磁性微粒子およびその製造方法
【課題】目的物質を簡単かつ効率的に固定化できる磁性微粒子およびその製造方法を提供する。
【解決手段】磁性体およびアルキル基を有する化合物を含む集合体と、該集合体を被覆するゲル層とを備える磁性微粒子であって、該ゲル層に親水性基を有する磁性微粒子。前記磁性微粒子は、少なくとも下記の工程を含む製造方法により得られる。１）磁性体およびアルキル基を有する化合物を含む集合体を形成する工程、２）工程１）で形成された集合体の表面に、重合性モノマーと架橋性モノマーとから架橋体を製造することで、親水性基を有するゲル層を形成する工程。
【解決手段】磁性体およびアルキル基を有する化合物を含む集合体と、該集合体を被覆するゲル層とを備える磁性微粒子であって、該ゲル層に親水性基を有する磁性微粒子。前記磁性微粒子は、少なくとも下記の工程を含む製造方法により得られる。１）磁性体およびアルキル基を有する化合物を含む集合体を形成する工程、２）工程１）で形成された集合体の表面に、重合性モノマーと架橋性モノマーとから架橋体を製造することで、親水性基を有するゲル層を形成する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁性体とアルキル基を有する化合物を含む集合体と、該集合体を被覆し且つ親水性基を有するゲル層とを含む磁性微粒子およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体材料の分離・精製を目的としたマイクロサイズ磁性微粒子が知られており、カラム法に比べ簡便な方法であり、診断・抽出の自動化などに応用されている（非特許文献１および２）。
【０００３】
また、細胞分離を目的としたナノサイズ磁性微粒子が知られており、ナノサイズ磁性微粒子と磁気カラムとを用いた方法も広く有用性が示されている（特許文献１および２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表平１０−５００４９２号公報
【特許文献２】特表２００３−５０８０７３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】川口春馬、「磁性体含有高分子粒子の作製」、月刊バイオインダストリー、シーエムシー出版、２００４年８月
【非特許文献２】小幡公道、「磁性微粒子を用いた核酸自動抽出装置」、ＢＭＥ、１２（２）、１９９８年、ｐ．１５―２４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところが、マイクロサイズ磁性微粒子は表面が硬い層でできており、デリケートな物質を回収する場合、硬い表面が悪影響を与える可能性がある。また、ナノサイズ磁性微粒子は、磁石で分離する場合に、ブラウン運動の影響を受けて磁気分離に時間を要するという欠点がある。また、マイクロサイズ磁性微粒子およびナノサイズ磁性微粒子の分離に磁気カラムを用いると、カラムのコストがかかり、経済的な負担が大きいという課題がある。
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、従来の磁性微粒子と比較して、格段に簡便、低コストかつ効率的に目的物質を精製する磁性微粒子を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を重ねた。その結果、磁性体およびアルキル基を有する化合物を含む集合体の表面にゲル層が形成されている磁性微粒子は、反応性に優れ、タンパク質、アミノ酸、ペプチド、糖および糖鎖を容易に固定化できることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ 磁性体およびアルキル基を有する化合物を含む集合体と、該集合体を被覆するゲル層とを備える磁性微粒子であって、該ゲル層に親水性基を有する磁性微粒子。
［２］ 平均粒子径が、０．９ｎｍ以上１００００ｎｍ未満である前記［１］項に記載の磁性微粒子。
［３］ アルキル基を有する化合物が、ベンゼン環を有さない化合物であって、鉄イオンと結合可能である前記［１］項または前記［２］項に記載の磁性微粒子。
［４］ アルキル基を有する化合物が、脂肪酸である前記［３］項に記載の磁性微粒子。
［５］ 脂肪酸が、オレイン酸である前記［４］項に記載の磁性微粒子。
［６］ 親水性基が、エポキシ基である前記［１］〜［５］のいずれか１項に記載の磁性微粒子。
［７］ ゲル層が、重合性モノマーと、架橋性モノマーとから得られる架橋体である前記［１］〜［６］のいずれか１項に記載の磁性微粒子。
［８］ 重合性モノマーが、メタクリル酸グリシジルおよびポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレートであり、架橋性モノマーが、ポリエチレングリコールジアクリレートである前記［７］項に記載の磁性微粒子。
［９］ 自家蛍光を発しない前記［１］〜［８］のいずれか１項に記載の磁性微粒子。
［１０］ 前記［１］〜［９］のいずれか１項に記載の磁性微粒子と、目的物質に対する親和性物質とからなる吸着材。
［１１］ 目的物質に対する親和性物質が、アビジン、プロテインＡまたは抗体である前記［１０］項に記載の吸着材。
［１２］ 少なくとも下記の工程（１）および（２）を有する前記［１０］項または前記［１１］項に記載の吸着材を用いた目的物質の分離方法。
（１）目的物質を含む水溶液と吸着材との混合液を調製し、目的物質と吸着材の結合体を生成させる工程
（２）工程（１）で得られた混合液から磁力により結合体を分離する工程
［１３］ さらに下記の工程（３）を含む前記［１２］項に記載の方法。
（３）工程（２）で分離した結合体から目的物質を溶出する工程
［１４］ 前記［１２］項または前記［１３］項に記載の方法を用いる汚水処理方法。
［１５］ 汚水からクリプトスポリジウムおよびジアルジアを分離する前記［１４］項に記載の汚水処理方法。
［１６］ 少なくとも下記の工程を含む磁性微粒子の製造方法。
（１）磁性体およびアルキル基を有する化合物を含む集合体を形成する工程
（２）工程（１）で形成された集合体の表面に、重合性モノマーと架橋性モノマーとを混合し、重合と架橋とを行うことで、親水性基を有するゲル層を形成する工程
【発明の効果】
【００１０】
本発明の磁性微粒子は、磁性体およびアルキル基を有する化合物を含む集合体を被覆するゲル層を含むことから反応性に優れ、生理活性タンパク質、アミノ酸、ペプチド、糖および糖鎖を容易に固定化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動の結果を示す図である。
【図２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動の結果を示す図である。
【図３】ＩｇＧの回収率と時間との関係を示す図である。
【図４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動の結果を示す図である。
【図５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動の結果を示す図である。
【図６】ゲル層を持つ磁性微粒子の模式図である。
【図７】蛍光顕微鏡により観察した結果を示す図である。
【図８】ＦＩＴＣラベル微粒子とストレプトアビジン微粒子混合液からのストレプトアビジン微粒子の分離を示す模式図である。
【図９】顕微鏡により観察した結果を示す図である。
【図１０】蛍光顕微鏡により観察した結果を示す図である。
【図１１】蛍光顕微鏡により観察した結果を示す図である。
【図１２】顕微鏡により観察した結果を示す図である。
【図１３】水道水濃縮液および河川水濃縮液からの磁気分離の結果を示す図である。
【図１４】蛍光顕微鏡により観察した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の一実施形態について説明する。
【００１３】
[磁性微粒子]
本発明の磁性微粒子は、磁性体およびアルキル基を有する化合物を含む集合体と、該集合体を被覆し且つ親水性基を有するゲル層とを備えた磁性微粒子である。
【００１４】
本発明の磁性微粒子は、０．９ｎｍ以上１００００ｎｍ未満の平均粒子径であることが好ましい。この範囲とすることで、良好な分散性が得られる。さらに、磁性微粒子の平均粒子径が、２００ｎｍ以上５０００ｎｍ未満であると、目的物質の分離効率、精製効率及び利便性が高くなるため、より好ましい。磁性微粒子の平均粒子径は、例えば、レーザーゼータ電位計（大塚電子株式会社製ＥＬＳ−８０００（商品名））を用いて測定することにより算出できる。
【００１５】
本発明の磁性微粒子は、自家蛍光を発しないことが好ましい。自家蛍光を発しないことで、蛍光標識した物質と区別し易いという利点がある。
【００１６】
本発明の磁性微粒子は、その形状に特に制限はなく、例えば、球状、針状および板状など各種の形状が利用できる。後述する目的物質に対する親和性物質（以下、「リガンド」ともいう。）を固定化した磁性微粒子（吸着材）から目的物質を分離する際に、捕集性と分散性のバランスがよく、操作性に優れる点から、球状、楕円体状または粒状の形状が好ましい。
【００１７】
[磁性体およびアルキル基を有する化合物を含む集合体]
本発明で用いられる集合体は、磁性体およびアルキル基を有する化合物を含む。
【００１８】
[磁性体]
本明細書における「磁性体」とは、磁気応答性（磁界に対する感応性）を有する粒子を指し、磁性微粒子とした場合に磁気応答性を付与し得るものであればよい。ここで、「磁気応答性を有する」とは、外部磁界が存在するとき、磁界により磁化する、または磁石に吸着するなど、磁界に対して感応性を示すことを指す。
【００１９】
磁性体としては、上記磁気応答性を示す従来公知の磁性体であれば特に制限はなく利用できる。当該磁性体としては、例えば、マグネタイト、ゲーサイト、酸化ニッケル、フェライト、コバルト鉄酸化物、バリウムフェライト、炭素鋼、タングステン鋼、ＫＳ鋼、希土類コバルト磁石およびヘマタイトの微粒子が挙げられる。
【００２０】
磁性体は、例えば、多価アルコールとマグネタイトとから従来公知の方法により製造することができる。例えば、特開２００５−０８２５３８号公報に、デキストランを用いた磁性微粒子の製造方法が開示されている。
【００２１】
磁性体は、その形状に特に制限はなく、例えば、球状、楕円体状、粒状、板状、針状および立方体状などの多面体状が挙げられる。好適な形状に実現されやすい点から、球状、楕円体状および粒状が好ましい。
【００２２】
ここで、「球状」とは、アスペクト比（あらゆる方向で測定した場合の最大長さと最小長さとの比）が１．０以上１．２以下の範囲内である形状を指す。「楕円体状」とは、アスペクト比が１．２を超えて１．５以下の範囲内である形状を指す。「粒状」とは、球状のように粒子の長さが全方向で揃っているもの、および楕円体状のように一方向の長さのみ大きいもの以外の、方向による長さの差異はあるが全体として形状に特に異方性がない形状を指す。
【００２３】
磁性体の大きさに特に制限はないが、磁気分離を可能とすることから、平均粒子径が０．００５〜１μｍであることが好ましく、０．２〜０．５μｍであることがより好ましい。この平均粒子径は、例えば、レーザーゼータ電位計（大塚電子株式会社製ＥＬＳ−８０００（商品名））を用いて測定することにより算出できる。
【００２４】
[アルキル基を有する化合物]
アルキル基を有する化合物は、アルキル基を有し、ベンゼン環を有さない化合物である。アルキル基を有する化合物は、鉄イオンと結合または相互作用が可能な化合物であることが好ましく、鉄イオンと結合が可能であることがより好ましい。アルキル基を有する化合物中のアルキル基の炭素数は、４〜２４が好ましく、アルキル基の炭素数が増えるにしたがって、疎水性が強くなる傾向にあることから、炭素数は、１０〜２０がより好ましい。
【００２５】
アルキル基を有する化合物としては、例えば、脂肪酸、アルコール、シリコーンおよびフルオロアルキルが好ましく、脂肪酸及びアルコールがより好ましく、特に脂肪酸が好ましい。また、鉄イオンとしては、鉄（ＩＩ）イオン（Ｆｅ２＋）および鉄（ＩＩＩ）イオン（Ｆｅ３＋）が挙げられる。
【００２６】
脂肪酸としては、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸が利用できる。飽和脂肪酸としては、例えば、酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルチミン酸、ヘプタデシル酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸およびリグノセリン酸が挙げられる。また、不飽和脂肪酸としては、例えば、パルミトレイン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノール酸、（９，１２，１５）−リノレン酸、（６，９，１２）−リノレン酸、１０−メチルオクタデカン酸、アラキドン酸が挙げられる。中でも、疎水性場を形成するという観点と、メタノールに溶けやすい点から、オレイン酸、ミリスチン酸およびステアリン酸が好ましい。
【００２７】
アルコールとしては、１分子中に水酸基を少なくとも１個有するアルコールであれば特に限定されない。アルコールとしては、例えば、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、カプリルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコールおよびリノリルアルコールが挙げられる。中でも、アルコールを構成するアルキルの炭素数が多くなるほど親水性が弱まる傾向、言い換えると、疎水性が強くなる傾向にあり、疎水性場を形成するという観点から、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコールおよびオレイルアルコールが好ましい。
【００２８】
[ゲル層]
本発明の磁性微粒子において、ゲル層は、磁性体およびアルキル基を有する化合物を含む集合体上に形成され、該集合体を被覆する。ここで、「被覆」とは、集合体の外側を覆い、得られる磁性微粒子の最外殻にゲル層が形成される状態を指す。ゲル層は、集合体の外側を完全に覆っている状態が好ましいが、ゲル層と集合体とが分離しなければ、不完全に覆っている状態でもよい。
【００２９】
ゲル層は、親水性基を有しており、ゲル層の表面および内部に親水性基を有することが好ましい。ゲル層の持つ親水性基に、リガンドを結合させるためには、ゲル層の表面に親水性基を有することがより好ましい。本発明の磁性微粒子は、磁性微粒子の表面がゲル層で形成されているため、フレキシビリティーを有している。そのため、目的物質と磁性微粒子に固定化されたリガンドとの反応効率が良好になるという利点を有する。
【００３０】
ここで、「フレキシビリティー」とは、柔軟性、融通性のことを意味する。具体的には、「フレキシビリティーを有する」とは、材料表面に依存する立体障害を受けない状態にすることであり、リガンドと、目的物質の一種である生理活性タンパク質との相互作用（結合定数）を阻害しないことを示す。また、フレキシビリティーは、得られたゲル層中の、架橋性モノマーの含有率に依存し、重合性モノマーとの質量比が、０．０１質量％以上１質量％未満が好ましく、０．１質量％以上０．８質量％以下がより好ましい。
【００３１】
[親水性基]
親水性基としては、例えば、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、アミノ基およびチオール基が挙げられる。磁性微粒子に調製した後に、親水性基を他の官能基に変換する観点およびリガンドのアミノ基、カルボキシル基およびチオール基との結合の観点から、エポキシ基およびカルボキシル基が好ましい。
【００３２】
ゲル層は、重合性モノマーと、架橋性モノマーとから得られる架橋体である。ゲル層には、架橋性モノマーで架橋されていない重合性モノマーからなる重合体などが含まれていてもよい。ゲル層は、予め重合性モノマーからなる重合体を製造し、これを架橋性モノマーによって架橋させることで製造してもよく、重合性モノマーと架橋性モノマーとを混合し、重合と架橋とを同時に行うことで、製造してもよい。
【００３３】
本発明では、重合性モノマーと架橋性モノマーとを混合し、重合と架橋とを同時に行うことで、製造することが好ましい。本発明では、該架橋体がゲル層であり、水等が含まれた状態だけでなく、乾燥した状態も含む。
【００３４】
重合性モノマーとしては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、アクリルアミド、メタクリルアミド、ヒドロキシメタクリルアミド、メタクリル酸グリシジル、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート、メタクリル酸２−ヒドロキシエチルおよびＮ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド・塩酸塩が挙げられる。中でも、親水場を有し、調製後のその他官能基への変換やリガンドとの結合の観点から、メタクリル酸グリシジルとポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレートとの共重合体が好ましい。
【００３５】
架橋性モノマーとしては、例えば、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、エチレングリコールジメタクリレートおよびポリエチレングリコールジアクリレートが挙げられる。中でも、ゲル層を形成するという観点から、ポリエチレングリコールジアクリレートが好ましい。
【００３６】
予め重合性モノマーからなる重合体を製造し、これを架橋性モノマーによって架橋させることで、ゲル層を製造する場合、重合性モノマーからなる重合体としては、少なくとも２種の重合性モノマーが共重合してなる共重合体を用いることが好ましい。２種類の重合性モノマーを用いて共重合体を製造する場合、２種類の重合性モノマーは、適宜選択すればよい。
【００３７】
例えば、１種類目の重合性モノマーとして、アクリル酸、メタクリル酸、アクリルアミド、メタクリルアミド、ヒドロキシメタクリルアミド、メタクリル酸グリシジルまたはＮ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド・塩酸塩を用い、２種類目の重合性モノマーとして、メタクリル酸２−ヒドロキシエチルまたはポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレートを用い、これらを組み合わせて用いることが好ましい。この場合、重合性モノマーの混合物全体の質量に対して、２種類目の重合性モノマーの含有量は、１〜１０質量％が好ましく、１〜５質量％がより好ましい。この範囲とすることで、分散性の高い微粒子が得られる。
【００３８】
得られた重合性モノマーからなる重合体を、架橋性モノマーで架橋することで、架橋体を製造することができる。架橋性モノマーの混合量は、重合性モノマーからなる重合体と架橋性モノマーとの混合物に対して、０．０１〜１質量％が好ましく、０．０２〜０．４質量％がより好ましい。この範囲とすることで、微粒子の架橋密度による含水率を向上させることができ、微粒子へのリガンドの固定化量を向上させることができる。
【００３９】
重合性モノマーと架橋性モノマーとを混合し、重合と架橋とを同時に行うことで、ゲル層を製造する場合、少なくとも２種の重合性モノマーと、架橋性モノマーを混合し、製造することが好ましい。２種類の重合性モノマーを用いる場合、２種類の重合性モノマーは、適宜選択すればよい。
【００４０】
例えば、１種類目の重合性モノマーとして、アクリル酸、メタクリル酸、アクリルアミド、メタクリルアミド、ヒドロキシメタクリルアミド、メタクリル酸グリシジルまたはＮ‐（３‐アミノプロピル）メタクリルアミド・塩酸塩を用い、２種類目の重合性モノマーとして、メタクリル酸２−ヒドロキシエチルまたはポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレートを用い、架橋性モノマーとしては、例えば、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、エチレングリコールジメタクリレートまたはポリエチレングリコールジアクリレートを用い、これらを組み合わせて用いることが好ましい。
【００４１】
それぞれのモノマーの使用割合は、重合性モノマーと架橋性モノマーとの混合物に対して、１種類目の重合性モノマーは、８９．２〜９８．９９質量％が好ましく、２種類目の重合性モノマーは、１〜１０質量％が好ましく、架橋性モノマーは、０．０１〜０．８質量％が好ましい。
【００４２】
重合性モノマーの重合のために用いる重合開始剤としては、例えば、２，２−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−Ａｚｏｂｉｓ（２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｉｎｅ）ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、過酸化ベンゾイルおよびＤｉｍｅｔｈｙｌ ２，２’−ａｚｏｂｉｓ（２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）が挙げられる。
【００４３】
本発明の磁性微粒子において、磁性体およびアルキル基を有する化合物を含む集合体を被覆するゲル層の厚みは、用いる重合性モノマーまたは架橋性モノマーの種類、該集合体の厚みによって適宜選択すればよく、特に制限されるものではない。
【００４４】
[磁性微粒子の製造方法]
本発明の磁性微粒子は、少なくとも下記の工程を含む製造方法により得られる。
１）磁性体およびアルキル基を有する化合物を含む集合体を形成する工程
２）工程１）で形成された集合体の表面に、重合性モノマーと架橋性モノマーとから架橋体を製造することで、親水性基を有するゲル層を形成する工程
工程２）において、重合性モノマーは、少なくとも２種であることが好ましく、得られる重合体も、共重合体であることが好ましい。また、ゲル層は、重合性モノマーに親水性基が含まれることから、形成されたゲル層は、親水性基を有することになり、ゲル層の表面に親水性基が存在する。
【００４５】
本発明の製造方法による各条件は、用いる磁性体、アルキル基を有する化合物、重合性モノマー、架橋性モノマーの種類によって適宜選択でき、特に限定されるものではない。
【００４６】
以下、具体例として、磁性体としてマグネタイト粒子を用い、アルキル基を有する化合物としてオレイン酸ナトリウムを用い、重合性モノマーとして、メタクリル酸グリシジル、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート（数平均分子量２０８０）を用い、架橋性モノマーとして、ポリエチレングリコールジアクリレート（数平均分子量５７５）を用い、重合開始剤として２，２’−アゾビスイソブチロニトリルを用いる場合について説明する。
【００４７】
１）磁性体およびアルキル基を有する化合物を含む集合体を形成する工程
この工程は、磁性体とアルキル基を有する化合物とを結合させ、集合体を形成する工程である。まず、常温（２０℃）でマグネタイトを分散媒中に分散させる。分散媒に添加するマグネタイトの量は特に制限はないが、均一な分散液が得られやすいことから、２〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度となるように添加することが好ましい。
【００４８】
分散媒としては、例えば、水、並びに水に緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ（ＨＥＰＥＳ：２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＭＥＳ（ＭＥＳ：２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）、リン酸、トリス、および酢酸各種緩衝液）、塩類（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、酢酸ナトリウムおよび硫酸マグネシウム）、界面活性剤類（例えば、トリトンＸ−１００およびＮＰ−４０）およびアルコール類（例えば、エタノール、メタノールおよびイソプロパノール）を適宜組み合わせた水溶液が挙げられる。
【００４９】
次に、マグネタイトの分散液に、オレイン酸ナトリウムを添加する。マグネタイトの分散液に対するオレイン酸ナトリウムの添加量は、１〜３０質量％が好ましく、３〜５質量％がより好ましい。
【００５０】
続いて、マグネタイトとオレイン酸ナトリウムの混合液を還流条件下で加熱し、マグネタイトとオレイン酸ナトリウムとを結合させて、マグネタイトおよびオレイン酸ナトリウムを含む集合体を得る。混合液の加熱条件は、還流条件下で、７０〜８０℃で、６〜１２時間反応させることが好ましい。
【００５１】
さらに、マグネタイトおよびオレイン酸ナトリウムを含む集合体を含有する混合液を遠心分離して余剰なオレイン酸ナトリウムを除去し、再度分散媒に分散させ、不純物を除いて、マグネタイトおよびオレイン酸ナトリウムを含む集合体とする。
【００５２】
２）工程１）で形成されたマグネタイトおよびオレイン酸ナトリウムを含む集合体を被覆するように、重合性モノマーと架橋性モノマーとを混合し、重合と架橋とを同時に行うことで架橋体を形成する工程
この工程は、工程１）で形成された集合体を被覆するようにゲル層を形成する工程である。まず、工程１）で得られたマグネタイトおよびオレイン酸ナトリウムを含む集合体を分散媒に分散させた分散液に、重合性モノマーであるメタクリル酸グリシジルおよびポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート（数平均分子量２０８０）と、架橋性モノマーであるポリエチレングリコールジアクリレート（数平均分子量５７５）を添加する。
【００５３】
それぞれのモノマーの使用割合は、メタクリル酸グリシジルを好ましくは８９．２〜９８．９９質量％、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート（数平均分子量２０８０）を好ましくは１〜１０質量％、ポリエチレングリコールジアクリレート（数平均分子量５７５）を好ましくは０．０１〜０．８質量％の濃度で添加することが好ましい。
【００５４】
マグネタイトおよびオレイン酸ナトリウムを含む集合体、並びに重合性モノマーと架橋性モノマーの混合液に、重合開始剤である２，２−アゾビスイソブチロニトリルを添加する。２，２−アゾビスイソブチロニトリルの添加量は、混合液に対し、０．０５〜０．５質量％の濃度となるよう添加することが好ましい。
【００５５】
重合開始剤を添加した後、加熱してメタクリル酸グリシジルおよびポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート（数平均分子量２０８０）を共重合させ、同時に生成する共重合体をポリエチレングリコールジアクリレート（数平均分子量５７５）で架橋させる。加熱条件は、７０〜８０℃にて６〜１２時間とすることが好ましい。
【００５６】
その後、室温に戻した後、磁気分離により有機溶媒で洗浄し、表面にゲル層を有する磁性微粒子が得られる。得られた磁性微粒子から有機溶媒を磁気分離により除去し、水に置換し、室温にて２４〜４８時間回転混合することによりゲル層を膨潤させ、乾燥する。
【００５７】
乾燥条件は、好ましくは６０〜７０℃にて３〜６時間、減圧乾燥する。乾燥後の磁性微粒子の含水率は、５０〜９０質量％であることが好ましく、７０〜８５質量％であることが好ましい。この範囲とすることで、磁性微粒子の分散性が高くなるからである。
【００５８】
上述した手順により、マグネタイトおよびオレイン酸ナトリウム複合体を含む集合体と、該集合体を被覆する、メタクリル酸グリシジル、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレートおよびポリエチレングリコールジアクリレートの架橋体よりなり、その表面にエポキシ基を有するゲル層とを備える本発明の磁性微粒子を製造することができる。
【００５９】
[吸着材]
本発明の磁性微粒子は、リガンドを固定化することにより、目的物質を特異的に吸着できる吸着材とすることができる。
目的物質は特に限定されないが、例えば、生理活性タンパク質、アミノ酸、ペプチド、糖および糖鎖が挙げられる。
【００６０】
生理活性タンパク質とは、哺乳動物、特にヒトの生理活性タンパク質と実質的に同じ生物学的活性を有するものであり、天然由来のもの、および遺伝子組換え法により得られるものが含まれる。遺伝子組換え法によって得られるタンパク質には天然タンパク質とアミノ酸配列が同じであるもの、または該アミノ酸配列の１若しくは複数を欠失、置換、または付加したもので前記生物学的活性を有するものが含まれる。
【００６１】
生理活性タンパク質としては、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、成長ホルモン、インシュリンおよびプロラクチン等のタンパク質ホルモン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、エリスロポエチン(ＥＰＯ)およびトロンボポエチン等の造血因子、インターフェロン、ＩＬ−１およびＩＬ−６等のサイトカイン、組織プラスミノーゲン活性化因子(ｔＰＡ)、ウロキナーゼ、血清アルブミン、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、レプチン、幹細胞成長因子(ＳＣＦ)、インスリン並びに副甲状腺ホルモンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
目的物質には、タグ融合タンパク質が含まれる。タグ融合タンパク質とは、遺伝子工学技術などを利用して人為的に導入した標識を持つタンパク質である。タグ融合タンパク質は、例えば、目的のタンパク質分子の一部に、特定のアミノ酸配列を持つペプチド鎖、または酵素活性および／若しくは特定の物質に対する結合能を持つタンパク質を標識として導入することで、作製することができる。目的のタンパク質に当該標識を導入することで、該タンパク質の分離や検出が容易になる。
【００６３】
タグ融合タンパク質のタグとしては、例えば、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）、ＧＳＴタグ、ＨＡタグ、Ｃ−Ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、ＨＳＶタグ、チオレドキシンタグ、アルカリフォスファターゼタグおよびリン酸化タンパク質タグが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
アミノ酸としては、特に限定はされないが、例えば、システインおよびメチオニンが挙げられる。また、ペプチドとしては、特に限定はされないが、例えば、インスリンおよびグルタチオンが挙げられる。
【００６５】
リガンドとしては、例えば、ビオチン、アビジン、グルタチオン、レクチン、抗体、Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノジ酢酸、プロテインＡおよびプロテインＧが挙げられる。ここで、ビオチンはイミノビオチンであってもよく、アビジンはストレプトアビジンであってもよい。
【００６６】
リガンドがビオチンの場合は、アビジンとの特異的な結合を介してビオチン化された目的タンパク質と、またビオチン化された抗体を用いてそれらの抗原である種々のタンパク質と更に結合することが可能である。本発明の吸着材には、市販されているアビジン化タンパク質およびビオチン化タンパク質が利用でき、ビオチン化は、当技術分野で周知の方法に従えばよい。
【００６７】
リガンドがグルタチオンの場合は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下、「ＧＳＴ」という。）を含有するタンパク質と特異的に結合できる。このようなＧＳＴ含有タンパク質の調製は当技術分野で周知の方法に従えばよい。
【００６８】
リガンドとしてプロテインＡまたはプロテインＧを用いる場合は、目的物質としては、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が好ましい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体としては、ＩｇＧが好ましい。なお、ヒトＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のサブクラスがあり、マウスＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３のサブクラスがある。本発明では、これらを使用することがより好ましい。
【００６９】
目的物質が糖鎖を有する生理活性タンパク質である場合、糖鎖の由来としては、特に制限はないが、哺乳動物細胞に付加される糖鎖が好ましい。該哺乳動物細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ細胞）、アフリカミドリザル腎臓由細胞（ＣＯＳ細胞）およびヒト由来の細胞が挙げられる。
【００７０】
目的物質がモノクローナル抗体である場合には、モノクローナル抗体はいかなる方法で製造されたものでもよい。モノクローナル抗体は、基本的には公知技術を使用し、抗原に感作させた免疫細胞を通常の細胞融合法によってミエローマ細胞と融合させて作成したハイブリドーマから生産することができる。
【００７１】
また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体に限られるものではなく、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変されたキメラ抗体を含む。さらに、トランスジェニック動物（ある特定の遺伝子を個体レベルで付加した遺伝子操作動物のこと。）およびファージディスプレイ等によって作製されたヒト抗体も好ましい。
【００７２】
リガンドは、磁性微粒子のゲル層に固定する。本発明の磁性微粒子とリガンドとの結合の例として、国際公開第０１／００９１４１号に記載されているように、ビオチンを、メタクリルやアクリル等の重合性官能基と結合させて付加重合性モノマーとし、他のモノマーと共重合することにより、本発明の磁性微粒子におけるゲル層にビオチンを結合させた吸着材が得られる。
【００７３】
一方、リガンドとしての抗体にアビジンを結合させ、前記吸着材と混合することにより、アビジンとビオチンの結合を利用して、前記吸着材に抗体を結合させることができる。
なお、ビオチンの代わりにグルタチオンを用いた場合は、アビジンではなく、グルタチオンＳトランスフェラーゼを用いればよい。
【００７４】
また、磁性微粒子のゲル層の形成時に親水性基を持つモノマーを他のモノマーと共重合させ、当技術分野で周知の方法に従い、親水性基を介して、抗体親和性物質（例えば、メロンゲル、プロテインＡおよびプロテインＧ）をゲル層上に結合させて吸着材を得ることができる。抗体親和性物質にリガンドとしての抗体を結合させることにより、吸着材に抗体を結合させることができる。
【００７５】
また、本発明の吸着材は、微生物に対する抗体を固定することにより、汚水からの微生物除去に用いることができる。汚水中の微生物としては、例えば、クリプトスポリジウム、ジアルジア、大腸菌、サルモネラ菌，レジオネラ菌およびピロリ菌が挙げられる。
【００７６】
[目的物質の分離方法]
本発明の吸着材を用いて、少なくとも下記の工程を含む方法により目的物質を分離することができる。
（１）目的物質を含む水溶液と吸着材との混合液を調製し、目的物質と吸着材の結合体を生成させる工程
（２）工程（１）で得られた混合液から磁力により結合体を分離する工程
（３）工程（２）で分離した結合体から目的物質を溶出する工程
【００７７】
以下、各工程について説明する。
（１）目的物質を含む水溶液と吸着材との混合液を調製し、目的物質と吸着材の結合体を生成させる工程
この工程は、目的物質を含む試料とリガンドを固定化した磁性微粒子（吸着材）とを混合し、該リガンドと目的物質との親和性を利用して、目的物質を吸着材に結合させる工程である。
【００７８】
混合操作は、適当なバッファー中で目的物質と吸着材が接触し得るならば、制限はない。例えば、目的物質を含む試料および吸着材が供されたチューブを軽く転倒攪拌または振とうさせる程度で十分であり、例えば市販のボルテックスミキサー等を用いて混合する操作が挙げられる。
【００７９】
目的物質を含む試料としては、例えば、生理活性タンパク質を含むＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞の培養培地およびこれに部分的精製などの一定の処理を施したもの、血清、血漿、腹水、リンパ液および尿が挙げられる。
【００８０】
本発明の目的物質の分離方法によれば、目的物質が生理活性タンパク質である場合、生理活性タンパク質を好ましくは１０−１８〜１０−２ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは１０−５〜１０−２ｍｏｌ／ｌという高濃度で含む試料から、磁性微粒子を用いて生理活性タンパク質を精製することができる。生理活性タンパク質の濃度は、例えば、ブラッドフォード法、ＢＣＡ法、２８０ｎｍの吸光度の測定および電気泳動により、測定することができる。なお、吸着材と混合する生理活性タンパク質を含む試料の容量は、１ｍｌ以上が好ましく、１５ｍｌ以上がより好ましい。また、５０ｌ以下が好ましく、１０ｌ以下がより好ましい。
【００８１】
また、目的物質が生理活性タンパク質である場合、工程（１）に供する生理活性タンパク質を含む試料は前処理していない試料であることが好ましい。生理活性タンパク質を含む試料の前処理としては、例えば、カラム法によりタンパク質を精製する際に必要である前処理が挙げられる。該前処理としては、例えば、細胞の分離、硫安沈殿、カプリル酸沈殿、硫酸デキストラン沈殿、ポリビニルピロリドン沈殿、活性炭によるフェノールレッド除去、並びに脱塩およびバッファー交換（例えば、ゲル濾過、透析および限外ろ過）が挙げられる。細胞を分離する方法としては、例えば、遠心分離、ろ過および限外ろ過が挙げられる。
【００８２】
本発明の目的物質の分離方法によれば、生理活性タンパク質を含む試料の前処理を経なくてもよいため、生理活性タンパク質の精製に要する時間を短縮することができる。前処理に要する時間は、生理活性タンパク質の種類および量等により異なるが、通常、１５〜３０時間である。例えば、遠心分離により夾雑物である細胞を分離する場合、通常約３０分〜１時間の所用時間である。また、生理活性タンパク質を含む試料が血清の場合、硫安沈殿および脱塩をする必要があるが、例えば、血清の量が１５〜１０００ｍｌの場合、その所要時間は、通常約３０分から１時間である。また、生理活性タンパク質を含む試料が培養上清の場合、フェノールレッド除去を必要に応じてする必要があるが、培養上清が１５〜１０００ｍｌの場合その所要時間は、通常約１時間である。
【００８３】
（２）工程（１）で得られた混合液から磁力により結合体を分離する工程
この工程は、工程（１）で得られた混合液から、目的物質の結合した吸着材を磁力により分離する工程である。具体的には、例えば、目的物質と吸着材との結合を適当なチューブ内で行った場合、チューブの側壁に磁石を外側から近づけることによって吸着材をチューブの側壁近傍に保持しつつ、チューブ内から上澄み部分となる液体を排出することによって、目的物質が結合した吸着材を分離することができる。
【００８４】
磁性微粒子の分離に用いる磁石等の磁力は、用いる磁性微粒子の有する磁力の大きさによって異なる。磁力は、目的の磁性微粒子を磁集可能な程度の磁力を適宜使用できる。磁石の素材としては、例えば、上述した磁性微粒子の素材で構成されたものを使用することができる。例えば、ネオジム磁石（株式会社二六製作所製）等が利用できる。ネオジム磁石の磁力は、３８００ガウス以上がより好ましい。
【００８５】
（３）工程（２）で分離した結合体から目的物質を溶出する工程
この工程は、工程（２）で磁性分離により分離した、目的物質と吸着材の結合体から、目的物質を溶出して回収する工程である。目的物質の特性に従い、当該技術分野で周知の方法によって結合体から目的物質を分離する。
【００８６】
具体的には、例えば、結合体を入れたチューブ内に適当な溶出液を加えることによって、目的物質を結合体から溶出させる。そして、溶出後、チューブの側壁に磁石を外側から近づけて磁性微粒子をチューブの側壁近傍に保持しつつ、チューブ内から上澄み部分となる液体を採取することによって、吸着材に結合していた目的物質を回収することができる。
【００８７】
目的物質を溶出させる溶出液としては、目的物質とリガンドとの親和性を低下させる効果がある液体が好ましい。当該液体としては、例えば、塩酸、イミダゾール、グルタチオンおよびビオチンを含むバッファーが挙げられる。バッファーとしては、例えば、リン酸カリウムバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、トリス塩酸塩バッファー、１，４−ピペラジンジエタンスルフォン酸バッファー（以下、「ＰＩＰＥＳバッファー」という。）、ホウ酸バッファーおよびグリシン塩酸バッファーが挙げられる。
【００８８】
尚、目的物質と吸着材の結合体から目的物質を溶出させる前に結合体を洗浄し、夾雑物を除去してもよい。具体的な洗浄方法としては、例えば、０．５質量％のＴｗｅｅｎ２０（ユニヒェマ ヒェミー ベスローテン フエンノートシャップ社の登録商標：Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ）を含むリン酸ナトリウムバッファー中に目的物質と吸着材の結合体を加え、再分散を繰り返すことで、疎水性相互作用で結合や巻き込みにより結合体中に取り込まれていた夾雑物を取り除く方法が挙げられる。
【００８９】
上記工程（１）〜（３）を経ることによって、目的物質を含む試料から目的物質を精製することができる。
【００９０】
また、本発明の吸着材を用いれば、少なくとも上記工程（１）および（２）を経ることによって、汚水処理することができる。
【実施例】
【００９１】
以下、本発明を実施例および比較例により説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
磁気分離とは、磁性微粒子等を磁石等の磁力によって、液体から収集することをいう。
なお、磁気分離には、株式会社二六製作所製ネオジム磁石を使用した。
精製水とは、ミリポア社製純水製造装置「Ｄｉｒｅｃｔ−ＱＴＭ」によって精製された導電率１８ＭΩｃｍの水であり、ＭｉｌｌＱ水と呼ばれることもある。
【００９２】
実施例１
＜表面にゲル層を持つ磁性微粒子の製造方法＞
２００ｍｌ容のフラスコに、塩化第二鉄・六水和物（１．０ｍｏｌ）及び塩化第一鉄・四水和物（０．５ｍｏｌ）混合水溶液を１００ｍｌ入れ、メカニカルスターラー（ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＨＩＧＨＴ ＰＯＷＥＲ ＭＩＸＥＲ、ＡＳＯＮＥ社製）で攪拌し、この混合溶液を５０℃に昇温した後、２８質量％アンモニア水溶液５．０ｍｌを滴下し、１時間程度攪拌した。この操作で、平均粒子径が約５ｎｍのマグネタイトが得られた。得られたマグネタイトを精製水で３回洗浄し、乾燥した後メタノールにて２０ｍｇ／ｍｌに調製した。マグネタイト分散液１００ｍｌに対し、オレイン酸ナトリウム３ｇを加え８０℃で１２時間還流操作を行った。遠心分離（１００００ｇ、３０分、２５℃）して過剰なオレイン酸ナトリウムを除き、再びメタノールに分散し２０ｍｇ／ｍｌに調製し、マグネタイト−オレイン酸ナトリウム複合体のメタノール溶液を得た。
【００９３】
マグネタイト−オレイン酸ナトリウム複合体（磁性微粒子）のメタノール溶液１００ｍｌにメタクリル酸グリシジル２５ｇ、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート（数平均分子量２０８０）１ｇおよびポリエチレングリコールジアクリレート（数平均分子量５７５）０．１ｇを加え、室温で２時間攪拌した後、２，２’−アゾビスイソブチロニトリルを０．２５ｇ加え、７０℃に加熱し６時間反応させた。得られた反応混合物を室温に戻した後、磁気分離（ネオジム磁石、株式会社二六製作所製）し、メタノールで２回洗浄することで、表面にゲル層を持つ磁性微粒子のメタノール分散液を得た。前記磁性微粒子のメタノール分散液から、磁気分離（ネオジム磁石、株式会社二六製作所製）によりメタノールを除き、精製水に置換し一晩回転混合によりゲル層を膨潤させた。その後、１ｍｌの分散液を分取し、磁気分離を行い上清を除き、水を含有する磁性微粒子の質量を測定し、乾燥（６０℃、６時間、恒温・乾燥器 ＤＫＮ４０２、ヤマト科学社製）させた後、乾燥後の磁性微粒子の質量を測定した。その結果、ゲル層を有する磁性微粒子の含水率は８３質量％であった。
【００９４】
得られた磁性微粒子の平均粒子径をレーザーゼータ電位計（大塚電子株式会社製ＥＬＳ−８０００（商品名））により測定したところ、５２５ｎｍであった。
【００９５】
実施例２
＜ストレプトアビジン固定化磁性微粒子によるビオチン化抗体の分離＞
（ストレプトアビジン固定化磁性微粒子の調製）
実施例１と同様に調製したゲル層を持つ磁性微粒子１ｍｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）を磁気分離し上清を除いた。そこへ精製水１ｍｌを添加し、磁性微粒子を再分散させた。再び磁気分離後、上清を除き、そこへ２５ｍＭ ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ４．７５）１ｍｌを加えて再分散させた。ストレプトアビジン（１０ｍｇ／ｍｌ）を２５μｌ添加し、３時間回転混合した。磁気分離を行い、上清を除いた後１ｍｌの１００ｍＭ ＴＢＳ（ＴＢＳ：Ｔｒｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）を加えて１時間反応させた。磁気分離の後、上清を除去し、１ｍｌの１００ｍＭ ＰＢＳ（ＰＢＳ：Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．５、０．０１質量％のＢＳＡを含む）を加え、磁性微粒子を再分散させた。同様の操作をもう一度行い、ストレプトアビジン固定化磁性微粒子を得た。
【００９６】
（ストレプトアビジン固定化磁性微粒子によるビオチン化抗体の分離）
ストレプトアビジン固定化磁性微粒子１００μｌに対してビオチン化ＩｇＧ（ＲＯＣＫＬＡＮＤ社製、Ａｎｔｉ−ＩｇＧ（Ｆｃ）、Ｒａｂｂｉｔ、Ｇｏａｔ−Ｐｏｌｙ、Ｂｉｏｔｉｎ）１０μｇを添加し５分間回転混合した。その後１５μｌを分取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の略。）による電気泳動のＴｏｔａｌサンプルとした。２分間磁気分離し、上清から１５μｌを分取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動の上清（ｓｕｐ）サンプルとした。上清を除去し、１ｍｌの１００ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．５、０．０１質量％のＢＳＡを含む）を加え、磁性微粒子を再分散させた。同様の操作をもう一度行い、上清を除去後１５μｌの１００ｍＭ ＰＢＳを添加し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動の残渣（ｐｐｔ）サンプルとした。
【００９７】
１５μｌの各サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動で分析した結果を図１に示す。図１に示したように、Ｔｏｔａｌサンプルに存在するＩｇＧに由来するバンドがｓｕｐサンプルでは消失し、磁性微粒子側（ｐｐｔサンプル）に結合していることがわかった。
この結果から、本発明によるストレプトアビジン固定化磁性微粒子により、効率的にビオチン化ＩｇＧを回収できることがわかった。
【００９８】
実施例３
＜プロテインＡ固定化磁性微粒子による抗体の精製＞
（プロテインＡ固定化磁性微粒子の調製）
実施例１と同様に調製したゲル層を持つ磁性微粒子１ｍｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）を磁気分離し、上清を除いた。そこへ精製水１ｍｌを添加し、磁性微粒子を再分散させた。再び磁気分離後、上清を除き、そこへ１ｍｌの２５ｍＭ ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒを加え再分散した。２５μｌのプロテインＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、３時間回転混合した。磁気分離を行い、上清を除いた後、１ｍｌの１００ｍＭ ＴＢＳ（ｐＨ７．５）を加えて１時間反応させた。磁気分離の後、上清を除去し、１ｍｌの１００ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．５）を加え、磁性微粒子を再分散させた。同様の操作をもう一度行い、プロテインＡ固定化磁性微粒子を得た。
【００９９】
（プロテインＡ固定化磁性微粒子を用いたウサギおよびヒト血清からのＩｇＧの分離）
プロテインＡ固定化磁性微粒子１００μｌに対してウサギおよびヒト血清１０μｌを添加し５分間、ＭＴＲ−１０３（ＡＳ ＯＮＥ社製）によって回転混合させた。上清を除去し、１ｍｌの１００ｍＭ ＰＢＳを加えて再分散させた。再び磁気分離操作を行い、上清を除去し再分散させた。磁気分離の後、上清を除去し、９０μｌの１００ｍＭ グリシン塩酸バッファー（ｐＨ３．０）加え３分間振とう混合することでＩｇＧを溶出させた（１回目）。磁気分離の後、上清を分離し、分離した上清に対して１０μｌの１０×ＰＢＳを添加し、溶出サンプル１とした。
【０１００】
再び９０μｌの１００ｍＭ グリシン塩酸バッファー（ｐＨ３．０）加え、３分間振とう混合して、ＩｇＧを溶出させた（２回目）。分離した上清に対して１０μｌの１０×ＰＢＳを添加し、溶出サンプル１とした。磁気分離の後、上清を分離し、上清に対して１０μｌの１０×ＰＢＳを添加し、溶出サンプル２とした。
【０１０１】
１５μｌの各サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動で分析した結果を図２に示す。図２に示すように、本発明によるプロテインＡ固定化磁性微粒子を用いて、ウサギ血清およびヒト血清のいずれからでもＩｇＧを分離・溶出できることがわかった。
【０１０２】
実施例４
＜プロテインＡ固定化磁性微粒子及びプロテインＧ固定化磁性微粒子と従来製品との比較＞
（ＩｇＧの分離）
実施例３と同様に、プロテインＡ固定化磁性微粒子及びプロテインＧ固定化磁性微粒子を調製した。２００μｇのＩｇＧ Ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｒａｂｂｉｔ（ＲＯＣＫＬＡＮＤ社製）を含む１００μｌの１００ｍＭ ＰＢＳに、各３ｍｇのプロテインＡ固定化磁性微粒子及びプロテインＧ固定化磁性微粒子を添加し２５℃で１５分間、ＭＴＲ−１０３（ＡＳ ＯＮＥ社製）によって回転混合させた。２分間磁気分離の後、上清を除去して２００μｌの１００ｍＭ ＰＢＳ−Ｔ（０．０５質量％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液）を加え、磁性微粒子を再分散させた。再び磁気分離操作を行い、上清を除去し再分散させた。さらに２回洗浄操作を行い、上清を除去した。４５μｌの１００ｍＭ グリシン塩酸バッファー（ｐＨ２．７）を加え、ピペットにより混合した。ボルテックスを５分間行い、磁気分離の後に上清を回収した。さらに再度抽出操作を行い、得られた２回分の上清を混合し、８μｌの１Ｎ ＮａＯＨを加え中和した。中和した各上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動を行った。
【０１０３】
電気泳動の結果はＣＳ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＴＴＯ社製）により解析した。なお、検量線は、ＩｇＧ Ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｒａｂｂｉｔを用いて作成した。また、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＡおよびＧ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）についても同様の操作を行った。
【０１０４】
電気泳動の結果、プロテインＡ固定化磁性微粒子は、１５８．４μｇのＩｇＧを分離し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＡは、３６．８μｇのＩｇＧを分離した。また、プロテインＧ固定化磁性微粒子は、９７．４μｇのＩｇＧを分離し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＧは、２７．３μｇのＩｇＧを分離した。
【０１０５】
上記の結果から、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＧを用いた場合に対して、本発明によるプロテインＡ固定化磁性微粒子では、最大４．３倍、プロテインＧ固定化磁性微粒子では、３．６倍のＩｇＧを分離できることが分かった。
【０１０６】
（希薄溶液からのＩｇＧの分離）
プロテインＡ固定化磁性微粒子を実施例３と同様に調製した。１ｍｇのプロテインＡ固定化磁性微粒子を５０μｇのＩｇＧ Ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏf Ａｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｒａｂｂｉｔ（ＲＯＣＫＬＡＮＤ社製）を含む５０ｍｌの希薄溶液に添加し３０分間回転混合させた。磁気分離の後、上清を除去し１ｍｌの１００ｍＭ ＰＢＳを加えて磁性微粒子を再分散させた。再び磁気分離操作を行い、上清を除去し、磁性微粒子を再分散させた。磁気分離の後、上清を除去し、磁性微粒子をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動で分析した。
【０１０７】
電気泳動の結果をＣＳ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＴＴＯ社製）により解析した。なお、検量線の作成はＩｇＧ Ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｒａｂｂｉｔを用いて行った。また、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＡ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）についても同様の操作を行った。
【０１０８】
その結果、プロテインＡ固定化磁性微粒子により２５μｇのＩｇＧが分離できた。一方、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＡにより６μｇのＩｇＧが分離できた。この結果から、本発明によるプロテインＡ固定化磁性微粒子はＤｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＡと比較して、希薄溶液から約４倍のＩｇＧを分離できることがわかった。
【０１０９】
（磁性微粒子とＩｇＧの反応速度の比較）
プロテインＡ固定化磁性微粒子を実施例３と同様に調製した。１０ｍｇのプロテインＡ固定化磁性微粒子を２５μｇのＩｇＧ Ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｒａｂｂｉｔ（ＲＯＣＫＬＡＮＤ社）を含む５００μｌのＰＢＳ溶液に添加し、０．５、１、５、１０、２０、３０分の反応の後に磁気分離を行い、上清を１５μｌ分取し、電気泳動を行った。
【０１１０】
電気泳動の結果は、ＣＳ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＴＴＯ社製）により解析した。また、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＡ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）についても同様の操作を行った。プロテインＧ固定化磁性微粒子についても同様に比較を行った。その結果を図３に示す。
【０１１１】
図３の上図に示すように、プロテインＡ固定化磁性微粒子は、約０．５分でほぼ１００％のＩｇＧを分離した。一方、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＡは、３０分で８５％のＩｇＧを分離した。また、図３の下図に示すように、プロテインＧ固定化微粒子は、０．５分でほぼ１００％のＩｇＧを分離した。一方、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＧは、３０分で２７％のＩｇＧを分離した。これらの結果から、本発明によるプロテインＡ固定化磁性微粒子およびプロテインＧ固定化磁性微粒子は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＡおよびＤｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＧと比較して、ＩｇＧとの反応速度が速いことがわかった。
【０１１２】
実施例５
＜ハイブリドーマ培養上清５０ｍｌからのプロテインＡ固定化磁性微粒子によるＩｇＧ２ａの分離＞
（処理１）
５０ｍｌのハイブリドーマ培養上清を３００ｍｌ容積の三角フラスコに分注し、１０質量％ Ｔｗｅｅｎ２０を２５０μｌ加えた（最終濃度：０．０５質量％）。そこへ、実施例３と同様に調製した４ｍｌのプロテインＡ固定化磁性微粒子(１０ｍｇ／ｍｌ)を加え、室温で１時間、泡立たぬ程度に振とう機（９０回／分、ＭＳ−１ Ｍｉｎｉｓｈａｋｅｒ、ＩＫＡ社製）によりインキュベートした。
【０１１３】
（処理２）
５０ｍｌ遠心チューブ２本に均等に移し、磁気分離を室温にて１０分間行った。上清を三角フラスコに戻し、再度４ｍｌのプロテインＡ固定化磁性微粒子を加え、１時間同様にインキュベートした。
【０１１４】
（洗浄操作）
処理１で磁気分離した磁性微粒子に３ｍｌのＰＢＳ−Ｔ（Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むＰＢＳ）を加え、十分に分散させた後、２ｍｌのマイクロチューブに２本に移した。空になった遠心チューブに再度１ｍｌのＰＢＳ−Ｔを加え、壁面を洗い、上記の２ｍｌマイクロチューブへ０．５ｍｌのＰＢＳ−Ｔを加えた。磁気分離装置（マグナスタント−８、マグナビート株式会社製）にセットし、氷水中で５〜１０分間静置し磁気分離した。上清を除去し、再びＰＢＳ−Ｔを添加して磁性微粒子を分散させ、５〜１０分間磁気分離を行い、上清を除去した。洗浄操作を再び行い、上清を除去した。
【０１１５】
（抽出操作）
各チューブに４５０μｌの１００ｍＭ グリシン塩酸バッファー(ｐＨ２．７)加え、十分に混合させた。マクロチューブをフロートへ指し、氷水中に装着し、ソニケーター（Ｓ３０Ｈ Ｅｌｍａｓｏｎｉｃ、Ｅｌｍａ社製）に浮かべ、超音波洗浄を行った。超音波洗浄は、１０秒間行った後、１０秒間休止し、これを洗浄操作のサイクルとし、これを５分間繰り返した。磁気分離操作の後、上清を分離し、新しいマイクロチューブに移し、８０μｌの１Ｍ ＮａＯＨを加え中和し、精製ＩｇＧ２ａを得た。抽出操作をさらにもう一度行った。再度（処理２）プロテインＡ固定化磁性微粒子を加え分離操作を行ったものは、同様に洗浄・抽出操作を行った。
【０１１６】
１５μｌの各サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動で分析した結果を図４に示す。
【０１１７】
図４に示すように、上清の洗浄液には、ＩｇＧに由来するバンドはなく溶出液にのみＩｇＧに由来するバンドが見られた。この結果から、本発明による磁性微粒子を用いた操作により、ＩｇＧを特異的に精製することができることがわかった。また、回収率は９３％であり、所要時間は約４時間であった。
【０１１８】
実施例６
＜ＡＢ−ＮＴＡ固定化磁性微粒子によるＨｉｓ−プロテインＡの回収＞（ＡＢ−ＮＴＡの固定化）
実施例１と同様に調製したゲル層を持つ磁性微粒子１０ｍｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）を磁気分離し上清を除いた。そこへ１０ｍｌの精製水を添加し、磁性微粒子を再分散させた。再び磁気分離後、上清を除き、そこへ１０ｍｌの１００ｍＭ ホウ酸バッファー（ｐＨ８．５）を加えて磁性微粒子を再分散させた。１００ｍｇのＡＢ−ＮＴＡ ｆｒｅｅ ａｃｉｄ（ＤＯＪＩＤＯ社製）を添加し、１２時間回転混合した。磁気分離の後、上清を除去し、１０ｍｌの精製水を加えて磁性微粒子を再分散させた。同様の操作をさらに３回行い、ＡＢ−ＮＴＡ固定化磁性微粒子を得た。
【０１１９】
（ニッケルとの複合体の形成）
１０ｍｌのＡＢ−ＮＴＡ固定化磁性微粒子を磁気分離の後、上清を除去し、１０ｍｌの１Ｍ濃度硫酸ニッケル溶液に懸濁し、６時間撹拌した。その後、磁気分離を行い、上清を除去し、１０ｍｌの精製水を加えて磁性微粒子を再分散させた。同様の操作をさらに３回行い、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）中に再懸濁しＮｉ−ＮＴＡ磁性微粒子を保存した。
【０１２０】
（Ｈｉｓ−プロテインＡの回収）
Ｈｉｓ−ｔａｇをＮ−末端に有するＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ−ＰｒｏｔｅｉｎＡ（フナコシ社製）１００μｇを含む１０μｌのＧｏａｔ血清に、１ｍｇのＮｉ−ＮＴＡ磁性微粒子を添加した。５分間の反応の後、上清を除去した。そこへＴｗｅｅｎ２０を０.１質量％含むＰＢＳを１ｍｌ添加して、Ｎｉ−ＮＴＡ磁性微粒子を再分散させた。同様にＴｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＰＢＳ１ｍｌで５回洗浄操作を行った。磁気分離の後、上清を除去し、５０μｌの５００ｍＭ イミダゾールＰＢＳ溶液を添加して溶出操作を行った。１５μｌの上清を分取しＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動で分析した結果を図５に示す。
【０１２１】
図５に示すように、溶出液にＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ−ＰｒｏｔｅｉｎＡに由来するバンドがみられた。この結果から、本発明によるＮｉ−ＮＴＡ磁性微粒子により、Ｈｉｓタグを有するタンパク質を特異的に分離できることがわかった。
【０１２２】
実施例７
＜自家蛍光の有無の評価＞
実施例１と同様に調製したゲル層を持つ磁性微粒子を、蛍光顕微鏡（アーク光源全反射蛍光顕微鏡システム ＩＸ７１−ＡＲＣＥＶＡ、オリンパス社製)を用いて、明視野および暗視野により観察した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ aｎｔｉ−Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ（ベリタス社製）についても同様に観察した。その結果を図７に示す。
【０１２３】
図７に示すように、Ｄｙｎａｂｅａｄｓは暗視野において自家蛍光が観察されるのに対して、ゲル層を有する磁性微粒子には自家蛍光は観察されなかった。この結果から、本発明による磁性微粒子は自家蛍光を発しないことがわかった。
【０１２４】
実施例８
＜抗ストレプトアビジン抗体固定化磁性微粒子による、ＦＩＴＣラベル微粒子とストレプトアビジン微粒子の混合液からのストレプトアビジン微粒子の分離＞
（抗ストレプトアビジン抗体の磁性微粒子への固定化）
実施例１と同様に調製したゲル層を持つ磁性微粒子１ｍｌ（２０ｍｇ／ｍl）を磁気分離し、上清を除いた。そこへ精製水１ｍｌを添加し、再分散した。再び磁気分離後、上清を除き、そこへ２５ｍＭ ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ＭＥＳ：２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ、ｐＨ４．７５）１ｍｌを加え再分散した。抗ストレプトアビジン抗体(１０ｍｇ／ｍＬ、Ａｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、Ｒａｂｂｉｔ、ＲＯＣＫＬＡＮＤ社製)を２５μｌ添加し、３時間回転混合した。その後、磁気分離を行い、上清を除いた後、１ｍｌの１００ｍＭ ＴＢＳを加え１時間反応させた。磁気分離の後、上清を除去し、１ｍｌの１００ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．５、０．０１質量％のＢＳＡを含む)を加え、再分散を行った。同様の操作をもう一度行い、抗ストレプトアビジン抗体固定化磁性微粒子を得た。
【０１２５】
（ＦＩＴＣラベル微粒子とストレプトアビジン微粒子混合液からのストレプトアビジン微粒子の分離（図８））
ＦＩＴＣラベル微粒子（Ｍｉｃｒｏ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｅｌａｍｉｎｅ ｒｅｓｉｎ、ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ、ＦＩＴＣ−ｍａｒｋｅｄ、Ｆｌｕｋａ社製、１０μｍ、２．５質量％）（以下、「ＦＩＴＣ微粒子」ともいう）とストレプトアビジン微粒子（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、６．０μｍ、ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、１．３６質量％）とを１：１０（容量比）で混合した混合液１００μｌに対して、５０μｌの抗ストレプトアビジン抗体固定化磁性微粒子を添加し、１５分間回転混合した。その後、磁気分離を行い、上清を除去後１ｍｌのＰＢＳに磁性微粒子を再分散させた。再び磁気分離を行い、上清を除去後、１ｍｌのＰＢＳに磁性微粒子を再分散させた。同様の操作をさらに２回行った。その後、蛍光顕微鏡および顕微鏡（ＩＸ７１、オリンパス社製）により観察した。図９に顕微鏡による観察結果を示す。図９に示すように、本発明による磁性微粒子により磁気分離する前のＦＩＴＣ微粒子は総数の約２０％であったが、磁気分離後は約１.４％になった。
【０１２６】
（磁性微粒子に対するＦＩＴＣ微粒子の非特異的吸着の確認）
実施例１と同様に調製したゲル層を持つ磁性微粒子５０μｌを１００μｌのＦＩＴＣ微粒子に添加し、１５分間回転混合した。その後、磁気分離を行い、上清を除去後、１ｍｌのＰＢＳに磁性微粒子を再分散させた。再び磁気分離を行い、上清を除去後、１ｍｌのＰＢＳに磁性微粒子を再分散した。同様の操作をさらに２回行った。その後、蛍光顕微鏡により観察した。その結果を図１０に示す。図１０に示すように、本発明の磁性微粒子による非特異的な吸着はほぼないことがわかった。
【０１２７】
これらの結果から、目的物質に対する特異的な抗体を本発明の磁性微粒子に固定化することで、目的物質を特異的に分離することができることがわかった。
【０１２８】
実施例９
＜微粒子分離における市販の磁性微粒子との比較＞
市販の磁性微粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｃａｒｂｏｙｌｉｃ ａｃｉｄ、ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）（以下、「ゲル層がない磁性微粒子」ともいう）と、実施例８に調製したゲル層を有する抗ストレプトアビジン抗体固定化磁性微粒子とを比較した。実施例８と同様の方法で、ＦＩＴＣ微粒子およびストレプトアビジン微粒子の混合液に磁性微粒子を添加した後に磁気分離操作を行い、１回目の磁気分離後の上清側を上清（ｓｕｐ）サンプルとし、磁性微粒子側を残渣（ｐｐｔ）サンプルとした。蛍光顕微鏡により観察した結果を図１１に示す。
【０１２９】
図１１に示すように、ゲル層がない磁性微粒子では効率的に分離することができなかったが、ゲル層を有する抗ストレプトアビジン抗体固定化磁性微粒子ではＳｕｐ側にはほぼＦＩＴＣ微粒子が、ｐｐｔ側にはストレプトアビジン微粒子が分離され効率的に微粒子が分離されているのがわかった。
【０１３０】
また、各５μｌのゲル層がない磁性微粒子およびゲル層を有する磁性微粒子を５μｌのストレプトアビジン微粒子を混合した混合液を顕微鏡で観察した。その結果を図１２に示す。
【０１３１】
図１２に示すように、ゲル層を有する抗ストレプトアビジン抗体固定化磁性微粒子とストレプトアビジン微粒子が共存する場合は、ストレプトアビジン微粒子の判別が容易であった。一方、ゲル層がない磁性微粒子とストレプトアビジン微粒子が共存する場合は、ストレプトアビジン微粒子の判別が困難であった。
【０１３２】
これらの結果から、本発明のゲル層を有する磁性微粒子は、市販のゲル層のない磁性微粒子と比較して、より特異的に目的物質を分離することができることがわかった。
【０１３３】
実施例１０
＜水道水濃縮液および河川水濃縮液からの磁気分離＞
各１ｍｌの水道水濃縮液（１０ｌの水道水を１０ｍｌに濃縮した。）および河川水濃縮液［１０ｌの河川水（採取場所：千葉県養老川、試験時期：２００８年９月〜１０月）］を１０ｍｌに濃縮した。）を２ｍｌのバイアルに分注し、実施例１と同様に調製したゲル層を有する磁性微粒子１００μｌを添加した。その後、磁気分離のために、ネオジム磁石（ＮＥ００１Φ８×３、丸型、株式会社二水製作所製）をバイアルの側面にあて、１分間静置した。その磁気分離挙動を確認した。その結果を図１３に示す。
【０１３４】
図１３に示すように、本発明によるゲル層を有する磁性微粒子によれば、水道水濃縮液および河川水濃縮液のいずれにおいても巻き込みがほとんどなく磁気分離できることがわかった。
【０１３５】
実施例１１
＜ジアルジアおよびクリプトスポリジウムの分離＞
実施例１０と同様に調製した河川水濃縮液１ｍｌに不活化したジアルジアとクリプトスポリジウムとを各１００個添加した懸濁液を調製した。懸濁液１ｍｌに対して、１０μｌのビオチン化クリプトスポリジウム抗体（Ａ４００ＢＩＯＴ−Ｒ−２０Ｘ：Ｃｒｙｐｔ−ａ−Ｇｌｏ、Ｗａｔｅｒｂｏｒｎｅ社製）２０μｌを添加し３０分間回転混合し反応させた。その後、実施例２と同様に調製したストレプトアビジン固定化磁性微粒子５０μｌを添加し、１５分振倒混合し反応させた。２分間磁気分離を行い、上清を回収し、上清（ｓｕｐ）サンプルとした。分離した磁性微粒子に１ｍｌのＰＢＳを加えて、磁性微粒子を再分散させた。再び磁気分離を行い上清を除去した。２００μｌのＰＢＳを添加し、磁性微粒子を再分散させて、残渣（ｐｐｔ）サンプルとした。Ｓｕｐおよびｐｐｔサンプルを、ＥａｓｙＳｔａｉｎＴＭ（和光純薬工業）を用いて染色を行い、蛍光顕微鏡で観察した。その結果を図１４に示す。
【０１３６】
図１４に示すように、ｓｕｐ側にはジアルジアのみが、ｐｐｔ側にはクリプトスポリジウムのみが観察できた。また、本発明の磁性微粒子は、微粒子組成にスチレンを含まないため自家蛍光がなく、磁性微粒子からの分離操作なしに蛍光測定ができた。これらの結果から、本発明による磁性微粒子によれば、公定法で用いられている磁性微粒子でも困難であった河川水からでもクリプトスポリジウムを分離できることがわかった。
【０１３７】
実施例１２
＜架橋性モノマーの影響＞
（プロテインＡ固定化磁性微粒子の調製）
表１に示すように、マグネタイト−オレイン酸ナトリウム複合体（磁性微粒子）のメタノール溶液１００ｍｌに、メタクリル酸グリシジル、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート（数平均分子量２０８０）、ポリエチレングリコールジアクリレート（数平均分子量５７５）、２，２’−アゾビスイソブチロニトリルを表１の配合量で仕込み、実施例１と同様に処理し、表面にゲル層を持つ磁性微粒子を調製した。得られたゲル層を持つ磁性微粒子を実施例３と同様に処理し、プロテインＡ固定化磁性微粒子を調製した。
【０１３８】
【表１】
【０１３９】
得られたプロテインＡ固定化磁性微粒子の粒径、含水率、エポキシ基濃度およびプロテインＡの固定化量を測定した。その結果を、表２に示す。
【０１４０】
【表２】
【０１４１】
表２に示すように、ほぼ同等のエポキシ基を有しているにかかわらず、プロテインＡの固定化量は、架橋性モノマーの量が少ない磁性微粒子（Ｎｏ．１〜３）の方が、架橋性モノマーの量が多い磁性微粒子（Ｎｏ．４および５）と比較して多かった。これは、架橋密度による含水率がプロテインＡの固定化に大きく影響していると考えられる。
【０１４２】
（ＩｇＧの分離）
実施例４と同様にして、プロテインＡ固定化磁性微粒子によりＩｇＧを磁気分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によりＩｇＧ回収量を調べた。その結果を表３に示す。なお、表３において、ＩｇＧ回収量（ｍｇ／ｍｇ）は、プロテインＡ固定化磁性微粒子１ｍｇ当りの回収されたＩｇＧの量を示す。
【０１４３】
【表３】
【０１４４】
表３に示すように、プロテインＡ固定化磁性微粒子によるＩｇＧの回収量は、プロテインＡの固定化量に依存していることがわかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁性体とアルキル基を有する化合物を含む集合体と、該集合体を被覆し且つ親水性基を有するゲル層とを含む磁性微粒子およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体材料の分離・精製を目的としたマイクロサイズ磁性微粒子が知られており、カラム法に比べ簡便な方法であり、診断・抽出の自動化などに応用されている（非特許文献１および２）。
【０００３】
また、細胞分離を目的としたナノサイズ磁性微粒子が知られており、ナノサイズ磁性微粒子と磁気カラムとを用いた方法も広く有用性が示されている（特許文献１および２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表平１０−５００４９２号公報
【特許文献２】特表２００３−５０８０７３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】川口春馬、「磁性体含有高分子粒子の作製」、月刊バイオインダストリー、シーエムシー出版、２００４年８月
【非特許文献２】小幡公道、「磁性微粒子を用いた核酸自動抽出装置」、ＢＭＥ、１２（２）、１９９８年、ｐ．１５―２４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところが、マイクロサイズ磁性微粒子は表面が硬い層でできており、デリケートな物質を回収する場合、硬い表面が悪影響を与える可能性がある。また、ナノサイズ磁性微粒子は、磁石で分離する場合に、ブラウン運動の影響を受けて磁気分離に時間を要するという欠点がある。また、マイクロサイズ磁性微粒子およびナノサイズ磁性微粒子の分離に磁気カラムを用いると、カラムのコストがかかり、経済的な負担が大きいという課題がある。
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、従来の磁性微粒子と比較して、格段に簡便、低コストかつ効率的に目的物質を精製する磁性微粒子を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を重ねた。その結果、磁性体およびアルキル基を有する化合物を含む集合体の表面にゲル層が形成されている磁性微粒子は、反応性に優れ、タンパク質、アミノ酸、ペプチド、糖および糖鎖を容易に固定化できることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ 磁性体およびアルキル基を有する化合物を含む集合体と、該集合体を被覆するゲル層とを備える磁性微粒子であって、該ゲル層に親水性基を有する磁性微粒子。
［２］ 平均粒子径が、０．９ｎｍ以上１００００ｎｍ未満である前記［１］項に記載の磁性微粒子。
［３］ アルキル基を有する化合物が、ベンゼン環を有さない化合物であって、鉄イオンと結合可能である前記［１］項または前記［２］項に記載の磁性微粒子。
［４］ アルキル基を有する化合物が、脂肪酸である前記［３］項に記載の磁性微粒子。
［５］ 脂肪酸が、オレイン酸である前記［４］項に記載の磁性微粒子。
［６］ 親水性基が、エポキシ基である前記［１］〜［５］のいずれか１項に記載の磁性微粒子。
［７］ ゲル層が、重合性モノマーと、架橋性モノマーとから得られる架橋体である前記［１］〜［６］のいずれか１項に記載の磁性微粒子。
［８］ 重合性モノマーが、メタクリル酸グリシジルおよびポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレートであり、架橋性モノマーが、ポリエチレングリコールジアクリレートである前記［７］項に記載の磁性微粒子。
［９］ 自家蛍光を発しない前記［１］〜［８］のいずれか１項に記載の磁性微粒子。
［１０］ 前記［１］〜［９］のいずれか１項に記載の磁性微粒子と、目的物質に対する親和性物質とからなる吸着材。
［１１］ 目的物質に対する親和性物質が、アビジン、プロテインＡまたは抗体である前記［１０］項に記載の吸着材。
［１２］ 少なくとも下記の工程（１）および（２）を有する前記［１０］項または前記［１１］項に記載の吸着材を用いた目的物質の分離方法。
（１）目的物質を含む水溶液と吸着材との混合液を調製し、目的物質と吸着材の結合体を生成させる工程
（２）工程（１）で得られた混合液から磁力により結合体を分離する工程
［１３］ さらに下記の工程（３）を含む前記［１２］項に記載の方法。
（３）工程（２）で分離した結合体から目的物質を溶出する工程
［１４］ 前記［１２］項または前記［１３］項に記載の方法を用いる汚水処理方法。
［１５］ 汚水からクリプトスポリジウムおよびジアルジアを分離する前記［１４］項に記載の汚水処理方法。
［１６］ 少なくとも下記の工程を含む磁性微粒子の製造方法。
（１）磁性体およびアルキル基を有する化合物を含む集合体を形成する工程
（２）工程（１）で形成された集合体の表面に、重合性モノマーと架橋性モノマーとを混合し、重合と架橋とを行うことで、親水性基を有するゲル層を形成する工程
【発明の効果】
【００１０】
本発明の磁性微粒子は、磁性体およびアルキル基を有する化合物を含む集合体を被覆するゲル層を含むことから反応性に優れ、生理活性タンパク質、アミノ酸、ペプチド、糖および糖鎖を容易に固定化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動の結果を示す図である。
【図２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動の結果を示す図である。
【図３】ＩｇＧの回収率と時間との関係を示す図である。
【図４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動の結果を示す図である。
【図５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動の結果を示す図である。
【図６】ゲル層を持つ磁性微粒子の模式図である。
【図７】蛍光顕微鏡により観察した結果を示す図である。
【図８】ＦＩＴＣラベル微粒子とストレプトアビジン微粒子混合液からのストレプトアビジン微粒子の分離を示す模式図である。
【図９】顕微鏡により観察した結果を示す図である。
【図１０】蛍光顕微鏡により観察した結果を示す図である。
【図１１】蛍光顕微鏡により観察した結果を示す図である。
【図１２】顕微鏡により観察した結果を示す図である。
【図１３】水道水濃縮液および河川水濃縮液からの磁気分離の結果を示す図である。
【図１４】蛍光顕微鏡により観察した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の一実施形態について説明する。
【００１３】
[磁性微粒子]
本発明の磁性微粒子は、磁性体およびアルキル基を有する化合物を含む集合体と、該集合体を被覆し且つ親水性基を有するゲル層とを備えた磁性微粒子である。
【００１４】
本発明の磁性微粒子は、０．９ｎｍ以上１００００ｎｍ未満の平均粒子径であることが好ましい。この範囲とすることで、良好な分散性が得られる。さらに、磁性微粒子の平均粒子径が、２００ｎｍ以上５０００ｎｍ未満であると、目的物質の分離効率、精製効率及び利便性が高くなるため、より好ましい。磁性微粒子の平均粒子径は、例えば、レーザーゼータ電位計（大塚電子株式会社製ＥＬＳ−８０００（商品名））を用いて測定することにより算出できる。
【００１５】
本発明の磁性微粒子は、自家蛍光を発しないことが好ましい。自家蛍光を発しないことで、蛍光標識した物質と区別し易いという利点がある。
【００１６】
本発明の磁性微粒子は、その形状に特に制限はなく、例えば、球状、針状および板状など各種の形状が利用できる。後述する目的物質に対する親和性物質（以下、「リガンド」ともいう。）を固定化した磁性微粒子（吸着材）から目的物質を分離する際に、捕集性と分散性のバランスがよく、操作性に優れる点から、球状、楕円体状または粒状の形状が好ましい。
【００１７】
[磁性体およびアルキル基を有する化合物を含む集合体]
本発明で用いられる集合体は、磁性体およびアルキル基を有する化合物を含む。
【００１８】
[磁性体]
本明細書における「磁性体」とは、磁気応答性（磁界に対する感応性）を有する粒子を指し、磁性微粒子とした場合に磁気応答性を付与し得るものであればよい。ここで、「磁気応答性を有する」とは、外部磁界が存在するとき、磁界により磁化する、または磁石に吸着するなど、磁界に対して感応性を示すことを指す。
【００１９】
磁性体としては、上記磁気応答性を示す従来公知の磁性体であれば特に制限はなく利用できる。当該磁性体としては、例えば、マグネタイト、ゲーサイト、酸化ニッケル、フェライト、コバルト鉄酸化物、バリウムフェライト、炭素鋼、タングステン鋼、ＫＳ鋼、希土類コバルト磁石およびヘマタイトの微粒子が挙げられる。
【００２０】
磁性体は、例えば、多価アルコールとマグネタイトとから従来公知の方法により製造することができる。例えば、特開２００５−０８２５３８号公報に、デキストランを用いた磁性微粒子の製造方法が開示されている。
【００２１】
磁性体は、その形状に特に制限はなく、例えば、球状、楕円体状、粒状、板状、針状および立方体状などの多面体状が挙げられる。好適な形状に実現されやすい点から、球状、楕円体状および粒状が好ましい。
【００２２】
ここで、「球状」とは、アスペクト比（あらゆる方向で測定した場合の最大長さと最小長さとの比）が１．０以上１．２以下の範囲内である形状を指す。「楕円体状」とは、アスペクト比が１．２を超えて１．５以下の範囲内である形状を指す。「粒状」とは、球状のように粒子の長さが全方向で揃っているもの、および楕円体状のように一方向の長さのみ大きいもの以外の、方向による長さの差異はあるが全体として形状に特に異方性がない形状を指す。
【００２３】
磁性体の大きさに特に制限はないが、磁気分離を可能とすることから、平均粒子径が０．００５〜１μｍであることが好ましく、０．２〜０．５μｍであることがより好ましい。この平均粒子径は、例えば、レーザーゼータ電位計（大塚電子株式会社製ＥＬＳ−８０００（商品名））を用いて測定することにより算出できる。
【００２４】
[アルキル基を有する化合物]
アルキル基を有する化合物は、アルキル基を有し、ベンゼン環を有さない化合物である。アルキル基を有する化合物は、鉄イオンと結合または相互作用が可能な化合物であることが好ましく、鉄イオンと結合が可能であることがより好ましい。アルキル基を有する化合物中のアルキル基の炭素数は、４〜２４が好ましく、アルキル基の炭素数が増えるにしたがって、疎水性が強くなる傾向にあることから、炭素数は、１０〜２０がより好ましい。
【００２５】
アルキル基を有する化合物としては、例えば、脂肪酸、アルコール、シリコーンおよびフルオロアルキルが好ましく、脂肪酸及びアルコールがより好ましく、特に脂肪酸が好ましい。また、鉄イオンとしては、鉄（ＩＩ）イオン（Ｆｅ２＋）および鉄（ＩＩＩ）イオン（Ｆｅ３＋）が挙げられる。
【００２６】
脂肪酸としては、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸が利用できる。飽和脂肪酸としては、例えば、酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルチミン酸、ヘプタデシル酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸およびリグノセリン酸が挙げられる。また、不飽和脂肪酸としては、例えば、パルミトレイン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノール酸、（９，１２，１５）−リノレン酸、（６，９，１２）−リノレン酸、１０−メチルオクタデカン酸、アラキドン酸が挙げられる。中でも、疎水性場を形成するという観点と、メタノールに溶けやすい点から、オレイン酸、ミリスチン酸およびステアリン酸が好ましい。
【００２７】
アルコールとしては、１分子中に水酸基を少なくとも１個有するアルコールであれば特に限定されない。アルコールとしては、例えば、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、カプリルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコールおよびリノリルアルコールが挙げられる。中でも、アルコールを構成するアルキルの炭素数が多くなるほど親水性が弱まる傾向、言い換えると、疎水性が強くなる傾向にあり、疎水性場を形成するという観点から、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコールおよびオレイルアルコールが好ましい。
【００２８】
[ゲル層]
本発明の磁性微粒子において、ゲル層は、磁性体およびアルキル基を有する化合物を含む集合体上に形成され、該集合体を被覆する。ここで、「被覆」とは、集合体の外側を覆い、得られる磁性微粒子の最外殻にゲル層が形成される状態を指す。ゲル層は、集合体の外側を完全に覆っている状態が好ましいが、ゲル層と集合体とが分離しなければ、不完全に覆っている状態でもよい。
【００２９】
ゲル層は、親水性基を有しており、ゲル層の表面および内部に親水性基を有することが好ましい。ゲル層の持つ親水性基に、リガンドを結合させるためには、ゲル層の表面に親水性基を有することがより好ましい。本発明の磁性微粒子は、磁性微粒子の表面がゲル層で形成されているため、フレキシビリティーを有している。そのため、目的物質と磁性微粒子に固定化されたリガンドとの反応効率が良好になるという利点を有する。
【００３０】
ここで、「フレキシビリティー」とは、柔軟性、融通性のことを意味する。具体的には、「フレキシビリティーを有する」とは、材料表面に依存する立体障害を受けない状態にすることであり、リガンドと、目的物質の一種である生理活性タンパク質との相互作用（結合定数）を阻害しないことを示す。また、フレキシビリティーは、得られたゲル層中の、架橋性モノマーの含有率に依存し、重合性モノマーとの質量比が、０．０１質量％以上１質量％未満が好ましく、０．１質量％以上０．８質量％以下がより好ましい。
【００３１】
[親水性基]
親水性基としては、例えば、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、アミノ基およびチオール基が挙げられる。磁性微粒子に調製した後に、親水性基を他の官能基に変換する観点およびリガンドのアミノ基、カルボキシル基およびチオール基との結合の観点から、エポキシ基およびカルボキシル基が好ましい。
【００３２】
ゲル層は、重合性モノマーと、架橋性モノマーとから得られる架橋体である。ゲル層には、架橋性モノマーで架橋されていない重合性モノマーからなる重合体などが含まれていてもよい。ゲル層は、予め重合性モノマーからなる重合体を製造し、これを架橋性モノマーによって架橋させることで製造してもよく、重合性モノマーと架橋性モノマーとを混合し、重合と架橋とを同時に行うことで、製造してもよい。
【００３３】
本発明では、重合性モノマーと架橋性モノマーとを混合し、重合と架橋とを同時に行うことで、製造することが好ましい。本発明では、該架橋体がゲル層であり、水等が含まれた状態だけでなく、乾燥した状態も含む。
【００３４】
重合性モノマーとしては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、アクリルアミド、メタクリルアミド、ヒドロキシメタクリルアミド、メタクリル酸グリシジル、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート、メタクリル酸２−ヒドロキシエチルおよびＮ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド・塩酸塩が挙げられる。中でも、親水場を有し、調製後のその他官能基への変換やリガンドとの結合の観点から、メタクリル酸グリシジルとポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレートとの共重合体が好ましい。
【００３５】
架橋性モノマーとしては、例えば、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、エチレングリコールジメタクリレートおよびポリエチレングリコールジアクリレートが挙げられる。中でも、ゲル層を形成するという観点から、ポリエチレングリコールジアクリレートが好ましい。
【００３６】
予め重合性モノマーからなる重合体を製造し、これを架橋性モノマーによって架橋させることで、ゲル層を製造する場合、重合性モノマーからなる重合体としては、少なくとも２種の重合性モノマーが共重合してなる共重合体を用いることが好ましい。２種類の重合性モノマーを用いて共重合体を製造する場合、２種類の重合性モノマーは、適宜選択すればよい。
【００３７】
例えば、１種類目の重合性モノマーとして、アクリル酸、メタクリル酸、アクリルアミド、メタクリルアミド、ヒドロキシメタクリルアミド、メタクリル酸グリシジルまたはＮ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド・塩酸塩を用い、２種類目の重合性モノマーとして、メタクリル酸２−ヒドロキシエチルまたはポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレートを用い、これらを組み合わせて用いることが好ましい。この場合、重合性モノマーの混合物全体の質量に対して、２種類目の重合性モノマーの含有量は、１〜１０質量％が好ましく、１〜５質量％がより好ましい。この範囲とすることで、分散性の高い微粒子が得られる。
【００３８】
得られた重合性モノマーからなる重合体を、架橋性モノマーで架橋することで、架橋体を製造することができる。架橋性モノマーの混合量は、重合性モノマーからなる重合体と架橋性モノマーとの混合物に対して、０．０１〜１質量％が好ましく、０．０２〜０．４質量％がより好ましい。この範囲とすることで、微粒子の架橋密度による含水率を向上させることができ、微粒子へのリガンドの固定化量を向上させることができる。
【００３９】
重合性モノマーと架橋性モノマーとを混合し、重合と架橋とを同時に行うことで、ゲル層を製造する場合、少なくとも２種の重合性モノマーと、架橋性モノマーを混合し、製造することが好ましい。２種類の重合性モノマーを用いる場合、２種類の重合性モノマーは、適宜選択すればよい。
【００４０】
例えば、１種類目の重合性モノマーとして、アクリル酸、メタクリル酸、アクリルアミド、メタクリルアミド、ヒドロキシメタクリルアミド、メタクリル酸グリシジルまたはＮ‐（３‐アミノプロピル）メタクリルアミド・塩酸塩を用い、２種類目の重合性モノマーとして、メタクリル酸２−ヒドロキシエチルまたはポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレートを用い、架橋性モノマーとしては、例えば、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、エチレングリコールジメタクリレートまたはポリエチレングリコールジアクリレートを用い、これらを組み合わせて用いることが好ましい。
【００４１】
それぞれのモノマーの使用割合は、重合性モノマーと架橋性モノマーとの混合物に対して、１種類目の重合性モノマーは、８９．２〜９８．９９質量％が好ましく、２種類目の重合性モノマーは、１〜１０質量％が好ましく、架橋性モノマーは、０．０１〜０．８質量％が好ましい。
【００４２】
重合性モノマーの重合のために用いる重合開始剤としては、例えば、２，２−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−Ａｚｏｂｉｓ（２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｉｎｅ）ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、過酸化ベンゾイルおよびＤｉｍｅｔｈｙｌ ２，２’−ａｚｏｂｉｓ（２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）が挙げられる。
【００４３】
本発明の磁性微粒子において、磁性体およびアルキル基を有する化合物を含む集合体を被覆するゲル層の厚みは、用いる重合性モノマーまたは架橋性モノマーの種類、該集合体の厚みによって適宜選択すればよく、特に制限されるものではない。
【００４４】
[磁性微粒子の製造方法]
本発明の磁性微粒子は、少なくとも下記の工程を含む製造方法により得られる。
１）磁性体およびアルキル基を有する化合物を含む集合体を形成する工程
２）工程１）で形成された集合体の表面に、重合性モノマーと架橋性モノマーとから架橋体を製造することで、親水性基を有するゲル層を形成する工程
工程２）において、重合性モノマーは、少なくとも２種であることが好ましく、得られる重合体も、共重合体であることが好ましい。また、ゲル層は、重合性モノマーに親水性基が含まれることから、形成されたゲル層は、親水性基を有することになり、ゲル層の表面に親水性基が存在する。
【００４５】
本発明の製造方法による各条件は、用いる磁性体、アルキル基を有する化合物、重合性モノマー、架橋性モノマーの種類によって適宜選択でき、特に限定されるものではない。
【００４６】
以下、具体例として、磁性体としてマグネタイト粒子を用い、アルキル基を有する化合物としてオレイン酸ナトリウムを用い、重合性モノマーとして、メタクリル酸グリシジル、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート（数平均分子量２０８０）を用い、架橋性モノマーとして、ポリエチレングリコールジアクリレート（数平均分子量５７５）を用い、重合開始剤として２，２’−アゾビスイソブチロニトリルを用いる場合について説明する。
【００４７】
１）磁性体およびアルキル基を有する化合物を含む集合体を形成する工程
この工程は、磁性体とアルキル基を有する化合物とを結合させ、集合体を形成する工程である。まず、常温（２０℃）でマグネタイトを分散媒中に分散させる。分散媒に添加するマグネタイトの量は特に制限はないが、均一な分散液が得られやすいことから、２〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度となるように添加することが好ましい。
【００４８】
分散媒としては、例えば、水、並びに水に緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ（ＨＥＰＥＳ：２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＭＥＳ（ＭＥＳ：２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）、リン酸、トリス、および酢酸各種緩衝液）、塩類（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、酢酸ナトリウムおよび硫酸マグネシウム）、界面活性剤類（例えば、トリトンＸ−１００およびＮＰ−４０）およびアルコール類（例えば、エタノール、メタノールおよびイソプロパノール）を適宜組み合わせた水溶液が挙げられる。
【００４９】
次に、マグネタイトの分散液に、オレイン酸ナトリウムを添加する。マグネタイトの分散液に対するオレイン酸ナトリウムの添加量は、１〜３０質量％が好ましく、３〜５質量％がより好ましい。
【００５０】
続いて、マグネタイトとオレイン酸ナトリウムの混合液を還流条件下で加熱し、マグネタイトとオレイン酸ナトリウムとを結合させて、マグネタイトおよびオレイン酸ナトリウムを含む集合体を得る。混合液の加熱条件は、還流条件下で、７０〜８０℃で、６〜１２時間反応させることが好ましい。
【００５１】
さらに、マグネタイトおよびオレイン酸ナトリウムを含む集合体を含有する混合液を遠心分離して余剰なオレイン酸ナトリウムを除去し、再度分散媒に分散させ、不純物を除いて、マグネタイトおよびオレイン酸ナトリウムを含む集合体とする。
【００５２】
２）工程１）で形成されたマグネタイトおよびオレイン酸ナトリウムを含む集合体を被覆するように、重合性モノマーと架橋性モノマーとを混合し、重合と架橋とを同時に行うことで架橋体を形成する工程
この工程は、工程１）で形成された集合体を被覆するようにゲル層を形成する工程である。まず、工程１）で得られたマグネタイトおよびオレイン酸ナトリウムを含む集合体を分散媒に分散させた分散液に、重合性モノマーであるメタクリル酸グリシジルおよびポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート（数平均分子量２０８０）と、架橋性モノマーであるポリエチレングリコールジアクリレート（数平均分子量５７５）を添加する。
【００５３】
それぞれのモノマーの使用割合は、メタクリル酸グリシジルを好ましくは８９．２〜９８．９９質量％、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート（数平均分子量２０８０）を好ましくは１〜１０質量％、ポリエチレングリコールジアクリレート（数平均分子量５７５）を好ましくは０．０１〜０．８質量％の濃度で添加することが好ましい。
【００５４】
マグネタイトおよびオレイン酸ナトリウムを含む集合体、並びに重合性モノマーと架橋性モノマーの混合液に、重合開始剤である２，２−アゾビスイソブチロニトリルを添加する。２，２−アゾビスイソブチロニトリルの添加量は、混合液に対し、０．０５〜０．５質量％の濃度となるよう添加することが好ましい。
【００５５】
重合開始剤を添加した後、加熱してメタクリル酸グリシジルおよびポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート（数平均分子量２０８０）を共重合させ、同時に生成する共重合体をポリエチレングリコールジアクリレート（数平均分子量５７５）で架橋させる。加熱条件は、７０〜８０℃にて６〜１２時間とすることが好ましい。
【００５６】
その後、室温に戻した後、磁気分離により有機溶媒で洗浄し、表面にゲル層を有する磁性微粒子が得られる。得られた磁性微粒子から有機溶媒を磁気分離により除去し、水に置換し、室温にて２４〜４８時間回転混合することによりゲル層を膨潤させ、乾燥する。
【００５７】
乾燥条件は、好ましくは６０〜７０℃にて３〜６時間、減圧乾燥する。乾燥後の磁性微粒子の含水率は、５０〜９０質量％であることが好ましく、７０〜８５質量％であることが好ましい。この範囲とすることで、磁性微粒子の分散性が高くなるからである。
【００５８】
上述した手順により、マグネタイトおよびオレイン酸ナトリウム複合体を含む集合体と、該集合体を被覆する、メタクリル酸グリシジル、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレートおよびポリエチレングリコールジアクリレートの架橋体よりなり、その表面にエポキシ基を有するゲル層とを備える本発明の磁性微粒子を製造することができる。
【００５９】
[吸着材]
本発明の磁性微粒子は、リガンドを固定化することにより、目的物質を特異的に吸着できる吸着材とすることができる。
目的物質は特に限定されないが、例えば、生理活性タンパク質、アミノ酸、ペプチド、糖および糖鎖が挙げられる。
【００６０】
生理活性タンパク質とは、哺乳動物、特にヒトの生理活性タンパク質と実質的に同じ生物学的活性を有するものであり、天然由来のもの、および遺伝子組換え法により得られるものが含まれる。遺伝子組換え法によって得られるタンパク質には天然タンパク質とアミノ酸配列が同じであるもの、または該アミノ酸配列の１若しくは複数を欠失、置換、または付加したもので前記生物学的活性を有するものが含まれる。
【００６１】
生理活性タンパク質としては、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、成長ホルモン、インシュリンおよびプロラクチン等のタンパク質ホルモン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、エリスロポエチン(ＥＰＯ)およびトロンボポエチン等の造血因子、インターフェロン、ＩＬ−１およびＩＬ−６等のサイトカイン、組織プラスミノーゲン活性化因子(ｔＰＡ)、ウロキナーゼ、血清アルブミン、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、レプチン、幹細胞成長因子(ＳＣＦ)、インスリン並びに副甲状腺ホルモンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
目的物質には、タグ融合タンパク質が含まれる。タグ融合タンパク質とは、遺伝子工学技術などを利用して人為的に導入した標識を持つタンパク質である。タグ融合タンパク質は、例えば、目的のタンパク質分子の一部に、特定のアミノ酸配列を持つペプチド鎖、または酵素活性および／若しくは特定の物質に対する結合能を持つタンパク質を標識として導入することで、作製することができる。目的のタンパク質に当該標識を導入することで、該タンパク質の分離や検出が容易になる。
【００６３】
タグ融合タンパク質のタグとしては、例えば、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）、ＧＳＴタグ、ＨＡタグ、Ｃ−Ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、ＨＳＶタグ、チオレドキシンタグ、アルカリフォスファターゼタグおよびリン酸化タンパク質タグが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
アミノ酸としては、特に限定はされないが、例えば、システインおよびメチオニンが挙げられる。また、ペプチドとしては、特に限定はされないが、例えば、インスリンおよびグルタチオンが挙げられる。
【００６５】
リガンドとしては、例えば、ビオチン、アビジン、グルタチオン、レクチン、抗体、Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノジ酢酸、プロテインＡおよびプロテインＧが挙げられる。ここで、ビオチンはイミノビオチンであってもよく、アビジンはストレプトアビジンであってもよい。
【００６６】
リガンドがビオチンの場合は、アビジンとの特異的な結合を介してビオチン化された目的タンパク質と、またビオチン化された抗体を用いてそれらの抗原である種々のタンパク質と更に結合することが可能である。本発明の吸着材には、市販されているアビジン化タンパク質およびビオチン化タンパク質が利用でき、ビオチン化は、当技術分野で周知の方法に従えばよい。
【００６７】
リガンドがグルタチオンの場合は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下、「ＧＳＴ」という。）を含有するタンパク質と特異的に結合できる。このようなＧＳＴ含有タンパク質の調製は当技術分野で周知の方法に従えばよい。
【００６８】
リガンドとしてプロテインＡまたはプロテインＧを用いる場合は、目的物質としては、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が好ましい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体としては、ＩｇＧが好ましい。なお、ヒトＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のサブクラスがあり、マウスＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３のサブクラスがある。本発明では、これらを使用することがより好ましい。
【００６９】
目的物質が糖鎖を有する生理活性タンパク質である場合、糖鎖の由来としては、特に制限はないが、哺乳動物細胞に付加される糖鎖が好ましい。該哺乳動物細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ細胞）、アフリカミドリザル腎臓由細胞（ＣＯＳ細胞）およびヒト由来の細胞が挙げられる。
【００７０】
目的物質がモノクローナル抗体である場合には、モノクローナル抗体はいかなる方法で製造されたものでもよい。モノクローナル抗体は、基本的には公知技術を使用し、抗原に感作させた免疫細胞を通常の細胞融合法によってミエローマ細胞と融合させて作成したハイブリドーマから生産することができる。
【００７１】
また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体に限られるものではなく、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変されたキメラ抗体を含む。さらに、トランスジェニック動物（ある特定の遺伝子を個体レベルで付加した遺伝子操作動物のこと。）およびファージディスプレイ等によって作製されたヒト抗体も好ましい。
【００７２】
リガンドは、磁性微粒子のゲル層に固定する。本発明の磁性微粒子とリガンドとの結合の例として、国際公開第０１／００９１４１号に記載されているように、ビオチンを、メタクリルやアクリル等の重合性官能基と結合させて付加重合性モノマーとし、他のモノマーと共重合することにより、本発明の磁性微粒子におけるゲル層にビオチンを結合させた吸着材が得られる。
【００７３】
一方、リガンドとしての抗体にアビジンを結合させ、前記吸着材と混合することにより、アビジンとビオチンの結合を利用して、前記吸着材に抗体を結合させることができる。
なお、ビオチンの代わりにグルタチオンを用いた場合は、アビジンではなく、グルタチオンＳトランスフェラーゼを用いればよい。
【００７４】
また、磁性微粒子のゲル層の形成時に親水性基を持つモノマーを他のモノマーと共重合させ、当技術分野で周知の方法に従い、親水性基を介して、抗体親和性物質（例えば、メロンゲル、プロテインＡおよびプロテインＧ）をゲル層上に結合させて吸着材を得ることができる。抗体親和性物質にリガンドとしての抗体を結合させることにより、吸着材に抗体を結合させることができる。
【００７５】
また、本発明の吸着材は、微生物に対する抗体を固定することにより、汚水からの微生物除去に用いることができる。汚水中の微生物としては、例えば、クリプトスポリジウム、ジアルジア、大腸菌、サルモネラ菌，レジオネラ菌およびピロリ菌が挙げられる。
【００７６】
[目的物質の分離方法]
本発明の吸着材を用いて、少なくとも下記の工程を含む方法により目的物質を分離することができる。
（１）目的物質を含む水溶液と吸着材との混合液を調製し、目的物質と吸着材の結合体を生成させる工程
（２）工程（１）で得られた混合液から磁力により結合体を分離する工程
（３）工程（２）で分離した結合体から目的物質を溶出する工程
【００７７】
以下、各工程について説明する。
（１）目的物質を含む水溶液と吸着材との混合液を調製し、目的物質と吸着材の結合体を生成させる工程
この工程は、目的物質を含む試料とリガンドを固定化した磁性微粒子（吸着材）とを混合し、該リガンドと目的物質との親和性を利用して、目的物質を吸着材に結合させる工程である。
【００７８】
混合操作は、適当なバッファー中で目的物質と吸着材が接触し得るならば、制限はない。例えば、目的物質を含む試料および吸着材が供されたチューブを軽く転倒攪拌または振とうさせる程度で十分であり、例えば市販のボルテックスミキサー等を用いて混合する操作が挙げられる。
【００７９】
目的物質を含む試料としては、例えば、生理活性タンパク質を含むＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞の培養培地およびこれに部分的精製などの一定の処理を施したもの、血清、血漿、腹水、リンパ液および尿が挙げられる。
【００８０】
本発明の目的物質の分離方法によれば、目的物質が生理活性タンパク質である場合、生理活性タンパク質を好ましくは１０−１８〜１０−２ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは１０−５〜１０−２ｍｏｌ／ｌという高濃度で含む試料から、磁性微粒子を用いて生理活性タンパク質を精製することができる。生理活性タンパク質の濃度は、例えば、ブラッドフォード法、ＢＣＡ法、２８０ｎｍの吸光度の測定および電気泳動により、測定することができる。なお、吸着材と混合する生理活性タンパク質を含む試料の容量は、１ｍｌ以上が好ましく、１５ｍｌ以上がより好ましい。また、５０ｌ以下が好ましく、１０ｌ以下がより好ましい。
【００８１】
また、目的物質が生理活性タンパク質である場合、工程（１）に供する生理活性タンパク質を含む試料は前処理していない試料であることが好ましい。生理活性タンパク質を含む試料の前処理としては、例えば、カラム法によりタンパク質を精製する際に必要である前処理が挙げられる。該前処理としては、例えば、細胞の分離、硫安沈殿、カプリル酸沈殿、硫酸デキストラン沈殿、ポリビニルピロリドン沈殿、活性炭によるフェノールレッド除去、並びに脱塩およびバッファー交換（例えば、ゲル濾過、透析および限外ろ過）が挙げられる。細胞を分離する方法としては、例えば、遠心分離、ろ過および限外ろ過が挙げられる。
【００８２】
本発明の目的物質の分離方法によれば、生理活性タンパク質を含む試料の前処理を経なくてもよいため、生理活性タンパク質の精製に要する時間を短縮することができる。前処理に要する時間は、生理活性タンパク質の種類および量等により異なるが、通常、１５〜３０時間である。例えば、遠心分離により夾雑物である細胞を分離する場合、通常約３０分〜１時間の所用時間である。また、生理活性タンパク質を含む試料が血清の場合、硫安沈殿および脱塩をする必要があるが、例えば、血清の量が１５〜１０００ｍｌの場合、その所要時間は、通常約３０分から１時間である。また、生理活性タンパク質を含む試料が培養上清の場合、フェノールレッド除去を必要に応じてする必要があるが、培養上清が１５〜１０００ｍｌの場合その所要時間は、通常約１時間である。
【００８３】
（２）工程（１）で得られた混合液から磁力により結合体を分離する工程
この工程は、工程（１）で得られた混合液から、目的物質の結合した吸着材を磁力により分離する工程である。具体的には、例えば、目的物質と吸着材との結合を適当なチューブ内で行った場合、チューブの側壁に磁石を外側から近づけることによって吸着材をチューブの側壁近傍に保持しつつ、チューブ内から上澄み部分となる液体を排出することによって、目的物質が結合した吸着材を分離することができる。
【００８４】
磁性微粒子の分離に用いる磁石等の磁力は、用いる磁性微粒子の有する磁力の大きさによって異なる。磁力は、目的の磁性微粒子を磁集可能な程度の磁力を適宜使用できる。磁石の素材としては、例えば、上述した磁性微粒子の素材で構成されたものを使用することができる。例えば、ネオジム磁石（株式会社二六製作所製）等が利用できる。ネオジム磁石の磁力は、３８００ガウス以上がより好ましい。
【００８５】
（３）工程（２）で分離した結合体から目的物質を溶出する工程
この工程は、工程（２）で磁性分離により分離した、目的物質と吸着材の結合体から、目的物質を溶出して回収する工程である。目的物質の特性に従い、当該技術分野で周知の方法によって結合体から目的物質を分離する。
【００８６】
具体的には、例えば、結合体を入れたチューブ内に適当な溶出液を加えることによって、目的物質を結合体から溶出させる。そして、溶出後、チューブの側壁に磁石を外側から近づけて磁性微粒子をチューブの側壁近傍に保持しつつ、チューブ内から上澄み部分となる液体を採取することによって、吸着材に結合していた目的物質を回収することができる。
【００８７】
目的物質を溶出させる溶出液としては、目的物質とリガンドとの親和性を低下させる効果がある液体が好ましい。当該液体としては、例えば、塩酸、イミダゾール、グルタチオンおよびビオチンを含むバッファーが挙げられる。バッファーとしては、例えば、リン酸カリウムバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、トリス塩酸塩バッファー、１，４−ピペラジンジエタンスルフォン酸バッファー（以下、「ＰＩＰＥＳバッファー」という。）、ホウ酸バッファーおよびグリシン塩酸バッファーが挙げられる。
【００８８】
尚、目的物質と吸着材の結合体から目的物質を溶出させる前に結合体を洗浄し、夾雑物を除去してもよい。具体的な洗浄方法としては、例えば、０．５質量％のＴｗｅｅｎ２０（ユニヒェマ ヒェミー ベスローテン フエンノートシャップ社の登録商標：Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ）を含むリン酸ナトリウムバッファー中に目的物質と吸着材の結合体を加え、再分散を繰り返すことで、疎水性相互作用で結合や巻き込みにより結合体中に取り込まれていた夾雑物を取り除く方法が挙げられる。
【００８９】
上記工程（１）〜（３）を経ることによって、目的物質を含む試料から目的物質を精製することができる。
【００９０】
また、本発明の吸着材を用いれば、少なくとも上記工程（１）および（２）を経ることによって、汚水処理することができる。
【実施例】
【００９１】
以下、本発明を実施例および比較例により説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
磁気分離とは、磁性微粒子等を磁石等の磁力によって、液体から収集することをいう。
なお、磁気分離には、株式会社二六製作所製ネオジム磁石を使用した。
精製水とは、ミリポア社製純水製造装置「Ｄｉｒｅｃｔ−ＱＴＭ」によって精製された導電率１８ＭΩｃｍの水であり、ＭｉｌｌＱ水と呼ばれることもある。
【００９２】
実施例１
＜表面にゲル層を持つ磁性微粒子の製造方法＞
２００ｍｌ容のフラスコに、塩化第二鉄・六水和物（１．０ｍｏｌ）及び塩化第一鉄・四水和物（０．５ｍｏｌ）混合水溶液を１００ｍｌ入れ、メカニカルスターラー（ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＨＩＧＨＴ ＰＯＷＥＲ ＭＩＸＥＲ、ＡＳＯＮＥ社製）で攪拌し、この混合溶液を５０℃に昇温した後、２８質量％アンモニア水溶液５．０ｍｌを滴下し、１時間程度攪拌した。この操作で、平均粒子径が約５ｎｍのマグネタイトが得られた。得られたマグネタイトを精製水で３回洗浄し、乾燥した後メタノールにて２０ｍｇ／ｍｌに調製した。マグネタイト分散液１００ｍｌに対し、オレイン酸ナトリウム３ｇを加え８０℃で１２時間還流操作を行った。遠心分離（１００００ｇ、３０分、２５℃）して過剰なオレイン酸ナトリウムを除き、再びメタノールに分散し２０ｍｇ／ｍｌに調製し、マグネタイト−オレイン酸ナトリウム複合体のメタノール溶液を得た。
【００９３】
マグネタイト−オレイン酸ナトリウム複合体（磁性微粒子）のメタノール溶液１００ｍｌにメタクリル酸グリシジル２５ｇ、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート（数平均分子量２０８０）１ｇおよびポリエチレングリコールジアクリレート（数平均分子量５７５）０．１ｇを加え、室温で２時間攪拌した後、２，２’−アゾビスイソブチロニトリルを０．２５ｇ加え、７０℃に加熱し６時間反応させた。得られた反応混合物を室温に戻した後、磁気分離（ネオジム磁石、株式会社二六製作所製）し、メタノールで２回洗浄することで、表面にゲル層を持つ磁性微粒子のメタノール分散液を得た。前記磁性微粒子のメタノール分散液から、磁気分離（ネオジム磁石、株式会社二六製作所製）によりメタノールを除き、精製水に置換し一晩回転混合によりゲル層を膨潤させた。その後、１ｍｌの分散液を分取し、磁気分離を行い上清を除き、水を含有する磁性微粒子の質量を測定し、乾燥（６０℃、６時間、恒温・乾燥器 ＤＫＮ４０２、ヤマト科学社製）させた後、乾燥後の磁性微粒子の質量を測定した。その結果、ゲル層を有する磁性微粒子の含水率は８３質量％であった。
【００９４】
得られた磁性微粒子の平均粒子径をレーザーゼータ電位計（大塚電子株式会社製ＥＬＳ−８０００（商品名））により測定したところ、５２５ｎｍであった。
【００９５】
実施例２
＜ストレプトアビジン固定化磁性微粒子によるビオチン化抗体の分離＞
（ストレプトアビジン固定化磁性微粒子の調製）
実施例１と同様に調製したゲル層を持つ磁性微粒子１ｍｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）を磁気分離し上清を除いた。そこへ精製水１ｍｌを添加し、磁性微粒子を再分散させた。再び磁気分離後、上清を除き、そこへ２５ｍＭ ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ４．７５）１ｍｌを加えて再分散させた。ストレプトアビジン（１０ｍｇ／ｍｌ）を２５μｌ添加し、３時間回転混合した。磁気分離を行い、上清を除いた後１ｍｌの１００ｍＭ ＴＢＳ（ＴＢＳ：Ｔｒｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）を加えて１時間反応させた。磁気分離の後、上清を除去し、１ｍｌの１００ｍＭ ＰＢＳ（ＰＢＳ：Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．５、０．０１質量％のＢＳＡを含む）を加え、磁性微粒子を再分散させた。同様の操作をもう一度行い、ストレプトアビジン固定化磁性微粒子を得た。
【００９６】
（ストレプトアビジン固定化磁性微粒子によるビオチン化抗体の分離）
ストレプトアビジン固定化磁性微粒子１００μｌに対してビオチン化ＩｇＧ（ＲＯＣＫＬＡＮＤ社製、Ａｎｔｉ−ＩｇＧ（Ｆｃ）、Ｒａｂｂｉｔ、Ｇｏａｔ−Ｐｏｌｙ、Ｂｉｏｔｉｎ）１０μｇを添加し５分間回転混合した。その後１５μｌを分取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の略。）による電気泳動のＴｏｔａｌサンプルとした。２分間磁気分離し、上清から１５μｌを分取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動の上清（ｓｕｐ）サンプルとした。上清を除去し、１ｍｌの１００ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．５、０．０１質量％のＢＳＡを含む）を加え、磁性微粒子を再分散させた。同様の操作をもう一度行い、上清を除去後１５μｌの１００ｍＭ ＰＢＳを添加し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動の残渣（ｐｐｔ）サンプルとした。
【００９７】
１５μｌの各サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動で分析した結果を図１に示す。図１に示したように、Ｔｏｔａｌサンプルに存在するＩｇＧに由来するバンドがｓｕｐサンプルでは消失し、磁性微粒子側（ｐｐｔサンプル）に結合していることがわかった。
この結果から、本発明によるストレプトアビジン固定化磁性微粒子により、効率的にビオチン化ＩｇＧを回収できることがわかった。
【００９８】
実施例３
＜プロテインＡ固定化磁性微粒子による抗体の精製＞
（プロテインＡ固定化磁性微粒子の調製）
実施例１と同様に調製したゲル層を持つ磁性微粒子１ｍｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）を磁気分離し、上清を除いた。そこへ精製水１ｍｌを添加し、磁性微粒子を再分散させた。再び磁気分離後、上清を除き、そこへ１ｍｌの２５ｍＭ ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒを加え再分散した。２５μｌのプロテインＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、３時間回転混合した。磁気分離を行い、上清を除いた後、１ｍｌの１００ｍＭ ＴＢＳ（ｐＨ７．５）を加えて１時間反応させた。磁気分離の後、上清を除去し、１ｍｌの１００ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．５）を加え、磁性微粒子を再分散させた。同様の操作をもう一度行い、プロテインＡ固定化磁性微粒子を得た。
【００９９】
（プロテインＡ固定化磁性微粒子を用いたウサギおよびヒト血清からのＩｇＧの分離）
プロテインＡ固定化磁性微粒子１００μｌに対してウサギおよびヒト血清１０μｌを添加し５分間、ＭＴＲ−１０３（ＡＳ ＯＮＥ社製）によって回転混合させた。上清を除去し、１ｍｌの１００ｍＭ ＰＢＳを加えて再分散させた。再び磁気分離操作を行い、上清を除去し再分散させた。磁気分離の後、上清を除去し、９０μｌの１００ｍＭ グリシン塩酸バッファー（ｐＨ３．０）加え３分間振とう混合することでＩｇＧを溶出させた（１回目）。磁気分離の後、上清を分離し、分離した上清に対して１０μｌの１０×ＰＢＳを添加し、溶出サンプル１とした。
【０１００】
再び９０μｌの１００ｍＭ グリシン塩酸バッファー（ｐＨ３．０）加え、３分間振とう混合して、ＩｇＧを溶出させた（２回目）。分離した上清に対して１０μｌの１０×ＰＢＳを添加し、溶出サンプル１とした。磁気分離の後、上清を分離し、上清に対して１０μｌの１０×ＰＢＳを添加し、溶出サンプル２とした。
【０１０１】
１５μｌの各サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動で分析した結果を図２に示す。図２に示すように、本発明によるプロテインＡ固定化磁性微粒子を用いて、ウサギ血清およびヒト血清のいずれからでもＩｇＧを分離・溶出できることがわかった。
【０１０２】
実施例４
＜プロテインＡ固定化磁性微粒子及びプロテインＧ固定化磁性微粒子と従来製品との比較＞
（ＩｇＧの分離）
実施例３と同様に、プロテインＡ固定化磁性微粒子及びプロテインＧ固定化磁性微粒子を調製した。２００μｇのＩｇＧ Ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｒａｂｂｉｔ（ＲＯＣＫＬＡＮＤ社製）を含む１００μｌの１００ｍＭ ＰＢＳに、各３ｍｇのプロテインＡ固定化磁性微粒子及びプロテインＧ固定化磁性微粒子を添加し２５℃で１５分間、ＭＴＲ−１０３（ＡＳ ＯＮＥ社製）によって回転混合させた。２分間磁気分離の後、上清を除去して２００μｌの１００ｍＭ ＰＢＳ−Ｔ（０．０５質量％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液）を加え、磁性微粒子を再分散させた。再び磁気分離操作を行い、上清を除去し再分散させた。さらに２回洗浄操作を行い、上清を除去した。４５μｌの１００ｍＭ グリシン塩酸バッファー（ｐＨ２．７）を加え、ピペットにより混合した。ボルテックスを５分間行い、磁気分離の後に上清を回収した。さらに再度抽出操作を行い、得られた２回分の上清を混合し、８μｌの１Ｎ ＮａＯＨを加え中和した。中和した各上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動を行った。
【０１０３】
電気泳動の結果はＣＳ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＴＴＯ社製）により解析した。なお、検量線は、ＩｇＧ Ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｒａｂｂｉｔを用いて作成した。また、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＡおよびＧ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）についても同様の操作を行った。
【０１０４】
電気泳動の結果、プロテインＡ固定化磁性微粒子は、１５８．４μｇのＩｇＧを分離し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＡは、３６．８μｇのＩｇＧを分離した。また、プロテインＧ固定化磁性微粒子は、９７．４μｇのＩｇＧを分離し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＧは、２７．３μｇのＩｇＧを分離した。
【０１０５】
上記の結果から、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＧを用いた場合に対して、本発明によるプロテインＡ固定化磁性微粒子では、最大４．３倍、プロテインＧ固定化磁性微粒子では、３．６倍のＩｇＧを分離できることが分かった。
【０１０６】
（希薄溶液からのＩｇＧの分離）
プロテインＡ固定化磁性微粒子を実施例３と同様に調製した。１ｍｇのプロテインＡ固定化磁性微粒子を５０μｇのＩｇＧ Ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏf Ａｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｒａｂｂｉｔ（ＲＯＣＫＬＡＮＤ社製）を含む５０ｍｌの希薄溶液に添加し３０分間回転混合させた。磁気分離の後、上清を除去し１ｍｌの１００ｍＭ ＰＢＳを加えて磁性微粒子を再分散させた。再び磁気分離操作を行い、上清を除去し、磁性微粒子を再分散させた。磁気分離の後、上清を除去し、磁性微粒子をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動で分析した。
【０１０７】
電気泳動の結果をＣＳ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＴＴＯ社製）により解析した。なお、検量線の作成はＩｇＧ Ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｒａｂｂｉｔを用いて行った。また、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＡ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）についても同様の操作を行った。
【０１０８】
その結果、プロテインＡ固定化磁性微粒子により２５μｇのＩｇＧが分離できた。一方、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＡにより６μｇのＩｇＧが分離できた。この結果から、本発明によるプロテインＡ固定化磁性微粒子はＤｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＡと比較して、希薄溶液から約４倍のＩｇＧを分離できることがわかった。
【０１０９】
（磁性微粒子とＩｇＧの反応速度の比較）
プロテインＡ固定化磁性微粒子を実施例３と同様に調製した。１０ｍｇのプロテインＡ固定化磁性微粒子を２５μｇのＩｇＧ Ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｒａｂｂｉｔ（ＲＯＣＫＬＡＮＤ社）を含む５００μｌのＰＢＳ溶液に添加し、０．５、１、５、１０、２０、３０分の反応の後に磁気分離を行い、上清を１５μｌ分取し、電気泳動を行った。
【０１１０】
電気泳動の結果は、ＣＳ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＴＴＯ社製）により解析した。また、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＡ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）についても同様の操作を行った。プロテインＧ固定化磁性微粒子についても同様に比較を行った。その結果を図３に示す。
【０１１１】
図３の上図に示すように、プロテインＡ固定化磁性微粒子は、約０．５分でほぼ１００％のＩｇＧを分離した。一方、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＡは、３０分で８５％のＩｇＧを分離した。また、図３の下図に示すように、プロテインＧ固定化微粒子は、０．５分でほぼ１００％のＩｇＧを分離した。一方、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＧは、３０分で２７％のＩｇＧを分離した。これらの結果から、本発明によるプロテインＡ固定化磁性微粒子およびプロテインＧ固定化磁性微粒子は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＡおよびＤｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＧと比較して、ＩｇＧとの反応速度が速いことがわかった。
【０１１２】
実施例５
＜ハイブリドーマ培養上清５０ｍｌからのプロテインＡ固定化磁性微粒子によるＩｇＧ２ａの分離＞
（処理１）
５０ｍｌのハイブリドーマ培養上清を３００ｍｌ容積の三角フラスコに分注し、１０質量％ Ｔｗｅｅｎ２０を２５０μｌ加えた（最終濃度：０．０５質量％）。そこへ、実施例３と同様に調製した４ｍｌのプロテインＡ固定化磁性微粒子(１０ｍｇ／ｍｌ)を加え、室温で１時間、泡立たぬ程度に振とう機（９０回／分、ＭＳ−１ Ｍｉｎｉｓｈａｋｅｒ、ＩＫＡ社製）によりインキュベートした。
【０１１３】
（処理２）
５０ｍｌ遠心チューブ２本に均等に移し、磁気分離を室温にて１０分間行った。上清を三角フラスコに戻し、再度４ｍｌのプロテインＡ固定化磁性微粒子を加え、１時間同様にインキュベートした。
【０１１４】
（洗浄操作）
処理１で磁気分離した磁性微粒子に３ｍｌのＰＢＳ−Ｔ（Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むＰＢＳ）を加え、十分に分散させた後、２ｍｌのマイクロチューブに２本に移した。空になった遠心チューブに再度１ｍｌのＰＢＳ−Ｔを加え、壁面を洗い、上記の２ｍｌマイクロチューブへ０．５ｍｌのＰＢＳ−Ｔを加えた。磁気分離装置（マグナスタント−８、マグナビート株式会社製）にセットし、氷水中で５〜１０分間静置し磁気分離した。上清を除去し、再びＰＢＳ−Ｔを添加して磁性微粒子を分散させ、５〜１０分間磁気分離を行い、上清を除去した。洗浄操作を再び行い、上清を除去した。
【０１１５】
（抽出操作）
各チューブに４５０μｌの１００ｍＭ グリシン塩酸バッファー(ｐＨ２．７)加え、十分に混合させた。マクロチューブをフロートへ指し、氷水中に装着し、ソニケーター（Ｓ３０Ｈ Ｅｌｍａｓｏｎｉｃ、Ｅｌｍａ社製）に浮かべ、超音波洗浄を行った。超音波洗浄は、１０秒間行った後、１０秒間休止し、これを洗浄操作のサイクルとし、これを５分間繰り返した。磁気分離操作の後、上清を分離し、新しいマイクロチューブに移し、８０μｌの１Ｍ ＮａＯＨを加え中和し、精製ＩｇＧ２ａを得た。抽出操作をさらにもう一度行った。再度（処理２）プロテインＡ固定化磁性微粒子を加え分離操作を行ったものは、同様に洗浄・抽出操作を行った。
【０１１６】
１５μｌの各サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動で分析した結果を図４に示す。
【０１１７】
図４に示すように、上清の洗浄液には、ＩｇＧに由来するバンドはなく溶出液にのみＩｇＧに由来するバンドが見られた。この結果から、本発明による磁性微粒子を用いた操作により、ＩｇＧを特異的に精製することができることがわかった。また、回収率は９３％であり、所要時間は約４時間であった。
【０１１８】
実施例６
＜ＡＢ−ＮＴＡ固定化磁性微粒子によるＨｉｓ−プロテインＡの回収＞（ＡＢ−ＮＴＡの固定化）
実施例１と同様に調製したゲル層を持つ磁性微粒子１０ｍｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）を磁気分離し上清を除いた。そこへ１０ｍｌの精製水を添加し、磁性微粒子を再分散させた。再び磁気分離後、上清を除き、そこへ１０ｍｌの１００ｍＭ ホウ酸バッファー（ｐＨ８．５）を加えて磁性微粒子を再分散させた。１００ｍｇのＡＢ−ＮＴＡ ｆｒｅｅ ａｃｉｄ（ＤＯＪＩＤＯ社製）を添加し、１２時間回転混合した。磁気分離の後、上清を除去し、１０ｍｌの精製水を加えて磁性微粒子を再分散させた。同様の操作をさらに３回行い、ＡＢ−ＮＴＡ固定化磁性微粒子を得た。
【０１１９】
（ニッケルとの複合体の形成）
１０ｍｌのＡＢ−ＮＴＡ固定化磁性微粒子を磁気分離の後、上清を除去し、１０ｍｌの１Ｍ濃度硫酸ニッケル溶液に懸濁し、６時間撹拌した。その後、磁気分離を行い、上清を除去し、１０ｍｌの精製水を加えて磁性微粒子を再分散させた。同様の操作をさらに３回行い、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）中に再懸濁しＮｉ−ＮＴＡ磁性微粒子を保存した。
【０１２０】
（Ｈｉｓ−プロテインＡの回収）
Ｈｉｓ−ｔａｇをＮ−末端に有するＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ−ＰｒｏｔｅｉｎＡ（フナコシ社製）１００μｇを含む１０μｌのＧｏａｔ血清に、１ｍｇのＮｉ−ＮＴＡ磁性微粒子を添加した。５分間の反応の後、上清を除去した。そこへＴｗｅｅｎ２０を０.１質量％含むＰＢＳを１ｍｌ添加して、Ｎｉ−ＮＴＡ磁性微粒子を再分散させた。同様にＴｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＰＢＳ１ｍｌで５回洗浄操作を行った。磁気分離の後、上清を除去し、５０μｌの５００ｍＭ イミダゾールＰＢＳ溶液を添加して溶出操作を行った。１５μｌの上清を分取しＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動で分析した結果を図５に示す。
【０１２１】
図５に示すように、溶出液にＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ−ＰｒｏｔｅｉｎＡに由来するバンドがみられた。この結果から、本発明によるＮｉ−ＮＴＡ磁性微粒子により、Ｈｉｓタグを有するタンパク質を特異的に分離できることがわかった。
【０１２２】
実施例７
＜自家蛍光の有無の評価＞
実施例１と同様に調製したゲル層を持つ磁性微粒子を、蛍光顕微鏡（アーク光源全反射蛍光顕微鏡システム ＩＸ７１−ＡＲＣＥＶＡ、オリンパス社製)を用いて、明視野および暗視野により観察した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ aｎｔｉ−Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ（ベリタス社製）についても同様に観察した。その結果を図７に示す。
【０１２３】
図７に示すように、Ｄｙｎａｂｅａｄｓは暗視野において自家蛍光が観察されるのに対して、ゲル層を有する磁性微粒子には自家蛍光は観察されなかった。この結果から、本発明による磁性微粒子は自家蛍光を発しないことがわかった。
【０１２４】
実施例８
＜抗ストレプトアビジン抗体固定化磁性微粒子による、ＦＩＴＣラベル微粒子とストレプトアビジン微粒子の混合液からのストレプトアビジン微粒子の分離＞
（抗ストレプトアビジン抗体の磁性微粒子への固定化）
実施例１と同様に調製したゲル層を持つ磁性微粒子１ｍｌ（２０ｍｇ／ｍl）を磁気分離し、上清を除いた。そこへ精製水１ｍｌを添加し、再分散した。再び磁気分離後、上清を除き、そこへ２５ｍＭ ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ＭＥＳ：２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ、ｐＨ４．７５）１ｍｌを加え再分散した。抗ストレプトアビジン抗体(１０ｍｇ／ｍＬ、Ａｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、Ｒａｂｂｉｔ、ＲＯＣＫＬＡＮＤ社製)を２５μｌ添加し、３時間回転混合した。その後、磁気分離を行い、上清を除いた後、１ｍｌの１００ｍＭ ＴＢＳを加え１時間反応させた。磁気分離の後、上清を除去し、１ｍｌの１００ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．５、０．０１質量％のＢＳＡを含む)を加え、再分散を行った。同様の操作をもう一度行い、抗ストレプトアビジン抗体固定化磁性微粒子を得た。
【０１２５】
（ＦＩＴＣラベル微粒子とストレプトアビジン微粒子混合液からのストレプトアビジン微粒子の分離（図８））
ＦＩＴＣラベル微粒子（Ｍｉｃｒｏ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｅｌａｍｉｎｅ ｒｅｓｉｎ、ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ、ＦＩＴＣ−ｍａｒｋｅｄ、Ｆｌｕｋａ社製、１０μｍ、２．５質量％）（以下、「ＦＩＴＣ微粒子」ともいう）とストレプトアビジン微粒子（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、６．０μｍ、ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、１．３６質量％）とを１：１０（容量比）で混合した混合液１００μｌに対して、５０μｌの抗ストレプトアビジン抗体固定化磁性微粒子を添加し、１５分間回転混合した。その後、磁気分離を行い、上清を除去後１ｍｌのＰＢＳに磁性微粒子を再分散させた。再び磁気分離を行い、上清を除去後、１ｍｌのＰＢＳに磁性微粒子を再分散させた。同様の操作をさらに２回行った。その後、蛍光顕微鏡および顕微鏡（ＩＸ７１、オリンパス社製）により観察した。図９に顕微鏡による観察結果を示す。図９に示すように、本発明による磁性微粒子により磁気分離する前のＦＩＴＣ微粒子は総数の約２０％であったが、磁気分離後は約１.４％になった。
【０１２６】
（磁性微粒子に対するＦＩＴＣ微粒子の非特異的吸着の確認）
実施例１と同様に調製したゲル層を持つ磁性微粒子５０μｌを１００μｌのＦＩＴＣ微粒子に添加し、１５分間回転混合した。その後、磁気分離を行い、上清を除去後、１ｍｌのＰＢＳに磁性微粒子を再分散させた。再び磁気分離を行い、上清を除去後、１ｍｌのＰＢＳに磁性微粒子を再分散した。同様の操作をさらに２回行った。その後、蛍光顕微鏡により観察した。その結果を図１０に示す。図１０に示すように、本発明の磁性微粒子による非特異的な吸着はほぼないことがわかった。
【０１２７】
これらの結果から、目的物質に対する特異的な抗体を本発明の磁性微粒子に固定化することで、目的物質を特異的に分離することができることがわかった。
【０１２８】
実施例９
＜微粒子分離における市販の磁性微粒子との比較＞
市販の磁性微粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｃａｒｂｏｙｌｉｃ ａｃｉｄ、ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）（以下、「ゲル層がない磁性微粒子」ともいう）と、実施例８に調製したゲル層を有する抗ストレプトアビジン抗体固定化磁性微粒子とを比較した。実施例８と同様の方法で、ＦＩＴＣ微粒子およびストレプトアビジン微粒子の混合液に磁性微粒子を添加した後に磁気分離操作を行い、１回目の磁気分離後の上清側を上清（ｓｕｐ）サンプルとし、磁性微粒子側を残渣（ｐｐｔ）サンプルとした。蛍光顕微鏡により観察した結果を図１１に示す。
【０１２９】
図１１に示すように、ゲル層がない磁性微粒子では効率的に分離することができなかったが、ゲル層を有する抗ストレプトアビジン抗体固定化磁性微粒子ではＳｕｐ側にはほぼＦＩＴＣ微粒子が、ｐｐｔ側にはストレプトアビジン微粒子が分離され効率的に微粒子が分離されているのがわかった。
【０１３０】
また、各５μｌのゲル層がない磁性微粒子およびゲル層を有する磁性微粒子を５μｌのストレプトアビジン微粒子を混合した混合液を顕微鏡で観察した。その結果を図１２に示す。
【０１３１】
図１２に示すように、ゲル層を有する抗ストレプトアビジン抗体固定化磁性微粒子とストレプトアビジン微粒子が共存する場合は、ストレプトアビジン微粒子の判別が容易であった。一方、ゲル層がない磁性微粒子とストレプトアビジン微粒子が共存する場合は、ストレプトアビジン微粒子の判別が困難であった。
【０１３２】
これらの結果から、本発明のゲル層を有する磁性微粒子は、市販のゲル層のない磁性微粒子と比較して、より特異的に目的物質を分離することができることがわかった。
【０１３３】
実施例１０
＜水道水濃縮液および河川水濃縮液からの磁気分離＞
各１ｍｌの水道水濃縮液（１０ｌの水道水を１０ｍｌに濃縮した。）および河川水濃縮液［１０ｌの河川水（採取場所：千葉県養老川、試験時期：２００８年９月〜１０月）］を１０ｍｌに濃縮した。）を２ｍｌのバイアルに分注し、実施例１と同様に調製したゲル層を有する磁性微粒子１００μｌを添加した。その後、磁気分離のために、ネオジム磁石（ＮＥ００１Φ８×３、丸型、株式会社二水製作所製）をバイアルの側面にあて、１分間静置した。その磁気分離挙動を確認した。その結果を図１３に示す。
【０１３４】
図１３に示すように、本発明によるゲル層を有する磁性微粒子によれば、水道水濃縮液および河川水濃縮液のいずれにおいても巻き込みがほとんどなく磁気分離できることがわかった。
【０１３５】
実施例１１
＜ジアルジアおよびクリプトスポリジウムの分離＞
実施例１０と同様に調製した河川水濃縮液１ｍｌに不活化したジアルジアとクリプトスポリジウムとを各１００個添加した懸濁液を調製した。懸濁液１ｍｌに対して、１０μｌのビオチン化クリプトスポリジウム抗体（Ａ４００ＢＩＯＴ−Ｒ−２０Ｘ：Ｃｒｙｐｔ−ａ−Ｇｌｏ、Ｗａｔｅｒｂｏｒｎｅ社製）２０μｌを添加し３０分間回転混合し反応させた。その後、実施例２と同様に調製したストレプトアビジン固定化磁性微粒子５０μｌを添加し、１５分振倒混合し反応させた。２分間磁気分離を行い、上清を回収し、上清（ｓｕｐ）サンプルとした。分離した磁性微粒子に１ｍｌのＰＢＳを加えて、磁性微粒子を再分散させた。再び磁気分離を行い上清を除去した。２００μｌのＰＢＳを添加し、磁性微粒子を再分散させて、残渣（ｐｐｔ）サンプルとした。Ｓｕｐおよびｐｐｔサンプルを、ＥａｓｙＳｔａｉｎＴＭ（和光純薬工業）を用いて染色を行い、蛍光顕微鏡で観察した。その結果を図１４に示す。
【０１３６】
図１４に示すように、ｓｕｐ側にはジアルジアのみが、ｐｐｔ側にはクリプトスポリジウムのみが観察できた。また、本発明の磁性微粒子は、微粒子組成にスチレンを含まないため自家蛍光がなく、磁性微粒子からの分離操作なしに蛍光測定ができた。これらの結果から、本発明による磁性微粒子によれば、公定法で用いられている磁性微粒子でも困難であった河川水からでもクリプトスポリジウムを分離できることがわかった。
【０１３７】
実施例１２
＜架橋性モノマーの影響＞
（プロテインＡ固定化磁性微粒子の調製）
表１に示すように、マグネタイト−オレイン酸ナトリウム複合体（磁性微粒子）のメタノール溶液１００ｍｌに、メタクリル酸グリシジル、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート（数平均分子量２０８０）、ポリエチレングリコールジアクリレート（数平均分子量５７５）、２，２’−アゾビスイソブチロニトリルを表１の配合量で仕込み、実施例１と同様に処理し、表面にゲル層を持つ磁性微粒子を調製した。得られたゲル層を持つ磁性微粒子を実施例３と同様に処理し、プロテインＡ固定化磁性微粒子を調製した。
【０１３８】
【表１】
【０１３９】
得られたプロテインＡ固定化磁性微粒子の粒径、含水率、エポキシ基濃度およびプロテインＡの固定化量を測定した。その結果を、表２に示す。
【０１４０】
【表２】
【０１４１】
表２に示すように、ほぼ同等のエポキシ基を有しているにかかわらず、プロテインＡの固定化量は、架橋性モノマーの量が少ない磁性微粒子（Ｎｏ．１〜３）の方が、架橋性モノマーの量が多い磁性微粒子（Ｎｏ．４および５）と比較して多かった。これは、架橋密度による含水率がプロテインＡの固定化に大きく影響していると考えられる。
【０１４２】
（ＩｇＧの分離）
実施例４と同様にして、プロテインＡ固定化磁性微粒子によりＩｇＧを磁気分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によりＩｇＧ回収量を調べた。その結果を表３に示す。なお、表３において、ＩｇＧ回収量（ｍｇ／ｍｇ）は、プロテインＡ固定化磁性微粒子１ｍｇ当りの回収されたＩｇＧの量を示す。
【０１４３】
【表３】
【０１４４】
表３に示すように、プロテインＡ固定化磁性微粒子によるＩｇＧの回収量は、プロテインＡの固定化量に依存していることがわかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性体およびアルキル基を有する化合物を含む集合体と、該集合体を被覆するゲル層とを備える磁性微粒子であって、該ゲル層に親水性基を有する磁性微粒子。
【請求項２】
平均粒子径が、０．９ｎｍ以上１００００ｎｍ未満である請求項１に記載の磁性微粒子。
【請求項３】
アルキル基を有する化合物が、ベンゼン環を有さない化合物であって、鉄イオンと結合可能である請求項１または請求項２に記載の磁性微粒子。
【請求項４】
アルキル基を有する化合物が、脂肪酸である請求項３に記載の磁性微粒子。
【請求項５】
脂肪酸が、オレイン酸である請求項４に記載の磁性微粒子。
【請求項６】
親水性基が、エポキシ基である請求項１〜５のいずれか１項に記載の磁性微粒子。
【請求項７】
ゲル層が、重合性モノマーと、架橋性モノマーとから得られる架橋体である請求項１〜６のいずれか１項に記載の磁性微粒子。
【請求項８】
重合性モノマーが、メタクリル酸グリシジルおよびポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレートであり、架橋性モノマーが、ポリエチレングリコールジアクリレートである請求項７に記載の磁性微粒子。
【請求項９】
自家蛍光を発しない請求項１〜８のいずれか１項に記載の磁性微粒子。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の磁性微粒子と、目的物質に対する親和性物質とからなる吸着材。
【請求項１１】
目的物質に対する親和性物質が、アビジン、プロテインＡまたは抗体である請求項１０に記載の吸着材。
【請求項１２】
少なくとも下記の工程（１）および（２）を有する請求項１０または請求項１１に記載の吸着材を用いた目的物質の分離方法。
（１）目的物質を含む水溶液と吸着材との混合液を調製し、目的物質と吸着材の結合体を生成させる工程
（２）工程（１）で得られた混合液から磁力により結合体を分離する工程
【請求項１３】
さらに下記の工程（３）を含む請求項１２に記載の方法。
（３）工程（２）で分離した結合体から目的物質を溶出する工程
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の方法を用いる汚水処理方法。
【請求項１５】
汚水からクリプトスポリジウムおよびジアルジアを分離する請求項１４に記載の汚水処理方法。
【請求項１６】
少なくとも下記の工程を含む磁性微粒子の製造方法。
（１）磁性体およびアルキル基を有する化合物を含む集合体を形成する工程
（２）工程（１）で形成された集合体の表面に、重合性モノマーと架橋性モノマーとを混合し、重合と架橋とを行うことで、親水性基を有するゲル層を形成する工程。
【請求項１】
磁性体およびアルキル基を有する化合物を含む集合体と、該集合体を被覆するゲル層とを備える磁性微粒子であって、該ゲル層に親水性基を有する磁性微粒子。
【請求項２】
平均粒子径が、０．９ｎｍ以上１００００ｎｍ未満である請求項１に記載の磁性微粒子。
【請求項３】
アルキル基を有する化合物が、ベンゼン環を有さない化合物であって、鉄イオンと結合可能である請求項１または請求項２に記載の磁性微粒子。
【請求項４】
アルキル基を有する化合物が、脂肪酸である請求項３に記載の磁性微粒子。
【請求項５】
脂肪酸が、オレイン酸である請求項４に記載の磁性微粒子。
【請求項６】
親水性基が、エポキシ基である請求項１〜５のいずれか１項に記載の磁性微粒子。
【請求項７】
ゲル層が、重合性モノマーと、架橋性モノマーとから得られる架橋体である請求項１〜６のいずれか１項に記載の磁性微粒子。
【請求項８】
重合性モノマーが、メタクリル酸グリシジルおよびポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレートであり、架橋性モノマーが、ポリエチレングリコールジアクリレートである請求項７に記載の磁性微粒子。
【請求項９】
自家蛍光を発しない請求項１〜８のいずれか１項に記載の磁性微粒子。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の磁性微粒子と、目的物質に対する親和性物質とからなる吸着材。
【請求項１１】
目的物質に対する親和性物質が、アビジン、プロテインＡまたは抗体である請求項１０に記載の吸着材。
【請求項１２】
少なくとも下記の工程（１）および（２）を有する請求項１０または請求項１１に記載の吸着材を用いた目的物質の分離方法。
（１）目的物質を含む水溶液と吸着材との混合液を調製し、目的物質と吸着材の結合体を生成させる工程
（２）工程（１）で得られた混合液から磁力により結合体を分離する工程
【請求項１３】
さらに下記の工程（３）を含む請求項１２に記載の方法。
（３）工程（２）で分離した結合体から目的物質を溶出する工程
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の方法を用いる汚水処理方法。
【請求項１５】
汚水からクリプトスポリジウムおよびジアルジアを分離する請求項１４に記載の汚水処理方法。
【請求項１６】
少なくとも下記の工程を含む磁性微粒子の製造方法。
（１）磁性体およびアルキル基を有する化合物を含む集合体を形成する工程
（２）工程（１）で形成された集合体の表面に、重合性モノマーと架橋性モノマーとを混合し、重合と架橋とを行うことで、親水性基を有するゲル層を形成する工程。
【図６】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１１−１４２３０１（Ｐ２０１１−１４２３０１Ａ）
【公開日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２３０７３５（Ｐ２０１０−２３０７３５）
【出願日】平成２２年１０月１３日（２０１０．１０．１３）
【出願人】（３１１００２０６７）ＪＮＣ株式会社 (208)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月１３日（２０１０．１０．１３）
【出願人】（３１１００２０６７）ＪＮＣ株式会社 (208)
【Ｆターム（参考）】
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