眼科用組成物
涙液層を構成する油層のバリア機能を高めて、ドライアイ等の眼障害を抑制乃至は改善し得る眼科用組成物を提供することを本願の解決課題とする。また、抗炎症作用や抗菌作用を発揮せしめて、角結膜炎等の角膜・結膜障害を有利に抑制乃至は改善し得る眼科用組成物を提供することも本願の解決課題とする。本願において、アポリポタンパクＡ−１を有効成分として、眼科用組成物に含有せしめるようにした。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、眼科用組成物に係り、特に、ドライアイや角結膜炎等の角膜・結膜障害を改善（治療）するのに有効な眼科用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、ドライアイの症状を訴える患者が増加しており、相当数の患者がドライアイに悩まされている。具体的には、３０〜６０歳ではその人口の１０％、６５歳以上ではその人口の１５％までもが、ドライアイの影響を受けていると言われており、影響を受けた概算人数は、アメリカで１０００万人〜１４００万人、日本ではおよそ８００万人にも及んでいる。また、コンタクトレンズの装用者の中にも、ドライアイに悩む患者が増加してきており、ドライアイがレンズ装用中止の主な原因となっている。
【０００３】
ドライアイは、眼瞼間の眼表面（即ち、露出した眼表面）に障害を惹起する、涙の欠乏又は過剰な涙の蒸発が原因となる涙液層の疾患であり、眼の不快感を伴うものである（非特許文献１）。また、ドライアイは、涙の分泌の減少と蒸発の増加に起因し、乾性角結膜炎（ＫＳＣ）における涙液層の高い浸透圧は、角膜や結膜で観られる疾患を惹起する重大な役割を果たしていること（非特許文献２）、更に、上昇した涙液層の浸透圧が直接的な原因となり、ドライアイの眼表面の疾患の進行を促進すること（非特許文献３〜６）が、報告されている。そして、かかるドライアイ疾患の進行の原因となる浸透圧の増大のメカニズムを、図１に示すが、かかる図１から明らかなように、浸透圧の増大は、一般に、（１）涙の分泌の減少と（２）涙の蒸発の増加によって惹起される。更に、前者の（１）涙の分泌の減少は、涙腺の疾患や角膜感覚の減少により惹起される一方、後者の（２）涙の蒸発の増加は、眼瞼裂の増大やマイボーム腺の機能不全により惹起される（非特許文献７参照）。加えて、ドライアイ症状の患者においては、特に、涙液層の高浸透圧化は、ＫＳＣの発症と診断において大きな要因であると主張されてきている（非特許文献８）。
【０００４】
さらに、ドライアイの症状は、しばしば、アレルギー性結膜炎の患者にも存在し、ドライアイとアレルギー性結膜炎、その他の眼の炎症が相互に関与しあっているとの報告もある（非特許文献９）。また、シェーグレン症候群（ＳＳ）や、乾性角結膜炎（ＫＣＳ）、重度のドライアイ症候群の患者は、健常者と比べて、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、及びＴＮＦ−αを含む多くの異なる炎症性サイトカインが、結膜上皮において増加していることが報告されている（非特許文献１０）。このため、一旦、涙分泌の減少によって、眼表面のバリア機能が低下すると、抗原と炎症性サイトカインの影響により、次には慢性化するおそれのある眼の炎症を患うリスクが増大する。
【０００５】
一方、角膜上皮表面を覆う涙液層は、角膜上皮側から順に、ムチン層（粘液層）、水液層、油層の３層で形成されている。これら３層のうちの最外層である油層の特性や厚さ、均一性が、涙層の安定化において重要な役割を果たしていることが明らかとなっている。この油層は、瞼にあるマイボーム腺から分泌される脂質にて主に構成されており、角膜上皮からの涙の蒸発やアレルゲン等の侵入を防ぐバリア機能を担っている。そして、マイボーム腺の機能が低下して脂質の分泌量が減少すると、油層が減って、涙が蒸発し、これにより、涙液の浸透圧が上昇し、ひいてはドライアイ等の眼障害が惹起されるようになるのである。
【０００６】
また、マイボーム腺の機能は、腺自体の遊離のコレステロール（ＦＣ）とコレステロールエステル（ＣＥ）の貯蔵量のレベルによって影響を受け（細胞内のコレステロールをエステル化する酵素である、コレステロールアシルトランスフェラーゼ：ＡＣＡＴ−１活性による）、また、ＣＥの蓄積及び貯蔵量の減少は、マイボーム腺の萎縮変化の原因となることが報告されており（非特許文献１１）、細胞内のコレステロールエステル値がマイボーム腺の萎縮をコントロールしていると考えられている。更に、脂質の代謝に関与するタンパク質であるアポリポタンパクの一種に、アポリポタンパクＣ−１（ＡｐｏＣ１）があるが、ヒトＡｐｏＣ１を過剰発現させたＡｐｏＣ１トランスジェニックマウスでは、マイボーム腺が激しく萎縮することが報告されている（非特許文献１２）。このようなマイボーム腺の萎縮は、脂質の分泌を減少させるため、コレステロールのエステル化を促し、マイボーム腺の働きを改善させることが望ましいのである。
【０００７】
かかる状況下、本発明者は、鋭意検討を重ねて、アポリポタンパクとドライアイの発症との間に相関関係があると仮定した。かかるアポリポタンパクには、その構造や働きにより、前記ＡｐｏＣ１の他にも、アポリポタンパクＡ−１（ＡｐｏＡ１）、Ａ２、Ａ５、Ｂ、Ｄ、Ｅ等の様々な型があるが、これらの中でも、後述するＲＴ−ＰＣＲ法による実験結果から、高比重リポタンパク（ＨＤＬ）の主要な構成成分であるＡｐｏＡ１に、特に着目した。
【０００８】
このＡｐｏＡ１は、コレステロールのエステル化に関与するレシチンコレステロールアシルトランスファーゼ（ＬＣＡＴ）を活性化することが知られており、このＬＣＡＴ活性化によって、ＨＤＬのコレステロール輸送が高められるため、動脈硬化や心筋梗塞等の心臓病予防に有用であるとされている。また、ドライアイの原因とされる高浸透圧ストレスは、炎症性サイトカインであるＩＬ−１β及びＴＮＦ−αの発現と産生を促すことによって、眼表面の炎症を惹起させるのであるが、ＡｐｏＡ１は、抗炎症性サイトカイン、ＩＬ−１０の発現を強めることにより、また、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６を抑制する作用により、抗炎症効果を有していると報告されている（非特許文献１３−１９）。更に、ＡｐｏＡ１は、リポ多糖（ＬＰＳ又はエンドドキシン）に結合する、ＨＤＬの抗エンドドキシン機能の主な貢献者であり、ＨＤＬとＡｐｏＡ１とが、ＬＰＳ毒性を中和し、サイトカインの産生の誘発を低減することも、報告されている（非特許文献２０−２３）。このＡｐｏＡ１の作用が、グラム陰性菌感染の発病や兆候から保護する役割を果たしている。また更に、ＡｐｏＡ１は、表皮ブドウ球菌や単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）によって誘発される細胞融合に対する抑制作用を有している（非特許文献２４−２６）。
【０００９】
ところで、特許文献１には、ＡｐｏＡ１とは異なるクラスに分類されるアポリポタンパクＪ（ＡｐｏＪ）を有効成分とする角膜障害治療剤が提案されているが、そこにおいて、ＡｐｏＪは、３層からなる涙液層のうちのムチン層を構成するムチンの分泌に関与していることが明らかにされているのであって、油層によるバリア機能については、何等明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平９−２２７４０１号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Lemp MA. Report of the National Eye Institute/ Industry workshop on Clinical Trials in Dry Eyes. CLAO J, 21: p221-232, 1995
【非特許文献２】Arch Ophthalmology, 96(4): p677-681, 1978
【非特許文献３】Acta Ophthalmologica, 61: p108-116, 1983
【非特許文献４】Ophthalmology, 92: p646-650, 1985
【非特許文献５】Am. J. Ophthalmology, 102: p505-507, 1986
【非特許文献６】Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 29: p374-378, 1988
【非特許文献７】W.B Saunders Company, Philadelphia, In Albert DM, Jakobiec FA(eds): Principles and Practice of Ophthalmology, p257-276, 1994
【非特許文献８】Adv. Exp. Med. Biol., 350: p495-503, 1994
【非特許文献９】ドライアイクリニック, 坪田編集, ２０００年出版, 医学書院, 日本語版
【非特許文献１０】Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 42(10): p2283-2292, 2001
【非特許文献１１】J. Biol. Chem., 275(28): p21324-21330, 2000
【非特許文献１２】J. Clin. Invest., 101(1): p145-152, 1998
【非特許文献１３】Blood, 15, 97(8): p2381-2389, 2001
【非特許文献１４】Circulation, 106: p1127-1132, 2002
【非特許文献１５】Circulation, 103(1): p108-112, 2001
【非特許文献１６】Bio. Chem. Biophys. Acta, 13; 1623(2-3): p120-128, 2003
【非特許文献１７】Lipids, 37(9): p925-928, 2002
【非特許文献１８】Ann N Y Acad Sci, 966: p464-473, 2002
【非特許文献１９】Infection and Immunity, Vol 61, No.12, 1993
【非特許文献２０】Acta Biochim. Biophys. Sin. (Shanghai), 36(6): p419-424, 2004
【非特許文献２１】Eur. J. Biochem., 269: p5972-5981, 2002
【非特許文献２２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: p12040-12044, 1993
【非特許文献２３】Circ. Res., 97(3): p236-243, 2005
【非特許文献２４】Mol Cell Biochem., 119(1-2): p171-178, 1993
【非特許文献２５】Virology, 176(1): p48-57, 1990
【非特許文献２６】J. Cell Biochem., 45(2): p224-237, 1991
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ここにおいて、本発明は、かかる事情を背景にして為されたものであって、その解決課題とするところは、涙液層を構成する油層のバリア機能を高めて、ドライアイ等の角膜障害を抑制乃至は改善し得る眼科用組成物を提供することにある。また、別の解決課題とするところは、抗炎症作用や抗菌作用を発揮せしめて、角結膜炎等の角膜・結膜障害を有利に抑制乃至は改善し得る眼科用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
そして、本発明者は、そのような課題を解決すべく、先ず、ドライアイの際に眼表面で生じている高浸透圧がアポリポタンパクに与える影響を調査した。具体的には、高浸透圧下におけるアポリポタンパクｍＲＮＡ遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲで調べた。その結果、高浸透圧下では、アポリポタンパクＡ−１の発現量が減少したのである。そして、本発明者が、更なる検討を重ねた結果、アポリポタンパクＡ−１を含む溶液を点眼することによって、ドライアイによる角膜障害が抑制乃至は改善されることを、見出したのである。
【００１４】
従って、本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものであって、その要旨とするところは、アポリポタンパクＡ−１を有効成分として含有することを特徴とする眼科用組成物にある。
【００１５】
また、そのような本発明に従う眼科用組成物における好ましい態様によれば、ビタミンＢ５類より選ばれる少なくとも１種の化合物が、更に含有されている構成が、採用され、また、かかるビタミンＢ５類としては、Ｄ−パンテチンが好適に採用される。
【００１６】
さらに、本発明の別の好ましい態様においては、前記眼科用組成物が、角膜障害治療用組成物として用いられる。また、かかる角膜障害としては、例えば、ドライアイ等があり、本発明に従う眼科用組成物により、ドライアイが効果的に治療され得る。
【００１７】
加えて、本発明の更に別の態様においては、前記眼科用組成物が、点眼剤又はコンタクトレンズ用液剤として、用いられる。
【００１８】
また、本発明に従う眼科用組成物の他の好ましい態様によれば、前記アポリポタンパクＡ−１が、０．００１〜１ｗ／ｖ％の割合で含有される一方、前記ビタミンＢ５類が、０．００５〜２ｗ／ｖ％の割合で含有される構成が、採用されることとなる。
【発明の効果】
【００１９】
このように、本発明に従う眼科用組成物にあっては、アポリポタンパクＡ−１が含有されているところから、涙液層を構成する油層のバリア機能が向上して、ドライアイ等の角膜障害が効果的に抑制乃至は改善されるのである。
【００２０】
また、かかるアポリポタンパクＡ−１の抗炎症作用や抗菌作用が、眼表面においても発揮されて、角結膜炎等の角膜・結膜障害も有利に抑制乃至は改善され得るようになる。
【００２１】
さらに、本発明に従う眼科用組成物の好ましい態様に従って、アポリポタンパクＡ−１とＤ−パンテチン等のビタミンＢ５類を併用すれば、２成分のシナジー効果によって、ドライアイや角結膜炎等の角膜・結膜障害がより一層効果的に抑制乃至は改善され得るのである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】W.B Saunders Company, Philadelphia, In Albert DM, Jakobiec FA (eds): Principles and Practice of Ophthalmology, (p257-276, 1994) の図を修正したものであって、ドライアイ疾患の進行の原因となる浸透圧の増大のメカニズムを示す図である。
【図２】アポリポタンパク遺伝子発現のゲル電気泳動を示す図である。
【図３】高浸透圧ストレスによって刺激されたＨＣＥＴ細胞でのＡｐｏＡ１のｍＲＮＡ発現を相対的に示すグラフである。
【図４】高浸透圧ストレスによって刺激されたＨＣＥＴ細胞でのＡｐｏＡ５、ＡｐｏＥ及びＡｐｏＣ１のｍＲＮＡ発現を相対的に示すグラフである。
【図５】臭化水素酸スコポラミンの皮下注射とブロワーによる乾燥処理が行なわれたマウス（ＤＥマウス）におけるフェノールレッド糸テストの結果を示すグラフである。
【図６】ＡｐｏＡ１で処理されたＤＥマウスにおけるフェノールレッド糸テストの結果を示すグラフである。
【図７】ＡｐｏＡ１とＤ−パンテチンで処理されたＤＥマウスにおけるフェノールレッド糸テストの結果を示すグラフである。
【図８】ＡｐｏＡ１を含む点眼液又は有効成分を含まないＰＢＳで処理された６匹のＤＥマウス（マウス１〜６）の角膜染色スコアを示すグラフである。
【図９】ＡｐｏＡ１とＤ−パンテチン（Ｄｐ）とを含有する点眼液又はこれらの有効成分を含まないＰＢＳで処理された６匹のＤＥマウス（マウス１〜６）の角膜染色スコアを示すグラフである。
【図１０】有効成分を含まないＰＢＳ又はＡｐｏＡ１を含む点眼液で処理されたＤＥマウスの角膜染色スコアを示すグラフであって、ＡｐｏＡ１の濃度変化の影響を示している。
【図１１】有効成分を含まないＰＢＳ又はＡｐｏＡ１とＤ−パンテチンとを含有する点眼液で処理されたＤＥマウスの角膜染色スコアを示すグラフであって、Ｄ−パンテチンの濃度変化の影響を示している。
【図１２】ヘマトキシリンとエオシンで染色された角膜上皮の写真であって、（ａ）は、ノーマルマウス、（ｂ）は、ＤＥマウス、（ｃ）は、ＡｐｏＡ１で処理されたＤＥマウス、（ｄ）は、ＰＢＳで処理されたＤＥマウスの角膜上皮の写真である。
【図１３】ノーマルマウス、ＤＥマウス、ＰＢＳで処理されたＤＥマウス、及びＡｐｏＡ１で処理されたＤＥマウスの各グループの角膜上皮の平均厚さを示すグラフである。
【図１４】ノーマルマウス、ＤＥマウス、ＰＢＳで処理されたＤＥマウス、及びＡｐｏＡ１とＤ−パンテチンで処理されたＤＥマウスの各グループの角膜上皮の平均厚さを示すグラフである。
【図１５】ＤＥマウスグループとＡｐｏＡ１を含む点眼液で処理されたマウスグループの角膜上皮の平均厚さを示すグラフであって、ＡｐｏＡ１の濃度変化の影響を示している。
【図１６】ＤＥマウスグループとＡｐｏＡ１とＤ−パンテチンとを含む点眼液で処理されたマウスグループの角膜上皮の平均厚さを示すグラフであって、Ｄ−パンテチンの濃度変化の影響を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
ところで、かかる本発明に従う眼科用組成物は、アポリポタンパクＡ−１（ＡｐｏＡ１）を有効成分として、含有するところに、大きな特徴を有しており、例えば、ドライアイや角結膜に関する炎症、アレルギー性結膜炎、細菌性の角膜炎等の種々の角膜・結膜障害を治療するための点眼剤やコンタクトレンズに接触させるコンタクトレンズ用液剤等として、使用され得るものである。
【００２４】
ここで、有効成分であるＡｐｏＡ１は、前述するように、脂質の代謝に関与するアポリポタンパクの一種であり、ＬＣＡＴ活性化機能を有していることや、抗炎症効果を発揮することが知られている。そして、このようなＡｐｏＡ１を眼科用組成物における有効成分として採用することにより、涙液層を構成する油層のバリア機能が効果的に改善されて、角膜上皮細胞の欠損（角膜上皮の薄層化）等が有利に抑制され、角膜の炎症や結膜の炎症等を含むドライアイの症状が効果的に抑制乃至は改善されるようになるのである。また、アポリポタンパクＡ−１の抗炎症作用や抗菌作用により、角結膜に関する炎症や、アレルギー性結膜炎、細菌性の角膜炎等の角膜・結膜障害も有利に抑制乃至は改善され得るようになる。
【００２５】
なお、かかるＡｐｏＡ１は、固体の形態又は水溶液の形態で、商業的に入手することが出来るが、本発明に従う眼科用組成物を、眼に適用したり、或いはコンタクトレンズに接触させる等して、使用するに際しては、溶液形態、特に水溶液の形態とされる。
【００２６】
即ち、本発明に従う眼科用組成物は、粉末、顆粒、錠剤、液剤等の何れの剤型をも採用可能であるが、使用に際しては、水系媒体を主体とする水溶液の形態（液剤型）が採用されることとなる。従って、以下に示す各成分の濃度は、使用時の水溶液の形態における濃度を示している。
【００２７】
そして、有効成分であるＡｐｏＡ１の濃度にあっては、適宜に設定されるものの、その濃度が薄くなり過ぎると、目的とするドライアイの抑制乃至は改善効果が充分に得られなくなる一方、余りにも濃くなり過ぎると、眼科用組成物が泡立ちやすくなることが懸念されるところから、好ましくは０．００１〜１ｗ／ｖ％、より好ましくは０．０１〜０．５ｗ／ｖ％、更に好ましくは０．０４〜０．２ｗ／ｖ％の範囲で含有せしめられることが望ましい。
【００２８】
また、上記ＡｐｏＡ１を有効成分として含有する、本発明に従う眼科用組成物には、ＡｐｏＡ１に加えて、ビタミンＢ５類を更に含有させることが好ましく、これによって、ＡｐｏＡ１によるドライアイ抑制乃至は改善効果を相乗的に高めることが出来るようになるのである。
【００２９】
そして、ビタミンＢ５類の具体例としては、例えば、パントテン酸又はその塩、パンテチン、パンテテイン、パンテノール、パントテニルエチルエーテル、アセチルパントテニルエチルエーテル等が挙げられ、これらのうちの１種が単独で、或いは２種以上が組み合わされて使用される。これらの中でも、パンテチンが、特に好適に採用される。
【００３０】
ここで、パンテチンは、ビタミンＢ５の誘導体であり、酸化的代謝に関わるコエンザイムＡ（ＣｏＡ）の前駆体である。パンテチンは、炭水化物、脂質とアミノ酸代謝を含む幾つかの代謝経路に関わる共同因子のレベルを上昇させるその能力により、脂質代謝をサポートする。また、ＣｏＡは、アセチル基と結合し、エネルギー生産における重要な因子である、アセチルＣｏＡを形成する。また、パンテチンは、高比重コレステロール（ＨＤＬ）の血中濃度を増加させ、低比重コレステロール（ＬＤＬ）の濃度を減少させる。それはまた、角膜上皮を含む再−上皮形成の増強効果を有している。パンテチンを含む人工涙液の滴下は、角膜上皮の浸透性の障害を著しく改善することが期待されるのである。
【００３１】
なお、上記ビタミンＢ５類の濃度は、適宜に設定され、特に限定されるものではないものの、その濃度が薄く過ぎると、使用による効果が充分に発揮されなくなる一方、濃くなり過ぎると、粘着き感が強くなって瞬きの邪魔になるおそれがあるところから、好ましくは０．００５〜２ｗ／ｖ％、より好ましくは０．０５〜０．５ｗ／ｖ％、更に好ましくは０．１〜０．２ｗ／ｖ％の範囲で含有されることが望ましい。
【００３２】
また、ビタミンＢ５類を配合する場合、ＡｐｏＡ１とビタミンＢ５類との配合割合は、特に制限されるものではないものの、好ましくは、４：５〜１：５、さらに好ましくは、２：５〜１：５とされることが望ましく、このような配合割合を採用することによって、２成分による相乗効果をより一層効率的に得ることが可能となる。
【００３３】
ところで、本発明に従う眼科用組成物においては、ＡｐｏＡ１やビタミンＢ５類の他にも、更に必要に応じて、点眼剤やコンタクトレンズ用液剤等の眼科用組成物に用いられている各種の添加成分のうちの１種が又は２種以上が適宜に選択されて、通常の添加割合において添加せしめられていても、何等差し支えない。なお、そのような添加成分は、生体への安全性が高く、尚且つ眼科的に充分に許容され、コンタクトレンズの形状又は物性に対する影響のないものであることが好ましく、また、そういった要件を満たす量的範囲内で用いられることが望ましいのであり、これによって、本発明の効果を何等阻害することなく、その添加成分に応じた各種の機能を眼科用組成物に対して有利に付与することが出来る。
【００３４】
例えば、本発明に従う眼科用組成物にあっては、使用時に、その浸透圧が大きくなり過ぎても、逆に小さくなり過ぎても、眼に対して刺激を与えたり、眼障害を招来するおそれがあるところから、浸透圧は、等張化剤等を添加することによって、通常、２００〜３５０ｍＯｓｍ／Ｌ程度に調整されていることが、望ましい。なお、かかる浸透圧の調整に用いられる等張化剤としては、一般に、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、糖アルコール、及び多価アルコール若しくはそのエーテル又はそのエステルを挙げることが出来、それらのうちの１種が単独で乃至は２種以上が組み合わされて用いられることとなる。
【００３５】
また、眼科用組成物にあっては、そのｐＨ値が大きくなり過ぎても、逆に小さくなり過ぎても、眼に対して刺激を与えたり、眼障害を招来するおそれがあるところから、通常、そのような眼科用組成物のｐＨ値は、適当なｐＨ調整剤や緩衝剤等の添加によって、５．３〜８．５程度、中でも７．０付近に調整されることが望ましい。なお、そのようなｐＨの調整のために用いられるｐＨ調整剤としては、水酸化ナトリウムや塩酸等が利用される一方、眼科用組成物のｐＨを前記した範囲に有効に且つ眼に対して安全な範囲に保つための緩衝剤としては、具体的には、例えば、リン酸、ホウ酸、カルボン酸、オキシカルボン酸等の酸や、その塩（例えば、ナトリウム塩等）、更にはＧｏｏｄ−Ｂｕｆｆｅｒやトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、炭酸水素ナトリウム等を、眼に対して安全であり、しかもコンタクトレンズに対する影響を少なくすることが出来るという理由から、挙げることが出来、それらの公知の各種のものの中から、適宜に選択されて、用いられることとなる。
【００３６】
さらに、本発明の眼科用組成物において、眼やコンタクトレンズに対する消毒効果乃至は殺菌効果、更には、眼科用組成物の防腐・保存効果を有利に発現させるためには、防腐効力乃至は殺菌効力を有する防腐剤や殺菌剤が添加せしめられる。なお、そのような防腐剤や殺菌剤としては、一般に、防腐乃至は殺菌効力と共に、眼やコンタクトレンズへの適合性に優れたもの、更には、アレルギー等の障害の要因となり難いものが望ましく、公知の各種のものの中から、適宜なものが選定され、単独で或いは複数を組み合わせて用いることが出来る。
【００３７】
因みに、防腐剤としては、例えば、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、安息香酸或いはその塩、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸ブチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸メチル、クロロブタノール、過ホウ酸或いは過ホウ酸ナトリウムのような過ホウ酸塩等が挙げられる。また一方、殺菌剤としては、例えば、ポリヘキサメチレンビグアニド（ＰＨＭＢ）等のビグアニド系殺菌剤やポリクオタニウム等の４級アンモニウム塩系殺菌剤等を挙げることが出来る。なお、例えば、本発明に従う眼科用組成物を点眼剤の形態で用いる際において、上記した防腐剤や殺菌剤を用いない場合には、本発明に従う眼科用組成物を、１回で使い切るシングルドーズタイプとして用いたり、フィルター付き吐出容器を使用するマルチドーズタイプとして用いることも可能である。
【００３８】
また、コンタクトレンズ、特にソフトコンタクトレンズには、一般に、涙液からの汚れとして、カルシウム等が沈着乃至は吸着する可能性があることから、そのようなカルシウム等の沈着乃至は吸着を防止するためには、キレート化剤が、添加されても良い。そのようなキレート化剤としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びその塩、例えばエチレンジアミン四酢酸・２ナトリウム（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）、エチレンジアミン四酢酸・３ナトリウム（ＥＤＴＡ・３Ｎａ）等が挙げられる。
【００３９】
加えて、本発明に従う眼科用組成物には、角膜上やコンタクトレンズに付着した眼脂汚れ等を除去乃至は洗浄するために、公知のアニオン系界面活性剤、両性界面活性剤、カチオン系界面活性剤、非イオン系界面活性剤等の界面活性剤が、添加、含有せしめられていても良い。
【００４０】
そして、そのような界面活性剤の具体例としては、例えば、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンエチレンジアミン、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルホルムアルデヒド縮合物、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレンステロール、ポリオキシエチレン水素添加ステロール、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンラノリンアルコール、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルキルアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリソルベート等を挙げることが出来、単独で或いは複数を組み合わせて用いることが出来る。
【００４１】
また、本発明において、粘度を適度に調整すると共に、角膜上における滞留時間を延ばしたりするために、粘稠剤（増粘剤）を添加することが出来、かかる粘稠剤の添加によって、眼科用組成物中に含有せしめられた有効成分による作用を持続させて、乾燥感等の眼の不快感をより一層有利に低減することが可能となる。なお、そのような粘稠剤としては、例えば、グルコン酸及びその塩；コンドロイチン硫酸やその塩の如きムコ多糖類；ヒアルロン酸やその塩；ヘテロ多糖類や多糖類等の種々のガム類；ポリビニルアルコール、ポリ−Ｎ−ビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリアクリルアミド等の合成有機高分子化合物；ポリクオタニウム−１０の如きカチオン化セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース等のセルロース誘導体；スターチ誘導体等が有利に用いられる。
【００４２】
また、点眼時に爽快感を与えたり、コンタクトレンズ装用時の異物感や痒みを解消すること等を目的として、メントール、ボルネオール、カンフル、ゲラニオール、ユーカリ油、ベルガモット油、ウィキョウ油、ハッカ油、ローズ油、クールミント等の清涼化剤を添加せしめることも、可能である。
【００４３】
この他にも、本発明に従う眼科用組成物には、ビタミンＡ類（パルミチン酸レチノール、β−カロチン等を含む）、ビタミンＢ2 、Ｂ6 、Ｂ12、酢酸ｄ−α−トコフェロール等のビタミンＥ類等のビタミン類や、硝酸ナファゾリン、塩酸テトラヒドロゾリン等の血管収縮剤、アスパラギン酸及びその塩、アミノエチルスルホン酸、アルギニン、アラニン、リジン、グルタミン酸等のアミノ酸類等、各種添加成分を、目的とする眼科用組成物の用途に応じて、適宜、添加することが可能である。
【００４４】
ところで、かかる本発明に従う眼科用組成物は、上述の如き成分を、従来と同様に、適当な水系媒体中にそれぞれ適量において添加、含有せしめることにより、調製されることとなるのであるが、それに際して用いられる水系媒体としては、水道水や精製水、蒸留水等の水そのものの他にも、生理食塩水や緩衝液等の水を主体とする溶液であれば、生体への安全性が高く、尚且つ眼科的に充分に許容され得るものである限り、何れも利用することが可能であることは、言うまでもないところである。
【００４５】
また、上述の如き成分を含有せしめてなる、本発明に従う眼科用組成物を調製するにあたっては、何等特殊な方法を必要とせず、通常の水溶液を調製する場合と同様に、水系媒体中に各成分を溶解させることにより、容易に得ることが出来る。更に、液剤型以外の粉末、顆粒、錠剤等の固体型の眼科用組成物を調製する場合には、上述のようにして液剤型の眼科用組成物を一旦調製した後、凍結乾燥や減圧乾燥等の公知の乾燥手法により、水分を飛ばすようにすれば良く、このような固体型にすれば、保存し易くなるといったメリットがある。なお、固体型の眼科用組成物は、使用直前に、上述せる如き好ましい濃度範囲となるように、所定量の水系媒体に溶解されて、使用されることとなる。液剤型の眼科用組成物を調整する場合には、液剤は、眼科用組成物が使用される直前に、上述せる如き好ましい濃度範囲になるように、希釈するようにすれば良い。
【００４６】
そして、以上のようにして得られる本発明に従う眼科用組成物は、ドライアイ、角結膜炎等の角膜障害に対して有効であり、また、コンタクトレンズの規格変化等の悪影響を惹起するものではないことから、点眼剤や、コンタクトレンズ用点眼液、コンタクトレンズ用マルチパーパスソリューション等のコンタクトレンズ用液剤として、有利に用いられるのである。
【００４７】
例えば、本発明に従う眼科用組成物を、点眼液として用いる場合には、従来から公知の点眼剤乃至は点眼薬と同様に、適量を１日に１〜数回点眼すれば良い。
【００４８】
そして、本発明に従う眼科用組成物が眼に投与されると、ＡｐｏＡ１により細胞内のコレステロールのエステル化が促されて、マイボーム腺の機能が改善され、以て、油層によるバリア機能が効果的に発揮されるようになる。これにより、ドライアイ、角結膜炎等の角膜障害が抑制乃至は改善されるようになるのである。更に、ＡｐｏＡ１の抗炎症作用や抗菌作用により、角結膜に関する炎症や、アレルギー性結膜炎、細菌性の角膜炎等の角膜・結膜障害も有利に緩和されたり、抑制されるようになる。
【００４９】
なお、本発明に従う眼科用組成物は、コンタクトレンズに対しても、何等悪影響を及ぼすものではなく、点眼に際しては、コンタクトレンズの装用の有無が何等問われることはないのである。
【００５０】
また、本発明に従う眼科用組成物を、点眼以外の用途のコンタクトレンズ用液剤として用いる場合には、例えば、かかる眼科用組成物にてコンタクトレンズの洗浄乃至はすすぎを行ない、その後、そのコンタクトレンズの表面に眼科用組成物が付着した状態のまま、コンタクトレンズを装用したり、或いは、かかる眼科用組成物中にコンタクトレンズを一定時間浸漬して保存せしめた後、そのコンタクトレンズを取り出し、そのまま装用するようにすれば良い。このように使用すれば、コンタクトレンズを介して有効成分が眼に投与されることとなって、ドライアイ等の症状が抑制乃至は改善される等、本発明による効果が有利に発揮されるのである。
【００５１】
なお、上記したコンタクトレンズ用液剤としては、例えば、単一の用途を目的とする、コンタクトレンズ用洗浄液、コンタクトレンズ用濯ぎ液、コンタクトレンズ保存液等の他、洗浄、濯ぎ及び保存等の複数の用途を目的とする、マルチパーパスソリューションを挙げることが出来る。
【００５２】
また、本発明に従う眼科用組成物を、コンタクトレンズ用点眼液やコンタクトレンズ用マルチパーパスソリューション等のコンタクトレンズ用液剤として用いた際に、その対象となるコンタクトレンズとしては、その種類が何等限定されるものではなく、例えば、非含水、低含水、高含水等の全てに分類されるソフトコンタクトレンズ、及びハードコンタクトレンズがその対象となり得るのであって、コンタクトレンズの材質等が、本発明の適用に際して何等問われることはない。
【実施例】
【００５３】
以下に、本発明の実施例を示し、本発明を更に具体的に明らかにすることとするが、本発明が、そのような実施例の記載によって、何等の制約をも受けるものでないことは、言うまでもないところである。また、本発明には、以下の実施例の他にも、更には上記の具体的記述以外にも、本発明の趣旨を逸脱しない限りにおいて、当業者の知識に基づいて種々なる変更、修正、改良等を加え得るものであることが、理解されるべきである。
【００５４】
また、下記実施例における全ての統計データは、 Pair-Wise comparisons via Turkey test を用いた一元配置分散分析で計算された。
【００５５】
−ＳＶ−４０不死化培養細胞株（ＨＣＥＴ）を用いた in vitro 実験−
角膜上皮細胞への高浸透圧ストレスの影響と、アポリポタンパクのｍＲＮＡ遺伝子発現における影響が実験された。ＨＣＥＴ細胞が、３７℃でインキュベートされた高浸透圧培地（５００ｍＯｓｍ／Ｌ）で、３時間、６時間及び１晩、刺激された。なお、細胞培地は、ＤＭＥＭ媒体と次のような組成である；
ＤＭＥＭ／Ｆ１２ ９５ｍＬ
ＦＢＳ ５ｍＬ
７．５％ＮａＨＣＯ3 ２．４ｍＬ
抗生物質−抗真菌剤 １ｍＬ
５ｍｇ／ｍＬ インスリン ０．１ｍＬ
【００５６】
培養後、細胞はＲＮＡ抽出用のＴＲＩｚｏｌに溶解し、その後、フェノールとエタノール沈殿で精製した。そして、ＳＡＧＥ分析、ＲＴ−ＰＣＲ分析及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析にて、ｍＲＮＡ遺伝子発現を調べた。得られたＳＡＧＥ分析データを下記表１に、また、ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を図２に、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を図３及び図４にそれぞれ示した。なお、ＲＴ−ＰＣＲ分析及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析で使用したプライマーは、以下の通りである；
【００５７】
＜ＲＴ−ＰＣＲ分析で使用したプライマー＞
アポリポタンパクＡ−１ Forward 5'-GTACGTGGATGTGCTCAAAGAC-3'
Reverse 5'-CTCCAGATCCTTGCTCATCTCT-3'
アポリポタンパクＡ−５ Forward 5'-CAGATAATGGCAAGCATGGCT-3'
Reverse 5'-GTCTGGCTGAAGTAGTCCCAGAAG-3'
アポリポタンパクＥ Forward 5'-GCAGGAAGATGAAGGTTCTGTG-3'
Reverse 5'-CCTTCAACTCCTTCATGGTCTC-3'
アポリポタンパクＢ Forward 5'-AGTCTTCCTTATACCCAGACTTTGC-3'
Reverse 5'-GTACAAGTTGCTGTAGACATTCGTG-3'
アポリポタンパクＣ−１ Forward 5'-CTCCAGTGCCTTGGATAAGC-3'
Reverse 5'-GGTGTGGGAAATTTCAGAGG-3'
【００５８】
＜リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析で使用したプライマー＞
アポリポタンパクＡ−１ Forward 5'-GCTCAAAGACAGCGGCAGAG-3'
Reverse 5'-AGGTCACGCTGTCCCAGTTG-3'
アポリポタンパクＡ−５ Forward 5'-GAAAGGCTTCTGGGACTACTTCAG-3'
Reverse 5'-AGATCCATCGTGTAGGGCTTC-3'
アポリポタンパクＥ Forward 5'-GCCAATCACAGGCAGGAAGA-3'
Reverse 5'-GCTCTGTCTCCACCGCTTG-3'
アポリポタンパクＣ−１ Forward 5'-CTCCAGCAAGGATTCAGAGTG-3'
Reverse 5'-CTTCAGGTCCTCATGAGTCAATC-3'
【００５９】
【表１】
【００６０】
図２には、アポリポタンパク遺伝子発現のゲル電気泳動が示されているが、このデータから、ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＡ５、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＣ１が、ヒト角膜上皮細胞で発現されたことがわかる。しかし、ＡｐｏＢの発現は、検出されなかった。なお、図２中、Ｍは、ＤＮＡマーカーである。
【００６１】
図３及び図４には、コントロールに対するｍＲＮＡ発現量比の相対変化が示されている。図３、４中、コントロールは、高浸透圧下で刺激されないものを、３時間、６時間、及び一晩中は、それぞれ、高浸透圧下で３時間、６時間、及び一晩中刺激されたものを示している。かかる図３によれば、高浸透圧ストレスによって刺激されたＨＣＥＴ細胞におけるＡｐｏＡ１のｍＲＮＡ発現量が、減少していることが認められる。これに対し、図４によれば、高浸透圧ストレスによって刺激されたＨＣＥＴ細胞おけるＡｐｏＡ５、ＡｐｏＥ及びＡｐｏＣ１のｍＲＮＡ発現量は、増加していることが認められる。このため、ＡｐｏＡ１は、高浸透圧下で、他のアポリポタンパクとは異なる挙動を示すことが、明らかとなった。なお、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲデータ（蛍光強度）は、１８Ｓ ＲＮＡで標準化された。ＡｐｏＡ１では、ｎ＝６、他のアポリポタンパクでは、ｎ＝４〜５の独立した実験を行なった（平均±標準偏差）。
【００６２】
−実験用ドライアイマウスを用いた in vivo 研究−
＜ドライアイマウスモデル＞
生後１０〜１２週の C57BL/6J マウスが研究で用いられた。すべての研究は、 "ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research" に従って行なわれた。マウスモデルは、背中に、０．５ｍｇ／０．２ｍＬの臭化水素酸スコポラミン（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を、１日４回、ＡＭ９時、ＰＭ１２時、ＰＭ３時及びＰＭ６時に投与する皮下注射により作られた。また、正常対象物（ノーマルマウス）として、未処置の年齢をマッチさせたマウスが使用された（Investigative Ophthalmology and Visual Science. 45:p4293-4301, 2004参照）。
【００６３】
＜動物＞
生後１０週の雄の C57BL/6J Jms Slc マウスが購入され、それらは、実験前に、隔離され、標準状態下：室温２３±２℃、相対湿度６０％±１０％で、１週間の期間、慣らされた。
【００６４】
＜乾燥手順＞
マウスは、５日間、１日４回、０．５ｍｇ／０．２ｍＬの臭化水素酸スコポラミンを皮下注射された。乾燥した環境ストレスは、マウスのケージを、連続的な通気ブロワー（２３±２℃の室温、６０％±１０％の相対湿度）の送風機のフードの中に配置することによって作り出された。後述する涙の産生量の測定は、処置前、処置後３日目、５日目に評価された。
【００６５】
＜局所の点眼液適用＞
乾燥の間、各マウスの一方の眼はＡｐｏＡ１（Sigma-Aldrich, Japnan） を含む点眼液又はＡｐｏА１とＤ−パンテチン（Sigma-Aldrich, Japnan） とを含む点眼液で処理され、他方の眼は、コントロールとして、ＰＢＳを点した。５μｌの点眼液が、５日間、１日４回、乾燥処理の間、投与された。すべての点眼剤が、ＰＢＳで形成され、浸透圧は、２９０〜３００ｍＯｓｍ／Ｌ、ｐＨ７．４に調整された。０．０１ＭのＰＢと塩（１２５ｍＭ）で、標準の浸透圧（３００ｍＯｓｍ／Ｌ）のＰＢＳを調製した。０．０１ＭのＰＢＳを１リットル調製するには、次の量が必要となる；
ＮａＣｌ (M.W. 58.44) 7.3 g ( 250 mOsm/L )
Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ (M.W. 358.14) 3.5814 g ( 30 mOsm/L )
ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ (M.W. 156) 1.56 g ( 20 mOsm/L )
【００６６】
（１）涙の産生量の測定
前述した臭化水素酸スコポラミンの皮下注射とブロワーによる乾燥（以下、両処理を併せて「ＤＥ処理」と、略記する。）によって、マウスの眼が、ドライアイとなっているかどうかを確認するために、フェノールレッド糸テストが行なわれた。具体的には、涙の産生量が、標準化されたフェノールレッドを染みこませた綿糸（Zone-Quick ;（株）メニコン、日本）を用いて測定された。糸は、無麻酔のマウスの外眼角の眼表面に、６０秒間、適用された。６０秒後、糸の色の変化の長さ（涙によって濡れた糸の長さ）が、ｍｍで測定された。また、糸の濡れた長さは、１ｍｍの精度で測定された。
【００６７】
そして、図５に、ＤＥ処理されたマウス（以下、「ＤＥマウス」と呼称する）におけるフェノールレッド糸テストの結果を示し（平均±標準偏差、ｎ＝６眼）、また、図６に、０．０４ｗ／ｖ％のＡｐｏＡ１を含む点眼液が点眼されたＤＥマウスにおけるフェノールレッド糸テストの結果を示した（平均±標準偏差、ｎ＝１２眼、ｐ値＜０．０１）。更に、図７に、０．０４ｗ／ｖ％のＡｐｏＡ１と０．１ｗ／ｖ％のＤ−パンテチンを含む点眼液が点眼されたＤＥマウスにおけるフェノールレッド糸テストの結果を示した（平均±標準偏差、ｎ＝１２眼、ｐ値＜０．０１）。かかる図５〜７中、Ｄａｙ１は、臭化水素酸スコポラミンの皮下注射とブロワーによる乾燥処理をする前のものであり、Ｄａｙ３及びＤａｙ５は、それぞれ、処理後３日目及び５日目のものである。
【００６８】
図５〜７から明らかなように、涙の分泌が、処理前のＤａｙ１と比較して、Ｄａｙ５では著しく減っており、臭化水素酸スコポラミンの皮下注射とブロワーによる乾燥（ＤＥ処理）によって、マウスの眼がドライアイとなったことを確認した。
【００６９】
（２）角膜フルオレセイン染色
前述のように、５日間に亘って処理されたマウスの眼に１μＬの１％フルオレセインナトリウム（Sigma-Aldrich, Japan）が局所適用された後、角膜フルオレセイン染色が、１０分後に評価され、光学顕微鏡（Leica Microsystems Inc., Deerfield, USA） で検査されて、顕微鏡に取り付けられたデジタルカメラ（CAMEDIA,オリンパス光学株式会社、日本）で撮影された。
【００７０】
角膜フルオレセイン染色は、角膜染色の面積に基づいて、下記表２及び表３のように、グレード分けされた（Nakamura S., Tsubota K et al., Investigative Ophthalmology and Visual Science. 46: p2379-2387, 2005） 。なお、下記表２，３中、Ｘは、角膜総面積に対する点状染色された面積の比を表している。
【００７１】
【表２】
【００７２】
【表３】
【００７３】
（２−１）ＡｐｏＡ１点眼液による効果
そして、図８に、０．０４ｗ／ｖ％のＡｐｏＡ１を含む点眼液又はＰＢＳ（ＡｐｏＡ１不含）で処理された６匹のＤＥマウス（マウス１〜６）の角膜染色スコアを示した。かかる図８から、ＡｐｏＡ１グループの平均スコアは、ＰＢＳグループの平均スコアと比べて２５％程度小さくなっている。
【００７４】
また、フルオレセインで染色された面積の定量的な測定を、画像分析ソフトウェア（NIH ImageJ, version 1.36; available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html） を用いて行なったところ、データは図示しないが、ＡｐｏＡ１グループの平均スコアが、ＰＢＳグループの平均スコアと比べて２０％減少していた。
【００７５】
これら等級スコアと定量的な測定によればＡｐｏＡ１は、乾燥による角膜上皮浸食の保護効果を有していると考えられる。
【００７６】
（２−２）ＡｐｏＡ１＋Ｄ−パンテチン点眼液による効果
また、図９には、０．０４ｗ／ｖ％のＡｐｏＡ１と０．０５ｗ／ｖ％のＤ−パンテチンとを含有する点眼液又はこれらの有効成分を含まないＰＢＳで処理された６匹のＤＥマウスの角膜染色スコアを示した。ＡｐｏＡ１とＤ−パンテチン（Ｄｐ）を組み合わせて処理した眼は、ＰＢＳで処理された眼に比べて、著しく改善されている。
【００７７】
（２−３）ＡｐｏＡ１の濃度変化の影響
図１０には、ＡｐｏＡ１の濃度変化の影響を見るために、ＰＢＳで処理したＤＥマウスと、ＡｐｏＡ１の濃度が、それぞれ、０．０１ｗ／ｖ％、０．０４ｗ／ｖ％、０．１ｗ／ｖ％である点眼液で処理されたＤＥマウスの角膜染色スコアのグラフが示されている。各列のデータは、各グループの平均グレードスコアを示している（平均±標準偏差、ＰＢＳ処理グループはｎ＝１２眼、０．０４ｗ／ｖ％のＡｐｏＡ１処理グループはｎ＝６眼、残りの薬物処理グループはｎ＝３眼、Ｐ値（＊）＜０．０１）。
【００７８】
図１０によれば、ＡｐｏＡ１（０．１ｗ／ｖ％）が、最も効果的な濃度である。
【００７９】
（２−４）Ｄ−パンテチンの濃度変化の影響
図１１には、Ｄ−パンテチンの濃度変化の影響を見るために、ＰＢＳで処理したＤＥマウスと、ＡｐｏＡ１の濃度を０．０４ｗ／ｖ％に固定して、Ｄ−パンテチンの濃度を、それぞれ、０．０５ｗ／ｖ％、０．１ｗ／ｖ％、０．２ｗ／ｖ％とした点眼液で処理されたＤＥマウスの角膜染色スコアのグラフが示されている。各列のデータは、各グループの平均グレードスコアを示している（平均±標準偏差、ＰＢＳ処理グループはｎ＝１２眼、ＡｐｏＡ１（０．０４ｗ／ｖ％）＋Ｄ−パンテチン（０．０５ｗ／ｖ％）処理グループはｎ＝６眼、残りの薬物処理グループはｎ＝３眼、Ｐ値（＊）＜０．０１）。
【００８０】
図１１によれば、ＡｐｏＡ１＋Ｄ−パンテチン（０．０４ｗ／ｖ％＋０．２ｗ／ｖ％）が、最も効果的な濃度である。
【００８１】
上記の角膜フルオレセイン染色実験による結論として、ＡｐｏＡ１は、用量依存的に、ドライアイ症候群に対して極めて効果的であることが示された。加えて、Ｄ−パンテチンを併用することにより、ＡｐｏＡ１の作用が相乗的に増強される。この作用は、用量依存的であるように思われる。
【００８２】
（３）組織学的研究
マウスの眼球が外科的に摘出され、１０％の中性に緩衝されたホルマリンで固定され、パラフィンに包埋された。そして、５μｍの厚さの組織切片がカットされ、ヘマトキシリンとエオシンで染色された。そして、眼の切断部分が検査され、カメディアデジタルカメラ、C-4040ズーム（オリンパス光学株式会社、日本）が備え付けられた Provis AX 70 顕微鏡（オリンパス光学株式会社、日本）で撮影された。厚さの顕微測光測定は、OB-M, 1/100, micro, AX0001 (オリンパス光学株式会社、日本）を使用することによって行なわれた。また、角膜上皮の厚さは、１０μｍの精度で測定された。
【００８３】
（３−１）ＡｐｏＡ１点眼液による効果
（ａ）ノーマルマウス、（ｂ）ＤＥマウス、（ｃ）０．０４ｗ／ｖ％のＡｐｏＡ１で処理されたＤＥマウス、（ｄ）ＰＢＳで処理されたＤＥマウスの各グループの６〜８の角膜が、この実験で使用された。
【００８４】
図１２に、各グループの代表的な角膜上皮の写真（倍率×１００倍）を示すと共に、図１３に、各グループの角膜上皮の平均厚さのグラフ（平均±標準偏差、ｎ＝６〜８角膜、Ｐ（＊）＜０．０１）を示した。
【００８５】
かかる図１２及び図１３によれば、ＤＥマウスの角膜上皮は、未処理のコントロールマウスの角膜上皮よりも著しく薄くなっている。また、角膜上皮の剥離に伴って起こる細胞層の薄層化は、ＡｐｏＡ１で処理された眼と比べて、ＰＢＳで処理された眼において、著しい。ＡｐｏＡ１で処理することにより、涙液層を構成する油層のバリア機能が有効に発揮され、角膜上皮が保護されることがわかる。
【００８６】
（３−２）ＡｐｏＡ１＋Ｄ−パンテチン点眼液による効果
また、図１４には、ノーマルマウス、ＤＥマウス、ＰＢＳで処理されたＤＥマウス、及び０．０４ｗ／ｖ％のＡｐｏＡ１と０．０５ｗ／ｖ％のＤ−パンテチンで処理されたＤＥマウスの角膜上皮厚さのグラフ（平均±標準偏差、ｎ＝６〜８角膜、Ｐ値（＊）＜０．０１）が示されている。
【００８７】
かかる図１４によれば、ＡｐｏＡ１＋Ｄ−パンテチン（０．０４ｗ／ｖ％＋０．０５ｗ／ｖ％）の組み合わせで処理されたグループが、大きな成果を挙げている。
【００８８】
（３−３）ＡｐｏＡ１の濃度変化の影響
図１５には、ＡｐｏＡ１の濃度変化の影響を見るために、ＤＥマウスグループと、ＡｐｏＡ１の濃度が、それぞれ、０．０１ｗ／ｖ％、０．０４ｗ／ｖ％、０．１ｗ／ｖ％である点眼液で処理されたＤＥマウスグループの角膜上皮厚さのグラフ（平均±標準偏差、ｎ＝３〜８角膜、Ｐ値は、＊＜０．０１、◆＜０．０５）が示されている。
【００８９】
図１５によれば、０．１ｗ／ｖ％のＡｐｏＡ１が、最も効果的な濃度である。
【００９０】
（３−４）Ｄ−パンテチンの濃度変化の影響
図１６には、Ｄ−パンテチンの濃度変化の影響を見るために、ＤＥマウスグループと、ＡｐｏＡ１の濃度を０．０４ｗ／ｖ％に固定して、Ｄ−パンテチンの濃度を、それぞれ、０．０５ｗ／ｖ％、０．１ｗ／ｖ％、０．２ｗ／ｖ％とした点眼液で処理されたＤＥマウスグループの角膜上皮厚さのグラフ（平均±標準偏差、ｎ＝３〜８角膜、Ｐ値（＊）＜０．０１）が示されている。
【００９１】
図１６によれば、Ｄ−パンテチンの添加によって、ＡｐｏＡ１の効果が相乗的に高められ、ＡｐｏＡ１＋Ｄ−パンテチン（０．０４ｗ／ｖ％＋０．２ｗ／ｖ％）が、最も効果的な濃度である。
【００９２】
上記の角膜上皮の厚さの測定実験による結論として、ＡｐｏＡ１は、ドライアイや角膜炎等において惹起される角膜上皮細胞の欠損（角膜上皮の薄層化）において、極めて有効であることが示された。加えて、Ｄ−パンテチンを併用することにより、ＡｐｏＡ１の作用が相乗的に増強される。この作用は、用量依存的であるように思われる。
【００９３】
上述した in vitro 及び in vivo 実験の両方のデータに基づき、ＡｐｏＡ１を含む点眼液は、ドライアイの発症や角膜炎に影響を与えると結論付けることが出来る。また、これらの知見から、ＡｐｏＡ１を含む眼科用組成物は、ドライアイを始め、角結膜に関する炎症や、アレルギー性結膜炎、細菌性の角膜炎等の種々の角膜・結膜障害に対して、臨床的応用が可能であると、思われる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、眼科用組成物に係り、特に、ドライアイや角結膜炎等の角膜・結膜障害を改善（治療）するのに有効な眼科用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、ドライアイの症状を訴える患者が増加しており、相当数の患者がドライアイに悩まされている。具体的には、３０〜６０歳ではその人口の１０％、６５歳以上ではその人口の１５％までもが、ドライアイの影響を受けていると言われており、影響を受けた概算人数は、アメリカで１０００万人〜１４００万人、日本ではおよそ８００万人にも及んでいる。また、コンタクトレンズの装用者の中にも、ドライアイに悩む患者が増加してきており、ドライアイがレンズ装用中止の主な原因となっている。
【０００３】
ドライアイは、眼瞼間の眼表面（即ち、露出した眼表面）に障害を惹起する、涙の欠乏又は過剰な涙の蒸発が原因となる涙液層の疾患であり、眼の不快感を伴うものである（非特許文献１）。また、ドライアイは、涙の分泌の減少と蒸発の増加に起因し、乾性角結膜炎（ＫＳＣ）における涙液層の高い浸透圧は、角膜や結膜で観られる疾患を惹起する重大な役割を果たしていること（非特許文献２）、更に、上昇した涙液層の浸透圧が直接的な原因となり、ドライアイの眼表面の疾患の進行を促進すること（非特許文献３〜６）が、報告されている。そして、かかるドライアイ疾患の進行の原因となる浸透圧の増大のメカニズムを、図１に示すが、かかる図１から明らかなように、浸透圧の増大は、一般に、（１）涙の分泌の減少と（２）涙の蒸発の増加によって惹起される。更に、前者の（１）涙の分泌の減少は、涙腺の疾患や角膜感覚の減少により惹起される一方、後者の（２）涙の蒸発の増加は、眼瞼裂の増大やマイボーム腺の機能不全により惹起される（非特許文献７参照）。加えて、ドライアイ症状の患者においては、特に、涙液層の高浸透圧化は、ＫＳＣの発症と診断において大きな要因であると主張されてきている（非特許文献８）。
【０００４】
さらに、ドライアイの症状は、しばしば、アレルギー性結膜炎の患者にも存在し、ドライアイとアレルギー性結膜炎、その他の眼の炎症が相互に関与しあっているとの報告もある（非特許文献９）。また、シェーグレン症候群（ＳＳ）や、乾性角結膜炎（ＫＣＳ）、重度のドライアイ症候群の患者は、健常者と比べて、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、及びＴＮＦ−αを含む多くの異なる炎症性サイトカインが、結膜上皮において増加していることが報告されている（非特許文献１０）。このため、一旦、涙分泌の減少によって、眼表面のバリア機能が低下すると、抗原と炎症性サイトカインの影響により、次には慢性化するおそれのある眼の炎症を患うリスクが増大する。
【０００５】
一方、角膜上皮表面を覆う涙液層は、角膜上皮側から順に、ムチン層（粘液層）、水液層、油層の３層で形成されている。これら３層のうちの最外層である油層の特性や厚さ、均一性が、涙層の安定化において重要な役割を果たしていることが明らかとなっている。この油層は、瞼にあるマイボーム腺から分泌される脂質にて主に構成されており、角膜上皮からの涙の蒸発やアレルゲン等の侵入を防ぐバリア機能を担っている。そして、マイボーム腺の機能が低下して脂質の分泌量が減少すると、油層が減って、涙が蒸発し、これにより、涙液の浸透圧が上昇し、ひいてはドライアイ等の眼障害が惹起されるようになるのである。
【０００６】
また、マイボーム腺の機能は、腺自体の遊離のコレステロール（ＦＣ）とコレステロールエステル（ＣＥ）の貯蔵量のレベルによって影響を受け（細胞内のコレステロールをエステル化する酵素である、コレステロールアシルトランスフェラーゼ：ＡＣＡＴ−１活性による）、また、ＣＥの蓄積及び貯蔵量の減少は、マイボーム腺の萎縮変化の原因となることが報告されており（非特許文献１１）、細胞内のコレステロールエステル値がマイボーム腺の萎縮をコントロールしていると考えられている。更に、脂質の代謝に関与するタンパク質であるアポリポタンパクの一種に、アポリポタンパクＣ−１（ＡｐｏＣ１）があるが、ヒトＡｐｏＣ１を過剰発現させたＡｐｏＣ１トランスジェニックマウスでは、マイボーム腺が激しく萎縮することが報告されている（非特許文献１２）。このようなマイボーム腺の萎縮は、脂質の分泌を減少させるため、コレステロールのエステル化を促し、マイボーム腺の働きを改善させることが望ましいのである。
【０００７】
かかる状況下、本発明者は、鋭意検討を重ねて、アポリポタンパクとドライアイの発症との間に相関関係があると仮定した。かかるアポリポタンパクには、その構造や働きにより、前記ＡｐｏＣ１の他にも、アポリポタンパクＡ−１（ＡｐｏＡ１）、Ａ２、Ａ５、Ｂ、Ｄ、Ｅ等の様々な型があるが、これらの中でも、後述するＲＴ−ＰＣＲ法による実験結果から、高比重リポタンパク（ＨＤＬ）の主要な構成成分であるＡｐｏＡ１に、特に着目した。
【０００８】
このＡｐｏＡ１は、コレステロールのエステル化に関与するレシチンコレステロールアシルトランスファーゼ（ＬＣＡＴ）を活性化することが知られており、このＬＣＡＴ活性化によって、ＨＤＬのコレステロール輸送が高められるため、動脈硬化や心筋梗塞等の心臓病予防に有用であるとされている。また、ドライアイの原因とされる高浸透圧ストレスは、炎症性サイトカインであるＩＬ−１β及びＴＮＦ−αの発現と産生を促すことによって、眼表面の炎症を惹起させるのであるが、ＡｐｏＡ１は、抗炎症性サイトカイン、ＩＬ−１０の発現を強めることにより、また、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６を抑制する作用により、抗炎症効果を有していると報告されている（非特許文献１３−１９）。更に、ＡｐｏＡ１は、リポ多糖（ＬＰＳ又はエンドドキシン）に結合する、ＨＤＬの抗エンドドキシン機能の主な貢献者であり、ＨＤＬとＡｐｏＡ１とが、ＬＰＳ毒性を中和し、サイトカインの産生の誘発を低減することも、報告されている（非特許文献２０−２３）。このＡｐｏＡ１の作用が、グラム陰性菌感染の発病や兆候から保護する役割を果たしている。また更に、ＡｐｏＡ１は、表皮ブドウ球菌や単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）によって誘発される細胞融合に対する抑制作用を有している（非特許文献２４−２６）。
【０００９】
ところで、特許文献１には、ＡｐｏＡ１とは異なるクラスに分類されるアポリポタンパクＪ（ＡｐｏＪ）を有効成分とする角膜障害治療剤が提案されているが、そこにおいて、ＡｐｏＪは、３層からなる涙液層のうちのムチン層を構成するムチンの分泌に関与していることが明らかにされているのであって、油層によるバリア機能については、何等明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平９−２２７４０１号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Lemp MA. Report of the National Eye Institute/ Industry workshop on Clinical Trials in Dry Eyes. CLAO J, 21: p221-232, 1995
【非特許文献２】Arch Ophthalmology, 96(4): p677-681, 1978
【非特許文献３】Acta Ophthalmologica, 61: p108-116, 1983
【非特許文献４】Ophthalmology, 92: p646-650, 1985
【非特許文献５】Am. J. Ophthalmology, 102: p505-507, 1986
【非特許文献６】Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 29: p374-378, 1988
【非特許文献７】W.B Saunders Company, Philadelphia, In Albert DM, Jakobiec FA(eds): Principles and Practice of Ophthalmology, p257-276, 1994
【非特許文献８】Adv. Exp. Med. Biol., 350: p495-503, 1994
【非特許文献９】ドライアイクリニック, 坪田編集, ２０００年出版, 医学書院, 日本語版
【非特許文献１０】Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 42(10): p2283-2292, 2001
【非特許文献１１】J. Biol. Chem., 275(28): p21324-21330, 2000
【非特許文献１２】J. Clin. Invest., 101(1): p145-152, 1998
【非特許文献１３】Blood, 15, 97(8): p2381-2389, 2001
【非特許文献１４】Circulation, 106: p1127-1132, 2002
【非特許文献１５】Circulation, 103(1): p108-112, 2001
【非特許文献１６】Bio. Chem. Biophys. Acta, 13; 1623(2-3): p120-128, 2003
【非特許文献１７】Lipids, 37(9): p925-928, 2002
【非特許文献１８】Ann N Y Acad Sci, 966: p464-473, 2002
【非特許文献１９】Infection and Immunity, Vol 61, No.12, 1993
【非特許文献２０】Acta Biochim. Biophys. Sin. (Shanghai), 36(6): p419-424, 2004
【非特許文献２１】Eur. J. Biochem., 269: p5972-5981, 2002
【非特許文献２２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: p12040-12044, 1993
【非特許文献２３】Circ. Res., 97(3): p236-243, 2005
【非特許文献２４】Mol Cell Biochem., 119(1-2): p171-178, 1993
【非特許文献２５】Virology, 176(1): p48-57, 1990
【非特許文献２６】J. Cell Biochem., 45(2): p224-237, 1991
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ここにおいて、本発明は、かかる事情を背景にして為されたものであって、その解決課題とするところは、涙液層を構成する油層のバリア機能を高めて、ドライアイ等の角膜障害を抑制乃至は改善し得る眼科用組成物を提供することにある。また、別の解決課題とするところは、抗炎症作用や抗菌作用を発揮せしめて、角結膜炎等の角膜・結膜障害を有利に抑制乃至は改善し得る眼科用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
そして、本発明者は、そのような課題を解決すべく、先ず、ドライアイの際に眼表面で生じている高浸透圧がアポリポタンパクに与える影響を調査した。具体的には、高浸透圧下におけるアポリポタンパクｍＲＮＡ遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲで調べた。その結果、高浸透圧下では、アポリポタンパクＡ−１の発現量が減少したのである。そして、本発明者が、更なる検討を重ねた結果、アポリポタンパクＡ−１を含む溶液を点眼することによって、ドライアイによる角膜障害が抑制乃至は改善されることを、見出したのである。
【００１４】
従って、本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものであって、その要旨とするところは、アポリポタンパクＡ−１を有効成分として含有することを特徴とする眼科用組成物にある。
【００１５】
また、そのような本発明に従う眼科用組成物における好ましい態様によれば、ビタミンＢ５類より選ばれる少なくとも１種の化合物が、更に含有されている構成が、採用され、また、かかるビタミンＢ５類としては、Ｄ−パンテチンが好適に採用される。
【００１６】
さらに、本発明の別の好ましい態様においては、前記眼科用組成物が、角膜障害治療用組成物として用いられる。また、かかる角膜障害としては、例えば、ドライアイ等があり、本発明に従う眼科用組成物により、ドライアイが効果的に治療され得る。
【００１７】
加えて、本発明の更に別の態様においては、前記眼科用組成物が、点眼剤又はコンタクトレンズ用液剤として、用いられる。
【００１８】
また、本発明に従う眼科用組成物の他の好ましい態様によれば、前記アポリポタンパクＡ−１が、０．００１〜１ｗ／ｖ％の割合で含有される一方、前記ビタミンＢ５類が、０．００５〜２ｗ／ｖ％の割合で含有される構成が、採用されることとなる。
【発明の効果】
【００１９】
このように、本発明に従う眼科用組成物にあっては、アポリポタンパクＡ−１が含有されているところから、涙液層を構成する油層のバリア機能が向上して、ドライアイ等の角膜障害が効果的に抑制乃至は改善されるのである。
【００２０】
また、かかるアポリポタンパクＡ−１の抗炎症作用や抗菌作用が、眼表面においても発揮されて、角結膜炎等の角膜・結膜障害も有利に抑制乃至は改善され得るようになる。
【００２１】
さらに、本発明に従う眼科用組成物の好ましい態様に従って、アポリポタンパクＡ−１とＤ−パンテチン等のビタミンＢ５類を併用すれば、２成分のシナジー効果によって、ドライアイや角結膜炎等の角膜・結膜障害がより一層効果的に抑制乃至は改善され得るのである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】W.B Saunders Company, Philadelphia, In Albert DM, Jakobiec FA (eds): Principles and Practice of Ophthalmology, (p257-276, 1994) の図を修正したものであって、ドライアイ疾患の進行の原因となる浸透圧の増大のメカニズムを示す図である。
【図２】アポリポタンパク遺伝子発現のゲル電気泳動を示す図である。
【図３】高浸透圧ストレスによって刺激されたＨＣＥＴ細胞でのＡｐｏＡ１のｍＲＮＡ発現を相対的に示すグラフである。
【図４】高浸透圧ストレスによって刺激されたＨＣＥＴ細胞でのＡｐｏＡ５、ＡｐｏＥ及びＡｐｏＣ１のｍＲＮＡ発現を相対的に示すグラフである。
【図５】臭化水素酸スコポラミンの皮下注射とブロワーによる乾燥処理が行なわれたマウス（ＤＥマウス）におけるフェノールレッド糸テストの結果を示すグラフである。
【図６】ＡｐｏＡ１で処理されたＤＥマウスにおけるフェノールレッド糸テストの結果を示すグラフである。
【図７】ＡｐｏＡ１とＤ−パンテチンで処理されたＤＥマウスにおけるフェノールレッド糸テストの結果を示すグラフである。
【図８】ＡｐｏＡ１を含む点眼液又は有効成分を含まないＰＢＳで処理された６匹のＤＥマウス（マウス１〜６）の角膜染色スコアを示すグラフである。
【図９】ＡｐｏＡ１とＤ−パンテチン（Ｄｐ）とを含有する点眼液又はこれらの有効成分を含まないＰＢＳで処理された６匹のＤＥマウス（マウス１〜６）の角膜染色スコアを示すグラフである。
【図１０】有効成分を含まないＰＢＳ又はＡｐｏＡ１を含む点眼液で処理されたＤＥマウスの角膜染色スコアを示すグラフであって、ＡｐｏＡ１の濃度変化の影響を示している。
【図１１】有効成分を含まないＰＢＳ又はＡｐｏＡ１とＤ−パンテチンとを含有する点眼液で処理されたＤＥマウスの角膜染色スコアを示すグラフであって、Ｄ−パンテチンの濃度変化の影響を示している。
【図１２】ヘマトキシリンとエオシンで染色された角膜上皮の写真であって、（ａ）は、ノーマルマウス、（ｂ）は、ＤＥマウス、（ｃ）は、ＡｐｏＡ１で処理されたＤＥマウス、（ｄ）は、ＰＢＳで処理されたＤＥマウスの角膜上皮の写真である。
【図１３】ノーマルマウス、ＤＥマウス、ＰＢＳで処理されたＤＥマウス、及びＡｐｏＡ１で処理されたＤＥマウスの各グループの角膜上皮の平均厚さを示すグラフである。
【図１４】ノーマルマウス、ＤＥマウス、ＰＢＳで処理されたＤＥマウス、及びＡｐｏＡ１とＤ−パンテチンで処理されたＤＥマウスの各グループの角膜上皮の平均厚さを示すグラフである。
【図１５】ＤＥマウスグループとＡｐｏＡ１を含む点眼液で処理されたマウスグループの角膜上皮の平均厚さを示すグラフであって、ＡｐｏＡ１の濃度変化の影響を示している。
【図１６】ＤＥマウスグループとＡｐｏＡ１とＤ−パンテチンとを含む点眼液で処理されたマウスグループの角膜上皮の平均厚さを示すグラフであって、Ｄ−パンテチンの濃度変化の影響を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
ところで、かかる本発明に従う眼科用組成物は、アポリポタンパクＡ−１（ＡｐｏＡ１）を有効成分として、含有するところに、大きな特徴を有しており、例えば、ドライアイや角結膜に関する炎症、アレルギー性結膜炎、細菌性の角膜炎等の種々の角膜・結膜障害を治療するための点眼剤やコンタクトレンズに接触させるコンタクトレンズ用液剤等として、使用され得るものである。
【００２４】
ここで、有効成分であるＡｐｏＡ１は、前述するように、脂質の代謝に関与するアポリポタンパクの一種であり、ＬＣＡＴ活性化機能を有していることや、抗炎症効果を発揮することが知られている。そして、このようなＡｐｏＡ１を眼科用組成物における有効成分として採用することにより、涙液層を構成する油層のバリア機能が効果的に改善されて、角膜上皮細胞の欠損（角膜上皮の薄層化）等が有利に抑制され、角膜の炎症や結膜の炎症等を含むドライアイの症状が効果的に抑制乃至は改善されるようになるのである。また、アポリポタンパクＡ−１の抗炎症作用や抗菌作用により、角結膜に関する炎症や、アレルギー性結膜炎、細菌性の角膜炎等の角膜・結膜障害も有利に抑制乃至は改善され得るようになる。
【００２５】
なお、かかるＡｐｏＡ１は、固体の形態又は水溶液の形態で、商業的に入手することが出来るが、本発明に従う眼科用組成物を、眼に適用したり、或いはコンタクトレンズに接触させる等して、使用するに際しては、溶液形態、特に水溶液の形態とされる。
【００２６】
即ち、本発明に従う眼科用組成物は、粉末、顆粒、錠剤、液剤等の何れの剤型をも採用可能であるが、使用に際しては、水系媒体を主体とする水溶液の形態（液剤型）が採用されることとなる。従って、以下に示す各成分の濃度は、使用時の水溶液の形態における濃度を示している。
【００２７】
そして、有効成分であるＡｐｏＡ１の濃度にあっては、適宜に設定されるものの、その濃度が薄くなり過ぎると、目的とするドライアイの抑制乃至は改善効果が充分に得られなくなる一方、余りにも濃くなり過ぎると、眼科用組成物が泡立ちやすくなることが懸念されるところから、好ましくは０．００１〜１ｗ／ｖ％、より好ましくは０．０１〜０．５ｗ／ｖ％、更に好ましくは０．０４〜０．２ｗ／ｖ％の範囲で含有せしめられることが望ましい。
【００２８】
また、上記ＡｐｏＡ１を有効成分として含有する、本発明に従う眼科用組成物には、ＡｐｏＡ１に加えて、ビタミンＢ５類を更に含有させることが好ましく、これによって、ＡｐｏＡ１によるドライアイ抑制乃至は改善効果を相乗的に高めることが出来るようになるのである。
【００２９】
そして、ビタミンＢ５類の具体例としては、例えば、パントテン酸又はその塩、パンテチン、パンテテイン、パンテノール、パントテニルエチルエーテル、アセチルパントテニルエチルエーテル等が挙げられ、これらのうちの１種が単独で、或いは２種以上が組み合わされて使用される。これらの中でも、パンテチンが、特に好適に採用される。
【００３０】
ここで、パンテチンは、ビタミンＢ５の誘導体であり、酸化的代謝に関わるコエンザイムＡ（ＣｏＡ）の前駆体である。パンテチンは、炭水化物、脂質とアミノ酸代謝を含む幾つかの代謝経路に関わる共同因子のレベルを上昇させるその能力により、脂質代謝をサポートする。また、ＣｏＡは、アセチル基と結合し、エネルギー生産における重要な因子である、アセチルＣｏＡを形成する。また、パンテチンは、高比重コレステロール（ＨＤＬ）の血中濃度を増加させ、低比重コレステロール（ＬＤＬ）の濃度を減少させる。それはまた、角膜上皮を含む再−上皮形成の増強効果を有している。パンテチンを含む人工涙液の滴下は、角膜上皮の浸透性の障害を著しく改善することが期待されるのである。
【００３１】
なお、上記ビタミンＢ５類の濃度は、適宜に設定され、特に限定されるものではないものの、その濃度が薄く過ぎると、使用による効果が充分に発揮されなくなる一方、濃くなり過ぎると、粘着き感が強くなって瞬きの邪魔になるおそれがあるところから、好ましくは０．００５〜２ｗ／ｖ％、より好ましくは０．０５〜０．５ｗ／ｖ％、更に好ましくは０．１〜０．２ｗ／ｖ％の範囲で含有されることが望ましい。
【００３２】
また、ビタミンＢ５類を配合する場合、ＡｐｏＡ１とビタミンＢ５類との配合割合は、特に制限されるものではないものの、好ましくは、４：５〜１：５、さらに好ましくは、２：５〜１：５とされることが望ましく、このような配合割合を採用することによって、２成分による相乗効果をより一層効率的に得ることが可能となる。
【００３３】
ところで、本発明に従う眼科用組成物においては、ＡｐｏＡ１やビタミンＢ５類の他にも、更に必要に応じて、点眼剤やコンタクトレンズ用液剤等の眼科用組成物に用いられている各種の添加成分のうちの１種が又は２種以上が適宜に選択されて、通常の添加割合において添加せしめられていても、何等差し支えない。なお、そのような添加成分は、生体への安全性が高く、尚且つ眼科的に充分に許容され、コンタクトレンズの形状又は物性に対する影響のないものであることが好ましく、また、そういった要件を満たす量的範囲内で用いられることが望ましいのであり、これによって、本発明の効果を何等阻害することなく、その添加成分に応じた各種の機能を眼科用組成物に対して有利に付与することが出来る。
【００３４】
例えば、本発明に従う眼科用組成物にあっては、使用時に、その浸透圧が大きくなり過ぎても、逆に小さくなり過ぎても、眼に対して刺激を与えたり、眼障害を招来するおそれがあるところから、浸透圧は、等張化剤等を添加することによって、通常、２００〜３５０ｍＯｓｍ／Ｌ程度に調整されていることが、望ましい。なお、かかる浸透圧の調整に用いられる等張化剤としては、一般に、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、糖アルコール、及び多価アルコール若しくはそのエーテル又はそのエステルを挙げることが出来、それらのうちの１種が単独で乃至は２種以上が組み合わされて用いられることとなる。
【００３５】
また、眼科用組成物にあっては、そのｐＨ値が大きくなり過ぎても、逆に小さくなり過ぎても、眼に対して刺激を与えたり、眼障害を招来するおそれがあるところから、通常、そのような眼科用組成物のｐＨ値は、適当なｐＨ調整剤や緩衝剤等の添加によって、５．３〜８．５程度、中でも７．０付近に調整されることが望ましい。なお、そのようなｐＨの調整のために用いられるｐＨ調整剤としては、水酸化ナトリウムや塩酸等が利用される一方、眼科用組成物のｐＨを前記した範囲に有効に且つ眼に対して安全な範囲に保つための緩衝剤としては、具体的には、例えば、リン酸、ホウ酸、カルボン酸、オキシカルボン酸等の酸や、その塩（例えば、ナトリウム塩等）、更にはＧｏｏｄ−Ｂｕｆｆｅｒやトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、炭酸水素ナトリウム等を、眼に対して安全であり、しかもコンタクトレンズに対する影響を少なくすることが出来るという理由から、挙げることが出来、それらの公知の各種のものの中から、適宜に選択されて、用いられることとなる。
【００３６】
さらに、本発明の眼科用組成物において、眼やコンタクトレンズに対する消毒効果乃至は殺菌効果、更には、眼科用組成物の防腐・保存効果を有利に発現させるためには、防腐効力乃至は殺菌効力を有する防腐剤や殺菌剤が添加せしめられる。なお、そのような防腐剤や殺菌剤としては、一般に、防腐乃至は殺菌効力と共に、眼やコンタクトレンズへの適合性に優れたもの、更には、アレルギー等の障害の要因となり難いものが望ましく、公知の各種のものの中から、適宜なものが選定され、単独で或いは複数を組み合わせて用いることが出来る。
【００３７】
因みに、防腐剤としては、例えば、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、安息香酸或いはその塩、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸ブチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸メチル、クロロブタノール、過ホウ酸或いは過ホウ酸ナトリウムのような過ホウ酸塩等が挙げられる。また一方、殺菌剤としては、例えば、ポリヘキサメチレンビグアニド（ＰＨＭＢ）等のビグアニド系殺菌剤やポリクオタニウム等の４級アンモニウム塩系殺菌剤等を挙げることが出来る。なお、例えば、本発明に従う眼科用組成物を点眼剤の形態で用いる際において、上記した防腐剤や殺菌剤を用いない場合には、本発明に従う眼科用組成物を、１回で使い切るシングルドーズタイプとして用いたり、フィルター付き吐出容器を使用するマルチドーズタイプとして用いることも可能である。
【００３８】
また、コンタクトレンズ、特にソフトコンタクトレンズには、一般に、涙液からの汚れとして、カルシウム等が沈着乃至は吸着する可能性があることから、そのようなカルシウム等の沈着乃至は吸着を防止するためには、キレート化剤が、添加されても良い。そのようなキレート化剤としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びその塩、例えばエチレンジアミン四酢酸・２ナトリウム（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）、エチレンジアミン四酢酸・３ナトリウム（ＥＤＴＡ・３Ｎａ）等が挙げられる。
【００３９】
加えて、本発明に従う眼科用組成物には、角膜上やコンタクトレンズに付着した眼脂汚れ等を除去乃至は洗浄するために、公知のアニオン系界面活性剤、両性界面活性剤、カチオン系界面活性剤、非イオン系界面活性剤等の界面活性剤が、添加、含有せしめられていても良い。
【００４０】
そして、そのような界面活性剤の具体例としては、例えば、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンエチレンジアミン、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルホルムアルデヒド縮合物、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレンステロール、ポリオキシエチレン水素添加ステロール、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンラノリンアルコール、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルキルアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリソルベート等を挙げることが出来、単独で或いは複数を組み合わせて用いることが出来る。
【００４１】
また、本発明において、粘度を適度に調整すると共に、角膜上における滞留時間を延ばしたりするために、粘稠剤（増粘剤）を添加することが出来、かかる粘稠剤の添加によって、眼科用組成物中に含有せしめられた有効成分による作用を持続させて、乾燥感等の眼の不快感をより一層有利に低減することが可能となる。なお、そのような粘稠剤としては、例えば、グルコン酸及びその塩；コンドロイチン硫酸やその塩の如きムコ多糖類；ヒアルロン酸やその塩；ヘテロ多糖類や多糖類等の種々のガム類；ポリビニルアルコール、ポリ−Ｎ−ビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリアクリルアミド等の合成有機高分子化合物；ポリクオタニウム−１０の如きカチオン化セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース等のセルロース誘導体；スターチ誘導体等が有利に用いられる。
【００４２】
また、点眼時に爽快感を与えたり、コンタクトレンズ装用時の異物感や痒みを解消すること等を目的として、メントール、ボルネオール、カンフル、ゲラニオール、ユーカリ油、ベルガモット油、ウィキョウ油、ハッカ油、ローズ油、クールミント等の清涼化剤を添加せしめることも、可能である。
【００４３】
この他にも、本発明に従う眼科用組成物には、ビタミンＡ類（パルミチン酸レチノール、β−カロチン等を含む）、ビタミンＢ2 、Ｂ6 、Ｂ12、酢酸ｄ−α−トコフェロール等のビタミンＥ類等のビタミン類や、硝酸ナファゾリン、塩酸テトラヒドロゾリン等の血管収縮剤、アスパラギン酸及びその塩、アミノエチルスルホン酸、アルギニン、アラニン、リジン、グルタミン酸等のアミノ酸類等、各種添加成分を、目的とする眼科用組成物の用途に応じて、適宜、添加することが可能である。
【００４４】
ところで、かかる本発明に従う眼科用組成物は、上述の如き成分を、従来と同様に、適当な水系媒体中にそれぞれ適量において添加、含有せしめることにより、調製されることとなるのであるが、それに際して用いられる水系媒体としては、水道水や精製水、蒸留水等の水そのものの他にも、生理食塩水や緩衝液等の水を主体とする溶液であれば、生体への安全性が高く、尚且つ眼科的に充分に許容され得るものである限り、何れも利用することが可能であることは、言うまでもないところである。
【００４５】
また、上述の如き成分を含有せしめてなる、本発明に従う眼科用組成物を調製するにあたっては、何等特殊な方法を必要とせず、通常の水溶液を調製する場合と同様に、水系媒体中に各成分を溶解させることにより、容易に得ることが出来る。更に、液剤型以外の粉末、顆粒、錠剤等の固体型の眼科用組成物を調製する場合には、上述のようにして液剤型の眼科用組成物を一旦調製した後、凍結乾燥や減圧乾燥等の公知の乾燥手法により、水分を飛ばすようにすれば良く、このような固体型にすれば、保存し易くなるといったメリットがある。なお、固体型の眼科用組成物は、使用直前に、上述せる如き好ましい濃度範囲となるように、所定量の水系媒体に溶解されて、使用されることとなる。液剤型の眼科用組成物を調整する場合には、液剤は、眼科用組成物が使用される直前に、上述せる如き好ましい濃度範囲になるように、希釈するようにすれば良い。
【００４６】
そして、以上のようにして得られる本発明に従う眼科用組成物は、ドライアイ、角結膜炎等の角膜障害に対して有効であり、また、コンタクトレンズの規格変化等の悪影響を惹起するものではないことから、点眼剤や、コンタクトレンズ用点眼液、コンタクトレンズ用マルチパーパスソリューション等のコンタクトレンズ用液剤として、有利に用いられるのである。
【００４７】
例えば、本発明に従う眼科用組成物を、点眼液として用いる場合には、従来から公知の点眼剤乃至は点眼薬と同様に、適量を１日に１〜数回点眼すれば良い。
【００４８】
そして、本発明に従う眼科用組成物が眼に投与されると、ＡｐｏＡ１により細胞内のコレステロールのエステル化が促されて、マイボーム腺の機能が改善され、以て、油層によるバリア機能が効果的に発揮されるようになる。これにより、ドライアイ、角結膜炎等の角膜障害が抑制乃至は改善されるようになるのである。更に、ＡｐｏＡ１の抗炎症作用や抗菌作用により、角結膜に関する炎症や、アレルギー性結膜炎、細菌性の角膜炎等の角膜・結膜障害も有利に緩和されたり、抑制されるようになる。
【００４９】
なお、本発明に従う眼科用組成物は、コンタクトレンズに対しても、何等悪影響を及ぼすものではなく、点眼に際しては、コンタクトレンズの装用の有無が何等問われることはないのである。
【００５０】
また、本発明に従う眼科用組成物を、点眼以外の用途のコンタクトレンズ用液剤として用いる場合には、例えば、かかる眼科用組成物にてコンタクトレンズの洗浄乃至はすすぎを行ない、その後、そのコンタクトレンズの表面に眼科用組成物が付着した状態のまま、コンタクトレンズを装用したり、或いは、かかる眼科用組成物中にコンタクトレンズを一定時間浸漬して保存せしめた後、そのコンタクトレンズを取り出し、そのまま装用するようにすれば良い。このように使用すれば、コンタクトレンズを介して有効成分が眼に投与されることとなって、ドライアイ等の症状が抑制乃至は改善される等、本発明による効果が有利に発揮されるのである。
【００５１】
なお、上記したコンタクトレンズ用液剤としては、例えば、単一の用途を目的とする、コンタクトレンズ用洗浄液、コンタクトレンズ用濯ぎ液、コンタクトレンズ保存液等の他、洗浄、濯ぎ及び保存等の複数の用途を目的とする、マルチパーパスソリューションを挙げることが出来る。
【００５２】
また、本発明に従う眼科用組成物を、コンタクトレンズ用点眼液やコンタクトレンズ用マルチパーパスソリューション等のコンタクトレンズ用液剤として用いた際に、その対象となるコンタクトレンズとしては、その種類が何等限定されるものではなく、例えば、非含水、低含水、高含水等の全てに分類されるソフトコンタクトレンズ、及びハードコンタクトレンズがその対象となり得るのであって、コンタクトレンズの材質等が、本発明の適用に際して何等問われることはない。
【実施例】
【００５３】
以下に、本発明の実施例を示し、本発明を更に具体的に明らかにすることとするが、本発明が、そのような実施例の記載によって、何等の制約をも受けるものでないことは、言うまでもないところである。また、本発明には、以下の実施例の他にも、更には上記の具体的記述以外にも、本発明の趣旨を逸脱しない限りにおいて、当業者の知識に基づいて種々なる変更、修正、改良等を加え得るものであることが、理解されるべきである。
【００５４】
また、下記実施例における全ての統計データは、 Pair-Wise comparisons via Turkey test を用いた一元配置分散分析で計算された。
【００５５】
−ＳＶ−４０不死化培養細胞株（ＨＣＥＴ）を用いた in vitro 実験−
角膜上皮細胞への高浸透圧ストレスの影響と、アポリポタンパクのｍＲＮＡ遺伝子発現における影響が実験された。ＨＣＥＴ細胞が、３７℃でインキュベートされた高浸透圧培地（５００ｍＯｓｍ／Ｌ）で、３時間、６時間及び１晩、刺激された。なお、細胞培地は、ＤＭＥＭ媒体と次のような組成である；
ＤＭＥＭ／Ｆ１２ ９５ｍＬ
ＦＢＳ ５ｍＬ
７．５％ＮａＨＣＯ3 ２．４ｍＬ
抗生物質−抗真菌剤 １ｍＬ
５ｍｇ／ｍＬ インスリン ０．１ｍＬ
【００５６】
培養後、細胞はＲＮＡ抽出用のＴＲＩｚｏｌに溶解し、その後、フェノールとエタノール沈殿で精製した。そして、ＳＡＧＥ分析、ＲＴ−ＰＣＲ分析及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析にて、ｍＲＮＡ遺伝子発現を調べた。得られたＳＡＧＥ分析データを下記表１に、また、ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を図２に、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を図３及び図４にそれぞれ示した。なお、ＲＴ−ＰＣＲ分析及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析で使用したプライマーは、以下の通りである；
【００５７】
＜ＲＴ−ＰＣＲ分析で使用したプライマー＞
アポリポタンパクＡ−１ Forward 5'-GTACGTGGATGTGCTCAAAGAC-3'
Reverse 5'-CTCCAGATCCTTGCTCATCTCT-3'
アポリポタンパクＡ−５ Forward 5'-CAGATAATGGCAAGCATGGCT-3'
Reverse 5'-GTCTGGCTGAAGTAGTCCCAGAAG-3'
アポリポタンパクＥ Forward 5'-GCAGGAAGATGAAGGTTCTGTG-3'
Reverse 5'-CCTTCAACTCCTTCATGGTCTC-3'
アポリポタンパクＢ Forward 5'-AGTCTTCCTTATACCCAGACTTTGC-3'
Reverse 5'-GTACAAGTTGCTGTAGACATTCGTG-3'
アポリポタンパクＣ−１ Forward 5'-CTCCAGTGCCTTGGATAAGC-3'
Reverse 5'-GGTGTGGGAAATTTCAGAGG-3'
【００５８】
＜リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析で使用したプライマー＞
アポリポタンパクＡ−１ Forward 5'-GCTCAAAGACAGCGGCAGAG-3'
Reverse 5'-AGGTCACGCTGTCCCAGTTG-3'
アポリポタンパクＡ−５ Forward 5'-GAAAGGCTTCTGGGACTACTTCAG-3'
Reverse 5'-AGATCCATCGTGTAGGGCTTC-3'
アポリポタンパクＥ Forward 5'-GCCAATCACAGGCAGGAAGA-3'
Reverse 5'-GCTCTGTCTCCACCGCTTG-3'
アポリポタンパクＣ−１ Forward 5'-CTCCAGCAAGGATTCAGAGTG-3'
Reverse 5'-CTTCAGGTCCTCATGAGTCAATC-3'
【００５９】
【表１】
【００６０】
図２には、アポリポタンパク遺伝子発現のゲル電気泳動が示されているが、このデータから、ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＡ５、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＣ１が、ヒト角膜上皮細胞で発現されたことがわかる。しかし、ＡｐｏＢの発現は、検出されなかった。なお、図２中、Ｍは、ＤＮＡマーカーである。
【００６１】
図３及び図４には、コントロールに対するｍＲＮＡ発現量比の相対変化が示されている。図３、４中、コントロールは、高浸透圧下で刺激されないものを、３時間、６時間、及び一晩中は、それぞれ、高浸透圧下で３時間、６時間、及び一晩中刺激されたものを示している。かかる図３によれば、高浸透圧ストレスによって刺激されたＨＣＥＴ細胞におけるＡｐｏＡ１のｍＲＮＡ発現量が、減少していることが認められる。これに対し、図４によれば、高浸透圧ストレスによって刺激されたＨＣＥＴ細胞おけるＡｐｏＡ５、ＡｐｏＥ及びＡｐｏＣ１のｍＲＮＡ発現量は、増加していることが認められる。このため、ＡｐｏＡ１は、高浸透圧下で、他のアポリポタンパクとは異なる挙動を示すことが、明らかとなった。なお、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲデータ（蛍光強度）は、１８Ｓ ＲＮＡで標準化された。ＡｐｏＡ１では、ｎ＝６、他のアポリポタンパクでは、ｎ＝４〜５の独立した実験を行なった（平均±標準偏差）。
【００６２】
−実験用ドライアイマウスを用いた in vivo 研究−
＜ドライアイマウスモデル＞
生後１０〜１２週の C57BL/6J マウスが研究で用いられた。すべての研究は、 "ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research" に従って行なわれた。マウスモデルは、背中に、０．５ｍｇ／０．２ｍＬの臭化水素酸スコポラミン（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を、１日４回、ＡＭ９時、ＰＭ１２時、ＰＭ３時及びＰＭ６時に投与する皮下注射により作られた。また、正常対象物（ノーマルマウス）として、未処置の年齢をマッチさせたマウスが使用された（Investigative Ophthalmology and Visual Science. 45:p4293-4301, 2004参照）。
【００６３】
＜動物＞
生後１０週の雄の C57BL/6J Jms Slc マウスが購入され、それらは、実験前に、隔離され、標準状態下：室温２３±２℃、相対湿度６０％±１０％で、１週間の期間、慣らされた。
【００６４】
＜乾燥手順＞
マウスは、５日間、１日４回、０．５ｍｇ／０．２ｍＬの臭化水素酸スコポラミンを皮下注射された。乾燥した環境ストレスは、マウスのケージを、連続的な通気ブロワー（２３±２℃の室温、６０％±１０％の相対湿度）の送風機のフードの中に配置することによって作り出された。後述する涙の産生量の測定は、処置前、処置後３日目、５日目に評価された。
【００６５】
＜局所の点眼液適用＞
乾燥の間、各マウスの一方の眼はＡｐｏＡ１（Sigma-Aldrich, Japnan） を含む点眼液又はＡｐｏА１とＤ−パンテチン（Sigma-Aldrich, Japnan） とを含む点眼液で処理され、他方の眼は、コントロールとして、ＰＢＳを点した。５μｌの点眼液が、５日間、１日４回、乾燥処理の間、投与された。すべての点眼剤が、ＰＢＳで形成され、浸透圧は、２９０〜３００ｍＯｓｍ／Ｌ、ｐＨ７．４に調整された。０．０１ＭのＰＢと塩（１２５ｍＭ）で、標準の浸透圧（３００ｍＯｓｍ／Ｌ）のＰＢＳを調製した。０．０１ＭのＰＢＳを１リットル調製するには、次の量が必要となる；
ＮａＣｌ (M.W. 58.44) 7.3 g ( 250 mOsm/L )
Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ (M.W. 358.14) 3.5814 g ( 30 mOsm/L )
ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ (M.W. 156) 1.56 g ( 20 mOsm/L )
【００６６】
（１）涙の産生量の測定
前述した臭化水素酸スコポラミンの皮下注射とブロワーによる乾燥（以下、両処理を併せて「ＤＥ処理」と、略記する。）によって、マウスの眼が、ドライアイとなっているかどうかを確認するために、フェノールレッド糸テストが行なわれた。具体的には、涙の産生量が、標準化されたフェノールレッドを染みこませた綿糸（Zone-Quick ;（株）メニコン、日本）を用いて測定された。糸は、無麻酔のマウスの外眼角の眼表面に、６０秒間、適用された。６０秒後、糸の色の変化の長さ（涙によって濡れた糸の長さ）が、ｍｍで測定された。また、糸の濡れた長さは、１ｍｍの精度で測定された。
【００６７】
そして、図５に、ＤＥ処理されたマウス（以下、「ＤＥマウス」と呼称する）におけるフェノールレッド糸テストの結果を示し（平均±標準偏差、ｎ＝６眼）、また、図６に、０．０４ｗ／ｖ％のＡｐｏＡ１を含む点眼液が点眼されたＤＥマウスにおけるフェノールレッド糸テストの結果を示した（平均±標準偏差、ｎ＝１２眼、ｐ値＜０．０１）。更に、図７に、０．０４ｗ／ｖ％のＡｐｏＡ１と０．１ｗ／ｖ％のＤ−パンテチンを含む点眼液が点眼されたＤＥマウスにおけるフェノールレッド糸テストの結果を示した（平均±標準偏差、ｎ＝１２眼、ｐ値＜０．０１）。かかる図５〜７中、Ｄａｙ１は、臭化水素酸スコポラミンの皮下注射とブロワーによる乾燥処理をする前のものであり、Ｄａｙ３及びＤａｙ５は、それぞれ、処理後３日目及び５日目のものである。
【００６８】
図５〜７から明らかなように、涙の分泌が、処理前のＤａｙ１と比較して、Ｄａｙ５では著しく減っており、臭化水素酸スコポラミンの皮下注射とブロワーによる乾燥（ＤＥ処理）によって、マウスの眼がドライアイとなったことを確認した。
【００６９】
（２）角膜フルオレセイン染色
前述のように、５日間に亘って処理されたマウスの眼に１μＬの１％フルオレセインナトリウム（Sigma-Aldrich, Japan）が局所適用された後、角膜フルオレセイン染色が、１０分後に評価され、光学顕微鏡（Leica Microsystems Inc., Deerfield, USA） で検査されて、顕微鏡に取り付けられたデジタルカメラ（CAMEDIA,オリンパス光学株式会社、日本）で撮影された。
【００７０】
角膜フルオレセイン染色は、角膜染色の面積に基づいて、下記表２及び表３のように、グレード分けされた（Nakamura S., Tsubota K et al., Investigative Ophthalmology and Visual Science. 46: p2379-2387, 2005） 。なお、下記表２，３中、Ｘは、角膜総面積に対する点状染色された面積の比を表している。
【００７１】
【表２】
【００７２】
【表３】
【００７３】
（２−１）ＡｐｏＡ１点眼液による効果
そして、図８に、０．０４ｗ／ｖ％のＡｐｏＡ１を含む点眼液又はＰＢＳ（ＡｐｏＡ１不含）で処理された６匹のＤＥマウス（マウス１〜６）の角膜染色スコアを示した。かかる図８から、ＡｐｏＡ１グループの平均スコアは、ＰＢＳグループの平均スコアと比べて２５％程度小さくなっている。
【００７４】
また、フルオレセインで染色された面積の定量的な測定を、画像分析ソフトウェア（NIH ImageJ, version 1.36; available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html） を用いて行なったところ、データは図示しないが、ＡｐｏＡ１グループの平均スコアが、ＰＢＳグループの平均スコアと比べて２０％減少していた。
【００７５】
これら等級スコアと定量的な測定によればＡｐｏＡ１は、乾燥による角膜上皮浸食の保護効果を有していると考えられる。
【００７６】
（２−２）ＡｐｏＡ１＋Ｄ−パンテチン点眼液による効果
また、図９には、０．０４ｗ／ｖ％のＡｐｏＡ１と０．０５ｗ／ｖ％のＤ−パンテチンとを含有する点眼液又はこれらの有効成分を含まないＰＢＳで処理された６匹のＤＥマウスの角膜染色スコアを示した。ＡｐｏＡ１とＤ−パンテチン（Ｄｐ）を組み合わせて処理した眼は、ＰＢＳで処理された眼に比べて、著しく改善されている。
【００７７】
（２−３）ＡｐｏＡ１の濃度変化の影響
図１０には、ＡｐｏＡ１の濃度変化の影響を見るために、ＰＢＳで処理したＤＥマウスと、ＡｐｏＡ１の濃度が、それぞれ、０．０１ｗ／ｖ％、０．０４ｗ／ｖ％、０．１ｗ／ｖ％である点眼液で処理されたＤＥマウスの角膜染色スコアのグラフが示されている。各列のデータは、各グループの平均グレードスコアを示している（平均±標準偏差、ＰＢＳ処理グループはｎ＝１２眼、０．０４ｗ／ｖ％のＡｐｏＡ１処理グループはｎ＝６眼、残りの薬物処理グループはｎ＝３眼、Ｐ値（＊）＜０．０１）。
【００７８】
図１０によれば、ＡｐｏＡ１（０．１ｗ／ｖ％）が、最も効果的な濃度である。
【００７９】
（２−４）Ｄ−パンテチンの濃度変化の影響
図１１には、Ｄ−パンテチンの濃度変化の影響を見るために、ＰＢＳで処理したＤＥマウスと、ＡｐｏＡ１の濃度を０．０４ｗ／ｖ％に固定して、Ｄ−パンテチンの濃度を、それぞれ、０．０５ｗ／ｖ％、０．１ｗ／ｖ％、０．２ｗ／ｖ％とした点眼液で処理されたＤＥマウスの角膜染色スコアのグラフが示されている。各列のデータは、各グループの平均グレードスコアを示している（平均±標準偏差、ＰＢＳ処理グループはｎ＝１２眼、ＡｐｏＡ１（０．０４ｗ／ｖ％）＋Ｄ−パンテチン（０．０５ｗ／ｖ％）処理グループはｎ＝６眼、残りの薬物処理グループはｎ＝３眼、Ｐ値（＊）＜０．０１）。
【００８０】
図１１によれば、ＡｐｏＡ１＋Ｄ−パンテチン（０．０４ｗ／ｖ％＋０．２ｗ／ｖ％）が、最も効果的な濃度である。
【００８１】
上記の角膜フルオレセイン染色実験による結論として、ＡｐｏＡ１は、用量依存的に、ドライアイ症候群に対して極めて効果的であることが示された。加えて、Ｄ−パンテチンを併用することにより、ＡｐｏＡ１の作用が相乗的に増強される。この作用は、用量依存的であるように思われる。
【００８２】
（３）組織学的研究
マウスの眼球が外科的に摘出され、１０％の中性に緩衝されたホルマリンで固定され、パラフィンに包埋された。そして、５μｍの厚さの組織切片がカットされ、ヘマトキシリンとエオシンで染色された。そして、眼の切断部分が検査され、カメディアデジタルカメラ、C-4040ズーム（オリンパス光学株式会社、日本）が備え付けられた Provis AX 70 顕微鏡（オリンパス光学株式会社、日本）で撮影された。厚さの顕微測光測定は、OB-M, 1/100, micro, AX0001 (オリンパス光学株式会社、日本）を使用することによって行なわれた。また、角膜上皮の厚さは、１０μｍの精度で測定された。
【００８３】
（３−１）ＡｐｏＡ１点眼液による効果
（ａ）ノーマルマウス、（ｂ）ＤＥマウス、（ｃ）０．０４ｗ／ｖ％のＡｐｏＡ１で処理されたＤＥマウス、（ｄ）ＰＢＳで処理されたＤＥマウスの各グループの６〜８の角膜が、この実験で使用された。
【００８４】
図１２に、各グループの代表的な角膜上皮の写真（倍率×１００倍）を示すと共に、図１３に、各グループの角膜上皮の平均厚さのグラフ（平均±標準偏差、ｎ＝６〜８角膜、Ｐ（＊）＜０．０１）を示した。
【００８５】
かかる図１２及び図１３によれば、ＤＥマウスの角膜上皮は、未処理のコントロールマウスの角膜上皮よりも著しく薄くなっている。また、角膜上皮の剥離に伴って起こる細胞層の薄層化は、ＡｐｏＡ１で処理された眼と比べて、ＰＢＳで処理された眼において、著しい。ＡｐｏＡ１で処理することにより、涙液層を構成する油層のバリア機能が有効に発揮され、角膜上皮が保護されることがわかる。
【００８６】
（３−２）ＡｐｏＡ１＋Ｄ−パンテチン点眼液による効果
また、図１４には、ノーマルマウス、ＤＥマウス、ＰＢＳで処理されたＤＥマウス、及び０．０４ｗ／ｖ％のＡｐｏＡ１と０．０５ｗ／ｖ％のＤ−パンテチンで処理されたＤＥマウスの角膜上皮厚さのグラフ（平均±標準偏差、ｎ＝６〜８角膜、Ｐ値（＊）＜０．０１）が示されている。
【００８７】
かかる図１４によれば、ＡｐｏＡ１＋Ｄ−パンテチン（０．０４ｗ／ｖ％＋０．０５ｗ／ｖ％）の組み合わせで処理されたグループが、大きな成果を挙げている。
【００８８】
（３−３）ＡｐｏＡ１の濃度変化の影響
図１５には、ＡｐｏＡ１の濃度変化の影響を見るために、ＤＥマウスグループと、ＡｐｏＡ１の濃度が、それぞれ、０．０１ｗ／ｖ％、０．０４ｗ／ｖ％、０．１ｗ／ｖ％である点眼液で処理されたＤＥマウスグループの角膜上皮厚さのグラフ（平均±標準偏差、ｎ＝３〜８角膜、Ｐ値は、＊＜０．０１、◆＜０．０５）が示されている。
【００８９】
図１５によれば、０．１ｗ／ｖ％のＡｐｏＡ１が、最も効果的な濃度である。
【００９０】
（３−４）Ｄ−パンテチンの濃度変化の影響
図１６には、Ｄ−パンテチンの濃度変化の影響を見るために、ＤＥマウスグループと、ＡｐｏＡ１の濃度を０．０４ｗ／ｖ％に固定して、Ｄ−パンテチンの濃度を、それぞれ、０．０５ｗ／ｖ％、０．１ｗ／ｖ％、０．２ｗ／ｖ％とした点眼液で処理されたＤＥマウスグループの角膜上皮厚さのグラフ（平均±標準偏差、ｎ＝３〜８角膜、Ｐ値（＊）＜０．０１）が示されている。
【００９１】
図１６によれば、Ｄ−パンテチンの添加によって、ＡｐｏＡ１の効果が相乗的に高められ、ＡｐｏＡ１＋Ｄ−パンテチン（０．０４ｗ／ｖ％＋０．２ｗ／ｖ％）が、最も効果的な濃度である。
【００９２】
上記の角膜上皮の厚さの測定実験による結論として、ＡｐｏＡ１は、ドライアイや角膜炎等において惹起される角膜上皮細胞の欠損（角膜上皮の薄層化）において、極めて有効であることが示された。加えて、Ｄ−パンテチンを併用することにより、ＡｐｏＡ１の作用が相乗的に増強される。この作用は、用量依存的であるように思われる。
【００９３】
上述した in vitro 及び in vivo 実験の両方のデータに基づき、ＡｐｏＡ１を含む点眼液は、ドライアイの発症や角膜炎に影響を与えると結論付けることが出来る。また、これらの知見から、ＡｐｏＡ１を含む眼科用組成物は、ドライアイを始め、角結膜に関する炎症や、アレルギー性結膜炎、細菌性の角膜炎等の種々の角膜・結膜障害に対して、臨床的応用が可能であると、思われる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポリポタンパクＡ−１を有効成分として含有することを特徴とする眼科用組成物。
【請求項２】
ビタミンＢ５類より選ばれる少なくとも１種の化合物を、更に含有することを特徴とする請求項１記載の眼科用組成物。
【請求項３】
前記ビタミンＢ５類がＤ−パンテチンであることを特徴とする請求項２記載の眼科用組成物。
【請求項４】
角膜障害治療用組成物として用いられることを特徴とする請求項１乃至請求項３の何れか１項に記載の眼科用組成物。
【請求項５】
前記角膜障害がドライアイであることを特徴とする請求項４に記載の眼科用組成物。
【請求項６】
点眼剤として用いられることを特徴とする請求項１乃至請求項５の何れか１項に記載の眼科用組成物。
【請求項７】
コンタクトレンズ用液剤として用いられることを特徴とする請求項１乃至請求項５の何れか１項に記載の眼科用組成物。
【請求項８】
前記アポリポタンパクＡ−１が、０．００１〜１ｗ／ｖ％の割合で含有されていることを特徴とする請求項６又は請求項７記載の眼科用組成物。
【請求項９】
前記ビタミンＢ５類が、０．００５〜２ｗ／ｖ％の割合で含有されていることを特徴とする請求項６乃至請求項８の何れか１項に記載の眼科用組成物。
【請求項１】
アポリポタンパクＡ−１を有効成分として含有することを特徴とする眼科用組成物。
【請求項２】
ビタミンＢ５類より選ばれる少なくとも１種の化合物を、更に含有することを特徴とする請求項１記載の眼科用組成物。
【請求項３】
前記ビタミンＢ５類がＤ−パンテチンであることを特徴とする請求項２記載の眼科用組成物。
【請求項４】
角膜障害治療用組成物として用いられることを特徴とする請求項１乃至請求項３の何れか１項に記載の眼科用組成物。
【請求項５】
前記角膜障害がドライアイであることを特徴とする請求項４に記載の眼科用組成物。
【請求項６】
点眼剤として用いられることを特徴とする請求項１乃至請求項５の何れか１項に記載の眼科用組成物。
【請求項７】
コンタクトレンズ用液剤として用いられることを特徴とする請求項１乃至請求項５の何れか１項に記載の眼科用組成物。
【請求項８】
前記アポリポタンパクＡ−１が、０．００１〜１ｗ／ｖ％の割合で含有されていることを特徴とする請求項６又は請求項７記載の眼科用組成物。
【請求項９】
前記ビタミンＢ５類が、０．００５〜２ｗ／ｖ％の割合で含有されていることを特徴とする請求項６乃至請求項８の何れか１項に記載の眼科用組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公表番号】特表２０１０−５１０９６１（Ｐ２０１０−５１０９６１Ａ）
【公表日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２１２６４（Ｐ２００９−５２１２６４）
【出願日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３２４４１３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６８８６６
【国際公開日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【出願人】（０００１３８０８２）株式会社メニコン (150)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３２４４１３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６８８６６
【国際公開日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【出願人】（０００１３８０８２）株式会社メニコン (150)
【Ｆターム（参考）】
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