癌を検出するためのマーカー
【課題】 癌を検出する方法、癌を治療するための医薬組成物、および癌を阻害する物質をスクリーニングする方法を提供する。
【解決手段】 本発明は、Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現を測定することを含む癌を検出する方法、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドもしくはその断片に特異的に結合する抗体、Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドおよび／もしくはその誘導体、またはＥｇｆｌ７ポリペプチドおよび／もしくはその誘導体を含む癌を治療するための医薬組成物、ならびにＥｇｆｌ７遺伝子の発現を阻害する物質または促進する物質を選択することを含む、癌を阻害する物質をスクリーニングする方法に関する。
【解決手段】 本発明は、Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現を測定することを含む癌を検出する方法、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドもしくはその断片に特異的に結合する抗体、Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドおよび／もしくはその誘導体、またはＥｇｆｌ７ポリペプチドおよび／もしくはその誘導体を含む癌を治療するための医薬組成物、ならびにＥｇｆｌ７遺伝子の発現を阻害する物質または促進する物質を選択することを含む、癌を阻害する物質をスクリーニングする方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌を検出する方法、癌を検出するためのマーカー、癌を阻害する物質をスクリーニングする方法、および癌を治療するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
内皮細胞で発現および分泌されるＥｇｆｌ７は、血管形成における内皮細胞の増殖に関与することはないが、血管の管腔構造の形成に必須のタンパク質として知られている。それゆえ、胚胎児期や新生児期など発達が進んでいる段階ではＥｇｆｌ７の発現は維持され続ける。一方、成育した生物の多くの器官では、Ｅｇｆｌ７の発現は減少して認められなくなる。しかし、血管の多い肺、心臓および腎臓等の器官、血管創傷による血管再生部、腫瘍等の増殖組織、妊娠期の生殖器官、および炎症組織等ではＥｇｆｌ７の発現が認められる。このことは、Ｅｇｆｌ７の発現が、血管新生および再生に関与していることを示唆している。上記のように、Ｅｇｆｌ７が血管形成における血管の管腔構造の形成に関与していることは知られているものの、この知見以外の機能に関しては解明されていない。
【０００３】
【非特許文献１】Ｌｅｏｎ Ｈ．Ｐａｒｋｅｒら、（２００４），Ｎａｔｕｒｅ，４２８，７５４−７５８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、癌を検出する方法、癌を治療するための医薬組成物、および癌を阻害する物質をスクリーニングする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、Ｅｇｆｌ７が、肝臓などの器官では癌化に伴って発現が増加するが、その他の器官では癌化に伴って発現が低減することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現を測定することを含む、癌を検出する方法。
（２）Ｅｇｆｌ７遺伝子が配列番号１または２の塩基配列で特定される遺伝子である、（１）記載の方法。
（３）Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドからなる、癌を検出するためのマーカー。
（４）Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドが配列番号１または２の塩基配列の全部または一部を含むポリヌクレオチドである、（３）記載のマーカー。
【０００７】
（５）Ｅｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片からなる、癌を検出するためのマーカー。
（６）Ｅｇｆｌ７ポリペプチドが配列番号３のアミノ酸配列の全部または一部を含むポリペプチドである、（５）記載のマーカー。
（７）Ｅｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する抗体を含む、癌を検出するためのキット。
（８）Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドを特異的に増幅するための、少なくとも１５塩基長の連続したプライマーまたはＥｇｆｌ７ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする少なくとも１５塩基長の連続したプローブを含む、癌を検出するためのキット。
（９）Ｅｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する抗体を含む、癌を治療するための医薬組成物。
【０００８】
（１０）Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドおよび／またはその誘導体、またはＥｇｆｌ７ポリペプチドおよび／またはその誘導体を含む、癌を治療するための医薬組成物。
（１１）Ｅｇｆｌ７遺伝子が発現している細胞と被験試料とを接触させ、被験試料の中からＥｇｆｌ７遺伝子の発現を阻害する物質または促進する物質を選択することを含む、癌を阻害する物質をスクリーニングする方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、癌を検出することができる。また、癌を阻害する物質をスクリーニングすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明者らは、血管の管腔構造の形成に必須のタンパク質であるＥｇｆｌ７遺伝子が特定の癌組織において発現が増加し、また別の癌組織においては発現が低減することを見いだした。そして、Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現を測定することにより、癌を検出できることを見いだした。本発明において、遺伝子の発現を測定することには、発現量を測定することおよび発現の有無を検出することが包含される。
【００１１】
本発明において、癌としては、固形癌、血管腫、血管内皮腫、肉腫、カポシ肉腫、造血器腫瘍、腺癌および扁平上皮癌などの種々の悪性腫瘍が包含され、例えば、肝臓癌、肺癌、腎臓癌、小腸癌、大腸癌、卵巣癌、胃癌、舌癌、食道癌、乳癌、子宮癌、咽頭癌等が挙げられる。さらにこれら癌の転移をも包含する。本発明の検出方法は、肝臓癌、肺癌、腎臓癌、大腸癌、小腸癌、卵巣癌の検出に有効であり、特に腎臓癌、肺癌および大腸癌の検出に有効である。
【００１２】
本発明においてＥｇｆｌ７遺伝子の塩基配列は、公知のものが公開されており、例えば、ヒトＥｇｆｌ７遺伝子の塩基配列は、公開されたデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ）においてアクセッションＮｏ．ＢＣ０８８３７１（配列番号１）およびＮｏ．ＢＣ０１２３７７（配列番号２）として登録されている。また、ヒトＥｇｆｌ７遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号３）は、公開されたデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ）において、各々アクセッションＮｏ．ＡＡＨ８８３７１．１およびＮｏ．ＡＡＨ１２３７７．１として登録されている。なお、配列番号２の塩基配列は、配列番号１の塩基配列の第１番塩基〜第２６５番塩基が配列番号２の第１番塩基〜第２５番塩基と置換し、第１５３９番塩基〜第１５６２番塩基が欠落した塩基配列である。各配列は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／から入手できる。
【００１３】
本発明において、その発現を測定するＥｇｆｌ７遺伝子は、検出しようとする対象によって適宜選択することができ、特に限定されないが、通常、脊椎動物由来Ｅｇｆｌ７遺伝子、好ましくは哺乳動物由来のＥｇｆｌ７遺伝子、好ましくはヒト由来Ｅｇｆｌ７遺伝子である。
【００１４】
本発明の一実施形態において、Ｅｇｆｌ７遺伝子は、配列番号１または２の塩基配列で特定される遺伝子である。本発明において、配列番号１または２で特定される遺伝子には、配列番号１または２で表される塩基配列からなる遺伝子、および該遺伝子と機能的に同等の遺伝子が包含される。ここで「機能的に同等」とは、対象となる遺伝子によってコードされるポリペプチドが、配列番号１または２で表される塩基配列からなる遺伝子によってコードされるポリペプチドと同等の生物学的機能、生化学的機能を有することを指す。
【００１５】
あるポリペプチドと機能的に同等のポリペプチドをコードする遺伝子を調製する当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ（１９８９））を利用する方法が挙げられる。なお、本明細書中において、「遺伝子」という用語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡやｃＤＮＡも含むものとする。また、全長遺伝子のみならずＥＳＴも含むものとする。
【００１６】
従って、配列番号１または２で表される塩基配列で特定される遺伝子には、配列番号１または２で表される塩基配列の全部または一部を含む塩基配列からなる遺伝子が包含される。配列番号１または２で表される塩基配列の全部または一部を含む塩基配列からなる遺伝子の塩基長は、機能的に同等であるポリペプチドをコードする限り特に制限されない。塩基配列の一部とは、各塩基配列の一部分の塩基配列であって、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせるのに十分な塩基配列の長さを有するものであり、例えば、少なくとも１５塩基、好ましくは少なくとも１００塩基、より好ましくは少なくとも２００塩基、最も好ましくは少なくとも１０００塩基の配列である。好ましくは各塩基配列において連続する少なくとも１５塩基、好ましくは少なくとも１００塩基、より好ましくは少なくとも２００塩基、最も好ましくは少なくとも１０００塩基の配列である。ここで「連続する」とは、基準とする塩基配列のうち連続した塩基配列を含むことを意味する。
【００１７】
より具体的には、配列番号１で特定される遺伝子には、配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＥｇｆｌ７と同等の生物学的機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなる遺伝子が包含され、配列番号２で特定される遺伝子には、配列番号２からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＥｇｆｌ７と同等の生物学的機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなる遺伝子が包含される。本明細書において、ポリヌクレオチドには、ＤＮＡおよびＲＮＡが包含される。
【００１８】
本明細書において、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、すなわち、各塩基配列に対し高い相同性（相同性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）を有するポリヌクレオチドがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、このような条件は、当該分野において周知慣用な手法、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、マイクロアレイ法またはサザンブロットハイブリダイゼーション法などにおいて、具体的には、コロニーまたはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したメンブランを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ；１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）溶液を用い、６５℃でメンブランを洗浄することにより達成できる。
【００１９】
これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するポリヌクレオチドが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２０】
また、塩基配列情報を基に合成したプライマーを用いる遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、ＬＡＭＰ法などを利用して、各遺伝子と機能的に同等の遺伝子を単離することも可能である。
【００２１】
これらハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により単離される、機能的に同等の遺伝子は、通常、アミノ酸配列レベルにおいて高い相同性または同一性を有する。高い相同性または同一性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも５０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性または同一性を指す。
【００２２】
アミノ酸配列や塩基配列の相同性または同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
【００２３】
癌を検出する方法
本発明における癌を検出する方法は、Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現を測定することを特徴とする。被検体由来の試料中におけるＥｇｆｌ７遺伝子の発現を検出する方法としては、被検体由来の試料中のＥｇｆｌ７遺伝子によってコードされるポリペプチド（本明細書中、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドと称する）を検出する方法、被検体由来の試料中のＥｇｆｌ７遺伝子の全部または一部であるポリヌクレオチド（本明細書中、Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドと称する）、特にＥｇｆｌ７ｍＲＮＡを検出する方法が挙げられる。ここで、Ｅｇｆｌ７ｍＲＮＡの検出には、該ＲＮＡから変換されたｃＤＮＡやｃＲＮＡの検出も包含される。
【００２４】
すなわち、本発明における癌を検出する方法は、Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドまたはＥｇｆｌ７ポリペプチドもしくはその断片をマーカーとして用いるものである。
【００２５】
一実施形態においてＥｇｆｌ７ポリヌクレオチドからなるマーカーは、配列番号１または２の塩基配列の全部または一部を含むポリヌクレオチドからなる。配列番号１または２で表される塩基配列の全部または一部を含むポリヌクレオチドの塩基長は、Ｅｇｆｌ７遺伝子の全部または一部である限り特に制限されない。塩基配列の一部とは、各塩基配列の一部分の塩基配列であって、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせるのに十分な塩基配列の長さを有するものであり、例えば、少なくとも１５塩基、好ましくは少なくとも１００塩基、より好ましくは少なくとも２００塩基の配列である。好ましくは各塩基配列において連続する少なくとも１５塩基、好ましくは少なくとも１００塩基、より好ましくは少なくとも２００塩基の配列である。ストリンジェントな条件については上記のとおりである。
【００２６】
一実施形態において、Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドは、配列番号１もしくは２の塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号１もしくは２からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＥｇｆｌ７と同等の生物学的機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００２７】
一実施形態においてＥｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片からなるマーカーは、配列番号３のアミノ酸配列の全部または一部を含むポリペプチドからなる。配列番号３のアミノ酸配列の全部または一部を含むポリペプチドのアミノ酸鎖長は、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドと同等の機能を有する限り特に制限されない。アミノ酸配列の一部とは、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドの活性を有するのに十分なアミノ酸鎖長を有するものであり、例えば、少なくとも１０残基、好ましくは１００残基、より好ましくは少なくとも２００残基の配列である。好ましくは各アミノ酸配列において連続する少なくとも１０残基、好ましくは１００残基、より好ましくは少なくとも２００残基の配列である。配列番号３のアミノ酸配列の全部または一部を含むポリペプチドには、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、ならびに配列番号３で表されるアミノ酸配列と少なくとも５０％以上の同一性、好ましくは７５％以上の同一性、さらに好ましくは８５％以上の同一性、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが包含される。
【００２８】
別の実施形態においてＥｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片からなるマーカーは、配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなり、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドと同等の生物学的機能を有するポリペプチドからなる。ここで数個とは、通常１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個である。
【００２９】
本明細書において、ポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドも包含され、ポリペプチドには、オリゴペプチドおよびタンパク質が包含される。
【００３０】
１．Ｅｇｆｌ７ポリペプチドの検出
試料中のＥｇｆｌ７ポリペプチドを検出する方法としては、当業者に周知の方法、例えば、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、二重モノクローナル抗体サンドイッチイムノアッセイ法（米国特許第４，３７６，１１０号）、モノクローナルポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ法（Ｗｉｄｅら、ＫｉｒｋｈａｍおよびＨｕｎｔｅｒ編集、「ラジオイムノアッセイ法（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）」、Ｅ．ａｎｄ Ｓ．Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、エジンバラ、（１９７０））、免疫蛍光法、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、プロテインチップによる解析法（蛋白質 核酸 酵素 Ｖｏｌ．４７ Ｎｏ．５（２００２）、蛋白質 核酸 酵素 Ｖｏｌ．４７ Ｎｏ．８（２００２））、２次元電気泳動法、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
以下に、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片と特異的に結合する抗体を用いて、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドの発現を検出する方法について詳述する。Ｅｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片と特異的に反応する抗体は、肝臓などの器官において発現したＥｇｆｌ７ポリペプチドと結合することができるため、該抗体を用いて試料中のＥｇｆｌ７ポリペプチドとの反応を検出することによって、癌を検出することができる。
【００３２】
Ｅｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片と特異的に反応する抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、それぞれＥｇｆｌ７ポリペプチドのエピトープに結合することができる。該抗体のグロブリンタイプは、上記特徴を有するものである限り特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれでもよいが、ＩｇＧおよびＩｇＭが好ましい。本発明におけるモノクローナル抗体には、特に、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種、または特定の抗体クラスもしくはサブクラス由来であり、鎖の残りの部分が別の種、または別の抗体クラスもしくはサブクラス由来である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびに、所望の生物学的活性を有する限り、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片等の免疫反応性の抗体断片が含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号）。
【００３３】
本発明の抗体を作製するにあたり、免疫原（抗原）となるためのポリペプチドを調製する。免疫原ポリペプチドとしては、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片を用いる。本発明において免疫原として使用可能なＥｇｆｌ７ポリペプチドのアミノ酸配列および該ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列は、上記のとおり公開されている。従って、公開されているアミノ酸配列情報を利用して、当技術分野で公知の手法、例えば固相ペプチド合成法などにより、免疫原として使用するためのＥｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片を合成することができる。断片としては、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドの免疫原性を有する断片であればよく、具体的には、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドのうち少なくとも６アミノ酸、好ましくは６〜２００アミノ酸、より好ましくは８〜５０アミノ酸からなる部分ペプチドが挙げられる。免疫原としてＥｇｆｌ７ポリペプチド断片を使用する場合は、ＫＬＨ、ＢＳＡなどのキャリアータンパク質に連結させて使用するのが好ましい。
【００３４】
また、公知の遺伝子組換え手法を利用して、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡの情報を用いてＥｇｆｌ７ポリペプチドを生産することも可能である。以下、組換え手法を用いたＥｇｆｌ７ポリペプチドの生産に関して説明する。
【００３５】
Ｅｇｆｌ７ポリペプチド生産用組換えベクターは、上記公開されているｃＤＮＡ配列を適当なベクターに連結することにより得ることができ、形質転換体は、Ｅｇｆｌ７ポリペプチド生産用組換えベクターを、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドが発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。
【００３６】
ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドが使用される。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ２１ａ、ｐＧＥＸ４Ｔ、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００３７】
ベクターにＥｇｆｌ７ｃＤＮＡを挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００３８】
その他、哺乳動物細胞において用いられるＥｇｆｌ７ポリペプチド生産用組換えベクターには、プロモーター、Ｅｇｆｌ７ｃＤＮＡのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などが連結されていてもよい。
【００３９】
ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。そして、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリングさせた後連結させ、Ｅｇｆｌ７ポリペプチド生産用組換えベクターを作製する。
【００４０】
形質転換に使用する宿主としては、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。
【００４１】
一例として、細菌を宿主とする場合は、Ｅｇｆｌ７ポリペプチド生産用組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、Ｅｇｆｌ７ＤＮＡ、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＲＬなどが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００４２】
酵母、動物細胞、昆虫細胞などを宿主とする場合には、同様に、当技術分野で公知の手法に従って、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドを生産することができる。
【００４３】
本発明において免疫原として使用するＥｇｆｌ７ポリペプチドは、上記作製した形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、または細胞もしくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。上記形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００４４】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００４５】
培養は、通常、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で６〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは中性付近に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４６】
培養後、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドが菌体内または細胞内に生産される場合には、菌体または細胞を破砕することによりＥｇｆｌ７ポリペプチドを抽出する。また、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドが菌体外または細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体または細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中からＥｇｆｌ７ポリペプチドを単離精製することができる。Ｅｇｆｌ７ポリペプチドが得られたか否かは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により確認することができる。
【００４７】
なお、以上の方法によって得られる組換えＥｇｆｌ７ポリペプチドには、他の任意のタンパク質との融合タンパク質も含まれる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）や緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）との融合タンパク質などが例示できる。さらに、形質転換細胞で発現されたペプチドは、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾されたペプチドもＥｇｆｌ７ポリペプチドとして用いることができる。このような翻訳後修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。
【００４８】
次に、得られたタンパク質を緩衝液に溶解して免疫原を調製する。なお、必要であれば、免疫を効果的に行うためにアジュバントを添加してもよい。アジュバントとしては、市販の完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント等が挙げられ、これらの何れのものを混合してもよい。
【００４９】
モノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマ法（ＫＯＨＬＥＲ ＡＮＤ ＭＩＬＳＴＥＩＮ，ＮＡＴＵＲＥ（１９７５）２５６：４９５)、または、組換え方法（米国特許第４，８１６，５６７号）により製造してもよい。また、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。例えば、以下のようにして作製することができる。
【００５０】
ｉ）免疫および抗体産生細胞の採取
上記のようにして得られた免疫原を、哺乳動物、例えばラット、マウス（例えば近交系マウスのＢＡＬＢ／ｃ）、ウサギなどに投与する。免疫原の１回の投与量は、免疫動物の種類、投与経路などにより適宜決定されるものであるが、動物１匹当たり約５０〜２００μｇである。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に免疫原を注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、初回免疫後、数日から数週間間隔で、好ましくは１〜４週間間隔で、２〜６回、好ましくは３〜４回追加免疫を行う。初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したときは、免疫原を静脈内または腹腔内に注射し、最終免疫とする。そして、最終免疫の日から２〜５日後、好ましくは３日後に、抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞または局所リンパ節細胞が好ましい。
【００５１】
ｉｉ）細胞融合
ハイブリドーマを得るため、上述のように免疫動物から得た抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。
【００５２】
抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。また株化細胞は、免疫動物と同種系の動物に由来するものが好ましい。ミエローマ細胞の具体例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損細胞株である、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ．８株、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１株、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１株、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３株またはＳｐ２／０−Ａｇ１４株などが挙げられる。
【００５３】
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを約１：１〜２０：１の割合で混合し、細胞融合促進剤の存在下にて融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１，５００〜４，０００ダルトンのポリエチレングリコール等を約１０〜８０％の濃度で使用することができる。また場合によっては、融合効率を高めるために、ジメチルスルホキシドなどの補助剤を併用してもよい。さらに、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
【００５４】
ｉｉｉ）ハイブリドーマの選別およびクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を、例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に２×１０５個／ウエル程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。培養温度は、２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株またはチミジンキナーゼ（ＴＫ）欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞とミエローマ細胞のハイブリドーマのみを選択的に培養し、増殖させることができる。その結果、選択培地で培養開始後、約１０日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
【００５５】
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採取し、酵素免疫測定法（ＥＩＡ：Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏ ＡｓｓａｙおよびＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ）等によって行うことができる。
【００５６】
融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立する。本発明のハイブリドーマは、後述するように、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ等の基本培地中での培養において安定であり、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドと特異的に反応するモノクローナル抗体を産生、分泌するものである。
【００５７】
ｉｖ）モノクローナル抗体の採取
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法または腹水形成法等を採用することができる。
【００５８】
細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＤＭＥＭ培地または無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃，５％ＣＯ２濃度）で２〜１０日以上培養し、その培養上清から抗体を取得する。
【００５９】
腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１×１０７個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜４週間後に腹水または血清を採取する。
【００６０】
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫酸アンモニウム沈澱、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせることにより、精製された本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。
【００６１】
ｖ）ポリクローナル抗体の採取
ポリクローナル抗体を作製する場合は、前記と同様に動物を免疫し、最終の免疫日から６〜６０日後に、酵素免疫測定法（ＥＩＡおよびＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。その後は、抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をＥＬＩＳＡ法などで測定する。
【００６２】
Ｅｇｆｌ７ポリペプチドに対する抗体を用いて被検体由来の試料中のＥｇｆｌ７遺伝子の発現を検出し、癌を検出する場合には、被検体の試料中のＥｇｆｌ７ポリペプチドに対する抗体またはその標識化抗体と結合する抗原ポリペプチドを測定することにより、癌の存在を検出できる。そして癌患者またはそのハイリスク者であると判定することができる。すなわち、ここで使用する抗体または標識化抗体は、癌により生じた細胞で発現しているＥｇｆｌ７ポリペプチドと特異的に結合する抗体であるから、非癌患者に由来する試料と比較して、この抗体と結合する抗原ポリペプチドの量が増加又は低減した試料を、癌化した細胞を含む試料および／または癌患者またはそのハイリスク患者に由来する試料として判定することができる。なおその際に、好ましくは２種類以上、好ましくは５種類以上、さらに好ましくは１０種類以上、最も好ましくは１５〜３９種類の抗体について試料中のＥｇｆｌ７ポリペプチドとの結合を判定する。被検体由来の試料としては、血液、臓器・組織、細胞などの生体由来試料を対象とすることができる。
【００６３】
癌のうち、腎臓癌、肺癌、小腸癌、大腸癌および卵巣癌、特に腎臓癌、肺癌および大腸癌については、試料中において、非癌患者に由来する試料と比較して、該抗原ポリペプチドの量が低減している場合に、癌患者またはそのハイリスク患者であると判定することができる。一方、癌のうち、肝臓癌については、試料中において、非癌患者に由来する試料と比較して、該抗原ポリペプチドの量が増加している場合に、癌患者またはそのハイリスク患者であると判定することができる。
【００６４】
また別の態様は、抗体とＥｇｆｌ７ポリペプチドとの結合を液相系において行う方法である。例えば、標識化抗体と試料とを接触させて標識化抗体とＥｇｆｌ７ポリペプチドを結合させ、この結合体を分離し、標識シグナルを検出する。
【００６５】
液相系での検出の別の方法は、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドに対する抗体（一次抗体）と試料とを接触させて一次抗体と抗原ポリペプチドを結合させ、この結合体に標識化抗体（二次抗体）を結合させ、この三者の結合体における標識シグナルを検出する。あるいは、さらにシグナルを増強させるためには、非標識の二次抗体を先ず抗体＋抗原ポリペプチド結合体に結合させ、この二次抗体に標識物質を結合させるようにしてもよい。このような二次抗体への標識物質の結合は、例えば二次抗体をビオチン化し、標識物質をアビジン化しておくことによって行うことができる。あるいは、二次抗体の一部領域（例えば、Ｆｃ領域）を認識する抗体（三次抗体）を標識し、この三次抗体を二次抗体に結合させるようにしてもよい。なお、一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。液相からの結合体の分離やシグナルの検出は上記と同様とすることができる。
【００６６】
また別の態様は、抗体とＥｇｆｌ７ポリペプチドとの結合を固相系において試験する方法である。この固相系における方法は、極微量のＥｇｆｌ７ポリペプチドの検出と操作の簡便化のため好ましい方法である。すなわちこの固相系の方法は、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドに対する抗体（一次抗体）を固相（樹脂プレート、メンブレン、ビーズ等）に固定化し、この固定化抗体にＥｇｆｌ７ポリペプチドを結合させ、非結合ペプチドを洗浄除去した後、プレート上に残った抗体＋Ｅｇｆｌ７結合体に標識化抗体（二次抗体）を結合させ、この二次抗体のシグナルを検出する方法である。この方法は、いわゆる「サンドイッチ法」と呼ばれる方法であり、マーカーとして酵素を用いる場合には、ＥＬＩＳＡとして広く用いられている方法である。一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。シグナルの検出は上記と同様とすることができる。
【００６７】
２．Ｅｇｆｌ７ｍＲＮＡの検出
被検体由来の試料中のＥｇｆｌ７ｍＲＮＡを検出する方法としては、Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドを特異的に増幅するための、少なくとも１５塩基長の連続したプライマーまたはＥｇｆｌ７ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする少なくとも１５塩基長の連続したプローブを用いて被検体由来の試料中のＥｇｆｌ７遺伝子の発現を検出する方法が挙げられる。
【００６８】
該プライマーまたはプローブは、被検体由来の試料中に発現しているＥｇｆｌ７遺伝子のｍＲＮＡまたはｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡまたはｃＲＮＡと特異的に結合することから、これらを用いて試料中のＥｇｆｌ７遺伝子の発現を検出することができる。
【００６９】
本発明のプライマーは、Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドの少なくとも一部を増幅するものであればよい。プライマーおよびプローブは、当業者に公知の手法に従って、設計することができる。プライマーおよびプローブ設計の留意点として、例えば以下を指摘することができる。
【００７０】
プライマーとして実質的な機能を有する長さは、通常１５塩基以上、好ましくは１６〜５０塩基であり、さらに好ましくは１８〜３０塩基である。またプローブとして実質的な機能を有する長さとしては、通常１５塩基以上、好ましくは１６〜１０００塩基、さらに好ましくは５０〜５００塩基である。
【００７１】
また設計の際には、プライマーまたはプローブの融解温度（Ｔｍ）を確認することが好ましい。Ｔｍとは、任意のポリヌクレオチド鎖の５０％がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度を意味し、鋳型ポリヌクレオチドとプライマーまたはプローブとが二本鎖を形成してアニーリングまたはハイブリダイズするためには、アニーリングまたはハイブリダイゼーションの温度を最適化する必要がある。一方、この温度を下げすぎると非特異的な反応が起こるため、温度は可能な限り高いことが望ましい。従って、設計しようとするプライマーまたはプローブのＴｍは、増幅反応またはハイブリダイゼーションを行う上で重要な因子である。Ｔｍの確認には、公知のプライマーまたはプローブ設計用ソフトウエアを利用することができ、本発明で利用可能なソフトウエアとしては、例えばＯｌｉｇｏＴＭ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．（米国）製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウェア開発（株）（日本）製）などが挙げられる。またＴｍの確認は、ソフトウエアを使わず、自ら計算することによっても行うことができる。その場合には、最近接塩基対法（Ｎｅａｒｅｓｔ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ Ｍｅｔｈｏｄ）、Ｗａｌｌａｎｃｅ法、ＧＣ％法等に基づく計算式を利用することができる。本発明では、平均Ｔｍが約４５〜６５℃であることが好ましい。
【００７２】
プライマーまたはプローブとして特異的なアニーリングまたはハイブリダイズが可能な条件としては、その他にもＧＣ含量などがあり、そのような条件は当業者に周知である。
【００７３】
上述のように設計したプライマーおよびプローブは、当業者に公知の方法に従って調製することができる。さらに、当業者には周知のように、プライマーまたはプローブには、アニーリングまたはハイブリダイズする部分以外の配列、例えばタグ配列などの付加配列が含まれていてもよく、上述したプライマーまたはプローブにそのような付加配列が付加されたものも本発明の範囲内に含まれるものとする。
【００７４】
ヒトＥｇｆｌ７ポリヌクレオチドを特異的に増幅するためのプライマーとしては、配列番号１の塩基配列から選定した少なくとも２種類の連続した１５塩基以上の塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであって、かつ選定したオリゴヌクレオチド間に１塩基以上の間隔を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号２の塩基配列から選定した少なくとも２種類の連続した１５塩基以上の塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであって、かつ選定したオリゴヌクレオチド間に１塩基以上の間隔を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットが挙げられる。
【００７５】
ヒトＥｇｆｌ７ポリヌクレオチドを特異的に増幅するためのプライマーとしては、具体的には、配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットが挙げられる。アフリカツメガエルＥｇｆｌ７ポリヌクレオチドを特異的に増幅するためのプライマーとしては、具体的には、配列番号８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットが挙げられる。
【００７６】
被検体由来の試料におけるＥｇｆｌ７遺伝子の発現を検出するためには、上記プライマーおよび／またはプローブをそれぞれ増幅反応またはハイブリダイゼーション反応において用い、その増幅産物またはハイブリッド産物を検出する。
【００７７】
被検体由来の試料としては、血液、臓器・組織、細胞などの生体由来試料を対象とすることができる。
【００７８】
増幅反応またはハイブリダイゼーション反応を行う場合には、通常は、被検体由来の試料から被検ポリヌクレオチドを調製する。被検ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれでもよい。ＤＮＡまたはＲＮＡは、当技術分野で周知の方法を適宜使用して抽出することができる。例えば、ＤＮＡを抽出する場合には、フェノール抽出およびエタノール沈殿を行う方法、ガラスビーズを用いる方法など、またＲＮＡを抽出する場合には、グアニジン−塩化セシウム超遠心法、ホットフェノール法、またはチオシアン酸グアジニウム−フェノール−クロロホルム（ＡＧＰＣ）法などを利用することができる。以上のように調製した試料または被検ポリヌクレオチドを用いて、以下に示す増幅反応および／またはハイブリダイゼーション反応を行う。
【００７９】
抽出されたＲＮＡはさらに精製してｍＲＮＡとして使用することが好ましい。精製方法は特に限定されないが、真核細胞の細胞質に存在するｍＲＮＡの多くは、その３’端にポリ（Ａ）配列を持つため、この特徴を利用して、例えば、以下のように実施することができる。まず抽出した全ＲＮＡにビオチン化オリゴ（ｄＴ）プローブ を加えてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを吸着させる。次に、ストレプトアビジンを固定化した常磁性粒子担体を加え、ビオチン／ストレプトアビジン間の結合を利用して、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを捕捉させる。洗浄操作の後、最後にオリゴ（ｄＴ）プローブからポリ（Ａ）＋ＲＮＡを溶出する。また、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用いてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを吸着させ、これを溶出して精製する方法を採用してもよい。溶出されたポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、さらに、ショ糖密度勾配遠心法等により分画してもよい。
【００８０】
プライマーを用いて被検ポリヌクレオチドを鋳型とした増幅反応を行い、その特異的増幅反応を検出することにより、試料中のＥｇｆｌ７遺伝子の発現を検出することができる。
【００８１】
増幅手法としては、特に限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の原理を利用した公知の方法、例えば、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法等が挙げられる。その他の増幅手法としては、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）法、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などを挙げることができる。増幅は、増幅産物が検出可能なレベルになるまで行う。
【００８２】
例えば、ＰＣＲ法は、被検ポリヌクレオチドであるＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼにより、一対のプライマー間の塩基配列を合成するものである。ＰＣＲ法によれば、変性、アニーリングおよび合成からなるサイクルを繰り返すことによって、増幅断片を指数関数的に増幅させることができる。ＰＣＲ法の最適条件は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００８３】
またＲＴ−ＰＣＲ法では、まず、被検ポリヌクレオチドであるＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素反応によりｃＤＮＡを作製し、その後、作製したｃＤＮＡを鋳型として一対のプライマーを用いてＰＣＲ法を行うものである。
【００８４】
なお、増幅手法として競合ＰＣＲ法やリアルタイムＰＣＲ法等の定量的ＰＣＲ法などを採用することにより、定量的な検出が可能となる。リアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ）法では、５’端は蛍光色素（レポーター）で、３’端は消光剤（クエンチャー）で標識した、目的遺伝子の特定領域にハイブリダイズするプローブが使用される。プローブは、通常の状態ではクエンチャーによってレポーターの蛍光が抑制されている。この蛍光プローブ を目的遺伝子に完全にハイブリダイズさせた状態で、その外側からＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進むと、そのエキソヌクレアーゼ活性により蛍光プローブ が５’端から加水分解され、レポーター色素が遊離し、蛍光を発する。リアルタイムＰＣＲ法は、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングすることにより、鋳型ＤＮＡの初期量を定量する。
【００８５】
またＬＡＭＰ法では、計６領域の塩基配列を認識する４種類のオリゴヌクレオチドからなるプライマー、鎖置換合成活性を有する核酸合成酵素、および基質を用い、熱変性工程を必要とせずに、終始等温で速やかに特異性の高い遺伝子増幅反応が進行する。ＬＡＭＰ法の最適条件は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００８６】
上記増幅反応後に特異的な増幅反応が起こったか否かを検出するには、増幅反応により得られる増幅産物を特異的に認識することができる公知の手段を用いることができる。例えば、アガロースゲル電気泳動法等を利用して、特定のサイズの増幅断片が増幅されているか否かを確認することにより、特異的な増幅反応を検出することができる。
【００８７】
あるいは、増幅反応の過程で取り込まれるｄＮＴＰに、放射性同位体、蛍光物質、発光物質などの標識体を作用させ、この標識体を検出することができる。放射性同位体としては、３２Ｐ、１２５Ｉ、３５Ｓなどを用いることができる。また蛍光物質としては、例えば、フルオレセン（ＦＩＴＣ）、スルホローダミン（ＳＲ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）などを用いることができる。また発光物質としてはルシフェリンなどを用いることができる。
【００８８】
これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、特に制限されることはなく、従来公知の各種手段を用いることができる。例えば標識体の導入方法としては、放射性同位体を用いるランダムプライム法が挙げられる。
【００８９】
標識したｄＮＴＰを取り込んだ増幅産物を観察する方法としては、上述した標識体を検出するための当技術分野で公知の方法であればいずれの方法でもよい。例えば、標識体として放射性同位体を用いた場合には、放射活性を、例えば液体シンチレーションカウンター、γ−カウンターなどにより計測することができる。また標識体として蛍光を用いた場合には、その蛍光を蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダーなどを用いて検出することができる。
【００９０】
以上のようにして特異的な増幅反応の増減により、試料においてＥｇｆｌ７遺伝子の発現の増減を検出できる。試料中においてＥｇｆｌ７遺伝子の発現が、非癌患者に由来する試料と比較して、増加又は低減している場合に、癌が存在すると判定できる。
【００９１】
癌のうち、腎臓癌、肺癌、小腸癌、大腸癌および卵巣癌、特に腎臓癌、肺癌および大腸癌については、試料中において、非癌患者に由来する試料と比較して、Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現が低減している場合に、癌患者またはそのハイリスク患者であると判定することができる。一方、癌のうち、肝臓癌については、試料中において、非癌患者に由来する試料と比較して、Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現が増加している場合に、癌患者またはそのハイリスク患者であると判定することができる。
【００９２】
また、プローブを用いて試料または被検ポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーション反応を行い、その特異的結合（ハイブリッド）を検出することにより、Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現を検出することもできる。
【００９３】
ハイブリダイゼーション反応は、プローブがＥｇｆｌ７ポリヌクレオチドのみと特異的に結合するような条件、すなわちストリンジェントな条件下で行う必要がある。そのようなストリンジェントな条件は当技術分野で周知であり、特に限定されない。ストリンジェントな条件としては、例えばナトリウム濃度が、１０〜３００ｍＭ、好ましくは２０〜１００ｍＭであり、温度が２５〜７０℃、好ましくは４２〜６５℃における条件が挙げられる。
【００９４】
ハイブリダイゼーションを行う場合には、プローブに蛍光標識（フルオレセイン、ローダミンなど）、放射性標識（３２Ｐなど）、酵素標識（アルカリホスファターゼ、西洋ワサビパーオキシダーゼ等）、ビオチン標識等の適当な標識を付加することができる。従って、以下に述べる本発明の検出用キットには、上記のような標識を付加したプローブも含まれる。
【００９５】
標識化プローブを用いた検出は、試料またはそれから調製した被検ポリヌクレオチドとプローブとをハイブリダイズ可能なように接触させることを含む。「ハイブリダイズ可能なように」とは、上述したストリンジェントな条件下にて特異的な結合が起こる環境（温度、塩濃度）において、ということである。具体的には、試料または被検ポリヌクレオチドをスライドグラス、メンブラン、マイクロタイタープレート等の適当な固相に固定化し、標識を付加したプローブを添加することにより、プローブと試料または被検ポリヌクレオチドとを接触させてハイブリダイゼーション反応を行い、ハイブリダイズしなかったプローブを除去した後、試料または被検ポリヌクレオチドとハイブリダイズしているプローブの標識を検出する。標識が検出された場合には、試料においてＥｇｆｌ７遺伝子が発現していることとなる。
【００９６】
また、標識の濃度を指標とすることにより、定量的な検出も可能となる。標識化プローブを用いた検出方法の例としては、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）法等を挙げることができる。
【００９７】
上記で述べたような本発明の検出方法における判定基準としては、典型的には、ＲＯＣ曲線（受信者動作特性曲線）を作成してカットオフ値（病態識別値）を設定し、所定のカットオフ値を基準として、癌が存在すること、ならびに癌を伴う患者またはハイリスク患者であることを判定する方法が挙げられる。
【００９８】
その他の検出方法として、例えば、サブトラクション法（Ｓｉｖｅ，Ｈ．Ｌ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ，Ｔ．Ｓｔ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６，１０９３７、Ｗａｎｇ，Ｚ．，ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．Ｄ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８，１１５０５−１１５０９）、ディファレンシャル・ディスプレイ法（Ｌｉａｎｇ，Ｐ．，ａｎｄ Ｐａｒｄｅｅ，Ａ．Ｂ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７，９６７−９７１、Ｌｉａｎｇ，Ｐ．，Ａｖｅｒｂｏｕｋｈ，Ｌ．，Ｋｅｙｏｍａｒｓｉ，Ｋ．，Ｓａｇｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ Ｐａｒｄｅｅ，Ａ．Ｂ．（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２，６９６６−６９６８）、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法（Ｊｏｈｎ，Ｔ．Ｓｔ．，ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．Ｃｅｌｌ（１９７９）１６，４４３−４５２）、また、適当なプローブ を用いたクロスハイブリダイゼーション法（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．（１９８２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． ｐｒｅｓｓ）等が挙げられる。
【００９９】
癌を検出するためのキット
本発明はまた、癌を検出するためのキットに関する。該キットは、Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現を検出する手段として、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドもしくはその断片と特異的に結合する抗体、Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドを特異的に増幅するための少なくとも１５塩基長の連続したプライマー、およびＥｇｆｌ７をコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする少なくとも１５塩基長の連続したプローブから選択される少なくとも１種を含む。このようなキットとしては、被検成分の種類に応じて各種のものが市販されており、本発明のキットも、Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現を検出する上記手段を用いることを除き、公知公用のキットに用いられている各要素によって構成することができる。Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現を検出するためのプライマー、プローブまたは抗体に加え、例えば、標識二次抗体、担体、洗浄バッファー、試料希釈液、酵素基質、反応停止液、標準物質等を含みうる。
【０１００】
医薬組成物
本発明により、Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現が特定の癌、特に肝臓癌の組織において増加することから、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する抗体を投与することにより、癌を治療することが可能であると考えられる。従って、本発明の一実施形態では、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する抗体を含む、癌を治療するための医薬組成物に関する。
【０１０１】
さらに、本発明者らは、Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現が、特定の癌、特に腎臓癌、肺癌、小腸癌、大腸癌および卵巣癌の癌組織において低減することから、癌細胞においてＥｇｆｌ７遺伝子を発現させることにより、もしくはＥｇｆｌ７ポリヌクレオチドおよび／またはその誘導体、またはＥｇｆｌ７ポリペプチドおよび／またはその誘導体を投与することにより、癌を治療することが可能であると考えられる。
【０１０２】
従って、本発明の一実施形態では、Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドおよび／またはその誘導体含む癌を治療するための医薬組成物、ならびにＥｇｆｌ７ポリペプチドおよび／またはその誘導体を含む癌を治療するための医薬組成物に関する。
【０１０３】
ポリヌクレオチド誘導体としては、例えば、ポリヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合またはＮ３’−Ｐ５’ホスホアミダイト結合などに変換されたポリヌクレオチド誘導体、リボースとリン酸ジエステル結合がペプチド結合に変換されたポリヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピオニルウラシルまたはＣ−５チアゾールウラシルなどで置換されたポリヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピオニルシトシンまたはフェノキサジン修飾シトシンなどで置換されたポリヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースまたは２’−メトキシエトキシリボースなどで置換されたポリヌクレオチド誘導体などを挙げることができる。ポリペプチド誘導体としては、その他のポリペプチドと融合した融合ポリペプチド、ポリエチレングリコールなどのポリマーに結合させた化学修飾ポリペプチドなどが挙げられる。
【０１０４】
Ｅｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する抗体、Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドおよびＥｇｆｌ７ポリペプチドならびにその誘導体は、通常は薬学的に許容される一つ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬組成物として提供するのが望ましい。投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与を挙げることができる。
【０１０５】
Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドまたはその誘導体を、癌疾患の治療に使用する場合は、Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドを注射により直接投与する方法のほか、該ポリヌクレオチドが組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。また、本発明の遺伝子をリポソームなどのリン脂質小胞に導入し、そのリポソームを投与する方法を採用してもよい。Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドの投与経路としては、通常の静脈内、動脈内等の全身投与のほか、免疫系組織（骨髄、リンパ節など）に局所投与を行うことができる。さらに、カテーテル技術、外科的手術等と組み合わせた投与経路を採用することもできる。
【０１０６】
癌を阻害する物質をスクリーニングする方法
本発明はまた、癌を阻害する物質をスクリーニングする方法に関する。本発明のスクリーニング方法は、Ｅｇｆｌ７遺伝子が発現している細胞と、被験試料とを接触させ、被験試料の中からＥｇｆｌ７遺伝子の発現を阻害する物質またはＥｇｆｌ７遺伝子の発現を促進する物質を選択することを特徴とするものである。Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現を測定する方法については、上記のとおりである。
【０１０７】
Ｅｇｆｌ７遺伝子が発現している細胞と、被験試料とを接触させたときに、Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現が阻害されたときには、当該試料に肝臓癌の進展を阻害する物質が含まれていると判定することができる。一方、Ｅｇｆｌ７遺伝子が発現している細胞と、被験試料とを接触させたときに、Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現が促進されたときには、当該試料に腎臓癌、肺癌、小腸癌、大腸癌および卵巣癌、特に腎臓癌、肺癌および大腸癌の進展を阻害する物質が含まれていると判定することができる。
【０１０８】
スクリーニングの対象とする被験試料としては、特に制限はなく、例えば、細胞抽出液、合成低分子化合物のライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプチドのライブラリーなどが挙げられる。
【実施例】
【０１０９】
（方法）
１）受精卵の準備
受精卵の採取１６時間前、アフリカツメガエルの雄および雌の皮下に、各々６００ＩＵのゴナトトロピンを注射し自然交配によって受精卵を得た。該受精卵を４．５％ Ｌ−システイン塩酸塩（ｐＨ７．８）を含有したＳｔｅｉｎｂｅｒｇ氏液（５８ｍＭ ＮａＣｌ、０．６７ｍＭ ＫＣｌ、０．３４ｍＭ Ｃａ（ＮＯ３）２・２４Ｈ２Ｏ、０．８３ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３．０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）を用いて脱ゼリーした後に２０℃条件下に置いて胞胚期（Ｎｉｅｕｗｋｏｏｐ ａｎｄ Ｆａｂｅｒのステージ表によるステージ９）になるまで発生を継続した。
【０１１０】
２）再集合培養
胞胚期（ステージ９）の胚より、卵膜をピンセットを用いて剥離した後に０．６ｍｍ×０．６ｍｍの大きさの未分化予定外胚葉領域（アニマルキャップ）の断片を５枚切り出し、３％寒天上にＳｔｅｉｎｂｅｒｇ氏液を満たしたシャーレ内で、ＣａおよびＭｇを含まないＳｔｅｉｎｂｅｒｇ氏液（ＣＭＦ−Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ氏液）を用いたピペッティングにより細胞を解離させた。
【０１１１】
解離させた該細胞を、０．１％の脂肪酸を含まないウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む４ｍＭ 塩酸溶液中に溶解した０．４ｎｇ／ｍＬ アクチビンＡによる単独処理、もしくは該０．４ｎｇ／ｍＬ アクチビンＡおよび１００ｎｇ／ｍＬ アンジオポエチン２（ＴＥＣＨＮＥ社）による共処理を、０．１％ ＢＳＡを含むＣＭＦ−Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ氏液中で１時間行った。その後、Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ氏液にて５回洗浄し、Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ氏液中で集合体を形成させた。
【０１１２】
３）プローブの作製
ｃＤＮＡ断片をクローニングして作製したプラスミドを制限酵素ＳｐｅIもしくはＳａｃIIで消化し、それをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼもしくはＳｐ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡの合成を行い、プローブとした。このとき、基質には１０×ＤＩＧ ＲＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用した。
【０１１３】
４）マイクロアレイによる検出
８，０９１クローンのアフリカツメガエルｃＤＮＡから６０ｍｅｒのオリゴＤＮＡを貼付したＤＮＡマイクロアレイを作製し、検出に使用した。一方、０．４ｎｇ／ｍＬ アクチビンＡ単独処理もしくは０．４ｎｇ／ｍＬ アクチビンＡおよび１００ｎｇ／ｍＬ アンジオポエチン２の共処理を施した集合体を２日間、２０℃で培養した後に、全てのＲＮＡを抽出した。該抽出ＲＮＡより、Ｌｏｗ ＲＮＡ Ｉｎｐｕｔリニア増幅アンドラベル化キット（アジレント社製）を用いて、ｃｙ３標識（ｃｙａｎｉｎｅ ３−ＣＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製））およびｃｙ５標識（ｃｙａｎｉｎｅ ５−ＣＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製））で標識したＲＮＡを調製した。ハイブリダイゼーションチャンバに該ＤＮＡマイクロアレイおよび該標識ＲＮＡを適用し、ハイブリダイゼーションを６０℃で１７時間実施した。ハイブリダイゼーションの終了後、アジレントマイクロアレイスキャナを使用して解析を行った。
【０１１４】
５）ＲＮＡの調製
全ＲＮＡの抽出はＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を使用して実施した。
【０１１５】
６）逆転写反応
逆転写反応は、スーパースクリプトファーストストランドシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用し、ランダムプライマー（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて行った。
【０１１６】
７）ＰＣＲ
ＰＣＲ反応には、Ｅｘｐａｎｄ ｌｏｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用した。使用したプライマーの配列およびアニール温度は以下の通りである。
（ヒト）
Ｈ．Ｅｇｆｌ７：
５’−ＡＧＣＡＡＴＡＴＧＣＣＡＧＣＣＧＣＣＡＴ−３’（配列番号４）
５’−ＴＣＡＣＧＡＧＴＣＴＴＴＣＴＴＧＣＡＧＧ−３’（配列番号５）
アニール温度６０℃、３５サイクル
Ｇ３ＰＤＨ：
５’−ＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴ−３’（配列番号６）
５’−ＣＡＴＧＴＧＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣ−３’（配列番号７）
アニール温度６８℃、２７サイクル
（アフリカツメガエル）
Ｘ．Ｅｇｆｌ７：
５’−ＣＣＧＡＴＴＧＣＡＡＴＧＴＣＡＧＡＡＣＧ−３’（配列番号８）
５’−ＴＣＡＡＡＧＣＴＣＣＧＴＣＴＴＧＣＡＴＧ−３’（配列番号９）
アニール温度６０℃、３８サイクル
ＯＤＣ：
５’−ＣＡＧＣＴＡＧＣＴＧＴＧＧＴＧＴＧＧ−３’（配列番号１０）
５’−ＣＡＡＣＡＴＧＧＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＣ−３’（配列番号１１）
アニール温度５５℃、２４サイクル
なお、ヒト組織での発現には、ヒトｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃＤＮＡ ｐａｎｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を鋳型として使用した。また、ヒト癌組織での発現には、ヒト癌組織ｃＤＮＡパネル（ＢｉｏＣｈａｉｎ社製）を鋳型として使用した。
【０１１７】
８）Ｗｈｏｌｅ−ｍｏｕｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
正常胚を１０％ 中性緩衝ホルマリン液中で固定した後に、１００％ メタノールを用いて脱水した。脱水した後に、Ｔｗｅｅｎ ２０を含有したＰＢＳ溶液と置き換え、９５℃で変性させて、４％ パラホルムアルデヒドで再度固定した。再固定後、再度Ｔｗｅｅｎ ２０を含有したＰＢＳ溶液と置き換えて試料とし、自動ｗｈｏｌｅ−ｍｏｕｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション装置ｉｎ ｓｉｔｕ ｐｒｏ（ＡＢＩＭＥＤ社製）に適用した。発色にはＢＭパープル（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用した。
【０１１８】
（結果）
１）アフリカツメガエル胚未分化細胞からの血管内皮細胞の誘導
解離集合体に０．４ｎｇ／ｍＬ アクチビン単独処理もしくは０．４ｎｇ／ｍＬ アクチビンおよび１００ｎｇ／ｍＬ アンジオポエチン２の共処理を施すことにより血管内皮様細胞が誘導できるか検討した。その結果、アクチビン単独処理に比較して、アクチビンおよびアンジオポエチン２の共処理において、血管内皮細胞のマーカーであるｍｓｒおよびｔｉｅ２遺伝子の発現が著しく増加していることが判明した。このことより、アクチビンおよびアンジオポエチン２の共処理によって解離集合体から血管内皮細胞が誘導されたと考えられた（図１）。さらに、赤血球のマーカーであるｇｌｏｂｉｎ遺伝子の発現について検討した結果、ｇｌｏｂｉｎ遺伝子の発現はいずれの場合も認められなかった。すなわち、アクチビンおよびアンジオポエチン２の共処理を行うことにより、血管内皮細胞が誘導される反面、赤血球は誘導されないことが判明し、血管内皮細胞のみを誘導する系を作り出すことができた。この結果、血管の細胞分化や遺伝子解析において有用な実験系が確立された。
【０１１９】
２）マイクロアレイによる解析
０．４ｎｇ／ｍＬ アクチビン単独処理ならびに０．４ｎｇ／ｍＬ アクチビンおよび１００ｎｇ／ｍＬ アンジオポエチン２の共処理による遺伝子発現をＤＮＡマイクロアレイ用いて比較して、血管形成に関与する遺伝子の探索を試みた。解離集合体に０．４ｎｇ／ｍＬ アクチビン単独処理もしくは０．４ｎｇ／ｍＬ アクチビンおよび１００ｎｇ／ｍＬ アンジオポエチン２の共処理を施した後、４８時間経過した時の遺伝子発現量の比較を行った結果、両者の遺伝子発現が２倍以上の差が認められた遺伝子として５７遺伝子が得られた。このうち共処理することにより３４遺伝子が増加し、２３遺伝子が減少した。遺伝子発現が増加した遺伝子群を表１に、遺伝子発現が減少した遺伝子群を表２に示す。
【０１２０】
【表１】
【０１２１】
【表２】
【０１２２】
３）Ｗｈｏｌｅ−ｍｏｕｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる遺伝子発現部位の特定
ＤＮＡマイクロアレイによる解析の結果で遺伝子発現が２倍以上の差が認められた５７遺伝子のうち、２倍以上増加したものの中から筋肉で発現しているものを除いた１２遺伝子についてアフリカツメガエル胚における発現部位を特定した。この結果、２遺伝子（ｘｌ．９４８０およびｘｌ．２３２７０）が血管で発現していた（図２）。ｘｌ．２３２７０に関しては、血管形成に関与する遺伝子であると報告されているＥｇｆｌ７遺伝子であった（Ｌｅｏｎ Ｈ．Ｐａｒｋｅｒら、（２００４），Ｎａｔｕｒｅ，４２８，７５４−７５８）。
【０１２３】
４）Ｘ．Ｅｇｆｌ７の時間的発現の検討
アフリカツメガエル血管で新たに発現が認められた遺伝子Ｘ．Ｅｇｆｌ７が、発生のどの段階から発現が見られるかをＲＴ−ＰＣＲ（図３）およびＷｈｏｌｅ−ｍｏｕｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（図４）を用いて検討した。この結果、発生のステージ２４から遺伝子Ｘ．Ｅｇｆｌ７が発現していることが判明した。この時期はアフリカツメガエルにおいて血管が形成されてくる時期で、すなわち、血管形成の時期と遺伝子Ｘ．Ｅｇｆｌ７の発現が見られる時期が一致していることが分った。
【０１２４】
５）Ｈ．Ｅｇｆｌ７の組織特異的発現の検討
さらに、ヒトＥｇｆｌ７のプライマーを作製し、ヒト癌組織ｃＤＮＡパネル（ＢｉｏＣｈａｉｎ社製）を用いてヒト癌組織で発現が増減しているかを検討した（図５）。その結果、Ｅｇｆｌ７は肝臓において癌組織での発現量の増加が認められた。一方、腎臓、肺、大腸、小腸、および卵巣などのその他の組織では癌組織での発現量の低減が見られた。特に、腎臓癌、肺癌、大腸癌において著しい低減が認められ、新規癌マーカーになるものと期待される。また、発現の低減がみられる癌細胞においてこの遺伝子産物を発現させることにより、癌細胞の異常増殖を抑制できることも期待され、遺伝子治療への応用も考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】解離集合体におけるｍｓｒおよびｔｉｅ２の発現解析の結果を示す。解離集合体に０．４ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ単独処理、または０．４ｎｇ／ｍＬアクチビンＡおよび１００ｎｇ／ｍＬアンジオポエチン２の共処理を施した結果を示す写真である。
【図２】遺伝子ｘｌ．９４８０およびｘｌ．２３２７０が、アフリカツメガエル胚において血管部分で発現していることを示す写真である。ｓｔ３４のアフリカツメガエルを用いた。ｍｓｒはコントロールであり、黒く染まっているところが血管である。
【図３】遺伝子Ｘ．Ｅｇｆｌ７について、発生のどの段階から発現が見られるかをＲＴ−ＰＣＲを用いて検討した結果を示す写真である。
【図４】遺伝子Ｘ．Ｅｇｆｌ７について、発生のどの段階から発現が見られるかをＷｈｏｌｅ−ｍｏｕｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いて検討した結果を示す写真である。
【図５】Ｈ．Ｅｇｆｌ７ｍＲＮＡについて、ヒト癌組織ｃＤＮＡパネル（ＢｉｏＣｈａｉｎ社製）を用いて正常組織と癌組織で比較検討した結果を示す写真である。
【配列表フリーテキスト】
【０１２６】
配列番号４〜１１：合成ＤＮＡ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌を検出する方法、癌を検出するためのマーカー、癌を阻害する物質をスクリーニングする方法、および癌を治療するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
内皮細胞で発現および分泌されるＥｇｆｌ７は、血管形成における内皮細胞の増殖に関与することはないが、血管の管腔構造の形成に必須のタンパク質として知られている。それゆえ、胚胎児期や新生児期など発達が進んでいる段階ではＥｇｆｌ７の発現は維持され続ける。一方、成育した生物の多くの器官では、Ｅｇｆｌ７の発現は減少して認められなくなる。しかし、血管の多い肺、心臓および腎臓等の器官、血管創傷による血管再生部、腫瘍等の増殖組織、妊娠期の生殖器官、および炎症組織等ではＥｇｆｌ７の発現が認められる。このことは、Ｅｇｆｌ７の発現が、血管新生および再生に関与していることを示唆している。上記のように、Ｅｇｆｌ７が血管形成における血管の管腔構造の形成に関与していることは知られているものの、この知見以外の機能に関しては解明されていない。
【０００３】
【非特許文献１】Ｌｅｏｎ Ｈ．Ｐａｒｋｅｒら、（２００４），Ｎａｔｕｒｅ，４２８，７５４−７５８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、癌を検出する方法、癌を治療するための医薬組成物、および癌を阻害する物質をスクリーニングする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、Ｅｇｆｌ７が、肝臓などの器官では癌化に伴って発現が増加するが、その他の器官では癌化に伴って発現が低減することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現を測定することを含む、癌を検出する方法。
（２）Ｅｇｆｌ７遺伝子が配列番号１または２の塩基配列で特定される遺伝子である、（１）記載の方法。
（３）Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドからなる、癌を検出するためのマーカー。
（４）Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドが配列番号１または２の塩基配列の全部または一部を含むポリヌクレオチドである、（３）記載のマーカー。
【０００７】
（５）Ｅｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片からなる、癌を検出するためのマーカー。
（６）Ｅｇｆｌ７ポリペプチドが配列番号３のアミノ酸配列の全部または一部を含むポリペプチドである、（５）記載のマーカー。
（７）Ｅｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する抗体を含む、癌を検出するためのキット。
（８）Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドを特異的に増幅するための、少なくとも１５塩基長の連続したプライマーまたはＥｇｆｌ７ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする少なくとも１５塩基長の連続したプローブを含む、癌を検出するためのキット。
（９）Ｅｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する抗体を含む、癌を治療するための医薬組成物。
【０００８】
（１０）Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドおよび／またはその誘導体、またはＥｇｆｌ７ポリペプチドおよび／またはその誘導体を含む、癌を治療するための医薬組成物。
（１１）Ｅｇｆｌ７遺伝子が発現している細胞と被験試料とを接触させ、被験試料の中からＥｇｆｌ７遺伝子の発現を阻害する物質または促進する物質を選択することを含む、癌を阻害する物質をスクリーニングする方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、癌を検出することができる。また、癌を阻害する物質をスクリーニングすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明者らは、血管の管腔構造の形成に必須のタンパク質であるＥｇｆｌ７遺伝子が特定の癌組織において発現が増加し、また別の癌組織においては発現が低減することを見いだした。そして、Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現を測定することにより、癌を検出できることを見いだした。本発明において、遺伝子の発現を測定することには、発現量を測定することおよび発現の有無を検出することが包含される。
【００１１】
本発明において、癌としては、固形癌、血管腫、血管内皮腫、肉腫、カポシ肉腫、造血器腫瘍、腺癌および扁平上皮癌などの種々の悪性腫瘍が包含され、例えば、肝臓癌、肺癌、腎臓癌、小腸癌、大腸癌、卵巣癌、胃癌、舌癌、食道癌、乳癌、子宮癌、咽頭癌等が挙げられる。さらにこれら癌の転移をも包含する。本発明の検出方法は、肝臓癌、肺癌、腎臓癌、大腸癌、小腸癌、卵巣癌の検出に有効であり、特に腎臓癌、肺癌および大腸癌の検出に有効である。
【００１２】
本発明においてＥｇｆｌ７遺伝子の塩基配列は、公知のものが公開されており、例えば、ヒトＥｇｆｌ７遺伝子の塩基配列は、公開されたデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ）においてアクセッションＮｏ．ＢＣ０８８３７１（配列番号１）およびＮｏ．ＢＣ０１２３７７（配列番号２）として登録されている。また、ヒトＥｇｆｌ７遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号３）は、公開されたデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ）において、各々アクセッションＮｏ．ＡＡＨ８８３７１．１およびＮｏ．ＡＡＨ１２３７７．１として登録されている。なお、配列番号２の塩基配列は、配列番号１の塩基配列の第１番塩基〜第２６５番塩基が配列番号２の第１番塩基〜第２５番塩基と置換し、第１５３９番塩基〜第１５６２番塩基が欠落した塩基配列である。各配列は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／から入手できる。
【００１３】
本発明において、その発現を測定するＥｇｆｌ７遺伝子は、検出しようとする対象によって適宜選択することができ、特に限定されないが、通常、脊椎動物由来Ｅｇｆｌ７遺伝子、好ましくは哺乳動物由来のＥｇｆｌ７遺伝子、好ましくはヒト由来Ｅｇｆｌ７遺伝子である。
【００１４】
本発明の一実施形態において、Ｅｇｆｌ７遺伝子は、配列番号１または２の塩基配列で特定される遺伝子である。本発明において、配列番号１または２で特定される遺伝子には、配列番号１または２で表される塩基配列からなる遺伝子、および該遺伝子と機能的に同等の遺伝子が包含される。ここで「機能的に同等」とは、対象となる遺伝子によってコードされるポリペプチドが、配列番号１または２で表される塩基配列からなる遺伝子によってコードされるポリペプチドと同等の生物学的機能、生化学的機能を有することを指す。
【００１５】
あるポリペプチドと機能的に同等のポリペプチドをコードする遺伝子を調製する当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ（１９８９））を利用する方法が挙げられる。なお、本明細書中において、「遺伝子」という用語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡやｃＤＮＡも含むものとする。また、全長遺伝子のみならずＥＳＴも含むものとする。
【００１６】
従って、配列番号１または２で表される塩基配列で特定される遺伝子には、配列番号１または２で表される塩基配列の全部または一部を含む塩基配列からなる遺伝子が包含される。配列番号１または２で表される塩基配列の全部または一部を含む塩基配列からなる遺伝子の塩基長は、機能的に同等であるポリペプチドをコードする限り特に制限されない。塩基配列の一部とは、各塩基配列の一部分の塩基配列であって、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせるのに十分な塩基配列の長さを有するものであり、例えば、少なくとも１５塩基、好ましくは少なくとも１００塩基、より好ましくは少なくとも２００塩基、最も好ましくは少なくとも１０００塩基の配列である。好ましくは各塩基配列において連続する少なくとも１５塩基、好ましくは少なくとも１００塩基、より好ましくは少なくとも２００塩基、最も好ましくは少なくとも１０００塩基の配列である。ここで「連続する」とは、基準とする塩基配列のうち連続した塩基配列を含むことを意味する。
【００１７】
より具体的には、配列番号１で特定される遺伝子には、配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＥｇｆｌ７と同等の生物学的機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなる遺伝子が包含され、配列番号２で特定される遺伝子には、配列番号２からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＥｇｆｌ７と同等の生物学的機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなる遺伝子が包含される。本明細書において、ポリヌクレオチドには、ＤＮＡおよびＲＮＡが包含される。
【００１８】
本明細書において、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、すなわち、各塩基配列に対し高い相同性（相同性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）を有するポリヌクレオチドがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、このような条件は、当該分野において周知慣用な手法、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、マイクロアレイ法またはサザンブロットハイブリダイゼーション法などにおいて、具体的には、コロニーまたはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したメンブランを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ；１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）溶液を用い、６５℃でメンブランを洗浄することにより達成できる。
【００１９】
これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するポリヌクレオチドが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２０】
また、塩基配列情報を基に合成したプライマーを用いる遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、ＬＡＭＰ法などを利用して、各遺伝子と機能的に同等の遺伝子を単離することも可能である。
【００２１】
これらハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により単離される、機能的に同等の遺伝子は、通常、アミノ酸配列レベルにおいて高い相同性または同一性を有する。高い相同性または同一性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも５０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性または同一性を指す。
【００２２】
アミノ酸配列や塩基配列の相同性または同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
【００２３】
癌を検出する方法
本発明における癌を検出する方法は、Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現を測定することを特徴とする。被検体由来の試料中におけるＥｇｆｌ７遺伝子の発現を検出する方法としては、被検体由来の試料中のＥｇｆｌ７遺伝子によってコードされるポリペプチド（本明細書中、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドと称する）を検出する方法、被検体由来の試料中のＥｇｆｌ７遺伝子の全部または一部であるポリヌクレオチド（本明細書中、Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドと称する）、特にＥｇｆｌ７ｍＲＮＡを検出する方法が挙げられる。ここで、Ｅｇｆｌ７ｍＲＮＡの検出には、該ＲＮＡから変換されたｃＤＮＡやｃＲＮＡの検出も包含される。
【００２４】
すなわち、本発明における癌を検出する方法は、Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドまたはＥｇｆｌ７ポリペプチドもしくはその断片をマーカーとして用いるものである。
【００２５】
一実施形態においてＥｇｆｌ７ポリヌクレオチドからなるマーカーは、配列番号１または２の塩基配列の全部または一部を含むポリヌクレオチドからなる。配列番号１または２で表される塩基配列の全部または一部を含むポリヌクレオチドの塩基長は、Ｅｇｆｌ７遺伝子の全部または一部である限り特に制限されない。塩基配列の一部とは、各塩基配列の一部分の塩基配列であって、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせるのに十分な塩基配列の長さを有するものであり、例えば、少なくとも１５塩基、好ましくは少なくとも１００塩基、より好ましくは少なくとも２００塩基の配列である。好ましくは各塩基配列において連続する少なくとも１５塩基、好ましくは少なくとも１００塩基、より好ましくは少なくとも２００塩基の配列である。ストリンジェントな条件については上記のとおりである。
【００２６】
一実施形態において、Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドは、配列番号１もしくは２の塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号１もしくは２からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＥｇｆｌ７と同等の生物学的機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００２７】
一実施形態においてＥｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片からなるマーカーは、配列番号３のアミノ酸配列の全部または一部を含むポリペプチドからなる。配列番号３のアミノ酸配列の全部または一部を含むポリペプチドのアミノ酸鎖長は、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドと同等の機能を有する限り特に制限されない。アミノ酸配列の一部とは、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドの活性を有するのに十分なアミノ酸鎖長を有するものであり、例えば、少なくとも１０残基、好ましくは１００残基、より好ましくは少なくとも２００残基の配列である。好ましくは各アミノ酸配列において連続する少なくとも１０残基、好ましくは１００残基、より好ましくは少なくとも２００残基の配列である。配列番号３のアミノ酸配列の全部または一部を含むポリペプチドには、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、ならびに配列番号３で表されるアミノ酸配列と少なくとも５０％以上の同一性、好ましくは７５％以上の同一性、さらに好ましくは８５％以上の同一性、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが包含される。
【００２８】
別の実施形態においてＥｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片からなるマーカーは、配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなり、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドと同等の生物学的機能を有するポリペプチドからなる。ここで数個とは、通常１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個である。
【００２９】
本明細書において、ポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドも包含され、ポリペプチドには、オリゴペプチドおよびタンパク質が包含される。
【００３０】
１．Ｅｇｆｌ７ポリペプチドの検出
試料中のＥｇｆｌ７ポリペプチドを検出する方法としては、当業者に周知の方法、例えば、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、二重モノクローナル抗体サンドイッチイムノアッセイ法（米国特許第４，３７６，１１０号）、モノクローナルポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ法（Ｗｉｄｅら、ＫｉｒｋｈａｍおよびＨｕｎｔｅｒ編集、「ラジオイムノアッセイ法（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）」、Ｅ．ａｎｄ Ｓ．Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、エジンバラ、（１９７０））、免疫蛍光法、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、プロテインチップによる解析法（蛋白質 核酸 酵素 Ｖｏｌ．４７ Ｎｏ．５（２００２）、蛋白質 核酸 酵素 Ｖｏｌ．４７ Ｎｏ．８（２００２））、２次元電気泳動法、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
以下に、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片と特異的に結合する抗体を用いて、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドの発現を検出する方法について詳述する。Ｅｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片と特異的に反応する抗体は、肝臓などの器官において発現したＥｇｆｌ７ポリペプチドと結合することができるため、該抗体を用いて試料中のＥｇｆｌ７ポリペプチドとの反応を検出することによって、癌を検出することができる。
【００３２】
Ｅｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片と特異的に反応する抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、それぞれＥｇｆｌ７ポリペプチドのエピトープに結合することができる。該抗体のグロブリンタイプは、上記特徴を有するものである限り特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれでもよいが、ＩｇＧおよびＩｇＭが好ましい。本発明におけるモノクローナル抗体には、特に、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種、または特定の抗体クラスもしくはサブクラス由来であり、鎖の残りの部分が別の種、または別の抗体クラスもしくはサブクラス由来である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびに、所望の生物学的活性を有する限り、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片等の免疫反応性の抗体断片が含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号）。
【００３３】
本発明の抗体を作製するにあたり、免疫原（抗原）となるためのポリペプチドを調製する。免疫原ポリペプチドとしては、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片を用いる。本発明において免疫原として使用可能なＥｇｆｌ７ポリペプチドのアミノ酸配列および該ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列は、上記のとおり公開されている。従って、公開されているアミノ酸配列情報を利用して、当技術分野で公知の手法、例えば固相ペプチド合成法などにより、免疫原として使用するためのＥｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片を合成することができる。断片としては、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドの免疫原性を有する断片であればよく、具体的には、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドのうち少なくとも６アミノ酸、好ましくは６〜２００アミノ酸、より好ましくは８〜５０アミノ酸からなる部分ペプチドが挙げられる。免疫原としてＥｇｆｌ７ポリペプチド断片を使用する場合は、ＫＬＨ、ＢＳＡなどのキャリアータンパク質に連結させて使用するのが好ましい。
【００３４】
また、公知の遺伝子組換え手法を利用して、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡの情報を用いてＥｇｆｌ７ポリペプチドを生産することも可能である。以下、組換え手法を用いたＥｇｆｌ７ポリペプチドの生産に関して説明する。
【００３５】
Ｅｇｆｌ７ポリペプチド生産用組換えベクターは、上記公開されているｃＤＮＡ配列を適当なベクターに連結することにより得ることができ、形質転換体は、Ｅｇｆｌ７ポリペプチド生産用組換えベクターを、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドが発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。
【００３６】
ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドが使用される。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ２１ａ、ｐＧＥＸ４Ｔ、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００３７】
ベクターにＥｇｆｌ７ｃＤＮＡを挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００３８】
その他、哺乳動物細胞において用いられるＥｇｆｌ７ポリペプチド生産用組換えベクターには、プロモーター、Ｅｇｆｌ７ｃＤＮＡのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などが連結されていてもよい。
【００３９】
ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。そして、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリングさせた後連結させ、Ｅｇｆｌ７ポリペプチド生産用組換えベクターを作製する。
【００４０】
形質転換に使用する宿主としては、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。
【００４１】
一例として、細菌を宿主とする場合は、Ｅｇｆｌ７ポリペプチド生産用組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、Ｅｇｆｌ７ＤＮＡ、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＲＬなどが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００４２】
酵母、動物細胞、昆虫細胞などを宿主とする場合には、同様に、当技術分野で公知の手法に従って、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドを生産することができる。
【００４３】
本発明において免疫原として使用するＥｇｆｌ７ポリペプチドは、上記作製した形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、または細胞もしくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。上記形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００４４】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００４５】
培養は、通常、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で６〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは中性付近に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４６】
培養後、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドが菌体内または細胞内に生産される場合には、菌体または細胞を破砕することによりＥｇｆｌ７ポリペプチドを抽出する。また、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドが菌体外または細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体または細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中からＥｇｆｌ７ポリペプチドを単離精製することができる。Ｅｇｆｌ７ポリペプチドが得られたか否かは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により確認することができる。
【００４７】
なお、以上の方法によって得られる組換えＥｇｆｌ７ポリペプチドには、他の任意のタンパク質との融合タンパク質も含まれる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）や緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）との融合タンパク質などが例示できる。さらに、形質転換細胞で発現されたペプチドは、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾されたペプチドもＥｇｆｌ７ポリペプチドとして用いることができる。このような翻訳後修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。
【００４８】
次に、得られたタンパク質を緩衝液に溶解して免疫原を調製する。なお、必要であれば、免疫を効果的に行うためにアジュバントを添加してもよい。アジュバントとしては、市販の完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント等が挙げられ、これらの何れのものを混合してもよい。
【００４９】
モノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマ法（ＫＯＨＬＥＲ ＡＮＤ ＭＩＬＳＴＥＩＮ，ＮＡＴＵＲＥ（１９７５）２５６：４９５)、または、組換え方法（米国特許第４，８１６，５６７号）により製造してもよい。また、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。例えば、以下のようにして作製することができる。
【００５０】
ｉ）免疫および抗体産生細胞の採取
上記のようにして得られた免疫原を、哺乳動物、例えばラット、マウス（例えば近交系マウスのＢＡＬＢ／ｃ）、ウサギなどに投与する。免疫原の１回の投与量は、免疫動物の種類、投与経路などにより適宜決定されるものであるが、動物１匹当たり約５０〜２００μｇである。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に免疫原を注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、初回免疫後、数日から数週間間隔で、好ましくは１〜４週間間隔で、２〜６回、好ましくは３〜４回追加免疫を行う。初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したときは、免疫原を静脈内または腹腔内に注射し、最終免疫とする。そして、最終免疫の日から２〜５日後、好ましくは３日後に、抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞または局所リンパ節細胞が好ましい。
【００５１】
ｉｉ）細胞融合
ハイブリドーマを得るため、上述のように免疫動物から得た抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。
【００５２】
抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。また株化細胞は、免疫動物と同種系の動物に由来するものが好ましい。ミエローマ細胞の具体例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損細胞株である、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ．８株、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１株、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１株、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３株またはＳｐ２／０−Ａｇ１４株などが挙げられる。
【００５３】
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを約１：１〜２０：１の割合で混合し、細胞融合促進剤の存在下にて融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１，５００〜４，０００ダルトンのポリエチレングリコール等を約１０〜８０％の濃度で使用することができる。また場合によっては、融合効率を高めるために、ジメチルスルホキシドなどの補助剤を併用してもよい。さらに、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
【００５４】
ｉｉｉ）ハイブリドーマの選別およびクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を、例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に２×１０５個／ウエル程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。培養温度は、２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株またはチミジンキナーゼ（ＴＫ）欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞とミエローマ細胞のハイブリドーマのみを選択的に培養し、増殖させることができる。その結果、選択培地で培養開始後、約１０日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
【００５５】
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採取し、酵素免疫測定法（ＥＩＡ：Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏ ＡｓｓａｙおよびＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ）等によって行うことができる。
【００５６】
融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立する。本発明のハイブリドーマは、後述するように、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ等の基本培地中での培養において安定であり、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドと特異的に反応するモノクローナル抗体を産生、分泌するものである。
【００５７】
ｉｖ）モノクローナル抗体の採取
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法または腹水形成法等を採用することができる。
【００５８】
細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＤＭＥＭ培地または無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃，５％ＣＯ２濃度）で２〜１０日以上培養し、その培養上清から抗体を取得する。
【００５９】
腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１×１０７個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜４週間後に腹水または血清を採取する。
【００６０】
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫酸アンモニウム沈澱、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせることにより、精製された本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。
【００６１】
ｖ）ポリクローナル抗体の採取
ポリクローナル抗体を作製する場合は、前記と同様に動物を免疫し、最終の免疫日から６〜６０日後に、酵素免疫測定法（ＥＩＡおよびＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。その後は、抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をＥＬＩＳＡ法などで測定する。
【００６２】
Ｅｇｆｌ７ポリペプチドに対する抗体を用いて被検体由来の試料中のＥｇｆｌ７遺伝子の発現を検出し、癌を検出する場合には、被検体の試料中のＥｇｆｌ７ポリペプチドに対する抗体またはその標識化抗体と結合する抗原ポリペプチドを測定することにより、癌の存在を検出できる。そして癌患者またはそのハイリスク者であると判定することができる。すなわち、ここで使用する抗体または標識化抗体は、癌により生じた細胞で発現しているＥｇｆｌ７ポリペプチドと特異的に結合する抗体であるから、非癌患者に由来する試料と比較して、この抗体と結合する抗原ポリペプチドの量が増加又は低減した試料を、癌化した細胞を含む試料および／または癌患者またはそのハイリスク患者に由来する試料として判定することができる。なおその際に、好ましくは２種類以上、好ましくは５種類以上、さらに好ましくは１０種類以上、最も好ましくは１５〜３９種類の抗体について試料中のＥｇｆｌ７ポリペプチドとの結合を判定する。被検体由来の試料としては、血液、臓器・組織、細胞などの生体由来試料を対象とすることができる。
【００６３】
癌のうち、腎臓癌、肺癌、小腸癌、大腸癌および卵巣癌、特に腎臓癌、肺癌および大腸癌については、試料中において、非癌患者に由来する試料と比較して、該抗原ポリペプチドの量が低減している場合に、癌患者またはそのハイリスク患者であると判定することができる。一方、癌のうち、肝臓癌については、試料中において、非癌患者に由来する試料と比較して、該抗原ポリペプチドの量が増加している場合に、癌患者またはそのハイリスク患者であると判定することができる。
【００６４】
また別の態様は、抗体とＥｇｆｌ７ポリペプチドとの結合を液相系において行う方法である。例えば、標識化抗体と試料とを接触させて標識化抗体とＥｇｆｌ７ポリペプチドを結合させ、この結合体を分離し、標識シグナルを検出する。
【００６５】
液相系での検出の別の方法は、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドに対する抗体（一次抗体）と試料とを接触させて一次抗体と抗原ポリペプチドを結合させ、この結合体に標識化抗体（二次抗体）を結合させ、この三者の結合体における標識シグナルを検出する。あるいは、さらにシグナルを増強させるためには、非標識の二次抗体を先ず抗体＋抗原ポリペプチド結合体に結合させ、この二次抗体に標識物質を結合させるようにしてもよい。このような二次抗体への標識物質の結合は、例えば二次抗体をビオチン化し、標識物質をアビジン化しておくことによって行うことができる。あるいは、二次抗体の一部領域（例えば、Ｆｃ領域）を認識する抗体（三次抗体）を標識し、この三次抗体を二次抗体に結合させるようにしてもよい。なお、一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。液相からの結合体の分離やシグナルの検出は上記と同様とすることができる。
【００６６】
また別の態様は、抗体とＥｇｆｌ７ポリペプチドとの結合を固相系において試験する方法である。この固相系における方法は、極微量のＥｇｆｌ７ポリペプチドの検出と操作の簡便化のため好ましい方法である。すなわちこの固相系の方法は、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドに対する抗体（一次抗体）を固相（樹脂プレート、メンブレン、ビーズ等）に固定化し、この固定化抗体にＥｇｆｌ７ポリペプチドを結合させ、非結合ペプチドを洗浄除去した後、プレート上に残った抗体＋Ｅｇｆｌ７結合体に標識化抗体（二次抗体）を結合させ、この二次抗体のシグナルを検出する方法である。この方法は、いわゆる「サンドイッチ法」と呼ばれる方法であり、マーカーとして酵素を用いる場合には、ＥＬＩＳＡとして広く用いられている方法である。一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。シグナルの検出は上記と同様とすることができる。
【００６７】
２．Ｅｇｆｌ７ｍＲＮＡの検出
被検体由来の試料中のＥｇｆｌ７ｍＲＮＡを検出する方法としては、Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドを特異的に増幅するための、少なくとも１５塩基長の連続したプライマーまたはＥｇｆｌ７ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする少なくとも１５塩基長の連続したプローブを用いて被検体由来の試料中のＥｇｆｌ７遺伝子の発現を検出する方法が挙げられる。
【００６８】
該プライマーまたはプローブは、被検体由来の試料中に発現しているＥｇｆｌ７遺伝子のｍＲＮＡまたはｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡまたはｃＲＮＡと特異的に結合することから、これらを用いて試料中のＥｇｆｌ７遺伝子の発現を検出することができる。
【００６９】
本発明のプライマーは、Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドの少なくとも一部を増幅するものであればよい。プライマーおよびプローブは、当業者に公知の手法に従って、設計することができる。プライマーおよびプローブ設計の留意点として、例えば以下を指摘することができる。
【００７０】
プライマーとして実質的な機能を有する長さは、通常１５塩基以上、好ましくは１６〜５０塩基であり、さらに好ましくは１８〜３０塩基である。またプローブとして実質的な機能を有する長さとしては、通常１５塩基以上、好ましくは１６〜１０００塩基、さらに好ましくは５０〜５００塩基である。
【００７１】
また設計の際には、プライマーまたはプローブの融解温度（Ｔｍ）を確認することが好ましい。Ｔｍとは、任意のポリヌクレオチド鎖の５０％がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度を意味し、鋳型ポリヌクレオチドとプライマーまたはプローブとが二本鎖を形成してアニーリングまたはハイブリダイズするためには、アニーリングまたはハイブリダイゼーションの温度を最適化する必要がある。一方、この温度を下げすぎると非特異的な反応が起こるため、温度は可能な限り高いことが望ましい。従って、設計しようとするプライマーまたはプローブのＴｍは、増幅反応またはハイブリダイゼーションを行う上で重要な因子である。Ｔｍの確認には、公知のプライマーまたはプローブ設計用ソフトウエアを利用することができ、本発明で利用可能なソフトウエアとしては、例えばＯｌｉｇｏＴＭ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．（米国）製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウェア開発（株）（日本）製）などが挙げられる。またＴｍの確認は、ソフトウエアを使わず、自ら計算することによっても行うことができる。その場合には、最近接塩基対法（Ｎｅａｒｅｓｔ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ Ｍｅｔｈｏｄ）、Ｗａｌｌａｎｃｅ法、ＧＣ％法等に基づく計算式を利用することができる。本発明では、平均Ｔｍが約４５〜６５℃であることが好ましい。
【００７２】
プライマーまたはプローブとして特異的なアニーリングまたはハイブリダイズが可能な条件としては、その他にもＧＣ含量などがあり、そのような条件は当業者に周知である。
【００７３】
上述のように設計したプライマーおよびプローブは、当業者に公知の方法に従って調製することができる。さらに、当業者には周知のように、プライマーまたはプローブには、アニーリングまたはハイブリダイズする部分以外の配列、例えばタグ配列などの付加配列が含まれていてもよく、上述したプライマーまたはプローブにそのような付加配列が付加されたものも本発明の範囲内に含まれるものとする。
【００７４】
ヒトＥｇｆｌ７ポリヌクレオチドを特異的に増幅するためのプライマーとしては、配列番号１の塩基配列から選定した少なくとも２種類の連続した１５塩基以上の塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであって、かつ選定したオリゴヌクレオチド間に１塩基以上の間隔を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号２の塩基配列から選定した少なくとも２種類の連続した１５塩基以上の塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであって、かつ選定したオリゴヌクレオチド間に１塩基以上の間隔を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットが挙げられる。
【００７５】
ヒトＥｇｆｌ７ポリヌクレオチドを特異的に増幅するためのプライマーとしては、具体的には、配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットが挙げられる。アフリカツメガエルＥｇｆｌ７ポリヌクレオチドを特異的に増幅するためのプライマーとしては、具体的には、配列番号８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットが挙げられる。
【００７６】
被検体由来の試料におけるＥｇｆｌ７遺伝子の発現を検出するためには、上記プライマーおよび／またはプローブをそれぞれ増幅反応またはハイブリダイゼーション反応において用い、その増幅産物またはハイブリッド産物を検出する。
【００７７】
被検体由来の試料としては、血液、臓器・組織、細胞などの生体由来試料を対象とすることができる。
【００７８】
増幅反応またはハイブリダイゼーション反応を行う場合には、通常は、被検体由来の試料から被検ポリヌクレオチドを調製する。被検ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれでもよい。ＤＮＡまたはＲＮＡは、当技術分野で周知の方法を適宜使用して抽出することができる。例えば、ＤＮＡを抽出する場合には、フェノール抽出およびエタノール沈殿を行う方法、ガラスビーズを用いる方法など、またＲＮＡを抽出する場合には、グアニジン−塩化セシウム超遠心法、ホットフェノール法、またはチオシアン酸グアジニウム−フェノール−クロロホルム（ＡＧＰＣ）法などを利用することができる。以上のように調製した試料または被検ポリヌクレオチドを用いて、以下に示す増幅反応および／またはハイブリダイゼーション反応を行う。
【００７９】
抽出されたＲＮＡはさらに精製してｍＲＮＡとして使用することが好ましい。精製方法は特に限定されないが、真核細胞の細胞質に存在するｍＲＮＡの多くは、その３’端にポリ（Ａ）配列を持つため、この特徴を利用して、例えば、以下のように実施することができる。まず抽出した全ＲＮＡにビオチン化オリゴ（ｄＴ）プローブ を加えてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを吸着させる。次に、ストレプトアビジンを固定化した常磁性粒子担体を加え、ビオチン／ストレプトアビジン間の結合を利用して、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを捕捉させる。洗浄操作の後、最後にオリゴ（ｄＴ）プローブからポリ（Ａ）＋ＲＮＡを溶出する。また、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用いてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを吸着させ、これを溶出して精製する方法を採用してもよい。溶出されたポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、さらに、ショ糖密度勾配遠心法等により分画してもよい。
【００８０】
プライマーを用いて被検ポリヌクレオチドを鋳型とした増幅反応を行い、その特異的増幅反応を検出することにより、試料中のＥｇｆｌ７遺伝子の発現を検出することができる。
【００８１】
増幅手法としては、特に限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の原理を利用した公知の方法、例えば、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法等が挙げられる。その他の増幅手法としては、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）法、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などを挙げることができる。増幅は、増幅産物が検出可能なレベルになるまで行う。
【００８２】
例えば、ＰＣＲ法は、被検ポリヌクレオチドであるＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼにより、一対のプライマー間の塩基配列を合成するものである。ＰＣＲ法によれば、変性、アニーリングおよび合成からなるサイクルを繰り返すことによって、増幅断片を指数関数的に増幅させることができる。ＰＣＲ法の最適条件は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００８３】
またＲＴ−ＰＣＲ法では、まず、被検ポリヌクレオチドであるＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素反応によりｃＤＮＡを作製し、その後、作製したｃＤＮＡを鋳型として一対のプライマーを用いてＰＣＲ法を行うものである。
【００８４】
なお、増幅手法として競合ＰＣＲ法やリアルタイムＰＣＲ法等の定量的ＰＣＲ法などを採用することにより、定量的な検出が可能となる。リアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ）法では、５’端は蛍光色素（レポーター）で、３’端は消光剤（クエンチャー）で標識した、目的遺伝子の特定領域にハイブリダイズするプローブが使用される。プローブは、通常の状態ではクエンチャーによってレポーターの蛍光が抑制されている。この蛍光プローブ を目的遺伝子に完全にハイブリダイズさせた状態で、その外側からＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進むと、そのエキソヌクレアーゼ活性により蛍光プローブ が５’端から加水分解され、レポーター色素が遊離し、蛍光を発する。リアルタイムＰＣＲ法は、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングすることにより、鋳型ＤＮＡの初期量を定量する。
【００８５】
またＬＡＭＰ法では、計６領域の塩基配列を認識する４種類のオリゴヌクレオチドからなるプライマー、鎖置換合成活性を有する核酸合成酵素、および基質を用い、熱変性工程を必要とせずに、終始等温で速やかに特異性の高い遺伝子増幅反応が進行する。ＬＡＭＰ法の最適条件は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００８６】
上記増幅反応後に特異的な増幅反応が起こったか否かを検出するには、増幅反応により得られる増幅産物を特異的に認識することができる公知の手段を用いることができる。例えば、アガロースゲル電気泳動法等を利用して、特定のサイズの増幅断片が増幅されているか否かを確認することにより、特異的な増幅反応を検出することができる。
【００８７】
あるいは、増幅反応の過程で取り込まれるｄＮＴＰに、放射性同位体、蛍光物質、発光物質などの標識体を作用させ、この標識体を検出することができる。放射性同位体としては、３２Ｐ、１２５Ｉ、３５Ｓなどを用いることができる。また蛍光物質としては、例えば、フルオレセン（ＦＩＴＣ）、スルホローダミン（ＳＲ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）などを用いることができる。また発光物質としてはルシフェリンなどを用いることができる。
【００８８】
これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、特に制限されることはなく、従来公知の各種手段を用いることができる。例えば標識体の導入方法としては、放射性同位体を用いるランダムプライム法が挙げられる。
【００８９】
標識したｄＮＴＰを取り込んだ増幅産物を観察する方法としては、上述した標識体を検出するための当技術分野で公知の方法であればいずれの方法でもよい。例えば、標識体として放射性同位体を用いた場合には、放射活性を、例えば液体シンチレーションカウンター、γ−カウンターなどにより計測することができる。また標識体として蛍光を用いた場合には、その蛍光を蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダーなどを用いて検出することができる。
【００９０】
以上のようにして特異的な増幅反応の増減により、試料においてＥｇｆｌ７遺伝子の発現の増減を検出できる。試料中においてＥｇｆｌ７遺伝子の発現が、非癌患者に由来する試料と比較して、増加又は低減している場合に、癌が存在すると判定できる。
【００９１】
癌のうち、腎臓癌、肺癌、小腸癌、大腸癌および卵巣癌、特に腎臓癌、肺癌および大腸癌については、試料中において、非癌患者に由来する試料と比較して、Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現が低減している場合に、癌患者またはそのハイリスク患者であると判定することができる。一方、癌のうち、肝臓癌については、試料中において、非癌患者に由来する試料と比較して、Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現が増加している場合に、癌患者またはそのハイリスク患者であると判定することができる。
【００９２】
また、プローブを用いて試料または被検ポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーション反応を行い、その特異的結合（ハイブリッド）を検出することにより、Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現を検出することもできる。
【００９３】
ハイブリダイゼーション反応は、プローブがＥｇｆｌ７ポリヌクレオチドのみと特異的に結合するような条件、すなわちストリンジェントな条件下で行う必要がある。そのようなストリンジェントな条件は当技術分野で周知であり、特に限定されない。ストリンジェントな条件としては、例えばナトリウム濃度が、１０〜３００ｍＭ、好ましくは２０〜１００ｍＭであり、温度が２５〜７０℃、好ましくは４２〜６５℃における条件が挙げられる。
【００９４】
ハイブリダイゼーションを行う場合には、プローブに蛍光標識（フルオレセイン、ローダミンなど）、放射性標識（３２Ｐなど）、酵素標識（アルカリホスファターゼ、西洋ワサビパーオキシダーゼ等）、ビオチン標識等の適当な標識を付加することができる。従って、以下に述べる本発明の検出用キットには、上記のような標識を付加したプローブも含まれる。
【００９５】
標識化プローブを用いた検出は、試料またはそれから調製した被検ポリヌクレオチドとプローブとをハイブリダイズ可能なように接触させることを含む。「ハイブリダイズ可能なように」とは、上述したストリンジェントな条件下にて特異的な結合が起こる環境（温度、塩濃度）において、ということである。具体的には、試料または被検ポリヌクレオチドをスライドグラス、メンブラン、マイクロタイタープレート等の適当な固相に固定化し、標識を付加したプローブを添加することにより、プローブと試料または被検ポリヌクレオチドとを接触させてハイブリダイゼーション反応を行い、ハイブリダイズしなかったプローブを除去した後、試料または被検ポリヌクレオチドとハイブリダイズしているプローブの標識を検出する。標識が検出された場合には、試料においてＥｇｆｌ７遺伝子が発現していることとなる。
【００９６】
また、標識の濃度を指標とすることにより、定量的な検出も可能となる。標識化プローブを用いた検出方法の例としては、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）法等を挙げることができる。
【００９７】
上記で述べたような本発明の検出方法における判定基準としては、典型的には、ＲＯＣ曲線（受信者動作特性曲線）を作成してカットオフ値（病態識別値）を設定し、所定のカットオフ値を基準として、癌が存在すること、ならびに癌を伴う患者またはハイリスク患者であることを判定する方法が挙げられる。
【００９８】
その他の検出方法として、例えば、サブトラクション法（Ｓｉｖｅ，Ｈ．Ｌ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ，Ｔ．Ｓｔ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６，１０９３７、Ｗａｎｇ，Ｚ．，ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．Ｄ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８，１１５０５−１１５０９）、ディファレンシャル・ディスプレイ法（Ｌｉａｎｇ，Ｐ．，ａｎｄ Ｐａｒｄｅｅ，Ａ．Ｂ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７，９６７−９７１、Ｌｉａｎｇ，Ｐ．，Ａｖｅｒｂｏｕｋｈ，Ｌ．，Ｋｅｙｏｍａｒｓｉ，Ｋ．，Ｓａｇｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ Ｐａｒｄｅｅ，Ａ．Ｂ．（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２，６９６６−６９６８）、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法（Ｊｏｈｎ，Ｔ．Ｓｔ．，ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．Ｃｅｌｌ（１９７９）１６，４４３−４５２）、また、適当なプローブ を用いたクロスハイブリダイゼーション法（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．（１９８２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． ｐｒｅｓｓ）等が挙げられる。
【００９９】
癌を検出するためのキット
本発明はまた、癌を検出するためのキットに関する。該キットは、Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現を検出する手段として、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドもしくはその断片と特異的に結合する抗体、Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドを特異的に増幅するための少なくとも１５塩基長の連続したプライマー、およびＥｇｆｌ７をコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする少なくとも１５塩基長の連続したプローブから選択される少なくとも１種を含む。このようなキットとしては、被検成分の種類に応じて各種のものが市販されており、本発明のキットも、Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現を検出する上記手段を用いることを除き、公知公用のキットに用いられている各要素によって構成することができる。Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現を検出するためのプライマー、プローブまたは抗体に加え、例えば、標識二次抗体、担体、洗浄バッファー、試料希釈液、酵素基質、反応停止液、標準物質等を含みうる。
【０１００】
医薬組成物
本発明により、Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現が特定の癌、特に肝臓癌の組織において増加することから、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する抗体を投与することにより、癌を治療することが可能であると考えられる。従って、本発明の一実施形態では、Ｅｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する抗体を含む、癌を治療するための医薬組成物に関する。
【０１０１】
さらに、本発明者らは、Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現が、特定の癌、特に腎臓癌、肺癌、小腸癌、大腸癌および卵巣癌の癌組織において低減することから、癌細胞においてＥｇｆｌ７遺伝子を発現させることにより、もしくはＥｇｆｌ７ポリヌクレオチドおよび／またはその誘導体、またはＥｇｆｌ７ポリペプチドおよび／またはその誘導体を投与することにより、癌を治療することが可能であると考えられる。
【０１０２】
従って、本発明の一実施形態では、Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドおよび／またはその誘導体含む癌を治療するための医薬組成物、ならびにＥｇｆｌ７ポリペプチドおよび／またはその誘導体を含む癌を治療するための医薬組成物に関する。
【０１０３】
ポリヌクレオチド誘導体としては、例えば、ポリヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合またはＮ３’−Ｐ５’ホスホアミダイト結合などに変換されたポリヌクレオチド誘導体、リボースとリン酸ジエステル結合がペプチド結合に変換されたポリヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピオニルウラシルまたはＣ−５チアゾールウラシルなどで置換されたポリヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピオニルシトシンまたはフェノキサジン修飾シトシンなどで置換されたポリヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースまたは２’−メトキシエトキシリボースなどで置換されたポリヌクレオチド誘導体などを挙げることができる。ポリペプチド誘導体としては、その他のポリペプチドと融合した融合ポリペプチド、ポリエチレングリコールなどのポリマーに結合させた化学修飾ポリペプチドなどが挙げられる。
【０１０４】
Ｅｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する抗体、Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドおよびＥｇｆｌ７ポリペプチドならびにその誘導体は、通常は薬学的に許容される一つ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬組成物として提供するのが望ましい。投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与を挙げることができる。
【０１０５】
Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドまたはその誘導体を、癌疾患の治療に使用する場合は、Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドを注射により直接投与する方法のほか、該ポリヌクレオチドが組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。また、本発明の遺伝子をリポソームなどのリン脂質小胞に導入し、そのリポソームを投与する方法を採用してもよい。Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドの投与経路としては、通常の静脈内、動脈内等の全身投与のほか、免疫系組織（骨髄、リンパ節など）に局所投与を行うことができる。さらに、カテーテル技術、外科的手術等と組み合わせた投与経路を採用することもできる。
【０１０６】
癌を阻害する物質をスクリーニングする方法
本発明はまた、癌を阻害する物質をスクリーニングする方法に関する。本発明のスクリーニング方法は、Ｅｇｆｌ７遺伝子が発現している細胞と、被験試料とを接触させ、被験試料の中からＥｇｆｌ７遺伝子の発現を阻害する物質またはＥｇｆｌ７遺伝子の発現を促進する物質を選択することを特徴とするものである。Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現を測定する方法については、上記のとおりである。
【０１０７】
Ｅｇｆｌ７遺伝子が発現している細胞と、被験試料とを接触させたときに、Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現が阻害されたときには、当該試料に肝臓癌の進展を阻害する物質が含まれていると判定することができる。一方、Ｅｇｆｌ７遺伝子が発現している細胞と、被験試料とを接触させたときに、Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現が促進されたときには、当該試料に腎臓癌、肺癌、小腸癌、大腸癌および卵巣癌、特に腎臓癌、肺癌および大腸癌の進展を阻害する物質が含まれていると判定することができる。
【０１０８】
スクリーニングの対象とする被験試料としては、特に制限はなく、例えば、細胞抽出液、合成低分子化合物のライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプチドのライブラリーなどが挙げられる。
【実施例】
【０１０９】
（方法）
１）受精卵の準備
受精卵の採取１６時間前、アフリカツメガエルの雄および雌の皮下に、各々６００ＩＵのゴナトトロピンを注射し自然交配によって受精卵を得た。該受精卵を４．５％ Ｌ−システイン塩酸塩（ｐＨ７．８）を含有したＳｔｅｉｎｂｅｒｇ氏液（５８ｍＭ ＮａＣｌ、０．６７ｍＭ ＫＣｌ、０．３４ｍＭ Ｃａ（ＮＯ３）２・２４Ｈ２Ｏ、０．８３ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３．０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）を用いて脱ゼリーした後に２０℃条件下に置いて胞胚期（Ｎｉｅｕｗｋｏｏｐ ａｎｄ Ｆａｂｅｒのステージ表によるステージ９）になるまで発生を継続した。
【０１１０】
２）再集合培養
胞胚期（ステージ９）の胚より、卵膜をピンセットを用いて剥離した後に０．６ｍｍ×０．６ｍｍの大きさの未分化予定外胚葉領域（アニマルキャップ）の断片を５枚切り出し、３％寒天上にＳｔｅｉｎｂｅｒｇ氏液を満たしたシャーレ内で、ＣａおよびＭｇを含まないＳｔｅｉｎｂｅｒｇ氏液（ＣＭＦ−Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ氏液）を用いたピペッティングにより細胞を解離させた。
【０１１１】
解離させた該細胞を、０．１％の脂肪酸を含まないウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む４ｍＭ 塩酸溶液中に溶解した０．４ｎｇ／ｍＬ アクチビンＡによる単独処理、もしくは該０．４ｎｇ／ｍＬ アクチビンＡおよび１００ｎｇ／ｍＬ アンジオポエチン２（ＴＥＣＨＮＥ社）による共処理を、０．１％ ＢＳＡを含むＣＭＦ−Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ氏液中で１時間行った。その後、Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ氏液にて５回洗浄し、Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ氏液中で集合体を形成させた。
【０１１２】
３）プローブの作製
ｃＤＮＡ断片をクローニングして作製したプラスミドを制限酵素ＳｐｅIもしくはＳａｃIIで消化し、それをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼもしくはＳｐ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡの合成を行い、プローブとした。このとき、基質には１０×ＤＩＧ ＲＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用した。
【０１１３】
４）マイクロアレイによる検出
８，０９１クローンのアフリカツメガエルｃＤＮＡから６０ｍｅｒのオリゴＤＮＡを貼付したＤＮＡマイクロアレイを作製し、検出に使用した。一方、０．４ｎｇ／ｍＬ アクチビンＡ単独処理もしくは０．４ｎｇ／ｍＬ アクチビンＡおよび１００ｎｇ／ｍＬ アンジオポエチン２の共処理を施した集合体を２日間、２０℃で培養した後に、全てのＲＮＡを抽出した。該抽出ＲＮＡより、Ｌｏｗ ＲＮＡ Ｉｎｐｕｔリニア増幅アンドラベル化キット（アジレント社製）を用いて、ｃｙ３標識（ｃｙａｎｉｎｅ ３−ＣＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製））およびｃｙ５標識（ｃｙａｎｉｎｅ ５−ＣＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製））で標識したＲＮＡを調製した。ハイブリダイゼーションチャンバに該ＤＮＡマイクロアレイおよび該標識ＲＮＡを適用し、ハイブリダイゼーションを６０℃で１７時間実施した。ハイブリダイゼーションの終了後、アジレントマイクロアレイスキャナを使用して解析を行った。
【０１１４】
５）ＲＮＡの調製
全ＲＮＡの抽出はＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を使用して実施した。
【０１１５】
６）逆転写反応
逆転写反応は、スーパースクリプトファーストストランドシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用し、ランダムプライマー（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて行った。
【０１１６】
７）ＰＣＲ
ＰＣＲ反応には、Ｅｘｐａｎｄ ｌｏｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用した。使用したプライマーの配列およびアニール温度は以下の通りである。
（ヒト）
Ｈ．Ｅｇｆｌ７：
５’−ＡＧＣＡＡＴＡＴＧＣＣＡＧＣＣＧＣＣＡＴ−３’（配列番号４）
５’−ＴＣＡＣＧＡＧＴＣＴＴＴＣＴＴＧＣＡＧＧ−３’（配列番号５）
アニール温度６０℃、３５サイクル
Ｇ３ＰＤＨ：
５’−ＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴ−３’（配列番号６）
５’−ＣＡＴＧＴＧＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣ−３’（配列番号７）
アニール温度６８℃、２７サイクル
（アフリカツメガエル）
Ｘ．Ｅｇｆｌ７：
５’−ＣＣＧＡＴＴＧＣＡＡＴＧＴＣＡＧＡＡＣＧ−３’（配列番号８）
５’−ＴＣＡＡＡＧＣＴＣＣＧＴＣＴＴＧＣＡＴＧ−３’（配列番号９）
アニール温度６０℃、３８サイクル
ＯＤＣ：
５’−ＣＡＧＣＴＡＧＣＴＧＴＧＧＴＧＴＧＧ−３’（配列番号１０）
５’−ＣＡＡＣＡＴＧＧＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＣ−３’（配列番号１１）
アニール温度５５℃、２４サイクル
なお、ヒト組織での発現には、ヒトｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃＤＮＡ ｐａｎｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を鋳型として使用した。また、ヒト癌組織での発現には、ヒト癌組織ｃＤＮＡパネル（ＢｉｏＣｈａｉｎ社製）を鋳型として使用した。
【０１１７】
８）Ｗｈｏｌｅ−ｍｏｕｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
正常胚を１０％ 中性緩衝ホルマリン液中で固定した後に、１００％ メタノールを用いて脱水した。脱水した後に、Ｔｗｅｅｎ ２０を含有したＰＢＳ溶液と置き換え、９５℃で変性させて、４％ パラホルムアルデヒドで再度固定した。再固定後、再度Ｔｗｅｅｎ ２０を含有したＰＢＳ溶液と置き換えて試料とし、自動ｗｈｏｌｅ−ｍｏｕｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション装置ｉｎ ｓｉｔｕ ｐｒｏ（ＡＢＩＭＥＤ社製）に適用した。発色にはＢＭパープル（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用した。
【０１１８】
（結果）
１）アフリカツメガエル胚未分化細胞からの血管内皮細胞の誘導
解離集合体に０．４ｎｇ／ｍＬ アクチビン単独処理もしくは０．４ｎｇ／ｍＬ アクチビンおよび１００ｎｇ／ｍＬ アンジオポエチン２の共処理を施すことにより血管内皮様細胞が誘導できるか検討した。その結果、アクチビン単独処理に比較して、アクチビンおよびアンジオポエチン２の共処理において、血管内皮細胞のマーカーであるｍｓｒおよびｔｉｅ２遺伝子の発現が著しく増加していることが判明した。このことより、アクチビンおよびアンジオポエチン２の共処理によって解離集合体から血管内皮細胞が誘導されたと考えられた（図１）。さらに、赤血球のマーカーであるｇｌｏｂｉｎ遺伝子の発現について検討した結果、ｇｌｏｂｉｎ遺伝子の発現はいずれの場合も認められなかった。すなわち、アクチビンおよびアンジオポエチン２の共処理を行うことにより、血管内皮細胞が誘導される反面、赤血球は誘導されないことが判明し、血管内皮細胞のみを誘導する系を作り出すことができた。この結果、血管の細胞分化や遺伝子解析において有用な実験系が確立された。
【０１１９】
２）マイクロアレイによる解析
０．４ｎｇ／ｍＬ アクチビン単独処理ならびに０．４ｎｇ／ｍＬ アクチビンおよび１００ｎｇ／ｍＬ アンジオポエチン２の共処理による遺伝子発現をＤＮＡマイクロアレイ用いて比較して、血管形成に関与する遺伝子の探索を試みた。解離集合体に０．４ｎｇ／ｍＬ アクチビン単独処理もしくは０．４ｎｇ／ｍＬ アクチビンおよび１００ｎｇ／ｍＬ アンジオポエチン２の共処理を施した後、４８時間経過した時の遺伝子発現量の比較を行った結果、両者の遺伝子発現が２倍以上の差が認められた遺伝子として５７遺伝子が得られた。このうち共処理することにより３４遺伝子が増加し、２３遺伝子が減少した。遺伝子発現が増加した遺伝子群を表１に、遺伝子発現が減少した遺伝子群を表２に示す。
【０１２０】
【表１】
【０１２１】
【表２】
【０１２２】
３）Ｗｈｏｌｅ−ｍｏｕｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる遺伝子発現部位の特定
ＤＮＡマイクロアレイによる解析の結果で遺伝子発現が２倍以上の差が認められた５７遺伝子のうち、２倍以上増加したものの中から筋肉で発現しているものを除いた１２遺伝子についてアフリカツメガエル胚における発現部位を特定した。この結果、２遺伝子（ｘｌ．９４８０およびｘｌ．２３２７０）が血管で発現していた（図２）。ｘｌ．２３２７０に関しては、血管形成に関与する遺伝子であると報告されているＥｇｆｌ７遺伝子であった（Ｌｅｏｎ Ｈ．Ｐａｒｋｅｒら、（２００４），Ｎａｔｕｒｅ，４２８，７５４−７５８）。
【０１２３】
４）Ｘ．Ｅｇｆｌ７の時間的発現の検討
アフリカツメガエル血管で新たに発現が認められた遺伝子Ｘ．Ｅｇｆｌ７が、発生のどの段階から発現が見られるかをＲＴ−ＰＣＲ（図３）およびＷｈｏｌｅ−ｍｏｕｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（図４）を用いて検討した。この結果、発生のステージ２４から遺伝子Ｘ．Ｅｇｆｌ７が発現していることが判明した。この時期はアフリカツメガエルにおいて血管が形成されてくる時期で、すなわち、血管形成の時期と遺伝子Ｘ．Ｅｇｆｌ７の発現が見られる時期が一致していることが分った。
【０１２４】
５）Ｈ．Ｅｇｆｌ７の組織特異的発現の検討
さらに、ヒトＥｇｆｌ７のプライマーを作製し、ヒト癌組織ｃＤＮＡパネル（ＢｉｏＣｈａｉｎ社製）を用いてヒト癌組織で発現が増減しているかを検討した（図５）。その結果、Ｅｇｆｌ７は肝臓において癌組織での発現量の増加が認められた。一方、腎臓、肺、大腸、小腸、および卵巣などのその他の組織では癌組織での発現量の低減が見られた。特に、腎臓癌、肺癌、大腸癌において著しい低減が認められ、新規癌マーカーになるものと期待される。また、発現の低減がみられる癌細胞においてこの遺伝子産物を発現させることにより、癌細胞の異常増殖を抑制できることも期待され、遺伝子治療への応用も考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】解離集合体におけるｍｓｒおよびｔｉｅ２の発現解析の結果を示す。解離集合体に０．４ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ単独処理、または０．４ｎｇ／ｍＬアクチビンＡおよび１００ｎｇ／ｍＬアンジオポエチン２の共処理を施した結果を示す写真である。
【図２】遺伝子ｘｌ．９４８０およびｘｌ．２３２７０が、アフリカツメガエル胚において血管部分で発現していることを示す写真である。ｓｔ３４のアフリカツメガエルを用いた。ｍｓｒはコントロールであり、黒く染まっているところが血管である。
【図３】遺伝子Ｘ．Ｅｇｆｌ７について、発生のどの段階から発現が見られるかをＲＴ−ＰＣＲを用いて検討した結果を示す写真である。
【図４】遺伝子Ｘ．Ｅｇｆｌ７について、発生のどの段階から発現が見られるかをＷｈｏｌｅ−ｍｏｕｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いて検討した結果を示す写真である。
【図５】Ｈ．Ｅｇｆｌ７ｍＲＮＡについて、ヒト癌組織ｃＤＮＡパネル（ＢｉｏＣｈａｉｎ社製）を用いて正常組織と癌組織で比較検討した結果を示す写真である。
【配列表フリーテキスト】
【０１２６】
配列番号４〜１１：合成ＤＮＡ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現を測定することを含む、癌を検出する方法。
【請求項２】
Ｅｇｆｌ７遺伝子が配列番号１または２の塩基配列で特定される遺伝子である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドからなる、癌を検出するためのマーカー。
【請求項４】
Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドが配列番号１または２の塩基配列の全部または一部を含むポリヌクレオチドである、請求項３記載のマーカー。
【請求項５】
Ｅｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片からなる、癌を検出するためのマーカー。
【請求項６】
Ｅｇｆｌ７ポリペプチドが配列番号３のアミノ酸配列の全部または一部を含むポリペプチドである、請求項５記載のマーカー。
【請求項７】
Ｅｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する抗体を含む、癌を検出するためのキット。
【請求項８】
Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドを特異的に増幅するための、少なくとも１５塩基長の連続したプライマーまたはＥｇｆｌ７ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする少なくとも１５塩基長の連続したプローブを含む、癌を検出するためのキット。
【請求項９】
Ｅｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する抗体を含む、癌を治療するための医薬組成物。
【請求項１０】
Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドおよび／またはその誘導体、またはＥｇｆｌ７ポリペプチドおよび／またはその誘導体を含む、癌を治療するための医薬組成物。
【請求項１１】
Ｅｇｆｌ７遺伝子が発現している細胞と被験試料とを接触させ、被験試料の中からＥｇｆｌ７遺伝子の発現を阻害する物質または促進する物質を選択することを含む、癌を阻害する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１】
Ｅｇｆｌ７遺伝子の発現を測定することを含む、癌を検出する方法。
【請求項２】
Ｅｇｆｌ７遺伝子が配列番号１または２の塩基配列で特定される遺伝子である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドからなる、癌を検出するためのマーカー。
【請求項４】
Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドが配列番号１または２の塩基配列の全部または一部を含むポリヌクレオチドである、請求項３記載のマーカー。
【請求項５】
Ｅｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片からなる、癌を検出するためのマーカー。
【請求項６】
Ｅｇｆｌ７ポリペプチドが配列番号３のアミノ酸配列の全部または一部を含むポリペプチドである、請求項５記載のマーカー。
【請求項７】
Ｅｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する抗体を含む、癌を検出するためのキット。
【請求項８】
Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドを特異的に増幅するための、少なくとも１５塩基長の連続したプライマーまたはＥｇｆｌ７ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする少なくとも１５塩基長の連続したプローブを含む、癌を検出するためのキット。
【請求項９】
Ｅｇｆｌ７ポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する抗体を含む、癌を治療するための医薬組成物。
【請求項１０】
Ｅｇｆｌ７ポリヌクレオチドおよび／またはその誘導体、またはＥｇｆｌ７ポリペプチドおよび／またはその誘導体を含む、癌を治療するための医薬組成物。
【請求項１１】
Ｅｇｆｌ７遺伝子が発現している細胞と被験試料とを接触させ、被験試料の中からＥｇｆｌ７遺伝子の発現を阻害する物質または促進する物質を選択することを含む、癌を阻害する物質をスクリーニングする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−２３８７５７（Ｐ２００６−２３８７５７Ａ）
【公開日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５７３６８（Ｐ２００５−５７３６８）
【出願日】平成１７年３月２日（２００５．３．２）
【出願人】（０００１２０４５６）栄研化学株式会社 (67)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月２日（２００５．３．２）
【出願人】（０００１２０４５６）栄研化学株式会社 (67)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]