本発明は、酸性セラミダーゼ阻害剤およびコリンキナーゼ阻害剤を含んでなる組成物に関するとともに、癌治療におけるその用途に関する。 本発明はまた、酸性セラミダーゼレベルの検出に基づいて、癌患者のための個別化治療を選択する方法に関する。さらに本発明はまた、コリンキナーゼ阻害剤および化学療法剤を含んでなる組成物ならびに癌治療におけるその用途に関する。最後に、本発明はまた、コリンキナーゼ阻害剤および細胞死受容体リガンドを含んでなる組成物および癌治療におけるその用途に関する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は治療法の分野に関し、より詳細には、個別に使用される複数の治療用化合物と比較して、改善された作用を示す該化合物含有組成物を用いた癌治療法の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
コリンキナーゼは、ケネディ経路やフォスファチジルコリン（ＰＣ）合成経路の第1酵素である。コリンキナーゼは、リン酸基供与体としてアデノシン５’‐三リン酸（ＡＴＰ）を用いてコリンをホスホリルコリン（ＰＣｈｏ）にリン酸化することにより作用する。Ｒａｓ遺伝子は、所謂癌遺伝子の一ファミリーを形成する。癌遺伝子は、全ヒト腫瘍の２５〜３０％において活性化し、幾つかのヒト腫瘍では９０％において活性化することから広く研究されてきている。Ｒａｓタンパク質は、細胞の増殖、最終分化、老化の制御に関与するため、細胞内シグナル伝達において重要な役割を担っている。様々な癌遺伝子、その中でも特にｒａｓ癌遺伝子は形質転換を促進させ、コリンキナーゼ活性レベル(level)が亢進されて、生成物のＰＣｈｏの細胞内レベルが異常に増加する結果となる。補足的な知見で、ヒト腫瘍の発生におけるＣｈｏＫの役割が裏付けられている。例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法により、正常細胞と比べて、乳房、前立腺、脳および卵巣腫瘍等幾つかのヒト腫瘍細胞では、ＰＣｈｏが高レベルで認められることが分かっている。一般的な認識として、ｒａｓはヒト発癌において最も深く研究されている癌遺伝子の一つであり、ＣｈｏＫ阻害が、癌遺伝子により形質転換された細胞での新しい有効な抗腫瘍戦略であると証明されている。これらの初期の知見は、その後、ｉｎ ｖｉｖｏでヌードマウスにおいて推定された。
【０００３】
このようなデータから考えて、コリンキナーゼ活性やホスホリルコリンによって活性化する酵素に対して、個々にまたは組み合わせることで直接作用する複数の化合物を設計すれば、効果的な抗腫瘍療法の開発が可能になる。
【０００４】
その意味で、ＣｈｏＫ阻害剤の研究により、比較的強力かつ選択的遮断薬としてＨｅｍｉｃｈｏｌｉｎｉｕｍ−３（ＨＣ−３）が同定されている（Cuadrado A., et al, 1993, Oncogene 8: 2959-2968, Jimenez B., et al., 1995, J. Cell Biochem. 57: 141-149; Hernandez-Alcoceba, R. et al., 1997, Oncogene, 15 :2289-2301）。ビフェニル構造を持つこのコリン同族体は、新規の抗腫瘍薬の設計に使われてきた。とは言え、ＨＣ−３は、呼吸器系の強力な麻痺薬であるため、臨床現場での使用にとって適切な候補ではない。ＣｈｏＫ阻害活性を改善し毒性作用を低減した誘導体の幾つかは、ＨＣ−３の構造を基にその修飾構造を導入して合成されている。
【０００５】
ピリジニウム由来の対称型ビス４級化合物も、細胞全体においてＰＣｈｏ生成を阻害することが分かっている（国際公開番号ＷＯ９８／０５６４４）。しかし、これらの誘導体には、その治療適用拡大を限定する高レベルの毒性がある。
【０００６】
化学療法抵抗性（「薬剤耐性」）は、今日癌治療に使用される多くの化学療法の有効性を制限する根本的問題である。薬剤耐性は、様々なメカニズムに因って発生する可能性がある。例えば、薬剤不活化の上昇、薬剤蓄積の減少、癌細胞からの薬剤排出、化学療法に起因する傷害の治療強化、生存促進性経路の活性化および細胞死経路の不活性化である（Hersey P. et al., 2008, Adv Exp Med Biol. 2008;615:105-26）。薬剤耐性は、抗腫瘍治療の開始前から、腫瘍細胞に本来備わっている場合がある。また、特定の薬剤耐性メカニズムは、腫瘍細胞が特定の治療薬に曝露後活性化されることがある。先天的または後天的耐性に関与するそれらの分子実体の同定によって、こうした薬剤耐性の克服に有効と思われる強力な分子標的に関する貴重な情報が得られる可能性がある。したがって、規定された腫瘍特異治療法のために、薬剤耐性を与える分子成分の阻害を目的とした戦略の設計は、癌治療効率向上に向けて重要な一歩前進になる。
【０００７】
Mori et al.（Cancer Res., 2007, 67:11284-11290）は、ＣｈｏＫ阻害剤（コリンキナーゼ特異ｓｉＲＮＡ）および５−フルオロウラシルの併用が、乳癌細胞の細胞増殖／生存能力の低減に相乗効果を生み出す結果となったと述べている。しかし、この治療法は、ｉｎ ｖｉｖｏで効率的に標的細胞に輸送されないｓｉＲＮＡの使用に依存している。また、この目的のために設計されたｓｉＲＮＡは、ＣｈｏＫαおよびＣｈｏＫβの両種類を認識する（Mori et al., Cancer Res., 2007, 67: 11284-11290）が、ＣｈｏＫαおよびＣｈｏＫβのみが、腫瘍学の分子標的となっており（国際公開番号ＷＯ２００６１０８９０５および 同時係属中のスペイン特許出願番号Ｐ２００８００４１６）、この戦略が強力な治療用途になるのかは疑問である。
【０００８】
それでも、腫瘍治療に使用できるように、ＣｈｏＫ酵素の阻害活性を高める化合物を開発する必要は大いにあるが、同時にそうした化合物は、最先端の化合物に対する毒性がかなり低い。
【発明の概要】
【０００９】
第1の態様によれば、本発明は、1種以上のコリンキナーゼ阻害剤を含んでなる第1の成分と、1種類以上の酸性セラミダーゼ阻害剤、１種類以上の化学療法剤および1種類以上の細胞死受容体リガンドより選択される第２の成分を、個別にまたは共に含んでなる組成物に関する。
【００１０】
第２の態様によれば、本発明は、本発明の組成物および薬学的に許容される担体または賦形剤を含んでなる医薬組成物に関し、また、その医学的用途、特に癌治療におけるその用途に関する。
【００１１】
もう一つの態様によれば、本発明は、コリンキナーゼ阻害剤に対する腫瘍細胞の感受性を高めるために、酸性セラミダーゼ阻害剤、化学療法剤または細胞死受容体リガンドの用途に関する。
【００１２】
さらにもう一つの態様によれば、本発明は、ＣｈｏＫ阻害剤療法に耐性を示す癌患者の同定方法に関し、前記同定方法は、該患者由来の試料中における酸性セラミダーゼレベルを定量することを含んでなり、前記試料中の酸性セラミダーゼレベルが基準試料(reference sample)よりも高い場合、該患者はＣｈｏＫ阻害剤耐性であると同定される。
【００１３】
もう一つの態様によれば、本発明は、癌患者のための個別化治療の選択方法に関し、前記選択方法は、該患者由来の試料中の酸性セラミダーゼレベルを定量することを含んでなり、酸性セラミダーゼの発現レベルが基準試料より高ければ、該患者は、ＣｈｏＫ阻害剤および酸性セラミダーゼ阻害剤の併用療法の候補者である。
【００１４】
さらにもう一つの態様によれば、本発明は、癌治療に対するＣｈｏＫ阻害剤の治療効果を高めることができる化合物の同定方法に関し、前記同定方法は、
（ｉ）ＣｈｏＫ阻害剤に耐性を示す腫瘍細胞を、候補化合物と接触させる工程と、
（ｉｉ）前記細胞中の酸性セラミダーゼレベルを定量する工程とを含んでなり、候補化合物による治療後、細胞中の酸性セラミダーゼレベルが治療前より低い場合、前記候補化合物は、癌治療に対するＣｈｏＫ阻害剤効果を高めることができるとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】非小細胞肺癌患者の腫瘍の初代培養細胞における、治療薬ＭＮ５８ｂに対する反応性を示す。
【図２】ＲＴ−ｑＰＣＲによるマイクロアレイ解析結果の検証である。
【図３】非小細胞肺癌におけるＣｈｏＫ阻害耐性のメカニズムを示すための提案モデルである。
【図４】ＲＴ−ｑＰＣＲにより定量された、ヒト肺癌由来の様々な細胞株に含まれるＡＳＡＨ１およびＣｈｏＫのレベルを示す。
【図５】ｑＲＴ−ＰＣＲにより定量されたＡＳＡＨ１遺伝子の発現およびＣｈｏＫ阻害剤耐性細胞株Ｈ４６０において、ウエスタンブロット解析により定量された酸性セラミダーゼタンパク質の発現を示す。
【図６】シスプラチン／ＣｈｏＫ阻害剤の併用連続療法の相乗効果を示す。
【図７】非小細胞肺癌異種移植片におけるシスプラチン／ＣｈｏＫ阻害剤の併用療法を示し、（Ａ）：ＭＮ５８ｂ／シスプラチン（統計的有意性：ＭＮ５８ｂ、ｐ＝０．０９；シスプラチン、ｐ＝０．３；連続投与、ｐ＝０．０１７；並行投与ｐ＝０．０１６）、（Ｂ）：非小細胞肺癌異種移植片における併用療法（統計学的有意性：ＲＳＭ−９３２Ａ（９３２Ａ）、ｐ＝０．１５７；シスプラチン（ＤＰＰ）、ｐ＝０．４４１；連続的ＤＰＰおよびＴＣｄ−１７１療法（ＳＥＣ）、ｐ＝０．０３）；（Ｃ）対照群およびＣｈｏＫ阻害剤投与マウスの毒性測定としての体重モニタリング（２ｍｇ／Ｋｇ）、シスプラチン（１ｍｇ／Ｋｇ）および併用療法群；（Ｄ）併用療法に比べて、シスプラチン単独の同様な抗腫瘍活性は、毒性が有意に上昇する結果となる。
【図８】指定細胞株における、コリンキナーゼ阻害剤（Ａ）ＲＳＭ−９３２Ａ（ＣｈｏＫＩ）または（Ｂ）ＴＲＡＩＬに対する腫瘍細胞の感受性を示す。
【図９】ＣｈｏＫＩおよびＴＲＡＩＬの併用療法による協調効果を示す。
【図１０】大腸癌細胞におけるＭＮ５８ｂおよびＴＲＡＩＬの併用療法の相乗効果を示す。
【図１１】流動細胞分析法により判定された大腸癌細胞におけるＭＮ５８ｂおよびＴＲＡＩＬの併用療法の相乗効果を示す。
【図１２】ＣｈｏＫ阻害によるＤＲ５発現の増加を示す。
【図１３】ＣｈｏＫＩ／ＴＲＡＩＬ併用療法後のセラミド生成を示す。
【図１４】大腸異種移植片におけるＣｈｏＫＩ／ＴＲＡＩＬ併用療法を示す。
【図１５】大腸癌細胞におけるＣｈｏＫ阻害剤および５−ＦＵによる併用療法の相乗効果を示す。
【図１６】流動細胞分析法により判定された大腸癌細胞におけるＣｈｏＫ阻害剤および５−ＦＵによる併用療法の相乗効果を示す。
【図１７】大腸異種移植片におけるＣｈｏＫＩ／５−ＦＵ併用療法を示す。
【発明の具体的説明】
【００１６】
ＣｈｏＫ阻害剤および酸性セラミダーゼ阻害剤の併用
（本発明の第１の成分）
本発明の発明者らは、コリンキナーゼ（ＣｈｏＫ）阻害剤耐性の原発性ヒト腫瘍の存在を同定している（図１）。詳細には、本発明の実施例１では、ヒト非小細胞肺癌組織由来の種々の初代培養細胞が、公知のＣｈｏＫ阻害剤であるＭＮ５８ｂに対する分差感度を示すと述べている（図１）。驚くことに、この耐性は、本発明の実施例２および３で示されるように、酸性セラミダーゼの発現レベルの上昇によって引き起こされることが分かっている（図２）。ＣｈｏＫの機能は、Ｃｈｏをリン酸化してホホコリン（Ｐｃｈｏ）を生成することである。ホホコリンは、原形質膜の主要構成成分フォスファチジルコリン（ＰＣ）の前駆体である（Lacal JC, IDrugs. 2001; 4:419-26）。しかし、細胞膜そして故にＰＣが、細胞増殖には絶対的に必要である。したがって、いかなる理論によっても縛られたくないとは思うが、腫瘍細胞は、スフィンゴミエリン（ＳＭ）の分解でＰＣｈｏを生成する代替経路の活性化によって、ＣｈｏＫ阻害に反応すると考えられている（図３）。しかし、ＳＭの分解は、ＰＣｈｏ生成のみならず、アポトーシス促進物質であるセラミドの生成にもつながり、結果的に腫瘍細胞には、アポトーシス細胞死が引き起こされる。興味深いことには、そうしたＣｈｏＫ阻害耐性の細胞には、アポトーシス促進性セラミドの分裂促進性スフィンゴシン−１Ｐへの転換を促進する酵素である酸性セラミダーゼのレベル上昇が見られることが、ここで同定されている（図３）。これらの結果により、酸性セラミダーゼの過剰発現は、細胞内でのセラミドレベルが減少するために、ＣｈｏＫ阻害による細胞死促進を抑制する可能性があることが示唆される。このため、腫瘍細胞内でＣｈｏＫ阻害により誘起されたアポトーシス促進性シグナルは、酸性セラミダーゼの過剰発現によって不活性化される。その上、生成されたセラミドは、分裂促進性スフィンゴシン−１Ｐに転換される可能性がある（図３）。
【００１７】
こうした所見は、ＣｈｏＫ阻害剤への感受性を、酸性セラミダーゼの並行投与によって高めることにより、癌治療改善の可能性を広げるものである。事実、本願の実施例４には、酸性セラミダーゼ阻害剤ＮＯＥを使用した非小細胞肺癌由来腫瘍細胞の治療が、ＣｈｏＫ阻害剤に対する感受性を上昇させた結果が示されている。さらには、ＣｈｏＫ阻害剤ＭＮ５８ｂまたはＲＳＭ−９３２Ａおよび酸性セラミダーゼ阻害剤Ｄ−ＮＭＡＰＰＤの併用療法では、これらの阻害剤の単独使用と比べ、もしくは、ＣｈｏＫ阻害剤およびアルカリ性セラミダーゼ特異阻害剤の併用と比べて、抗腫瘍効果が改善している（実施例４参照）。このように、酸性セラミダーゼ阻害剤およびＣｈｏＫ阻害剤の併用投与を行えば、その後に投与される化合物の投薬量を低減することができ、好ましくない副作用の減少につながる。
【００１８】
したがって、第１の態様によれば、本発明は、１種以上のコリンキナーゼ阻害剤を含んでなる第１の成分と、１種以上の酸性セラミダーゼ阻害剤を含んでなる第２の成分を、個別にまたは共に含んでなる組成物（以下、本発明の第１の組成物という）を提供する。
【００１９】
「組成物」という用語は、本発明の代替的態様に係る種々の組み合わせにおいて、１種類以上の化合物を意味する。好ましくは、前記組成物は、少なくとも１種類の酸性セラミダーゼ阻害剤および少なくとも１種のＣｈｏＫ阻害剤を含んでなる。
【００２０】
ここで使用されるコリンキナーゼは、ホスホリルコリン（ＰＣｈｏ）生成のために、ＡＴＰ存在下でコリンのリン酸化を触媒する酵素を意味する（EC 2.7.1.32）。本発明によれば、阻害可能なコリンキナーゼとしては、例えば、コリンキナーゼα等がある（ＵｎｉＰｒｏｔにおいて、ヒト、マウスおよびラットの各タンパク質を、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｐ３５７９０，０５４８０４およびＱＯｌ１３４によって規定）。
【００２１】
ここで使用される酸性セラミダーゼ（Ｎ−アシルスフィンゴシン デアシラーゼ活性、ＥＣ ３．５．１．２３）は、リソソーム内におけるセラミドのスフィンゴシンおよび遊離脂肪酸への分解に関与する脂質加水分解酵素である。細胞には、少なくとも３種類のセラミダーゼが含まれている。これらのセラミダーゼは、活性および場所毎にその至適ｐＨに応じて（Li CM. et al., Genomics, 1999, 62:223-31）、酸性セラミダーゼ（ＡＳＡＨ１、ＮＭ＿１７７９２４．３またはＱ１３５１０）、中性セラミダーゼ（ＡＳＡＨ２，ＮＭ Ｏ １９８９３またはＱ９ＮＲ７１）ならびにアルカリ性セラミダーゼ（ＡＳＡＨ３，ＮＭ＿１３３４９２，Ｑ８ＴＤＮ７またはＱ５ＱＪＵ３）に分類される。第２の酸性セラミダーゼ（酸性セラミダーゼ様またはＡＳＡＨＬとして公知である）ポリペプチドについての記述もある（ＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｑ０２０８３）。本発明で使用する阻害剤は、少なくとも酸性セラミダーゼおよび／または酸性セラミダーゼ様タンパク質を阻害するものである。これは、その他の２種類のセラミダーゼはいずれも、ＣｈｏＫ阻害剤耐性細胞における発現が有意に増加するためである。
【００２２】
酸性セラミダーゼ活性は、幾つかの種類のヒト癌において異常に発現する。この酵素は、癌における新たな標的として有用かもしれないし、また、抗腫瘍形成治療耐性に関与している可能性がある（Seelan RS., Genes Chromosomes Cancer. 2000, 29:137-46; Liu X., Front Biosci. 2008;13:2293-8 and Morales A., Oncogene. 2007, 26:905-16）。
【００２３】
コリンキナーゼ阻害剤
ここで使用されるコリンキナーゼ阻害剤としては、Ｃｈｏｋ活性を低下させることが可能な何らかの化合物に関連し、例えば、当該酵素の活性を低下させるＣｈｏｋ阻害化合物に加え、ＣｈｏＫ遺伝子の発現を妨げ、ＣｈｏＫ ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを低減する化合物等がある。
【００２４】
一つの好ましい態様によれば、コリンキナーゼ阻害剤は、コリンキナーゼα特異である。
【００２５】
ＣｈｏＫ ｍＲＮＡレベルを低減させる化合物は、ｍＲＮＡ発現レベルを定量するための標準的アッセイを用いて同定することができる。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ，ＲＮＡ保護分析、ノーザンブロット法、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション、マイクロアレイ技術等がある。
【００２６】
ＣｈｏＫタンパク質レベルを低減させる化合物は、タンパク質発現レベル定量用の標準的アッセイを用いて同定することができる。例えば、ウエスタンブロット法またはウエスタントランスファー法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）、ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＩＡ（競合型酵素免疫測定法）、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ（二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）、免疫細胞化学的・免疫組織化学的手法、特定の抗体を含むプロテインチップまたはマイクロアレイ使用に基づく手法、ディップスティック等の形態でのコロイド沈殿に基づくアッセイ等がある。
【００２７】
コリンキナーゼの生物学的活性に対する阻害能の定量は、コリンキナーゼの活性を測定するために標準的アッセイを用いて検出を行う。例えば、精製・組換えコリンキナーゼまたはコリンキナーゼ中に濃縮された分画の存在下で、ＡＴＰにより［１４Ｃ］標識コリンをリン酸化し、ＥＰ１７１０２３６記載の標準的分析手法（ＴＬＣ等）を用いて、該リン酸化コリンの検出を行う方法等がある。
【００２８】
化合物がコリンキナーゼα（ＣｈｏＫα）に特異的である場合、ＣｈｏＫαに特異的で、緊縮条件下で他のアイソフォーム（ＣｈｏＫβ等）とハイブリダイズしないＣｈｏＫプローブを用いてＣｈｏＫα ｍＲＮＡのレベル低下を検出するか、またはＣｈｏＫαに特異的で、他のアイソフォーム（ＣｈｏＫβ等）と結合しない抗体を用いてＣｈｏＫαタンパク質のレベル低下を検出することによって同定されることができる。ＣｈｏＫα ｍＲＮＡおよびＣｈｏＫαタンパク質レベルを特異的に定量するための好適な試薬については、国際公開番号ＷＯ２００６１０８９０５に詳細に記載されている。
【００２９】
本発明の第１の組成物において使用可能なコリンキナーゼ阻害剤の例を、表１のＩからＸＶＩＩＩに記載する。
【００３０】
【表１】





















【００３１】
酸性セラミダーゼ阻害剤
ここで使用される酸性セラミダーゼ阻害剤としては、酸性セラミダーゼ活性の低下を生じさせることが可能な何らかの化合物に関連し、例えば、酸性セラミダーゼの活性部位に結合して当該酵素の活性を低下させる化合物に加えて、酸性セラミダーゼ遺伝子の発現を妨げ、酸性セラミダーゼｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを低減させる化合物等がある。
【００３２】
ここで使用される「酸性セラミダーゼ阻害剤」という表現は、酸性セラミダーゼ活性の低下を生じさせることが可能な何らかの化合物に関連し、酸性セラミダーゼの活性部位に結合して当該酵素の活性を低下させる化合物に加えて、酸性セラミダーゼ遺伝子の発現を妨げ、酸性セラミダーゼｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを低減させる化合物等が挙げられる。
【００３３】
酸性セラミダーゼｍＲＮＡのレベルを低減させる化合物の同定には、ｍＲＮＡ発現レベルを定量するための標準的アッセイを用いることができる。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ，ＲＮＡ保護分析、ノーザンブロット法、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション、マイクロアレイ技術等がある。
【００３４】
酸性セラミダーゼタンパク質のレベルを低減させる化合物は、タンパク質発現レベル定量用の標準的アッセイを用いて同定することができる。例えば、ウエスタンブロット法またはウエスタントランスファー法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）、ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＩＡ（競合型酵素免疫測定法）、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ（二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）、免疫細胞化学的・免疫組織化学的手法、特定の抗体を含むプロテインチップまたはマイクロアレイ使用に基づく手法、ディップスティック等の形態でのコロイド沈殿に基づくアッセイ等がある。
【００３５】
酸性セラミダーゼの酵素活性を低下させる酸性セラミダーゼ阻害剤の同定には標準的アッセイを用いることができ、精製酸性セラミダーゼまたは酸性セラミダーゼ中に濃縮された分画および該酵素の基質を用いて、酸性セラミダーゼの活性を測定する。例えば、ＥＳ２２３３２０４に記載の方法は、Ｎ−（１２−（４−ニトロベンゼン−２−オキサ−１，３−ジアゾロ）ドデシル）スフィンゴシン（サー−Ｃ１２−ＮＢＤ）の加水分解の阻害に基づいている。
【００３６】
本発明の第１の組成物において使用可能な非限定的酸性セラミダーゼ阻害剤または酸性セラミダーゼ様阻害剤の例を、表２のＩ〜ＸＩＩＩに記載する。
【００３７】
【表２】










【００３８】
酸性セラミダーゼまたはコリンキナーゼに対する特異的な阻害抗体
酸性セラミダーゼまたはコリンキナーゼに存在するエピトープに対する抗体は、これらのタンパク質の機能を効果的に遮断する可能性があり、したがって、本発明の組成物の阻害剤として使用することができる。ここで使用される“阻害抗体”とは、酸性セラミダーゼまたはコリンキナーゼの生物学的活性を少なくとも部分的に阻害することができる抗体を意味する。
【００３９】
酸性セラミダーゼの生物学的活性に対する阻害能の定量は、標準的アッセイを用いた検出を行い、精製酸性セラミダーゼまたは酸性セラミダーゼ中に濃縮された分画を使用して酸性セラミダーゼ活性を測定する。その方法としては、例えば、スペイン特許ＥＳ２２３３２０４号に記載されているように、Ｎ−（１２−（４−ニトロベンゼン−２−オキサ−１，３−ジアゾロ）ドデシル）スフィンゴシン（サー−Ｃ１２−ＮＢＤ）の加水分解を阻害する抗体の能力に基づく方法等がある。
【００４０】
コリンキナーゼの生物学的活性に対する阻害能の定量は、コリンキナーゼの活性を測定するために標準的アッセイを用いて検出を行う。例えば、精製・組換えコリンキナーゼまたはコリンキナーゼ中に濃縮された分画の存在下で、ＡＴＰにより［１４Ｃ］標識コリンをリン酸化し、欧州特許ＥＰ１７１０２３６号記載の標準的分析手法（ＴＬＣ等）を用いて、該リン酸化コリンの検出を行う方法等がある。
【００４１】
コリンキナーゼもしくは酸性セラミダーゼに特異的な阻害抗体または断片は、容易に入手可能であるか、または従来の分子生物学的手法によって容易に生成可能である。例えば、酸性セラミダーゼまたはコリンキナーゼ由来の免疫原を用いて、標準プロトコルを使用することによって、抗タンパク質／抗ペプチドの抗血清もしくはモノクローナル抗体を入手することが可能である（参照例：Antibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)）。マウス、ハムスター、ウサギのような哺乳動物は、ペプチド免疫原（抗体反応を誘導できる酸性セラミダーゼ、コリンキナーゼまたはその抗原断片等）で免疫処置されることができる。タンパク質またはペプチドに免疫原性を与える方法は、担体分子への接合または当該分野で公知の他の手法がある。ポリペプチドの免疫原性部分は、アジュバントの存在下で投与されることができる。
【００４２】
免疫化の進行は、血漿または血清中の抗体力価を検出することによってモニタリングすることができる。標準的ＥＬＩＳＡまたは他の免疫測定法により、抗原としての免疫原を用いて、抗体のレベルを評価することができる。１つの好ましい態様によれば、本発明の組成物の一部を構成する抗体は、酸性セラミダーゼまたはコリンキナーゼ（またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９８％の同一性を有するバリアント）の抗原決定基に対し免疫特異的である。ある態様によれば、免疫特異的な患者抗体は、無脊椎生物（酵母菌等）の酸性セラミダーゼまたはコリンキナーゼ関連プロテインとは実質的に交差反応しない。「実質的に交差反応しない」とは、該抗体が、酸性セラミダーゼまたはコリンキナーゼに対する該抗体の結合親和性よりも、少なくとも１桁小さい、より好ましくは少なくとも２桁小さい、さらにより好ましくは少なくとも３桁小さい、非相同タンパク質に対する結合親和性を有することを意味している。
【００４３】
したがって、本発明の抗体は、コリンキナーゼまたは酸性セラミダーゼのエピトープに結合することが可能であるが、エピトープの形成には、典型的には少なくとも６，８，１０もしくは１２個の連続アミノ酸が必要であり、非連続アミノ酸から成るエピトープは、もっと多く、例えば、少なくとも１５，２５もしくは５０個のアミノ酸が必要になる可能性がある。「本発明の抗体」という用語は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、それら抗体のＦａｂおよび1本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、二重特異性抗体、ヘテロ結合体、ヒトおよびヒト化抗体等を含む。このような抗体は種々の方法で生成されることができる。例えば、ハイブリドーマ培養、細菌または哺乳類細胞の培養による組換え発現、および遺伝子導入動物による組換え発現等がある。また、抗体は、繊維状ファージ、細菌、酵母菌またはリボソーム等の表示系で発現した配列からなるライブラリーから配列を選択して生成されることができる。特定の生成方法を選択するための文献、例えば、Chadd and Chamow, Curr. Opin. Biotechnol, 12:188-194 (2001)には豊富な案内情報がある。生成方法の選択を左右する幾つかの要因がある。例えば、望ましい抗体構造、抗体における炭水化物部位の重要性、培養および精製の容易さ、ならびにコスト等である。多くの様々な抗体構造は、標準的発現技術を用いて形成することができる。抗体構造には、例えば、全長抗体、ＦａｂおよびＦｖ断片等の抗体断片、さらには、異なる種由来の構成部分を含んでなるキメラ抗体等がある。ＦａｂおよびＦｖ断片等の、小サイズで、エフェクター機能を持たず限られた薬物動態的活性を有する抗体断片は、細菌発現系での生成が可能である。1本鎖Ｆｖ断片は、免疫原性が低く、血液から迅速にクリアランスされる。
【００４４】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもよい。このようなポリクローナル抗体は、非ヒト哺乳類等の哺乳類で、例えば、下記のような免疫剤および、好ましくは、アジュバントを一回以上注射して生成することができる。典型的には、免疫剤および／またはアジュバントは、一連の皮下もしくは腹膜内注射により哺乳類に投与される。免疫剤は、コリンキナーゼ、酸性セラミダーゼまたはそれらの断片、それらの融合タンパク質、またはコリンキナーゼもしくは酸性セラミダーゼを発現する細胞等であってよい。このようなタンパク質、断片、または調製物は、適切なアジュバントの存在下で非ヒト哺乳類に導入される。免疫原の別の投与形態は、細胞表面に膜貫通型タンパク質として投与される（例えば、Spiller et al. J. Immunol. Methods, 224: 51-60 (1999)に記載の方法）。これらの細胞は、自然に抗原を発現する細胞であってもよく、または、他のＤＮＡ配列のうち抗原をコードする配列、細胞内での十分な発現に必要な配列を含むＤＮＡ構築物で細胞のトランスフェクションを行った後に、抗原の発現が得られる細胞であってもよい。こうしたアプローチは、細胞膜が、抗原が発現する天然部位である場合だけではなく、細胞内で一旦合成された抗原であっても、抗原をコードする配列に付加されるシグナルペプチドによって、これらの場所に送られる場合でも可能である。血清中に、もしも好ましくないエピトープに対するポリクローナル抗体が含まれる場合、該ポリクローナル抗体は、免疫親和性クロマトグラフィーによって精製されることができる。
【００４５】
あるいはまた、前記抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマで生成されてもよい。その場合、マウス、ハムスター、または他の妥当な宿主動物を免疫剤で免疫化し、該免疫剤に特異的に結合する抗体を生成するもしくは生成可能なリンパ球を誘導する（参照例：Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975)）。前記免疫剤としては、典型的には、コリンキナーゼ、酸性セラミダーゼまたはそれらの受容体、断片、もしくは融合タンパク質、および必要に応じて、担体またはコリンキナーゼもしくは酸性セラミダーゼが濃縮された粗タンパク質調製物、または、前記タンパク質のいずれかを発現する細胞等がある。このようなタンパク質、断片または調製物は、適切なアジュバントの存在下で非ヒト哺乳類に導入される。免疫原の別の投与形態は、細胞表面に膜貫通型タンパク質として投与される（例えば、Spiller et al. J. Immunol. Methods, 224: 51-60 (1999)に記載の方法）。これらの細胞は、自然に抗原を発現する細胞であればどの細胞でもよく、または、他のＤＮＡ配列のうち抗原をコードする配列、細胞内での十分な発現に必要な配列を含むＤＮＡ構築物で細胞のトランスフェクションを行った後に、抗原の発現が得られる細胞ならどのようなものでもよい。こうしたアプローチは、細胞膜が、抗原が発現する天然部位である場合だけではなく、細胞内で一旦合成された抗原であっても、抗原をコードする配列に付加されるシグナルペプチドによって、これらの場所に送られる場合でも可能である。あるいは、リンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化してもよい。一般に、もし非ヒト哺乳類ソースが望ましい場合は、脾臓細胞またはリンパ節細胞が用いられ、もしヒト由来の細胞が望ましい場合には、末梢血リンパ球（「ＰＢＬｓ」）が用いられる。これらのリンパ球は、ポリエチレングリコール等の好適な融剤を使用して不死化細胞株と融合されてハイブリドーマ細胞が生成される。一般に、不死化細胞株は、ラット、マウス、ウシまたはヒト由来の骨髄腫細胞である。前記ハイブリドーマ細胞は、好適な培地、好ましくは非融合の不死化細胞の増殖または生存を阻害する一種類以上の物質を含む培地で培養される。クローンは、限界希釈法およびハイブリ
ドーマ細胞を培養する前記培地（上澄み）を用いて単離される。クローンアッセイは、ＣｈｏＫに対するモノクローナル抗体を得るために、流動細胞分析法、免疫沈降法、または、その他、ＲＩＡやＥＬＩＳＡ等のｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合アッセイのような従来手法によって行われることができる。クローンはまた、動物における腹水腫瘍として、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されることができる。
【００４６】
好ましくは、ハイブリドーマ細胞のクローンで生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降、放射免疫測定法（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）等の他のｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイ、または蛍光顕微鏡もしくは流動細胞分析法等の免疫蛍光法によって定量される。サブクローンで分泌されたモノクローナル抗体は、培地、腹水または血清から、従来の免疫グロブリン精製法、例えば、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析もしくは親和性クロマトグラフィーによって好適に分離される。
【００４７】
モノクローナル抗体はまた、米国特許ＵＳ４，８１６，５６７号記載の方法のような、組換えＤＮＡ法によって生成されてもよい。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、コリンキナーゼまたは酸性セラミダーゼ受容体特異的ハイブリドーマ細胞から単離され、従来の方法、例えば、ハツカネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いて配列されることができる。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましいソースとして機能する。一旦単離されたＤＮＡは、発現ベクターに挿入されてもよい。そして、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または他の方法では免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞等の宿主細胞にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞内にモノクローナル抗体を合成する。前記ＤＮＡはまた、例えば、相同ヒト配列を、マウス重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列で置換することによって、または、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全体もしくは一部を、免疫グロブリンコード配列に共有結合させることによって修飾されることができる。非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインの代わりに置換されるか、または、本発明に係る抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換されて、キメラ二価抗体を作ることができる。
【００４８】
標的分子に反応する特異的抗体または抗体断片を生成するもう一つの方法は、細菌、酵母菌、繊維状ファージ、リボゾームもしくはリボゾームサブユニットおよび他の表示系で発現する免疫グロブリン遺伝子またはその一部をコードする発現ライブラリーをスクリーニングすることである。これらの方法は、通常、健康なドナー、患者、または健康もしくは不健康な動物等の多様なソースから得られた抗体配列または抗体断片配列の大ライブラリーを使用する。これらの配列は、適切な細胞株でクローニングされて発現され、抗原に対するその結合親和性によって選択される。中和、アゴニスト等の望ましい特性を有する抗体または断片を選択するために様々なアプローチの記述がある（Fernandez, Curr. Op. Biotech., 15: 364-373 (2004); Schmidt, Eur. J. Biochem., 268: 1730-1738 (2001)）。１つの態様によれば、本発明のハイブリドーマの特性を有する抗体および抗体断片は、メッセンジャーＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡライブラリーを構築して、抗体分子のセグメントをコードするクローンを選択して、組換え手段により生成することも可能である。
【００４９】
抗体はまた、その臨床用途を変えるために設計されてもよい。数多くのアプローチが、分子生物学および遺伝子技術、例えば遺伝学や免疫グロブリン構造の十分な知識等を利用して、臨床その他の用途のために免疫グロブリンの特性を改善する目的で、免疫グロブリン分子の様々な変形を作り出している。それらの幾つかは、使用されるべき種において、該分子の免疫原性を低下させる傾向があり、合成された分子はその種とより相同性のある配列を有している。健康なヒトにおいて非倫理的であると認められる処置を避けつつ、ヒト由来のｍＡｂｓを得るために様々な方法が用いられている。他のアプローチでは、例えば、固形腫瘍内の分子の分布を改善するために、分子の重さやサイズを減らしている。別の可能性は、１個以上の標的分子に対する結合ドメイン分子（２重特異抗体、３重特異抗体等）の接合、または、望ましい機能を備えた別の分子、例えば、有毒物質、ホルモン、成長因子、免疫修飾剤（免疫抑制剤もしくは免疫刺激剤）、細胞増殖阻害剤等と抗体もしくは断片の接合である。一般に、合成された分子はすべて、抗原−抗体結合に特徴的な高い特異性および親和性を与える抗体可変ドメインをほぼ１個保持している。このような構造例の幾つかが以下に記載される：
【００５０】
キメラ抗体：
幾つかの種（通常、ｍＡｂが生成された哺乳類）の抗体由来の可変領域および他の種（キメラ抗体が使用されることになる種）の定常領域とで構成された抗体を意味する。このような構成の目的は、オリジナルのｍＡｂでありながら免疫原性が低く、治療される患者では寛容性が高く、改善された血清半減期を有し、エフェクターの免疫作用機序、例えば、補体、細胞毒性細胞のＦｃ受容体または種特異性を示す免疫グロブリンに対する他の特異的受容体等のために認識され得る抗体を生成するためである。
【００５１】
ヒト化抗体：
「ヒト化抗体」とは、非ヒト抗体由来の抗体、典型的にはネズミ抗体であって、親抗体の抗原結合特性を保持しつつヒトでは免疫原性が低い抗体を意味する。この抗体の実現には、可能性として様々な手法がある。例えば、（ａ）非ヒト可変ドメイン全体をヒト定常領域にグラフトしてキメラ抗体を生成する；（ｂ）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲｓ）のみを、臨界的フレームワーク残基を保持するかまたは保持していないヒトフレームワークならびに定常領域に、グラフトする；および（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体の移植ではあるが、表面残基の置換によりヒト様セクションでそれらを「覆う」等の方法がある。非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該分野で記述がある。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒトの供給源から導入された１個以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基と呼ばれることが多く、典型的には、「移入」可変ドメインから取られたものである。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者ら（Jones et al., Nature, 321 :522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)）の方法に従って、超可変領域配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに置換することにより行われることができる。実際のところ、ヒト化抗体は、典型的には、幾つかの超可変領域残基および、もしかすると幾つかのフレームワーク（ＦＲ）残基が、齧歯類抗体の類似部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。ヒト化抗体生成において使用される重鎖および軽鎖のヒト可変ドメインの選択は、抗原に対する特異性および親和性を保持する免疫原性を低減するために非常に重要である。所謂「最適な」方法によれば、齧歯類抗体の可変ドメインの配列について、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーがスクリーニングされる。そして、齧歯類の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）として認められる（Suns et al., J. Immunol, 151 :2296 (1993); Chothia et al., J. MoI. Biol, 196:901 (1987)）。もう一つの方法は、軽鎖または重鎖の特定サブグループの全ヒト抗体コンセンサス配列から由来する特定フレームワーク領域を用いる。同じフレームワークを、幾つかの異なるヒト化抗体に用いる場合がある（Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol, 151 :2623 (1993)）
【００５２】
さらに重要なことは、抗原に対する親和性が高く、他の好都合な生物学的特性を備えたヒト化抗体を生成することである。この目標を実現するため、好ましい方法によれば、親およびヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列および様々なコンセプトのヒト化産物の解析法により、ヒト化抗体が作製される。
【００５３】
霊長類化抗体：
ヒト抗体により類似の抗体を作製するこうしたアプローチにおける次の段階は、所謂霊長類化抗体、すなわち、サル（または他の霊長類）の可変重鎖および軽鎖ドメインを含むように構築された組換え抗体、詳細には、カニクイザル抗体であり、ヒト定常ドメイン配列、好ましくは、ヒト免疫グロブリンγ１またはγ４定常ドメイン（もしくはＰＥバリアント）を含むものである。このような抗体の作製については、Newman et al, Biotechnology, 10:1455-1460 (1992)、米国特許ＵＳ５６５８５７０およびＵＳ６１１３８９８に記載されている。これらの抗体は、ヒト抗体に対する高い相同性８５％〜９８％を示し、ヒトエフェクター機能を発揮し、低免疫原性であるため、ヒト抗原に対し高親和性である可能性が報告されている。組換え抗体生成におけるもう一つの高効率的手段が、Newman, Biotechnology, 10:1455-1460 (1992)によって開示されている。
【００５４】
ヒト抗体：
「ヒト抗体」とは、公知の標準的な方法のいずれかによって生成された、全体としてヒト軽鎖および重鎖ならびに定常領域を含む抗体を意味する。
【００５５】
ヒト化の代替として、ヒト抗体を作製することができる。例えば、免疫化を行う際、内因性免疫グロブリン産生が行われない状況下でヒト抗体の完全なレパートリーの産生が可能なトランスジェニック動物（マウス等）を作製することが現在では可能である。例えば、キメラマウスおよび生殖細胞系変異マウスにおける抗体重鎖連結領域ＰＨ）遺伝子のホモ接合性欠失は、内因性抗体の生成を完全に阻害するという記述がある。そのような生殖細胞系変異マウスに、ヒト生殖系細胞免疫グロブリン遺伝子アレイを移入することによって、免疫化後ヒト抗体が生成される結果となる。例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993) を参照されたい。
【００５６】
あるいは、ファージディスプレイ法（McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)）を用いて、ドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからヒト抗体および抗体断片をｉｎ ｖｉｔｒｏで生成することができる。この方法によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子が、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３もしくはｆｄなどメジャーなまたはマイナーなコートタンパク質遺伝子のいずれかに、インフレームでクローニングされ、ファージ粒子表面に機能性抗体断片としてディスプレイされる。繊維状粒子はファージゲノムの１本鎖ＤＮＡコピーを含んでいるため、抗体の機能特性に基づく選択も、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択につながることとなる。したがって、ファージは、Ｂ−細胞の特性の幾つかを模倣する。ファージディスプレイは、様々な形態で実施可能である。それらの概説については、例えば、Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)を参照されたい。
【００５７】
ヒト抗体はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化されたＢ細胞またはヒト細胞で再構築された免疫系を有するＳＣＩＤマウスによって作製されることができる。
【００５８】
ヒト抗体が一旦得られると、それをコードするＤＮＡ配列が単離されクローニングされて、適切な発現系、すなわち好ましくは、連続して遺伝子発現し、その抗体が単離可能な培地に放出される哺乳類由来細胞株に導入されることができる。
【００５９】
抗体断片：
抗体断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’およびｓｃＦｖのような抗体断片である。抗体断片の生成のために様々な技術が開発されてきている。従来は、これらの断片は、インタクト抗体のタンパク質消化により誘導されていたが、ごく最近では、組換え宿主細胞によって直接生成されることができる。他の複数の態様によれば、選択される抗体は1本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片で、さらに単一特異的または二重特異的であってもよい。
【００６０】
抗体のパパイン消化により、２つの同一性抗原結合断片が生成される。「Ｆａｂ」断片と呼ばれものは、その各々が単一の抗原結合部位を有し、残りの「Ｆｃ」断片は、その名が、容易に結晶化するその能力を反映している。ペプシン処理をすると、Ｆ（ａｂ’）２断片が生成される。この断片は、２つの抗原結合部位を有しており、抗原の架橋がよりいっそう可能である。
【００６１】
「Ｆｖ」は、最小の抗体断片で、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む。この領域は、密接な非共有結合性の会合において１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの２量体からなる。この構成において、各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用し、ＶＨ-ＶＬダイマーの表面に抗原結合部位を規定する。集合的に、その６つの超可変領域が、抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含んでなるＦｖの半分）であっても、抗原を認識して結合する能力を有している。ただし、結合部位全体よりも親和性は低い。
【００６２】
「Ｆａｂ」断片も、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む。Ｆａｂ’断片は、抗体のヒンジ領域から数えて１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、数個の残基が付加されることによりＦａｂ断片とは異なっている。Ｆａｂ’-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも１つの遊離チオール基を有するＦａｂ’を示す、本明細書中での名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、本来、ヒンジシステインをその間に挟んでいる一対のＦａｂ’断片として生成されていた。抗体断片の他の化学的カップリングも公知である。
【００６３】
「単一鎖Ｆｖ」すなわち「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含んでなり、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドはさらに、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを含んでなり、これにより、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することが可能になる。ｓｃＦｖの概説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer- Verlag, N.Y., pp. 269-315 (1994) を参照されたい。
【００６４】
「ディアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小抗体断片のことで、該断片は、同じポリペプチド鎖内に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ‐ＶＬ）を含んでなる。同じ鎖上の２つのドメイン間における対形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いて、これらのドメインは、別の鎖の相補ドメインと対合させられ、２つの抗原結合部位が生じる。ディアボディについての十分な詳細は、例えば、欧州特許ＥＰ４０４，０９７号、国際公開ＷＯ９３／１１１６１号，およびHollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) に記載されている。
【００６５】
本発明に包含される、ＣｈｏＫに結合する機能性抗体断片は、それらが由来する完全長抗体の少なくとも１つの結合機能および／または調節機能を保持している。好ましい機能性抗体断片は、それに対応する完全長抗体の抗原抗体機能を保持する（例えば、哺乳類ＣｈｏＫを結合する能力）。特に好ましい機能性断片は、結合活性、伝達活性、および／または細胞応答の刺激等、哺乳類ＣｈｏＫに特徴的な機能の１つ以上を阻害する能力を保持する。例えば、１つの態様によれば、機能性断片は、ＣｈｏＫとそのリガンド１個以上との結合を阻害する、および／または１つ以上の受容体介在性の機能を阻害することができる。
【００６６】
２重特異性抗体：
２重特異性抗体は、少なくとも２個以上の異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例えば、２重特異性抗体は、Ｂ細胞表面マーカーの２個の異なるエピトープに結合するものがあり、また他の２重特異性抗体は、第１のＢ細胞表面マーカーに結合し、さらに第２のＢ細胞表面マーカーに結合するものがある。あるいは、抗Ｂ細胞マーカー結合アームが、Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２もしくはＣＤ３）等の白血球上のトリガー分子、またはＩｇＧのＦｃ受容体（ＦｃｙＲ），例えば、ＦｃｙＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃｙＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃｙＲＩＩＩ（ＣＤ１６）等に結合するアームと結合して、Ｂ細胞に細胞防御機序を集中させることができる。２重特異性抗体はまた、細胞傷害性薬物をＢ細胞に局在化するために使用されることもできる。これらの抗体は、Ｂ細胞マーカー結合アームおよび細胞傷害性薬物（サポリン、抗インターフェロン‐α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセートまたは放射性同位体ハプテン等）に結合するアームを有している。２重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片（Ｆ（ａｂ）２二重特異性抗体等）として作製できる。
【００６７】
２重特異性抗体の作製方法は、当該分野において公知である。全長２重特異性抗体の従来の作製方法は、２つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づいており、この場合、その２つの鎖は異なる特異性を有している（Millstein et al, Nature, 305:537-539 (1983)）。免疫グロブリン重鎖-軽鎖は無作為な組み合わせのため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）が、１０個の異なる抗体分子からなる潜在能力を備えた混合物を産生する。そのうち１個のみが正確な２重特異性構造を有している。正確な構造の分子の精製は、通常、親和性クロマトグラフィーの工程により行われるが、多少煩わしく生成物収率は低い。類似の方法が、国際公開番号ＷＯ９３／０８８２９およびTraunecker et al., EMBO J, 10:3655-3659 (1991)で開示されている。別のアプローチによれば、所望の結合特異性（抗体抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインが、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。当該融合は、好ましくは、ヒンジ領域の少なくとも一部、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含んでなる免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。
【００６８】
好ましくは、軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常ドメイン（ＣＨＩ）を、上記融合の少なくとも１つに存在させる。免疫グロブリン重鎖融合および、必要に応じて免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡが、別々の発現ベクターに挿入され、好適な宿主生物に同時トランスフェクトされる。これによって、抗体構築に３つのポリペプチド鎖を不均等比率で使用し最適収率が得られる場合、態様によれば、当該３つのポリペプチド断片の相互比率調整がかなり柔軟に行える。しかし、均等な比率での少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高収率となる場合、またはその比率が格別重要ではない場合は、１つの発現ベクターに２つもしくは３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することが可能である。
【００６９】
二重特異性抗体は、架橋されたまたは「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体の一方は、アビジンに結合され、他方はビオチンに結合されることができる。このような抗体は、例えば、好ましくない細胞に対する免疫系細胞を標的にするために提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋法を用いて作製されることができる。好適な架橋剤は、当該分野で公知となっており、架橋技術の幾つかと共に、米国特許ＵＳ４，６７６，９８０に開示されている。
【００７０】
二重特異性抗体を抗体断片から生成する技術も文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を用いて作製されることができる。
【００７１】
酸性セラミダーゼまたはコリンキナーゼに特異的なＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）
もう一つの態様によれば、本発明の組成物の一部を構成する酸性セラミダーゼまたはコリンキナーゼの阻害剤は、酸性セラミダーゼおよび／またはコリンキナーゼの発現、または酸性セラミダーゼおよび／またはコリンキナーゼ機能に必要な任意の成分遺伝子の発現をノックダウンさせることが可能なＲＮＡｉである。ＲＮＡｉは、真核細胞に発生する可能性のある、配列特異的な転写後遺伝子発現のプロセスである。一般に、このプロセスは、特定の配列のｍＲＮＡの分解を伴う。該ｍＲＮＡ分解は、その配列に相同的な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって誘導される。例えば、特定の一本鎖ｍＲＮＡ（ｓｓｍＲＮＡ）の配列に相当する長鎖ｄｓＲＮＡの発現が、そのメッセージを不安定にし、それによって、対応する遺伝子の発現の「干渉」となる。したがって、任意の選択遺伝子の抑制が、その遺伝子に対するｍＲＮＡの全体または重要部分に相当するｄｓＲＮＡの導入によって可能になる。長鎖ｄｓＲＮＡが発現すると、最初に、リボヌクレアーゼＩＩＩによる処理で、わずか２１〜２２個の塩基対からなる、これまでよりも短い長さのｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドにされるように思われる。したがって、ＲＮＡｉは、比較的短い相同的なｄｓＲＮＡｓの導入または発現によって実行されることができる。事実、比較的短い相同ｄｓＲＮＡｓの使用には、以下で述べるような特定の利点がある可能性がある。
【００７２】
ＲＮＡｉの実行に使用される二本鎖オリゴヌクレオチドは、好ましくは、長さが３０塩基対未満で、より好ましくは、約２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個，１９個，１８個または１７個のリボ核酸塩基対を含んでなる。場合により、本発明のｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、３’突出末端を含んでいてもよい。例示的な２−ヌクレオチド３’突出末端は、任意のタイプのリボヌクレオチド残基から構成されることが可能であり、２’−デオキシチミジン残基での構成さえ可能である。これにより、ＲＮＡ合成のコストが低減され、細胞培地中およびトランスフェクトされた細胞内でｓｉＲＮＡｓのヌクレアーゼ耐性を強化できる（Elbashir et al., Nature 411 : 494-8, 2001を参照）。塩基対が５０個、７５個、１００個、またはさらには５００個もしくはそれ以上の長さのｄｓＲＮＡｓもまた、本発明のある態様によれば利用可能である。ＲＮＡｉ実行のためのｄｓＲＮＡの濃度は、例えば、約０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１．０ｎＭ、１．５ｎＭ、２５ｎＭ、または１００ｎＭであるが、治療細胞の性質、標的遺伝子および当業者が容易に認識できる他の要因により、他の濃度も使用可能である。例えば、ｄｓＲＮＡｓは、化学的に合成されるか、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、または適切な発現ベクターを使用してｉｎ ｖｉｖｏで合成されることができる。例えば、合成ＲＮＡは、公知の方法（Expedite RNA phosphoramidites and thymidine phosphoramidite (Proligo, Germany)等）を用いて化学的に合成された２１ヌクレオチドＲＮＡを含む。合成オリゴヌクレオチドは、好ましくは、公知の方法（例えば、Elbashir et al., Genes Dev. 15: 188-200, 2001を参照）を用いて脱保護されゲル精製される。比較的長いＲＮＡは、当該分野で公知のプロモーター、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター等から転写されることができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏプロモーター下流に、両方向に可能な配向で単一のＲＮＡ標的が置かれ、その標的の両鎖を転写して、所望の標的配列のｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドが作製される。上記のＲＮＡ種のいずれも、標的核酸、例えば、緊縮条件および／または生理学的条件下で、ヒト酸性セラミダーゼまたはヒトＣｈｏＫをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸等に表される核酸配列の一部を含むように設計される。
【００７３】
オリゴヌクレオチドの設計に使用される特異的配列は、標的の発現した遺伝子メッセージに含まれる任意の連続したヌクレオチド配列であってもよい。当該分野で公知のプログラムおよびアルゴリズムを、適切な標的配列の選択に使用することができる。また、最適な配列の選択は、特定の1本鎖核酸配列の二次構造を予測するために設計されたプログラムを使用して、それらの配列の選択が、折り畳みｍＲＮＡの露出した一本鎖核酸領域で生じやすいようにさせることで行われてもよい。適切なオリゴヌクレオチドを設計するための方法および組成物は、例えば、米国特許第６，２５１，５８８号で知ることができる。その内容は、本明細書中に参照により組み込まれる。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、一般に、リボヌクレオチド配列内のタンパク質合成の指示情報を含む直鎖分子として考えられている。しかし、研究によって、ほとんどのｍＲＮＡには、多くの二次構造および三次構造が存在することが明らかになっている。ＲＮＡの二次構造要素は、同じＲＮＡ分子の異なる領域間で、ワトソン・クリック型相互作用により大量に形成される。重要な二次構造要素には、分子内の二本鎖領域、ヘアピンループ、二本鎖ＲＮＡ内のバルジおよびインターナルループ等がある。三重構造要素は、二重構造要素が互いに接触するか、または一本鎖領域と接触してより複雑な三次元構造が生じる場合に形成される。多くの研究者たちが、大量のＲＮＡ二重構造の結合エネルギーを測定し、ＲＮＡの二次構造予測に使用可能な一連の法則を見出している（例えば、Jaeger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7706, 1989; and Turner et al., Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 17:167, 1988を参照）。それらの法則は、ＲＮＡ構造要素の同定、特に、サイレンシングＲＮＡｉ、リボザイムまたはアンチセンス技術の標的に対するｍＲＮＡの好ましいセグメントを表すことが可能な一本鎖ＲＮＡ領域の同定に役立つ。したがって、ｍＲＮＡ標的の好ましいセグメントが、ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを仲介するＲＮＡｉの設計、および本発明の適切なリボザイムならびにハンマーヘッド型リボザイム組成物の設計のために同定されることが可能である。
【００７４】
幾つかの異なるタイプの分子が、ＲＮＡｉ技術に効果的に利用されている。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、時には短干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡとしても知られており、２０〜２５個のヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ分子の種類であって、生物学的に多様な役割を果たす。最も注目すべきことは、ｓｉＲＮＡがＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路に関与しており、その経路で特定遺伝子の発現に干渉するという点である。ＲＮＡｉ経路でのその役割に加えて、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ関連経路、例えば、抗ウイルス機序またはゲノムのクロマチン構造形成等においても作用する。合成ｓｉＲＮＡによる哺乳類細胞へのＲＮＡｉ誘導能力が証明されている。この発見により、バイオ医学研究および製薬開発におけるｓｉＲＮＡ／ＲＮＡｉの利用が急増した。
【００７５】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、遺伝子調節低分子ＲＮＡ関連の種類であって、典型的には２１〜２３ヌクレオチド長を有する。ｍｉＲＮＡがｓｉＲＮＡと典型的に異なる点は、ｍｉＲＮＡが一本鎖ＲＮＡ前駆体から処理されたものであり、ｍＲＮＡ標的に対して一部のみが相補的である点である。初期の研究では、ｍｉＲＮＡが、細胞質におけるＰ体での翻訳阻害の段階で、転写後の遺伝子発現調節を行っていることが指摘されている。しかし、ｍｉＲＮＡはまた、ｓｉＲＮＡ同様に、ｍＲＮＡ開裂の誘導も行う場合がある。これは、植物によく見られるが、標的部位がｍｉＲＮＡに対して典型的に高い相補性を有している。植物のｍＲＮＡ中の標的部位は、動物において、５’側非翻訳領域、オープンリーディングフレームおよび３’側非翻訳領域に見られることができるが、主たる標的は３’側非翻訳領域である。ｍｉＲＮＡは、初期ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ‐ｍｉＲＮＡ）の一部としてまず転写される。そして、Ｄｒｏｓｈａおよびそれを助けるＰａｓｈａ／ＤＧＣＲ８により（マイクロプロセッサー複合体）処理されてｐｒｅ‐ｍｉＲＮＡになる。その約７５ヌクレオチド長のｐｒｅ‐ｍｉＲＮＡは、次にエクスポーチン‐５によって細胞質に輸送され、そこでダイサーにより、２１〜２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ様分子に分解される。時には、ｐｒｉ‐ｍｉＲＮＡ上に複数のｍｉＲＮＡが見られる場合がある。
【００７６】
低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、さらに別のＲＮＡのタイプであり、ＲＮＡｉを実行するために使われることができる。ＲＮＡの配列は、隙間のないヘアピンターンを形成しており、遺伝子発現をサイレンシングするために使用されることが可能である。ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって転写される。
【００７７】
現在、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、遺伝子機能のサイレンシングを目的に、様々な遺伝子のサイレンシングに広く使用されている。多様なソースを用いた既成のｓｈＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ遺伝子サイレンシング構築物からなるライブラリー開発のおかげで、特定の遺伝子のサイレンシングのためにＲＮＡｉを利用することはいっそう容易になっている。例えば、ｓｈＲＮＡ関連情報と関連ウェブサイトのデータベースから構成されるＲＮＡｉ Ｃｏｄｅｘは、公的に利用可能なｓｈＲＮＡリソースのための入り口として開発され、ｈｔｔｐ：／／ｃｏｄｅｘ．ｃｓｈｌ．ｏｒｇでアクセス可能である。ＲＮＡｉ Ｃｏｄｅｘは現在、Ｈａｎｎｏｎ‐Ｅｌｌｅｄｇｅ ｓｈＲＮＡライブラリー由来のデータを保有しており、生物学者にとって優しい遺伝子名の使用により、所望の遺伝子のサイレンシングができるｓｈＲＮＡ構築物情報へのアクセスを可能にしている。それは、そのようなデータが入手可能であればだが、各構築物に関して使用者による注釈および出版物を保管するために設計されている。Olson et al. (Nucleic Acids Res. 34(Database issue): D153-D157, 2006, incorporated by reference)は、ＲＮＡｉ Ｃｏｄｅｘの特徴に関し詳細に記載し、そのツール使用を説明している。これらの全情報が、酸性セラミダーゼ、コリンキナーゼもしくは他の所望のタンパク質を標的とする様々なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの設計の手助けとして利用されることができる。
【００７８】
酸性セラミダーゼまたはコリンキナーゼに特異的なリボザイム
標的ｍＲＮＡ転写物を触媒作用で開裂するために設計されたリボザイム分子も、酸性セラミダーゼおよび／またはコリンキナーゼｍＲＮＡの翻訳を妨げるために使用されることができる。したがって、もう一つの態様によれば、本発明の組成物は、ｍＲＮＡ酸性セラミダーゼおよび／またはコリンキナーゼを特異的に対象とするリボザイムを含んでなる。リボザイムは、ＲＮＡの特定の開裂を触媒することができる酵素ＲＮＡ分子である（概説は、Rossi, Current Biology 4: 469-471, 1994を参照）。リボザイム作用の機序は、相補的な標的ＲＮＡに対するリボザイムの配列特異的ハイブリダイゼーション、そしてそれに続くヌクレオチド鎖開裂事象に関与する。リボザイム分子の組成物は、好ましくは、標的ｍＲＮＡに相補的な1つ以上の配列およびｍＲＮＡ開裂に関連する公知の触媒配列または機能的に等価な配列を含む（例えば、米国特許第５，０９３，２４６号を参照。尚、該特許はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）。
【００７９】
部位特異的認識配列でｍＲＮＡを開裂するリボザイムは、標的ｍＲＮＡを破壊するために使用されることができるが、ハンマーヘッドリボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは、ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成する隣接領域により指示された場所でｍＲＮＡを開裂する。好ましくは、標的ｍＲＮＡは、以下の２塩基の配列：５’‐ＵＧ‐３’を有する。ハンマーヘッドリボザイムの構築および生成は当該分野において公知であり、より詳細な記載がHaseloff and Gerlach, Nature 334: 585-591, 1988にあり、またＰＣＴ出願番号ＷＯ８９／０５８５２を参照されたい。該ＰＣＴ出願の内容は、本明細書に参照により組み込まれる。ハンマーヘッドリボザイム配列を、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）等の安定なＲＮＡに組み込んで、ｉｎ ｖｉｖｏでの開裂効率を向上させることができる（Perriman et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 6175-79, 1995; de Feyter, and Gaudron, Methods in Molecular Biology, Vol. 74, Chapter 43, "Expressing Ribozymes in Plants," Edited by Turner, P. C, Humana Press Inc., Totowa, N. J.）。特に、ｔＲＮＡ融合リボザイムのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ仲介発現は、当該分野で公知である（Kawasaki et al., Nature 393: 284-9, 1998; Kuwabara et al., Nature Biotechnol. 16: 961-5, 1998; and Kuwabara et al., MoI. Cell. 2: 617-27, 1998; Koseki et al., J Virol 73: 1868-77, 1999; Kuwabara et al., Proc Natl Acad Sci USA 96: 1886-91, 1999; Tanabe et al., Nature 406: 473-4, 2000を参照）。所定のＣＤＮＡ配列内部には、典型的に多数の潜在的ハンマーヘッドリボザイム開裂部位がある。好ましくは、リボザイムは、開裂認識部位が５’末端近くに位置するように構築され、開裂効率を上げて非機能性ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最小限にする。さらには、例えば、形態に長短がある標的のＣ‐末端アミノ酸ドメインの異なった部分をコードする標的配列に含まれる任意の開裂認識部位を使用すれば、該標的の一方または他方の形態を選択的に標的とすることが可能となり、したがって、標的遺伝子産物の一形態に対して選択的な効果がある。
【００８０】
遺伝子を標的とするリボザイムは、２つの領域、すなわち各々少なくとも５個、好ましくは各々６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の連続ヌクレオチド長の標的ｍＲＮＡに対して相補的なハイブリッド形成領域を必ず含む。例えば、酸性セラミダーゼまたはコリンキナーゼ遺伝子に見られる配列のｍＲＮＡ等である。また、リボザイムは、高度に特異的なエンドヌクレアーゼ活性を有する。該活性は、自動触媒的に標的センスｍＲＮＡを開裂するものである。本発明は、治療薬の標的候補遺伝子等の標的遺伝子をコードするセンスｍＲＮＡにハイブリダイズし、それにより、機能性ポリペプチド生成物合成のための翻訳がそれ以上できないように、該センスｍＲＮＡにハイブリダイズしてそれを開裂するリボザイムにまで及ぶ。
【００８１】
本発明の組成物に使用されるリボザイムはまた、例えばテトラヒメナ・サーモフィラ（ＩＶＳ ＲＮＡまたはＬ‐１９ ＩＶＳ ＲＮＡとして公知である）に自然発生するような、ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以下、「Ｃｅｃｈ‐型リボザイム」という）も含む。これは、Thomas Cech and collaborators (Zaug et al, Science 224:574-578, 1984; Zaug et al., Science 231 : 470-475, 1986; Zaug et al., Nature 324: 429- 433, 1986; Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｔｅｎｔｓ Ｉｎｃ．による国際公開ＷＯ８８／０４３００号; Been, et al., Cell 47: 207-216, 1986)によって広範囲に記載がなされている。Ｃｅｃｈ‐型リボザイムは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする８塩基対活性部位を有しており、その後に、標的ＲＮＡの開裂が起きる。本発明は、標的遺伝子または核酸配列に存在する８塩基対活性部位配列を標的とするこのようなＣｅｃｈ‐型リボザイムを包含する。
【００８２】
リボザイムは、修飾オリゴヌクレオチド（例えば、安定性向上、ターゲティング等を目的とする）から構成されることが可能であり、ｉｎ ｖｉｖｏで標的遺伝子を発現する細胞に送達されるべきである。好ましい送達方法は、トランスフェクト細胞が、内因性標的メッセージを破壊して翻訳を阻害するための十分量のリボゾームを産生するように、強力な構成的ｐｏｌＩＩＩまたはｐｏｌＩＩプロモーターの制御下で、リボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物の使用を含む。アンチセンス分子と異なり、リボザイムは触媒的に働くため、効率のためには、比較的低い細胞内濃度が求められる。
【００８３】
ある態様によれば、リボザイムは、ＲＮＡによる有効なノックダウンを引き起こすに十分な配列部分を最初に同定することによって設計されてもよい。次に、同じ配列部位がリボザイムに組み込まれてもよい。本発明のこの態様によれば、リボザイムまたはＲＮＡｉの遺伝子標的部分は、標的核酸の少なくとも５個、好ましくは６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれ以上の連続ヌクレオチドの配列と実質的に同じであり、該標的核酸は、例えば、ヒト酸性セラミダーゼまたはコリンキナーゼ配列のいずれかの核酸等である。長い標的ＲＮＡ鎖では、相当数の標的部位が二次構造または三次構造内に隠れているため、リボザイムに接近することができない（Birikh et al., Eur J Biochem 245: 1-16, 1997）。標的ＲＮＡの接近容易性の問題を克服するために、典型的には、コンピューターで作成された二次構造予測を使用し、一本鎖であるか「開いた」形状である可能性が最も大きい標的の同定が行われる（Jaeger et al., Methods Enzymol 183: 281-306, 1989を参照）。
【００８４】
他のアプローチは、二次構造予測のための系統的なアプローチを利用するもので、これには、膨大な数のハイブリダイゼーション候補のオリゴヌクレオチド分子の評価が含まれる（Milner et al, Nat Biotechnol 15: 537-41, 1997; and Patzel and Sczakiel, Nat Biotechnol 16: 64-8, 1998を参照）。また、米国特許第６，２５１，５８８号（その内容は、参照により本明細書中に組み込まれる）には、標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの可能性を予測するため、オリゴヌクレオチドプローブ配列の評価方法が記載されている。本発明の方法は、当該発明のＲＮＡｉおよびリボザイム両方の設計において、一本鎖であると予測される標的ｍＲＮＡの好ましいセグメントを選択するための上記方法の用途、さらに、好ましくは約１０〜２０個の連続ヌクレオチドを含んでなる、同じかまたは実質的に同一の標的ｍＲＮＡ配列の便宜的用途を提供する。
【００８５】
酸性セラミダーゼまたはコリンキナーゼに特異的なアンチセンス核酸
本発明のさらなる様態は、例えば、酸性セラミダーゼおよび／またはコリンキナーゼ核酸の転写および／または翻訳の阻害により、発現を阻害するための単離「アンチセンス」核酸の使用に関する。前記アンチセンス核酸は、従来の塩基対相補性によって、または、例えば、二重螺旋の主要な溝での特異的相互作用を通じてＤＮＡに結合する場合に、潜在的な標的薬剤に結合することができる。一般に、これらの方法は、当該分野で一般に使用される技術の範囲に当てはまり、またオリゴヌクレオチド配列に対する特異的結合に依拠するいかなる方法をも含む。
【００８６】
本発明のアンチセンス構築物は、発現プラスミドとして送達されることができる。該プラスミドは、例えば、細胞に転写されると、ＣｈｏＫポリペプチドまたは酸性セラミダーゼポリペプチドをコードする細胞内ｍＲＮＡの少なくとも特殊な部分に相補的なＲＮＡを産生する。あるいは、前記アンチセンス構築物は、オリゴヌクレオチドプローブであり、ｅｘ ｖｉｖｏで生成される。該プローブは、細胞に導入されると、標的核酸のｍＲＮＡおよび／またはゲノム配列とのハイブリダイゼーションによって発現を阻害する。このようなオリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは、内因性ヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼ等に耐性で、そのためｉｎ ｖｉｖｏで安定な修飾オリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用される核酸分子の例は、ＤＮＡのホスホロアミダイト、ホスホチオエートおよびメチルホスホネート類似体である（米国特許第５，１７６，９９６号、第５，２６４，５６４号および第５，２５６，７７５号も参照）。また、アンチセンス治療に役立つオリゴマーを構築するための一般的アプローチが、例えば、Van der Krol et al, BioTechniques 6: 958-976, 1988; and Stein et al., Cancer Res 48: 2659-2668, 1988により概説されている。
【００８７】
アンチセンスＤＮＡに関して、例えば、標的遺伝子の−１０領域〜＋１０領域までの間の翻訳開始部位由来のオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。アンチセンスアプローチは、標的ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の設計に関与する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡに結合して翻訳を阻害する。完全な相補性は好ましくはあるが、完全である必要はない。二本鎖アンチセンス核酸の場合、したがって、二本鎖ＤＮＡの一本鎖が試験されることができ、または３重構造の分析が可能である。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補性の程度および該核酸の長さ次第になる。一般に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、ＲＮＡに対する塩基ミスマッチがより多く含まれる可能性があり、依然として安定な二重鎖（または、場合により３重鎖）を形成する。当業者は、ハイブリダイズされた複合体の融点を測定するための標準的手法を用いて、ミスマッチの許容度を確認することができる。
【００８８】
ｍＲＮＡの５‘’末端、例えば、ＡＵＧ開始コドンまでおよびそれを含む５’側非翻訳配列に相補的なオリゴヌクレオチドは、翻訳を阻害する上で最も効率的に働く必要がある。しかし、最近、ｍＲＮＡの３’側非翻訳配列に相補的な配列も同様に、ｍＲＮＡの翻訳阻害に有効であることが証明されている（Wagner, Nature 372: 333, 1994）。そのため、遺伝子の５’側または３’側非翻訳、非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチドをアンチセンスアプローチに使用すれば、ｍＲＮＡの翻訳を阻害することが可能である。ｍＲＮＡの５’側非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補体を含むべきである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、あまり有能な翻訳阻害剤ではないが、本発明に従って、これも使用されることができる。ｍＲＮＡの５’側または３’側 非コード領域のどちらにハイブリダイズするように設計されていても、アンチセンス核酸は、少なくとも６個のヌクレオチド長でなければならないが、好ましくは約１００個未満、より好ましくは約５０、２５，１７または１０個未満のヌクレオチド長を有する。
【００８９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの遺伝子発現阻害能力を定量するため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究をまず実施することが好ましい。これらの研究では、オリゴヌクレオチドのアンチセンス遺伝子阻害と非特異的な生物学的効果の区別の目安となる対照群を使うことが好ましい。さらに、これらの研究で、標的ＲＮＡまたはタンパク質のレベルと内部対照ＲＮＡまたはタンパク質のレベルとを比較することが好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して得られた結果は、対照オリゴヌクレオチドを使用して得られた結果と比較されることができる。好ましくは、対照オリゴヌクレオチドが、被験オリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さであり、また、対照オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が、標的配列への特異的ハイブリダイゼーションを阻害するために必要なだけのアンチセンス配列と異なる。
【００９０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、キメラ混合物、誘導体、それらの修飾物、一本鎖または二本鎖のいずれでも可能である。このオリゴヌクレオチドは、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション等を改善するために、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で修飾されることができる。本ヌクレオチドは、ペプチド等の他の付加基（例えば、宿主受容体を標的とするため）、または細胞膜内外の輸送促進物質（例えば、Letsinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6553-6556, 1989; Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 648-652, 1987; ＰＣＴ公報ＷＯ８８／０９８１０を参照）、血液脳関門を通過する輸送の促進物質（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ８９／１０１３４を参照）、ハイブリダイゼーション誘導開裂物質（例えば、Krol et al., BioTechniques 6: 958-976, 1988を参照）、または挿入剤（例えば、Zon, Pharm. Res. 5: 539-549, 1988を参照）を含んでいてもよい。この目的のために、該オリゴヌクレオチドは、別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘導架橋物質、輸送物質、ハイブリダイゼーション誘導開裂物質等に結合されることができる。
【００９１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５‐フルオロウラシル、５‐ブロモウラシル、５‐クロロウラシル、５‐ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４‐アセチルシトシン、５‐（カルボキシヒドロキシエチル）ウラシル、５‐カルボキシメチルアミノメチル‐２‐チオウリジン、５‐カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β‐Ｄ‐ガラクトシルケウオシン、イノシン、Ｎ６‐イソペンチルアデニン、１‐メチルグアニン、１‐メチルイノシン、２，２‐ジメチルグアニン、２‐メチルアデニン、２‐メチルグアニン、３‐メチルシトシン、５‐メチルシトシン、Ｎ６‐アデニン、７‐メチルグアニン、５‐メチルアミノメチルウラシル、５‐メトキシアミノメチル‐２‐チオウラシル、β‐Ｄ‐マンノシルケオシン、５’‐メトキシカルボキシメチルウラシル、５‐メトキシウラシル、２‐メチルチオ‐Ｎ６‐イソペンチルアデニン、ウラシル‐５‐オキシ酢酸（Ｖ），ワイブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、２‐チオシトシン、５‐メチル‐２‐チオウラシル、２‐チオウラシル、４‐チオウラシル、５‐メチルウラシル、ウラシル‐５‐オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル‐５‐オキシ酢酸（Ｖ），５‐メチル‐２‐チオウラシル、３‐（３‐アミノ‐３‐Ｎ‐２‐カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ）ｗおよび２，６‐ジアミノプリンからなるが、これらに限定されない群より選択された少なくとも１つの修飾塩基部分も含んでなることができる。
【００９２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アラビノース、２‐フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースからなるが、これらに限定されない群より選択された少なくとも１つの修飾糖部分を含んでなることもできる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、中性ペプチド様骨格を含んでいてもよい。このような分子は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）‐オリゴマーと称され、例えば、Perry-O'Keefe et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 14670, 1996、および in Eglom et al., Nature 365: 566, 1993に記載されている。ＰＮＡオリゴマーの利点の１つは、ＤＮＡの中性骨格によって、培地のイオン強度とは本質的に無関係に、相補ＤＮＡに結合するその能力である。さらにもう一つの態様によれば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミドチオエート、ホスホラミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステルおよびホルムアセタールまたはこれらの類似体からなる群から選択された少なくとも１つの修飾リン酸骨格を含んでなる。
【００９３】
さらにもう一つの態様によれば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、α‐アノマーオリゴヌクレオチドである。α‐アノマーオリゴヌクレオチドは、相補ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、通常の逆平行配向に反して、それらの鎖は互いに平行である（Gautier et al., Nucl. Acids Res. 15: 6625-6641, 1987）。該オリゴヌクレオチドは、２’‐０‐メチルリボヌクレオチド（Inoue et al., Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148, 1987）またはキメラＲＮＡ‐ＤＮＡ類似体（Inoue et al., FEBS Lett. 215: 327-330, 1987）である。
【００９４】
標的ｍＲＮＡ配列のコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用はできるが、転写非翻訳領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用も可能である。
【００９５】
ある例では、内因性ｍＲＮＡ上での翻訳を抑制するために十分な細胞内濃度のアンチセンスを実現することは難しいかもしれない。そのため、１つの好ましいアプローチは、組換えＤＮＡ構築物を使用する。該構築物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、強力なｐｏｌＩＩＩまたはｐｏｌＩＩプロモーターの制御下に置かれる。標的細胞のトランスフェクトションにこのような構築物を使用することにより、内因性の潜在的薬剤標的転写物との相補的塩基対を形成する十分量の一本鎖ＲＮＡが転写される結果となり、それによって翻訳が阻害される。例えば、ベクターは、それが細胞に取り込まれてアンチセンスＲＮＡの転写を指示するように導入されることができる。このようなベクターは、望ましいアンチセンスＲＮＡを生成するために転写が可能でありさえすれば、エピゾームの状態か、または染色体に組み込まれてもよい。このようなベクターは、当該分野で標準的な組換えＤＮＡ技術手法によって構築されることができる。ベクターは、プラスミド、ウイルスまたは哺乳類細胞における複製および発現に使用される、当該分野で公知の他の物であってよい。アンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、哺乳類、好ましくはヒト細胞で作用するために当該分野で公知の任意のプロモーターによるものであってよい。このようなプロモーターは、誘導的または構成的なものであってよい。このようなプロモーターとしては以下が挙げられるが、それらに限定されない：ＳＶ４０初期プロモーター領域（Bernoist and Chambon, Nature 290: 304-310, 1981）、ラウス肉腫ウイルスの長い３’末端反復配列に含まれるプロモーター（Yamamoto et al, Cell 22: 787-797, 1980）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1441-1445, 1981）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinster et al, Nature 296: 39-42, 1982）等である。
【００９６】
あるいは、標的遺伝子発現の低減は、遺伝子の調節領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を標的にして、体内の標的細胞における遺伝子転写を阻害する三重螺旋構造の形成によって行うことができる（一般的には、Helene, Anticancer Drug Des. 6(6): 569-84, 1991; Helene et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 660: 27-36, 1992; and Maher, Bioassays 14(12): 807-15, 1992を参照）。
【００９７】
転写阻害のために、三重螺旋形成に使用される核酸分子は、好ましくは、一本鎖でデオキシリボヌクレオチドから構成される。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成物は、フーグステン型塩基対合則による三重螺旋形成を促進するものでなくてはならない。該塩基対合則は一般に、二本鎖の一方上に相当な長さのプリン又はピリミジンの存在を必要とする。ヌクレオチド配列は、ピリミジンベースであってもよい。この場合は、形成された３重螺旋の３本の会合鎖に亘ってＴＡＴおよびＣＧＣのトリプレットが生じることになる。このピリミジン豊富な分子は、二本鎖のうち一方の鎖のプリン豊富な領域において、その鎖に平行配向で相補的な塩基を与える。また、核酸分子は、例えば伸展したＧ残基を含むプリン豊富なものが選択されてもよい。これらの分子は、ＧＣ対に豊富なＤＮＡ二本鎖と共に三重螺旋を形成し、そこでは、プリン残基の大多数が標的二本鎖の一本に存在し、三重構造における３本鎖に亘りＣＧＣトリプレットができることになる。
【００９８】
あるいは、三重螺旋形成のために標的となり得る潜在的な標的配列は、所謂「スイッチバック」核酸分子の生成により増加させてもよい。スイッチバック分子は、交互に５’‐３’、３’‐５’の形態で合成され、これにより、該分子は、まず二重鎖のうち一方と塩基対になり、次に他方の鎖と塩基対になり、二重鎖の一方上に相当な長さのプリンまたはピリミジンが存在する必要がなくなる。
【００９９】
ある態様によれば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、モルフォリノアンチセンスである。モルフォリノは合成分子であり、天然の核酸構造の再設計による産物である。通常、２５塩基長で、標準的な核酸塩基対合によりＲＮＡの相補的配列に結合する。構造上、モルフォリノがＤＮＡと異なる点は、モルフォリノが標準的核酸塩基を有する一方で、これらの塩基は、デオキシリボース環の代わりにモルホリン環に結合し、かつリン酸塩の代わりにホスホロジアミデート基で連結される点である。アニオン性リン酸塩が非荷電のホスホロジアミデート基と置換されることで、通常の生理学的ｐＨ範囲におけるイオン化が防止されるため、生物または細胞内のモルフォリノは、非荷電分子である。モルフォリノは、キメラオリゴではなく、モルフォリノの全体骨格は、これらの修飾サブユニットから形成されている。モルフォリノは、一本鎖オリゴとして最も一般的に使用されるが、ヘテロ二重鎖モルフォリノと相補鎖ＤＮＡとが、カチオン性サイトゾル送達試薬と組み合わせて使用されることができる。
【０１００】
多くのアンチセンス構造のタイプ（ホスホロチオエート等）と異なり、モルフォリノは、その標的ＲＮＡ分子を分解しない。代わりに、モルフォリノは「立体遮断的」に作用し、ＲＮＡ内の標的配列に結合して、モルフォリノの結合がなければそのＲＮＡと結合する可能性のある分子を単純に妨害する。モルフォリノリゴは、モルファント胚を産生する胎芽、例えばゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル（ゼノパス）、ひよこ、およびウニの卵または胚における特異的なｍＲＮＡ転写物の役割を調べるために使用されることが多い。適切なサイトゾル送達系を持つため、モルフォリノは細胞培養に有効である。
【０１０１】
モルフォリノは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の５’側非翻訳領域に結合して、５’キャップから開始コドンまでのリボソーム開始複合体の形成進行を妨げる。これにより標的転写物のコード領域の翻訳が阻害される（「ノックダウン」遺伝子発現と呼ぶ）。モルフォリノは、タンパク質の発現をノックダウンしてそのノックダウンによりいかに細胞または生物が変化するかがわかる便利な手段である。
【０１０２】
モルフォリノは、通常、ｐｒｅ‐ＲＮＡの一本鎖上のイントロン境界で、スプライシング誘導性のｓｎＲＮＰ複合体がその標的に結合するのを妨げることで、ｐｒｅ‐ｍＲＮＡの処理工程も阻害することができる。Ｕ１（ドナー部位で）またはＵ２／Ｕ５（ポリピリミヂン体およびアクセプター部位で）の結合を妨害することにより、修飾スプライシングを起こすことが可能であり、普通、成熟ｍＲＮＡからエクソンが除去されることになる。幾つかのスプライシング標的を対象にすることでイントロンの封入が生じる一方、隠れたスプライス部位の活性が部分的封入または排除につながる可能性がある。Ｕ１１／Ｕ１２ｓｎＲＮＰｓの標的も遮断されることができる。スプライシング修飾は、逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）により、好都合にアッセイされることができ、ＲＴ‐ＰＣＲ生成物のゲル電気泳動後に、バンドシフトとして見られる。
【０１０３】
モルフォリノはまた、ｍｉＲＮＡ活性、リボゾーム活性、イントロンスプライシングサイレンサーおよびスプライシングエンハンサーの遮断にも使用されている。Ｕ２およびＵ１２ｓｎＲＮＰ機能は、モルフォリノにより阻害されている。タンパク質コード領域内で「不安定な」ｍＲＮＡ配列を標的にしたモルフォリノは、翻訳のフレームシフトを誘導することができる。こうした様々な標的に対するモルフォリノの活性は、モルフォリノが、タンパク質または核酸とｍＲＮＡとの相互作用を遮断するための汎用ツールとして使用可能であることを示唆している。
【０１０４】
酸性セラミダーゼまたはコリンキナーゼに特異的なＤＮＡ酵素
本発明のさらなる態様は、酸性セラミダーゼおよび／またはコリンキナーゼ阻害剤がＤＮＡ酵素である組成物に関する。ＤＮＡ酵素は、アンチセンスおよびリボザイム両技術の仕組みの特徴を幾つか組み込む。ＤＮＡ酵素は、アンチセンスオリゴヌクレオチドとまさに同様に特定の標的核酸配列を認識するが、リボザイムとほぼ同様に、触媒的に働き特異的に標的核酸を開裂させるように設計される。
【０１０５】
現在、ＤＮＡ酵素には２つの基本タイプがあり、その両方ともＳａｎｔｏｒｏおよびＪｏｙｃｅにより同定された（例えば、米国特許第６，１１０，４６２号を参照）。１０‐２３ＤＮＡ酵素は、２本のアームをつないだループ構造を含んでなる。この２本のアームによって、特定の標的核酸配列の認識による特異性が与えられる一方、ループ構造によって、生理学的条件下で触媒作用が引き起こされる。
【０１０６】
簡単に述べれば、標的核酸を特異的に認識して開裂させる理想的ＤＮＡ酵素を設計するには、当業者は、最初に特有の標的配列を同定しなくてはならない。これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの概略で示したものと同様のアプローチを用いて実施することができる。好ましくは、固有のまたは実質的に配列は、約１８〜２２個のヌクレオチドからなるＧ／Ｃが豊富な配列である。配列に含まれるＧ／Ｃの量が多いと、ＤＮＡ酵素と標的配列との相互作用を確実に強くする助けになる。
【０１０７】
ＤＮＡ酵素の合成では、メッセージを該酵素の標的にする特異的アンチセンス認識配列が、ＤＮＡ酵素の２本のアームを含んでなり、ＤＮＡ酵素ループがその２本の特異的アームの間に置かれるように分割される。
【０１０８】
ＤＮＡ酵素を生成して投与する方法は、例えば、米国特許第６，１１０，４６２号で見出すことができる。同様に、ＤＮＡリボザイムをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで送達する方法は、上記で詳細に概説したような、ＲＮＡリボザイム送達方法を含む。また、当業者は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと同様に、ＤＮＡ酵素が、安定性を改善して分解に対する耐性を向上させるため、任意に修飾され得ることを認識するであろう。
【０１０９】
本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、リボゾーム、ＲＮＡｉおよび三重螺旋分子は、ＤＮＡならびにＲＮＡ分子を合成するための当該分野に公知の任意の方法により作製されることができる。これらには、例えば固相ホスホアミダイト化学合成等、当該分野で公知のオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成する技術も含まれる。あるいは、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ転写により生成されることができる。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーター等の好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込む多種多様のベクターに組み込まれることができる。あるいは、アンチセンスＲＮＡを構成的にまたは誘導的に合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物は、使用されるプロモーターに応じて、細胞株に安定的に導入されることができる。さらには、核酸分子に対する様々な公知の修飾が、細胞内の安定性および半減期を向上させる手段として導入されてもよい。可能な修飾としては、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの隣接配列を該分子の５’および／または３’末端に付加するか、またはオリゴデオキシリボヌクレオチド骨格内部にホスホジエステラーゼ結合よりもむしろホスホロチオエートもしくは２’Ｏ‐メチルの使用等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
コリンキナーゼ阻害剤および酸性セラミダーゼ阻害剤の好ましい組み合わせとしては、ＭＮ５８ｂ（表１のＩＩの構造）とＮＯＥ（表２のＶＩにある構造）、ＲＳＭ−９３２Ａ（表１のＩの構造）とＮＯＥ，ＭＮ５８ｂとＤ‐ＮＭＡＰＰＤ（表２のＶＩＩＩの構造）、およびＲＳＭ‐９３２ＡとＤ‐ＮＭＡＰＰＤ．
【０１１１】
Ｃｈｏｋ阻害剤と化学療法剤との併用
（本発明の第２の組成物）
本発明の発明者らは、驚くべきことに、コリンキナーゼ阻害剤ＭＮ５８ｂ治療への耐性が、シスプラチン、タキソール、ビレルビンまたはゲムシタビン等の従来の化学療法剤への耐性と相関関係がないことを発見している。
【０１１２】
これは、ＣｈｏＫ阻害剤耐性の腫瘍（実施例１を参照）およびＣｈｏＫ阻害剤の存在下で増殖を繰り返す周期によって選択された樹立細胞株（本発明の実施例６を参照）の両方で認められている。いかなる理論にも束縛されるつもりはないが、ＣｈｏＫ阻害剤とシスプラチンとの間の非交差耐性は、両剤が異なる機序で作用する事実に起因すると考えられている。この仮説は、異種移植モデルでのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両試験（本発明の実施例７を参照）で、ＣｈｏＫ阻害剤とシスプラチンの併用が、その個々の化合物による治療（本発明の実施例７を参照）と比較された場合、腫瘍細胞の増殖抑制において相乗効果を示した事実によって裏付けられている。さらには、本発明の発明者らはまた、コリンキナーゼ阻害剤と５‐フルオロウラシルの併用が、異なる大腸癌細胞株の試験で（実施例９を参照）相乗的抗腫瘍効果を示したことも確認している。
【０１１３】
したがって、もう一つの態様によれば、本発明は、１種類以上のコリンキナーゼ阻害剤を含んでなる第１の成分と、１種類以上の化学療法剤を含んでなる第２の成分を、個別にまたは共に含んでなる組成物（以下、本発明の第２の組成物）に関する。
【０１１４】
「組成物」という用語は、本発明の代替的態様に係る様々な組み合わせの１種類以上の化合物を意味する。好ましくは、当該組成物は、ＣｈｏＫ阻害剤および少なくともアルキル化剤を含んでなる。
【０１１５】
本発明の組成物における使用に好適なＣｈｏＫ阻害剤としては、本発明の第１の組成物の一部を構成するものとして、表１であらかじめ示されたＣｈｏＫ阻害剤のいずれかが挙げられる。１つの好ましい態様によれば、ＣｈｏＫ阻害剤は、Ｃｈｏｋαに特異的な阻害剤である。
【０１１６】
本明細書で使用される「化学療法剤」という用語は、癌細胞の増殖、成長、寿命または転移活性を阻害する化学剤を意味し、以下に限定はされないが、ＤＮＡアルキル化剤、代謝拮抗剤、有糸分裂阻害剤、アントラサイクリン、トポイソメラーゼＩおよびＩＩ阻害剤、ホルモン療法および、ＥＧＦＲ阻害剤セツキシマブ、ゲフィチニブまたはタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤イマチニブ等の標的療法が挙げられる。１つの好ましい態様によれば、化学療法剤は、アルキル化剤であり、より詳細には、ＤＮＡアルキル化剤または代謝拮抗剤である。
【０１１７】
本明細書で使用される「アルキル化剤」という表現は、アルキル残基を急速に分化する細胞の遺伝物質に付加して、それにより複製停止および細胞死に導くことのできる化合物を意味する。このような化学物質としては、白金系化合物(platinum-based compound)、窒素マスタード、ニトロソウレア、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキルおよびトリアゼン、またそれらに限定されないが、メクロレタミン、シクロホスファミド（シトキサンＴＭ）、メルファラン（Ｌ‐サルコリシン）、エトポシド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル‐ＣＣＮＵ）、ストレプトゾシン、クロロゾトシン、ウラシルマスタード、クロルメチン、イホスファミド、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスフォルアミン、ブスルファン、プロカルバジン、ダカルバジンおよびテモゾロミド等が挙げられる。
【０１１８】
１つの態様によれば、アルキル化剤は、白金系化合物である。本発明で使用できる白金系化合物の例としては、シスプラチン、カルボプラチン、イプロプラチン、テトラプラチン、オキサリプラチン、ＪＭ１１８、ＪＭ１４９、ＪＭ２１６、ＪＭ３３５，トランスプラチノ、シス、トランス、シス‐Ｐｔ（ＮＨ３）（Ｃ６Ｈ１１ＮＨ２）（ＯＯＣＣ３Ｈ７）２Ｃ１、ネダプラチン、マラネート‐１，２‐ジアミノシクロヘキサノプラチン（ＩＩ）、５‐スルホサリチル酸‐トランス‐（１，２‐ジアミノシクロヘキサン）プラチン（ＩＩ）（ＳＳＰ）、ポリ‐［（トランス‐１，２‐ジアミノシクロヘキサン）プラチン］‐カルボキシアミロース（ＰＯＬＹ‐ＰＬＡＴ）および４‐ヒドロキシ‐スルホニルフェニルアセテート（トランス‐１，２‐ジアミノシクロヘキサン）プラチノ（ＩＩ）（ＳＡＰ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
本明細書で使用される「代謝拮抗剤」という用語は、広い意味で、正常な代謝を妨害する物質および電子輸送系を阻害してエネルギー豊富な中間体の生成を妨げる物質を意味する。これは、それらの物質が、生きている生物にとって重要な代謝物質（ビタミン、補酵素、アミノ酸ならびに糖等）に構造的または作用機序的に類似しているためである。抗腫瘍活性を有する代謝拮抗剤の例としては、葉酸類似体（メトトレキサート（アメトプテリン）等）、デノプテリン、エダトレキサート、メトトレキサート、ノラトレキシド、ペメトレキセド、ピリトレキシム、プテロプテリン、ラルチトレキセド、トリメトレキサート；ピリミジン類似体（フルオロウラシル（５‐フルオロウラシル：５‐ＦＵ（Ｒ））、フロキシウリジン（フルオロデ‐オキシウリジン：ＦｕｄＲ）、ドキシフルリジンおよびシタラビン（シトシンアラビノシド）；プリン類似体（メルカプトプリン（６‐メルカプトプリン：６‐ＭＰ）、チオグアニン（６‐チオグアニン：ＴＧ）、およびペントスタチン（２’‐デオキシコホルマイシン）等が挙げられるが、これらに限られない。
【０１２０】
好ましい組み合わせとしては、ＭＮ５８ｂとシスプラチン、ＲＳＭ‐９３２Ａとシスプラチン、ＭＮ５８ｂと５‐フルオロウラシル、およびＲＳＭ‐９３２Ａと５‐フルオロウラシル等が挙げられる。
これらに限られない。
【０１２１】
ＣｈｏＫ阻害剤および細胞死受容体リガンドの併用
（本発明の第３の組成物）
本発明の発明者らは、細胞死受容体リガンドおよびＣｈｏＫ阻害剤を個別に使用した治療と比べて、細胞死受容体リガンドおよびＣｈｏＫ阻害剤併用による腫瘍細胞治療が、細胞増殖をより阻害することを明らかにしている。例えば、本発明の実施例８で示されるように、コリンキナーゼ阻害剤ＲＳＭ−９３２Ａ（ＣｈｏＫＩ）およびＴＲＡＩＬの併用による大腸癌細胞の治療は、各化合物を個別投与して同じ細胞を治療する場合と比べ、細胞傷害性が上昇している。さらに、本発明の実施例８によれば、ＣｈｏＫ阻害剤ＭＮ５８ｂおよびＴＲＡＩＬの併用使用により、腫瘍異種移植モデルでの腫瘍成長の阻害が、それらの化合物の各々を別々に使用する場合に見られるよりも改善された結果が示されている。
【０１２２】
したがって、もう一つの態様によれば、本発明は、１種類以上のＣｈｏＫ阻害剤を含んでなる第１の成分と、１種類以上の細胞死受容体リガンドである第２の成分とを共にまたは個別に含んでなる組成物に関する。
【０１２３】
本発明の組成物における使用に好適なＣｈｏＫ阻害剤としては、本発明の第１の組成物の一部を構成するものとして、表１であらかじめ示されたＣｈｏＫ阻害剤のいずれかが挙げられる。１つの好ましい態様によれば、ＣｈｏＫ阻害剤は、Ｃｈｏｋαに特異的な阻害剤である。
【０１２４】
本発明の組成物における使用に好適な細胞死受容体リガンドとしては、ＮＧＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ／４‐１ＢＢＬ、ＴＮＦ‐αＣＤ１３４Ｌ／ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ／ＣＤ７０、ＦａｓＬ／ＣＤ９５、ＣＤ３０Ｌ、ＴＮＦ‐β／ＬＴ‐α、ＬＴ‐βおよびＴＲＡＩＬ．１つの好ましい態様によれば、ＴＮＦファミリー分子はＴＲＡＩＬ、機能的に等価なその誘導体またはその 模倣低分子化合物である。ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド）は、「Ａｐｏ‐２リガンド」、「Ａｐｏ‐２Ｌ」、「Ａｐｏ２Ｌ」、「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ」および「Ａｐｏ‐２リガンド／ＴＲＡＩＬ」としても知られており、ＴＲＡＩＬの同族受容体を発現する細胞のアポトーシスを誘導することができる分子である。ＴＲＡＩＬは数年前、サイトカインのＴＮＦファミリーの分子として同定された（(Pitti et al., 1996, J.BioLChem., 271 :12687-12690 and US Patent 6,284,236）。完全長のネイティブ配列ヒトＴＲＡＩＬポリペプチドは、アミノ酸２８１個の長さを有する、配列番号７（ＵｎｉｔＰｒｏｔ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｐ５０５９１）に示された配列のＩＩ型膜貫通タンパク質である。可溶型のＴＲＡＩＬの結晶学的研究により、ＴＮＦおよび他の関連タンパク質の構造に類似するホモトリマー構造が明らかになっている。しかし、他のＴＮＦファミリー分子と異なり、ＴＲＡＩＬは、その３つのシステイン残基（ホモトリマーの各サブユニットの２３０番の位置にある）が協調して亜鉛原子の調整を行い、また亜鉛結合がトリマーの安定性および生物学的活性にとって重要であるという独特の構造的特徴を持つことが分かった。本発明は、３つの異なるＴＲＡＩＬアイソフォーム（ＴＲＡＩＬα、ＴＲＡＩＬβおよびＴＲＡＩＬγ）またはその組み合わせのいずれかの使用を考察する。
【０１２５】
機能的に等価なＴＲＡＩＬバリアントとしては、可溶性ＴＲＡＩＬアイソフォーム類、例えば、国際公開ＷＯ０８０８８５８２号ならびに米国特許ＵＳ６２８４２３６号に記載のＴＲＡＩＬアイソフォーム、または米国特許出願ＵＳ２００２１２８４３８号に記載のＴＲＡＩＬ断片類９５−２８１ならびに１１４−２８１、Bremer et al (Neoplasia, 2004, 6:636-45)によるｓｃＦｖ：ｓＴＲＡＩＬ溶解物、米国特許出願ＵＳ２００２０６１５２５号に記載の選択的スプライシング型ＴＲＡＩＬ、国際公開ＷＯ０４１０１６０８号に記載のＴＲＡＩＬ受容体結合ペプチド、国際公開ＷＯ０７０６３３０１号に記載の１９ＩＬ、１９９Ｖ、２０ＩＬ、２１３Ｗ、２１５Ｄおよび／または１９３Ｓ ＴＲＡＩＬ変異体等のアポトーシス促進受容体に対する特異性が向上したＴＲＡＩＬバリアント類または国際公開ＷＯ０４００１００９Ａ号に記載の受容体ファージディスプレイによって選択されるバリアント類、ＴＲＡＩＬ同族受容体のＴＲＡＩＬ‐Ｒ１（ＤＲ４）ならびにＴＲＡＩＬ‐Ｒ２（ＤＲ５）を標的とするアゴニスト抗体類であるマパツムマブ、レクサツムマブ等、国際公開ＷＯ０７１２８２３１号に記載の抗体類、国際公開ＷＯ０２０９４８８０号に記載の抗体類、国際公開ＷＯ０６０１７９６１号に記載のモノクローナル抗体ＡＤ５‐１０、国際公開ＷＯ０５０５６６０５号に記載のＴＲＡＩＬ特異的タンデム型ディアボディならびにトリアボディ、国際公開ＷＯ９９３７６８４号に記載のキメラ抗ＤＲ４抗体類、国際公開ＷＯ０３０３８０４３号に記載のアゴニスト抗ＤＲ５抗体類、国際公開ＷＯ０２０８５９４６号に記載の二重特異性抗ＴＲＡＩＬ受容体抗体類、国際公開ＷＯ９８３２８５６号に記載の抗ＤＲ４特異的抗体類、Park,K.J et al (Cancer Res., 2007, 67:7327-7334) により記載された抗ＤＲ２ ＳｃＦＶ、国際公開ＷＯ０８０２５５１６号ならびに国際公開ＷＯ０４０１４９５１号に記載の三量体ＴＲＡＩＬ溶解タンパク質、国際公開ＷＯ０７１０２６９０号に記載の十二量体ＴＲＡＩＬバリアント類、国際公開ＷＯ０７１４５４５７号に記載のペグ化ＴＲＡＩＬ，および米国特許出願ＵＳ２００６１５３８０９号、国際公開ＷＯ０４０８７９３０号ならびに米国特許出願ＵＳ２００５０３
１５９３号に記載されているようなＴＲＡＩＬをコードするポリヌクレオチドを含んでなるＤＮＡベクター等が挙げられる。
【０１２６】
アポトーシス促進効果を有するＴＲＡＩＬの低分子模倣体としては、国際公開ＷＯ２００８０９４３１９号に記載の化合物類等が挙げられる。
【０１２７】
好ましい組み合わせとしては、ＲＳＭ‐９３２ＡとヒトＴＲＡＩＬの細胞外領域（アミノ酸９５〜２８１）およびＭＮ５８ｂとヒトＴＲＡＩＬの細胞外領域（アミノ酸９５〜２８１）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２８】
本発明の製剤
本発明の第１、第２および第３の組成物の一部を構成する化合物としては、そうした化合物のみならず薬学的に許容されるその塩、溶媒和物、プロドラッグ、等が挙げられる。「薬学的に許容される塩、溶媒和物、プロドラッグ」という表現は、任意の薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物、または受容体への投与の場合、本発明に記載の化合物を（直接または間接的に）提供することが可能な他の任意の化合物を意味する。しかし、薬学的に許容されない塩も、薬学的に許容される塩の調製に役立つため本発明の範囲に包含される。塩、プロドラッグおよび誘導体の調製は、当該分野に公知の方法を用いて実施されることができる。
【０１２９】
例えば、本明細書で提供される化合物の薬学的に許容される塩は、塩基性または酸性の残基を含む原化合物から、従来の化学的方法を用いて合成される。このような塩は一般に、例えば、遊離酸や遊離塩基の形の当該化合物と、化学量論的量の酸性もしくは塩基性水溶液または有機溶媒、または両者の混合溶液とを反応させることによって調製される。ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリル等の非水溶性媒体が一般に好ましい。酸付加塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の鉱酸付加塩および酢酸塩、マレイン酸、フマル酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸およびｐ‐トルエンスルホン酸等の有機酸付加塩等が挙げられる。塩基付加塩の例としては、ナトリウム、カリウム、臭化物、カルシウム、アンモニウム、マグネシウム、アルミニウムおよびリチウム塩等の無機塩、エチレンジアミン、エタノールアミン、Ｎ，Ｎ‐ジアルキレンエタノールアミン、トリエタノールアミン、グルカミンおよび塩基性アミノ酸塩等の有機塩基塩等が挙げられる。
【０１３０】
特に好ましい誘導体またはプロドラッグは、本発明の化合物を患者に投与した場合（例えば、経口投与化合物を血流によってより容易に吸収させることにより）、それらの生物学的利用能を向上させるもの、または原種に関連して生物学的区分（例えば、脳もしくはリンパ系）における原化合物の放出を促すものである。
【０１３１】
本発明はまた、当該化合物の少なくとも１つがプロドラッグとして見出される組成物を提供する。「プロドラッグ」という用語は、その最も広い意味で使われており、本発明の化合物にｉｎ ｖｉｖｏで変換されるそれらの誘導体等が挙げられる。このような誘導体については、当業者であれば明らかであり、その分子中に存在する官能基に応じて、以下の本発明の化合物の誘導体：エステル、アミノ酸エステル、リン酸エステル、硫酸エステル金属塩、カルバメートおよびアミド等が挙げられるが、これらに限定されない。所定の活性化合物のプロドラッグを製造する方法の例は当業者には公知であり、例えば、Krogsgaard-Larsen et al. "Textbook of Drug design and Discovery" Taylor & Francis (April 2002)で見ることができる。
【０１３２】
本発明の化合物は、遊離化合物または溶媒和物として結晶形であってもよく、それらの両者とも本発明の範囲内に包含されるものであることが意図されている。溶媒和の方法は、当該分野で一般に知られている。好適な溶媒和物は、薬学的に許容される溶媒和物である。１つの特定の態様によれば、溶媒和物は水和物である。本発明の組成物を形成する化合物としては、Ｃ上のキラル中心、すなわち異性体の存在に応じて、多重結合の存在に応じて（例えば、Ｚ、Ｅ）、光学異性体を挙げることができる。個々の異性体、光学異性体またはジアステレオ異性体、およびそれらの混合体が、本発明の範囲内に包含される。
【０１３３】
本発明の様々な化合物のために選択される種々の置換基は、ｌｏｇＰ値にかなり影響する一連の要因を与える。したがって、ヒドロキシル基は、水素結合ドナーとして作用し、フェノールの場合であっても分子間および分子内結合が確立されることができる。カルボニルまたはカルボキシル基の存在によって、分子内にプロトン受容体基が発生する。ハロゲンの存在は、非常に不完全な炭素を発生させ、生物学的特性をかなり改変する。アミノ基は、分子上に適切な求核基を発生させ、多くの場合、その極性および分極率を著しく改変する。また、さらにアルキル基および／またはアリール基の存在は、分子の親油性を高める。
【０１３４】
もう一つの態様によれば、本発明は、本発明の第１、第２もしくは第３の組成物を含んでなる医薬組成物、それらの薬学的に許容される塩、誘導体、プロドラッグ、溶媒和物またはそれらの立体異性体と共に、患者に投与されるための薬学的に許容される担体、アジュバントまたはビークルを提供する。ここで使用される「薬学的に許容される担体」という表現は、薬学的に許容される物質、組成物またはビークル、例えば、液体もしくは固形の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒もしくはカプセル封止材等を意味し、体内の１つの臓器もしくは部位から別の臓器もしくは部位に、主剤を運ぶもしくは移動させる働きをする。各担体は、その製剤の他の成分に対して適合性があるという意味で「許容しうる」ものでなくてはならない。薬学的に許容される担体として機能することができる物質の例は、以下のとおりである：（１）乳糖、ブドウ糖、ならびに蔗糖等の糖類；（２）コーンスターチならびにポテトスターチ等のデンプン類；（３）セルロースならびにその誘導体、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロースならびにセルロースアセテート等；（４）粉末トラガント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）ココアバターならびに坐剤ワックス等の賦形剤；（９）ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ごま油、オリーブ油、コーン油ならびに大豆油等の油類；（１０）プロピレングリコール等のグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ソルトールならびにポリエチレングリコール等のポリオール；（１２）オレイン酸エチルならびにラウリン酸エチル等のエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムならびに水酸化アルミニウム等の緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱性物質除去蒸留水；（１７）等張食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝液；および（２１）ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）ならびにその誘導体等、医薬製剤に使用される他の非毒性適合物質等。
【０１３５】
医薬組成物は、任意の好適な投与経路、例えば、経口、塗布、経腸または腸管外の経路（皮下、腹腔内、皮内、筋肉内および静脈内経路を含む）によって投与されることができる。
【０１３６】
経口投与のための好適な剤形には、任意の固形組成（錠剤、トローチ剤、カプセル剤、顆粒剤等）または液状組成（溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ等）等が含まれ、結合剤、例えば糖蜜、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカントゴムもしくはポリビニルピロリドン等；充填剤、例えば乳糖、糖、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトールもしくはグリシン等：錠剤の製剤用の潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム；崩壊剤、例えばデンプン、ポリビニルピロリドン、デンプングリコール酸ナトリウムもしくは微細結晶セルロース等；または薬学的に許容される湿潤剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム等、当該分野で公知となっている従来の賦形剤を含有することができる。
【０１３７】
固形の経口組成物は、錠剤を混合、充填または調製する従来の方法を用いて調製されることができる。繰り返し混合する作業は、大量の充填剤を使用して、組成物全体に有効成分を分散させるために行うことができる。このような作業は、当該分野では従来的な方法である。錠剤は、例えば湿性または乾燥性の顆粒化によって調製されることができ、場合によっては、通常の薬務でよく知られている方法にしたがってコーティングされることができる。特に、腸溶コーティングはよく知られた方法である。
【０１３８】
医薬組成物は、好適な個装の剤形になった無菌液、懸濁液または凍結乾燥製剤等、非経口投与用になっているものであってもよい。バルク剤、緩衝剤または界面活性剤等の好適な賦活剤が使用されてもよい。前述の製剤類は、スペイン薬局方、米国薬局方および類似の参考書籍に記載または引用されているような通常の方法を用いて調製されることができる。
【０１３９】
本発明で使用される化合物または組成物の投与は、静脈内注入、経口剤、腹腔内投与、静脈内投与等の任意の好適な方法で行われることができる。ただ、好ましい投与経路は、患者の状態次第である。経口投与は、患者にとって楽であり、また治療対象の病気が慢性的な特徴を持つものであれば好ましい。
【０１４０】
本発明の組成物は、それらを治療に適用するため、好ましくは薬学的に許容されるまたは実質的に純粋な形で生成される。言い換えれば、本発明の組成物は、薬学的に許容される賦形剤を除き、かつ通常の投薬レベルで毒性があると思われる物質を含有していない、薬学的に許容される純度を有する。酸性セラミダーゼ阻害剤またはコリンキナーゼ阻害剤の純度は、好ましくは５０％を超え、より好ましくは７０％を超え、さらに好ましくは９０％を超える。１つの態様によれば、当該阻害剤の純度は９５％を超える。
【０１４１】
本発明の組成物において、酸性セラミダーゼ阻害剤、化学療法剤、細胞死受容体リガンドおよびコリンキナーゼ阻害剤の有効治療量は、一般に、他の要因と比べて特に、治療対象となる個人、その個人の病態の重篤度、選択される投与形態等に応じて異なってくる。こうした理由で、本発明で記載される投与量は、当業者にとって指標としてみなされるべきであって、当業者は、あらかじめ記載された変数に従って、投与量を調整しなければならない。その一方、酸性セラミダーゼ阻害剤は、１日一回以上、例えば１日１，２，３または４回、典型的１日用量が１〜２００ｍｇ／ｋｇ（除脂肪体重）／日、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇ（除脂肪体重）／日で投与されることができる。同様にして、コリンキナーゼ阻害剤は、１日１回以上、例えば、１日１，２，３または４回、典型的１日用量が１〜２００ｍｇ／ｋｇ（除脂肪体重）／日、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇ（除脂肪体重）／日で投与されることができる。
【０１４２】
本発明に係る組成物は、単一の製剤として処方されることができるが、あるいはまた、同時、並行、個別または連続投与のための調製品として提供されてもよい。
【０１４３】
本発明において記載される組成物、それらの薬学的に許容される塩、プロドラッグおよび／または溶媒和物、そしてそれらを含有する医薬組成物は、併用療法のために、他の付加的薬剤類と共に使用されることができる。前記付加的薬剤類は、同じ医薬組成物の一部を構成していてもよく、またあるいは、酸性セラミダーゼ阻害剤およびコリンキナーゼ阻害剤または薬学的に許容されるそれらのプロドラッグ、溶媒和物もしくは塩を含んでなる医薬組成物との同時もしくは非同時投与のために、個別の組成物の形態で提供されてもよい。当該他の薬剤は、同時もしくは別々に投与されるために、同じ組成物の一部を構成していてもよく、または個別の組成物として提供されてもよい。
【０１４４】
本発明の組成物は、当該分野で公知の他の化学療法剤と併用して投与されることができ、例えば以下の化学療法剤がある：
代謝拮抗剤，例えば葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤等があり、シタラビン（ＣＹＴＯＳＡＲ‐Ｕ）、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル（５‐ＦＵ）、フロキシウリジン（ＦｕｄＲ）、６‐チオグアニン、６‐メルカプトプリン（６‐ＭＰ）、ペントスタチン、メトトレキサート、１０‐プロパルギル‐５，８‐ジデアザ葉酸（ＰＤＤＦ、ＣＢ３７１７）、５，８‐ジデアザテトラヒドロ葉酸（ＤＤＡＴＨＦ）、ロイコボリン、フルダラビンリン酸、ペントスタチンおよびゲムシタビン等が挙げられるが、これらに限られない；
好適な天然生成物およびそれらの誘導体（ビンカアルカロイド、抗腫瘍抗体、酵素、リンパ球ならびにエピポドフィロトキシン等）、例えばＡｒａ‐Ｃ，パクリタキシル（タキソール（ｋ）、ドセタキシル（タキソテール）、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン‐Ｃ、Ｌ‐アスパラギナーゼ、アザチオプリン；ブレキナル；アルカロイド類、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン等；ポドフィロトキシン類、例えばエトポシド、テニポシド等；抗体類、例えばアントラサイクリン、塩酸ダウノルビシン（ダウノマイシン、ルビドマイシン、セルビジン）、イダルビシン、ドキソルビシン、エピルビシンならびにモルフォリノ誘導体等；フェノキシゾンビスシクロペプチド、例えばダクチノマイシン；塩基性糖ペプチド、例えばブレオマイシン；アントラキノン配糖体、例えばプリカマイシン（ミトラマイシン）；アントラセンジオン、例えばミトキサントロン；アジリノピロロインドールジオン、例えばマイトマイシン；大環状免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、ＦＫ‐５０６（タクロリムス、プログラフ）、ラパマイシン等が挙げられるが、これらに限定されない。他の抗増殖性・細胞毒性薬剤は、ナベルベン、ＣＰＴ‐１１，アナストロゾール、レトラゾール、カペシタビン、レロキサフィン、シクロホスファミド、イホスファミドおよびドロキサフィン等が挙げられる；
抗増殖活性を有する微小管影響性の薬剤も使用に好適であり、以下のものが挙げられるが、それらに限定されない：アロコルヒチン（ＮＳＣ ４０６０４２）、ハリコンドリンＢ（ＮＳＣ ６０９３９５）、コルヒチン（ＮＳＣ ７５７）、コルヒチン誘導体（ＮＳＣ ３３４１０等）、ドルスタチン１０（ＮＳＣ ３７６１２８）、メイタンシン（）、リゾキシン（）、パクリタキセル（タキソール）、タキソール誘導体（）、デセタキセル（）、チオコルヒチン（）、トリチルシステイン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、エポチロンＡ，エポチロンＢ、ジスコデルモリド等を含むがこれらに限定されない天然および合成エポチロン；エストラムスチン、ノコダゾール等がある；
チロシンキナーゼ阻害剤、例えばゲフィニチブ、イマチニブ、ソラフェニブ、ダサチニブならびにエルロチニブ等がある；
トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばトポテカン、イリノテカン、エトポシドならびにテニポシド等のエピポドフィロトキシン等があげられるが、これらに限定されない；
アントラサイクリン（ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン等）がある；
モノクローナル抗体、例えばセツキシマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、アレムツズマブならびにトラスツズマブ等がある。
【０１４５】
また、本発明の第１および第３の組成物の場合、これらの組成物はさらに、アルキル化剤を含んでなることができる。本発明の第１および第３の組成物に使用するための好適なアルキル化剤には、白金系化合物、例えばカルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、トリプラチン、テトラニトレート、サトラプラチンならびにこれらの併用；ブスルファン等のアルキルスルホン酸、ヘキサメチルメラミン、アルトレタミンまたはチオテパ等のエチレンイミンならびにメチルメラミン、シクロホスファミド、メクロレタミンまたはムスチン等の窒素マスタード、ウラムスチンまたはウラシルマスタード、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミド、カルムスチンまたはストレプトゾシン等のニトロソウレア、ダカルバジン等のトリアゼンおよびテモゾロミド等のイミダゾテトラジン等が挙げられる。
【０１４６】
また、本発明の第１および第２の組成物の場合、これらの組成物はまた、細胞死受容体リガンドを含んでなることができる。好ましくは、前記細胞死受容体リガンドは、ＮＧＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ／４‐１ＢＢＬ、ＴＮＦ‐α、ＣＤ１３４Ｌ／ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ／ＣＤ７０、ＦａｓＬ／ＣＤ９５、ＣＤ３０Ｌ、ＴＮＦ‐β／ＬＴ‐α、ＬＴ‐βおよびＴＲＡＩＬからなる群から選択される。１つの好ましい態様によれば、ＴＮＦファミリー分子は、ＴＡＩＬ，機能的に等価なその誘導体またはその模倣低分子化合物である。ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド）は、「Ａｐｏ‐２リガンド」「Ａｐｏ‐２Ｌ」「Ａｐｏ２Ｌ」「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ」および「Ａｐｏ‐２リガンド／ＴＲＡＩＬ」としても知られており、ＴＲＡＩＬ同族受容体を発現する細胞にアポトーシスを誘導することができる分子である。ＴＲＡＩＬは数年前、サイトカインのＴＮＦファミリーの分子として同定された（(Pitti et al., 1996, J.BioLChem., 271 :12687-12690 and US Patent 6,284,236）。完全長のネイティブ配列ヒトＴＲＡＩＬポリペプチドは、アミノ酸２８１個の長さを有するＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＴＲＡＩＬの結晶学的研究により、ＴＮＦおよび他の関連タンパク質の構造に類似するホモトリマー構造が明らかになっている。しかし、他のＴＮＦファミリー分子と異なり、ＴＲＡＩＬは、その３つのシステイン残基（ホモトリマーの各サブユニットの２３０番の位置にある）が協調して亜鉛原子の調整を行い、また亜鉛結合がトリマーの安定性および生物学的活性にとって重要であるという独特の構造的特徴を持つことが分かった。本発明は、３つの異なるＴＲＡＩＬアイソフォーム（ＴＲＡＩＬα、ＴＲＡＩＬβおよびＴＲＡＩＬγ）またはその組み合わせのいずれかの使用を考察する。
【０１４７】
機能的に等価なＴＲＡＩＬバリアントとしては、可溶性ＴＲＡＩＬアイソフォーム類、例えば、国際公開ＷＯ０８０８８５８２号ならびに米国特許ＵＳ６２８４２３６号に記載のＴＲＡＩＬアイソフォーム、または米国特許出願ＵＳ２００２１２８４３８号に記載のＴＲＡＩＬ断片類９５−２８１ならびに１１４−２８１、Bremer et al (Neoplasia, 2004, 6:636-45)によるｓｃＦｖ：ｓＴＲＡＩＬ溶解物、米国特許出願ＵＳ２００２０６１５２５号に記載の選択的スプライシング型ＴＲＡＩＬ、国際公開ＷＯ０４１０１６０８号に記載のＴＲＡＩＬ受容体結合ペプチド、国際公開ＷＯ０７０６３３０１号に記載の１９ＩＬ、１９９Ｖ、２０ＩＬ、２１３Ｗ、２１５Ｄおよび／または１９３Ｓ ＴＲＡＩＬ変異体等のアポトーシス促進受容体に対する特異性が向上したＴＲＡＩＬバリアント類または国際公開ＷＯ０４００１００９Ａ号に記載の受容体ファージディスプレイによって選択されるバリアント類、ＴＲＡＩＬ同族受容体のＴＲＡＩＬ‐Ｒ１（ＤＲ４）ならびにＴＲＡＩＬ‐Ｒ２（ＤＲ５）を標的とするアゴニスト抗体類であるマパツムマブ、レクサツムマブ等、国際公開ＷＯ０７１２８２３１号に記載の抗体類、国際公開ＷＯ０２０９４８８０号に記載の抗体類、国際公開ＷＯ０６０１７９６１号に記載のモノクローナル抗体ＡＤ５‐１０、国際公開ＷＯ０５０５６６０５号に記載のＴＲＡＩＬ特異的タンデム型ディアボディならびにトリアボディ、国際公開ＷＯ９９３７６８４号に記載のキメラ抗ＤＲ４抗体類、国際公開ＷＯ０３０３８０４３号に記載のアゴニスト抗ＤＲ５抗体類、国際公開ＷＯ０２０８５９４６号に記載の二重特異性抗ＴＲＡＩＬ受容体抗体類、国際公開ＷＯ９８３２８５６号に記載の抗ＤＲ４特異的抗体類、Park,K.J et al (Cancer Res., 2007, 67:7327-7334) により記載された抗ＤＲ２ ＳｃＦＶ、国際公開ＷＯ０８０２５５１６号ならびに国際公開ＷＯ０４０１４９５１号に記載の三量体ＴＲＡＩＬ溶解タンパク質、国際公開ＷＯ０７１０２６９０号に記載の十二量体ＴＲＡＩＬバリアント類、国際公開ＷＯ０７１４５４５７号に記載のペグ化ＴＲＡＩＬ，および米国特許出願ＵＳ２００６１５３８０９号、国際公開ＷＯ０４０８７９３０号ならびに米国特許出願ＵＳ２００５０３
１５９３号に記載されているようなＴＲＡＩＬをコードするポリヌクレオチドを含んでなるＤＮＡベクター等が挙げられる。
【０１４８】
アポトーシス促進効果を有するＴＲＡＩＬの低分子模倣体としては、国際公開ＷＯ２００８０９４３１９号に記載の化合物類等が挙げられる。
【０１４９】
本発明の組成物の治療用途
本発明の組成物は、腫瘍細胞の増殖阻害におけるそれらの相乗効果の点から、医療に用いられることができる。したがって、もう一つの様態で、本発明は、医薬に用いられる本発明の組成物に関する。
【０１５０】
もう一つの態様によれば、本発明は、癌の治療方法に関し、（ｉ）酸性セラミダーゼ阻害剤およびコリンキナーゼ阻害剤、（ｉｉ）コリンキナーゼ阻害剤および化学療法剤、または（ｉｉｉ）コリンキナーゼ阻害剤および細胞死受容体リガンドを含んでなる組成物を患者に投与することを含んでなる、癌の治療のための方法に関する。あるいは、本発明は、癌治療薬の製造に向けた、（ｉ）酸性セラミダーゼ阻害剤およびコリンキナーゼ阻害剤、（ｉｉ）コリンキナーゼ阻害剤および化学療法剤、または（ｉｉｉ）コリンキナーゼ阻害剤および細胞死受容体リガンドを含んでなる組成物の使用に関する。あるいは、本発明は、癌の治療用途のための、（ｉ）酸性セラミダーゼ阻害剤およびコリンキナーゼ阻害剤、（ｉｉ）コリンキナーゼ阻害剤および化学療法剤、または（ｉｉｉ）コリンキナーゼ阻害剤および細胞死受容体リガンドを含んでなる組成物に関する。
【０１５１】
本発明はまた、上記に記載の付加的な抗腫瘍薬類を含む本発明の医薬組成物のいずれかの投与を考察する。好ましくは、前記癌は、重鎖疾患、白血病（例えば急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、急性前骨髄球性白血病、骨髄異形成症候群、若年性骨髄単球性白血病等）、腫瘍転移、新生物、腫瘍（例えば、聴神経腫瘍、腺癌、副腎皮質癌、肛門癌、血管肉腫、星状細胞腫、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、気管支原性癌、腹膜癌、子宮頸部癌、軟骨肉腫、脊索腫、絨毛癌、結腸癌、結直腸癌、頭蓋咽頭腫、嚢胞腺癌、胎生期癌、子宮内膜癌、内皮肉腫、上衣腫、上皮癌、食道癌、ユーイング腫瘍、成人型線維肉腫、消化器癌、尿生殖器癌、膠芽腫、神経膠腫、頭部癌、血管芽腫、肝腫、ホジキン病、腎癌、平滑筋肉腫、粘液様脂肪肉腫、肝癌、肺癌、リンパ管内皮肉腫、リンパ管腫症、リンパ腫、悪性高カルシウム血症、悪性膵臓性インスラノーマ、髄様癌、髄芽腫、メラノーマ、髄膜腫、中皮腫、頸部癌、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、欠突起膠腫、骨原性肉腫、卵巣癌、膵臓癌、乳頭腺癌、乳頭癌、陰茎癌、松果体腫、前癌性皮膚病変、原発性脳腫瘍、原発性マクログロブリン血症、原発性血小板血症、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、唾液腺癌、肉腫、脂腺癌、精上皮腫、小細胞肺癌、扁平上皮細胞癌、胃癌、滑膜性腫瘍、汗腺癌、睾丸腫瘍、甲状腺癌、子宮癌、外陰腺癌、およびウィルムス腫瘍）、または非制御細胞増殖に特徴付けられる何らかの病気もしくは疾患よりなる群から選択される。
【０１５２】
１つの好ましい態様によれば、前記癌は肺癌である。ここで使われている「肺癌」とは、肺組織に存在する１種類以上の細胞に影響する何らかの腫瘍性変化を意味する。本発明の組成物を使用して治療ができる非限定的種類の肺癌としては、小細胞および非小細胞肺癌、例えば扁平上皮癌、腺癌、大細胞癌ならびに悪性中皮腫等が挙げられる。より好ましい態様によれば、前記肺癌は非小細胞肺癌である。
【０１５３】
別の好ましい１つの態様によれば、前記癌は、大腸癌または結腸直腸癌である。ここで使われている「結腸直腸癌」という用語は、結腸、直腸および虫垂の腫瘍形成のいずれかのタイプを含有し、早期ならびに後期両方の腺腫および癌腫、さらには遺伝性、家族性または散発性癌を意味する。遺伝性の結腸直腸癌（ＣＲＣ）には、過誤腫性ポリープ症候群および最も知られた家族性腺腫ポリープ（ＦＡＰ）等、さらには、遺伝性非ポリープ性結腸直腸癌（ＨＮＰＣＣ）またはリンチ症候群Ｉのような非ポリープ性症候群等、ポリープの存在が含まれる。本発明は、デュークス分類法によるステージＡ、Ｂ、Ｃ１、Ｃ２およびＤ、アストラーカラー分類法によるステージＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３およびＤ、ＴＮＭ分類法によるステージＴＸ、ＴＯ、Ｔｉｓ、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、ＮＸ、ＮＯ、Ｎ１、Ｎ２、ＭＸ、ＭＯおよびＭ１、さらにはＡＪＣＣ（米国対癌合同委員会）分類法によるステージ０、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ等の異なったステージにおける結腸直腸癌の診断を可能にする。
【０１５４】
本発明に係る組成物は、単一の製剤として処方されることができるが、あるいは、同時、並行、個別または連続の投与のための製剤として提供されてもよい。
【０１５５】
ＣｈｏＫ阻害剤療法に対する腫瘍細胞感作における酸性セラミダーゼ阻害剤、化学療法剤または細胞死受容体リガンドの使用
本発明の発明者らはまた、コリンキナーゼ阻害剤に対する反応が、酸性セラミダーゼ阻害剤（本発明の実施例６を参照）、化学療法剤（実施例７および９を参照）または細胞死受容体リガンド（実施例８を参照）をあらかじめもしくは同時に投与して治療する場合に高まることも確認している。
【０１５６】
したがって、もう一つの態様によれば、本発明は、コリンキナーゼ阻害剤に対する腫瘍細胞の感受性を高める方法に関し、該方法は、酸性セラミダーゼ阻害剤、化学療法剤または細胞死受容体リガンドと併用して前記腫瘍細胞を治療することを含んでなる。さらにもう一つの態様によれば、本発明は、コリンキナーゼ阻害剤に対する腫瘍細胞の感受性を高めるための酸性セラミダーゼ阻害剤、化学療法剤または細胞死受容体リガンドの使用に関する。
【０１５７】
ここで使われている「感受性」という用語は、所定のコリンキナーゼ阻害剤に対する細胞の反応を意味し、通常、最小量のコリンキナーゼ阻害剤で腫瘍細胞の増殖が５０％阻害されるものとして測定される。したがって、酸性セラミダーゼ、化学療法剤もしくは細胞死受容体リガンドとの併用により、該感受性の上昇、または細胞増殖を５０％阻害するために必要な該最小量の低減につながる。
【０１５８】
コリンキナーゼ阻害剤を用いた療法に対する腫瘍細胞の感作は、酸性セラミダーゼ阻害剤、化学療法剤または細胞死受容体リガンドを同時に投与するか、コリンキナーゼ阻害剤の投与後もしくは投与前に投与して該細胞を治療することによって行うことができる。コリンキナーゼ阻害剤に対する腫瘍細胞の感受性上昇に使用できる酸性セラミダーゼ阻害剤、化学療法剤および細胞死受容体リガンドとして、本発明の組成物の一部を構成するものとして上述された化合物のいずれかを使用してよい。また、酸性セラミダーゼ阻害剤または細胞死受容体リガンドで感作済みの細胞の治療に使用できるコリンキナーゼ阻害剤は、本質的に、本発明の組成物の成分として上述された阻害剤のいずれかである。
【０１５９】
ＣｈｏＫ阻害剤耐性の癌患者の同定方法
さらにまた、本発明の発明者らによる発見は、ＣｈｏＫ阻害剤療法に耐性を示す可能性のある癌患者を、該患者の試料中の酸性セラミダーゼレベルを定量することにより同定できる可能性を拓くものである。もし酸性セラミダーゼレベルが基準試料よりも高ければ、患者のＣｈｏＫ阻害剤耐性の可能性を示すことになる。これは、ＣｈｏＫ阻害剤に反応して産生されたアポトーシス促進性セラミダーゼが加水分解され、細胞分裂促進効果を有するスフィンゴシンが生成されるためである。反対に、もし酸性セラミダーゼレベルが、基準試料のレベルより低いかまたは少なくとも高くない場合は、その患者はＣｈｏＫ阻害剤療法に対して好ましい反応を示すことが分かる。
【０１６０】
したがって、もう一つの形態によれば、本発明は、患者の試料中の酸性セラミダーゼレベルを定量することを含んでなる、ＣｈｏＫ阻害剤療法に耐性の癌患者の同定方法（以下、本発明の第１の方法）に関し、該方法において、前記試料中の酸性セラミダーゼレベルが基準試料よりも高い場合、前記患者はＣｈｏＫ阻害剤耐性であると同定される。
【０１６１】
本発明の第１の方法を実施するために、研究対象の患者から試料を採取する。ここで使われる「試料」という用語は、該患者から入手可能な何らかの試料に関する。本発明の第１の方法は、生検標本、組織、細胞または液体（血清、唾液、精液、喀痰、脳脊髄液（ＣＳＦ）、涙、粘液、汗、乳、脳抽出液等）のような、患者由来のいずれかの種類の生物学的試料に適用されることができる。一つの特定の態様によれば、前記試料は、組織試料またはその一部分、好ましくは腫瘍組織試料またはその一部分である。前記試料は、例えば生検等の従来の方法、関連する医療技術分野の当業者に公知の方法によって採取することができる。生検で試料を採取する方法には、細胞塊の総分割（gross apportioning of a mass）、顕微解剖、または他の公知の細胞分離手法等がある。腫瘍細胞はまた、穿刺吸引細胞診で採取されてもよい。試料の保存や扱いを簡素化するために、これらの試料は、ホルマリン固定およびパラフィン包埋されてもよく、または急速冷凍可能な優れた低温培地に浸漬することにより、最初に凍結しその後にＯＣＴ化合物等の低温凝固可能な培地に包埋されることができる。
【０１６２】
患者からの試料採取後、本発明の第１の方法は、酸性セラミダーゼレベルの定量を含んでなる。当業者であれば理解しているように、前記「酸性セラミダーゼレベル」は、酸性セラミダーゼをコードするｍＲＮＡのレベルを測定することにより、酸性セラミダーゼのレベルを同定することによって、または酸性セラミダーゼの酵素活性を測定することによって定量されることができる。
【０１６３】
「発現レベル」がｍＲＮＡ発現レベル酸性セラミダーゼの測定により定量される場合、生物学的試料には、物理的にもしくは機械で組織または細胞構造を破壊するための処理が施されて、細胞内成分を水性もしくは有機性の溶液に放出させ、さらなる解析のために核酸を調製することができる。核酸は、当業者に公知の方法や市販の方法により試料から抽出される。そして、当該分野で典型的方法のいずれか、例えば、Sambrook, J., et al, 2001, Molecular cloning: a Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3による手法を用いて、凍結された試料かまたは新しい試料からＲＮＡが抽出される。好ましくは、抽出過程の間、ＲＮＡの分解が生じないように考慮する。
【０１６４】
一つの特定の態様によれば、発現レベルは、ホルマリン固定およびパラフィン包埋された組織試料から採取したｍＲＮＡを用いて定量される。ｍＲＮＡは、保存用の病理学的試料、または最初に脱パラフィンされた生検試料から単離されることができる。脱パラフィンの方法には、例えば、パラフィン化された試料をキシレン等の有機溶媒で洗浄する方法等がある。脱パラフィンされた試料は、低アルコール水溶液で再水和されることができる。好適な低アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノールおよびブタノール等が挙げられる。脱パラフィンされた試料は、例えば、濃度が低減されたより低アルコールの溶液で連続洗浄して再水和されてもよい。あるいは、試料の脱パラフィンおよび再水和は同時に行われてもよい。その後に、試料を溶解させて、そこからＲＮＡの抽出が行われる。
【０１６５】
全ての遺伝子発現プロファイリング技術（ＲＴ‐ＰＣＲ、ＳＡＧＥまたはＴａｑＭａｎ）が、本発明の前述の態様を実施する上で好適に使用され得るが、遺伝子ｍＲＮＡ発現レベルは、逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）により定量される場合が多い。一つの特定の態様によれば、酸性セラミダーゼｍＲＮＡの発現レベルは、定量的ＰＣＲ、好ましくは、リアルタイムＰＣＲによって定量される。個々の試料または組織マイクロアレイでの検出が可能である。
【０１６６】
様々な試料中でｍＲＮＡ発現の値を標準化するために、試験試料における所望のｍＲＮＡの発現レベルと対照ＲＮＡの発現とを比較することが可能である。ここで使われる「対照ＲＮＡ」は、非腫瘍原性細胞と比べて、発現レベルが変化しないかまたは限定数の腫瘍細胞においてのみ変化するＲＮＡを意味する。好ましくは、対照ＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子に相当するｍＲＮＡであり、構造的に発現されるタンパク質をコードして本質的細胞機能を実行する。本発明で使用される好ましいハウスキーピング遺伝子には、β‐２‐マイクログロブリン、ユビキチン、１８‐Ｓリボソームタンパク質、シクロフィリン、ＧＡＰＤＨおよびアクチン等がある。一つの特定の態様によれば、対照ＲＮＡはβ‐アクチンｍＲＮＡである。ある一つの態様によれば、内因性の対照ＲＮＡとしてβ‐アクチンおよび基準として市販の対照ＲＮＡを用いて、比較性ＣＴ法に従って相対的遺伝子発現定量が計算される。最終結果は、公式：２−（ΔＣｔ試料−ΔＣｔ基準）となる。ここで、基準および試料のΔＣＴは、ハウスキーピング遺伝子のＣＴ値から標的遺伝子のＣＴ値を引き算することによって決定される。
【０１６７】
酸性セラミダーゼｍＲＮＡのｍＲＮＡ発現レベルの定量後、本発明の第１の方法は、その発現レベルを基準試料のレベルと比較することを含んでなる。ここで使われる「基準(reference)試料」は、酸性セラミダーゼｍＲＮＡの基準レベルを示す試料であることを理解すべきである。例えば、基準試料は、試験対象の患者の腫瘍に類似であるがＣｈｏＫ阻害剤耐性ではない某患者の腫瘍試料であってもよい。あるいは、基準試料として、試験対象の腫瘍と同種類の腫瘍を有する何人かの患者から採取した腫瘍組織試料プールを用いてもよい。あるいは、腫瘍試料の集合体におけるｍＲＮＡ発現レベルを定量して、個々の値の合計から中間値を決定することも可能である。そして、得られた中間値は、試験対象の試料中のｍＲＮＡ発現レベルが多いとみなすか否かを判定するための基準値として使われる。
【０１６８】
被験者間のばらつき（年齢、人種等に関する面）のため、ｍＲＮＡのレベルの絶対基準値を設定することは、（実際に不可能ではないにしても）非常に困難である。したがって、一つの特定の態様によれば、「高い」または「低い」酸性セラミダーゼｍＲＮＡに対する基準値は、酸性セラミダーゼｍＲＮＡの発現レベルを得るために健康な被験者（例えば、ＮＳＣＬＣと診断されていない人々）から単離された一群の試料の試験に関わる従来手法を用いて、百分位数（パーセンタイル）の計算により決定される。そして、「高い」レベルとして、好ましくは、酸性セラミダーゼｍＲＮＡの発現レベルが、正常集団における５０パーセンタイル以上となる試料が指定され、これには、例えば、正常集団で６０パーセンタイル以上の発現レベル、正常集団で７０パーセンタイル以上の発現レベル、正常集団で８０パーセンタイル以上の発現レベル、正常集団で９０パーセンタイル以上の発現レベルおよび正常集団で９５パーセンタイル以上の発現レベル等が含まれる。
【０１６９】
あるいは、もう一つの特定の態様によれば、酸性セラミダーゼレベルは、酸性セラミダーゼタンパク質のレベルを測定することにより定量されることができる。当該タンパク質の発現レベルは、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法または免疫蛍光法等の免疫学的手法によって定量されてもよい。ウエスタンブロット法は、変性状態下でゲル電気泳動によりあらかじめ分離され、細胞膜、一般にはニトロセルロース上に固定化されたタンパク質を、特異的抗体および現像系（化学発光等）を使用したインキュベーションによって検出する手法に基づいている。免疫蛍光法による解析は、発現の分析のために、標的タンパク質に特異的な抗体を使用する必要がある。ＥＬＩＳＡは、標的抗原と標識抗体間に形成される共役が、酵素活性を示す複合体の形成になるように、抗原または酵素標識抗体を使用する方法に基づく。それらの要素（抗原または標識抗体）の一方が支持体上に固定されるので、抗体抗原複合体は支持体に固定化され、したがって、酵素により変換される基質を、吸光度測定法または蛍光光度法等によって検出可能な生成物に添加することにより、標的タンパク質を検出することができる。
【０１７０】
あるいは、酸性セラミダーゼタンパク質発現レベルの定量は、集められた患者の試料が含まれる組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を構築して、免疫組織化学法によりタンパク質の発現レベルを定量することによって実施できる。免疫染色強度は、その方法の再現性を維持するために、二人の異なる病理学者によって評価され、一定の明確なカットオフ基準を用いて点数化される。食い違いがあれば、同時に再評価することによって解決が可能である。簡単に説明すると、免疫染色の結果は、腫瘍細胞における発現と各マーカーの特異的カットオフ値を考慮しながら、ネガティブ発現（０）ｖｓポジティブ発現、および低発現（１＋）ｖｓ中程度（＋２）ならびに高（３＋）発現として記録されることができる。総合的基準として、カットオフ値は、再現性促進のために選択され、また可能であれば、生物学的事象を解釈するために選択された。
【０１７１】
免疫学的方法を使用する場合、標的タンパク質の量を検出するために、標的タンパク質に高親和性を持って結合することが知られている任意の抗体または試薬を使用することができる。しかし、好ましくは抗体が使用され、例えば、ポリクローナル血清、ハイブリドーマ上澄みもしくはモノクローナル抗体、抗体断片Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’ｙＦ（ａｂ’）２、ＳｃＦｖ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディおよびヒト化抗体が使用される。
【０１７２】
酸性セラミダーゼレベルの定量に、ｍＲＮＡ発現レベルを測定するのかタンパク質レベルを測定するのかに関わらず、得られた値は、基準試料の値と比較される必要がある。基準試料は、多くの健康な患者から均等量をプールして得られた試料に相当するものであってもよい。この基準試料の値が設定されると、患者由来の腫瘍細胞に発現される該マーカーのレベルを、この中間値と比較することができ、したがって、「低」、「正常」または「高」のレベルを割り当てることが可能となる。基準レベルが由来する試料のコレクションは、好ましくは患者と同年齢の健康な人からの試料で構成される。いずれの場合でも、異なる数の試料を含むことができる。より好ましい一つの態様によれば、試料は、生脳組織の生検試料である。好ましくは、該コレクションは、正確な基準レベルを提供するために十分なものであるべきである。好ましくは、基準レベルを設定するために使われる試料数は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００以上である。
【０１７３】
一つの特定の態様によれば、基準値と比較して、少なくとも１．１倍、１．５倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはそれ以上の、基準値を超える発現の増加が「高」発現とみなされる。一つの特定の態様によれば、基準値と比較して、少なくとも０．９倍、０．７５倍、０．２倍、０．１倍、０．０５倍、０．０２５倍、０．０２倍、０．０１倍、０．００５倍またはそれ以下の、基準値を下回る発現の減少が「低」発現とみなされる。
【０１７４】
その一方で、タンパク質発現レベルの定量は、集められた被験者試料を含む組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を構築して、当該分野に公知の免疫組織化学法によりタンパク質の発現レベルを定量することによって実施することができる。
【０１７５】
もう一つの態様によれば、酸性セラミダーゼレベルの定量は、試験対象の試料中の酸性セラミダーゼ活性を同定することにより行うことができる。酸性セラミダーゼの酵素活性の同定方法は、当業者には多数知られており、上記で詳細に述べられている。
【０１７６】
癌患者のための個別化治療を選択する方法
本発明の発明者らにより提供された研究成果によって、ＣｈｏＫ阻害剤療法に耐性を示す可能性のある癌患者を、その患者由来の試料中の酸性セラミダーゼの発現レベルに基づいて同定することが可能になっている。したがって、さらにもう一つの態様によれば、本発明は、癌の患者のための個別化治療を選択するための方法（以下、本発明の第２の方法という）に関し、該方法は、前記患者由来の試料中の酸性セラミダーゼのレベルを同定する方法を含んでなり、前記試料中の酸性セラミダーゼの発現レベルが、基準試料よりも高い場合、前記患者は、ＣｈｏＫ阻害剤またはＣｈｏＫ阻害剤および酸性セラミダーゼ阻害剤併用の治療候補者である。
【０１７７】
本発明の第２の方法の工程は、本質的に、本発明の第１の方法に記載されているとおりであり、患者由来の試料（好ましくは腫瘍試料）中の酸性セラミダーゼレベルの定量を含み、前記レベルが、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベルまたは酸性セラミダーゼ活性の何れかを前述の方法のいずれかを用いて測定することにより定量されることができる。
【０１７８】
酸性セラミダーゼのレベルを定量して基準試料と比較した場合、酸性セラミダーゼレベルが基準試料中に認められるレベルよりも高ければ、その患者は、ＣｈｏＫ阻害剤および酸性セラミダーゼ阻害剤併用治療の候補者である。
【０１７９】
一つの好ましい態様によれば、前記癌は、非小細胞肺癌である。
【０１８０】
ＣｈｏＫ阻害剤の治療効果を高める化合物の同定方法
本発明の発明者らは、ＣｈｏＫ阻害剤に高い耐性を示す腫瘍細胞が、酸性セラミダーゼレベルが高いことを確認している。したがって、所定の化合物に反応して酸性セラミダーゼが上昇するレベルを測定することにより、該化合物がＣｈｏＫ阻害剤耐性を低減できるかどうかを判定すること、言い換えればこれらの化合物の治療効果を高めることが可能となる。
【０１８１】
したがって、もう一つの態様によれば、本発明は、癌治療のためのＣｈｏＫ阻害剤の治療効果を高めることができる化合物の同定方法（以下、本発明の第３の方法という）に関し、該方法は、（ｉ）ＣｈｏＫ阻害剤に耐性を示す腫瘍細胞を候補化合物と接触させ、（ｉｉ）前記細胞中における酸性セラミダーゼのレベルを定量することを含んでなり、候補化合物による処置後に、前記細胞中の酸性セラミダーゼレベルが処置前よりも低い場合、該候補化合物は、癌治療のためのＣｈｏＫ阻害剤の治療効果を高めることができるとみなされる。
【０１８２】
本発明の第３の方法は、ＣｈｏＫ阻害剤に耐性を示す腫瘍細胞を候補化合物と接触させることからなる第１の工程を含んでなる。前記接触工程は、ＣｈｏＫ阻害剤耐性細胞によって形成された腫瘍を含む非ヒト動物において、ｉｎ ｖｉｖｏで実施されることができるか、またはＣｈｏＫ阻害剤に耐性を示す細胞の培養によりｉｎ ｖｉｔｒｏで実施されることができる。
【０１８３】
本発明の第３の方法をｉｎ ｖｉｔｒｏで実施する場合、ＣｈｏＫ阻害剤に耐性の腫瘍細胞の培養細胞が必要となる。培養細胞は、ＣｈｏＫ阻害剤耐性に基づいてあらかじめ選択されていた腫瘍細胞、ＣｈｏＫ阻害剤の濃度を高めてあらかじめ一回以上選択処理された腫瘍細胞、ＣｈｏＫの発現レベルが過剰な細胞、またはＣｈｏＫに特異的なｓｉＲＮＡを構成的に発現する細胞から採取することができる。もしもＣｈｏＫ阻害剤の濃度を高めて一回以上選択処理をして選ばれた細胞であれば、上記段落で述べたＣｈｏＫ阻害剤のいずれもこの目的に適する。
【０１８４】
ＣｈｏＫ阻害剤耐性細胞の培地が設定されると、ＣｈｏＫ阻害剤の治療効果を高める効果が測定される候補化合物に対して、培養細胞が接触させられる。本発明によれば、細胞を候補化合物と「接触させる」ことは、ＤＮＡ構築物を発現する細胞内に当該候補化合物を取り込むいずれかの可能な方法を含む。したがって、候補化合物が低分子量の分子であれば、前記分子を培地に添加すれば十分である。候補化合物が高分子量の分子（例えば、核酸またはタンパク質等の生物学的ポリマー）なら、その分子が細胞内部に接近できるような手段を提供することが必要である。候補分子が核酸の場合、従来のトランスフェクション手段を、当該分野に公知の方法（リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、ポリブレン法、電気穿孔法、顕微注射、リポソームの仲介による融合、リポフェクション、レトロウィルスによる感染および微粒子銃によるトランスフェクション）のいずれかを用いて適用することができる。候補化合物がタンパク質である場合は、細胞を該タンパク質と直接接触させてもよく、または細胞内部に存在する時には転写／翻訳を可能にする要素類に結合される、該タンパク質をコードする核酸と接触させてもよい。あるいは、その細胞を、研究対象のタンパク質のバリアントと接触させることも可能である。該バリアントは、該タンパク質の細胞内部への移動を促進できるペプチド、例えば、ＨＩＶ‐１ ＴＡＴタンパク質由来のＴａｔペプチド、キイロショウジョウバエ由来のアンテナペディアホメオドメインタンパク質の第３ヘリックス、単純ヘルペスウィルスのＶＰ２２タンパク質およびアルギニンオリゴマー等で修飾されたものである（Lindgren, A. et al, 2000, Trends Pharmacol. Sci, 21 :99-103, Schwarze, S.R. et al., 2000, Trends Pharmacol. Sci., 21 :45-48, Lundberg, M et al., 2003, MoI. Therapy 8:143-150 and Snyder, EX. and Dowdy, S.F., 2004, Pharm. Res. 21 :389-393）。
【０１８５】
アッセイ対象の化合物は、好ましくは、単離されたものではなく、天然ソース由来のまたは化合物ライブラリーの一部を構成するほぼ複合混合体の一部を構成する。本発明の方法に従ってアッセイされることのできる化合物ライブラリーは、例えば、Ｄ−アミノ酸を含んでなるペプチドおよびそのペプチド類似体または非ペプチド結合を含んでなるペプチドを含むペプチドライブラリー、ホスホチオネート型非ホスホジエステル結合の核酸またはペプチド核酸を含む核酸ライブラリー、抗体ライブラリー、炭水化物ライブラリー、低分子量化合物、好ましくは有機分子化合物ライブラリー、ペプチド模倣体等が挙げられるが、これらに限定されない。低分子量の有機化合物ライブラリーを使用する場合、該ライブラリーは、細胞内部により容易に接近可能な化合物を含むように、事前に選択されておくことができる。これらの化合物は、したがって、サイズ、親油性、新水性、水素結合形成能力等の特定パラメーターに基づいて選択されることが可能である。
【０１８６】
アッセイされる化合物は、あるいは天然ソース由来の抽出物の一部を構成していてもよい。この天然ソースは、任意の環境から採取された動植物ソース、例えば、土地、大気、海洋生物等の抽出物であってもよいが、これらに限定されない。
【０１８７】
第２の工程で、本発明の方法は、候補化合物で治療された細胞の酸性セラミダーゼレベルを定量することを含んでなる。酸性セラミダーゼレベルをの定量は、前述されたように、前述された生化学的手法のいずれかを用いて、細胞の抽出物におけるｍＲＮＡレベル、タンパク質レベルまたは酸性セラミダーゼ活性を測定することによって行うことができる。酸性セラミダーゼレベルの減少を生じさせる化合物は、ＣｈｏＫ阻害剤に対する腫瘍細胞の反応を高める候補化合物として選択されることになる。
【０１８８】
候補化合物が、ほぼ複合混合体の一部を構成する場合、本発明はさらに、一つまたは複数の工程（ｉｉｉ）を含んでなり、工程（iii）は、前記混合体を断片化して、転写促進活性に関与する混合体の化合物が単離されるまで、様々な回数で本発明の方法の工程（ｉ）、（ｉｉ）ならびに（ｉｉｉ）を反復することを含む。混合体に存在する化合物を断片化するための方法としては、クロマトグラフィー（薄層、ガス、ゲルによる分子排除、親和性クロマトグラフィー）、結晶化、蒸留、濾過、沈殿、昇華、抽出、蒸発、遠心分離、質量分析、吸着等が挙げられる。
【０１８９】
もう一つの態様によれば、本発明に係るスクリーニング法が、ＣｈｏＫ阻害剤耐性の非ヒト動物腫瘍細胞に移植することにより得られた癌の動物モデルを使用してｉｎ ｖｉｖｏで実施される。当該細胞は、前述された方法のいずれかを用いて得られる。ＣｈｏＫ阻害剤耐性細胞は、任意の種の非ヒト動物のいずれか、好ましくは哺乳類、より好ましくは霊長類（サル、ヒヒ、チンパンジー等）、齧歯類（マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター等）またはブタに移植されることができる。腫瘍細胞の移植を容易にするため、該動物は、免疫不全動物であってもよい。レシピエント生物に移植されることができる腫瘍細胞としては、循環腫瘍細胞、腫瘍幹細胞、不死化循環腫瘍細胞由来の細胞株、微小転移性腫瘍細胞、不死化微小転移性腫瘍細胞由来の細胞株、固形腫瘍からあらかじめ精製されていた不死化腫瘍細胞由来の細胞株、固形腫瘍由来の原発腫瘍細胞、固形腫瘍から切除された一片の新鮮な腫瘍、原発腫瘍細胞、臨床転移からあらかじめ精製されていた不死化細胞由来の細胞株（ＰＣ３細胞株等）およびこれらの任意の組み合わせ等がある。
【０１９０】
ＣｈｏＫ阻害剤耐性細胞によって形成された腫瘍の動物モデルが得られると、本発明の方法の第１の工程は、前記腫瘍細胞を候補化合物と接触させることを含んでなる。該接触工程は、前記候補化合物が腫瘍細胞に接近するための適切な条件下で、前記候補化合物を動物に投与することにより行われてもよい。試験化合物の投与は、いずれかの好適な経路で、例えば、経口、経皮、静脈内、点滴、筋肉内投与等によって実施されてもよい。
【０１９１】
腫瘍が候補化合物と接触すると、前記腫瘍細胞内の酸性セラミダーゼの発現レベルが、前述されたようにして、例えば、酸性セラミダーゼｍＲＮＡレベル、酸性セラミダーゼタンパク質レベルまたは酸性セラミダーゼ活性を測定することによって定量される。
【０１９２】
本発明の第３の方法は、候補化合物による治療後の腫瘍細胞内における酸性セラミダーゼレベルを、該治療前に認められたレベルと比較することを含む。ここで用いられる場合、酸性セラミダーゼは、それが少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％すなわち酸性セラミダーゼレベルが検出不可である場合、治療前よりも低いとみなされる。
【０１９３】
そこで本発明を、以下の方法および実施例により詳細に記載するが、それらの方法および実施例は、単なる例示と解釈されるべきであり、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【０１９４】
材料および方法
患者
本分析のために使用されたのは、２００１〜２００４年までの間にＮＳＣＬＣの外科切除を受け、その後マドリードのLa Paz病院のMedical Oncology divisionによりフォローアップされた、８４人の無作為に選択された患者から採取された肺癌組織の標本である。これらの患者には、アジュバント療法は行われなかった。本研究は、病院の治験審査委員会によって承認され、書面によるインフォームドコンセントが全患者から得られた。
【０１９５】
ＮＳＣＬＣ腫瘍の初代培養
ＮＳＣＬＣ患者由来の切除組織が分離され（組織分離用篩い‐組織粉砕キット ＣＤ１ ＳＩＧＭＡ）、得られた細胞が２４ウェルプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、バイオサイセンス社、米国カルフォルニア州サンホセ）に接種された。細胞は、ＤＤＰ、タキソール、ビノレルビン、ゲムシタビンの濃度を漸増して（０、０．５、１、５、１０および２０μＭ）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：ライフテクノロジーズ社、ニューヨーク州グランドアイランド）を添加したＤＭＥＭ：１２ＨＡＭ培地（Ｄ８４３７：シグマ社）で、１０日間培養された。各ウェル内の最終的に残存する集団が前述されたようなクリスタルバイオレット法により定量化された（Rodriguez- Gonzalez, A. et al, Oncogene, 22:8803-8812）。
【０１９６】
化合物
ＭＮ５８ｂが国際公開ＷＯ９８０５６４４に記載されており、１，４‐（４‐４’‐ビス‐（（４‐（ジメチルアミン）ピリジニウム‐１‐イル）メチル）ジフェニル）ブタンジブロマイドに相当する。ＲＳＭ‐９３２Ａは、米国特許出願ＵＳ２００７１８５１７０号に記載されており、１，１’‐（ビフェニル‐４，４’‐ジルメチレン）ビス［４‐（４‐クロロ‐Ｎ‐メチルアニリノ‐）キノリニウム］ジブロマイドに相当する。ＮＯＥは、Sugita et al (Biochim.Biphys.Acta, 1975, 398:125-131)による記載があり、Ｎ‐オレオイルエタノールアミン（ＮＯＥ）に相当する。Ｄ‐ＮＭＡＰＰＤは、３‐エトキシ‐１‐（２‐メチルアミノエチル）‐３‐フェニル‐インドール‐２‐オン（ＣＡＳ ３５９２２‐０６‐６）に相当し、Raisova, M., et al. (FEBS Lett., 2002, 516:47-52) およびSelzner, M. et al. (Cancer Res., 2001, 61 :1233-1240)により記載されている。ＴＲＡＩＬは前述されており、ヒトＴＲＡＩＬ（アミノ酸９５‐２８１）細胞外ドメインに相当する。
【０１９７】
ＲＮＡの単離および遺伝子発現解析
選択された生検のＲＮＡが、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社、ドイツ、ヒルデン）を用いて、製品の指示に従って、マイクロアレイおよびＱＴ‐ＰＣＲのために単離された。試料が調製され、アフィメトリクスジーンチップ発現解析（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）技術マニュアルに従って、マイクロアレイのハイブリダイゼーションが行われた。Affymetrix U133plus2遺伝子チップとのハイブリダイゼーション（４７，０００個の転写物を表す５４，６１４個のプローブセット）、染色、洗浄およびスキャニングの工程が、国立バイオテクノロジーセンター（スペイン、マドリード）のゲノム施設で実施された。これは、www.affymetrix.com (アフィメトリクス社、カルフォルニア州サンタクララ)に掲載されている。シグナルＬｏｇ比（Ｓｉｇｎａｌ Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ）で、転写物の大きさおよび変化の方向が評価される。使用されたＬｏｇスケールは、２を底とする。したがって、１．０のシグナルＬｏｇ比は、転写レベルの増加が２倍であることを示し、−１．０は、２倍の減少を示す。シグナルＬｏｇ比が０であれば、変化が無いことを示す。
【０１９８】
遺伝子は、インジェヌイティー・パスウェイソフト（ＩＰＡ，インジェヌイティーシステムズ社、www.ingenuity.com）を用いて、生物学的プロセスに従って分類された。耐性と感受性の間で差別的に調節された遺伝子は、インジェヌイティー・パスウェイノーリッジベース（Ingenuity Pathways Knowledge Base）に含まれる情報から発展した世界的分子ネットワークに載せられる。そして、特異的に発現する遺伝子のネットワークは、それらの相関性に基づいてアルゴリズムにより生み出され、最終的に創造されたネットワークが、遺伝子間の分子関係を図解的に表示する。描かれた全ての接続関係は、出版された参考文献、書籍またはIngenuity Pathways Knowledge Baseに保存されている正規の情報で裏付けされている（Sorensen G, BMC Genomics, 2008, 9:114; Kim SY et al, Stat. Methods Med. Res., 2006, 15:3-20）。
【０１９９】
定量的リアルタイムＰＣＲによるマイクロアレイ解析の検証
ＲＮＡ１μｇを使い、高性能ｃＤＮＡアーカイブキット（High-Capacity cDNA Archive Kit：アプライド・バイオシステムズ社）を用いてｃＤＮＡを生成し、定量的リアルタイムＰＣＲを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ 配列検出システム（アプライド・バイオシステムズ社）を用いて３点測定で実施した。ＧＡＰＤＨおよび１８ＳリボソームｍＲＮＡを、内部対照として増幅した。増幅用のプローブとしては、アプライド・バイオシステムズ社製のTaqman Gene Expression Assaysのプローブ（ASAHl : HS00602774 M1 Taqman Probe, ASAH2: HS00184096 M1 Taqman Probe and ASAH3: HS00370322 M1 Taqman Probe, DUT: HS00798995 S1 Taqman Probe, TYMS: HS00426591 M1 Taqman Probe, UPPl : HS00427695 M1 Taqman Probe, RRM2: HS00357247 G1 Taqman Probe）を使用した。各遺伝子の相対的発現の計算には、２‐ΔΔＣｔ法を使用した（Livak KJ., Methods. 2001; 25:402-8）。
【０２００】
細胞培養およびＣｈｏＫ阻害剤耐性細胞株の生成
本研究で使用される全細胞株を、温度（３７℃）、湿度（９５％）および二酸化炭素（５％）の標準条件下で維持した。ヒト初代気管支上皮細胞ＮＨＢＥ（ＢＥＣ）（ＣＣ‐２５４１、カンブレックス社）を、ＢＥＧＭ（気管支上皮細胞増殖培地）ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（ＣＣ‐３１７０、カンブレックス社）で増殖させた。ヒト初代乳房上皮細胞ＨＭＥＣ（ＣＣ−２５５１、クロネティクス社）を、ブレットキット添加のＭＥＭＢ培地で増殖させた。上皮非小細胞肺癌細胞株Ｈ４６０ならびにＨ１２９９、および小細胞肺癌細胞株Ｈ５１０ならびにＨ８２を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：ライフテクノロジーズ社、ニューヨーク州グランドアイランド）を添加したＲＰＭＩで維持した。
【０２０１】
ＭＮ５８ｂおよびＲＳＭ‐９３２Ａに対して耐性の細胞株（ＭＮ５８ＲおよびＲＳＭ‐９３２Ａ‐Ｒとして同定）を、各薬剤の濃度を漸増しつつ長時間持続的曝露により生成した。該細胞株の平行対照（Ｈ４６０細胞株）を、該化合物の非存在下で同じ時間培養した。
【０２０２】
細胞増殖アッセイ
細胞を、６０００個／ウェルの密度で９６ウェルプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ，バイオサイエンス社、米国カルフォルニア州サンホセ）に接種し、２４時間標準条件下でインキュベートした。次に、異なる濃度のＣｈｏＫ阻害剤（各濃度４つずつ）で細胞を処理し、７２時間維持した。各ウェル内に残っている細胞数の定量化を、ＭＴＴ（３‐（４，５‐ジメチルチアゾール‐２‐イル）‐２，５‐ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）法により行った。５９５ｎｍの吸光度を、VersaMaxマイクロプレートリーダー (モレキュラーデバイス社, 米国カルフォルニア州サニーベイル)で測定する。酸性セラミダーゼ阻害剤への感作のために、ＮＯＥに相当するＩＣ５０で、細胞を４時間前処理した後、ＣｈｏＫ阻害剤で処理した。ＮＯＥ（Ｎ‐オレオイルエタノールアミン）は、カルバイオケム社製（米国カルフォルニア州ラホラ）を使用した。
【０２０３】
異種移植およびｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍増殖阻害アッセイ
指定細胞を、接種（１０６細胞／０．１モル）直前にＤＭＥＭで再懸濁し、免疫抑制マウス（ｎｕ／ｎｕ）に皮下注射した。スペイン政府ガイドラインに従い、標準的ラボ条件下に置いた。腫瘍が平均体積０．１ｃｍ^３に達した時、マウスを対照群と治療群に無作為化した。抗腫瘍剤（および対照群にはビークル）による治療を以下の指定スケジュールで実施した（腹腔内投与）。腫瘍は、週３回、直径の大（Ｄ）・小（ｄ）を測定してモニターし、腫瘍体積は、Ｖ＝（Ｄ^＊ｄ^２）／２で算出した。腫瘍の成長における有意な変化の統計解析を、ＳＰＳＳソフトｖ．１３．０を使用して算定した。
【０２０４】
アネキシンＶを使用したアポトーシス検出
アポスクリーン・アネキシンＶ・アポトーシスキット(Ａｐｏｓｃｒｅｅｎ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｋｉｔ) （サザンバイオテク社）を用いて製造者の手順に従い、フローサイトメトリーにより、細胞死の解析を行った。細胞は、４×１０５個／ウェルとなるように６ウェルプレートに接種した。２４時間後、指定の化合物で処理した。冷やしたＰＢＳで細胞を２回洗って、ＰＢＳを除去後、１×１０６〜１×１０７個／ｍＬの濃度になるように、冷やしたＩＸ結合バッファーで再懸濁した。これらの細胞の１００μｌをフローサイトメトリー用の試験管に集め、アネキシンＶを１０μｌ加えた。ボルテックスで静かに混和し、氷で１５分間インキュベートし、遮光した。洗浄しないで、各試料にＩＸ結合バッファー３８０μｌを加え、次にプロピジウムイオジン１０μｌを加え、速やかにフローサイトメリーにより細胞解析を行った。
【０２０５】
ＦＡＣＳによる細胞周期解析
７０％エタノールで固定してプロピジウムイオダイド４μｇ／ｍＬで染色した細胞（ＩＸ１０６）の細胞周期解析を、Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣｓ ＳＣＡＮを用いて実施した。サイトメトリーのデータは、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ解析プログラム（ベクトンデッキンソン社）およびＦｌｏｗＪｏソフトを使用して解析した。
【０２０６】
細胞内セラミダーゼレベルの定量
細胞を、６ウェルプレートに１×１０５個／ウェルとなるように接種し、２日間［１４Ｃ］‐セリンで脂質を標識した。２４時間標識培地は交換せずに、細胞を培養した。次に、脂質を抽出して、事前に記載されたプロトコールを用いてＴＬＣにより解析した（van Echten-Deckert, G. (2000) Sphingo lipid extraction and analysis by thin-layer chromatography. Methods Enzymol, 312, 64-79）。脂質抽出に先だって、細胞は−２０℃で保たれた。メタノールで細胞をハーベストして脂質を、最終比６０：３０：６（ｖ／ｖ／ｖ）のクロロホルム‐メタノール‐水で抽出した。有機相をコンセントレーター内でＮ２フロー下３７℃で乾燥させた。試料をクロロホルム‐メタノール（１：１ｖ／ｖ）で再懸濁してＴＬＣプレートに塗布した。クロロホルム‐メタノール‐２Ｍアンモニウム（６０：４５：４、ｖ／ｖ／ｖ）の溶媒混合液を用いて脂質を分離させ、インスタントイメージャー（ｉｎｓｔａｎｔ ｉｍａｇｅｒ）により定量化を行った（Pakard, Meriden, CT, USA）。
【０２０７】
ＬＳ‐ＭＳセラミドおよびジヒドロセラミド解析
細胞を、ｐ１００プレート１枚につき８×１０５個の密度で接種し、２４時間後、指定の化合物で処理した。次いで、ＰＢＳ洗浄を行い、短時間トリプシン処理して採取し、細胞のアリコットを取り出してタンパク質の測定を行った。内部標準物質（Ｎ−ドデカノイルスフィンゴシン、Ｎ‐ドデカノイルグルコシルスフィンゴシンおよびＮ‐ドデカノイル スフィンゴシルホスホリルコリンを各０．５モル）で強化されたスフィンゴ脂質抽出物を調製して解析した。液体クロマトグラフィー質量分析装置は、ウォーターズ社直交加速型飛行時間質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ ＬＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）に接続されたウォーターズ社Ａｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステム（ウォーターズ社：マサチューセッツ州ミルフォード）からなり、ポジティブ電子噴霧イオン化モードで作動させた。５０〜１５００Ｄａの完全スキャンスペクトラムが得られ、個々のスペクトルを合計してデータポイント各０．２ｓが生成された。質量精度と再現性が、ロックスプレー・インターフィアランス（ＬｏｃｋＳｐｒａｙ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を介する独立した標準噴霧を用いて維持された。解析カラムは、Ａｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨＣ８カラム：１００ｍｍ×２．１ｍｍｉ．ｄ；１．７μｍ（ウォーターズ社）を使用した。二つの移動相は、移動相Ａ：ｍｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ／ＨＣＯＯＨ（７４：２５：１；ｖ／ｖ／ｖ）および移動相Ｂ：ｍｅＯＨ／ＨＣＯＯＨ（９９／１；ｖ／ｖ）で、両者とも５ｍＭのギ酸アンモニウムを含んでいた。勾配が計画された―０．０分、８０％Ｂ；３分、９０％Ｂ；６分、９０％Ｂ；１５分、９９％Ｂ；１８分、９９％Ｂ；２０分、８０％Ｂ．フロー速度は、０．３ｍＬ ｍｉｎ^−１であった。カラムは３０℃で保たれた。５０ｍＤａウィンドウを使用し、各化合物の抽出イオンクロマトグラムを用いて定量化を行った。直線ダイナミックレンジが、標準混合物を注入することにより決定された。化合物のポジティブ同定は、正確な質量測定に基づいていた（エラー＜５ｐｐｍおよびＬＣ保持時間±２％：標準との比較）。
【０２０８】
ウェスタンブロッティング法によるタンパク質発現の定量
等量の細胞溶解産物（３０μｇ）のウェスタンブロット解析を、各相当の抗体を用いて行った。タンパク質を電気泳動で分離して、１０％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルに付着させ、ニトロセルロースにトランスフェクトした。ブロットを、Ｔ‐ＴＢＳ中の５％無脂肪ドライミルクで２時間ブロックした。ＡＳＡＨ１の同定は、ＢＤトランスダクション・ラボラトリーズ社（Ｒｅｆ：６１２３０１２）から入手したモノクローナル抗体（１：２５０）を使用して実施した。ローディングコントロールとして、α‐チューブリン（Ｔ９０２６、シグマ社）を使用してブロットのアッセイを行った。カスパーゼ‐３およびＰＡＲＰの同定には、抗カスパーゼ‐３および抗‐ＰＡＲＰ抗体（サンタクルーズバイオテクノロジー社、カルフォルニア州サンタクルーズ）を使用した。
【０２０９】
組み合わせ指数を用いたアッセイ
上述された細胞増殖ＭＴＴアッセイを使用して、ＣｈｏＫ阻害剤との併用におけるシスプラチンの評価を行った。一晩インキュベートした細胞に、様々に異なる濃度のシスプラチンを添加し、３時間インキュベートした。濃度を漸増しながら、ＣｈｏＫ阻害剤を４時間添加した後、新鮮な培地でさらに２４時間培養した。相乗作用、加成性または拮抗作用の点で、コンビネーションアッセイの結果を、チョウ・タラレイ（Chou Talalay）の組み合わせ指数アイソボログラム法 (Chou TC. et al, Trends Pharmacol Sci, 1983, 4:450-4)を用いて解析した。ＣＩの範囲は、既に記載されている値で設定される(Chou TC. et al., supra.)。組み合わせ指数（ＣＩ）＜１は、２剤間の相乗的相互作用を表す。付加的相互作用は、ＣＩ＝１で表され、ＣＩ＞１は両剤間の拮抗作用を表す。協調効果は、相互作用ＣＩ＜１．０としてみなされる。全ての試験は４通り行った。
【０２１０】
統計学的分析
事象率の相関関係を、ピアソンのカイ二乗統計を用いて測定した。報告された全Ｐ値は両側Ｐ値であった。統計学的有意性は、Ｐ＜０．０５として定義された。統計学的分析は、ＳＰＳＳソフトバージョン１３．０（社、イリノイ州シカゴ）を使用して行った。
【０２１１】
実施例１
ＮＳＣＬＣ患者におけるＭＮ５８ｂのＣｈｏＫ阻害に対する本質的薬剤耐性
ＭＮ５８ｂによるＣｈｏＫの特異的阻害に対する薬剤耐性の推定される機序を同定するために、我々は、マドリード（スペイン）Ｌａ Ｐａｚ病院の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者８４人の臨床前研究を実施した。その目的のため、それらの患者の切除腫瘍由来の初代培養を確立して１０日間培養した。細胞は、ＣｈｏＫ特異的阻害剤ＭＮ５８ｂの濃度を２０μＭまで漸増しながら処理された。一つの濃度が、ヒト肺腫瘍から生成された幾つかの腫瘍由来細胞株における７〜５０回のＩＣ５０を表す（表６参照）。図１に示されるように、本治療に対して様々な反応が認められた。一つは、一連の３９個の試料（４６．４％）が、ＭＮ５８ｂに対して完全に耐性であったが、これは１０日目に、薬剤の最大濃度で、ほぼ１００％の細胞が生存していたためである。その一方、その他の４５個の腫瘍（５３．６％）は、ＭＮ５８ｂの抗増殖作用に感受性を示した。中でも、１５個の試料群は、１０日目に該薬剤が低濃度であった場合でも、細胞の生存率はゼロであったため、ＭＮ５８ｂに対して高い感受性があるとみなされた（３３．３％）。最終的に、３０個の試料群（６６．７％）が、ＭＮ５８ｂに部分的に感受性があると認められ、約５０％の細胞が治療終了時に生存していた。
【０２１２】
また、これらの患者の腫瘍の初代培養細胞も、ＮＳＣＬＣに用いられる従来の治療法で処理された（Belani CP, Lung Cancer. 2005, 50 Suppl 2: S3-8)。したがって、細胞生存率に関して、当該患者の６２個の試料がシスプラチンで、同じ６２個の試料がタキソールで処理され、これらの試料の５２個はゲムシタビンでも処理され、また、３９個がビノレルビンで処理された。表３で示されるように、ＭＮ５８ｂは、こうした条件下で最も有効な抗癌剤であることがわかった。これは、５５．５％が同剤に感受性を示したためであり、次いでシスプラチンが、５０％の腫瘍反応性を示した。
【０２１３】
【表３】

【０２１４】
さらに、異なる薬剤間における耐性の相関関係を統計学的に分析した。シスプラチン耐性は、タキソール、ビノレルビンおよびゲムシタビンに対する耐性と有意な関連があった。同様の結果は、タキソール耐性の分析でも認められた。また、ビノレルビン耐性は、シスプラチンおよびタキソールへの耐性と関連があり、ゲムシタビン耐性は、タキソール耐性と関連していた。しかし、他のどの化学療法剤への耐性とも反応関連性が見られなかった唯一の薬剤は、ＭＮ５８ｂであった（表４）。
【０２１５】
【表４】

【０２１６】
以上の結果により、これらの抗腫瘍治療薬のいずれにも反応しないＮＳＣＬＣ患者は、ＣｈｏＫ阻害に基づく治療に対しては効率よく反応する可能性があることが示唆されている。これは、ＭＮ５８ｂの耐性メカニズムが、他の４つの試験薬のそれとは異なるためである。その一方で、これらの結果はまた、ＣｈｏＫ阻害に対する特定の化学療法耐性系が存在することも示唆している。
【０２１７】
実施例２
ＮＳＣＬＣにおけるＣｈｏＫ阻害への薬剤耐性メカニズムの同定
感受性を示した患者由来の、ＣｈｏＫ阻害剤に本質的に耐性を示す腫瘍の遺伝的相違を調査するため、我々は、代表的なＮＳＣＬＣ患者由来の腫瘍の転写的特徴を分析した。アフィメトリックスジーンチップ：ヒトゲノムＨＧ‐Ｕ１３３およびマイクロアレイ２個を使用して、ＭＮ５８ｂ耐性を示す腫瘍の患者５人の一群と、同剤に高感受性を示す腫瘍の患者５人からなる別の一群とを比較した。このマイクロアレイプラットフォームは、４７，０００個の転写物を表す５４，６１４個のプローブセットを含む。−２＜倍率変化＞２（−１＜シグナル比＞１）の観点では、９１２個の適格な転写物が、反応性試料との比較で、耐性のある腫瘍試料において有意な差別的調節を示した。差別的に発現した遺伝子の生物学的有意性を解釈するため、インジェヌイティー・パスウェイ解析（ＩＰＡ：インジェヌイティーシステムズ社）を用いて遺伝子オントロジー解析を行った（Sorensen G., BMC Genomics. 2008, 9:114）。
【０２１８】
調節が認められた遺伝子間の相互作用をさらに調べたところ、該ソフトによる解析でスコアが２０を超えた反応性試料において、差別的に調節された３２個のネットワークが見出された。これは、入力データセットおよび遺伝子間の適切な相関性におけるこれらの遺伝子の関連性を示している。上位の経路は、これらのネットワークに関与する遺伝子の主要機能が、細胞周期、細胞死、癌、免疫反応、脂質代謝および薬剤代謝に関連することを示している。
【０２１９】
マイクロアレイの多数の転写物によるフォールスポジティブの出現率回避のために、我々は、「Ｂ」として知られる第２の統計学的解析を使用した。これによって、試験全体の中で差別的発現が統計学的に有意である遺伝子をさらにフィルタリングすることができる(Kim SY., Stat Methods Med Res., 2006, 15:3-20)。この試験では、ヒト試料を使用したため、本解析が非常に限定的なものとなり、（Ｂ＞０）の評価を満たしているのは５０個の遺伝子である。１８個の遺伝子は、両解析（２倍の差別発現およびＢ＞０）で一致しており、そのうちの４個は試料において過剰発現し、ＭＮ５８ｂ耐性であるとみなされ、１４個は下方調節された。これらの遺伝子の中で、酸性セラミダーゼ（ＡＳＡＨ１）は、この二つの解析後、耐性試料において有意に上方調節された。
【０２２０】
実施例３
ＭＮ５８ｂ耐性腫瘍のＮＳＣＬＣ細胞株における酸性セラミダーゼ発現
上述のように、脂質代謝に関与する酵素の酸性セラミダーゼ（ＡＳＡＨ１）は、ＭＮ５８ｂ耐性の腫瘍においては、いずれの選択基準によっても有意に過剰発現することが分かった。
【０２２１】
ＮＳＣＬＣのＭＮ５８ｂ耐性細胞株における様々なセラミダーゼの挙動について、マイクロアレイにより詳細に調べた。表５に示されているように、ＭＮ５８ｂ耐性のＮＳＣＬＣ腫瘍で調節されるセラミダーゼは、酸性セラミダーゼのみである。また、Ｂ統計に準じた有意な方法においてではないが、酸性セラミダーゼ様酵素と呼ばれる同定された酵素であり、酸性セラミダーゼと同じ局在化および機能を有すると思われる酵素も、耐性試料において上方調節される（表５）。
【０２２２】
【表５】

【０２２３】
マイクロアレイ解析で認められた変化が、ＡＳＡＨ１の実際の変化に相当することを証明するため、この遺伝子に対する特異的ｔａｑｍａｎプローブを使用して、定量的リアルタイムＰＣＲを実施し（Applied Biosystems assay Hs00602774_ml）、ネガティブ対照としての中性およびアルカリセラミダーゼ（Applied Biosystems assay Hs00602774_ml）についても同様のプローブを使用した。この目的のため、マイクロアレイ解析用に、耐性および反応性両方の腫瘍試料を５個を使用すると共に、各ケースにおいて新たな一群として付加した５個の患者試料も本解析に使用した。リアルタイムＰＣＲにより、ＡＳＡＨ１は、ＡＳＡＨ２およびＡＳＡＨ３と異なり、耐性腫瘍で差別的に発現されることが明らかになり、マイクロアレイ解析の結果（図２）を裏付けている。これらの結果は、酸性セラミダーゼが、ＣｈｏＫ阻害耐性の腫瘍患者において特異的に上方調節されること、かつＣｈｏＫ阻害耐性のメカニズムに対する提示モデルの基準であることを証明するものである（図３）。したがって、特異的阻害剤（ＣｈｏＫＩ）によるＣｈｏＫ活性の阻害は、ＰＣｈｏのレベルの減少を誘導する。その結果、ＰＣｈｏ生成の代替経路が活性化され、スフィンゴミエリナーゼ（ＳＭｌａｓｅ）活性が上昇することになる。この酵素は、ＰＣｈｏおよびセラミドの両方を生成する。この後者の代謝物質は、細胞死の強力な誘発因子である。セラミドのｅ．スフィンゴシンへの変換に関与する酵素の活性が上昇すれば、ＣｈｏＫＩ活性に対する耐性が生じる可能性がある。この酵素が酸性セラミダーゼ（ＡＳＡＨ１）である（図３）。
【０２２４】
実施例４
酸性セラミダーゼの阻害により、ＣｈｏＫ阻害剤に対してＮＳＣＬＣ細胞を感作する
最初に、一連のヒト肺腫瘍細胞株（ＮＳＣＬＣ細胞株としてＨ４６０ならびにＨ１２９９およびＳＣＬＣ細胞株としてＨ５１０ならびにＨ８２）におけるＡＳＡＨ１のレベルを調べた。図４に示されるように、ＳＣＬＣ由来細胞株は、老衰対照ＢＥＣ細胞と類似する酸性セラミダーゼレベルを示し、ＮＳＣＬＣでのレベルよりもかなり低いレベルとなった。興味深いことに、これらのＳＣＬＣ細胞株はまた、コリンキナーゼαが高レベルとなり、ＮＳＣＬＣ細胞よりもＣｈｏＫ阻害に対する感受性が非常に高いことを示した（表６）。これにより、低レベルの酸性セラミダーゼは、ＣｈｏＫ阻害剤に対するＳＣＬＣ細胞の非常に高い反応性を少なくとも部分的に示している可能性のあることが示唆されている。
【０２２５】
【表６】

【０２２６】
したがって、酸性セラミダーゼレベルを阻害することにより、ＣｈｏＫ阻害剤がこれらの細胞により有効に作用する可能性がある。この仮説を立証するため、我々は、あらかじめ特徴付けた酸性セラミダーゼ阻害剤のＮ‐オレオイルエタノールアミン（ＮＯＥ）を使用して（Grijalvo S., Chem Phys Lipids. 2006; 144:69-84）、酸性セラミダーゼの阻害によるＣｈｏＫ阻害剤への腫瘍細胞株の感作について調査した。この目的のため、Ｈ４６０は、酸性セラミダーゼ阻害のためにＮＯＥで３時間前処理された。次いで、ＣｈｏＫα阻害剤ＭＮ５８ｂおよびＲＳＭ‐９３２Ａの濃度を漸増させながら細胞を処理し、全細胞集団の５０％が影響された濃度（ＩＣ５０）を同定した。表７に示されるように、酸性セラミダーゼ阻害剤ＮＯＥでＨ４６０細胞を前処理したことにより、ＣｈｏＫα阻害に対して細胞が感作された。これらの結果は、酸性セラミダーゼレベルの上昇が、ＣｈｏＫ阻害に対する薬剤耐性のメカニズムを与える可能性があるという我々の仮説と整合している。
【０２２７】
【表７】

【０２２８】
これらの結果を証明する目的で、我々は、別の公知の酸性セラミダーゼ阻害剤ＣＡＹ１０４６６（ＣＡＹ）（Ｄ‐ＮＭＡＰＰＤ（１Ｒ，２Ｒ）‐Ｂ１３；１０００６３０５：ケイマンケミカル社）（表２の項目ＩＩＩ）およびネガティブ対照としてアルカリ性セラミダーゼ阻害剤Ｄ‐エリスロ‐ＭＡＰＰ（ＤＭＰ）（１０１６５：ケイマンケミカル社）を使用してさらに試験を行った。セラミダーゼを阻害するため、これらの化合物でＨ４６０細胞を３時間前処理した。次に、ＣｈｏＫα阻害剤ＭＮ５８ｂおよびＲＳＭ‐９３２Ａの濃度を漸増させながら細胞を処理し、全細胞集団の５０％が影響された濃度（ＩＣ５０）を同定した。表８に示されるように、Ｄ‐エリスロ‐ＭＡＰＰではなく酸性セラミダーゼ阻害剤Ｄ‐ＮＭＡＰＰＤでＨ４６０細胞を前処理したことにより、ＣｈｏＫα阻害に対して細胞が感作された。これらの結果は、酸性セラミダーゼレベルの上昇が、ＣｈｏＫ阻害に対する薬剤耐性のメカニズムを与える可能性があるという我々の仮説と整合している。その上、ＣｈｏＫ阻害剤および酸性セラミダーゼ阻害剤の併用によって、さらにいっそう強力な抗癌活性が与えられる。
【０２２９】
【表８】

【０２３０】
実施例５
ＣｈｏＫ阻害剤耐性ＮＳＬＣ細胞の生成
ＣｈｏＫ阻害に対する耐性の根底にあるメカニズムおよびこの阻害効果における酸性セラミダーゼの意味するものをさらに調査するため、我々は、ヒトＮＳＣＬＣ由来Ｈ４６０細胞株を使用して一連のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を行った。この細胞株を９ヶ月間、ＭＮ５８ｂおよび第２世代ＣｈｏＫα阻害剤ＲＳＭ‐９３２Ａの投与サイクルを徐々に増やしながら培養状態で維持して、これらのＣｈｏＫα阻害剤への耐性を獲得した新規細胞株を樹立した。対照細胞株（Ｈ４６０細胞株）も、Ｈ４６０の培養を維持しつつ、処理無しで同時に樹立された。したがって、ＭＮ５８ｂ耐性の樹立細胞株（Ｈ４６０ ＭＮ５８Ｒ）およびＲＳＭ‐９３２Ａ耐性の樹立細胞株（Ｈ４６０ ＲＳＭ‐９３２Ａ‐Ｒ）は、正常細胞株Ｈ４６０または対照細胞株Ｈ４６０が劇的に影響された濃度で影響を受けなかった。結果的に、これらのＭＮ５８ｂおよびＲＳＭ‐９３２Ａ耐性細胞株における細胞増殖の５０％を阻害するための必要濃度（ＩＣ５０）は、対照群細胞に認められた濃度よりも有意に高くなっている（表９）。その上、両ＣｈｏＫ阻害剤間での強力な交差耐性が認められた。これは、これら２種類の抗腫瘍剤の作用機序が類似しているために起こりうると思われていた（表９）。
【０２３１】
【表９】

【０２３２】
ＣｈｏＫα阻害剤に反応して細胞死することがないのは、酸性セラミダーゼレベルが高いためであるのかを試験する目的で、ＱＴ‐ＰＣＲおよびウェスタンブロット解析の両方を実施し、こうした細胞の酸性セラミダーゼレベルを測定した。以前の結果と一致して、対照細胞株Ｈ４６０と比較して、ＣｈｏＫα阻害耐性細胞では、遺伝子発現およびタンパク質レベルとも過剰に発現した（図５）。
【０２３３】
実施例６
ＣｈｏＫα阻害剤およびシスプラチン間の非交差耐性
前述されているように、ＮＳＣＬＣ患者由来腫瘍の初代培養で実施された、種々の化学療法剤に反応する遺伝子の相関関係の統計学的解析によって、ＭＮ５８ｂ耐性は、試験された抗腫瘍剤の他のいずれに対する耐性とも関連がないことが分かった（表４）。患者の試料から得られたデータを検証するため、また、ＣｈｏＫ阻害剤耐性のメカニズムがＮＳＣＬＣ治療に使用される従来の他の抗腫瘍剤への耐性と無関係であることを証明するために、ＣｈｏＫ阻害耐性の樹立細胞におけるシスプラチンの抗増殖効果を分析した。表１０に示すように、Ｈ４６０ ＭＮ５８ＲおよびＨ４６０ ＲＳＭ‐９３２Ａ‐Ｒは、親細胞Ｈ４６０よりもシスプラチンの抗増殖効果に対してよりいっそう高い感受性を示した。これらの結果は、ＣｈｏＫ阻害耐性の獲得が、酸性セラミダーゼの過剰発現に関連する可能性のある特異的メカニズムを介して引き起こされ、シスプラチン等他の抗腫瘍剤の作用のメカニズムを妨げるものではないことを示唆する。
【０２３４】
【表１０】

【０２３５】
実施例７
ＮＳＣＬＣにおけるシスプラチンおよびＣｈｏＫ阻害剤併用療法の有効性
上記で示した結果は、ＣｈｏＫ阻害剤が、シスプラチンに不応のＮＳＣＬＣ患者に抗腫瘍剤として使用可能であること、またその逆も可能であることを示唆している。そこで、ＣｈｏＫ阻害剤およびシスプラチンによる従来の白金系療法との併用治療がいかに強力的効果があるかを分析した。細胞生存率に対するシスプラチンとＣｈｏＫ阻害剤ＭＮ５８ｂおよびＲＳＭ‐９３２Ａとの併用による効果を、ＭＴＴアッセイを用いて、ＮＳＣＬＣ由来細胞株Ｈ４６０で評価した。連続投与では、シスプラチンを３時間投与して、その後にＣｈｏＫ阻害剤を４０時間投与した。その結果を、チョウ・タラレイ（Chou Talalay）の組み合わせ指数アイソボログラム法(Chou TC. et al., supra.)を用いて解析した。図６に示されているように、強力な相乗的（ＣＩｓ＜０．５）成長阻害が、Ｈ４６０細胞におけるシスプラチンとＣｈｏＫ阻害剤ＭＮ５８ｂまたはＲＳＭ‐９３２Ａの両剤間に認められ（それぞれＣＩ＝０．１およびＣＩ＝０．４）、これら２剤の併用が、ＮＳＣＬＣ腫瘍成長抑制に有意な利点となり得ることが分かる。
【０２３６】
これら２剤の併用が、ＮＳＣＬＣ腫瘍成長抑制に有意な利点となる可能性を検証するために、ＮＳＣＬＣ異種移植を使用したｉｎ ｖｉｖｏ試験を行った。ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験の知見に準じて、連続治療をｉｎ ｖｉｖｏで実施し、シスプラチンを第１週の間（週２回）投与し、次いでＣｈｏＫ阻害剤治療を２週間（週３回）行った。また、３週間ＭＮ５８ｂとシスプラチンの平行投与の１群を加えた。図７に示すように、Ｈ４６０異種移植において、シスプラチンとＣｈｏＫ阻害剤ＭＮ５８ｂ（図７Ａ）またはＲＳＭ−９３２Ａ（図７Ｂ）との間に強力な相乗的成長阻害が認められ、毒性の上昇も見られなかった（図７Ｃ）。したがって、これらの２剤の併用が、ＮＳＣＬＣの管理に有意な利点になり得ることが分かる。
【０２３７】
考慮すべき重要なことは、併用スケジュールで得られた抗腫瘍活性と同様の活性率を、シスプラチン単独で得るためには、シスプラチンの濃度を４倍にしなくてはならず、体重減少等毒性の臨床兆候が認められることである（図７Ｄ）。したがって、シスプラチンおよびＣｈｏＫ阻害剤の連続的併用療法は、強力な抗腫瘍効果をもたらしつつ、濃度が２倍減少した化学療法剤と同程度のわずかなレベルまで毒性を低減する。
【０２３８】
実施例８
コリンキナーゼ阻害剤とＴＲＡＩＬの協調が、大腸癌由来細胞株における細胞死を誘導する。
ＲＳＭ‐９３２ＡおよびＴＲＡＩＬの抗腫瘍活性が、類似のまたは別個の作用メカニズムの結果として生じるのかを調査するために、腫瘍細胞の細胞毒性におけるコリンキナーゼ阻害剤（ＣｈｏＫＩ）およびＴＲＡＩＬの併用による強調効果を試験した。その目的のために、５種類の大腸癌由来細胞株：ＤＬＤ‐１、ＨＴ‐２９、ＨＣＴ‐１１６、ＳＷ６２０およびＳＷ４８０を使用した。
【０２３９】
この目的のため、処理の２４時間前に、９６マルチウェルプレートに１×１０４個／ウェルの密度で細胞を接種した。細胞は、様々な濃度のＲＳＭ‐９３２Ａ（ＣｈｏＫＩ）またはＴＲＡＩＬを様々な回数で添加して処理し、ＭＴＴ［３‐（４，５‐ジメチルチアゾール‐２‐イル）‐２，５‐ジフェニルテトラゾリウムブロマイド］比色分析法を用いて細胞増殖を定量した。
【０２４０】
その結果によれば、ＣｈｏＫＩに対する感受性は、分析した全細胞株で非常に類似していた（図８Ａ）。しかし、ＴＲＡＩＬに対する感受性も、ＳＷ６２０を除く全細胞株で非常に類似していたが、ＳＷ６２０は、ＴＲＡＩＬ治療にほぼ耐性を示す（図８Ｂ）。次に、効率的なコリンキナーゼ阻害に十分な２時間のＣｈｏＫＩによる前処理を同じ細胞に行った後、さらに２４時間、ＴＲＡＩＬで処理した。ＤＬＤ‐１細胞に、ＣｈｏＫＩまたはＴＲＡＩＬの単独処理を実施したところ、細胞毒性は、それぞれ５３％と１２％となり、認められる細胞死の割合として同定された。両剤併用の場合には、細胞毒性は上昇して、７５％の細胞死となった（図９Ａ）。Ｈ‐２９細胞では、ＣｈｏＫＩおよびＴＲＡＩＬによる誘導性細胞毒性は、それぞれ４８％と１８％となった一方、併用での細胞毒性は、８１％まで上昇した（図９Ｂ）。ＴＲＡＩＬ耐性のＳＷ６２０細胞では、ＣｈｏＫＩ細胞毒性は９％であったが、併用での細胞毒性は４１％まで上昇した（図９Ｃ）。この結果は、ウェスタンブロット解析により確認されたが、それは、ＴＲＡＩＬおよびコリンキナーゼ阻害剤の併用時に、ＰＡＲＰ分解の増加またはカスパーゼ‐３活性も見られたためである（図９Ｄ）。
【０２４１】
この実施例でＣｈｏＫＩとして設計されたＲＳＭ−９３２ＡおよびＴＲＡＩＬの協調の結果を、チョウ・タラレイ（Chou Talalay）の組み合わせ指数アイソボログラム法(Chou TC. et al., supra.)を用いて解析した。図１０に示すように、強力な相乗的（ＣＩｓ＜０．５）成長阻害が、これらの化合物間に認められ（ＤＬＤ‐１のＣＩ＝０．１９、ＨＴ‐２９のＣＩ＝０．４およびＳＷ６２０のＣＩ＝０．０８５）、これら２剤の併用が、大腸腫瘍成長抑制に有意な利点となり得ることが分かる。
【０２４２】
上記の結果を検証するために、ＣｈｏＫ阻害剤ＭＮ５８ｂをＤＬＤ‐１およびＳＷ６２０細胞に使用して、同様の結果を得た（それぞれＣＩ＝０．１０およびＣＩ＝１．１５）（図１０）。
【０２４３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで認められた相乗作用の解析も行った。この解析では、アポトーシスならびに壊死または後期アポトーシスを区別するため、アネキシンＶおよびＩＰ染色法を用いてフローサイトメトリーを実施した。７時間処理した後、ＭＮ５８ｂでは、ＤＬＤ‐１細胞のアポトーシスはほんの少し増加する。これは、ＭＮ５８による腫瘍細胞死誘導には、７時間よりももっと時間が必要だからである。ＴＲＡＩＬ単独でＤＬＤ‐１細胞を処理すると、アポトーシスは３５％である。併用においては、腫瘍細胞死は５０％まで増幅した。ＲＳＭ−９３２ＡをＴＲＡＩＬと併用してＤＬＤ‐１を処理すると、腫瘍細胞死は５５％の増加であるが、これは、ＲＳＭ−９３２Ａの効果がＭＮ５８よりも早いため、主に壊死または後期アポトーシス集団となる。ＴＲＡＩＬ耐性のＳＷ６２０では、ＭＮ５８との併用でアポトーシス集団も３５％にまで増加する。ＴＲＡＩＬとＲＳＭ−９３２Ａとを併用すると、壊死または後期アポトーシス集団が増加し、７時間の処理後、総細胞死は５９％である（図１１）。これにより、大腸癌細胞におけるＴＲＡＩＬおよびＣｈｏＫ阻害剤の併用の相乗効果が証明される。
【０２４４】
ＴＲＡＩＬは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーの一つであり、細胞死受容体ＤＲ４（ＴＮＦＳＦ１０ＡすなわちＴＲＡＩＬ‐Ｒ１）およびＤＲ５（ＴＮＦＲＳＦ１０ＢすなわちＴＲＡＩＬ‐Ｒ２）の刺激を介して結びついた外因性経路によってアポトーシスを誘導することができる。ＴＲＡＩＬおよびＣｈｏＫ阻害剤併用療法の有効性のメカニズムを同定するため、ＭＮ５８ｂ、ＴＲＡＩＬまたはこれらの同時併用による処理後、定量的ＰＣＲにより、ＤＬＤ‐１およびＳＷ６２０細胞株におけるＤＲ５およびＤＲ４レベルを解析した。ＤＲ４レベルには有意な変化は見られなかったが、ＭＮ５８ｂ処理において、ＤＲ５レベルがＳＷ６２０細胞株で２倍増加し、ＤＬＤ‐１細胞株で１．６増加した。これによって、ＣｈｏＫ阻害剤およびＴＲＡＩＬ間に認められる相乗効果の作用メカニズムが説明され得る。
【０２４５】
ＭＮ５８ｂおよびＴＲＡＩＬは共に、細胞内のセラミドレベルを上昇させると以前に記述されている。この系におけるセラミド生成を調べるために、細胞内脂質を４８時間［１４Ｃ］‐セリンで標識してから、ＤＬＤ‐１細胞をＭＮ５８またはＴＲＡＩＬで処理した。抽出後、脂質を薄層クロマトグラフィーによって解析して定量した。図１３で認められるように、ＭＮ５８ｂおよびＴＲＡＩＬの同時併用では、セラミドレベルが３倍の増加となっている。さらに、ＳＷ６２０のＴＲＡＩＬ耐性は、セラミドシグナル伝達の欠陥に関連しており、外因性セラミドにより克服可能であると以前に記述されている。したがって、処理後のＳＷ６２０では、Ｃ‐１６セラミドは増加しない。ＣｈｏＫ阻害がＣ‐１６セラミド生成の一因となっている可能性を調べるため、液体クロマトグラフィーおよび質量分析法で解析を行ったところ、ＭＮ５８ｂおよびＴＲＡＩＬの併用でＣ‐１６セラミドは５０％増加した（図１３）。
【０２４６】
最終的に、ｉｎ ｖｉｖｏでの併用治療もヌードマウスの異種移植モデルを使用して実施した。腫瘍体積が０．１５ｃｍ^３になった時、同時併用治療を開始した。１群につき１０匹のマウスが含まれていた。マウスの治療は、月曜、水曜および金曜にはＭＮ５８ｂ（２ｍｇ／ｋｇ）で、火曜および木曜はＴＲＡＩＬ２０ｍｇ／ｋｇで行った。図１４で分かるように、３週間の治療後、ＤＬＤ‐１およびＳＷ６２０異種移植における腫瘍成長阻害は、それぞれ６８％および７５％となり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験で認められた強力な相乗作用を裏付けている。
【０２４７】
実施例９
コリンキナーゼ阻害剤および５‐ＦＵの協調が、大腸癌由来細胞株における細胞死を誘導する。
さらに、コリンキナーゼ阻害剤および従来の５‐フルオロウラシル（５‐ＦＵ）併用に基づく大腸癌治療の潜在的効果も分析した。細胞生存率に対する５‐ＦＵとＣｈｏＫ阻害剤ＭＮ５８ｂおよびＲＳＭ‐９３２Ａ併用の効果を、ＭＴＴアッセイによりＤＬＤ‐１、ＳＷ６２０およびＨＴ‐２９細胞で評価した。最高の組み合わせの選択肢は、並行投与またはＣｈｏＫ阻害剤を短時間（９〜２４時間）投与後、５‐ＦＵをそれより長く（４８〜７２時間）投与した連続投与であることが確認された。この結果を、チョウ・タラレイ（Chou Talalay）の組み合わせ指数アイソボログラム法(Chou TC. et al., supra.)を用いて解析した。図１５に示すように、解析された全ヒト大腸癌細胞において、成長阻害への相乗的効果が、５‐ＦＵとＣｈｏＫ阻害剤ＭＮ５８ｂまたはＲＳＭ‐９３２Ａとの間に認められ、これら２剤の併用が、大腸腫瘍成長抑制に有意な利点となり得ることが分かる。
【０２４８】
これらの結果もフローサイトメトリー解析で検証された。図１６に認められるように、細胞周期の解析により、併用療法が、これらの製剤を低濃度で使用しても細胞死を有意に増加させることが分かっただけではなく、ＣｈｏＫ阻害剤が細胞周期のＧ０／Ｇ１相に効果を発揮する一方、５‐ＦＵは、細胞周期のＧ２／Ｍ相に影響する効果があることも分かった。これらは以前の報告と一致する。これらの結果は、細胞を５‐ＦＵの抗増殖効果に感作させるために併用療法を行う場合、ＣｈｏＫ阻害剤による前処理の必要性の根拠となる。
【０２４９】
５‐ＦＵの抗腫瘍効果に対するＣｈｏＫＩ感作のメカニズムをさらに調べるため、５‐ＦＵ代謝経路の遺伝子発現解析をＨ４６０細胞で実施した。Ｈ４６０細胞は、アフィメトリクス手法を用いて、ＭＮ５８ｂおよびＲＳＭ‐９３２Ａにより別々の時点で処理された。表１１で分かるように、この経路の幾つかの遺伝子が、ＣｈｏＫ阻害剤の影響を有意にかつ共通して受ける結果となった。これは、ＣｈｏＫ阻害剤による前処理が、５‐ＦＵ効果を高める酵素の発現を修飾することを示唆している。
【０２５０】
【表１１】

【０２５１】
Ｈ４６０はＮＳＣＬＣ由来細胞であるため、上記の結果は、ＱＴ‐ＰＣＲ技術を用いて、三種類の異なる大腸由来の癌細胞で検証し、５‐ＦＵ誘導の細胞死増強のこのようなメカニズムが細胞依存性であるのか、そしてこの経路の遺伝子発現レベルの修飾が、大腸癌系に見られるＣｈｏＫＩ感作の効果を説明できるのかを明らかにした。表１２で分かるように、この経路には、解析された全癌細胞において同程度に有意な変化がみられ、５‐ＦＵの代謝上の変化がこの併用療法の作用メカニズムである可能性が示唆されている。
【０２５２】
【表１２】

【０２５３】
最後に、これらの２剤の併用がＮＳＣＬＣ腫瘍成長抑制に有意な利点となる可能性を検証するために、２種類の異なる大腸異種移植を使用したｉｎ ｖｉｖｏ試験を行った。ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験の知見に準じて、並行治療または連続治療をｉｎ ｖｉｖｏで実施した。連続治療では、ＣｈｏＫ阻害剤ＭＮ５８ｂまたはＲＳＭ−９３２Ａを第１週の間（週３回）投与し、次いで５‐ＦＵ治療を２週間（週２回）行った。図１７に示すように、ＤＬＤ‐１およびＳＷ６２０両方の異種移植を用いる５‐ＦＵとＣｈｏＫ阻害剤との間に強力な相乗的成長阻害が認められ、これらの２剤の併用は、大腸腫瘍の成長抑制に有意な利点になり得ることが示唆されている。
【図１５Ａ】

【図１５Ｂ】

【図１５Ｃ】

【図１７Ｂ】

【図１７Ｃ】

【図１７Ｄ】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種類以上のコリンキナーゼ阻害剤を含んでなる第１の成分と、
１種類以上の酸性セラミダーゼ阻害剤、１種類以上の化学療法剤および１種類以上の細胞死受容体リガンドからなる群から選択される第２の成分とを、個別にまたは共に含んでなる、組成物。
【請求項２】
前記コリンキナーゼ阻害剤が、コリンキナーゼαに特異的である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記コリンキナーゼ阻害剤が、表１に示された化合物である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記酸性セラミダーゼが、表２に示された化合物である、請求項１または３に記載の組成物。
【請求項５】
前記化学療法剤がアルキル化剤である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記アルキル化剤が白金系化合物である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記白金系化合物がシスプラチンである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記化学療法剤が代謝拮抗剤である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記代謝拮抗剤が５−フルオロウラシルである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記細胞死受容体リガンドが、ＴＲＡＩＬ、機能的に同等なその変異体、またはその模倣低分子化合物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物と薬学的に許容される担体または賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１２】
医薬に用いられる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
癌の治療に用いられる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記癌が非小細胞肺癌または大腸癌である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
コリンキナーゼ阻害剤に対する腫瘍細胞の感受性を高める方法であって、前記細胞と、酸性セラミダーゼ、化学療法剤、または細胞死受容体リガンドとを接触させることを含んでなる、方法。
【請求項１６】
前記化学療法剤がアルキル化剤または代謝拮抗剤である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＣｈｏＫ阻害剤を用いた療法に耐性を示す癌患者の同定方法であって、
前記患者由来の試料中における酸性セラミダーゼレベルを定量することを含んでなり、前記試料中の酸性セラミダーゼレベルが基準試料よりも高い場合、前記患者はＣｈｏＫ阻害剤耐性であると同定される、方法。
【請求項１８】
前記試料が腫瘍試料である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
癌患者のための個別化治療を選択する方法であって、
前記患者由来の試料中における酸性セラミダーゼレベルを定量することを含んでなり、前記試料中の酸性セラミダーゼの発現レベルが前記基準試料におけるレベルよりも高い場合、前記患者は、ＣｈｏＫ阻害剤および酸性セラミダーゼ阻害剤併用治療の候補者である、方法。
【請求項２０】
前記癌は、非小細胞肺癌または大腸癌である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＣｈｏＫ阻害剤は、表１に示された化合物または化合物の混合物であり、および／または前記酸性セラミダーゼ阻害剤が、表２に示された化合物または化合物の混合物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
癌治療のためのＣｈｏＫ阻害剤の治療効果を高めることができる化合物の同定方法であって、
（ｉ）ＣｈｏＫ阻害剤耐性を示す腫瘍細胞と、候補化合物とを接触させ、
（ｉｉ）前記細胞中の酸性セラミダーゼのレベルを定量することを含んでなり、
前記候補化合物による処置後に、前記細胞中の酸性セラミダーゼのレベルまたは酸性セラミダーゼ活性が、前記処置の前よりも低い場合、前記候補化合物は、癌治療のためのＣｈｏＫ阻害剤の効果を高めることができるとされる、方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７Ａ】

【図７Ｂ】

【図７Ｃ】

【図７Ｄ】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１Ａ】

【図１１Ｂ】

【図１１Ｃ】

【図１２】

【図１３】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１６】

【図１７Ａ】

【公表番号】特表２０１２−５０２９５４（Ｐ２０１２−５０２９５４Ａ）
【公表日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２７３２６（Ｐ２０１１−５２７３２６）
【出願日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６２０７８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３１８２５
【国際公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【出願人】（５１１０６９０７９）トラスラショナル、キャンサー、ドラッグス、ファーマ、ソシエダッド、リミターダ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＴＲＡＳＬＡＴＩＯＮＡＬ　ＣＡＮＣＥＲ　ＤＲＵＧＳ　ＰＨＡＲＭＡ，　Ｓ．Ｌ．
【Ｆターム（参考）】