皮膚表面に存在するグルコース測定方法
【課題】被験者への負荷を軽減し、かつ簡便で手軽に実施することができる皮膚表面に存在するグルコース測定方法を提供する。
【解決手段】指を洗浄後、よく拭き取り、所定の時間静置してためた後、界面活性剤を含んだ水溶液により発生させた気泡を下方に向いた指の汗成分を有する皮膚表面へ塗布し、次いで、前記気泡及びこの気泡から生じた水分を前記皮膚表面より回収し、この中に含まれる糖分を測定する。
【解決手段】指を洗浄後、よく拭き取り、所定の時間静置してためた後、界面活性剤を含んだ水溶液により発生させた気泡を下方に向いた指の汗成分を有する皮膚表面へ塗布し、次いで、前記気泡及びこの気泡から生じた水分を前記皮膚表面より回収し、この中に含まれる糖分を測定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病疾患やその予備群の人たちの自己管理のための在宅医療で使用可能な医療器具、医療現場で用いることのできる簡易グルコース測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
（１）血液中のグルコース値（血糖値）は、糖尿病疾患においては非常に重要な指標として用いられており、血糖値医療現場で、採血により求められる。また糖尿病疾患の患者は自己管理のために簡易型のグルコース測定器を用いている。しかしながら、この従来のグルコース測定器は試料として指からの血液を用いているが、採血のために指を針で刺すことは苦痛を伴い、また感染症に感染する危険がある。
【０００３】
（２）一方、皮下の間質液を、皮膚に電圧印加して発生させた電気浸透流により採集（イントフォレシスと呼ばれる）し、ついでグルコースセンサーにて測定する方法がある。しかしながら、間質液を取り出す際に皮膚に電流を通じるので、火傷を負う可能性がある。
【０００４】
（３）また、口内における歯根と歯肉との間の液を採集して用いる方法が提案されているが、採集が困難であり、また口内の唾液が混入する可能性があり、まだ実用化されていない。
【特許文献１】なし
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記したように、従来の技術はいずれも問題がある。すなわち、血液採集に関しては、苦痛を伴いかつ感染の危険がある。皮膚への電圧印加の方法は火傷の危険がある。また、口内の歯根液からの採集に関しては被験者への負荷が大きい。
【０００６】
グルコースの測定のための試料サンプリングは、非侵襲で、かつ、非観血に行え、またサンプリングに際しての被験者への生理的負荷が少ないことが望ましい。
【０００７】
さらに、日常的にサンプリングが行え、手軽に在宅医療の方法として用いることができるグルコースサンプリング方法ならびに測定方法を実施することが望ましい。
【０００８】
そこで、本発明は、上記状況に鑑みて、被験者への負荷を軽減し、かつ簡便で手軽に実施することができる皮膚表面に存在するグルコース測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記目的を達成するために、
〔１〕皮膚表面に存在するグルコース測定方法において、指を洗浄後、よく拭き取り、所定の時間静置してためた後、界面活性剤を含んだ水溶液により発生させた気泡を、下方に向いた指の汗成分を有する皮膚表面へ塗布し、次いで、前記気泡及びこの気泡から生じた水分を前記皮膚表面より回収し、この中に含まれる糖分を測定することを特徴とする。
【００１０】
〔２〕上記〔１〕記載の皮膚表面に存在するグルコース測定方法において、前記指に付着した水滴をスプーンを用いて容器中へ掻き落とすことを特徴とする。
【００１１】
〔３〕上記〔１〕記載の皮膚表面に存在するグルコース測定方法において、前記指に付着した水滴をゴム輪を指の根元から指先まで滑らせることによって容器中へ回収することを特徴とする。
【００１２】
〔４〕上記〔１〕記載の皮膚表面に存在するグルコース測定方法において、前記指に付着した水滴を袋状になった容器を指全体にかぶせそれを指先まで滑らせることにより容器に回収することを特徴とする。
【００１３】
〔５〕上記〔１〕記載の皮膚表面に存在するグルコース測定方法において、前記指に付着した水滴を綿状の繊維の吸い取り材で集めた後、この吸い取り材を遠心分離にかけ、糖分を含んだ水分を回収することを特徴とする。
【００１４】
〔６〕上記〔１〕記載の皮膚表面に存在するグルコース測定方法において、前記回収した水分を直接に高感度グルコースセンサーにより測定することを特徴とする。
【００１５】
〔７〕上記〔１〕記載の皮膚表面に存在するグルコース測定方法において、前記回収した水分を固体抽出剤に入れグルコース成分のみを回収し、次いで高感度グルコースセンサーにより測定することを特徴とする。
【００１６】
〔８〕上記〔１〕記載の皮膚表面に存在するグルコース測定方法において、前記所定の時間静置して汗をためた後、小型噴霧器を用いて、指全体に１０秒間５％エタノール水溶液を噴霧し、指に付着した水滴を容器に回収することを特徴とする。
【００１７】
本発明者らは、汗やその他の染み出した液に伴って皮膚上にグルコースが出てくることを見出した。そこで、皮膚上のグルコースを集めて測定したところ、この得られた測定値は血中グルコースの値と相関しており、皮膚上のグルコース値により簡易的な診断に用いることができることが分かった。
【００１８】
本発明は、グルコースを皮膚中から効率よく集めるとともに、この捕集液を分析し、グルコースの測定を行うことができる。
【００１９】
なお、本発明において、皮膚表面には、正確にいうと、汗からの成分、皮膚細胞からの成分、皮膚組織からの成分があり、いずれも、本発明の対象に含まれるものである。
【００２０】
また、試料の採集部位は、被験者の指にかきらず、腕、足、脚、手、その他の体表面であってもよい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、以下のような効果を奏することができる。
【００２２】
（Ａ）簡易にグルコース測定を行うことが可能になる。
【００２３】
（Ｂ）非侵襲・非観血での測定法であり、非常に用いやすい。また、容易に在宅医療に用いることができる。
【００２４】
（Ｃ）糖尿病のシステム管理にも用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明の皮膚表面に存在するグルコース測定方法は、指を洗浄後、よく拭き取り、所定の時間静置をしてためた後、界面活性剤を含んだ水溶液により発生させた気泡を、下方に向いた指の汗成分を有する皮膚表面へ塗布し、次いで、前記気泡及びこの気泡から生じた水分を前記皮膚表面より回収し、この中に含まれる糖分を測定する。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら詳細に説明する。
【００２７】
図１は本発明の実施例を示す皮膚表面に存在するグルコース測定方法の説明図である。
【００２８】
この図において、１は被験者の手、２はその人指し指、４は５％エタノール水溶液３の小型噴霧器、５は人指し指２に付着した後、容器６に回収された水滴である。
【００２９】
この糖測定方法をより詳細に説明すると、人指し指２を洗浄後、キムワイプでよく拭き取る。所定の時間静置し、汗をためた後、霧状に水溶液を塗布できる小型噴霧器（ＩＮＨＡＬＥＲ，松下電工）４を用いて、人指し指２の全体に１０秒間５％エタノール水溶液３を噴霧する。人指し指２に付着した水滴５を容器６に回収し、サンプルとして使用し、次いで、液体クロマトグラフィー及び簡易型グルコースセンサーにより糖分を測定する。この糖分は血中濃度に比例するので、糖モニターとして使用できる。
【００３０】
次に、指皮膚表面に付着した水分を回収するための方法と、回収補助器具について説明する。
【００３１】
図２はその指皮膚表面に付着した水分を回収するための方法（その１）の説明図である。
【００３２】
ここでは、図２（ａ）及び図２（ｂ）に示すように、指１１に付着した水滴１２を小さなスプーン１３（水を掻き落とすための工夫を施している）を用いて、１．２ｍｌの容器（バイアル）１４中へ掻き落とす。
【００３３】
図３はその指皮膚表面に付着した水分を回収するための方法（その２）の説明図である。
【００３４】
ここでは、図３（ａ）及び図３（ｂ）に示すように、ゴム輪２３を指の根元から指先まで滑らせることによって、指２１に付着した水滴２２を１．２ｍｌの容器（バイアル）２４中に回収する。
【００３５】
このゴム輪２３は常に一定の力を指表面に付与できる付属装置（図示なし）を用いることができる。
【００３６】
なお、このようなゴムに代えて、輪状の形態を有するプラスチックスや金属ワイヤーを用いるようにしてもよい。
【００３７】
図４はその指皮膚表面に付着した水分を回収するための方法（その３）の説明図である。
【００３８】
ここでは、指３１に水滴３２を噴霧後、袋状になった容器３３を指全体にかぶせそれを指先まで滑らせることにより行う。ここで、３２′は回収された水滴である。
【００３９】
さらに、図示しないが、水を綿状の繊維の吸い取り材で集めた後、次いで吸い取り材を遠心分離にかけ、糖分を含んだ水分を回収する方法も採用できる。
【００４０】
また、水分を吸引により補集する容器を用いるようにしてもよい。
【００４１】
次に、上記した方法により回収した水分中のグルコースの測定方法について説明する。
【００４２】
（１）上記した方法により回収した水分中のグルコースを、直接に高感度グルコースセンサーにより測定する。
【００４３】
（２）上記した方法により回収した水滴を、固体抽出剤に入れ、グルコース成分のみを回収し、次いで高感度グルコースセンサーにより測定する。
【００４４】
次に、皮膚表面のグルコース量を用いた糖尿病疾患への管理システムについて説明する。
【００４５】
まず、実験装置としてのＨＰＬＣ装置について説明する。
【００４６】
図５は本発明の実施例を示す皮膚表面に存在するグルコース測定装置の模式図である。
【００４７】
この図において、４１はＰＣ（パーソナルコンピュータ）、４２はダイオードアレー検出器、４３は貯槽（リザーバー）、４４は溶離剤（ｅｌｕｅｎｔ）、４５は噴霧器、４６はカラム、４７はポンプである。
【００４８】
本発明では、検出器４２としてＤｉｏｄｅ ａｒｒａｙ ｄｅｔｅｃｏｒ ３５０ＲＳ（大塚電子株式会社）、ポンプ４７としてＬＣ−９Ａ（島津製作所）、カラム４６にはＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ18 ２．０ｍｍ ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ（ＳＨＩＳＥＩＤＯ）を用いた。
【００４９】
ポンプ４７は０．２００ｍｌ／ｍｉｎの流量で定流量送液を行った。検出器４２では２４５ｎｍでのＵＶ吸光度法によって検出を行った。
【００５０】
次に、誘導体化法について説明する。
【００５１】
炭水化物の分析において、ＨＰＬＣ装置は重要な役割を果たしているが、高感度検出は困難であり、それを解決するために様々な誘導体化法が存在する。
【００５２】
ポストカラム誘導体化は、サンプルを直接注入できる、といった利点があるが誘導体化の収率が低いため高感度な検出は不可能であった。
【００５３】
金またはニッケル電極を用いた電気化学的検出方法は高感度な検出が可能である。
【００５４】
ｐ−ブロモベンゼン誘導体化、ｐ−ニトロベンゼン誘導体化などのプレカラム誘導体化は誘導体の高い収率が得られる。しかし、定量的、且つ立体異性体を持たないような誘導体化は難しかった。
【００５５】
それに対して、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン（ＰＭＰ）による誘導体化では、ＰＭＰは還元糖とほぼ定量的に反応し、強いＵＶ吸収をもつ誘導体を生成する。ＰＭＰは還元糖と２：１の化合物を作り、またその化合物は立体異性体を持たない。
【００５６】
これらの利点から、本発明ではＰＭＰ誘導体化法を採用した。
【００５７】
一般的な還元糖と１−フェニル−３メチル−５−ピラゾロン（ＰＭＰ）との反応式を以下に示す。
【００５８】
【化１】
次に、誘導体化の操作について説明する。
【００５９】
誘導体化の操作は以下のようにして行った。
【００６０】
（１）５％エタノール水にグルコースを溶解した溶液を減圧乾固する。
【００６１】
（２）水酸化ナトリウム水溶液とＰＭＰメタノール溶液を加える。
【００６２】
（３）７０℃で１時間半反応させる
（４）室温まで冷却後塩酸で中和させる。
【００６３】
（５）反応液を減圧乾固する。
【００６４】
（６）残渣を蒸留水とクロロホルムで溶解し抽出する。
【００６５】
（７）水層を減圧乾固する。
【００６６】
（８）残渣を溶離液に溶解したものを、液体クロマトグラフィー用サンプルとする。
【００６７】
１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン（ＰＭＰ）による誘導体化によって得られる誘導体は、極大吸収波長が２４５ｎｍとなる。汗中にはグルコース以外の還元糖も存在するため、同定はスペクトル以外に溶出時間及び添加法によって行った。
【００６８】
次に、他の測定方法について説明する。
【００６９】
皮膚から回収した水溶液を濃縮し、市販のグルコースセンサーにて測定した。この際その読みを高感度の測定器を用いて増幅し定量的に読み出した。
【００７０】
図１に示したように汗成分を含む水分を採取し、図５に示す測定装置によって測定する。すなわち、採取した水分は、減圧乾固後、０．３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液３０μｌと０．５Ｍ １−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン（ＰＭＰ）メタノール溶液３０μｌを加え、７０℃で１時間半反応させた後、１Ｎ塩酸を当量加え中和し、減圧乾固させた。その残渣を蒸留水とクロロホルム各２００μｌで溶解し、溶媒抽出を行った。その水層を１００μｌ取り出し、減圧乾固させ、溶離液（アセトニトリル／０．１Ｍリン酸緩衝液＝１８．５／８１．５）３０μ１を加えたものをサンプルとし測定を行った。
（１）糖摂取による汗中グルコース濃度の変化
糖摂取負荷試験の実験においては、経口糖認容力試験用糖質液トレーランＧ７５（清水製薬株式会社製）を使用した。
（１−１）試験用試薬
トレーランＧ７５は、ブドウ糖の代わりにデンプン部分加水分解物を用い、服用しやすくした糖質液で、糖尿病診断時の糖負荷試験に用いられる。トレーランＧ７５とブドウ糖との負荷後の血糖値及び血中インスリン値の推移には有意な差がないことが認められている。
【００７１】
また、トレーランＧ７５は、１瓶（２２５ｍｌ）中にデンプン部分加水分解物１００．０ｇ（ブドウ糖に換算して７５．０ｇ）を含有する。
（１−２）糖摂取の際の負荷条件
被験者は前日の午後９時以降、試験直前まで絶食を行い午前中から実験を行った。実験中はトレーランＧ７５以外のものの摂取は行わなかった。また試験前日の９時以降から試験終了後まで飲酒、喫煙は行わないようにした。
（１−３）糖摂取前後での汗の採取法
トレーランＧ７５摂取前に３回、摂取後に１２回の合計１５回のサンプリングを１５分毎に行った。汗の採取は人指し指を洗浄後５分間静置し、５％エタノール水を１０秒噴霧した。
【００７２】
回収法は、指に付着した水滴を小さなスプーンを用いて１．２ｍｌの容器（バイアル）中へ掻き落とす方法を用いて行った。
【００７３】
水滴採取後、減圧乾燥をしたのち誘導体化を行った。
（１−４）血糖値の測定
糖摂取の際の血糖値は、水滴を採取する人差し指以外の指先から少量の血を採取し、簡易型血糖センサ（グルテストＥII−３ 三和化学研究所）を用いて測定を行った。
【００７４】
血糖値の測定は水滴採取とほぼ同時に行った。
測定条件：ここでは、汗サンプルの液体クロマトグラフによる測定条件を示す。
【００７５】
検出器：Ｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ ｄｅｔｅｃｔｏｒ ３５０ＲＳ（大塚電子株式会社）
ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所）
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ18 ２．０ｍｍ ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ（ＳＨＩＳＥＩＤＯ）
溶離液：アセトニトリル／０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）＝１８／８２
流量：０．２００ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：２４５ｎｍ
サンプル注入量：１０μｌ
（１−５）結果
被験者２人に糖摂取実験を行った際の汗中グルコース絶対量及び血糖値の時間変化の代表例を図６〜図７に示す。図６、図７はそれぞれ異なる被験者である。図６のＡ及び図７のＣは血糖値の時間変化を示し、図６のＢ及び図７のＤは汗中のグルコース絶対量の時間変化を示す。
【００７６】
図６及び図７では、横軸に時間（分）、左縦軸に汗中グルコース絶対量（ｐｍｏｌ）、右縦軸に血糖値（ｍｇ／ｄｌ）を表しており、◆は汗中グルコース絶対量、■は血糖値を示している。
【００７７】
図８は本発明の実施例を示すグルコース測定用試料回収装置の模式図である。
【００７８】
この図において、５１は試料採取箱、５２は加熱装置、５３は霧吹き装置、５４は加熱装置５２及び霧吹き装置５３を駆動させる光電スイッチ、５５は鍔付き回収具、５６はその鍔付き回収具５５の装着空間、５７はその装着空間５６の開閉蓋、５８はその開閉蓋の枢着部、５９は被験者の指である。
【００７９】
試料採取箱５１内には加熱装置５２が配置されており、試料採取箱５１内は使用中は温度を高くしておき、被験者の指５９からの発汗を促すようにしている。そこで、被験者の指５９が試料採取箱５１に挿入されると、これを光電スイッチ（タイマー付き）５４が検出し、所定のタイミング（指５９からの発汗時間）を得た後に霧吹き装置５３を動作させて汗成分を含む水分を鍔付き回収具５５で受けて回収する。その回収された汗成分を含む水分は鍔付き回収具５５ごと装着空間５６から取り出して、グルコース測定用試料とすることができる。新たな被験者のグルコース測定を行う場合には、新たな鍔付き回収具を装着して、上記した手順でグルコース測定用試料を得ることができる。
【００８０】
また、汗成分を含む水分の指表面からの回収は、指表面に接する輪状の回収具６１を駆動装置（図示せず）により指の上方から下方へ駆動することにより掻き集めるようにすることができる。
【００８１】
このように、本発明のグルコース測定用試料回収装置は、霧吹きの過程と指の皮膚上の水溶液の回収過程とを連続的に行うことができる。
【００８２】
次に、汗中のグルコース濃度の測定を実施した。
【００８３】
指あるいは腕の皮膚を清浄化した後、その部分を二つの出入口を備えた容器で覆い、乾燥空気を導き、容器より出てくる空気を、発汗計（Ｋｅｎｚ Ｐｅｒｓｐｉｒｏ ２１０、スズケン）に導き、前記皮膚よりグルコース成分を回収し、定量した。この発汗量とグルコース量との関係から発汗中のグルコース濃度を求めた。このグルコース濃度と血糖値の相関を調べたところ、良い相関が得られた。
【００８４】
別の上記した実施例では、グルコース絶対量と血糖の関係を見出しているが、発汗量を測定することにより、汗中のグルコース濃度と血糖値との相関を求めることが可能である。
【００８５】
また、界面活性剤を含んだ水溶液により発生させた気泡を汗成分を有する皮膚上に塗布し、次いで、前記気泡及びこの気泡から生じた水分を皮膚より回収し、この中に含まれる糖分を測定することができる。
【００８６】
更に、本発明は、皮膚上の有機化合物及び又は無期化合物の定量にも応用できる。
【００８７】
なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づいて種々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明の皮膚表面に存在するグルコース測定方法は、被験者への負荷を軽減し、かつ簡便で手軽に実施することができるグルコース測定ツールとして利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】本発明の実施例を示す皮膚表面に存在するグルコース測定方法の説明図である。
【図２】本発明の実施例を示す指皮膚表面に付着した水分を回収するための方法（その１）の説明図である。
【図３】本発明の実施例を示す指皮膚表面に付着した水分を回収するための方法（その２）の説明図である。
【図４】本発明の実施例を示す指皮膚表面に付着した水分を回収するための方法（その３）の説明図である。
【図５】本発明の実施例を示す皮膚表面に存在するグルコース測定装置の模式図である。
【図６】被験者２人に糖摂取実験を行った際の汗中グルコース濃度及び血糖値の変化の代表例を示す図（その１）である。
【図７】被験者２人に糖摂取実験を行った際の汗中グルコース濃度及び血糖値の変化の代表例を示す図（その２）である。
【図８】本発明の実施例を示すグルコース測定用試料回収装置の模式図である。
【符号の説明】
【００９０】
１ 被験者の手
２ 人指し指
３ ５％エタノール水溶液
４ 小型噴霧器
５，１２，２２，３２ 水滴
６，１４，２４，３３ 容器
１１，２１，３１ 指
１３ スプーン
２３ ゴム輪
３２′ 回収された水滴
４１ ＰＣ（パーソナルコンピュータ）
４２ ダイオードアレー検出器
４３ 貯槽（リザーバー）
４４ 溶離剤（ｅｌｕｅｎｔ）
４５ 噴霧器
４６ カラム
４７ ポンプ
５１ 試料採取箱
５２ 加熱装置
５３ 霧吹き装置
５４ 光電スイッチ
５５ 鍔付き回収具
５６ 鍔付き回収具の装着空間
５７ 開閉蓋
５８ 開閉蓋の枢着部
５９ 被験者の指
６１ 輪状の回収具
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病疾患やその予備群の人たちの自己管理のための在宅医療で使用可能な医療器具、医療現場で用いることのできる簡易グルコース測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
（１）血液中のグルコース値（血糖値）は、糖尿病疾患においては非常に重要な指標として用いられており、血糖値医療現場で、採血により求められる。また糖尿病疾患の患者は自己管理のために簡易型のグルコース測定器を用いている。しかしながら、この従来のグルコース測定器は試料として指からの血液を用いているが、採血のために指を針で刺すことは苦痛を伴い、また感染症に感染する危険がある。
【０００３】
（２）一方、皮下の間質液を、皮膚に電圧印加して発生させた電気浸透流により採集（イントフォレシスと呼ばれる）し、ついでグルコースセンサーにて測定する方法がある。しかしながら、間質液を取り出す際に皮膚に電流を通じるので、火傷を負う可能性がある。
【０００４】
（３）また、口内における歯根と歯肉との間の液を採集して用いる方法が提案されているが、採集が困難であり、また口内の唾液が混入する可能性があり、まだ実用化されていない。
【特許文献１】なし
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記したように、従来の技術はいずれも問題がある。すなわち、血液採集に関しては、苦痛を伴いかつ感染の危険がある。皮膚への電圧印加の方法は火傷の危険がある。また、口内の歯根液からの採集に関しては被験者への負荷が大きい。
【０００６】
グルコースの測定のための試料サンプリングは、非侵襲で、かつ、非観血に行え、またサンプリングに際しての被験者への生理的負荷が少ないことが望ましい。
【０００７】
さらに、日常的にサンプリングが行え、手軽に在宅医療の方法として用いることができるグルコースサンプリング方法ならびに測定方法を実施することが望ましい。
【０００８】
そこで、本発明は、上記状況に鑑みて、被験者への負荷を軽減し、かつ簡便で手軽に実施することができる皮膚表面に存在するグルコース測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記目的を達成するために、
〔１〕皮膚表面に存在するグルコース測定方法において、指を洗浄後、よく拭き取り、所定の時間静置してためた後、界面活性剤を含んだ水溶液により発生させた気泡を、下方に向いた指の汗成分を有する皮膚表面へ塗布し、次いで、前記気泡及びこの気泡から生じた水分を前記皮膚表面より回収し、この中に含まれる糖分を測定することを特徴とする。
【００１０】
〔２〕上記〔１〕記載の皮膚表面に存在するグルコース測定方法において、前記指に付着した水滴をスプーンを用いて容器中へ掻き落とすことを特徴とする。
【００１１】
〔３〕上記〔１〕記載の皮膚表面に存在するグルコース測定方法において、前記指に付着した水滴をゴム輪を指の根元から指先まで滑らせることによって容器中へ回収することを特徴とする。
【００１２】
〔４〕上記〔１〕記載の皮膚表面に存在するグルコース測定方法において、前記指に付着した水滴を袋状になった容器を指全体にかぶせそれを指先まで滑らせることにより容器に回収することを特徴とする。
【００１３】
〔５〕上記〔１〕記載の皮膚表面に存在するグルコース測定方法において、前記指に付着した水滴を綿状の繊維の吸い取り材で集めた後、この吸い取り材を遠心分離にかけ、糖分を含んだ水分を回収することを特徴とする。
【００１４】
〔６〕上記〔１〕記載の皮膚表面に存在するグルコース測定方法において、前記回収した水分を直接に高感度グルコースセンサーにより測定することを特徴とする。
【００１５】
〔７〕上記〔１〕記載の皮膚表面に存在するグルコース測定方法において、前記回収した水分を固体抽出剤に入れグルコース成分のみを回収し、次いで高感度グルコースセンサーにより測定することを特徴とする。
【００１６】
〔８〕上記〔１〕記載の皮膚表面に存在するグルコース測定方法において、前記所定の時間静置して汗をためた後、小型噴霧器を用いて、指全体に１０秒間５％エタノール水溶液を噴霧し、指に付着した水滴を容器に回収することを特徴とする。
【００１７】
本発明者らは、汗やその他の染み出した液に伴って皮膚上にグルコースが出てくることを見出した。そこで、皮膚上のグルコースを集めて測定したところ、この得られた測定値は血中グルコースの値と相関しており、皮膚上のグルコース値により簡易的な診断に用いることができることが分かった。
【００１８】
本発明は、グルコースを皮膚中から効率よく集めるとともに、この捕集液を分析し、グルコースの測定を行うことができる。
【００１９】
なお、本発明において、皮膚表面には、正確にいうと、汗からの成分、皮膚細胞からの成分、皮膚組織からの成分があり、いずれも、本発明の対象に含まれるものである。
【００２０】
また、試料の採集部位は、被験者の指にかきらず、腕、足、脚、手、その他の体表面であってもよい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、以下のような効果を奏することができる。
【００２２】
（Ａ）簡易にグルコース測定を行うことが可能になる。
【００２３】
（Ｂ）非侵襲・非観血での測定法であり、非常に用いやすい。また、容易に在宅医療に用いることができる。
【００２４】
（Ｃ）糖尿病のシステム管理にも用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明の皮膚表面に存在するグルコース測定方法は、指を洗浄後、よく拭き取り、所定の時間静置をしてためた後、界面活性剤を含んだ水溶液により発生させた気泡を、下方に向いた指の汗成分を有する皮膚表面へ塗布し、次いで、前記気泡及びこの気泡から生じた水分を前記皮膚表面より回収し、この中に含まれる糖分を測定する。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら詳細に説明する。
【００２７】
図１は本発明の実施例を示す皮膚表面に存在するグルコース測定方法の説明図である。
【００２８】
この図において、１は被験者の手、２はその人指し指、４は５％エタノール水溶液３の小型噴霧器、５は人指し指２に付着した後、容器６に回収された水滴である。
【００２９】
この糖測定方法をより詳細に説明すると、人指し指２を洗浄後、キムワイプでよく拭き取る。所定の時間静置し、汗をためた後、霧状に水溶液を塗布できる小型噴霧器（ＩＮＨＡＬＥＲ，松下電工）４を用いて、人指し指２の全体に１０秒間５％エタノール水溶液３を噴霧する。人指し指２に付着した水滴５を容器６に回収し、サンプルとして使用し、次いで、液体クロマトグラフィー及び簡易型グルコースセンサーにより糖分を測定する。この糖分は血中濃度に比例するので、糖モニターとして使用できる。
【００３０】
次に、指皮膚表面に付着した水分を回収するための方法と、回収補助器具について説明する。
【００３１】
図２はその指皮膚表面に付着した水分を回収するための方法（その１）の説明図である。
【００３２】
ここでは、図２（ａ）及び図２（ｂ）に示すように、指１１に付着した水滴１２を小さなスプーン１３（水を掻き落とすための工夫を施している）を用いて、１．２ｍｌの容器（バイアル）１４中へ掻き落とす。
【００３３】
図３はその指皮膚表面に付着した水分を回収するための方法（その２）の説明図である。
【００３４】
ここでは、図３（ａ）及び図３（ｂ）に示すように、ゴム輪２３を指の根元から指先まで滑らせることによって、指２１に付着した水滴２２を１．２ｍｌの容器（バイアル）２４中に回収する。
【００３５】
このゴム輪２３は常に一定の力を指表面に付与できる付属装置（図示なし）を用いることができる。
【００３６】
なお、このようなゴムに代えて、輪状の形態を有するプラスチックスや金属ワイヤーを用いるようにしてもよい。
【００３７】
図４はその指皮膚表面に付着した水分を回収するための方法（その３）の説明図である。
【００３８】
ここでは、指３１に水滴３２を噴霧後、袋状になった容器３３を指全体にかぶせそれを指先まで滑らせることにより行う。ここで、３２′は回収された水滴である。
【００３９】
さらに、図示しないが、水を綿状の繊維の吸い取り材で集めた後、次いで吸い取り材を遠心分離にかけ、糖分を含んだ水分を回収する方法も採用できる。
【００４０】
また、水分を吸引により補集する容器を用いるようにしてもよい。
【００４１】
次に、上記した方法により回収した水分中のグルコースの測定方法について説明する。
【００４２】
（１）上記した方法により回収した水分中のグルコースを、直接に高感度グルコースセンサーにより測定する。
【００４３】
（２）上記した方法により回収した水滴を、固体抽出剤に入れ、グルコース成分のみを回収し、次いで高感度グルコースセンサーにより測定する。
【００４４】
次に、皮膚表面のグルコース量を用いた糖尿病疾患への管理システムについて説明する。
【００４５】
まず、実験装置としてのＨＰＬＣ装置について説明する。
【００４６】
図５は本発明の実施例を示す皮膚表面に存在するグルコース測定装置の模式図である。
【００４７】
この図において、４１はＰＣ（パーソナルコンピュータ）、４２はダイオードアレー検出器、４３は貯槽（リザーバー）、４４は溶離剤（ｅｌｕｅｎｔ）、４５は噴霧器、４６はカラム、４７はポンプである。
【００４８】
本発明では、検出器４２としてＤｉｏｄｅ ａｒｒａｙ ｄｅｔｅｃｏｒ ３５０ＲＳ（大塚電子株式会社）、ポンプ４７としてＬＣ−９Ａ（島津製作所）、カラム４６にはＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ18 ２．０ｍｍ ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ（ＳＨＩＳＥＩＤＯ）を用いた。
【００４９】
ポンプ４７は０．２００ｍｌ／ｍｉｎの流量で定流量送液を行った。検出器４２では２４５ｎｍでのＵＶ吸光度法によって検出を行った。
【００５０】
次に、誘導体化法について説明する。
【００５１】
炭水化物の分析において、ＨＰＬＣ装置は重要な役割を果たしているが、高感度検出は困難であり、それを解決するために様々な誘導体化法が存在する。
【００５２】
ポストカラム誘導体化は、サンプルを直接注入できる、といった利点があるが誘導体化の収率が低いため高感度な検出は不可能であった。
【００５３】
金またはニッケル電極を用いた電気化学的検出方法は高感度な検出が可能である。
【００５４】
ｐ−ブロモベンゼン誘導体化、ｐ−ニトロベンゼン誘導体化などのプレカラム誘導体化は誘導体の高い収率が得られる。しかし、定量的、且つ立体異性体を持たないような誘導体化は難しかった。
【００５５】
それに対して、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン（ＰＭＰ）による誘導体化では、ＰＭＰは還元糖とほぼ定量的に反応し、強いＵＶ吸収をもつ誘導体を生成する。ＰＭＰは還元糖と２：１の化合物を作り、またその化合物は立体異性体を持たない。
【００５６】
これらの利点から、本発明ではＰＭＰ誘導体化法を採用した。
【００５７】
一般的な還元糖と１−フェニル−３メチル−５−ピラゾロン（ＰＭＰ）との反応式を以下に示す。
【００５８】
【化１】
次に、誘導体化の操作について説明する。
【００５９】
誘導体化の操作は以下のようにして行った。
【００６０】
（１）５％エタノール水にグルコースを溶解した溶液を減圧乾固する。
【００６１】
（２）水酸化ナトリウム水溶液とＰＭＰメタノール溶液を加える。
【００６２】
（３）７０℃で１時間半反応させる
（４）室温まで冷却後塩酸で中和させる。
【００６３】
（５）反応液を減圧乾固する。
【００６４】
（６）残渣を蒸留水とクロロホルムで溶解し抽出する。
【００６５】
（７）水層を減圧乾固する。
【００６６】
（８）残渣を溶離液に溶解したものを、液体クロマトグラフィー用サンプルとする。
【００６７】
１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン（ＰＭＰ）による誘導体化によって得られる誘導体は、極大吸収波長が２４５ｎｍとなる。汗中にはグルコース以外の還元糖も存在するため、同定はスペクトル以外に溶出時間及び添加法によって行った。
【００６８】
次に、他の測定方法について説明する。
【００６９】
皮膚から回収した水溶液を濃縮し、市販のグルコースセンサーにて測定した。この際その読みを高感度の測定器を用いて増幅し定量的に読み出した。
【００７０】
図１に示したように汗成分を含む水分を採取し、図５に示す測定装置によって測定する。すなわち、採取した水分は、減圧乾固後、０．３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液３０μｌと０．５Ｍ １−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン（ＰＭＰ）メタノール溶液３０μｌを加え、７０℃で１時間半反応させた後、１Ｎ塩酸を当量加え中和し、減圧乾固させた。その残渣を蒸留水とクロロホルム各２００μｌで溶解し、溶媒抽出を行った。その水層を１００μｌ取り出し、減圧乾固させ、溶離液（アセトニトリル／０．１Ｍリン酸緩衝液＝１８．５／８１．５）３０μ１を加えたものをサンプルとし測定を行った。
（１）糖摂取による汗中グルコース濃度の変化
糖摂取負荷試験の実験においては、経口糖認容力試験用糖質液トレーランＧ７５（清水製薬株式会社製）を使用した。
（１−１）試験用試薬
トレーランＧ７５は、ブドウ糖の代わりにデンプン部分加水分解物を用い、服用しやすくした糖質液で、糖尿病診断時の糖負荷試験に用いられる。トレーランＧ７５とブドウ糖との負荷後の血糖値及び血中インスリン値の推移には有意な差がないことが認められている。
【００７１】
また、トレーランＧ７５は、１瓶（２２５ｍｌ）中にデンプン部分加水分解物１００．０ｇ（ブドウ糖に換算して７５．０ｇ）を含有する。
（１−２）糖摂取の際の負荷条件
被験者は前日の午後９時以降、試験直前まで絶食を行い午前中から実験を行った。実験中はトレーランＧ７５以外のものの摂取は行わなかった。また試験前日の９時以降から試験終了後まで飲酒、喫煙は行わないようにした。
（１−３）糖摂取前後での汗の採取法
トレーランＧ７５摂取前に３回、摂取後に１２回の合計１５回のサンプリングを１５分毎に行った。汗の採取は人指し指を洗浄後５分間静置し、５％エタノール水を１０秒噴霧した。
【００７２】
回収法は、指に付着した水滴を小さなスプーンを用いて１．２ｍｌの容器（バイアル）中へ掻き落とす方法を用いて行った。
【００７３】
水滴採取後、減圧乾燥をしたのち誘導体化を行った。
（１−４）血糖値の測定
糖摂取の際の血糖値は、水滴を採取する人差し指以外の指先から少量の血を採取し、簡易型血糖センサ（グルテストＥII−３ 三和化学研究所）を用いて測定を行った。
【００７４】
血糖値の測定は水滴採取とほぼ同時に行った。
測定条件：ここでは、汗サンプルの液体クロマトグラフによる測定条件を示す。
【００７５】
検出器：Ｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ ｄｅｔｅｃｔｏｒ ３５０ＲＳ（大塚電子株式会社）
ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所）
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ18 ２．０ｍｍ ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ（ＳＨＩＳＥＩＤＯ）
溶離液：アセトニトリル／０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）＝１８／８２
流量：０．２００ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：２４５ｎｍ
サンプル注入量：１０μｌ
（１−５）結果
被験者２人に糖摂取実験を行った際の汗中グルコース絶対量及び血糖値の時間変化の代表例を図６〜図７に示す。図６、図７はそれぞれ異なる被験者である。図６のＡ及び図７のＣは血糖値の時間変化を示し、図６のＢ及び図７のＤは汗中のグルコース絶対量の時間変化を示す。
【００７６】
図６及び図７では、横軸に時間（分）、左縦軸に汗中グルコース絶対量（ｐｍｏｌ）、右縦軸に血糖値（ｍｇ／ｄｌ）を表しており、◆は汗中グルコース絶対量、■は血糖値を示している。
【００７７】
図８は本発明の実施例を示すグルコース測定用試料回収装置の模式図である。
【００７８】
この図において、５１は試料採取箱、５２は加熱装置、５３は霧吹き装置、５４は加熱装置５２及び霧吹き装置５３を駆動させる光電スイッチ、５５は鍔付き回収具、５６はその鍔付き回収具５５の装着空間、５７はその装着空間５６の開閉蓋、５８はその開閉蓋の枢着部、５９は被験者の指である。
【００７９】
試料採取箱５１内には加熱装置５２が配置されており、試料採取箱５１内は使用中は温度を高くしておき、被験者の指５９からの発汗を促すようにしている。そこで、被験者の指５９が試料採取箱５１に挿入されると、これを光電スイッチ（タイマー付き）５４が検出し、所定のタイミング（指５９からの発汗時間）を得た後に霧吹き装置５３を動作させて汗成分を含む水分を鍔付き回収具５５で受けて回収する。その回収された汗成分を含む水分は鍔付き回収具５５ごと装着空間５６から取り出して、グルコース測定用試料とすることができる。新たな被験者のグルコース測定を行う場合には、新たな鍔付き回収具を装着して、上記した手順でグルコース測定用試料を得ることができる。
【００８０】
また、汗成分を含む水分の指表面からの回収は、指表面に接する輪状の回収具６１を駆動装置（図示せず）により指の上方から下方へ駆動することにより掻き集めるようにすることができる。
【００８１】
このように、本発明のグルコース測定用試料回収装置は、霧吹きの過程と指の皮膚上の水溶液の回収過程とを連続的に行うことができる。
【００８２】
次に、汗中のグルコース濃度の測定を実施した。
【００８３】
指あるいは腕の皮膚を清浄化した後、その部分を二つの出入口を備えた容器で覆い、乾燥空気を導き、容器より出てくる空気を、発汗計（Ｋｅｎｚ Ｐｅｒｓｐｉｒｏ ２１０、スズケン）に導き、前記皮膚よりグルコース成分を回収し、定量した。この発汗量とグルコース量との関係から発汗中のグルコース濃度を求めた。このグルコース濃度と血糖値の相関を調べたところ、良い相関が得られた。
【００８４】
別の上記した実施例では、グルコース絶対量と血糖の関係を見出しているが、発汗量を測定することにより、汗中のグルコース濃度と血糖値との相関を求めることが可能である。
【００８５】
また、界面活性剤を含んだ水溶液により発生させた気泡を汗成分を有する皮膚上に塗布し、次いで、前記気泡及びこの気泡から生じた水分を皮膚より回収し、この中に含まれる糖分を測定することができる。
【００８６】
更に、本発明は、皮膚上の有機化合物及び又は無期化合物の定量にも応用できる。
【００８７】
なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づいて種々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明の皮膚表面に存在するグルコース測定方法は、被験者への負荷を軽減し、かつ簡便で手軽に実施することができるグルコース測定ツールとして利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】本発明の実施例を示す皮膚表面に存在するグルコース測定方法の説明図である。
【図２】本発明の実施例を示す指皮膚表面に付着した水分を回収するための方法（その１）の説明図である。
【図３】本発明の実施例を示す指皮膚表面に付着した水分を回収するための方法（その２）の説明図である。
【図４】本発明の実施例を示す指皮膚表面に付着した水分を回収するための方法（その３）の説明図である。
【図５】本発明の実施例を示す皮膚表面に存在するグルコース測定装置の模式図である。
【図６】被験者２人に糖摂取実験を行った際の汗中グルコース濃度及び血糖値の変化の代表例を示す図（その１）である。
【図７】被験者２人に糖摂取実験を行った際の汗中グルコース濃度及び血糖値の変化の代表例を示す図（その２）である。
【図８】本発明の実施例を示すグルコース測定用試料回収装置の模式図である。
【符号の説明】
【００９０】
１ 被験者の手
２ 人指し指
３ ５％エタノール水溶液
４ 小型噴霧器
５，１２，２２，３２ 水滴
６，１４，２４，３３ 容器
１１，２１，３１ 指
１３ スプーン
２３ ゴム輪
３２′ 回収された水滴
４１ ＰＣ（パーソナルコンピュータ）
４２ ダイオードアレー検出器
４３ 貯槽（リザーバー）
４４ 溶離剤（ｅｌｕｅｎｔ）
４５ 噴霧器
４６ カラム
４７ ポンプ
５１ 試料採取箱
５２ 加熱装置
５３ 霧吹き装置
５４ 光電スイッチ
５５ 鍔付き回収具
５６ 鍔付き回収具の装着空間
５７ 開閉蓋
５８ 開閉蓋の枢着部
５９ 被験者の指
６１ 輪状の回収具
【特許請求の範囲】
【請求項１】
指を洗浄後、よく拭き取り、所定の時間静置してためた後、界面活性剤を含んだ水溶液により発生させた気泡を、下方に向いた指の汗成分を有する皮膚表面へ塗布し、次いで、前記気泡及び該気泡から生じた水分を前記皮膚表面より回収し、この中に含まれる糖分を測定することを特徴とする皮膚表面に存在するグルコース測定方法。
【請求項２】
請求項１記載の皮膚表面に存在するグルコース測定方法において、前記指に付着した水滴をスプーンを用いて容器中へ掻き落とすことを特徴とする皮膚表面に存在するグルコース測定方法。
【請求項３】
請求項１記載の皮膚表面に存在するグルコース測定方法において、前記指に付着した水滴をゴム輪を指の根元から指先まで滑らせることによって容器中へ回収することを特徴とする皮膚表面に存在するグルコース測定方法。
【請求項４】
請求項１記載の皮膚表面に存在するグルコース測定方法において、前記指に付着した水滴を袋状になった容器を指全体にかぶせそれを指先まで滑らせることにより容器に回収することを特徴とする皮膚表面に存在するグルコース測定方法。
【請求項５】
請求項１記載の皮膚表面に存在するグルコース測定方法において、前記指に付着した水滴を綿状の繊維の吸い取り材で集めた後、該吸い取り材を遠心分離にかけ、糖分を含んだ水分を回収することを特徴とする皮膚表面に存在するグルコース測定方法。
【請求項６】
請求項１記載の皮膚表面に存在するグルコース測定方法において、前記回収した水分を直接に高感度グルコースセンサーにより測定することを特徴とする皮膚表面に存在するグルコース測定方法。
【請求項７】
請求項１記載の皮膚表面に存在するグルコース測定方法において、前記回収した水分を固体抽出剤に入れグルコース成分のみを回収し、次いで高感度グルコースセンサーにより測定することを特徴とする皮膚表面に存在するグルコース測定方法。
【請求項８】
請求項１記載の皮膚表面に存在するグルコース測定方法において、前記所定の時間静置して汗をためた後、小型噴霧器を用いて、指全体に１０秒間５％エタノール水溶液を噴霧し、指に付着した水滴を容器に回収することを特徴とする皮膚表面に存在するグルコース測定方法。
【請求項１】
指を洗浄後、よく拭き取り、所定の時間静置してためた後、界面活性剤を含んだ水溶液により発生させた気泡を、下方に向いた指の汗成分を有する皮膚表面へ塗布し、次いで、前記気泡及び該気泡から生じた水分を前記皮膚表面より回収し、この中に含まれる糖分を測定することを特徴とする皮膚表面に存在するグルコース測定方法。
【請求項２】
請求項１記載の皮膚表面に存在するグルコース測定方法において、前記指に付着した水滴をスプーンを用いて容器中へ掻き落とすことを特徴とする皮膚表面に存在するグルコース測定方法。
【請求項３】
請求項１記載の皮膚表面に存在するグルコース測定方法において、前記指に付着した水滴をゴム輪を指の根元から指先まで滑らせることによって容器中へ回収することを特徴とする皮膚表面に存在するグルコース測定方法。
【請求項４】
請求項１記載の皮膚表面に存在するグルコース測定方法において、前記指に付着した水滴を袋状になった容器を指全体にかぶせそれを指先まで滑らせることにより容器に回収することを特徴とする皮膚表面に存在するグルコース測定方法。
【請求項５】
請求項１記載の皮膚表面に存在するグルコース測定方法において、前記指に付着した水滴を綿状の繊維の吸い取り材で集めた後、該吸い取り材を遠心分離にかけ、糖分を含んだ水分を回収することを特徴とする皮膚表面に存在するグルコース測定方法。
【請求項６】
請求項１記載の皮膚表面に存在するグルコース測定方法において、前記回収した水分を直接に高感度グルコースセンサーにより測定することを特徴とする皮膚表面に存在するグルコース測定方法。
【請求項７】
請求項１記載の皮膚表面に存在するグルコース測定方法において、前記回収した水分を固体抽出剤に入れグルコース成分のみを回収し、次いで高感度グルコースセンサーにより測定することを特徴とする皮膚表面に存在するグルコース測定方法。
【請求項８】
請求項１記載の皮膚表面に存在するグルコース測定方法において、前記所定の時間静置して汗をためた後、小型噴霧器を用いて、指全体に１０秒間５％エタノール水溶液を噴霧し、指に付着した水滴を容器に回収することを特徴とする皮膚表面に存在するグルコース測定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００６−２５０９４９（Ｐ２００６−２５０９４９Ａ）
【公開日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１３４６７２（Ｐ２００６−１３４６７２）
【出願日】平成１８年５月１５日（２００６．５．１５）
【分割の表示】特願２００２−１２３４１６（Ｐ２００２−１２３４１６）の分割
【原出願日】平成１４年４月２５日（２００２．４．２５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００１年１１月９日 社団法人日本分析化学会発行の「日本分析化学会第５０年会 講演要旨集」に発表
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月１５日（２００６．５．１５）
【分割の表示】特願２００２−１２３４１６（Ｐ２００２−１２３４１６）の分割
【原出願日】平成１４年４月２５日（２００２．４．２５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００１年１１月９日 社団法人日本分析化学会発行の「日本分析化学会第５０年会 講演要旨集」に発表
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
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