癌抑制剤
【課題】癌抑制遺伝子を新たに見出してこれを含有する癌抑制剤 を提供すること。
【解決手段】ＮＲ１Ｉ２遺伝子又はその相同遺伝子を含有する癌抑制剤；ＮＲ１Ｉ２タンパク質又はその相同タンパク質を含有する癌抑制剤。
【解決手段】ＮＲ１Ｉ２遺伝子又はその相同遺伝子を含有する癌抑制剤；ＮＲ１Ｉ２タンパク質又はその相同タンパク質を含有する癌抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌抑制遺伝子及び該遺伝子がコードするタンパク質の医薬用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の発症は細胞のタンパク質の変異や量的変化に起因することが知られている。近年の遺伝子工学の発達により、特定のタンパク質をコードする遺伝子の増幅や癌細胞における遺伝子変異の解析が可能となり、癌研究の分野においても飛躍的な発展をもたらした。これまでに細胞の癌化や癌細胞の異常増殖に関与する癌遺伝子の解析及び同定が進んでいる。一方、変異あるいは発現低下により癌化につながる癌抑制遺伝子がここ数年脚光を浴びている。これまでに同定されている癌抑制遺伝子としては、網膜芽細胞腫のＲｂ遺伝子、大腸癌のｐ５３遺伝子及びＡＰＣ遺伝子、Ｗｉｌｍｓ腫瘍のＷＴ１遺伝子などが挙げられる。ＷＴ１遺伝子を活用した癌抑制剤の例も報告されている（特許文献１）。
【０００３】
また、癌の発生、進展悪性化、転移などには一つの遺伝子の異常だけでなく複数の遺伝子の異常が関与していることが次第に明らかになりつつあり、さらに多くの未同定の癌遺伝子及び癌抑制遺伝子が存在するものと考えられている。癌抑制効果を有する遺伝子は数多く知られているが、多くの場合、その選別には患者の遺伝子の変異を、染色体ＤＮＡを染色することにより視覚化して見つけ出すアプローチ（非特許文献１）や、遺伝子の欠失をＬＯＨ（Ｌｏｓｓ Ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）解析で大まかな範囲を選定した後、重要な遺伝子領域を絞り込むという方法がこれまで行われてきた（特許文献２）。しかし、これらの方法では、判別できるＤＮＡ欠失領域が莫大なものとなり、重要な遺伝子領域を絞り込む作業に大量の時間と手間を必要とする欠点を持っており、癌抑制遺伝子を探し出す手段としては限界があった。
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２００３／００２１４２号公報
【特許文献２】ＷＯ０１／０３２８５９号公報
【非特許文献１】Ｙａｓｕｈｉｄｅ Ｙａｍａｓｈｉｔａ，ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ，１１（３３）：５１２９−５１３５，２００５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、癌抑制遺伝子を新たに見出してこれを含有する癌抑制剤を提供することを課題とする。本発明はまた、該癌抑制遺伝子がコードするタンパク質を含有する癌抑制剤 、ならびに該癌抑制遺伝子を用いる癌の検出及び診断方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決すべく、神経芽細胞腫症例のＤＮＡのメチル化度の異なる遺伝子を同定することを精力的に行ってきた。神経芽細胞腫は、胎生期に神経冠細胞由来の遊走性交感神経芽細胞より発生する小児悪性腫瘍である。癌細胞の場合、大半はメチル化されていないはずの癌の発生を抑える遺伝子（癌抑制遺伝子）の５’領域に存在するＣｐＧ部位が密集したゲノム領域（ＣｐＧアイランド）が異常にメチル化され、メッセンジャーＲＮＡへの発現が抑制されていることがある。近年、遺伝子の突然変異と並ぶ、重要な発癌機構として認知されている。本発明では、神経芽細胞腫におけるメチル化ＤＮＡを特定するために、新規に開発されたＢＡＭＣＡ（ＢＡＣ ａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ ＭＣＡ）法（Ｉｎａｚａｗａ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ． ９５（７） ，５５９，２００４）により癌で高頻度にメチル化した遺伝子をスクリーニングした。さらに、本発明者らは、ＣＯＢＲＡ（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）法（Ｔｏｙｏｔａ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９，２３０７，１９９９）とＲＴ−ＰＣＲ法を組み合わせ、神経芽細胞腫でその進行度に伴いＤＮＡのメチル化度が高く、発現が著しく抑制されている遺伝子として、ＮＲ１Ｉ２（ＮＵＣＬＥＡＲ ＲＥＣＥＰＴＯＲ ＳＵＢＦＡＭＩＬＹ １， ＧＲＯＵＰ Ｉ， ＭＥＭＢＥＲ ２； ＮＲ１Ｉ２、 別名 ＰＲＥＧＮＡＮＥ Ｘ ＲＥＣＥＰＴＯＲ； ＰＸＲ）遺伝子を同定することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち本発明によれば、ＮＲ１Ｉ２遺伝子又はその相同遺伝子を含有する癌抑制剤が提供される。
【０００８】
好ましくは、前記遺伝子又はその相同遺伝子はベクターに組み込まれている。
好ましくは、前記ベクターはウイルスベクター又は動物細胞発現用プラスミドベクターである。
好ましくは、前記ウイルスベクターはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである。
好ましくは、前記遺伝子又はその相同遺伝子はリポソームに封入されている。
【０００９】
本発明の別の態様によれば、ＮＲ１Ｉ２タンパク質又はその相同タンパク質を含有する癌抑制剤が提供される。
【００１０】
本発明のさらに別の態様によれば、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の全部又はその一部を含むＤＮＡ又はＲＮＡを用いて検体試料中のＮＲ１Ｉ２遺伝子を解析する工程を含む、癌の検出及び診断方法が提供される。
【００１１】
好ましくは、前記解析は遺伝子の変異の検出又は遺伝子の発現量の異常の検出である。
好ましくは、癌の検出及び診断方法は、本発明の癌抑制剤の適用対象となる癌を選別するための方法である。
【００１２】
本発明のさらに別の態様によれば、ＮＲ１Ｉ２タンパク質に対する抗体又はその断片を用いて検体試料中のＮＲ１Ｉ２タンパク質を解析する工程を含む、癌の検出及び診断方法が提供される。
【００１３】
好ましくは、前記解析はタンパク質の発現量の異常の検出である。
好ましくは、癌の検出及び診断方法は、本発明の癌抑制剤の適用対象となる癌を選別するための方法である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、新たに癌抑制機能を見出したＮＲ１Ｉ２遺伝子又は該遺伝子がコードするＮＲ１Ｉ２タンパク質を含有する癌抑制剤が提供される。これらの薬剤は癌の個別性に基づく治療や癌の予後の改善などの臨床上の観点から、あるいは癌の基礎的研究の観点から非常に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の実施態様及び実施方法について詳細に説明する。
（１）癌抑制剤
本発明に一態様によれば、本発明の癌抑制剤は有効成分としてＮＲ１Ｉ２遺伝子又はその相同遺伝子を含む。本発明のもう一つの態様によれば、本発明の癌抑制剤は有効成分としてＮＲ１Ｉ２タンパク質又はその相同タンパク質を含む。
【００１６】
ＮＲ１Ｉ２遺伝子の塩基配列及びＮＲ１Ｉ２タンパク質のアミノ酸配列は既に知られており（Ｌｅｈｍａｎｎ， Ｊ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０２， １０１６−１０２３， １９９８）、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の塩基配列はＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ のデータベースにＡＦ０６１０５６番にて、またＮＲ１Ｉ２タンパク質のアミノ酸配列は同データベースにＡＡＤ０５４３６．１番にて登録されている。ＮＲ１Ｉ２遺伝子の塩基配列は配列番号１に記載する通りであり、ＮＲ１Ｉ２タンパク質は配列番号１の塩基配列の３０４番目から１６０８番目までの領域によりコードされ、そのアミノ酸配列は配列番号２に示される通りである。
【００１７】
本明細書において「ＮＲ１Ｉ２遺伝子」というのは、上記塩基配列で特定されるヒト由来の遺伝子をいい、「ＮＲ１Ｉ２タンパク質」というのは、該ＮＲ１Ｉ２遺伝子がコードし、上記アミノ酸配列で特定されるタンパク質をいう。
【００１８】
ＮＲ１Ｉ２遺伝子は、当業者に公知の技術を用いて培養細胞などから取得したｃＤＮＡであってもよいし、又は本明細書の配列番号１に記載の塩基配列に基づいてＰＣＲ法などにより合成したものでもよい。ＰＣＲ法により配列番号１に記載した塩基配列を有するＤＮＡを取得する場合、ヒトの染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを使用してＰＣＲを行う。ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片は大腸菌などの宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００１９】
上記のブローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ， ２nd Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ．，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）などに記載された方法に準じて行うことができる。
【００２０】
本発明において、「ＮＲ１Ｉ２遺伝子の相同遺伝子」とは、配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加又は置換されている塩基配列であって、癌抑制活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子；又は配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、癌抑制活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子いう。また、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の相同遺伝子にはＮＲ１Ｉ２遺伝子の断片も含まれる。
【００２１】
上記の「配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加又は置換されている塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から６０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個程度を意味する。
【００２２】
上記の「癌抑制活性」の程度は特に限定はされないが、好ましくはＮＲ１Ｉ２タンパク質が有する癌抑制活性と実質的に同等又はそれ以上の癌抑制活性をいう（以下、本明細書における「癌抑制活性」は同じ意味を示す）。
【００２３】
従って、「ＮＲ１Ｉ２遺伝子の相同遺伝子」は上記に定義される構造と機能を有する限り、由来は問わず、ヒト以外の哺乳動物由来であってもよいし、ヒトなどの哺乳動物由来の遺伝子に対して人工的に変異を導入したものであってもよい。ただし、該遺伝子を後記のごとく癌抑制剤に使用する場合は臨床上の安全性の観点からヒト由来ものが好ましい。
【００２４】
上記の「配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加又は置換されている塩基配列であって、癌抑制活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子」は、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。具体的には、上記遺伝子は配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡを利用し、これらＤＮＡに変異を導入することにより取得することができる。例えば、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法などを用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ， ２nd Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ．，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ （１９８７−１９９７）などに記載の方法に準じて行うことができる。
【００２５】
上記の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニー又はプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡなどを挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ， ２nd Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ．，１９８９などに記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２６】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００２７】
上記の「配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、癌抑制活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子」は、上述の通り、一定のハイブリダイゼーション条件下でコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法などを行うことにより得ることができる。
【００２８】
本発明において、「ＮＲ１Ｉ２タンパク質の相同タンパク質」とは、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は挿入したアミノ酸配列であって、癌抑制活性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質；又は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、癌抑制活性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をいう。
【００２９】
上記した「配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は挿入したアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００３０】
上記した「配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、該アミノ酸配列と配列番号２に記載のアミノ酸配列との相同性が少なくとも７０％以上であり、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上であることを意味する。
【００３１】
ＮＲ１Ｉ２タンパク質は、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。比較的容易な操作でかつ大量に製造できるという点では、組み換えタンパク質が好ましい。
【００３２】
天然由来のタンパク質は、該タンパク質を発現している細胞又は組織からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせて単離することができる。化学合成タンパク質は、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法に従って合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。組み換えタンパク質は、該タンパク質をコードする塩基配列（例えば、配列番号１に記載の塩基配列）を有するＤＮＡを好適な発現系に導入することにより生産することができる。
【００３３】
なお、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換又は挿入したアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の一例示す配列番号１に記載の塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜製造又は入手することができる。
【００３４】
本発明の癌抑制剤の好ましい態様としては、有効成分として上記のＮＲ１Ｉ２遺伝子又はその相同遺伝子をベクターに組み込んだ組換えベクターを含む。ベクターとしてはウイルスベクター又は動物細胞発現用ベクター、好ましくはウイルスベクターが用いられる。
【００３５】
ウイルスベクターとしてはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。中でも、レトロウイルスベクターは、細胞に感染後、ウイルスゲノムが宿主染色体に組み込まれ、ベクターに組み込んだ外来遺伝子を安定にかつ長期的に発現させる可能であるからレトロウイルスベクターを使用することが特に望ましい。
【００３６】
動物細胞発現用ベクターとしては例えばｐＣＸＮ２（Ｇｅｎｅ， １０８， １９３−２００， １９９１）、ＰＡＧＥ２０７（特開平６−４６８４１号公報）又はその改変体などを用いることができる。
【００３７】
上記組換えベクターは適当な宿主に導入して形質転換し、得られた形質転換体を培養することによって生産することができる。組換えベクターがウイルスベクターの場合、これを導入する宿主としてはウイルス生産能を有する動物細胞が用いられ、例えば、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞などが挙げられる。レトロウイルスベクターの宿主としては、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＭＬＶなどが、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターの宿主としては、ヒト胎児腎臓由来の２９３細胞などが用いられる。ウイルスベクターの動物細胞への導入はリン酸カルシウム法などで行うことができる。また、組換えベクターが動物細胞発現用ベクターの場合、これを導入する宿主としては大腸菌Ｋ１２株、ＨＢ１０１株、ＤＨ５α株などを使用でき、大腸菌の形質転換は当業者に公知である。
【００３８】
得られた形質転換体はそれぞれに適した培地、培養条件により培養する。例えば、大腸菌の形質転換体の培養は、生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他を含有するｐＨ５〜８程度の液体培地を用いて行うことができる。培養は通常１５〜４３℃で約８〜２４時間程度行う。この場合、目的とする組み換えベクターは、培養終了後、通常のＤＮＡ単離精製法により得ることができる。
【００３９】
また、動物細胞の形質転換体の培養は、例えば約５〜２０％のウシ胎児血清を含む１９９培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地などの培地を用いて行うことができる。培地のｐＨは約６〜８が好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１８〜６０時間行う。この場合、目的とする組み換えベクターは、それを含有するウイルス粒子が培養上清中に放出されるので、ウイルス粒子の濃縮、精製を塩化セシウム遠心法、ポリエチレングリコール沈澱法、フィルター濃縮法などにより得ることができる。
【００４０】
本発明の癌抑制剤のうち、有効成分としてＮＲ１Ｉ２遺伝子又はその相同遺伝子を含む癌抑制剤（以下、遺伝子治療剤という）は、有効成分であるＮＲ１Ｉ２遺伝子又はその相同遺伝子を遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合することにより製造することができる。また、ＮＲ１Ｉ２遺伝子又はその相同遺伝子をウイルスベクターに組み込んだ場合は、組換えベクターを含有するウイルス粒子を調製し、これを遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合する。
【００４１】
上記基剤としては、通常注射剤に用いる基剤を使用することができ、例えば、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物などの塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコースなどの溶液、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液などが挙げられる。あるいはまた、当業者に既知の常法に従って、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、植物油、界面活性剤などの助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製することもできる。これらの注射剤は、粉末化、凍結乾燥などの操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。
【００４２】
また、本発明の遺伝子治療剤は、常法により調製されたリポソームの懸濁液にＮＲ１Ｉ２遺伝子を添加し凍結した後融解することにより製造することもできる。リポソームを調製する方法は、薄膜振とう法、超音波法、逆相蒸発法、界面活性剤除去法などがある。リポソームの懸濁液は超音波処理した後、遺伝子を添加するのが遺伝子の封入効率を向上させる上で好ましい。遺伝子を封入したリポソームはそのまま、又は水、生理食塩水などに懸濁して静脈投与することができる。
【００４３】
上記遺伝子治療剤の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内などの全身投与でもよいし、あるいは癌原病巣又は予想転移部位に対して、局所注射又は経口投与などの局所投与を行ってもよい。さらに、遺伝子治療剤の投与にあたっては、カテーテル技術、遺伝子導入技術、又は外科的手術などと組み合わせた投与形態をとることもできる。
【００４４】
上記遺伝子治療剤の投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日当たり組み換え遺伝子の重量として１μｇ／ｋｇ体重から１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。
【００４５】
また、本発明の癌抑制剤のうち、有効成分としてＮＲ１Ｉ２タンパク質又はその相同タンパク質を含む癌抑制剤（以下、タンパク質製剤という）は、有効成分であるＮＲ１Ｉ２タンパク質又はその相同タンパク質に製剤用添加物（例えば、担体、賦形剤など）を含む医薬組成物の形態で提供される。
【００４６】
上記タンパク質製剤の形態は特に限定されず、経口投与のための製剤としては例えば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤などが挙げられ、非経口投与のための製剤としては例えば、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、経粘膜吸収剤、経皮吸収剤などが挙げられる。
【００４７】
上記タンパク質製剤の投与経路は特に限定されず、経口投与又は非経口投与（例えば、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与などへの粘膜投与、又は吸入投与など）の何れでもよい。
【００４８】
上記タンパク質治療剤の投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日あたり０．００１μｇ／ｋｇ体重から１０００μｇ／ｋｇ体重程度の範囲であり、好ましくは０．００１μｇ／ｋｇ体重から１００μｇ／ｋｇ体重程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。
【００４９】
上記癌抑制剤（遺伝子治療剤及びタンパク質製剤の両形態を含む）は、その有効量をヒトを含む哺乳動物に投与することによって癌を抑制するのに使用することができる。上記癌抑制剤はまたその予防及び／又は治療有効量をヒトを含む哺乳動物に投与することによって癌の予防及び／又は治療をするのに使用することができる。
【００５０】
本明細書でいう「癌抑制」とは、癌の発生又は転移・着床を防止するという予防的作用、ならびに癌細胞の増殖を抑制したり、癌を縮小することによって癌の進行を阻止したり、症状を改善させるという治療的作用の両方を含む最も広い意味を有し、いかなる場合においても限定的に解釈されるものではない。
【００５１】
本発明の癌抑制剤の適用対象となる癌の具体例としては、例えば悪性黒色腫、悪性リンパ腫、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、尿管腫瘍、胆嚢癌、胆管癌、胆道癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、睾丸腫瘍、上顎癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、甲状腺癌、脳腫瘍、カポジ肉腫、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽細胞腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚癌、基底細胞癌、皮膚付属器癌、皮膚転移癌、皮膚黒色腫などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、上記のうち特に好ましい適用対象となる癌は、神経芽細胞腫である。
【００５２】
（２）ＮＲ１Ｉ２遺伝子を用いた癌の検出方法
本発明の癌の検出及び診断方法は、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の全部又はその一部を含むＤＮＡ又はＲＮＡを用いて検体試料中のＮＲ１Ｉ２遺伝子を解析する工程を含む。本発明の癌の検出及び診断方法は、本発明の癌抑制剤の適用対象となる癌を選別するための検出方法でもよい。
【００５３】
ここで、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の一部とは、配列番号１に記載するＮＲ１Ｉ２遺伝子の塩基配列のうち、例えば約１０〜３０個の連続する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを意味する。検体試料としては、腫瘍が疑われる組織切片、血液、リンパ液、喀痰、肺洗浄液、尿、便、組織培養上清などを用いることができる。
【００５４】
上記の「癌抑制剤の適用対象となる癌を選別するための検出」とは組織等における本発明における癌抑制剤が有効に作用する癌の存在の有無を知ることをいう。
【００５５】
癌を選別するための検出は、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の全部又はその一部を含むＤＮＡ又はＲＮＡをプライマー又はプローブとして用いて検体試料中のＮＲ１Ｉ２遺伝子を解析することにより行う。ここで「ＮＲ１Ｉ２遺伝子を解析する」とは、具体的にはゲノムＤＮＡのメチル化の検出又は遺伝子の発現量の異常の検出を行うことをいう。
【００５６】
遺伝子の変異の検出は、上記ＤＮＡ又はＲＮＡをプライマーとして用いる場合では、例えば選択した２種の配列のプライマーによりＰＣＲ法で検体試料より調製したＤＮＡの部分配列を増幅させ、亜硫酸水素ナトリウムを処理することで、ゲノムＤＮＡ中の非メチル化シトシン（Ｃ）を、ウラシル（Ｕ）に変換する。メチル化されているシトシンは構造上安定であるために、この反応を受けず、ウラシルに変換されない。メチル化の影響を受ける制限酵素と組み合わせて変化したシトシンと非メチル化シトシンを制限酵素切断により解析することにより、メチル化ＤＮＡの存在を特定できる（ＣＯＢＲＡ法）。またＰＣＲ法で検体試料より調製したＤＮＡの部分配列を増幅させ、亜硫酸水素ナトリウムを処理後、この増幅産物をプラスミドに組み込み、宿主細胞を形質転換させて培養し、得られるクローンの塩基配列を解析することにより行うことも可能である。
【００５７】
一方、遺伝子の発現量の異常の検出は、上記ＲＮＡ配列を含むプローブを用いてノーザンハイブリダイゼーション法又はＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によって行うことができる。
【００５８】
（３）ＮＲ１Ｉ２タンパク質抗体又はその断片を用いた癌を選別するための検出方法
本発明の癌の検出及び診断方法は、ＮＲ１Ｉ２タンパク質に対する抗体又はその断片を用いて検体試料中のＮＲ１Ｉ２タンパク質の量を解析する工程を含む。本発明の癌の検出及び診断方法は、本発明の癌抑制剤の適用対象となる癌を選別するための検出方法でもよい。
【００５９】
本方法に用いるＮＲ１Ｉ２タンパク質に対する抗体（以下、ＮＲ１Ｉ２抗体という）は、ＮＲ１Ｉ２タンパク質の全部又は一部を抗原として、通常の方法で作成することができる。ＮＲ１Ｉ２タンパク質の一部とは、配列番号２に記載するＮＲ１Ｉ２タンパク質のアミノ酸配列のうち、例えば連続する少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは、少なくとも約１１〜２０個のアミノ酸からなるポリペプチドをいう。抗原とするＮＲ１Ｉ２タンパク質の全部又は一部の調製法は生物学的手法、化学合成手法いずれでもよい。
【００６０】
ポリクローナル抗体は、例えば上記抗原をマウス、モルモット、ウサギなどの動物の皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内などに複数回接種し十分に免疫した後、該動物から採血、血清分離して作製することができる。モノクローナル抗体は、例えば上記抗原で免疫したマウスの脾細胞と市販のマウスミエローマ細胞との細胞融合により得られるハイブリドーマを作成後、該ハイブリドーマ培養上清、又は該ハイブリドーマ投与マウス腹水から作成することができる。
【００６１】
上記のようにして調製したＮＲ１Ｉ２タンパク質抗体又はその断片を用いることによって検体試料中のＮＲ１Ｉ２タンパク質の発現量を知ることができる。測定には、例えばイムノブロット法、酵素抗体法（ＥＩＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光抗体法、免疫細胞染色などの免疫学的方法、又はウェスタンブロット法などが利用できる。ここで、ＮＲ１Ｉ２タンパク質抗体の断片とは当該抗体の一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）などをいう。また、検体試料としては、腫瘍が疑われる組織切片、血液、リンパ液、喀痰、肺洗浄液、尿、便、組織培養上清などを用いることができる。測定した検体試料中のＮＲ１Ｉ２タンパク質の発現量が低い場合は、検体とした組織や細胞においてＮＲ１Ｉ２遺伝子の発現が抑制されていることになり、本発明の癌抑制剤の適用対象となる癌を選別することができる。
【００６２】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
【００６３】
実施例１：ＢＡＭＣＡ法による神経芽細胞腫からのメチル化ＤＮＡの分離
神経芽細胞腫の培養細胞株ＩＭＲ３２およびＧＯＴＯを対象サンプルとし、５人の神経芽細胞腫で病期１の患者のＤＮＡを混ぜたものをコントロールサンプルとして用い、ＭＣＧ Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｒｒａｙ−４５００（Ｉｎａｚａｗａ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．９５（７），５５９，２００４）を用いてＢＡＭＣＡ法を行った。ＩＭＲ３２およびＧＯＴＯ細胞でＣｙ３で標識された各細胞の蛍光シグナルをコントロールサンプルのＣｙ５で標識された混合したｓｔａｇｅ １癌細胞の蛍光シグナルで割った値が、１．５以上のメチル化ＤＮＡとして分離されたＢＡＣクローンとその中に含まれる遺伝子を示している（表１）。ＮＲ１Ｉ２遺伝子はＢＡＣクローンの番号１６９Ｎ１３の中に含まれる遺伝子であり、そのＤＮＡ中にＣｐＧアイランドを有する。さらにＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ量を測定したところ、コントロールサンプルで発現があるものの、ＩＭＲ３２およびＧＯＴＯ細胞ではその発現は見られなかった。細胞にＤＮＡメチルトランスフェラーゼの阻害剤である５−アザ−デオキシシチジン（５−ａｚａ−ｄＣｙｄ）を細胞に添加して培養を続けると、ＤＮＡのメチル化を低下させることができるが、ＧＯＴＯ細胞に１μＭの濃度で５日間培養を続けた後、メッセンジャーＲＮＡ量を測定したところＮＲ１Ｉ２遺伝子は発現が回復することが判明した。このことは、ＮＲ１Ｉ２遺伝子は神経芽細胞腫ＧＯＴＯ細胞で、そのＤＮＡは通常メチル化してそのメッセンジャーＲＮＡの発現が低下しており、メチル化を解除することによりメッセンジャーＲＮＡの発現が発生することを意味する。言い換えるとＮＲ１Ｉ２遺伝子は進行した神経芽細胞腫でＤＮＡのメチル化によりそのメッセンジャーＲＮＡの発現を制御される、癌抑制遺伝子であることが示された。
【００６４】
【表１】
【００６５】
実施例２：ＮＲ１Ｉ２遺伝子を含むＢＡＣクローン１６９Ｎ１３の構造
神経芽細胞腫の培養細胞株を用い、得られたメチル化ＤＮＡを含むＢＡＣクローン１６９Ｎ１３中のＮＲ１Ｉ２遺伝子の構造を図１に示す。ＮＲ１Ｉ２遺伝子のゲノムＤＮＡ構造中には、９個のエクソンが含まれ、その上流域に領域１（Ｒｅｇｉｏｎ１）とエクソン３中に２３９塩基からなる領域２（Ｒｅｇｉｏｎ２）と命名するＣｐＧが多く含まれる領域が存在した。
【００６６】
実施例３：ＮＲ１Ｉ２遺伝子のＣｐＧ領域のメチル化頻度の確認
ＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現が見られないＩＭＲ３２とＳＨ−ＳＹ５Ｙ、メッセンジャーＲＮＡの発現が見られるＳＫ−Ｎ−ＡＳ，ＳＪ−Ｎ−ＫＰ，ＬＣＬ細胞について、そのゲノムＤＮＡに亜硫酸水素ナトリウムを処理することで、ゲノムＤＮＡ中の非メチル化シトシン（Ｃ）を、ウラシル（Ｕ）に変換させた後、該ＮＲ１Ｉ２遺伝子のＣｐＧ領域をＰＣＲにて増幅後プラスミドに組み込み、そのＣｐＧ領域の塩基配列を確認した。図２に、各細胞で３−５回の頻度で塩基配列を検証し、そのＣｐＧ領域でメチル化が起こっている場合黒で、起こっていない場合グレーで示した。ＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＋と−）と領域２のメチル化が逆相関していることが明らかになった。
【００６７】
実施例４：細胞培養
用いた細胞株は子宮頸部癌細胞ＨｅＬａおよび外科的切除したサンプルに由来するＳＫ−Ｎ−ＫＳ， ＳＫ−Ｎ−ＡＳ， ＳＫ−Ｎ−ＳＨ， ＳＫ−Ｎ−ＤＺ， ＳＨ−ＳＹ５Ｙ， ＭＰ−Ｎ−ＴＳ， ＭＰ−Ｎ−ＭＳ，ＫＰ−Ｎ−ＲＴ， ＫＰ−Ｎ−ＳＩＦＡ， ＫＰ−Ｎ−ＳＩＬＡ， ＫＰ−Ｎ−ＴＫ， ＫＰ−Ｎ−ＹＳ， ＳＭＳ−ＫＣＮ， ＳＭＳ−ＫＡＮ， ＳＪ−Ｎ−ＣＧ，ＮＢ−１，ＣＨＰ１３４，ＩＭＲ３２，ＧＯＴＯ（Ｓａｉｔｏ−Ｏｈａｒａ Ｆ， ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６３，１８７６，２００３）のヒト由来神経芽細胞腫細胞を使用した。また、ＤＮＡとしてメチル化を阻害した材料を得るため、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの阻害剤である５−アザ−デオキシシチジン（５−ａｚａ−ｄＣｙｄ）を各種細胞に１μＭの濃度で５日間添加して培養を行った。
【００６８】
実施例５：ＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現
ＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現量を測定するため副腎（Ａｄｒ−ｇｌａｎｄ）をコントロールとし、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子の増幅の有無が知られている神経芽細胞腫細胞株１５株についてＲＴ−ＰＣＲを行った（図３）。ＲＴ−ＰＣＲの発現量のコントロールとして発現量が細胞種、条件で変化しにくいことで知られるＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３燐酸−デヒドロゲナーゼ）を用いた。Ｎ−ｍｙｃ遺伝子の増幅とＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現量の無い現象が相関することが示された。神経芽細胞腫がＮ−ｍｙｃ遺伝子の増幅に伴い悪性化が進むことを考慮すると、ＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現量低下は神経芽細胞腫の悪性化に関与することが示された。
【００６９】
実施例６：ＮＲ１Ｉ２遺伝子のメチル化、脱メチル化状態でのメッセンジャーＲＮＡの発現比較
通常培養条件下、ＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現がない神経芽細胞腫細胞８株について、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの阻害剤である５−アザ−デオキシシチジン（５−ａｚａ−ｄＣｙｄ）を各種細胞に１μＭの濃度で５日間添加して培養を行い、ＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲで比較した（図４）。ＲＴ−ＰＣＲの発現量のコントロールとしてＧＡＰＤＨを用いた。試験した全ての細胞株で、メチル化を阻害することでＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現が観察されることから、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の発現はそのゲノムＤＮＡのメチル化状態で制御されることが明らかとなった。
【００７０】
実施例７：ＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２におけるＣＯＢＲＡ法によるメチル化検出と発現との相関
神経芽細胞腫細胞１１株とＮＲ１Ｉ２遺伝子の発現が確認されているＢリンパ腫細胞株ＬＣＬについて、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２のメチル化をＣＯＢＲＡ法により検出した（図５）。Ｍ位置にバンドが出現している細胞種は領域２がメチル化していることを示している。領域２がメチル化している細胞種はＮＲ１Ｉ２遺伝子の発現がみられないこととよく相関している。すなわち、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２のメチル化は、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の発現を負に調節していることが明らかとなった。
【００７１】
実施例８：臨床サンプルのＣＯＢＲＡ法によるＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２のメチル化頻度の検出
表２に、１９８６年から２００３年までに京都府立医科大学に於いて切除され、両親の同意を得、かつ倫理委員会での承認を得た５１種の神経芽細胞腫サンプルについてＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２のメチル化を解析した。サンプルの内訳は、１２症例が病期１、１１症例が病期２、８症例が病期３、１３症例が病期４、４症例が病期４ｓであった。また３７症例が１歳未満の幼児由来であり、Ｎ−ｍｙｃの増幅は５１例中８例（１５％）に見られた。３９例（７６％）は神経芽細胞腫マススクリーニングによって発見された。
【００７２】
Ｐ−ｖａｌｕｅはＦｉｓｈｅｒ’ｓ ｅｘａｃｔ ｔｅｓｔにて算出し、優位と思われるものについては太字で表した。病期分類はＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ Ｓｔａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＮＳＳ）（Ｂｒｏｄｅｕｒ ＧＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，１１，１４６６，１９９３）に従った。
【００７３】
この解析から、病期が進むこと、Ｎ−ｍｙｃの増幅、予後の悪さに関してＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２のメチル化と相関があることが判明した。この結果は、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２のメチル化が神経芽細胞腫の病状を悪性化させることに大きく関係していることを示しており、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２のメチル化、更にＮＲ１Ｉ２遺伝子の発現量の低下が神経芽細胞腫の悪性化に重要な働きをしていることが明らかとなった。
【００７４】
【表２】
【００７５】
実施例９：レポーターアッセイによるＮＲ１Ｉ２遺伝子領域１と領域２の転写促進効果の測定
ＮＲ１Ｉ２遺伝子のエクソン１の上流１０６０塩基対からなる領域１、エクソン３を含む４８０塩基対からなる領域２を用いて転写促進活性の有無をレポーターアッセイにより検証した。用いたレポーターアッセイ系は、ホタルルシフェラーゼ酵素のメッセンジャーＲＮＡが発現し、タンパクに変換されて活性のある酵素として働くことによる発光物を測定する方法によった。ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ）を用いルシフェラーゼ遺伝子を中心に配置しＮＲ１Ｉ２遺伝子領域１と領域２を以下Ａの組み合わせで作製した遺伝子を構築しコンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）とした（図６Ａ）。ＨｅＬａ、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞に対し遺伝子導入し３６時間後にルシフェラーゼ酵素活性を測定した。遺伝子導入効率の差を補正するため、ｐＲＬ−ｈＴＫ（プロメガ；ウミシイタケルシフェラーゼの発現量を内部コントロールとして、実験用ホタルルシフェラーゼ レポーター遺伝子の発現を補正するベクター）を用いて、相対的なルシフェラーゼ酵素活性を転写活性とした。ＭｏｃｋはｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクターを遺伝子導入した際の陰性コントロールを示す。１／Ｌ、２／Ｌを用いＨｅＬａ、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞にてルシフェラーゼ酵素活性を測定した結果を図６Ｂに示す。両細胞共に、２／Ｌを遺伝子導入したものが高いルシフェラーゼ酵素活性を示すが、この結果は領域２が高い転写活性化能力を有していることを示す。一方、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の転写調節領域と考えられるＣｐＧに富む領域１には転写活性化能力が殆どないことが判明した。次にＭｏｃｋを含め１／Ｌ、２／Ｌ、Ｌ／２、１／Ｌ／２をＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞に対し遺伝子導入後同様にルシフェラーゼ酵素活性を測定した結果を図６Ｃに示す。図６Ｂの結果と同様に２／Ｌを遺伝子導入したものが高いルシフェラーゼ酵素活性を示した。一方、Ｌ／２では２／Ｌの約半分、１／Ｌ／２ではほぼ陰性コントロールの転写能力を示した。この結果は、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２は確かな転写活性化能力を有しているが、その能力は転写開始位置の上流で強く発揮されることを意味している。１／Ｌ／２でルシフェラーゼ遺伝子への転写活性化能力が殆どないことに関しては、領域１がＬ／２では上昇していた転写活性化能力を抑制していることがわかった。
【００７６】
実施例１０：臨床サンプルのＣＯＢＲＡ法によるＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２のメチル化検出とＮＲ１Ｉ２遺伝子の発現、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子の増幅、病期、予後との関連
１９８６年から２００３年までに京都府立医科大学に於いて切除され、両親の同意を得、かつ倫理委員会での承認を得た５１種の神経芽細胞腫サンプルについてＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２のメチル化の解析を行った。
【００７７】
図７Ａは病期分類したサンプルのうち代表的な９サンプル、Ｔ５９７、Ｔ３９９、Ｔ９７４、Ｔ６２１、Ｔ４９１、Ｔ４７７３、Ｔ３０４、Ｔ５３０、Ｔ５７１８についてＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２のメチル化をＣＯＢＲＡ法にて検出したものである。Ｍ位置にバンドが出現しているサンプルは領域２がメチル化していることを示している。同様に、図７Ｂには上記９サンプルからＲＮＡを得た後、ＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲにて確認した結果を示す。発現量のコントロールとしてＧＡＰＤＨを用いた。図７Ａおよび図７Ｂから、細胞を用いたサンプルの場合と同様に、臨床サンプルにおいても領域２がメチル化していることとＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡが負の相関を示すことが明らかとなった。
【００７８】
５１種の神経芽細胞腫サンプルで４７例について高品質のメッセンジャーＲＮＡが得られたため、ＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲにて測定し、コントロールとしてＧＡＰＤＨのメッセンジャーＲＮＡ量を測定し、相対比として算出した。この相対比を縦軸に、
ＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２のメチル化の有無（ＣＯＢＲＡ法にて測定）、
Ｎ−ｍｙｃ遺伝子の増幅の有無、
神経芽細胞腫の病期分類、
予後（生存しているか、死亡したか）、
についてグラフで示したものが図７Ｃである。予後の項目を除き、ＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現量と有意差があることが確認された（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔ）。すなわち、臨床由来神経芽細胞腫サンプルを用いて、
ＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２のメチル化とメッセンジャーＲＮＡの発現は逆相関する、
Ｎ−ｍｙｃ遺伝子の増幅があるものはＮＲ１Ｉ２メッセンジャーＲＮＡの発現が低い、
進行した神経芽細胞腫ほどＮＲ１Ｉ２メッセンジャーＲＮＡの発現が低い、
ということが明らかとなった。
【００７９】
実施例１１：神経芽細胞腫細胞へのＮＲ１Ｉ２遺伝子導入による癌原性の低下
培養条件下において、正常細胞と癌細胞の性質の違いの一つとして、固形物への付着性が知られている。すなわち、正常細胞が増殖するためには固形物に付着することが必要である（足場依存性）。正常細胞は、０．３３％前後の軟らかい寒天培地中で培養した場合、浮遊状態では増殖できないが、多くの癌細胞では、足場依存性の性質は失われ、軟寒天培地中でも増殖可能となる。癌細胞は浮遊しているが、軟寒天培地の中を移動できないので、１個の細胞から次々に分裂を繰り返し、１〜３週間の後には細胞塊（コロニー）を形成する。この細胞の軟寒天コロニー形成能は、移植腫瘍形成能と相関することから、悪性度の指標として広く利用されている（Ｓｈｉｎ，Ｓ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７２， ４４３５， １９７５）。挿入遺伝子のアミノ末端にｍｙｃペプチドを付加可能なｐＣＭＶ−Ｔａｇ３ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にＮＲ１Ｉ２完全長ｃＤＮＡを挿入したものを作成した（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ＮＲ１Ｉ２）。また、我々はヘルペスウィルス由来ＶＰ１６タンパクとＮＲ１Ｉ２タンパクの融合体がＮＲ１Ｉ２タンパク単体より強い転写活性を持つことを以前に発見していることから、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３ベクターにＶＰ１６のｃＤＮＡとＮＲ１Ｉ２完全長ｃＤＮＡを挿入したものも作成した（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ＶＰ−ＮＲ１Ｉ２）。ＮＲ１Ｉ２遺伝子の発現が見られない神経芽細胞腫細胞株ＩＭＲ３２、ＳＭＳ−ＫＡＮ細胞にＦｕＧＥＮＥ６（ロシュダイアグノスティクス）を用い遺伝子導入した。５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ジェネテシン）存在下、３週間培養を行った後、クリスタルバイオレット染色後コロニー数を計測した（図８Ａ、Ｂ）。ＩＭＲ３２、ＳＭＳ−ＫＡＮ細胞共に、ＮＲ１Ｉ２遺伝子を発現させることで有意にコロニー数を低下させること、特にｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ＶＰ−ＮＲ１Ｉ２を使用した場合顕著にコロニー数の減少が確認された。この事象は、ＮＲ１Ｉ２遺伝子が癌細胞の増殖を抑制する機能を有することを示しており、この遺伝子が神経芽細胞腫で癌抑制遺伝子として機能していることが明らかとなった。
【００８０】
実施例１２：神経芽細胞腫細胞へのＮＲ１Ｉ２遺伝子導入による癌原性の低下
挿入遺伝子を含まないｐＣＭＶ−Ｔａｇ３ベクター、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ＶＰ−ＮＲ１Ｉ２をＳＭＳ−ＫＡＮ細胞に導入し、コントロール細胞クローンを１種（ｅｍｐｔｙ）、ＮＲ１Ｉ２タンパクを恒常的に発現する細胞クローンを２種（Ｂ１、Ｂ２）を得た。これら３種の細胞について、細胞破壊液をウェスタンブロットし、ｍｙｃタンパク質に対する抗体で検出した結果を、図９Ａに示す。コントロール細胞（ｅｍｐｔｙ）に比し、ＮＲ１Ｉ２タンパクが発現していることが確認できる。これら細胞についてその増殖速度について、テトラゾリウム塩（ＷＳＴ−１）を利用した生細胞中のミトコンドリア脱水素酵素によるホルマザン色素への変換にて色素で細胞数をモニター（同仁化学研究所：ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８）したのが図９Ｂである。コントロール細胞（ｅｍｐｔｙ）に比しＮＲ１Ｉ２タンパクが発現することでクローンＢ１、Ｂ２共に３日培養後以降、有意に細胞増殖が低下した（ａはコントロール細胞（ｅｍｐｔｙ）とクローンＢ１、ｂはコントロール細胞（ｅｍｐｔｙ）とクローンＢ２に対しＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔでＰ−ｖａｌｕｅが０．０５未満であったことを示す）。
【００８１】
この結果から、ＮＲ１Ｉ２タンパクは細胞内に発現することで細胞増殖を抑制する働きのあることが判明した。これまで知られている癌抑制遺伝子タンパクが細胞増殖を抑制したり、細胞死を誘導することから生体を癌から守っていることから、ＮＲ１Ｉ２タンパクの一つの側面として癌抑制遺伝子産物としての効果があることが示された。
【００８２】
実施例１３：ＮＲ１Ｉ２遺伝子が制御する遺伝子の検索
ＮＲ１Ｉ２遺伝子は転写因子として知られていることから、ＮＲ１Ｉ２タンパクを発現しない細胞と発現する細胞からメッセンジャーＲＮＡを取り出し、その発現を比較することによりどのような遺伝子がその発現を制御されるかを知ることが可能である。ＮＲ１Ｉ２遺伝子タンパクが癌抑制効果を有する可能性があることは先にも述べたが、この効果の実体はＮＲ１Ｉ２遺伝子タンパクが制御する遺伝子産物によると考えられる。そこで、ＳＭＳ−ＫＡＮ細胞にコントロールとして外来遺伝子を含まないｐＣＭＶ−Ｔａｇ３ベクター、検査サンプルとしてＮＲ１Ｉ２遺伝子を含むｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ＶＰ−ＮＲ１Ｉ２をＳＭＳ−ＫＡＮ細胞に導入し、コントロール細胞クローン、ＮＲ１Ｉ２タンパクを恒常的に発現する細胞クローンＢ１を得た。これら２種の細胞を用い、ヒトの３０，０００遺伝子の発現量を観察可能なＡｃｅＧｅｎｅ Ｈｕｍａｎ ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐ ３０Ｋ （ＤＮＡチップ研究所）によりメッセンジャーＲＮＡの発現解析を行った（Ｉｎｏｕｅ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ． Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１６５．７１．２００４）。Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８プライマーを用いて、アミノアリル−ｄＵＴＰ （Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．）を取り込ませた相補鎖ＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ）を作製後、アミノアリル基に反応性のＣｙ３（シアニン３）、Ｃｙ５（シアニン５）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とカップリング反応を行い標識を行った。ハイブリダイゼーションを２回（１回目； Ｃｙ３−Ｂ１／Ｃｙ５−コントロール、２回目； Ｃｙ５−Ｂ１／Ｃｙ３−コントロール）行い、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてシグナルを測定後、ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ４．１ソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）にて解析した。表３及び表４には、２回の実験共にＮＲ１Ｉ２遺伝子を導入したＳＭＳ−ＫＡＮ細胞でコントロール細胞クローンに比し、１．５倍以上の発現量を示した遺伝子を示す。
【００８３】
ＮＲ１Ｉ２遺伝子により発現の上昇することが既に判明しているＣＹＰ３Ａ４遺伝子がこの実験結果に含まれていたことから、実験は信頼性のあるものであったことが確認された。
【００８４】
【表３】
【００８５】
【表４】
【００８６】
実施例１４：ＮＲ１Ｉ２遺伝子が制御する癌抑制効果が期待される遺伝子
これまでに判明しているＮＲ１Ｉ２遺伝子の推定される機能として、生体異物が生体に入った際にそれを解毒する酵素群のメッセンジャーＲＮＡを誘導することが知られている（Ｂｌｕｍｂｅｒｇ Ｂ， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ， １２， ３１９５， １９９８、Ｋｌｉｅｗｅｒ ＳＡ， ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ， ９２， ７３， １９９８、Ｘｉｅ Ｗ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ，４０６， ４３５， ２０００）。例えば、ＮＲ１Ｉ２タンパクは異物代謝酵素ＣＹＰ３Ａ４や細胞内薬物の排出ポンプであるＡＢＣＢ１（Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）のメッセンジャーＲＮＡを誘導する（Ｓｙｎｏｌｄ ＴＷ，ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｍｅｄ，７，５８４， ２００１）。しかしながら、ＮＲ１Ｉ２遺伝子が制御する癌抑制に関わる遺伝子はこれまでに報告されていなかった。そこで先の転写解析実験より得られた１０５種の遺伝子の中から、過去の論文情報やＯＭＩＭ情報（Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｍ／ｏｍｉｍｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ）を参考として、癌の増殖抑制に関与する遺伝子の候補として１０種を選び出し、電気泳動を利用したＲＴ−ＰＣＲにてその発現量を観察した（図１０）。
【００８７】
使用したメッセンジャーＲＮＡ材料を得た細胞はＡ：ＳＭＳ−ＫＡＮ：コントロール， Ｂ：ＫＡＮ−ＮＲ１Ｉ２発現クローンＢ１， Ｃ：ＫＡＮ−ＮＲ１Ｉ２発現クローンＢ２、 Ｄ： ＧＯＴＯ コントロール、 Ｅ：ＧＯＴＯ−ＮＲ１Ｉ２発現クローンＡ１を使用した。ＰＣＲにて生成したＤＮＡを３％寒天ゲルで電気泳動後ＬＡＳ−３０００（富士フイルム）にてバンドを定量した。ＧＡＰＤＨ遺伝子について同様の実験を行い、コントロールとして補正し相対値として各遺伝子の発現量を算出した。ＮＲ１Ｉ２遺伝子の発現に相関して発現の上昇が見られる遺伝子が、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の制御下にあると考えられる。最もＮＲ１Ｉ２遺伝子発現との相関が高かった遺伝子は、ＰＬＡ２Ｇ２Ａ遺伝子であった。図１１には実際の電気泳動イメージを示した。ＮＲ１Ｉ２とＰＬＡ２Ｇ２Ａ遺伝子の発現がよく相関していることが確認された。
【００８８】
ＰＬＡ２Ｇ２Ａ遺伝子は分泌型のホスホリパーゼＡ２として知られている。興味深いことに、ＰＬＡ２Ｇ２Ａ遺伝子が存在する染色体位置は、神経芽細胞腫でしばしば欠失が観察される１ｐ３６位置に存在する（Ｐｒａｍｌ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ５５，５５０４，１９９５）。また、ノックアウトマウスを用いた実験で、ＰＬＡ２Ｇ２Ａ遺伝子を欠如させたマウスは結腸ポリープ数が増加することも報告されており、結腸癌との関連があることが示された（Ｈａｌｕｓｋａ ＦＧ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ７２，３３７，１９９７）。
【００８９】
実施例の結論
（１）ＢＡＭＣＡ法によるスクリーニングから、そのゲノムＤＮＡ中に高頻度メチル化部位を有し、悪性な神経芽細胞腫でメッセンジャーＲＮＡの発現が低下するＮＲ１Ｉ２遺伝子を単離した。さらに臨床サンプル由来の細胞を用いた実験から、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の発現低下はメチル化を解除することにより回復することも示された。
【００９０】
（２）ＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２（ｅｘｏｎ３領域）が転写活性化能力を持ち、そのメチル化がそのメッセンジャーＲＮＡレベルでの発現低下に寄与していることが判明した。臨床サンプルの解析から領域２のメチル化は神経芽細胞腫の進行度、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子の増幅、予後の悪さと相関することが明らかとなった。さらに、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の発現が高いことと、領域２のメチル化、神経芽細胞腫の進行度、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子の増幅が逆相関することも判明した。
【００９１】
（３）ＮＲ１Ｉ２遺伝子を発現していない神経芽細胞腫細胞株へのＮＲ１Ｉ２遺伝子移入後の足場依存性実験における細胞増殖の低下、ならびに細胞増殖速度の低下から、ＮＲ１Ｉ２遺伝子がタンパクとして発現することが癌細胞としての性質を失う、即ちＮＲ１Ｉ２遺伝子は癌抑制遺伝子として機能することが明らかとなった。
【００９２】
（４）ＮＲ１Ｉ２遺伝子は転写因子として働くことが報告されており、他の遺伝子の発現を制御する働きを有する。ＮＲ１Ｉ２遺伝子を発現していない神経芽細胞腫細胞株へのＮＲ１Ｉ２遺伝子移入後に、遺伝子発現が上昇する遺伝子をスクリーニングした結果、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の制御下に増殖を制御する遺伝子としてＰＬＡ２Ｇ２Ａを見出した。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１は、ＢＡＭＣＡ法で得られた神経芽細胞腫細胞株でメチル化頻度の高いＢＡＣクローン１６９Ｎ１３の遺伝子構造を示す。
【図２】図２は、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の発現の有無が既知の細胞株での、ＣｐＧに富むＮＲ１Ｉ２遺伝子領域（領域１と領域２）についてそのメチル化を配列決定して確認した結果を示す。黒がメチル化部位、グレーが非メチル化ＣｐＧを示す。
【図３】図３は、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子のゲノムＤＮＡでの増幅が既知の神経芽細胞腫細胞株１５株と正常人副腎（Ａｄｒ−ｇｌａｎｄ）でのＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲにて電気泳動で観察した結果を示す。鋳型量のコントロールとしてＧＡＰＤＨを下段に示した。
【図４】図４は、神経芽細胞腫細胞８株について、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの阻害剤である５−ａｚａ−ｄＣｙｄの存在（＋）、非存在（−）下で培養後、ＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲにて電気泳動で観察した結果を示す。鋳型量のコントロールとしてＧＡＰＤＨを下段に示した。
【図５】図５は、神経芽細胞腫細胞１１株とＢリンパ腫細胞株ＬＣＬについて、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２のメチル化をＣＯＢＲＡ法により検出した結果を示す。Ｍ位置にバンドが出現している細胞種は領域２がメチル化していることを示している。それぞれの細胞株で、ＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現があるものをＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＋、ないものを−で表記した。
【図６】図６Ａは、レポーターアッセイによるＮＲ１Ｉ２遺伝子領域１と領域２を用いたコンストラクトの構造を示す。図６Ｂは、１／Ｌ、２／Ｌを用いＨｅＬａ、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞にてルシフェラーゼ酵素活性を測定した結果を示す。Ｍｏｃｋは外来遺伝子を含まないベクターを遺伝子導入した際の陰性コントロールを示す。図６Ｃは、Ｍｏｃｋを含め１／Ｌ、２／Ｌ、Ｌ／２、１／Ｌ／２をＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞に遺伝子を導入後同様にルシフェラーゼ酵素活性を測定した結果を示す。
【図７】図７Ａは、臨床サンプルで病期分類した９サンプルについてＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２のメチル化をＣＯＢＲＡ法にて検出した結果を示す。Ｍ位置にバンドが出現しているサンプルは領域２がメチル化していることを示す。図７Ｂは、これら９サンプルからＲＮＡを得た後、ＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲにて確認した結果を示す。鋳型量のコントロールとしてＧＡＰＤＨを下段に示した。図７Ｃには、神経芽細胞腫サンプル４７例について、ＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲにて測定しＧＡＰＤＨで補正後、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２のメチル化の有無、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子の増幅の有無、神経芽細胞腫の病期分類、予後についてグラフで示した。
【図８】図８Ａは、神経芽細胞腫細胞株ＩＭＲ３２、ＳＭＳ−ＫＡＮ細胞に発現ベクター単体（Ｅｍｐｔｙ）、ＮＲ１Ｉ２遺伝子、ＶＰ１６が結合したＮＲ１Ｉ２遺伝子を導入後、３週間軟寒天培養を行った培養ディッシュのイメージを示す。図８Ｂは、図８Ａの実験で観察された増殖細胞塊（コロニー）数をグラフで示した。
【図９】図９Ａは、ＳＭＳ−ＫＡＮ細胞に発現ベクターのみ、発現ベクター＋ＮＲ１Ｉ２遺伝子をＳＭＳ−ＫＡＮ細胞に導入し、樹立したコントロール細胞（ｅｍｐｔｙ）、ＮＲ１Ｉ２遺伝子導入株２種（Ｂ１、Ｂ２）に対し、細胞破壊液をウェスタンブロットし、タグ配列であるｍｙｃタンパク質に対する抗体で検出した結果を示す。図９Ｂは、これら３種の細胞の増殖速度をミトコンドリア脱水素酵素活性を細胞数の指標として縦軸にとり、観察した結果を示す。
【図１０】図１０は、表３及び表４で示したＮＲ１Ｉ２遺伝子が発現することにより、１．５倍以上の発現量を示した遺伝子のうち、がんの増殖抑制に関与する候補遺伝子として１０種を選び出し、電気泳動を利用したＲＴ−ＰＣＲにてそれぞれの発現量を観察した結果を示す。Ａ：ＳＭＳ−ＫＡＮ：コントロール， Ｂ：ＫＡＮ−ＮＲ１Ｉ２発現クローンＢ１， Ｃ：ＫＡＮ−ＮＲ１Ｉ２発現クローンＢ２， Ｄ： ＧＯＴＯ コントロール， Ｅ：ＧＯＴＯ−ＮＲ１Ｉ２発現クローンＡ１を使用した。ＧＡＰＤＨ遺伝子について同様の実験を行い、コントロールとして補正し相対値として各遺伝子の発現量を算出した。
【図１１】図１１は、ＳＭＳ−ＫＡＮ細胞でのコントロール（ｖｅｃｔｏｒ）、ＮＲ１Ｉ２発現クローンＢ１、Ｂ２およびＧＯＴＯ細胞でのコントロール（ｖｅｃｔｏｒ）、ＮＲ１Ｉ２発現クローンＡ１についてＣＹＰ２Ａ４遺伝子、ＰＬＡ２Ｇ２Ａ遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲでの電気泳動イメージを示す。
【配列表フリーテキスト】
【００９４】
SEQUENCE LISTING
<110> Fuji Photo Film Co.
<120> Cancer suppressing agent
<130> A51756A
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2146
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
tgaaatatag gtgagagaca agattgtctc atatccgggg aaatcataac ctatgactag 60
gacgggaaga ggaagcactg cctttacttc agtgggaatc tcggcctcag cctgcaagcc 120
aagtgttcac agtgagaaaa gcaagagaat aagctaatac tcctgtcctg aacaaggcag 180
cggctccttg gtaaagctac tccttgatcg atcctttgca ccggattgtt caaagtggac 240
cccaggggag aagtcggagc aaagaactta ccaccaagca gtccaagagg cccagaagca 300
aacctggagg tgagacccaa agaaagctgg aaccatgctg actttgtaca ctgtgaggac 360
acagagtctg ttcctggaaa gcccagtgtc aacgcagatg aggaagtcgg aggtccccaa 420
atctgccgtg tatgtgggga caaggccact ggctatcact tcaatgtcat gacatgtgaa 480
ggatgcaagg gctttttcag gagggccatg aaacgcaacg cccggctgag gtgccccttc 540
cggaagggcg cctgcgagat cacccggaag acccggcgac agtgccaggc ctgccgcctg 600
cgcaagtgcc tggagagcgg catgaagaag gagatgatca tgtccgacga ggccgtggag 660
gagaggcggg ccttgatcaa gcggaagaaa agtgaacgga cagggactca gccactggga 720
gtgcaggggc tgacagagga gcagcggatg atgatcaggg agctgatgga cgctcagatg 780
aaaacctttg acactacctt ctcccatttc aagaatttcc ggctgccagg ggtgcttagc 840
agtggctgcg agttgccaga gtctctgcag gccccatcga gggaagaagc tgccaagtgg 900
agccaggtcc ggaaagatct gtgctctttg aaggtctctc tgcagctgcg gggggaggat 960
ggcagtgtct ggaactacaa acccccagcc gacagtggcg ggaaagagat cttctccctg 1020
ctgccccaca tggctgacat gtcaacctac atgttcaaag gcatcatcag ctttgccaaa 1080
gtcatctcct acttcaggga cttgcccatc gaggaccaga tctccctgct gaagggggcc 1140
gctttcgagc tgtgtcaact gagattcaac acagtgttca acgcggagac tggaacctgg 1200
gagtgtggcc ggctgtccta ctgcttggaa gacactgcag gtggcttcca gcaacttcta 1260
ctggagccca tgctgaaatt ccactacatg ctgaagaagc tgcagctgca tgaggaggag 1320
tatgtgctga tgcaggccat ctccctcttc tccccagacc gcccaggtgt gctgcagcac 1380
cgcgtggtgg accagctgca ggagcaattc gccattactc tgaagtccta cattgaatgc 1440
aatcggcccc agcctgctca taggttcttg ttcctgaaga tcatggctat gctcaccgag 1500
ctccgcagca tcaatgctca gcacacccag cggctgctgc gcatccagga catacacccc 1560
tttgctacgc ccctcatgca ggagttgttc ggcatcacag gtagctgagc ggctgccctt 1620
gggtgacacc tccgagaggc agccagaccc agagccctct gagccgccac tcccgggcca 1680
agacagatgg acactgccaa gagccgacaa tgccctgctg gcctgtctcc ctagggaatt 1740
cctgctatga cagctggcta gcattcctca ggaaggacat gggtgccccc cacccccagt 1800
tcagtctgta gggagtgaag ccacagactc ttacgtggag agtgcactga cctgtaggtc 1860
aggaccatca gagaggcaag gttgcccttt ccttttaaaa ggccctgtgg tctggggaga 1920
aatccctcag atcccactaa agtgtcaagg tgtggaaggg accaagcgac caaggatagg 1980
ccatctgggg tctatgccca catacccacg tttgttcgct tcctgagtct tttcattgct 2040
acctctaata gtcctgtctc ccacttccca ctcgttcccc tcctcttccg agctgctttg 2100
tgggctccag gcctgtactc atcggcaggt gcatgagtat ctgtgg 2146
<210> 2
<211> 434
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Glu Val Arg Pro Lys Glu Ser Trp Asn His Ala Asp Phe Val His
1 5 10 15
Cys Glu Asp Thr Glu Ser Val Pro Gly Lys Pro Ser Val Asn Ala Asp
20 25 30
Glu Glu Val Gly Gly Pro Gln Ile Cys Arg Val Cys Gly Asp Lys Ala
35 40 45
Thr Gly Tyr His Phe Asn Val Met Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe
50 55 60
Phe Arg Arg Ala Met Lys Arg Asn Ala Arg Leu Arg Cys Pro Phe Arg
65 70 75 80
Lys Gly Ala Cys Glu Ile Thr Arg Lys Thr Arg Arg Gln Cys Gln Ala
85 90 95
Cys Arg Leu Arg Lys Cys Leu Glu Ser Gly Met Lys Lys Glu Met Ile
100 105 110
Met Ser Asp Glu Ala Val Glu Glu Arg Arg Ala Leu Ile Lys Arg Lys
115 120 125
Lys Ser Glu Arg Thr Gly Thr Gln Pro Leu Gly Val Gln Gly Leu Thr
130 135 140
Glu Glu Gln Arg Met Met Ile Arg Glu Leu Met Asp Ala Gln Met Lys
145 150 155 160
Thr Phe Asp Thr Thr Phe Ser His Phe Lys Asn Phe Arg Leu Pro Gly
165 170 175
Val Leu Ser Ser Gly Cys Glu Leu Pro Glu Ser Leu Gln Ala Pro Ser
180 185 190
Arg Glu Glu Ala Ala Lys Trp Ser Gln Val Arg Lys Asp Leu Cys Ser
195 200 205
Leu Lys Val Ser Leu Gln Leu Arg Gly Glu Asp Gly Ser Val Trp Asn
210 215 220
Tyr Lys Pro Pro Ala Asp Ser Gly Gly Lys Glu Ile Phe Ser Leu Leu
225 230 235 240
Pro His Met Ala Asp Met Ser Thr Tyr Met Phe Lys Gly Ile Ile Ser
245 250 255
Phe Ala Lys Val Ile Ser Tyr Phe Arg Asp Leu Pro Ile Glu Asp Gln
260 265 270
Ile Ser Leu Leu Lys Gly Ala Ala Phe Glu Leu Cys Gln Leu Arg Phe
275 280 285
Asn Thr Val Phe Asn Ala Glu Thr Gly Thr Trp Glu Cys Gly Arg Leu
290 295 300
Ser Tyr Cys Leu Glu Asp Thr Ala Gly Gly Phe Gln Gln Leu Leu Leu
305 310 315 320
Glu Pro Met Leu Lys Phe His Tyr Met Leu Lys Lys Leu Gln Leu His
325 330 335
Glu Glu Glu Tyr Val Leu Met Gln Ala Ile Ser Leu Phe Ser Pro Asp
340 345 350
Arg Pro Gly Val Leu Gln His Arg Val Val Asp Gln Leu Gln Glu Gln
355 360 365
Phe Ala Ile Thr Leu Lys Ser Tyr Ile Glu Cys Asn Arg Pro Gln Pro
370 375 380
Ala His Arg Phe Leu Phe Leu Lys Ile Met Ala Met Leu Thr Glu Leu
385 390 395 400
Arg Ser Ile Asn Ala Gln His Thr Gln Arg Leu Leu Arg Ile Gln Asp
405 410 415
Ile His Pro Phe Ala Thr Pro Leu Met Gln Glu Leu Phe Gly Ile Thr
420 425 430
Gly Ser
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌抑制遺伝子及び該遺伝子がコードするタンパク質の医薬用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の発症は細胞のタンパク質の変異や量的変化に起因することが知られている。近年の遺伝子工学の発達により、特定のタンパク質をコードする遺伝子の増幅や癌細胞における遺伝子変異の解析が可能となり、癌研究の分野においても飛躍的な発展をもたらした。これまでに細胞の癌化や癌細胞の異常増殖に関与する癌遺伝子の解析及び同定が進んでいる。一方、変異あるいは発現低下により癌化につながる癌抑制遺伝子がここ数年脚光を浴びている。これまでに同定されている癌抑制遺伝子としては、網膜芽細胞腫のＲｂ遺伝子、大腸癌のｐ５３遺伝子及びＡＰＣ遺伝子、Ｗｉｌｍｓ腫瘍のＷＴ１遺伝子などが挙げられる。ＷＴ１遺伝子を活用した癌抑制剤の例も報告されている（特許文献１）。
【０００３】
また、癌の発生、進展悪性化、転移などには一つの遺伝子の異常だけでなく複数の遺伝子の異常が関与していることが次第に明らかになりつつあり、さらに多くの未同定の癌遺伝子及び癌抑制遺伝子が存在するものと考えられている。癌抑制効果を有する遺伝子は数多く知られているが、多くの場合、その選別には患者の遺伝子の変異を、染色体ＤＮＡを染色することにより視覚化して見つけ出すアプローチ（非特許文献１）や、遺伝子の欠失をＬＯＨ（Ｌｏｓｓ Ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）解析で大まかな範囲を選定した後、重要な遺伝子領域を絞り込むという方法がこれまで行われてきた（特許文献２）。しかし、これらの方法では、判別できるＤＮＡ欠失領域が莫大なものとなり、重要な遺伝子領域を絞り込む作業に大量の時間と手間を必要とする欠点を持っており、癌抑制遺伝子を探し出す手段としては限界があった。
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２００３／００２１４２号公報
【特許文献２】ＷＯ０１／０３２８５９号公報
【非特許文献１】Ｙａｓｕｈｉｄｅ Ｙａｍａｓｈｉｔａ，ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ，１１（３３）：５１２９−５１３５，２００５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、癌抑制遺伝子を新たに見出してこれを含有する癌抑制剤を提供することを課題とする。本発明はまた、該癌抑制遺伝子がコードするタンパク質を含有する癌抑制剤 、ならびに該癌抑制遺伝子を用いる癌の検出及び診断方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決すべく、神経芽細胞腫症例のＤＮＡのメチル化度の異なる遺伝子を同定することを精力的に行ってきた。神経芽細胞腫は、胎生期に神経冠細胞由来の遊走性交感神経芽細胞より発生する小児悪性腫瘍である。癌細胞の場合、大半はメチル化されていないはずの癌の発生を抑える遺伝子（癌抑制遺伝子）の５’領域に存在するＣｐＧ部位が密集したゲノム領域（ＣｐＧアイランド）が異常にメチル化され、メッセンジャーＲＮＡへの発現が抑制されていることがある。近年、遺伝子の突然変異と並ぶ、重要な発癌機構として認知されている。本発明では、神経芽細胞腫におけるメチル化ＤＮＡを特定するために、新規に開発されたＢＡＭＣＡ（ＢＡＣ ａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ ＭＣＡ）法（Ｉｎａｚａｗａ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ． ９５（７） ，５５９，２００４）により癌で高頻度にメチル化した遺伝子をスクリーニングした。さらに、本発明者らは、ＣＯＢＲＡ（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）法（Ｔｏｙｏｔａ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９，２３０７，１９９９）とＲＴ−ＰＣＲ法を組み合わせ、神経芽細胞腫でその進行度に伴いＤＮＡのメチル化度が高く、発現が著しく抑制されている遺伝子として、ＮＲ１Ｉ２（ＮＵＣＬＥＡＲ ＲＥＣＥＰＴＯＲ ＳＵＢＦＡＭＩＬＹ １， ＧＲＯＵＰ Ｉ， ＭＥＭＢＥＲ ２； ＮＲ１Ｉ２、 別名 ＰＲＥＧＮＡＮＥ Ｘ ＲＥＣＥＰＴＯＲ； ＰＸＲ）遺伝子を同定することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち本発明によれば、ＮＲ１Ｉ２遺伝子又はその相同遺伝子を含有する癌抑制剤が提供される。
【０００８】
好ましくは、前記遺伝子又はその相同遺伝子はベクターに組み込まれている。
好ましくは、前記ベクターはウイルスベクター又は動物細胞発現用プラスミドベクターである。
好ましくは、前記ウイルスベクターはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである。
好ましくは、前記遺伝子又はその相同遺伝子はリポソームに封入されている。
【０００９】
本発明の別の態様によれば、ＮＲ１Ｉ２タンパク質又はその相同タンパク質を含有する癌抑制剤が提供される。
【００１０】
本発明のさらに別の態様によれば、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の全部又はその一部を含むＤＮＡ又はＲＮＡを用いて検体試料中のＮＲ１Ｉ２遺伝子を解析する工程を含む、癌の検出及び診断方法が提供される。
【００１１】
好ましくは、前記解析は遺伝子の変異の検出又は遺伝子の発現量の異常の検出である。
好ましくは、癌の検出及び診断方法は、本発明の癌抑制剤の適用対象となる癌を選別するための方法である。
【００１２】
本発明のさらに別の態様によれば、ＮＲ１Ｉ２タンパク質に対する抗体又はその断片を用いて検体試料中のＮＲ１Ｉ２タンパク質を解析する工程を含む、癌の検出及び診断方法が提供される。
【００１３】
好ましくは、前記解析はタンパク質の発現量の異常の検出である。
好ましくは、癌の検出及び診断方法は、本発明の癌抑制剤の適用対象となる癌を選別するための方法である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、新たに癌抑制機能を見出したＮＲ１Ｉ２遺伝子又は該遺伝子がコードするＮＲ１Ｉ２タンパク質を含有する癌抑制剤が提供される。これらの薬剤は癌の個別性に基づく治療や癌の予後の改善などの臨床上の観点から、あるいは癌の基礎的研究の観点から非常に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の実施態様及び実施方法について詳細に説明する。
（１）癌抑制剤
本発明に一態様によれば、本発明の癌抑制剤は有効成分としてＮＲ１Ｉ２遺伝子又はその相同遺伝子を含む。本発明のもう一つの態様によれば、本発明の癌抑制剤は有効成分としてＮＲ１Ｉ２タンパク質又はその相同タンパク質を含む。
【００１６】
ＮＲ１Ｉ２遺伝子の塩基配列及びＮＲ１Ｉ２タンパク質のアミノ酸配列は既に知られており（Ｌｅｈｍａｎｎ， Ｊ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０２， １０１６−１０２３， １９９８）、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の塩基配列はＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ のデータベースにＡＦ０６１０５６番にて、またＮＲ１Ｉ２タンパク質のアミノ酸配列は同データベースにＡＡＤ０５４３６．１番にて登録されている。ＮＲ１Ｉ２遺伝子の塩基配列は配列番号１に記載する通りであり、ＮＲ１Ｉ２タンパク質は配列番号１の塩基配列の３０４番目から１６０８番目までの領域によりコードされ、そのアミノ酸配列は配列番号２に示される通りである。
【００１７】
本明細書において「ＮＲ１Ｉ２遺伝子」というのは、上記塩基配列で特定されるヒト由来の遺伝子をいい、「ＮＲ１Ｉ２タンパク質」というのは、該ＮＲ１Ｉ２遺伝子がコードし、上記アミノ酸配列で特定されるタンパク質をいう。
【００１８】
ＮＲ１Ｉ２遺伝子は、当業者に公知の技術を用いて培養細胞などから取得したｃＤＮＡであってもよいし、又は本明細書の配列番号１に記載の塩基配列に基づいてＰＣＲ法などにより合成したものでもよい。ＰＣＲ法により配列番号１に記載した塩基配列を有するＤＮＡを取得する場合、ヒトの染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを使用してＰＣＲを行う。ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片は大腸菌などの宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００１９】
上記のブローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ， ２nd Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ．，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）などに記載された方法に準じて行うことができる。
【００２０】
本発明において、「ＮＲ１Ｉ２遺伝子の相同遺伝子」とは、配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加又は置換されている塩基配列であって、癌抑制活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子；又は配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、癌抑制活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子いう。また、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の相同遺伝子にはＮＲ１Ｉ２遺伝子の断片も含まれる。
【００２１】
上記の「配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加又は置換されている塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から６０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個程度を意味する。
【００２２】
上記の「癌抑制活性」の程度は特に限定はされないが、好ましくはＮＲ１Ｉ２タンパク質が有する癌抑制活性と実質的に同等又はそれ以上の癌抑制活性をいう（以下、本明細書における「癌抑制活性」は同じ意味を示す）。
【００２３】
従って、「ＮＲ１Ｉ２遺伝子の相同遺伝子」は上記に定義される構造と機能を有する限り、由来は問わず、ヒト以外の哺乳動物由来であってもよいし、ヒトなどの哺乳動物由来の遺伝子に対して人工的に変異を導入したものであってもよい。ただし、該遺伝子を後記のごとく癌抑制剤に使用する場合は臨床上の安全性の観点からヒト由来ものが好ましい。
【００２４】
上記の「配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加又は置換されている塩基配列であって、癌抑制活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子」は、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。具体的には、上記遺伝子は配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡを利用し、これらＤＮＡに変異を導入することにより取得することができる。例えば、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法などを用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ， ２nd Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ．，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ （１９８７−１９９７）などに記載の方法に準じて行うことができる。
【００２５】
上記の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニー又はプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡなどを挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ， ２nd Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ．，１９８９などに記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２６】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００２７】
上記の「配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、癌抑制活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子」は、上述の通り、一定のハイブリダイゼーション条件下でコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法などを行うことにより得ることができる。
【００２８】
本発明において、「ＮＲ１Ｉ２タンパク質の相同タンパク質」とは、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は挿入したアミノ酸配列であって、癌抑制活性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質；又は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、癌抑制活性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をいう。
【００２９】
上記した「配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は挿入したアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００３０】
上記した「配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、該アミノ酸配列と配列番号２に記載のアミノ酸配列との相同性が少なくとも７０％以上であり、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上であることを意味する。
【００３１】
ＮＲ１Ｉ２タンパク質は、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。比較的容易な操作でかつ大量に製造できるという点では、組み換えタンパク質が好ましい。
【００３２】
天然由来のタンパク質は、該タンパク質を発現している細胞又は組織からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせて単離することができる。化学合成タンパク質は、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法に従って合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。組み換えタンパク質は、該タンパク質をコードする塩基配列（例えば、配列番号１に記載の塩基配列）を有するＤＮＡを好適な発現系に導入することにより生産することができる。
【００３３】
なお、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換又は挿入したアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の一例示す配列番号１に記載の塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜製造又は入手することができる。
【００３４】
本発明の癌抑制剤の好ましい態様としては、有効成分として上記のＮＲ１Ｉ２遺伝子又はその相同遺伝子をベクターに組み込んだ組換えベクターを含む。ベクターとしてはウイルスベクター又は動物細胞発現用ベクター、好ましくはウイルスベクターが用いられる。
【００３５】
ウイルスベクターとしてはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。中でも、レトロウイルスベクターは、細胞に感染後、ウイルスゲノムが宿主染色体に組み込まれ、ベクターに組み込んだ外来遺伝子を安定にかつ長期的に発現させる可能であるからレトロウイルスベクターを使用することが特に望ましい。
【００３６】
動物細胞発現用ベクターとしては例えばｐＣＸＮ２（Ｇｅｎｅ， １０８， １９３−２００， １９９１）、ＰＡＧＥ２０７（特開平６−４６８４１号公報）又はその改変体などを用いることができる。
【００３７】
上記組換えベクターは適当な宿主に導入して形質転換し、得られた形質転換体を培養することによって生産することができる。組換えベクターがウイルスベクターの場合、これを導入する宿主としてはウイルス生産能を有する動物細胞が用いられ、例えば、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞などが挙げられる。レトロウイルスベクターの宿主としては、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＭＬＶなどが、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターの宿主としては、ヒト胎児腎臓由来の２９３細胞などが用いられる。ウイルスベクターの動物細胞への導入はリン酸カルシウム法などで行うことができる。また、組換えベクターが動物細胞発現用ベクターの場合、これを導入する宿主としては大腸菌Ｋ１２株、ＨＢ１０１株、ＤＨ５α株などを使用でき、大腸菌の形質転換は当業者に公知である。
【００３８】
得られた形質転換体はそれぞれに適した培地、培養条件により培養する。例えば、大腸菌の形質転換体の培養は、生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他を含有するｐＨ５〜８程度の液体培地を用いて行うことができる。培養は通常１５〜４３℃で約８〜２４時間程度行う。この場合、目的とする組み換えベクターは、培養終了後、通常のＤＮＡ単離精製法により得ることができる。
【００３９】
また、動物細胞の形質転換体の培養は、例えば約５〜２０％のウシ胎児血清を含む１９９培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地などの培地を用いて行うことができる。培地のｐＨは約６〜８が好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１８〜６０時間行う。この場合、目的とする組み換えベクターは、それを含有するウイルス粒子が培養上清中に放出されるので、ウイルス粒子の濃縮、精製を塩化セシウム遠心法、ポリエチレングリコール沈澱法、フィルター濃縮法などにより得ることができる。
【００４０】
本発明の癌抑制剤のうち、有効成分としてＮＲ１Ｉ２遺伝子又はその相同遺伝子を含む癌抑制剤（以下、遺伝子治療剤という）は、有効成分であるＮＲ１Ｉ２遺伝子又はその相同遺伝子を遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合することにより製造することができる。また、ＮＲ１Ｉ２遺伝子又はその相同遺伝子をウイルスベクターに組み込んだ場合は、組換えベクターを含有するウイルス粒子を調製し、これを遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合する。
【００４１】
上記基剤としては、通常注射剤に用いる基剤を使用することができ、例えば、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物などの塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコースなどの溶液、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液などが挙げられる。あるいはまた、当業者に既知の常法に従って、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、植物油、界面活性剤などの助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製することもできる。これらの注射剤は、粉末化、凍結乾燥などの操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。
【００４２】
また、本発明の遺伝子治療剤は、常法により調製されたリポソームの懸濁液にＮＲ１Ｉ２遺伝子を添加し凍結した後融解することにより製造することもできる。リポソームを調製する方法は、薄膜振とう法、超音波法、逆相蒸発法、界面活性剤除去法などがある。リポソームの懸濁液は超音波処理した後、遺伝子を添加するのが遺伝子の封入効率を向上させる上で好ましい。遺伝子を封入したリポソームはそのまま、又は水、生理食塩水などに懸濁して静脈投与することができる。
【００４３】
上記遺伝子治療剤の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内などの全身投与でもよいし、あるいは癌原病巣又は予想転移部位に対して、局所注射又は経口投与などの局所投与を行ってもよい。さらに、遺伝子治療剤の投与にあたっては、カテーテル技術、遺伝子導入技術、又は外科的手術などと組み合わせた投与形態をとることもできる。
【００４４】
上記遺伝子治療剤の投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日当たり組み換え遺伝子の重量として１μｇ／ｋｇ体重から１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。
【００４５】
また、本発明の癌抑制剤のうち、有効成分としてＮＲ１Ｉ２タンパク質又はその相同タンパク質を含む癌抑制剤（以下、タンパク質製剤という）は、有効成分であるＮＲ１Ｉ２タンパク質又はその相同タンパク質に製剤用添加物（例えば、担体、賦形剤など）を含む医薬組成物の形態で提供される。
【００４６】
上記タンパク質製剤の形態は特に限定されず、経口投与のための製剤としては例えば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤などが挙げられ、非経口投与のための製剤としては例えば、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、経粘膜吸収剤、経皮吸収剤などが挙げられる。
【００４７】
上記タンパク質製剤の投与経路は特に限定されず、経口投与又は非経口投与（例えば、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与などへの粘膜投与、又は吸入投与など）の何れでもよい。
【００４８】
上記タンパク質治療剤の投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日あたり０．００１μｇ／ｋｇ体重から１０００μｇ／ｋｇ体重程度の範囲であり、好ましくは０．００１μｇ／ｋｇ体重から１００μｇ／ｋｇ体重程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。
【００４９】
上記癌抑制剤（遺伝子治療剤及びタンパク質製剤の両形態を含む）は、その有効量をヒトを含む哺乳動物に投与することによって癌を抑制するのに使用することができる。上記癌抑制剤はまたその予防及び／又は治療有効量をヒトを含む哺乳動物に投与することによって癌の予防及び／又は治療をするのに使用することができる。
【００５０】
本明細書でいう「癌抑制」とは、癌の発生又は転移・着床を防止するという予防的作用、ならびに癌細胞の増殖を抑制したり、癌を縮小することによって癌の進行を阻止したり、症状を改善させるという治療的作用の両方を含む最も広い意味を有し、いかなる場合においても限定的に解釈されるものではない。
【００５１】
本発明の癌抑制剤の適用対象となる癌の具体例としては、例えば悪性黒色腫、悪性リンパ腫、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、尿管腫瘍、胆嚢癌、胆管癌、胆道癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、睾丸腫瘍、上顎癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、甲状腺癌、脳腫瘍、カポジ肉腫、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽細胞腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚癌、基底細胞癌、皮膚付属器癌、皮膚転移癌、皮膚黒色腫などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、上記のうち特に好ましい適用対象となる癌は、神経芽細胞腫である。
【００５２】
（２）ＮＲ１Ｉ２遺伝子を用いた癌の検出方法
本発明の癌の検出及び診断方法は、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の全部又はその一部を含むＤＮＡ又はＲＮＡを用いて検体試料中のＮＲ１Ｉ２遺伝子を解析する工程を含む。本発明の癌の検出及び診断方法は、本発明の癌抑制剤の適用対象となる癌を選別するための検出方法でもよい。
【００５３】
ここで、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の一部とは、配列番号１に記載するＮＲ１Ｉ２遺伝子の塩基配列のうち、例えば約１０〜３０個の連続する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを意味する。検体試料としては、腫瘍が疑われる組織切片、血液、リンパ液、喀痰、肺洗浄液、尿、便、組織培養上清などを用いることができる。
【００５４】
上記の「癌抑制剤の適用対象となる癌を選別するための検出」とは組織等における本発明における癌抑制剤が有効に作用する癌の存在の有無を知ることをいう。
【００５５】
癌を選別するための検出は、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の全部又はその一部を含むＤＮＡ又はＲＮＡをプライマー又はプローブとして用いて検体試料中のＮＲ１Ｉ２遺伝子を解析することにより行う。ここで「ＮＲ１Ｉ２遺伝子を解析する」とは、具体的にはゲノムＤＮＡのメチル化の検出又は遺伝子の発現量の異常の検出を行うことをいう。
【００５６】
遺伝子の変異の検出は、上記ＤＮＡ又はＲＮＡをプライマーとして用いる場合では、例えば選択した２種の配列のプライマーによりＰＣＲ法で検体試料より調製したＤＮＡの部分配列を増幅させ、亜硫酸水素ナトリウムを処理することで、ゲノムＤＮＡ中の非メチル化シトシン（Ｃ）を、ウラシル（Ｕ）に変換する。メチル化されているシトシンは構造上安定であるために、この反応を受けず、ウラシルに変換されない。メチル化の影響を受ける制限酵素と組み合わせて変化したシトシンと非メチル化シトシンを制限酵素切断により解析することにより、メチル化ＤＮＡの存在を特定できる（ＣＯＢＲＡ法）。またＰＣＲ法で検体試料より調製したＤＮＡの部分配列を増幅させ、亜硫酸水素ナトリウムを処理後、この増幅産物をプラスミドに組み込み、宿主細胞を形質転換させて培養し、得られるクローンの塩基配列を解析することにより行うことも可能である。
【００５７】
一方、遺伝子の発現量の異常の検出は、上記ＲＮＡ配列を含むプローブを用いてノーザンハイブリダイゼーション法又はＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によって行うことができる。
【００５８】
（３）ＮＲ１Ｉ２タンパク質抗体又はその断片を用いた癌を選別するための検出方法
本発明の癌の検出及び診断方法は、ＮＲ１Ｉ２タンパク質に対する抗体又はその断片を用いて検体試料中のＮＲ１Ｉ２タンパク質の量を解析する工程を含む。本発明の癌の検出及び診断方法は、本発明の癌抑制剤の適用対象となる癌を選別するための検出方法でもよい。
【００５９】
本方法に用いるＮＲ１Ｉ２タンパク質に対する抗体（以下、ＮＲ１Ｉ２抗体という）は、ＮＲ１Ｉ２タンパク質の全部又は一部を抗原として、通常の方法で作成することができる。ＮＲ１Ｉ２タンパク質の一部とは、配列番号２に記載するＮＲ１Ｉ２タンパク質のアミノ酸配列のうち、例えば連続する少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは、少なくとも約１１〜２０個のアミノ酸からなるポリペプチドをいう。抗原とするＮＲ１Ｉ２タンパク質の全部又は一部の調製法は生物学的手法、化学合成手法いずれでもよい。
【００６０】
ポリクローナル抗体は、例えば上記抗原をマウス、モルモット、ウサギなどの動物の皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内などに複数回接種し十分に免疫した後、該動物から採血、血清分離して作製することができる。モノクローナル抗体は、例えば上記抗原で免疫したマウスの脾細胞と市販のマウスミエローマ細胞との細胞融合により得られるハイブリドーマを作成後、該ハイブリドーマ培養上清、又は該ハイブリドーマ投与マウス腹水から作成することができる。
【００６１】
上記のようにして調製したＮＲ１Ｉ２タンパク質抗体又はその断片を用いることによって検体試料中のＮＲ１Ｉ２タンパク質の発現量を知ることができる。測定には、例えばイムノブロット法、酵素抗体法（ＥＩＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光抗体法、免疫細胞染色などの免疫学的方法、又はウェスタンブロット法などが利用できる。ここで、ＮＲ１Ｉ２タンパク質抗体の断片とは当該抗体の一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）などをいう。また、検体試料としては、腫瘍が疑われる組織切片、血液、リンパ液、喀痰、肺洗浄液、尿、便、組織培養上清などを用いることができる。測定した検体試料中のＮＲ１Ｉ２タンパク質の発現量が低い場合は、検体とした組織や細胞においてＮＲ１Ｉ２遺伝子の発現が抑制されていることになり、本発明の癌抑制剤の適用対象となる癌を選別することができる。
【００６２】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
【００６３】
実施例１：ＢＡＭＣＡ法による神経芽細胞腫からのメチル化ＤＮＡの分離
神経芽細胞腫の培養細胞株ＩＭＲ３２およびＧＯＴＯを対象サンプルとし、５人の神経芽細胞腫で病期１の患者のＤＮＡを混ぜたものをコントロールサンプルとして用い、ＭＣＧ Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｒｒａｙ−４５００（Ｉｎａｚａｗａ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．９５（７），５５９，２００４）を用いてＢＡＭＣＡ法を行った。ＩＭＲ３２およびＧＯＴＯ細胞でＣｙ３で標識された各細胞の蛍光シグナルをコントロールサンプルのＣｙ５で標識された混合したｓｔａｇｅ １癌細胞の蛍光シグナルで割った値が、１．５以上のメチル化ＤＮＡとして分離されたＢＡＣクローンとその中に含まれる遺伝子を示している（表１）。ＮＲ１Ｉ２遺伝子はＢＡＣクローンの番号１６９Ｎ１３の中に含まれる遺伝子であり、そのＤＮＡ中にＣｐＧアイランドを有する。さらにＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ量を測定したところ、コントロールサンプルで発現があるものの、ＩＭＲ３２およびＧＯＴＯ細胞ではその発現は見られなかった。細胞にＤＮＡメチルトランスフェラーゼの阻害剤である５−アザ−デオキシシチジン（５−ａｚａ−ｄＣｙｄ）を細胞に添加して培養を続けると、ＤＮＡのメチル化を低下させることができるが、ＧＯＴＯ細胞に１μＭの濃度で５日間培養を続けた後、メッセンジャーＲＮＡ量を測定したところＮＲ１Ｉ２遺伝子は発現が回復することが判明した。このことは、ＮＲ１Ｉ２遺伝子は神経芽細胞腫ＧＯＴＯ細胞で、そのＤＮＡは通常メチル化してそのメッセンジャーＲＮＡの発現が低下しており、メチル化を解除することによりメッセンジャーＲＮＡの発現が発生することを意味する。言い換えるとＮＲ１Ｉ２遺伝子は進行した神経芽細胞腫でＤＮＡのメチル化によりそのメッセンジャーＲＮＡの発現を制御される、癌抑制遺伝子であることが示された。
【００６４】
【表１】
【００６５】
実施例２：ＮＲ１Ｉ２遺伝子を含むＢＡＣクローン１６９Ｎ１３の構造
神経芽細胞腫の培養細胞株を用い、得られたメチル化ＤＮＡを含むＢＡＣクローン１６９Ｎ１３中のＮＲ１Ｉ２遺伝子の構造を図１に示す。ＮＲ１Ｉ２遺伝子のゲノムＤＮＡ構造中には、９個のエクソンが含まれ、その上流域に領域１（Ｒｅｇｉｏｎ１）とエクソン３中に２３９塩基からなる領域２（Ｒｅｇｉｏｎ２）と命名するＣｐＧが多く含まれる領域が存在した。
【００６６】
実施例３：ＮＲ１Ｉ２遺伝子のＣｐＧ領域のメチル化頻度の確認
ＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現が見られないＩＭＲ３２とＳＨ−ＳＹ５Ｙ、メッセンジャーＲＮＡの発現が見られるＳＫ−Ｎ−ＡＳ，ＳＪ−Ｎ−ＫＰ，ＬＣＬ細胞について、そのゲノムＤＮＡに亜硫酸水素ナトリウムを処理することで、ゲノムＤＮＡ中の非メチル化シトシン（Ｃ）を、ウラシル（Ｕ）に変換させた後、該ＮＲ１Ｉ２遺伝子のＣｐＧ領域をＰＣＲにて増幅後プラスミドに組み込み、そのＣｐＧ領域の塩基配列を確認した。図２に、各細胞で３−５回の頻度で塩基配列を検証し、そのＣｐＧ領域でメチル化が起こっている場合黒で、起こっていない場合グレーで示した。ＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＋と−）と領域２のメチル化が逆相関していることが明らかになった。
【００６７】
実施例４：細胞培養
用いた細胞株は子宮頸部癌細胞ＨｅＬａおよび外科的切除したサンプルに由来するＳＫ−Ｎ−ＫＳ， ＳＫ−Ｎ−ＡＳ， ＳＫ−Ｎ−ＳＨ， ＳＫ−Ｎ−ＤＺ， ＳＨ−ＳＹ５Ｙ， ＭＰ−Ｎ−ＴＳ， ＭＰ−Ｎ−ＭＳ，ＫＰ−Ｎ−ＲＴ， ＫＰ−Ｎ−ＳＩＦＡ， ＫＰ−Ｎ−ＳＩＬＡ， ＫＰ−Ｎ−ＴＫ， ＫＰ−Ｎ−ＹＳ， ＳＭＳ−ＫＣＮ， ＳＭＳ−ＫＡＮ， ＳＪ−Ｎ−ＣＧ，ＮＢ−１，ＣＨＰ１３４，ＩＭＲ３２，ＧＯＴＯ（Ｓａｉｔｏ−Ｏｈａｒａ Ｆ， ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６３，１８７６，２００３）のヒト由来神経芽細胞腫細胞を使用した。また、ＤＮＡとしてメチル化を阻害した材料を得るため、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの阻害剤である５−アザ−デオキシシチジン（５−ａｚａ−ｄＣｙｄ）を各種細胞に１μＭの濃度で５日間添加して培養を行った。
【００６８】
実施例５：ＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現
ＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現量を測定するため副腎（Ａｄｒ−ｇｌａｎｄ）をコントロールとし、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子の増幅の有無が知られている神経芽細胞腫細胞株１５株についてＲＴ−ＰＣＲを行った（図３）。ＲＴ−ＰＣＲの発現量のコントロールとして発現量が細胞種、条件で変化しにくいことで知られるＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３燐酸−デヒドロゲナーゼ）を用いた。Ｎ−ｍｙｃ遺伝子の増幅とＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現量の無い現象が相関することが示された。神経芽細胞腫がＮ−ｍｙｃ遺伝子の増幅に伴い悪性化が進むことを考慮すると、ＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現量低下は神経芽細胞腫の悪性化に関与することが示された。
【００６９】
実施例６：ＮＲ１Ｉ２遺伝子のメチル化、脱メチル化状態でのメッセンジャーＲＮＡの発現比較
通常培養条件下、ＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現がない神経芽細胞腫細胞８株について、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの阻害剤である５−アザ−デオキシシチジン（５−ａｚａ−ｄＣｙｄ）を各種細胞に１μＭの濃度で５日間添加して培養を行い、ＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲで比較した（図４）。ＲＴ−ＰＣＲの発現量のコントロールとしてＧＡＰＤＨを用いた。試験した全ての細胞株で、メチル化を阻害することでＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現が観察されることから、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の発現はそのゲノムＤＮＡのメチル化状態で制御されることが明らかとなった。
【００７０】
実施例７：ＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２におけるＣＯＢＲＡ法によるメチル化検出と発現との相関
神経芽細胞腫細胞１１株とＮＲ１Ｉ２遺伝子の発現が確認されているＢリンパ腫細胞株ＬＣＬについて、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２のメチル化をＣＯＢＲＡ法により検出した（図５）。Ｍ位置にバンドが出現している細胞種は領域２がメチル化していることを示している。領域２がメチル化している細胞種はＮＲ１Ｉ２遺伝子の発現がみられないこととよく相関している。すなわち、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２のメチル化は、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の発現を負に調節していることが明らかとなった。
【００７１】
実施例８：臨床サンプルのＣＯＢＲＡ法によるＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２のメチル化頻度の検出
表２に、１９８６年から２００３年までに京都府立医科大学に於いて切除され、両親の同意を得、かつ倫理委員会での承認を得た５１種の神経芽細胞腫サンプルについてＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２のメチル化を解析した。サンプルの内訳は、１２症例が病期１、１１症例が病期２、８症例が病期３、１３症例が病期４、４症例が病期４ｓであった。また３７症例が１歳未満の幼児由来であり、Ｎ−ｍｙｃの増幅は５１例中８例（１５％）に見られた。３９例（７６％）は神経芽細胞腫マススクリーニングによって発見された。
【００７２】
Ｐ−ｖａｌｕｅはＦｉｓｈｅｒ’ｓ ｅｘａｃｔ ｔｅｓｔにて算出し、優位と思われるものについては太字で表した。病期分類はＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ Ｓｔａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＮＳＳ）（Ｂｒｏｄｅｕｒ ＧＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，１１，１４６６，１９９３）に従った。
【００７３】
この解析から、病期が進むこと、Ｎ−ｍｙｃの増幅、予後の悪さに関してＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２のメチル化と相関があることが判明した。この結果は、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２のメチル化が神経芽細胞腫の病状を悪性化させることに大きく関係していることを示しており、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２のメチル化、更にＮＲ１Ｉ２遺伝子の発現量の低下が神経芽細胞腫の悪性化に重要な働きをしていることが明らかとなった。
【００７４】
【表２】
【００７５】
実施例９：レポーターアッセイによるＮＲ１Ｉ２遺伝子領域１と領域２の転写促進効果の測定
ＮＲ１Ｉ２遺伝子のエクソン１の上流１０６０塩基対からなる領域１、エクソン３を含む４８０塩基対からなる領域２を用いて転写促進活性の有無をレポーターアッセイにより検証した。用いたレポーターアッセイ系は、ホタルルシフェラーゼ酵素のメッセンジャーＲＮＡが発現し、タンパクに変換されて活性のある酵素として働くことによる発光物を測定する方法によった。ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ）を用いルシフェラーゼ遺伝子を中心に配置しＮＲ１Ｉ２遺伝子領域１と領域２を以下Ａの組み合わせで作製した遺伝子を構築しコンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）とした（図６Ａ）。ＨｅＬａ、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞に対し遺伝子導入し３６時間後にルシフェラーゼ酵素活性を測定した。遺伝子導入効率の差を補正するため、ｐＲＬ−ｈＴＫ（プロメガ；ウミシイタケルシフェラーゼの発現量を内部コントロールとして、実験用ホタルルシフェラーゼ レポーター遺伝子の発現を補正するベクター）を用いて、相対的なルシフェラーゼ酵素活性を転写活性とした。ＭｏｃｋはｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクターを遺伝子導入した際の陰性コントロールを示す。１／Ｌ、２／Ｌを用いＨｅＬａ、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞にてルシフェラーゼ酵素活性を測定した結果を図６Ｂに示す。両細胞共に、２／Ｌを遺伝子導入したものが高いルシフェラーゼ酵素活性を示すが、この結果は領域２が高い転写活性化能力を有していることを示す。一方、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の転写調節領域と考えられるＣｐＧに富む領域１には転写活性化能力が殆どないことが判明した。次にＭｏｃｋを含め１／Ｌ、２／Ｌ、Ｌ／２、１／Ｌ／２をＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞に対し遺伝子導入後同様にルシフェラーゼ酵素活性を測定した結果を図６Ｃに示す。図６Ｂの結果と同様に２／Ｌを遺伝子導入したものが高いルシフェラーゼ酵素活性を示した。一方、Ｌ／２では２／Ｌの約半分、１／Ｌ／２ではほぼ陰性コントロールの転写能力を示した。この結果は、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２は確かな転写活性化能力を有しているが、その能力は転写開始位置の上流で強く発揮されることを意味している。１／Ｌ／２でルシフェラーゼ遺伝子への転写活性化能力が殆どないことに関しては、領域１がＬ／２では上昇していた転写活性化能力を抑制していることがわかった。
【００７６】
実施例１０：臨床サンプルのＣＯＢＲＡ法によるＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２のメチル化検出とＮＲ１Ｉ２遺伝子の発現、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子の増幅、病期、予後との関連
１９８６年から２００３年までに京都府立医科大学に於いて切除され、両親の同意を得、かつ倫理委員会での承認を得た５１種の神経芽細胞腫サンプルについてＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２のメチル化の解析を行った。
【００７７】
図７Ａは病期分類したサンプルのうち代表的な９サンプル、Ｔ５９７、Ｔ３９９、Ｔ９７４、Ｔ６２１、Ｔ４９１、Ｔ４７７３、Ｔ３０４、Ｔ５３０、Ｔ５７１８についてＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２のメチル化をＣＯＢＲＡ法にて検出したものである。Ｍ位置にバンドが出現しているサンプルは領域２がメチル化していることを示している。同様に、図７Ｂには上記９サンプルからＲＮＡを得た後、ＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲにて確認した結果を示す。発現量のコントロールとしてＧＡＰＤＨを用いた。図７Ａおよび図７Ｂから、細胞を用いたサンプルの場合と同様に、臨床サンプルにおいても領域２がメチル化していることとＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡが負の相関を示すことが明らかとなった。
【００７８】
５１種の神経芽細胞腫サンプルで４７例について高品質のメッセンジャーＲＮＡが得られたため、ＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲにて測定し、コントロールとしてＧＡＰＤＨのメッセンジャーＲＮＡ量を測定し、相対比として算出した。この相対比を縦軸に、
ＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２のメチル化の有無（ＣＯＢＲＡ法にて測定）、
Ｎ−ｍｙｃ遺伝子の増幅の有無、
神経芽細胞腫の病期分類、
予後（生存しているか、死亡したか）、
についてグラフで示したものが図７Ｃである。予後の項目を除き、ＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現量と有意差があることが確認された（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔ）。すなわち、臨床由来神経芽細胞腫サンプルを用いて、
ＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２のメチル化とメッセンジャーＲＮＡの発現は逆相関する、
Ｎ−ｍｙｃ遺伝子の増幅があるものはＮＲ１Ｉ２メッセンジャーＲＮＡの発現が低い、
進行した神経芽細胞腫ほどＮＲ１Ｉ２メッセンジャーＲＮＡの発現が低い、
ということが明らかとなった。
【００７９】
実施例１１：神経芽細胞腫細胞へのＮＲ１Ｉ２遺伝子導入による癌原性の低下
培養条件下において、正常細胞と癌細胞の性質の違いの一つとして、固形物への付着性が知られている。すなわち、正常細胞が増殖するためには固形物に付着することが必要である（足場依存性）。正常細胞は、０．３３％前後の軟らかい寒天培地中で培養した場合、浮遊状態では増殖できないが、多くの癌細胞では、足場依存性の性質は失われ、軟寒天培地中でも増殖可能となる。癌細胞は浮遊しているが、軟寒天培地の中を移動できないので、１個の細胞から次々に分裂を繰り返し、１〜３週間の後には細胞塊（コロニー）を形成する。この細胞の軟寒天コロニー形成能は、移植腫瘍形成能と相関することから、悪性度の指標として広く利用されている（Ｓｈｉｎ，Ｓ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７２， ４４３５， １９７５）。挿入遺伝子のアミノ末端にｍｙｃペプチドを付加可能なｐＣＭＶ−Ｔａｇ３ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にＮＲ１Ｉ２完全長ｃＤＮＡを挿入したものを作成した（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ＮＲ１Ｉ２）。また、我々はヘルペスウィルス由来ＶＰ１６タンパクとＮＲ１Ｉ２タンパクの融合体がＮＲ１Ｉ２タンパク単体より強い転写活性を持つことを以前に発見していることから、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３ベクターにＶＰ１６のｃＤＮＡとＮＲ１Ｉ２完全長ｃＤＮＡを挿入したものも作成した（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ＶＰ−ＮＲ１Ｉ２）。ＮＲ１Ｉ２遺伝子の発現が見られない神経芽細胞腫細胞株ＩＭＲ３２、ＳＭＳ−ＫＡＮ細胞にＦｕＧＥＮＥ６（ロシュダイアグノスティクス）を用い遺伝子導入した。５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ジェネテシン）存在下、３週間培養を行った後、クリスタルバイオレット染色後コロニー数を計測した（図８Ａ、Ｂ）。ＩＭＲ３２、ＳＭＳ−ＫＡＮ細胞共に、ＮＲ１Ｉ２遺伝子を発現させることで有意にコロニー数を低下させること、特にｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ＶＰ−ＮＲ１Ｉ２を使用した場合顕著にコロニー数の減少が確認された。この事象は、ＮＲ１Ｉ２遺伝子が癌細胞の増殖を抑制する機能を有することを示しており、この遺伝子が神経芽細胞腫で癌抑制遺伝子として機能していることが明らかとなった。
【００８０】
実施例１２：神経芽細胞腫細胞へのＮＲ１Ｉ２遺伝子導入による癌原性の低下
挿入遺伝子を含まないｐＣＭＶ−Ｔａｇ３ベクター、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ＶＰ−ＮＲ１Ｉ２をＳＭＳ−ＫＡＮ細胞に導入し、コントロール細胞クローンを１種（ｅｍｐｔｙ）、ＮＲ１Ｉ２タンパクを恒常的に発現する細胞クローンを２種（Ｂ１、Ｂ２）を得た。これら３種の細胞について、細胞破壊液をウェスタンブロットし、ｍｙｃタンパク質に対する抗体で検出した結果を、図９Ａに示す。コントロール細胞（ｅｍｐｔｙ）に比し、ＮＲ１Ｉ２タンパクが発現していることが確認できる。これら細胞についてその増殖速度について、テトラゾリウム塩（ＷＳＴ−１）を利用した生細胞中のミトコンドリア脱水素酵素によるホルマザン色素への変換にて色素で細胞数をモニター（同仁化学研究所：ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８）したのが図９Ｂである。コントロール細胞（ｅｍｐｔｙ）に比しＮＲ１Ｉ２タンパクが発現することでクローンＢ１、Ｂ２共に３日培養後以降、有意に細胞増殖が低下した（ａはコントロール細胞（ｅｍｐｔｙ）とクローンＢ１、ｂはコントロール細胞（ｅｍｐｔｙ）とクローンＢ２に対しＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔでＰ−ｖａｌｕｅが０．０５未満であったことを示す）。
【００８１】
この結果から、ＮＲ１Ｉ２タンパクは細胞内に発現することで細胞増殖を抑制する働きのあることが判明した。これまで知られている癌抑制遺伝子タンパクが細胞増殖を抑制したり、細胞死を誘導することから生体を癌から守っていることから、ＮＲ１Ｉ２タンパクの一つの側面として癌抑制遺伝子産物としての効果があることが示された。
【００８２】
実施例１３：ＮＲ１Ｉ２遺伝子が制御する遺伝子の検索
ＮＲ１Ｉ２遺伝子は転写因子として知られていることから、ＮＲ１Ｉ２タンパクを発現しない細胞と発現する細胞からメッセンジャーＲＮＡを取り出し、その発現を比較することによりどのような遺伝子がその発現を制御されるかを知ることが可能である。ＮＲ１Ｉ２遺伝子タンパクが癌抑制効果を有する可能性があることは先にも述べたが、この効果の実体はＮＲ１Ｉ２遺伝子タンパクが制御する遺伝子産物によると考えられる。そこで、ＳＭＳ−ＫＡＮ細胞にコントロールとして外来遺伝子を含まないｐＣＭＶ−Ｔａｇ３ベクター、検査サンプルとしてＮＲ１Ｉ２遺伝子を含むｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ＶＰ−ＮＲ１Ｉ２をＳＭＳ−ＫＡＮ細胞に導入し、コントロール細胞クローン、ＮＲ１Ｉ２タンパクを恒常的に発現する細胞クローンＢ１を得た。これら２種の細胞を用い、ヒトの３０，０００遺伝子の発現量を観察可能なＡｃｅＧｅｎｅ Ｈｕｍａｎ ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐ ３０Ｋ （ＤＮＡチップ研究所）によりメッセンジャーＲＮＡの発現解析を行った（Ｉｎｏｕｅ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ． Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１６５．７１．２００４）。Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８プライマーを用いて、アミノアリル−ｄＵＴＰ （Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．）を取り込ませた相補鎖ＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ）を作製後、アミノアリル基に反応性のＣｙ３（シアニン３）、Ｃｙ５（シアニン５）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とカップリング反応を行い標識を行った。ハイブリダイゼーションを２回（１回目； Ｃｙ３−Ｂ１／Ｃｙ５−コントロール、２回目； Ｃｙ５−Ｂ１／Ｃｙ３−コントロール）行い、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてシグナルを測定後、ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ４．１ソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）にて解析した。表３及び表４には、２回の実験共にＮＲ１Ｉ２遺伝子を導入したＳＭＳ−ＫＡＮ細胞でコントロール細胞クローンに比し、１．５倍以上の発現量を示した遺伝子を示す。
【００８３】
ＮＲ１Ｉ２遺伝子により発現の上昇することが既に判明しているＣＹＰ３Ａ４遺伝子がこの実験結果に含まれていたことから、実験は信頼性のあるものであったことが確認された。
【００８４】
【表３】
【００８５】
【表４】
【００８６】
実施例１４：ＮＲ１Ｉ２遺伝子が制御する癌抑制効果が期待される遺伝子
これまでに判明しているＮＲ１Ｉ２遺伝子の推定される機能として、生体異物が生体に入った際にそれを解毒する酵素群のメッセンジャーＲＮＡを誘導することが知られている（Ｂｌｕｍｂｅｒｇ Ｂ， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ， １２， ３１９５， １９９８、Ｋｌｉｅｗｅｒ ＳＡ， ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ， ９２， ７３， １９９８、Ｘｉｅ Ｗ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ，４０６， ４３５， ２０００）。例えば、ＮＲ１Ｉ２タンパクは異物代謝酵素ＣＹＰ３Ａ４や細胞内薬物の排出ポンプであるＡＢＣＢ１（Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）のメッセンジャーＲＮＡを誘導する（Ｓｙｎｏｌｄ ＴＷ，ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｍｅｄ，７，５８４， ２００１）。しかしながら、ＮＲ１Ｉ２遺伝子が制御する癌抑制に関わる遺伝子はこれまでに報告されていなかった。そこで先の転写解析実験より得られた１０５種の遺伝子の中から、過去の論文情報やＯＭＩＭ情報（Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｍ／ｏｍｉｍｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ）を参考として、癌の増殖抑制に関与する遺伝子の候補として１０種を選び出し、電気泳動を利用したＲＴ−ＰＣＲにてその発現量を観察した（図１０）。
【００８７】
使用したメッセンジャーＲＮＡ材料を得た細胞はＡ：ＳＭＳ−ＫＡＮ：コントロール， Ｂ：ＫＡＮ−ＮＲ１Ｉ２発現クローンＢ１， Ｃ：ＫＡＮ−ＮＲ１Ｉ２発現クローンＢ２、 Ｄ： ＧＯＴＯ コントロール、 Ｅ：ＧＯＴＯ−ＮＲ１Ｉ２発現クローンＡ１を使用した。ＰＣＲにて生成したＤＮＡを３％寒天ゲルで電気泳動後ＬＡＳ−３０００（富士フイルム）にてバンドを定量した。ＧＡＰＤＨ遺伝子について同様の実験を行い、コントロールとして補正し相対値として各遺伝子の発現量を算出した。ＮＲ１Ｉ２遺伝子の発現に相関して発現の上昇が見られる遺伝子が、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の制御下にあると考えられる。最もＮＲ１Ｉ２遺伝子発現との相関が高かった遺伝子は、ＰＬＡ２Ｇ２Ａ遺伝子であった。図１１には実際の電気泳動イメージを示した。ＮＲ１Ｉ２とＰＬＡ２Ｇ２Ａ遺伝子の発現がよく相関していることが確認された。
【００８８】
ＰＬＡ２Ｇ２Ａ遺伝子は分泌型のホスホリパーゼＡ２として知られている。興味深いことに、ＰＬＡ２Ｇ２Ａ遺伝子が存在する染色体位置は、神経芽細胞腫でしばしば欠失が観察される１ｐ３６位置に存在する（Ｐｒａｍｌ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ５５，５５０４，１９９５）。また、ノックアウトマウスを用いた実験で、ＰＬＡ２Ｇ２Ａ遺伝子を欠如させたマウスは結腸ポリープ数が増加することも報告されており、結腸癌との関連があることが示された（Ｈａｌｕｓｋａ ＦＧ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ７２，３３７，１９９７）。
【００８９】
実施例の結論
（１）ＢＡＭＣＡ法によるスクリーニングから、そのゲノムＤＮＡ中に高頻度メチル化部位を有し、悪性な神経芽細胞腫でメッセンジャーＲＮＡの発現が低下するＮＲ１Ｉ２遺伝子を単離した。さらに臨床サンプル由来の細胞を用いた実験から、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の発現低下はメチル化を解除することにより回復することも示された。
【００９０】
（２）ＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２（ｅｘｏｎ３領域）が転写活性化能力を持ち、そのメチル化がそのメッセンジャーＲＮＡレベルでの発現低下に寄与していることが判明した。臨床サンプルの解析から領域２のメチル化は神経芽細胞腫の進行度、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子の増幅、予後の悪さと相関することが明らかとなった。さらに、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の発現が高いことと、領域２のメチル化、神経芽細胞腫の進行度、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子の増幅が逆相関することも判明した。
【００９１】
（３）ＮＲ１Ｉ２遺伝子を発現していない神経芽細胞腫細胞株へのＮＲ１Ｉ２遺伝子移入後の足場依存性実験における細胞増殖の低下、ならびに細胞増殖速度の低下から、ＮＲ１Ｉ２遺伝子がタンパクとして発現することが癌細胞としての性質を失う、即ちＮＲ１Ｉ２遺伝子は癌抑制遺伝子として機能することが明らかとなった。
【００９２】
（４）ＮＲ１Ｉ２遺伝子は転写因子として働くことが報告されており、他の遺伝子の発現を制御する働きを有する。ＮＲ１Ｉ２遺伝子を発現していない神経芽細胞腫細胞株へのＮＲ１Ｉ２遺伝子移入後に、遺伝子発現が上昇する遺伝子をスクリーニングした結果、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の制御下に増殖を制御する遺伝子としてＰＬＡ２Ｇ２Ａを見出した。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１は、ＢＡＭＣＡ法で得られた神経芽細胞腫細胞株でメチル化頻度の高いＢＡＣクローン１６９Ｎ１３の遺伝子構造を示す。
【図２】図２は、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の発現の有無が既知の細胞株での、ＣｐＧに富むＮＲ１Ｉ２遺伝子領域（領域１と領域２）についてそのメチル化を配列決定して確認した結果を示す。黒がメチル化部位、グレーが非メチル化ＣｐＧを示す。
【図３】図３は、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子のゲノムＤＮＡでの増幅が既知の神経芽細胞腫細胞株１５株と正常人副腎（Ａｄｒ−ｇｌａｎｄ）でのＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲにて電気泳動で観察した結果を示す。鋳型量のコントロールとしてＧＡＰＤＨを下段に示した。
【図４】図４は、神経芽細胞腫細胞８株について、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの阻害剤である５−ａｚａ−ｄＣｙｄの存在（＋）、非存在（−）下で培養後、ＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲにて電気泳動で観察した結果を示す。鋳型量のコントロールとしてＧＡＰＤＨを下段に示した。
【図５】図５は、神経芽細胞腫細胞１１株とＢリンパ腫細胞株ＬＣＬについて、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２のメチル化をＣＯＢＲＡ法により検出した結果を示す。Ｍ位置にバンドが出現している細胞種は領域２がメチル化していることを示している。それぞれの細胞株で、ＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現があるものをＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＋、ないものを−で表記した。
【図６】図６Ａは、レポーターアッセイによるＮＲ１Ｉ２遺伝子領域１と領域２を用いたコンストラクトの構造を示す。図６Ｂは、１／Ｌ、２／Ｌを用いＨｅＬａ、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞にてルシフェラーゼ酵素活性を測定した結果を示す。Ｍｏｃｋは外来遺伝子を含まないベクターを遺伝子導入した際の陰性コントロールを示す。図６Ｃは、Ｍｏｃｋを含め１／Ｌ、２／Ｌ、Ｌ／２、１／Ｌ／２をＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞に遺伝子を導入後同様にルシフェラーゼ酵素活性を測定した結果を示す。
【図７】図７Ａは、臨床サンプルで病期分類した９サンプルについてＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２のメチル化をＣＯＢＲＡ法にて検出した結果を示す。Ｍ位置にバンドが出現しているサンプルは領域２がメチル化していることを示す。図７Ｂは、これら９サンプルからＲＮＡを得た後、ＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲにて確認した結果を示す。鋳型量のコントロールとしてＧＡＰＤＨを下段に示した。図７Ｃには、神経芽細胞腫サンプル４７例について、ＮＲ１Ｉ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲにて測定しＧＡＰＤＨで補正後、ＮＲ１Ｉ２遺伝子の領域２のメチル化の有無、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子の増幅の有無、神経芽細胞腫の病期分類、予後についてグラフで示した。
【図８】図８Ａは、神経芽細胞腫細胞株ＩＭＲ３２、ＳＭＳ−ＫＡＮ細胞に発現ベクター単体（Ｅｍｐｔｙ）、ＮＲ１Ｉ２遺伝子、ＶＰ１６が結合したＮＲ１Ｉ２遺伝子を導入後、３週間軟寒天培養を行った培養ディッシュのイメージを示す。図８Ｂは、図８Ａの実験で観察された増殖細胞塊（コロニー）数をグラフで示した。
【図９】図９Ａは、ＳＭＳ−ＫＡＮ細胞に発現ベクターのみ、発現ベクター＋ＮＲ１Ｉ２遺伝子をＳＭＳ−ＫＡＮ細胞に導入し、樹立したコントロール細胞（ｅｍｐｔｙ）、ＮＲ１Ｉ２遺伝子導入株２種（Ｂ１、Ｂ２）に対し、細胞破壊液をウェスタンブロットし、タグ配列であるｍｙｃタンパク質に対する抗体で検出した結果を示す。図９Ｂは、これら３種の細胞の増殖速度をミトコンドリア脱水素酵素活性を細胞数の指標として縦軸にとり、観察した結果を示す。
【図１０】図１０は、表３及び表４で示したＮＲ１Ｉ２遺伝子が発現することにより、１．５倍以上の発現量を示した遺伝子のうち、がんの増殖抑制に関与する候補遺伝子として１０種を選び出し、電気泳動を利用したＲＴ−ＰＣＲにてそれぞれの発現量を観察した結果を示す。Ａ：ＳＭＳ−ＫＡＮ：コントロール， Ｂ：ＫＡＮ−ＮＲ１Ｉ２発現クローンＢ１， Ｃ：ＫＡＮ−ＮＲ１Ｉ２発現クローンＢ２， Ｄ： ＧＯＴＯ コントロール， Ｅ：ＧＯＴＯ−ＮＲ１Ｉ２発現クローンＡ１を使用した。ＧＡＰＤＨ遺伝子について同様の実験を行い、コントロールとして補正し相対値として各遺伝子の発現量を算出した。
【図１１】図１１は、ＳＭＳ−ＫＡＮ細胞でのコントロール（ｖｅｃｔｏｒ）、ＮＲ１Ｉ２発現クローンＢ１、Ｂ２およびＧＯＴＯ細胞でのコントロール（ｖｅｃｔｏｒ）、ＮＲ１Ｉ２発現クローンＡ１についてＣＹＰ２Ａ４遺伝子、ＰＬＡ２Ｇ２Ａ遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲでの電気泳動イメージを示す。
【配列表フリーテキスト】
【００９４】
SEQUENCE LISTING
<110> Fuji Photo Film Co.
<120> Cancer suppressing agent
<130> A51756A
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2146
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
tgaaatatag gtgagagaca agattgtctc atatccgggg aaatcataac ctatgactag 60
gacgggaaga ggaagcactg cctttacttc agtgggaatc tcggcctcag cctgcaagcc 120
aagtgttcac agtgagaaaa gcaagagaat aagctaatac tcctgtcctg aacaaggcag 180
cggctccttg gtaaagctac tccttgatcg atcctttgca ccggattgtt caaagtggac 240
cccaggggag aagtcggagc aaagaactta ccaccaagca gtccaagagg cccagaagca 300
aacctggagg tgagacccaa agaaagctgg aaccatgctg actttgtaca ctgtgaggac 360
acagagtctg ttcctggaaa gcccagtgtc aacgcagatg aggaagtcgg aggtccccaa 420
atctgccgtg tatgtgggga caaggccact ggctatcact tcaatgtcat gacatgtgaa 480
ggatgcaagg gctttttcag gagggccatg aaacgcaacg cccggctgag gtgccccttc 540
cggaagggcg cctgcgagat cacccggaag acccggcgac agtgccaggc ctgccgcctg 600
cgcaagtgcc tggagagcgg catgaagaag gagatgatca tgtccgacga ggccgtggag 660
gagaggcggg ccttgatcaa gcggaagaaa agtgaacgga cagggactca gccactggga 720
gtgcaggggc tgacagagga gcagcggatg atgatcaggg agctgatgga cgctcagatg 780
aaaacctttg acactacctt ctcccatttc aagaatttcc ggctgccagg ggtgcttagc 840
agtggctgcg agttgccaga gtctctgcag gccccatcga gggaagaagc tgccaagtgg 900
agccaggtcc ggaaagatct gtgctctttg aaggtctctc tgcagctgcg gggggaggat 960
ggcagtgtct ggaactacaa acccccagcc gacagtggcg ggaaagagat cttctccctg 1020
ctgccccaca tggctgacat gtcaacctac atgttcaaag gcatcatcag ctttgccaaa 1080
gtcatctcct acttcaggga cttgcccatc gaggaccaga tctccctgct gaagggggcc 1140
gctttcgagc tgtgtcaact gagattcaac acagtgttca acgcggagac tggaacctgg 1200
gagtgtggcc ggctgtccta ctgcttggaa gacactgcag gtggcttcca gcaacttcta 1260
ctggagccca tgctgaaatt ccactacatg ctgaagaagc tgcagctgca tgaggaggag 1320
tatgtgctga tgcaggccat ctccctcttc tccccagacc gcccaggtgt gctgcagcac 1380
cgcgtggtgg accagctgca ggagcaattc gccattactc tgaagtccta cattgaatgc 1440
aatcggcccc agcctgctca taggttcttg ttcctgaaga tcatggctat gctcaccgag 1500
ctccgcagca tcaatgctca gcacacccag cggctgctgc gcatccagga catacacccc 1560
tttgctacgc ccctcatgca ggagttgttc ggcatcacag gtagctgagc ggctgccctt 1620
gggtgacacc tccgagaggc agccagaccc agagccctct gagccgccac tcccgggcca 1680
agacagatgg acactgccaa gagccgacaa tgccctgctg gcctgtctcc ctagggaatt 1740
cctgctatga cagctggcta gcattcctca ggaaggacat gggtgccccc cacccccagt 1800
tcagtctgta gggagtgaag ccacagactc ttacgtggag agtgcactga cctgtaggtc 1860
aggaccatca gagaggcaag gttgcccttt ccttttaaaa ggccctgtgg tctggggaga 1920
aatccctcag atcccactaa agtgtcaagg tgtggaaggg accaagcgac caaggatagg 1980
ccatctgggg tctatgccca catacccacg tttgttcgct tcctgagtct tttcattgct 2040
acctctaata gtcctgtctc ccacttccca ctcgttcccc tcctcttccg agctgctttg 2100
tgggctccag gcctgtactc atcggcaggt gcatgagtat ctgtgg 2146
<210> 2
<211> 434
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Glu Val Arg Pro Lys Glu Ser Trp Asn His Ala Asp Phe Val His
1 5 10 15
Cys Glu Asp Thr Glu Ser Val Pro Gly Lys Pro Ser Val Asn Ala Asp
20 25 30
Glu Glu Val Gly Gly Pro Gln Ile Cys Arg Val Cys Gly Asp Lys Ala
35 40 45
Thr Gly Tyr His Phe Asn Val Met Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe
50 55 60
Phe Arg Arg Ala Met Lys Arg Asn Ala Arg Leu Arg Cys Pro Phe Arg
65 70 75 80
Lys Gly Ala Cys Glu Ile Thr Arg Lys Thr Arg Arg Gln Cys Gln Ala
85 90 95
Cys Arg Leu Arg Lys Cys Leu Glu Ser Gly Met Lys Lys Glu Met Ile
100 105 110
Met Ser Asp Glu Ala Val Glu Glu Arg Arg Ala Leu Ile Lys Arg Lys
115 120 125
Lys Ser Glu Arg Thr Gly Thr Gln Pro Leu Gly Val Gln Gly Leu Thr
130 135 140
Glu Glu Gln Arg Met Met Ile Arg Glu Leu Met Asp Ala Gln Met Lys
145 150 155 160
Thr Phe Asp Thr Thr Phe Ser His Phe Lys Asn Phe Arg Leu Pro Gly
165 170 175
Val Leu Ser Ser Gly Cys Glu Leu Pro Glu Ser Leu Gln Ala Pro Ser
180 185 190
Arg Glu Glu Ala Ala Lys Trp Ser Gln Val Arg Lys Asp Leu Cys Ser
195 200 205
Leu Lys Val Ser Leu Gln Leu Arg Gly Glu Asp Gly Ser Val Trp Asn
210 215 220
Tyr Lys Pro Pro Ala Asp Ser Gly Gly Lys Glu Ile Phe Ser Leu Leu
225 230 235 240
Pro His Met Ala Asp Met Ser Thr Tyr Met Phe Lys Gly Ile Ile Ser
245 250 255
Phe Ala Lys Val Ile Ser Tyr Phe Arg Asp Leu Pro Ile Glu Asp Gln
260 265 270
Ile Ser Leu Leu Lys Gly Ala Ala Phe Glu Leu Cys Gln Leu Arg Phe
275 280 285
Asn Thr Val Phe Asn Ala Glu Thr Gly Thr Trp Glu Cys Gly Arg Leu
290 295 300
Ser Tyr Cys Leu Glu Asp Thr Ala Gly Gly Phe Gln Gln Leu Leu Leu
305 310 315 320
Glu Pro Met Leu Lys Phe His Tyr Met Leu Lys Lys Leu Gln Leu His
325 330 335
Glu Glu Glu Tyr Val Leu Met Gln Ala Ile Ser Leu Phe Ser Pro Asp
340 345 350
Arg Pro Gly Val Leu Gln His Arg Val Val Asp Gln Leu Gln Glu Gln
355 360 365
Phe Ala Ile Thr Leu Lys Ser Tyr Ile Glu Cys Asn Arg Pro Gln Pro
370 375 380
Ala His Arg Phe Leu Phe Leu Lys Ile Met Ala Met Leu Thr Glu Leu
385 390 395 400
Arg Ser Ile Asn Ala Gln His Thr Gln Arg Leu Leu Arg Ile Gln Asp
405 410 415
Ile His Pro Phe Ala Thr Pro Leu Met Gln Glu Leu Phe Gly Ile Thr
420 425 430
Gly Ser
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＲ１Ｉ２遺伝子又はその相同遺伝子を含有する癌抑制剤。
【請求項２】
前記遺伝子又はその相同遺伝子がベクターに組み込まれている、請求項１に記載の癌抑制剤。
【請求項３】
前記ベクターがウイルスベクター又は動物細胞発現用プラスミドベクターである、請求項２に記載の癌抑制剤。
【請求項４】
前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである、請求項３に記載の癌抑制剤。
【請求項５】
前記遺伝子又はその相同遺伝子がリポソームに封入されている、請求項１に記載の癌抑制剤。
【請求項６】
ＮＲ１Ｉ２タンパク質又はその相同タンパク質を含有する癌抑制剤。
【請求項７】
ＮＲ１Ｉ２遺伝子の全部又はその一部を含むＤＮＡ又はＲＮＡを用いて検体試料中のＮＲ１Ｉ２遺伝子を解析する工程を含む、癌の検出及び診断方法。
【請求項８】
前記解析が遺伝子の変異の検出又は遺伝子の発現量の異常の検出である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１から６の何れかに記載の癌抑制剤の適用対象となる癌を選別するための方法である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
ＮＲ１Ｉ２タンパク質に対する抗体又はその断片を用いて検体試料中のＮＲ１Ｉ２タンパク質を解析する工程を含む、癌の検出及び診断方法。
【請求項１１】
前記解析がタンパク質の発現量の異常の検出である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から６の何れかに記載の癌抑制剤の適用対象となる癌を選別するための方法である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１】
ＮＲ１Ｉ２遺伝子又はその相同遺伝子を含有する癌抑制剤。
【請求項２】
前記遺伝子又はその相同遺伝子がベクターに組み込まれている、請求項１に記載の癌抑制剤。
【請求項３】
前記ベクターがウイルスベクター又は動物細胞発現用プラスミドベクターである、請求項２に記載の癌抑制剤。
【請求項４】
前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである、請求項３に記載の癌抑制剤。
【請求項５】
前記遺伝子又はその相同遺伝子がリポソームに封入されている、請求項１に記載の癌抑制剤。
【請求項６】
ＮＲ１Ｉ２タンパク質又はその相同タンパク質を含有する癌抑制剤。
【請求項７】
ＮＲ１Ｉ２遺伝子の全部又はその一部を含むＤＮＡ又はＲＮＡを用いて検体試料中のＮＲ１Ｉ２遺伝子を解析する工程を含む、癌の検出及び診断方法。
【請求項８】
前記解析が遺伝子の変異の検出又は遺伝子の発現量の異常の検出である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１から６の何れかに記載の癌抑制剤の適用対象となる癌を選別するための方法である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
ＮＲ１Ｉ２タンパク質に対する抗体又はその断片を用いて検体試料中のＮＲ１Ｉ２タンパク質を解析する工程を含む、癌の検出及び診断方法。
【請求項１１】
前記解析がタンパク質の発現量の異常の検出である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から６の何れかに記載の癌抑制剤の適用対象となる癌を選別するための方法である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図６】
【図１０】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図２】
【図６】
【図１０】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【公開番号】特開２００７−１１９３５９（Ｐ２００７−１１９３５９Ａ）
【公開日】平成１９年５月１７日（２００７．５．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３０９９２１（Ｐ２００５−３０９９２１）
【出願日】平成１７年１０月２５日（２００５．１０．２５）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【出願人】（５０４１７９２５５）国立大学法人 東京医科歯科大学 (228)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年５月１７日（２００７．５．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月２５日（２００５．１０．２５）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【出願人】（５０４１７９２５５）国立大学法人 東京医科歯科大学 (228)
【Ｆターム（参考）】
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