癌抑制剤
【課題】癌抑制遺伝子を新たに見出してこれを含有する癌抑制剤ならびに該癌抑制遺伝子を用いる癌の診断方法を提供すること。
【解決手段】ＲＧＣ３２遺伝子又はその相同遺伝子を含有する癌抑制剤；ＲＧＣ３２タンパク質又はその相同タンパク質を含有する癌抑制剤。ＲＧＣ３２遺伝子の全部又はその一部を含むＤＮＡ又はＲＮＡを用いて検体試料中のＲＧＣ３２遺伝子を解析する工程を含む癌の診断方法；ならびにＲＧＣ３２タンパク質に対する抗体又はその断片を用いて検体試料中のＲＧＣ３２タンパク質を解析する工程を含む癌の診断方法。
【解決手段】ＲＧＣ３２遺伝子又はその相同遺伝子を含有する癌抑制剤；ＲＧＣ３２タンパク質又はその相同タンパク質を含有する癌抑制剤。ＲＧＣ３２遺伝子の全部又はその一部を含むＤＮＡ又はＲＮＡを用いて検体試料中のＲＧＣ３２遺伝子を解析する工程を含む癌の診断方法；ならびにＲＧＣ３２タンパク質に対する抗体又はその断片を用いて検体試料中のＲＧＣ３２タンパク質を解析する工程を含む癌の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌抑制遺伝子及び該遺伝子がコードするタンパク質の医薬用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の発症は細胞のタンパク質の変異や量的変化に起因することは古くから知られている。近年の遺伝子工学の発達は特定タンパク質をコードする遺伝子の増幅や癌細胞における遺伝子変異の解析を可能にし、癌研究の分野においても飛躍的な発展をもたらした。これまでに細胞の癌化や癌細胞の異常増殖に関与するいわゆる癌遺伝子の解析及び同定が進んでいる。一方、変異あるいは発現低下により癌化につながる癌抑制遺伝子がここ数年脚光を浴びている。これまでに癌抑制遺伝子として網膜芽細胞腫のＲｂ遺伝子、大腸癌のｐ５３遺伝子及びＡＰＣ遺伝子、Ｗｉｌｍｓ腫瘍のＷＴ１遺伝子などが発見されている。ＷＴ１遺伝子を活用した癌抑制剤の例も報告されている（特許文献１）。
【０００３】
また、癌の発生、進展悪性化、転移などには一つの遺伝子の異常だけでなく複数の遺伝子の異常が関与していることが次第に明らかになりつつあり、さらに多くの未同定の癌遺伝子及び癌抑制遺伝子が存在するものと考えられている。癌抑制効果を有する遺伝子は数多く知られているが、多くの場合、その選別には患者の遺伝子の変異を、染色体ＤＮＡを染色することにより視覚化して見つけ出すアプローチ（非特許文献１）や、遺伝子の欠失をＬＯＨ（Ｌｏｓｓ Ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）解析で大まかな範囲を選定した後、重要な遺伝子領域を絞り込むという方法がこれまで行われてきた（特許文献２）。しかし、これらの方法では、判別できるＤＮＡ欠失領域が莫大なものとなり、重要な遺伝子領域を絞り込む作業に大量の時間と手間を必要とする欠点を持っており、癌抑制遺伝子を探し出す手段としては限界があった。また、従来の遺伝子を用いた癌病態の分離・識別法では悪性度の判定は困難であった。
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２００３／００２１４２号公報
【特許文献２】ＷＯ０１／０３２８５９号公報
【非特許文献１】Ｙａｓｕｈｉｄｅ Ｙａｍａｓｈｉｔａ、ｅｔ ａｌ．、Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ 、１１（３３）：５１２９−５１３５、２００５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、既存の方法に代わる新たな方法により癌抑制遺伝子を見出して、これを含有する癌抑制剤を提供することを課題とする。本発明はまた、該癌抑制遺伝子がコードするタンパク質を含有する癌抑制剤を提供することを課題とする。本発明はさらに該癌抑制遺伝子の存在量または発現量を計測することによる癌患者の病態における悪性度を診断する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決すべく神経膠腫（Ｇｌｉｏｍａ）症例のＤＮＡの部分欠失領域を探索することを精力的に行ってきた。神経膠腫は、主に星膠腫（Ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）、乏突起膠腫（Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍａ）、上衣腫（Ｅｐｅｎｄｙｍｏｍａ）、最も悪性度の高い膠芽腫（Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）に分類され、脳腫瘍全体の３０−４０％を占める。本発明者らは、神経膠腫における癌関連遺伝子を特定するため、新規に開発されたアレイＣＧＨ法（Ｉｎａｚａｗａ Ｊ．、ｅｔ ａｌ．、 Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．９５（７）、５５９、２００４）により癌で高頻度に欠失した遺伝子をスクリーニングした。さらに、ｃＤＮＡマイクロアレイとＲＴ−ＰＣＲ法を組み合わせ、神経膠腫でＤＮＡ中から欠失し、発現が著しく抑制されている遺伝子として、ＲＧＣ３２（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｇｅｎｅ ｔｏ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ３２）遺伝子を同定した。さらに、ＲＧＣ３２タンパク質の無い癌細胞にＲＧＣ３２タンパク質を発現させることで、足場依存性増殖能の低下、細胞増殖速度の低下が起こることを確認し、ＲＧＣ３２タンパク質は癌抑制遺伝子産物の働きを持つことを実証した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００７】
即ち、本発明によれば、ＲＧＣ３２遺伝子又はその相同遺伝子を含有する癌抑制剤が提供される。
好ましくは、前記遺伝子又はその相同遺伝子はベクターに組み込まれている。
好ましくは、前記ベクターはウイルスベクター又は動物細胞発現用プラスミドベクターである。
【０００８】
好ましくは、前記ウイルスベクターはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである。
好ましくは、前記遺伝子又はその相同遺伝子はリポソームに封入されている。
【０００９】
本発明の別の側面によれば、ＲＧＣ３２タンパク質又はその相同タンパク質を含有する癌抑制剤が提供される。
【００１０】
本発明のさらに別の側面によれば、ＲＧＣ３２遺伝子の全部又はその一部を含むＤＮＡ又はＲＮＡを用いて検体試料中のＲＧＣ３２遺伝子を解析する工程を含む、癌の診断方法が提供される。
好ましくは、前記解析は遺伝子の変異の検出又は遺伝子の発現量の異常の検出である。
【００１１】
本発明のさらに別の側面によれば、ＲＧＣ３２タンパク質に対する抗体又はその断片を用いて検体試料中のＲＧＣ３２タンパク質を解析する工程を含む、癌の診断方法が提供される。
好ましくは、前記解析はタンパク質の発現量の異常の検出である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、新たに癌抑制機能を見出したＲＧＣ３２遺伝子又は該遺伝子がコードするＲＧＣ３２タンパク質を含有する癌抑制剤が提供される。これらの薬剤は癌の個別性に基づく治療や癌の予後の改善などの臨床上の観点から、あるいは癌の基礎的研究の観点から非常に有用である。また、ＲＧＣ３２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現量を測定すること、ゲノムＤＮＡ上でのＲＧＣ３２遺伝子の存在を確認すること、あるいはＲＧＣ３２タンパク質量を測定することにより、脳腫瘍患者の病理学的悪性度を予測することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施態様及び実施方法について詳細に説明する。
（１）本発明の癌抑制剤
本発明の一態様によれば、本発明の癌抑制剤は有効成分としてＲＧＣ３２遺伝子又はその相同遺伝子を含む。本発明のもう一つの態様によれば、本発明の癌抑制剤は有効成分としてＲＧＣ３２タンパク質又はその相同タンパク質を含む。
【００１４】
ＲＧＣ３２遺伝子の塩基配列及びＲＧＣ３２タンパク質のアミノ酸配列は既に知られており（Ｂａｄｅａ、Ｔ．Ｃ．、 Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ、Ｆ．Ｉ．、 Ｓｏａｎｅ、Ｌ．、 Ｓｈｉｎ、Ｍ．Ｌ． ａｎｄ Ｒｕｓ、Ｈ． １９９８）、ＲＧＣ３２遺伝子の塩基配列はＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのデータベースにＡＦ１６９６３番にて、またＲＧＣ３２タンパク質のアミノ酸配列は同データベースにＮＰ０５４７７８番にて登録されている。ＲＧＣ３２遺伝子の塩基配列は配列番号１に記載する通りであり、ＲＧＣ３２タンパク質は配列番号１の塩基配列の１４７番目から５００番目までの領域をコードし、そのアミノ酸配列は配列番号２に示される通りである。
【００１５】
本明細書において「ＲＧＣ３２遺伝子」というのは、上記塩基配列で特定されるヒト由来の遺伝子をいい、「ＲＧＣ３２タンパク質」というのは、該ＲＧＣ３２遺伝子がコードし、上記アミノ酸配列で特定されるタンパク質をいう。
【００１６】
ＲＧＣ３２遺伝子は、当業者に公知の技術を用いて培養細胞などから取得したｃＤＮＡであってもよいし、又は本明細書の配列番号１に記載の塩基配列に基づいてＰＣＲ法などにより化学的に合成したものでもよい。ＰＣＲ法により配列番号１に記載した塩基配列を有するＤＮＡを取得する場合、ヒトの染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを使用してＰＣＲを行う。ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片は大腸菌などの宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００１７】
上記のブローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ、２nd Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ．、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）などに記載された方法に準じて行うことができる。
【００１８】
本発明において、「ＲＧＣ３２遺伝子の相同遺伝子」とは、配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加又は置換されている塩基配列であって、癌抑制活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子；又は配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、癌抑制活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子いう。また、ＲＧＣ３２遺伝子の相同遺伝子にはＲＧＣ３２遺伝子の断片も含まれる。
【００１９】
上記の「配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加又は置換されている塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から６０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個程度を意味する。
【００２０】
上記の「癌抑制活性」の程度は特に限定はされないが、好ましくはＲＧＣ３２タンパク質が有する癌抑制活性と実質的に同等又はそれ以上の癌抑制活性をいう（以下、本明細書における「癌抑制活性」は同じ意味を示す）。
【００２１】
従って、「ＲＧＣ３２遺伝子の相同遺伝子」は上記に定義される構造と機能を有する限り、由来は問わず、ヒト以外の哺乳動物由来であってもよいし、ヒトなどの哺乳動物由来の遺伝子に対して人工的に変異を導入したものであってもよい。ただし、該遺伝子を後記のごとく癌抑制剤に使用する場合は臨床上の安全性の観点からヒト由来のものが好ましい。
【００２２】
上記の「配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加又は置換されている塩基配列であって、癌抑制活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子」は、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。具体的には、上記遺伝子は配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡを利用し、これらＤＮＡに変異を導入することにより取得することができる。例えば、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法などを用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ、２nd Ｅｄ．、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ．、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）などに記載の方法に準じて行うことができる。
【００２３】
上記の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニー又はプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡなどを挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ、２nd Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ．、１９８９などに記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２４】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００２５】
上記の「配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、癌抑制活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子」は、上述の通り、一定のハイブリダイゼーション条件下でコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法などを行うことにより得ることができる。
【００２６】
本発明において、「ＲＧＣ３２タンパク質の相同タンパク質」とは、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は挿入したアミノ酸配列であって、癌抑制活性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質；又は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、癌抑制活性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をいう。
【００２７】
上記した「配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は挿入したアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００２８】
上記した「配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、該アミノ酸配列と配列番号２に記載のアミノ酸配列との相同性が少なくとも７０％以上であり、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上であることを意味する。
【００２９】
ＲＧＣ３２タンパク質は、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。比較的容易な操作でかつ大量に製造できるという点では、組み換えタンパク質が好ましい。
【００３０】
天然由来のタンパク質は、該タンパク質を発現している細胞又は組織からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせて単離することができる。化学合成タンパク質は、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法に従って合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。組み換えタンパク質は、該タンパク質をコードする塩基配列（例えば、配列番号１に記載の塩基配列）を有するＤＮＡを好適な発現系に導入することにより生産することができる。
【００３１】
なお、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換又は挿入したアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の一例示す配列番号１に記載の塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜製造又は入手することができる。
【００３２】
本発明の癌抑制剤の好ましい態様としては、有効成分として上記のＲＧＣ３２遺伝子又はその相同遺伝子をベクターに組み込んだ組換えベクターを含む。ベクターとしてはウイルスベクター又は動物細胞発現用ベクター、好ましくはウイルスベクターが用いられる。
【００３３】
ウイルスベクターとしてはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。中でも、レトロウイルスベクターは、細胞に感染後、ウイルスゲノムが宿主染色体に組み込まれ、ベクターに組み込んだ外来遺伝子を安定にかつ長期的に発現させる可能であるからレトロウイルスベクターを使用することが特に望ましい。
【００３４】
動物細胞発現用ベクターとしては例えばｐＣＸＮ２（Ｇｅｎｅ、１０８、１９３−２００、１９９１）、ＰＡＧＥ２０７（特開平６−４６８４１号公報）又はその改変体などを用いることができる。
【００３５】
上記組換えベクターは適当な宿主に導入して形質転換し、得られた形質転換体を培養することによって生産することができる。組換えベクターがウイルスベクターの場合、これを導入する宿主としてはウイルス生産能を有する動物細胞が用いられ、例えば、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞などが挙げられる。レトロウイルスベクターの宿主としては、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＭＬＶなどが、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターの宿主としては、ヒト胎児腎臓由来の２９３細胞などが用いられる。ウイルスベクターの動物細胞への導入はリン酸カルシウム法などで行うことができる。また、組換えベクターが動物細胞発現用ベクターの場合、これを導入する宿主としては大腸菌Ｋ１２株、ＨＢ１０１株、ＤＨ５α株などを使用でき、大腸菌の形質転換は当業者に公知である。
【００３６】
得られた形質転換体はそれぞれに適した培地、培養条件により培養する。例えば、大腸菌の形質転換体の培養は、生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他を含有するｐＨ５〜８程度の液体培地を用いて行うことができる。培養は通常１５〜４３℃で約８〜２４時間程度行う。この場合、目的とする組み換えベクターは、培養終了後、通常のＤＮＡ単離精製法により得ることができる。
【００３７】
また、動物細胞の形質転換体の培養は、例えば約５〜２０％のウシ胎児血清を含む１９９培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地などの培地を用いて行うことができる。培地のｐＨは約６〜８が好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１８〜６０時間行う。この場合、目的とする組み換えベクターは、それを含有するウイルス粒子が培養上清中に放出されるので、ウイルス粒子の濃縮、精製を塩化セシウム遠心法、ポリエチレングリコール沈澱法、フィルター濃縮法などにより得ることができる。
【００３８】
本発明の癌抑制剤のうち、有効成分としてＲＧＣ３２遺伝子又はその相同遺伝子を含む癌抑制剤（以下、遺伝子治療剤という）は、有効成分であるＲＧＣ３２遺伝子又はその相同遺伝子を遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合することにより製造することができる。また、ＲＧＣ３２遺伝子又はその相同遺伝子をウイルスベクターに組み込んだ場合は、組換えベクターを含有するウイルス粒子を調製し、これを遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合する。
【００３９】
上記基剤としては、通常注射剤に用いる基剤を使用することができ、例えば、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物などの塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコースなどの溶液、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液などが挙げられる。あるいはまた、当業者に既知の常法に従って、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、植物油、界面活性剤などの助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製することもできる。これらの注射剤は、粉末化、凍結乾燥などの操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。
【００４０】
また、本発明の遺伝子治療剤は、常法により調製されたリポソームの懸濁液にＲＧＣ３２遺伝子を添加し凍結した後融解することにより製造することもできる。リポソームを調製する方法は、薄膜振とう法、超音波法、逆相蒸発法、界面活性剤除去法などがある。リポソームの懸濁液は超音波処理した後、遺伝子を添加するのが遺伝子の封入効率を向上させる上で好ましい。遺伝子を封入したリポソームはそのまま、又は水、生理食塩水などに懸濁して静脈投与することができる。
【００４１】
上記遺伝子治療剤の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内などの全身投与でもよいし、あるいは癌原病巣又は予想転移部位に対して、局所注射又は経口投与などの局所投与を行ってもよい。さらに、遺伝子治療剤の投与にあたっては、カテーテル技術、遺伝子導入技術、又は外科的手術などと組み合わせた投与形態をとることもできる。
【００４２】
上記遺伝子治療剤の投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日当たり組み換え遺伝子の重量として１μｇ／ｋｇ体重から１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。
【００４３】
また、本発明の癌抑制剤のうち、有効成分としてＲＧＣ３２タンパク質又はその相同タンパク質を含む癌抑制剤（以下、タンパク質製剤という）は、有効成分であるＲＧＣ３２タンパク質又はその相同タンパク質に製剤用添加物（例えば、担体、賦形剤など）を含む医薬組成物の形態で提供される。
【００４４】
上記タンパク質製剤の形態は特に限定されず、経口投与のための製剤としては例えば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤などが挙げられ、非経口投与のための製剤としては例えば、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、経粘膜吸収剤、経皮吸収剤などが挙げられる。
【００４５】
上記タンパク質製剤の投与経路は特に限定されず、経口投与又は非経口投与（例えば、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与などへの粘膜投与、又は吸入投与など）の何れでもよい。
【００４６】
上記タンパク質治療剤の投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日あたり０．００１μｇ／ｋｇ体重から１０００μｇ／ｋｇ体重程度の範囲であり、好ましくは０．００１μｇ／ｋｇ体重から１００μｇ／ｋｇ体重程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。
【００４７】
上記癌抑制剤（遺伝子治療剤及びタンパク質製剤の両形態を含む）は、その有効量をヒトを含む哺乳動物に投与することによって癌を抑制するのに使用することができる。上記癌抑制剤はまたその予防及び／又は治療有効量をヒトを含む哺乳動物に投与することによって癌の予防及び／又は治療をするのに使用することができる。
【００４８】
本明細書でいう「癌抑制」とは、癌の発生又は転移・着床を防止するという予防的作用、ならびに癌細胞の増殖を抑制したり、癌を縮小することによって癌の進行を阻止したり、症状を改善させるという治療的作用の両方を含む最も広い意味を有し、いかなる場合においても限定的に解釈されるものではない。
【００４９】
本発明の癌抑制剤の適用対象となる癌の具体例としては、例えば悪性黒色腫、悪性リンパ腫、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、尿管腫瘍、胆嚢癌、胆管癌、胆道癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、睾丸腫瘍、上顎癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、甲状腺癌、脳腫瘍、カポジ肉腫、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽細胞腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚癌、基底細胞癌、皮膚付属器癌、皮膚転移癌、皮膚黒色腫などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、上記のうち特に好ましい適用対象となる癌は、脳腫瘍である。
【００５０】
（２）ＲＧＣ３２遺伝子を用いた癌の診断方法
本発明の癌の診断方法としては、癌の悪性度の診断方法、本発明の癌抑制剤の適用対象となる癌を選別するための診断方法などを挙げることができる。本発明の癌の診断方法は、ＲＧＣ３２遺伝子の全部又はその一部を含むＤＮＡ又はＲＮＡを用いて検体試料中のＲＧＣ３２遺伝子を解析する工程を含む。
【００５１】
ここで、ＲＧＣ３２遺伝子の一部とは、配列番号１に記載するＲＧＣ３２遺伝子の塩基配列のうち、例えば約１０〜３０個の連続する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを意味する。検体試料としては、腫瘍が疑われる組織切片、血液、リンパ液、喀痰、肺洗浄液、尿、便、組織培養上清などを用いることができる。
【００５２】
上記の「癌抑制剤の適用対象となる癌を選別するための検出」とは組織等における本発明における癌抑制剤が有効に作用する癌の存在の有無を知ることをいう。
【００５３】
癌の診断は、ＲＧＣ３２遺伝子の全部又はその一部を含むＤＮＡ又はＲＮＡをプライマー又はプローブとして用いて検体試料中のＲＧＣ３２遺伝子を解析することにより行う。ここで「ＲＧＣ３２遺伝子を解析する」とは、具体的にはゲノムＤＮＡの当該遺伝子の欠失の検出又は遺伝子の発現量の異常を検出することをいう。
【００５４】
遺伝子の変異の検出は、上記ＤＮＡ又はＲＮＡをプライマーとして用いる場合では、例えば選択した２種の配列のプライマーによりＰＣＲ法で検体試料より調製したＤＮＡの部分配列を増幅させ、その存在の有無を確認する、もしくはその増幅物をそのまま、あるいは各種プラスミドベクターに組み換えた後配列を確認することにより可能である。
【００５５】
一方、遺伝子の発現量の異常の検出は、上記ＲＮＡ配列を含むプローブを用いてノーザンハイブリダイゼーション法又はＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によって行うことができる。
【００５６】
（３）ＲＧＣ３２タンパク質抗体又はその断片を用いた癌の診断方法
本発明の癌の診断方法は、ＲＧＣ３２タンパク質に対する抗体又はその断片を用いて検体試料中のＲＧＣ３２タンパク質の量を解析する工程を含む。
【００５７】
本方法に用いるＲＧＣ３２タンパク質に対する抗体（以下、ＲＧＣ３２抗体という）は、ＲＧＣ３２タンパク質の全部又は一部を抗原として、通常の方法で作成することができる。ＲＧＣ３２タンパク質の一部とは、配列番号２に記載するＲＧＣ３２タンパク質のアミノ酸配列のうち、例えば連続する少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは、少なくとも約１１〜２０個のアミノ酸からなるポリペプチドをいう。抗原とするＲＧＣ３２タンパク質の全部又は一部の調製法は生物学的手法、化学合成手法いずれでもよい。
【００５８】
ポリクローナル抗体は、例えば上記抗原をマウス、モルモット、ウサギなどの動物の皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内などに複数回接種し十分に免疫した後、該動物から採血、血清分離して作製することができる。モノクローナル抗体は、例えば上記抗原で免疫したマウスの脾細胞と市販のマウスミエローマ細胞との細胞融合により得られるハイブリドーマを作成後、該ハイブリドーマ培養上清、又は該ハイブリドーマ投与マウス腹水から作成することができる。
【００５９】
上記のようにして調製したＲＧＣ３２タンパク質抗体又はその断片を用いることによって検体試料中のＲＧＣ３２タンパク質の発現量を知ることができる。測定には、例えばイムノブロット法、酵素抗体法（ＥＩＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光抗体法、免疫細胞染色などの免疫学的方法、又はウェスタンブロット法などが利用できる。ここで、ＲＧＣ３２タンパク質抗体の断片とは当該抗体の一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）などをいう。また、検体試料としては、腫瘍が疑われる組織切片、血液、リンパ液、喀痰、肺洗浄液、尿、便、組織培養上清などを用いることができる。測定した検体試料中のＲＧＣ３２タンパク質の発現量が低い場合は、検体とした組織や細胞においてＲＧＣ３２遺伝子の発現が抑制されていることになり、本発明の癌抑制剤の適用対象となる癌を選別することができる。
【００６０】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
【００６１】
（１）実験材料
神経膠腫由来細胞株はＡ−１７２、ＡＭ−３８、Ｂｅｃｋｅｒ、ＧＢ−１、ＫＡＬＳ−１、ＫＩＮＧＳ−１、ＫＮＳ−４２、ＫＮＳ−６０、ＫＮＳ−８１、ＫＮＳ−８９、ＫＳ−１、Ｍａｒｃｕｓ、ＮＭＣ−Ｇ１、ｎｏ．１０、ｎｏ．１１、ＳＦ１２６、Ｔ９８Ｇ、Ｕ−２５１ ＭＧ、ＹＨ−１３、ＹＫＧ−１を医薬基盤研究所（ＪＣＲＢ）より入手し用いた。Ｕ−３７３ ＭＧ、Ｕ−８７ ＭＧ、ＳａＯＳ２はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より入手した。子宮頸癌のＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞はＣｌｏｎｔｅｃｈ社より入手した。大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６（ｐ５３＋／＋）とＨＣＴ１１６（ｐ５３−／−）はＤｒ．Ｂｅｒｔ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎの好意により譲渡された。これら細胞株を１０％胎児牛血清、１００ ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ペニシリン、１００ μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンの存在下Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）にて培養を行った。臨床検体由来の３５人からの星細胞腫サンプルは東京医科歯科大学病院・脳神経外科部門から入手し、各患者の同意をもってかつ各組織の倫理委員会の承認を得て使用した。ヘマトキシリン−エオシン染色による病期分類は世界保健機関（ＷＨＯ）の基準に従った。３５サンプルの癌腫において８種がｌｏｗ−ｇｒａｄｅ ｄｉｆｆｕｓｅ ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ（Ｇｒａｄｅ ＩＩ）、８種がａｎａｐｌａｓｔｉｃ ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ（Ｇｒａｄｅ ＩＩＩ）さらに１９種がｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ（ＧＢＭ 、Ｇｒａｄｅ ＩＶ）と判定された。表１に神経膠腫由来細胞株の組織情報をまとめた。
【００６２】
【表１】
【００６３】
（２）発現解析マイクロアレイ法による神経膠腫由来細胞での低発現遺伝子の分離
アレイＣＧＨ法にて、ＭＣＧ Ｃａｎｃｅｒ Ａｒｒａｙ−８００（Ｓａｉｇｕｓａ Ｋ．、ｅｔ ａｌ．、 Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．９６、６７６、２００５）を用いて上記２２種の神経膠腫由来細胞におけるDNAの増幅・欠失遺伝子のスクリーニングが報告されている。この際染色体１３番の長腕に高頻度のヘミ欠失が観察された。そこで正常ヒト脳およびＭａｒｃｕｓ細胞由来のＲＮＡを用いて、ヒトの３０，０００遺伝子の発現量を観察可能なＡｃｅＧｅｎｅ Ｈｕｍａｎ ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐ ３０Ｋ（ＤＮＡチップ研究所）によりメッセンジャーＲＮＡの発現解析を行い、染色体１３番長腕中の低発現遺伝子の探索を行った。Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８プライマーを用いて、アミノアリル−ｄＵＴＰ（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．）を取り込ませた相補鎖ＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ）を作製後、アミノアリル基に反応性のＣｙ３（シアニン３、Ｍａｒｃｕｓ）、Ｃｙ５（シアニン５、正常ヒト脳）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とカップリング反応を行い標識を行った。ハイブリダイゼーション後に、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてシグナルを測定後、ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ６．０ソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）にて解析した。表２には、染色体１３番の長腕に存在する遺伝子でＭａｒｃｕｓ細胞で正常ヒト脳に比べ発現の低下した遺伝子を示した。
【００６４】
【表２】
【００６５】
染色体１３番長腕のＲＧＣ３２を含む遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現ＲＧＣ３２遺伝子および発現解析マイクロアレイ法により染色体１３番の長腕で発現量低下が観察されたＭＲＰ６３、ＡＬＯＸ５ＡＰ、ＲＧＣ３２、Ｆ１０遺伝子についてメッセンジャーＲＮＡの発現量を測定するため正常脳（Ｂｒａｉｎ）をコントロールとし、神経膠腫由来細胞２２株についてＲＴ−ＰＣＲを行った（図１）。ＲＴ−ＰＣＲの発現量のコントロールとして発現量が細胞種、条件で変化しにくいことで知られるＧＡＰＤＨを用いた。ＲＧＣ３２遺伝子およびＭＲＰ６３、ＡＬＯＸ５ＡＰ、Ｆ１０遺伝子について発現解析を行ったが、特にＲＧＣ３２遺伝子が２２株中２１株で発現の著しい低下が観察された。
【００６６】
３５種の星細胞腫（ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）サンプルについて、病理学的な分類を行い、コントロールとしてＧＡＰＤＨを用いＲＧＣ３２遺伝子の定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。８種のｌｏｗ−ｇｒａｄｅ ｄｉｆｆｕｓｅ ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ（Ｇｒａｄｅ ＩＩ）、８種のａｎａｐｌａｓｔｉｃ ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ（Ｇｒａｄｅ ＩＩＩ）１９種のｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ（ＧＢＭ 、Ｇｒａｄｅ ＩＶ）のそれぞれについてＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを行った結果、Ｇｒａｄｅ ＩＩとＧｒａｄｅ ＩＶ間で有意にＲＧＣ３２遺伝子の発現と病理学的悪性度の間に逆相関が見られた（図２Ａ、ｐ＝０．００３）。また、代表的な癌抑制遺伝子であるｐ５３遺伝子の点突然変異の有無とＲＧＣ３２遺伝子の発現について病理学的な分類毎に比較を行った（図２Ｂ）。その結果、ｐ５３遺伝子の点突然変異はＧｒａｄｅを問わず存在し、有意差は無いものの、ＲＧＣ３２遺伝子の発現量はｐ５３遺伝子の点突然変異があるもので発現量が低下する傾向が観察された。
【００６７】
（３）ｐ５３遺伝子を強制発現させた細胞でのＲＧＣ３２遺伝子の発現
ｐ５３遺伝子が機能しないことで知られるＵ−３７３ ＭＧ細胞株を用いて、ヒトｐ５３遺伝子を発現するアデノウィルスを感染させ、ＲＧＣ３２遺伝子の発現を観察した。ヒトβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（Ａｄ−ｌａｃＺ）をコントロールとし、ｐ５３（Ａｄ−ｐ５３）の両ウィルスを別々の細胞に感染後、ＲＧＣ３２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲにて測定した（図３Ａ）。コントロールとしてＧＡＰＤＨを用いた。ｐ２１遺伝子はｐ５３遺伝子の発現により発現上昇が知られている遺伝子であるが、ＲＧＣ３２遺伝子もｐ２１遺伝子と同様にｐ５３遺伝子のアデノウィルス感染後に発現上昇することが確認された。一方、ヒトβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（Ａｄ−ｌａｃＺ）を感染させた細胞では、ｐ２１、ｐ５３遺伝子共に発現上昇が認められなかった。
【００６８】
（４）ＤＮＡ細胞でのＲＧＣ３２遺伝子、タンパク質の発現
内在性のｐ５３遺伝子が存在する大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６（ｐ５３＋／＋）と内在性のｐ５３遺伝子が存在しないＨＣＴ１１６（ｐ５３−／−）両者を用い、ＤＮＡ損傷を惹起する抗癌剤アドリアマイシン（ＡＤＲ）を細胞に１μｇ／ｍｌ濃度で添加後、ｐ２１、ｐ５３タンパク質の発現量をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法（上段）ならびにｐ２１、ＲＧＣ３２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲ法にて測定した（図３Ｂ）。細胞にＤＮＡ損傷を与えることによりｐ５３、ｐ２１遺伝子両者が発現上昇することは広く知られているが、正常なｐ５３タンパク質を有するＨＣＴ１１６細胞（ｐ５３＋／＋）のみでそのタンパク質の誘導が観察された。一方、ｐ２１、ＲＧＣ３２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現もＡＤＲ添加後正常なｐ５３タンパク質を有するＨＣＴ１１６細胞（ｐ５３＋／＋）のみでそのメッセンジャーＲＮＡの発現が上昇することが観察された。この結果から、ＲＧＣ３２遺伝子は正常なｐ５３タンパク質を介して発現上昇することが確認された。
【００６９】
（５）ＲＧＣ３２遺伝子ＤＮＡ上のｐ５３タンパク質の結合サイト
ＲＧＣ３２遺伝子のゲノムＤＮＡ上の塩基配列を確認した。２０塩基対程度からなるｐ５３タンパク質の結合サイトの存在を調査したところ、８０％以上の相同性（ｅｌ−Ｄｅｉｒｙ ＷＳ、ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１．４５．１９９２）で１０ヶ所のｐ５３タンパク質の結合サイトを確認した（図３Ｃ）。ＲＧＣ３２−ＲＥ１からＲＧＣ３２−ＲＥ１０と命名した。
【００７０】
（６）レポーターアッセイによるＲＧＣ３２遺伝子のプロモーター領域の転写促進効果の測定
ＲＧＣ３２遺伝子のゲノムＤＮＡ上の１０ヶ所のｐ５３タンパク質の結合サイトＲＧＣ３２−ＲＥ１からＲＧＣ３２−ＲＥ１０それぞれについて、ホタルルシフェラーゼ酵素による発光物を測定する方法にて、プロモーター活性を確認した。ｐ５３遺伝子を持たないＳａＯＳ２細胞に、ｐＧＬ３ベクター（プロメガ）を用いルシフェラーゼ遺伝子を下流域に配置しプロモーター解析領域としてＲＧＣ３２−ＲＥ１からＲＧＣ３２−ＲＥ１０含むコンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）について、野生型ｐ５３タンパク質を発現するベクター（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ｐ５３）と コントロールとしてｐ５３変異体タンパク質を発現するベクターとｐ５３遺伝子無しのベクター（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ｐ５３ＭｕｔおよびｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ｍｏｃｋ）を組み合わせ酵素活性を測定した。その結果、ＲＧＣ３２−ＲＥ２のみが野生型ｐ５３タンパク質が発現した際のみルシフェラーゼ酵素活性が上昇した（データは示していない）。そこで、ＲＧＣ３２−ＲＥ２を合成オリゴヌクレオチド５’−ＡＧＧＣｇＡＧＴＴＴ−ａａｇ−ｃＡＧＣＴＴＧＴＣＣ −３’を１回または繰り返して２回連結して合成したものをｐＧＬ３ベクターのプロモーターとして挿入したものを作製しｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ｐ５３、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ｐ５３Ｍｕｔ（Ｒ２７３Ｈ）、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ｍｏｃｋそれぞれと共にＳａＯＳ２細胞に遺伝子導入３６時間後、ルシフェラーゼ酵素活性を測定した（図４）。ｐ２１遺伝子由来のｐ５３ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ（ＣＢＳ）が野生型ｐ５３タンパク質を発現するベクターの存在下ルシフェラーゼ酵素活性が上昇するのと同様に、ＲＧＣ３２−ＲＥ２、特に２回連結して合成したＲＧＣ３２−ＲＥ２ｘ２でコントロールに対し６０倍高い下ルシフェラーゼ酵素活性を示し、この配列がｐ５３タンパク質依存性にプロモーター領域として働くことが確認された。
【００７１】
（７）Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ（ＣｈＩＰ）によるプロモーターＤＮＡの存在確認
ＣｈＩＰアッセイはＣｈＩＰ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いた。２ｘ１０6個のＨＣＴ１１６（ｐ５３＋／＋）とＨＣＴ１１６（ｐ５３−／−）を１０ｃｍディッシュに蒔き、終濃度１μｇ／ｍｌのＡＤＲを添加２４時間後に１％のホルムアミドを１０分間処理後、細胞をｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）を含む２００μｌのＳＤＳ細胞溶解バッファーに回収した。超音波処理を行い、ＤＮＡ長が２００から１０００ｂｐとなるように破砕した。上清をサケ精子ＤＮＡ／ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇａｒｏｓｅにて処理し、抗ｐ５３抗体（Ａｂ−６；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）またはコントロールとして抗ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２；Ｓｉｇｍａ）を用い４°Ｃにて１６時間免疫沈降を行った。沈殿物を５０μｌのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡに溶解し１μｌを鋳型としてＰＣＲにてそれぞれのｐ５３の結合サイトを検出した。ＨＣＴ１１６（ｐ５３＋／＋）のＡＤＲ処理後の、抗ｐ５３抗体にて免疫沈降したもののみにプロモーター配列の存在が観察された（図５、ｐ２１、ＲＧＣ３２−ＲＥ２）。このことから細胞内で実際にＤＮＡ損傷応答時にｐ５３タンパク質を介したプロモーター配列への応答がＲＧＣ３２−ＲＥ２上にも観察された。
【００７２】
（８）神経膠腫細胞へのＲＧＣ３２遺伝子導入による癌原性の低下
神経膠腫細胞へのＲＧＣ３２遺伝子導入による細胞増殖活性に及ぼす影響を、足場依存性条件下でコロニー形成能に変化が見られるかを検討した。先ず、挿入遺伝子のアミノＮ末端にｍｙｃペプチドを付加したｐＣＭＶベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にＲＧＣ３２完全長ｃＤＮＡを挿入したものおよびコントロールとして挿入遺伝子なしのものを作製した（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ＲＧＣ３２、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−Ｍｏｃｋ）。これを、ＲＧＣ３２遺伝子の発現がみられないＵ−８７ ＭＧ細胞に導入した。遺伝子導入４８時間後その細胞溶解液を用いＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法にてｍｙｃタンパク質の発現を観察したところ、予想どおりｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ＲＧＣ３２を導入した細胞にのみｐＲＧＣ３２−Ｍｙｃ融合タンパク質の存在を確認した（図６、Ａ上）。別途ディッシュにＧ４１８存在下３週間培養したものを固定、クリスタルバイオレットにより染色しコロニーを計測した。Ｍｏｃｋに比べ、ＲＧＣ３２遺伝子を発現させることで有意にコロニー数を低下させることが確認された（図６、Ａ下）。
【００７３】
（９）神経膠腫細胞へのＲＧＣ３２遺伝子導入による増殖能の低下
細胞へのＲＧＣ３２遺伝子導入による細胞増殖活性に及ぼす影響について、増殖速度に変化が見られるかを検討した。ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ＲＧＣ３２とｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−Ｍｏｃｋを、ＲＧＣ３２遺伝子の発現がみられないＵ−８７ ＭＧ細胞に導入した。Ｇ４１８存在下３週間培養し構成的にｍｙｃ−ＲＧＣ３２を発現する細胞、および陰性コントロール細胞を樹立した。これら細胞についてその増殖速度について、テトラゾリウム塩（ＷＳＴ−１）を利用した生細胞中のミトコンドリア脱水素酵素によるホルマザン色素への変換にて色素で細胞数をモニター（同仁化学研究所：ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８）した（図６Ｂ）。９６ウェルプレートにて１ｘ１０3個を蒔き培養した。コントロール細胞（ｅｍｐｔｙ）に比しＲＧＣ３２タンパクが発現することでクローン１、２共に３日間の培養で明らかに細胞増殖が低下した。この結果から、ＲＧＣ３２タンパクは細胞内に発現することで細胞増殖を抑制する働きのあることが判明した。これまで知られている癌抑制遺伝子タンパクが細胞増殖を抑制したり、細胞死を誘導することにより生体を癌から守っていることから、ＲＧＣ３２タンパクの機能として癌抑制遺伝子産物としての働きがあることが示された。
【００７４】
（１０）一過性発現細胞でのＲＧＣ３２タンパク質集積部位の解析
Ｍｙｃ抗原を有するＲＧＣ３２タンパク質を発現させるためｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ＲＧＣ３２を８ウェルスライドグラスにて１０4個のＵ−８７ ＭＧ細胞に導入後、２４時間後に冷アセトン−メタノール（１：１）にて固定した。ブロッキング液（３％ＢＳＡ入りｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）と抗Ｍｙｃ抗体（１：２００）および抗β−ｔｕｂｕｌｉｎ抗体（１：２００、Ｓｉｇｍａ）にて２時間反応させた。その後１時間ＦＩＴＣ標識羊由来抗マウスＩｇＧ（１：４００、ＭＢＬ）およびＡｌｅｘａ ５９４標識羊由来抗ウサギＩｇＧ（１：１０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を反応させた。細胞核を染めるための対比染色のため４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）による染色を行い、ＥＣＬＩＰＳＥ Ｅ８００蛍光顕微鏡（ニコン）にて観察した（図７）。細胞周期上、分裂期（Ｍ期）を除く間期（ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ）に一過性発現したＲＧＣ３２タンパク質は細胞質上に広く分布し、特に核膜での分布が顕著に観察された。Ｍ期には、前期（ｐｒｏｐｈａｓｅ）で中心体（ｃｅｎｔｒｏｓｏｍｅ）への分布を観察し、前中期（ｐｒｏｍｅｔａｐｈａｓｅ）から中期（ｍｅｔａｐｈａｓｅ）に、最大染色強度を観察した。終期（ｔｅｌｏｐｈａｓｅ）と細胞質分裂（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ）の細胞では、中心体に低いレベルのＲＧＣ３２タンパク質が観察された。このことからＲＧＣ３２タンパク質は主として中心体において機能するタンパクであることが判明した。
【００７５】
（１１）ＲＧＣ３２タンパク質の細胞周期に与える影響の観察
ＲＧＣ３２ ｃＤＮＡをｐＴＲＥ２ｈｙｇにＧｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＧＦＰ）遺伝子とともに挿入した発現ベクター（ｐＴＲＥ２−ＧＦＰ−ＲＧＣ３２）を構築しＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を樹立した。同時にコントロールとして、ＧＦＰのみを有するベクター（ｐＴＲＥ２−ＧＦＰ）を用いた細胞も樹立した。ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ（Ｄｏｘ）添加後細胞溶解液を用い抗ＧＦＰ抗体（ＭＢＬ）にてＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 法でＧＦＰタンパクの存在を確認した。これら細胞において１０ｃｍ培養皿にて１０4個の細胞を播き２４時間後にＤｏｘ（１０μｇ／ｍｌ）を添加後さらに２４時間培養した。細胞を７０％冷エタノールにて固定後、ＲＮａｓｅ Ａ処理とｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ染色を行いｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ；ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ ＨＧ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））にて蛍光を測定し、ＢＤ ＣｅｌｌＱｕｅｓｔTM Ｐｒｏ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて解析した（図８）。その結果、Ｇ２／Ｍ期の細胞含量がコントロール（１６．５３％）に比べＧＦＰ−ＲＧＣ３２発現細胞で高い（２４．８７％）ことが判明した。このことからＲＧＣ３２タンパク質は細胞周期に対してＧ２／Ｍ期細胞を増加させる効果があることが示された。
【００７６】
（１２）ＲＧＣ３２タンパク質発現によるＧ２／Ｍ期の延長効果
対数増殖期の２種のＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞（ＧＦＰ−ＲＧＣ３２、ＧＦＰ）を１０ｃｍ培養皿にて１０6個の細胞を播き２４時間後に終濃度１０ｍＭのｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ）を５％Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）入りの培養液にて３７°Ｃで１５時間培養を行った。ＰＢＳにて３回洗浄後通常の培養液にて９時間培養し、さらに再度終濃度１０ｍＭのｔｈｙｍｉｄｉｎｅ存在下１５時間培養しＰＢＳにて３回洗浄後、通常の培養液中２４時間培養までＤｏｘ（１０μｇ／ｍｌ）存在下での経時時間を変えた細胞を用意した。これらをＦＡＣＳにて解析した（図９）。その結果、ＧＦＰに比しＧＦＰ−ＲＧＣ３２ではＤｏｘ添加後１０時間以降でＧ２／Ｍ期の細胞含量が高いことから、ＲＧＣ３２タンパク質の発現によりＧ２／Ｍ期の延長が起こったことを示す。
【００７７】
（１３）ＲＧＣ３２タンパク質のＰｌｋ１リン酸化酵素との相互作用の検証
ＲＧＣ３２タンパク質の発現によりＧ２／Ｍ期からＧ１期への移行が遅れ、Ｍ期に中心体に分布を示したことから有糸分裂のタンパクリン酸化酵素と結合するかについて検討した。まずＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞（ＧＦＰ−ＲＧＣ３２、ＧＦＰ）のＤｏｘ処理時間別の細胞溶解液をｐｒｏｔｅａｓｅ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ存在下ＮＰ−４０バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、２ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、 １００ｍＭ ＮａＦ、１０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｃａｈｙｄｒａｔｅ）にて溶解し、定法にて抗ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ １（Ｐｌｋ１）抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、抗ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ）、抗Ａｕｒｏｒａ−Ｂキナーゼ抗体（Ａｂｃａｍ）、抗Ａｕｒｏｒａ−Ａキナーゼ抗体（佐谷秀行氏より譲渡）、コントロールとして抗βアクチン抗体にてＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法にて解析した（図１０）。その結果、Ｐｌｋ１の分解のみが遅延しており、ＲＧＣ３２タンパク質がそれを遅らせＧ２／Ｍ期を延長させていることが示された。さらにＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞（ＧＦＰ−ＲＧＣ３２、ＧＦＰ）でＤｏｘ添加２４時間後の細胞をＮＰ−４０バッファーにて溶解後抗ＧＦＰ抗体にて４°Ｃ、２時間処理後Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅで４°Ｃで１時間処理した。これをＮＰ−４０バッファーで５回洗浄し、抗Ｐｌｋ１抗体にてＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法にて解析した（図１１）。その結果、ＧＦＰ−ＲＧＣ３２でのみ免疫沈降したＧＦＰに結合するＲＧＣ３２タンパク質に起因したＰｌｋ１の結合が観察された。さらにＰｌｋ１のタンパクリン酸化酵素活性に与えるＲＧＣ３２タンパク質の影響について検討した。全長ＲＧＣ３２のｃＤＮＡをｐＥＴ−２３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入（ｐＥＴ−２３ｄ−ＲＧＣ３２）し組み換えＨｉｓ６結合ＲＧＣ３２タンパク質をＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）大腸菌にて産生、Ｎｉ−ＮＴＡ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅｓｉｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い精製後ＰＢＳにて透析した。ヒト組み換えＰｌｋ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と組み換えＨｉｓ６結合ＲＧＣ３２タンパク質とを脱リン酸化α−ｃａｓｅｉｎ （Ｓｉｇｍａ）存在下４°Ｃ、３０分間Ｒａｆ バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ、 ２５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）中で［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを加え保温した。２μｌの６ｘＳＤＳサンプルバッファーを加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後オートラジオグラフィーにてシグナルを検出した（図１２）。Ｐｌｋ１、ＲＧＣ３２のＰｌｋ１によるリン酸化が検出される他（ＲＧＣ３２中のＴｈｒ８２とＴｈｒ１１３にＰｌｋ１によるリン酸化標的配列が存在）、Ｐｌｋ１によるα−ｃａｓｅｉｎのリン酸化をＲＧＣ３２タンパク質が阻害することが確認された。以上のことから、ＲＧＣ３２タンパク質はＰｌｋ１と結合しリン酸化酵素活性を抑制すると共にＰｌｋ１の分解を遅延させることにより、Ｇ２／Ｍ期を延長させていることが確認された。
【００７８】
（１４）結論
（ａ）アレイＣＧＨ法によるスクリーニングから、２２種の神経膠腫由来細胞におけるDNAのヘミ欠失遺伝子のスクリーニングが報告され、発現解析データを組み合わせた確認によりＲＧＣ３２遺伝子に高頻度に異常が観察された。
（ｂ）神経膠腫の臨床検体において有意にＲＧＣ３２遺伝子の発現とその病理学的な分類による悪性度に逆相関が見られた。また、ＲＧＣ３２遺伝子の発現量はｐ５３遺伝子の点突然変異があるもので発現量が低下する傾向も観察された。
（ｃ）ＲＧＣ３２遺伝子の発現はｐ５３遺伝子産物により正に制御されていることが明らかとなった。
（ｄ）ＲＧＣ３２タンパク質の無い癌細胞にＲＧＣ３２タンパク質を発現させることで、足場依存性増殖能の低下、細胞増殖速度の低下が起こることからＲＧＣ３２タンパク質は癌抑制遺伝子産物の働きを持つことが判明した。
（ｅ）ＲＧＣ３２タンパク質は核分裂期における中心体部位に局在し、Ｐｌｋ１リン酸化酵素と相互作用し、その酵素活性を低下、分解を遅らせることにより核分裂におけるＧ２／Ｍ期での細胞周期制御に関わっていることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、ＭＲＰ６３、ＡＬＯＸ５ＡＰ、ＲＧＣ３２およびＦ１０遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲにて２２種の神経膠腫（ｇｌｉｏｍａ）細胞株および正常脳にて検出した結果を示す。アスタリスクのあるＭａｒｃｕｓ細胞は染色体１３ｑでの遺伝子欠失がアレイＣＧＨ解析で確認された。
【図２】図２Ａは、神経膠腫の臨床検体３５個についてＲＧＣ３２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法にてＧＡＰＤＨ遺伝子をコントロールに測定し、病理組織学的な分類での相関を示した。ｌｏｗ−ｇｒａｄｅ ｄｉｆｆｕｓｅ ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ （Ｇｒａｄｅ ＩＩ）とｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ（ＧＢＭ 、Ｇｒａｄｅ ＩＶ）間で有意なＲＧＣ３２遺伝子の発現との逆相関が見られた。図２Ｂは、ｐ５３遺伝子の点突然変異の有無という観点からＲＧＣ３２遺伝子の発現について病理学的な分類毎に比較を行った。ｐ５３遺伝子の点突然変異はＧｒａｄｅを問わず存在し、有意差は無いがＲＧＣ３２遺伝子の発現量はｐ５３遺伝子の点突然変異があるもので発現量が低下する傾向が示された。
【図３】図３Ａは、ＲＧＣ３２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現のないＵ−３７３ ＭＧ細胞に於いてアデノウィルスＡｄ−ｐ５３ とコントロールアデノウィルスＡｄ−ｌａｃＺを感染後、ｐ２１とＧＡＰＤＨを陽性コントロールとして用い、ＲＴ−ＰＣＲ解析を行った結果を示す。図３Ｂは、ｐ５３遺伝子をホモ欠失（ｐ５３−／−）しているＨＣＴ１１６細胞および正常型（ｐ５３＋／＋）のＨＣＴ１１６細胞を用い、ＤＮＡ損傷を惹起するアドリアマイシン（ＡＤＲ）添加後のｐ５３、ｐ２１遺伝子のＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ解析とｐ２１、ＲＧＣ３２、コントロールのＧＡＰＤＨ遺伝子についてＲＴ−ＰＣＲ解析を行った結果を示す。図３Ｃは、ＲＧＣ３２遺伝子のゲノムＤＮＡ構造を図式化したものである。黒いボックスはエクソン構造を示す。楔形はｐ５３応答配列（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を示す。ＲＧＣ３２−ＲＥ２に関して実際のｐ５３応答配列との比較を示した。大文字はｐ５３応答配列に一致する塩基を、小文字は一致しない塩基を示す。Ｒはプリン塩基を、Ｙはピリミジン塩基を、ＷはＡまたはＴの塩基であることを示す。
【図４】図４は、ＲＧＣ３２−ＲＥ２およびＲＧＣ３２−ＲＥ２ｘ２（ＲＧＣ３２−ＲＥ２の２コピー）をルシフェラーゼレポータープラスミド（ｐＧＬ３−ＲＧＣ３２−ＲＥ２、ｐＧＬ３−ＲＧＣ３２−ＲＥ２ｘ２）に結合・構築し、ｐ２１ （ｐＧＬ３−ｐ５３ＣＢＳ）を陽性コントロールとし、ｐｈＲＬ−ＴＫベクターと共にＳａＯＳ２細胞にＳＶ４０の最小プロモーターを持つ野生型ｐ５３ （ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ｐ５３）乃至変異型ｐ５３（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ｐ５３Ｍｕｔ）あるいはコントロールの（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３）を遺伝子導入後、各３回のレポーター活性を測定した結果を示す。縦軸はｐＧＬ３のプロモーターのＭｏｃｋコントロールに対する相対活性を示す。
【図５】図５は、ＨＣＴ１１６（ｐ５３−／−）あるいはＨＣＴ１１６（ｐ５３＋／＋）を用い、ＡＤＲ（１μｇ／ｍｌ、２４時間）の添加の有無の違いにより細胞破壊液を調整し、それらを抗ｐ５３ 抗体または、陰性コントロールとして抗ＦＬＡＧ抗体にて免疫沈降したものを材料にその沈降物の中にどのようなＤＮＡが含まれるかを、ｐ２１ のプロモーター領域、ＲＧＣ３２−ＲＥ２、ＲＧＣ３２−ＲＥ３に特異的なプライマーを用いＰＣＲにて検出した。Ｉｎｐｕｔは免疫沈降前の細胞破壊液を用いた陽性コントロールを示す。
【図６】図６Ａ左上は、ＲＧＣ３２遺伝子の発現がみられないＵ−８７ ＭＧ細胞にＭｙｃが結合したＲＧＣ３２遺伝子発現ベクター（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ＲＧＣ３２）あるいは陰性コントロール（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−Ｍｏｃｋ）を遺伝子導入４８時間後に細胞破壊液１０μｇを用いその外部導入遺伝子の発現を抗Ｍｙｃ抗体にてＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法にて検出した結果を示す。図６Ａ左下は、上記条件の２種の遺伝子導入細胞を培地中にてＧ４１８存在下３週間培養し、コロニー形成能をクリスタルバイオレット染色にて観察した培養皿の写真を示す。図６Ａ右は、コロニー形成能の結果を径２ｍｍ以上のコロニーに関しまとめたもので、コントロールに比しＲＧＣ３２遺伝子を発現させることで、有意にコロニー形成能が低下したことを示す。図６Ｂは、Ｕ−８７ ＭＧ細胞にてＲＧＣ３２遺伝子（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ＲＧＣ３２）、陰性コントロールの（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−Ｍｏｃｋ（ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ））を遺伝子導入し、Ｇ４１８耐性であるクローンを樹立（ＲＧＣ３２遺伝子発現クローンは２種）後その細胞増殖速度を生細胞数として水溶性テトラゾリウム塩の色度にて検出した結果を示す。
【図７】図７は、ＲＧＣ３２遺伝子の発現がみられないＵ−８７ ＭＧ細胞にＭｙｃが結合したＲＧＣ３２遺伝子発現ベクター（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ＲＧＣ３２）を一過性に発現した細胞を用い、抗Ｍｙｃ抗体（赤）、β−チューブリン（緑）、ＤＡＰＩ（青）にてそれぞれ染色し、間期（ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ）から細胞質分裂（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ）期までを通して観察し、下段にはそれらを結合（Ｍｅｒｇｅ）した蛍光顕微鏡像を示した。
【図８】図８は、ＧＦＰもしくはＧＦＰ−ＲＧＣ３２のＤｏｘでの誘導後ＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞をＦＡＣＳ解析した結果を示す。矢印は４Ｎのピーク（Ｇ２／Ｍ期）を示す。
【図９】図９は、ＧＦＰもしくはＧＦＰ−ＲＧＣ３２を発現するＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞にて２回のチミジンによる細胞のＧ１／Ｓ同調解除後にＦＡＣＳ解析した結果を示す。矢印は４Ｎのピーク（Ｇ２／Ｍ期）を示す。ＧＦＰ−ＲＧＣ３２を発現するＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞ではコントロールのＧＦＰ発現細胞に比べＭ期からの移行に遅延がみられることが判明した。
【図１０】図１０は、ＧＦＰもしくはＧＦＰ−ＲＧＣ３２を発現するＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞にて２回のチミジンによる細胞のＧ１／Ｓ同調解除後にＭ期リン酸化酵素Ｐｌｋ１、ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、Ａｕｒｏｒａ−Ｂならびにコントロールのβアクチンについてそれぞれの抗体にてＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法にて検出した結果を示す。
【図１１】図１１は、ＧＦＰもしくはＧＦＰ−ＲＧＣ３２のＤｏｘでの誘導後ＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞破壊液を抗ＧＦＰ抗体にて免疫沈降後、抗Ｐｌｋ１抗体にてＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法にて検出した結果を示す。ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅは細胞破壊液コントロールでの検出を示す。
【図１２】図１２は、ＲＧＣ３２の遺伝子組み換えタンパク質を用意し、ヒト組み換えＰｌｋ１、脱リン酸化α−ｃａｓｅｉｎの組み合わせにより、Ｐｌｋ１リン酸化酵素活性をオートラジオグラフィーにて検出した結果を示した。
【配列表フリーテキスト】
【００８０】
SEQUENCE LISTING［配列表］
<110> Fuji Photo Film Co.
<120> A cancer-suppressing agent
<130> A61523A
<160> 2
<210> 1
<211> 895
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
gcggccgcgt cgaccggcgc ggctggagcg cagcgccgaa gggactggca gggctgaagt 60
gtgcgggaca gcaagccccc gaatagcccc ggctgccacc tcgcaggacc caaggccacg 120
cgcgccgggc ccagctgagc cgcctcatga agccgcccgc ggaggacctg tcggacgcgc 180
tgtgcgagtt tgacgcggtg ctggccgact tcgcgtcgcc cttccacgag cgccacttcc 240
actacgagga gcacctggag cgcatgaagc ggcgcagcag cgccagtgtc agcgacagca 300
gcggcttcag cgactcggag agtgcagatt cactttatag gaacagcttc agcttcagtg 360
atgaaaaact gaattctcca acagactcta ccccagctct tctctctgcc actgtcactc 420
ctcagaaagc taaattagga gacacaaaag agctagaagc cttcattgct gatcttgaca 480
aaactttagc aagtatgtga aacaagaagt tctgggtcct ttcatcataa gggagaagct 540
tcagaaagtt ccgaggacct gctaaaatca gctactagaa tctgctgcca gaggggacaa 600
agacgtgcac tcaaccttct accaggccac tctcaggctc accttaaaat cagcccttga 660
tcccatttct gggcaattta gacagtgaaa ctgactttgt ttacctgctt gcagcatatt 720
agaacagacg atccatgcta atattgtatt ttctcttaaa acatagcttt cctgtaattt 780
aaagtgcttt tatgaaaata tttgtaatta attatatata gttggaaata gcagtaagct 840
ttcccattat aatatatttt tgtatacaaa taaaatttga actgaacctc gtgcc 895
<210> 2
<211> 117
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Lys Pro Pro Ala Glu Asp Leu Ser Asp Ala Leu Cys Glu Phe Asp
1 5 10 15
Ala Val Leu Ala Asp Phe Ala Ser Pro Phe His Glu Arg His Phe His
20 25 30
Tyr Glu Glu His Leu Glu Arg Met Lys Arg Arg Ser Ser Ala Ser Val
35 40 45
Ser Asp Ser Ser Gly Phe Ser Asp Ser Glu Ser Ala Asp Ser Leu Tyr
50 55 60
Arg Asn Ser Phe Ser Phe Ser Asp Glu Lys Leu Asn Ser Pro Thr Asp
65 70 75 80
Ser Thr Pro Ala Leu Leu Ser Ala Thr Val Thr Pro Gln Lys Ala Lys
85 90 95
Leu Gly Asp Thr Lys Glu Leu Glu Ala Phe Ile Ala Asp Leu Asp Lys
100 105 110
Thr Leu Ala Ser Met
115
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌抑制遺伝子及び該遺伝子がコードするタンパク質の医薬用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の発症は細胞のタンパク質の変異や量的変化に起因することは古くから知られている。近年の遺伝子工学の発達は特定タンパク質をコードする遺伝子の増幅や癌細胞における遺伝子変異の解析を可能にし、癌研究の分野においても飛躍的な発展をもたらした。これまでに細胞の癌化や癌細胞の異常増殖に関与するいわゆる癌遺伝子の解析及び同定が進んでいる。一方、変異あるいは発現低下により癌化につながる癌抑制遺伝子がここ数年脚光を浴びている。これまでに癌抑制遺伝子として網膜芽細胞腫のＲｂ遺伝子、大腸癌のｐ５３遺伝子及びＡＰＣ遺伝子、Ｗｉｌｍｓ腫瘍のＷＴ１遺伝子などが発見されている。ＷＴ１遺伝子を活用した癌抑制剤の例も報告されている（特許文献１）。
【０００３】
また、癌の発生、進展悪性化、転移などには一つの遺伝子の異常だけでなく複数の遺伝子の異常が関与していることが次第に明らかになりつつあり、さらに多くの未同定の癌遺伝子及び癌抑制遺伝子が存在するものと考えられている。癌抑制効果を有する遺伝子は数多く知られているが、多くの場合、その選別には患者の遺伝子の変異を、染色体ＤＮＡを染色することにより視覚化して見つけ出すアプローチ（非特許文献１）や、遺伝子の欠失をＬＯＨ（Ｌｏｓｓ Ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）解析で大まかな範囲を選定した後、重要な遺伝子領域を絞り込むという方法がこれまで行われてきた（特許文献２）。しかし、これらの方法では、判別できるＤＮＡ欠失領域が莫大なものとなり、重要な遺伝子領域を絞り込む作業に大量の時間と手間を必要とする欠点を持っており、癌抑制遺伝子を探し出す手段としては限界があった。また、従来の遺伝子を用いた癌病態の分離・識別法では悪性度の判定は困難であった。
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２００３／００２１４２号公報
【特許文献２】ＷＯ０１／０３２８５９号公報
【非特許文献１】Ｙａｓｕｈｉｄｅ Ｙａｍａｓｈｉｔａ、ｅｔ ａｌ．、Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ 、１１（３３）：５１２９−５１３５、２００５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、既存の方法に代わる新たな方法により癌抑制遺伝子を見出して、これを含有する癌抑制剤を提供することを課題とする。本発明はまた、該癌抑制遺伝子がコードするタンパク質を含有する癌抑制剤を提供することを課題とする。本発明はさらに該癌抑制遺伝子の存在量または発現量を計測することによる癌患者の病態における悪性度を診断する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決すべく神経膠腫（Ｇｌｉｏｍａ）症例のＤＮＡの部分欠失領域を探索することを精力的に行ってきた。神経膠腫は、主に星膠腫（Ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）、乏突起膠腫（Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍａ）、上衣腫（Ｅｐｅｎｄｙｍｏｍａ）、最も悪性度の高い膠芽腫（Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）に分類され、脳腫瘍全体の３０−４０％を占める。本発明者らは、神経膠腫における癌関連遺伝子を特定するため、新規に開発されたアレイＣＧＨ法（Ｉｎａｚａｗａ Ｊ．、ｅｔ ａｌ．、 Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．９５（７）、５５９、２００４）により癌で高頻度に欠失した遺伝子をスクリーニングした。さらに、ｃＤＮＡマイクロアレイとＲＴ−ＰＣＲ法を組み合わせ、神経膠腫でＤＮＡ中から欠失し、発現が著しく抑制されている遺伝子として、ＲＧＣ３２（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｇｅｎｅ ｔｏ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ３２）遺伝子を同定した。さらに、ＲＧＣ３２タンパク質の無い癌細胞にＲＧＣ３２タンパク質を発現させることで、足場依存性増殖能の低下、細胞増殖速度の低下が起こることを確認し、ＲＧＣ３２タンパク質は癌抑制遺伝子産物の働きを持つことを実証した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００７】
即ち、本発明によれば、ＲＧＣ３２遺伝子又はその相同遺伝子を含有する癌抑制剤が提供される。
好ましくは、前記遺伝子又はその相同遺伝子はベクターに組み込まれている。
好ましくは、前記ベクターはウイルスベクター又は動物細胞発現用プラスミドベクターである。
【０００８】
好ましくは、前記ウイルスベクターはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである。
好ましくは、前記遺伝子又はその相同遺伝子はリポソームに封入されている。
【０００９】
本発明の別の側面によれば、ＲＧＣ３２タンパク質又はその相同タンパク質を含有する癌抑制剤が提供される。
【００１０】
本発明のさらに別の側面によれば、ＲＧＣ３２遺伝子の全部又はその一部を含むＤＮＡ又はＲＮＡを用いて検体試料中のＲＧＣ３２遺伝子を解析する工程を含む、癌の診断方法が提供される。
好ましくは、前記解析は遺伝子の変異の検出又は遺伝子の発現量の異常の検出である。
【００１１】
本発明のさらに別の側面によれば、ＲＧＣ３２タンパク質に対する抗体又はその断片を用いて検体試料中のＲＧＣ３２タンパク質を解析する工程を含む、癌の診断方法が提供される。
好ましくは、前記解析はタンパク質の発現量の異常の検出である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、新たに癌抑制機能を見出したＲＧＣ３２遺伝子又は該遺伝子がコードするＲＧＣ３２タンパク質を含有する癌抑制剤が提供される。これらの薬剤は癌の個別性に基づく治療や癌の予後の改善などの臨床上の観点から、あるいは癌の基礎的研究の観点から非常に有用である。また、ＲＧＣ３２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現量を測定すること、ゲノムＤＮＡ上でのＲＧＣ３２遺伝子の存在を確認すること、あるいはＲＧＣ３２タンパク質量を測定することにより、脳腫瘍患者の病理学的悪性度を予測することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施態様及び実施方法について詳細に説明する。
（１）本発明の癌抑制剤
本発明の一態様によれば、本発明の癌抑制剤は有効成分としてＲＧＣ３２遺伝子又はその相同遺伝子を含む。本発明のもう一つの態様によれば、本発明の癌抑制剤は有効成分としてＲＧＣ３２タンパク質又はその相同タンパク質を含む。
【００１４】
ＲＧＣ３２遺伝子の塩基配列及びＲＧＣ３２タンパク質のアミノ酸配列は既に知られており（Ｂａｄｅａ、Ｔ．Ｃ．、 Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ、Ｆ．Ｉ．、 Ｓｏａｎｅ、Ｌ．、 Ｓｈｉｎ、Ｍ．Ｌ． ａｎｄ Ｒｕｓ、Ｈ． １９９８）、ＲＧＣ３２遺伝子の塩基配列はＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのデータベースにＡＦ１６９６３番にて、またＲＧＣ３２タンパク質のアミノ酸配列は同データベースにＮＰ０５４７７８番にて登録されている。ＲＧＣ３２遺伝子の塩基配列は配列番号１に記載する通りであり、ＲＧＣ３２タンパク質は配列番号１の塩基配列の１４７番目から５００番目までの領域をコードし、そのアミノ酸配列は配列番号２に示される通りである。
【００１５】
本明細書において「ＲＧＣ３２遺伝子」というのは、上記塩基配列で特定されるヒト由来の遺伝子をいい、「ＲＧＣ３２タンパク質」というのは、該ＲＧＣ３２遺伝子がコードし、上記アミノ酸配列で特定されるタンパク質をいう。
【００１６】
ＲＧＣ３２遺伝子は、当業者に公知の技術を用いて培養細胞などから取得したｃＤＮＡであってもよいし、又は本明細書の配列番号１に記載の塩基配列に基づいてＰＣＲ法などにより化学的に合成したものでもよい。ＰＣＲ法により配列番号１に記載した塩基配列を有するＤＮＡを取得する場合、ヒトの染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを使用してＰＣＲを行う。ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片は大腸菌などの宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００１７】
上記のブローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ、２nd Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ．、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）などに記載された方法に準じて行うことができる。
【００１８】
本発明において、「ＲＧＣ３２遺伝子の相同遺伝子」とは、配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加又は置換されている塩基配列であって、癌抑制活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子；又は配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、癌抑制活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子いう。また、ＲＧＣ３２遺伝子の相同遺伝子にはＲＧＣ３２遺伝子の断片も含まれる。
【００１９】
上記の「配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加又は置換されている塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から６０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個程度を意味する。
【００２０】
上記の「癌抑制活性」の程度は特に限定はされないが、好ましくはＲＧＣ３２タンパク質が有する癌抑制活性と実質的に同等又はそれ以上の癌抑制活性をいう（以下、本明細書における「癌抑制活性」は同じ意味を示す）。
【００２１】
従って、「ＲＧＣ３２遺伝子の相同遺伝子」は上記に定義される構造と機能を有する限り、由来は問わず、ヒト以外の哺乳動物由来であってもよいし、ヒトなどの哺乳動物由来の遺伝子に対して人工的に変異を導入したものであってもよい。ただし、該遺伝子を後記のごとく癌抑制剤に使用する場合は臨床上の安全性の観点からヒト由来のものが好ましい。
【００２２】
上記の「配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加又は置換されている塩基配列であって、癌抑制活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子」は、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。具体的には、上記遺伝子は配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡを利用し、これらＤＮＡに変異を導入することにより取得することができる。例えば、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法などを用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ、２nd Ｅｄ．、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ．、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）などに記載の方法に準じて行うことができる。
【００２３】
上記の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニー又はプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡなどを挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ、２nd Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ．、１９８９などに記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２４】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００２５】
上記の「配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、癌抑制活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子」は、上述の通り、一定のハイブリダイゼーション条件下でコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法などを行うことにより得ることができる。
【００２６】
本発明において、「ＲＧＣ３２タンパク質の相同タンパク質」とは、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は挿入したアミノ酸配列であって、癌抑制活性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質；又は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、癌抑制活性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をいう。
【００２７】
上記した「配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は挿入したアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００２８】
上記した「配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、該アミノ酸配列と配列番号２に記載のアミノ酸配列との相同性が少なくとも７０％以上であり、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上であることを意味する。
【００２９】
ＲＧＣ３２タンパク質は、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。比較的容易な操作でかつ大量に製造できるという点では、組み換えタンパク質が好ましい。
【００３０】
天然由来のタンパク質は、該タンパク質を発現している細胞又は組織からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせて単離することができる。化学合成タンパク質は、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法に従って合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。組み換えタンパク質は、該タンパク質をコードする塩基配列（例えば、配列番号１に記載の塩基配列）を有するＤＮＡを好適な発現系に導入することにより生産することができる。
【００３１】
なお、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換又は挿入したアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の一例示す配列番号１に記載の塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜製造又は入手することができる。
【００３２】
本発明の癌抑制剤の好ましい態様としては、有効成分として上記のＲＧＣ３２遺伝子又はその相同遺伝子をベクターに組み込んだ組換えベクターを含む。ベクターとしてはウイルスベクター又は動物細胞発現用ベクター、好ましくはウイルスベクターが用いられる。
【００３３】
ウイルスベクターとしてはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。中でも、レトロウイルスベクターは、細胞に感染後、ウイルスゲノムが宿主染色体に組み込まれ、ベクターに組み込んだ外来遺伝子を安定にかつ長期的に発現させる可能であるからレトロウイルスベクターを使用することが特に望ましい。
【００３４】
動物細胞発現用ベクターとしては例えばｐＣＸＮ２（Ｇｅｎｅ、１０８、１９３−２００、１９９１）、ＰＡＧＥ２０７（特開平６−４６８４１号公報）又はその改変体などを用いることができる。
【００３５】
上記組換えベクターは適当な宿主に導入して形質転換し、得られた形質転換体を培養することによって生産することができる。組換えベクターがウイルスベクターの場合、これを導入する宿主としてはウイルス生産能を有する動物細胞が用いられ、例えば、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞などが挙げられる。レトロウイルスベクターの宿主としては、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＭＬＶなどが、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターの宿主としては、ヒト胎児腎臓由来の２９３細胞などが用いられる。ウイルスベクターの動物細胞への導入はリン酸カルシウム法などで行うことができる。また、組換えベクターが動物細胞発現用ベクターの場合、これを導入する宿主としては大腸菌Ｋ１２株、ＨＢ１０１株、ＤＨ５α株などを使用でき、大腸菌の形質転換は当業者に公知である。
【００３６】
得られた形質転換体はそれぞれに適した培地、培養条件により培養する。例えば、大腸菌の形質転換体の培養は、生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他を含有するｐＨ５〜８程度の液体培地を用いて行うことができる。培養は通常１５〜４３℃で約８〜２４時間程度行う。この場合、目的とする組み換えベクターは、培養終了後、通常のＤＮＡ単離精製法により得ることができる。
【００３７】
また、動物細胞の形質転換体の培養は、例えば約５〜２０％のウシ胎児血清を含む１９９培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地などの培地を用いて行うことができる。培地のｐＨは約６〜８が好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１８〜６０時間行う。この場合、目的とする組み換えベクターは、それを含有するウイルス粒子が培養上清中に放出されるので、ウイルス粒子の濃縮、精製を塩化セシウム遠心法、ポリエチレングリコール沈澱法、フィルター濃縮法などにより得ることができる。
【００３８】
本発明の癌抑制剤のうち、有効成分としてＲＧＣ３２遺伝子又はその相同遺伝子を含む癌抑制剤（以下、遺伝子治療剤という）は、有効成分であるＲＧＣ３２遺伝子又はその相同遺伝子を遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合することにより製造することができる。また、ＲＧＣ３２遺伝子又はその相同遺伝子をウイルスベクターに組み込んだ場合は、組換えベクターを含有するウイルス粒子を調製し、これを遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合する。
【００３９】
上記基剤としては、通常注射剤に用いる基剤を使用することができ、例えば、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物などの塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコースなどの溶液、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液などが挙げられる。あるいはまた、当業者に既知の常法に従って、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、植物油、界面活性剤などの助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製することもできる。これらの注射剤は、粉末化、凍結乾燥などの操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。
【００４０】
また、本発明の遺伝子治療剤は、常法により調製されたリポソームの懸濁液にＲＧＣ３２遺伝子を添加し凍結した後融解することにより製造することもできる。リポソームを調製する方法は、薄膜振とう法、超音波法、逆相蒸発法、界面活性剤除去法などがある。リポソームの懸濁液は超音波処理した後、遺伝子を添加するのが遺伝子の封入効率を向上させる上で好ましい。遺伝子を封入したリポソームはそのまま、又は水、生理食塩水などに懸濁して静脈投与することができる。
【００４１】
上記遺伝子治療剤の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内などの全身投与でもよいし、あるいは癌原病巣又は予想転移部位に対して、局所注射又は経口投与などの局所投与を行ってもよい。さらに、遺伝子治療剤の投与にあたっては、カテーテル技術、遺伝子導入技術、又は外科的手術などと組み合わせた投与形態をとることもできる。
【００４２】
上記遺伝子治療剤の投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日当たり組み換え遺伝子の重量として１μｇ／ｋｇ体重から１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。
【００４３】
また、本発明の癌抑制剤のうち、有効成分としてＲＧＣ３２タンパク質又はその相同タンパク質を含む癌抑制剤（以下、タンパク質製剤という）は、有効成分であるＲＧＣ３２タンパク質又はその相同タンパク質に製剤用添加物（例えば、担体、賦形剤など）を含む医薬組成物の形態で提供される。
【００４４】
上記タンパク質製剤の形態は特に限定されず、経口投与のための製剤としては例えば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤などが挙げられ、非経口投与のための製剤としては例えば、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、経粘膜吸収剤、経皮吸収剤などが挙げられる。
【００４５】
上記タンパク質製剤の投与経路は特に限定されず、経口投与又は非経口投与（例えば、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与などへの粘膜投与、又は吸入投与など）の何れでもよい。
【００４６】
上記タンパク質治療剤の投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日あたり０．００１μｇ／ｋｇ体重から１０００μｇ／ｋｇ体重程度の範囲であり、好ましくは０．００１μｇ／ｋｇ体重から１００μｇ／ｋｇ体重程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。
【００４７】
上記癌抑制剤（遺伝子治療剤及びタンパク質製剤の両形態を含む）は、その有効量をヒトを含む哺乳動物に投与することによって癌を抑制するのに使用することができる。上記癌抑制剤はまたその予防及び／又は治療有効量をヒトを含む哺乳動物に投与することによって癌の予防及び／又は治療をするのに使用することができる。
【００４８】
本明細書でいう「癌抑制」とは、癌の発生又は転移・着床を防止するという予防的作用、ならびに癌細胞の増殖を抑制したり、癌を縮小することによって癌の進行を阻止したり、症状を改善させるという治療的作用の両方を含む最も広い意味を有し、いかなる場合においても限定的に解釈されるものではない。
【００４９】
本発明の癌抑制剤の適用対象となる癌の具体例としては、例えば悪性黒色腫、悪性リンパ腫、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、尿管腫瘍、胆嚢癌、胆管癌、胆道癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、睾丸腫瘍、上顎癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、甲状腺癌、脳腫瘍、カポジ肉腫、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽細胞腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚癌、基底細胞癌、皮膚付属器癌、皮膚転移癌、皮膚黒色腫などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、上記のうち特に好ましい適用対象となる癌は、脳腫瘍である。
【００５０】
（２）ＲＧＣ３２遺伝子を用いた癌の診断方法
本発明の癌の診断方法としては、癌の悪性度の診断方法、本発明の癌抑制剤の適用対象となる癌を選別するための診断方法などを挙げることができる。本発明の癌の診断方法は、ＲＧＣ３２遺伝子の全部又はその一部を含むＤＮＡ又はＲＮＡを用いて検体試料中のＲＧＣ３２遺伝子を解析する工程を含む。
【００５１】
ここで、ＲＧＣ３２遺伝子の一部とは、配列番号１に記載するＲＧＣ３２遺伝子の塩基配列のうち、例えば約１０〜３０個の連続する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを意味する。検体試料としては、腫瘍が疑われる組織切片、血液、リンパ液、喀痰、肺洗浄液、尿、便、組織培養上清などを用いることができる。
【００５２】
上記の「癌抑制剤の適用対象となる癌を選別するための検出」とは組織等における本発明における癌抑制剤が有効に作用する癌の存在の有無を知ることをいう。
【００５３】
癌の診断は、ＲＧＣ３２遺伝子の全部又はその一部を含むＤＮＡ又はＲＮＡをプライマー又はプローブとして用いて検体試料中のＲＧＣ３２遺伝子を解析することにより行う。ここで「ＲＧＣ３２遺伝子を解析する」とは、具体的にはゲノムＤＮＡの当該遺伝子の欠失の検出又は遺伝子の発現量の異常を検出することをいう。
【００５４】
遺伝子の変異の検出は、上記ＤＮＡ又はＲＮＡをプライマーとして用いる場合では、例えば選択した２種の配列のプライマーによりＰＣＲ法で検体試料より調製したＤＮＡの部分配列を増幅させ、その存在の有無を確認する、もしくはその増幅物をそのまま、あるいは各種プラスミドベクターに組み換えた後配列を確認することにより可能である。
【００５５】
一方、遺伝子の発現量の異常の検出は、上記ＲＮＡ配列を含むプローブを用いてノーザンハイブリダイゼーション法又はＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によって行うことができる。
【００５６】
（３）ＲＧＣ３２タンパク質抗体又はその断片を用いた癌の診断方法
本発明の癌の診断方法は、ＲＧＣ３２タンパク質に対する抗体又はその断片を用いて検体試料中のＲＧＣ３２タンパク質の量を解析する工程を含む。
【００５７】
本方法に用いるＲＧＣ３２タンパク質に対する抗体（以下、ＲＧＣ３２抗体という）は、ＲＧＣ３２タンパク質の全部又は一部を抗原として、通常の方法で作成することができる。ＲＧＣ３２タンパク質の一部とは、配列番号２に記載するＲＧＣ３２タンパク質のアミノ酸配列のうち、例えば連続する少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは、少なくとも約１１〜２０個のアミノ酸からなるポリペプチドをいう。抗原とするＲＧＣ３２タンパク質の全部又は一部の調製法は生物学的手法、化学合成手法いずれでもよい。
【００５８】
ポリクローナル抗体は、例えば上記抗原をマウス、モルモット、ウサギなどの動物の皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内などに複数回接種し十分に免疫した後、該動物から採血、血清分離して作製することができる。モノクローナル抗体は、例えば上記抗原で免疫したマウスの脾細胞と市販のマウスミエローマ細胞との細胞融合により得られるハイブリドーマを作成後、該ハイブリドーマ培養上清、又は該ハイブリドーマ投与マウス腹水から作成することができる。
【００５９】
上記のようにして調製したＲＧＣ３２タンパク質抗体又はその断片を用いることによって検体試料中のＲＧＣ３２タンパク質の発現量を知ることができる。測定には、例えばイムノブロット法、酵素抗体法（ＥＩＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光抗体法、免疫細胞染色などの免疫学的方法、又はウェスタンブロット法などが利用できる。ここで、ＲＧＣ３２タンパク質抗体の断片とは当該抗体の一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）などをいう。また、検体試料としては、腫瘍が疑われる組織切片、血液、リンパ液、喀痰、肺洗浄液、尿、便、組織培養上清などを用いることができる。測定した検体試料中のＲＧＣ３２タンパク質の発現量が低い場合は、検体とした組織や細胞においてＲＧＣ３２遺伝子の発現が抑制されていることになり、本発明の癌抑制剤の適用対象となる癌を選別することができる。
【００６０】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
【００６１】
（１）実験材料
神経膠腫由来細胞株はＡ−１７２、ＡＭ−３８、Ｂｅｃｋｅｒ、ＧＢ−１、ＫＡＬＳ−１、ＫＩＮＧＳ−１、ＫＮＳ−４２、ＫＮＳ−６０、ＫＮＳ−８１、ＫＮＳ−８９、ＫＳ−１、Ｍａｒｃｕｓ、ＮＭＣ−Ｇ１、ｎｏ．１０、ｎｏ．１１、ＳＦ１２６、Ｔ９８Ｇ、Ｕ−２５１ ＭＧ、ＹＨ−１３、ＹＫＧ−１を医薬基盤研究所（ＪＣＲＢ）より入手し用いた。Ｕ−３７３ ＭＧ、Ｕ−８７ ＭＧ、ＳａＯＳ２はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より入手した。子宮頸癌のＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞はＣｌｏｎｔｅｃｈ社より入手した。大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６（ｐ５３＋／＋）とＨＣＴ１１６（ｐ５３−／−）はＤｒ．Ｂｅｒｔ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎの好意により譲渡された。これら細胞株を１０％胎児牛血清、１００ ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ペニシリン、１００ μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンの存在下Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）にて培養を行った。臨床検体由来の３５人からの星細胞腫サンプルは東京医科歯科大学病院・脳神経外科部門から入手し、各患者の同意をもってかつ各組織の倫理委員会の承認を得て使用した。ヘマトキシリン−エオシン染色による病期分類は世界保健機関（ＷＨＯ）の基準に従った。３５サンプルの癌腫において８種がｌｏｗ−ｇｒａｄｅ ｄｉｆｆｕｓｅ ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ（Ｇｒａｄｅ ＩＩ）、８種がａｎａｐｌａｓｔｉｃ ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ（Ｇｒａｄｅ ＩＩＩ）さらに１９種がｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ（ＧＢＭ 、Ｇｒａｄｅ ＩＶ）と判定された。表１に神経膠腫由来細胞株の組織情報をまとめた。
【００６２】
【表１】
【００６３】
（２）発現解析マイクロアレイ法による神経膠腫由来細胞での低発現遺伝子の分離
アレイＣＧＨ法にて、ＭＣＧ Ｃａｎｃｅｒ Ａｒｒａｙ−８００（Ｓａｉｇｕｓａ Ｋ．、ｅｔ ａｌ．、 Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．９６、６７６、２００５）を用いて上記２２種の神経膠腫由来細胞におけるDNAの増幅・欠失遺伝子のスクリーニングが報告されている。この際染色体１３番の長腕に高頻度のヘミ欠失が観察された。そこで正常ヒト脳およびＭａｒｃｕｓ細胞由来のＲＮＡを用いて、ヒトの３０，０００遺伝子の発現量を観察可能なＡｃｅＧｅｎｅ Ｈｕｍａｎ ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐ ３０Ｋ（ＤＮＡチップ研究所）によりメッセンジャーＲＮＡの発現解析を行い、染色体１３番長腕中の低発現遺伝子の探索を行った。Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８プライマーを用いて、アミノアリル−ｄＵＴＰ（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．）を取り込ませた相補鎖ＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ）を作製後、アミノアリル基に反応性のＣｙ３（シアニン３、Ｍａｒｃｕｓ）、Ｃｙ５（シアニン５、正常ヒト脳）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とカップリング反応を行い標識を行った。ハイブリダイゼーション後に、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてシグナルを測定後、ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ６．０ソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）にて解析した。表２には、染色体１３番の長腕に存在する遺伝子でＭａｒｃｕｓ細胞で正常ヒト脳に比べ発現の低下した遺伝子を示した。
【００６４】
【表２】
【００６５】
染色体１３番長腕のＲＧＣ３２を含む遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現ＲＧＣ３２遺伝子および発現解析マイクロアレイ法により染色体１３番の長腕で発現量低下が観察されたＭＲＰ６３、ＡＬＯＸ５ＡＰ、ＲＧＣ３２、Ｆ１０遺伝子についてメッセンジャーＲＮＡの発現量を測定するため正常脳（Ｂｒａｉｎ）をコントロールとし、神経膠腫由来細胞２２株についてＲＴ−ＰＣＲを行った（図１）。ＲＴ−ＰＣＲの発現量のコントロールとして発現量が細胞種、条件で変化しにくいことで知られるＧＡＰＤＨを用いた。ＲＧＣ３２遺伝子およびＭＲＰ６３、ＡＬＯＸ５ＡＰ、Ｆ１０遺伝子について発現解析を行ったが、特にＲＧＣ３２遺伝子が２２株中２１株で発現の著しい低下が観察された。
【００６６】
３５種の星細胞腫（ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）サンプルについて、病理学的な分類を行い、コントロールとしてＧＡＰＤＨを用いＲＧＣ３２遺伝子の定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。８種のｌｏｗ−ｇｒａｄｅ ｄｉｆｆｕｓｅ ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ（Ｇｒａｄｅ ＩＩ）、８種のａｎａｐｌａｓｔｉｃ ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ（Ｇｒａｄｅ ＩＩＩ）１９種のｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ（ＧＢＭ 、Ｇｒａｄｅ ＩＶ）のそれぞれについてＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを行った結果、Ｇｒａｄｅ ＩＩとＧｒａｄｅ ＩＶ間で有意にＲＧＣ３２遺伝子の発現と病理学的悪性度の間に逆相関が見られた（図２Ａ、ｐ＝０．００３）。また、代表的な癌抑制遺伝子であるｐ５３遺伝子の点突然変異の有無とＲＧＣ３２遺伝子の発現について病理学的な分類毎に比較を行った（図２Ｂ）。その結果、ｐ５３遺伝子の点突然変異はＧｒａｄｅを問わず存在し、有意差は無いものの、ＲＧＣ３２遺伝子の発現量はｐ５３遺伝子の点突然変異があるもので発現量が低下する傾向が観察された。
【００６７】
（３）ｐ５３遺伝子を強制発現させた細胞でのＲＧＣ３２遺伝子の発現
ｐ５３遺伝子が機能しないことで知られるＵ−３７３ ＭＧ細胞株を用いて、ヒトｐ５３遺伝子を発現するアデノウィルスを感染させ、ＲＧＣ３２遺伝子の発現を観察した。ヒトβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（Ａｄ−ｌａｃＺ）をコントロールとし、ｐ５３（Ａｄ−ｐ５３）の両ウィルスを別々の細胞に感染後、ＲＧＣ３２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲにて測定した（図３Ａ）。コントロールとしてＧＡＰＤＨを用いた。ｐ２１遺伝子はｐ５３遺伝子の発現により発現上昇が知られている遺伝子であるが、ＲＧＣ３２遺伝子もｐ２１遺伝子と同様にｐ５３遺伝子のアデノウィルス感染後に発現上昇することが確認された。一方、ヒトβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（Ａｄ−ｌａｃＺ）を感染させた細胞では、ｐ２１、ｐ５３遺伝子共に発現上昇が認められなかった。
【００６８】
（４）ＤＮＡ細胞でのＲＧＣ３２遺伝子、タンパク質の発現
内在性のｐ５３遺伝子が存在する大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６（ｐ５３＋／＋）と内在性のｐ５３遺伝子が存在しないＨＣＴ１１６（ｐ５３−／−）両者を用い、ＤＮＡ損傷を惹起する抗癌剤アドリアマイシン（ＡＤＲ）を細胞に１μｇ／ｍｌ濃度で添加後、ｐ２１、ｐ５３タンパク質の発現量をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法（上段）ならびにｐ２１、ＲＧＣ３２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲ法にて測定した（図３Ｂ）。細胞にＤＮＡ損傷を与えることによりｐ５３、ｐ２１遺伝子両者が発現上昇することは広く知られているが、正常なｐ５３タンパク質を有するＨＣＴ１１６細胞（ｐ５３＋／＋）のみでそのタンパク質の誘導が観察された。一方、ｐ２１、ＲＧＣ３２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現もＡＤＲ添加後正常なｐ５３タンパク質を有するＨＣＴ１１６細胞（ｐ５３＋／＋）のみでそのメッセンジャーＲＮＡの発現が上昇することが観察された。この結果から、ＲＧＣ３２遺伝子は正常なｐ５３タンパク質を介して発現上昇することが確認された。
【００６９】
（５）ＲＧＣ３２遺伝子ＤＮＡ上のｐ５３タンパク質の結合サイト
ＲＧＣ３２遺伝子のゲノムＤＮＡ上の塩基配列を確認した。２０塩基対程度からなるｐ５３タンパク質の結合サイトの存在を調査したところ、８０％以上の相同性（ｅｌ−Ｄｅｉｒｙ ＷＳ、ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１．４５．１９９２）で１０ヶ所のｐ５３タンパク質の結合サイトを確認した（図３Ｃ）。ＲＧＣ３２−ＲＥ１からＲＧＣ３２−ＲＥ１０と命名した。
【００７０】
（６）レポーターアッセイによるＲＧＣ３２遺伝子のプロモーター領域の転写促進効果の測定
ＲＧＣ３２遺伝子のゲノムＤＮＡ上の１０ヶ所のｐ５３タンパク質の結合サイトＲＧＣ３２−ＲＥ１からＲＧＣ３２−ＲＥ１０それぞれについて、ホタルルシフェラーゼ酵素による発光物を測定する方法にて、プロモーター活性を確認した。ｐ５３遺伝子を持たないＳａＯＳ２細胞に、ｐＧＬ３ベクター（プロメガ）を用いルシフェラーゼ遺伝子を下流域に配置しプロモーター解析領域としてＲＧＣ３２−ＲＥ１からＲＧＣ３２−ＲＥ１０含むコンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）について、野生型ｐ５３タンパク質を発現するベクター（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ｐ５３）と コントロールとしてｐ５３変異体タンパク質を発現するベクターとｐ５３遺伝子無しのベクター（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ｐ５３ＭｕｔおよびｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ｍｏｃｋ）を組み合わせ酵素活性を測定した。その結果、ＲＧＣ３２−ＲＥ２のみが野生型ｐ５３タンパク質が発現した際のみルシフェラーゼ酵素活性が上昇した（データは示していない）。そこで、ＲＧＣ３２−ＲＥ２を合成オリゴヌクレオチド５’−ＡＧＧＣｇＡＧＴＴＴ−ａａｇ−ｃＡＧＣＴＴＧＴＣＣ −３’を１回または繰り返して２回連結して合成したものをｐＧＬ３ベクターのプロモーターとして挿入したものを作製しｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ｐ５３、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ｐ５３Ｍｕｔ（Ｒ２７３Ｈ）、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ｍｏｃｋそれぞれと共にＳａＯＳ２細胞に遺伝子導入３６時間後、ルシフェラーゼ酵素活性を測定した（図４）。ｐ２１遺伝子由来のｐ５３ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ（ＣＢＳ）が野生型ｐ５３タンパク質を発現するベクターの存在下ルシフェラーゼ酵素活性が上昇するのと同様に、ＲＧＣ３２−ＲＥ２、特に２回連結して合成したＲＧＣ３２−ＲＥ２ｘ２でコントロールに対し６０倍高い下ルシフェラーゼ酵素活性を示し、この配列がｐ５３タンパク質依存性にプロモーター領域として働くことが確認された。
【００７１】
（７）Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ（ＣｈＩＰ）によるプロモーターＤＮＡの存在確認
ＣｈＩＰアッセイはＣｈＩＰ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いた。２ｘ１０6個のＨＣＴ１１６（ｐ５３＋／＋）とＨＣＴ１１６（ｐ５３−／−）を１０ｃｍディッシュに蒔き、終濃度１μｇ／ｍｌのＡＤＲを添加２４時間後に１％のホルムアミドを１０分間処理後、細胞をｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）を含む２００μｌのＳＤＳ細胞溶解バッファーに回収した。超音波処理を行い、ＤＮＡ長が２００から１０００ｂｐとなるように破砕した。上清をサケ精子ＤＮＡ／ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇａｒｏｓｅにて処理し、抗ｐ５３抗体（Ａｂ−６；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）またはコントロールとして抗ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２；Ｓｉｇｍａ）を用い４°Ｃにて１６時間免疫沈降を行った。沈殿物を５０μｌのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡに溶解し１μｌを鋳型としてＰＣＲにてそれぞれのｐ５３の結合サイトを検出した。ＨＣＴ１１６（ｐ５３＋／＋）のＡＤＲ処理後の、抗ｐ５３抗体にて免疫沈降したもののみにプロモーター配列の存在が観察された（図５、ｐ２１、ＲＧＣ３２−ＲＥ２）。このことから細胞内で実際にＤＮＡ損傷応答時にｐ５３タンパク質を介したプロモーター配列への応答がＲＧＣ３２−ＲＥ２上にも観察された。
【００７２】
（８）神経膠腫細胞へのＲＧＣ３２遺伝子導入による癌原性の低下
神経膠腫細胞へのＲＧＣ３２遺伝子導入による細胞増殖活性に及ぼす影響を、足場依存性条件下でコロニー形成能に変化が見られるかを検討した。先ず、挿入遺伝子のアミノＮ末端にｍｙｃペプチドを付加したｐＣＭＶベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にＲＧＣ３２完全長ｃＤＮＡを挿入したものおよびコントロールとして挿入遺伝子なしのものを作製した（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ＲＧＣ３２、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−Ｍｏｃｋ）。これを、ＲＧＣ３２遺伝子の発現がみられないＵ−８７ ＭＧ細胞に導入した。遺伝子導入４８時間後その細胞溶解液を用いＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法にてｍｙｃタンパク質の発現を観察したところ、予想どおりｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ＲＧＣ３２を導入した細胞にのみｐＲＧＣ３２−Ｍｙｃ融合タンパク質の存在を確認した（図６、Ａ上）。別途ディッシュにＧ４１８存在下３週間培養したものを固定、クリスタルバイオレットにより染色しコロニーを計測した。Ｍｏｃｋに比べ、ＲＧＣ３２遺伝子を発現させることで有意にコロニー数を低下させることが確認された（図６、Ａ下）。
【００７３】
（９）神経膠腫細胞へのＲＧＣ３２遺伝子導入による増殖能の低下
細胞へのＲＧＣ３２遺伝子導入による細胞増殖活性に及ぼす影響について、増殖速度に変化が見られるかを検討した。ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ＲＧＣ３２とｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−Ｍｏｃｋを、ＲＧＣ３２遺伝子の発現がみられないＵ−８７ ＭＧ細胞に導入した。Ｇ４１８存在下３週間培養し構成的にｍｙｃ−ＲＧＣ３２を発現する細胞、および陰性コントロール細胞を樹立した。これら細胞についてその増殖速度について、テトラゾリウム塩（ＷＳＴ−１）を利用した生細胞中のミトコンドリア脱水素酵素によるホルマザン色素への変換にて色素で細胞数をモニター（同仁化学研究所：ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８）した（図６Ｂ）。９６ウェルプレートにて１ｘ１０3個を蒔き培養した。コントロール細胞（ｅｍｐｔｙ）に比しＲＧＣ３２タンパクが発現することでクローン１、２共に３日間の培養で明らかに細胞増殖が低下した。この結果から、ＲＧＣ３２タンパクは細胞内に発現することで細胞増殖を抑制する働きのあることが判明した。これまで知られている癌抑制遺伝子タンパクが細胞増殖を抑制したり、細胞死を誘導することにより生体を癌から守っていることから、ＲＧＣ３２タンパクの機能として癌抑制遺伝子産物としての働きがあることが示された。
【００７４】
（１０）一過性発現細胞でのＲＧＣ３２タンパク質集積部位の解析
Ｍｙｃ抗原を有するＲＧＣ３２タンパク質を発現させるためｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ＲＧＣ３２を８ウェルスライドグラスにて１０4個のＵ−８７ ＭＧ細胞に導入後、２４時間後に冷アセトン−メタノール（１：１）にて固定した。ブロッキング液（３％ＢＳＡ入りｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）と抗Ｍｙｃ抗体（１：２００）および抗β−ｔｕｂｕｌｉｎ抗体（１：２００、Ｓｉｇｍａ）にて２時間反応させた。その後１時間ＦＩＴＣ標識羊由来抗マウスＩｇＧ（１：４００、ＭＢＬ）およびＡｌｅｘａ ５９４標識羊由来抗ウサギＩｇＧ（１：１０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を反応させた。細胞核を染めるための対比染色のため４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）による染色を行い、ＥＣＬＩＰＳＥ Ｅ８００蛍光顕微鏡（ニコン）にて観察した（図７）。細胞周期上、分裂期（Ｍ期）を除く間期（ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ）に一過性発現したＲＧＣ３２タンパク質は細胞質上に広く分布し、特に核膜での分布が顕著に観察された。Ｍ期には、前期（ｐｒｏｐｈａｓｅ）で中心体（ｃｅｎｔｒｏｓｏｍｅ）への分布を観察し、前中期（ｐｒｏｍｅｔａｐｈａｓｅ）から中期（ｍｅｔａｐｈａｓｅ）に、最大染色強度を観察した。終期（ｔｅｌｏｐｈａｓｅ）と細胞質分裂（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ）の細胞では、中心体に低いレベルのＲＧＣ３２タンパク質が観察された。このことからＲＧＣ３２タンパク質は主として中心体において機能するタンパクであることが判明した。
【００７５】
（１１）ＲＧＣ３２タンパク質の細胞周期に与える影響の観察
ＲＧＣ３２ ｃＤＮＡをｐＴＲＥ２ｈｙｇにＧｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＧＦＰ）遺伝子とともに挿入した発現ベクター（ｐＴＲＥ２−ＧＦＰ−ＲＧＣ３２）を構築しＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を樹立した。同時にコントロールとして、ＧＦＰのみを有するベクター（ｐＴＲＥ２−ＧＦＰ）を用いた細胞も樹立した。ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ（Ｄｏｘ）添加後細胞溶解液を用い抗ＧＦＰ抗体（ＭＢＬ）にてＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 法でＧＦＰタンパクの存在を確認した。これら細胞において１０ｃｍ培養皿にて１０4個の細胞を播き２４時間後にＤｏｘ（１０μｇ／ｍｌ）を添加後さらに２４時間培養した。細胞を７０％冷エタノールにて固定後、ＲＮａｓｅ Ａ処理とｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ染色を行いｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ；ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ ＨＧ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））にて蛍光を測定し、ＢＤ ＣｅｌｌＱｕｅｓｔTM Ｐｒｏ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて解析した（図８）。その結果、Ｇ２／Ｍ期の細胞含量がコントロール（１６．５３％）に比べＧＦＰ−ＲＧＣ３２発現細胞で高い（２４．８７％）ことが判明した。このことからＲＧＣ３２タンパク質は細胞周期に対してＧ２／Ｍ期細胞を増加させる効果があることが示された。
【００７６】
（１２）ＲＧＣ３２タンパク質発現によるＧ２／Ｍ期の延長効果
対数増殖期の２種のＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞（ＧＦＰ−ＲＧＣ３２、ＧＦＰ）を１０ｃｍ培養皿にて１０6個の細胞を播き２４時間後に終濃度１０ｍＭのｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ）を５％Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）入りの培養液にて３７°Ｃで１５時間培養を行った。ＰＢＳにて３回洗浄後通常の培養液にて９時間培養し、さらに再度終濃度１０ｍＭのｔｈｙｍｉｄｉｎｅ存在下１５時間培養しＰＢＳにて３回洗浄後、通常の培養液中２４時間培養までＤｏｘ（１０μｇ／ｍｌ）存在下での経時時間を変えた細胞を用意した。これらをＦＡＣＳにて解析した（図９）。その結果、ＧＦＰに比しＧＦＰ−ＲＧＣ３２ではＤｏｘ添加後１０時間以降でＧ２／Ｍ期の細胞含量が高いことから、ＲＧＣ３２タンパク質の発現によりＧ２／Ｍ期の延長が起こったことを示す。
【００７７】
（１３）ＲＧＣ３２タンパク質のＰｌｋ１リン酸化酵素との相互作用の検証
ＲＧＣ３２タンパク質の発現によりＧ２／Ｍ期からＧ１期への移行が遅れ、Ｍ期に中心体に分布を示したことから有糸分裂のタンパクリン酸化酵素と結合するかについて検討した。まずＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞（ＧＦＰ−ＲＧＣ３２、ＧＦＰ）のＤｏｘ処理時間別の細胞溶解液をｐｒｏｔｅａｓｅ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ存在下ＮＰ−４０バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、２ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、 １００ｍＭ ＮａＦ、１０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｃａｈｙｄｒａｔｅ）にて溶解し、定法にて抗ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ １（Ｐｌｋ１）抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、抗ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ）、抗Ａｕｒｏｒａ−Ｂキナーゼ抗体（Ａｂｃａｍ）、抗Ａｕｒｏｒａ−Ａキナーゼ抗体（佐谷秀行氏より譲渡）、コントロールとして抗βアクチン抗体にてＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法にて解析した（図１０）。その結果、Ｐｌｋ１の分解のみが遅延しており、ＲＧＣ３２タンパク質がそれを遅らせＧ２／Ｍ期を延長させていることが示された。さらにＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞（ＧＦＰ−ＲＧＣ３２、ＧＦＰ）でＤｏｘ添加２４時間後の細胞をＮＰ−４０バッファーにて溶解後抗ＧＦＰ抗体にて４°Ｃ、２時間処理後Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅで４°Ｃで１時間処理した。これをＮＰ−４０バッファーで５回洗浄し、抗Ｐｌｋ１抗体にてＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法にて解析した（図１１）。その結果、ＧＦＰ−ＲＧＣ３２でのみ免疫沈降したＧＦＰに結合するＲＧＣ３２タンパク質に起因したＰｌｋ１の結合が観察された。さらにＰｌｋ１のタンパクリン酸化酵素活性に与えるＲＧＣ３２タンパク質の影響について検討した。全長ＲＧＣ３２のｃＤＮＡをｐＥＴ−２３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入（ｐＥＴ−２３ｄ−ＲＧＣ３２）し組み換えＨｉｓ６結合ＲＧＣ３２タンパク質をＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）大腸菌にて産生、Ｎｉ−ＮＴＡ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅｓｉｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い精製後ＰＢＳにて透析した。ヒト組み換えＰｌｋ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と組み換えＨｉｓ６結合ＲＧＣ３２タンパク質とを脱リン酸化α−ｃａｓｅｉｎ （Ｓｉｇｍａ）存在下４°Ｃ、３０分間Ｒａｆ バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ、 ２５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）中で［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを加え保温した。２μｌの６ｘＳＤＳサンプルバッファーを加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後オートラジオグラフィーにてシグナルを検出した（図１２）。Ｐｌｋ１、ＲＧＣ３２のＰｌｋ１によるリン酸化が検出される他（ＲＧＣ３２中のＴｈｒ８２とＴｈｒ１１３にＰｌｋ１によるリン酸化標的配列が存在）、Ｐｌｋ１によるα−ｃａｓｅｉｎのリン酸化をＲＧＣ３２タンパク質が阻害することが確認された。以上のことから、ＲＧＣ３２タンパク質はＰｌｋ１と結合しリン酸化酵素活性を抑制すると共にＰｌｋ１の分解を遅延させることにより、Ｇ２／Ｍ期を延長させていることが確認された。
【００７８】
（１４）結論
（ａ）アレイＣＧＨ法によるスクリーニングから、２２種の神経膠腫由来細胞におけるDNAのヘミ欠失遺伝子のスクリーニングが報告され、発現解析データを組み合わせた確認によりＲＧＣ３２遺伝子に高頻度に異常が観察された。
（ｂ）神経膠腫の臨床検体において有意にＲＧＣ３２遺伝子の発現とその病理学的な分類による悪性度に逆相関が見られた。また、ＲＧＣ３２遺伝子の発現量はｐ５３遺伝子の点突然変異があるもので発現量が低下する傾向も観察された。
（ｃ）ＲＧＣ３２遺伝子の発現はｐ５３遺伝子産物により正に制御されていることが明らかとなった。
（ｄ）ＲＧＣ３２タンパク質の無い癌細胞にＲＧＣ３２タンパク質を発現させることで、足場依存性増殖能の低下、細胞増殖速度の低下が起こることからＲＧＣ３２タンパク質は癌抑制遺伝子産物の働きを持つことが判明した。
（ｅ）ＲＧＣ３２タンパク質は核分裂期における中心体部位に局在し、Ｐｌｋ１リン酸化酵素と相互作用し、その酵素活性を低下、分解を遅らせることにより核分裂におけるＧ２／Ｍ期での細胞周期制御に関わっていることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、ＭＲＰ６３、ＡＬＯＸ５ＡＰ、ＲＧＣ３２およびＦ１０遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲにて２２種の神経膠腫（ｇｌｉｏｍａ）細胞株および正常脳にて検出した結果を示す。アスタリスクのあるＭａｒｃｕｓ細胞は染色体１３ｑでの遺伝子欠失がアレイＣＧＨ解析で確認された。
【図２】図２Ａは、神経膠腫の臨床検体３５個についてＲＧＣ３２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法にてＧＡＰＤＨ遺伝子をコントロールに測定し、病理組織学的な分類での相関を示した。ｌｏｗ−ｇｒａｄｅ ｄｉｆｆｕｓｅ ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ （Ｇｒａｄｅ ＩＩ）とｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ（ＧＢＭ 、Ｇｒａｄｅ ＩＶ）間で有意なＲＧＣ３２遺伝子の発現との逆相関が見られた。図２Ｂは、ｐ５３遺伝子の点突然変異の有無という観点からＲＧＣ３２遺伝子の発現について病理学的な分類毎に比較を行った。ｐ５３遺伝子の点突然変異はＧｒａｄｅを問わず存在し、有意差は無いがＲＧＣ３２遺伝子の発現量はｐ５３遺伝子の点突然変異があるもので発現量が低下する傾向が示された。
【図３】図３Ａは、ＲＧＣ３２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現のないＵ−３７３ ＭＧ細胞に於いてアデノウィルスＡｄ−ｐ５３ とコントロールアデノウィルスＡｄ−ｌａｃＺを感染後、ｐ２１とＧＡＰＤＨを陽性コントロールとして用い、ＲＴ−ＰＣＲ解析を行った結果を示す。図３Ｂは、ｐ５３遺伝子をホモ欠失（ｐ５３−／−）しているＨＣＴ１１６細胞および正常型（ｐ５３＋／＋）のＨＣＴ１１６細胞を用い、ＤＮＡ損傷を惹起するアドリアマイシン（ＡＤＲ）添加後のｐ５３、ｐ２１遺伝子のＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ解析とｐ２１、ＲＧＣ３２、コントロールのＧＡＰＤＨ遺伝子についてＲＴ−ＰＣＲ解析を行った結果を示す。図３Ｃは、ＲＧＣ３２遺伝子のゲノムＤＮＡ構造を図式化したものである。黒いボックスはエクソン構造を示す。楔形はｐ５３応答配列（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を示す。ＲＧＣ３２−ＲＥ２に関して実際のｐ５３応答配列との比較を示した。大文字はｐ５３応答配列に一致する塩基を、小文字は一致しない塩基を示す。Ｒはプリン塩基を、Ｙはピリミジン塩基を、ＷはＡまたはＴの塩基であることを示す。
【図４】図４は、ＲＧＣ３２−ＲＥ２およびＲＧＣ３２−ＲＥ２ｘ２（ＲＧＣ３２−ＲＥ２の２コピー）をルシフェラーゼレポータープラスミド（ｐＧＬ３−ＲＧＣ３２−ＲＥ２、ｐＧＬ３−ＲＧＣ３２−ＲＥ２ｘ２）に結合・構築し、ｐ２１ （ｐＧＬ３−ｐ５３ＣＢＳ）を陽性コントロールとし、ｐｈＲＬ−ＴＫベクターと共にＳａＯＳ２細胞にＳＶ４０の最小プロモーターを持つ野生型ｐ５３ （ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ｐ５３）乃至変異型ｐ５３（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ｐ５３Ｍｕｔ）あるいはコントロールの（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３）を遺伝子導入後、各３回のレポーター活性を測定した結果を示す。縦軸はｐＧＬ３のプロモーターのＭｏｃｋコントロールに対する相対活性を示す。
【図５】図５は、ＨＣＴ１１６（ｐ５３−／−）あるいはＨＣＴ１１６（ｐ５３＋／＋）を用い、ＡＤＲ（１μｇ／ｍｌ、２４時間）の添加の有無の違いにより細胞破壊液を調整し、それらを抗ｐ５３ 抗体または、陰性コントロールとして抗ＦＬＡＧ抗体にて免疫沈降したものを材料にその沈降物の中にどのようなＤＮＡが含まれるかを、ｐ２１ のプロモーター領域、ＲＧＣ３２−ＲＥ２、ＲＧＣ３２−ＲＥ３に特異的なプライマーを用いＰＣＲにて検出した。Ｉｎｐｕｔは免疫沈降前の細胞破壊液を用いた陽性コントロールを示す。
【図６】図６Ａ左上は、ＲＧＣ３２遺伝子の発現がみられないＵ−８７ ＭＧ細胞にＭｙｃが結合したＲＧＣ３２遺伝子発現ベクター（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ＲＧＣ３２）あるいは陰性コントロール（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−Ｍｏｃｋ）を遺伝子導入４８時間後に細胞破壊液１０μｇを用いその外部導入遺伝子の発現を抗Ｍｙｃ抗体にてＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法にて検出した結果を示す。図６Ａ左下は、上記条件の２種の遺伝子導入細胞を培地中にてＧ４１８存在下３週間培養し、コロニー形成能をクリスタルバイオレット染色にて観察した培養皿の写真を示す。図６Ａ右は、コロニー形成能の結果を径２ｍｍ以上のコロニーに関しまとめたもので、コントロールに比しＲＧＣ３２遺伝子を発現させることで、有意にコロニー形成能が低下したことを示す。図６Ｂは、Ｕ−８７ ＭＧ細胞にてＲＧＣ３２遺伝子（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ＲＧＣ３２）、陰性コントロールの（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−Ｍｏｃｋ（ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ））を遺伝子導入し、Ｇ４１８耐性であるクローンを樹立（ＲＧＣ３２遺伝子発現クローンは２種）後その細胞増殖速度を生細胞数として水溶性テトラゾリウム塩の色度にて検出した結果を示す。
【図７】図７は、ＲＧＣ３２遺伝子の発現がみられないＵ−８７ ＭＧ細胞にＭｙｃが結合したＲＧＣ３２遺伝子発現ベクター（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３−ＲＧＣ３２）を一過性に発現した細胞を用い、抗Ｍｙｃ抗体（赤）、β−チューブリン（緑）、ＤＡＰＩ（青）にてそれぞれ染色し、間期（ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ）から細胞質分裂（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ）期までを通して観察し、下段にはそれらを結合（Ｍｅｒｇｅ）した蛍光顕微鏡像を示した。
【図８】図８は、ＧＦＰもしくはＧＦＰ−ＲＧＣ３２のＤｏｘでの誘導後ＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞をＦＡＣＳ解析した結果を示す。矢印は４Ｎのピーク（Ｇ２／Ｍ期）を示す。
【図９】図９は、ＧＦＰもしくはＧＦＰ−ＲＧＣ３２を発現するＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞にて２回のチミジンによる細胞のＧ１／Ｓ同調解除後にＦＡＣＳ解析した結果を示す。矢印は４Ｎのピーク（Ｇ２／Ｍ期）を示す。ＧＦＰ−ＲＧＣ３２を発現するＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞ではコントロールのＧＦＰ発現細胞に比べＭ期からの移行に遅延がみられることが判明した。
【図１０】図１０は、ＧＦＰもしくはＧＦＰ−ＲＧＣ３２を発現するＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞にて２回のチミジンによる細胞のＧ１／Ｓ同調解除後にＭ期リン酸化酵素Ｐｌｋ１、ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、Ａｕｒｏｒａ−Ｂならびにコントロールのβアクチンについてそれぞれの抗体にてＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法にて検出した結果を示す。
【図１１】図１１は、ＧＦＰもしくはＧＦＰ−ＲＧＣ３２のＤｏｘでの誘導後ＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞破壊液を抗ＧＦＰ抗体にて免疫沈降後、抗Ｐｌｋ１抗体にてＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法にて検出した結果を示す。ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅは細胞破壊液コントロールでの検出を示す。
【図１２】図１２は、ＲＧＣ３２の遺伝子組み換えタンパク質を用意し、ヒト組み換えＰｌｋ１、脱リン酸化α−ｃａｓｅｉｎの組み合わせにより、Ｐｌｋ１リン酸化酵素活性をオートラジオグラフィーにて検出した結果を示した。
【配列表フリーテキスト】
【００８０】
SEQUENCE LISTING［配列表］
<110> Fuji Photo Film Co.
<120> A cancer-suppressing agent
<130> A61523A
<160> 2
<210> 1
<211> 895
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
gcggccgcgt cgaccggcgc ggctggagcg cagcgccgaa gggactggca gggctgaagt 60
gtgcgggaca gcaagccccc gaatagcccc ggctgccacc tcgcaggacc caaggccacg 120
cgcgccgggc ccagctgagc cgcctcatga agccgcccgc ggaggacctg tcggacgcgc 180
tgtgcgagtt tgacgcggtg ctggccgact tcgcgtcgcc cttccacgag cgccacttcc 240
actacgagga gcacctggag cgcatgaagc ggcgcagcag cgccagtgtc agcgacagca 300
gcggcttcag cgactcggag agtgcagatt cactttatag gaacagcttc agcttcagtg 360
atgaaaaact gaattctcca acagactcta ccccagctct tctctctgcc actgtcactc 420
ctcagaaagc taaattagga gacacaaaag agctagaagc cttcattgct gatcttgaca 480
aaactttagc aagtatgtga aacaagaagt tctgggtcct ttcatcataa gggagaagct 540
tcagaaagtt ccgaggacct gctaaaatca gctactagaa tctgctgcca gaggggacaa 600
agacgtgcac tcaaccttct accaggccac tctcaggctc accttaaaat cagcccttga 660
tcccatttct gggcaattta gacagtgaaa ctgactttgt ttacctgctt gcagcatatt 720
agaacagacg atccatgcta atattgtatt ttctcttaaa acatagcttt cctgtaattt 780
aaagtgcttt tatgaaaata tttgtaatta attatatata gttggaaata gcagtaagct 840
ttcccattat aatatatttt tgtatacaaa taaaatttga actgaacctc gtgcc 895
<210> 2
<211> 117
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Lys Pro Pro Ala Glu Asp Leu Ser Asp Ala Leu Cys Glu Phe Asp
1 5 10 15
Ala Val Leu Ala Asp Phe Ala Ser Pro Phe His Glu Arg His Phe His
20 25 30
Tyr Glu Glu His Leu Glu Arg Met Lys Arg Arg Ser Ser Ala Ser Val
35 40 45
Ser Asp Ser Ser Gly Phe Ser Asp Ser Glu Ser Ala Asp Ser Leu Tyr
50 55 60
Arg Asn Ser Phe Ser Phe Ser Asp Glu Lys Leu Asn Ser Pro Thr Asp
65 70 75 80
Ser Thr Pro Ala Leu Leu Ser Ala Thr Val Thr Pro Gln Lys Ala Lys
85 90 95
Leu Gly Asp Thr Lys Glu Leu Glu Ala Phe Ile Ala Asp Leu Asp Lys
100 105 110
Thr Leu Ala Ser Met
115
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＧＣ３２遺伝子又はその相同遺伝子を含有する癌抑制剤。
【請求項２】
前記遺伝子又はその相同遺伝子がベクターに組み込まれている、請求項１に記載の癌抑制剤。
【請求項３】
前記ベクターがウイルスベクター又は動物細胞発現用プラスミドベクターである、請求項２に記載の癌抑制剤。
【請求項４】
前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである、請求項３に記載の癌抑制剤。
【請求項５】
前記遺伝子又はその相同遺伝子がリポソームに封入されている、請求項１に記載の癌抑制剤。
【請求項６】
ＲＧＣ３２タンパク質又はその相同タンパク質を含有する癌抑制剤。
【請求項７】
ＲＧＣ３２遺伝子の全部又はその一部を含むＤＮＡ又はＲＮＡを用いて検体試料中のＲＧＣ３２遺伝子を解析する工程を含む、癌の診断方法。
【請求項８】
前記解析が遺伝子の変異の検出又は遺伝子の発現量の異常の検出である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＲＧＣ３２タンパク質に対する抗体又はその断片を用いて検体試料中のＲＧＣ３２タンパク質を解析する工程を含む、癌の診断方法。
【請求項１０】
前記解析がタンパク質の発現量の異常の検出である、請求項９に記載の方法。
【請求項１】
ＲＧＣ３２遺伝子又はその相同遺伝子を含有する癌抑制剤。
【請求項２】
前記遺伝子又はその相同遺伝子がベクターに組み込まれている、請求項１に記載の癌抑制剤。
【請求項３】
前記ベクターがウイルスベクター又は動物細胞発現用プラスミドベクターである、請求項２に記載の癌抑制剤。
【請求項４】
前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである、請求項３に記載の癌抑制剤。
【請求項５】
前記遺伝子又はその相同遺伝子がリポソームに封入されている、請求項１に記載の癌抑制剤。
【請求項６】
ＲＧＣ３２タンパク質又はその相同タンパク質を含有する癌抑制剤。
【請求項７】
ＲＧＣ３２遺伝子の全部又はその一部を含むＤＮＡ又はＲＮＡを用いて検体試料中のＲＧＣ３２遺伝子を解析する工程を含む、癌の診断方法。
【請求項８】
前記解析が遺伝子の変異の検出又は遺伝子の発現量の異常の検出である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＲＧＣ３２タンパク質に対する抗体又はその断片を用いて検体試料中のＲＧＣ３２タンパク質を解析する工程を含む、癌の診断方法。
【請求項１０】
前記解析がタンパク質の発現量の異常の検出である、請求項９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００８−３１０６３（Ｐ２００８−３１０６３Ａ）
【公開日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２０４６０１（Ｐ２００６−２０４６０１）
【出願日】平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【出願人】（５０４１７９２５５）国立大学法人 東京医科歯科大学 (228)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【出願人】（５０４１７９２５５）国立大学法人 東京医科歯科大学 (228)
【Ｆターム（参考）】
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