神経変性障害を治療するための方法、核酸構築物および細胞
神経変性障害を治癒する方法が提供される。その方法は神経伝達物質の外因的に調節可能な合成が可能であり、それにより神経変性障害を治療することができる細胞を、その必要性のある個体に投与することによって実施される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経伝達物質の制御が可能な合成を行うことができるニューロン様細胞、および、パーキンソン病などの神経変性障害を治療するために細胞を使用する細胞置換治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病は、震せん、固縮および運動失調などの症状を介して現れる運動機能の進行性消失がやがてはもたらされる中脳の黒質におけるドーパミン産生ニューロンの進行性消失によって特徴づけられる加齢に関連した障害である。パーキンソン病は、薬理学的用量のドーパミン前駆体Ｌ−ＤＯＰＡを投与することによって治療することができる（Ｍａｒｓｄｅｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、９：５１２、１９８６；Ｖｉｎｋｅｎ他、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、１８５頁、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｒｓｔｅｒｄａｍ、１９８６）。そのような治療は初期段階のパーキンソン病患者では効果的であるが、黒質細胞の進行性消失は、最終的には、残存細胞が、投与された前駆体から十分なドーパミンを合成することができないこと、および、薬効の低下をもたらす。
【０００３】
神経変性疾患の研究では、病気に苦しむ人々において生じる症状は、局所的な神経回路における不具合に対して二次的であり、全身的な薬物送達を用いて効果的に治療することができないことが示唆される。その結果、神経変性疾患を治療するための代わりの方法、例えば、損傷したニューロンの機能を置換または補充することができる細胞の移植などの方法が出現している。そのような細胞置換治療が機能するためには、移植された細胞が、損傷した組織の中で生存し、かつ、機能的および構造的にその両方で一体化しなければならない。
【０００４】
パーキンソン病は、大脳内細胞置換治療がヒトにおいて使用された脳の最初の疾患である。いくつかの試みが、副腎髄質細胞を患者の脳に同種移植することによって、神経伝達物質のドーパミンをパーキンソン病患者の病変した脳幹神経節に提供するために行われている（Ｂａｃｋｌｕｎｄ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．、６２：１６９〜１７３、１９８５；Ｍａｄｒａｚｏ他、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３１６：８３１〜８３６、１９８７）。黒質（これは、ドーパミンを含有する細胞体が多い脳の領域であり、また、パーキンソン病において最も冒される脳の領域でもある）由来の胎児脳細胞などの他のドナー細胞の移植は、選択的なドーパミン作動性神経毒によって誘導される行動的欠損を逆行させることにおいて部分的に効果的であることが示されている（Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ他、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、４５７：５３〜８１、１９８６；Ｄｕｎｎｅｔｔ他、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｕｅｒｏｓｃｉ．、６：２６６〜２７０、１９８３）。
【０００５】
異なる供給源に由来する様々な非ニューロン細胞タイプを利用したいくつかの細胞置換研究もまたこの数年間にわたって行われている。パーキンソン病の動物モデルにおいて、研究者は、単球、骨髄幹細胞、筋芽細胞、繊維芽細胞、星状膠細胞およびセルトリ細胞などの細胞を移植している（Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ他、２０００；Ｈｗａｎ−Ｗｕｎ他、１９９９；Ｌｉｎｄｅｒ他、１９９５；Ｐａｔｒｉｄｇｅ＆Ｄａｖｉｅｓ、１９９５；Ｐｅｒｒｙ＆Ｇｏｒｄｏｎ、１９９８；Ｙａｄｉｄ他、１９９９）。他の研究では、細胞が、生存率を高めるために増殖因子遺伝子（例えば、グリア由来増殖因子および脳由来増殖因子）で遺伝子操作された後で移植され、あるいは、チロシンヒドロキシラーゼ、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼまたはＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ（これらは、形質転換された細胞におけるドーパミン合成を増大させることができる）などの遺伝子で遺伝子操作された後で移植された（Ｃｈｏｉ−Ｌｕｎｄｂｅｒｇ他、１９９８；Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ他、１９９５；Ｓｃｈｗａｒｚ他、１９９９）。しかしながら、これらの細胞は、損傷したニューロン細胞の構造的および機能的な特徴を完全に獲得することができず、従って、治療的に効果的でないことが判明した（Ｂｒｕｎｄｉｎ他、２０００）。
【０００６】
パーキンソン病患者のための臨床的細胞置換試験が、ドーパミン作動性ニューロンを１〜２％のみ含む胎児細胞を使用して行われている（Ｆｒｅｅｄ他、１９９２；Ｆｒｅｅｄ他、２００１；Ｆｒｅｅｍａｎ他、１９９５；Ｋｏｒｄｏｗｅｒ他、１９９５；Ｋｏｒｄｏｗｅｒ他、１９９８；Ｌｉｎｄｖａｌｌ Ｏ．、１９９１；Ｗｅｎｎｉｎｇ他、１９９７）。Ｆｒｅｅｄ他（２００１）は、パーキンソン病患者に対する胎児細胞の移植が若い患者（６０歳未満）に対してのみ有益であったことを見出した。さらに、幾人かの患者は、移植された細胞によるドーパミンの過度かつ制御されない産生および放出のために、レボドパ治療がない場合、重篤なジスキネジー（「遁走（ｒｕｎａｗａｙ）ジスキネジー」）に悩まされた（Ｆｒｅｅｄ他、２００１；Ｏｌａｎｏｗ他、２００３）。また、ヒト胎児組織の入手性が低いことにより、胎児細胞の移植から利益を受け得る患者の数が実質的に制限されている。
【０００７】
成人骨髄間質細胞（ＢＭＳｃ）は非造血系の細胞であり、様々なニューロンマーカー（Ａｚｉｚｉ他、１９９８；Ｄｅｎｇ他、２００１；Ｋｏｐｅｎ他、１９９９；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓ他、２０００；Ｓｃｈｗａｒｚ他、１９９９；Ｗｏｏｄｂｕｒｙ他、２０００）、電気生理学的機能（Ｋｏｈｙａｍａ他、２００１）、および、チロシンヒドロキシラーゼのインビボ発現（Ｓｃｈｗａｒｚ他、１９９９）を示すニューロン様細胞に分化することができる。そのうえ、パーキンソン病のマウスモデルおよびラットモデルにおけるＢＭＳｃの移植は有益な効果をもたらした（Ｌｉ他、２００１；Ｓｃｈｗａｒｚ他、１９９９）。
【０００８】
成人ＢＭＳｃは、移植に構造的に適合し得るニューロン様細胞に分化することができるが、生着したＢＭＳｃはドーパミンなどの神経伝達物質を制御不能に放出するかもしれず、このことは、「遁走遁走ジスキネジー」などの重篤な副作用をやがて引き起こす可能性があり、従って、ＢＭＳｃの使用を神経変性障害の治療のために不適にしている。
【０００９】
従って、損傷したニューロン組織への一体化が可能であり、また、ドーパミンなどの神経伝達物質を制御可能に合成することがさらに可能であり、従って、神経変性障害を効果的かつ安全に治療するために利用することができるニューロン様細胞が必要であることが広く認識されており、そのようなニューロン様細胞を有することは非常に好都合であると考えられる。
【発明の開示】
【００１０】
本発明の１つの態様によれば、神経伝達物質の外因的に調節可能な合成が可能であり、それにより神経変性障害を治療することができる細胞を、その必要性のある個体に投与することを含む、神経変性障害を治療する方法が提供される。
【００１１】
本発明の別の態様によれば、（ａ）神経伝達物質の外因的に調節可能な合成が可能である細胞を、その必要性のある個体に投与する工程、および（ｂ）細胞における神経伝達物質の合成を調節することができる作用物または条件に個体を定期的にさらし、それにより神経変性障害を治療する工程を含む、神経変性障害を治療する方法が提供される。
【００１２】
本発明のさらに別の態様によれば、神経伝達物質の合成に関係する酵素をコードするポリヌクレオチド配列を、哺乳動物細胞におけるその酵素の発現を調節することができる調節配列の制御下に配置されて含む核酸構築物が提供される。
【００１３】
本発明のなお別の態様によれば、神経伝達物質の合成に関係する酵素をコードする第１のポリヌクレオチド配列を第１の調節配列の転写制御下に配置されて含む第１の発現構築物と、トランス活性化因子をコードする第２のポリヌクレオチド配列を第２の調節配列の転写制御下に配置されて含む第２の発現構築物とを含む構築物システムが提供され、この場合、トランス活性化因子は、第１の調節配列を活性化して、第１のポリヌクレオチド配列の転写を行わせることができる。
【００１４】
本発明のさらなる態様によれば、神経伝達物質の合成に関係する酵素をコードするポリヌクレオチド配列を、細胞におけるその酵素の発現を調節することができる調節配列の制御下に配置されて含む核酸構築物を含む細胞が提供される。
【００１５】
本発明のさらにさらなる態様によれば、神経伝達物質の合成に関係する酵素をコードする第１のポリヌクレオチド配列を第１の調節配列の転写制御下に配置されて含む第１の発現構築物と、トランス活性化因子をコードする第２のポリヌクレオチド配列を第２の調節配列の転写制御下に配置されて含む第２の発現構築物とを含む構築物システムを含む細胞が提供される。この場合、トランス活性化因子は、第１の調節配列を活性化して、第１のポリヌクレオチド配列の転写を行わせることができる。
【００１６】
本発明のなおさらなる態様によれば、神経変性障害を治療する際に使用される細胞を作製する方法が提供される。この方法は、（ｉ）骨髄細胞を単離する工程、（ｉｉ）骨髄細胞を維持および／または拡大することができる増殖用培地において骨髄細胞をインキュベーションする工程、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から得られる細胞から骨髄間質細胞を選択する工程、および（ｉｖ）少なくとも１つの多不飽和脂肪酸および少なくとも１つの分化用作用物を含む分化用培地において骨髄間質細胞をインキュベーションし、それにより、神経変性障害を治療する際に使用される細胞を作製する工程を含む。
【００１７】
本発明のさらにさらなる態様によれば、神経伝達物質を合成することができる骨髄由来間質細胞を含む細胞集団が提供される。
【００１８】
本発明のなおさらなる態様によれば、少なくとも２つのタイプの神経伝達物質を合成することができる骨髄由来間質細胞を含む混合細胞集団が提供される。
【００１９】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、神経変性障害を治療する方法は、細胞における神経伝達物質の合成を調節することができる作用物または条件に個体をさらすことをさらに含む。
【００２０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞は、神経伝達物質の外因的に調節可能な合成が可能であるように遺伝子改変される。
【００２１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞は、神経伝達物質の合成に関係する酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現構築物で形質転換される。この場合、発現構築物は、ポリヌクレオチドの発現が前記作用物により制御可能であるように設計される。
【００２２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、作用物は、神経伝達物質の合成に関係する酵素の発現をダウンレギュレーションすることができる。
【００２３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、作用物は、神経伝達物質の合成に関係する酵素の発現をアップレギュレーションすることができる。
【００２４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞は、第１の調節配列の転写制御下に配置された、神経伝達物質の合成に関係する酵素をコードする第１のポリヌクレオチド配列と、第２の調節配列の転写制御下に配置された、トランス活性化因子をコードする第２のポリヌクレオチド配列とを含む少なくとも１つの発現構築物で形質転換される。この場合、トランス活性化因子は、前記作用物の非存在下で、第１の調節配列を活性化して、第１のポリヌクレオチド配列の転写を行わせることができる。
【００２５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、作用物はドキシサイクリンである。
【００２６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、トランス活性化因子はテトラサイクリン制御のトランス活性化因子である。
【００２７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、第１の調節配列はテトラサイクリン応答エレメントを含む。
【００２８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、酵素は、チロシンヒドロキシラーゼ、ＤＯＰＡデカルボキシラーゼ、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ、ドーパミンβ−ヒドロキシラーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、トリプトファン−５モノオキシゲナーゼおよびコリンアセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される。
【００２９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、第２の調節配列はヒトニューロン特異的エノラーゼのプロモーターを含む。
【００３０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、神経変性障害は、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、アルツハイマー病およびハンチングトン病からなる群から選択される。
【００３１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、神経変性障害はパーキンソン病である。
【００３２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、神経伝達物質は、ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、γ−アミノ酪酸、セロトニン、アセチルコリンおよびグルタミン酸からなる群から選択される。
【００３３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、神経伝達物質はドーパミンである。
【００３４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞は骨髄細胞である。
【００３５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、骨髄細胞は骨髄間質細胞である。
【００３６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞はニューロン様細胞である。
【００３７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ニューロン様細胞は少なくとも１つのニューロンマーカーを発現する。
【００３８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ニューロンマーカーは、ＣＤ９０、ニューロン特異的核タンパク質、ニューロフィラメント重鎖、ニューロン特異的エノラーゼ、β−チューブリン３、チロシンヒドロキシラーゼ、微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ−２）、ネスチンおよびカルビンジンからなる群から選択される。
【００３９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞を投与することは、細胞を個体の脳組織内に移植することによって達成される。
【００４０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞を投与することは、細胞を個体の脊髄内に移植することによって達成される。
【００４１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、個体をさらすことは、作用物を個体に経口投与することによって達成される。
【００４２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、個体をさらすことは、作用物を個体に注入することによって達成される。
【００４３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞は、神経伝達物質の外因性の調節可能な合成が可能であるように遺伝子改変される。
【００４４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞は、神経伝達物質の合成に関係する酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現構築物で形質転換される。この場合、発現構築物は、ポリヌクレオチドの発現が調節作用物により制御可能であるように設計される。
【００４５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、作用物は、神経伝達物質の合成に関係する酵素の発現をダウンレギュレーションすることができる。
【００４６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、作用物は、神経伝達物質の合成に関係する酵素の発現をアップレギュレーションすることができる。
【００４７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞は、作用物が存在しないとき、活性化因子分子が応答エレメントと結合し、それによりチロシンヒドロキシラーゼの発現をアップレギュレーションするように作用物の調節可能な制御下でチロシンヒドロキシラーゼを発現させるために遺伝子改変される。
【００４８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞は、神経伝達物質の合成に関係する酵素の内因性活性を有しないニューロン様細胞である。
【００４９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞は、アポトーシス阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
【００５０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、増殖培地は、ＤＭＥＭ、ＳＰＮ、Ｌ−グルタミン、ＦＣＳ、２−β−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸およびＥＧＦを含む。
【００５１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、神経変性障害を治療するための細胞を作製する方法は、工程（ｉｖ）の前に、工程（ｉｉｉ）から得られた細胞を前分化用培地においてインキュベーションし、それにより細胞をニューロン様細胞に分化させやすくすることを含む。
【００５２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、前分化用培地はｂＦＧＦを含む。
【００５３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、前分化用培地は、ＤＭＥＭ、ＳＰＮ、Ｌ−グルタミン、Ｎ２補充物およびＦＣＳをさらに含む。
【００５４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、少なくとも１つの多不飽和脂肪酸はドコサヘキサエン酸である。
【００５５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、少なくとも１つの分化用作用物は、ＢＨＡ、ｄｂｃＡＭＰおよびＩＢＭＸからなる群から選択される。
【００５６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、分化用培地は、ＤＭＥＭ、ＳＰＮ、Ｌ−グルタミン、Ｎ２補充物およびレチノイン酸をさらに含む。
【００５７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、神経変性障害を治療するための細胞を作製する方法はさらに、工程（ｉｖ）の前に、工程（ｉｉｉ）から得られた細胞を本発明の核酸構築物で形質転換することによって達成される。
【００５８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、工程（ｉ）は吸引によって達成される。
【００５９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、工程（ｉｉｉ）は、表面接着細胞を集めることによって達成される。
【００６０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、神経伝達物質はドーパミンである。
【００６１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、少なくとも２つのタイプの神経伝達物質には、ドーパミンが含まれる。
【００６２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、少なくとも２つのタイプの神経伝達物質には、セロトニンが含まれる。
【００６３】
本発明は、神経伝達物質の制御可能な合成が可能であるニューロン様細胞で、パーキンソン病などの神経変性障害を治療するためにそのような細胞を使用する細胞置換治療が可能であるニューロン様細胞を提供することによって、神経変性疾患を治療する現在知られている方法の欠点を対処することに成功している。
【００６４】
別途定義されない場合、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と同様または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。また、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【００６５】
本発明は、例示のみを目的とし、添付されている図面を参照して、本明細書中に記載される。次に図面を詳しく具体的に参照して、示されている項目は、例としてであり、また、本発明の好ましい実施形態の例示的な議論のためのものであり、従って、本発明の原理および概念的態様の最も有用かつ容易に理解された記述であると考えられるものを提供するために示されていることが強調される。これに関して、記述を図面と一緒に理解することにより、本発明のいくつかの形態が実際にどのように具体化され得るかが当業者には明らかになるので、発明の構造的詳細を、発明の基本的な理解のために必要であるよりも詳細に示すことは試みられていない。
図面の簡単な記述
図１Ａ〜Ｃは非分化のヒト骨髄間質細胞（ｈＢＭＳｃ）の光学顕微鏡像を例示する（図１Ａ〜図１Ｃ）。ｈＢＭＳｃは「増殖培地」（下記の実施例の節の実施例１に記載される）で培養され、約１５日の期間にわたって８０％〜９０％の密集度に成長させられた。プラスチック接着性のｈＢＭＳｃは円形もしくは紡錘体の体形状（図１Ａ）または平坦な体形状（図１Ｂ〜図１Ｃ）を有した。
図２は非分化ｈＢＭＳｃのフローサイトメーター分析を例示する。１５日目のｈＢＭＳ細胞が、表面マーカーのＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ３４（これらはリンパ造血系細胞に特徴的である）の存在について染色され、また、ＣＤ９０（Ｔｈｙ−１；シナプス形成時に発現するタンパク質）に関して染色された。細胞は、アルゴンイオンレーザー（これは４８８ｎｍの励起波長に調節された）およびＣＥＬＬＱｕｅｓｔ（商標）ソフトウエアプログラム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を備えるＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析された。分析では、ｈＢＭＳ細胞はリンパ球関連マーカーのいずれも発現しないが、Ｔｈｙ−１タンパク質を明確に発現したことが示される。
図３はニューロンに分化した成人ｈＢＭＳｃの光学顕微鏡像を例示する。分化の２４時間前に、培養されたｈＢＭＳｃを「増殖用培地」から「前分化培地」（下記の実施例の節の実施例１〜実施例２を参照のこと）に移した。「前分化培地」で２４時間インキュベーションした後、ｈＢＭＳｃを「分化培地」（下記の実施例の実施例２を参照のこと）に移した。プラスチック接着性の細胞を、分化誘導後の３時間もの早期に現れ、分化誘導後の７２時間において現れ続ける紡錘体の形状をした細胞体および長い枝分かれプロセスを有するニューロン様細胞に転換させた。
図４は「分化用培地」で培養されたｈＢＭＳｃ、および「前分化用培地」（下記の実施例の実施例２を参照のこと）で培養されたｈＢＭＳｃにおける３Ｈ−チミジン取り込み（これは細胞増殖を示す）を例示する。分化中の細胞への３Ｈ−チミジン取り込みは、１６時間および３９時間のインキュベーション期間の後で、非分化細胞と比較して、約４５％および９０％それぞれ低下した。
図５Ａ〜Ｄは非分化のｈＢＭＳｃおよび分化中のｈＢＭＳｃにおけるニューロンマーカーから抽出されたＲＮＡの逆転写酵素ＲＴ−ＰＣＲ分析、リアルタイムＰＣＲ分析およびノーザンブロット分析を例示する（図５Ａ〜図５Ｄ）。図５Ａは、ニューロン転写物を同定するために計画されたＲＴ−ＰＣＲ分析を例示する。図５Ｂは、ＮＥＧＦ２の３２Ｐ標識されたＰＣＲ産物をプローブとして利用したノーザンブロット分析およびリアルタイムＰＣＲ分析を例示する。図５Ｃは、ニューロフィラメント２００（ＮＦ−２００）の３２Ｐ標識されたＰＣＲ産物をプローブとして利用したノーザンブロット分析を例示する。図５Ｄは、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）の３２Ｐ標識されたＰＣＲ産物をプローブとして利用したノーザンブロット分析を例示する。
図６Ａ〜Ｂは「分化培地」（下記の実施例の実施例２を参照のこと）で１２時間〜５日間培養されたｈＢＭＳｃにおけるニューロンマーカーの蛍光顕微鏡像を例示する（図６Ａ〜図６Ｂ）。図６Ａは、抗体で標識されたニューロン核特異的マーカー（ＮｅｕＮ；１２時間後に発現した）、ニューロフィラメント重鎖（ＮＦ−２００；２４時間後に発現した）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ；４８時間後に発現した）およびネスチン（４８時間後に発現した）を例示する。図６Ｂは、抗体で標識されたグリア原線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ；４８時間後に発現した）およびβ−チューブリンＩＩＩ（５日後に発現した）を例示する。
図７Ａ〜Ｃはニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ；図７Ａ）、ニューロン核特異的マーカー（ＮｅｕＮ；図７Ｂ）およびネスチン（図７Ｃ）の上昇した発現を示す、分化したｈＢＭＳｃのウエスタンブロット分析を例示する。
図８は「長期分化培地」（下記の実施例の実施例５を参照のこと）で２８日間インキュベーションした後におけるニューロン様の分化したｈＢＭＳｃの光学顕微鏡像を例示する。
図９Ａ〜Ｃは「増殖培地」（下記の実施例の実施例１を参照のこと）または「長期分化培地」（下記の実施例の実施例５を参照のこと）でインキュベーションされたｈＢＭＳｃの光学顕微鏡像および蛍光顕微鏡像を例示する（ 図９Ａ〜図９Ｃ）。図９Ａは、分化した細胞におけるニューロンマーカーのβ−チューブリンＩＩＩの抗体標識された発現を例示する。図９Ｂは、分化した細胞におけるニューロンマーカーのＭＡＰ−２の抗体標識された発現を例示する。図９Ｃは、分化した細胞におけるニューロンマーカーのネスチンの抗体標識された発現を例示する。
図１０は「分化培地」（下記の実施例の実施例２を参照のこと）で１２時間〜７２時間培養されたｈＢＭＳｃにおけるドーパミン作動性マーカーを同定するために計画されたＲＴ−ＰＣＲ分析を例示する。
図１１Ａ〜Ｃは分化したｈＢＭＳｃにおけるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の発現を例示する。図１１Ａは、分化した細胞における上昇したＴＨ転写を示すリアルタイムＰＣＲ分析を例示する（図１１Ａ〜図１１Ｃ）。図１１Ｂは、分化した細胞におけるＴＨの上昇したレベルを示すウエスタンブロット分析を例示する。図１１Ｃは、分化した細胞における抗体標識されたＴＨ発現を強調する蛍光顕微鏡像を例示する。
図１２は分化した細胞における抗体標識された小胞モノアミン輸送体２（ＶＭＡＴ−２）を強調する、「分化培地」（下記の実施例の実施例２を参照のこと）で５日間インキュベーションされたｈＢＭＳｃの共焦点蛍光顕微鏡像を例示する。
図１３は「分化培地」（下記の実施例の実施例２を参照のこと）で４８時間インキュベーションされたｈＢＭＳｃのフローサイトメーター分析を例示する。細胞はＤ２ドーパミン受容体の存在について染色され、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析された。分析では、Ｄ２ドーパミン受容体が、分化した細胞に存在したことが示される。
図１４Ａ〜Ｄは分化中のｈＢＭＳｃのＨＰＬＣ分析を例示する（図１４Ａ〜図１４Ｄ）。図１４Ａは、「分化培地」（下記の実施例の実施例２を参照のこと）で０〜９６時間インキュベーションされたｈＢＭＳｃの上清における測定されたドーパミンのレベルを例示する。図１４Ｂは、「分化培地」で０〜９６時間インキュベーションされ、その後、５６ｍＭのＫＣｌ溶液において１０分間さらにインキュベーションされたｈＢＭＳｃの上清における測定されたドーパミンのレベルを例示する。図１４Ｃは、「分化培地」で０〜７２時間インキュベーションされたｈＢＭＳｃの上清における測定されたドーパミン前駆体ＤＯＰＡのレベルを例示する。図１４Ｄは、「分化培地」で０〜５０時間培養されたｈＢＭＳｃの上清における測定されたドーパミン代謝産物ＤＯＰＡＣのレベルを例示する。
図１５Ａ〜Ｄはパーキンソン病についてのラットモデルにおけるアンフェタミン誘導の運動回旋の回復に対するマウス骨髄間質細胞（ｍＢＭＳｃ）移植の効果を例示する（図１５Ａ〜図１５Ｄ）。ｍＢＭＳｃを、緑色蛍光タンパク質を目印とした遺伝子組換えマウス（ＧＦＴ−Ｔｇ）から単離した。単離されたｍＢＭＳｃは神経分化のために誘導され、６−ＯＨＤＡ障害ラットの黒質に移植された。その後、ラットはアンフェタミンで治療され、移植後４５日の期間にわたって回旋応答について調べられた。図１５Ａは、移植後の経時的な回旋速度の変化を例示し、低下しつつある回旋（これは運動機能の改善を示す）を移植後４５日目に示している。図１５Ｂは、移植後の経時的な（非治療マウスと比較したときの）相対的回旋における変化を例示し、相対的回旋の９７．９％の減少を移植後４５日目に示している。図１５Ｃは、移植後４５日目の治療されたマウスの黒質に存在する移植されたｍＢＭＳｃを強調する蛍光顕微鏡像を例示する。図１５Ｄは、黒質移植後４５日目の治療されたマウスの線条体に存在する移植されたｍＢＭＳｃを強調する蛍光顕微鏡像を例示する。
図１６Ａ〜Ｃは分化したヒト骨髄間質細胞（ｈＢＭＳｃ）におけるドーパミン作動性活性およびセロトニン作動性活性を例示する（図１６Ａ〜図１６Ｃ）。図１６Ａは、トリプトファンヒドロキシラーゼの発現を示すウエスタンブロット分析を例示する。図１６Ｂは、トリプトファンヒドロキシラーゼの転写を示すＲＴ−ＰＣＲ分析を例示する。図１６Ｃは、ＤＯＰＡＣ（ドーパミン代謝産物）および５ＨＩＡＡ（セロトニン代謝産物）の合成を示すＨＰＬＣ分析を例示する。
図１７はｐｃＤＮＡ−３．１Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）に挿入されたＮｕｒｒ−１コード配列を含有する発現ベクターの構築物を例示する。
図１８はドーパミン作動性細胞の負の選択のために設計された構築物を例示する。この構築物は、「自殺遺伝子」ＨＳＶ１−ｔｋ（毒性のガンシクロビルをコードする１型単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ）の上流側においてｐＭＯＤ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎｅ）に挿入されたヒトＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）プロモーターを含有する。
図１９Ａ〜Ｂはチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）のドキシサイクリン制御の発現のためのＴｅｔ−ｏｆｆ／Ｔｅｔ−ｏｎシステムを例示する（図１９Ａ〜図１９Ｂ）。図１９Ａはこのシステムの調節因子構築物および応答構築物を例示する。図１９Ｂは、このシステムの作用様式を記載する概略図を例示する。
図２０Ａ〜ＢはＧＦＰ−Ｔｇマウスの分化したＢＭＳｃ（ｍＢＭＳｃ）の蛍光顕微鏡像を例示する（図２０Ａ〜図２０Ｂ）。図２０Ａは、「分化培地」（実施例１参照）により誘導される形態学的変化の蛍光顕微鏡像を例示する。図２０Ｂは、ＮＴ−３誘導のｍＢＭＳｃにおいて発現する抗体標識されたＡ２Ｂ５（稀突起神経膠細胞前駆体のマーカー）を強調する蛍光顕微鏡像を例示する。
図２１はＳＯＤ１を発現するマウス（筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の動物モデル）の回旋成績における経時変化を例示する。ＳＯＤ１マウスは、野生型マウスと比較して、回旋成績の実質的な低下を受け、４月齢〜５月齢で完全な麻痺になった。
図２２は雄由来のｍＢＭＳｃが大槽内に移植された後の１週間目にサンプリングされた雌マウスの種々の組織のＰＣＲ分析を例示する。分析では、（移植された細胞であることを示す）Ｙ染色体が雌マウスの脊髄において検出され、他の組織では検出されない。
図２３は７週齢のときにその脊髄内へのｍＢＭＳｃ移植を受けた野生型マウスのロータロド（ｒｏｔａｒｏｄ）成績（回旋行動を示す）を例示する。生理的食塩水の注射で治療されたマウスが対照として使用された。ｍＢＭＳｃの移植は野生型マウスの回旋行動に影響を及ぼさなかった。
図２４は７週齢のときにその脊髄内へのｍＢＭＳｃ移植を受けたＳＯＤ１マウス（筋萎縮性側索硬化症のモデル）のロータロド成績（回旋行動を示す）を例示する。生理的食塩水の注射で治療されたマウスが対照として使用された。ｍＢＭＳｃの移植では、生理的食塩水で治療された対照と比較して、ＳＯＤ１マウスの回旋行動が著しく改善された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６６】
本発明は、神経伝達物質の制御可能な合成が可能な遺伝子改変された細胞、ならびに、そのような細胞を作製する方法、および、神経変性障害の細胞置換治療においてそのような細胞を使用する方法に関する。
【００６７】
本発明の原理および操作は、図面および付随する記述を参照してより良好に理解され得る。
【００６８】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施することが可能であり、または様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであり、限定であるとして見なしてはならないことを理解しなければならない。
【００６９】
ニューロン機能の消失によって特徴づけられる神経変性障害（例えば、パーキンソン病など）は、従来の薬物治療を使用して効率的に治療することができない。これは、そのような薬物は、ニューロンの変性によって典型的に引き起こされる根本的な疾患プロセスに対して全く効果がないからである。結果として、薬物治療では、ニューロン細胞の増大しつつある消失を完全に補うことができない。
【００７０】
先行技術の様々な細胞置換法は、動物モデルにおいて試験されたときには成功している（米国特許第６５２８２４５号；Ｓｃｈｗａｒｔｚ他、１９９９；Ｌｉ他、２００１；Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ他、２０００；Ｈｗａｎ−Ｗｕｎ他、１９９９；Ｌｉｎｄｅｒ他、１９９５；Ｐａｔｒｉｄｇｅ＆Ｄａｖｉｅｓ、１９９５；Ｐｅｒｒｙ＆Ｇｏｒｄｏｎ、１９９８；Ｙａｄｉｄ他、１９９９；Ｃｈｏｉ−Ｌｕｎｄｂｅｒｇ他、１９９８；Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ他、１９９５）が、これらの方法は、ヒト患者におけるそれらの使用を妨げ得るいくつかの固有的な制限により損なわれている。
【００７１】
本発明を考えているとき、本発明者らは、パーキンソン病などの神経変性疾患の安全かつ効果的な細胞置換治療を提供するために、容易に採取および操作され得る細胞で、とりわけ、外部の刺激に応答してドーパミンなどの神経伝達物質を合成することができる細胞が必要であることを実感した。
【００７２】
神経伝達物質を合成することができるニューロン様骨髄間質細胞（ＢＭＳｃ）が先行技術の様々な研究（例えば、米国特許第６５２８２４５号；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓ他（２０００）；Ｗｏｏｄｂｕｒｒｙ他（２０００）；Ｗｏｏｄｂｅｒｒｙ他（Ｊ．Ｎｅｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．、９６：９０８〜９１７、２００２）；Ｄｅｎｇ他（Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２８２：１４８〜１５２、２００１）を参照のこと）によって記載されているが、これらの研究は、そのような分化したＢＭＳｃによる神経伝達物質の産生を明らかにしていなかった。
【００７３】
上記からそれにもかかわらず、そのような先行技術の細胞が神経伝達物質を産生したとしても、細胞置換治療におけるその使用は、移植された細胞からの構成的な神経伝達物質の合成が重篤な副作用（例えば、遁走ジスキネジーなど）の形成をもたらし得るので気づいていない。
【００７４】
従って、本発明の１つの態様によれば、神経変性障害を治療する方法が提供される。本明細書中で使用される表現「神経変性障害」は、神経組織、神経伝達物質または神経機能の徐々に進行する消失によって特徴づけられる神経系（好ましくはＣＮＳ）の任意の障害または疾患または状態を示す。神経変性障害の例には、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、アルツハイマー病およびハンチングトン病が含まれる。
【００７５】
本明細書中で使用される用語「治療する」は、そのような用語が適用される障害または疾患または状態の進行を逆行させ、または軽減させ、または阻害すること、あるいは、そのような用語が適用される障害または疾患または状態を防止すること、あるいは、そのような障害または状態の１つまたは複数の症状を防止することを示す。本明細書中で使用される用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または用語「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」は、治療するという作用を示す。
【００７６】
本発明の方法は、神経伝達物質の外因的に制御可能な合成が可能であり、それにより神経変性障害を治療することができる細胞を、その必要性のある個体に投与することによって達成される。
【００７７】
神経伝達物質の外因的に制御可能な合成が可能である細胞（すなわち、要求に応じて神経伝達物質を産生する細胞）、例えば、より詳しくは本明細書中下記において記載される細胞などは、上記で記載された先行技術方法によって利用される細胞に伴う望ましくない副作用が除かれ得るので、細胞置換治療のためにより良好に適する。
【００７８】
本発明の教示による神経伝達物質は、中枢神経系または末梢神経系のシナプス前ニューロンの軸索終端から興奮時に放出され、かつ、シナプス間隙を超えて移動し、標的細胞の興奮または阻害のいずれかを生じさせる任意の物質であり得る。神経伝達物質は、例えば、ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、γ−アミノ酪酸、セロトニン、アセチルコリンまたはグルタミン酸であり得る。好ましくは、神経伝達物質はドーパミンである。
【００７９】
そのような神経伝達物質の細胞合成は、前駆体分子を活性な神経伝達物質に変換することにおいて協力する様々な酵素からなる経路によって導かれる。例えば、ドーパミンは、ドーパミン作動性ニューロンにおいて、Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）からＤＯＰＡデカルボキシラーゼの作用によって合成され、一方、Ｌ−ＤＯＰＡはチロシンからチロシンヒドロキシラーゼの作用によって産生される。ノルエピネフリンは、ノルエピネフリン作動性ニューロンにおいて、ドーパミンからドーパミンβ−ヒドロキシラーゼの作用によって産生される。エピネフリンは、エピネフリン作動性ニューロンにおいて、ノルエピネフリンからフェニルエタノールアミンＮ−メチルトランスフェラーゼの作用によって産生される。γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）は、ＧＡＢＡ作動性ニューロンにおいて、グルタミン酸からグルタミン酸デカルボキシラーゼの作用によって産生される。セロトニンは、セロトニン作動性ニューロンにおいて、トリプトファンから、トリプトファン−５−モノオキシゲナーゼ（ヒドロキシル化）および芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（脱カルボキシル化）による二段階プロセスによって産生される。アセチルコリンは、コリン作動性ニューロンにおいて、コリンおよびアセチル−ＣｏＡから、コリンアセチルトランスフェラーゼの作用によって産生される（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｄｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／ｔｈｅｍｅ／ｍｗｋｉｎｇ／ｎｅｒｖｅｓ．ｈｔｍｌ）。
【００８０】
本発明によって利用される細胞は、任意の活発に成長する細胞であり得るが、好ましくは骨髄由来の細胞であり、より好ましくは骨髄間質細胞（ＢＭＳｃ）である。ＢＭＳｃは、吸引し、その後、単離された細胞をエクスビボで維持および／または拡大することができる増殖培地で培養することによって個体の腸骨稜から単離することができる。好ましくは、増殖培地は、下記の実施例の節の実施例１に記載されるように、ＤＭＥＭ、ＳＰＮ、Ｌ−グルタミン、ＦＣＳ、２−β−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸およびＥＧＦを含む。
【００８１】
増殖中の細胞は、ニューロン様細胞に直接分化させることができ、または、ニューロン様細胞へのその分化に先立って、本明細書中下記に記載される構築物および形質転換方法を使用して形質転換することができる。
【００８２】
ニューロン様細胞への分化は、米国特許第６５２８２４５号に、また、Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓ他（２０００）；Ｗｏｏｄｂｕｒｒｙ他（２０００）；Ｗｏｏｄｂｅｒｒｙ他（Ｊ．Ｎｅｕｒｉｓｃｉ．Ｒｅｓ．、９６：９０８〜９１７、２００１）；ＢｌａｃｋおよびＷｏｏｄｂｕｒｒｙ（Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ Ｍｏｌ．Ｄｉｓ．、２７：６３２〜６３５、２００１）；Ｄｅｎｇ他（２００１）；Ｋｏｈｙａｍａ他（２００１）；ＲｅｙｅｓおよびＶｅｒｆａｔｉｌｅ（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９３８：２３１〜２３５、２００１）；Ｊｉａｎｇ他（Ｎａｔｕｒｅ、４１８：４７〜４９、２００２）によって記載される培地などの分化用培地で細胞をインキュベーションすることによって達成され得る。
【００８３】
好ましくは、分化は少なくとも１つのタイプの長鎖多不飽和脂肪酸の存在下で達成される。ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などの長鎖多不飽和脂肪酸は、ニューロンの適正な発達および機能のために不可欠であることが知られている。そのような多不飽和脂肪酸は、ニューロン膜における主要なアニオン性リン脂質の生合成および蓄積を調節することに関与している［ＣｏｎｎｏｒおよびＮｅｕｒｉｎｇｅｒ、“Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ａｎｄ Ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ”、Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ，Ｍ．、Ｌｅａｆ，Ａ．およびＢｏｌｉｓ，Ｌ．編、２６７頁〜２９２頁、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；Ａｌａｎ Ｒ．Ｌ．、“Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎ−３ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ Ｒｅｐｌｅｔｉｏｎ ｕｐｏｎ ｔｈｅ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｒａｉｎ ａｎｄ Ｒｅｔｉｎａ”、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；ＧｒｅｅｎおよびＹａｖｉｎ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、６５：２５５５〜２５６０、１９９５］。ニューロンの細胞培養研究において、ＤＨＡはシナプスの周りのホスファチジルエタノールアミンリン脂質およびホスファチジルセリンリン脂質の一部を形成することが明らかにされている（Ｋｉｍ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５：３５２１５〜３５２２３、２０００；Ｋｉｍ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１６：２２３〜２２７、２００２；ＡｋｂａｒおよびＫｉｍ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、８２：６５５〜６６５、２００２）。
【００８４】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、２０μＭ〜１００μＭのＤＨＡ（Ｓｉｇｍａ）またはエチル−ＤＨＡ（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ−Ｐｒｅｏ、Ｅｌｙｓｉａｎ、ＭＮ）を培養されたＢＭＳｃに添加することにより、ニューロン様ＢＭＳｃのシナプスにおける神経伝達物質分泌小胞の形成が実質的に促進されたことを発見した（データは示されず）。
【００８５】
従って、本発明の好ましい実施形態によれば、ニューロン様細胞へのＢＭＳｃの分化は、少なくとも１つの多不飽和脂肪酸（例えば、ＤＨＡなど）を含む分化用培地で細胞をインキュベーションすることによって達成される。好ましくは、分化用培地はまた、少なくとも１つのニューロン分化用作用物、例えば、ＢＨＡ、ｄｂｃＡＭＰまたはＩＢＭＸを含む。より好ましくは、分化培地は、ＤＭＥＭ、ＳＰＮ、Ｌ−グルタミン、Ｎ２補充物およびレチノイン酸をさらに含む（下記の実施例の節の実施例２を参照のこと）。
【００８６】
分化効率をさらに増大させるために、ＢＭＳｃは、好ましくは、上記の分化培地におけるそのインキュベーションの前に「前分化培地」でインキュベーションされる。好適な前分化培地は、細胞にニューロン様分化を受けやすくすることができる任意の成長培地、例えば、マイトジェンの塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）が補充された成長培地などであり得る。好ましくは、前分化用培地はさらに、下記の実施例の節の実施例２などに記載されるように、ＤＭＥＭ、ＳＰＮ、Ｌ−グルタミン、Ｎ２補充物およびＦＣＳを含む。
【００８７】
本明細書中上記に記載される手順から得られるニューロン様細胞は典型的には、ニューロン細胞の形態学（これは図３に例示される）を示し、少なくとも１つのニューロンマーカー（例えば、ＣＤ９０、ニューロン特異的核タンパク質、ニューロフィラメント重鎖、ニューロン特異的エノラーゼ、β−チューブリン３、ＭＡＰ−２、チロシンヒドロキシラーゼ、微小管結合タンパク質、ネスチンおよびカルビンジンなど）を発現する。ニューロンマーカーの発現は、下記の実施例の節における実施例３〜実施例９および実施例１２などに記載される免疫アッセイ、フローサイトメトリー、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲおよびＨＰＬＣ法などの様々な方法を使用して確認される。
【００８８】
本発明の分化した細胞は、好ましくは、神経伝達物質を合成することができる。神経伝達物質を合成する細胞は、上記などに記載されるニューロン様分化培地、または、下記の実施例の節の実施例９などに記載される「ドーパミン作動性分化培地」でインキュベーションすることによって作製することができる。
【００８９】
ドーパミン作動性の細胞のみを利用するパーキンソン病の置換治療では、長期間の治療において、非ドーパミン作動性伝達物質系の不均衡がもたらされ、その後に、効果の低下およびジスキネジーなどの副作用が生じ得ることが理解される（ＮｉｃｈｏｌｓｏｎおよびＢｒｏｔｃｈｉｅ、Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ．、３：１〜６、２００２）。従って、非ドーパミン作動系を標的化し、かつ、パーキンソン病における不随意運動の発現を防止または制限することができる薬剤が、パーキンソン病患者を治療する際の使用のために提案されている（ＤｊａｌｄｅｔｔｉおよびＭｅｌａｍｅｄ、Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ．、２：３０〜５、２００２；Ｍｕｌｌｅｒ，Ｔ．、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．、２：５５７〜７２、２００１；Ｊｅｎｎｅｒ，Ｐ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２：４３〜５０、２０００）。さらに、様々なセロトニン受容体がパーキンソン病における潜在的な治療標的として同定されている（ＮｉｃｈｏｌｓｏｎおよびＢｒｏｔｃｈｉｅ、Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ．、３：１〜６、２００２）。
【００９０】
従って、本発明の別の実施形態によれば、本発明によって利用される細胞の集団は、バランスの取れた神経伝達物質の産生を提供するために向けられた２つ以上の異なる神経伝達物質産生細胞を含む混合細胞集団である。好ましくは、混合細胞集団は、図１６Ａ〜図１６Ｃに例示される細胞などのドーパミン作動性細胞ならびにセロトニン作動性細胞を含む。
【００９１】
本明細書中上記で述べられたように、本発明のこの態様によって利用される細胞は、好ましくは、神経伝達物質の制御可能な合成が可能である。
【００９２】
いくつかの方法が、そのような制御された合成が可能である細胞を作製するために利用することができる。
【００９３】
好ましくは、ニューロン移植のために好適な細胞は、本明細書中上記で記載されたように採取または作製され、神経伝達物質の制御可能な発現が可能であるように遺伝子改変される。
【００９４】
遺伝子改変は、好ましくは、神経伝達物質の合成に関係する酵素の制御可能な発現のために設計される発現構築物でそのような細胞を形質転換することによって達成される。
【００９５】
本発明の発現構築物は、好ましくは、神経伝達物質の合成に関係する酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含むが、発現構築物は、ポリヌクレオチドの発現が、特定の作用物または条件にさらされることにより調節されるように設計される。神経伝達物質の合成に関係する酵素の制御可能な発現は、神経伝達物質の合成に関係する酵素をコードするポリヌクレオチド配列を、「オン」（誘導）または「オフ」（抑制）の切り替えができるプロモーターまたは調節因子の転写制御下に配置させて含む発現構築物を利用することによって達成することができる。
【００９６】
発現構築物は、構築物配列のゲノム組込みをもたらす遺伝子ノックイン構築物として設計することができ、または、エピソーム発現ベクターとして設計することができる。
【００９７】
どのような場合でも、発現構築物は、この分野で広く知られている標準的な連結技術および制限技術を使用して作製することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８２）を参照のこと）。単離されたプラスミド、ＤＮＡ配列または合成オリゴヌクレオチドは切断され、調整され、所望される形態で再連結される。
【００９８】
本発明の発現構築物において利用され得るポリヌクレオチド配列は、国立分子生物学情報資源によって管理されるデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）などの様々なデータベースに記載されている。例には、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０００３６０（これはチロシンヒドロキシラーゼをコードする）、同ＮＭ＿０００７９０（これはＤＯＰＡデカルボキシラーゼをコードする）、同ＮＭ＿０００１６１（これはＧＴＰシクロヒドロラーゼＩをコードする）、同ＮＭ＿０００７８７（これはドーパミンβ−ヒドロキシラーゼをコードする）、同ＮＭ＿００２６８６（これはグルタミン酸デカルボキシラーゼをコードする）、同ＮＭ＿００３４５０（これはトリプトファン−５モノオキシゲナーゼをコードする）および同ＮＭ＿０２０５４９（これはコリンアセチルトランスフェラーゼをコードする）において示される配列が含まれる。
【００９９】
本発明とともに使用される好適なプロモーターは、好ましくは、神経伝達物質の調節可能な発現をもたらすようにポリヌクレオチド配列の転写を行わせることができる応答エレメントである。好適な応答エレメントは、例えば、テトラサイクリン応答エレメント（例えば、ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７〜５５１、１９９２）によって記載される応答エレメントなど）；エクチゾン誘導可能な応答エレメント（Ｎｏ Ｄ他（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：３３４６〜３３５１、１９９６））；金属イオン応答エレメント、例えば、Ｍａｙｏ他（Ｃｅｌｌ、２９：９９〜１０８、１９８２）、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ他（Ｎａｔｕｒｅ、２９６：３９〜４２、１９８２）およびＳｅａｒｌｅ他（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：１４８０〜１４８９、１９８５）などによって記載される応答エレメント；熱ショック応答エレメント、例えば、Ｎｏｕｅｒ他（Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｎｏｕｅｒ，Ｌ．編、ＣＲＣ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ、１６７頁〜２２０頁、１９９１）などによって記載される応答エレメント；または、ホルモン応答エレメント、例えば、Ｌｅｅ他（Ｎａｔｕｒｅ、２９４：２２８〜２３２、１９８１）、Ｈｙｎｅｓ他（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：２０３８〜２０４２、１９８１）、Ｋｌｏｃｋ他（Ｎａｔｕｒｅ、３２９：７３４〜７３６、１９８７）、ＩｓｒａｅｌおよびＫａｕｆｍａｎ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１７：２５８９〜２６０４、１９８９）などによって記載される応答エレメントであり得る。好ましくは、応答エレメントはエクチゾン誘導可能な応答エレメントであり、より好ましくは、応答エレメントはテトラサイクリン応答エレメントである。
【０１００】
本発明の発現構築物はまた、１つまたは複数のエレメントを含むことができる。エンハンサーエレメントは、転写を、連結された同種プロモーターまたは異種プロモーターから１０００倍にまで刺激することができる。エンハンサーは、転写開始部位の下流側または上流側に置かれたときに活性である。ウイルスに由来する多くのエンハンサーエレメントは広い宿主範囲を有し、様々な組織において活性である。例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーは多くの細胞タイプについて好適である。本発明のために好適であるエンハンサー／プロモーターの他の組合せには、ポリオーマウイルス、ヒトまたはマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するもの、様々なレトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルスまたはラウス肉腫ウイルスおよびＨＩＶなど）に由来する長末端反復が含まれる。Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ａｎｄ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８３）を参照のこと（これは参考として本明細書中に取り込まれる）。
【０１０１】
ポリアデニル化配列もまた、本発明の発現構築物から発現される酵素の翻訳効率を増大させるために発現構築物に加えることができる。２つの異なった配列エレメントが正確かつ効率的なポリアデニル化のために要求される：ポリアデニル化部位の下流側に存在するＧＵリッチ配列またはＵリッチ配列、および、１１ヌクレオチド〜３０ヌクレオチド上流に存在する６ヌクレオチドの高度に保存された配列ＡＡＵＡＡＡ。本発明のために好適である終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルには、ＳＶ４０に由来するシグナルが含まれる。
【０１０２】
既に記載されたエレメントに加えて、本発明の発現構築物は、典型的には、クローン化されたポリヌクレオチドの発現レベルを増大させるために、または組換えＤＮＡを保有する細胞の同定を容易にするために意図された他の特殊化されたエレメントを含むことができる。例えば、数多くの動物ウイルスは、許容細胞タイプにおけるウイルスゲノムの染色体外複製を促進させるＤＮＡ配列を含有する。これらのウイルスレプリコンを運搬するプラスミドは、適切な因子が、プラスミドで運ばれる遺伝子、または宿主細胞のゲノムとともに運ばれる遺伝子のいずれかによって提供される限り、エピソーム的に複製する。
【０１０３】
発現構築物は真核生物レプリコンを含んでもよく、または真核生物レプリコンを含まなくてもよい。真核生物レプリコンが存在する場合、ベクターは、適切な選択マーカーを使用して真核生物細胞において増幅可能である。構築物が真核生物レプリコンを含まない場合、エピソーム増幅を行うことができない。代わりに、組換えＤＮＡは、操作された細胞のゲノムに組み込まれ、細胞において、プロモーターにより、所望されるポリヌクレオチドの発現が行われる。
【０１０４】
本発明の発現構築物はさらに、例えば、１つのｍＲＮＡからの数個のタンパク質の翻訳を可能にするさらなるポリヌクレオチド配列（例えば、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、およびプロモーターがキメラなポリペプチドのゲノム組込みのための配列など）を含むことができる。例えば、１つの発現構築物を設計し、神経伝達物質の合成に関係する２つの異なった酵素（例えば、ドーパミン合成において関係する酵素のチロシンヒドロキシラーゼおよびＤＯＰＡデカルボキシラーゼなど）を同時発現させることができる。
【０１０５】
哺乳動物発現構築物のための例には、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１（これらはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である）、ｐＣＩ（これはＰｒｏｍｅｇａから入手可能である）、ｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ（これらはＳｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能である）、ｐＴＲＥＳ（これはＣｌｏｎｔｅｃｋから入手可能である）、ならびにそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
真核生物ウイルス（例えば、レトロウイルスなど）に由来する調節エレメントを含有する発現構築物もまた、本発明によって使用することができる。ＳＶ４０系ベクターには、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２が含まれる。ウシ乳頭腫ウイルスに由来するベクターには、ｐＢＶ−１ＭＴＨＡが含まれる。エプスタイン・バールウイルスに由来するベクターには、ｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５が含まれる。他の例示的なベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＮｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、および、ＳＶ−４０初期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核生物細胞における発現のために効果的であることが示されている他のプロモーターの指揮下でのタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが含まれる。
【０１０７】
ウイルスは、多くの場合には宿主の防御機構を回避するために進化してきた特殊化された感染性因子である。典型的には、ウイルスは特定の細胞タイプにおいて感染し、伝搬する。ウイルスベクターの標的化特異性では、その天然の特異性が、所定の細胞タイプを特異的に標的化し、それにより組換え遺伝子を感染した細胞に導入するために利用される。従って、本発明によって使用されるベクターのタイプは、形質転換される宿主細胞に依存する。形質転換される細胞タイプに従って好適なベクターを選択する能力は、十分に当業者の能力の範囲内であり、そのため、選択の考慮すべき事項の一般的な記述は本明細書中には示されていない。例えば、骨髄細胞は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）を使用して標的化することができる。
【０１０８】
組換えウイルスベクターは、側方感染および標的化特異性などの利点を提供するので、遺伝子組換えポリヌクレオチドのインビボ発現のために有用である。側方感染は、例えば、レトロウイルスの生活環において固有的であり、１つだけの感染細胞が、出芽し、隣接する細胞に感染する多くの子孫ビリオンを産生するプロセスである。その結果は、そのほとんどが一番最初のウイルス粒子によって最初に感染しなかった大きな面積が急速に感染するということである。これは、感染性因子が娘子孫を介してのみ広がる垂直型の感染とは対照的である。側方に広がることができないウイルスベクターもまた作製することができる。この特徴は、所望される目的が、局在化した多数の標的化された細胞にだけ指定の遺伝子を導入することであるならば、有用であり得る。
【０１０９】
下記の実施例の節において記載されるように、本発明の細胞はまた、トランス活性化因子によって調節される第１のポリヌクレオチド配列を第２の調節配列の転写制御下に配置されて含む発現構築物または構築物システムで形質転換することができる。そのような発現スキームにおいて、トランス活性化因子は、作用物の非存在下で、第１の調節配列を活性化して、第１のポリヌクレオチド配列の転写を行わせることができる。
【０１１０】
好ましくは、発現構築物または構築物システムの第１のポリヌクレオチド配列は、Ｎｏ他（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：３３４６〜３３５１、１９９６）などによって記載されるエクジソン応答性のプロモーターに機能的に連結されている、神経伝達物質の合成に関係する酵素をコードする配列を含む。
【０１１１】
より好ましくは、発現構築物または構築物システムの第１のポリヌクレオチド配列は、ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７〜５５１、１９９２）などによって記載されるテトラサイクリン制御エレメントに機能的に連結されている、神経伝達物質の合成に関係する酵素をコードする配列を含む。さらなる詳細については、下記の実施例の節の実施例１５を参照のこと。
【０１１２】
トランス活性化因子は、好ましくは、ヒトエノラーゼプロモーターに機能的に連結された、ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７〜５５１、１９９２）などによって記載されるテトラサイクリン制御のトランス活性化因子である。さらなる詳細については、下記の実施例の節の実施例１５を参照のこと。
【０１１３】
様々な方法を、本発明の発現構築物を哺乳動物細胞に導入するために使用することができる。そのような様々な方法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９、１９９２））；Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ（１９８９））；Ｃｈａｎｇ他、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈ．（１９９５））；Ｖｅｇａ他、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈ．（１９９５））；Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．（１９８８））；Ｇｉｌｂｏａ他［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４（６）：５０４〜５１２、１９８６］において一般的に記載されており、そのような方法には、例えば、安定的または一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、および、組換えウイルスベクターを用いた感染が含まれる。また、正・負の選択法については、米国特許第５４６４７６４号および同第５４８７９９２号を参照のこと。
【０１１４】
形質転換された細胞が作製されると、形質転換された細胞は、外部のシグナル（例えば、作用物の存在または非存在）に応答して機能的な神経伝達物質を合成するその能力について（培養において）調べられる。好ましくは、神経伝達物質の濃度が、例えば、ＨＰＬＣまたはＧＣ−ＭＳなどの標準的な化学分析法を使用して（作用物の非存在に対してその存在において）比較分析される。あるいは、培養液が、下記の実施例の節の実施例７などに記載される手順を使用して、免疫アッセイ、ウエスタンブロットおよびリアルタイムＰＣＲなどの生化学分析法を使用して、または、酵素活性のバイオアッセイによって、組換え酵素（例えば、チロシンヒドロキシラーゼ）の発現について比較分析される。
【０１１５】
神経伝達物質を内因的に産生することができる細胞が本発明との使用のために選択される場合（例えば、ニューロン誘導されたＢＭＳｃ）においては、そのような細胞は、好ましくは、神経伝達物質の合成に関係している酵素（例えば、内因性チロシンヒドロキシラーゼ）の内因性コード配列を欠失または変異させるように遺伝子操作されることが理解される。そのような遺伝子操作は、例えば、Ｇａｌｌｉ−Ｔａｌｉａｄｏｒｏｓ他（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８１：１〜１５、１９９５）およびＨａｒｒｉｓ＆Ｆｏｒｄ（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ、１：４３３〜４３、２０００）によって記載される技術およびベクターなどの、遺伝子ノックアウトまたは部位特異的変異のための技術およびベクターを用いることによって達成することができる。あるいは、神経伝達物質を内因的に産生することができる細胞を、神経毒（例えば、ＭＰＴＰ）にさらすことによって、または、図１８などに例示される自殺ベクターを用いた形質転換によって除くことができる。
【０１１６】
内因性配列の欠失は、細胞が、神経伝達物質を内因的に合成する能力を同時に失い、かつ、制御可能な調節配列の転写制御下に配置された、酵素をコードする外因性配列のゲノム組込みにより（調節可能な）そのような能力を獲得するように、外因性酵素のコード配列（例えば、上記のコード配列）のノックインと組み合わせることができる。
【０１１７】
あるいは、そのような細胞はまた、内因性酵素のコード配列が調節可能なプロモーター配列の制御下にもたらされるように遺伝子操作することができる。そのような操作は、酵素の内因性プロモーター配列（例えば、ＴＨプロモーター配列）を調節可能なプロモーター配列の遺伝子ノックインにより置換することによって達成することができる。
【０１１８】
場合により、本発明の細胞は、脳移植時に生じる細胞死に対する抵抗性を獲得するように形質転換される。脳組織に移植された細胞は、低酸素症、低血糖、機械的外傷、フリーラジカル、増殖因子枯渇、および、宿主脳における興奮性アミノ酸の過度な細胞外濃度によって開始されるアポトーシスを受け得ることが見出されている（Ｂｒｕｎｄｉｎ他、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｏｌａｎｔ．、９：１７９〜１９５、２０００）。アポトーシス誘導による細胞死の危険性が高い状況のもとでは、本発明の細胞は、アポトーシス阻害ポリペプチド（例えば、ヒトｂｃｌ−２遺伝子（ＡｄａｍｓおよびＣｏｒｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１：１３２２〜１３２６、１９９８）など）をコードするポリヌクレオチドで形質転換することができる。このポリペプチドは、本明細書中上記などに記載される構成的プロモーターの制御下で、または好ましくは、例えば、Ｌｅｖｙ他（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２１：１２１〜１３２、２００３）によって記載されるようなヒトニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターなどのニューロン組織特異的なプロモーターの制御下で発現させることができる。
【０１１９】
本発明の細胞は、その種類は移植部位に依存する様々な移植法を使用して治療者に投与することができる。
【０１２０】
「移植」、「細胞置換」または「移植する」の用語または表現は、本明細書中では相互に交換可能に使用され、本発明の細胞を標的組織に導入することを示す。細胞は移植者に由来し得るか、または、同種もしくは異種の提供者に由来し得る。
【０１２１】
細胞は、中枢神経系内に、または宿主の脳の脳室空洞内に、または宿主の脳の表面の硬膜下に移植することができる。成功する移植のための条件には、（ｉ）移植組織の生存性；（ｉｉ）移植部位における移植片の保持；および（ｉｉｉ）移植部位における最小限量の病理学的反応が含まれる。様々な神経組織（例えば、胚性脳組織）を宿主の脳に移植するための様々な方法が、“Ｎｅｕｒａｌ ｇｒａｆｔｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ＣＮＳ”（ＢｊｏｒｋｌｕｎｄおよびＳｔｅｎｅｖｉ編、１９８５）に記載されている。これらの手法には、実質内の移植、すなわち、移植時に、脳の実質組織と対比されるように宿主脳内における組織の注射または留置によって達成される、（脳の外側または実質外での移植と比較されるような）宿主脳内での実質内移植が含まれる。
【０１２２】
実質内移植は、２つの方法を使用して達成することができる：（ｉ）細胞を宿主の脳の実質組織の中に注射すること、または（ｉｉ）宿主の脳の実質組織を露出させるために手術的手段によって空洞を調製し、その後、移植片を空洞の中に置くこと。両方の方法では、実質組織留置が移植時に移植片と宿主の脳組織との間にもたらされ、また、両方の方法では、移植片と宿主の脳組織との間での解剖学的な一体化が促進される。このことは、移植片が宿主の脳の構成部分になり、宿主の生涯にわたって生存することが要求されるならば、重要である。
【０１２３】
あるいは、移植片は、脳室（例えば、大脳脳室）に、または硬膜下、すなわち、宿主の脳の表面に設置することができ、この場合、移植片は、介在する軟膜またはクモ膜および軟膜によって宿主の脳の実質組織から隔てられる。脳室への移植は、ドナー細胞の注射によって達成することができ、または、３％コラーゲンなどの基質において細胞を成長させて、移植片の位置の変化を防止するために、脳室に移植され得る充実組織の栓を形成させることによって達成することができる。硬膜下移植の場合、細胞は、硬膜にすき間を作製した後、脳の表面の周囲に注射することができる。宿主の脳の選択された領域への注射は、ドリルで穴を開け、硬膜に穴を開けて、マイクロシリンジのニードルが挿入されることを可能にすることによって行うことができる。マイクロシリンジは、好ましくは、定位固定フレームに取り付けられ、三次元の定位固定座標が、ニードルを脳または脊髄の所望される位置に設置するために選択される。細胞はまた、脳の被殻、基底核、海馬皮質、線条体、黒質または尾状領域、ならびに脊髄に導入することができる。
【０１２４】
移植のために、細胞懸濁物がシリンジの中に引き込まれ、麻酔された移植者に投与される。多数回の注射を、この手法を使用して行うことができる。
【０１２５】
従って、このような細胞懸濁手法は、脳または脊髄における任意の所定部位への細胞の移植を可能にし、比較的非外傷性であり、同じ細胞懸濁物を使用して数カ所の異なる部位または同じ部位における同時での多数回の移植を可能にし、かつ、異なる解剖学的領域からの細胞の混合物を可能にする。多数の移植片は、細胞タイプの混合物、および／または細胞に挿入された導入遺伝子の混合物からなり得る。好ましくは、約１０４個〜約１０８個の細胞が移植片あたり導入される。
【０１２６】
空洞内への移植の場合、これは脊髄移植のためには好ましい場合があるが、組織が、例えば、Ｓｔｅｎｅｖｉ他（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．、１１４：１〜２０、１９７６）によって記載されるように、脳を覆っている骨を除き、ゲルフォームなどの材料で出血を止めることによって、移植空洞を形成するために、中枢神経系（ＣＮＳ）の外側表面に近い領域から除かれる。吸引を、空洞を作製するために使用することができる。その後、移植片が空洞内に設置される。２つ以上の移植片を、細胞または充実組織移植組織の注射を使用して同じ空洞に設置することができる。好ましくは、移植部位は、本発明の細胞によって合成される神経伝達物質のタイプによって決定される。例えば、ドーパミン作動性細胞は、好ましくは、パーキンソン病患者の黒質に移植される。
【０１２７】
本発明の細胞は、神経変性障害を治療することにおいて有用な治療剤と同時投与することができ、例えば、増殖因子（例えば、神経増殖因子）、ガングリオシド、抗生物質、神経伝達物質、神経ホルモン、毒素、神経突起促進分子、および代謝拮抗剤、ならびにこれらの分子の前駆体（例えば、Ｌ−ＤＯＰＡなど）と同時投与することができる。
【０１２８】
移植後、治療された個体は、移植された細胞によって放出される神経伝達物質のレベルについて注意深く、かつ継続してモニターされる。神経伝達物質レベルは、好ましくは、神経変性障害を診断するために好適な臨床試験を使用することによって間接的に推定される。例えば、パーキンソン病患者における移植された細胞によるドーパミンの放出は、例えば、Ａｄｋｅｒ，Ｃ．Ｈ．およびＡｈｌｓｋｏｇ，Ｊ．Ｅ．編、“Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｉｎｇ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ”（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、２０００）などに記載されるパーキンソン病用の臨床診断試験を使用して推定することができる。モニターされた表示値に基づいて、神経伝達物質の放出速度が、移植された細胞における神経伝達物質の合成を調節することができる作用物を個体に投与することによって、またはそのような作用物を個体から取り除くことによって調節される。作用物は、本明細書中上記などに記載される、神経伝達物質の合成に関係する酵素の発現をアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションすることができる任意の分子であり得る。
【０１２９】
作用物は、個体に対して直接投与することができ、または医薬組成物の一部（有効成分）として投与することができる。
【０１３０】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分または作用物の１つまたは複数と、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤などの他の化学的成分との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する配合物の投与を容易にすることである。
【０１３１】
本明細書中以降において、表現「生理学的に許容され得るキャリア」および表現「医薬的に許容され得るキャリア」は、相互に交換可能に使用され得るが、生物に対する著しい刺激を生じさせず、投与された配合物の生物学的な活性および性質を妨げないキャリアまたは希釈剤を示す。佐剤はこれらの表現に含まれる。
【０１３２】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。
【０１３３】
薬物の配合および投与のための様々な技術を、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出すことができる（これは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０１３４】
本発明の方法において使用される任意の調製物について、治療効果的な量または用量をインビトロアッセイおよび細胞培養アッセイから最初に推定することができる。好ましくは、用量が、所望される濃度または力価を達成するために動物モデルにおいて定められる。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【０１３５】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、インビトロ、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手法によって明らかにすることができる。これらのインビトロアッセイおよび細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおいて使用される投薬量範囲を定める際に使用することができる。投薬量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ他、１９７５、“Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”、第１章、１頁を参照のこと）。例えば、パーキンソン病患者は、治療に対する正の応答を示す改善された運動機能について、また、過度なドーパミン発現を示す遁走ジスキネジー症状について症状的にモニターされ得る。
【０１３６】
作用物は様々な方法で患者に投与することができ、そのような方法には、限定されないが、経口投与、非経口投与、クモ膜下投与、脳室内投与および黒質内（ｉｎｔｒａｎｉｇｒａｌ）適用が含まれる。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ他、１９７５、“Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”、第１章、１頁を参照のこと）。
【０１３７】
投薬量および投薬間隔は、移植された細胞による神経伝達物質の合成を効果的に調節するために十分である有効成分のレベルに合わせて個々に調製され得る。所望される効果を達成するために必要な投薬量は、個体の特性および投与経路に依存する。様々な検出アッセイを、血漿濃度を測定するために使用することができる。
【０１３８】
治療される状態の重篤度および応答性に依存して、服薬は単回または複数回の投与が可能であり、治療の経過は、数日から数週間まで、または、疾患状態の縮小が達成されるまで続く。
【０１３９】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、治療されている個体、病気の重篤度、投与様式、処方医師の判断などに依存する。投薬量および投与時期は、個体の変化する状態の注意深い継続したモニターリングに応答する。例えば、治療されているパーキンソン病患者には、モニターリング中の表示値に基づいて、所望されるレベルにドーパミン合成を促進または抑制するために十分である量の作用物が投与される。
【０１４０】
従って、本発明は、効果的であり、安全であり、かつ臨床的に実施可能である神経変性疾患の細胞治療の新規な核酸構築物、構築物システム、細胞および方法を提供する。
【０１４１】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴が、限定であることが意図されない下記の実施例を検討したとき、当業者には明らかになる。また、本明細書中上記に描かれ、また、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、下記の実施例において実験的裏付けが見出される。
【０１４２】
上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なおこれら実施例によって本発明は限定されない。
【０１４３】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学及び組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている［例えば以下の諸文献を参照されたい。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｒ．Ｍ．編１９９４年「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻；Ａｕｓｕｂｅｌら著１９８９年「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク１９８８年；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク１９９８年；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号及び５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ， Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク１９９４年；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、米国ニューヨーク１９８０年；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている。米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号及び５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４年；Ｈａｍｅｓ， Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１９８５年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」１９８４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」１９８６年；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８６年；Ｐｅｒｂａｌ， Ｂ．著「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」１９８４年及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ１９９０年；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、１９９６年及びＰａｒｆｉｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９８７）．Ｂｏｎｅ ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ：ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，ｓｙｍｂｏｌｓ，ａｎｄ ｕｎｉｔｓ．Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ＡＳＢＭＲ Ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２（６），５９５−６１０；なおこれらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである］。その外の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１４４】
実施例１
ヒト骨髄間質細胞（ｈＢＭＳｃ）の単離および培養
方法：
増殖培養：骨髄吸引物（１０ｍｌ）を、インフォームドコンセントを得た健康なヒトドナーの腸骨稜から得た。単核細胞を、密度勾配（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）−１０７７）による遠心分離によって単離し、「増殖培地」［ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）；１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１２．５ユニット／ｍｌのナイスタチン（ＳＰＮ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）；２ｍＭのＬ−グルタミン；５％のウマ血清；１５％のウシ胎児血清（ＦＣＳ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）；０．００１％の２−β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）；１ｘの非必須アミノ酸；１０ｎｇ／ｍｌのヒト上皮増殖因子（ＥＧＦ）］に置床した。細胞を、３７℃で２日間、加湿された５％ＣＯ２インキュベーターにおいてインキュベーションし、その後、非接着の細胞を捨てた。残ったプラスチック接着性の細胞をダルベッコのリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）で２回洗浄し、新鮮な成長培地を加えた。培地を３日毎または４日毎に取り替えた。細胞は１５日以内に８０％〜９０％の密集度に成長し、円形もしくは紡錘体の形状（図１Ａ）または平坦な形状（図１Ｂ〜図１Ｃ）となって現れた。
【０１４５】
フローサイトメトリー：増殖培養条件のもとで１５日後、細胞を集め、０．０５％トリプシンおよび２５ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した。細胞を、０．５ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度での溶液において、細胞表面マーカーのＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ３４（これらはリンパ造血系細胞に関連する）に対して特異的な抗体（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で２０分間、各抗体の経験的に決定された量（一般には１０μｌ〜２０μｌ）を用いて染色した。抗体で標識された細胞を２容量のＰＢＳで徹底的に洗浄し、フロー緩衝液（ＰＢＳにおける１％パラホルムアルデヒド、０．１％アジ化ナトリウムおよび０．５％ウシ血清アルブミン）において固定処理した。洗浄細胞を、４８８ｎｍの励起波長に調節されたアルゴンイオンレーザーを備えるＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって、また、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ（商標）ソフトウエアプログラム（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて１００００個の事象を集めることによって分析した。
【０１４６】
結果：
培養されたｈＢＭＳｃは、リンパ造血系細胞に関連する表面マーカー（すなわち、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ３４）のいずれも発現しておらず、むしろ、シナプス形成を示すＣＤ９０表面マーカー（Ｔｈｙ−１）を発現していた（図２）。
【０１４７】
実施例２
ヒト骨髄間質細胞（ｈＢＭＳｃ）のインビトロ分化
方法：
分化培養：ｈＢＭＳｃを、分化誘導に先だって、３ヶ月間まで「増殖培地」（これは本明細書中上記の実施例１に記載される）で培養した。その後、プラスチック接着性の細胞を「前分化培地」［ＳＰＮ、２ｍＭのグルタミン、Ｎ２補充物（インスリン ２５μｇ／ｍｌ；プロゲステロン ２０ｎＭ；プトレッシン １００μＭ；セレン ３０ｎＭ；トランスフェリン １００μｇ／ｍｌ）、１０％のＦＣＳ、１０ｎｇ／ｍｌの塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）、および１０ｎｇ／ｍｌのヒト上皮増殖因子（ＥＧＦ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）が補充されたＤＭＥＭ］に移した。３７℃で２４時間インキュベーションした後、細胞を「分化用培地」［ＳＰＮ、２ｍＭのグルタミン、Ｎ２補充物（インスリン ２５μｇ／ｍｌ；プロゲステロン ２０ｎＭ；プトレッシン １００μＭ；セレン ３０ｎＭ；１ｘ１０５細胞／ｍｌの密度にされた培地；トランスフェリン １００μｇ／ｍｌ）、２００μＭのブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ；Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭのジブチリル環状ＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ；Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ；Ｓｉｇｍａ）、１０μＭのドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ；Ｓｉｇｍａ）、および１０μＭのレチノイン酸（ＲＡ；Ｓｉｇｍａ）が補充されたＤＭＥＭ］に移し、３７℃で１２時間〜７２時間インキュベーションした。
【０１４８】
増殖評価：ｈＭＢＳｃを、９６ウエルマイクロタイタープレート（１００μｌ／ウエル）に分注された「前分化培地」および「分化培地」に懸濁し、３７℃で１６時間および３９時間インキュベーションした。その後、培養物に１０μＣｉ／ｍｌの３Ｈ−チミジンを補充し、培養物をさらに４時間インキュベーションした。その後、細胞を集め、０．０５％トリプシンおよび２５ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）に懸濁し、液体シンチレーションカウンタ−を用いて分析して、細胞における３Ｈ−チミジンの取り込みレベル（これは増殖活性を示す）を測定した。
【０１４９】
結果：
プラスチック接着性の細胞は、分化誘導後の３時間もの早期に現れ、分化誘導後の７２時間において現れ続ける長い枝分かれプロセスを伴ったニューロン様の紡錘体形状を示した（図３Ａ〜図３Ｆ）。
【０１５０】
３Ｈ−チミジンの取り込みは、分化した細胞では実質的に低下していた（図４）。従って、このことは、増殖がニューロン様の分化したｂＢＭＳｃでは弱められたことを示している。
【０１５１】
実施例３
分化中のｈＢＭＳｃにおけるニューロン転写物の同定
方法
ＲＴ−ＰＣＲ：ｈＢＭＳｃを「増殖培地」または「分化培地」（本明細書中上記の実施例１〜実施例２を参照のこと）において３７℃で３時間〜７２時間インキュベーションした。総ＲＮＡを、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ＆Ｓａｃｃｈｉ（１９８７）によって記載されるようなグアニジンイソチオシアナート法を使用することによってｈＢＭＳｃから抽出した。また、総ＲＮＡは、ＲＮＡ単離キット（Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｇｅｎｔｒａ、Ｍａｎｎｅａｐｏｌｉｓ、米国）を使用して新鮮なヒトリンパ球（ドナー由来）から抽出された。これらのＲＮＡサンプルを１％アガロースのホルムアルデヒド変性ゲル電気泳動で分離して、それらの完全性を確認した。ｃＤＮＡを作製するために、ＲＮＡサンプル（０．５μｇ）を、反応混合物［１．３μＭのランダムプライマー、１ｘ緩衝液（これはＩｎｖｉｔｒｏＧｅｎｅによって供給された）、１０ｍＭのＤＴＴ、２０μＭのｄＮＴＰｓおよびＲＮａｓｅ阻害剤］に含有されるＲＴ−ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ酵素（１０ユニット）と混合し、２５℃で１０分間、４２℃で２時間、７０℃で１５分間、そして９５℃で５分インキュベーションした。得られたｃＤＮＡサンプルを、配列番号１〜２、配列番号１１〜１２、配列番号２１〜２２、配列番号２６〜２６および配列番号２９〜３０（下記の表１を参照のこと）によって示されるプライマーを使用するＰＣＲによって分析し、９４℃で１分間、５５℃〜５８℃で１分間および７２℃で１分間の３５サイクルのもとで増幅した。
表１
分化したｈＢＭＳｃにおけるニューロン転写物およびドーパミン作動性転写物を検出するための異なるエキソンに由来する上流側センスプライマーおよび下流側アンチセンスプライマー
【０１５２】
ノーザンブロット分析：ｈＢＭＳｃから抽出されたＲＮＡサンプルを、３％ホルムアルデヒドおよびＭＯＰＳが補充された１％アガロースゲルでサイズ分画して、Ｄｕｒａｌｏｎ−ＵＶＴＭメンブラン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に転写した。その後、メンブランを、ニューロンマーカーのＮＥＧＦ２（神経突起成長促進因子２）、ＮＦ−２００（ニューロフィラメント重鎖）およびＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）のための精製された３２Ｐ標識プローブと一晩ハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーション後のメンブランを数回洗浄して、保存ホスホルスクリーンに感光させ、ホスホルイメージャー（Ｃｙｃｌｏｎｅ、Ｐａｃｋａｒｄ）によってオートラジオグラフ化し、そして、ＲＮＡの等しい負荷および転写を確認するために、プローブを除き、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）のための３２Ｐ標識プローブで再ハイブリダイゼーションした。
【０１５３】
リアルタイムＰＣＲ：ニューロンマーカーＮＥＧＦ２のリアルタイム定量的ＰＣＲ分析を、Ｓｙｂｅｒｇｒｅｅｎ「ＰＣＲマスターミックス」および配列番号１７〜１８のプライマーを使用して「Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ ＤＮＡサンプル分析システム」バージョン４．６（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で行った。また、ＧＡＰＤＨのリアルタイムＰＣＲ分析を、配列番号９〜１０のプライマーを使用して、サンプル正規化のための促進された条件を提供するために行った。増幅プロトコルは、９５℃で１５秒間、５５℃で４０秒間、７２℃で４０秒間および７７℃で２０秒間の４０サイクルであった。サンプル正規化のための促進された条件が１８Ｓ ｒＲＮＡの増幅によって適用された。増幅プロトコルは、９５℃で２０秒間および６１℃で１分間の８０サイクルであった。１８Ｓ ｒＲＮＡに対する遺伝子発現の定量が、プロトコルのΔΔＣＴ法によって、また、標準曲線法から計算された。
【０１５４】
結果：
ＲＴ−ＰＣＲ分析では、分化したｈＢＭＳｃおよび非分化のｈＢＭＳｃの両方におけるニューロンマーカーのネスチン、ＮＳＥ、ＮＦ−Ｍ、ＣＤ９０、ＲＡ−ＲおよびＧＰＣ４の転写発現が示される（図５Ａ）。しかしながら、ニューロンマーカーのＮＦ−Ｈおよびネクジンの転写発現は、分化したｈＢＭＳｃにおいてだけ生じていた（図５Ａ）。
【０１５５】
リアルタイムＰＣＲ分析では、５０時間のインキュベーションの後、非分化の細胞と比較したとき、分化した細胞においてＮＥＧＦ２のｍＲＮＡの７倍の増大が示される（図５Ｂ）。
【０１５６】
ノーザンブロット分析では、ニューロンマーカーのＮＥＧＦ２、ＮＦ−２００およびＮＳＥの転写発現が分化中のｈＢＭＳｃにおいて著しく増大したことが示される（それぞれ図５Ｂ〜図５Ｄ）。
【０１５７】
実施例４
分化したｈＢＭＳｃにおけるニューロンタンパク質の同定
方法：
ウエスタンブロット：ｈＢＭＳｃから得られたタンパク質抽出物の５０マイクログラムをサンプル緩衝液（６２．５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、５％の２−β−メルカプトエタノール、０．００２５％ブロモフェノールブルー（ＳＩＧＭＡ）において変性させた（サンプルで１：５希釈し、５分間煮沸した）。各サンプルを製造者の説明書に従って１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に負荷した。電気泳動後、タンパク質をポリビニリデンジフルリドメンブラン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に転写し、その後、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＴｒｉｓ緩衝化生理的食塩水（ＴＳＢ；１０ｍＭのＴｒｉｓ（７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）における５％脱脂乳（ブロッキング溶液）を用いてブロッキング処理した。メンブランを、本明細書中下記の表２に記載されるようなニューロンマーカー特異的抗体と４℃で一晩プローブした。インキュベーション後、メンブランをブロッキング溶液で２回（それぞれ１５分）洗浄し、次いでＴＢＳ−Ｔで１回、１５分間洗浄し、その後、本明細書中下記の表３に記載されるような西洋ワサビペルオキシダーゼ共役化二次抗体にさらした。その後、メンブランをブロッキング溶液で２回（それぞれ１５分）洗浄し、次いでＴＢＳ−Ｔで１回、１５分間洗浄し、その後、増強ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）化学発光検出キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して染色し、医療用Ｘ線フィルム（Ｆｕｊｉ Ｐｈｏｔｏ Ｆｉｌｍ）に感光させた。アクチンが、誘導時の変化を評価および定量するために使用された。特定のタンパク質バンドの密度測定を、ＶｅｒｓａＤｏｃ（登録商標）画像化システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびＱｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ（登録商標）ソフトウエア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用することによって行った。
表２
ニューロンマーカー特異的抗体およびドーパミン作動性マーカー特異的抗体
表３
抗マウス二次抗体および抗ウサギ二次抗体
【０１５８】
結果：
免疫染色により、ニューロンマーカー（ＮｅｕＮ、ＮＦ−２００、ＮＳＥ）の存在が、分化誘導後の１２時間、２４時間、４８時間および４８時間の分化中のｈＢＭＳｃにおいてそれぞれ明らかにされた（図６Ａ）。抗体標識されたＧＦＡＰおよびβ−チューブリンＩＩＩが、分化誘導後の４８時間および５日のｈＢＭＳｃにおいてそれぞれ観測された（図６Ｂ）。
【０１５９】
Ｎｅｕ−Ｎタンパク質、ＮＳＥタンパク質およびネスチンタンパク質の（アクチンに対する）発現は、ウエスタンブロット分析によって示されるように、分化誘導の後では実質的に増大していた（図７Ａ〜図７Ｃ）。
【０１６０】
実施例５
分化中のｈＢＭＳｃの長期間の生存
方法：
長期分化培養：ｈＢＭＳｃを「前分化培地」（上記の実施例２を参照のこと）において３７℃で２４時間インキュベーションし、その後、「長期分化培地」［ＳＰＮ、２ｍＭのグルタミン、Ｎ２補充物（インスリン ２５μｇ／ｍｌ；プロゲステロン ２０ｎＭ；プトレッシン １００μＭ；セレン ３０ｎＭ；トランスフェリン １００μｇ／ｍｌ）、１ｍＭのｄｂｃＡＭＰ、０．５ｍＭのＩＢＭＸ、１０μＭのドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ；Ｓｉｇｍａ）、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのヒトグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、および１０ｎｇ／ｍｌのヒトβ−神経増殖因子（β−ＮＧＦ）が補充されたＤＭＥＭ］に移した。ｈＢＭＳｃをこの「長期分化培地」において３７℃で２８日間インキュベーションした。
【０１６１】
免疫アッセイ：細胞を、ポリ−Ｌ−リシン（Ｓｉｇｍａ）で無菌的に事前に処理されたスライドチャンバー（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に置き、処理した。細胞を、ＰＢＳ（ｐＨ７．３）における４％パラホルムアルデヒドを用いて４℃で３０分間、次いで室温で３０分間、固定処理した。その後、スライドをＰＢＳで３回（それぞれ５分）洗浄し、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ）および１０％ヤギ血清（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を含有するＰＢＳを用いて４℃で１０分間、次いで室温で１０分間、透過処理した。その後、スライドをＰＢＳで３回（それぞれ５分）洗浄した。内因性ペルオキシドを、無水メタノール（Ｂｉｏ−Ｌａｂ、イスラエル）における３％Ｈ２Ｏ２（Ｍｅｒｃｋ）を加えることによって室温で２０分間ブロッキング処理した。ＰＢＳにおける３回の洗浄（それぞれ５分）の後、スライドチャンバーを、本明細書中上記の実施例４における表２〜表３に記載されるように希釈された抗ＭＡＰ２、抗β−チューブリンＩＩＩまたは抗ネスチンと４℃で一晩インキュベーションした。翌日、スライドをＰＢＳにおいて３回（それぞれ１０分）徹底的に洗浄し、その後、１０％ヤギ血清および０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳにおけるＣｙ（商標）３−共役化ヤギ抗ウサギＩｇＧまたはＣｙ（商標）２−共役化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と室温で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、スライドをＰＢＳで３回（それぞれ５分）洗浄し、グリセロールビニルアルコール固定液（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で固定し、カバーガラスで覆い、蛍光顕微鏡で調べた。
【０１６２】
結果：
ｈＢＭＳｃは、典型的なニューロン様細胞の形態を「長期分化培地」での２８日間のインキュベーションの後に示した（図８）。
【０１６３】
抗体標識されたニューロンマーカーのＭＡＰ２（微小管結合タンパク質２）、β−チューブリンＩＩＩおよびネスチンが、２８日間のインキュベーションの後のｈＢＭＳｃにおいて観測された（それぞれ図９Ａ〜図９Ｃ）。
【０１６４】
実施例６
分化したｈＢＭＳｃにおけるドーパミン作動性ｍＲＮＡの発現
方法：
ＲＴ−ＰＣＲ：ｈＢＭＳｃを「増殖培地」および「分化培地」（本明細書中上記の実施例１〜実施例２を参照のこと）において１２時間〜７２時間インキュベーションした。総ＲＮＡを、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ＆Ｓａｃｃｈｉ（１９８７）によって記載されるようなグアニジンイソチオシアナート法を使用することによってｈＢＭＳｃから抽出した。ドーパミン作動性マーカーを同定するために設計されたＲＴ−ＰＣＲ法が、配列番号３〜８、配列番号１３〜１４および配列番号２７〜２８のプライマーを使用することを除いて、本質的には本明細書中上記の実施例３に記載されるように行われた。
【０１６５】
結果：
図１０において認められ得るように、数個のドーパミン作動性マーカーの転写物が、分化したｈＢＭＳｃおよび／または非分化のｈＢＭＳｃにおいて発現していた。これらには、Ｎｕｒｒ１［核受容体関連１；ドーパミンニューロンへの中脳前駆体の分化において役割を有する転写因子］およびＡＡＤＣ［芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ；Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）のドーパミンへの脱カルボキシル化、Ｌ−５−ヒドロキシトリプトファンのセロトニンへの脱カルボキシル化、およびＬ−トリプトファンのトリプタミンへの脱カルボキシル化を触媒する酵素］が含まれる。ＧＴＰ［シクロヒドロラーゼ１；ＴＨに対するテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）補因子を産生するために必要な酵素］の転写発現が、非分化のｈＢＭＳｃと比較した場合、分化したｈＢＭＳｃにおいて顕著に高くなっており、一方、Ｄ２ドーパミン受容体およびＤＡＴドーパミン輸送体の転写物が、分化したｈＢＭＳｃにおいてのみ発現していた。
【０１６６】
実施例７
分化したｈＢＭＳｃにおけるチロシンヒドロキシラーゼの誘導
方法：
リアルタイムＰＣＲ：総ＲＮＡを、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ＆Ｓａｃｃｈｉ（１９８７）によって記載されるようなグアニジンイソチオシアナート法を使用してｈＢＭＳｃから抽出した。ｃＤＮＡを、ランダムプライマーを用いてＲＴ反応を行うことによって、本明細書中上記の実施例３に記載されるように作製した。ｃＤＮＡの増幅を、ヒトＴＨおよび１８Ｓ ｒＲＮＡの特異的なプライマーを使用するＴａｑＭａｎ（登録商標）ユニバーサルＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において行った。サンプル正規化のための促進された条件が１８Ｓ ｒＲＮＡの増幅によって適用された。増幅プロトコルは、９５℃で２０秒間および６１℃で１分間の８０サイクルであった。１８Ｓ ｒＲＮＡに対する遺伝子発現の定量が、プロトコルのΔΔＣＴ法によって、また、標準曲線法から計算された。
【０１６７】
ウエスタンブロット分析： アッセイを、抗ＴＨ抗体および抗アクチン抗体を用いた免疫ブロッティングを行うことを除いて、本明細書中上記の実施例４に記載されるように行った。
【０１６８】
免疫アッセイ：アッセイを、本明細書中上記の実施例４における表２〜表３に記載されるような抗ＴＨ抗体を使用して、本明細書中上記の実施例５に記載されるように行った。
【０１６９】
結果
チロシンヒドロキシラーゼのｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルがｈＢＭＳｃのニューロン分化のときに実質的に上昇していた（それぞれ図１１Ａ〜図１１Ｂ）。また、抗体標識されたチロシンヒドロキシラーゼの存在が、分化誘導後６時間〜４８時間の分化中のｈＢＭＳｃにおいて観測された（図１１Ｃ）。
【０１７０】
実施例８
ｈＢＭＳｃにおけるドーパミン関連タンパク質の同定
方法：
免疫アッセイ：ｈＢＭＳｃを「分化培地」（本明細書中上記の実施例２を参照のこと）で５日間インキュベーションし、その後、集め、上記の実施例５に記載される手順を使用して小胞モノアミン輸送体２（ＶＭＡＴ−２）に対して特異的な抗体で染色した。細胞におけるＶＭＡＴ−２に結合している抗体を、二次のＣｙ（商標）３−共役化抗体を使用することによって可視化した。染色された細胞を、レーザー共焦点顕微鏡ＬＳＭ５１０（ＺＥＩＳＳ、ドイツ）で観測した。
【０１７１】
フローサイトメトリー：「分化培地」（本明細書中上記の実施例２を参照のこと）で４８時間インキュベーションした後、細胞を集め、０．０５％トリプシンおよび２５ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した。細胞懸濁物（０．５ｘ１０６細胞／ｍｌ）を、上記の実施例４における表２〜表３に記載されるようなＤ２ドーパミン受容体に対して特異的な抗体と３０分間インキュベーションした。抗体標識された細胞を２容量のＰＢＳで徹底的に洗浄し、フロー緩衝液（ＰＢＳにおける１％パラホルムアルデヒド、０．１％アジ化ナトリウムおよび０．５％ウシ血清アルブミン）において固定処理した。洗浄された細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析した。
【０１７２】
結果：
ｈＢＭＳｃの蛍光顕微鏡像により、抗体標識されたＶＭＡＴ２ドーパミン作動性マーカーが、分化したｈＢＭＳｃに存在し、非分化の細胞には存在しないことが明らかにされた（図１２）。
【０１７３】
同様に、フローサイトメーター分析では、ドーパミノゲニンマーカーＤ２が、分化したｈＢＭＳｃにおいて発現し、非分化の細胞では発現していなかったことが示される（図１３）。
【０１７４】
実施例９
分化中のｈＢＭＳｃによるドーパミン分泌は神経栄養性因子により誘導される
方法：
細胞培養：ｈＢＭＳｃを下記の表４に記載されるように培養した。
表４
ｈＢＭＳｃによるドーパミン分泌を誘導するために使用された培養培地
【０１７５】
ＨＰＬＣ分析：サンプルを、８８μｌの８５％オルトリン酸および４．４ｍｇのメタ重亜硫酸塩を ｍｌのサンプルに加えることによって安定化させた。ドーパミンをアルミニウム吸着（アルミナ、Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）によって抽出した。注入サンプル（５０μｌ）の分離は、逆相Ｃ１８カラム（１２５Ｘ４．６ｍｍ直径、Ｈｉｃｈｒｏｍ，Ｉｎｃ．）をモノクロロ酢酸塩緩衝液移動相において用いたＨＰＬＣ−電子化学検出（ＨＰＬＣ−ＥＣＤ）システムでのイソクラティック溶出によって達成された。流速が１．２ｍｌ／分で設定され、分析セルの酸化電位が＋６５０ｍＶで設定された。結果は、様々な緩衝液条件および検出器設定のもとでのドーパミン標準物との同時溶出によって確認された。
【０１７６】
結果：
分化中のｈＢＭＳｃの上清における測定されたドーパミンの量は、「ドーパミン作動性分化用培地」での７２時間のインキュベーション期間中、検出できないレベルから約２３ｎｇ／ｍｌ（１０５細胞）に増大した（図１４Ａ）。ＫＣｌによって細胞分極を誘導すること（５６ｍＭのＫＣｌを培地に補充し、その後、１０分間のインキュベーションを行うこと）により、ドーパミン分泌がさらに高まった（図１４Ｂ）。分化中のｈＢＭＳｃにより合成されたＤＯＰＡ（ドーパミン前駆体）の量は、「ドーパミン作動性分化用培地」での７２時間のインキュベーション期間中、約１０ｐｇ／ｍｌから３００ｐｇ／ｍｌ（１０５細胞）に増大し（図１４Ｃ）、一方、ＤＯＰＡＣ（ドーパミン代謝産物）の量は、「ドーパミン作動性分化用培地」での５０時間のインキュベーション期間中、検出できないレベルから約１０５ｎｇ／ｍｌ（１０５細胞）に増大した（図１４Ｄ）。
【０１７７】
実施例１０
パーキンソン病についてのラットモデルの線条体におけるマウスＢＭＳｃの移植は回旋行動を改善する
方法：
マウス骨髄間質細胞（マウスＢＭＳｃ）の作製：マウスＢＭＳ細胞を、強化緑色蛍光タンパク質を保有する遺伝子組換え雄マウス（Ｔｇ−ＥＧＦＰ；Ｈａｄｊａｎｔｏｎａｋｉｓ他、１９９８）から得た。マウスを頚部脱臼によって屠殺し、脛骨および大腿骨を取り出し、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に入れた。マウス骨髄細胞を、０．５ｍｌの無菌ＨＢＳＳを詰めた、２５Ｇニードルを有するシリンジ（１ｍｌ）を使用して骨髄を流し出すことによって回収した。回収された細胞を、牛乳のような均質な単一細胞懸濁物が達成されるまで穏やかにピペッティングを繰り返すことによって解離させた。単一細胞懸濁物を５ｍｌのＨＢＳＳにおいて洗浄し、室温で２０分間、１０００ｇのもとで遠心分離した。遠心分離後、上清を捨て、細胞ペレットを１０ｍｌの成長培地に再懸濁した。
【０１７８】
細胞培養：単離されたマウス骨髄細胞を「増殖培地」（本明細書中上記の実施例１を参照のこと）で培養し、３７℃で４８時間インキュベーションした。その後、非接着性の層を捨て、強固に接着した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、新鮮な「増殖培地」で培養した。成長培地を、細胞が７０％〜９０％の密集度に達するまで３日毎〜４日毎に取り替えた。その後、細胞を集め、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（ＰＢＳにおける０．０５％のトリプシンおよび２５ｍＭのＥＤＴＡ）に混合し、３７℃で５分間インキュベーションし、その後、「前分化培地」（本明細書中上記の実施例２を参照のこと）に移し、３７℃で７２時間さらにインキュベーションした。前分化させた細胞をＰＢＳにおいて洗浄し、「分化培地」（本明細書中上記の実施例１を参照のこと）において３７℃で１２時間〜７２時間インキュベーションすることによる神経様分化のために誘導した。
【０１７９】
マウスＢＭＳｃの移植：神経分化した骨髄間質細胞（ｍＢＭＳｃ）を、（Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ他（２００２）によって記載されるように）定位固定フレームを使用して雌６−ＯＨＤＡ障害ラットの黒質に注射した。生理的食塩水の注射が対照として使用された。
【０１８０】
回旋行動の分析：６−ＯＨＤＡ障害ラットを、回旋行動を誘導するためにアンフェタミン（５ｍｇ／ｋｇ）で治療した。アンフェタミンに対する回旋応答が、コンピューター処理される回旋計（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使用して、移植後の３日目、１５日目、３０日目および４５日目に調べられた。
【０１８１】
結果：
アンフェタミン誘導された６−ＯＨＤＡラットへのニューロン誘導ｍＢＭＳｃの移植により、ラットの回旋行動は、移植後４５日目に２時間あたり約３４０回転からたった２５回転に著しく減少していた（図１５Ａ）。治療されたラットの相対的な回旋速度は、移植後４５日目に、生理的食塩水で治療されたラットと比較して９７．９％減少していた（図１５Ｂ）。
【０１８２】
実施例１１
ラット脳における移植されたマウスＢＭＳｃの生存および移動
方法：
ニューロン分化したＴｇ−ＥＧＥＦマウスのＢＭＳｃを、本明細書中上記の実施例１０に記載されるように、調製し、６−ＯＨＤＡラットの黒質（両方の脳半球）に移植した。治療ラットおよび非治療ラット（生理的食塩水のみ）を移植後４５日目に屠殺した。障害ラットおよび非障害ラットの脳半球から得られた組織サンプルを切片化して、移植されたｍＢＭＳｃの印となっている緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の存在について蛍光顕微鏡で観察した。
【０１８３】
結果：
ｍＢＭＳｃは、黒質移植後４５日目に、治療ラットの黒質において生存しており（図１５Ｃ）、治療ラットの線条体に移動していた（図１５Ｄ）。また。移植された細胞は皮質および線条体への移動に成功していた（図１５Ｃ〜図１５Ｄ）。生理的食塩水が注射されたラットでは、回旋行動は変化がなかった。
【０１８４】
実施例１２
稀突起神経膠細胞前駆体に分化したマウスＢＭＳｃ
方法：
細胞培養：マウスＢ５／ＥＧＦＰ（雄）を頚部脱臼によって屠殺し、７０％アルコール溶液を用いて調製した。脛骨および大腿骨を取り出し、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｔ−Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）に入れ、マウス骨髄細胞を、０．５ｍｌの無菌ＨＢＳＳを詰めた、２５Ｇニードルを有するシリンジ（１ｍｌ）を使用して骨髄を流し出すことによって回収した。細胞を、牛乳のような均質な単一細胞懸濁物が達成されるまで数回、穏やかにピペッティングすることによって解離させた。骨髄吸引物を希釈し、５ｍｌのＨＢＳＳを加え、室温（ＲＴ）で２０分間、１０００ｇで遠心分離し、上清を除くことによって洗浄した。細胞ペレットを１ｍｌの成長培地に再懸濁し、１０ｍｌに希釈した。細胞を、ポリスチレンのプラスチック組織培養用の７５ｃｍ２フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）において、「増殖培地」（本明細書中上記の実施例１を参照のこと）に１週間入れた。その後、細胞を、「増殖培地」が補充されたポリリシン被覆のスライドチャンバー（３２００細胞／ウエル）に移し、３７℃で２４時間インキュベーションした。その後、成長培地を、２ｍＭのグルタミン、ＳＰＮ、下記物質の１つまたは複数が補充されたＤＭＥＭから構成される「稀突起神経膠細胞分化培地」で置き換えた：ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ）、インターロイキン−１ｂ（２０ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌ）、ｄｂｃＡＭＰ（１ｍＭ〜２ｍＭ）、レチノイン酸（０．５μＭまたは１μＭ）、ニューロトロフィン−３（５０ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒト血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＡＡ；５ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｎ２補充物、トリヨードチロニエン（Ｔ３；４０ｎｇ／ｍｌ）および毛様体神経栄養因子（２０ｎｇ／ｍｌ；ＣＮＴＦ）。
【０１８５】
免疫アッセイ：培養物を、１日間、２日間または６日間（成長培地を新鮮な培地で２日毎に置き換えながら）、３７℃でインキュベーションして、４％ＰＦＡにおいて固定処理した。細胞を１０％ＦＣＳ溶液においてブロッキング処理し、その後、５ｕｇ／ｍｌの抗Ａ２Ｂ５モノクローナル抗体（１：２００；Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ；１：２００）と４℃で一晩インキュベーションした。その後、細胞を、ＰＢＳにおいて１０分間、２回洗浄し、ヤギ抗マウスＣｙ−３二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；１：５００）と室温で２０分間インキュベーションした。Ａ２Ｂ５（稀突起神経膠細胞前駆体の初期マーカー）について陽性に染色された細胞の出現を、Ｉｍａｇｅ ＰｒｏＰｌｕｓ細胞計数プログラム（Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を備える蛍光顕微鏡を使用して測定した。
【０１８６】
結果：
ニューロン的な細胞形態が、誘導物質のいずれか１つ（ＩＬ−１ｂ、ｄｂｃＡＭＰ、レチノイン酸またはＮＴ−３）を単独で用いて培養された、２４時間のインキュベーションの後の細胞において観測された。細胞形態に対する最も顕著な影響が、ｄｂｃＡＭＰおよびＮＴ−３によって誘導され（図２０Ａ）、同様に、ＩＬ−６および甲状腺因子３によって誘導された（データは示されず）。
【０１８７】
細胞の生存は、誘導物質のいずれか１つを単独で（いずれかの濃度で）用いて６日間インキュベーションした後において正常であった。他方で、誘導物質が組み合わせられたときには、細胞の生存が低下した。
【０１８８】
稀突起神経膠細胞始原細胞のマーカーＡ２Ｂ５について陽性に染色された細胞の出現は全体で８％であった。抗体標識されたＡ２Ｂ５の最高の出現が、ＮＴ−３で治療された細胞において見出された（図２０Ｂ）。
【０１８９】
従って、ＢＭＳｃは、多発性硬化症を治療するために利用され得る稀突起神経膠細胞（ミエリン産生細胞）の前駆体に分化させるために誘導されることができる。
【０１９０】
実施例１３
筋萎縮性脊索硬化症（ＡＬＳ）における細胞置換
方法：
動物：変異したヒトスーパーオキシドジスムターゼ−１遺伝子（ＳＯＤ１；Ｇｕｒｎｅｙ他、１９９４）を発現するＴｇＮ（ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ遺伝子組換えマウスがＣＳＪＦ１において交配された。この遺伝子組換えマウスは３月齢までは健康であったが、その後、ＡＬＳが悪化し、４月齢〜５月齢で完全に麻痺した。
【０１９１】
移植：ニューロン分化した雄マウスＢＭＳｃを本明細書中上記の実施例１０に記載されるように得た。細胞を雌の変異ＳＯＤ１遺伝子組換えマウスおよび野生型マウスの脊髄（大槽）内に注射した（１０５細胞／注射；治療群あたり５匹の動物による反復）。生理的食塩水の注射が対照として使用された。
【０１９２】
運動機能の評価：治療マウスおよび非治療マウス（生理的食塩水のみ）の回旋行動が、回旋計（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使用することによって毎週評価された。
【０１９３】
結果：
ＳＯＤ１を発現するマウスは、７週目以降からの回旋成績の実質的な低下および４ヶ月後〜５ヶ月後での完全な麻痺によって示されるように筋萎縮性脊索硬化症（ＡＬＳ）に罹患した（図２１）。
【０１９４】
ＰＣＲ分析では、（雄由来の移植された細胞を示す）Ｙ染色体が、治療された雌マウスの脊髄に存在することが検出された。Ｙ染色体は、治療された雌マウスのどの他の組織においても検出されなかった（図２２）。
【０１９５】
７週齢の治療された野生型の回旋行動は、非治療（生理的食塩水のみ）の野生型マウスとは著しく異なっていなかった（図２３）。他方で、治療されたＳＯＤ１マウスは、運動機能の改善を示す回旋行動の実質的な低下を示した（図２４）。
【０１９６】
実施例１４
Ｎｕｒｒ１発現ベクターの構築
核受容体関連１（Ｎｕｒｒ−１）は、ドーパミンニューロンへの中脳前駆体の分化に関与する転写因子である。ヒトＮｕｒｒ１の全長ｃＤＮＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿１７３１７１）を、５’ＢａｍＨＩプライマーおよび３’ＸｂａＩプライマー（配列番号３１〜３２によって示されるプライマー）を使用して、高忠実Ｔａｑポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ、日本）を使用して増幅した。増幅のＰＣＲ条件は下記の通りであった：９５℃で１分間、５６℃で１分間、７２℃で１分間の１０サイクル；９５℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間の１０サイクル；９５℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で１分間の１０サイクル。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＸｂａＩの制限酵素で消化し、得られたフラグメントを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を使用して、図１７に例示されるような発現ベクターｐｃＤＮＡ−３．１Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）に挿入し、クローン化した。
【０１９７】
ヒト骨髄間質細胞（ｈＢＭＳｃ；６０％〜８０％のコンフルエンス）を、ＦｕＧＥＮＥ−６トランスフェクション試薬を製造者の推奨法（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）に従って使用してｐｃＤＮＡＮｕｒｒ１でトランスフェクションした。安定的にトランスフェクションされた細胞を、５００μｇ／ｍＬのネオマイシン（Ｇ４１８硫酸塩、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を含有する成長培地で単離した。総ＲＮＡを、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ＆Ｓａｃｃｈｉ（１９８７）によって記載されるように、単離されたネオマイシン抵抗性ｈＢＭＳｃから抽出し、Ｎｕｒｒ１転写物の存在を、本明細書中上記の実施例３に記載されるようなＲＴ−ＰＣＲ手法を使用して確認した。
【０１９８】
実施例１５
チロシンヒドロキシラーゼのドキシサイクリン調節による発現のためのｈＢＭＳｃの形質転換
誘導可能なチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）発現を、下記のように構築され得る応答性ベクターおよび調節ベクターでｈＢＭＳｃを形質転換することによって達成することができる。
【０１９９】
ＴＨ応答性ベクター：１．５ｋｂのヒトチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子（ＴＨ、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０００３６０）を、高忠実Ｔａｑポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ、日本）、配列番号３９〜４０により示されるプライマーを使用するＰＣＲによってヒトｃＤＮＡから単離することができる。ＴＨのｃＤＮＡは、図１９Ａに例示されるようなｐＢＩ−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｔｅｔ−Ｏｆｆ（商標）遺伝子発現システムおよびＴｅｔ−Ｏｎ（商標）遺伝子発現システム）に挿入される。
【０２００】
ＴＨ調節ベクター：１．３ｋｂのヒトＮＳＥ遺伝子（ＨＳＥＮＯ２、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセション番号Ｘ５１９５６）のプロモーターが、配列番号３７〜３８のプロモーターを使用するＰＣＲによってヒトｃＤＮＡから単離される。ＮＳＥプロモーターのｃＤＮＡは、その後、図１９Ａに例示されるように、５−ＬＴＲ−Ψ＋の代わりに、ｐＲｅｖＴｅｔ−Ｏｆｆ−ＩＮ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）において転写活性化因子遺伝子（ｔＴＡ；Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＢｕｊａｒｄ，Ｈ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７〜５５１、１９９２）の上流に挿入される。ｎｅｏｒ遺伝子を有する陽性のクローンが、抗生物質ネオマイシンを使用して選択される。
【０２０１】
ｈＢＭＳｃは、本明細書中上記で記載される形質転換方法のいずれかを使用して応答性ベクターおよび調節ベクター（Ｔｅｔ−ｏｆｆ／Ｔｅｔ−ｏｎシステム）の両方で形質転換することができる。細胞に導入されると、テトラサイクリンにより制御されるトランス活性化因子（ｔＴＡ）と、ネオマイシン抵抗性をコードする遺伝子（Ｎｅｏｒ）との間に存在する内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む調節ベクターにより、これら２つのエレメントが同時に発現される。発現したｔＴＡは、応答ベクターに存在するテトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）と結合し、それによりＴＨの転写を活性化する。しかしながら、ドキシサイクリン（血液脳関門を横断する抗生物質）が存在する場合、ＴＲＥに対するｉＴＡの結合が阻止され、それにより、ＴＨの転写が停止させられる。ＴＨのこの薬物制御された発現が図１９Ｂに概略的に図示される。
【０２０２】
従って、ｈＢＭＳｃは、経口投与することができるドキシサイクリンなどの負の調節因子の制御下でＴＨを発現するように遺伝子改変することができる。
【０２０３】
ＴＨの発現はドーパミンの合成をもたらすので、遺伝子改変されたｈＢＭＳｃは、パーキンソン病などの神経変性疾患の安全かつ効果的な治療を提供するために細胞置換治療において使用することができる。
【０２０４】
ＴＨの発現を誘導する作用物を使用する正の調節もまた、例えば、ＴＨ遺伝子を含有する応答性ベクターｐＤＨＳＰと、調節因子ベクターｐＶｇＲＸＲとを利用するエクジソン誘導可能な哺乳動物発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して達成され得ることが理解される。誘導因子（例えば、ポナステロンＡまたはムリステロンＡ）が存在する場合、機能的なエクジソン受容体がエクジソン応答性プロモーターの上流側で結合し、ＴＨの発現を活性化する。
【０２０５】
分かりやすくするため別個の実施態様で説明されている本発明のいくつもの特徴は、組み合わせて単一の実施態様にして提供することもできることは分かるであろう。逆に簡略化するため単一の実施態様で説明されている本発明の各種特徴は、別個に又は適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０２０６】
本発明を、その具体的実施態様とともに説明してきたが、多くの代替、変形及び変更が当業技術者には明らかであることは明白である。したがって、本発明は、本願の特許請求の範囲の精神と広い範囲内に入っているこのような代替、変形及び変更をすべて含むものであることを意図する。本明細書に記載のすべての刊行物、特許及び特許願及びＧｅｎＢａｎｋは、あたかも、個々の刊行物、特許又は特許願及びＧｅｎＢａｎｋ各々が、本願に具体的にかつ個々に参照して示されているように、本願に援用するものである。さらに、本願における任意の文献の引用もしくは確認は、このような文献が本発明に対する従来技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０２０７】
【図１】非分化のヒト骨髄間質細胞（ｈＢＭＳｃ）の光学顕微鏡像を例示する（図１Ａ〜図１Ｃ）。
【図２】非分化ｈＢＭＳｃのフローサイトメーター分析を例示する。
【図３】ニューロンに分化した成人ｈＢＭＳｃの光学顕微鏡像を例示する。
【図４】「分化用培地」で培養されたｈＢＭＳｃ、および「前分化用培地」（下記の実施例の実施例２を参照のこと）で培養されたｈＢＭＳｃにおける３Ｈ−チミジン取り込み（これは細胞増殖を示す）を例示する。
【図５ａ】ニューロン転写物を同定するために計画されたＲＴ−ＰＣＲ分析を例示する。
【図５ｂ】ＮＥＧＦ２の３２Ｐ標識されたＰＣＲ産物をプローブとして利用したノーザンブロット分析およびリアルタイムＰＣＲ分析を例示する。
【図５ｃ−ｄ】図５Ｃは、ニューロフィラメント２００（ＮＦ−２００）の３２Ｐ標識されたＰＣＲ産物をプローブとして利用したノーザンブロット分析を例示する。図５Ｄは、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）の３２Ｐ標識されたＰＣＲ産物をプローブとして利用したノーザンブロット分析を例示する。
【図６】「分化培地」（下記の実施例の実施例２を参照のこと）で１２時間〜５日間培養されたｈＢＭＳｃにおけるニューロンマーカーの蛍光顕微鏡像を例示する（図６Ａ〜図６Ｂ）。図６Ａは、抗体で標識されたニューロン核特異的マーカー（ＮｅｕＮ；１２時間後に発現した）、ニューロフィラメント重鎖（ＮＦ−２００；２４時間後に発現した）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ；４８時間後に発現した）およびネスチン（４８時間後に発現した）を例示する。図６Ｂは、抗体で標識されたグリア原線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ；４８時間後に発現した）およびβ−チューブリンＩＩＩ（５日後に発現した）を例示する。
【図７ａ−ｂ】ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ；図７Ａ）、ニューロン核特異的マーカー（ＮｅｕＮ；図７Ｂ）およびネスチン（図７Ｃ）の上昇した発現を示す、分化したｈＢＭＳｃのウエスタンブロット分析を例示する。
【図７ｃ】ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ；図７Ａ）、ニューロン核特異的マーカー（ＮｅｕＮ；図７Ｂ）およびネスチン（図７Ｃ）の上昇した発現を示す、分化したｈＢＭＳｃのウエスタンブロット分析を例示する。
【図８】「長期分化培地」（下記の実施例の実施例５を参照のこと）で２８日間インキュベーションした後におけるニューロン様の分化したｈＢＭＳｃの光学顕微鏡像を例示する。
【図９ａ】分化した細胞におけるニューロンマーカーのβ−チューブリンＩＩＩの抗体標識された発現を例示する。
【図９ｂ】分化した細胞におけるニューロンマーカーのＭＡＰ−２の抗体標識された発現を例示する。
【図９ｃ】分化した細胞におけるニューロンマーカーのネスチンの抗体標識された発現を例示する。
【図１０】「分化培地」（下記の実施例の実施例２を参照のこと）で１２時間〜７２時間培養されたｈＢＭＳｃにおけるドーパミン作動性マーカーを同定するために計画されたＲＴ−ＰＣＲ分析を例示する。
【図１１ａ−ｂ】図１１Ａは、分化した細胞における上昇したＴＨ転写を示すリアルタイムＰＣＲ分析を例示する（図１１Ａ〜図１１Ｃ）。図１１Ｂは、分化した細胞におけるＴＨの上昇したレベルを示すウエスタンブロット分析を例示する。
【図１１ｃ】分化した細胞における抗体標識されたＴＨ発現を強調する蛍光顕微鏡像を例示する。
【図１２】分化した細胞における抗体標識された小胞モノアミン輸送体２（ＶＭＡＴ−２）を強調する、「分化培地」（下記の実施例の実施例２を参照のこと）で５日間インキュベーションされたｈＢＭＳｃの共焦点蛍光顕微鏡像を例示する。
【図１３】「分化培地」（下記の実施例の実施例２を参照のこと）で４８時間インキュベーションされたｈＢＭＳｃのフローサイトメーター分析を例示する。
【図１４ａ−ｂ】図１４Ａは、「分化培地」（下記の実施例の実施例２を参照のこと）で０〜９６時間インキュベーションされたｈＢＭＳｃの上清における測定されたドーパミンのレベルを例示する。図１４Ｂは、「分化培地」で０〜９６時間インキュベーションされ、その後、５６ｍＭのＫＣｌ溶液において１０分間さらにインキュベーションされたｈＢＭＳｃの上清における測定されたドーパミンのレベルを例示する。
【図１４ｃ−ｄ】図１４Ｃは、「分化培地」で０〜７２時間インキュベーションされたｈＢＭＳｃの上清における測定されたドーパミン前駆体ＤＯＰＡのレベルを例示する。図１４Ｄは、「分化培地」で０〜５０時間培養されたｈＢＭＳｃの上清における測定されたドーパミン代謝産物ＤＯＰＡＣのレベルを例示する。
【図１５ａ−ｂ】図１５Ａは、移植後の経時的な回旋速度の変化を例示し、低下しつつある回旋（これは運動機能の改善を示す）を移植後４５日目に示している。図１５Ｂは、移植後の経時的な（非治療マウスと比較したときの）相対的回旋における変化を例示し、相対的回旋の９７．９％の減少を移植後４５日目に示している。
【図１５ｃ−ｄ】図１５Ｃは、移植後４５日目の治療されたマウスの黒質に存在する移植されたｍＢＭＳｃを強調する蛍光顕微鏡像を例示する。図１５Ｄは、黒質移植後４５日目の治療されたマウスの線条体に存在する移植されたｍＢＭＳｃを強調する蛍光顕微鏡像を例示する。
【図１６ａ−ｂ】図１６Ａは、トリプトファンヒドロキシラーゼの発現を示すウエスタンブロット分析を例示する。図１６Ｂは、トリプトファンヒドロキシラーゼの転写を示すＲＴ−ＰＣＲ分析を例示する
【図１６ｃ】ＤＯＰＡＣ（ドーパミン代謝産物）および５ＨＩＡＡ（セロトニン代謝産物）の合成を示すＨＰＬＣ分析を例示する。
【図１７】ｐｃＤＮＡ−３．１Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）に挿入されたＮｕｒｒ−１コード配列を含有する発現ベクターの構築物を例示する。
【図１８】ドーパミン作動性細胞の負の選択のために設計された構築物を例示する。
【図１９ａ】このシステムの調節因子構築物および応答構築物を例示する。
【図１９ｂ】このシステムの作用様式を記載する概略図を例示する。
【図２０】ＧＦＰ−Ｔｇマウスの分化したＢＭＳｃ（ｍＢＭＳｃ）の蛍光顕微鏡像を例示する（図２０Ａ〜図２０Ｂ）。図２０Ａは、「分化培地」（実施例１参照）により誘導される形態学的変化の蛍光顕微鏡像を例示する。図２０Ｂは、ＮＴ−３誘導のｍＢＭＳｃにおいて発現する抗体標識されたＡ２Ｂ５（稀突起神経膠細胞前駆体のマーカー）を強調する蛍光顕微鏡像を例示する。
【図２１】ＳＯＤ１を発現するマウス（筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の動物モデル）の回旋成績における経時変化を例示する。
【図２２】雄由来のｍＢＭＳｃが大槽内に移植された後の１週間目にサンプリングされた雌マウスの種々の組織のＰＣＲ分析を例示する。
【図２３】７週齢のときにその脊髄内へのｍＢＭＳｃ移植を受けた野生型マウスのロータロド（ｒｏｔａｒｏｄ）成績（回旋行動を示す）を例示する。
【図２４】７週齢のときにその脊髄内へのｍＢＭＳｃ移植を受けたＳＯＤ１マウス（筋萎縮性側索硬化症のモデル）のロータロド成績（回旋行動を示す）を例示する。
【配列表フリーテキスト】
【０２０８】
配列番号１〜４０は一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列である。
【配列表】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経伝達物質の制御が可能な合成を行うことができるニューロン様細胞、および、パーキンソン病などの神経変性障害を治療するために細胞を使用する細胞置換治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病は、震せん、固縮および運動失調などの症状を介して現れる運動機能の進行性消失がやがてはもたらされる中脳の黒質におけるドーパミン産生ニューロンの進行性消失によって特徴づけられる加齢に関連した障害である。パーキンソン病は、薬理学的用量のドーパミン前駆体Ｌ−ＤＯＰＡを投与することによって治療することができる（Ｍａｒｓｄｅｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、９：５１２、１９８６；Ｖｉｎｋｅｎ他、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、１８５頁、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｒｓｔｅｒｄａｍ、１９８６）。そのような治療は初期段階のパーキンソン病患者では効果的であるが、黒質細胞の進行性消失は、最終的には、残存細胞が、投与された前駆体から十分なドーパミンを合成することができないこと、および、薬効の低下をもたらす。
【０００３】
神経変性疾患の研究では、病気に苦しむ人々において生じる症状は、局所的な神経回路における不具合に対して二次的であり、全身的な薬物送達を用いて効果的に治療することができないことが示唆される。その結果、神経変性疾患を治療するための代わりの方法、例えば、損傷したニューロンの機能を置換または補充することができる細胞の移植などの方法が出現している。そのような細胞置換治療が機能するためには、移植された細胞が、損傷した組織の中で生存し、かつ、機能的および構造的にその両方で一体化しなければならない。
【０００４】
パーキンソン病は、大脳内細胞置換治療がヒトにおいて使用された脳の最初の疾患である。いくつかの試みが、副腎髄質細胞を患者の脳に同種移植することによって、神経伝達物質のドーパミンをパーキンソン病患者の病変した脳幹神経節に提供するために行われている（Ｂａｃｋｌｕｎｄ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．、６２：１６９〜１７３、１９８５；Ｍａｄｒａｚｏ他、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３１６：８３１〜８３６、１９８７）。黒質（これは、ドーパミンを含有する細胞体が多い脳の領域であり、また、パーキンソン病において最も冒される脳の領域でもある）由来の胎児脳細胞などの他のドナー細胞の移植は、選択的なドーパミン作動性神経毒によって誘導される行動的欠損を逆行させることにおいて部分的に効果的であることが示されている（Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ他、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、４５７：５３〜８１、１９８６；Ｄｕｎｎｅｔｔ他、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｕｅｒｏｓｃｉ．、６：２６６〜２７０、１９８３）。
【０００５】
異なる供給源に由来する様々な非ニューロン細胞タイプを利用したいくつかの細胞置換研究もまたこの数年間にわたって行われている。パーキンソン病の動物モデルにおいて、研究者は、単球、骨髄幹細胞、筋芽細胞、繊維芽細胞、星状膠細胞およびセルトリ細胞などの細胞を移植している（Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ他、２０００；Ｈｗａｎ−Ｗｕｎ他、１９９９；Ｌｉｎｄｅｒ他、１９９５；Ｐａｔｒｉｄｇｅ＆Ｄａｖｉｅｓ、１９９５；Ｐｅｒｒｙ＆Ｇｏｒｄｏｎ、１９９８；Ｙａｄｉｄ他、１９９９）。他の研究では、細胞が、生存率を高めるために増殖因子遺伝子（例えば、グリア由来増殖因子および脳由来増殖因子）で遺伝子操作された後で移植され、あるいは、チロシンヒドロキシラーゼ、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼまたはＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ（これらは、形質転換された細胞におけるドーパミン合成を増大させることができる）などの遺伝子で遺伝子操作された後で移植された（Ｃｈｏｉ−Ｌｕｎｄｂｅｒｇ他、１９９８；Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ他、１９９５；Ｓｃｈｗａｒｚ他、１９９９）。しかしながら、これらの細胞は、損傷したニューロン細胞の構造的および機能的な特徴を完全に獲得することができず、従って、治療的に効果的でないことが判明した（Ｂｒｕｎｄｉｎ他、２０００）。
【０００６】
パーキンソン病患者のための臨床的細胞置換試験が、ドーパミン作動性ニューロンを１〜２％のみ含む胎児細胞を使用して行われている（Ｆｒｅｅｄ他、１９９２；Ｆｒｅｅｄ他、２００１；Ｆｒｅｅｍａｎ他、１９９５；Ｋｏｒｄｏｗｅｒ他、１９９５；Ｋｏｒｄｏｗｅｒ他、１９９８；Ｌｉｎｄｖａｌｌ Ｏ．、１９９１；Ｗｅｎｎｉｎｇ他、１９９７）。Ｆｒｅｅｄ他（２００１）は、パーキンソン病患者に対する胎児細胞の移植が若い患者（６０歳未満）に対してのみ有益であったことを見出した。さらに、幾人かの患者は、移植された細胞によるドーパミンの過度かつ制御されない産生および放出のために、レボドパ治療がない場合、重篤なジスキネジー（「遁走（ｒｕｎａｗａｙ）ジスキネジー」）に悩まされた（Ｆｒｅｅｄ他、２００１；Ｏｌａｎｏｗ他、２００３）。また、ヒト胎児組織の入手性が低いことにより、胎児細胞の移植から利益を受け得る患者の数が実質的に制限されている。
【０００７】
成人骨髄間質細胞（ＢＭＳｃ）は非造血系の細胞であり、様々なニューロンマーカー（Ａｚｉｚｉ他、１９９８；Ｄｅｎｇ他、２００１；Ｋｏｐｅｎ他、１９９９；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓ他、２０００；Ｓｃｈｗａｒｚ他、１９９９；Ｗｏｏｄｂｕｒｙ他、２０００）、電気生理学的機能（Ｋｏｈｙａｍａ他、２００１）、および、チロシンヒドロキシラーゼのインビボ発現（Ｓｃｈｗａｒｚ他、１９９９）を示すニューロン様細胞に分化することができる。そのうえ、パーキンソン病のマウスモデルおよびラットモデルにおけるＢＭＳｃの移植は有益な効果をもたらした（Ｌｉ他、２００１；Ｓｃｈｗａｒｚ他、１９９９）。
【０００８】
成人ＢＭＳｃは、移植に構造的に適合し得るニューロン様細胞に分化することができるが、生着したＢＭＳｃはドーパミンなどの神経伝達物質を制御不能に放出するかもしれず、このことは、「遁走遁走ジスキネジー」などの重篤な副作用をやがて引き起こす可能性があり、従って、ＢＭＳｃの使用を神経変性障害の治療のために不適にしている。
【０００９】
従って、損傷したニューロン組織への一体化が可能であり、また、ドーパミンなどの神経伝達物質を制御可能に合成することがさらに可能であり、従って、神経変性障害を効果的かつ安全に治療するために利用することができるニューロン様細胞が必要であることが広く認識されており、そのようなニューロン様細胞を有することは非常に好都合であると考えられる。
【発明の開示】
【００１０】
本発明の１つの態様によれば、神経伝達物質の外因的に調節可能な合成が可能であり、それにより神経変性障害を治療することができる細胞を、その必要性のある個体に投与することを含む、神経変性障害を治療する方法が提供される。
【００１１】
本発明の別の態様によれば、（ａ）神経伝達物質の外因的に調節可能な合成が可能である細胞を、その必要性のある個体に投与する工程、および（ｂ）細胞における神経伝達物質の合成を調節することができる作用物または条件に個体を定期的にさらし、それにより神経変性障害を治療する工程を含む、神経変性障害を治療する方法が提供される。
【００１２】
本発明のさらに別の態様によれば、神経伝達物質の合成に関係する酵素をコードするポリヌクレオチド配列を、哺乳動物細胞におけるその酵素の発現を調節することができる調節配列の制御下に配置されて含む核酸構築物が提供される。
【００１３】
本発明のなお別の態様によれば、神経伝達物質の合成に関係する酵素をコードする第１のポリヌクレオチド配列を第１の調節配列の転写制御下に配置されて含む第１の発現構築物と、トランス活性化因子をコードする第２のポリヌクレオチド配列を第２の調節配列の転写制御下に配置されて含む第２の発現構築物とを含む構築物システムが提供され、この場合、トランス活性化因子は、第１の調節配列を活性化して、第１のポリヌクレオチド配列の転写を行わせることができる。
【００１４】
本発明のさらなる態様によれば、神経伝達物質の合成に関係する酵素をコードするポリヌクレオチド配列を、細胞におけるその酵素の発現を調節することができる調節配列の制御下に配置されて含む核酸構築物を含む細胞が提供される。
【００１５】
本発明のさらにさらなる態様によれば、神経伝達物質の合成に関係する酵素をコードする第１のポリヌクレオチド配列を第１の調節配列の転写制御下に配置されて含む第１の発現構築物と、トランス活性化因子をコードする第２のポリヌクレオチド配列を第２の調節配列の転写制御下に配置されて含む第２の発現構築物とを含む構築物システムを含む細胞が提供される。この場合、トランス活性化因子は、第１の調節配列を活性化して、第１のポリヌクレオチド配列の転写を行わせることができる。
【００１６】
本発明のなおさらなる態様によれば、神経変性障害を治療する際に使用される細胞を作製する方法が提供される。この方法は、（ｉ）骨髄細胞を単離する工程、（ｉｉ）骨髄細胞を維持および／または拡大することができる増殖用培地において骨髄細胞をインキュベーションする工程、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から得られる細胞から骨髄間質細胞を選択する工程、および（ｉｖ）少なくとも１つの多不飽和脂肪酸および少なくとも１つの分化用作用物を含む分化用培地において骨髄間質細胞をインキュベーションし、それにより、神経変性障害を治療する際に使用される細胞を作製する工程を含む。
【００１７】
本発明のさらにさらなる態様によれば、神経伝達物質を合成することができる骨髄由来間質細胞を含む細胞集団が提供される。
【００１８】
本発明のなおさらなる態様によれば、少なくとも２つのタイプの神経伝達物質を合成することができる骨髄由来間質細胞を含む混合細胞集団が提供される。
【００１９】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、神経変性障害を治療する方法は、細胞における神経伝達物質の合成を調節することができる作用物または条件に個体をさらすことをさらに含む。
【００２０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞は、神経伝達物質の外因的に調節可能な合成が可能であるように遺伝子改変される。
【００２１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞は、神経伝達物質の合成に関係する酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現構築物で形質転換される。この場合、発現構築物は、ポリヌクレオチドの発現が前記作用物により制御可能であるように設計される。
【００２２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、作用物は、神経伝達物質の合成に関係する酵素の発現をダウンレギュレーションすることができる。
【００２３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、作用物は、神経伝達物質の合成に関係する酵素の発現をアップレギュレーションすることができる。
【００２４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞は、第１の調節配列の転写制御下に配置された、神経伝達物質の合成に関係する酵素をコードする第１のポリヌクレオチド配列と、第２の調節配列の転写制御下に配置された、トランス活性化因子をコードする第２のポリヌクレオチド配列とを含む少なくとも１つの発現構築物で形質転換される。この場合、トランス活性化因子は、前記作用物の非存在下で、第１の調節配列を活性化して、第１のポリヌクレオチド配列の転写を行わせることができる。
【００２５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、作用物はドキシサイクリンである。
【００２６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、トランス活性化因子はテトラサイクリン制御のトランス活性化因子である。
【００２７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、第１の調節配列はテトラサイクリン応答エレメントを含む。
【００２８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、酵素は、チロシンヒドロキシラーゼ、ＤＯＰＡデカルボキシラーゼ、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ、ドーパミンβ−ヒドロキシラーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、トリプトファン−５モノオキシゲナーゼおよびコリンアセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される。
【００２９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、第２の調節配列はヒトニューロン特異的エノラーゼのプロモーターを含む。
【００３０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、神経変性障害は、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、アルツハイマー病およびハンチングトン病からなる群から選択される。
【００３１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、神経変性障害はパーキンソン病である。
【００３２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、神経伝達物質は、ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、γ−アミノ酪酸、セロトニン、アセチルコリンおよびグルタミン酸からなる群から選択される。
【００３３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、神経伝達物質はドーパミンである。
【００３４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞は骨髄細胞である。
【００３５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、骨髄細胞は骨髄間質細胞である。
【００３６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞はニューロン様細胞である。
【００３７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ニューロン様細胞は少なくとも１つのニューロンマーカーを発現する。
【００３８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ニューロンマーカーは、ＣＤ９０、ニューロン特異的核タンパク質、ニューロフィラメント重鎖、ニューロン特異的エノラーゼ、β−チューブリン３、チロシンヒドロキシラーゼ、微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ−２）、ネスチンおよびカルビンジンからなる群から選択される。
【００３９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞を投与することは、細胞を個体の脳組織内に移植することによって達成される。
【００４０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞を投与することは、細胞を個体の脊髄内に移植することによって達成される。
【００４１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、個体をさらすことは、作用物を個体に経口投与することによって達成される。
【００４２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、個体をさらすことは、作用物を個体に注入することによって達成される。
【００４３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞は、神経伝達物質の外因性の調節可能な合成が可能であるように遺伝子改変される。
【００４４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞は、神経伝達物質の合成に関係する酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現構築物で形質転換される。この場合、発現構築物は、ポリヌクレオチドの発現が調節作用物により制御可能であるように設計される。
【００４５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、作用物は、神経伝達物質の合成に関係する酵素の発現をダウンレギュレーションすることができる。
【００４６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、作用物は、神経伝達物質の合成に関係する酵素の発現をアップレギュレーションすることができる。
【００４７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞は、作用物が存在しないとき、活性化因子分子が応答エレメントと結合し、それによりチロシンヒドロキシラーゼの発現をアップレギュレーションするように作用物の調節可能な制御下でチロシンヒドロキシラーゼを発現させるために遺伝子改変される。
【００４８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞は、神経伝達物質の合成に関係する酵素の内因性活性を有しないニューロン様細胞である。
【００４９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞は、アポトーシス阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
【００５０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、増殖培地は、ＤＭＥＭ、ＳＰＮ、Ｌ−グルタミン、ＦＣＳ、２−β−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸およびＥＧＦを含む。
【００５１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、神経変性障害を治療するための細胞を作製する方法は、工程（ｉｖ）の前に、工程（ｉｉｉ）から得られた細胞を前分化用培地においてインキュベーションし、それにより細胞をニューロン様細胞に分化させやすくすることを含む。
【００５２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、前分化用培地はｂＦＧＦを含む。
【００５３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、前分化用培地は、ＤＭＥＭ、ＳＰＮ、Ｌ−グルタミン、Ｎ２補充物およびＦＣＳをさらに含む。
【００５４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、少なくとも１つの多不飽和脂肪酸はドコサヘキサエン酸である。
【００５５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、少なくとも１つの分化用作用物は、ＢＨＡ、ｄｂｃＡＭＰおよびＩＢＭＸからなる群から選択される。
【００５６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、分化用培地は、ＤＭＥＭ、ＳＰＮ、Ｌ−グルタミン、Ｎ２補充物およびレチノイン酸をさらに含む。
【００５７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、神経変性障害を治療するための細胞を作製する方法はさらに、工程（ｉｖ）の前に、工程（ｉｉｉ）から得られた細胞を本発明の核酸構築物で形質転換することによって達成される。
【００５８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、工程（ｉ）は吸引によって達成される。
【００５９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、工程（ｉｉｉ）は、表面接着細胞を集めることによって達成される。
【００６０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、神経伝達物質はドーパミンである。
【００６１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、少なくとも２つのタイプの神経伝達物質には、ドーパミンが含まれる。
【００６２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、少なくとも２つのタイプの神経伝達物質には、セロトニンが含まれる。
【００６３】
本発明は、神経伝達物質の制御可能な合成が可能であるニューロン様細胞で、パーキンソン病などの神経変性障害を治療するためにそのような細胞を使用する細胞置換治療が可能であるニューロン様細胞を提供することによって、神経変性疾患を治療する現在知られている方法の欠点を対処することに成功している。
【００６４】
別途定義されない場合、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と同様または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。また、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【００６５】
本発明は、例示のみを目的とし、添付されている図面を参照して、本明細書中に記載される。次に図面を詳しく具体的に参照して、示されている項目は、例としてであり、また、本発明の好ましい実施形態の例示的な議論のためのものであり、従って、本発明の原理および概念的態様の最も有用かつ容易に理解された記述であると考えられるものを提供するために示されていることが強調される。これに関して、記述を図面と一緒に理解することにより、本発明のいくつかの形態が実際にどのように具体化され得るかが当業者には明らかになるので、発明の構造的詳細を、発明の基本的な理解のために必要であるよりも詳細に示すことは試みられていない。
図面の簡単な記述
図１Ａ〜Ｃは非分化のヒト骨髄間質細胞（ｈＢＭＳｃ）の光学顕微鏡像を例示する（図１Ａ〜図１Ｃ）。ｈＢＭＳｃは「増殖培地」（下記の実施例の節の実施例１に記載される）で培養され、約１５日の期間にわたって８０％〜９０％の密集度に成長させられた。プラスチック接着性のｈＢＭＳｃは円形もしくは紡錘体の体形状（図１Ａ）または平坦な体形状（図１Ｂ〜図１Ｃ）を有した。
図２は非分化ｈＢＭＳｃのフローサイトメーター分析を例示する。１５日目のｈＢＭＳ細胞が、表面マーカーのＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ３４（これらはリンパ造血系細胞に特徴的である）の存在について染色され、また、ＣＤ９０（Ｔｈｙ−１；シナプス形成時に発現するタンパク質）に関して染色された。細胞は、アルゴンイオンレーザー（これは４８８ｎｍの励起波長に調節された）およびＣＥＬＬＱｕｅｓｔ（商標）ソフトウエアプログラム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を備えるＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析された。分析では、ｈＢＭＳ細胞はリンパ球関連マーカーのいずれも発現しないが、Ｔｈｙ−１タンパク質を明確に発現したことが示される。
図３はニューロンに分化した成人ｈＢＭＳｃの光学顕微鏡像を例示する。分化の２４時間前に、培養されたｈＢＭＳｃを「増殖用培地」から「前分化培地」（下記の実施例の節の実施例１〜実施例２を参照のこと）に移した。「前分化培地」で２４時間インキュベーションした後、ｈＢＭＳｃを「分化培地」（下記の実施例の実施例２を参照のこと）に移した。プラスチック接着性の細胞を、分化誘導後の３時間もの早期に現れ、分化誘導後の７２時間において現れ続ける紡錘体の形状をした細胞体および長い枝分かれプロセスを有するニューロン様細胞に転換させた。
図４は「分化用培地」で培養されたｈＢＭＳｃ、および「前分化用培地」（下記の実施例の実施例２を参照のこと）で培養されたｈＢＭＳｃにおける３Ｈ−チミジン取り込み（これは細胞増殖を示す）を例示する。分化中の細胞への３Ｈ−チミジン取り込みは、１６時間および３９時間のインキュベーション期間の後で、非分化細胞と比較して、約４５％および９０％それぞれ低下した。
図５Ａ〜Ｄは非分化のｈＢＭＳｃおよび分化中のｈＢＭＳｃにおけるニューロンマーカーから抽出されたＲＮＡの逆転写酵素ＲＴ−ＰＣＲ分析、リアルタイムＰＣＲ分析およびノーザンブロット分析を例示する（図５Ａ〜図５Ｄ）。図５Ａは、ニューロン転写物を同定するために計画されたＲＴ−ＰＣＲ分析を例示する。図５Ｂは、ＮＥＧＦ２の３２Ｐ標識されたＰＣＲ産物をプローブとして利用したノーザンブロット分析およびリアルタイムＰＣＲ分析を例示する。図５Ｃは、ニューロフィラメント２００（ＮＦ−２００）の３２Ｐ標識されたＰＣＲ産物をプローブとして利用したノーザンブロット分析を例示する。図５Ｄは、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）の３２Ｐ標識されたＰＣＲ産物をプローブとして利用したノーザンブロット分析を例示する。
図６Ａ〜Ｂは「分化培地」（下記の実施例の実施例２を参照のこと）で１２時間〜５日間培養されたｈＢＭＳｃにおけるニューロンマーカーの蛍光顕微鏡像を例示する（図６Ａ〜図６Ｂ）。図６Ａは、抗体で標識されたニューロン核特異的マーカー（ＮｅｕＮ；１２時間後に発現した）、ニューロフィラメント重鎖（ＮＦ−２００；２４時間後に発現した）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ；４８時間後に発現した）およびネスチン（４８時間後に発現した）を例示する。図６Ｂは、抗体で標識されたグリア原線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ；４８時間後に発現した）およびβ−チューブリンＩＩＩ（５日後に発現した）を例示する。
図７Ａ〜Ｃはニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ；図７Ａ）、ニューロン核特異的マーカー（ＮｅｕＮ；図７Ｂ）およびネスチン（図７Ｃ）の上昇した発現を示す、分化したｈＢＭＳｃのウエスタンブロット分析を例示する。
図８は「長期分化培地」（下記の実施例の実施例５を参照のこと）で２８日間インキュベーションした後におけるニューロン様の分化したｈＢＭＳｃの光学顕微鏡像を例示する。
図９Ａ〜Ｃは「増殖培地」（下記の実施例の実施例１を参照のこと）または「長期分化培地」（下記の実施例の実施例５を参照のこと）でインキュベーションされたｈＢＭＳｃの光学顕微鏡像および蛍光顕微鏡像を例示する（ 図９Ａ〜図９Ｃ）。図９Ａは、分化した細胞におけるニューロンマーカーのβ−チューブリンＩＩＩの抗体標識された発現を例示する。図９Ｂは、分化した細胞におけるニューロンマーカーのＭＡＰ−２の抗体標識された発現を例示する。図９Ｃは、分化した細胞におけるニューロンマーカーのネスチンの抗体標識された発現を例示する。
図１０は「分化培地」（下記の実施例の実施例２を参照のこと）で１２時間〜７２時間培養されたｈＢＭＳｃにおけるドーパミン作動性マーカーを同定するために計画されたＲＴ−ＰＣＲ分析を例示する。
図１１Ａ〜Ｃは分化したｈＢＭＳｃにおけるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の発現を例示する。図１１Ａは、分化した細胞における上昇したＴＨ転写を示すリアルタイムＰＣＲ分析を例示する（図１１Ａ〜図１１Ｃ）。図１１Ｂは、分化した細胞におけるＴＨの上昇したレベルを示すウエスタンブロット分析を例示する。図１１Ｃは、分化した細胞における抗体標識されたＴＨ発現を強調する蛍光顕微鏡像を例示する。
図１２は分化した細胞における抗体標識された小胞モノアミン輸送体２（ＶＭＡＴ−２）を強調する、「分化培地」（下記の実施例の実施例２を参照のこと）で５日間インキュベーションされたｈＢＭＳｃの共焦点蛍光顕微鏡像を例示する。
図１３は「分化培地」（下記の実施例の実施例２を参照のこと）で４８時間インキュベーションされたｈＢＭＳｃのフローサイトメーター分析を例示する。細胞はＤ２ドーパミン受容体の存在について染色され、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析された。分析では、Ｄ２ドーパミン受容体が、分化した細胞に存在したことが示される。
図１４Ａ〜Ｄは分化中のｈＢＭＳｃのＨＰＬＣ分析を例示する（図１４Ａ〜図１４Ｄ）。図１４Ａは、「分化培地」（下記の実施例の実施例２を参照のこと）で０〜９６時間インキュベーションされたｈＢＭＳｃの上清における測定されたドーパミンのレベルを例示する。図１４Ｂは、「分化培地」で０〜９６時間インキュベーションされ、その後、５６ｍＭのＫＣｌ溶液において１０分間さらにインキュベーションされたｈＢＭＳｃの上清における測定されたドーパミンのレベルを例示する。図１４Ｃは、「分化培地」で０〜７２時間インキュベーションされたｈＢＭＳｃの上清における測定されたドーパミン前駆体ＤＯＰＡのレベルを例示する。図１４Ｄは、「分化培地」で０〜５０時間培養されたｈＢＭＳｃの上清における測定されたドーパミン代謝産物ＤＯＰＡＣのレベルを例示する。
図１５Ａ〜Ｄはパーキンソン病についてのラットモデルにおけるアンフェタミン誘導の運動回旋の回復に対するマウス骨髄間質細胞（ｍＢＭＳｃ）移植の効果を例示する（図１５Ａ〜図１５Ｄ）。ｍＢＭＳｃを、緑色蛍光タンパク質を目印とした遺伝子組換えマウス（ＧＦＴ−Ｔｇ）から単離した。単離されたｍＢＭＳｃは神経分化のために誘導され、６−ＯＨＤＡ障害ラットの黒質に移植された。その後、ラットはアンフェタミンで治療され、移植後４５日の期間にわたって回旋応答について調べられた。図１５Ａは、移植後の経時的な回旋速度の変化を例示し、低下しつつある回旋（これは運動機能の改善を示す）を移植後４５日目に示している。図１５Ｂは、移植後の経時的な（非治療マウスと比較したときの）相対的回旋における変化を例示し、相対的回旋の９７．９％の減少を移植後４５日目に示している。図１５Ｃは、移植後４５日目の治療されたマウスの黒質に存在する移植されたｍＢＭＳｃを強調する蛍光顕微鏡像を例示する。図１５Ｄは、黒質移植後４５日目の治療されたマウスの線条体に存在する移植されたｍＢＭＳｃを強調する蛍光顕微鏡像を例示する。
図１６Ａ〜Ｃは分化したヒト骨髄間質細胞（ｈＢＭＳｃ）におけるドーパミン作動性活性およびセロトニン作動性活性を例示する（図１６Ａ〜図１６Ｃ）。図１６Ａは、トリプトファンヒドロキシラーゼの発現を示すウエスタンブロット分析を例示する。図１６Ｂは、トリプトファンヒドロキシラーゼの転写を示すＲＴ−ＰＣＲ分析を例示する。図１６Ｃは、ＤＯＰＡＣ（ドーパミン代謝産物）および５ＨＩＡＡ（セロトニン代謝産物）の合成を示すＨＰＬＣ分析を例示する。
図１７はｐｃＤＮＡ−３．１Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）に挿入されたＮｕｒｒ−１コード配列を含有する発現ベクターの構築物を例示する。
図１８はドーパミン作動性細胞の負の選択のために設計された構築物を例示する。この構築物は、「自殺遺伝子」ＨＳＶ１−ｔｋ（毒性のガンシクロビルをコードする１型単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ）の上流側においてｐＭＯＤ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎｅ）に挿入されたヒトＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）プロモーターを含有する。
図１９Ａ〜Ｂはチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）のドキシサイクリン制御の発現のためのＴｅｔ−ｏｆｆ／Ｔｅｔ−ｏｎシステムを例示する（図１９Ａ〜図１９Ｂ）。図１９Ａはこのシステムの調節因子構築物および応答構築物を例示する。図１９Ｂは、このシステムの作用様式を記載する概略図を例示する。
図２０Ａ〜ＢはＧＦＰ−Ｔｇマウスの分化したＢＭＳｃ（ｍＢＭＳｃ）の蛍光顕微鏡像を例示する（図２０Ａ〜図２０Ｂ）。図２０Ａは、「分化培地」（実施例１参照）により誘導される形態学的変化の蛍光顕微鏡像を例示する。図２０Ｂは、ＮＴ−３誘導のｍＢＭＳｃにおいて発現する抗体標識されたＡ２Ｂ５（稀突起神経膠細胞前駆体のマーカー）を強調する蛍光顕微鏡像を例示する。
図２１はＳＯＤ１を発現するマウス（筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の動物モデル）の回旋成績における経時変化を例示する。ＳＯＤ１マウスは、野生型マウスと比較して、回旋成績の実質的な低下を受け、４月齢〜５月齢で完全な麻痺になった。
図２２は雄由来のｍＢＭＳｃが大槽内に移植された後の１週間目にサンプリングされた雌マウスの種々の組織のＰＣＲ分析を例示する。分析では、（移植された細胞であることを示す）Ｙ染色体が雌マウスの脊髄において検出され、他の組織では検出されない。
図２３は７週齢のときにその脊髄内へのｍＢＭＳｃ移植を受けた野生型マウスのロータロド（ｒｏｔａｒｏｄ）成績（回旋行動を示す）を例示する。生理的食塩水の注射で治療されたマウスが対照として使用された。ｍＢＭＳｃの移植は野生型マウスの回旋行動に影響を及ぼさなかった。
図２４は７週齢のときにその脊髄内へのｍＢＭＳｃ移植を受けたＳＯＤ１マウス（筋萎縮性側索硬化症のモデル）のロータロド成績（回旋行動を示す）を例示する。生理的食塩水の注射で治療されたマウスが対照として使用された。ｍＢＭＳｃの移植では、生理的食塩水で治療された対照と比較して、ＳＯＤ１マウスの回旋行動が著しく改善された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６６】
本発明は、神経伝達物質の制御可能な合成が可能な遺伝子改変された細胞、ならびに、そのような細胞を作製する方法、および、神経変性障害の細胞置換治療においてそのような細胞を使用する方法に関する。
【００６７】
本発明の原理および操作は、図面および付随する記述を参照してより良好に理解され得る。
【００６８】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施することが可能であり、または様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであり、限定であるとして見なしてはならないことを理解しなければならない。
【００６９】
ニューロン機能の消失によって特徴づけられる神経変性障害（例えば、パーキンソン病など）は、従来の薬物治療を使用して効率的に治療することができない。これは、そのような薬物は、ニューロンの変性によって典型的に引き起こされる根本的な疾患プロセスに対して全く効果がないからである。結果として、薬物治療では、ニューロン細胞の増大しつつある消失を完全に補うことができない。
【００７０】
先行技術の様々な細胞置換法は、動物モデルにおいて試験されたときには成功している（米国特許第６５２８２４５号；Ｓｃｈｗａｒｔｚ他、１９９９；Ｌｉ他、２００１；Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ他、２０００；Ｈｗａｎ−Ｗｕｎ他、１９９９；Ｌｉｎｄｅｒ他、１９９５；Ｐａｔｒｉｄｇｅ＆Ｄａｖｉｅｓ、１９９５；Ｐｅｒｒｙ＆Ｇｏｒｄｏｎ、１９９８；Ｙａｄｉｄ他、１９９９；Ｃｈｏｉ−Ｌｕｎｄｂｅｒｇ他、１９９８；Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ他、１９９５）が、これらの方法は、ヒト患者におけるそれらの使用を妨げ得るいくつかの固有的な制限により損なわれている。
【００７１】
本発明を考えているとき、本発明者らは、パーキンソン病などの神経変性疾患の安全かつ効果的な細胞置換治療を提供するために、容易に採取および操作され得る細胞で、とりわけ、外部の刺激に応答してドーパミンなどの神経伝達物質を合成することができる細胞が必要であることを実感した。
【００７２】
神経伝達物質を合成することができるニューロン様骨髄間質細胞（ＢＭＳｃ）が先行技術の様々な研究（例えば、米国特許第６５２８２４５号；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓ他（２０００）；Ｗｏｏｄｂｕｒｒｙ他（２０００）；Ｗｏｏｄｂｅｒｒｙ他（Ｊ．Ｎｅｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．、９６：９０８〜９１７、２００２）；Ｄｅｎｇ他（Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２８２：１４８〜１５２、２００１）を参照のこと）によって記載されているが、これらの研究は、そのような分化したＢＭＳｃによる神経伝達物質の産生を明らかにしていなかった。
【００７３】
上記からそれにもかかわらず、そのような先行技術の細胞が神経伝達物質を産生したとしても、細胞置換治療におけるその使用は、移植された細胞からの構成的な神経伝達物質の合成が重篤な副作用（例えば、遁走ジスキネジーなど）の形成をもたらし得るので気づいていない。
【００７４】
従って、本発明の１つの態様によれば、神経変性障害を治療する方法が提供される。本明細書中で使用される表現「神経変性障害」は、神経組織、神経伝達物質または神経機能の徐々に進行する消失によって特徴づけられる神経系（好ましくはＣＮＳ）の任意の障害または疾患または状態を示す。神経変性障害の例には、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、アルツハイマー病およびハンチングトン病が含まれる。
【００７５】
本明細書中で使用される用語「治療する」は、そのような用語が適用される障害または疾患または状態の進行を逆行させ、または軽減させ、または阻害すること、あるいは、そのような用語が適用される障害または疾患または状態を防止すること、あるいは、そのような障害または状態の１つまたは複数の症状を防止することを示す。本明細書中で使用される用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または用語「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」は、治療するという作用を示す。
【００７６】
本発明の方法は、神経伝達物質の外因的に制御可能な合成が可能であり、それにより神経変性障害を治療することができる細胞を、その必要性のある個体に投与することによって達成される。
【００７７】
神経伝達物質の外因的に制御可能な合成が可能である細胞（すなわち、要求に応じて神経伝達物質を産生する細胞）、例えば、より詳しくは本明細書中下記において記載される細胞などは、上記で記載された先行技術方法によって利用される細胞に伴う望ましくない副作用が除かれ得るので、細胞置換治療のためにより良好に適する。
【００７８】
本発明の教示による神経伝達物質は、中枢神経系または末梢神経系のシナプス前ニューロンの軸索終端から興奮時に放出され、かつ、シナプス間隙を超えて移動し、標的細胞の興奮または阻害のいずれかを生じさせる任意の物質であり得る。神経伝達物質は、例えば、ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、γ−アミノ酪酸、セロトニン、アセチルコリンまたはグルタミン酸であり得る。好ましくは、神経伝達物質はドーパミンである。
【００７９】
そのような神経伝達物質の細胞合成は、前駆体分子を活性な神経伝達物質に変換することにおいて協力する様々な酵素からなる経路によって導かれる。例えば、ドーパミンは、ドーパミン作動性ニューロンにおいて、Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）からＤＯＰＡデカルボキシラーゼの作用によって合成され、一方、Ｌ−ＤＯＰＡはチロシンからチロシンヒドロキシラーゼの作用によって産生される。ノルエピネフリンは、ノルエピネフリン作動性ニューロンにおいて、ドーパミンからドーパミンβ−ヒドロキシラーゼの作用によって産生される。エピネフリンは、エピネフリン作動性ニューロンにおいて、ノルエピネフリンからフェニルエタノールアミンＮ−メチルトランスフェラーゼの作用によって産生される。γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）は、ＧＡＢＡ作動性ニューロンにおいて、グルタミン酸からグルタミン酸デカルボキシラーゼの作用によって産生される。セロトニンは、セロトニン作動性ニューロンにおいて、トリプトファンから、トリプトファン−５−モノオキシゲナーゼ（ヒドロキシル化）および芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（脱カルボキシル化）による二段階プロセスによって産生される。アセチルコリンは、コリン作動性ニューロンにおいて、コリンおよびアセチル−ＣｏＡから、コリンアセチルトランスフェラーゼの作用によって産生される（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｄｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／ｔｈｅｍｅ／ｍｗｋｉｎｇ／ｎｅｒｖｅｓ．ｈｔｍｌ）。
【００８０】
本発明によって利用される細胞は、任意の活発に成長する細胞であり得るが、好ましくは骨髄由来の細胞であり、より好ましくは骨髄間質細胞（ＢＭＳｃ）である。ＢＭＳｃは、吸引し、その後、単離された細胞をエクスビボで維持および／または拡大することができる増殖培地で培養することによって個体の腸骨稜から単離することができる。好ましくは、増殖培地は、下記の実施例の節の実施例１に記載されるように、ＤＭＥＭ、ＳＰＮ、Ｌ−グルタミン、ＦＣＳ、２−β−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸およびＥＧＦを含む。
【００８１】
増殖中の細胞は、ニューロン様細胞に直接分化させることができ、または、ニューロン様細胞へのその分化に先立って、本明細書中下記に記載される構築物および形質転換方法を使用して形質転換することができる。
【００８２】
ニューロン様細胞への分化は、米国特許第６５２８２４５号に、また、Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓ他（２０００）；Ｗｏｏｄｂｕｒｒｙ他（２０００）；Ｗｏｏｄｂｅｒｒｙ他（Ｊ．Ｎｅｕｒｉｓｃｉ．Ｒｅｓ．、９６：９０８〜９１７、２００１）；ＢｌａｃｋおよびＷｏｏｄｂｕｒｒｙ（Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ Ｍｏｌ．Ｄｉｓ．、２７：６３２〜６３５、２００１）；Ｄｅｎｇ他（２００１）；Ｋｏｈｙａｍａ他（２００１）；ＲｅｙｅｓおよびＶｅｒｆａｔｉｌｅ（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９３８：２３１〜２３５、２００１）；Ｊｉａｎｇ他（Ｎａｔｕｒｅ、４１８：４７〜４９、２００２）によって記載される培地などの分化用培地で細胞をインキュベーションすることによって達成され得る。
【００８３】
好ましくは、分化は少なくとも１つのタイプの長鎖多不飽和脂肪酸の存在下で達成される。ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などの長鎖多不飽和脂肪酸は、ニューロンの適正な発達および機能のために不可欠であることが知られている。そのような多不飽和脂肪酸は、ニューロン膜における主要なアニオン性リン脂質の生合成および蓄積を調節することに関与している［ＣｏｎｎｏｒおよびＮｅｕｒｉｎｇｅｒ、“Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ａｎｄ Ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ”、Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ，Ｍ．、Ｌｅａｆ，Ａ．およびＢｏｌｉｓ，Ｌ．編、２６７頁〜２９２頁、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；Ａｌａｎ Ｒ．Ｌ．、“Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎ−３ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ Ｒｅｐｌｅｔｉｏｎ ｕｐｏｎ ｔｈｅ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｒａｉｎ ａｎｄ Ｒｅｔｉｎａ”、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；ＧｒｅｅｎおよびＹａｖｉｎ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、６５：２５５５〜２５６０、１９９５］。ニューロンの細胞培養研究において、ＤＨＡはシナプスの周りのホスファチジルエタノールアミンリン脂質およびホスファチジルセリンリン脂質の一部を形成することが明らかにされている（Ｋｉｍ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５：３５２１５〜３５２２３、２０００；Ｋｉｍ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１６：２２３〜２２７、２００２；ＡｋｂａｒおよびＫｉｍ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、８２：６５５〜６６５、２００２）。
【００８４】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、２０μＭ〜１００μＭのＤＨＡ（Ｓｉｇｍａ）またはエチル−ＤＨＡ（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ−Ｐｒｅｏ、Ｅｌｙｓｉａｎ、ＭＮ）を培養されたＢＭＳｃに添加することにより、ニューロン様ＢＭＳｃのシナプスにおける神経伝達物質分泌小胞の形成が実質的に促進されたことを発見した（データは示されず）。
【００８５】
従って、本発明の好ましい実施形態によれば、ニューロン様細胞へのＢＭＳｃの分化は、少なくとも１つの多不飽和脂肪酸（例えば、ＤＨＡなど）を含む分化用培地で細胞をインキュベーションすることによって達成される。好ましくは、分化用培地はまた、少なくとも１つのニューロン分化用作用物、例えば、ＢＨＡ、ｄｂｃＡＭＰまたはＩＢＭＸを含む。より好ましくは、分化培地は、ＤＭＥＭ、ＳＰＮ、Ｌ−グルタミン、Ｎ２補充物およびレチノイン酸をさらに含む（下記の実施例の節の実施例２を参照のこと）。
【００８６】
分化効率をさらに増大させるために、ＢＭＳｃは、好ましくは、上記の分化培地におけるそのインキュベーションの前に「前分化培地」でインキュベーションされる。好適な前分化培地は、細胞にニューロン様分化を受けやすくすることができる任意の成長培地、例えば、マイトジェンの塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）が補充された成長培地などであり得る。好ましくは、前分化用培地はさらに、下記の実施例の節の実施例２などに記載されるように、ＤＭＥＭ、ＳＰＮ、Ｌ−グルタミン、Ｎ２補充物およびＦＣＳを含む。
【００８７】
本明細書中上記に記載される手順から得られるニューロン様細胞は典型的には、ニューロン細胞の形態学（これは図３に例示される）を示し、少なくとも１つのニューロンマーカー（例えば、ＣＤ９０、ニューロン特異的核タンパク質、ニューロフィラメント重鎖、ニューロン特異的エノラーゼ、β−チューブリン３、ＭＡＰ−２、チロシンヒドロキシラーゼ、微小管結合タンパク質、ネスチンおよびカルビンジンなど）を発現する。ニューロンマーカーの発現は、下記の実施例の節における実施例３〜実施例９および実施例１２などに記載される免疫アッセイ、フローサイトメトリー、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲおよびＨＰＬＣ法などの様々な方法を使用して確認される。
【００８８】
本発明の分化した細胞は、好ましくは、神経伝達物質を合成することができる。神経伝達物質を合成する細胞は、上記などに記載されるニューロン様分化培地、または、下記の実施例の節の実施例９などに記載される「ドーパミン作動性分化培地」でインキュベーションすることによって作製することができる。
【００８９】
ドーパミン作動性の細胞のみを利用するパーキンソン病の置換治療では、長期間の治療において、非ドーパミン作動性伝達物質系の不均衡がもたらされ、その後に、効果の低下およびジスキネジーなどの副作用が生じ得ることが理解される（ＮｉｃｈｏｌｓｏｎおよびＢｒｏｔｃｈｉｅ、Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ．、３：１〜６、２００２）。従って、非ドーパミン作動系を標的化し、かつ、パーキンソン病における不随意運動の発現を防止または制限することができる薬剤が、パーキンソン病患者を治療する際の使用のために提案されている（ＤｊａｌｄｅｔｔｉおよびＭｅｌａｍｅｄ、Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ．、２：３０〜５、２００２；Ｍｕｌｌｅｒ，Ｔ．、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．、２：５５７〜７２、２００１；Ｊｅｎｎｅｒ，Ｐ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２：４３〜５０、２０００）。さらに、様々なセロトニン受容体がパーキンソン病における潜在的な治療標的として同定されている（ＮｉｃｈｏｌｓｏｎおよびＢｒｏｔｃｈｉｅ、Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ．、３：１〜６、２００２）。
【００９０】
従って、本発明の別の実施形態によれば、本発明によって利用される細胞の集団は、バランスの取れた神経伝達物質の産生を提供するために向けられた２つ以上の異なる神経伝達物質産生細胞を含む混合細胞集団である。好ましくは、混合細胞集団は、図１６Ａ〜図１６Ｃに例示される細胞などのドーパミン作動性細胞ならびにセロトニン作動性細胞を含む。
【００９１】
本明細書中上記で述べられたように、本発明のこの態様によって利用される細胞は、好ましくは、神経伝達物質の制御可能な合成が可能である。
【００９２】
いくつかの方法が、そのような制御された合成が可能である細胞を作製するために利用することができる。
【００９３】
好ましくは、ニューロン移植のために好適な細胞は、本明細書中上記で記載されたように採取または作製され、神経伝達物質の制御可能な発現が可能であるように遺伝子改変される。
【００９４】
遺伝子改変は、好ましくは、神経伝達物質の合成に関係する酵素の制御可能な発現のために設計される発現構築物でそのような細胞を形質転換することによって達成される。
【００９５】
本発明の発現構築物は、好ましくは、神経伝達物質の合成に関係する酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含むが、発現構築物は、ポリヌクレオチドの発現が、特定の作用物または条件にさらされることにより調節されるように設計される。神経伝達物質の合成に関係する酵素の制御可能な発現は、神経伝達物質の合成に関係する酵素をコードするポリヌクレオチド配列を、「オン」（誘導）または「オフ」（抑制）の切り替えができるプロモーターまたは調節因子の転写制御下に配置させて含む発現構築物を利用することによって達成することができる。
【００９６】
発現構築物は、構築物配列のゲノム組込みをもたらす遺伝子ノックイン構築物として設計することができ、または、エピソーム発現ベクターとして設計することができる。
【００９７】
どのような場合でも、発現構築物は、この分野で広く知られている標準的な連結技術および制限技術を使用して作製することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８２）を参照のこと）。単離されたプラスミド、ＤＮＡ配列または合成オリゴヌクレオチドは切断され、調整され、所望される形態で再連結される。
【００９８】
本発明の発現構築物において利用され得るポリヌクレオチド配列は、国立分子生物学情報資源によって管理されるデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）などの様々なデータベースに記載されている。例には、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０００３６０（これはチロシンヒドロキシラーゼをコードする）、同ＮＭ＿０００７９０（これはＤＯＰＡデカルボキシラーゼをコードする）、同ＮＭ＿０００１６１（これはＧＴＰシクロヒドロラーゼＩをコードする）、同ＮＭ＿０００７８７（これはドーパミンβ−ヒドロキシラーゼをコードする）、同ＮＭ＿００２６８６（これはグルタミン酸デカルボキシラーゼをコードする）、同ＮＭ＿００３４５０（これはトリプトファン−５モノオキシゲナーゼをコードする）および同ＮＭ＿０２０５４９（これはコリンアセチルトランスフェラーゼをコードする）において示される配列が含まれる。
【００９９】
本発明とともに使用される好適なプロモーターは、好ましくは、神経伝達物質の調節可能な発現をもたらすようにポリヌクレオチド配列の転写を行わせることができる応答エレメントである。好適な応答エレメントは、例えば、テトラサイクリン応答エレメント（例えば、ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７〜５５１、１９９２）によって記載される応答エレメントなど）；エクチゾン誘導可能な応答エレメント（Ｎｏ Ｄ他（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：３３４６〜３３５１、１９９６））；金属イオン応答エレメント、例えば、Ｍａｙｏ他（Ｃｅｌｌ、２９：９９〜１０８、１９８２）、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ他（Ｎａｔｕｒｅ、２９６：３９〜４２、１９８２）およびＳｅａｒｌｅ他（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：１４８０〜１４８９、１９８５）などによって記載される応答エレメント；熱ショック応答エレメント、例えば、Ｎｏｕｅｒ他（Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｎｏｕｅｒ，Ｌ．編、ＣＲＣ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ、１６７頁〜２２０頁、１９９１）などによって記載される応答エレメント；または、ホルモン応答エレメント、例えば、Ｌｅｅ他（Ｎａｔｕｒｅ、２９４：２２８〜２３２、１９８１）、Ｈｙｎｅｓ他（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：２０３８〜２０４２、１９８１）、Ｋｌｏｃｋ他（Ｎａｔｕｒｅ、３２９：７３４〜７３６、１９８７）、ＩｓｒａｅｌおよびＫａｕｆｍａｎ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１７：２５８９〜２６０４、１９８９）などによって記載される応答エレメントであり得る。好ましくは、応答エレメントはエクチゾン誘導可能な応答エレメントであり、より好ましくは、応答エレメントはテトラサイクリン応答エレメントである。
【０１００】
本発明の発現構築物はまた、１つまたは複数のエレメントを含むことができる。エンハンサーエレメントは、転写を、連結された同種プロモーターまたは異種プロモーターから１０００倍にまで刺激することができる。エンハンサーは、転写開始部位の下流側または上流側に置かれたときに活性である。ウイルスに由来する多くのエンハンサーエレメントは広い宿主範囲を有し、様々な組織において活性である。例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーは多くの細胞タイプについて好適である。本発明のために好適であるエンハンサー／プロモーターの他の組合せには、ポリオーマウイルス、ヒトまたはマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するもの、様々なレトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルスまたはラウス肉腫ウイルスおよびＨＩＶなど）に由来する長末端反復が含まれる。Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ａｎｄ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８３）を参照のこと（これは参考として本明細書中に取り込まれる）。
【０１０１】
ポリアデニル化配列もまた、本発明の発現構築物から発現される酵素の翻訳効率を増大させるために発現構築物に加えることができる。２つの異なった配列エレメントが正確かつ効率的なポリアデニル化のために要求される：ポリアデニル化部位の下流側に存在するＧＵリッチ配列またはＵリッチ配列、および、１１ヌクレオチド〜３０ヌクレオチド上流に存在する６ヌクレオチドの高度に保存された配列ＡＡＵＡＡＡ。本発明のために好適である終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルには、ＳＶ４０に由来するシグナルが含まれる。
【０１０２】
既に記載されたエレメントに加えて、本発明の発現構築物は、典型的には、クローン化されたポリヌクレオチドの発現レベルを増大させるために、または組換えＤＮＡを保有する細胞の同定を容易にするために意図された他の特殊化されたエレメントを含むことができる。例えば、数多くの動物ウイルスは、許容細胞タイプにおけるウイルスゲノムの染色体外複製を促進させるＤＮＡ配列を含有する。これらのウイルスレプリコンを運搬するプラスミドは、適切な因子が、プラスミドで運ばれる遺伝子、または宿主細胞のゲノムとともに運ばれる遺伝子のいずれかによって提供される限り、エピソーム的に複製する。
【０１０３】
発現構築物は真核生物レプリコンを含んでもよく、または真核生物レプリコンを含まなくてもよい。真核生物レプリコンが存在する場合、ベクターは、適切な選択マーカーを使用して真核生物細胞において増幅可能である。構築物が真核生物レプリコンを含まない場合、エピソーム増幅を行うことができない。代わりに、組換えＤＮＡは、操作された細胞のゲノムに組み込まれ、細胞において、プロモーターにより、所望されるポリヌクレオチドの発現が行われる。
【０１０４】
本発明の発現構築物はさらに、例えば、１つのｍＲＮＡからの数個のタンパク質の翻訳を可能にするさらなるポリヌクレオチド配列（例えば、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、およびプロモーターがキメラなポリペプチドのゲノム組込みのための配列など）を含むことができる。例えば、１つの発現構築物を設計し、神経伝達物質の合成に関係する２つの異なった酵素（例えば、ドーパミン合成において関係する酵素のチロシンヒドロキシラーゼおよびＤＯＰＡデカルボキシラーゼなど）を同時発現させることができる。
【０１０５】
哺乳動物発現構築物のための例には、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１（これらはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である）、ｐＣＩ（これはＰｒｏｍｅｇａから入手可能である）、ｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ（これらはＳｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能である）、ｐＴＲＥＳ（これはＣｌｏｎｔｅｃｋから入手可能である）、ならびにそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
真核生物ウイルス（例えば、レトロウイルスなど）に由来する調節エレメントを含有する発現構築物もまた、本発明によって使用することができる。ＳＶ４０系ベクターには、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２が含まれる。ウシ乳頭腫ウイルスに由来するベクターには、ｐＢＶ−１ＭＴＨＡが含まれる。エプスタイン・バールウイルスに由来するベクターには、ｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５が含まれる。他の例示的なベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＮｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、および、ＳＶ−４０初期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核生物細胞における発現のために効果的であることが示されている他のプロモーターの指揮下でのタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが含まれる。
【０１０７】
ウイルスは、多くの場合には宿主の防御機構を回避するために進化してきた特殊化された感染性因子である。典型的には、ウイルスは特定の細胞タイプにおいて感染し、伝搬する。ウイルスベクターの標的化特異性では、その天然の特異性が、所定の細胞タイプを特異的に標的化し、それにより組換え遺伝子を感染した細胞に導入するために利用される。従って、本発明によって使用されるベクターのタイプは、形質転換される宿主細胞に依存する。形質転換される細胞タイプに従って好適なベクターを選択する能力は、十分に当業者の能力の範囲内であり、そのため、選択の考慮すべき事項の一般的な記述は本明細書中には示されていない。例えば、骨髄細胞は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）を使用して標的化することができる。
【０１０８】
組換えウイルスベクターは、側方感染および標的化特異性などの利点を提供するので、遺伝子組換えポリヌクレオチドのインビボ発現のために有用である。側方感染は、例えば、レトロウイルスの生活環において固有的であり、１つだけの感染細胞が、出芽し、隣接する細胞に感染する多くの子孫ビリオンを産生するプロセスである。その結果は、そのほとんどが一番最初のウイルス粒子によって最初に感染しなかった大きな面積が急速に感染するということである。これは、感染性因子が娘子孫を介してのみ広がる垂直型の感染とは対照的である。側方に広がることができないウイルスベクターもまた作製することができる。この特徴は、所望される目的が、局在化した多数の標的化された細胞にだけ指定の遺伝子を導入することであるならば、有用であり得る。
【０１０９】
下記の実施例の節において記載されるように、本発明の細胞はまた、トランス活性化因子によって調節される第１のポリヌクレオチド配列を第２の調節配列の転写制御下に配置されて含む発現構築物または構築物システムで形質転換することができる。そのような発現スキームにおいて、トランス活性化因子は、作用物の非存在下で、第１の調節配列を活性化して、第１のポリヌクレオチド配列の転写を行わせることができる。
【０１１０】
好ましくは、発現構築物または構築物システムの第１のポリヌクレオチド配列は、Ｎｏ他（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：３３４６〜３３５１、１９９６）などによって記載されるエクジソン応答性のプロモーターに機能的に連結されている、神経伝達物質の合成に関係する酵素をコードする配列を含む。
【０１１１】
より好ましくは、発現構築物または構築物システムの第１のポリヌクレオチド配列は、ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７〜５５１、１９９２）などによって記載されるテトラサイクリン制御エレメントに機能的に連結されている、神経伝達物質の合成に関係する酵素をコードする配列を含む。さらなる詳細については、下記の実施例の節の実施例１５を参照のこと。
【０１１２】
トランス活性化因子は、好ましくは、ヒトエノラーゼプロモーターに機能的に連結された、ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７〜５５１、１９９２）などによって記載されるテトラサイクリン制御のトランス活性化因子である。さらなる詳細については、下記の実施例の節の実施例１５を参照のこと。
【０１１３】
様々な方法を、本発明の発現構築物を哺乳動物細胞に導入するために使用することができる。そのような様々な方法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９、１９９２））；Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ（１９８９））；Ｃｈａｎｇ他、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈ．（１９９５））；Ｖｅｇａ他、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈ．（１９９５））；Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．（１９８８））；Ｇｉｌｂｏａ他［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４（６）：５０４〜５１２、１９８６］において一般的に記載されており、そのような方法には、例えば、安定的または一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、および、組換えウイルスベクターを用いた感染が含まれる。また、正・負の選択法については、米国特許第５４６４７６４号および同第５４８７９９２号を参照のこと。
【０１１４】
形質転換された細胞が作製されると、形質転換された細胞は、外部のシグナル（例えば、作用物の存在または非存在）に応答して機能的な神経伝達物質を合成するその能力について（培養において）調べられる。好ましくは、神経伝達物質の濃度が、例えば、ＨＰＬＣまたはＧＣ−ＭＳなどの標準的な化学分析法を使用して（作用物の非存在に対してその存在において）比較分析される。あるいは、培養液が、下記の実施例の節の実施例７などに記載される手順を使用して、免疫アッセイ、ウエスタンブロットおよびリアルタイムＰＣＲなどの生化学分析法を使用して、または、酵素活性のバイオアッセイによって、組換え酵素（例えば、チロシンヒドロキシラーゼ）の発現について比較分析される。
【０１１５】
神経伝達物質を内因的に産生することができる細胞が本発明との使用のために選択される場合（例えば、ニューロン誘導されたＢＭＳｃ）においては、そのような細胞は、好ましくは、神経伝達物質の合成に関係している酵素（例えば、内因性チロシンヒドロキシラーゼ）の内因性コード配列を欠失または変異させるように遺伝子操作されることが理解される。そのような遺伝子操作は、例えば、Ｇａｌｌｉ−Ｔａｌｉａｄｏｒｏｓ他（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８１：１〜１５、１９９５）およびＨａｒｒｉｓ＆Ｆｏｒｄ（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ、１：４３３〜４３、２０００）によって記載される技術およびベクターなどの、遺伝子ノックアウトまたは部位特異的変異のための技術およびベクターを用いることによって達成することができる。あるいは、神経伝達物質を内因的に産生することができる細胞を、神経毒（例えば、ＭＰＴＰ）にさらすことによって、または、図１８などに例示される自殺ベクターを用いた形質転換によって除くことができる。
【０１１６】
内因性配列の欠失は、細胞が、神経伝達物質を内因的に合成する能力を同時に失い、かつ、制御可能な調節配列の転写制御下に配置された、酵素をコードする外因性配列のゲノム組込みにより（調節可能な）そのような能力を獲得するように、外因性酵素のコード配列（例えば、上記のコード配列）のノックインと組み合わせることができる。
【０１１７】
あるいは、そのような細胞はまた、内因性酵素のコード配列が調節可能なプロモーター配列の制御下にもたらされるように遺伝子操作することができる。そのような操作は、酵素の内因性プロモーター配列（例えば、ＴＨプロモーター配列）を調節可能なプロモーター配列の遺伝子ノックインにより置換することによって達成することができる。
【０１１８】
場合により、本発明の細胞は、脳移植時に生じる細胞死に対する抵抗性を獲得するように形質転換される。脳組織に移植された細胞は、低酸素症、低血糖、機械的外傷、フリーラジカル、増殖因子枯渇、および、宿主脳における興奮性アミノ酸の過度な細胞外濃度によって開始されるアポトーシスを受け得ることが見出されている（Ｂｒｕｎｄｉｎ他、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｏｌａｎｔ．、９：１７９〜１９５、２０００）。アポトーシス誘導による細胞死の危険性が高い状況のもとでは、本発明の細胞は、アポトーシス阻害ポリペプチド（例えば、ヒトｂｃｌ−２遺伝子（ＡｄａｍｓおよびＣｏｒｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１：１３２２〜１３２６、１９９８）など）をコードするポリヌクレオチドで形質転換することができる。このポリペプチドは、本明細書中上記などに記載される構成的プロモーターの制御下で、または好ましくは、例えば、Ｌｅｖｙ他（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２１：１２１〜１３２、２００３）によって記載されるようなヒトニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターなどのニューロン組織特異的なプロモーターの制御下で発現させることができる。
【０１１９】
本発明の細胞は、その種類は移植部位に依存する様々な移植法を使用して治療者に投与することができる。
【０１２０】
「移植」、「細胞置換」または「移植する」の用語または表現は、本明細書中では相互に交換可能に使用され、本発明の細胞を標的組織に導入することを示す。細胞は移植者に由来し得るか、または、同種もしくは異種の提供者に由来し得る。
【０１２１】
細胞は、中枢神経系内に、または宿主の脳の脳室空洞内に、または宿主の脳の表面の硬膜下に移植することができる。成功する移植のための条件には、（ｉ）移植組織の生存性；（ｉｉ）移植部位における移植片の保持；および（ｉｉｉ）移植部位における最小限量の病理学的反応が含まれる。様々な神経組織（例えば、胚性脳組織）を宿主の脳に移植するための様々な方法が、“Ｎｅｕｒａｌ ｇｒａｆｔｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ＣＮＳ”（ＢｊｏｒｋｌｕｎｄおよびＳｔｅｎｅｖｉ編、１９８５）に記載されている。これらの手法には、実質内の移植、すなわち、移植時に、脳の実質組織と対比されるように宿主脳内における組織の注射または留置によって達成される、（脳の外側または実質外での移植と比較されるような）宿主脳内での実質内移植が含まれる。
【０１２２】
実質内移植は、２つの方法を使用して達成することができる：（ｉ）細胞を宿主の脳の実質組織の中に注射すること、または（ｉｉ）宿主の脳の実質組織を露出させるために手術的手段によって空洞を調製し、その後、移植片を空洞の中に置くこと。両方の方法では、実質組織留置が移植時に移植片と宿主の脳組織との間にもたらされ、また、両方の方法では、移植片と宿主の脳組織との間での解剖学的な一体化が促進される。このことは、移植片が宿主の脳の構成部分になり、宿主の生涯にわたって生存することが要求されるならば、重要である。
【０１２３】
あるいは、移植片は、脳室（例えば、大脳脳室）に、または硬膜下、すなわち、宿主の脳の表面に設置することができ、この場合、移植片は、介在する軟膜またはクモ膜および軟膜によって宿主の脳の実質組織から隔てられる。脳室への移植は、ドナー細胞の注射によって達成することができ、または、３％コラーゲンなどの基質において細胞を成長させて、移植片の位置の変化を防止するために、脳室に移植され得る充実組織の栓を形成させることによって達成することができる。硬膜下移植の場合、細胞は、硬膜にすき間を作製した後、脳の表面の周囲に注射することができる。宿主の脳の選択された領域への注射は、ドリルで穴を開け、硬膜に穴を開けて、マイクロシリンジのニードルが挿入されることを可能にすることによって行うことができる。マイクロシリンジは、好ましくは、定位固定フレームに取り付けられ、三次元の定位固定座標が、ニードルを脳または脊髄の所望される位置に設置するために選択される。細胞はまた、脳の被殻、基底核、海馬皮質、線条体、黒質または尾状領域、ならびに脊髄に導入することができる。
【０１２４】
移植のために、細胞懸濁物がシリンジの中に引き込まれ、麻酔された移植者に投与される。多数回の注射を、この手法を使用して行うことができる。
【０１２５】
従って、このような細胞懸濁手法は、脳または脊髄における任意の所定部位への細胞の移植を可能にし、比較的非外傷性であり、同じ細胞懸濁物を使用して数カ所の異なる部位または同じ部位における同時での多数回の移植を可能にし、かつ、異なる解剖学的領域からの細胞の混合物を可能にする。多数の移植片は、細胞タイプの混合物、および／または細胞に挿入された導入遺伝子の混合物からなり得る。好ましくは、約１０４個〜約１０８個の細胞が移植片あたり導入される。
【０１２６】
空洞内への移植の場合、これは脊髄移植のためには好ましい場合があるが、組織が、例えば、Ｓｔｅｎｅｖｉ他（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．、１１４：１〜２０、１９７６）によって記載されるように、脳を覆っている骨を除き、ゲルフォームなどの材料で出血を止めることによって、移植空洞を形成するために、中枢神経系（ＣＮＳ）の外側表面に近い領域から除かれる。吸引を、空洞を作製するために使用することができる。その後、移植片が空洞内に設置される。２つ以上の移植片を、細胞または充実組織移植組織の注射を使用して同じ空洞に設置することができる。好ましくは、移植部位は、本発明の細胞によって合成される神経伝達物質のタイプによって決定される。例えば、ドーパミン作動性細胞は、好ましくは、パーキンソン病患者の黒質に移植される。
【０１２７】
本発明の細胞は、神経変性障害を治療することにおいて有用な治療剤と同時投与することができ、例えば、増殖因子（例えば、神経増殖因子）、ガングリオシド、抗生物質、神経伝達物質、神経ホルモン、毒素、神経突起促進分子、および代謝拮抗剤、ならびにこれらの分子の前駆体（例えば、Ｌ−ＤＯＰＡなど）と同時投与することができる。
【０１２８】
移植後、治療された個体は、移植された細胞によって放出される神経伝達物質のレベルについて注意深く、かつ継続してモニターされる。神経伝達物質レベルは、好ましくは、神経変性障害を診断するために好適な臨床試験を使用することによって間接的に推定される。例えば、パーキンソン病患者における移植された細胞によるドーパミンの放出は、例えば、Ａｄｋｅｒ，Ｃ．Ｈ．およびＡｈｌｓｋｏｇ，Ｊ．Ｅ．編、“Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｉｎｇ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ”（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、２０００）などに記載されるパーキンソン病用の臨床診断試験を使用して推定することができる。モニターされた表示値に基づいて、神経伝達物質の放出速度が、移植された細胞における神経伝達物質の合成を調節することができる作用物を個体に投与することによって、またはそのような作用物を個体から取り除くことによって調節される。作用物は、本明細書中上記などに記載される、神経伝達物質の合成に関係する酵素の発現をアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションすることができる任意の分子であり得る。
【０１２９】
作用物は、個体に対して直接投与することができ、または医薬組成物の一部（有効成分）として投与することができる。
【０１３０】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分または作用物の１つまたは複数と、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤などの他の化学的成分との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する配合物の投与を容易にすることである。
【０１３１】
本明細書中以降において、表現「生理学的に許容され得るキャリア」および表現「医薬的に許容され得るキャリア」は、相互に交換可能に使用され得るが、生物に対する著しい刺激を生じさせず、投与された配合物の生物学的な活性および性質を妨げないキャリアまたは希釈剤を示す。佐剤はこれらの表現に含まれる。
【０１３２】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。
【０１３３】
薬物の配合および投与のための様々な技術を、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出すことができる（これは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０１３４】
本発明の方法において使用される任意の調製物について、治療効果的な量または用量をインビトロアッセイおよび細胞培養アッセイから最初に推定することができる。好ましくは、用量が、所望される濃度または力価を達成するために動物モデルにおいて定められる。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【０１３５】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、インビトロ、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手法によって明らかにすることができる。これらのインビトロアッセイおよび細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおいて使用される投薬量範囲を定める際に使用することができる。投薬量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ他、１９７５、“Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”、第１章、１頁を参照のこと）。例えば、パーキンソン病患者は、治療に対する正の応答を示す改善された運動機能について、また、過度なドーパミン発現を示す遁走ジスキネジー症状について症状的にモニターされ得る。
【０１３６】
作用物は様々な方法で患者に投与することができ、そのような方法には、限定されないが、経口投与、非経口投与、クモ膜下投与、脳室内投与および黒質内（ｉｎｔｒａｎｉｇｒａｌ）適用が含まれる。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ他、１９７５、“Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”、第１章、１頁を参照のこと）。
【０１３７】
投薬量および投薬間隔は、移植された細胞による神経伝達物質の合成を効果的に調節するために十分である有効成分のレベルに合わせて個々に調製され得る。所望される効果を達成するために必要な投薬量は、個体の特性および投与経路に依存する。様々な検出アッセイを、血漿濃度を測定するために使用することができる。
【０１３８】
治療される状態の重篤度および応答性に依存して、服薬は単回または複数回の投与が可能であり、治療の経過は、数日から数週間まで、または、疾患状態の縮小が達成されるまで続く。
【０１３９】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、治療されている個体、病気の重篤度、投与様式、処方医師の判断などに依存する。投薬量および投与時期は、個体の変化する状態の注意深い継続したモニターリングに応答する。例えば、治療されているパーキンソン病患者には、モニターリング中の表示値に基づいて、所望されるレベルにドーパミン合成を促進または抑制するために十分である量の作用物が投与される。
【０１４０】
従って、本発明は、効果的であり、安全であり、かつ臨床的に実施可能である神経変性疾患の細胞治療の新規な核酸構築物、構築物システム、細胞および方法を提供する。
【０１４１】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴が、限定であることが意図されない下記の実施例を検討したとき、当業者には明らかになる。また、本明細書中上記に描かれ、また、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、下記の実施例において実験的裏付けが見出される。
【０１４２】
上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なおこれら実施例によって本発明は限定されない。
【０１４３】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学及び組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている［例えば以下の諸文献を参照されたい。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｒ．Ｍ．編１９９４年「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻；Ａｕｓｕｂｅｌら著１９８９年「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク１９８８年；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク１９９８年；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号及び５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ， Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク１９９４年；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、米国ニューヨーク１９８０年；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている。米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号及び５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４年；Ｈａｍｅｓ， Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１９８５年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」１９８４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」１９８６年；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８６年；Ｐｅｒｂａｌ， Ｂ．著「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」１９８４年及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ１９９０年；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、１９９６年及びＰａｒｆｉｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９８７）．Ｂｏｎｅ ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ：ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，ｓｙｍｂｏｌｓ，ａｎｄ ｕｎｉｔｓ．Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ＡＳＢＭＲ Ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２（６），５９５−６１０；なおこれらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである］。その外の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１４４】
実施例１
ヒト骨髄間質細胞（ｈＢＭＳｃ）の単離および培養
方法：
増殖培養：骨髄吸引物（１０ｍｌ）を、インフォームドコンセントを得た健康なヒトドナーの腸骨稜から得た。単核細胞を、密度勾配（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）−１０７７）による遠心分離によって単離し、「増殖培地」［ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）；１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１２．５ユニット／ｍｌのナイスタチン（ＳＰＮ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）；２ｍＭのＬ−グルタミン；５％のウマ血清；１５％のウシ胎児血清（ＦＣＳ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）；０．００１％の２−β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）；１ｘの非必須アミノ酸；１０ｎｇ／ｍｌのヒト上皮増殖因子（ＥＧＦ）］に置床した。細胞を、３７℃で２日間、加湿された５％ＣＯ２インキュベーターにおいてインキュベーションし、その後、非接着の細胞を捨てた。残ったプラスチック接着性の細胞をダルベッコのリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）で２回洗浄し、新鮮な成長培地を加えた。培地を３日毎または４日毎に取り替えた。細胞は１５日以内に８０％〜９０％の密集度に成長し、円形もしくは紡錘体の形状（図１Ａ）または平坦な形状（図１Ｂ〜図１Ｃ）となって現れた。
【０１４５】
フローサイトメトリー：増殖培養条件のもとで１５日後、細胞を集め、０．０５％トリプシンおよび２５ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した。細胞を、０．５ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度での溶液において、細胞表面マーカーのＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ３４（これらはリンパ造血系細胞に関連する）に対して特異的な抗体（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で２０分間、各抗体の経験的に決定された量（一般には１０μｌ〜２０μｌ）を用いて染色した。抗体で標識された細胞を２容量のＰＢＳで徹底的に洗浄し、フロー緩衝液（ＰＢＳにおける１％パラホルムアルデヒド、０．１％アジ化ナトリウムおよび０．５％ウシ血清アルブミン）において固定処理した。洗浄細胞を、４８８ｎｍの励起波長に調節されたアルゴンイオンレーザーを備えるＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって、また、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ（商標）ソフトウエアプログラム（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて１００００個の事象を集めることによって分析した。
【０１４６】
結果：
培養されたｈＢＭＳｃは、リンパ造血系細胞に関連する表面マーカー（すなわち、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ３４）のいずれも発現しておらず、むしろ、シナプス形成を示すＣＤ９０表面マーカー（Ｔｈｙ−１）を発現していた（図２）。
【０１４７】
実施例２
ヒト骨髄間質細胞（ｈＢＭＳｃ）のインビトロ分化
方法：
分化培養：ｈＢＭＳｃを、分化誘導に先だって、３ヶ月間まで「増殖培地」（これは本明細書中上記の実施例１に記載される）で培養した。その後、プラスチック接着性の細胞を「前分化培地」［ＳＰＮ、２ｍＭのグルタミン、Ｎ２補充物（インスリン ２５μｇ／ｍｌ；プロゲステロン ２０ｎＭ；プトレッシン １００μＭ；セレン ３０ｎＭ；トランスフェリン １００μｇ／ｍｌ）、１０％のＦＣＳ、１０ｎｇ／ｍｌの塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）、および１０ｎｇ／ｍｌのヒト上皮増殖因子（ＥＧＦ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）が補充されたＤＭＥＭ］に移した。３７℃で２４時間インキュベーションした後、細胞を「分化用培地」［ＳＰＮ、２ｍＭのグルタミン、Ｎ２補充物（インスリン ２５μｇ／ｍｌ；プロゲステロン ２０ｎＭ；プトレッシン １００μＭ；セレン ３０ｎＭ；１ｘ１０５細胞／ｍｌの密度にされた培地；トランスフェリン １００μｇ／ｍｌ）、２００μＭのブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ；Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭのジブチリル環状ＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ；Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ；Ｓｉｇｍａ）、１０μＭのドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ；Ｓｉｇｍａ）、および１０μＭのレチノイン酸（ＲＡ；Ｓｉｇｍａ）が補充されたＤＭＥＭ］に移し、３７℃で１２時間〜７２時間インキュベーションした。
【０１４８】
増殖評価：ｈＭＢＳｃを、９６ウエルマイクロタイタープレート（１００μｌ／ウエル）に分注された「前分化培地」および「分化培地」に懸濁し、３７℃で１６時間および３９時間インキュベーションした。その後、培養物に１０μＣｉ／ｍｌの３Ｈ−チミジンを補充し、培養物をさらに４時間インキュベーションした。その後、細胞を集め、０．０５％トリプシンおよび２５ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）に懸濁し、液体シンチレーションカウンタ−を用いて分析して、細胞における３Ｈ−チミジンの取り込みレベル（これは増殖活性を示す）を測定した。
【０１４９】
結果：
プラスチック接着性の細胞は、分化誘導後の３時間もの早期に現れ、分化誘導後の７２時間において現れ続ける長い枝分かれプロセスを伴ったニューロン様の紡錘体形状を示した（図３Ａ〜図３Ｆ）。
【０１５０】
３Ｈ−チミジンの取り込みは、分化した細胞では実質的に低下していた（図４）。従って、このことは、増殖がニューロン様の分化したｂＢＭＳｃでは弱められたことを示している。
【０１５１】
実施例３
分化中のｈＢＭＳｃにおけるニューロン転写物の同定
方法
ＲＴ−ＰＣＲ：ｈＢＭＳｃを「増殖培地」または「分化培地」（本明細書中上記の実施例１〜実施例２を参照のこと）において３７℃で３時間〜７２時間インキュベーションした。総ＲＮＡを、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ＆Ｓａｃｃｈｉ（１９８７）によって記載されるようなグアニジンイソチオシアナート法を使用することによってｈＢＭＳｃから抽出した。また、総ＲＮＡは、ＲＮＡ単離キット（Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｇｅｎｔｒａ、Ｍａｎｎｅａｐｏｌｉｓ、米国）を使用して新鮮なヒトリンパ球（ドナー由来）から抽出された。これらのＲＮＡサンプルを１％アガロースのホルムアルデヒド変性ゲル電気泳動で分離して、それらの完全性を確認した。ｃＤＮＡを作製するために、ＲＮＡサンプル（０．５μｇ）を、反応混合物［１．３μＭのランダムプライマー、１ｘ緩衝液（これはＩｎｖｉｔｒｏＧｅｎｅによって供給された）、１０ｍＭのＤＴＴ、２０μＭのｄＮＴＰｓおよびＲＮａｓｅ阻害剤］に含有されるＲＴ−ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ酵素（１０ユニット）と混合し、２５℃で１０分間、４２℃で２時間、７０℃で１５分間、そして９５℃で５分インキュベーションした。得られたｃＤＮＡサンプルを、配列番号１〜２、配列番号１１〜１２、配列番号２１〜２２、配列番号２６〜２６および配列番号２９〜３０（下記の表１を参照のこと）によって示されるプライマーを使用するＰＣＲによって分析し、９４℃で１分間、５５℃〜５８℃で１分間および７２℃で１分間の３５サイクルのもとで増幅した。
表１
分化したｈＢＭＳｃにおけるニューロン転写物およびドーパミン作動性転写物を検出するための異なるエキソンに由来する上流側センスプライマーおよび下流側アンチセンスプライマー
【０１５２】
ノーザンブロット分析：ｈＢＭＳｃから抽出されたＲＮＡサンプルを、３％ホルムアルデヒドおよびＭＯＰＳが補充された１％アガロースゲルでサイズ分画して、Ｄｕｒａｌｏｎ−ＵＶＴＭメンブラン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に転写した。その後、メンブランを、ニューロンマーカーのＮＥＧＦ２（神経突起成長促進因子２）、ＮＦ−２００（ニューロフィラメント重鎖）およびＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）のための精製された３２Ｐ標識プローブと一晩ハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーション後のメンブランを数回洗浄して、保存ホスホルスクリーンに感光させ、ホスホルイメージャー（Ｃｙｃｌｏｎｅ、Ｐａｃｋａｒｄ）によってオートラジオグラフ化し、そして、ＲＮＡの等しい負荷および転写を確認するために、プローブを除き、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）のための３２Ｐ標識プローブで再ハイブリダイゼーションした。
【０１５３】
リアルタイムＰＣＲ：ニューロンマーカーＮＥＧＦ２のリアルタイム定量的ＰＣＲ分析を、Ｓｙｂｅｒｇｒｅｅｎ「ＰＣＲマスターミックス」および配列番号１７〜１８のプライマーを使用して「Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ ＤＮＡサンプル分析システム」バージョン４．６（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で行った。また、ＧＡＰＤＨのリアルタイムＰＣＲ分析を、配列番号９〜１０のプライマーを使用して、サンプル正規化のための促進された条件を提供するために行った。増幅プロトコルは、９５℃で１５秒間、５５℃で４０秒間、７２℃で４０秒間および７７℃で２０秒間の４０サイクルであった。サンプル正規化のための促進された条件が１８Ｓ ｒＲＮＡの増幅によって適用された。増幅プロトコルは、９５℃で２０秒間および６１℃で１分間の８０サイクルであった。１８Ｓ ｒＲＮＡに対する遺伝子発現の定量が、プロトコルのΔΔＣＴ法によって、また、標準曲線法から計算された。
【０１５４】
結果：
ＲＴ−ＰＣＲ分析では、分化したｈＢＭＳｃおよび非分化のｈＢＭＳｃの両方におけるニューロンマーカーのネスチン、ＮＳＥ、ＮＦ−Ｍ、ＣＤ９０、ＲＡ−ＲおよびＧＰＣ４の転写発現が示される（図５Ａ）。しかしながら、ニューロンマーカーのＮＦ−Ｈおよびネクジンの転写発現は、分化したｈＢＭＳｃにおいてだけ生じていた（図５Ａ）。
【０１５５】
リアルタイムＰＣＲ分析では、５０時間のインキュベーションの後、非分化の細胞と比較したとき、分化した細胞においてＮＥＧＦ２のｍＲＮＡの７倍の増大が示される（図５Ｂ）。
【０１５６】
ノーザンブロット分析では、ニューロンマーカーのＮＥＧＦ２、ＮＦ−２００およびＮＳＥの転写発現が分化中のｈＢＭＳｃにおいて著しく増大したことが示される（それぞれ図５Ｂ〜図５Ｄ）。
【０１５７】
実施例４
分化したｈＢＭＳｃにおけるニューロンタンパク質の同定
方法：
ウエスタンブロット：ｈＢＭＳｃから得られたタンパク質抽出物の５０マイクログラムをサンプル緩衝液（６２．５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、５％の２−β−メルカプトエタノール、０．００２５％ブロモフェノールブルー（ＳＩＧＭＡ）において変性させた（サンプルで１：５希釈し、５分間煮沸した）。各サンプルを製造者の説明書に従って１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に負荷した。電気泳動後、タンパク質をポリビニリデンジフルリドメンブラン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に転写し、その後、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＴｒｉｓ緩衝化生理的食塩水（ＴＳＢ；１０ｍＭのＴｒｉｓ（７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）における５％脱脂乳（ブロッキング溶液）を用いてブロッキング処理した。メンブランを、本明細書中下記の表２に記載されるようなニューロンマーカー特異的抗体と４℃で一晩プローブした。インキュベーション後、メンブランをブロッキング溶液で２回（それぞれ１５分）洗浄し、次いでＴＢＳ−Ｔで１回、１５分間洗浄し、その後、本明細書中下記の表３に記載されるような西洋ワサビペルオキシダーゼ共役化二次抗体にさらした。その後、メンブランをブロッキング溶液で２回（それぞれ１５分）洗浄し、次いでＴＢＳ−Ｔで１回、１５分間洗浄し、その後、増強ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）化学発光検出キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して染色し、医療用Ｘ線フィルム（Ｆｕｊｉ Ｐｈｏｔｏ Ｆｉｌｍ）に感光させた。アクチンが、誘導時の変化を評価および定量するために使用された。特定のタンパク質バンドの密度測定を、ＶｅｒｓａＤｏｃ（登録商標）画像化システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびＱｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ（登録商標）ソフトウエア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用することによって行った。
表２
ニューロンマーカー特異的抗体およびドーパミン作動性マーカー特異的抗体
表３
抗マウス二次抗体および抗ウサギ二次抗体
【０１５８】
結果：
免疫染色により、ニューロンマーカー（ＮｅｕＮ、ＮＦ−２００、ＮＳＥ）の存在が、分化誘導後の１２時間、２４時間、４８時間および４８時間の分化中のｈＢＭＳｃにおいてそれぞれ明らかにされた（図６Ａ）。抗体標識されたＧＦＡＰおよびβ−チューブリンＩＩＩが、分化誘導後の４８時間および５日のｈＢＭＳｃにおいてそれぞれ観測された（図６Ｂ）。
【０１５９】
Ｎｅｕ−Ｎタンパク質、ＮＳＥタンパク質およびネスチンタンパク質の（アクチンに対する）発現は、ウエスタンブロット分析によって示されるように、分化誘導の後では実質的に増大していた（図７Ａ〜図７Ｃ）。
【０１６０】
実施例５
分化中のｈＢＭＳｃの長期間の生存
方法：
長期分化培養：ｈＢＭＳｃを「前分化培地」（上記の実施例２を参照のこと）において３７℃で２４時間インキュベーションし、その後、「長期分化培地」［ＳＰＮ、２ｍＭのグルタミン、Ｎ２補充物（インスリン ２５μｇ／ｍｌ；プロゲステロン ２０ｎＭ；プトレッシン １００μＭ；セレン ３０ｎＭ；トランスフェリン １００μｇ／ｍｌ）、１ｍＭのｄｂｃＡＭＰ、０．５ｍＭのＩＢＭＸ、１０μＭのドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ；Ｓｉｇｍａ）、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのヒトグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、および１０ｎｇ／ｍｌのヒトβ−神経増殖因子（β−ＮＧＦ）が補充されたＤＭＥＭ］に移した。ｈＢＭＳｃをこの「長期分化培地」において３７℃で２８日間インキュベーションした。
【０１６１】
免疫アッセイ：細胞を、ポリ−Ｌ−リシン（Ｓｉｇｍａ）で無菌的に事前に処理されたスライドチャンバー（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に置き、処理した。細胞を、ＰＢＳ（ｐＨ７．３）における４％パラホルムアルデヒドを用いて４℃で３０分間、次いで室温で３０分間、固定処理した。その後、スライドをＰＢＳで３回（それぞれ５分）洗浄し、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ）および１０％ヤギ血清（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を含有するＰＢＳを用いて４℃で１０分間、次いで室温で１０分間、透過処理した。その後、スライドをＰＢＳで３回（それぞれ５分）洗浄した。内因性ペルオキシドを、無水メタノール（Ｂｉｏ−Ｌａｂ、イスラエル）における３％Ｈ２Ｏ２（Ｍｅｒｃｋ）を加えることによって室温で２０分間ブロッキング処理した。ＰＢＳにおける３回の洗浄（それぞれ５分）の後、スライドチャンバーを、本明細書中上記の実施例４における表２〜表３に記載されるように希釈された抗ＭＡＰ２、抗β−チューブリンＩＩＩまたは抗ネスチンと４℃で一晩インキュベーションした。翌日、スライドをＰＢＳにおいて３回（それぞれ１０分）徹底的に洗浄し、その後、１０％ヤギ血清および０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳにおけるＣｙ（商標）３−共役化ヤギ抗ウサギＩｇＧまたはＣｙ（商標）２−共役化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と室温で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、スライドをＰＢＳで３回（それぞれ５分）洗浄し、グリセロールビニルアルコール固定液（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で固定し、カバーガラスで覆い、蛍光顕微鏡で調べた。
【０１６２】
結果：
ｈＢＭＳｃは、典型的なニューロン様細胞の形態を「長期分化培地」での２８日間のインキュベーションの後に示した（図８）。
【０１６３】
抗体標識されたニューロンマーカーのＭＡＰ２（微小管結合タンパク質２）、β−チューブリンＩＩＩおよびネスチンが、２８日間のインキュベーションの後のｈＢＭＳｃにおいて観測された（それぞれ図９Ａ〜図９Ｃ）。
【０１６４】
実施例６
分化したｈＢＭＳｃにおけるドーパミン作動性ｍＲＮＡの発現
方法：
ＲＴ−ＰＣＲ：ｈＢＭＳｃを「増殖培地」および「分化培地」（本明細書中上記の実施例１〜実施例２を参照のこと）において１２時間〜７２時間インキュベーションした。総ＲＮＡを、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ＆Ｓａｃｃｈｉ（１９８７）によって記載されるようなグアニジンイソチオシアナート法を使用することによってｈＢＭＳｃから抽出した。ドーパミン作動性マーカーを同定するために設計されたＲＴ−ＰＣＲ法が、配列番号３〜８、配列番号１３〜１４および配列番号２７〜２８のプライマーを使用することを除いて、本質的には本明細書中上記の実施例３に記載されるように行われた。
【０１６５】
結果：
図１０において認められ得るように、数個のドーパミン作動性マーカーの転写物が、分化したｈＢＭＳｃおよび／または非分化のｈＢＭＳｃにおいて発現していた。これらには、Ｎｕｒｒ１［核受容体関連１；ドーパミンニューロンへの中脳前駆体の分化において役割を有する転写因子］およびＡＡＤＣ［芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ；Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）のドーパミンへの脱カルボキシル化、Ｌ−５−ヒドロキシトリプトファンのセロトニンへの脱カルボキシル化、およびＬ−トリプトファンのトリプタミンへの脱カルボキシル化を触媒する酵素］が含まれる。ＧＴＰ［シクロヒドロラーゼ１；ＴＨに対するテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）補因子を産生するために必要な酵素］の転写発現が、非分化のｈＢＭＳｃと比較した場合、分化したｈＢＭＳｃにおいて顕著に高くなっており、一方、Ｄ２ドーパミン受容体およびＤＡＴドーパミン輸送体の転写物が、分化したｈＢＭＳｃにおいてのみ発現していた。
【０１６６】
実施例７
分化したｈＢＭＳｃにおけるチロシンヒドロキシラーゼの誘導
方法：
リアルタイムＰＣＲ：総ＲＮＡを、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ＆Ｓａｃｃｈｉ（１９８７）によって記載されるようなグアニジンイソチオシアナート法を使用してｈＢＭＳｃから抽出した。ｃＤＮＡを、ランダムプライマーを用いてＲＴ反応を行うことによって、本明細書中上記の実施例３に記載されるように作製した。ｃＤＮＡの増幅を、ヒトＴＨおよび１８Ｓ ｒＲＮＡの特異的なプライマーを使用するＴａｑＭａｎ（登録商標）ユニバーサルＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において行った。サンプル正規化のための促進された条件が１８Ｓ ｒＲＮＡの増幅によって適用された。増幅プロトコルは、９５℃で２０秒間および６１℃で１分間の８０サイクルであった。１８Ｓ ｒＲＮＡに対する遺伝子発現の定量が、プロトコルのΔΔＣＴ法によって、また、標準曲線法から計算された。
【０１６７】
ウエスタンブロット分析： アッセイを、抗ＴＨ抗体および抗アクチン抗体を用いた免疫ブロッティングを行うことを除いて、本明細書中上記の実施例４に記載されるように行った。
【０１６８】
免疫アッセイ：アッセイを、本明細書中上記の実施例４における表２〜表３に記載されるような抗ＴＨ抗体を使用して、本明細書中上記の実施例５に記載されるように行った。
【０１６９】
結果
チロシンヒドロキシラーゼのｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルがｈＢＭＳｃのニューロン分化のときに実質的に上昇していた（それぞれ図１１Ａ〜図１１Ｂ）。また、抗体標識されたチロシンヒドロキシラーゼの存在が、分化誘導後６時間〜４８時間の分化中のｈＢＭＳｃにおいて観測された（図１１Ｃ）。
【０１７０】
実施例８
ｈＢＭＳｃにおけるドーパミン関連タンパク質の同定
方法：
免疫アッセイ：ｈＢＭＳｃを「分化培地」（本明細書中上記の実施例２を参照のこと）で５日間インキュベーションし、その後、集め、上記の実施例５に記載される手順を使用して小胞モノアミン輸送体２（ＶＭＡＴ−２）に対して特異的な抗体で染色した。細胞におけるＶＭＡＴ−２に結合している抗体を、二次のＣｙ（商標）３−共役化抗体を使用することによって可視化した。染色された細胞を、レーザー共焦点顕微鏡ＬＳＭ５１０（ＺＥＩＳＳ、ドイツ）で観測した。
【０１７１】
フローサイトメトリー：「分化培地」（本明細書中上記の実施例２を参照のこと）で４８時間インキュベーションした後、細胞を集め、０．０５％トリプシンおよび２５ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した。細胞懸濁物（０．５ｘ１０６細胞／ｍｌ）を、上記の実施例４における表２〜表３に記載されるようなＤ２ドーパミン受容体に対して特異的な抗体と３０分間インキュベーションした。抗体標識された細胞を２容量のＰＢＳで徹底的に洗浄し、フロー緩衝液（ＰＢＳにおける１％パラホルムアルデヒド、０．１％アジ化ナトリウムおよび０．５％ウシ血清アルブミン）において固定処理した。洗浄された細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析した。
【０１７２】
結果：
ｈＢＭＳｃの蛍光顕微鏡像により、抗体標識されたＶＭＡＴ２ドーパミン作動性マーカーが、分化したｈＢＭＳｃに存在し、非分化の細胞には存在しないことが明らかにされた（図１２）。
【０１７３】
同様に、フローサイトメーター分析では、ドーパミノゲニンマーカーＤ２が、分化したｈＢＭＳｃにおいて発現し、非分化の細胞では発現していなかったことが示される（図１３）。
【０１７４】
実施例９
分化中のｈＢＭＳｃによるドーパミン分泌は神経栄養性因子により誘導される
方法：
細胞培養：ｈＢＭＳｃを下記の表４に記載されるように培養した。
表４
ｈＢＭＳｃによるドーパミン分泌を誘導するために使用された培養培地
【０１７５】
ＨＰＬＣ分析：サンプルを、８８μｌの８５％オルトリン酸および４．４ｍｇのメタ重亜硫酸塩を ｍｌのサンプルに加えることによって安定化させた。ドーパミンをアルミニウム吸着（アルミナ、Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）によって抽出した。注入サンプル（５０μｌ）の分離は、逆相Ｃ１８カラム（１２５Ｘ４．６ｍｍ直径、Ｈｉｃｈｒｏｍ，Ｉｎｃ．）をモノクロロ酢酸塩緩衝液移動相において用いたＨＰＬＣ−電子化学検出（ＨＰＬＣ−ＥＣＤ）システムでのイソクラティック溶出によって達成された。流速が１．２ｍｌ／分で設定され、分析セルの酸化電位が＋６５０ｍＶで設定された。結果は、様々な緩衝液条件および検出器設定のもとでのドーパミン標準物との同時溶出によって確認された。
【０１７６】
結果：
分化中のｈＢＭＳｃの上清における測定されたドーパミンの量は、「ドーパミン作動性分化用培地」での７２時間のインキュベーション期間中、検出できないレベルから約２３ｎｇ／ｍｌ（１０５細胞）に増大した（図１４Ａ）。ＫＣｌによって細胞分極を誘導すること（５６ｍＭのＫＣｌを培地に補充し、その後、１０分間のインキュベーションを行うこと）により、ドーパミン分泌がさらに高まった（図１４Ｂ）。分化中のｈＢＭＳｃにより合成されたＤＯＰＡ（ドーパミン前駆体）の量は、「ドーパミン作動性分化用培地」での７２時間のインキュベーション期間中、約１０ｐｇ／ｍｌから３００ｐｇ／ｍｌ（１０５細胞）に増大し（図１４Ｃ）、一方、ＤＯＰＡＣ（ドーパミン代謝産物）の量は、「ドーパミン作動性分化用培地」での５０時間のインキュベーション期間中、検出できないレベルから約１０５ｎｇ／ｍｌ（１０５細胞）に増大した（図１４Ｄ）。
【０１７７】
実施例１０
パーキンソン病についてのラットモデルの線条体におけるマウスＢＭＳｃの移植は回旋行動を改善する
方法：
マウス骨髄間質細胞（マウスＢＭＳｃ）の作製：マウスＢＭＳ細胞を、強化緑色蛍光タンパク質を保有する遺伝子組換え雄マウス（Ｔｇ−ＥＧＦＰ；Ｈａｄｊａｎｔｏｎａｋｉｓ他、１９９８）から得た。マウスを頚部脱臼によって屠殺し、脛骨および大腿骨を取り出し、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に入れた。マウス骨髄細胞を、０．５ｍｌの無菌ＨＢＳＳを詰めた、２５Ｇニードルを有するシリンジ（１ｍｌ）を使用して骨髄を流し出すことによって回収した。回収された細胞を、牛乳のような均質な単一細胞懸濁物が達成されるまで穏やかにピペッティングを繰り返すことによって解離させた。単一細胞懸濁物を５ｍｌのＨＢＳＳにおいて洗浄し、室温で２０分間、１０００ｇのもとで遠心分離した。遠心分離後、上清を捨て、細胞ペレットを１０ｍｌの成長培地に再懸濁した。
【０１７８】
細胞培養：単離されたマウス骨髄細胞を「増殖培地」（本明細書中上記の実施例１を参照のこと）で培養し、３７℃で４８時間インキュベーションした。その後、非接着性の層を捨て、強固に接着した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、新鮮な「増殖培地」で培養した。成長培地を、細胞が７０％〜９０％の密集度に達するまで３日毎〜４日毎に取り替えた。その後、細胞を集め、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（ＰＢＳにおける０．０５％のトリプシンおよび２５ｍＭのＥＤＴＡ）に混合し、３７℃で５分間インキュベーションし、その後、「前分化培地」（本明細書中上記の実施例２を参照のこと）に移し、３７℃で７２時間さらにインキュベーションした。前分化させた細胞をＰＢＳにおいて洗浄し、「分化培地」（本明細書中上記の実施例１を参照のこと）において３７℃で１２時間〜７２時間インキュベーションすることによる神経様分化のために誘導した。
【０１７９】
マウスＢＭＳｃの移植：神経分化した骨髄間質細胞（ｍＢＭＳｃ）を、（Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ他（２００２）によって記載されるように）定位固定フレームを使用して雌６−ＯＨＤＡ障害ラットの黒質に注射した。生理的食塩水の注射が対照として使用された。
【０１８０】
回旋行動の分析：６−ＯＨＤＡ障害ラットを、回旋行動を誘導するためにアンフェタミン（５ｍｇ／ｋｇ）で治療した。アンフェタミンに対する回旋応答が、コンピューター処理される回旋計（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使用して、移植後の３日目、１５日目、３０日目および４５日目に調べられた。
【０１８１】
結果：
アンフェタミン誘導された６−ＯＨＤＡラットへのニューロン誘導ｍＢＭＳｃの移植により、ラットの回旋行動は、移植後４５日目に２時間あたり約３４０回転からたった２５回転に著しく減少していた（図１５Ａ）。治療されたラットの相対的な回旋速度は、移植後４５日目に、生理的食塩水で治療されたラットと比較して９７．９％減少していた（図１５Ｂ）。
【０１８２】
実施例１１
ラット脳における移植されたマウスＢＭＳｃの生存および移動
方法：
ニューロン分化したＴｇ−ＥＧＥＦマウスのＢＭＳｃを、本明細書中上記の実施例１０に記載されるように、調製し、６−ＯＨＤＡラットの黒質（両方の脳半球）に移植した。治療ラットおよび非治療ラット（生理的食塩水のみ）を移植後４５日目に屠殺した。障害ラットおよび非障害ラットの脳半球から得られた組織サンプルを切片化して、移植されたｍＢＭＳｃの印となっている緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の存在について蛍光顕微鏡で観察した。
【０１８３】
結果：
ｍＢＭＳｃは、黒質移植後４５日目に、治療ラットの黒質において生存しており（図１５Ｃ）、治療ラットの線条体に移動していた（図１５Ｄ）。また。移植された細胞は皮質および線条体への移動に成功していた（図１５Ｃ〜図１５Ｄ）。生理的食塩水が注射されたラットでは、回旋行動は変化がなかった。
【０１８４】
実施例１２
稀突起神経膠細胞前駆体に分化したマウスＢＭＳｃ
方法：
細胞培養：マウスＢ５／ＥＧＦＰ（雄）を頚部脱臼によって屠殺し、７０％アルコール溶液を用いて調製した。脛骨および大腿骨を取り出し、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｔ−Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）に入れ、マウス骨髄細胞を、０．５ｍｌの無菌ＨＢＳＳを詰めた、２５Ｇニードルを有するシリンジ（１ｍｌ）を使用して骨髄を流し出すことによって回収した。細胞を、牛乳のような均質な単一細胞懸濁物が達成されるまで数回、穏やかにピペッティングすることによって解離させた。骨髄吸引物を希釈し、５ｍｌのＨＢＳＳを加え、室温（ＲＴ）で２０分間、１０００ｇで遠心分離し、上清を除くことによって洗浄した。細胞ペレットを１ｍｌの成長培地に再懸濁し、１０ｍｌに希釈した。細胞を、ポリスチレンのプラスチック組織培養用の７５ｃｍ２フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）において、「増殖培地」（本明細書中上記の実施例１を参照のこと）に１週間入れた。その後、細胞を、「増殖培地」が補充されたポリリシン被覆のスライドチャンバー（３２００細胞／ウエル）に移し、３７℃で２４時間インキュベーションした。その後、成長培地を、２ｍＭのグルタミン、ＳＰＮ、下記物質の１つまたは複数が補充されたＤＭＥＭから構成される「稀突起神経膠細胞分化培地」で置き換えた：ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ）、インターロイキン−１ｂ（２０ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌ）、ｄｂｃＡＭＰ（１ｍＭ〜２ｍＭ）、レチノイン酸（０．５μＭまたは１μＭ）、ニューロトロフィン−３（５０ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒト血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＡＡ；５ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｎ２補充物、トリヨードチロニエン（Ｔ３；４０ｎｇ／ｍｌ）および毛様体神経栄養因子（２０ｎｇ／ｍｌ；ＣＮＴＦ）。
【０１８５】
免疫アッセイ：培養物を、１日間、２日間または６日間（成長培地を新鮮な培地で２日毎に置き換えながら）、３７℃でインキュベーションして、４％ＰＦＡにおいて固定処理した。細胞を１０％ＦＣＳ溶液においてブロッキング処理し、その後、５ｕｇ／ｍｌの抗Ａ２Ｂ５モノクローナル抗体（１：２００；Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ；１：２００）と４℃で一晩インキュベーションした。その後、細胞を、ＰＢＳにおいて１０分間、２回洗浄し、ヤギ抗マウスＣｙ−３二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；１：５００）と室温で２０分間インキュベーションした。Ａ２Ｂ５（稀突起神経膠細胞前駆体の初期マーカー）について陽性に染色された細胞の出現を、Ｉｍａｇｅ ＰｒｏＰｌｕｓ細胞計数プログラム（Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を備える蛍光顕微鏡を使用して測定した。
【０１８６】
結果：
ニューロン的な細胞形態が、誘導物質のいずれか１つ（ＩＬ−１ｂ、ｄｂｃＡＭＰ、レチノイン酸またはＮＴ−３）を単独で用いて培養された、２４時間のインキュベーションの後の細胞において観測された。細胞形態に対する最も顕著な影響が、ｄｂｃＡＭＰおよびＮＴ−３によって誘導され（図２０Ａ）、同様に、ＩＬ−６および甲状腺因子３によって誘導された（データは示されず）。
【０１８７】
細胞の生存は、誘導物質のいずれか１つを単独で（いずれかの濃度で）用いて６日間インキュベーションした後において正常であった。他方で、誘導物質が組み合わせられたときには、細胞の生存が低下した。
【０１８８】
稀突起神経膠細胞始原細胞のマーカーＡ２Ｂ５について陽性に染色された細胞の出現は全体で８％であった。抗体標識されたＡ２Ｂ５の最高の出現が、ＮＴ−３で治療された細胞において見出された（図２０Ｂ）。
【０１８９】
従って、ＢＭＳｃは、多発性硬化症を治療するために利用され得る稀突起神経膠細胞（ミエリン産生細胞）の前駆体に分化させるために誘導されることができる。
【０１９０】
実施例１３
筋萎縮性脊索硬化症（ＡＬＳ）における細胞置換
方法：
動物：変異したヒトスーパーオキシドジスムターゼ−１遺伝子（ＳＯＤ１；Ｇｕｒｎｅｙ他、１９９４）を発現するＴｇＮ（ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ遺伝子組換えマウスがＣＳＪＦ１において交配された。この遺伝子組換えマウスは３月齢までは健康であったが、その後、ＡＬＳが悪化し、４月齢〜５月齢で完全に麻痺した。
【０１９１】
移植：ニューロン分化した雄マウスＢＭＳｃを本明細書中上記の実施例１０に記載されるように得た。細胞を雌の変異ＳＯＤ１遺伝子組換えマウスおよび野生型マウスの脊髄（大槽）内に注射した（１０５細胞／注射；治療群あたり５匹の動物による反復）。生理的食塩水の注射が対照として使用された。
【０１９２】
運動機能の評価：治療マウスおよび非治療マウス（生理的食塩水のみ）の回旋行動が、回旋計（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使用することによって毎週評価された。
【０１９３】
結果：
ＳＯＤ１を発現するマウスは、７週目以降からの回旋成績の実質的な低下および４ヶ月後〜５ヶ月後での完全な麻痺によって示されるように筋萎縮性脊索硬化症（ＡＬＳ）に罹患した（図２１）。
【０１９４】
ＰＣＲ分析では、（雄由来の移植された細胞を示す）Ｙ染色体が、治療された雌マウスの脊髄に存在することが検出された。Ｙ染色体は、治療された雌マウスのどの他の組織においても検出されなかった（図２２）。
【０１９５】
７週齢の治療された野生型の回旋行動は、非治療（生理的食塩水のみ）の野生型マウスとは著しく異なっていなかった（図２３）。他方で、治療されたＳＯＤ１マウスは、運動機能の改善を示す回旋行動の実質的な低下を示した（図２４）。
【０１９６】
実施例１４
Ｎｕｒｒ１発現ベクターの構築
核受容体関連１（Ｎｕｒｒ−１）は、ドーパミンニューロンへの中脳前駆体の分化に関与する転写因子である。ヒトＮｕｒｒ１の全長ｃＤＮＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿１７３１７１）を、５’ＢａｍＨＩプライマーおよび３’ＸｂａＩプライマー（配列番号３１〜３２によって示されるプライマー）を使用して、高忠実Ｔａｑポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ、日本）を使用して増幅した。増幅のＰＣＲ条件は下記の通りであった：９５℃で１分間、５６℃で１分間、７２℃で１分間の１０サイクル；９５℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間の１０サイクル；９５℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で１分間の１０サイクル。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＸｂａＩの制限酵素で消化し、得られたフラグメントを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を使用して、図１７に例示されるような発現ベクターｐｃＤＮＡ−３．１Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）に挿入し、クローン化した。
【０１９７】
ヒト骨髄間質細胞（ｈＢＭＳｃ；６０％〜８０％のコンフルエンス）を、ＦｕＧＥＮＥ−６トランスフェクション試薬を製造者の推奨法（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）に従って使用してｐｃＤＮＡＮｕｒｒ１でトランスフェクションした。安定的にトランスフェクションされた細胞を、５００μｇ／ｍＬのネオマイシン（Ｇ４１８硫酸塩、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を含有する成長培地で単離した。総ＲＮＡを、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ＆Ｓａｃｃｈｉ（１９８７）によって記載されるように、単離されたネオマイシン抵抗性ｈＢＭＳｃから抽出し、Ｎｕｒｒ１転写物の存在を、本明細書中上記の実施例３に記載されるようなＲＴ−ＰＣＲ手法を使用して確認した。
【０１９８】
実施例１５
チロシンヒドロキシラーゼのドキシサイクリン調節による発現のためのｈＢＭＳｃの形質転換
誘導可能なチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）発現を、下記のように構築され得る応答性ベクターおよび調節ベクターでｈＢＭＳｃを形質転換することによって達成することができる。
【０１９９】
ＴＨ応答性ベクター：１．５ｋｂのヒトチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子（ＴＨ、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０００３６０）を、高忠実Ｔａｑポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ、日本）、配列番号３９〜４０により示されるプライマーを使用するＰＣＲによってヒトｃＤＮＡから単離することができる。ＴＨのｃＤＮＡは、図１９Ａに例示されるようなｐＢＩ−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｔｅｔ−Ｏｆｆ（商標）遺伝子発現システムおよびＴｅｔ−Ｏｎ（商標）遺伝子発現システム）に挿入される。
【０２００】
ＴＨ調節ベクター：１．３ｋｂのヒトＮＳＥ遺伝子（ＨＳＥＮＯ２、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセション番号Ｘ５１９５６）のプロモーターが、配列番号３７〜３８のプロモーターを使用するＰＣＲによってヒトｃＤＮＡから単離される。ＮＳＥプロモーターのｃＤＮＡは、その後、図１９Ａに例示されるように、５−ＬＴＲ−Ψ＋の代わりに、ｐＲｅｖＴｅｔ−Ｏｆｆ−ＩＮ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）において転写活性化因子遺伝子（ｔＴＡ；Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＢｕｊａｒｄ，Ｈ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７〜５５１、１９９２）の上流に挿入される。ｎｅｏｒ遺伝子を有する陽性のクローンが、抗生物質ネオマイシンを使用して選択される。
【０２０１】
ｈＢＭＳｃは、本明細書中上記で記載される形質転換方法のいずれかを使用して応答性ベクターおよび調節ベクター（Ｔｅｔ−ｏｆｆ／Ｔｅｔ−ｏｎシステム）の両方で形質転換することができる。細胞に導入されると、テトラサイクリンにより制御されるトランス活性化因子（ｔＴＡ）と、ネオマイシン抵抗性をコードする遺伝子（Ｎｅｏｒ）との間に存在する内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む調節ベクターにより、これら２つのエレメントが同時に発現される。発現したｔＴＡは、応答ベクターに存在するテトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）と結合し、それによりＴＨの転写を活性化する。しかしながら、ドキシサイクリン（血液脳関門を横断する抗生物質）が存在する場合、ＴＲＥに対するｉＴＡの結合が阻止され、それにより、ＴＨの転写が停止させられる。ＴＨのこの薬物制御された発現が図１９Ｂに概略的に図示される。
【０２０２】
従って、ｈＢＭＳｃは、経口投与することができるドキシサイクリンなどの負の調節因子の制御下でＴＨを発現するように遺伝子改変することができる。
【０２０３】
ＴＨの発現はドーパミンの合成をもたらすので、遺伝子改変されたｈＢＭＳｃは、パーキンソン病などの神経変性疾患の安全かつ効果的な治療を提供するために細胞置換治療において使用することができる。
【０２０４】
ＴＨの発現を誘導する作用物を使用する正の調節もまた、例えば、ＴＨ遺伝子を含有する応答性ベクターｐＤＨＳＰと、調節因子ベクターｐＶｇＲＸＲとを利用するエクジソン誘導可能な哺乳動物発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して達成され得ることが理解される。誘導因子（例えば、ポナステロンＡまたはムリステロンＡ）が存在する場合、機能的なエクジソン受容体がエクジソン応答性プロモーターの上流側で結合し、ＴＨの発現を活性化する。
【０２０５】
分かりやすくするため別個の実施態様で説明されている本発明のいくつもの特徴は、組み合わせて単一の実施態様にして提供することもできることは分かるであろう。逆に簡略化するため単一の実施態様で説明されている本発明の各種特徴は、別個に又は適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０２０６】
本発明を、その具体的実施態様とともに説明してきたが、多くの代替、変形及び変更が当業技術者には明らかであることは明白である。したがって、本発明は、本願の特許請求の範囲の精神と広い範囲内に入っているこのような代替、変形及び変更をすべて含むものであることを意図する。本明細書に記載のすべての刊行物、特許及び特許願及びＧｅｎＢａｎｋは、あたかも、個々の刊行物、特許又は特許願及びＧｅｎＢａｎｋ各々が、本願に具体的にかつ個々に参照して示されているように、本願に援用するものである。さらに、本願における任意の文献の引用もしくは確認は、このような文献が本発明に対する従来技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０２０７】
【図１】非分化のヒト骨髄間質細胞（ｈＢＭＳｃ）の光学顕微鏡像を例示する（図１Ａ〜図１Ｃ）。
【図２】非分化ｈＢＭＳｃのフローサイトメーター分析を例示する。
【図３】ニューロンに分化した成人ｈＢＭＳｃの光学顕微鏡像を例示する。
【図４】「分化用培地」で培養されたｈＢＭＳｃ、および「前分化用培地」（下記の実施例の実施例２を参照のこと）で培養されたｈＢＭＳｃにおける３Ｈ−チミジン取り込み（これは細胞増殖を示す）を例示する。
【図５ａ】ニューロン転写物を同定するために計画されたＲＴ−ＰＣＲ分析を例示する。
【図５ｂ】ＮＥＧＦ２の３２Ｐ標識されたＰＣＲ産物をプローブとして利用したノーザンブロット分析およびリアルタイムＰＣＲ分析を例示する。
【図５ｃ−ｄ】図５Ｃは、ニューロフィラメント２００（ＮＦ−２００）の３２Ｐ標識されたＰＣＲ産物をプローブとして利用したノーザンブロット分析を例示する。図５Ｄは、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）の３２Ｐ標識されたＰＣＲ産物をプローブとして利用したノーザンブロット分析を例示する。
【図６】「分化培地」（下記の実施例の実施例２を参照のこと）で１２時間〜５日間培養されたｈＢＭＳｃにおけるニューロンマーカーの蛍光顕微鏡像を例示する（図６Ａ〜図６Ｂ）。図６Ａは、抗体で標識されたニューロン核特異的マーカー（ＮｅｕＮ；１２時間後に発現した）、ニューロフィラメント重鎖（ＮＦ−２００；２４時間後に発現した）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ；４８時間後に発現した）およびネスチン（４８時間後に発現した）を例示する。図６Ｂは、抗体で標識されたグリア原線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ；４８時間後に発現した）およびβ−チューブリンＩＩＩ（５日後に発現した）を例示する。
【図７ａ−ｂ】ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ；図７Ａ）、ニューロン核特異的マーカー（ＮｅｕＮ；図７Ｂ）およびネスチン（図７Ｃ）の上昇した発現を示す、分化したｈＢＭＳｃのウエスタンブロット分析を例示する。
【図７ｃ】ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ；図７Ａ）、ニューロン核特異的マーカー（ＮｅｕＮ；図７Ｂ）およびネスチン（図７Ｃ）の上昇した発現を示す、分化したｈＢＭＳｃのウエスタンブロット分析を例示する。
【図８】「長期分化培地」（下記の実施例の実施例５を参照のこと）で２８日間インキュベーションした後におけるニューロン様の分化したｈＢＭＳｃの光学顕微鏡像を例示する。
【図９ａ】分化した細胞におけるニューロンマーカーのβ−チューブリンＩＩＩの抗体標識された発現を例示する。
【図９ｂ】分化した細胞におけるニューロンマーカーのＭＡＰ−２の抗体標識された発現を例示する。
【図９ｃ】分化した細胞におけるニューロンマーカーのネスチンの抗体標識された発現を例示する。
【図１０】「分化培地」（下記の実施例の実施例２を参照のこと）で１２時間〜７２時間培養されたｈＢＭＳｃにおけるドーパミン作動性マーカーを同定するために計画されたＲＴ−ＰＣＲ分析を例示する。
【図１１ａ−ｂ】図１１Ａは、分化した細胞における上昇したＴＨ転写を示すリアルタイムＰＣＲ分析を例示する（図１１Ａ〜図１１Ｃ）。図１１Ｂは、分化した細胞におけるＴＨの上昇したレベルを示すウエスタンブロット分析を例示する。
【図１１ｃ】分化した細胞における抗体標識されたＴＨ発現を強調する蛍光顕微鏡像を例示する。
【図１２】分化した細胞における抗体標識された小胞モノアミン輸送体２（ＶＭＡＴ−２）を強調する、「分化培地」（下記の実施例の実施例２を参照のこと）で５日間インキュベーションされたｈＢＭＳｃの共焦点蛍光顕微鏡像を例示する。
【図１３】「分化培地」（下記の実施例の実施例２を参照のこと）で４８時間インキュベーションされたｈＢＭＳｃのフローサイトメーター分析を例示する。
【図１４ａ−ｂ】図１４Ａは、「分化培地」（下記の実施例の実施例２を参照のこと）で０〜９６時間インキュベーションされたｈＢＭＳｃの上清における測定されたドーパミンのレベルを例示する。図１４Ｂは、「分化培地」で０〜９６時間インキュベーションされ、その後、５６ｍＭのＫＣｌ溶液において１０分間さらにインキュベーションされたｈＢＭＳｃの上清における測定されたドーパミンのレベルを例示する。
【図１４ｃ−ｄ】図１４Ｃは、「分化培地」で０〜７２時間インキュベーションされたｈＢＭＳｃの上清における測定されたドーパミン前駆体ＤＯＰＡのレベルを例示する。図１４Ｄは、「分化培地」で０〜５０時間培養されたｈＢＭＳｃの上清における測定されたドーパミン代謝産物ＤＯＰＡＣのレベルを例示する。
【図１５ａ−ｂ】図１５Ａは、移植後の経時的な回旋速度の変化を例示し、低下しつつある回旋（これは運動機能の改善を示す）を移植後４５日目に示している。図１５Ｂは、移植後の経時的な（非治療マウスと比較したときの）相対的回旋における変化を例示し、相対的回旋の９７．９％の減少を移植後４５日目に示している。
【図１５ｃ−ｄ】図１５Ｃは、移植後４５日目の治療されたマウスの黒質に存在する移植されたｍＢＭＳｃを強調する蛍光顕微鏡像を例示する。図１５Ｄは、黒質移植後４５日目の治療されたマウスの線条体に存在する移植されたｍＢＭＳｃを強調する蛍光顕微鏡像を例示する。
【図１６ａ−ｂ】図１６Ａは、トリプトファンヒドロキシラーゼの発現を示すウエスタンブロット分析を例示する。図１６Ｂは、トリプトファンヒドロキシラーゼの転写を示すＲＴ−ＰＣＲ分析を例示する
【図１６ｃ】ＤＯＰＡＣ（ドーパミン代謝産物）および５ＨＩＡＡ（セロトニン代謝産物）の合成を示すＨＰＬＣ分析を例示する。
【図１７】ｐｃＤＮＡ−３．１Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）に挿入されたＮｕｒｒ−１コード配列を含有する発現ベクターの構築物を例示する。
【図１８】ドーパミン作動性細胞の負の選択のために設計された構築物を例示する。
【図１９ａ】このシステムの調節因子構築物および応答構築物を例示する。
【図１９ｂ】このシステムの作用様式を記載する概略図を例示する。
【図２０】ＧＦＰ−Ｔｇマウスの分化したＢＭＳｃ（ｍＢＭＳｃ）の蛍光顕微鏡像を例示する（図２０Ａ〜図２０Ｂ）。図２０Ａは、「分化培地」（実施例１参照）により誘導される形態学的変化の蛍光顕微鏡像を例示する。図２０Ｂは、ＮＴ−３誘導のｍＢＭＳｃにおいて発現する抗体標識されたＡ２Ｂ５（稀突起神経膠細胞前駆体のマーカー）を強調する蛍光顕微鏡像を例示する。
【図２１】ＳＯＤ１を発現するマウス（筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の動物モデル）の回旋成績における経時変化を例示する。
【図２２】雄由来のｍＢＭＳｃが大槽内に移植された後の１週間目にサンプリングされた雌マウスの種々の組織のＰＣＲ分析を例示する。
【図２３】７週齢のときにその脊髄内へのｍＢＭＳｃ移植を受けた野生型マウスのロータロド（ｒｏｔａｒｏｄ）成績（回旋行動を示す）を例示する。
【図２４】７週齢のときにその脊髄内へのｍＢＭＳｃ移植を受けたＳＯＤ１マウス（筋萎縮性側索硬化症のモデル）のロータロド成績（回旋行動を示す）を例示する。
【配列表フリーテキスト】
【０２０８】
配列番号１〜４０は一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列である。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経伝達物質の外因的に調節可能な合成が可能であり、それにより神経変性障害を治療することができる細胞を、その必要性のある個体に投与することを含む、神経変性障害を治療する方法。
【請求項２】
前記細胞における前記神経伝達物質の前記合成を調節することができる作用物または条件に前記個体をさらすことをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞は、前記神経伝達物質の外因的に調節可能な合成が可能であるように遺伝子改変される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞は、前記神経伝達物質の前記合成に関係する酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現構築物で形質転換され、この場合、前記発現構築物は、前記ポリヌクレオチドの発現が前記作用物により制御可能であるように設計される請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記作用物は、前記神経伝達物質の前記合成に関係する前記酵素の発現をダウンレギュレーションすることができる請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記作用物は、前記神経伝達物質の前記合成に関係する前記酵素の発現をアップレギュレーションすることができる請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞は、第１の調節配列の転写制御下に配置された、神経伝達物質の合成に関係する酵素をコードする第１のポリヌクレオチド配列と、第２の調節配列の転写制御下に配置された、トランス活性化因子をコードする第２のポリヌクレオチド配列とを含む少なくとも１つの発現構築物で形質転換され、この場合、前記トランス活性化因子は、前記作用物の非存在下で、前記第１の調節配列を活性化して、前記第１のポリヌクレオチド配列の転写を行わせることができる請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記作用物はドキシサイクリンである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記トランス活性化因子はテトラサイクリン制御のトランス活性化因子である請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の調節配列はテトラサイクリン応答エレメントを含む請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記酵素は、チロシンヒドロキシラーゼ、ＤＯＰＡデカルボキシラーゼ、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ、ドーパミンβ−ヒドロキシラーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、トリプトファン−５モノオキシゲナーゼおよびコリンアセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２の調節配列はヒト特異的エノラーゼのプロモーターを含む請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記神経変性障害は、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、アルツハイマー病およびハンチングトン病からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記神経変性障害はパーキンソン病である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記神経伝達物質は、ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、γ−アミノ酪酸、セロトニン、アセチルコリンおよびグルタミン酸からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記神経伝達物質はドーパミンである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞は骨髄細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記骨髄細胞は骨髄間質細胞である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞はニューロン様細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ニューロン様細胞は、前記神経伝達物質の前記合成に関係する前記酵素の内因性活性を有しない請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ニューロン様細胞は少なくとも１つのニューロンマーカーを発現する請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ニューロンマーカーは、ＣＤ９０、ニューロン特異的核タンパク質、ニューロフィラメント重鎖、ニューロン特異的エノラーゼ、β−チューブリン３、ＭＡＰ−２、チロシンヒドロキシラーゼ、微小管結合タンパク質、ネスチンおよびカルビンジンからなる群から選択される請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞を投与することは、前記細胞を前記個体の脳組織内に移植することによって達成される請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞を投与することは、前記細胞を前記個体の脊髄内に移植することによって達成される請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記個体をさらすことは、前記作用物を前記個体に経口投与することによって達成される請求項２に記載の方法。
【請求項２６】
前記個体をさらすことは、前記作用物を前記個体に注入することによって達成される請求項２に記載の方法。
【請求項２７】
（ａ）神経伝達物質の外因的に調節可能な合成が可能である細胞を、その必要性のある個体に投与する工程、および（ｂ）前記細胞における前記神経伝達物質の前記合成を調節することができる作用物または条件に前記個体を定期的にさらし、それにより神経変性障害を治療する工程を含む、神経変性障害を治療する方法。
【請求項２８】
前記細胞は、前記神経伝達物質の外因的に調節可能な合成が可能であるように遺伝子改変される請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞は、前記神経伝達物質の前記合成に関係する酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現構築物で形質転換され、この場合、前記発現構築物は、前記ポリヌクレオチドの発現が前記作用物により制御可能であるように設計される請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記作用物は、前記神経伝達物質の前記合成に関係する前記酵素の発現をダウンレギュレーションすることができる請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記作用物は、前記神経伝達物質の前記合成に関係する前記酵素の発現をアップレギュレーションすることができる請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記神経変性障害は、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、アルツハイマー病およびハンチングトン病からなる群から選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記神経変性障害はパーキンソン病である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記神経伝達物質は、ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、γ−アミノ酪酸、セロトニン、アセチルコリンおよびグルタミン酸からなる群から選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記神経伝達物質はドーパミンである請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記酵素は、チロシンヒドロキシラーゼ、ＤＯＰＡデカルボキシラーゼ、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ、ドーパミンβ−ヒドロキシラーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、トリプトファン−５モノオキシゲナーゼおよびコリンアセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞は骨髄細胞である請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
前記骨髄細胞は骨髄間質細胞である請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞はニューロン様細胞である請求項２７に記載の方法。
【請求項４０】
前記ニューロン様細胞は少なくとも１つのニューロンマーカーを発現する請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ニューロンマーカーは、ＣＤ９０、ニューロン特異的核タンパク質、ニューロフィラメント重鎖、ニューロン特異的エノラーゼ、β−チューブリン３、ＭＡＰ−２、チロシンヒドロキシラーゼ、微小管結合タンパク質、ネスチンおよびカルビンジンからなる群から選択される請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞は、前記作用物が存在しないとき、活性化因子分子が応答エレメントと結合し、それにより前記チロシンヒドロキシラーゼの発現をアップレギュレーションするように前記作用物の調節可能な制御下でチロシンヒドロキシラーゼを発現させるために遺伝子改変される請求項２７に記載の方法。
【請求項４３】
前記作用物はドキシサイクリンである請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記活性化因子分子はテトラサイクリン制御のトランス活性化因子である請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記応答エレメントはテトラサイクリン応答エレメントである請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
神経伝達物質の合成に関係する酵素をコードするポリヌクレオチド配列を、哺乳動物細胞における前記酵素の発現を調節することができる調節配列の制御下に配置されて含む核酸構築物。
【請求項４７】
前記調節配列はテトラサイクリン応答エレメントを含む請求項４６に記載の核酸構築物。
【請求項４８】
前記酵素は、チロシンヒドロキシラーゼ、ＤＯＰＡデカルボキシラーゼ、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ、ドーパミンβ−ヒドロキシラーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、トリプトファン−５モノオキシゲナーゼおよびコリンアセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される請求項４６に記載の核酸構築物。
【請求項４９】
神経伝達物質の合成に関係する酵素をコードする第１のポリヌクレオチド配列を第１の調節配列の転写制御下に配置されて含む第１の発現構築物と、トランス活性化因子をコードする第２のポリヌクレオチド配列を第２の調節配列の転写制御下に配置されて含む第２の発現構築物とを含む構築物システムであって、この場合、前記トランス活性化因子は、前記第１の調節配列を活性化して、前記第１のポリヌクレオチド配列の転写を行わせることができる構築物システム。
【請求項５０】
前記神経伝達物質はドーパミンである請求項４９に記載の構築物システム。
【請求項５１】
前記酵素はチロシンヒドロキシラーゼである請求項４９に記載の構築物システム。
【請求項５２】
前記第１の調節配列はテトラサイクリン応答エレメントを含む請求項４９に記載の構築物システム。
【請求項５３】
前記トランス活性化因子はテトラサイクリン制御のトランス活性化因子である請求項４９に記載の構築物システム。
【請求項５４】
請求項４６に記載の核酸構築物を含む細胞。
【請求項５５】
前記細胞は、前記神経伝達物質の前記合成に関係する前記酵素の内因性活性を有しないニューロン様細胞である請求項５４に記載の細胞。
【請求項５６】
アポトーシス阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む請求項５４に記載の細胞。
【請求項５７】
請求項４９に記載の構築物システムを含む細胞。
【請求項５８】
前記細胞は、前記神経伝達物質の前記合成に関係する前記酵素の内因性活性を有しないニューロン様細胞である請求項５６に記載の細胞。
【請求項５９】
アポトーシス阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む請求項５７に記載の細胞。
【請求項６０】
神経変性障害を治療する際に使用される細胞を作製する方法であって、（ａ）骨髄細胞を単離する工程、（ｂ）前記骨髄細胞を維持および／または拡大することができる増殖用培地において前記骨髄細胞をインキュベーションする工程、（ｃ）工程（ｂ）から得られる細胞から骨髄間質細胞を選択する工程、および（ｄ）少なくとも１つの多不飽和脂肪酸および少なくとも１つの分化用作用物を含む分化用培地において前記骨髄間質細胞をインキュベーションし、それにより、神経変性障害を治療する際に使用される細胞を作製する工程を含む方法。
【請求項６１】
前記増殖培地は、ＤＭＥＭ、ＳＰＮ、Ｌ−グルタミン、ＦＣＳ、２−β−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸およびＥＧＦを含む請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
工程（ｄ）の前に、工程（ｃ）から得られた細胞を前分化用培地においてインキュベーションし、それにより前記細胞をニューロン様細胞に分化させやすくすることをさらに含む請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前分化用培地はｂＦＧＦを含む請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記前分化用培地は、ＤＭＥＭ、ＳＰＮ、Ｌ−グルタミン、Ｎ２補充物およびＦＣＳをさらに含む請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記少なくとも１つの多不飽和脂肪酸はドコサヘキサエン酸である請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
前記少なくとも１つの分化用作用物は、ＢＨＡ、ｄｂｃＡＭＰおよびＩＢＭＸからなる群から選択される請求項６０に記載の方法。
【請求項６７】
前記分化用培地は、ＤＭＥＭ、ＳＰＮ、Ｌ−グルタミン、Ｎ２補充物およびレチノイン酸をさらに含む請求項６０に記載の方法。
【請求項６８】
工程（ａ）は吸引によって達成される請求項６０に記載の方法。
【請求項６９】
工程（ｃ）は、表面接着細胞を集めることによって達成される請求項６０に記載の方法。
【請求項７０】
神経伝達物質を合成することができる骨髄由来間質細胞を含む細胞集団。
【請求項７１】
前記神経伝達物質はドーパミンである請求項７０に記載の細胞集団。
【請求項７２】
前記神経伝達物質はセロトニンである請求項７０に記載の細胞集団。
【請求項７３】
少なくとも２つのタイプの神経伝達物質を合成することができる骨髄由来ニューロン様細胞を含む混合細胞集団。
【請求項７４】
前記少なくとも２つのタイプの神経伝達物質は、ドーパミンを含む請求項７３に記載の混合細胞集団。
【請求項７５】
前記少なくとも２つのタイプの神経伝達物質は、セロトニンを含む請求項７３に記載の混合細胞集団。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経伝達物質の外因的に調節可能な合成が可能であり、それにより神経変性障害を治療することができる細胞を、その必要性のある個体に投与することを含む、神経変性障害を治療する方法。
【請求項２】
前記細胞における前記神経伝達物質の前記合成を調節することができる作用物または条件に前記個体をさらすことをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）神経伝達物質の外因的に調節可能な合成が可能である細胞を、その必要性のある個体に投与する工程、および（ｂ）前記細胞における前記神経伝達物質の前記合成を調節することができる作用物または条件に前記個体を定期的にさらし、それにより神経変性障害を治療する工程を含む、神経変性障害を治療する方法。
【請求項４】
前記細胞は、前記神経伝達物質の外因的に調節可能な合成が可能であるように遺伝子改変される請求項１又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞は、前記神経伝達物質の前記合成に関係する酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現構築物で形質転換され、この場合、前記発現構築物は、前記ポリヌクレオチドの発現が前記作用物により制御可能であるように設計される請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６】
前記作用物は、前記神経伝達物質の前記合成に関係する前記酵素の発現をダウンレギュレーションすることができる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記作用物は、前記神経伝達物質の前記合成に関係する前記酵素の発現をアップレギュレーションすることができる請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞は、第１の調節配列の転写制御下に配置された、神経伝達物質の合成に関係する酵素をコードする第１のポリヌクレオチド配列と、第２の調節配列の転写制御下に配置された、トランス活性化因子をコードする第２のポリヌクレオチド配列とを含む少なくとも１つの発現構築物で形質転換され、この場合、前記トランス活性化因子は、前記作用物の非存在下で、前記第１の調節配列を活性化して、前記第１のポリヌクレオチド配列の転写を行わせることができる請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記作用物はドキシサイクリンである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記トランス活性化因子はテトラサイクリン制御のトランス活性化因子である請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の調節配列はテトラサイクリン応答エレメントを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素は、チロシンヒドロキシラーゼ、ＤＯＰＡデカルボキシラーゼ、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ、ドーパミンβ−ヒドロキシラーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、トリプトファン−５モノオキシゲナーゼおよびコリンアセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２の調節配列はヒト特異的エノラーゼのプロモーターを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記神経変性障害は、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、アルツハイマー病およびハンチングトン病からなる群から選択される請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１５】
前記神経変性障害はパーキンソン病である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記神経伝達物質は、ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、γ−アミノ酪酸、セロトニン、アセチルコリンおよびグルタミン酸からなる群から選択される請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１７】
前記神経伝達物質はドーパミンである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞は骨髄細胞である請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１９】
前記骨髄細胞は骨髄間質細胞である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞はニューロン様細胞である請求項１又は３に記載の方法。
【請求項２１】
前記ニューロン様細胞は、前記神経伝達物質の前記合成に関係する前記酵素の内因性活性を有しない請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ニューロン様細胞は少なくとも１つのニューロンマーカーを発現する請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ニューロンマーカーは、ＣＤ９０、ニューロン特異的核タンパク質、ニューロフィラメント重鎖、ニューロン特異的エノラーゼ、β−チューブリン３、ＭＡＰ−２、チロシンヒドロキシラーゼ、微小管結合タンパク質、ネスチンおよびカルビンジンからなる群から選択される請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞を投与することは、前記細胞を前記個体の脳組織内に移植することによって達成される請求項１又は３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞を投与することは、前記細胞を前記個体の脊髄内に移植することによって達成される請求項１又は３に記載の方法。
【請求項２６】
前記個体をさらすことは、前記作用物を前記個体に経口投与することによって達成される請求項２又は３に記載の方法。
【請求項２７】
前記個体をさらすことは、前記作用物を前記個体に注入することによって達成される請求項２又は３に記載の方法。
【請求項２８】
神経変性障害を治療する際に使用される細胞を作製する方法であって、（ａ）骨髄細胞を単離する工程、（ｂ）前記骨髄細胞を維持および／または拡大することができる増殖用培地において前記骨髄細胞をインキュベーションする工程、（ｃ）工程（ｂ）から得られる細胞から骨髄間質細胞を選択する工程、および（ｄ）少なくとも１つの多不飽和脂肪酸および少なくとも１つの分化用作用物を含む分化用培地において前記骨髄間質細胞をインキュベーションし、それにより、神経変性障害を治療する際に使用される細胞を作製する工程を含む方法。
【請求項２９】
前記増殖培地は、ＤＭＥＭ、ＳＰＮ、Ｌ−グルタミン、ＦＣＳ、２−β−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸およびＥＧＦを含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
工程（ｄ）の前に、工程（ｃ）から得られた細胞を前分化用培地においてインキュベーションし、それにより前記細胞をニューロン様細胞に分化させやすくすることをさらに含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前分化用培地はｂＦＧＦを含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記前分化用培地は、ＤＭＥＭ、ＳＰＮ、Ｌ−グルタミン、Ｎ２補充物およびＦＣＳをさらに含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの多不飽和脂肪酸はドコサヘキサエン酸である請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの分化用作用物は、ＢＨＡ、ｄｂｃＡＭＰおよびＩＢＭＸからなる群から選択される請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記分化用培地は、ＤＭＥＭ、ＳＰＮ、Ｌ−グルタミン、Ｎ２補充物およびレチノイン酸をさらに含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
工程（ａ）は吸引によって達成される請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
工程（ｃ）は、表面接着細胞を集めることによって達成される請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
神経伝達物質を合成することができる骨髄由来間質細胞を含む細胞集団。
【請求項３９】
前記神経伝達物質はドーパミンである請求項３８に記載の細胞集団。
【請求項４０】
前記神経伝達物質はセロトニンである請求項３８に記載の細胞集団。
【請求項４１】
少なくとも２つのタイプの神経伝達物質を合成することができる骨髄由来ニューロン様細胞を含む混合細胞集団。
【請求項４２】
前記少なくとも２つのタイプの神経伝達物質は、ドーパミンを含む請求項４１に記載の混合細胞集団。
【請求項４３】
前記少なくとも２つのタイプの神経伝達物質は、セロトニンを含む請求項４１に記載の混合細胞集団。
【請求項１】
神経伝達物質の外因的に調節可能な合成が可能であり、それにより神経変性障害を治療することができる細胞を、その必要性のある個体に投与することを含む、神経変性障害を治療する方法。
【請求項２】
前記細胞における前記神経伝達物質の前記合成を調節することができる作用物または条件に前記個体をさらすことをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞は、前記神経伝達物質の外因的に調節可能な合成が可能であるように遺伝子改変される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞は、前記神経伝達物質の前記合成に関係する酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現構築物で形質転換され、この場合、前記発現構築物は、前記ポリヌクレオチドの発現が前記作用物により制御可能であるように設計される請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記作用物は、前記神経伝達物質の前記合成に関係する前記酵素の発現をダウンレギュレーションすることができる請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記作用物は、前記神経伝達物質の前記合成に関係する前記酵素の発現をアップレギュレーションすることができる請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞は、第１の調節配列の転写制御下に配置された、神経伝達物質の合成に関係する酵素をコードする第１のポリヌクレオチド配列と、第２の調節配列の転写制御下に配置された、トランス活性化因子をコードする第２のポリヌクレオチド配列とを含む少なくとも１つの発現構築物で形質転換され、この場合、前記トランス活性化因子は、前記作用物の非存在下で、前記第１の調節配列を活性化して、前記第１のポリヌクレオチド配列の転写を行わせることができる請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記作用物はドキシサイクリンである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記トランス活性化因子はテトラサイクリン制御のトランス活性化因子である請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の調節配列はテトラサイクリン応答エレメントを含む請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記酵素は、チロシンヒドロキシラーゼ、ＤＯＰＡデカルボキシラーゼ、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ、ドーパミンβ−ヒドロキシラーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、トリプトファン−５モノオキシゲナーゼおよびコリンアセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２の調節配列はヒト特異的エノラーゼのプロモーターを含む請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記神経変性障害は、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、アルツハイマー病およびハンチングトン病からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記神経変性障害はパーキンソン病である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記神経伝達物質は、ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、γ−アミノ酪酸、セロトニン、アセチルコリンおよびグルタミン酸からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記神経伝達物質はドーパミンである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞は骨髄細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記骨髄細胞は骨髄間質細胞である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞はニューロン様細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ニューロン様細胞は、前記神経伝達物質の前記合成に関係する前記酵素の内因性活性を有しない請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ニューロン様細胞は少なくとも１つのニューロンマーカーを発現する請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ニューロンマーカーは、ＣＤ９０、ニューロン特異的核タンパク質、ニューロフィラメント重鎖、ニューロン特異的エノラーゼ、β−チューブリン３、ＭＡＰ−２、チロシンヒドロキシラーゼ、微小管結合タンパク質、ネスチンおよびカルビンジンからなる群から選択される請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞を投与することは、前記細胞を前記個体の脳組織内に移植することによって達成される請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞を投与することは、前記細胞を前記個体の脊髄内に移植することによって達成される請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記個体をさらすことは、前記作用物を前記個体に経口投与することによって達成される請求項２に記載の方法。
【請求項２６】
前記個体をさらすことは、前記作用物を前記個体に注入することによって達成される請求項２に記載の方法。
【請求項２７】
（ａ）神経伝達物質の外因的に調節可能な合成が可能である細胞を、その必要性のある個体に投与する工程、および（ｂ）前記細胞における前記神経伝達物質の前記合成を調節することができる作用物または条件に前記個体を定期的にさらし、それにより神経変性障害を治療する工程を含む、神経変性障害を治療する方法。
【請求項２８】
前記細胞は、前記神経伝達物質の外因的に調節可能な合成が可能であるように遺伝子改変される請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞は、前記神経伝達物質の前記合成に関係する酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現構築物で形質転換され、この場合、前記発現構築物は、前記ポリヌクレオチドの発現が前記作用物により制御可能であるように設計される請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記作用物は、前記神経伝達物質の前記合成に関係する前記酵素の発現をダウンレギュレーションすることができる請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記作用物は、前記神経伝達物質の前記合成に関係する前記酵素の発現をアップレギュレーションすることができる請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記神経変性障害は、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、アルツハイマー病およびハンチングトン病からなる群から選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記神経変性障害はパーキンソン病である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記神経伝達物質は、ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、γ−アミノ酪酸、セロトニン、アセチルコリンおよびグルタミン酸からなる群から選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記神経伝達物質はドーパミンである請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記酵素は、チロシンヒドロキシラーゼ、ＤＯＰＡデカルボキシラーゼ、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ、ドーパミンβ−ヒドロキシラーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、トリプトファン−５モノオキシゲナーゼおよびコリンアセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞は骨髄細胞である請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
前記骨髄細胞は骨髄間質細胞である請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞はニューロン様細胞である請求項２７に記載の方法。
【請求項４０】
前記ニューロン様細胞は少なくとも１つのニューロンマーカーを発現する請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ニューロンマーカーは、ＣＤ９０、ニューロン特異的核タンパク質、ニューロフィラメント重鎖、ニューロン特異的エノラーゼ、β−チューブリン３、ＭＡＰ−２、チロシンヒドロキシラーゼ、微小管結合タンパク質、ネスチンおよびカルビンジンからなる群から選択される請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞は、前記作用物が存在しないとき、活性化因子分子が応答エレメントと結合し、それにより前記チロシンヒドロキシラーゼの発現をアップレギュレーションするように前記作用物の調節可能な制御下でチロシンヒドロキシラーゼを発現させるために遺伝子改変される請求項２７に記載の方法。
【請求項４３】
前記作用物はドキシサイクリンである請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記活性化因子分子はテトラサイクリン制御のトランス活性化因子である請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記応答エレメントはテトラサイクリン応答エレメントである請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
神経伝達物質の合成に関係する酵素をコードするポリヌクレオチド配列を、哺乳動物細胞における前記酵素の発現を調節することができる調節配列の制御下に配置されて含む核酸構築物。
【請求項４７】
前記調節配列はテトラサイクリン応答エレメントを含む請求項４６に記載の核酸構築物。
【請求項４８】
前記酵素は、チロシンヒドロキシラーゼ、ＤＯＰＡデカルボキシラーゼ、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ、ドーパミンβ−ヒドロキシラーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、トリプトファン−５モノオキシゲナーゼおよびコリンアセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される請求項４６に記載の核酸構築物。
【請求項４９】
神経伝達物質の合成に関係する酵素をコードする第１のポリヌクレオチド配列を第１の調節配列の転写制御下に配置されて含む第１の発現構築物と、トランス活性化因子をコードする第２のポリヌクレオチド配列を第２の調節配列の転写制御下に配置されて含む第２の発現構築物とを含む構築物システムであって、この場合、前記トランス活性化因子は、前記第１の調節配列を活性化して、前記第１のポリヌクレオチド配列の転写を行わせることができる構築物システム。
【請求項５０】
前記神経伝達物質はドーパミンである請求項４９に記載の構築物システム。
【請求項５１】
前記酵素はチロシンヒドロキシラーゼである請求項４９に記載の構築物システム。
【請求項５２】
前記第１の調節配列はテトラサイクリン応答エレメントを含む請求項４９に記載の構築物システム。
【請求項５３】
前記トランス活性化因子はテトラサイクリン制御のトランス活性化因子である請求項４９に記載の構築物システム。
【請求項５４】
請求項４６に記載の核酸構築物を含む細胞。
【請求項５５】
前記細胞は、前記神経伝達物質の前記合成に関係する前記酵素の内因性活性を有しないニューロン様細胞である請求項５４に記載の細胞。
【請求項５６】
アポトーシス阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む請求項５４に記載の細胞。
【請求項５７】
請求項４９に記載の構築物システムを含む細胞。
【請求項５８】
前記細胞は、前記神経伝達物質の前記合成に関係する前記酵素の内因性活性を有しないニューロン様細胞である請求項５６に記載の細胞。
【請求項５９】
アポトーシス阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む請求項５７に記載の細胞。
【請求項６０】
神経変性障害を治療する際に使用される細胞を作製する方法であって、（ａ）骨髄細胞を単離する工程、（ｂ）前記骨髄細胞を維持および／または拡大することができる増殖用培地において前記骨髄細胞をインキュベーションする工程、（ｃ）工程（ｂ）から得られる細胞から骨髄間質細胞を選択する工程、および（ｄ）少なくとも１つの多不飽和脂肪酸および少なくとも１つの分化用作用物を含む分化用培地において前記骨髄間質細胞をインキュベーションし、それにより、神経変性障害を治療する際に使用される細胞を作製する工程を含む方法。
【請求項６１】
前記増殖培地は、ＤＭＥＭ、ＳＰＮ、Ｌ−グルタミン、ＦＣＳ、２−β−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸およびＥＧＦを含む請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
工程（ｄ）の前に、工程（ｃ）から得られた細胞を前分化用培地においてインキュベーションし、それにより前記細胞をニューロン様細胞に分化させやすくすることをさらに含む請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前分化用培地はｂＦＧＦを含む請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記前分化用培地は、ＤＭＥＭ、ＳＰＮ、Ｌ−グルタミン、Ｎ２補充物およびＦＣＳをさらに含む請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記少なくとも１つの多不飽和脂肪酸はドコサヘキサエン酸である請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
前記少なくとも１つの分化用作用物は、ＢＨＡ、ｄｂｃＡＭＰおよびＩＢＭＸからなる群から選択される請求項６０に記載の方法。
【請求項６７】
前記分化用培地は、ＤＭＥＭ、ＳＰＮ、Ｌ−グルタミン、Ｎ２補充物およびレチノイン酸をさらに含む請求項６０に記載の方法。
【請求項６８】
工程（ａ）は吸引によって達成される請求項６０に記載の方法。
【請求項６９】
工程（ｃ）は、表面接着細胞を集めることによって達成される請求項６０に記載の方法。
【請求項７０】
神経伝達物質を合成することができる骨髄由来間質細胞を含む細胞集団。
【請求項７１】
前記神経伝達物質はドーパミンである請求項７０に記載の細胞集団。
【請求項７２】
前記神経伝達物質はセロトニンである請求項７０に記載の細胞集団。
【請求項７３】
少なくとも２つのタイプの神経伝達物質を合成することができる骨髄由来ニューロン様細胞を含む混合細胞集団。
【請求項７４】
前記少なくとも２つのタイプの神経伝達物質は、ドーパミンを含む請求項７３に記載の混合細胞集団。
【請求項７５】
前記少なくとも２つのタイプの神経伝達物質は、セロトニンを含む請求項７３に記載の混合細胞集団。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経伝達物質の外因的に調節可能な合成が可能であり、それにより神経変性障害を治療することができる細胞を、その必要性のある個体に投与することを含む、神経変性障害を治療する方法。
【請求項２】
前記細胞における前記神経伝達物質の前記合成を調節することができる作用物または条件に前記個体をさらすことをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）神経伝達物質の外因的に調節可能な合成が可能である細胞を、その必要性のある個体に投与する工程、および（ｂ）前記細胞における前記神経伝達物質の前記合成を調節することができる作用物または条件に前記個体を定期的にさらし、それにより神経変性障害を治療する工程を含む、神経変性障害を治療する方法。
【請求項４】
前記細胞は、前記神経伝達物質の外因的に調節可能な合成が可能であるように遺伝子改変される請求項１又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞は、前記神経伝達物質の前記合成に関係する酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現構築物で形質転換され、この場合、前記発現構築物は、前記ポリヌクレオチドの発現が前記作用物により制御可能であるように設計される請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６】
前記作用物は、前記神経伝達物質の前記合成に関係する前記酵素の発現をダウンレギュレーションすることができる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記作用物は、前記神経伝達物質の前記合成に関係する前記酵素の発現をアップレギュレーションすることができる請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞は、第１の調節配列の転写制御下に配置された、神経伝達物質の合成に関係する酵素をコードする第１のポリヌクレオチド配列と、第２の調節配列の転写制御下に配置された、トランス活性化因子をコードする第２のポリヌクレオチド配列とを含む少なくとも１つの発現構築物で形質転換され、この場合、前記トランス活性化因子は、前記作用物の非存在下で、前記第１の調節配列を活性化して、前記第１のポリヌクレオチド配列の転写を行わせることができる請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記作用物はドキシサイクリンである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記トランス活性化因子はテトラサイクリン制御のトランス活性化因子である請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の調節配列はテトラサイクリン応答エレメントを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素は、チロシンヒドロキシラーゼ、ＤＯＰＡデカルボキシラーゼ、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ、ドーパミンβ−ヒドロキシラーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、トリプトファン−５モノオキシゲナーゼおよびコリンアセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２の調節配列はヒト特異的エノラーゼのプロモーターを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記神経変性障害は、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、アルツハイマー病およびハンチングトン病からなる群から選択される請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１５】
前記神経変性障害はパーキンソン病である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記神経伝達物質は、ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、γ−アミノ酪酸、セロトニン、アセチルコリンおよびグルタミン酸からなる群から選択される請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１７】
前記神経伝達物質はドーパミンである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞は骨髄細胞である請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１９】
前記骨髄細胞は骨髄間質細胞である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞はニューロン様細胞である請求項１又は３に記載の方法。
【請求項２１】
前記ニューロン様細胞は、前記神経伝達物質の前記合成に関係する前記酵素の内因性活性を有しない請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ニューロン様細胞は少なくとも１つのニューロンマーカーを発現する請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ニューロンマーカーは、ＣＤ９０、ニューロン特異的核タンパク質、ニューロフィラメント重鎖、ニューロン特異的エノラーゼ、β−チューブリン３、ＭＡＰ−２、チロシンヒドロキシラーゼ、微小管結合タンパク質、ネスチンおよびカルビンジンからなる群から選択される請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞を投与することは、前記細胞を前記個体の脳組織内に移植することによって達成される請求項１又は３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞を投与することは、前記細胞を前記個体の脊髄内に移植することによって達成される請求項１又は３に記載の方法。
【請求項２６】
前記個体をさらすことは、前記作用物を前記個体に経口投与することによって達成される請求項２又は３に記載の方法。
【請求項２７】
前記個体をさらすことは、前記作用物を前記個体に注入することによって達成される請求項２又は３に記載の方法。
【請求項２８】
神経変性障害を治療する際に使用される細胞を作製する方法であって、（ａ）骨髄細胞を単離する工程、（ｂ）前記骨髄細胞を維持および／または拡大することができる増殖用培地において前記骨髄細胞をインキュベーションする工程、（ｃ）工程（ｂ）から得られる細胞から骨髄間質細胞を選択する工程、および（ｄ）少なくとも１つの多不飽和脂肪酸および少なくとも１つの分化用作用物を含む分化用培地において前記骨髄間質細胞をインキュベーションし、それにより、神経変性障害を治療する際に使用される細胞を作製する工程を含む方法。
【請求項２９】
前記増殖培地は、ＤＭＥＭ、ＳＰＮ、Ｌ−グルタミン、ＦＣＳ、２−β−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸およびＥＧＦを含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
工程（ｄ）の前に、工程（ｃ）から得られた細胞を前分化用培地においてインキュベーションし、それにより前記細胞をニューロン様細胞に分化させやすくすることをさらに含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前分化用培地はｂＦＧＦを含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記前分化用培地は、ＤＭＥＭ、ＳＰＮ、Ｌ−グルタミン、Ｎ２補充物およびＦＣＳをさらに含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの多不飽和脂肪酸はドコサヘキサエン酸である請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの分化用作用物は、ＢＨＡ、ｄｂｃＡＭＰおよびＩＢＭＸからなる群から選択される請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記分化用培地は、ＤＭＥＭ、ＳＰＮ、Ｌ−グルタミン、Ｎ２補充物およびレチノイン酸をさらに含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
工程（ａ）は吸引によって達成される請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
工程（ｃ）は、表面接着細胞を集めることによって達成される請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
神経伝達物質を合成することができる骨髄由来間質細胞を含む細胞集団。
【請求項３９】
前記神経伝達物質はドーパミンである請求項３８に記載の細胞集団。
【請求項４０】
前記神経伝達物質はセロトニンである請求項３８に記載の細胞集団。
【請求項４１】
少なくとも２つのタイプの神経伝達物質を合成することができる骨髄由来ニューロン様細胞を含む混合細胞集団。
【請求項４２】
前記少なくとも２つのタイプの神経伝達物質は、ドーパミンを含む請求項４１に記載の混合細胞集団。
【請求項４３】
前記少なくとも２つのタイプの神経伝達物質は、セロトニンを含む請求項４１に記載の混合細胞集団。
【図５ｃ−ｄ】
【図１４ａ−ｂ】
【図１４ｃ−ｄ】
【図１５ａ−ｂ】
【図１６ｃ】
【図１７】
【図１８】
【図１９ａ】
【図１９ｂ】
【図２１】
【図２３】
【図２４】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図６】
【図７ａ−ｂ】
【図７ｃ】
【図８】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図９ｃ】
【図１０】
【図１１ａ−ｂ】
【図１１ｃ】
【図１２】
【図１３】
【図１５ｃ−ｄ】
【図１６ａ−ｂ】
【図２０】
【図２２】
【図１４ａ−ｂ】
【図１４ｃ−ｄ】
【図１５ａ−ｂ】
【図１６ｃ】
【図１７】
【図１８】
【図１９ａ】
【図１９ｂ】
【図２１】
【図２３】
【図２４】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図６】
【図７ａ−ｂ】
【図７ｃ】
【図８】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図９ｃ】
【図１０】
【図１１ａ−ｂ】
【図１１ｃ】
【図１２】
【図１３】
【図１５ｃ−ｄ】
【図１６ａ−ｂ】
【図２０】
【図２２】
【公表番号】特表２００６−５０６０８６（Ｐ２００６−５０６０８６Ａ）
【公表日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５３０５７（Ｐ２００４−５５３０５７）
【出願日】平成１５年１１月１７日（２００３．１１．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００３／０００９７２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４６３４８
【国際公開日】平成１６年６月３日（２００４．６．３）
【出願人】（５０３２５５９５８）ラモト アット テル アヴィヴ ユニヴァーシティ リミテッド (14)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１１月１７日（２００３．１１．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００３／０００９７２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４６３４８
【国際公開日】平成１６年６月３日（２００４．６．３）
【出願人】（５０３２５５９５８）ラモト アット テル アヴィヴ ユニヴァーシティ リミテッド (14)
【Ｆターム（参考）】
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