよい。被覆入れ物を用いることもできる。直腸投与のためには、例えばラノリンまたはココアバターなどの油性基剤を用いることができる。注射用製剤のためには、緩衝剤、安定剤および等張剤を含有させることもできる。
【００４２】
一般式ＩおよびIVで示される化合物の投与量は、患者の体重および身体状態、病気の重篤度および期間、ならびに、活性成分の特定形態、投与方法および使用する組成物に依存するであろう。１日あたり約０.００１〜約１００mg／kg体重の投与量を、１日１回または数回(６回まで)で、または連続注入によって投与するのが、最も普通に要求される有効量である。好ましい範囲は、１日あたり約０.０１〜約５０mg／kg体重であり、最も好ましくは１日あたり約０.１〜約３０mg／kg体重である。
【００４３】
化学療法における一般式ＩまたはIVで示される化合物の使用には、腫瘍細胞への該化合物の供給を助ける物質(例えば、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、タンパク質またはリポソーム)に結合させた化合物が含まれうることを理解すべきである。
【００４４】
従って、本発明はさらに、担体と組合せて有効量の式ＩまたはIVで示される化合物を含有する医薬および獣医学組成物に関する。
【００４５】
以下において、図１および図２(抗有糸分裂活性に関するグラフである)を参照しながら、例示の目的で本発明をさらに詳しく説明する。
方法１：天然化合物の単離
シンバステラ種の試料を、ニューギニアのパプア島マンダン周辺の礁において、スキュバにより手で採取した。採取した新鮮な海綿をそこで凍結し、ドライアイスを詰めてカナダのバンクーバーに輸送した。先導的な海綿分類学の専門家であるバン・セスト(R.van Soest)教授がこの海綿を同定した。証拠試料を、アムステルダム大学のインスティテュト・ボア・システマトレク・エン・ポピュラティービオロジー-ズーロギッシュ・ミューゼウム(Institut voor Systematrek en Populatiebiologie-Zoologisch Museum)に寄託した。
【００４６】
解凍した海綿(２６０g、乾燥重量)を、ＣＨ２Ｃl２／ＭeＯＨ(１：１)溶液で徹底的に抽出した。真空下でこの有機抽出物を蒸発させて水性懸濁液を得た。ＭeＯＨを加えて９：１のＭeＯＨ：Ｈ２Ｏ溶液(１Ｌ)を得、これをヘキサン(４×２５０ml)で抽出した。このヘキサン抽出物を一緒にして真空下で濃縮してオレンジ色の油を得た。水をＭeＯＨ溶液に加えて１：１のＭeＯＨ／Ｈ２Ｏ溶液を得、これをＣＨＣl３(４×２５０ml)で抽出した。一緒にしたＣＨＣl３層を真空下に濃縮してオレンジ色の油(３.５g)を得た。ＭeＯＨで溶離するセファデックス(Sephadex)ＬＨ-２０によるサイズ排除クロマトグラフィーを繰返して、多数の粗製ゲオディアモリドおよびヘミアスターリンを得た。純粋なゲオディアモリドＧ(下記の化合物１；２mg、０.０００７％乾燥重量)を、逆相ＨＰＬＣ(ＭeＯＨ／Ｈ２Ｏ ６０：４０)によって得た。逆相イソクラティックＨＰＬＣ(０.０５％ＴＦＡ：ＭeＯＨ １：１)により、ヘミアスターリンＡ(下記の化合物２；３２mg、０.０１２％乾燥重量)およびヘミアスターリンＢ(下記の化合物３；１mg、０.０００４％乾燥重量)を得た。これらの化合物は新規である。また、ＴＦＡおよびＭeＯＨを用いる逆相イソクラティックＨＰＬＣは、既知の化合物であるヘミアスターリン(下記の化合物Ａ；４０mg、０.０１５％乾燥重量)を与えた。この化合物を用いて、後記の新規なアシル化およびエステル化した化合物を調製した。
【００４７】
ゲオディアモリドＧ(化合物１)：
無色ガラス状物質；
ＩＲ(そのまま)：3313、2977、2933、1732、1675、1635、1505、1455、1417、1377、1285、1217、1102、1083、1052、952、827、754cm-1；
ＮＭＲデータ：以下の表１；
ＨＲＥＩＭＳ：Ｍ＋ m/z 655.1760 (C28H38N3O7I ΔM 0.6mmu)
ヘミアスターリンＡ(化合物２)：
白色固体；
[α]D＝−４５°(c 0.25、MeOH)；
ＵＶ(MeOH)：λmax (ε) 218 (23,400)、280nm (2,800)；
ＩＲ(そのまま)：3418、2966、1689、1680、1643cm-1；
ＮＭＲデータ：以下の表２；
ＨＲＦＡＢＭＳ：ＭＨ＋ m/z 513.3471 (C29H45O4N4 ΔM 3.0mmu)
【００４８】
ヘミアスターリンＢ(化合物３)：
白色固体；
ＣＤ(MeOH)：(θ)226 10,800；
ＮＭＲデータ：以下の表２；
ＨＲＦＡＢＭＳ：ＭＨ＋ m/z 499.3319 (C28H43O4N4 ΔM 3.4mmu)
ヘミアスターリン(化合物Ａ)：
白色固体；
[α]D＝−７７°(c 0.07、MeOH)；
ＵＶ(MeOH)：λmax (ε) 216 (15,400)、273nm (1,600)；
ＩＲ(そのまま)：3412、2962、1650、1635cm-1；
ＮＭＲデータ：以下の表２；
ＨＲＦＡＢＭＳ：ＭＨ＋ m/z 527.3594 (C30H47O4N4 ΔM -0.35mmu)
【００４９】
生成物の同定(立体化学配置の帰属を含む)は、既知の化合物に対して文献に報告されている分析結果を参照しながら、一連の方法(ＮＭＲ、質量スペクトルおよび旋光度測定を含む)によって行った。化合物２および３の場合には、ＣＤおよび化学分解分析を行って立体化学の決定の助けとした。
【００５０】
【化２１】
化合物１
【００５１】
【化２２】
化合物２ Ｒ１ ＝ Ｒ２ ＝ Ｒ４ ＝ Ｈ 、 Ｒ８３ ＝ Ｍe
化合物３ Ｒ１ ＝ Ｒ２ ＝ Ｒ３ ＝ Ｒ８４ ＝ Ｈ
化合物Ａ Ｒ１ ＝ Ｒ８３ ＝ Ｍe 、 Ｒ２ ＝ Ｒ８４ ＝ Ｈ
【００５２】
【表１】
【００５３】
【表２】
【００５４】
別の例において、シンバシエラ(Cymbasyela)種の試料を、ニューギニアのパプア島マンダンの礁において、スキュバにより手で採取した。新鮮な海綿をそこで凍結し、ドライアイスを詰めてカナダのバンクーバーに輸送した。この凍結乾燥した海綿(１５７g、乾燥重量)を、ヘキサン、四塩化炭素、クロロホルムおよびメタノール(３×８Ｌ)で順次抽出した。これらの抽出物を真空下に濃縮して、各溶媒に対してそれぞれ６g、０.７６g、１.２４gおよび１.１gを得た。メタノールを用いてセファデックスＬＨ-２０により、クロロホルム抽出物のサイズ排除クロマトグラフィーを繰返して、粗製ヘミアスターリンおよびクリアミドの混合物を得た。逆相ＨＰＬＣ(５０：５０の０.０５％ＴＦＡ：ＭeＯＨ)により、純粋なヘミアスターリン(６０mg、０.０３８％乾燥重量)(上記の化合物Ａ)、ヘミアスターリンＡ(５５mg、０.０３５％乾燥重量)(上記の化合物２)、ヘミアスターリンＢ(３mg、０.００１９％乾燥重量)(上記の化合物３)、クリアミドＡ(２mg、０.００１３％乾燥重量)(下記の化合物６)、クリアミドＢ(２mg、０.００１３％乾燥重量)(下記の化合物７)を得た。
【００５５】
【化２３】
化合物６ Ｒ１ ＝ Ｍe
化合物７ Ｒ１ ＝ Ｈ
【００５６】
化合物６および７の生成物同定(立体化学配置の帰属を含む)は、他の試料について上記した一連の方法によって行った。ＮＭＲデータを以下の表３に示す。
【表３】
【００５７】
方法２：天然化合物の誘導体化
以下の化合物４および５を、それぞれ上記の化合物Ａおよび２から調製した。
【化２４】
化合物４ Ｒ１ ＝ Ｒ８３ ＝ Ｒ８４ ＝ Ｍe 、 Ｒ２ ＝ ＣＯＣＨ３
化合物５ Ｒ１ ＝ Ｈ 、 Ｒ２ ＝ ＣＯＣＨ３ 、 Ｒ８３ ＝ Ｒ８４ ＝ Ｍe
【００５８】
これら化合物は、初めに化合物Ａおよび２をそのメチルエステルに変換し、次いでこのエステルをアシル化することによって調製した。
化合物Ａおよび２のメチルエステルを調製するために、アルドリッチ(Aldrich)のＭＮＮＧ-ジアゾメタンキットを用いて１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン(ＭＮＮＧ)から常法によりジアゾメタンを調製した。得られた黄色のジアゾメタン溶液(３mlエーテル)を、クロロホルム(３ml)に溶解したペプチドＡまたは２(１mg)に加えた。この反応混合物を周囲温度で１時間放置し、次いで真空下に溶媒を除去した。
【００５９】
次いで、このエステル化したペプチドをアシル化するために、それぞれのエステル化ペプチド(約１mg)を、新たに蒸留(ＮaＯＨから)したピリジンおよび無水酢酸(各１.０ml)とともにアルゴン雰囲気下で一晩撹拌した。過剰の試薬を真空下に除去して、純粋なＮ-アセチルペプチドエステルである化合物４および５を得た。これら化合物は以下の特性を有する。
【００６０】
ヘミアスターリン、Ｎ-アセチルメチルエステル(化合物４)：
【数１】
【００６１】
ヘミアスターリンＡ、Ｎ-アセチルメチルエステル(化合物５)：
【数２】
【００６２】
方法３：全合成法
全合成法によって本明細書中に記載の化合物を調製する方法は、一般的に言うと、アミノ酸をカップリングさせることからなる。即ち、以下の式：
【化２５】
で示される化合物の調製は、単位Ａ、ＢおよびＣに対応するアミノ酸をカップリングさせることからなる。上に示した化合物の末端Ｃにカップリングして追加部分Ｄを含むクリアミド化合物は、所望の部分Ｄに対応するアミノ酸をペプチドＡ-Ｂ-Ｃにカップリングさせることによって調製することができる。
【００６３】
アミノ酸ＡおよびＣの調製を以下に説明する。アミノ酸Ｂは市販品から入手可能である。
１．アミノ酸Ｃ(Ｎ-メチルホモ ビニログ バリンエチルエステル)の調製
以下に説明する方法の要約を、後記の反応式１に示す。
(a)Ｎ-Ｂoc、Ｎ-Ｍe-Ｌ-バリン(１)の調製
Ｎ-Ｂoc-Ｌ-バリン(５g、２３mモル)およびヨウ化メチル(１.５９ml、２５.３mモル)をＴＨＦ(６５ml)に溶解し、この溶液をアルゴン下に０℃まで冷却した。穏やかに撹拌しながら、水素化ナトリウム分散液(２.０３g、５０.６mモル)を慎重に加えた。この懸濁液を室温で１６時間撹拌した。次いで、酢酸エチル(３０ml)を加え(過剰の水素化ナトリウムから生成した水酸化ナトリウムを消費するため)、続いて水を滴下して過剰の水素化ナトリウムを破壊した。この溶液を蒸発乾固し、油状の残留物をエーテル(２５ml)と水(５０ml)の間に分配した。このエーテル層を５％ ＮaＨＣＯ３水溶液(２５ml)で洗浄し、一緒にした水性抽出物をクエン酸水溶液でｐＨ３に酸性化した。この生成物を酢酸エチル(３×２５ml)中に抽出し、この抽出物を水(２×２５ml)、５％チオ硫酸ナトリウム水溶液(２×２５ml；ヨウ素を除去するため)および水(２×２５ml)で洗浄し、ＭgＳＯ４で乾燥し、蒸発させて黄色の油を得た。この方法を繰返して全体収量を改善した。最終の収量は３.５３g(７０.６％)であった。
【数３】
【００６４】
(b)Ｎ-Ｂoc、Ｎ-Ｍe-Ｌ-バリン-Ｎ-Ｍe、Ｎ-Ｏme[ヴァインレプ(Weinreb)アミド](２)の調製
Ｎ-Ｂoc、Ｎ-Ｍe-Ｌ-バリン(３.２g、１３.９mモル)、Ｎ,Ｏ-ジメチルヒドロキシルアミン・ＨＣl(１.５g、１５mモル)、およびトリエチルアミン(２.１ml、３０mモル)をＣＨ２Ｃl２(３０ml)に溶解し、この溶液をアルゴン下に−１０℃まで冷却した。ジシクロヘキシルカルビミド(３.１g、１５mモル)をＣＨ２Ｃl２(１５ml)に溶解し、１０分間で反応混合物に滴下した。この溶液を−１０℃でさらに１５分間撹拌し、次いで室温で１時間撹拌し、この時点で反応液を濾過し、過剰の溶媒を真空下に除去した。この油をＥtＯＡc(５０ml)に溶解し、５％ ＨＣl(２×２５ml)、水(２×２５ml)、５％ ＮaＨＣＯ３(２×２５ml)および水(２×２５ml)で洗浄し、ＭgＳＯ４で乾燥し、蒸発させて黄色の油(３.４g、８５％収率)を得た。
【数４】
Ｎ-Ｂoc基の周りの回転異性体によってピークの二重化が引き起こされた。
【００６５】
(c)Ｎ-Ｂoc、Ｎ-Ｍe-Ｌ-バリンアルデヒド(３)の調製
ヴァインレプアミド(２２６mg、０.７８mモル)をＴＨＦ(８ml)に溶解し、−７８℃まで冷却し、次いで、−７８℃のＴＨＦ中のＬiＡlＨ４(３５mg、０.８６mモル)の分散液に滴下した。この反応液を０.５時間撹拌した時点で、Ｎa２ＳＯ４・１０Ｈ２Ｏ(２５１mg、０.７８mモル)によって反応停止させ、室温まで暖めた。この溶液をセライトで濾過し、過剰の溶媒を真空下に除去して無色の油を得た。通常相のシリカゲルクロマトグラフィー(１：６の酢酸エチル：ヘキサンで溶離)により、透明な油として純粋なＮ-Ｂoc、Ｎ-Ｍe-Ｌ-バリンアルデヒド(１１６mg、６８％)を得た。
【数５】
【００６６】
(d)Ｎ-Ｂoc-ＭＨＶＶ-ＯＥt(４)の調製
Ｎ-Ｂoc、Ｎ-Ｍe-バリンアルデヒド(１２０mg、０.５６mモル)をＴＨＦ：Ｈ２Ｏの１：１混合物(６ml)に溶解し、(カルブエトキシエチリデン)トリフェニルホスファン(２２２mg、６.２mモル)を加え、この反応液を室温で４時間撹拌した。通常相のシリカゲルクロマトグラフィー(１：６の酢酸エチル：ヘキサンで溶離)により、透明な油としてＮ-Ｂoc-ホモ ビニログ バリンエチルエステル(２１２mg、７１％)を得た。
【数６】
【００６７】
(e)ＭＨＶＶ-ＯＥt(５)の調製
Ｎ-Ｂoc-ＭＨＶＶ-ＯＥt(２００mg、６７mモル)を１：１のＣＨ２Ｃl２：トリフルオロ酢酸混合液(１ml)に溶解し、アルゴン下に０.５時間撹拌した。過剰の溶媒を真空下に除去し、油状の残留物をＣＨ２Ｃl２(２５ml)に２回再溶解し、そして濃縮することによって、ＴＦＡの痕跡を除去した。最終生成物は白色無定形の固体であった(２０７mg、９９％)。
【数７】
【００６８】
２．アミノ酸Ａ(Ｎ-Ｂoc-テトラメチルトリプトファン誘導体)の調製
本明細書中に記載のアミノ酸Ａおよびその誘導体を調製するための、以下に説明する方法の要約を、後記の反応式２に示す。
(a)メチルエステル(７)の調製
室温のエーテル(２０ml)中のインドール-３-酢酸(６)(１.０７g、６.１１mモル)の撹拌懸濁液に、ジアゾメタンのエーテル溶液を滴下した。この滴下を、ジアゾメタンの黄色が反応混合物において残り、ｔｌｃ分析が出発物質の完全消費を示すまで行った。過剰のジアゾメタンをアルゴン流のもとで除去し、残存する溶媒を真空下に除去した。このようにして得た粗製の油をフラッシュカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の５０％エーテル)により精製して、純白ではない白色の固体としてメチルエステル(７)(１.１６g、１００％)を得た。
【数８】
HRMS (EI) C11H11O2Nに対する計算値：189.07898 ; 実測値：189.07866
元素分析 C11H11O2Nに対する計算値：C 69.83; H 5.86; N 7.40；実測値：C 69.47; H 5.91; N 7.50
【００６９】
(b)ジメチルエステル(８)の調製
アルゴン下の乾燥ＴＨＦ(１００ml)中のカリウム ビス(トリメチルシリル)アミド(４.９０g、２４.６mモル)の撹拌および冷却(−７８℃)懸濁液に、ＴＨＦ(３０ml＋２０ml洗浄)中のメチルエステル(７)(１.５７g、８.３１mモル)の溶液をカニューレから加えた。この反応混合物を０℃まで暖め、２時間撹拌し、次いで−７８℃まで再冷却した。新たに蒸留したヨウ化メチル(５.２ml、８２.８mモル)を加え、この混合物を０℃まで暖め、３時間またはｔｌｃ分析が反応の完結を示すまで撹拌を続けた。この反応を水(１００ml)により停止させ、次にエーテル(３×１００ml)で抽出し、一緒にした有機抽出液を食塩水(１００ml)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下に濃縮した。得られた粗製の油を、フラッシュカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の２５％エーテル)で精製して、粘稠な淡黄色の油としてメチルエステル(８)(１.６１g、８９％)を得た。
【数９】
HRMS (EI) C13H15O2Nに対する計算値：217.11028 ; 実測値：217.11013
元素分析 C13H15O2Nに対する計算値：C 71.87; H 6.96; N 6.45；実測値：C 71.52; H 6.80; N 6.26
【００７０】
(c)トリメチルエステル(９)の調製
アルゴン下の乾燥ＴＨＦ(６０ml)中のカリウム ビス(トリメチルシリル)アミド(２.９０g、１４.５mモル)の撹拌および冷却(−７８℃)懸濁液に、ＴＨＦ(３０ml＋２０ml洗浄)中のメチルエステル(８)(１.２５g、５.７６mモル)の溶液をカニューレから加えた。この反応混合物を０℃まで暖め、２時間撹拌し、次いで−７８℃まで再冷却した。新たに蒸留したヨウ化メチル(３.５ml、５７.６mモル)を加え、この混合物を０℃まで暖め、３時間またはｔｌｃ分析が反応の完結を示すまで撹拌を続けた。この反応を水(６０ml)により停止させ、次にエーテル(３×７５ml)で抽出し、一緒にした有機抽出液を食塩水(７５ml)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下に濃縮した。得られた粗製の油を、フラッシュカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の２０％エーテル)で精製して、純白ではない白色の固体としてメチルエステル(９)(１.２２g、９２％)を得た。
【数１０】
HRMS (EI) C14H17O2Nに対する計算値：231.12593 ; 実測値：231.12572
元素分析 C14H17O2Nに対する計算値：C 72.70; H 7.41; N 6.06；実測値：C 72.83; H 7.44; N 6.04
【００７１】
(d)アルコール(１０)の調製
アルゴン雰囲気下の乾燥エーテル(７０ml)中のメチルエステル(９)(１.３８g、５.９７mモル)の撹拌および冷却(−７８℃)溶液に、ＤＩＢＡＬ(１４.９ml、ヘキサン中１.０Ｍ、１４.９mモル)を加えた。得られた溶液を０℃まで暖め、３時間撹拌を続けた。この反応を水(３０ml)の添加によって停止させ、室温まで暖め、この時点でロシェレス(Rochelles)塩(３０ml)を加えた。有機層を分離し、水層をエーテル(２×５０ml)で抽出した。一緒にした有機抽出液を食塩水(５０ml)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下に濃縮した。この粗製の混合物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の５０％エーテル)で精製して、白色の固体としてアルコール(１０)(１.１４g、９４％)を得た。
【数１１】
HRMS (EI) C13H17ONに対する計算値：203.13101 ; 実測値：203.13052
元素分析 C13H17ONに対する計算値：C 76.81; H 8.43; N 6.89；実測値：C 76.89; H 8.43; N 6.70
【００７２】
(e)アルデヒド(１１)の調製
室温でアルゴン雰囲気下の乾燥ジクロロメタン(１２ml)中のアルコール(１０)(３６２mg、１.７８mモル)、４-メチルモルホリン Ｎ-オキシド(３７５mg、３.２１mモル)および４Ａ粉末モレキュラーシーブ(４００mg)の混合物に、固体ＴＰＡＰ(３５mg、０.０９９６mモル)を一度に加えた。得られた黒色の混合物を同温度で３時間撹拌し、次いでセライトで濾過してモレキュラーシーブを除去し、濾液を真空下に濃縮した。黒色の油をフラッシュカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の２０％エーテル)で精製して、純白ではない白色の固体としてアルデヒド(１１)(３１４mg、８８％)を得た。
【数１２】
HRMS (EI) C13H15ONに対する計算値：201.11537 ; 実測値：201.11473
元素分析 C13H15ONに対する計算値：C 77.58; H 7.51; N 6.96；実測値：C 77.42; H 7.58; N 6.83
【００７３】
(f)エノールエーテル(１２)の調製
室温(水浴)でアルゴン雰囲気下の乾燥ＴＨＦ(４０ml)中のメトキシメチルトリフェニルホスホニウムクロリド(３.０３g、８.８４mモル)の撹拌懸濁液に、固体のカリウムｔ-ブトキシド(９９１mg、８.８２mモル)を一度に加えた。この反応混合物は直ちに濃い赤色に変化した。水浴を取り去り、室温で１.５時間撹拌を続けた。アルデヒド(１１)(８２８mg、４.１２mモル)をＴＨＦ(１０ml＋５ml洗浄)中でカニューレにより添加し、さらに２時間撹拌を続けた。この反応混合物を水(３０ml)で希釈し、エーテル(３×４０ml)で抽出した。一緒にした有機抽出液を食塩水(６０ml)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下に濃縮した。この粗製の油を、フラッシュカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の５％エーテル)で精製して、シスおよびトランス異性体の４０：６０混合物(分離していない)として所望のエノールエーテル(１２)(８７３mg、９２％)を得た。この混合物の純度を２００ＭＨzのＮＭＲでチェックし、さらに特性を調べることなくこの混合物を次の工程に使用した。
【数１３】
【００７４】
(g)アルデヒド(１３)の調製
室温でジオキサン(４０ml)および水(１０ml)中のエノールエーテル(１２)(８５４mg、３.７３mモル)の撹拌懸濁液に、ｐ-トルエンスルホン酸・一水和物(１００mg、０.５２６mモル)を加え、得られた混合物を６０℃に１６時間加熱した。次いで、この反応混合物を水(４０ml)で希釈し、エーテル(３×５０ml)で抽出した。一緒にした有機抽出液を食塩水(７５ml)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下に濃縮した。この粗製の油を、フラッシュカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の２０％エーテル)で精製して、純白ではない白色の固体として所望のアルデヒド(１３)(６９６.２mg、８６％)を得た。
【数１４】
HRMS (EI) C14H17ONに対する計算値：215.13101 ; 実測値：215.13103
元素分析 C14H17ONに対する計算値：C 78.10; H 7.96; N 6.51；実測値：C 78.22; H 7.98; N 6.41
【００７５】
(h)酸(１４)の調製
室温でｔ-ブチルアルコール(６ml)中のアルデヒド(１３)(２３４mg、１.０９mモル)の溶液に２-メチル-２-ブテン(８.０ml、ＴＨＦ中２.０Ｍ、１６.３mモル)を加えた。得られた溶液に、亜塩素酸ナトリウム(１４８mg、１.６３mモル)およびリン酸水素ナトリウム(６００mg、４.３６mモル)の水(６ml)溶液を加えた。得られた溶液を室温で２０分間撹拌し、次いで水(１０ml)で希釈し、希塩酸によりｐＨ１〜２に酸性化し、酢酸エチル(３×２５ml)で抽出した。一緒にした有機抽出物を真空下に濃縮し、痕跡量の水をトルエンとの共沸蒸留によって除去した。得られた粗製の混合物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の５０％エーテル＋１％酢酸)で精製して、純白ではない白色の固体として酸(１４)を得た。
【数１５】
HRMS (EI) C14H17O2Nに対する計算値：231.12593 ; 実測値：231.12586
【００７６】
(i)側鎖化合物(１５)の調製
アルゴン下のＴＨＦ(２０ml)中の酸(１４)(２６９mg、１.１６mモル)の撹拌および冷却(−７８℃)溶液に、トリエチルアミン(２４３μl、１.７５mモル)、続いてトリメチルアセチルクロリド(１５８μl、１.２８mモル)を加え、得られた混合物を０℃まで暖め、１時間撹拌し、次いで−７８℃まで再冷却した。第２のフラスコにおいて、ブチルリチウム(１.２７ml、ヘキサン中１.５３Ｍ、１.９３mモル)を、アルゴン雰囲気下のＴＨＦ(８ml)中の(４Ｓ)-(−)-４-イソプロピル-２-オキサゾリジノン(２５０mg、１.９４mモル)の撹拌および冷却(−７８℃)溶液に滴下し、得られたリチオ化オキサゾリジノンをカニューレにより反応フラスコに加えた。１時間撹拌を続け、次いで水(２０ml)を加え、反応混合物を室温まで暖め、この後にエーテル(３×３０ml)で抽出した。一緒にした有機抽出物を食塩水(３０ml)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下に濃縮した。この粗製の黄色油をフラッシュカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の４０％エーテル)で精製して、純白ではない白色の固体として所望の化合物(１５)(３１３mg、７８％)を得た。
【数１６】
【００７７】
(j)アジド(１６)の調製
アルゴン雰囲気下のＴＨＦ(３ml)中のオキサゾリジノン(１５)(８２.７mg、０.２４２mモル)の撹拌および冷却(−７８℃)溶液に、カリウム ビス(トリメチルシリル)アミド(０.７３ml、ＴＨＦ中０.４Ｍ、０.２９mモル)を加え、得られた溶液を−７８℃で１時間撹拌した。予め−７８℃まで冷却したＴＨＦ(２ml)中のトリイソプロピルスルホニルアジド(９７mg、０.３１５mモル)の溶液をカニューレから加え、１分後に氷酢酸(１００ml)を加えることによって反応を停止させ、４０℃(水浴)まで暖め、さらに１時間撹拌した。次いで、この反応混合物をジクロロメタン(１０ml)と希食塩水(１０ml)の間に分配し、層を分離した。水相をジクロロメタン(２×１０ml)で抽出し、一緒にした有機抽出物を炭酸水素ナトリウム(１０ml、飽和水溶液)、食塩水(１０ml)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下に濃縮した。得られた粗製の油をフラッシュカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の３０％エーテル)で精製して、所望の化合物(１６)とトリイソプロピルスルホニルアミンの混合物(合計５６.７mg、分離不能、所望の化合物４５mgと概算、約５０％)を得た。
【数１７】
【００７８】
(k)Ｂoc-側鎖化合物(１７)の調製
酢酸エチル(４ml)中のアジド(１６)(５８mg、半粗製、＜０.１５２mモル)、１０％パラジウム／炭素(３０mg)およびジ-ｔ-ブチルジカーボネート(６６mg、０.３０４mモル)の混合物にアルゴン、次いで水素を通気し、水素バルーン下に室温で１６時間撹拌した。パラジウムをセライト濾過によって除去し、溶媒を真空下に除去し、この粗製の混合物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の５０％エーテル)で精製して、所望の化合物(１７)(２１.８mg、＜５０％)を得た。
【数１８】
【００７９】
(l)(１７)のメチルエステルの調製
０℃でＴＨＦ(１ml)および水(０.３ml)中の(１７)(１３mg、０.０２８５mモル)の溶液に、固体の水酸化リチウム(８mg、過剰)を一度に加えた。得られた懸濁液を室温で１６時間撹拌し、次いで１Ｎ塩酸で酸性化し、溶媒を真空下に除去した。得られた粗製の白色固体をエーテルに懸濁させ、ジアゾメタンのエーテル溶液を添加した。この添加を、ジアゾメタンの黄色が反応混合物において残り、ｔｌｃ分析が出発物質の完全消費を示すまで行った。過剰のジアゾメタンをアルゴン流のもとで除去し、残存する溶媒を真空下に除去した。得られた粗製の油をフラッシュカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の４０％エーテル)で精製して、所望の化合物である(１７)のメチルエステル(７.７mg、７５％)を得た。
【数１９】
【００８０】
(m)(１７)のメチルエステルへの別経路
上記の２つの工程を逆転させても、同じ化合物を同等の収率で合成することができる。
【００８１】
(n)メチル化したメチルエステルの調製
アルゴン雰囲気下の乾燥ＴＨＦ(０.５ml)中の水素化ナトリウム(過剰)およびヨウ化メチル(過剰)の懸濁液に、ＴＨＦ(１ml)中の(１７)のメチルエステル(１０.４mg、０.０２８９mモル)をカニューレから加え、得られた混合物を室温で１６時間撹拌した。水を加え、この混合物をエーテルで抽出し、一緒にした有機抽出液を食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下に濃縮した。この粗製の油を、フラッシュカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の４０％エーテル)で精製して、無色の油として所望のＮ-メチル化メチルエステル(３.１mg、約３０％)を得た。
【数２０】
【００８２】
(o)(１８)の調製
工程(l)の方法に従ったが、ジアゾメタンによるエステル化は削除した。
【００８３】
(p)(１９)の調製
Ｎ-Ｂoc-アミン酸(１８)(１０mモル)およびヨウ化メチル(５ml、８０mモル)をＴＨＦ(３０ml)に溶解し、この溶液をアルゴン下に０℃まで冷却した。水素化ナトリウム分散液(１.３２g、３０mモル)を穏やかに撹拌しながら慎重に添加した。この懸濁液を室温で１６時間撹拌した。次いで、酢酸エチル(５０ml)を加え(過剰の水素化ナトリウムから生成した水酸化ナトリウムを消費するため)、続いて水を滴下して過剰の水素化ナトリウムを破壊した。この溶液を蒸発乾固し、油状の残留物をエーテル(３０ml)と水(１００ml)の間に分配した。このエーテル層を５％ ＮaＨＣＯ３水溶液(５０ml)で洗浄し、一緒にした水性抽出物をクエン酸水溶液でｐＨ３に酸性化した。この生成物を酢酸エチル(３×２５ml)中に抽出し、この抽出物を水(２×２５ml)、５％チオ硫酸ナトリウム水溶液(２×２５ml；ヨウ素を除去するため)および水(２×２５ml)で洗浄し、ＭgＳＯ４で乾燥し、蒸発させて淡黄色油の(１９)を得た。
【００８４】
３．アミノ酸のカップリング
Ｎ-Ｂocアミノ酸(１９)(１mモル)、部分Ｂのアミノ酸メチルエステル(１.１mモル)およびカップリング剤ｐｙ-ＢＯＰ(１.１mモル)をアルゴン下にＣＨ２Ｃl２(１０ml)に溶解した。ＴＩＥＡ(３mモル)を加え、この反応液を室温で１時間撹拌した。過剰の溶媒を真空下に除去し、黄色の油状残留物を得た。この残留物をＥtＯＡc(５０ml)に再溶解した。このＥtＯＡc溶液を１０％クエン酸(２×２５ml)、水(２５ml)、５％ ＮaＨＣＯ３(２×２５ml)、水(２５ml)で洗浄し、次いで無水ＭgＳＯ４で乾燥し、通常相のシリカゲルクロマトグラフィーで処理して、白色の無定形固体として保護されたペプチドＡ-Ｂを得た。
Ｃのアミノ酸部分(５)へのペプチドＡ-Ｂのカップリングを同様の方法で行った。
【００８５】
【化２６】
【００８６】
【化２７】
【化２８】
【００８７】
化合物の試験
１．本明細書中に記載した化合物の細胞毒性を文献[J.Immunol.Methods, 65, 55-63, 1983]のように試験し、結果を以下の表４に示した。表中、Ｐ３８８はネズミ白血病Ｐ３８８に対するインビトロ試験を意味し、Ｕ３７３はヒトグリア芽腫／星細胞腫Ｕ３７３に対するインビトロ試験を意味し、ＨＥＹはヒト卵巣癌ＨＥＹに対するインビトロ試験を意味し、ＭＣＦ７はヒト胸癌ＭＣＦ７に対するインビトロ試験を意味する。
【００８８】
２．ＮＩＨ刊行物Ｎo.84-2635、「インビボ癌モデル」[Developmental Therapeutic Program, Division of Cancer Treatment, National Cancer Institute, Bethesda, Maryland]に記載されているインビボ試験において、ヘミアスターリンは細胞毒性であることがわかった。１×１０６個のＰ３８８白血病細胞を注射したマウスにおいて、ヘミアスターリンは、移植の２４時間後に開始した０.４５μgの５日間の毎日投与の後に２２３の％ＴＣの結果を与えた。この実験中に数匹の長期生存動物が存在した。
【００８９】
【表４】
【表５】
【００９０】
３．本明細書中に記載した化合物について、ヒト乳癌ＭＣＦ７細胞に対する抗有糸分裂活性を比較して試験した。
１５％ウシ胎児血清および抗生物質を追加したＲＰＭＩ中、湿度調節した１０％ＣＯ２下に３７℃で、ＭＣＦ７細胞を単層として増殖させた。全ての化合物をジメチルスルホキシドに溶解したが、ビンブラスチン(既知の薬物)については生理食塩水中の１mg／ml溶液とした。指数増殖しているＭＣＦ７細胞を異なる薬物濃度で２０時間処理し、染色体展開物(スプレッド)を調製し、有糸分裂細胞の割合(％)を蛍光顕微鏡で測定した。これらの結果を図１および図２に示す。ヘミアスターリン、ヘミアスターリンＡおよび修飾した化合物は、極めて強力な抗有糸分裂剤であり、それぞれ０.３nＭおよび３nＭのＩＣ５０値を有していた。ヘミアスターリンおよびヘミアスターリンＡは、タキソール(Taxol)、ビンブラスチン(Vinblastine)およびノコダゾール(Nocodazole)(全て既知の薬物である)よりも強力であった。
【００９１】
有糸分裂紡錘体の形態に対するヘミアスターリンおよびヘミアスターリンＡの効果を、蛍光ＤＮＡ染料ビスベンズイミドを用いる染色体分布およびβ-チューブリンに対するモノクローナル抗体を用いる間接免疫蛍光によって調べた。ヘミアスターリンＡが２nＭで存在すると、完全に正常な紡錘体は観察されなかった。一部の細胞は比較的小さな異常を示し、双極紡錘体は存在したが、星状体微小管は正常のものよりかなり長く、染色体は中期板に完全に拘束されなかった。大部分の細胞は複数の星状体を持ち、染色体が球状体中に分配された。タキソール、ビンブラスチンおよびノコダゾールの半-最大濃度が、ヘミアスターリンＡと同じ種類の異常紡錘体を生じた。ＭＣＦ７細胞において最大の有糸分裂抑制を引き起こす最低濃度である１０nＭのヘミアスターリンＡは、有糸分裂細胞において微小管の解重合を引き起こした。また、これは高濃度のビンブラスチンおよびノコダゾールのときにもそのようであった。高濃度のタキソールは全く違った効果を持ち、有糸分裂細胞における極めて濃密な複数星状体および間期細胞における細胞質微小管の束化を引き起こした。
【００９２】
これらの結果は、ヘミアスターリンが有糸分裂抑制を引き起こし、異常な有糸分裂紡錘体を生じることを示すものである。これらを、有糸分裂において細胞のブロックを必要とする方法において、例えば、核型分析のための有糸分裂展開物の調製において、他の抗有糸分裂薬物の代わりに用いることができる。また、これらを、有糸分裂細胞における微小管の機能を探るために用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】ヘミアスターリンと既知の抗有糸分裂剤の抗有糸分裂活性を比較するグラフである。
【図２】化学修飾したヘミアスターリンの抗有糸分裂活性を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な生物学的に活性な化合物および組成物、これらの使用および誘導に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、海綿からの新規な生物学的に活性な化合物の抽出を包含する。
【０００３】
他に記すことがなければ、本明細書中において、全てのアルキル基は、８個まで、特に６個まで、最も好ましくは４個までの炭素原子を持ち、直鎖または可能であれば分岐鎖の構造を持つものであってよい。通常は、メチルが好ましいアルキル基である。ハロゲン原子は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素であってよい。好ましいアシル基は、アルキルカルボニル、特にアセチルである。
【０００４】
他に記すことがなければ、本明細書中において、アルキル基の所望による置換基には、ハロゲン原子、例えばフッ素、塩素、臭素およびヨウ素原子、ならびに、ニトロ、シアノ、アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、スルフィニル、アルキルスルフィニル、スルホニル、アルキルスルホニル、アミド、アルキルアミド、アルコキシカルボニル、ハロアルコキシカルボニルおよびハロアルキル基が含まれる。好ましくは、所望により置換されたアルキル基は未置換である。
【０００５】
他に記すことがなければ、本明細書中において、化合物についての記述は、これら化合物に付与された構造式の範囲内で可能な全ての可能な異性体(特に、幾何および光学異性体)を意味する。他に記すことがなければ、定義は、異性体の混合物(ラセミ混合物を含む)および個々の異性体(分割可能であるとき)を包含するものとみなすべきである。
【０００６】
他に記すことがなければ、本明細書中における化合物の定義は、化合物の全ての可能な塩を包含するものとみなすべきである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、新規な生物学的に活性な化合物および組成物、これらの使用および誘導を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１の態様に係る化合物は、驚くべきことに、インビボでの癌治療に有効であることがわかった。
本発明の１つの態様によれば、後記の一般式Ｉで示されるヘミアスターリン(hemiasterlin)化合物が提供される。
本発明の別の態様によれば、後記の一般式IVで示されるゲオディアモリド(geodiamolide)化合物が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の第１の態様は、治療に使用する薬物を製造するための、以下の一般式で示されるヘミアスターリン(hemiasterlin)化合物の使用を提供する：
【化１】
[式中、Ｒ１およびＲ７０は、独立して、水素原子または所望により置換されたアルキルもしくはアシル基であり；
Ｒ２は、水素原子または所望により置換されたアルキルもしくはアシル基であるか、または、Ｒ６が以下で説明する−ＣＨ＝基であるときには存在せず；
Ｒ７３は、水素原子または所望による置換基であるか、または、Ｒ６が以下で説明する−ＣＨ＝基またはメチレン基であるときには存在せず；
Ｙは、所望による置換基であり；
ｎは、０、１、２、３または４であり；
Ｒ３は、水素原子または所望により置換されたアルキル基であり；
Ｒ７４は、水素原子、ヒドロキシ基、または所望により置換されたアルキルもしくはアシル基であり；
Ｒ７は、水素原子またはアルキル基であり；
Ｒ７５は、所望により置換されたアルキル基であり；そして
(ｉ)Ｒ６およびＲ７１が、独立して、水素原子または所望により置換されたアルキルもしくはアシル基であり；そして
Ｒ７２が水素原子であるか；または
(ii)Ｒ７１が水素原子または所望により置換されたアルキルもしくはアシル基であり、Ｒ７２が水素原子であるか、または、Ｒ７１およびＲ７２のそれぞれがラジカルであってそれらが結合している炭素原子間で二重結合が形成されており；そして
Ｒ６がインドール部分に結合した所望により置換されたメチレン基であって、三環式部分を形成しているか；または
Ｒ６がインドール部分に結合した所望により置換された−ＣＨ＝基であって、芳香族の三環式部分を形成している]。
【００１０】
好ましくは、Ｒ１は水素原子またはアルキル基、特にメチル基である。より好ましくは、Ｒ１は水素原子である。
Ｒ２は水素原子またはアシル基であるのが適当である。アシル基はベンゾイル基であってもよいが、好ましくはアルキルカルボニル基である。特に好ましいアシル基はアセチル基である。好ましくは、Ｒ２は水素原子である。
Ｙおよび／またはＲ７３が所望による置換基である場合、これら置換基は、ハロゲン、特にフッ素、塩素、臭素およびヨウ素原子、ならびに、アルキル、アシル、−ＯＨ、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アシル、−ＮＨ２、−ＮＨ−アルキル、−Ｎ(アルキル)２、−ＮＨ−アシル、−ＮＯ２、−ＳＨ、−Ｓ−アルキルおよび−Ｓ−アシル(ここで、これら置換基のアルキルおよびアシル基は所望により置換されている)から独立して選択することができる。
Ｙおよび／またはＲ７３で示される所望による置換基は、アルキル基であるのが好ましい。
【００１１】
好ましくは、Ｒ７３は水素原子である。
好ましくは、ｎは０、１または２である。より好ましくは、ｎは０である。
Ｒ３はアルキル基であるのが適当である。好ましくは、Ｒ３はＣ３−６、特にＣ３−４の分岐アルキル基、例えばｔ-ブチルまたはイソプロピルである。
Ｒ７４は水素原子またはメチル基、特に水素原子であるのが適当である。
Ｒ７はアルキル基であるのが適当であり、好ましくはメチル基である。
好ましくは、Ｒ６は水素原子または所望により置換されたアルキル基、または三環式部分を形成するようにインドール部分と結合しているメチレン基である。より好ましくは、Ｒ６はアルキル基である。
好ましくは、Ｒ７１は独立して水素原子または所望により置換されたアルキルもしくはアシル基である。より好ましくは、Ｒ７１はアルキル基、特にメチル基である。
好ましくは、Ｒ６およびＲ７１は、上記(ｉ)に記載した通りである。
【００１２】
Ｒ７５は、以下の一般式で示される基であってよい：
【化２】
[式中、Ｑは、所望により置換された−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨＣＨ−、−ＣＨ２Ｃ.Ｃ.−またはフェニレン基であり；
Ｘは、−ＯＲ８、−ＳＲ８または−ＮＲ９Ｒ１０基である(ここで、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は独立して水素原子または所望により置換されたアルキル基である)]。
【００１３】
Ｑが上記の所望により置換された非環式基のいずれかであるときには、この基は１またはそれ以上のアルキル基で置換されていてもよい。フェニレン基は、１またはそれ以上の上記の置換基Ｙで置換されていてもよい。
Ｘが−ＯＲ８基であるときには、適当なＲ８は水素原子またはメチル基である。好ましくは、Ｒ８は水素原子である。
Ｘが−ＮＲ９Ｒ１０基であるときには、適当なＲ９は水素原子またはアルキル基(例えば、メチル基)であり、Ｒ１０は置換されたアルキル基である。
Ｒ１０が置換されたアルキル基であるときには、該基は、一般式：−ＣＨＲ２１ＣＯＯＨ(式中、Ｒ２１は所望により置換されたアルキル基である)で示される基であるのが好ましい。好ましくは、Ｒ２１は少なくとも１個の窒素原子を含有する基である。好ましくは、Ｒ２１は、一般式：−(ＣＨ２)ｘＮＲ２２Ｒ２３(式中、ｘは好ましくは１〜４の範囲内の整数であり、Ｒ２２およびＲ２３は独立して水素原子または所望により置換されたアルキル、アルケニルもしくはイミン基である)で示される基である。好ましくは、Ｒ２２は水素原子であり、Ｒ２３はイミン基：−Ｃ(ＮＨ)ＮＨ２である。
好ましくは、Ｘは、−ＯＲ８基である(ここで、Ｒ８は水素原子である)。
【００１４】
好ましくは、Ｒ７５は、以下の一般式で示される基である：
【化３】
[式中、Ｒ４およびＲ５は、独立して水素原子または所望により置換されたアルキル基であり；
Ｒ７６およびＲ７７は、それぞれ水素原子またはラジカル(従って、これらが結合している炭素原子間で二重結合が形成される)であり；
Ｘは上記の通りである]。
【００１５】
一般式Ｉで示される化合物が、有糸分裂抑制および異常な有糸分裂紡錘体の生成を引き起こしうることを発見した。従って、本発明は、第２の態様において、抗有糸分裂化合物としての一般式Ｉの化合物の使用を包含する。
この化合物を、例えば、有糸分裂細胞における微小管機能のプローブおよび核型分析のための有糸分裂展開物の調製などの、有糸分裂において細胞のブロックを必要とする方法における抗有糸分裂化合物として、インビボまたはインビトロで使用することができる。
【００１６】
第３の態様において、本発明は、本明細書中に記載した一般式Ｉで示される新規化合物を提供するものであるが、一般式ＩにおいてＲ１がメチルであり、Ｒ２が水素であり、Ｒ７０がメチルであり、Ｒ７１がメチルであり、Ｒ７３が水素であり、ｎが０であり、Ｒ３がｔ-ブチルであり、Ｒ７４が水素であり、Ｒ６がメチルであり、Ｒ７がメチルであり、Ｒ７２が水素であり、そして、Ｒ７５が−ＣＨ(ＣＨ(ＣＨ３)２)ＣＨ.ＣＣＨ３.ＣＯＯＨである１つの化合物は除外する。この除外した化合物はヘミアスターリンである。
【００１７】
好ましくは、Ｒ１がメチル基である化合物を除外した本明細書中に記載の一般式Ｉの化合物が提供される。
好ましくは、Ｒ２が水素原子である化合物を除外した本明細書中に記載の一般式Ｉの化合物が提供される。
【００１８】
好ましい新規化合物の１つの群には、一般式Ｉで示されるヘミアスターリン(hemiasterlin)であって、
Ｒ１が水素原子であり；
Ｒ２が水素原子、アルキル基またはアシル基であり；
Ｒ３が水素原子または所望により置換されたアルキル基であり；
ｎが０であり；
Ｒ７０およびＲ７１が独立して水素原子または所望により置換されたアルキル基であり、好ましくはそれぞれがメチル基であり；
Ｒ７２、Ｒ７３およびＲ７４が水素原子であり；
Ｒ７が水素原子またはアルキル基であり；
Ｒ６が水素原子または所望により置換されたアルキル基であるか、またはインドール部分に結合したメチレン基であって三環式部分を形成しており；
Ｒ７５が上記一般式III[式中、Ｒ４は水素原子または所望により置換されたアルキル基であり；Ｒ５は水素原子またはアルキル基であり；Ｒ７６およびＲ７７は記載した通りのラジカルであり；Ｘは−ＯＲ８基または−ＮＲ９Ｒ１０基である(ここで、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は独立して水素原子または所望により置換されたアルキル基である)]で示される基である；
ヘミアスターリンが含まれる。
【００１９】
好ましい新規化合物の別の群には、一般式Ｉで示されるヘミアスターリンであって、
Ｒ１が水素原子またはアルキル基であり；
Ｒ２がアシル基であり；
Ｒ３が水素原子または所望により置換されたアルキル基であり；
ｎが０であり；
Ｒ７０およびＲ７１が独立して水素原子または所望により置換されたアルキル基であり、好ましくはそれぞれがメチル基であり；
Ｒ７２、Ｒ７３およびＲ７４が水素原子であり；
Ｒ７が水素原子またはアルキル基であり；
Ｒ６が水素原子または所望により置換されたアルキル基であるか、またはインドール部分に結合したメチレン基であって三環式部分を形成しており；
Ｒ７５が上記一般式III[式中、Ｒ４は水素原子または所望により置換されたアルキル基であり；Ｒ５は水素原子またはアルキル基であり；Ｒ７６およびＲ７７は記載した通りのラジカルであり；Ｘは−ＯＲ８基または−ＮＲ９Ｒ１０基である(ここで、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は独立して水素原子または所望により置換されたアルキル基である)]で示される基である；
ヘミアスターリンが含まれる。
【００２０】
好ましい新規化合物の別の群には、一般式Ｉで示されるクリアミド(criamide)であって、
Ｒ１が水素原子またはアルキル基であり；
Ｒ２が水素原子、アルキル基またはアシル基であり；
Ｒ３が水素原子または所望により置換されたアルキル基であり；
ｎが０であり；
Ｒ７０およびＲ７１が独立して水素原子または所望により置換されたアルキル基であり、好ましくはそれぞれがメチル基であり；
Ｒ７２、Ｒ７３およびＲ７４が水素原子であり；
Ｒ６が水素原子または所望により置換されたアルキル基であるか、またはインドール部分に結合したメチレン基であって三環式部分を形成しており；
Ｒ７５が上記一般式III[式中、Ｒ４は水素原子または所望により置換されたアルキル基であり；Ｒ５は水素原子またはアルキル基であり；Ｒ７６およびＲ７７は記載した通りのラジカルであり；Ｘは−ＮＲ９Ｒ１０基である(ここで、Ｒ９およびＲ１０は独立して水素原子または所望により置換されたアルキル基である)]で示される基である；
クリアミドが含まれる。
【００２１】
上記の式ＩおよびIIIにおいて、波線で示した結合は、光学中心であるかまたは光学中心になりうる炭素原子からのものである。
好ましくは、一般式Ｉで示される化合物においては、以下の光学立体配置が多い：
【化４】
【００２２】
本発明のさらに別の態様によれば、以下の一般式で示されるゲオディアモリド(geodiamolide)化合物が提供される：
【化５】
[式中、Ｒ５１はアルキル基であり；
Ｒ５２は水素原子またはアルキル基であり；
Ａはハロゲン原子である]。
好ましくは、Ｒ５１はメチル基である。
Ｒ５２は水素原子であるのが適当であるか、または好ましくはメチル基である。
Ａは塩素、臭素、または好ましくはヨウ素原子であるのが適当である。
【００２３】
上記の式IVにおいて、波線で示した結合は、水素原子であるＲ５１およびＲ５２基を保持する場合の炭素原子を除き、光学中心である炭素原子からのものである。好ましくは、以下の光学立体配置が多い。
【化６】
【００２４】
上に定義した一般式ＩおよびIVで示される化合物の一部は、海綿シンバステラ(Cymbastela)種[以前はシューダキシニッサ(Pseudaxinyssa)種と分類されていた]から得ることができるか、または、これから得られる化合物の誘導体化によって得ることができる。一般式Ｉで示される化合物の誘導体化には、抽出した化合物の通常のアシル化(所望により、通常のエステル化による)が含まれるであろう。また、一般式ＩおよびIVで示される化合物を、全合成経路により調製することもできる。
本発明は、治療に使用する薬物の製造のための一般式IVで示される化合物の使用を包含する。
【００２５】
一般式Ｉで示される化合物は、以下に示すアミノ酸部分Ａ、ＢおよびＣ：
【化７】
をカップリングさせることによって製造することができる。
このカップリング反応は、通常の方法で行ってよい。アミノ酸部分Ａ、ＢおよびＣは、通常の方法により、または後記実施例に記載した方法と同様の方法によって調製することができる。
【００２６】
一般式Ｉで示される化合物の一部を製造するための一般法の１つを以下に挙げる。
Ｒ７５が、
【化８】
である一般式Ｉで示される化合物は、一般式：
【化９】
で示される化合物を、一般式：
【化１０】
で示される化合物と反応させることによって調製することができる。
【００２７】
カップリング剤、例えばＮ,Ｎ'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(ＤＣＣ)をこの反応に用いるのが好都合である。この反応は、カップリング剤、塩基[トリエタノールアミン(ＴＥＡ)など]および有機溶媒(アセトニトリルなど)の存在下に低温で、化合物ＶとVIを接触させることからなるのが好都合である。一定時間の後に、無機塩基(例えば、水酸化ナトリウム)を加え、次いで温度を周囲温度まで上昇させ、トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)を加えてよい。次いで、一般式Ｉで示される所望の化合物を常法により単離することができる。
【００２８】
一般式VIで示される化合物は、一般式：
【化１１】
[式中、ＢＯＣ(ｔ-ブトキシカルボニル)は保護基である]
で示される化合物を、例えば、式：(Ｐh)３＝ＣＲ５ＣＯ２Ｒ８で示されるイリドと反応させることによって調製することができる。この反応は、ロイド(R.Lloyd)の博士論文(ケンブリッジ大学、1994年)に記載されているように、ＴＨＦ／水の１：１混合液中、炭酸カリウムの存在下に行うのが好都合である。保護基ＢＯＣは、ＴＦＡ中、周囲温度で約２時間の反応によって、必要なときに除去するのが好都合である。
【００２９】
一般式VIIで示される化合物は、一般式：
【化１２】
で示される化合物を、テトラヒドロフラン中で還元剤(例えば、水素化アルミニウムリチウム)と反応させることによって調製することができる。
【００３０】
一般式VIIIで示される化合物は、文献[Synthesis 1983, 676]に記載された方法を用いて、一般式：
【化１３】
で示される化合物から調製することができる。
【００３１】
一般式IXで示される化合物は、文献[Can.J.Chem. 1973, 51, 1915]に記載された方法を用いて、一般式：
【化１４】
で示される化合物から、ＴＨＦ中、水素化アルカリ金属の存在下、一般式：Ｒ７Ｉで示される化合物との反応によって調製することができる。
【００３２】
一般式Ｖで示される化合物は、一般式：
【化１５】
で示される化合物を、初めに塩基(例えば、希水酸化ナトリウム溶液)と反応させ、次いで約ｐＨ６まで酸性化することによって調製することができる。ある種の状況下では、−ＮＲ６Ｒ２基を反応から保護するのが望ましく、これを、ＢＯＣなどの保護剤を用いて行うのが好都合である。
【００３３】
一般式XIで示される化合物は、一般式：
【化１６】
で示される化合物を塩基と反応させ、次いでアジド化合物で処理することによって調製することができる。次いで、この化合物XIIのアジド誘導体を還元してアミン誘導体を得る。次いで、この化合物を塩基(例えば、水素化ナトリウム)の存在下にＲ６１および／またはＲ２１基で処理して、式XIで示される化合物中のＲ６Ｒ２Ｎ−基を生成させる。
【００３４】
一般式XIIで示される化合物は、一般式：
【化１７】
および
【化１８】
で示される化合物を、カップリング剤(ＤＣＣなど)および塩基(ＴＥＡなど)を用い、有機溶媒(アセトニトリルなど)中、好都合には約０℃でカップリングさせることによって調製することができる。
【００３５】
一般式XIIIで示される化合物は、当業者には周知の方法により、一般式：
【化１９】
で示される化合物から調製することができる。
一般式XIVおよびXVで示される化合物は、当業者には周知の方法によって調製することができる。
【００３６】
Ｒ７５が、
【化２０】
である一般式Ｉで示される化合物は、上記の一般式Ｉで示される化合物を、一般式：Ｒ９Ｒ１０ＮＨで示されるアミンと反応させることによって調製することができる。この反応は、カップリング剤(ＤＣＣなど)および塩基(ＴＥＡなど)の存在下に、有機溶媒(アセトニトリルなど)中、低温で行うのが好都合である。ある種の状況下では、−ＮＲ６Ｒ２基を所望ではない反応から保護することが必要になることもあり、これを、ＢＯＣなどの保護剤を用いて行うのが好都合である。
【００３７】
本発明の別の態様によれば、一般式Ｉで示される化合物を得る方法であって、シンバステラ(Cymbastela)種から一般式Ｉで示される化合物を抽出することによる方法が提供される。この方法は、分離および精製工程、ならびに該化合物を所望により誘導体化して、一般式Ｉの別化合物を得る工程を包含する。
一般式Ｉで示される化合物の誘導体化には、アシル化および／またはエステル化工程が含まれるであろう。エステル化および／またはアシル化工程は、通常の条件下で行ってよい。
【００３８】
本発明のさらに別の態様によれば、一般式IVで示される化合物を得る方法であって、シンバステラ種から一般式IVで示される化合物を抽出することによる方法が提供される。この方法は、分離および精製工程、ならびに該化合物を所望により誘導体化して、一般式IVの別化合物を得る工程を包含する。
【００３９】
一般式ＩおよびIVで示される化合物は生物学的に活性である。本発明は、一般式ＩまたはIVで示される化合物の生物学的使用にも関する。一般式ＩまたはIVで示される化合物は、殺虫活性、例えば殺昆虫活性を有しているであろう。しかし、この使用は、好ましくは獣医学分野であり、最も好ましくは医薬分野である。
本明細書中に記載した化合物は、特に抗細菌および／または抗ウイルス剤として、および／またはとりわけ細胞毒性剤としての用途を有しているであろう。
さらに本発明は、哺乳動物の癌または腫瘍の治療に使用する薬物の製造のための、一般式ＩまたはIVで示されるいずれかの化合物の使用を提供する。
【００４０】
本明細書中に記載した一般式ＩまたはIVで示される化合物を使用する際には、この化合物を、薬学的または獣医学的に許容しうる担体および所望による１またはそれ以上の他の生物学的に活性な成分をも含有する医薬または獣医学組成物として患者に投与するのが好ましい。このような組成物は、医薬物質を投与するために使用する任意の形態、例えば、経口、局所、腟、非経口、直腸および吸入で使用するのに適する任意の形態であってよい。これら組成物は、独立した投与単位で供してよい。担体は粒子状であってよく、組成物は、例えば錠剤、粉末または液体であり、組成物は、例えば経口シロップまたは注射用液体であるか、または吸入使用のためにガス状である。
【００４１】
経口投与のためには、賦形剤および／または結合剤が存在していてもよい。その例は、スクロース、カオリン、グリセリン、デンプンデキストリン、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースおよびエチルセルロースである。着色剤および／または香味剤が存在していてもよい。被覆入れ物を用いることもできる。直腸投与のためには、例えばラノリンまたはココアバターなどの油性基剤を用いることができる。注射用製剤のためには、緩衝剤、安定剤および等張剤を含有させることもできる。
【００４２】
一般式ＩおよびIVで示される化合物の投与量は、患者の体重および身体状態、病気の重篤度および期間、ならびに、活性成分の特定形態、投与方法および使用する組成物に依存するであろう。１日あたり約０.００１〜約１００mg／kg体重の投与量を、１日１回または数回(６回まで)で、または連続注入によって投与するのが、最も普通に要求される有効量である。好ましい範囲は、１日あたり約０.０１〜約５０mg／kg体重であり、最も好ましくは１日あたり約０.１〜約３０mg／kg体重である。
【００４３】
化学療法における一般式ＩまたはIVで示される化合物の使用には、腫瘍細胞への該化合物の供給を助ける物質(例えば、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、タンパク質またはリポソーム)に結合させた化合物が含まれうることを理解すべきである。
【００４４】
従って、本発明はさらに、担体と組合せて有効量の式ＩまたはIVで示される化合物を含有する医薬および獣医学組成物に関する。
【００４５】
以下において、図１および図２(抗有糸分裂活性に関するグラフである)を参照しながら、例示の目的で本発明をさらに詳しく説明する。
方法１：天然化合物の単離
シンバステラ種の試料を、ニューギニアのパプア島マンダン周辺の礁において、スキュバにより手で採取した。採取した新鮮な海綿をそこで凍結し、ドライアイスを詰めてカナダのバンクーバーに輸送した。先導的な海綿分類学の専門家であるバン・セスト(R.van Soest)教授がこの海綿を同定した。証拠試料を、アムステルダム大学のインスティテュト・ボア・システマトレク・エン・ポピュラティービオロジー-ズーロギッシュ・ミューゼウム(Institut voor Systematrek en Populatiebiologie-Zoologisch Museum)に寄託した。
【００４６】
解凍した海綿(２６０g、乾燥重量)を、ＣＨ２Ｃl２／ＭeＯＨ(１：１)溶液で徹底的に抽出した。真空下でこの有機抽出物を蒸発させて水性懸濁液を得た。ＭeＯＨを加えて９：１のＭeＯＨ：Ｈ２Ｏ溶液(１Ｌ)を得、これをヘキサン(４×２５０ml)で抽出した。このヘキサン抽出物を一緒にして真空下で濃縮してオレンジ色の油を得た。水をＭeＯＨ溶液に加えて１：１のＭeＯＨ／Ｈ２Ｏ溶液を得、これをＣＨＣl３(４×２５０ml)で抽出した。一緒にしたＣＨＣl３層を真空下に濃縮してオレンジ色の油(３.５g)を得た。ＭeＯＨで溶離するセファデックス(Sephadex)ＬＨ-２０によるサイズ排除クロマトグラフィーを繰返して、多数の粗製ゲオディアモリドおよびヘミアスターリンを得た。純粋なゲオディアモリドＧ(下記の化合物１；２mg、０.０００７％乾燥重量)を、逆相ＨＰＬＣ(ＭeＯＨ／Ｈ２Ｏ ６０：４０)によって得た。逆相イソクラティックＨＰＬＣ(０.０５％ＴＦＡ：ＭeＯＨ １：１)により、ヘミアスターリンＡ(下記の化合物２；３２mg、０.０１２％乾燥重量)およびヘミアスターリンＢ(下記の化合物３；１mg、０.０００４％乾燥重量)を得た。これらの化合物は新規である。また、ＴＦＡおよびＭeＯＨを用いる逆相イソクラティックＨＰＬＣは、既知の化合物であるヘミアスターリン(下記の化合物Ａ；４０mg、０.０１５％乾燥重量)を与えた。この化合物を用いて、後記の新規なアシル化およびエステル化した化合物を調製した。
【００４７】
ゲオディアモリドＧ(化合物１)：
無色ガラス状物質；
ＩＲ(そのまま)：3313、2977、2933、1732、1675、1635、1505、1455、1417、1377、1285、1217、1102、1083、1052、952、827、754cm-1；
ＮＭＲデータ：以下の表１；
ＨＲＥＩＭＳ：Ｍ＋ m/z 655.1760 (C28H38N3O7I ΔM 0.6mmu)
ヘミアスターリンＡ(化合物２)：
白色固体；
[α]D＝−４５°(c 0.25、MeOH)；
ＵＶ(MeOH)：λmax (ε) 218 (23,400)、280nm (2,800)；
ＩＲ(そのまま)：3418、2966、1689、1680、1643cm-1；
ＮＭＲデータ：以下の表２；
ＨＲＦＡＢＭＳ：ＭＨ＋ m/z 513.3471 (C29H45O4N4 ΔM 3.0mmu)
【００４８】
ヘミアスターリンＢ(化合物３)：
白色固体；
ＣＤ(MeOH)：(θ)226 10,800；
ＮＭＲデータ：以下の表２；
ＨＲＦＡＢＭＳ：ＭＨ＋ m/z 499.3319 (C28H43O4N4 ΔM 3.4mmu)
ヘミアスターリン(化合物Ａ)：
白色固体；
[α]D＝−７７°(c 0.07、MeOH)；
ＵＶ(MeOH)：λmax (ε) 216 (15,400)、273nm (1,600)；
ＩＲ(そのまま)：3412、2962、1650、1635cm-1；
ＮＭＲデータ：以下の表２；
ＨＲＦＡＢＭＳ：ＭＨ＋ m/z 527.3594 (C30H47O4N4 ΔM -0.35mmu)
【００４９】
生成物の同定(立体化学配置の帰属を含む)は、既知の化合物に対して文献に報告されている分析結果を参照しながら、一連の方法(ＮＭＲ、質量スペクトルおよび旋光度測定を含む)によって行った。化合物２および３の場合には、ＣＤおよび化学分解分析を行って立体化学の決定の助けとした。
【００５０】
【化２１】
化合物１
【００５１】
【化２２】
化合物２ Ｒ１ ＝ Ｒ２ ＝ Ｒ４ ＝ Ｈ 、 Ｒ８３ ＝ Ｍe
化合物３ Ｒ１ ＝ Ｒ２ ＝ Ｒ３ ＝ Ｒ８４ ＝ Ｈ
化合物Ａ Ｒ１ ＝ Ｒ８３ ＝ Ｍe 、 Ｒ２ ＝ Ｒ８４ ＝ Ｈ
【００５２】
【表１】
【００５３】
【表２】
【００５４】
別の例において、シンバシエラ(Cymbasyela)種の試料を、ニューギニアのパプア島マンダンの礁において、スキュバにより手で採取した。新鮮な海綿をそこで凍結し、ドライアイスを詰めてカナダのバンクーバーに輸送した。この凍結乾燥した海綿(１５７g、乾燥重量)を、ヘキサン、四塩化炭素、クロロホルムおよびメタノール(３×８Ｌ)で順次抽出した。これらの抽出物を真空下に濃縮して、各溶媒に対してそれぞれ６g、０.７６g、１.２４gおよび１.１gを得た。メタノールを用いてセファデックスＬＨ-２０により、クロロホルム抽出物のサイズ排除クロマトグラフィーを繰返して、粗製ヘミアスターリンおよびクリアミドの混合物を得た。逆相ＨＰＬＣ(５０：５０の０.０５％ＴＦＡ：ＭeＯＨ)により、純粋なヘミアスターリン(６０mg、０.０３８％乾燥重量)(上記の化合物Ａ)、ヘミアスターリンＡ(５５mg、０.０３５％乾燥重量)(上記の化合物２)、ヘミアスターリンＢ(３mg、０.００１９％乾燥重量)(上記の化合物３)、クリアミドＡ(２mg、０.００１３％乾燥重量)(下記の化合物６)、クリアミドＢ(２mg、０.００１３％乾燥重量)(下記の化合物７)を得た。
【００５５】
【化２３】
化合物６ Ｒ１ ＝ Ｍe
化合物７ Ｒ１ ＝ Ｈ
【００５６】
化合物６および７の生成物同定(立体化学配置の帰属を含む)は、他の試料について上記した一連の方法によって行った。ＮＭＲデータを以下の表３に示す。
【表３】
【００５７】
方法２：天然化合物の誘導体化
以下の化合物４および５を、それぞれ上記の化合物Ａおよび２から調製した。
【化２４】
化合物４ Ｒ１ ＝ Ｒ８３ ＝ Ｒ８４ ＝ Ｍe 、 Ｒ２ ＝ ＣＯＣＨ３
化合物５ Ｒ１ ＝ Ｈ 、 Ｒ２ ＝ ＣＯＣＨ３ 、 Ｒ８３ ＝ Ｒ８４ ＝ Ｍe
【００５８】
これら化合物は、初めに化合物Ａおよび２をそのメチルエステルに変換し、次いでこのエステルをアシル化することによって調製した。
化合物Ａおよび２のメチルエステルを調製するために、アルドリッチ(Aldrich)のＭＮＮＧ-ジアゾメタンキットを用いて１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン(ＭＮＮＧ)から常法によりジアゾメタンを調製した。得られた黄色のジアゾメタン溶液(３mlエーテル)を、クロロホルム(３ml)に溶解したペプチドＡまたは２(１mg)に加えた。この反応混合物を周囲温度で１時間放置し、次いで真空下に溶媒を除去した。
【００５９】
次いで、このエステル化したペプチドをアシル化するために、それぞれのエステル化ペプチド(約１mg)を、新たに蒸留(ＮaＯＨから)したピリジンおよび無水酢酸(各１.０ml)とともにアルゴン雰囲気下で一晩撹拌した。過剰の試薬を真空下に除去して、純粋なＮ-アセチルペプチドエステルである化合物４および５を得た。これら化合物は以下の特性を有する。
【００６０】
ヘミアスターリン、Ｎ-アセチルメチルエステル(化合物４)：
【数１】
【００６１】
ヘミアスターリンＡ、Ｎ-アセチルメチルエステル(化合物５)：
【数２】
【００６２】
方法３：全合成法
全合成法によって本明細書中に記載の化合物を調製する方法は、一般的に言うと、アミノ酸をカップリングさせることからなる。即ち、以下の式：
【化２５】
で示される化合物の調製は、単位Ａ、ＢおよびＣに対応するアミノ酸をカップリングさせることからなる。上に示した化合物の末端Ｃにカップリングして追加部分Ｄを含むクリアミド化合物は、所望の部分Ｄに対応するアミノ酸をペプチドＡ-Ｂ-Ｃにカップリングさせることによって調製することができる。
【００６３】
アミノ酸ＡおよびＣの調製を以下に説明する。アミノ酸Ｂは市販品から入手可能である。
１．アミノ酸Ｃ(Ｎ-メチルホモ ビニログ バリンエチルエステル)の調製
以下に説明する方法の要約を、後記の反応式１に示す。
(a)Ｎ-Ｂoc、Ｎ-Ｍe-Ｌ-バリン(１)の調製
Ｎ-Ｂoc-Ｌ-バリン(５g、２３mモル)およびヨウ化メチル(１.５９ml、２５.３mモル)をＴＨＦ(６５ml)に溶解し、この溶液をアルゴン下に０℃まで冷却した。穏やかに撹拌しながら、水素化ナトリウム分散液(２.０３g、５０.６mモル)を慎重に加えた。この懸濁液を室温で１６時間撹拌した。次いで、酢酸エチル(３０ml)を加え(過剰の水素化ナトリウムから生成した水酸化ナトリウムを消費するため)、続いて水を滴下して過剰の水素化ナトリウムを破壊した。この溶液を蒸発乾固し、油状の残留物をエーテル(２５ml)と水(５０ml)の間に分配した。このエーテル層を５％ ＮaＨＣＯ３水溶液(２５ml)で洗浄し、一緒にした水性抽出物をクエン酸水溶液でｐＨ３に酸性化した。この生成物を酢酸エチル(３×２５ml)中に抽出し、この抽出物を水(２×２５ml)、５％チオ硫酸ナトリウム水溶液(２×２５ml；ヨウ素を除去するため)および水(２×２５ml)で洗浄し、ＭgＳＯ４で乾燥し、蒸発させて黄色の油を得た。この方法を繰返して全体収量を改善した。最終の収量は３.５３g(７０.６％)であった。
【数３】
【００６４】
(b)Ｎ-Ｂoc、Ｎ-Ｍe-Ｌ-バリン-Ｎ-Ｍe、Ｎ-Ｏme[ヴァインレプ(Weinreb)アミド](２)の調製
Ｎ-Ｂoc、Ｎ-Ｍe-Ｌ-バリン(３.２g、１３.９mモル)、Ｎ,Ｏ-ジメチルヒドロキシルアミン・ＨＣl(１.５g、１５mモル)、およびトリエチルアミン(２.１ml、３０mモル)をＣＨ２Ｃl２(３０ml)に溶解し、この溶液をアルゴン下に−１０℃まで冷却した。ジシクロヘキシルカルビミド(３.１g、１５mモル)をＣＨ２Ｃl２(１５ml)に溶解し、１０分間で反応混合物に滴下した。この溶液を−１０℃でさらに１５分間撹拌し、次いで室温で１時間撹拌し、この時点で反応液を濾過し、過剰の溶媒を真空下に除去した。この油をＥtＯＡc(５０ml)に溶解し、５％ ＨＣl(２×２５ml)、水(２×２５ml)、５％ ＮaＨＣＯ３(２×２５ml)および水(２×２５ml)で洗浄し、ＭgＳＯ４で乾燥し、蒸発させて黄色の油(３.４g、８５％収率)を得た。
【数４】
Ｎ-Ｂoc基の周りの回転異性体によってピークの二重化が引き起こされた。
【００６５】
(c)Ｎ-Ｂoc、Ｎ-Ｍe-Ｌ-バリンアルデヒド(３)の調製
ヴァインレプアミド(２２６mg、０.７８mモル)をＴＨＦ(８ml)に溶解し、−７８℃まで冷却し、次いで、−７８℃のＴＨＦ中のＬiＡlＨ４(３５mg、０.８６mモル)の分散液に滴下した。この反応液を０.５時間撹拌した時点で、Ｎa２ＳＯ４・１０Ｈ２Ｏ(２５１mg、０.７８mモル)によって反応停止させ、室温まで暖めた。この溶液をセライトで濾過し、過剰の溶媒を真空下に除去して無色の油を得た。通常相のシリカゲルクロマトグラフィー(１：６の酢酸エチル：ヘキサンで溶離)により、透明な油として純粋なＮ-Ｂoc、Ｎ-Ｍe-Ｌ-バリンアルデヒド(１１６mg、６８％)を得た。
【数５】
【００６６】
(d)Ｎ-Ｂoc-ＭＨＶＶ-ＯＥt(４)の調製
Ｎ-Ｂoc、Ｎ-Ｍe-バリンアルデヒド(１２０mg、０.５６mモル)をＴＨＦ：Ｈ２Ｏの１：１混合物(６ml)に溶解し、(カルブエトキシエチリデン)トリフェニルホスファン(２２２mg、６.２mモル)を加え、この反応液を室温で４時間撹拌した。通常相のシリカゲルクロマトグラフィー(１：６の酢酸エチル：ヘキサンで溶離)により、透明な油としてＮ-Ｂoc-ホモ ビニログ バリンエチルエステル(２１２mg、７１％)を得た。
【数６】
【００６７】
(e)ＭＨＶＶ-ＯＥt(５)の調製
Ｎ-Ｂoc-ＭＨＶＶ-ＯＥt(２００mg、６７mモル)を１：１のＣＨ２Ｃl２：トリフルオロ酢酸混合液(１ml)に溶解し、アルゴン下に０.５時間撹拌した。過剰の溶媒を真空下に除去し、油状の残留物をＣＨ２Ｃl２(２５ml)に２回再溶解し、そして濃縮することによって、ＴＦＡの痕跡を除去した。最終生成物は白色無定形の固体であった(２０７mg、９９％)。
【数７】
【００６８】
２．アミノ酸Ａ(Ｎ-Ｂoc-テトラメチルトリプトファン誘導体)の調製
本明細書中に記載のアミノ酸Ａおよびその誘導体を調製するための、以下に説明する方法の要約を、後記の反応式２に示す。
(a)メチルエステル(７)の調製
室温のエーテル(２０ml)中のインドール-３-酢酸(６)(１.０７g、６.１１mモル)の撹拌懸濁液に、ジアゾメタンのエーテル溶液を滴下した。この滴下を、ジアゾメタンの黄色が反応混合物において残り、ｔｌｃ分析が出発物質の完全消費を示すまで行った。過剰のジアゾメタンをアルゴン流のもとで除去し、残存する溶媒を真空下に除去した。このようにして得た粗製の油をフラッシュカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の５０％エーテル)により精製して、純白ではない白色の固体としてメチルエステル(７)(１.１６g、１００％)を得た。
【数８】
HRMS (EI) C11H11O2Nに対する計算値：189.07898 ; 実測値：189.07866
元素分析 C11H11O2Nに対する計算値：C 69.83; H 5.86; N 7.40；実測値：C 69.47; H 5.91; N 7.50
【００６９】
(b)ジメチルエステル(８)の調製
アルゴン下の乾燥ＴＨＦ(１００ml)中のカリウム ビス(トリメチルシリル)アミド(４.９０g、２４.６mモル)の撹拌および冷却(−７８℃)懸濁液に、ＴＨＦ(３０ml＋２０ml洗浄)中のメチルエステル(７)(１.５７g、８.３１mモル)の溶液をカニューレから加えた。この反応混合物を０℃まで暖め、２時間撹拌し、次いで−７８℃まで再冷却した。新たに蒸留したヨウ化メチル(５.２ml、８２.８mモル)を加え、この混合物を０℃まで暖め、３時間またはｔｌｃ分析が反応の完結を示すまで撹拌を続けた。この反応を水(１００ml)により停止させ、次にエーテル(３×１００ml)で抽出し、一緒にした有機抽出液を食塩水(１００ml)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下に濃縮した。得られた粗製の油を、フラッシュカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の２５％エーテル)で精製して、粘稠な淡黄色の油としてメチルエステル(８)(１.６１g、８９％)を得た。
【数９】
HRMS (EI) C13H15O2Nに対する計算値：217.11028 ; 実測値：217.11013
元素分析 C13H15O2Nに対する計算値：C 71.87; H 6.96; N 6.45；実測値：C 71.52; H 6.80; N 6.26
【００７０】
(c)トリメチルエステル(９)の調製
アルゴン下の乾燥ＴＨＦ(６０ml)中のカリウム ビス(トリメチルシリル)アミド(２.９０g、１４.５mモル)の撹拌および冷却(−７８℃)懸濁液に、ＴＨＦ(３０ml＋２０ml洗浄)中のメチルエステル(８)(１.２５g、５.７６mモル)の溶液をカニューレから加えた。この反応混合物を０℃まで暖め、２時間撹拌し、次いで−７８℃まで再冷却した。新たに蒸留したヨウ化メチル(３.５ml、５７.６mモル)を加え、この混合物を０℃まで暖め、３時間またはｔｌｃ分析が反応の完結を示すまで撹拌を続けた。この反応を水(６０ml)により停止させ、次にエーテル(３×７５ml)で抽出し、一緒にした有機抽出液を食塩水(７５ml)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下に濃縮した。得られた粗製の油を、フラッシュカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の２０％エーテル)で精製して、純白ではない白色の固体としてメチルエステル(９)(１.２２g、９２％)を得た。
【数１０】
HRMS (EI) C14H17O2Nに対する計算値：231.12593 ; 実測値：231.12572
元素分析 C14H17O2Nに対する計算値：C 72.70; H 7.41; N 6.06；実測値：C 72.83; H 7.44; N 6.04
【００７１】
(d)アルコール(１０)の調製
アルゴン雰囲気下の乾燥エーテル(７０ml)中のメチルエステル(９)(１.３８g、５.９７mモル)の撹拌および冷却(−７８℃)溶液に、ＤＩＢＡＬ(１４.９ml、ヘキサン中１.０Ｍ、１４.９mモル)を加えた。得られた溶液を０℃まで暖め、３時間撹拌を続けた。この反応を水(３０ml)の添加によって停止させ、室温まで暖め、この時点でロシェレス(Rochelles)塩(３０ml)を加えた。有機層を分離し、水層をエーテル(２×５０ml)で抽出した。一緒にした有機抽出液を食塩水(５０ml)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下に濃縮した。この粗製の混合物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の５０％エーテル)で精製して、白色の固体としてアルコール(１０)(１.１４g、９４％)を得た。
【数１１】
HRMS (EI) C13H17ONに対する計算値：203.13101 ; 実測値：203.13052
元素分析 C13H17ONに対する計算値：C 76.81; H 8.43; N 6.89；実測値：C 76.89; H 8.43; N 6.70
【００７２】
(e)アルデヒド(１１)の調製
室温でアルゴン雰囲気下の乾燥ジクロロメタン(１２ml)中のアルコール(１０)(３６２mg、１.７８mモル)、４-メチルモルホリン Ｎ-オキシド(３７５mg、３.２１mモル)および４Ａ粉末モレキュラーシーブ(４００mg)の混合物に、固体ＴＰＡＰ(３５mg、０.０９９６mモル)を一度に加えた。得られた黒色の混合物を同温度で３時間撹拌し、次いでセライトで濾過してモレキュラーシーブを除去し、濾液を真空下に濃縮した。黒色の油をフラッシュカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の２０％エーテル)で精製して、純白ではない白色の固体としてアルデヒド(１１)(３１４mg、８８％)を得た。
【数１２】
HRMS (EI) C13H15ONに対する計算値：201.11537 ; 実測値：201.11473
元素分析 C13H15ONに対する計算値：C 77.58; H 7.51; N 6.96；実測値：C 77.42; H 7.58; N 6.83
【００７３】
(f)エノールエーテル(１２)の調製
室温(水浴)でアルゴン雰囲気下の乾燥ＴＨＦ(４０ml)中のメトキシメチルトリフェニルホスホニウムクロリド(３.０３g、８.８４mモル)の撹拌懸濁液に、固体のカリウムｔ-ブトキシド(９９１mg、８.８２mモル)を一度に加えた。この反応混合物は直ちに濃い赤色に変化した。水浴を取り去り、室温で１.５時間撹拌を続けた。アルデヒド(１１)(８２８mg、４.１２mモル)をＴＨＦ(１０ml＋５ml洗浄)中でカニューレにより添加し、さらに２時間撹拌を続けた。この反応混合物を水(３０ml)で希釈し、エーテル(３×４０ml)で抽出した。一緒にした有機抽出液を食塩水(６０ml)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下に濃縮した。この粗製の油を、フラッシュカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の５％エーテル)で精製して、シスおよびトランス異性体の４０：６０混合物(分離していない)として所望のエノールエーテル(１２)(８７３mg、９２％)を得た。この混合物の純度を２００ＭＨzのＮＭＲでチェックし、さらに特性を調べることなくこの混合物を次の工程に使用した。
【数１３】
【００７４】
(g)アルデヒド(１３)の調製
室温でジオキサン(４０ml)および水(１０ml)中のエノールエーテル(１２)(８５４mg、３.７３mモル)の撹拌懸濁液に、ｐ-トルエンスルホン酸・一水和物(１００mg、０.５２６mモル)を加え、得られた混合物を６０℃に１６時間加熱した。次いで、この反応混合物を水(４０ml)で希釈し、エーテル(３×５０ml)で抽出した。一緒にした有機抽出液を食塩水(７５ml)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下に濃縮した。この粗製の油を、フラッシュカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の２０％エーテル)で精製して、純白ではない白色の固体として所望のアルデヒド(１３)(６９６.２mg、８６％)を得た。
【数１４】
HRMS (EI) C14H17ONに対する計算値：215.13101 ; 実測値：215.13103
元素分析 C14H17ONに対する計算値：C 78.10; H 7.96; N 6.51；実測値：C 78.22; H 7.98; N 6.41
【００７５】
(h)酸(１４)の調製
室温でｔ-ブチルアルコール(６ml)中のアルデヒド(１３)(２３４mg、１.０９mモル)の溶液に２-メチル-２-ブテン(８.０ml、ＴＨＦ中２.０Ｍ、１６.３mモル)を加えた。得られた溶液に、亜塩素酸ナトリウム(１４８mg、１.６３mモル)およびリン酸水素ナトリウム(６００mg、４.３６mモル)の水(６ml)溶液を加えた。得られた溶液を室温で２０分間撹拌し、次いで水(１０ml)で希釈し、希塩酸によりｐＨ１〜２に酸性化し、酢酸エチル(３×２５ml)で抽出した。一緒にした有機抽出物を真空下に濃縮し、痕跡量の水をトルエンとの共沸蒸留によって除去した。得られた粗製の混合物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の５０％エーテル＋１％酢酸)で精製して、純白ではない白色の固体として酸(１４)を得た。
【数１５】
HRMS (EI) C14H17O2Nに対する計算値：231.12593 ; 実測値：231.12586
【００７６】
(i)側鎖化合物(１５)の調製
アルゴン下のＴＨＦ(２０ml)中の酸(１４)(２６９mg、１.１６mモル)の撹拌および冷却(−７８℃)溶液に、トリエチルアミン(２４３μl、１.７５mモル)、続いてトリメチルアセチルクロリド(１５８μl、１.２８mモル)を加え、得られた混合物を０℃まで暖め、１時間撹拌し、次いで−７８℃まで再冷却した。第２のフラスコにおいて、ブチルリチウム(１.２７ml、ヘキサン中１.５３Ｍ、１.９３mモル)を、アルゴン雰囲気下のＴＨＦ(８ml)中の(４Ｓ)-(−)-４-イソプロピル-２-オキサゾリジノン(２５０mg、１.９４mモル)の撹拌および冷却(−７８℃)溶液に滴下し、得られたリチオ化オキサゾリジノンをカニューレにより反応フラスコに加えた。１時間撹拌を続け、次いで水(２０ml)を加え、反応混合物を室温まで暖め、この後にエーテル(３×３０ml)で抽出した。一緒にした有機抽出物を食塩水(３０ml)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下に濃縮した。この粗製の黄色油をフラッシュカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の４０％エーテル)で精製して、純白ではない白色の固体として所望の化合物(１５)(３１３mg、７８％)を得た。
【数１６】
【００７７】
(j)アジド(１６)の調製
アルゴン雰囲気下のＴＨＦ(３ml)中のオキサゾリジノン(１５)(８２.７mg、０.２４２mモル)の撹拌および冷却(−７８℃)溶液に、カリウム ビス(トリメチルシリル)アミド(０.７３ml、ＴＨＦ中０.４Ｍ、０.２９mモル)を加え、得られた溶液を−７８℃で１時間撹拌した。予め−７８℃まで冷却したＴＨＦ(２ml)中のトリイソプロピルスルホニルアジド(９７mg、０.３１５mモル)の溶液をカニューレから加え、１分後に氷酢酸(１００ml)を加えることによって反応を停止させ、４０℃(水浴)まで暖め、さらに１時間撹拌した。次いで、この反応混合物をジクロロメタン(１０ml)と希食塩水(１０ml)の間に分配し、層を分離した。水相をジクロロメタン(２×１０ml)で抽出し、一緒にした有機抽出物を炭酸水素ナトリウム(１０ml、飽和水溶液)、食塩水(１０ml)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下に濃縮した。得られた粗製の油をフラッシュカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の３０％エーテル)で精製して、所望の化合物(１６)とトリイソプロピルスルホニルアミンの混合物(合計５６.７mg、分離不能、所望の化合物４５mgと概算、約５０％)を得た。
【数１７】
【００７８】
(k)Ｂoc-側鎖化合物(１７)の調製
酢酸エチル(４ml)中のアジド(１６)(５８mg、半粗製、＜０.１５２mモル)、１０％パラジウム／炭素(３０mg)およびジ-ｔ-ブチルジカーボネート(６６mg、０.３０４mモル)の混合物にアルゴン、次いで水素を通気し、水素バルーン下に室温で１６時間撹拌した。パラジウムをセライト濾過によって除去し、溶媒を真空下に除去し、この粗製の混合物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の５０％エーテル)で精製して、所望の化合物(１７)(２１.８mg、＜５０％)を得た。
【数１８】
【００７９】
(l)(１７)のメチルエステルの調製
０℃でＴＨＦ(１ml)および水(０.３ml)中の(１７)(１３mg、０.０２８５mモル)の溶液に、固体の水酸化リチウム(８mg、過剰)を一度に加えた。得られた懸濁液を室温で１６時間撹拌し、次いで１Ｎ塩酸で酸性化し、溶媒を真空下に除去した。得られた粗製の白色固体をエーテルに懸濁させ、ジアゾメタンのエーテル溶液を添加した。この添加を、ジアゾメタンの黄色が反応混合物において残り、ｔｌｃ分析が出発物質の完全消費を示すまで行った。過剰のジアゾメタンをアルゴン流のもとで除去し、残存する溶媒を真空下に除去した。得られた粗製の油をフラッシュカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の４０％エーテル)で精製して、所望の化合物である(１７)のメチルエステル(７.７mg、７５％)を得た。
【数１９】
【００８０】
(m)(１７)のメチルエステルへの別経路
上記の２つの工程を逆転させても、同じ化合物を同等の収率で合成することができる。
【００８１】
(n)メチル化したメチルエステルの調製
アルゴン雰囲気下の乾燥ＴＨＦ(０.５ml)中の水素化ナトリウム(過剰)およびヨウ化メチル(過剰)の懸濁液に、ＴＨＦ(１ml)中の(１７)のメチルエステル(１０.４mg、０.０２８９mモル)をカニューレから加え、得られた混合物を室温で１６時間撹拌した。水を加え、この混合物をエーテルで抽出し、一緒にした有機抽出液を食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下に濃縮した。この粗製の油を、フラッシュカラムクロマトグラフィー(石油エーテル中の４０％エーテル)で精製して、無色の油として所望のＮ-メチル化メチルエステル(３.１mg、約３０％)を得た。
【数２０】
【００８２】
(o)(１８)の調製
工程(l)の方法に従ったが、ジアゾメタンによるエステル化は削除した。
【００８３】
(p)(１９)の調製
Ｎ-Ｂoc-アミン酸(１８)(１０mモル)およびヨウ化メチル(５ml、８０mモル)をＴＨＦ(３０ml)に溶解し、この溶液をアルゴン下に０℃まで冷却した。水素化ナトリウム分散液(１.３２g、３０mモル)を穏やかに撹拌しながら慎重に添加した。この懸濁液を室温で１６時間撹拌した。次いで、酢酸エチル(５０ml)を加え(過剰の水素化ナトリウムから生成した水酸化ナトリウムを消費するため)、続いて水を滴下して過剰の水素化ナトリウムを破壊した。この溶液を蒸発乾固し、油状の残留物をエーテル(３０ml)と水(１００ml)の間に分配した。このエーテル層を５％ ＮaＨＣＯ３水溶液(５０ml)で洗浄し、一緒にした水性抽出物をクエン酸水溶液でｐＨ３に酸性化した。この生成物を酢酸エチル(３×２５ml)中に抽出し、この抽出物を水(２×２５ml)、５％チオ硫酸ナトリウム水溶液(２×２５ml；ヨウ素を除去するため)および水(２×２５ml)で洗浄し、ＭgＳＯ４で乾燥し、蒸発させて淡黄色油の(１９)を得た。
【００８４】
３．アミノ酸のカップリング
Ｎ-Ｂocアミノ酸(１９)(１mモル)、部分Ｂのアミノ酸メチルエステル(１.１mモル)およびカップリング剤ｐｙ-ＢＯＰ(１.１mモル)をアルゴン下にＣＨ２Ｃl２(１０ml)に溶解した。ＴＩＥＡ(３mモル)を加え、この反応液を室温で１時間撹拌した。過剰の溶媒を真空下に除去し、黄色の油状残留物を得た。この残留物をＥtＯＡc(５０ml)に再溶解した。このＥtＯＡc溶液を１０％クエン酸(２×２５ml)、水(２５ml)、５％ ＮaＨＣＯ３(２×２５ml)、水(２５ml)で洗浄し、次いで無水ＭgＳＯ４で乾燥し、通常相のシリカゲルクロマトグラフィーで処理して、白色の無定形固体として保護されたペプチドＡ-Ｂを得た。
Ｃのアミノ酸部分(５)へのペプチドＡ-Ｂのカップリングを同様の方法で行った。
【００８５】
【化２６】
【００８６】
【化２７】
【化２８】
【００８７】
化合物の試験
１．本明細書中に記載した化合物の細胞毒性を文献[J.Immunol.Methods, 65, 55-63, 1983]のように試験し、結果を以下の表４に示した。表中、Ｐ３８８はネズミ白血病Ｐ３８８に対するインビトロ試験を意味し、Ｕ３７３はヒトグリア芽腫／星細胞腫Ｕ３７３に対するインビトロ試験を意味し、ＨＥＹはヒト卵巣癌ＨＥＹに対するインビトロ試験を意味し、ＭＣＦ７はヒト胸癌ＭＣＦ７に対するインビトロ試験を意味する。
【００８８】
２．ＮＩＨ刊行物Ｎo.84-2635、「インビボ癌モデル」[Developmental Therapeutic Program, Division of Cancer Treatment, National Cancer Institute, Bethesda, Maryland]に記載されているインビボ試験において、ヘミアスターリンは細胞毒性であることがわかった。１×１０６個のＰ３８８白血病細胞を注射したマウスにおいて、ヘミアスターリンは、移植の２４時間後に開始した０.４５μgの５日間の毎日投与の後に２２３の％ＴＣの結果を与えた。この実験中に数匹の長期生存動物が存在した。
【００８９】
【表４】
【表５】
【００９０】
３．本明細書中に記載した化合物について、ヒト乳癌ＭＣＦ７細胞に対する抗有糸分裂活性を比較して試験した。
１５％ウシ胎児血清および抗生物質を追加したＲＰＭＩ中、湿度調節した１０％ＣＯ２下に３７℃で、ＭＣＦ７細胞を単層として増殖させた。全ての化合物をジメチルスルホキシドに溶解したが、ビンブラスチン(既知の薬物)については生理食塩水中の１mg／ml溶液とした。指数増殖しているＭＣＦ７細胞を異なる薬物濃度で２０時間処理し、染色体展開物(スプレッド)を調製し、有糸分裂細胞の割合(％)を蛍光顕微鏡で測定した。これらの結果を図１および図２に示す。ヘミアスターリン、ヘミアスターリンＡおよび修飾した化合物は、極めて強力な抗有糸分裂剤であり、それぞれ０.３nＭおよび３nＭのＩＣ５０値を有していた。ヘミアスターリンおよびヘミアスターリンＡは、タキソール(Taxol)、ビンブラスチン(Vinblastine)およびノコダゾール(Nocodazole)(全て既知の薬物である)よりも強力であった。
【００９１】
有糸分裂紡錘体の形態に対するヘミアスターリンおよびヘミアスターリンＡの効果を、蛍光ＤＮＡ染料ビスベンズイミドを用いる染色体分布およびβ-チューブリンに対するモノクローナル抗体を用いる間接免疫蛍光によって調べた。ヘミアスターリンＡが２nＭで存在すると、完全に正常な紡錘体は観察されなかった。一部の細胞は比較的小さな異常を示し、双極紡錘体は存在したが、星状体微小管は正常のものよりかなり長く、染色体は中期板に完全に拘束されなかった。大部分の細胞は複数の星状体を持ち、染色体が球状体中に分配された。タキソール、ビンブラスチンおよびノコダゾールの半-最大濃度が、ヘミアスターリンＡと同じ種類の異常紡錘体を生じた。ＭＣＦ７細胞において最大の有糸分裂抑制を引き起こす最低濃度である１０nＭのヘミアスターリンＡは、有糸分裂細胞において微小管の解重合を引き起こした。また、これは高濃度のビンブラスチンおよびノコダゾールのときにもそのようであった。高濃度のタキソールは全く違った効果を持ち、有糸分裂細胞における極めて濃密な複数星状体および間期細胞における細胞質微小管の束化を引き起こした。
【００９２】
これらの結果は、ヘミアスターリンが有糸分裂抑制を引き起こし、異常な有糸分裂紡錘体を生じることを示すものである。これらを、有糸分裂において細胞のブロックを必要とする方法において、例えば、核型分析のための有糸分裂展開物の調製において、他の抗有糸分裂薬物の代わりに用いることができる。また、これらを、有糸分裂細胞における微小管の機能を探るために用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】ヘミアスターリンと既知の抗有糸分裂剤の抗有糸分裂活性を比較するグラフである。
【図２】化学修飾したヘミアスターリンの抗有糸分裂活性を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式IVで示されるゲオディアモリド化合物：
【化１】
[式中、Ｒ５１はアルキル基であり；
Ｒ５２は水素原子またはアルキル基であり；
Ａはハロゲン原子である]。
【請求項１】
以下の一般式IVで示されるゲオディアモリド化合物：
【化１】
[式中、Ｒ５１はアルキル基であり；
Ｒ５２は水素原子またはアルキル基であり；
Ａはハロゲン原子である]。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００７−３１４４１（Ｐ２００７−３１４４１Ａ）
【公開日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２２１１５０（Ｐ２００６−２２１１５０）
【出願日】平成１８年８月１４日（２００６．８．１４）
【分割の表示】特願平８−５３１５６４の分割
【原出願日】平成８年４月２２日（１９９６．４．２２）
【出願人】（５０６２７７１９９）ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＢＲＩＴＩＳＨ ＣＯＬＵＭＢＩＡ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月１４日（２００６．８．１４）
【分割の表示】特願平８−５３１５６４の分割
【原出願日】平成８年４月２２日（１９９６．４．２２）
【出願人】（５０６２７７１９９）ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＢＲＩＴＩＳＨ ＣＯＬＵＭＢＩＡ
【Ｆターム（参考）】
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