癌ワクチン
本発明者らは、パッパリシンを含むワクチンおよびパッパリシンを含むワクチン組成物を開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パッパリシン（ｐａｐｐａｌｙｓｉｎ）を含むワクチンおよびパッパリシンを含むワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
パッパリシンは、ジスルフィド結合ホモダイマーとして天然に存在する分子量１８１キロダルトンの分泌型妊娠関連メタロプロテイナーゼであり、妊娠中に継続的に発現し、好酸球主要塩基性タンパク質と呼ばれるインヒビタータンパク質との複合体として２：２のプロテイナーゼ：インヒビター複合体で見出される。その酵素の第２の型は、１９８．５キロダルトンの分子量を有するパッパリシン２［ＰａｐｐＡ２］として存在し、モノマーとして機能し、胎盤および非妊娠乳腺において優先的に発現し、腎臓、胎児脳、および膵臓においての発現は低い。パッパリシンの基質は、６つの異なるタンパク質が存在する、インスリン様成長因子結合タンパク質［ＩＧＦＢＰ］である。ＩＧＦＢＰ４およびＩＧＦＢＰ５は、パッパリシンの好ましい基質である。ＰａｐｐＡ２はＩＧＦＢＰ５を優先的に切断する。ＩＧＦＢＰは、インスリン様成長因子［ＩＧＦ−１］と密接に結合して見出され、ＩＧＦ−１活性を抑制する。ＩＧＦ−１は、７．６ｋＤの分子量を有する７０アミノ酸のポリペプチドである。ＩＧＦ−１は、数ある細胞の中でも特に、骨成長をもたらす軟骨細胞の増殖を刺激する。ＩＧＦ−１はまた、筋発生に関与する。ＩＧＦ−１は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）スーパーファミリーのメンバーと相互作用するタンパク質リガンドの一例である。約９８％のＩＧＦ−１が、６つのＩＧＦＢＰのうちの１つに結合している。ＩＧＦＢＰ３は、最も多く存在し、ＩＧＦ−１結合の８０％を占める。ＩＧＦ−１は、２つの受容体：ＩＧＦ−１受容体（ＩＧＦＲ）およびインスリン受容体（ＩＲ）に結合し、そのうちの前者は、より大きな親和性で結合する。ＩＧＦ−１は腫瘍の維持において役割を有することも知られており、それゆえに、ＩＧＦ−１アンタゴニストは、癌の処置において治療的価値をもつであろう。
【０００３】
本発明者らの同時係属出願（ＷＯ２００５／０８９０４３）において、本発明者らは、一連の患者試料由来のリンパ節および前立腺から直接単離された前立腺幹細胞の単離を記載している。これらの幹細胞は、幹細胞性質をもつ細胞を特徴づけるマーカーを発現する。以下のマーカーは典型的には、前立腺幹細胞マーカーとして発現される：ヒト上皮抗原（ＨＥＡ）、ＣＤ４４、高発現のα２β１インテグリン、およびＣＤ１３３。さらに、本発明者らの同時係属出願（ＷＯ２００７／０１２８１１０）において、本発明者らは、正常前立腺幹細胞と比較して、癌前立腺幹細胞において上方制御される遺伝子のアレイ発現を開示している。このアレイにおいて最も高く上方制御される遺伝子の１つが、パッパリシンである。
【０００４】
本発明者らはさらに、前立腺幹細胞においてパッパリシン発現を分析しており、それが高度に発現していることを確認し、それによって、ＷＯ２００７／０１２８１１０に開示されたアレイ分析を立証している。さらに、本発明者らは、他の細胞においてパッパリシンの発現を分析し、発現が前立腺癌細胞系において高く、前立腺細胞系の悪性度と相関することを見出した。さらに、本発明者らは、その関連したパッパリシンであるパッパリシン２もまた、癌細胞系によって高レベルで産生されることを開示している。パッパリシンおよびパッパリシン２は、小分子インヒビターなどの開発のための理想的な候補を提供する、限定された組織／細胞発現パターンを有する分泌型タンパク質である。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の態様によれば、アジュバントおよび／または担体と共に、パッパリシンポリペプチドまたはその抗原性部分を含むワクチン組成物が提供される。
【０００６】
本発明の好ましい実施形態において、パッパリシンポリペプチドは、図２または図４におけるアミノ酸配列によって表される。
【０００７】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗原性部分は、図１３ａ、１３ｂ、１３ｃ、１３ｄ、１３ｅ、または１３ｆに示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその配列変異体からなり、前記配列変異体は、少なくとも１つのアミノ酸残基のアミノ酸付加、欠失、または置換であり、前記配列変異体は少なくとも１つの抗原性エピトープを含む。
【０００８】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗原性部分は、図１３ｃに示されるアミノ酸配列からなる。
【０００９】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗原性部分は、図１４ａ、１４ｂ、１４ｃ、１４ｄ、１４ｅ、または１４ｆに示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその配列変異体からなり、前記配列変異体は、少なくとも１つのアミノ酸残基のアミノ酸付加、欠失、または置換であり、前記配列変異体は少なくとも１つの抗原性エピトープを含む。
【００１０】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗原性部分は図１４ｃに示されるアミノ酸配列からなる。
【００１１】
変異ポリペプチドは、任意の組み合わせで存在し得る、１つまたは複数の置換、付加、欠失、切断によってアミノ酸配列が異なり得る。好ましい変異体は、保存的アミノ酸置換によって参照ポリペプチドと異なるものである。そのような置換は、所定のアミノ酸を類似の特性をもつ別のアミノ酸によって置換するものである。以下のアミノ酸の非限定的なリストは、保存的置き換え（類似）とみなされる：ａ）アラニン、セリン、およびスレオニン；ｂ）グルタミン酸およびアスパラギン酸；ｃ）アスパラギンおよびグルタミン；ｄ）アルギニンおよびリシン；ｅ）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびバリン；ならびにｆ）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン。最も非常に好ましいのは、参照ポリペプチドと異なる変異体が、その参照ポリペプチドと同じ生物学的機能および活性を保持または増強する変異体である。加えて、本発明は、本明細書に開示されたポリペプチド配列と少なくとも５０〜７５％同一性を有するポリペプチド配列、またはその断片および機能的に等価のポリペプチドを特徴とする。一実施形態において、ポリペプチドは、本明細書に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％同一性、８５％同一性、より好ましくは少なくとも９０％同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一性、なおより好ましくは少なくとも９７％同一性、最も好ましくは少なくとも９９％同一性を有する。
【００１２】
アジュバントおよび担体という用語は、以下のように解釈される。いくつかのポリペプチド抗原またはペプチド抗原は、Ｂ細胞エピトープを含むがＴ細胞エピトープを含まない。免疫応答は、ポリペプチド／ペプチド内のＴ細胞エピトープの包含によって、または複数のＴ細胞エピトープを含むキーホールリンペットヘモシアニンもしくは破傷風トキソイドなどの免疫原性担体タンパク質へのポリペプチド／ペプチドのコンジュゲーションによって大いに増強することができる。そのコンジュゲートは、抗原提示細胞によって取り込まれ、プロセシングされ、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ分子によって提示される。これにより、担体由来エピトープに特異的なＴ細胞が、もとの抗原性ポリペプチド／ペプチドに特異的なＢ細胞にＴ細胞を与えるのを助けることができる。これは、抗体産生、分泌、およびアイソタイプスイッチの増加をもたらすことができる。アジュバントは、免疫細胞の活性を調節することによって抗原に対する特異的免疫応答を増大する物質または方法である。アジュバントの例には、フロイントアジュバント、ムラミルジペプチド、リポソーム、ＧＭＣＳＦ、インターフェロンγ、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１２、インターロイキン２３、インターロイキン１７、インターロイキン２、インターロイキン１、ＴＧＦ、ＴＮＦα、およびＴＮＦβからなる群から選択されるサイトカイン、ならびにＣｐＧオリゴヌクレオチド、フラジェリン、モノホスホリルリピドＡ、ポリＩ：Ｃ、およびそれらの誘導体などのＴＬＲアゴニストが挙げられる。
【００１３】
担体は、第２の分子に結合したとき、その第２の分子に対する免疫応答を増大する免疫原性分子である。
【００１４】
本発明のさらなる態様によれば、パッパリシンポリペプチドまたはその抗原性部分をコードする核酸分子を含むＤＮＡワクチン組成物が提供される。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態において、前記組成物は、以下からなる群から選択される核酸分子を含む：
ｉ）図１および／または図３に表される核酸配列を含む、またはそれからなる核酸分子、
ｉｉ）相補鎖が上記ｉ）における配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子であって、パッパリシンポリペプチドまたはその抗原性部分をコードする、核酸分子。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態において、前記核酸分子は、以下からなる群から選択される：
ｉ）図１１ａ、１１ｂ、１１ｃ、１１ｄ、１１ｅ、または１１ｆに表される核酸配列からなる核酸分子、
ｉｉ）相補鎖が上記ｉ）における配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子であって、パッパリシンポリペプチドまたはその抗原性部分をコードする、核酸分子。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態において、前記核酸分子は、図１１ｃに示される核酸配列からなる。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態において、前記核酸分子は、以下からなる群から選択される：
ｉ）図１２ａ、１２ｂ、１２ｃ、１２ｄ、１２ｅ、または１２ｆに表される核酸配列からなる核酸分子、
ｉｉ）相補鎖が上記ｉ）における配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子であって、パッパリシンポリペプチドまたはその抗原性部分をコードする、核酸分子。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態において、前記核酸分子は、図１２ｃに示される核酸配列からなる。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態において、前記核酸分子は、前記パッパリシンポリペプチドまたはその抗原性部分を発現するのに適合させた発現ベクターの部分である。
【００２１】
典型的には、前記適合には、細胞／組織特異的発現を媒介する転写調節配列（プロモーター配列）の供給が挙げられる。これらのプロモーター配列は、細胞／組織特異的配列、誘導配列、または構成的配列であり得る。
【００２２】
プロモーターは、当技術分野で認められている用語であり、明確にするために、以下の特徴が挙げられるが、それらは、例としてのみ提供され、限定のために提供されるのではない。エンハンサーエレメントは、遺伝子の転写開始部位の５’側に見出されることが多い、シス作用性核酸配列である（エンハンサーはまた、遺伝子配列の３’側にも見出すことができ、またはさらにイントロン配列中にも位置することもでき、したがって、位置非依存性である）。エンハンサーは、そのエンハンサーが関連づけられる遺伝子の転写速度を増加させるように機能する。エンハンサー活性は、エンハンサーエレメントへ特異的に結合することが示されているトランス作用性転写因子（ポリペプチド）に応答性である。転写因子の結合／活性（Ｄａｖｉｄ Ｓ Ｌａｔｃｈｍａｎによる、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏを参照されたい）は、多くの環境信号に応答性であり、その環境信号には、中間代謝産物（例えば、グルコース、脂質）、環境エフェクター（例えば、光、熱）が挙げられるが、それらは例としてであって、限定するためのものではない。
【００２３】
プロモーターエレメントにはまた、転写開始の部位を選択するように機能する、いわゆるＴＡＴＡボックスおよびＲＮＡポリメラーゼ開始選択（ＲＩＳ）配列が挙げられる。これらの配列はまた、とりわけ、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始選択を促進するように機能するポリペプチドを結合する。
【００２４】
適合はまた、選択マーカーおよび自己複製配列の供給が挙げられ、そのどちらも、真核細胞または原核細胞宿主のいずれかにおける前記ベクターの維持を促進する。自律的に維持されるベクターは、エピソームベクターと呼ばれる。
【００２５】
ベクターにコードされた遺伝子の発現を促進する適合には、転写終結／ポリアデニル化配列の供給が挙げられる。これにはまた、バイシストロニックまたはマルチシストロニックな発現カセット中に配置された、ベクターにコードされた遺伝子の発現を最大にするように機能する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の供給が挙げられる。
【００２６】
発現調節配列にはまた、いわゆる遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）が挙げられる。これらは、マウスにおいてトランスジェニック構築物としてアッセイされた場合、位置非依存性でコピー数依存性の発現を、関連づけられた遺伝子に与える制御エレメントである。ＬＣＲには、隣接ヘテロクロマチンのサイレンシング効果から導入遺伝子を遮断する制御エレメントが挙げられる（Ｇｒｏｓｖｅｌｄら、Ｃｅｌｌ（１９８７）、５１：９７５〜９８５）。
【００２７】
これらの適合は当技術分野においてよく知られている。一般的な発現ベクター構築および組換えＤＮＡ技術に関してかなりの量の既刊文献がある。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ、ＮＹおよびその中の参考文献；Ｍａｒｓｔｏｎ，Ｆ（１９８７）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＩＩ巻、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ ＵＫ；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｆ Ｍ Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ｌｎｃ．（１９９４）を参照されたい。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態において、前記アジュバントは、ＧＭＣＳＦ、インターフェロンγ、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１２、インターロイキン２３、インターロイキン１７、インターロイキン２、インターロイキン１、ＴＧＦ、ＴＮＦα、およびＴＮＦβからなる群から選択されるサイトカインからなる群から選択される。
【００２９】
本発明のさらなる代替実施形態において、前記アジュバントは、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、フラジェリン、モノホスホリルリピドＡ、ポリＩ：Ｃ、およびそれらの誘導体などのＴＬＲアゴニストである。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態において、前記アジュバントはＣｐＧオリゴヌクレオチドである。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態において、前記アジュバントは、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）および／またはトレハロースジコリノミコラート（ＴＤＭ）などの細菌細胞壁誘導体である。
【００３２】
本発明のさらなる態様によれば、パッパリシンポリペプチドまたはその抗原性部分、ならびにアジュバントおよび／または担体を含む有効量のワクチン組成物を投与するステップを含む、癌に罹患している、または癌の素因を有する対象にワクチン接種する方法が提供される。
【００３３】
本明細書に用いられる場合、用語「癌」は、自律成長能力を有する細胞、すなわち、急速に増殖する細胞成長によって特徴づけられる異常な事態または状態を指す。その用語は、組織病理学的型または侵襲性の段階に関わらず、全ての型の癌の成長もしくは発癌過程、転移組織、または悪性形質転換細胞、組織、もしくは器官を含むものとする。用語「癌」は、冒された器官系、例えば、肺、乳房、甲状腺、リンパ系、胃腸、および尿生殖路などの様々な器官系の悪性腫瘍、ならびに大部分の結腸癌、腎細胞癌腫、前立腺癌および／または精巣腫瘍、非小細胞肺癌腫、小腸癌、および食道癌などの悪性腫瘍を含む腺癌を含む。用語「癌腫」は、当技術分野で認められており、呼吸器系癌腫、胃腸系癌腫、泌尿生殖器系癌腫、精巣癌腫、乳癌腫、前立腺癌腫、内分泌系癌腫、およびメラノーマを含む上皮組織または内分泌組織の悪性腫瘍を指す。例示的な癌腫として、頸部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸、および卵巣の組織から形成される癌腫が挙げられる。用語「癌腫」はまた、癌肉腫を含み、例えば、それは癌性組織および肉腫組織で構成される悪性腫瘍を含む。「腺癌」は、腺組織に由来する癌腫、または腫瘍細胞が認識できる腺構造を形成する癌腫を指す。用語「肉腫」は、技術分野で認められており、間葉系由来の悪性腫瘍を指す。
【００３４】
本発明の好ましい方法において、前記癌は前立腺癌である。
【００３５】
本発明の代替の好ましい方法において、前記癌は肺癌である。
【００３６】
本発明のさらなる態様によれば、以下からなる群から選択される核酸配列からなる核酸分子が提供される：
（ｉ）図１１ａ、１１ｂ、１１ｃ、１１ｄ、１１ｅ、または１１ｆに表される核酸配列からなる核酸分子、
（ｉｉ）相補鎖が上記ｉ）における配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子であって、パッパリシンポリペプチドまたはその抗原性部分をコードする、核酸分子、ならびに
（ｉｉｉ）遺伝暗号の結果として（ｉ）および（ｉｉ）に定義されたヌクレオチド配列に対して縮重しているヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【００３７】
本発明のさらなる態様によれば、以下からなる群から選択される核酸配列からなる核酸分子が提供される：
（ｉ）図１２ａ、１２ｂ、１２ｃ、１２ｄ、１２ｅ、または１２ｆに表される核酸配列からなる核酸分子、
（ｉｉ）相補鎖が上記ｉ）における配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子であって、パッパリシンポリペプチドまたはその抗原性部分をコードする、核酸分子、ならびに
（ｉｉｉ）遺伝暗号の結果として（ｉ）および（ｉｉ）に定義されたヌクレオチド配列に対して縮重しているヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【００３８】
本発明のさらなる態様によれば、本発明による核酸分子によってコードされるポリペプチドが提供される。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、変異ポリペプチドであり、図１３ａ、１３ｂ、１３ｃ、１３ｄ、１３ｅ、または１３ｆに表されるアミノ酸配列を含み、その配列は、少なくとも１アミノ酸残基の欠失、付加、または置換によって改変されている。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、図１３ａ、１３ｂ、１３ｃ、１３ｄ、１３ｅ、または１３ｆに表されるアミノ酸配列からなる。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、図１３ｃに表されるアミノ酸配列からなる。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、変異ポリペプチドであり、図１４ａ、１４ｂ、１４ｃ、１４ｄ、１４ｅ、または１４ｆに表されるアミノ酸配列を含み、その配列は、少なくとも１アミノ酸残基の欠失、付加、または置換によって改変されている。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、図１４ａ、１４ｂ、１４ｃ、１４ｄ、１４ｅ、または１４ｆに表されるアミノ酸配列からなる。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、図１４ｃに表されるアミノ酸配列からなる。
【００４５】
本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」ならびにその語の語尾変化形、例えば、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含むが、それらに限定されないこと」を意味し、他の部分、付加物、成分、整数、またはステップを排除することを意図するものではない（排除しない）。
【００４６】
本明細書の説明および特許請求の範囲の全体において、単数形は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、複数形を含む。特に、不定冠詞が用いられる場合、その明細は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単数だけでなく複数を企図するものと理解されるべきである。
【００４７】
本発明の特定の態様、実施形態、または例に関連して記載された特徴、整数、特性、化合物、化学的部分、または化学基は、それと矛盾しない限り、本明細書に記載された任意の他の態様、実施形態、または実施例に適用可能であると理解されるべきである。
【００４８】
以下に、本発明の実施形態を、ただの例として、以下の図を参照して記載する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ヒトパッパリシンの核酸配列の図である。
【図２】ヒトパッパリシンのアミノ酸配列の図である。
【図３】ヒトパッパリシン２の核酸配列の図である。
【図４】ヒトパッパリシン２のアミノ酸配列の図である。
【図５】前立腺細胞系ＰＮＴ２、Ｐ４Ｅ６、およびＰＣ３におけるパッパリシンの免疫蛍光を示す図である。
【図６】初代ＢＰＨ細胞におけるパッパリシンの免疫蛍光を示す図である。
【図７】初代癌細胞におけるパッパリシンの免疫蛍光を示す図である。
【図８】細胞系ＰＮＴ２、Ｐ４Ｅ６、およびＰＣ３におけるパッパリシン２の免疫蛍光を示す図である。
【図９】ＲＴ ＰＣＲを用いるパッパリシン発現の、アレイ分析から予想される発現レベルとの比較を示す図である。
【図１０】パッパリシン、ならびにＤＮＡ断片および免疫原性タンパク質断片が由来するドメイン１〜６の概略図である。
【図１１ａ】マウスパッパリシン１断片１のヌクレオチド配列の図である。
【図１１ｂ】マウスパッパリシン１断片２のヌクレオチド配列の図である。
【図１１ｃ】マウスパッパリシン１断片３のヌクレオチド配列の図である。
【図１１ｄ】マウスパッパリシン１断片４のヌクレオチド配列の図である。
【図１１ｅ】マウスパッパリシン１断片５のヌクレオチド配列の図である。
【図１１ｆ】マウスパッパリシン１断片６のヌクレオチド配列の図である。
【図１２ａ】ヒトパッパリシン１断片１のヌクレオチド配列の図である。
【図１２ｂ】ヒトパッパリシン１断片２のヌクレオチド配列の図である。
【図１２ｃ】ヒトパッパリシン１断片３のヌクレオチド配列の図である。
【図１２ｄ】ヒトパッパリシン１断片４のヌクレオチド配列の図である。
【図１２ｅ】ヒトパッパリシン１断片５のヌクレオチド配列の図である。
【図１２ｆ】ヒトパッパリシン１断片６のヌクレオチド配列の図である。
【図１３ａ】マウスパッパリシン１断片１のアミノ酸配列の図である。
【図１３ｂ】マウスパッパリシン１断片２のアミノ酸配列の図である。
【図１３ｃ】マウスパッパリシン１断片３のアミノ酸配列の図である。
【図１３ｄ】マウスパッパリシン１断片４のアミノ酸配列の図である。
【図１３ｅ】マウスパッパリシン１断片５のアミノ酸配列の図である。
【図１３ｆ】マウスパッパリシン１断片６のアミノ酸配列の図である。
【図１４ａ】ヒトパッパリシン１断片１のアミノ酸配列の図である。
【図１４ｂ】ヒトパッパリシン１断片２のアミノ酸配列の図である。
【図１４ｃ】ヒトパッパリシン１断片３のアミノ酸配列の図である。
【図１４ｄ】ヒトパッパリシン１断片４のアミノ酸配列の図である。
【図１４ｅ】ヒトパッパリシン１断片５のアミノ酸配列の図である。
【図１４ｆ】ヒトパッパリシン１断片６のアミノ酸配列の図である。
【図１５】Ｂ１６細胞の安定発現株におけるパッパリシン発現を示す図である。発現を、連続培養での６継代後（レーン２〜５）または２０を超える継代後（レーン６〜９）の４つの安定クローンにおいてＲＴ−ＰＣＲによって測定した。親Ｂ１６細胞は、パッパリシン陰性であることが示された（レーン１）。パッパリシン発現プラスミドを、陽性対照として増幅し（レーン１０）、水を陰性対照として用いた（レーン１１）。
【図１６】精製されたタンパク質断片のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。精製カラムからの溶出画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供し、所望の産物の回収率および混入しているタンパク質（画分）の存在を決定した。非誘導性（Ｕ）および誘導性（Ｉ）細菌培養物のアリコートは、発現が誘導されたことを表すことが示されている。通過画分試料（Ｆ）および洗浄試料（Ｗ）もまた、分析し、タンパク質精製手順中のタンパク質損失を検出した。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
材料および方法
腫瘍幹細胞の組織収集、単離、および培養
前立腺癌について前立腺全摘除術を受けた患者から、患者の同意を得て、ヒト前立腺組織を入手した。前立腺癌を、代表的な隣接断片の組織学的検討によって確認した。一部の症例において、転移が疑われる場合には、リンパ節生検を行った。初代幹細胞由来培養物を、完全ケラチノサイト成長培地［上皮成長因子（ＥＧＦ）およびウシ下垂体抽出物を含むケラチノサイト無血清培地；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ］中で維持した。培地にまた、２ｎｇ／ｍＬの白血病抑制因子（ＬＩＦ；Ｓｉｇｍａ、Ｐｏｏｌｅ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）、２ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子（Ｓｉｇｍａ）、および１００ｎｇ／ｍＬのコレラ毒素（Ｓｉｇｍａ）を追加した。正常な前立腺上皮について以前記載されているように（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、２００４）、ＣＤ４４／α２β１ｈｉ／ＣＤ１３３＋細胞を組織から単離した。
【００５１】
標準細胞系の組織培養
細胞系を、以下の成長培地中、３７℃／大気中５％ＣＯ２で維持した：ＰＮＴ２ Ｒ１０培地：１０％ウシ胎仔血清および１％Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ＰＣ３細胞 Ｈ７培地：ウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ）および上皮成長因子（ＥＧＦ）を追加した７％ウシ胎仔血清および１％Ｌ−グルタミンを含むＨＡＭＳ Ｆ１２；Ｐ４Ｅ６細胞 Ｋ２培地：２％ウシ胎仔血清および１％Ｌ−グルタミンを含むＫＳＦＭ。
【００５２】
α２β１ｈｉ／ＣＤ１３３＋細胞の免疫蛍光染色
氷冷した２：１のメタノール：アセトン中の２０分間の固定化による共焦点顕微鏡下での画像化のための処理前に、腫瘍由来の培養細胞から直接、α２β１ｈｉ／ＣＤ１３３＋細胞を選択した。スライドを、２０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）中、室温で１時間、ブロッキングした。ブロッキング後、細胞を、２０％ＮＧＳ中に希釈されたパッパリシンＡ（ａｂ５９０８８、Ａｂｃａｍ）に対するウサギポリクローナル抗体とインキュベートした。洗浄（３×ＴＢＳ）後、細胞を、アレクサ４８８タグ付き二次抗体でさらに探索した。細胞を、カバーガラス下の抗光退色（Ｄａｋｏ）媒体中にマウントした。
【００５３】
マウスＰＡＰＰＡ断片のｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターへのクローニング
ヒトＰＡＰＰＡの推定タンパク質ドメイン（図２および表１参照）におおよそ対応する産物を増幅するようにプライマーを設計した。各フォワードプライマーおよびリバースプライマーはまた、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、下記参照）に用いるＨｉｓタグ付きタンパク質発現ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）のＢａｍＨ１部位に相同である１５ｂｐ配列を含んだ。ＰＣＲを、ＫＯＤ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて以下の条件で行った：９５℃で２分間、続いて９５℃１０秒間、５５℃１０秒間、７０℃１５秒間の２５サイクル。産物を、ＧｅｌＲｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１／１０，０００希釈物を含む１％アガロースゲル上に流した。バンドを、ＵＶトランスイルミネータ（ＧｅｎｅＧｅｎｉｕｓ）を用いて可視化した。
【００５４】
ｐＥＴ−２２ｂ（＋）をＢａｍＨ１で直線化し（３７℃、３時間）、生成物を、ＧｅｌＲｅｄで染色された０．８％アガロースゲル上に流した。直線化したベクターに対応するバンドを切り取り、ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを用いて、製造会社のプロトコールに従い精製した。
【００５５】
断片ＤＮＡのベクターへの挿入を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ａｄｖａｎｔａｇｅキットを用いて、製造会社の使用説明書に従い達成した。生じた構築物を、ＤＨ５αコンピテント細菌へ形質転換し、続いて、アンピシリン（５０ｕｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）を含むＬｕｒｉａ ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）寒天で培養した。プレートを３７℃で一晩、インキュベートした。個々のコロニーを採取して、アンピシリン含有の５ｍｌのＬＢの中へ入れ、振盪インキュベータで一晩、インキュベートした。ＤＮＡを、Ｑｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造会社の使用説明書に従い抽出した。ＤＮＡシークエンシングにより、挿入断片は、精製に必要とされるＨｉｓタグとインフレームであることが確認された（Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｙｏｒｋ）。構築物を、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ発現宿主へ形質転換した。
【００５６】
タンパク質発現の誘導
上記と同じ条件を用いて、バルク誘導を行った。関連パッパリシン断片を含むＲｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞を、アンピシリン（５０ｕｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）含有の１０ｍｌのＬＢへ接種し、振盪インキュベータ内、３７℃で、インキュベートした。ＯＤ６００が０．５に達したとき、培養物を、アンピシリン含有の５００ｍｌのＬＢに加えた。ＯＤ６００が０．５ユニットに達したとき、１ｍＭのＩＰＴＧを加え、培養物をさらに２時間、インキュベートした。細胞を遠心分離によってペレット化し、洗浄緩衝液（Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ５ＯｍＭ；ＥＤＴＡ ２ｍＭ、ＮａＣＩ ５ＯｍＭ、ｐＨ７．９）中に再懸濁し、もう一度、ペレット化した。乾燥ペレットを精製まで−８０℃で保存した。
【００５７】
変性条件下での精製
予備実験により、断片が不溶性封入体へパッケージングされたことが示され、したがって、断片を変性条件下で精製した。５００ｍｌの培養物からの細菌細胞ペレットを１０ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁し、続いて、氷上で超音波処理（Ｓｏｎｉｐｒｅｐ １５０、ＭＳＥ；１５秒間の冷却を差し入れて４×３０秒間のバースト）を行った。溶解した培養物を１０，０００ｘｇで１５分間、回転させた。上清を捨て、不溶性物質のペレットを、１０ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁し、もう一度、遠心分離した。
【００５８】
生じたペレットを、グアニジン溶解緩衝液中に再懸濁した。最初に、ペレットを、５ｍｌの再懸濁緩衝液（オルトリン酸二水素ナトリウム２０ｍＭ；ＮａＣｌ０．５Ｍ、ｐＨ７．８）中に再懸濁し、１５ｍｌのグアニジン溶解緩衝液（オルトリン酸二水素ナトリウム２０ｍＭ；ＮａＣｌ０．５Ｍ、グアニジンＨＣｌ ８Ｍ、ｐＨ７．８）を加えて、６ＭのグアニジンＨＣｌの最終濃度を生じた。可溶化タンパク質を、回転式振盪機上、室温で１０分間、インキュベートし、続いて、０．８μｍのシリンジフィルターを通して濾過した。
【００５９】
ＡＫＴＡ精製器（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に取り付けた、３％ＮｉＳＯ４を充填した１ｍｌ ＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製を行った。可溶化タンパク質を、変性結合緩衝液（オルトリン酸二水素ナトリウム２０ｍＭ；ＮａＣｌ０．５Ｍ、尿素８Ｍ、ｐＨ７．８）と共に１ｍｌ／分の速度でカラムを通過させた。変性洗浄緩衝液（オルトリン酸二水素ナトリウム２０ｍＭ；ＮａＣｌ０．５Ｍ、尿素８Ｍ、ｐＨ６）を用いてカラムを洗浄し、その緩衝液については３０分間にわたって徐々に未変性洗浄緩衝液（オルトリン酸二水素ナトリウム２５ｍＭ；ＮａＣｌ０．５Ｍ、イミダゾール５ｍＭ、ｐＨ８）に置き換えていった。５ｍＭ〜５００ｍＭのイミダゾールの勾配が時間とともに生じるように、未変性洗浄緩衝液を未変性溶出緩衝液（オルトリン酸二水素ナトリウム２５ｍＭ；ＮａＣｌ０．５Ｍ、イミダゾール５００ｍＭ、ｐＨ８）へ１５分間にわたって交換することによって直線勾配溶出を行った。１ｍｌの画分を溶出液から１分間隔で収集した。
【００６０】
緩衝液交換およびタンパク質の濃度
溶出断片のＰＡＧＥ分析後、ＰＢＳへの緩衝液交換およびさらに濃度のために、高発現を有する画分を選択した。画分をプールし、Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０内に置いた。ＰＢＳを加えて、容量を２０ｍｌにし、続いて、容量が５ｍｌまで減少するまで４０００ｒｐｍで遠心分離した。ＰＢＳを２０ｍｌまで加え、その工程をさらに２回、繰り返した。最後に、容量をさらに１ｍｌまで減少させた。タンパク質濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を用いて定量した。
【００６１】
Ｂ１６細胞の培養
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．、Ｙｅｏｖｉｌ、ＵＫ）および１％Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）を追加したＲＰＭＩ１６４０培地で構成されるＲ１０成長培地中に維持した。
【００６２】
Ｂ１６細胞の安定的遺伝子導入
Ｂ１６細胞を２５ｃｍ２フラスコ内に５×１０５細胞／フラスコでプレーティングし、遺伝子導入前に２４時間、Ｒ１０成長培地中、３７℃でインキュベートした。Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅリポソーム遺伝子導入試薬を用いて、製造会社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）の使用説明書に従い、６．５μｇ／フラスコのｐＬＮＣＸ−ＰＡＰＰＡ発現ベクターを細胞に導入した。簡単に言えば、ＤＮＡをＯｐｔｉＭＥＭ遺伝子導入培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）と混合した。安定発現株を選択するために、遺伝子導入から７２時間後、成長培地をＲ１０＋６００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８へ変えた。Ｇ４１８抵抗性コロニーの成長を可能にするように、１０〜１４日間、選択を維持した。その後、９６ウェル組織培養プレート内に１細胞／ウェルで細胞を再びプレーティングし、Ｒ１０＋６００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８中に維持した。
【００６３】
実施例
パッパリシン発現は、試験された全ての３つの細胞系において一貫して細胞質発現である；図５、６、および７を参照されたい。分泌された成分はこの技術を用いて検出することができないので、これは分泌型タンパク質について正常である。発現は、良性細胞系（ＰＮＴ２）より癌細胞系（Ｐ４Ｅ６およびＰＣ３）で高い。興味深いことに、パッパリシン発現は、骨転移に由来した進行期細胞系ＰＣ３より初期癌系Ｐ４Ｅ６で高い。初代細胞において、発現は、良性と比較して、平均して癌細胞で高い。癌患者において、発現は、より分化したα２β１低集団と比較して、α２β１高／ＣＤ１３３＋幹細胞およびα２β１高／ＣＤ１３３始原細胞の集団で高い。パッパリシン２に関しての類似した免疫蛍光染色パターンは、Ｐ４Ｅ６、ＰＣ３、およびＰＮＴ２細胞によって示されており、図８を参照されたい。
【００６４】
本明細書に開示されたワクチンの効力を試験するためにインビボモデルにＢ１６メラノーマ細胞安定発現株を用いる。クローン化細胞系におけるパッパリシンの発現は、図１５に示されている。図１６は、図１０に記載されている選択されたパッパリシン断片２、３、および４の組換え発現を記載する。
【図１−１】
【図１−２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パッパリシン（ｐａｐｐａｌｙｓｉｎ）を含むワクチンおよびパッパリシンを含むワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
パッパリシンは、ジスルフィド結合ホモダイマーとして天然に存在する分子量１８１キロダルトンの分泌型妊娠関連メタロプロテイナーゼであり、妊娠中に継続的に発現し、好酸球主要塩基性タンパク質と呼ばれるインヒビタータンパク質との複合体として２：２のプロテイナーゼ：インヒビター複合体で見出される。その酵素の第２の型は、１９８．５キロダルトンの分子量を有するパッパリシン２［ＰａｐｐＡ２］として存在し、モノマーとして機能し、胎盤および非妊娠乳腺において優先的に発現し、腎臓、胎児脳、および膵臓においての発現は低い。パッパリシンの基質は、６つの異なるタンパク質が存在する、インスリン様成長因子結合タンパク質［ＩＧＦＢＰ］である。ＩＧＦＢＰ４およびＩＧＦＢＰ５は、パッパリシンの好ましい基質である。ＰａｐｐＡ２はＩＧＦＢＰ５を優先的に切断する。ＩＧＦＢＰは、インスリン様成長因子［ＩＧＦ−１］と密接に結合して見出され、ＩＧＦ−１活性を抑制する。ＩＧＦ−１は、７．６ｋＤの分子量を有する７０アミノ酸のポリペプチドである。ＩＧＦ−１は、数ある細胞の中でも特に、骨成長をもたらす軟骨細胞の増殖を刺激する。ＩＧＦ−１はまた、筋発生に関与する。ＩＧＦ−１は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）スーパーファミリーのメンバーと相互作用するタンパク質リガンドの一例である。約９８％のＩＧＦ−１が、６つのＩＧＦＢＰのうちの１つに結合している。ＩＧＦＢＰ３は、最も多く存在し、ＩＧＦ−１結合の８０％を占める。ＩＧＦ−１は、２つの受容体：ＩＧＦ−１受容体（ＩＧＦＲ）およびインスリン受容体（ＩＲ）に結合し、そのうちの前者は、より大きな親和性で結合する。ＩＧＦ−１は腫瘍の維持において役割を有することも知られており、それゆえに、ＩＧＦ−１アンタゴニストは、癌の処置において治療的価値をもつであろう。
【０００３】
本発明者らの同時係属出願（ＷＯ２００５／０８９０４３）において、本発明者らは、一連の患者試料由来のリンパ節および前立腺から直接単離された前立腺幹細胞の単離を記載している。これらの幹細胞は、幹細胞性質をもつ細胞を特徴づけるマーカーを発現する。以下のマーカーは典型的には、前立腺幹細胞マーカーとして発現される：ヒト上皮抗原（ＨＥＡ）、ＣＤ４４、高発現のα２β１インテグリン、およびＣＤ１３３。さらに、本発明者らの同時係属出願（ＷＯ２００７／０１２８１１０）において、本発明者らは、正常前立腺幹細胞と比較して、癌前立腺幹細胞において上方制御される遺伝子のアレイ発現を開示している。このアレイにおいて最も高く上方制御される遺伝子の１つが、パッパリシンである。
【０００４】
本発明者らはさらに、前立腺幹細胞においてパッパリシン発現を分析しており、それが高度に発現していることを確認し、それによって、ＷＯ２００７／０１２８１１０に開示されたアレイ分析を立証している。さらに、本発明者らは、他の細胞においてパッパリシンの発現を分析し、発現が前立腺癌細胞系において高く、前立腺細胞系の悪性度と相関することを見出した。さらに、本発明者らは、その関連したパッパリシンであるパッパリシン２もまた、癌細胞系によって高レベルで産生されることを開示している。パッパリシンおよびパッパリシン２は、小分子インヒビターなどの開発のための理想的な候補を提供する、限定された組織／細胞発現パターンを有する分泌型タンパク質である。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の態様によれば、アジュバントおよび／または担体と共に、パッパリシンポリペプチドまたはその抗原性部分を含むワクチン組成物が提供される。
【０００６】
本発明の好ましい実施形態において、パッパリシンポリペプチドは、図２または図４におけるアミノ酸配列によって表される。
【０００７】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗原性部分は、図１３ａ、１３ｂ、１３ｃ、１３ｄ、１３ｅ、または１３ｆに示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその配列変異体からなり、前記配列変異体は、少なくとも１つのアミノ酸残基のアミノ酸付加、欠失、または置換であり、前記配列変異体は少なくとも１つの抗原性エピトープを含む。
【０００８】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗原性部分は、図１３ｃに示されるアミノ酸配列からなる。
【０００９】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗原性部分は、図１４ａ、１４ｂ、１４ｃ、１４ｄ、１４ｅ、または１４ｆに示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその配列変異体からなり、前記配列変異体は、少なくとも１つのアミノ酸残基のアミノ酸付加、欠失、または置換であり、前記配列変異体は少なくとも１つの抗原性エピトープを含む。
【００１０】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗原性部分は図１４ｃに示されるアミノ酸配列からなる。
【００１１】
変異ポリペプチドは、任意の組み合わせで存在し得る、１つまたは複数の置換、付加、欠失、切断によってアミノ酸配列が異なり得る。好ましい変異体は、保存的アミノ酸置換によって参照ポリペプチドと異なるものである。そのような置換は、所定のアミノ酸を類似の特性をもつ別のアミノ酸によって置換するものである。以下のアミノ酸の非限定的なリストは、保存的置き換え（類似）とみなされる：ａ）アラニン、セリン、およびスレオニン；ｂ）グルタミン酸およびアスパラギン酸；ｃ）アスパラギンおよびグルタミン；ｄ）アルギニンおよびリシン；ｅ）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびバリン；ならびにｆ）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン。最も非常に好ましいのは、参照ポリペプチドと異なる変異体が、その参照ポリペプチドと同じ生物学的機能および活性を保持または増強する変異体である。加えて、本発明は、本明細書に開示されたポリペプチド配列と少なくとも５０〜７５％同一性を有するポリペプチド配列、またはその断片および機能的に等価のポリペプチドを特徴とする。一実施形態において、ポリペプチドは、本明細書に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％同一性、８５％同一性、より好ましくは少なくとも９０％同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一性、なおより好ましくは少なくとも９７％同一性、最も好ましくは少なくとも９９％同一性を有する。
【００１２】
アジュバントおよび担体という用語は、以下のように解釈される。いくつかのポリペプチド抗原またはペプチド抗原は、Ｂ細胞エピトープを含むがＴ細胞エピトープを含まない。免疫応答は、ポリペプチド／ペプチド内のＴ細胞エピトープの包含によって、または複数のＴ細胞エピトープを含むキーホールリンペットヘモシアニンもしくは破傷風トキソイドなどの免疫原性担体タンパク質へのポリペプチド／ペプチドのコンジュゲーションによって大いに増強することができる。そのコンジュゲートは、抗原提示細胞によって取り込まれ、プロセシングされ、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ分子によって提示される。これにより、担体由来エピトープに特異的なＴ細胞が、もとの抗原性ポリペプチド／ペプチドに特異的なＢ細胞にＴ細胞を与えるのを助けることができる。これは、抗体産生、分泌、およびアイソタイプスイッチの増加をもたらすことができる。アジュバントは、免疫細胞の活性を調節することによって抗原に対する特異的免疫応答を増大する物質または方法である。アジュバントの例には、フロイントアジュバント、ムラミルジペプチド、リポソーム、ＧＭＣＳＦ、インターフェロンγ、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１２、インターロイキン２３、インターロイキン１７、インターロイキン２、インターロイキン１、ＴＧＦ、ＴＮＦα、およびＴＮＦβからなる群から選択されるサイトカイン、ならびにＣｐＧオリゴヌクレオチド、フラジェリン、モノホスホリルリピドＡ、ポリＩ：Ｃ、およびそれらの誘導体などのＴＬＲアゴニストが挙げられる。
【００１３】
担体は、第２の分子に結合したとき、その第２の分子に対する免疫応答を増大する免疫原性分子である。
【００１４】
本発明のさらなる態様によれば、パッパリシンポリペプチドまたはその抗原性部分をコードする核酸分子を含むＤＮＡワクチン組成物が提供される。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態において、前記組成物は、以下からなる群から選択される核酸分子を含む：
ｉ）図１および／または図３に表される核酸配列を含む、またはそれからなる核酸分子、
ｉｉ）相補鎖が上記ｉ）における配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子であって、パッパリシンポリペプチドまたはその抗原性部分をコードする、核酸分子。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態において、前記核酸分子は、以下からなる群から選択される：
ｉ）図１１ａ、１１ｂ、１１ｃ、１１ｄ、１１ｅ、または１１ｆに表される核酸配列からなる核酸分子、
ｉｉ）相補鎖が上記ｉ）における配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子であって、パッパリシンポリペプチドまたはその抗原性部分をコードする、核酸分子。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態において、前記核酸分子は、図１１ｃに示される核酸配列からなる。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態において、前記核酸分子は、以下からなる群から選択される：
ｉ）図１２ａ、１２ｂ、１２ｃ、１２ｄ、１２ｅ、または１２ｆに表される核酸配列からなる核酸分子、
ｉｉ）相補鎖が上記ｉ）における配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子であって、パッパリシンポリペプチドまたはその抗原性部分をコードする、核酸分子。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態において、前記核酸分子は、図１２ｃに示される核酸配列からなる。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態において、前記核酸分子は、前記パッパリシンポリペプチドまたはその抗原性部分を発現するのに適合させた発現ベクターの部分である。
【００２１】
典型的には、前記適合には、細胞／組織特異的発現を媒介する転写調節配列（プロモーター配列）の供給が挙げられる。これらのプロモーター配列は、細胞／組織特異的配列、誘導配列、または構成的配列であり得る。
【００２２】
プロモーターは、当技術分野で認められている用語であり、明確にするために、以下の特徴が挙げられるが、それらは、例としてのみ提供され、限定のために提供されるのではない。エンハンサーエレメントは、遺伝子の転写開始部位の５’側に見出されることが多い、シス作用性核酸配列である（エンハンサーはまた、遺伝子配列の３’側にも見出すことができ、またはさらにイントロン配列中にも位置することもでき、したがって、位置非依存性である）。エンハンサーは、そのエンハンサーが関連づけられる遺伝子の転写速度を増加させるように機能する。エンハンサー活性は、エンハンサーエレメントへ特異的に結合することが示されているトランス作用性転写因子（ポリペプチド）に応答性である。転写因子の結合／活性（Ｄａｖｉｄ Ｓ Ｌａｔｃｈｍａｎによる、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏを参照されたい）は、多くの環境信号に応答性であり、その環境信号には、中間代謝産物（例えば、グルコース、脂質）、環境エフェクター（例えば、光、熱）が挙げられるが、それらは例としてであって、限定するためのものではない。
【００２３】
プロモーターエレメントにはまた、転写開始の部位を選択するように機能する、いわゆるＴＡＴＡボックスおよびＲＮＡポリメラーゼ開始選択（ＲＩＳ）配列が挙げられる。これらの配列はまた、とりわけ、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始選択を促進するように機能するポリペプチドを結合する。
【００２４】
適合はまた、選択マーカーおよび自己複製配列の供給が挙げられ、そのどちらも、真核細胞または原核細胞宿主のいずれかにおける前記ベクターの維持を促進する。自律的に維持されるベクターは、エピソームベクターと呼ばれる。
【００２５】
ベクターにコードされた遺伝子の発現を促進する適合には、転写終結／ポリアデニル化配列の供給が挙げられる。これにはまた、バイシストロニックまたはマルチシストロニックな発現カセット中に配置された、ベクターにコードされた遺伝子の発現を最大にするように機能する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の供給が挙げられる。
【００２６】
発現調節配列にはまた、いわゆる遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）が挙げられる。これらは、マウスにおいてトランスジェニック構築物としてアッセイされた場合、位置非依存性でコピー数依存性の発現を、関連づけられた遺伝子に与える制御エレメントである。ＬＣＲには、隣接ヘテロクロマチンのサイレンシング効果から導入遺伝子を遮断する制御エレメントが挙げられる（Ｇｒｏｓｖｅｌｄら、Ｃｅｌｌ（１９８７）、５１：９７５〜９８５）。
【００２７】
これらの適合は当技術分野においてよく知られている。一般的な発現ベクター構築および組換えＤＮＡ技術に関してかなりの量の既刊文献がある。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ、ＮＹおよびその中の参考文献；Ｍａｒｓｔｏｎ，Ｆ（１９８７）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＩＩ巻、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ ＵＫ；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｆ Ｍ Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ｌｎｃ．（１９９４）を参照されたい。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態において、前記アジュバントは、ＧＭＣＳＦ、インターフェロンγ、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１２、インターロイキン２３、インターロイキン１７、インターロイキン２、インターロイキン１、ＴＧＦ、ＴＮＦα、およびＴＮＦβからなる群から選択されるサイトカインからなる群から選択される。
【００２９】
本発明のさらなる代替実施形態において、前記アジュバントは、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、フラジェリン、モノホスホリルリピドＡ、ポリＩ：Ｃ、およびそれらの誘導体などのＴＬＲアゴニストである。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態において、前記アジュバントはＣｐＧオリゴヌクレオチドである。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態において、前記アジュバントは、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）および／またはトレハロースジコリノミコラート（ＴＤＭ）などの細菌細胞壁誘導体である。
【００３２】
本発明のさらなる態様によれば、パッパリシンポリペプチドまたはその抗原性部分、ならびにアジュバントおよび／または担体を含む有効量のワクチン組成物を投与するステップを含む、癌に罹患している、または癌の素因を有する対象にワクチン接種する方法が提供される。
【００３３】
本明細書に用いられる場合、用語「癌」は、自律成長能力を有する細胞、すなわち、急速に増殖する細胞成長によって特徴づけられる異常な事態または状態を指す。その用語は、組織病理学的型または侵襲性の段階に関わらず、全ての型の癌の成長もしくは発癌過程、転移組織、または悪性形質転換細胞、組織、もしくは器官を含むものとする。用語「癌」は、冒された器官系、例えば、肺、乳房、甲状腺、リンパ系、胃腸、および尿生殖路などの様々な器官系の悪性腫瘍、ならびに大部分の結腸癌、腎細胞癌腫、前立腺癌および／または精巣腫瘍、非小細胞肺癌腫、小腸癌、および食道癌などの悪性腫瘍を含む腺癌を含む。用語「癌腫」は、当技術分野で認められており、呼吸器系癌腫、胃腸系癌腫、泌尿生殖器系癌腫、精巣癌腫、乳癌腫、前立腺癌腫、内分泌系癌腫、およびメラノーマを含む上皮組織または内分泌組織の悪性腫瘍を指す。例示的な癌腫として、頸部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸、および卵巣の組織から形成される癌腫が挙げられる。用語「癌腫」はまた、癌肉腫を含み、例えば、それは癌性組織および肉腫組織で構成される悪性腫瘍を含む。「腺癌」は、腺組織に由来する癌腫、または腫瘍細胞が認識できる腺構造を形成する癌腫を指す。用語「肉腫」は、技術分野で認められており、間葉系由来の悪性腫瘍を指す。
【００３４】
本発明の好ましい方法において、前記癌は前立腺癌である。
【００３５】
本発明の代替の好ましい方法において、前記癌は肺癌である。
【００３６】
本発明のさらなる態様によれば、以下からなる群から選択される核酸配列からなる核酸分子が提供される：
（ｉ）図１１ａ、１１ｂ、１１ｃ、１１ｄ、１１ｅ、または１１ｆに表される核酸配列からなる核酸分子、
（ｉｉ）相補鎖が上記ｉ）における配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子であって、パッパリシンポリペプチドまたはその抗原性部分をコードする、核酸分子、ならびに
（ｉｉｉ）遺伝暗号の結果として（ｉ）および（ｉｉ）に定義されたヌクレオチド配列に対して縮重しているヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【００３７】
本発明のさらなる態様によれば、以下からなる群から選択される核酸配列からなる核酸分子が提供される：
（ｉ）図１２ａ、１２ｂ、１２ｃ、１２ｄ、１２ｅ、または１２ｆに表される核酸配列からなる核酸分子、
（ｉｉ）相補鎖が上記ｉ）における配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子であって、パッパリシンポリペプチドまたはその抗原性部分をコードする、核酸分子、ならびに
（ｉｉｉ）遺伝暗号の結果として（ｉ）および（ｉｉ）に定義されたヌクレオチド配列に対して縮重しているヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【００３８】
本発明のさらなる態様によれば、本発明による核酸分子によってコードされるポリペプチドが提供される。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、変異ポリペプチドであり、図１３ａ、１３ｂ、１３ｃ、１３ｄ、１３ｅ、または１３ｆに表されるアミノ酸配列を含み、その配列は、少なくとも１アミノ酸残基の欠失、付加、または置換によって改変されている。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、図１３ａ、１３ｂ、１３ｃ、１３ｄ、１３ｅ、または１３ｆに表されるアミノ酸配列からなる。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、図１３ｃに表されるアミノ酸配列からなる。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、変異ポリペプチドであり、図１４ａ、１４ｂ、１４ｃ、１４ｄ、１４ｅ、または１４ｆに表されるアミノ酸配列を含み、その配列は、少なくとも１アミノ酸残基の欠失、付加、または置換によって改変されている。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、図１４ａ、１４ｂ、１４ｃ、１４ｄ、１４ｅ、または１４ｆに表されるアミノ酸配列からなる。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、図１４ｃに表されるアミノ酸配列からなる。
【００４５】
本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」ならびにその語の語尾変化形、例えば、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含むが、それらに限定されないこと」を意味し、他の部分、付加物、成分、整数、またはステップを排除することを意図するものではない（排除しない）。
【００４６】
本明細書の説明および特許請求の範囲の全体において、単数形は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、複数形を含む。特に、不定冠詞が用いられる場合、その明細は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単数だけでなく複数を企図するものと理解されるべきである。
【００４７】
本発明の特定の態様、実施形態、または例に関連して記載された特徴、整数、特性、化合物、化学的部分、または化学基は、それと矛盾しない限り、本明細書に記載された任意の他の態様、実施形態、または実施例に適用可能であると理解されるべきである。
【００４８】
以下に、本発明の実施形態を、ただの例として、以下の図を参照して記載する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ヒトパッパリシンの核酸配列の図である。
【図２】ヒトパッパリシンのアミノ酸配列の図である。
【図３】ヒトパッパリシン２の核酸配列の図である。
【図４】ヒトパッパリシン２のアミノ酸配列の図である。
【図５】前立腺細胞系ＰＮＴ２、Ｐ４Ｅ６、およびＰＣ３におけるパッパリシンの免疫蛍光を示す図である。
【図６】初代ＢＰＨ細胞におけるパッパリシンの免疫蛍光を示す図である。
【図７】初代癌細胞におけるパッパリシンの免疫蛍光を示す図である。
【図８】細胞系ＰＮＴ２、Ｐ４Ｅ６、およびＰＣ３におけるパッパリシン２の免疫蛍光を示す図である。
【図９】ＲＴ ＰＣＲを用いるパッパリシン発現の、アレイ分析から予想される発現レベルとの比較を示す図である。
【図１０】パッパリシン、ならびにＤＮＡ断片および免疫原性タンパク質断片が由来するドメイン１〜６の概略図である。
【図１１ａ】マウスパッパリシン１断片１のヌクレオチド配列の図である。
【図１１ｂ】マウスパッパリシン１断片２のヌクレオチド配列の図である。
【図１１ｃ】マウスパッパリシン１断片３のヌクレオチド配列の図である。
【図１１ｄ】マウスパッパリシン１断片４のヌクレオチド配列の図である。
【図１１ｅ】マウスパッパリシン１断片５のヌクレオチド配列の図である。
【図１１ｆ】マウスパッパリシン１断片６のヌクレオチド配列の図である。
【図１２ａ】ヒトパッパリシン１断片１のヌクレオチド配列の図である。
【図１２ｂ】ヒトパッパリシン１断片２のヌクレオチド配列の図である。
【図１２ｃ】ヒトパッパリシン１断片３のヌクレオチド配列の図である。
【図１２ｄ】ヒトパッパリシン１断片４のヌクレオチド配列の図である。
【図１２ｅ】ヒトパッパリシン１断片５のヌクレオチド配列の図である。
【図１２ｆ】ヒトパッパリシン１断片６のヌクレオチド配列の図である。
【図１３ａ】マウスパッパリシン１断片１のアミノ酸配列の図である。
【図１３ｂ】マウスパッパリシン１断片２のアミノ酸配列の図である。
【図１３ｃ】マウスパッパリシン１断片３のアミノ酸配列の図である。
【図１３ｄ】マウスパッパリシン１断片４のアミノ酸配列の図である。
【図１３ｅ】マウスパッパリシン１断片５のアミノ酸配列の図である。
【図１３ｆ】マウスパッパリシン１断片６のアミノ酸配列の図である。
【図１４ａ】ヒトパッパリシン１断片１のアミノ酸配列の図である。
【図１４ｂ】ヒトパッパリシン１断片２のアミノ酸配列の図である。
【図１４ｃ】ヒトパッパリシン１断片３のアミノ酸配列の図である。
【図１４ｄ】ヒトパッパリシン１断片４のアミノ酸配列の図である。
【図１４ｅ】ヒトパッパリシン１断片５のアミノ酸配列の図である。
【図１４ｆ】ヒトパッパリシン１断片６のアミノ酸配列の図である。
【図１５】Ｂ１６細胞の安定発現株におけるパッパリシン発現を示す図である。発現を、連続培養での６継代後（レーン２〜５）または２０を超える継代後（レーン６〜９）の４つの安定クローンにおいてＲＴ−ＰＣＲによって測定した。親Ｂ１６細胞は、パッパリシン陰性であることが示された（レーン１）。パッパリシン発現プラスミドを、陽性対照として増幅し（レーン１０）、水を陰性対照として用いた（レーン１１）。
【図１６】精製されたタンパク質断片のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。精製カラムからの溶出画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供し、所望の産物の回収率および混入しているタンパク質（画分）の存在を決定した。非誘導性（Ｕ）および誘導性（Ｉ）細菌培養物のアリコートは、発現が誘導されたことを表すことが示されている。通過画分試料（Ｆ）および洗浄試料（Ｗ）もまた、分析し、タンパク質精製手順中のタンパク質損失を検出した。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
材料および方法
腫瘍幹細胞の組織収集、単離、および培養
前立腺癌について前立腺全摘除術を受けた患者から、患者の同意を得て、ヒト前立腺組織を入手した。前立腺癌を、代表的な隣接断片の組織学的検討によって確認した。一部の症例において、転移が疑われる場合には、リンパ節生検を行った。初代幹細胞由来培養物を、完全ケラチノサイト成長培地［上皮成長因子（ＥＧＦ）およびウシ下垂体抽出物を含むケラチノサイト無血清培地；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ］中で維持した。培地にまた、２ｎｇ／ｍＬの白血病抑制因子（ＬＩＦ；Ｓｉｇｍａ、Ｐｏｏｌｅ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）、２ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子（Ｓｉｇｍａ）、および１００ｎｇ／ｍＬのコレラ毒素（Ｓｉｇｍａ）を追加した。正常な前立腺上皮について以前記載されているように（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、２００４）、ＣＤ４４／α２β１ｈｉ／ＣＤ１３３＋細胞を組織から単離した。
【００５１】
標準細胞系の組織培養
細胞系を、以下の成長培地中、３７℃／大気中５％ＣＯ２で維持した：ＰＮＴ２ Ｒ１０培地：１０％ウシ胎仔血清および１％Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ＰＣ３細胞 Ｈ７培地：ウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ）および上皮成長因子（ＥＧＦ）を追加した７％ウシ胎仔血清および１％Ｌ−グルタミンを含むＨＡＭＳ Ｆ１２；Ｐ４Ｅ６細胞 Ｋ２培地：２％ウシ胎仔血清および１％Ｌ−グルタミンを含むＫＳＦＭ。
【００５２】
α２β１ｈｉ／ＣＤ１３３＋細胞の免疫蛍光染色
氷冷した２：１のメタノール：アセトン中の２０分間の固定化による共焦点顕微鏡下での画像化のための処理前に、腫瘍由来の培養細胞から直接、α２β１ｈｉ／ＣＤ１３３＋細胞を選択した。スライドを、２０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）中、室温で１時間、ブロッキングした。ブロッキング後、細胞を、２０％ＮＧＳ中に希釈されたパッパリシンＡ（ａｂ５９０８８、Ａｂｃａｍ）に対するウサギポリクローナル抗体とインキュベートした。洗浄（３×ＴＢＳ）後、細胞を、アレクサ４８８タグ付き二次抗体でさらに探索した。細胞を、カバーガラス下の抗光退色（Ｄａｋｏ）媒体中にマウントした。
【００５３】
マウスＰＡＰＰＡ断片のｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターへのクローニング
ヒトＰＡＰＰＡの推定タンパク質ドメイン（図２および表１参照）におおよそ対応する産物を増幅するようにプライマーを設計した。各フォワードプライマーおよびリバースプライマーはまた、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、下記参照）に用いるＨｉｓタグ付きタンパク質発現ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）のＢａｍＨ１部位に相同である１５ｂｐ配列を含んだ。ＰＣＲを、ＫＯＤ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて以下の条件で行った：９５℃で２分間、続いて９５℃１０秒間、５５℃１０秒間、７０℃１５秒間の２５サイクル。産物を、ＧｅｌＲｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１／１０，０００希釈物を含む１％アガロースゲル上に流した。バンドを、ＵＶトランスイルミネータ（ＧｅｎｅＧｅｎｉｕｓ）を用いて可視化した。
【００５４】
ｐＥＴ−２２ｂ（＋）をＢａｍＨ１で直線化し（３７℃、３時間）、生成物を、ＧｅｌＲｅｄで染色された０．８％アガロースゲル上に流した。直線化したベクターに対応するバンドを切り取り、ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを用いて、製造会社のプロトコールに従い精製した。
【００５５】
断片ＤＮＡのベクターへの挿入を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ａｄｖａｎｔａｇｅキットを用いて、製造会社の使用説明書に従い達成した。生じた構築物を、ＤＨ５αコンピテント細菌へ形質転換し、続いて、アンピシリン（５０ｕｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）を含むＬｕｒｉａ ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）寒天で培養した。プレートを３７℃で一晩、インキュベートした。個々のコロニーを採取して、アンピシリン含有の５ｍｌのＬＢの中へ入れ、振盪インキュベータで一晩、インキュベートした。ＤＮＡを、Ｑｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造会社の使用説明書に従い抽出した。ＤＮＡシークエンシングにより、挿入断片は、精製に必要とされるＨｉｓタグとインフレームであることが確認された（Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｙｏｒｋ）。構築物を、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ発現宿主へ形質転換した。
【００５６】
タンパク質発現の誘導
上記と同じ条件を用いて、バルク誘導を行った。関連パッパリシン断片を含むＲｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞を、アンピシリン（５０ｕｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）含有の１０ｍｌのＬＢへ接種し、振盪インキュベータ内、３７℃で、インキュベートした。ＯＤ６００が０．５に達したとき、培養物を、アンピシリン含有の５００ｍｌのＬＢに加えた。ＯＤ６００が０．５ユニットに達したとき、１ｍＭのＩＰＴＧを加え、培養物をさらに２時間、インキュベートした。細胞を遠心分離によってペレット化し、洗浄緩衝液（Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ５ＯｍＭ；ＥＤＴＡ ２ｍＭ、ＮａＣＩ ５ＯｍＭ、ｐＨ７．９）中に再懸濁し、もう一度、ペレット化した。乾燥ペレットを精製まで−８０℃で保存した。
【００５７】
変性条件下での精製
予備実験により、断片が不溶性封入体へパッケージングされたことが示され、したがって、断片を変性条件下で精製した。５００ｍｌの培養物からの細菌細胞ペレットを１０ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁し、続いて、氷上で超音波処理（Ｓｏｎｉｐｒｅｐ １５０、ＭＳＥ；１５秒間の冷却を差し入れて４×３０秒間のバースト）を行った。溶解した培養物を１０，０００ｘｇで１５分間、回転させた。上清を捨て、不溶性物質のペレットを、１０ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁し、もう一度、遠心分離した。
【００５８】
生じたペレットを、グアニジン溶解緩衝液中に再懸濁した。最初に、ペレットを、５ｍｌの再懸濁緩衝液（オルトリン酸二水素ナトリウム２０ｍＭ；ＮａＣｌ０．５Ｍ、ｐＨ７．８）中に再懸濁し、１５ｍｌのグアニジン溶解緩衝液（オルトリン酸二水素ナトリウム２０ｍＭ；ＮａＣｌ０．５Ｍ、グアニジンＨＣｌ ８Ｍ、ｐＨ７．８）を加えて、６ＭのグアニジンＨＣｌの最終濃度を生じた。可溶化タンパク質を、回転式振盪機上、室温で１０分間、インキュベートし、続いて、０．８μｍのシリンジフィルターを通して濾過した。
【００５９】
ＡＫＴＡ精製器（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に取り付けた、３％ＮｉＳＯ４を充填した１ｍｌ ＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製を行った。可溶化タンパク質を、変性結合緩衝液（オルトリン酸二水素ナトリウム２０ｍＭ；ＮａＣｌ０．５Ｍ、尿素８Ｍ、ｐＨ７．８）と共に１ｍｌ／分の速度でカラムを通過させた。変性洗浄緩衝液（オルトリン酸二水素ナトリウム２０ｍＭ；ＮａＣｌ０．５Ｍ、尿素８Ｍ、ｐＨ６）を用いてカラムを洗浄し、その緩衝液については３０分間にわたって徐々に未変性洗浄緩衝液（オルトリン酸二水素ナトリウム２５ｍＭ；ＮａＣｌ０．５Ｍ、イミダゾール５ｍＭ、ｐＨ８）に置き換えていった。５ｍＭ〜５００ｍＭのイミダゾールの勾配が時間とともに生じるように、未変性洗浄緩衝液を未変性溶出緩衝液（オルトリン酸二水素ナトリウム２５ｍＭ；ＮａＣｌ０．５Ｍ、イミダゾール５００ｍＭ、ｐＨ８）へ１５分間にわたって交換することによって直線勾配溶出を行った。１ｍｌの画分を溶出液から１分間隔で収集した。
【００６０】
緩衝液交換およびタンパク質の濃度
溶出断片のＰＡＧＥ分析後、ＰＢＳへの緩衝液交換およびさらに濃度のために、高発現を有する画分を選択した。画分をプールし、Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０内に置いた。ＰＢＳを加えて、容量を２０ｍｌにし、続いて、容量が５ｍｌまで減少するまで４０００ｒｐｍで遠心分離した。ＰＢＳを２０ｍｌまで加え、その工程をさらに２回、繰り返した。最後に、容量をさらに１ｍｌまで減少させた。タンパク質濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を用いて定量した。
【００６１】
Ｂ１６細胞の培養
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．、Ｙｅｏｖｉｌ、ＵＫ）および１％Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）を追加したＲＰＭＩ１６４０培地で構成されるＲ１０成長培地中に維持した。
【００６２】
Ｂ１６細胞の安定的遺伝子導入
Ｂ１６細胞を２５ｃｍ２フラスコ内に５×１０５細胞／フラスコでプレーティングし、遺伝子導入前に２４時間、Ｒ１０成長培地中、３７℃でインキュベートした。Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅリポソーム遺伝子導入試薬を用いて、製造会社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）の使用説明書に従い、６．５μｇ／フラスコのｐＬＮＣＸ−ＰＡＰＰＡ発現ベクターを細胞に導入した。簡単に言えば、ＤＮＡをＯｐｔｉＭＥＭ遺伝子導入培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）と混合した。安定発現株を選択するために、遺伝子導入から７２時間後、成長培地をＲ１０＋６００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８へ変えた。Ｇ４１８抵抗性コロニーの成長を可能にするように、１０〜１４日間、選択を維持した。その後、９６ウェル組織培養プレート内に１細胞／ウェルで細胞を再びプレーティングし、Ｒ１０＋６００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８中に維持した。
【００６３】
実施例
パッパリシン発現は、試験された全ての３つの細胞系において一貫して細胞質発現である；図５、６、および７を参照されたい。分泌された成分はこの技術を用いて検出することができないので、これは分泌型タンパク質について正常である。発現は、良性細胞系（ＰＮＴ２）より癌細胞系（Ｐ４Ｅ６およびＰＣ３）で高い。興味深いことに、パッパリシン発現は、骨転移に由来した進行期細胞系ＰＣ３より初期癌系Ｐ４Ｅ６で高い。初代細胞において、発現は、良性と比較して、平均して癌細胞で高い。癌患者において、発現は、より分化したα２β１低集団と比較して、α２β１高／ＣＤ１３３＋幹細胞およびα２β１高／ＣＤ１３３始原細胞の集団で高い。パッパリシン２に関しての類似した免疫蛍光染色パターンは、Ｐ４Ｅ６、ＰＣ３、およびＰＮＴ２細胞によって示されており、図８を参照されたい。
【００６４】
本明細書に開示されたワクチンの効力を試験するためにインビボモデルにＢ１６メラノーマ細胞安定発現株を用いる。クローン化細胞系におけるパッパリシンの発現は、図１５に示されている。図１６は、図１０に記載されている選択されたパッパリシン断片２、３、および４の組換え発現を記載する。
【図１−１】
【図１−２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パッパリシンポリペプチドまたはその抗原性部分、ならびにアジュバントおよび／または担体を含むワクチン組成物。
【請求項２】
パッパリシンポリペプチドが図２および／または図４におけるアミノ酸配列によって表される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗原性部分が、図１４ａ、１４ｂ、１４ｃ、１４ｄ、１４ｅ、または１４ｆに示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその配列変異体からなり、前記配列変異体が、少なくとも１つのアミノ酸残基のアミノ酸付加、欠失、または置換であり、前記配列変異体が少なくとも１つの抗原性エピトープを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗原性部分が、図１４ｃに示されるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列またはその配列変異体からなり、前記配列変異体が、少なくとも１つのアミノ酸残基のアミノ酸付加、欠失、または置換であり、前記配列変異体が少なくとも１つの抗原性エピトープを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
パッパリシンポリペプチドまたはその抗原性部分をコードする核酸分子を含む、ＤＮＡワクチン組成物。
【請求項６】
前記組成物が、以下：
ｉ）図１および／または図３に表される核酸配列を含む、またはそれからなる核酸分子、
ｉｉ）相補鎖が上記ｉ）における配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子であって、パッパリシンポリペプチドまたはその抗原性部分をコードする、核酸分子、
からなる群から選択される核酸分子を含む、請求項５に記載のＤＮＡワクチン組成物。
【請求項７】
前記核酸分子が以下：
ｉ）図１２ａ、１２ｂ、１２ｃ、１２ｄ、１２ｅ、または１２ｆに表される核酸配列からなる核酸分子、
ｉｉ）相補鎖が上記ｉ）における配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子であって、パッパリシンポリペプチドまたはその抗原性部分をコードする、核酸分子、
からなる群から選択される、請求項６に記載のＤＮＡワクチン組成物。
【請求項８】
前記核酸分子が図１２ｃに示される核酸配列からなる、請求項７に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項９】
前記核酸分子が、前記パッパリシンポリペプチドまたはその抗原性部分を発現するのに適合させた発現ベクターの部分である、請求項５〜８のいずれかに記載のＤＮＡワクチン組成物。
【請求項１０】
前記アジュバントが以下：
ＧＭＣＳＦ、インターフェロンγ、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１２、インターロイキン２３、インターロイキン１７、インターロイキン２、インターロイキン１、ＴＧＦ、ＴＮＦα、およびＴＮＦβからなる群から選択されるサイトカイン、
からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
アジュバントがＴＬＲアゴニストである、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＴＬＲアゴニストが以下：
ＣｐＧオリゴヌクレオチド、フラジェリン、モノホスホリルリピドＡ、ポリＩ：Ｃ、およびそれらの誘導体、
からなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記アジュバントがＣｐＧオリゴヌクレオチドである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記アジュバントがムラミルジペプチド（ＭＤＰ）および／またはトレハロースジコリノミコラート（ＴＤＭ）などの細菌細胞壁誘導体である、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
パッパリシンポリペプチドまたはその抗原性部分ならびにアジュバントおよび／または担体を含む有効量のワクチン組成物を投与するステップを含む、癌に罹患している、または癌の素因を有する対象にワクチン接種する方法。
【請求項１６】
前記癌が前立腺癌である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記癌が肺癌である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１】
パッパリシンポリペプチドまたはその抗原性部分、ならびにアジュバントおよび／または担体を含むワクチン組成物。
【請求項２】
パッパリシンポリペプチドが図２および／または図４におけるアミノ酸配列によって表される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗原性部分が、図１４ａ、１４ｂ、１４ｃ、１４ｄ、１４ｅ、または１４ｆに示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその配列変異体からなり、前記配列変異体が、少なくとも１つのアミノ酸残基のアミノ酸付加、欠失、または置換であり、前記配列変異体が少なくとも１つの抗原性エピトープを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗原性部分が、図１４ｃに示されるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列またはその配列変異体からなり、前記配列変異体が、少なくとも１つのアミノ酸残基のアミノ酸付加、欠失、または置換であり、前記配列変異体が少なくとも１つの抗原性エピトープを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
パッパリシンポリペプチドまたはその抗原性部分をコードする核酸分子を含む、ＤＮＡワクチン組成物。
【請求項６】
前記組成物が、以下：
ｉ）図１および／または図３に表される核酸配列を含む、またはそれからなる核酸分子、
ｉｉ）相補鎖が上記ｉ）における配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子であって、パッパリシンポリペプチドまたはその抗原性部分をコードする、核酸分子、
からなる群から選択される核酸分子を含む、請求項５に記載のＤＮＡワクチン組成物。
【請求項７】
前記核酸分子が以下：
ｉ）図１２ａ、１２ｂ、１２ｃ、１２ｄ、１２ｅ、または１２ｆに表される核酸配列からなる核酸分子、
ｉｉ）相補鎖が上記ｉ）における配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子であって、パッパリシンポリペプチドまたはその抗原性部分をコードする、核酸分子、
からなる群から選択される、請求項６に記載のＤＮＡワクチン組成物。
【請求項８】
前記核酸分子が図１２ｃに示される核酸配列からなる、請求項７に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項９】
前記核酸分子が、前記パッパリシンポリペプチドまたはその抗原性部分を発現するのに適合させた発現ベクターの部分である、請求項５〜８のいずれかに記載のＤＮＡワクチン組成物。
【請求項１０】
前記アジュバントが以下：
ＧＭＣＳＦ、インターフェロンγ、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１２、インターロイキン２３、インターロイキン１７、インターロイキン２、インターロイキン１、ＴＧＦ、ＴＮＦα、およびＴＮＦβからなる群から選択されるサイトカイン、
からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
アジュバントがＴＬＲアゴニストである、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＴＬＲアゴニストが以下：
ＣｐＧオリゴヌクレオチド、フラジェリン、モノホスホリルリピドＡ、ポリＩ：Ｃ、およびそれらの誘導体、
からなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記アジュバントがＣｐＧオリゴヌクレオチドである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記アジュバントがムラミルジペプチド（ＭＤＰ）および／またはトレハロースジコリノミコラート（ＴＤＭ）などの細菌細胞壁誘導体である、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
パッパリシンポリペプチドまたはその抗原性部分ならびにアジュバントおよび／または担体を含む有効量のワクチン組成物を投与するステップを含む、癌に罹患している、または癌の素因を有する対象にワクチン接種する方法。
【請求項１６】
前記癌が前立腺癌である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記癌が肺癌である、請求項１５に記載の方法。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１１ｃ】
【図１１ｄ】
【図１１ｅ】
【図１１ｆ】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１２ｃ】
【図１２ｄ】
【図１２ｅ】
【図１２ｆ】
【図１３ａ】
【図１３ｂ】
【図１３ｃ】
【図１３ｄ】
【図１３ｅ】
【図１３ｆ】
【図１４ａ】
【図１４ｂ】
【図１４ｃ】
【図１４ｄ】
【図１４ｅ】
【図１４ｆ】
【図１５】
【図１６】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１１ｃ】
【図１１ｄ】
【図１１ｅ】
【図１１ｆ】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１２ｃ】
【図１２ｄ】
【図１２ｅ】
【図１２ｆ】
【図１３ａ】
【図１３ｂ】
【図１３ｃ】
【図１３ｄ】
【図１３ｅ】
【図１３ｆ】
【図１４ａ】
【図１４ｂ】
【図１４ｃ】
【図１４ｄ】
【図１４ｅ】
【図１４ｆ】
【図１５】
【図１６】
【公表番号】特表２０１２−５３０７７４（Ｐ２０１２−５３０７７４Ａ）
【公表日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１６８４７（Ｐ２０１２−５１６８４７）
【出願日】平成２２年６月２２日（２０１０．６．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００１２２５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４９９６３
【国際公開日】平成２２年１２月２９日（２０１０．１２．２９）
【出願人】（５０４０５１５４８）プロキュア・セラピューティクス・リミテッド (4)
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＣＵＲＥ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｒｅ， Ｙｏｒｋ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐａｒｋ， Ｙｏｒｋ ＹＯ１０ ５ＤＧ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月２２日（２０１０．６．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００１２２５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４９９６３
【国際公開日】平成２２年１２月２９日（２０１０．１２．２９）
【出願人】（５０４０５１５４８）プロキュア・セラピューティクス・リミテッド (4)
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＣＵＲＥ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｒｅ， Ｙｏｒｋ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐａｒｋ， Ｙｏｒｋ ＹＯ１０ ５ＤＧ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ
【Ｆターム（参考）】
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