発癌抑制用油脂含有組成物
【課題】 遺伝性癌あるいは職業癌の予防、または癌治療後の再発防止等に有効な発癌抑制剤を得ること、または発癌抑制の機能を有する飲食品を得ることを課題とする。
【解決手段】 甘草疎水性抽出物を溶解している油脂を含有することを特徴とする油脂含有組成物が発癌抑制作用を有することを見いだした。
【解決手段】 甘草疎水性抽出物を溶解している油脂を含有することを特徴とする油脂含有組成物が発癌抑制作用を有することを見いだした。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、健康食品や保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）などの飲食品、又は医薬品、医薬部外品、化粧品などに使用することができる発癌抑制用の油脂含有組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の治療法に関しては、これまでに様々な研究がなされている。特に、治療剤については、数多くの研究および開発が行われ、実際に医療現場で使用されている薬剤もある。しかしながら、未だに癌を根治する特効薬はなく、現在使用されている抗癌剤あるいは免疫療法剤などの癌治療薬では、その治療効果の弱さと副作用の強さとが問題となっている。このような癌発生後の治療薬の問題点は、薬剤を正常細胞に影響を与えることなく癌細胞のみに特異的に作用させることの困難性、および化学合成物質の薬剤が本来的に有する安全性の問題に起因する。
【０００３】
最近、癌発生後の治療薬とは別に、癌の発生を抑制するという観点で、発癌抑制物質の探索が特に重要視されている。有効な発癌抑制物質を抽出あるいは合成し薬剤として、発癌の抑制に用いることができれば、特に遺伝性癌あるいは職業癌の予防が可能となる。このような薬剤は、今後の新しい医療および日常生活における健康維持に大きく寄与すると考えられる。このような発癌抑制剤は、日常生活で手軽に摂取し得ることが好ましい。さらに、経口投与でも効果を示し、副作用のないことが必要条件である。しかしながら、これまでのところ、安全性に問題がない特定の発癌抑制物質を発癌予防あるいは治療用の薬剤として用いている例はない。
【０００４】
甘草はマメ科カンゾウ属（Glycyrrhiza属）の植物であり、食用や医薬用（生薬）として利用されており、主な品種としてグリキルリーザ・グラブラ（Glycyrrhiza. glabra）、Ｇ．ウラレンシス（G. uralensis）、Ｇ．インフラータ（G. inflata）などが挙げられる。いずれの品種にも親水性成分であるグリチルリチン（グリチルリチン酸）は含まれているが、疎水性成分のフラボノイドは品種によって特異的な化合物が含まれている。この品種特異的なフラボノイドは、甘草の品種同定に利用されることもある。
【０００５】
甘草から得られる抽出物のうち、甘草フラボノイドを多く含み、グリチルリチン含量が極微量である甘草疎水性抽出物は、マルチプル・リスク・ファクター症候群の予防及び／又は処置に有用であることが見出されている（特許文献１を参照）。さらに最新の研究において、この甘草疎水性抽出物がＰＰＡＲγリガンド活性を有し、その活性成分はフラボノイドであることが見出されている（特許文献２を参照）。その中でも、Ｇ．グラブラ由来の抽出物に含有される特徴的なフラボノイドであるグラブレン、グラブリジン、グラブロール、３'−ヒドロキシ−４'−Ｏ−メチルグラブリジン、４'−Ｏ−メチルグラブリジン及びヒスパグラブリジンＢが高いＰＰＡＲγリガンド活性を有していることが見出されている（特許文献２参照）。
【０００６】
一方、甘草疎水性抽出物に含まれる化合物、例えば甘草疎水性フラボノイドは、水にほとんど溶解せず、また、有機溶媒抽出物のままでは固結し易く、着色の進行も早いなど、経時的変化が著しいという性質があるため、利用し難い。それを解決するために、中鎖脂肪酸トリグリセリドに溶解して安定化して製剤化することが提案されている（特許文献３を参照）。特許文献３では、その甘草疎水性フラボノイド製剤を酸化防止剤、抗菌剤、酵素阻害剤、着色料、抗腫瘍剤、抗アレルギー剤、抗ウイルス剤として利用しうる可能性を示唆してはいるが、試験されておらず、実際上、これらの用途に用いることができるのかどうかは不明である。さらに、この文献では、甘草疎水性抽出物を得るための抽出溶剤の種類と用途との詳細な検討もなされていない。
【特許文献１】国際公開第０２／０４７６９９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０３／０３７３１６号パンフレット
【特許文献３】特許２７９４４３３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、発癌抑制用の油脂含有組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
驚くべきことに、本発明者らは、油脂含有組成物であって、甘草をアルコールと接触させて得たアルコール抽出物を油脂と接触させることにより得られる溶液が発癌抑制作用を有することを見出して、本発明の課題が達成された。よって、本発明が提供するのは、以下の通りである。
（１） 甘草疎水性抽出物を油脂と接触させることにより得られる溶液を含む発癌抑制用油脂含有組成物。
（２） 甘草疎水性抽出物として、成人一人一日当たり０．４５〜３．６ｍｇ／ｋｇ体重を摂取できる量である、上記（１）１記載の組成物。
（３） 油脂が、中鎖脂肪酸トリグリセリド及び／または脂肪酸部分グリセリドを含むグリセリン脂肪酸エステルを含む、上記（１）記載の組成物。
（４） 油脂が、中鎖脂肪酸トリグリセリドを５０重量％以上含むグリセリン脂肪酸エステルを含む、上記（１）記載の組成物。
（５） 油脂が、脂肪酸部分グリセリドを５０重量％以上含むグリセリン脂肪酸エステルを含む、上記（４）記載の組成物。
（６） 飲食用である上記（１）〜（５）のいずれか１項記載の組成物。
（７） 医薬用である上記（１）〜（５）のいずれか１項記載の組成物。
（８） 甘草疎水性抽出物を油脂と接触させることを特徴とする、発癌予防及び／または癌治療用組成物の製造方法。
（９） 甘草疎水性抽出物を油脂と接触させることにより得られる溶液を有効成分として投与することを特徴とする、発癌予防方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、健康食品や保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）などの飲食品、又は医薬品、医薬部外品、化粧品などに利用することができる癌予防または処置用の油脂含有組成物が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に、本発明の実施の形態を詳しく説明する。
１実施態様では、本発明は、甘草から有機溶媒により抽出された甘草疎水性抽出物を油脂と接触させて得られる溶液を含む、癌予防または処置用の油脂含有組成物を提供する。
【００１１】
ここで述べる油脂含有組成物とは、甘草疎水性抽出物を油脂に溶解したままの組成物、甘草疎水性抽出物を溶解した油脂から不溶性不純物を除去した組成物、さらにそれに油脂を添加した組成物、あるいは該組成物から疎水性抽出溶剤を除去した組成物を含むもので、また、これらの組成物を含有してなる飲食用、医薬用、医薬部外用等の組成物である。すなわち、甘草疎水性抽出物を油脂に溶解した組成物、及びこれに他の成分を混合してなる組成物、さらにはこれを加工してなる飲食用、医薬用、医薬部外用等の組成物のいずれも本発明の油脂含有組成物に含まれる。
油脂含有組成物中の甘草疎水性抽出物の量は特に制限されないが、油脂への溶解性の観点から、疎水性抽出溶媒を含まない量に換算して、上限は３０重量％以下が好ましく、甘草疎水性抽出物の有効性の観点から、下限は０．０１重量％以上が好ましい。より好ましくは、油脂含有組成物中０．１〜３０重量％であり、更に好ましくは１〜１０重量％である。
【００１２】
本発明に用いられる甘草材料は、マメ科カンゾウ属（Glycyrrhiza属）の植物であれば限定されず、グリキルリーザ・グラブラ（Glycyrrhiza. glabra）、Ｇ．ウラレンシス（G. uralensis）、Ｇ．インフラータ（G. inflata）などが挙げられる。中でも安全性の観点から、最も分布が広く食経験も豊かなＧ．グラブラ種の甘草が好ましい。
【００１３】
本発明において、甘草疎水性抽出物を得る方法は特に限定されないが、Ｇ．グラブラ種の甘草より得ることができる。該抽出物を甘草から得る場合、その方法は特に限定されないが、アルコール、酢酸エチル、アセトンなどの有機溶媒による抽出で得ることができるが、飲食用、医薬用、医薬部外用等に用いることからアルコール、とりわけエタノールによる抽出が好ましい。エタノールは食品、医薬品の製造に用いられるものであれば特に限定されないが、疎水性成分の抽出を目的とすることから、その含水率は３０％以下、好ましくは１０％以下、更に好ましくは５％以下である。
【００１４】
アルコールと甘草材料の重量比は、特に限定されないが、抽出効率の観点から、好ましくは０．５：１〜２０：１、より好ましくは１：１〜１０：１である。また、抽出温度及び抽出時間については特に限定されないが、抽出率を上げるために２０℃以上、好ましくは２０〜８０℃、更に好ましくは３０〜６０℃の条件で、抽出時間を１時間以上、好ましくは１〜１０時間、更に好ましくは１〜３時間行うことが好ましい。更に抽出回数を複数回行うことにより、甘草材料から疎水性成分を効率よく抽出することが可能であり、少なくとも２回以上抽出することが好ましい。
【００１５】
この様にして得られる抽出物は、そのまま使用してもよいが、さらにカラム処理、脱臭処理、脱色処理などにより粗精製又は精製したもの、さらにまたそれらから溶剤を除去した固形物を使用してもよい。また、該抽出物は、精製したものを使用することができるが、飲食品、医薬品、医薬部外品などとして不適当な不純物を含有しない限り粗精製したものを使用することもできる。
【００１６】
本発明で使用される油脂は、中鎖脂肪酸トリグリセリドを含むグリセリン脂肪酸エステルであって、好ましくは中鎖脂肪酸トリグリセリドを約５０重量％以上含むグリセリン脂肪酸エステル、より好ましくは中鎖脂肪酸トリグリセリドを約７０重量％以上含むグリセリン脂肪酸エステルである。ここでの中鎖脂肪酸トリグリセリドは、炭素原子数約６〜１２の脂肪酸を構成脂肪酸とし、その脂肪酸の構成比率は特に限定されないが、炭素原子数約８〜１０の脂肪酸の構成比率は約５０重量％以上が好ましく、約７０重量％以上がより好ましい。とりわけ、約２０℃での比重が約０．９４〜０．９６、約２０℃での粘度が約２３〜２８ｃＰの中鎖脂肪酸トリグリセリドがさらに好ましい。また、中鎖脂肪酸トリグリセリドは、天然由来のものやエステル交換などにより調製したものなど、いずれも使用することができる。
【００１７】
また、本発明で使用される油脂は、脂肪酸部分グリセリドを含むグリセリン脂肪酸エステルであって、好ましくは部分グリセリドを約５０重量％以上含むグリセリン脂肪酸エステル、より好ましくは部分グリセリドを約７０重量％以上含むグリセリン脂肪酸エステルである。ここでの部分グリセリドとは、ジグリセリド（１，２−ジアシルグリセロール、１，３−ジアシルグリセロール）又はモノグリセリド（１−モノアシルグリセロール、２−モノアシルグリセロール）であり、いずれを用いても良いし、両者が混合されたものを用いても良く、構成脂肪酸についても特に限定されないが、加工性の観点から不飽和脂肪酸および／または中鎖脂肪酸からなるジグリセリドが好ましい。また、部分グリセリドは、天然由来のものやエステル交換などにより調製したものなど、いずれも使用することができる。さらに、本発明で使用される油脂は、上記の中鎖脂肪酸トリグリセリドと部分グリセリドが混合されたものを用いることもできる。
【００１８】
本発明において、油脂含有組成物を得る方法は特に限定されないが、上記甘草疎水性抽出物を油脂に溶解することによって得ることが出来る。この場合、通常の撹拌又は混合などの操作により実施できるが、撹拌又は混合などの操作により該抽出物を油脂に溶解した後に、ろ過又は遠心分離などの操作により油脂に不溶な不純物を除去することが望ましい。或いは、ＷＯ０３／８４５５６記載の方法が好適である。例えば、甘草原料から直接油脂により抽出することも可能であるが、甘草疎水性抽出物を含む有機溶媒、好ましくは、エタノール溶液と油脂を混合した後、エタノールを除去することによって得ることが出来る。さらに、本発明では、これらの甘草疎水性抽出物と油脂の混合物に対してさらに油脂を添加して、甘草疎水性抽出物と油脂の組成比を調整しても良い。
【００１９】
一般に、甘草疎水性抽出物は、粉末状態において不安定であり、エタノールなどの有機溶媒へ溶解しても安定性は改善されない。しかし、該抽出物を本発明で使用する油脂に溶解することによりその安定性を改善することができる。また、該抽出物は難水溶性であることから、本発明で使用する油脂に溶解することによりその吸収性が向上することも期待できる。
【００２０】
本発明の組成物は飲食用、医薬用または美容用に許容される担体を含んでいてもよい。該医薬用担体は、例えば経口、経腸、経皮、皮下、または非経腸投与のため好適な任意の不活性、有機または無機材料であり得、限定されないが水、ゼラチン、アラビアガム、ラクトース、微結晶性セルロース、スターチ、ナトリウムスターチグリコレート、燐酸水素カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、およびコロイド性二酸化ケイ素、などであることができる。そのような組成物はまた、他の薬理学的活性な剤、および通常の添加物、例えば安定剤、湿潤剤、乳化剤、香味剤、および緩衝剤、などを含みうる。
本発明の癌予防または処置用の油脂含有組成物は、グラブレン、グラブリジン、グラブロール、３'−ヒドロキシ−４'−Ｏ−メチルグラブリジン、４'−Ｏ−メチルグラブリジン、ヒスパグラブリジンＢからなる群より選ばれた少なくとも１つの化合物を溶解している油脂を含有することを特徴としている。
【００２１】
本発明において、グラブレン、グラブリジン、グラブロール、３'−ヒドロキシ−４'−Ｏ−メチルグラブリジン、４'−Ｏ−メチルグラブリジン、ヒスパグラブリジンＢは、特に限定されないが、Ｇ．グラブラ種の甘草より得ることができる。該化合物を甘草から得る場合、その方法は特に限定されないが、アルコール、酢酸エチル、アセトンなどの有機溶媒による抽出で得られる甘草疎水性抽出物に該化合物は含まれ、抽出物のまま使用してもよいが、さらにカラム処理、脱臭処理、脱色処理などにより粗精製又は精製したものを使用してもよい。
【００２２】
勿論、該化合物は、その他植物等の天然由来、化学合成あるいは培養細胞などにより生合成した化合物のいずれであっても使用することができる。また、該化合物は、精製したものを使用することができるが、飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品などとして不適当な不純物を含有しない限り粗精製したものを使用することもできる。
【００２３】
該化合物の中でも、グラブリジンを含有し、かつグラブレン、グラブロール、３'−ヒドロキシ−４'−Ｏ−メチルグラブリジン、４'−Ｏ−メチルグラブリジン、ヒスパグラブリジンＢからなる群より選ばれた少なくとも１つの化合物を含有することが好ましい。さらに、グラブリジン及びグラブレンを含有し、かつグラブロール、３'−ヒドロキシ−４'−Ｏ−メチルグラブリジン、４'−Ｏ−メチルグラブリジン、ヒスパグラブリジンＢからなる群より選ばれた少なくとも１つの化合物を含有することがより好ましい。とりわけ、グラブレン、グラブリジン、グラブロール、３'−ヒドロキシ−４'−Ｏ−メチルグラブリジン、４'−Ｏ−メチルグラブリジン、ヒスパグラブリジンＢを全て含有していることが最も好ましい。
【００２４】
グラブリジン（glabridin）、３'−ヒドロキシ−４'−Ｏ−メチルグラブリジン（3'-hydroxyl-4'-O-methylglabridin）、４'−Ｏ−メチルグラブリジン（4'-O-methylglabridin）、ヒスパグラブリジンＢ（hyspaglabridin B）はイソフラバン（isoflavan）に分類されるフラボノイドであり、下記一般式（1）にて表される化合物である。
【化１】
〔グラブリジンはＲ１＝Ｈ、Ｒ２＝ＯＨ、３'−ヒドロキシ−４'−Ｏ−メチルグラブリジンはＲ１＝ＯＨ、Ｒ２＝ＯＣＨ3、４'−Ｏ−メチルグラブリジンはＲ１＝Ｈ、Ｒ２＝ＯＣＨ3、ヒスパグラブリジンＢはＲ１〜Ｒ２が−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（ＣＨ3）2−Ｏ−で六員環を構成する。〕
【００２５】
グラブレン（glabrene）は、イソフラブ−３−エン（isoflav-3-ene）に分類されるフラボノイドであり、下記一般式（２）で表される化合物である。
【化２】
【００２６】
グラブロール（glabrol）は、フラバノン（flavanone）に分類されるフラボノイドであり、下記一般式（３）で表される化合物である。
【化３】
【００２７】
グラブレン、グラブリジン、グラブロール、３'−ヒドロキシ−４'−Ｏ−メチルグラブリジン、４'−Ｏ−メチルグラブリジン、ヒスパグラブリジンＢは、甘草の中でもグリキリーザ・グラブラ（Glycyrrhiza glabra）に特異的に含まれる成分であり、他品種にはほとんど含まれていない。ただし、Ｇ．グラブラと他品種との雑種においては含まれる場合もある。該化合物は、ＯＤＳなどの逆相カラムを用いたＨＰＬＣ分析により、他のフラボノイド成分と分離して検出、定量することができる。
得られる油脂抽出物に所望により他の担体を添加して、油脂含有組成物を製造できる。
【００２８】
該化合物を含む抽出物、あるいは該化合物の粗精製品を用いる場合、該化合物以外の不純物が含まれているため、撹拌又は混合などの操作により該化合物を油脂に溶解した後に、ろ過又は遠心分離などの操作により油脂に不溶な不純物を除去することが望ましい。該化合物の精製品を用いる場合、容易に均一な溶液を得ることができる。また、該化合物を含む抽出物、あるいは該化合物の粗精製品を用いる場合、予めエタノールなどの有機溶媒に溶解し、その溶液と油脂を混合した後に、有機溶媒を留去することもできる。
【００２９】
本発明において、グラブレン、グラブリジン、グラブロール、３'−ヒドロキシ−４'−Ｏ−メチルグラブリジン、４'−Ｏ−メチルグラブリジン、ヒスパグラブリジンＢを油脂に溶解する方法は、特に限定されず、通常の撹拌又は混合などの操作により実施できる。
【００３０】
一般に、グラブレン、グラブリジン、グラブロール、３'−ヒドロキシ−４'−Ｏ−メチルグラブリジン、４'−Ｏ−メチルグラブリジン、ヒスパグラブリジンＢは、粉末状態において不安定であり、エタノールなどの有機溶媒へ溶解しても安定性は改善されない。しかし、該化合物を本発明で使用する油脂に溶解することによりその安定性を改善することができる。油脂は、前の実施態様と同様である。
【００３１】
本発明の癌予防または処置用の油脂含有組成物について、その形態は特に限定されず、健康食品や保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）などの飲食品、又は医薬品、医薬部外品、化粧品などに利用することができる。例えば、グラブレン、グラブリジン、グラブロール、３'−ヒドロキシ−４'−Ｏ−メチルグラブリジン、４'−Ｏ−メチルグラブリジン、ヒスパグラブリジンＢよりなる群より選ばれた少なくとも１つの化合物を溶解している油脂を、そのまま単独で調理用、ソフトカプセル製剤用、ローション用などとして利用することができる。また、油性の対象物と自由に混和することができるため、目的に応じて他の油脂と混合して物性を調整することが可能である。この場合、他の油脂は食品又は医薬品であることが好ましく、その種類及び使用量は、個々の製品に要求される物性や使用温度域などの諸条件を考慮して決定され、その種類及び使用量を調整することにより稠度や融点などの特性をコントロールすることができる。例えば、コーン油、ナタネ油、ハイエルシンナタネ油、大豆油、オリーブ油、紅花油、綿実油、ヒマワリ油、米糠油、パーム油、パーム核油などの植物油、魚油、牛脂、豚脂、乳脂、卵黄油などの動物油、又はこれらを原料として分別、水添、エステル交換などを行った油脂、あるいはこれらの混合油を使用することができる。
【００３２】
このようにして得られる油脂含有組成物は、サラダ油やフライ油などの液状油脂、マーガリンやショートニングなどの可塑性油脂としての利用や、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョンへ利用することができる。また、これらを原材料にして製造される飲食用の油脂含有組成物として、チューインガム、チョコレート、キャンディー、ゼリー、ビスケット、クラッカーなどの菓子類、アイスクリーム、氷菓などの冷菓類、乳飲料、清涼飲料、栄養ドリンク、美容ドリンクなどの飲料、うどん、中華麺、スパゲティー、即席麺などの麺類、蒲鉾、竹輪、半片などの練り製品、ドレッシング、マヨネーズ、ソースなどの調味料、パン、ハム、スープ、各種レトルト食品、各種冷凍食品などが例示され、ペットフードや家畜飼料などへも利用することができる。
【００３３】
さらに、栄養強化を目的として、ビタミンＡ，Ｄ，Ｅなどの各種ビタミン類を添加、併用してもよいし、呈味剤としての各種塩類、各種香料、乳関連物質、例えば、全脂粉乳、脱脂粉乳、発酵乳、乳脂肪などを添加、併用してもよい。また、上記以外の原材料として、通常の油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョンに使用される酸化防止剤、着色剤などを全て使用することができる。
【００３４】
本発明の発癌予防及び／又は抑制用の油脂含有組成物に含まれるグラブレン、グラブリジン、グラブロール、３'−ヒドロキシ−４'−Ｏ−メチルグラブリジン、４'−Ｏ−メチルグラブリジン、ヒスパグラブリジンＢが、その発癌予防及び／又は抑制の効果を発揮するためには、甘草抽出物として、成人一日一人当たり０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．４５〜３．６ｍｇ／ｋｇ体重を摂取できる量の該化合物を油脂含有組成物中に含んでいることが望ましい。尚、該化合物の含量は、ＯＤＳなどの逆相カラムを用いたＨＰＬＣ分析によって測定した。
【００３５】
本明細書にいう用語「発癌抑制」とは、癌細胞の発生を抑制することおよび一旦発生した癌細胞の増殖を抑制することを意味する。本発明の発癌抑制剤により抑制される腫瘍の種類は、限定されない。すなわち、上皮性腫瘍、非上皮性腫瘍さらにはその良性、悪性を問わない。例えば、体内の各種臓器である、胃、腸、肺、肝臓、腎臓、膵臓、胆嚢、子宮、卵巣、精巣、前立腺、あるいは脳などに発生する上皮性腫瘍および非上皮性腫瘍、神経系腫瘍、骨腫瘍、リンパ系腫瘍などの腫瘍であり得る。
【００３６】
本発明の発癌抑制剤を投与する場合あるいは飲食品として摂取する場合の例としては、遺伝性癌の予防、環境あるいは生活習慣に起因する癌の予防、あるいは腫瘍摘出手術後の再発および癌転移の予防、あるいは癌治療の１つとしての投与が挙げられる。より具体的には、遺伝子診断により、将来発癌する可能性が高いと認められる者が、発症前に本発明の癌抑制剤を予防的に摂取する場合、喫煙習慣のある者や放射性物質に暴露される職業に従事する者が予防的に摂取する場合、または化学療法としての抗癌剤投与に代わってあるいはそれと並行して投与する場合等がある。
【実施例】
【００３７】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞
【００３８】
アフガン産甘草（Ｇ．グラブラ）９．８５ｋｇからエタノール抽出（４９．２５Ｌ、４５℃、２時間、２回抽出）、次いで濃縮により濃縮液４．４Ｌを得た。そのうち３Ｌを更に濃縮して、活性炭処理、濃縮により甘草疎水性抽出物を含有したエタノール溶液８１１．２ｇを得た。
上記のエタノール溶液６２９．２ｇ（甘草疎水性抽出物１２５．８ｇを含有する）と中鎖脂肪酸トリグリセリド（ＭＣＴ）であるアクターＭ−２（理研ビタミン（株）：脂肪酸組成はＣ８：Ｃ１０＝９９：１）１８７．６ｇを混合し、約８０℃に保温しながら約１時間撹拌した後、減圧濃縮によりエタノールを除去した。吸引ろ過により不溶分を分離し、ろ別後のろ液にＭＣＴ４５．７ｇを更に添加して、ＭＣＴ溶液２９７．０ｇを得た。得られたＭＣＴ溶液１ｇをＨＰＬＣ用メタノールに溶解し、全量を１００ｍｌとした。この溶液を試料として下記の条件にてＨＰＬＣ分析を行った結果、ＭＣＴ溶液１ｇあたりにグラブレン、グラブリジン、グラブロール、４'−Ｏ−メチルグラブリジンがそれぞれ６．６ｍｇ、３０．８ｍｇ、１２．６ｍｇ、３．７ｍｇ含まれていた。
グラブレン、グラブリジン、グラブロール、４'−Ｏ−メチルグラブリジンを含む甘草抽出物は、ＭＣＴ溶液の約３０重量％であった。
【００３９】
ＨＰＬＣ分析条件
分析カラムは、Ｊ’ｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ−Ｈ８０，４．６×２５０ｍｍ（ワイエムシィ）をカラム温度４０℃にて使用した。移動相は、２０ｍＭリン酸水溶液に対してアセトニトリルの比率を分析開始から２０ｍｉｎまで３５％で一定とし、２０ｍｉｎ以降７５ｍｉｎ後に７０％となるように一定の比率で上昇させ、７５ｍｉｎから８０ｍｉｎまで８０％で一定とするグラジエント条件で、流速１ｍｌ／ｍｉｎとした。注入量は２０μｌとし、検出波長は２５４ｎｍとした。各化合物の保持時間は、グラブレンが４０．０ｍｉｎ、グラブリジンが５０．２ｍｉｎ、グラブロールが５８．３ｍｉｎ、４'−Ｏ−メチルグラブリジンが６６．８ｍｉｎであった。
＜実施例２＞
【００４０】
発癌抑制作用
実施例１のＭＣＴ溶液の発癌への影響を調べるため中期肝発癌性試験法（伊東テスト）を用いた検索を実施した。本試験法は、げっ歯類を用いた二段階発癌モデルの１つであり、ラット肝臓を標的としたものである。本試験法を用いて既に３１３以上の化学物質が検索されており、発癌物質あるいは発癌抑制物質を検索する上で、信頼性の高い有用な検索法とされている。よって日・米・EU三極医薬品規制ハーモナイゼーション国際会議（ＩＣＨ）においても従来の長期癌原性試験の代替試験として認められている。さらに、本試験は「医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施の基準に関する省令」（平成９年３月２６日厚生省令第２１号）に基づくＧＬＰ（Good Laboratory Practice）基準に準拠して実施しており、試験結果の信頼性は充分に高い。
６週齢のＦ３４４系雄ラット１００匹からコンピューターを用いた乱塊法により平均体重に統計学的有意差が生じないように７群（第１−５群：１５匹、第６，７群：９匹）に群分けした。肝発癌に対するイニシエーション処置のため、ラットにジエチルニトロサミン (DEN) を２００ mg/kgの用量で１回腹腔内に投与し、その２週間後から、被験物質であるＭＣＴ溶液を０（対照群）、１５０、３００および６００ mg/kgの投与量で１日１回、７回/週の頻度で６週間強制経口投与した（第１−４群）。試験に用いたＭＣＴ溶液の１５０、３００および６００ mg/kgは、有効成分である甘草抽出物に換算すると４５、９０および１８０mg/kg体重に相当する。また、フェノバルビタールナトリウム塩(Ｓ．ＰＢ)を陽性対照群として５００ ppmの濃度で混餌投与した（第５群）。なお、ＤＥＮ無処置の対照群および被験物質６００mg/kg群も設けた（第６，７群）。実験第３週経過時（被験物質投与開始１週後）に全動物について部分肝切除術を施行し、肝臓の病変を増幅させた。実験開始８週間経過後（被験物質投与期間終了後）に全てのラットを屠殺剖検し、肝臓を摘出した。それぞれの肝臓から３片の組織を切りだし１０％緩衝ホルマリン液にて固定後、パラフィンブロックを作製、薄切して組織標本を作製した。得られたラット肝臓の組織標本について、肝臓の前癌病変の指標である胎盤型グルタチオンＳ−トランスフェラ−ゼ（GST-P）の発現をアビジン−ビオチン複合体法による免疫組織化学染色を用いて調べた。肝臓切片の面積および直径０．２mm以上のGST-P陽性細胞巣の個数および面積を、病理標本画像解析装置IPAP-WIN（住化テクノサービス株式会社）を用いて計測した後、肝臓切片１cm2当たりの個数および面積を算出し、定量的解析を行った。また、第６および７群の各３例については免疫組織化学的検査に供した肝臓の残りから１部を採取し、４％グルタールアルデヒドで固定後、電子顕微鏡検査を実施した。統計学的解析は、第１群と第２〜４群間の体重、器官重量および肝臓の免疫組織化学的検査における平均値の差の検定については、５％有意水準でBertlett法による等分散検定を行った。等分散の場合はパラメトリックのDunnett法による片側検定を行い、不等分散の場合はノンパラメトリックのSteel法による片側検定を行った。なお、DEN処置の第１群（対照群）と第５群（S.PB群）間およびDEN無処置の第６群（対照群）と第７群（６００ mg/kg群）間の平均値の差の検定についてはＦ検定を用い、等分散である場合はstudentのt検定（片側）を用い、等分散でない場合にはWelch検定（片側）を用いた。肝臓重量およびGST-P陽性細胞巣の定量的解析の結果を表１および表２に示す。
投与期間中、被験物質投与に起因する一般状態の変化、死亡動物、摂餌量および体重変化を認めなかった。摂水量では、DEN処置の３００および６００ mg/kg群（第３および４群）およびDEN無処置の６００ mg/kg群（第７群）において持続的な高値傾向を示したことから被験物質投与の影響と考えられた。肝臓重量では、DEN処置の３００および６００ mg/kg群（第３および４群）で絶対および相対重量の有意な高値を認め、１５０ mg/kg群（第２群）では相対重量の有意な高値を認めた。さらにDEN無処置の６００mg/kg群（第７群）においても、絶対および相対重量の有意な高値を認めたことから被験物質投与の影響と考えられたが、その程度は軽度であり、光学顕微鏡レベルでは組織学的に差異は認められなかった。さらに、DEN無処置の６００ mg/kg群（第７群）で実施した肝臓の電子顕微鏡学的検査でも何らの変化も認めなかった。よって肝臓重量の増加は毒性とは判断されなかった。肝臓のGST-P陽性細胞巣の計測では、DEN処置の６００ mg/kg群（第４群）における単位面積当りの数が対照群（第１群）と比較して有意な低値を示し、単位面積当りの面積については１５０および６００ mg/kg群（第２および４群）で有意な低値を示した。
一方、陽性対照のS.PB群（第５群）のGST-P陽性細胞巣の計測では、単位面積当りの個数および面積ともに明らかな高値が認められ、本試験の妥当性が証明された。なお、肝臓においてペルオキシソーム増殖性を示す化合物は本試験系において偽陰性あるいは偽抑制作用を示すことが知られているが、上述したようにDEN無処置の６００ mg/kg群（第７群）で実施した肝臓の電子顕微鏡学的検査では、肝細胞内のペルオキシソーム増殖性を認めなかったことより、本試験結果における偽陰性および偽抑制作用の可能性が否定された。
以上、ＭＣＴ溶液を１５０、３００および６００ mg/kgの用量で強制経口投与した結果、いずれの用量においてもGST-P陽性細胞巣の個数および面積に増加を認めず、６００mg/kgでは逆に減少が認められた。よってＭＣＴ溶液はラット肝臓において発癌促進作用を有さず、発癌抑制作用を有することが明らかとなった。
ラットに比べてヒトの感受性は約５０〜１００倍高いことが知られている。したがって、ＭＣＴ溶液１５０〜６００ mg/kg（すなわち、有効成分である甘草抽出物換算で４５〜１８０mg/kg）の用量でラットが発癌抑制作用を有するということは、ヒトでは、甘草抽出物０．４５〜３．６mg/kg用量で発癌抑制作用を有すると推定される。
【表１】
【表２】
＜実施例３＞
【００４１】
ソフトカプセル剤の製造
実施例１のＭＣＴ溶液を、ロータリー式ソフトカプセル製造装置を用いてゼラチン皮膜に圧入し、内容量３５０ｍｇのソフトカプセル剤を得た。
＜実施例４＞
【００４２】
マーガリンの製造
硬化綿実油（商品名：スノーライト、株式会社カネカ）８０重量部、実施例１のＭＣＴ溶液２０重量部、無塩バター（四つ葉乳業（株））１０重量部に、グリセリンモノ脂肪酸エステル（商品名：エマルジーＭＳ、理研ビタミン（株））０．２重量部、レシチン０．２重量部を添加し、６０℃に加熱溶解し油相を調製した。
調製された油相８４．９重量部に撹拌しながら水１５．１重量部を添加し、２０分間乳化を行った後、コンビネーターで冷却捏和してマーガリンを作製した。
＜実施例５＞
【００４３】
濃縮乳の製造
実施例１のＭＣＴ溶液１０重量部を７０℃に加温後、レシチン０．１重量部及びポリグリセリン脂肪酸エステル０．１重量部を順次溶解して油相を作製した。
脱脂粉乳２５重量部、グリセリン脂肪酸エステル０．１重量部、ショ糖脂肪酸エステル０．１重量部を６０℃の水６４．６重量部に溶解して水相を調製した。
調製した水相と油相を予備乳化した後、ＵＨＴ殺菌機にて１４５℃で４秒間殺菌した。次いで真空冷却した後、均質化機により１０ＭＰａの圧力で均質化し、更に１０℃までプレート冷却して加工用濃縮乳を得た。
＜実施例６＞
【００４４】
マヨネーズの製造
醸造酢１０重量部、食塩１重量部、砂糖０．６重量部、マスタード粉末０．２重量部、グルタミン酸ナトリウム０．２重量部を混合器の中に加え、１５〜２０℃下で攪拌・混合し水相を調製した。その後、米白絞油６８重量部、実施例１のＭＣＴ溶液１０重量部に卵黄１０重量部を加え、攪拌乳化して得た乳化液（１０〜１５℃）を少しずつ加えながら１５〜２０℃下で攪拌し、予備乳化した。次いで、コロイドミルを用いて仕上げ乳化を行いマヨネーズを得た。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、健康食品や保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）などの飲食品、又は医薬品、医薬部外品、化粧品などに使用することができる発癌抑制用の油脂含有組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の治療法に関しては、これまでに様々な研究がなされている。特に、治療剤については、数多くの研究および開発が行われ、実際に医療現場で使用されている薬剤もある。しかしながら、未だに癌を根治する特効薬はなく、現在使用されている抗癌剤あるいは免疫療法剤などの癌治療薬では、その治療効果の弱さと副作用の強さとが問題となっている。このような癌発生後の治療薬の問題点は、薬剤を正常細胞に影響を与えることなく癌細胞のみに特異的に作用させることの困難性、および化学合成物質の薬剤が本来的に有する安全性の問題に起因する。
【０００３】
最近、癌発生後の治療薬とは別に、癌の発生を抑制するという観点で、発癌抑制物質の探索が特に重要視されている。有効な発癌抑制物質を抽出あるいは合成し薬剤として、発癌の抑制に用いることができれば、特に遺伝性癌あるいは職業癌の予防が可能となる。このような薬剤は、今後の新しい医療および日常生活における健康維持に大きく寄与すると考えられる。このような発癌抑制剤は、日常生活で手軽に摂取し得ることが好ましい。さらに、経口投与でも効果を示し、副作用のないことが必要条件である。しかしながら、これまでのところ、安全性に問題がない特定の発癌抑制物質を発癌予防あるいは治療用の薬剤として用いている例はない。
【０００４】
甘草はマメ科カンゾウ属（Glycyrrhiza属）の植物であり、食用や医薬用（生薬）として利用されており、主な品種としてグリキルリーザ・グラブラ（Glycyrrhiza. glabra）、Ｇ．ウラレンシス（G. uralensis）、Ｇ．インフラータ（G. inflata）などが挙げられる。いずれの品種にも親水性成分であるグリチルリチン（グリチルリチン酸）は含まれているが、疎水性成分のフラボノイドは品種によって特異的な化合物が含まれている。この品種特異的なフラボノイドは、甘草の品種同定に利用されることもある。
【０００５】
甘草から得られる抽出物のうち、甘草フラボノイドを多く含み、グリチルリチン含量が極微量である甘草疎水性抽出物は、マルチプル・リスク・ファクター症候群の予防及び／又は処置に有用であることが見出されている（特許文献１を参照）。さらに最新の研究において、この甘草疎水性抽出物がＰＰＡＲγリガンド活性を有し、その活性成分はフラボノイドであることが見出されている（特許文献２を参照）。その中でも、Ｇ．グラブラ由来の抽出物に含有される特徴的なフラボノイドであるグラブレン、グラブリジン、グラブロール、３'−ヒドロキシ−４'−Ｏ−メチルグラブリジン、４'−Ｏ−メチルグラブリジン及びヒスパグラブリジンＢが高いＰＰＡＲγリガンド活性を有していることが見出されている（特許文献２参照）。
【０００６】
一方、甘草疎水性抽出物に含まれる化合物、例えば甘草疎水性フラボノイドは、水にほとんど溶解せず、また、有機溶媒抽出物のままでは固結し易く、着色の進行も早いなど、経時的変化が著しいという性質があるため、利用し難い。それを解決するために、中鎖脂肪酸トリグリセリドに溶解して安定化して製剤化することが提案されている（特許文献３を参照）。特許文献３では、その甘草疎水性フラボノイド製剤を酸化防止剤、抗菌剤、酵素阻害剤、着色料、抗腫瘍剤、抗アレルギー剤、抗ウイルス剤として利用しうる可能性を示唆してはいるが、試験されておらず、実際上、これらの用途に用いることができるのかどうかは不明である。さらに、この文献では、甘草疎水性抽出物を得るための抽出溶剤の種類と用途との詳細な検討もなされていない。
【特許文献１】国際公開第０２／０４７６９９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０３／０３７３１６号パンフレット
【特許文献３】特許２７９４４３３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、発癌抑制用の油脂含有組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
驚くべきことに、本発明者らは、油脂含有組成物であって、甘草をアルコールと接触させて得たアルコール抽出物を油脂と接触させることにより得られる溶液が発癌抑制作用を有することを見出して、本発明の課題が達成された。よって、本発明が提供するのは、以下の通りである。
（１） 甘草疎水性抽出物を油脂と接触させることにより得られる溶液を含む発癌抑制用油脂含有組成物。
（２） 甘草疎水性抽出物として、成人一人一日当たり０．４５〜３．６ｍｇ／ｋｇ体重を摂取できる量である、上記（１）１記載の組成物。
（３） 油脂が、中鎖脂肪酸トリグリセリド及び／または脂肪酸部分グリセリドを含むグリセリン脂肪酸エステルを含む、上記（１）記載の組成物。
（４） 油脂が、中鎖脂肪酸トリグリセリドを５０重量％以上含むグリセリン脂肪酸エステルを含む、上記（１）記載の組成物。
（５） 油脂が、脂肪酸部分グリセリドを５０重量％以上含むグリセリン脂肪酸エステルを含む、上記（４）記載の組成物。
（６） 飲食用である上記（１）〜（５）のいずれか１項記載の組成物。
（７） 医薬用である上記（１）〜（５）のいずれか１項記載の組成物。
（８） 甘草疎水性抽出物を油脂と接触させることを特徴とする、発癌予防及び／または癌治療用組成物の製造方法。
（９） 甘草疎水性抽出物を油脂と接触させることにより得られる溶液を有効成分として投与することを特徴とする、発癌予防方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、健康食品や保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）などの飲食品、又は医薬品、医薬部外品、化粧品などに利用することができる癌予防または処置用の油脂含有組成物が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に、本発明の実施の形態を詳しく説明する。
１実施態様では、本発明は、甘草から有機溶媒により抽出された甘草疎水性抽出物を油脂と接触させて得られる溶液を含む、癌予防または処置用の油脂含有組成物を提供する。
【００１１】
ここで述べる油脂含有組成物とは、甘草疎水性抽出物を油脂に溶解したままの組成物、甘草疎水性抽出物を溶解した油脂から不溶性不純物を除去した組成物、さらにそれに油脂を添加した組成物、あるいは該組成物から疎水性抽出溶剤を除去した組成物を含むもので、また、これらの組成物を含有してなる飲食用、医薬用、医薬部外用等の組成物である。すなわち、甘草疎水性抽出物を油脂に溶解した組成物、及びこれに他の成分を混合してなる組成物、さらにはこれを加工してなる飲食用、医薬用、医薬部外用等の組成物のいずれも本発明の油脂含有組成物に含まれる。
油脂含有組成物中の甘草疎水性抽出物の量は特に制限されないが、油脂への溶解性の観点から、疎水性抽出溶媒を含まない量に換算して、上限は３０重量％以下が好ましく、甘草疎水性抽出物の有効性の観点から、下限は０．０１重量％以上が好ましい。より好ましくは、油脂含有組成物中０．１〜３０重量％であり、更に好ましくは１〜１０重量％である。
【００１２】
本発明に用いられる甘草材料は、マメ科カンゾウ属（Glycyrrhiza属）の植物であれば限定されず、グリキルリーザ・グラブラ（Glycyrrhiza. glabra）、Ｇ．ウラレンシス（G. uralensis）、Ｇ．インフラータ（G. inflata）などが挙げられる。中でも安全性の観点から、最も分布が広く食経験も豊かなＧ．グラブラ種の甘草が好ましい。
【００１３】
本発明において、甘草疎水性抽出物を得る方法は特に限定されないが、Ｇ．グラブラ種の甘草より得ることができる。該抽出物を甘草から得る場合、その方法は特に限定されないが、アルコール、酢酸エチル、アセトンなどの有機溶媒による抽出で得ることができるが、飲食用、医薬用、医薬部外用等に用いることからアルコール、とりわけエタノールによる抽出が好ましい。エタノールは食品、医薬品の製造に用いられるものであれば特に限定されないが、疎水性成分の抽出を目的とすることから、その含水率は３０％以下、好ましくは１０％以下、更に好ましくは５％以下である。
【００１４】
アルコールと甘草材料の重量比は、特に限定されないが、抽出効率の観点から、好ましくは０．５：１〜２０：１、より好ましくは１：１〜１０：１である。また、抽出温度及び抽出時間については特に限定されないが、抽出率を上げるために２０℃以上、好ましくは２０〜８０℃、更に好ましくは３０〜６０℃の条件で、抽出時間を１時間以上、好ましくは１〜１０時間、更に好ましくは１〜３時間行うことが好ましい。更に抽出回数を複数回行うことにより、甘草材料から疎水性成分を効率よく抽出することが可能であり、少なくとも２回以上抽出することが好ましい。
【００１５】
この様にして得られる抽出物は、そのまま使用してもよいが、さらにカラム処理、脱臭処理、脱色処理などにより粗精製又は精製したもの、さらにまたそれらから溶剤を除去した固形物を使用してもよい。また、該抽出物は、精製したものを使用することができるが、飲食品、医薬品、医薬部外品などとして不適当な不純物を含有しない限り粗精製したものを使用することもできる。
【００１６】
本発明で使用される油脂は、中鎖脂肪酸トリグリセリドを含むグリセリン脂肪酸エステルであって、好ましくは中鎖脂肪酸トリグリセリドを約５０重量％以上含むグリセリン脂肪酸エステル、より好ましくは中鎖脂肪酸トリグリセリドを約７０重量％以上含むグリセリン脂肪酸エステルである。ここでの中鎖脂肪酸トリグリセリドは、炭素原子数約６〜１２の脂肪酸を構成脂肪酸とし、その脂肪酸の構成比率は特に限定されないが、炭素原子数約８〜１０の脂肪酸の構成比率は約５０重量％以上が好ましく、約７０重量％以上がより好ましい。とりわけ、約２０℃での比重が約０．９４〜０．９６、約２０℃での粘度が約２３〜２８ｃＰの中鎖脂肪酸トリグリセリドがさらに好ましい。また、中鎖脂肪酸トリグリセリドは、天然由来のものやエステル交換などにより調製したものなど、いずれも使用することができる。
【００１７】
また、本発明で使用される油脂は、脂肪酸部分グリセリドを含むグリセリン脂肪酸エステルであって、好ましくは部分グリセリドを約５０重量％以上含むグリセリン脂肪酸エステル、より好ましくは部分グリセリドを約７０重量％以上含むグリセリン脂肪酸エステルである。ここでの部分グリセリドとは、ジグリセリド（１，２−ジアシルグリセロール、１，３−ジアシルグリセロール）又はモノグリセリド（１−モノアシルグリセロール、２−モノアシルグリセロール）であり、いずれを用いても良いし、両者が混合されたものを用いても良く、構成脂肪酸についても特に限定されないが、加工性の観点から不飽和脂肪酸および／または中鎖脂肪酸からなるジグリセリドが好ましい。また、部分グリセリドは、天然由来のものやエステル交換などにより調製したものなど、いずれも使用することができる。さらに、本発明で使用される油脂は、上記の中鎖脂肪酸トリグリセリドと部分グリセリドが混合されたものを用いることもできる。
【００１８】
本発明において、油脂含有組成物を得る方法は特に限定されないが、上記甘草疎水性抽出物を油脂に溶解することによって得ることが出来る。この場合、通常の撹拌又は混合などの操作により実施できるが、撹拌又は混合などの操作により該抽出物を油脂に溶解した後に、ろ過又は遠心分離などの操作により油脂に不溶な不純物を除去することが望ましい。或いは、ＷＯ０３／８４５５６記載の方法が好適である。例えば、甘草原料から直接油脂により抽出することも可能であるが、甘草疎水性抽出物を含む有機溶媒、好ましくは、エタノール溶液と油脂を混合した後、エタノールを除去することによって得ることが出来る。さらに、本発明では、これらの甘草疎水性抽出物と油脂の混合物に対してさらに油脂を添加して、甘草疎水性抽出物と油脂の組成比を調整しても良い。
【００１９】
一般に、甘草疎水性抽出物は、粉末状態において不安定であり、エタノールなどの有機溶媒へ溶解しても安定性は改善されない。しかし、該抽出物を本発明で使用する油脂に溶解することによりその安定性を改善することができる。また、該抽出物は難水溶性であることから、本発明で使用する油脂に溶解することによりその吸収性が向上することも期待できる。
【００２０】
本発明の組成物は飲食用、医薬用または美容用に許容される担体を含んでいてもよい。該医薬用担体は、例えば経口、経腸、経皮、皮下、または非経腸投与のため好適な任意の不活性、有機または無機材料であり得、限定されないが水、ゼラチン、アラビアガム、ラクトース、微結晶性セルロース、スターチ、ナトリウムスターチグリコレート、燐酸水素カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、およびコロイド性二酸化ケイ素、などであることができる。そのような組成物はまた、他の薬理学的活性な剤、および通常の添加物、例えば安定剤、湿潤剤、乳化剤、香味剤、および緩衝剤、などを含みうる。
本発明の癌予防または処置用の油脂含有組成物は、グラブレン、グラブリジン、グラブロール、３'−ヒドロキシ−４'−Ｏ−メチルグラブリジン、４'−Ｏ−メチルグラブリジン、ヒスパグラブリジンＢからなる群より選ばれた少なくとも１つの化合物を溶解している油脂を含有することを特徴としている。
【００２１】
本発明において、グラブレン、グラブリジン、グラブロール、３'−ヒドロキシ−４'−Ｏ−メチルグラブリジン、４'−Ｏ−メチルグラブリジン、ヒスパグラブリジンＢは、特に限定されないが、Ｇ．グラブラ種の甘草より得ることができる。該化合物を甘草から得る場合、その方法は特に限定されないが、アルコール、酢酸エチル、アセトンなどの有機溶媒による抽出で得られる甘草疎水性抽出物に該化合物は含まれ、抽出物のまま使用してもよいが、さらにカラム処理、脱臭処理、脱色処理などにより粗精製又は精製したものを使用してもよい。
【００２２】
勿論、該化合物は、その他植物等の天然由来、化学合成あるいは培養細胞などにより生合成した化合物のいずれであっても使用することができる。また、該化合物は、精製したものを使用することができるが、飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品などとして不適当な不純物を含有しない限り粗精製したものを使用することもできる。
【００２３】
該化合物の中でも、グラブリジンを含有し、かつグラブレン、グラブロール、３'−ヒドロキシ−４'−Ｏ−メチルグラブリジン、４'−Ｏ−メチルグラブリジン、ヒスパグラブリジンＢからなる群より選ばれた少なくとも１つの化合物を含有することが好ましい。さらに、グラブリジン及びグラブレンを含有し、かつグラブロール、３'−ヒドロキシ−４'−Ｏ−メチルグラブリジン、４'−Ｏ−メチルグラブリジン、ヒスパグラブリジンＢからなる群より選ばれた少なくとも１つの化合物を含有することがより好ましい。とりわけ、グラブレン、グラブリジン、グラブロール、３'−ヒドロキシ−４'−Ｏ−メチルグラブリジン、４'−Ｏ−メチルグラブリジン、ヒスパグラブリジンＢを全て含有していることが最も好ましい。
【００２４】
グラブリジン（glabridin）、３'−ヒドロキシ−４'−Ｏ−メチルグラブリジン（3'-hydroxyl-4'-O-methylglabridin）、４'−Ｏ−メチルグラブリジン（4'-O-methylglabridin）、ヒスパグラブリジンＢ（hyspaglabridin B）はイソフラバン（isoflavan）に分類されるフラボノイドであり、下記一般式（1）にて表される化合物である。
【化１】
〔グラブリジンはＲ１＝Ｈ、Ｒ２＝ＯＨ、３'−ヒドロキシ−４'−Ｏ−メチルグラブリジンはＲ１＝ＯＨ、Ｒ２＝ＯＣＨ3、４'−Ｏ−メチルグラブリジンはＲ１＝Ｈ、Ｒ２＝ＯＣＨ3、ヒスパグラブリジンＢはＲ１〜Ｒ２が−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（ＣＨ3）2−Ｏ−で六員環を構成する。〕
【００２５】
グラブレン（glabrene）は、イソフラブ−３−エン（isoflav-3-ene）に分類されるフラボノイドであり、下記一般式（２）で表される化合物である。
【化２】
【００２６】
グラブロール（glabrol）は、フラバノン（flavanone）に分類されるフラボノイドであり、下記一般式（３）で表される化合物である。
【化３】
【００２７】
グラブレン、グラブリジン、グラブロール、３'−ヒドロキシ−４'−Ｏ−メチルグラブリジン、４'−Ｏ−メチルグラブリジン、ヒスパグラブリジンＢは、甘草の中でもグリキリーザ・グラブラ（Glycyrrhiza glabra）に特異的に含まれる成分であり、他品種にはほとんど含まれていない。ただし、Ｇ．グラブラと他品種との雑種においては含まれる場合もある。該化合物は、ＯＤＳなどの逆相カラムを用いたＨＰＬＣ分析により、他のフラボノイド成分と分離して検出、定量することができる。
得られる油脂抽出物に所望により他の担体を添加して、油脂含有組成物を製造できる。
【００２８】
該化合物を含む抽出物、あるいは該化合物の粗精製品を用いる場合、該化合物以外の不純物が含まれているため、撹拌又は混合などの操作により該化合物を油脂に溶解した後に、ろ過又は遠心分離などの操作により油脂に不溶な不純物を除去することが望ましい。該化合物の精製品を用いる場合、容易に均一な溶液を得ることができる。また、該化合物を含む抽出物、あるいは該化合物の粗精製品を用いる場合、予めエタノールなどの有機溶媒に溶解し、その溶液と油脂を混合した後に、有機溶媒を留去することもできる。
【００２９】
本発明において、グラブレン、グラブリジン、グラブロール、３'−ヒドロキシ−４'−Ｏ−メチルグラブリジン、４'−Ｏ−メチルグラブリジン、ヒスパグラブリジンＢを油脂に溶解する方法は、特に限定されず、通常の撹拌又は混合などの操作により実施できる。
【００３０】
一般に、グラブレン、グラブリジン、グラブロール、３'−ヒドロキシ−４'−Ｏ−メチルグラブリジン、４'−Ｏ−メチルグラブリジン、ヒスパグラブリジンＢは、粉末状態において不安定であり、エタノールなどの有機溶媒へ溶解しても安定性は改善されない。しかし、該化合物を本発明で使用する油脂に溶解することによりその安定性を改善することができる。油脂は、前の実施態様と同様である。
【００３１】
本発明の癌予防または処置用の油脂含有組成物について、その形態は特に限定されず、健康食品や保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）などの飲食品、又は医薬品、医薬部外品、化粧品などに利用することができる。例えば、グラブレン、グラブリジン、グラブロール、３'−ヒドロキシ−４'−Ｏ−メチルグラブリジン、４'−Ｏ−メチルグラブリジン、ヒスパグラブリジンＢよりなる群より選ばれた少なくとも１つの化合物を溶解している油脂を、そのまま単独で調理用、ソフトカプセル製剤用、ローション用などとして利用することができる。また、油性の対象物と自由に混和することができるため、目的に応じて他の油脂と混合して物性を調整することが可能である。この場合、他の油脂は食品又は医薬品であることが好ましく、その種類及び使用量は、個々の製品に要求される物性や使用温度域などの諸条件を考慮して決定され、その種類及び使用量を調整することにより稠度や融点などの特性をコントロールすることができる。例えば、コーン油、ナタネ油、ハイエルシンナタネ油、大豆油、オリーブ油、紅花油、綿実油、ヒマワリ油、米糠油、パーム油、パーム核油などの植物油、魚油、牛脂、豚脂、乳脂、卵黄油などの動物油、又はこれらを原料として分別、水添、エステル交換などを行った油脂、あるいはこれらの混合油を使用することができる。
【００３２】
このようにして得られる油脂含有組成物は、サラダ油やフライ油などの液状油脂、マーガリンやショートニングなどの可塑性油脂としての利用や、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョンへ利用することができる。また、これらを原材料にして製造される飲食用の油脂含有組成物として、チューインガム、チョコレート、キャンディー、ゼリー、ビスケット、クラッカーなどの菓子類、アイスクリーム、氷菓などの冷菓類、乳飲料、清涼飲料、栄養ドリンク、美容ドリンクなどの飲料、うどん、中華麺、スパゲティー、即席麺などの麺類、蒲鉾、竹輪、半片などの練り製品、ドレッシング、マヨネーズ、ソースなどの調味料、パン、ハム、スープ、各種レトルト食品、各種冷凍食品などが例示され、ペットフードや家畜飼料などへも利用することができる。
【００３３】
さらに、栄養強化を目的として、ビタミンＡ，Ｄ，Ｅなどの各種ビタミン類を添加、併用してもよいし、呈味剤としての各種塩類、各種香料、乳関連物質、例えば、全脂粉乳、脱脂粉乳、発酵乳、乳脂肪などを添加、併用してもよい。また、上記以外の原材料として、通常の油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョンに使用される酸化防止剤、着色剤などを全て使用することができる。
【００３４】
本発明の発癌予防及び／又は抑制用の油脂含有組成物に含まれるグラブレン、グラブリジン、グラブロール、３'−ヒドロキシ−４'−Ｏ−メチルグラブリジン、４'−Ｏ−メチルグラブリジン、ヒスパグラブリジンＢが、その発癌予防及び／又は抑制の効果を発揮するためには、甘草抽出物として、成人一日一人当たり０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．４５〜３．６ｍｇ／ｋｇ体重を摂取できる量の該化合物を油脂含有組成物中に含んでいることが望ましい。尚、該化合物の含量は、ＯＤＳなどの逆相カラムを用いたＨＰＬＣ分析によって測定した。
【００３５】
本明細書にいう用語「発癌抑制」とは、癌細胞の発生を抑制することおよび一旦発生した癌細胞の増殖を抑制することを意味する。本発明の発癌抑制剤により抑制される腫瘍の種類は、限定されない。すなわち、上皮性腫瘍、非上皮性腫瘍さらにはその良性、悪性を問わない。例えば、体内の各種臓器である、胃、腸、肺、肝臓、腎臓、膵臓、胆嚢、子宮、卵巣、精巣、前立腺、あるいは脳などに発生する上皮性腫瘍および非上皮性腫瘍、神経系腫瘍、骨腫瘍、リンパ系腫瘍などの腫瘍であり得る。
【００３６】
本発明の発癌抑制剤を投与する場合あるいは飲食品として摂取する場合の例としては、遺伝性癌の予防、環境あるいは生活習慣に起因する癌の予防、あるいは腫瘍摘出手術後の再発および癌転移の予防、あるいは癌治療の１つとしての投与が挙げられる。より具体的には、遺伝子診断により、将来発癌する可能性が高いと認められる者が、発症前に本発明の癌抑制剤を予防的に摂取する場合、喫煙習慣のある者や放射性物質に暴露される職業に従事する者が予防的に摂取する場合、または化学療法としての抗癌剤投与に代わってあるいはそれと並行して投与する場合等がある。
【実施例】
【００３７】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞
【００３８】
アフガン産甘草（Ｇ．グラブラ）９．８５ｋｇからエタノール抽出（４９．２５Ｌ、４５℃、２時間、２回抽出）、次いで濃縮により濃縮液４．４Ｌを得た。そのうち３Ｌを更に濃縮して、活性炭処理、濃縮により甘草疎水性抽出物を含有したエタノール溶液８１１．２ｇを得た。
上記のエタノール溶液６２９．２ｇ（甘草疎水性抽出物１２５．８ｇを含有する）と中鎖脂肪酸トリグリセリド（ＭＣＴ）であるアクターＭ−２（理研ビタミン（株）：脂肪酸組成はＣ８：Ｃ１０＝９９：１）１８７．６ｇを混合し、約８０℃に保温しながら約１時間撹拌した後、減圧濃縮によりエタノールを除去した。吸引ろ過により不溶分を分離し、ろ別後のろ液にＭＣＴ４５．７ｇを更に添加して、ＭＣＴ溶液２９７．０ｇを得た。得られたＭＣＴ溶液１ｇをＨＰＬＣ用メタノールに溶解し、全量を１００ｍｌとした。この溶液を試料として下記の条件にてＨＰＬＣ分析を行った結果、ＭＣＴ溶液１ｇあたりにグラブレン、グラブリジン、グラブロール、４'−Ｏ−メチルグラブリジンがそれぞれ６．６ｍｇ、３０．８ｍｇ、１２．６ｍｇ、３．７ｍｇ含まれていた。
グラブレン、グラブリジン、グラブロール、４'−Ｏ−メチルグラブリジンを含む甘草抽出物は、ＭＣＴ溶液の約３０重量％であった。
【００３９】
ＨＰＬＣ分析条件
分析カラムは、Ｊ’ｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ−Ｈ８０，４．６×２５０ｍｍ（ワイエムシィ）をカラム温度４０℃にて使用した。移動相は、２０ｍＭリン酸水溶液に対してアセトニトリルの比率を分析開始から２０ｍｉｎまで３５％で一定とし、２０ｍｉｎ以降７５ｍｉｎ後に７０％となるように一定の比率で上昇させ、７５ｍｉｎから８０ｍｉｎまで８０％で一定とするグラジエント条件で、流速１ｍｌ／ｍｉｎとした。注入量は２０μｌとし、検出波長は２５４ｎｍとした。各化合物の保持時間は、グラブレンが４０．０ｍｉｎ、グラブリジンが５０．２ｍｉｎ、グラブロールが５８．３ｍｉｎ、４'−Ｏ−メチルグラブリジンが６６．８ｍｉｎであった。
＜実施例２＞
【００４０】
発癌抑制作用
実施例１のＭＣＴ溶液の発癌への影響を調べるため中期肝発癌性試験法（伊東テスト）を用いた検索を実施した。本試験法は、げっ歯類を用いた二段階発癌モデルの１つであり、ラット肝臓を標的としたものである。本試験法を用いて既に３１３以上の化学物質が検索されており、発癌物質あるいは発癌抑制物質を検索する上で、信頼性の高い有用な検索法とされている。よって日・米・EU三極医薬品規制ハーモナイゼーション国際会議（ＩＣＨ）においても従来の長期癌原性試験の代替試験として認められている。さらに、本試験は「医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施の基準に関する省令」（平成９年３月２６日厚生省令第２１号）に基づくＧＬＰ（Good Laboratory Practice）基準に準拠して実施しており、試験結果の信頼性は充分に高い。
６週齢のＦ３４４系雄ラット１００匹からコンピューターを用いた乱塊法により平均体重に統計学的有意差が生じないように７群（第１−５群：１５匹、第６，７群：９匹）に群分けした。肝発癌に対するイニシエーション処置のため、ラットにジエチルニトロサミン (DEN) を２００ mg/kgの用量で１回腹腔内に投与し、その２週間後から、被験物質であるＭＣＴ溶液を０（対照群）、１５０、３００および６００ mg/kgの投与量で１日１回、７回/週の頻度で６週間強制経口投与した（第１−４群）。試験に用いたＭＣＴ溶液の１５０、３００および６００ mg/kgは、有効成分である甘草抽出物に換算すると４５、９０および１８０mg/kg体重に相当する。また、フェノバルビタールナトリウム塩(Ｓ．ＰＢ)を陽性対照群として５００ ppmの濃度で混餌投与した（第５群）。なお、ＤＥＮ無処置の対照群および被験物質６００mg/kg群も設けた（第６，７群）。実験第３週経過時（被験物質投与開始１週後）に全動物について部分肝切除術を施行し、肝臓の病変を増幅させた。実験開始８週間経過後（被験物質投与期間終了後）に全てのラットを屠殺剖検し、肝臓を摘出した。それぞれの肝臓から３片の組織を切りだし１０％緩衝ホルマリン液にて固定後、パラフィンブロックを作製、薄切して組織標本を作製した。得られたラット肝臓の組織標本について、肝臓の前癌病変の指標である胎盤型グルタチオンＳ−トランスフェラ−ゼ（GST-P）の発現をアビジン−ビオチン複合体法による免疫組織化学染色を用いて調べた。肝臓切片の面積および直径０．２mm以上のGST-P陽性細胞巣の個数および面積を、病理標本画像解析装置IPAP-WIN（住化テクノサービス株式会社）を用いて計測した後、肝臓切片１cm2当たりの個数および面積を算出し、定量的解析を行った。また、第６および７群の各３例については免疫組織化学的検査に供した肝臓の残りから１部を採取し、４％グルタールアルデヒドで固定後、電子顕微鏡検査を実施した。統計学的解析は、第１群と第２〜４群間の体重、器官重量および肝臓の免疫組織化学的検査における平均値の差の検定については、５％有意水準でBertlett法による等分散検定を行った。等分散の場合はパラメトリックのDunnett法による片側検定を行い、不等分散の場合はノンパラメトリックのSteel法による片側検定を行った。なお、DEN処置の第１群（対照群）と第５群（S.PB群）間およびDEN無処置の第６群（対照群）と第７群（６００ mg/kg群）間の平均値の差の検定についてはＦ検定を用い、等分散である場合はstudentのt検定（片側）を用い、等分散でない場合にはWelch検定（片側）を用いた。肝臓重量およびGST-P陽性細胞巣の定量的解析の結果を表１および表２に示す。
投与期間中、被験物質投与に起因する一般状態の変化、死亡動物、摂餌量および体重変化を認めなかった。摂水量では、DEN処置の３００および６００ mg/kg群（第３および４群）およびDEN無処置の６００ mg/kg群（第７群）において持続的な高値傾向を示したことから被験物質投与の影響と考えられた。肝臓重量では、DEN処置の３００および６００ mg/kg群（第３および４群）で絶対および相対重量の有意な高値を認め、１５０ mg/kg群（第２群）では相対重量の有意な高値を認めた。さらにDEN無処置の６００mg/kg群（第７群）においても、絶対および相対重量の有意な高値を認めたことから被験物質投与の影響と考えられたが、その程度は軽度であり、光学顕微鏡レベルでは組織学的に差異は認められなかった。さらに、DEN無処置の６００ mg/kg群（第７群）で実施した肝臓の電子顕微鏡学的検査でも何らの変化も認めなかった。よって肝臓重量の増加は毒性とは判断されなかった。肝臓のGST-P陽性細胞巣の計測では、DEN処置の６００ mg/kg群（第４群）における単位面積当りの数が対照群（第１群）と比較して有意な低値を示し、単位面積当りの面積については１５０および６００ mg/kg群（第２および４群）で有意な低値を示した。
一方、陽性対照のS.PB群（第５群）のGST-P陽性細胞巣の計測では、単位面積当りの個数および面積ともに明らかな高値が認められ、本試験の妥当性が証明された。なお、肝臓においてペルオキシソーム増殖性を示す化合物は本試験系において偽陰性あるいは偽抑制作用を示すことが知られているが、上述したようにDEN無処置の６００ mg/kg群（第７群）で実施した肝臓の電子顕微鏡学的検査では、肝細胞内のペルオキシソーム増殖性を認めなかったことより、本試験結果における偽陰性および偽抑制作用の可能性が否定された。
以上、ＭＣＴ溶液を１５０、３００および６００ mg/kgの用量で強制経口投与した結果、いずれの用量においてもGST-P陽性細胞巣の個数および面積に増加を認めず、６００mg/kgでは逆に減少が認められた。よってＭＣＴ溶液はラット肝臓において発癌促進作用を有さず、発癌抑制作用を有することが明らかとなった。
ラットに比べてヒトの感受性は約５０〜１００倍高いことが知られている。したがって、ＭＣＴ溶液１５０〜６００ mg/kg（すなわち、有効成分である甘草抽出物換算で４５〜１８０mg/kg）の用量でラットが発癌抑制作用を有するということは、ヒトでは、甘草抽出物０．４５〜３．６mg/kg用量で発癌抑制作用を有すると推定される。
【表１】
【表２】
＜実施例３＞
【００４１】
ソフトカプセル剤の製造
実施例１のＭＣＴ溶液を、ロータリー式ソフトカプセル製造装置を用いてゼラチン皮膜に圧入し、内容量３５０ｍｇのソフトカプセル剤を得た。
＜実施例４＞
【００４２】
マーガリンの製造
硬化綿実油（商品名：スノーライト、株式会社カネカ）８０重量部、実施例１のＭＣＴ溶液２０重量部、無塩バター（四つ葉乳業（株））１０重量部に、グリセリンモノ脂肪酸エステル（商品名：エマルジーＭＳ、理研ビタミン（株））０．２重量部、レシチン０．２重量部を添加し、６０℃に加熱溶解し油相を調製した。
調製された油相８４．９重量部に撹拌しながら水１５．１重量部を添加し、２０分間乳化を行った後、コンビネーターで冷却捏和してマーガリンを作製した。
＜実施例５＞
【００４３】
濃縮乳の製造
実施例１のＭＣＴ溶液１０重量部を７０℃に加温後、レシチン０．１重量部及びポリグリセリン脂肪酸エステル０．１重量部を順次溶解して油相を作製した。
脱脂粉乳２５重量部、グリセリン脂肪酸エステル０．１重量部、ショ糖脂肪酸エステル０．１重量部を６０℃の水６４．６重量部に溶解して水相を調製した。
調製した水相と油相を予備乳化した後、ＵＨＴ殺菌機にて１４５℃で４秒間殺菌した。次いで真空冷却した後、均質化機により１０ＭＰａの圧力で均質化し、更に１０℃までプレート冷却して加工用濃縮乳を得た。
＜実施例６＞
【００４４】
マヨネーズの製造
醸造酢１０重量部、食塩１重量部、砂糖０．６重量部、マスタード粉末０．２重量部、グルタミン酸ナトリウム０．２重量部を混合器の中に加え、１５〜２０℃下で攪拌・混合し水相を調製した。その後、米白絞油６８重量部、実施例１のＭＣＴ溶液１０重量部に卵黄１０重量部を加え、攪拌乳化して得た乳化液（１０〜１５℃）を少しずつ加えながら１５〜２０℃下で攪拌し、予備乳化した。次いで、コロイドミルを用いて仕上げ乳化を行いマヨネーズを得た。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
甘草疎水性抽出物を油脂と接触させることにより得られる溶液を含む発癌抑制用油脂含有組成物。
【請求項２】
甘草疎水性抽出物として、成人一人一日当たり０．４５〜３．６ｍｇ／ｋｇ体重を摂取できる量である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
油脂が、中鎖脂肪酸トリグリセリド及び／または脂肪酸部分グリセリドを含むグリセリン脂肪酸エステルを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
油脂が、中鎖脂肪酸トリグリセリドを５０重量％以上含むグリセリン脂肪酸エステルを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
油脂が、脂肪酸部分グリセリドを５０重量％以上含むグリセリン脂肪酸エステルを含む、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
飲食用である請求項１〜５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
医薬用である請求項１〜５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項８】
甘草疎水性抽出物を油脂と接触させることを特徴とする、発癌予防及び／または癌治療用組成物の製造方法。
【請求項９】
甘草疎水性抽出物を油脂と接触させることにより得られる溶液を有効成分として投与することを特徴とする、発癌予防方法。
【請求項１】
甘草疎水性抽出物を油脂と接触させることにより得られる溶液を含む発癌抑制用油脂含有組成物。
【請求項２】
甘草疎水性抽出物として、成人一人一日当たり０．４５〜３．６ｍｇ／ｋｇ体重を摂取できる量である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
油脂が、中鎖脂肪酸トリグリセリド及び／または脂肪酸部分グリセリドを含むグリセリン脂肪酸エステルを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
油脂が、中鎖脂肪酸トリグリセリドを５０重量％以上含むグリセリン脂肪酸エステルを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
油脂が、脂肪酸部分グリセリドを５０重量％以上含むグリセリン脂肪酸エステルを含む、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
飲食用である請求項１〜５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
医薬用である請求項１〜５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項８】
甘草疎水性抽出物を油脂と接触させることを特徴とする、発癌予防及び／または癌治療用組成物の製造方法。
【請求項９】
甘草疎水性抽出物を油脂と接触させることにより得られる溶液を有効成分として投与することを特徴とする、発癌予防方法。
【公開番号】特開２００６−３０６８５５（Ｐ２００６−３０６８５５Ａ）
【公開日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−９２６８３（Ｐ２００６−９２６８３）
【出願日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
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