【課題】神経系の障害を診断し処置するために、さらなる神経栄養因子を提供する。
【解決手段】（ａ）特定の配列からなるヌクレオチド配列；（ｂ）特定の配列からなるＡＡ_１−ＡＡ_１０５に対して少なくとも９０％の相同性を含むニューブラスチンポリペプチド又はそこから誘導されるポリペプチドを発現時にコードするオープンリーディングフレームを含む核酸配列；（ｃ）特定の配列からなるヌクレオチド配列を含む核酸に高ストリンジェンシー溶液ハイブリダイゼーション条件で特異的にハイブリダイズする核酸、又はその相補ストランド；および、（ｄ）特定の配列として存在するポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の相同性である核酸、より成る群から選ばれた配列を含む、単離されたニューブラスチン核酸からなる。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は神経栄養因子ポリペプチド、神経栄養因子ポリペプチドをコード化する核酸および神経栄養因子に特異的に結合する抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経栄養因子はニューロン細胞およびニューロン組織の生存を促進し、表現型分化を維持し、変性を防ぎ、活性を増進する、天然のタンパク質である。神経栄養因子は神経組織、および神経系によって支配される非神経組織から単離され、機能的および構造的に関連するグループ（ファミリー、スーパーファミリーまたはサブファミリーとも呼ばれる）に分類されている。神経栄養因子スーパーファミリーには、線維芽細胞成長因子、ニューロトロフィンおよびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーが含まれる。神経栄養因子の個々の分子種は、それらの物理的構造、それらの複合受容体との相互作用および様々なタイプの神経細胞に対するそれらの作用によって識別される。ＴＧＦ−βスーパーファミリー（Ｍａｓｓａｇｕｅら，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４，４，１７２−１７８）に分類されるものには、ＧＤＮＦ、パーセフィン（ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ）（「ＰＳＰ」；Ｍｉｌｂｒａｎｄｔら，Ｎｅｕｒｏｎ １９９８，２０，２４５−２５３、参考文献としてここに援用する）およびニュールツリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）（「ＮＴＮ」；ＷＯ ９７／０８１９６、参考文献としてここに援用する）を包含するグリア細胞由来神経栄養因子リガンド（「ＧＤＮＦ」；ＷＯ ９３／０６１１６，参考文献としてここに援用する）がある。ＧＤＮＦサブファミリーのリガンドは共通して、ＲＥＴ受容体チロシンキナーゼによるシグナル伝達を誘導する能力を持っている。ＧＤＮＦサブファミリーの上記３つのリガンドは、神経栄養受容体のファミリー、
【０００３】
【化２】

受容体に対する相対的親和性が異なる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
神経栄養因子はニューロン組織に対する作用を持つので、神経系の障害を診断し処置するために、さらなる神経栄養因子を同定し特徴づけることが、依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（項目１）
（ａ）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）：１ のヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号：２のＡＡ_１−ＡＡ_１０５に対して少なくとも９０％の相同性を含むニューブラスチンポリペプチド又はそこから誘導されるポリペプチドを発現時にコードするオープンリーディングフレームを含む核酸配列；
（ｃ）配列番号：１のヌクレオチド配列を含む核酸に高ストリンジェンシー溶液ハイブリダイゼーション条件で特異的にハイブリダイズする核酸、又はその相補ストランド；
（ｄ）配列番号：１として存在するポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の相同性である核酸
より成る群から選ばれた配列を含む、単離されたニューブラスチン核酸。
【０００６】
（項目２）
コード化されたポリペプチドが、配列番号：２、及び配列番号：５，６及び７のＡＡ_１−ＡＡ_１０５より成る群から選ばれる、項目１記載の核酸。
【０００７】
（項目３）
配列番号：３の配列を含む、項目１記載の核酸。
【０００８】
（項目４）
配列番号：１として存在するポリヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の相同性である，項目１記載の核酸。
【０００９】
（項目５）
配列番号：１として存在するポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の相同性である，項目１記載の核酸。
【００１０】
（項目６）
項目１〜５のいずれか１つに記載の核酸を含む発現ベクター。
【００１１】
（項目７）
当該核酸によってコード化されるポリペプチドを、インビトロで当該核酸から発現させる段階を含む、項目６記載のベクターを使用する方法。
【００１２】
（項目８）
項目１〜５のいずれか１つに記載の核酸及び（又は）項目６記載の発現ベクターを用いてインビトロで形質転換させた細胞。
【００１３】
（項目９）
該細胞が真核細胞である、項目８記載の細胞。
【００１４】
（項目１０）
該細胞が哺乳類細胞、真菌細胞及び酵母細胞より成る群から選ばれる、項目９記載の細胞。
【００１５】
（項目１１）
哺乳類細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＰＣ１２、ＨｉＢ５、ＲＮ３３ｂ及びヒト神経幹細胞より成る群から選ばれる、項目１０記載の細胞。
【００１６】
（項目１２）
配列番号：２のアミノ酸１〜１０５に対して少なくとも９０％相同するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【００１７】
（項目１３）
配列番号：２，４，５，６及び７において上記アミノ酸配列のいずれか１つを含むニューブラスチン神経栄養因子ポリペプチド。
【００１８】
（項目１４）
当該ポリペプチドがグリコシル化されている、項目１２又は１３記載のポリペプチド。
【００１９】
（項目１５）
当該ポリペプチドが項目１〜５のいずれか１つに記載の核酸によってコードされる、項目１２記載のポリペプチド。
【００２０】
（項目１６）
項目１２〜１５のいずれか１つに記載のポリペプチドを製造する方法であって、当該方法が上記ポリペプチドをニューブラスチン神経栄養因子核酸から発現させる工程を含む、上記方法。
【００２１】
（項目１７）
上記ニューブラスチン神経栄養因子核酸を含む細胞を、当該ポリペプチドの産生が可能な培養培地で培養する工程を含む、項目１６記載の方法。
【００２２】
（項目１８）
当該ポリペプチドを、上記培養培地から回収する工程をさらに含む、項目１７記載の方法。
【００２３】
（項目１９）
項目１８記載の方法によって得られる精製されたポリペプチド。
【００２４】
（項目２０）
項目１２〜１５又は１９のいずれか１つに記載のポリペプチドおよび薬学的に許容し得る担体を含む調合物。
【００２５】
（項目２１）
項目１２〜１５又は１９のいずれか１つに記載のポリペプチドを医薬の製造に使用する方法。
【００２６】
（項目２２）
損傷性及び外傷性ニューロンに係わる神経変性疾患、たとえば末梢神経系、延髄及び（又は）脊髄の外傷性障害、脳虚血ニューロン損傷、神経障害及び特に末梢神経障、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症又はその他のあらゆる神経変性障害、及び痴呆に関連する記憶障害の治療ために、項目２１記載の使用する方法。
【００２７】
（項目２３）
配列番号：１７、１８、１９、２０、２３、２４、２５、２６または２８に記載の配列のいずれか１つを含む、ＰＣＲプライマー核酸配列。
【００２８】
（項目２４）
配列番号：２、４、５、６又は７に記載のポリペプチドのいずれか１つを製造する方法であって、配列番号：１又は３に記載の核酸配列のいずれか１つを含む細胞を、上記ポリペプチドの産生が可能な条件で培養し、その培養培地から上記ポリペプチドを回収することを含む、上記方法。
【００２９】
（項目２５）
（ａ）ニューブラスチンポリペプチドを発現時にコードするポリヌクレオチドを細胞に導入するか、または調節配列をその調節配列が内因性ニューブラスチン遺伝子の発現を調節するように相同組換えによって細胞に導入して、ニューブラスチン産生細胞を作成し、（ｂ）そのニューブラスチン産生細胞をニューブラスチンポリペプチドの発現をもたらす培養条件で培養すること、
を含む、項目１２〜１５のいずれか１つに記載のニューブラスチンポリペプチドを製造する方法。
【００３０】
（項目２６）
配列番号：２９または３０に記載の配列を含む、ニューブラスチンポリペプチドをコード化する合成遺伝子。
【００３１】
（項目２７）
次の配列：
【００３２】
【化２−Ａ】

のいずれかを有するニューブラスチンペプチド。
【００３３】
（項目２８）
項目２７のペプチドのいずれかに対して産生される抗体。
【００３４】
（項目２９）
配列番号：２、４、５、６、７、９、１０、１１、１２及び１６に記載の配列のいずれか１つに対して少なくとも７０％の相同性であるアミノ酸配列を有するニューブラスチン神経栄養因子を、黄斑変性、色素性痒疹、及び緑内障を患う患者の網膜で光受容体損失を含む、眼疾患の治療用医薬の製造に使用する方法。
【００３５】
（項目３０）
配列番号：２、４、５、６、７、９、１０、１１、１２及び１６に記載の配列のいずれか１つに対して少なくとも７０％の相同性であるアミノ酸配列を有するニューブラスチンポリペプチドを発現時にコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を、黄斑変性、色素性痒疹、及び緑内障を患う患者の網膜で光受容体損失を含む、眼疾患の治療用医薬の製造に使用する方法。
【００３６】
発明の要約
本発明は、本明細書で「ニューブラスチン（ｎｅｕｂｌａｓｔｉｎ）」または「ＮＢＮ」と呼ぶ、新規神経栄養因子に関する。ニューブラスチンは他のＧＤＮＦリガンドと相同（＝同一）な領域を有し（下記表３および表４参照）、ＲＥＴと相互作用する能力を持つ（例えばＡｉｒａｋｓｉｎｅｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，１３，３１３−３２５）ので、ニューブラスチンはＧＤＮＦサブファミリーに分類され、ニューブラスチンは新規かつユニークな神経栄養因子である。他のＧＤＮＦリガンドとは異なり、ニューブラスチンはＧＦＲα３−ＲＥＴ受容体複合体に対する高い親和性を示し、またそのアミノ酸配列中にユニークな亜領域を示す。
【００３７】
本明細書で使用されるとき「ニューブラスチンポリペプチド」は、（例えば実施例６、７、８および９に記載するように）神経栄養活性活性を有するポリペプチドであり、配列番号２のＡＡ_−９５〜ＡＡ_１０５、配列番号２のＡＡ_１〜ＡＡ_１０５、配列番号４のＡＡ_−９７〜ＡＡ_１４０、配列番号４のＡＡ_−４１〜ＡＡ_１４０（「プロ」）、配列番号４のＡＡ_１〜ＡＡ_１４０、配列番号９のＡＡ_−８０〜ＡＡ_１４０（「野生型」プレプロ）、配列番号９のＡＡ_−４１〜ＡＡ_１４０（プロ）、配列番号５のＡＡ_１〜ＡＡ_１４０（成熟１４０ＡＡ）、配列番号６のＡＡ_１〜ＡＡ_１１６（成熟１１６ＡＡ）、配列番号７のＡＡ_１〜ＡＡ_１１３（成熟１１３ＡＡ）、配列番号１０のＡＡ_１〜ＡＡ_１４０（成熟１４０ＡＡ）、配列番号１１のＡＡ_１〜ＡＡ_１１６（成熟１１６ＡＡ）、配列番号１２のＡＡ_１〜ＡＡ_１１３（成熟１１３ＡＡ）に記載のヒト「ニューブラスチン」ポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性（＝同一性）を有するアミノ酸配列を持つポリペプチドおよびそれらの変異体および誘導体を包含する。また本発明では、配列番号１６のＡＡ_１〜ＡＡ_２２４に記載のネズミ「ニューブラスチン」ポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を持つポリペプチドも考えられる。
【００３８】
上に定義したニューブラスチンポリペプチドのＣ末端配列は、好ましくは、配列番号２のＡＡ_７２〜ＡＡ_１０５（すなわち配列番号９のＡＡ_１０７〜ＡＡ_１４０）、より好ましくは配列番号２のＡＡ_４１〜ＡＡ_１０５（すなわち配列番号９のＡＡ_７６〜ＡＡ_１４０）に記載のアミノ酸配列、または配列番号１６のＡＡ_１９１〜ＡＡ_２２４に記載するアミノ酸配列を持つ。
【００３９】
また、ニューブラスチンポリペプチドはＧＤＮＦファミリーおよびＴＧＦ−βスーパーファミリーに特有の７つの保存されたＣｙｓ残基を保持していることが好ましい。
【００４０】
ニューブラスチンポリペプチドは、好ましくは、上記の配列（すなわち配列番号２のＡＡ_−９５〜ＡＡ_１０５、配列番号２のＡＡ_１〜ＡＡ_１０５、配列番号４のＡＡ_−９７〜ＡＡ_１４０、配列番号４のＡＡ_１〜ＡＡ_１４０、配列番号４のＡＡ_−４１〜ＡＡ_１４０、配列番号９のＡＡ_−８０〜ＡＡ_１４０（「野生型」プレプロ）、配列番号９のＡＡ_−４１〜ＡＡ_１４０（プロ）、配列番号５のＡＡ_１〜ＡＡ_１４０（成熟１４０ＡＡ）、配列番号６のＡＡ_１〜ＡＡ_１１６（成熟１１６ＡＡ）、配列番号７のＡＡ_１〜ＡＡ_１１３（成熟１１３ＡＡ）、配列番号１０のＡＡ_１〜ＡＡ_１４０（成熟１４０ＡＡ）、配列番号１１のＡＡ_１〜ＡＡ_１１６（成熟１１６ＡＡ）、配列番号１２のＡＡ_１〜ＡＡ_１１３（成熟１１３ＡＡ）および配列番号１６のＡＡ_１〜ＡＡ_２２４）に対して、８５％より高い相同性、最も好ましくは９５％より高い相同性を有する。
【００４１】
本明細書で使用されるとき「ニューブラスチン核酸」とは、ニューブラスチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。したがって、単離されたニューブラスチン核酸は、翻訳に必要とされる適切な諸成分にばく露された場合にニューブラスチンポリペプチドをコード化またはコードするヌクレオチドコドンのオープンリーディングフレームを有するポリヌクレオチド分子である。本発明のニューブラスチン核酸はＲＮＡでも、ＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡまたはニューブラスチンｍＲＮＡに相補的なかつ／またはニューブラスチンｍＲＮＡから転写されたＤＮＡ（「ｃＤＮＡ」））でもよい。したがって本発明のニューブラスチン核酸はさらに、ニューブラスチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件で、特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド分子を包含する。また本発明は、ニューブラスチンポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドまたはその断片の同定、単離および増幅に有用な核酸プライマーに関する。本発明の一定の態様では、それらプライマーのうち一定のものが、ニューブラスチン核酸へのハイブリダイゼーションには有用であるがＧＤＮＦファミリーの他のメンバーをコードする核酸へのハイブリダイゼーションには役立たない、ニューブラスチン特異的プローブである。「特異的」「特異性」または「特異的に」という用語は、ニューブラスチン核酸とハイブリダイズすることができ、ＧＤＮＦリガンド（例えばＧＤＮＦ、パーセフィンおよびニュールツリン）を一意的にコードする核酸にはハイブリダイズできないことを含めて非ニューブラスチン核酸とはハイブリダイズできないことを意味する。
【００４２】
もう一つの態様として、本発明のニューブラスチン核酸は、相補的核酸配列を持つことにより、または当該核酸がニューブラスチンをコードするポリヌクレオチドに高ストリンジェンシー条件で特異的にハイブリダイズすることを立証することにより、ニューブラスチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに相補的であると同定される核酸である。ニューブラスチン核酸の具体例には、配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２９および配列番号３０として本明細書に示す核酸配列ならびに配列番号１７〜２８、３１および３２のプライマーなどがあるが、これらに限定されるわけではない。本発明のニューブラスチン核酸にはさらに、例えば図８に示す核酸断片など（ただしこれらに限らない）の、ニューブラスチン核酸のユニークな亜領域または断片も包含される。
【００４３】
本発明のニューブラスチン核酸は、例えばインビトロでニューブラスチンポリペプチドを発現させたり、またはニューブラスチン核酸を動物に投与してインビボで発現させることなどによって、ニューブラスチンポリペプチドを発現させるために使用できる。ニューブラスチン核酸は、核酸ベクター、例えば発現ベクターまたはクローニングベクターに組み込むことができる。ニューブラスチン核酸は、核酸ベクターの一部として維持し、複製し、転移させ、または発現させることができるが、必ずしもその必要はない。ニューブラスチンポリヌクレオチド配列を含有する組換え発現ベクターは、細胞内に導入しかつ／または細胞内に維持することができる。ニューブラスチンベクターを保持する細胞は原核細胞であってよい。もう一つの選択肢として、ニューブラスチン核酸を真核細胞（例えばポリペプチドを成熟タンパク質に翻訳後プロセシングするための適切な装置および／またはポリペプチドを当該細胞の細胞外環境に分泌するための適切な装置を含有する真核細胞）に導入することもできる。
【００４４】
さらに本発明はニューブラスチン神経栄養因子「ニューブラスチン」を特徴とする。ニューブラスチンは単ポリペプチドの形をとってもよいし、２以上のニューブラスチンポリペプチドの多量体（例えばニューブラスチン二量体）であってもよい。ニューブラスチンポリペプチドは、例えばシステイン−システイン相互作用、スルフヒドリル結合および非共有結合的相互作用など（ただしこれらに限らない）といった、当業者に知られる分子間の構造的結合により、多量体として会合する。ニューブラスチンポリペプチドの具体例には、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１６として本明細書に開示するアミノ酸配列があるが、これらに限定されるわけではない。
【００４５】
本発明のニューブラスチンポリペプチドは、ニューロンの欠陥（損傷を受けたニューロンおよび外傷を受けたニューロンを含むが、これらに限らない）の処置に有用である。外傷を受ける末梢神経には、延髄または脊髄の神経が含まれるが、これらに限らない。ニューブラスチンポリペプチドは、神経変性疾患、例えば脳虚血性ニューロン損傷、神経障害、例えば末梢神経障害、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの処置に有用である。さらに、ニューブラスチンポリペプチドには、記憶障害（例えば痴呆に伴なう記憶障害）の処置での使用が考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
発明の詳細な開示
出願人は、ここに「ニューブラスチン（ｎｅｕｂｌａｓｔｉｎ）」または「ＮＢＮ」と呼ぶ新規神経栄養因子をコード化する核酸を同定した。ニューブラスチンは、神経栄養因子のトランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）サブクラスのメンバーである。
【００４７】
ニューブラスチンをコード化するｃＤＮＡは、最初は、以下のように同定された。ＴＢＬＡＳＴＮ １．４．１１アルゴリズム（Ａｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９７，２５，３３８９−３４０２）を使用し、クエリーとしてヒトパーセフィン（ＧｅｎＢａｎｋ受諾番号ＡＦ０４０９６２）を使用することにより、ＧｅｎＢａｎｋエントリーＡＣ００５０３８およびＡＣ００５０５１の２つのヒト細菌人工染色体（ＢＡＣ）のＨＧＴＳ（Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に、２９０ｂｐの断片が同定された。ＡＣ００５０３８は順序不明の５つのコンティグ約１９０，０００ｂｐからなり、ＡＣ００５０５１は順序不明の１２のコンティグ約１３２，０００ｂｐからなる。上記２つのＢＡＣクローン中に同定された２９０ｂｐ断片は、神経栄養因子ヒトパーセフィンのｃＤＮＡのコード領域と相同であるが同一ではない領域を持つことが判明した。
【００４８】
この２９０ｂｐ配列から、２つのニューブラスチン特異的ＰＣＲプライマー（トップ鎖（ｔｏｐ ｓｔｒａｎｄ）プライマー［配列番号１７］およびボトム鎖（ｂｏｔｔｏｍ ｓｔｒａｎｄ）プライマー［配列番号１８］）を合成した。ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。最初のスクリーニングでは、約５，０００クローン／ウェルの５０，０００ｃＤＮＡクローンから、上記２つのＰＣＲプライマー［配列番号１７および１８］によるｃＤＮＡライブラリー「マスタープレート」の９６ウェルＰＣＲスクリーニングを行なった。第二のＰＣＲスクリーニングは、約５，０００クローン／ウェルの大腸菌グリセロール保存液を含むヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー「サブプレート」で行なった。
【００４９】
上記マスタープレートとサブプレートの両方のＰＣＲスクリーニングで１０２ｂｐの断片［配列番号１３］が同定された。陽性ｃＤＮＡクローン（１０２ｂｐ断片を保持するもの）を選択し、２枚のＬＢ／抗生物質含有プレートに播種し、終夜生育させた。これらのプレートから、合計９６個の細菌コロニーを選択し、両ＰＣＲプライマー［配列番号１７および１８］ならびに不可欠なＰＣＲ増幅試薬類を含む新しい９６ウェルＰＣＲプレートの各ウェルに、個別に播種した。次にＰＣＲ増幅を行ない、９６個の個々のＰＣＲ反応系を２％アガロースゲル電気泳動によって分析した。次に、上記１０２ｂｐ断片を含有するクローンを持つ陽性コロニーを同定した。上記１０２ｂｐ断片を含有する陽性コロニーからプラスミドＤＮＡを得て、配列決定した。次に、配列決定分析を行なうことにより、８６１ｂｐの完全長ｃＤＮＡ［配列番号８］の存在が明らかになった。配列番号８中に同定される６６３ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）またはコード領域は、プレプロポリペプチド（「プレプロニューブラスチン」と呼ぶ）をコード化し、これを配列番号９に示す。配列番号９に基づき、３つのニューブラスチン変異体が同定された。それらの変異体には以下のポリペプチドが含まれる：
（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を有し、本明細書でＮＢＮ１４０と呼ばれる１４０アミノ酸ポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を有し、本明細書でＮＢＮ１１６と呼ばれる１１６アミノ酸ポリペプチド；
（ｉｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を有し、本明細書でＮＢＮ１１３と呼ばれる１１３アミノ酸ポリペプチド。
【００５０】
７８２ｂｐの５’非翻訳ＤＮＡ、６６３ｂｐのコード化ＤＮＡおよび４４７ｂｐの３’非翻訳ＤＮＡ（合計１９９２ｂｐ）を含有する全ｃＤＮＡ配列は、受諾番号ＡＦ１２０２７４としてＧｅｎＢａｎｋに提出されている。
【００５１】
ゲノムニューブラスチンコード化配列は以下のように同定された。
【００５２】
ゲノムニューブラスチンコード化配列をクローニングする目的で、新たなプライマーセットを作成した。具体的に述べると、第１プライマー対はセンス＝配列番号２３およびアンチセンス＝配列番号２４からなり、第２プライマー対はセンス＝配列番号２５およびアンチセンス＝配列番号２６からなった。
【００５３】
第２プライマー対を使って、８８７ｂｐのＤＮＡ断片をヒトゲノムＤＮＡの調製物からＰＣＲによって増幅し、ｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、大腸菌に形質転換した。得られたプラスミドを配列決定したところ、（配列番号３に記載するように）８６１ｂｐの推定ｃＤＮＡ配列（ここにニューブラスチンと名付けるタンパク質をコード化する）が予測された。同様に、第１プライマー対を使用すると、８７０ｂｐのＤＮＡ断片がヒトゲノムＤＮＡのＰＣＲによって得られた。この断片には、上記の８８７ｂｐ配列と比較して、オープンリーディングフレームの３’末端に余分な４２ｂｐの領域が見出された。エキソン−イントロン境界をマッピングして、他の神経栄養因子の核酸配列と比較することにより、ニューブラスチン遺伝子のゲノム構造を予測した。この分析により、ニューブラスチン遺伝子は７０ｂｐのイントロンによって分離された少なくとも２つのエキソンを有することが明らかになった。
【００５４】
また、この配列を用いて、ＧｅｎＢａｎｋをニューブラスチンＥＳＴ配列についてスクリーニングした。ＧｅｎＢａｎｋエントリーＡＡ８４４０７２、ＡＡ９３１６３７およびＡＡ５３３５１２に、３つのＥＳＴ配列が同定されたことから、ニューブラスチン核酸がｍＲＮＡに転写されることが示された。
【００５５】
得られた全ｃＤＮＡ配列（ＡＦ１２０２７４）とＧｅｎＢａｎｋエントリーＡＣ００５０３８およびＡＣ００５０５１中に存在するゲノム配列との比較により、ニューブラスチン遺伝子は４つのイントロンによって分離された少なくとも５つのエキソン（３つのコーディングエキソンを含む）からなることが明らかになった（例えば図８を参照されたい）。全体として上記エキソンは完全長ニューブラスチンポリペプチドの予想アミノ酸配列を持つ。８８７ｂｐ断片がプロニューブラスチンの全コード領域を含むことがわかった点にも注目すべきである。予想されるｃＤＮＡ［配列番号３］は、３つの既知ヒトタンパク質、すなわちパーセフィン、ニュールツリンおよびＧＤＮＦに対して相同性を示すプロニューブラスチン（１８１アミノ酸残基）をコード化するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいる。
【００５６】
本発明のニューブラスチン核酸
もう一つの側面として、本発明は、本発明のポリペプチドを発現させることができるポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡ配列ならびにアンチセンス配列を包含し、天然のポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチドおよび意図的に操作したポリヌクレオチドを包含する。本発明のポリヌクレオチドには、遺伝暗号の結果、縮重しているが、ニューブラスチンポリペプチドを発現時にコードする配列も包含される。
【００５７】
ここに定義される用語「ポリヌクレオチド」は、少なくとも１０塩基長、好ましくは少なくとも１５塩基長のポリマー型ヌクレオチドを指す。「単離されたポリヌクレオチド」とは、当該ポリヌクレオチドが由来する生物の天然のゲノム中で当該ポリヌクレオチドが（一つは５’末端側で、一つは３’末端側で）すぐに接している両コード配列と、すぐには接していないポリヌクレオチドを意味する。したがって、この用語は、発現ベクター、自律複製プラスミドまたは自律複製ウイルス、もしくは原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた組換えＤＮＡ、または他の配列から独立した単独の分子（例えばｃＤＮＡ）として存在する組換えＤＮＡを包含する。
【００５８】
本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のヌクレオチド配列と１つまたは複数のヌクレオチド位置で相違するヌクレオチド配列を持つ対立遺伝子変異体および「突然変異ポリヌクレオチド」も包含する。
【００５９】
好ましい一態様として、本発明のポリヌクレオチドは、下に詳述するように、少なくとも中、中／高または高ストリンジェンシー条件で、配列番号１として記載するポリヌクレオチド配列、配列番号３として記載するポリヌクレオチド配列、配列番号８として記載するポリヌクレオチド配列、または配列番号１５として記載するポリヌクレオチド配列、その相補鎖もしくは部分配列とハイブリダイズすることができる核酸（ＤＮＡ）配列を有する。
【００６０】
もう一つの好ましい態様として、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１として記載するポリヌクレオチド配列、配列番号３として記載するポリヌクレオチド配列、配列番号８として記載するポリヌクレオチド配列、または配列番号１５として記載するポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％相同な核酸（ＤＮＡ）配列を有する。
【００６１】
その最も好ましい態様として、本ポリヌクレオチドは、配列番号１として記載するＤＮＡ配列、配列番号３として記載するＤＮＡ配列、配列番号８として記載するＤＮＡ配列、または配列番号１５として記載するポリヌクレオチド配列を有する。
【００６２】
本発明は、ニューブラスチンポリペプチドまたはその断片を発現時にコードするニューブラスチンポリヌクレオチドを同定、単離および増幅するための新規プライマーならびにＤＮＡ配列も提供する。そのようなプライマーには、配列番号１７〜２８および３１〜３２に記載のポリヌクレオチドが包含される。また本発明は、それらのプライマーから生成するニューブラスチンＤＮＡ配列を、配列番号１３および１４に記載の配列を含めて、提供する。さらに本発明は、ニューブラスチンエキソンに隣接するゲノムＤＮＡ中の３’または５’非翻訳領域（「ＵＴＲ」）から得られるＤＮＡ配列を提供する。そのような配列は、ニューブラスチンポリペプチドまたはその断片を発現時にコードするニューブラスチンポリヌクレオチドを同定、単離および増幅するのに有用である。
【００６３】
本発明の３’ＵＴＲ配列には、
配列番号１のヌクレオチド７２１−８６５、
配列番号３のヌクレオチド７１８−８６１、
配列番号８のヌクレオチド７１８−８６１、
配列番号１５のヌクレオチド１６４７−２１３６、
に記載の配列、および上記の配列に由来する（すなわち上記の配列に含まれる）１０〜２５ヌクレオチドの連続する配列（例えばプライマーとして有用なもの）、
が包含される。
【００６４】
本発明の５’ＵＴＲ配列には、
配列番号１のヌクレオチド１−１０、
配列番号８のヌクレオチド１−５７、
配列番号１５の１−９７４、
に記載の配列、および上記の配列に由来する（すなわち上記の配列に含まれる）１０〜２５ヌクレオチドの連続する配列（例えばプライマーとして有用なもの）、
が包含される。
【００６５】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）に記載されているようなクローニング法によって、好ましく取得することができる。好ましい一態様として、本ポリヌクレオチドは、ヒトゲノムＤＮＡまたはヒト脳のｃＤＮＡライブラリーからクローニングされるか、ヒトゲノムＤＮＡまたはヒト脳のｃＤＮＡライブラリーに基づいて作成される。
【００６６】
ＤＮＡ配列の相同性
上で言及したＤＮＡ配列相同性は、第１配列の第２配列からの派生を示す２つの配列間の同一度として決定することができる。相同性は、例えばＧＣＧプログラムパッケージに含まれるＧＡＰなどの当技術分野で知られるコンピュータープログラムを使って、適切に決定できる［Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．およびＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９７０，４８，４４３−４５３］。ＧＡＰ挿入ペナルティー（ＧＡＰ ｃｒｅａｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）５．０およびＧＡＰ伸長ペナルティー（ＧＡＰ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）０．３というＤＮＡ配列比較用の設定でＧＡＰを使用することにより、上で言及した類似ＤＮＡ配列のコード領域は、配列番号１に示すＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード化）部分または配列番号３に示すＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード化）部分または配列番号８に示すＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード化）部分、配列番号１５に示すＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード化）部分と、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一度を示す。
【００６７】
「配列同一性」という用語は、２つのポリヌクレオチド配列が特定の比較領域にわたってヌクレオチド単位で同一である程度を指す。「配列同一性百分率」という用語は、上記の比較領域にわたって最適に整列された２つの配列を比較し、同一の核酸塩基（例えばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＩ）が両方の配列中に存在する位置の数を決定することで一致した位置の数を求め、その一致した位置の数を比較領域の位置の総数（すなわちウインドウサイズ）で割り、その商を１００倍して、配列同一性百分率を求めることによって計算される。本明細書で使用する「実質的同一」という用語は、当該ポリヌクレオチドが、ある比較領域にわたって基準配列と比較したときに、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、しばしば９０〜９５％の配列同一性、より一般には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含んでなるようなポリヌクレオチド配列の特徴を示す。
【００６８】
ハイブリダイゼーションプロトコール
本発明のポリヌクレオチドは、以下に詳述するように、少なくとも中、中／高または高ストリンジェンシー条件で、配列番号１として記載するポリヌクレオチド配列、配列番号３として記載するポリヌクレオチド配列、または配列番号８として記載するポリヌクレオチド配列、または配列番号１５として記載するポリヌクレチド配列、もしくはそれらの相補鎖またはそれらの部分配列とハイブリダイズすることができる核酸配列を持つものである。
【００６９】
ヌクレオチドプローブと相同ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の間のハイブリダイゼーションを決定するのに適した実験条件では、ハイブリダイズさせるＤＮＡ断片またはＲＮＡを含んでいるフィルターを５×ＳＳＣ［塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，コールドスプリングハーバー研究所，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，１９８９を参照されたい］中で１０分間予浸し、５×ＳＳＣ、５×デンハート液［Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）参照］、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性超音波処理サケ精子ＤＮＡ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）参照］の溶液中でフィルターのプレハイブリダイゼーションを行なった後、ランダムプライム法［Ｆｅｉｎｂｅｒｇ ＡＰおよびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ Ｂ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８３，１３２，６−１３］で^３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識した（比活性＞１×１０^９ｃｐｍ／μｇ）プローブを１０ｎｇ／ｍｌの濃度で含む同溶液中、約４５℃で１２時間のハイブリダイゼーションを行なう。次いでフィルターに、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中、少なくとも、少なくとも６０℃（中ストリンジェンシー条件）、好ましくは少なくとも６５℃（中／高ストリンジェンシー条件）、より好ましくは少なくとも７０℃（高ストリンジェンシー条件）、より一層好ましくは少なくとも７５℃（超高ストリンジェンシー条件）の温度での３０分間の洗浄を２回行なう。これらの条件でオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする分子は、Ｘ線フィルムを使って検出できる。
【００７０】
クローン化ポリヌクレオチド
本発明の単離されたポリヌクレオチドは、具体的には、クローン化ポリヌクレオチドであってもよい。ここに定義される用語「クローン化ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ（具体的にはｃＤＮＡ、すなわちＲＮＡから酵素的に誘導されたＤＮＡであってもよい）のセグメントを本来の位置から異なる部位に移動させてその部位で複製させるために、遺伝子工学において現在使用されている標準的クローニング法に従ってクローン化された、ポリヌクレオチドまたはＤＮＡ配列を指す。
【００７１】
クローニングは任意の適当な方法で達成でき、クローニングには逆転写酵素法、ＰＣＲ法などの方法と、所望のＤＮＡセグメントの切り出しおよび単離が必要になりうる。
【００７２】
本発明のクローン化ポリヌクレオチドは、その他に「ＤＮＡ構築体」または「単離されたＤＮＡ配列」と呼ぶこともでき、具体的には相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）であってもよい。
【００７３】
生物学的供給源
本発明の単離されたポリヌクレオチドは任意の適当な供給源から得ることができる。
【００７４】
好ましい一態様として、本発明のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡライブラリー、例えば胎児または成人の脳（具体的には前脳、後脳、皮質、線条体、扁桃体、小脳、尾状核、脳梁、海馬、視床核、視床下核、嗅核、被殻、黒質、後根神経節、三叉神経節、上腸間膜動脈、または視床）、脊髄、心臓、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、肝臓、膵臓、腸、眼、網膜、歯髄、毛包、前立腺、下垂体、または気管のｃＤＮＡライブラリーなどからクローニングされるか、それらｃＤＮＡライブラリーに基づいて作成される。
【００７５】
ヒトおよびヒト以外の様々な組織に由来する市販のｃＤＮＡライブラリーは、例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅやＣｌｏｎｔｅｃｈなどから入手できる。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、例えば実施例に記載するような標準的方法によって得ることができる。
【００７６】
本発明のニューブラスチンポリペプチド
上記のように、本明細書で使用されるとき「ニューブラスチンポリペプチド」は、（例えば実施例６、７、８および９に記載するように）神経栄養活性を有するポリペプチドであり、配列番号２のＡＡ_−９５〜ＡＡ_１０５、配列番号２のＡＡ_１〜ＡＡ_１０５、配列番号４のＡＡ_−９７〜ＡＡ_１４０、配列番号４のＡＡ_−４１〜ＡＡ_１４０、配列番号４のＡＡ_１〜ＡＡ_１４０、配列番号９のＡＡ_−８０〜ＡＡ_１４０（「野生型」プレプロ）、配列番号９のＡＡ_−４１〜ＡＡ_１４０（プロ）、配列番号５のＡＡ_１〜ＡＡ_１４０（成熟１４０ＡＡ）、配列番号６のＡＡ_１〜ＡＡ_１１６（成熟１１６ＡＡ）、配列番号７のＡＡ_１〜ＡＡ_１１３（成熟１１３ＡＡ）、配列番号１０のＡＡ_１〜ＡＡ_１４０（成熟１４０ＡＡ）、配列番号１１のＡＡ_１〜ＡＡ_１１６（成熟１１６ＡＡ）、配列番号１２のＡＡ_１〜ＡＡ_１１３（成熟１１３ＡＡ）、配列番号１６のＡＡ_１〜ＡＡ_２２４（ネズミプレプロ）に記載の「ニューブラスチン」ポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を持つポリペプチドおよび前記各ポリペプチドの変異体ならびに誘導体を包含する。
【００７７】
上記ニューブラスチンポリペプチドのＣ末端配列は、好ましくは、配列番号２のＡＡ_７２〜ＡＡ_１０５（すなわち配列番号９のＡＡ_１０７〜ＡＡ_１４０）、より好ましくは配列番号２のＡＡ_４１〜ＡＡ_１０５（すなわち配列番号９のＡＡ_７６〜ＡＡ_１４０）に記載するようなアミノ酸配列を持つ。
【００７８】
また、ニューブラスチンポリペプチドはＧＤＮＦファミリーおよびＴＧＦ−βスーパーファミリーに特有の７つの保存されたＣｙｓ残基を保持していることが好ましい。
【００７９】
ニューブラスチンポリペプチドは、好ましくは、上記の配列（すなわち配列番号２のＡＡ_−９５〜ＡＡ_１０５、配列番号２のＡＡ_１〜ＡＡ_１０５、配列番号４のＡＡ_−９７〜ＡＡ_１４０、配列番号４のＡＡ_−４１〜ＡＡ_１４０、配列番号４のＡＡ_１〜ＡＡ_１４０、配列番号９のＡＡ_−８０〜ＡＡ_１４０（「野生型」プレプロ）、配列番号９のＡＡ_−４１〜ＡＡ_１４０（プロ）、配列番号５のＡＡ_１〜ＡＡ_１４０（成熟１４０ＡＡ）、配列番号６のＡＡ_１〜ＡＡ_１１６（成熟１１６ＡＡ）、配列番号７のＡＡ_１〜ＡＡ_１１３（成熟１１３ＡＡ）、配列番号１０のＡＡ_１〜ＡＡ_１４０（成熟１４０ＡＡ）、配列番号１１のＡＡ_１〜ＡＡ_１１６（成熟１１６ＡＡ）、配列番号１２のＡＡ_１〜ＡＡ_１１３（成熟１１３ＡＡ）、配列番号１６のＡＡ_１〜ＡＡ_２２４（ネズミプレプロ）に対して、８５％より高い相同性、最も好ましくは９５％より高い相同性を有し、上記ニューブラスチンポリペプチドのＣ末端配列を持つ前記ポリペプチドはいずれも、好ましくは、配列番号２のＡＡ_７２〜ＡＡ_１０５（すなわち配列番号９のＡＡ_１０７〜ＡＡ_１４０）、より好ましくは配列番号２のＡＡ_４１〜ＡＡ_１０５（すなわち配列番号９のＡＡ_７６〜ＡＡ_１４０）または配列番号１６のＡ_１９１−Ａ_２２４に記載するようなアミノ酸配列を持つ。
【００８０】
また本発明では、配列番号１６のＡＡ_１〜ＡＡ_２２４に記載のネズミ「ニューブラスチン」ポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を持つポリペプチドも考えられる。
【００８１】
一態様として本発明の好ましいポリペプチドの代表例は、ニューブラスチンのプレプロ配列（配列番号２、４、９および１６にそれぞれ記載するような配列）、プロ配列（配列番号２のＡＡ_−７５−Ａ_１０５または配列番号４および９のそれぞれＡＡ_−４１〜ＡＡ_１４０に記載するような配列）および成熟配列（配列番号５、６、７、１０、１１または１２、好ましくは配列番号１０、１１、１２に記載するような配列）である。
【００８２】
本発明のポリペプチドは変異体ポリペプチドを包含する。本発明に関して「変異体ポリペプチド」という用語は、１つまたは複数のアミノ酸位置で配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１６として記載する配列と相違するアミノ酸配列を持つポリペプチド（またはタンパク質）を意味する。そのような変異体ポリペプチドには、上述の改変ポリペプチド、保存的置換体、スプライス変異体、イソ型、他の種に由来する相同体および多型が包含される。
【００８３】
ここに定義される用語「保存的置換」とは、あるアミノ酸残基を別の生物学的に類似する残基で置き換えることを意味する。例えば、保存的アミノ酸置換は、特にそれらが当該ポリペプチドまたはタンパク質中の残基の総数の１０％未満に相当する場合は、生物活性にほとんどまたは全く影響をもたないと予想される。保存的アミノ酸置換は、好ましくは、当該ポリペプチドまたはタンパク質の５％未満、最も好ましくは当該ポリペプチドまたはタンパク質の２％未満の変化に相当する（例えば、ＮＢＮ１１３で計算すると、最も好ましい保存的置換は野生型成熟アミノ酸配列中の３個未満のアミノ酸置換に相当することになる）。特に好ましい一態様では、成熟配列中にただ一つのアミノ酸置換があり、置換される残基と代替残基は両者とも非環状アミノ酸である。
【００８４】
特に保存的な置換の他の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの疎水性残基の別の疎水性残基による置換、極性残基の別の極性残基による置換、例えばアルギニンによるリジンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換またはグルタミンによるアルパラギンの置換などが挙げられる。
【００８５】
保存的置換という用語には、置換ポリペプチドに対して産生させた抗体が非置換ポリペプチドとも免疫反応するという条件の下で、非置換親アミノ酸残基の代わりに置換アミノ酸残基を使用することも包含される。
【００８６】
この一次アミノ酸配列の改変は、無改変の対応ポリペプチドと比較して実質的に等価な活性を持ち、したがって当該親タンパク質の機能的類似体であるとみなすことができるタンパク質をもたらしうる。そのような改変は、例えば部位特異的突然変異誘発による改変のように意図的であってもよいし自発的に起こる場合もあり、スプライス変異体、イソ型、他の種に由来する相同体および多型が包含される。本発明では、そのような機能的類似体も考えられている。
【００８７】
さらにまた一次アミノ酸配列の改変は、親タンパク質の生物活性を保っていないタンパク質（ドミナントネガティブ型などを含む）も、もたらしうる。ドミナントネガティブタンパク質は、通常は当該ポリペプチドと機能的に相互作用する上流または下流成分などの調節因子に結合するか、それら調節因子を他の方法で封鎖することによって、野生型タンパク質を妨害しうる。本発明では、そのようなドミナントネガティブ型も考えられている。
【００８８】
「シグナルペプチド」とは、さらなる翻訳後プロセッシングと分布のために、当該シグナルペプチドが結合している新たに合成されたポリペプチドを小胞体（ＥＲ）に誘導するペプチド配列である。
【００８９】
ニューブラスチンに関して本明細書で使用されるとき「異種シグナルペプチド」とは、ヒトニューブラスチンシグナルペプチドではないシグナルペプチド、通例はニューブラスチン以外の何らかの哺乳類タンパク質のシグナルペプチドを意味する。
【００９０】
ヒトニューブラスチンＤＮＡ配列（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、もしくはサイレントなコドン変化または保存的アミノ酸置換をもたらすコドン変化を持つ点でヒトニューブラスチンＤＮＡとは相違する配列を使って、培養ヒト細胞が当該酵素を過剰発現し分泌するように、それらの細胞を遺伝子改変できることは、当業者には理解されるだろう。
【００９１】
本発明のポリペプチドには、ポリペプチドまたはその断片のＮ末端もしくはＣ末端に、別のポリペプチドが融合されているキメラポリペプチドまたは切断可能な融合ポリペプチドも包含される。キメラポリペプチドは、本発明の核酸配列（またはその一部）に、別のポリペプチドをコード化する核酸配列（またはその一部）を融合することによって作成できる。
【００９２】
キメラポリペプチドを製造する技術は標準的技術である。そのような技術では、通常、各配列をそれらがどちらも同じ読み枠になるように結合し、１つまたは複数の同じプロモーターおよび同じターミネーターの制御下に、その融合ポリペプチドを発現させることが必要とされる。
【００９３】
本発明のポリペプチドには、完全長ニューブラスチン分子の切断型も包含される。そのような切断型分子では、１つまたは複数のアミノ酸が、Ｎ末端またはＣ末端（好ましくはＮ末端）から削除されている。
【００９４】
アミノ酸配列相同性
候補ポリペプチドが本発明のニューブラスチンポリペプチドと相同性を共有する程度は、２つのアミノ酸配列間の同一度として決定される。高レベルの配列同一性は、第１配列が第２配列に由来する可能性を示す。
【００９５】
相同性は、ＣｌｕｓｔａｌＸコンピューター整列プログラム［Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ＪＤ，Ｇｉｂｓｏｎ ＴＪ，Ｐｌｅｗｎｉａｋ Ｆ，Ｊｅａｎｍｏｕｇｉｎ ＦおよびＨｉｇｇｉｎｓ ＤＧ「Ｔｈｅ ＣｌｕｓｔａｌＸ ｗｉｎｄｏｗｓ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ： ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｉｄｅｄ ｂｙ ｑｕａｌｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９７，２５（２４）： ４８７６−８２］と、ここに提案するデフォルトパラメーターなど（ただしこれに限らない）のコンピューター分析によって決定される。このプログラムを使用すると、本発明の類似ＤＮＡ配列によってコード化されるポリペプチドの成熟部分は、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１６として本明細書に記載するアミノ酸配列と、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一度を示す。
【００９６】
相同性決定によれば、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する本発明のポリペプチドはＧＤＮＦサブファミリーと近縁であるが、このサブファミリーの別個のメンバーであることが確認される。
【００９７】
生物活性ポリペプチド
本発明のポリペプチドは、プレプロタンパク質、プロタンパク質、成熟タンパク質、グリコシル化タンパク質、リン酸化タンパク質の形、または他の翻訳後修飾を受けた任意のタンパク質の形を含めて、任意の生物活性形で提供できる。
【００９８】
本発明のポリペプチドは、具体的には、好ましくは配列表に示すＮ残基でグリコシル化されるＮ−グリコシル化ポリペプチドであってもよい。
【００９９】
好ましい態様として、本発明のポリペプチドは、１２２位にグリコシル化アスパラギン残基を有する配列番号９として記載のアミノ酸配列、１２２位にグリコシル化アスパラギン残基を有する配列番号１０として記載のアミノ酸配列、９８位にグリコシル化アスパラギン残基を有する配列番号１１として記載のアミノ酸配列、または９５位にグリコシル化アスパラギン残基を有する配列番号１２として記載のアミノ酸配列を持つ。
【０１００】
本発明では、例えば参考文献としてここに援用する米国特許第５，４３４，１３１号などに記載されているようなＩｇ融合物などのニューブラスチン融合タンパク質も考えられる。
【０１０１】
一態様として本発明は、配列番号２として示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号２として記載する配列に少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９８％、最も好ましくは少なくとも約９９％相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【０１０２】
もう一つの態様として本発明は、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号４として記載する配列に少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より一層好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【０１０３】
第三の態様として本発明は、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号５として記載する配列に少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【０１０４】
第四の態様として本発明は、配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号６として記載する配列に少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【０１０５】
第五の態様として本発明は、配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号７として記載する配列に少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【０１０６】
本発明のニューブラスチンポリペプチドには、例えば配列番号５〜７のポリペプチドアミノ酸配列（配列中のＸａａはＡｓｎまたはＴｈｒを示し、ＹａａはＡｌａまたはＰｒｏを示す）などの対立遺伝子変異体も包含される。
【０１０７】
第六の態様として本発明は、配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号９として記載する配列に少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【０１０８】
第七の態様として本発明は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号１０として記載する配列に少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【０１０９】
第八の態様として本発明は、配列番号１１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号１１として記載する配列に少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【０１１０】
第九の態様として本発明は、配列番号１２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号１２として記載する配列に少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【０１１１】
第十の態様として本発明は、配列番号１６のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはネズミプレプロニューブラスチンである配列番号１６として記載の配列に少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【０１１２】
もう一つの態様として、本発明のポリペプチドは、ＧＤＮＦサブファミリーフィンガープリント、すなわち表３の下線部のアミノ酸残基を持つ。
【０１１３】
さらにもう一つの態様として、本発明は、配列番号１として記載するポリヌクレオチド配列、その相補鎖またはその部分配列と高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列によってコード化されるポリペプチドを提供する。好ましい一態様として、本発明のポリペプチドは、配列番号１として記載するポリヌクレオチド配列に少なくとも７０％相同なポリヌクレオチド配列によってコード化される。その最も好ましい態様として、本発明のポリペプチドは、配列番号１として記載するポリヌクレオチド配列によってコード化される。
【０１１４】
さらにもう一つの態様として、本発明は、配列番号３として記載するポリヌクレオチド配列、その相補鎖またはその部分配列と高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列によってコード化される新規ポリペプチドを提供する。好ましい一態様として、本発明のポリペプチドは、配列番号３として記載するポリヌクレオチド配列に少なくとも７０％相同なポリヌクレオチド配列によってコード化される。その最も好ましい態様として、本発明のポリペプチドは、配列番号３として記載するポリヌクレオチド配列によってコード化される。
【０１１５】
さらにもう一つの態様として、本発明は、配列番号８として記載するポリヌクレオチド配列、その相補鎖またはその部分配列と高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列によってコード化される新規ポリペプチドを提供する。好ましい一態様として、本発明のポリペプチドは、配列番号８として記載するポリヌクレオチド配列に少なくとも７０％相同なポリヌクレオチド配列によってコード化される。その最も好ましい態様として、本発明のポリペプチドは、配列番号８として記載するポリヌクレオチド配列によってコード化される。
【０１１６】
さらにもう一つの態様として、本発明は、配列番号１５として記載するポリヌクレオチド配列、その相補鎖またはその部分配列と高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列によってコード化される新規ポリペプチドを提供する。好ましい一態様として、本発明のポリペプチドは、配列番号１５として記載するポリヌクレオチド配列に少なくとも７０％相同なポリヌクレオチド配列によってコード化される。その最も好ましい態様として、本発明のポリペプチドは、配列番号１５として記載するポリヌクレオチド配列によってコード化される。
【０１１７】
生物学的起源
本発明のポリペプチドは哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞またはネズミ由来の細胞から単離できる。
【０１１８】
最も好ましい一態様として、本発明のポリペプチドは、ヒト心臓組織、ヒト骨格筋、ヒト膵臓、またはヒト脳組織、特に尾状核もしくは視床から単離することができ、または下に詳述するように、哺乳類由来のＤＮＡから得ることができる。
【０１１９】
神経栄養活性
本発明のニューブラスチンポリペプチドは神経細胞またはニューロン細胞の代謝、成長、分化または生存を調節するのに有用である。具体的に述べると、ニューブラスチンポリペプチドは、生きている動物（例えばヒト）の障害または疾患であって神経栄養剤の活性に反応するものを処置または軽減するために使用される。そのような処置と方法は、下に詳述する。
【０１２０】
抗体
本発明のニューブラスチンポリペプチドまたはニューブラスチンポリペプチド断片は、ニューブラスチン特異抗体を作成するために使用される。本明細書で使用されるとき「ニューブラスチン特異抗体」とは、ニューブラスチンポリペプチドまたはニューブラスチンポリペプチド断片に対して免疫反応性の抗体またはニューブラスチンポリペプチドのエピトープに特異的に結合する抗体（例えばポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）である。
【０１２１】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の製造は当技術分野では周知である。ポリクローナル抗体は、具体的には、例えばＧｒｅｅｎら著「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ（ポリクローナル抗血清の産生）」Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍａｎｓｏｎ編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９２）の１〜５頁、Ｃｏｌｉｇａｎら著「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ ｉｎ Ｒａｂｂｉｔｓ，Ｒａｔｓ，Ｍｉｃｅ ａｎｄ Ｈａｍｓｔｅｒｓ（ウサギ、ラット、マウスおよびハムスターにおけるポリクローナル抗血清の産生）」Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９２）の２．４．１節、ならびにＥｄ ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ（編）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８８）に記載されているように取得することができる。これらのプロトコールは参照によりここに援用される。モノクローナル抗体は、具体的には、例えばＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，１９７５，２５６：４９５、Ｃｏｌｌｉｇａｎら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９２の２．５．１〜２．６．７節、およびＨａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｐｕｂ．，１９８８）の７２６頁に記載されているように取得することができ、これらのプロトコールは参照によりここに援用される。
【０１２２】
簡単に述べると、モノクローナル抗体は、抗原を含んでなる組成物を例えばマウスに注射し、血清試料を採取することによって抗体産生の存在を確認し、脾臓を摘出してＢリンパ球を入手し、そのＢリンパ球をメラノーマ細胞と融合してハイブリドーマを生成し、そのハイブリドーマをクローン化し、上記抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、そのハイブリドーマ培養から抗体を単離することによって得ることができる。
【０１２３】
モノクローナル抗体は、プロテインＡセファロースによるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどを含む、種々の確立された技術によって、ハイブリドーマ培養から単離および精製できる。例えばＣｏｌｉｇａｎら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９２，２．７．１〜２．７．１２節および２．９．１〜２．９．３節ならびにＢａｒｎｅｓら著「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（ＩｇＧ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９２）の第１０巻７９〜１０４頁を参照されたい。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、随意に、例えば、その抗体を産生させる際に対象としたポリペプチドが結合しているマトリックスへの結合と、そのマトリックスからの溶出によって、さらに精製することができる。
【０１２４】
本発明のニューブラスチンポリペプチドに結合する抗体は、完全なポリペプチドまたは興味のある小ペプチドを含有する断片を免疫抗原として使用して、作成することができる。動物の免疫化に使用するポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって、または化学合成によって得ることができ、それらのポリペプチドは随意に担体タンパク質に結合してもよい。ペプチドに化学的に結合される担体タンパク質であって、よく使用されるものには、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および破傷風トキソイドがある。次に、結合したペプチドを使って動物（具体的にはマウス、ラット、ハムスターまたはウサギなどが挙げられる）を免疫化する。
【０１２５】
一態様として、抗体は次のペプチドを用いて作成される：ペプチド１：ＣＲＰＴＲＹＥＡＶＳＦＭＤＶＮＳＴ（配列番号９のアミノ酸（ＡＡ）１０８−１２４）またはペプチド２：ＡＬＲＰＰＰＧＳＲＰＶＳＱＰＣ（配列番号９のアミノ酸９３−１０７）。これらのポリペプチドを用いて抗体を作成する方法は実施例１０に記載する。
【０１２６】
本発明者らは、次のペプチドに対するウサギポリクローナル抗体も作成した。
【０１２７】
【化３】

このグループのうち、比較的Ｃ末端に近いペプチドＲ３０およびＲ３１だけが、ウェスタンブロット上で、還元条件下に、変性タンパク質を認識した。
【０１２８】
本発明者らは、既知のＧＤＮＦ構造に基づいて表面露出ループであると予想され（ＥｉｇｅｎｂｒｏｔおよびＧｅｒｂｅｒ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１９９７，４，４３５−４３８）、したがって抗体作成に有用である、成熟タンパク質由来のさらなるニューブラスチン由来ペプチドも、下に詳述するように同定した。
【０１２９】
【化４】

本発明のもう一つの側面として、ニューブラスチンまたはニューブラスチン由来ペプチドを特異的に結合する抗体は、様々な媒質中のそれらニューブラスチン神経栄養因子の存在を検出するために、また特に、本発明のニューブラスチン分子と関係する状態または疾患の診断に使用できる。当技術分野では、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡおよびＦＡＣＳなどといった、そのような検出のための様々なプロトコールが知られている。
【０１３０】
本発明の抗体は本神経栄養因子の効果を遮断するためにも使用でき、具体的には中和抗体でありうる。
【０１３１】
本発明のポリペプチドの製造方法
下に詳述するように、本発明のニューブラスチンポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列を含む細胞を、当該ポリペプチドの産生が可能な条件で培養した後、その培養培地から当該ポリペプチドの回収を行なう。ニューブラスチンポリペプチドを生産する目的で細胞を遺伝子改変する必要がある場合は、細胞を従来の方法で、または遺伝子活性化法によって、改変することができる。
【０１３２】
従来の方法では、ニューブラスチンｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ分子が発現構築体内に含まれ、例えばリポソーム−、ポリブレン−またはＤＥＡＥデキストラン−トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション、または加速微粒子法（「バイオリスティック法」）など（ただしこれらに限らない）の標準的方法によって、細胞中にトランスフェクトされる。もう一つの選択肢として、ウイルスベクターによってＤＮＡを送達する系も使用できるだろう。遺伝子導入に役立つことが知られているウイルスには、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、おたふくかぜウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルス、およびカナリア痘瘡ウイルスなどのワクシニアウイルス、ならびに昆虫細胞（特にＳｆＰ９昆虫細胞）のバキュロウイルス感染などがある。
【０１３３】
もう一つの選択肢として、米国特許第５，７３３，７６１号および同第５，７５０，３７６号（それぞれ参考文献としてここに援用する）に記載されているような遺伝子活性化（「ＧＡ」）法を使って、細胞を改変することもできる。
【０１３４】
したがって、細胞に関して本明細書で使用する「遺伝子改変（された）」という用語は、特定の遺伝子産物を、その遺伝子産物をコード化するＤＮＡ分子および／またはその遺伝子産物のコード配列の発現を制御する調節要素をコード化するＤＮＡ分子が導入された結果、発現させる細胞を包含するものとする。上記ＤＮＡ分子は、特定のゲノム部位への当該ＤＮＡ分子の組み込みを可能にする遺伝子ターゲティングによって導入することができる。
【０１３５】
組換え発現ベクター
さらなる側面として、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを提供する。本発明の組換え発現ベクターは任意の適当な真核細胞用発現ベクターであってよい。好ましい組換え発現ベクターは、ユビキチンプロモーター含有ベクターｐＴＥＪ−８（Ｊｏｈａｎｓｅｎ ＴＥ，Ｓｃｈｏｅｌｌｅｒ ＭＳ，Ｔｏｌｓｔｏｙ Ｓ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｔ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９０，２６７，２８９−２９４）およびその誘導体、例えばｐＵｂｉ１Ｚである。好ましい市販の真核細胞用発現ベクターには、例えばウイルスプロモーター含有ベクターｐｃＤＮＡ−３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手できる）がある。もう一つの好ましい発現ベクターはＳＶ４０初期およびアデノウイルス主要後期プロモーター（プラスミドｐＡＤ２ｂｅｔａに由来、ＮｏｒｔｏｎおよびＣｏｆｆｉｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９８５，５，２８１）を使用するものである。
【０１３６】
本発明は、原核細胞用発現ベクターおよび原核細胞での発現にコドンを最適化した合成遺伝子（シンジーン（ｓｙｎｇｅｎｅ））も提供する。シンジーンは、より低いＧＣ含量と好ましい細菌（例えば大腸菌）コドンを持つものを構築した。このシンジーンは２つのベクター、すなわちｐＥＴ１９ｂと、ｐＥＴ１９ｂの誘導体であるｐＭＪＢ１６４にクローニングされている。ｐＥＴ１９ｂを使った構築を図１４に示す。この構築体では、ニューブラスチンの成熟ドメインをコード化する配列が開始メチオニンに直接融合されている。ｐＭＪＢ１６４を使った構築を図１５に示す。
【０１３７】
産生細胞
さらにもう一つの側面として、本発明は、本発明の単離されたポリヌクレオチド配列および／または本発明の組換え発現ベクターを含むように遺伝子操作された産生細胞を提供する。本発明の細胞は、具体的には、本発明のポリペプチドを一過性または安定に発現、過剰発現もしくは同時発現するように遺伝子操作することができる。一過性または安定発現を引き起こす方法は当技術分野では知られている。
【０１３８】
本発明のポリヌクレオチドは発現ベクター（例えばプラスミド、ウイルスまたは他の発現媒体）に挿入することができ、また随意に、発現制御配列に対して、コード配列の発現が当該発現制御配列に適合する条件で達成されるような方法で、連結により、機能的に連結することができる。好適な発現制御配列には、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン、イントロンのためのスプライスシグナル、停止コドンなどがあり、それらは全て、ｍＲＮＡの適切な翻訳が可能なように、本発明ポリヌクレオチドの正しい読み枠内に保たれる。発現制御配列にはリーダー配列、融合パートナー配列などの追加の成分を含めてもよい。
【０１３９】
プロモーターは具体的には構成的プロモーターでも誘導性プロモーターでもよい。細菌系でクローニングを行なう場合は、バクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）などの誘導性プロモーターを使用できる。クローニングを哺乳類系で行なう場合は、哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター、例えばユビキチンプロモーター、ＴＫプロモーターまたはメタロチオネインプロモーターなど、もしくは哺乳類ウイルスに由来するプロモーター、例えばレトロウイルス末端反復配列、アデノウイルス後期プロモーターまたはワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーターなどを使用できる。組換えＤＮＡ法または合成法によって得られるプロモーターも、本発明ポリヌクレオチドの転写に備えて使用することができる。
【０１４０】

好適な発現ベクターは通例、発現起点（ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、プロモーターおよび形質転換された細胞の表現型選択を可能にする特殊な遺伝子を含み、例えば細菌における発現のためのＴ７系発現ベクター［Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，Ｇｅｎｅ １９８７，５６，１２５］、哺乳類細胞における発現のためのｐＴＥＪ−８、ｐＵｂｉ１Ｚ、ｐｃＤＮＡ−３およびｐＭＳＸＮＤ発現ベクター［ＬｅｅおよびＮａｔｈａｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８８，２６３，３５２１］、昆虫細胞における発現のためのバキュロウイルス由来ベクター、および卵母細胞発現ベクターＰＴＬＮ［Ｌｏｒｅｎｚ Ｃ，Ｐｕｓｃｈ ＭおよびＪｅｎｔｓｃｈ ＴＪ著「Ｈｅｔｅｒｏｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ ＣＬＣ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｗｉｔｈ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（新規な特性をもつヘテロ多量体型ＣＬＣ塩素イオンチャネル）」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９３，９３，１３３６２−１３３６６］などが挙げられる。
【０１４１】
好ましい一態様として、本発明の細胞は、真核細胞、例えば、ヒト細胞などの哺乳類細胞、卵母細胞または酵母細胞である。本発明の細胞は、ＨＥＫ２９３細胞などのヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、ＢＨＫ２１細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞（ＸＬＯ）であってよいが、これらに限定されるわけではない。もう一つの態様としては、本発明の細胞は、真菌細胞、例えば糸状菌細胞である。もう一つの好ましい態様として、本細胞は昆虫細胞であり、最も好ましくはＳｆ９細胞である。他の好ましい本発明の哺乳類細胞はＰＣ１２、ＨｉＢ５、ＲＮ３３ｂ細胞系およびヒト神経前駆細胞である。ヒト細胞が最も好ましい。
【０１４２】
初代または二次細胞の例としては、線維芽細胞、上皮細胞（乳腺上皮細胞および腸上皮細胞を含む）、内皮細胞、血液の固形成分（リンパ球および骨髄細胞を含む）、グリア細胞、肝細胞、ケラチノサイト、筋細胞、神経細胞、またはそれら細胞型の前駆体が挙げられる。本発明方法に有用な不死化ヒト細胞系の例としては、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ９６０７）、Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ２１３）、ＨｅＬａ細胞およびＨｅＬａ細胞の派生株（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ２、ＣＣＬ２．１、およびＣＣＬ２．２）、ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ２４０）、ＨＴ−１０８０細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ１２１）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＴＩＢ１５２）、ＫＢ癌腫細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ１７）、Ｋ−５６２白血病細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ２４３）、ＭＣＦ−７乳癌細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＢＴＨ２２）、ＭＯＬＴ−４細胞（ＡＴＣＣ受託番号１５８２）、Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１４３２）、Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ８６）、ＲＰＭＩ８２２６細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ１５５）、Ｕ−９３７細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１５９３）、ＷＩ−３８ＶＡ１３亜系統２Ｒ４細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＬＬ７５．１）、２７８０ＡＤ卵巣癌細胞（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｌｉｃｋら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９８８，４８，５９２７−５９３２）およびヒト細胞と別の種の細胞との融合によって作出されるヘテロハイブリドーマ細胞が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。ＷＩ−３８（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ７５）およびＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ１７１）などの二次ヒト線維芽細胞株も使用できる。
【０１４３】
本発明の細胞が真核細胞である場合、異種ポリヌクレオチドの取り込みは、具体的には、感染（ウイルスベクターを使用）、トランスフェクション（プラスミドベクターを使用）、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクションまたは当技術分野で知られる他の物理的化学的方法によって行なうことができる。
【０１４４】
より好ましい態様として、本発明の単離されたポリヌクレオチド配列および／または本発明の組換え発現ベクターは、細胞の不死化および／またはトランスフォーメーションを媒介することができる少なくとも一つのＤＮＡ分子を含む哺乳類宿主細胞、神経前駆細胞、星状膠細胞、Ｔ細胞、造血幹細胞、非分裂細胞または大脳内皮細胞にトランスフェクトされる。
【０１４５】
宿主細胞における内因性遺伝子の活性化は、調節要素を導入することによって、具体的には、本発明のニューブラスチンポリペプチドをコード化する内因性遺伝子の転写をもたらすことができるプロモーターを導入することによって、達成することができる。
【０１４６】
医薬組成物
もう一つの側面として本発明は、治療有効量の本発明ポリペプチドを含んでなる新規医薬組成物を提供する。
【０１４７】
本発明のポリペプチドは、治療用として、任意の便利な形態で投与することができる。好ましい一態様として、本発明のポリペプチドは、１つまたは複数の佐剤、賦形剤、担体および／または希釈剤と共に、当技術分野で知られる従来の方法を使って当業者が製造する医薬組成物に組み込まれる。
【０１４８】
上記の医薬組成物は、本発明のポリペプチドまたはその抗体を含みうる。本組成物は単独でまたは１つもしくは複数の薬剤、薬物またはホルモンと組み合わせて投与することができる。
【０１４９】
本発明の医薬組成物は、例えば経口、静脈内、筋肉内、動脈間（ｉｎｔｅｒａｒｔｅｒｉａｌ）、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸（ａｎｔｅｒａｌ）、局所外用、舌下または直腸適用、口腔内、膣、眼窩内、脳内、頭蓋内、髄腔内、脳室内、槽内、嚢内、肺内、経粘膜または吸入など（ただしこれらに限らない）の任意の適当な経路で投与できる。
【０１５０】
肺内送達の方法、装置および製薬は、例えば米国特許第５，７８５，０４９号、第５，７８０，０１９号および第５，７７５，３２０号（それぞれ参考文献としてここに援用する）などに記載されている。投与は製剤の定期的ボーラス注射によって行なうことができ、または体外（例えばＩＶバッグ）もしくは体内（例えば生崩壊性植込み剤、生体人工器官、または移植されたニューブラスチン産生細胞のコロニー）にあるリザーバーからの静脈内または腹腔内投与によって、より継続的に行なうことができる。例えば米国特許第４，４０７，９５７号、第５，７９８，１１３号および第５，８００，８２８号（それぞれ参考文献としてここに援用する）などを参照されたい。肺内送達の方法および装置は、例えば米国特許第５，６５４，００７号、第５，７８０，０１４号および第５，８１４，６０７号（それぞれ参考文献としてここに援用する）などに記載されている。
【０１５１】
具体的に述べると、本発明によるニューブラスチンの投与は、
（ａ）ポンプ（例えばＡｎｎａｌｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ，２７：９１２（１９９３）；Ｃａｎｃｅｒ，４１：１２７０（１９９３）；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４４：１６９８（１９８４）（参考文献としてここに援用する）を参照されたい）、
（ｂ）マイクロカプセル化（例えば米国特許第４，３５２，８８３号、第４，３５３，８８８号および第５，０８４，３５０号（参考文献としてここに援用する）を参照されたい）、
（ｃ）持続放出ポリマー植込み剤（例えばＳａｂｅｌ，米国特許第４，８８３，６６号（参考文献としてここに援用する）を参照されたい）、
（ｄ）マクロカプセル化（例えば米国特許第５，２８４，７６１号、第５，１５８，８８１号、第４，９７６，８５９号および第４，９６８，７３３号ならびにＰＣＴ特許出願公開ＷＯ９２／１９１９５、ＷＯ９５／０５４５２（それぞれ参考文献としてここに援用する）を参照されたい）、
（ｅ）ＣＮＳへの裸のまたはカプセル化されていない細胞移植物（例えば米国特許第５，０８２，６７０号および第５，６１８，５３１号（それぞれ参考文献としてここに援用する）、
（ｆ）皮下、静脈内、動脈内、筋肉内への、または他の適当な部位への注射、および
（ｇ）カプセル剤、液剤、錠剤、丸剤、または持続放出製剤としての経口投与
を含めて、任意の適当な送達手段を使って達成できる。
【０１５２】
本発明の一態様では、ニューブラスチンが、ＣＮＳに、好ましくは脳室、脳実質、くも膜下腔または他の適当なＣＮＳ部位に、最も好ましくはくも膜下腔内に、直接送達される。
【０１５３】
もう一つの好ましい態様として、本発明者らは、皮下注射、静脈内投与または静脈内注入による全身送達を考えている。
【０１５４】
他の有用な非経口送達システムには、エチレン−ビニル酢酸コポリマー粒子、浸透圧ポンプ、植込み型注入システム、ポンプ送達、カプセル化細胞送達、リポソーム送達、注射針による注射、ニードルレス注射、噴霧器、エアロゾル化装置、エレクトロポレーションおよび経皮パッチがある。
【０１５５】
製剤化と投与の技術に関するさらなる詳細はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，ペンシルバニア州イーストン）の最新版に見ることができる。
【０１５６】
活性成分は１日に１回または数回の投薬で投与することができる。現時点で考えられる適切な投薬量は、１投与あたり０．５ｎｇ／ｋｇ−体重〜約５０μｇ／ｋｇおよび１日あたり約１．０ｎｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇのニューブラスチンである。ニューブラスチン医薬組成物は、神経栄養因子の局所濃度を、約５ｎｇ／ｍｌ−脳脊髄液（「ＣＳＦ」）〜２５ｎｇ／ｍｌ−ＣＳＦにするべきである。
【０１５７】
投与される量はもちろん、処置される個体の年齢、体重および状態ならびに投与経路、剤形、投与計画および所望する結果に注意深く適応させなければならず、正確な投薬量はもちろん医師によって決定されるべきである。
【０１５８】
さらなる態様として、本発明のニューブラスチンポリペプチドは、下記治療法の項に詳述するように細胞系およびベクターを使用して、遺伝子送達によって投与することができる。そのような治療用細胞系を作成するために、本発明のポリヌクレオチドを発現ベクター（例えばプラスミド、ウイルスまたは他の発現媒体）に挿入し、発現制御配列に対して、コード配列の発現が当該発現制御配列に適合する条件で達成されるような方法で、連結により、機能的に連結することができる。好適な発現制御配列には、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン、イントロンのためのスプライスシグナル、停止コドンが含まれ、それらは全て、ｍＲＮＡの適切な翻訳が可能なように、本発明ポリヌクレオチドの正しい読み枠内に保たれる。発現制御配列にはリーダー配列、融合パートナー配列などの追加の成分を含めてもよい。
【０１５９】
プロモーターは具体的には構成的プロモーターでも誘導性プロモーターでもよい。構成的プロモーターとしては、合成プロモーター、ウイルスプロモーターまたは哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーター（例えばヒトユビキチンプロモーター）などが考えられる。好ましい一態様として、本治療用細胞系は、本発明のポリペプチドを発現させるヒト不死化神経細胞系になるだろう。移植について本発明者らは、約１０^５〜１０^１０細胞、より好適には１０^６〜約１０^８細胞を移植することを考えている。
【０１６０】
治療法
ポリヌクレオチドおよびタンパク質、そこから生産されるポリペプチド、ペプチド断片または誘導体、ならびにそれらタンパク質、ペプチドまたは誘導体に対する抗体に関する本発明は、動物（ヒトを含む）の生体の障害または疾患であって神経栄養剤の活性に反応するものを処置または軽減するために使用できる。
【０１６１】
本発明のポリペプチドは、ニューブラスチンポリペプチドに反応する病理学的過程を処置するために、例えば注射、植込みまたは経口摂取型医薬組成物などを介して直接使用できる。
【０１６２】
本発明のポリヌクレオチドは、その相補配列を含めて、本発明の神経栄養因子の発現に使用できる。これは、それら本発明のタンパク質、ペプチドまたは誘導体を発現させる細胞系によって、またはそれら本発明のタンパク質、ペプチドまたは誘導体をコード化するウイルスベクターによって、またはそれらタンパク質、ペプチドまたは誘導体を発現させる宿主細胞によって達成できる。これらの細胞、ベクターおよび組成物は、ニューブラスチンポリペプチドに反応する疾患過程に冒されている処置標的領域に投与できる。
【０１６３】
好適な発現ベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスまたはワクシニアウイルスもしくは種々の細菌産生プラスミドから得ることができ、生物全体または標的とする器官、組織または細胞集団へのヌクレオチド配列のインビボ送達に使用できる。他の方法には、リポソームトランスフェクション、エレクトロポレーション、核その他の局在シグナルを含む担体ペプチドを用いたトランスフェクションおよび徐放系による遺伝子送達などがあるが、これらに限定されるわけではない。本発明のさらにもう一つの側面として、ニューブラスチン発現を阻害または増進するために、ニューブラスチン遺伝子またはその一部に相補的な「アンチセンス」ヌクレオチド配列を使用できる。
【０１６４】
さらにもう一つの側面として、本発明は、動物（ヒトを含む）の生体の障害または疾患であって神経栄養剤の活性に反応するものを処置または軽減する方法に関する。
【０１６５】
上記の障害または疾患は、具体的には、外傷、手術、虚血、感染、代謝性疾患、栄養不足、悪性腫瘍または毒物によって起こる神経系の損傷および遺伝性または特発性の過程でありうる。
【０１６６】
上記の損傷は、具体的には、感覚ニューロンまたは網膜神経節細胞（後根神経節のニューロンまたは次に挙げる組織中の任意のニューロンを含む）に起こっているものであってよい：膝、錐体および節状神経節、第八脳神経の前庭聴覚複合体、三叉神経節の上下顎葉の腹外側極、および中脳三叉神経核。
【０１６７】
本発明方法の好ましい一態様では、上記の疾患または障害が、例えば末梢神経、延髄および／または脊髄の外傷性損傷、脳虚血性ニューロン損傷、神経障害、特に末梢神経障害、末梢神経の外傷または損傷、虚血性脳卒中、急性脳損傷、急性脊髄損傷、神経系腫瘍、多発性硬化症、神経毒へのばく露、糖尿病または腎機能不全などの代謝性疾患、および感染性物質によって起こる損傷、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、パーキンソンプラス症候群、進行性核上麻痺（スチール・リチャードソン・オルセウスキー症候群）、オリーブ橋小脳萎縮症（ＯＰＣＡ）、シャイ・ドレーガー症候群（多系統萎縮症）、グァムパーキンソン痴呆症候群、筋萎縮性側索硬化症、または他の任意の先天性または神経変性疾患、および痴呆に関係する記憶障害などの、損傷したニューロンおよび外傷性ニューロンが関係する神経変性疾患である。
【０１６８】
好ましい一態様として、本発明者らは、感覚系および／または自律系ニューロンの処置を考えている。もう一つの好ましい態様として、本発明者らは、筋萎縮性側索硬化症（「ＡＬＳ」）および脊髄筋萎縮症などの運動ニューロン疾患の処置を考えている。さらにもう一つの好ましい態様として、本発明者らは、本発明ニューブラスチン分子を使用して外傷性損傷後の神経回復を増進することを考えている。一態様として、本発明者らは、神経誘導管をニューブラスチンポリペプチドを含有するマトリックスと共に使用することを考えている。そのような神経誘導管は、例えば米国特許第５，８３４，０２９号（参考文献としてここに援用する）に開示されている。
【０１６９】
好ましい一態様として、本発明のポリペプチドおよび核酸（ならびにそれらを含んでなる医薬組成物）は、末梢神経障害の処置に使用される。本発明の分子による治療が考えられる末梢神経障害には、外傷誘発性の神経障害、例えば物理的損傷または疾患状態、脳への物理的損傷、脊髄への物理的損傷、脳損傷に伴なう脳卒中、および神経変性に関係する神経学的障害などよって起こるものなどがある。
【０１７０】
本発明者らは、化学療法誘発性の神経障害（タキソールまたはシスプラチンなどの化学療法剤の送達によって起こるもの）、毒素誘発性の神経障害、薬物誘発性の神経障害、ビタミン不足誘発性の神経障害、特発性神経障害および糖尿病性神経障害の処置も考えている。例えば米国特許第５，４９６，８０４号および第５，９１６，５５５号（それぞれ参考文献としてここに援用する）を参照されたい。
【０１７１】
本発明者らは、本発明のニューブラスチンヌクレオチドおよびニューブラスチンペプチドを使った、非神経障害、多発性単神経障害、多発神経障害（軸索性および脱髄性神経障害を含む）の処置も考えている。
【０１７２】
もう一つの好ましい態様として、本発明のポリペプチドおよび核酸（ならびにそれらを含む医薬組成物）は、眼の様々な障害（黄斑変性、網膜色素変性症、緑内障などの疾患に冒された患者における網膜中の光受容器損失を含む）の処置に使用される。
【０１７３】
本発明のもう一つの目的は、ヒトを含む哺乳動物の脳に生物活性型のニューブラスチンまたはニューブラスチンの前駆体（すなわち身体によって生物活性型のニューブラスチンに容易に変換されうる分子）を産生できるベクターまたは細胞を移植することによって、上記の疾患および障害に関係する変性変化を予防する方法を提供することであり、またさらに、ニューブラスチンを分泌する細胞は（例えば半透性膜に）カプセル化することもできる。
【０１７４】
細胞はヒトを含む哺乳類の脳への移植または埋植に使用するためにインビトロで生育させることができる。
【０１７５】
好ましい一態様として、本発明のポリペプチドをコード化する遺伝子を、例えば国際特許出願ＷＯ９８／３２８６９に記載の発現ベクターを用いて、適当な細胞系に（例えばＨｉＢ５やＲＮ３３ｂにような不死化ラット神経幹細胞系またはヒト不死化神経前駆細胞系に）トランスフェクトし、得られた細胞株をヒトを含む生体の脳内に植込んで、ＣＮＳ中で本発明の治療用ポリペプチドを分泌させる。
【０１７６】
診断およびスクリーニング方法
ニューブラスチン核酸は、ある個体が、ニューブラスチン遺伝子の欠損（例えば遺伝によって、または異常な胚発生によって、または後天的なＤＮＡ損傷によって獲得されたニューブラスチン対立遺伝子の欠損など）に起因する神経障害を発生させる素因を持つかどうかを決定するために使用できる。その分析は、例えばニューブラスチン遺伝子内の欠失または点突然変異を検出することによって、またはそのような遺伝子欠損の素因の遺伝を特異的制限断片長多型で検出することによって、または患者から採取した核酸試料をニューブラスチン遺伝子に特異的な核酸プローブとハイブリダイズさせて当該核酸にハイブリダイズするそのプローブの能力を確認することにより正常なニューブラスチン遺伝子の有無を検出することによって、行なうことができる。
【０１７７】
特にニューブラスチン核酸は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。そのようなハイブリダイゼーション測定法は、ニューブラスチンタンパク質をコード化するｍＲＮＡのレベルの異常に関係する様々な異常、障害または疾患状態を検出、予知、診断または監視するために使用できる。ニューブラスチン核酸は、ニューブラスチン神経栄養因子依存的な生理過程の「マーカー」と解釈することができる。それらの過程には「正常な」生理過程（例えばニューロンの機能）および病的過程（例えば神経変性疾患）が含まれるが、これらに限らない。ニューブラスチンタンパク質および／またはニューブラスチンコード化ｍＲＮＡのレベルの異常（すなわち上昇または欠乏）による特定患者部分集団の特徴づけは、新しい疾患分類につながりうる。ここに定義される「レベルの異常」とは、定量的または定性的手段によって決定される、対照試料またはその障害をもたない個体と比較した場合のレベルの増加または減少を意味する。
【０１７８】
本発明のニューブラスチン核酸およびニューブラスチンポリペプチドは、ニューブラスチン類似体（ニューブラスチンの小分子模倣体を含む）をスクリーニングし同定するためにも使用できる。考えられる一態様として、本発明は、ニューロブラスチン（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｉｎ）媒介性の生物学的効果を誘導する候補化合物を同定する方法であって、ニューブラスチンと接触させると検出可能な産物を発現させる試験細胞を用意し、その細胞を候補化合物にばく露し、上記検出可能な産物を検出するという各段階を含む方法を提供する。上記検出可能な産物の発現は、ニューロブラスチン媒介性の生物学的効果を誘導する当該候補化合物の能力を示す。
【０１７９】
さらに本発明のニューブラスチン核酸およびニューブラスチンポリペプチドは、近縁の新規遺伝子配列およびそれらによってコードされるタンパク質（対立遺伝子変異体および一塩基多型（「ＳＮＰ」）を含む）を同定するために、ＤＮＡチップまたはタンパク質チップ上で、もしくはコンピュータープログラムで、使用することができる。そのような方法は、例えば米国特許第５，７９５，７１６号、第５，７５４，５２４号、第５，７３３，７２９号、第５，８００，９９２号、第５，４４５，９３４号、第５，５２５，４６４号（それぞれ参考文献としてここに援用する）などに記載されている。
【実施例】
【０１８０】
実施例１：ニューブラスチン核酸の単離法
方法１：ニューブラスチン遺伝子に関するヒト胎児脳ｃＤＮＡの迅速スクリーニング
ＧｅｎＢａｎｋに提出された２つのＨＧＴＳ（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（受諾番号ＡＣ００５０３８およびＡＣ００５０５１）に、ヒトパーセフィンとの相同性によって、２９０ｂｐの断片が同定された。その２９０ｂｐ断片の核酸配列から、２つのニューブラスチン特異的プライマーを合成した。ニューブラスチントップ鎖プライマー（「ＮＢＮｉｎｔ．ｓｅｎｃｅ」）の配列は５’−ＣＣＴ ＧＧＣ ＣＡＧ ＣＣＴ ＡＣＴ ＧＧＧ−３’［配列番号１７］とした。ニューブラスチンボトム鎖プライマー（「ＮＢＮｉｎｔ．ａｎｔｉｓｅｎｃｅ」）の配列は、５’−ＡＡＧ ＧＡＧ ＡＣＣ ＧＣＴ ＴＣＧ ＴＡＧ ＣＧ−３’［配列番号１８］とした。これらのプライマーを使って、９６ウェルのＰＣＲ反応を行なった。
【０１８１】
５００，０００個のｃＤＮＡクローンから得たプラスミドＤＮＡを含む９６ウェルマスタープレートには、１ウェルあたり約５０００クローンが負荷された。９６ウェルサブプレートは、１ウェルあたり５０クローンの大腸菌ＤＨ１０Ｂグリセロール保存液を含むものを使用した。
【０１８２】
ニューブラスチン核酸はポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）法を使った３ラウンドの増幅によって同定された。増幅は試料中の核酸のコピー数を増加させる。
【０１８３】
マスタープレートスクリーニング：上記の９６ウェルＰＣＲスクリーニング法を使って、ヒト胎児脳ｃＤＮＡマスタープレートを、ヒトニューブラスチンｃＤＮＡを単離するために、遺伝子特異的プライマーでスクリーニングした。
【０１８４】
３０ｎｇのヒト胎児脳ｃＤＮＡ（６ｎｇ／μｌ；Ｏｒｉｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をマスタープレートの対応するウェルから取り、次の試薬を含む総液量２５μｌの反応液に入れた：上記２つの遺伝子特異的プライマー（すなわちＮＢＮｉｎｔ．ｓｅｎｃｅおよびＮＢＮｉｎｔ．ａｎｔｉｓｅｎｃｅ）各０．２ｍＭ、１×標準ＰＣＲ緩衝液（バッファーＶ，英国Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、０．１Ｍ ＧＣ−Ｍｅｌｔ（米国Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および０．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ；英国Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【０１８５】
ＰＣＲ熱サイクル反応は次の手順と条件で行なった。まずＤＮＡを９４℃で３分間変性させた後、９４℃で各１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、７２℃で９０秒間の第一伸長を３５サイクル行ない、最終伸長を７２℃で５分間行った。９６の個々のＰＣＲ反応の産物を、臭化エチジウム染料を含む２％アガロースゲルを使ったゲル電気泳動によって分析した。あるウェルにみられた１０２ｂｐの陽性ＰＣＲ産物は、ただ一つの９６ウェルサブプレートに対応することがわかった。
【０１８６】
その１０２ｂｐ核酸断片は次の配列［配列番号１３］を持っていた。
【０１８７】
【化５】

サブプレートスクリーニング：上記２つの遺伝子特異的プライマー各０．２ｍＭ、１×標準ＰＣＲ緩衝液（バッファーＶ，英国Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、０．１Ｍ ＧＣ−Ｍｅｌｔ（米国Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および０．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ；英国Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む総液量２５μｌの反応液に、対応するサブプレートウェルから取った１μｌのグリセロール保存液を入れ、ＰＣＲによる増幅を行なうことにより、９６ウェルヒト胎児脳サブプレートをスクリーニングした。
【０１８８】
マスタープレートスクリーニングについて記載したものと同じＰＣＲ熱サイクル条件を使用した。９６の個々のＰＣＲ反応を、臭化エチジウムを含む２％アガロースゲルで分析し、上記の１０２ｐｂのＰＣＲ断片を与える陽性ウェルを同定した。
【０１８９】
コロニーＰＣＲ：陽性サブプレートウェルから取ったグリセロール保存液１ｍｌをルリアブロスに１：１００希釈した。次に、上記の希釈液１ｍｌおよび１０ｍｌを、ルリアブロス（「ＬＢ」）と１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含む２枚の別個の寒天プレートに播種した。次にそのＬＢプレートを３０℃で終夜培養した。これらのプレートから９６個のコロニーを拾って、２５μｌの最終液量に上記２つの遺伝子特異的プライマー各０．２ｍＭ、１×標準ＰＣＲ緩衝液（バッファーＶ； 英国Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、０．１Ｍ ＧＣ−Ｍｅｌｔ（米国Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、０．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ；英国Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む新しい９６ウェルＰＣＲプレートに入れた。
【０１９０】
マスタープレートスクリーニングについて記載したものと同じＰＣＲ熱サイクル条件を使用した。次に、９６の個々のＰＣＲ反応を、臭化エチジウムを含む２％アガロースゲルで分析した。次いで上記１０２ｂｐ断片を含む陽性コロニーを同定した。
【０１９１】
この陽性コロニーから調製したプラスミドＤＮＡの配列決定により、８６１ｂｐ［配列番号８］の完全長ｃＤＮＡが明らかになった。このｃＤＮＡはプレプロニューブラスチン［配列番号９］をコードしていた。ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ターミネーターサイクルシークエンシングキット（米国ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、自動ＤＮＡ配列決定を行なった。配列決定用ゲルはＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７（米国ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で泳動した。
【０１９２】
方法２：ヒト脳からのニューブラスチンｃＤＮＡのクローニング
完全長ニューブラスチンｃＤＮＡまたはｃＤＮＡ断片を増幅するもう一つの方法は、ベクター特異的またはアダプター特異的プライマーと組み合わせた上記ニューブラスチン特異的プライマーＮＢＮｉｎｔ．ｓｅｎｃｅおよびＮＢＮｉｎｔ．ａｎｔｉｓｅｎｃｅならびにＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）法により、例えばＭａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ増幅キット（米国Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，カタログ番号Ｋ１８０２−１）を使って行なうことができる。
【０１９３】
完全長ニューブラスチンｃＤＮＡの増幅には、ヒト全脳Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（米国Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，カタログ番号７４００−１）を使用することができる。増幅に有用なプライマーとしては、Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡに同梱されているアダプタープライマーＡＰ１と組み合わせたニューブラスチントップ鎖プライマー５’−ＡＴＧＧＡＡＣＴＴＧＧＡＣＴＴＧＧ−３’［配列番号１９］（「ＮＢＮｅｘｔ．ｓｅｎｃｅ」）およびニューブラスチンボトム鎖プライマー５’−ＴＣＣＡＴＣＡＣＣＣＡＣＣＧＧＣ−３’［配列番号２０］（「ＮＢＮｅｘｔ．ａｎｔｉｓｅｎｃｅ」）が挙げられる。代替トップ鎖プライマー５’−ＣＴＡＧＧＡＧＣＣＣＡＴＧＣＣＣ−３’［配列番号２８］も使用した。さらにもう一つの代替ボトム鎖プライマー５’−ＧＡＧＣＧＡＧＣＣＣＴＣＡＧＣＣ−３’［配列番号３３］も使用できる。同様に、代替ボトム鎖プライマー配列番号２４および２６も使用できる。
【０１９４】
方法３：ヒト脳からのニューブラスチンｃＤＮＡのクローニング
ニューブラスチンｃＤＮＡをクローニングするもう一つの方法は、ここに記載する１つまたは複数のニューブラスチンプローブを使って（図１に例示するように）成人または胎児脳ライブラリーをスクリーニングすることである。これらのライブラリーには、λｇｔ１１ヒト脳（米国Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，カタログ番号ＨＬ３００２ｂ）またはλｇｔ１１ヒト胎児脳（米国Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，カタログ番号ＨＬ３００２ｂ）が含まれる。
【０１９５】
方法４：ニューブラスチン遺伝子に関するマウス胎児ｃＤＮＡの迅速スクリーニング
ニューブラスチン遺伝子の迅速スクリーニングを次の方法で行なった。５００，０００個のｃＤＮＡクローンから得たプラスミドＤＮＡを含む９６ウェルマスタープレートには、１ウェルあたり約５０００クローンが負荷された。９６ウェルサブプレートは、１ウェルあたり５０クローンの大腸菌グリセロール保存液を含むものを使用した。問題の遺伝子（すなわちニューブラスチン）を同定するために、ＰＣＲによる３ラウンドの増幅を行なった。
【０１９６】
マスタープレートスクリーニング：マウスニューブラスチンｃＤＮＡを単離するために、遺伝子特異的プライマーを用いた９６ウェルＰＣＲにより、マウスフェトル（ｆｅｔｔｌｅ）ｃＤＮＡマスタープレートをスクリーニングした。次に２つのプライマーを合成した：
（１）ニューブラスチンＣ２プライマー（ＮＢＮｉｎｔ．ｓｅｎｃｅ）：５’−ＧＧＣＣＡＣＣＧＣＴＣＣＧＡＣＧＡＧ−３’［配列番号２１］および（２）ニューブラスチンＣ２ａｓプライマー（ＮＢＮｉｎｔ．ａｎｔｉｓｅｎｃｅ）：５’−ＧＧＣＧＧＴＣＣＡＣＧＧＴＴＣＴＣＣＡＧ−３’［配列番号２２］。これら２つの遺伝子特異的プライマーを使用することにより、２２０ｂｐの陽性ＰＣＲ産物が同定された。この２２０ｂｐ核酸は次の配列［配列番号１４］を持っていた。
【０１９７】
【化６】

次に、９６ウェルＰＣＲ反応を以下の方法で行なった。３０ｎｇのマウス胎仔脳ｃＤＮＡ（６ｎｇ／μｌ；Ｏｒｉｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をマスタープレートの対応するウェルから取り、上記２つの遺伝子特異的プライマー（すなわちＣ２プライマー（ＮＢＮｉｎｔ．ｓｅｎｃｅ）およびＣ２ａｓプライマー（ＮＢＮｉｎｔ．ａｎｔｉｓｅｎｃｅ））各０．２ｍＭ、１×標準ＰＣＲ緩衝液（バッファーＶ，英国Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、０．１Ｍ ＧＣ−Ｍｅｌｔ（米国Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および０．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ；英国Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む総液量２５μｌの反応液に入れた。
【０１９８】
次のＰＣＲ熱サイクル条件を使用した：９４℃で３分間の初期変性の後、９４℃で各１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、７２℃で９０秒間の伸長を３５サイクル、そして７２℃で５分間の最終伸長。９６の個々のＰＣＲ反応を、臭化エチジウム染料を含む２％アガロースゲルで分析した。あるウェルにみられた２２０ｂｐの陽性ＰＣＲ産物は、ただ一つの９６ウェルサブプレートに対応することがわかった。次に、９６の個々のＰＣＲ反応を、臭化エチジウム染料を含む２％アガロースゲルで分析した。同定された２２０ｂｐの陽性ＰＣＲ産物は、９６ウェルサブプレートのただ一つのウェルに対応した。
【０１９９】
サブプレートスクリーニング：上記２つの遺伝子特異的プライマー各０．２ｍＭ、１×標準ＰＣＲ緩衝液（バッファーＶ，英国Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、０．１Ｍ ＧＣ−Ｍｅｌｔ（米国Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および０．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ；英国Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む最終総液量２５μｌの反応液に、対応するサブプレートウェルから取った１μｌのグリセロール保存液を入れてＰＣＲによる増幅を行なうことにより、９６ウェルマウス胎児脳サブプレートをスクリーニングした。ＰＣＲ熱サイクルは、マスタープレートスクリーニングについて記載した条件に従って行なった。
【０２００】
次に、９６の個々のＰＣＲ反応を、臭化エチジウムを含む２％アガロースゲルで分析し、上記の２２０ｂｐ断片を生成する陽性ウェルを同定した。
【０２０１】
コロニーＰＣＲ：陽性サブプレートウェルから取ったグリセロール保存液１ｍｌをルリアブロス（ＬＢ）に１：１００希釈した。次に、上記の希釈液１ｍｌおよび１０ｍｌを、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含む２枚の別個のＬＢプレートに播種し、３０℃で終夜培養した。合計９６個のコロニーを単離し、２５μｌの最終液量に上記２つの遺伝子特異的プライマー各０．２ｍＭ、１×標準ＰＣＲ緩衝液（バッファーＶ； 英国Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、０．１Ｍ ＧＣ−Ｍｅｌｔ（米国Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および０．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ；英国Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含んでいる９６ウェルＰＣＲプレートに、上記９６個のコロニーを移した。
【０２０２】
ＰＣＲ熱サイクルを上記の条件に従って行なった（下記「マスタープレート」の項を参照）。９６の個々のＰＣＲ反応を、臭化エチジウムを含む２％アガロースゲルでのゲル電気泳動によって分析した。２２０ｂｐ断片の存在によって、陽性コロニーを同定した。この陽性コロニーからプラスミドを調製した。そのクローンを、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ターミネーターサイクルシークエンシングキットとＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼとを用いる自動ＤＮＡ配列決定によって配列決定した。配列決定用ゲルはＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７（米国ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で泳動した。その結果得られたこのクローンの配列から、２１３６ｂｐの完全長ｃＤＮＡ［配列番号１５］が明らかになった。このｃＤＮＡは、マウスプレプロニューブラスチンポリペプチドをコードする配列番号１６の予想アミノ酸配列を持つオープンリーディングフレームを含む。
【０２０３】
実施例２：ゲノムニューブラスチンのクローニング
上述のように本出願人らは、ＧｅｎＢａｎｋに登録された２つのヒトＢＡＣクローン（受諾番号ＡＣ００５０３８およびＡＣ００５０５１）に、ペーセフィンおよびパーセフィンの隣接配列に相同な領域を有する２９０ｂｐの核酸断片を同定した。出願人らは、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＤＮＡＳｔａｒ，Ｉｎｃ．）を使って、さらなるニューブラスチン核酸をコード化する核酸をクローニングする目的で、上記８６１ｂｐの予想配列を使って追加のプライマーを設計した。ゲノムＤＮＡでのＰＣＲ反応を用いてニューブラスチン遺伝子をクローニグするために、２対のプライマーを使用した。それら２対のプライマーを、次に示す。
【０２０４】
第１プライマー対
【０２０５】
【化７】

第２プライマー対
【０２０６】
【化８】

第１プライマー対を使ったところ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入したヒトゲノムＤＮＡの調製物（カタログ番号６５５０−１）から、８８７ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
【０２０７】
ＰＣＲプロトコール：ＰＣＲはＥｘｐａｎｄ^ＴＭハイフィデリティ（Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ＰＣＲシステム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）をバッファー１と共に使用して行なった。ＰＣＲ反応混合物には、５０μｌの総液量で５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と１７．５ｐｍｏｌの各ｄＮＴＰを添加した。熱サイクルは、９４℃で２分間の前変性段階の後、それぞれ９４℃で１０秒間および６８℃で１分間の２段階サイクルを３５回行なった。６８℃で５分間のインキュベーションによって熱サイクルを停止した。熱サイクルはＰＴＣ−２５５ ＤＮＡエンジンテトラッド（Ｅｎｇｉｎｅ Ｔｅｔｒａｄ）サーモサイクラー（マサチューセッツ州ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で行なった。ＰＣＲ産物を２％アガロース（ＦＭＣ）でのゲル電気泳動によって分析し、写真撮影した。
【０２０８】
ヒトゲノムＤＮＡから第１プライマー対を使って増幅された８８７ｂｐ断片をｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ＸＬ１−Ｂｌｕｅコンピテント大腸菌細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。得られたプラスミド（ニューブラスチン−２と呼ぶ）をサーモシケナーゼ（Ｔｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使って配列決定した。配列決定反応生成物を、ＡＬＦＥｘｐｒｅｓｓ自動配列決定装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）での電気泳動によって分析した。
【０２０９】
第２のプライマー対（上記の第１プライマー対）を用いるヒトゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅によって得られた断片を配列決定したところ、オープンリーディングフレームの３’末端に追加された４２ｂｐ領域が明らかになった。その完全長配列を、他の神経栄養因子類の核酸の配列と比較すると共に、ＮｅｔｇｅｎｅおよびＧｅｎｅ Ｍａｒｋソフトウェア（Ｂｒｕｎａｋら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９１，２２０，４９−６５；Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９５，２３，３５５４−６２）を使って、考えうるスプライス接合部とコードである可能性が高い領域とを同定する遺伝子発見ソフトウェアプログラムでエキソン−イントロン境界をマッピングすることによって分析した。エキソン−イントロン境界は、上記の迅速スクリーニングで得たｃＤＮＡによって確認された。
【０２１０】
図７に図示するように、得られたニューブラスチン遺伝子は７０ｂｐのイントロンで分離された２つのエキソンを持つ。それらのエキソンは全体として完全長ニューブラスチンポリペプチドの予想アミノ酸配列を持つ。予想されるｃＤＮＡ［配列番号３］は、２３８アミノ酸残基［配列番号４］をコード化するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいる。ニューブラスチン−２クローンはプロニューブラスチンの全コード配列を含んでいた。この遺伝子によってコード化されるアミノ酸配列は３つのタンパク質、パーセフィン、ニュールツリンおよびＧＤＮＦに高い相同性を示した。
【０２１１】
実施例３：ニューブラスチン核酸の発現
ニューブラスチンＲＮＡの発現は、げっ歯類およびヒトの神経組織と非神経組織の両方に、様々な未成熟および成熟発育段階で、下記の技術を用いて検出された。
【０２１２】
ＲＴ−ＰＣＲを用いてニューブラスチンＲＮＡ発現を検出する方法：配列番号１であると確認されたニューブラスチンＤＮＡ配列に基づいて、次のプライマーを合成した：（１）ニューブラスチンＣ２プライマー５’−ＧＧＣＣＡＣＣＧＣＴＣＣＧＡＣＧＡＧ−３’［配列番号２１］および（２）ニューブラスチンＣ２ａｓプライマー５’−ＧＧＣＧＧＴＣＣＡＣＧＧＴＴＣＴＣＣＡＧ−３’［配列番号２２］。このプライマーセットを使って、成人およびヒト胎児全脳ｍＲＮＡからＤＮＡ断片をＲＴ−ＰＣＲ増幅した。この反応によって生成したＤＮＡ断片の中に２２０ｂｐの断片があった。２２０ｂｐのＤＮＡ断片が同定されたことから、ニューブラスチン遺伝子は成人および胎児の脳組織で発現されることが確認された。２２０ｂｐのＤＮＡ断片は、これらのプライマーを用いてゲノムＤＮＡからも増幅された。
【０２１３】
ノーザンブロットハイブリダイゼーションによってニューブラスチンＲＮＡ発現を検出する方法：成人組織由来のポリＡ^＋ＲＮＡのノーザンブロットを商業的供給者（米国Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から購入し、^３２Ｐ標識ニューブラスチンｃＤＮＡでプローブした。この標識ニューブラスチンｃＤＮＡは上記実施例１に記載の方法に従って調製した。
【０２１４】
プローブの調製：ニューブラスチン核酸ＤＮＡ断片（配列番号８のヌクレオチド２９６−８１９）を、ハイブリダイゼーションプローブとして使用するために、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ ＩＩラベリングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ；カタログ番号ＲＰＮ１６３３）により、製造者の推奨するとおりに標識した。簡単に述べると、ＤＮＡ試料を、４５μｌの１０ｍＭ ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に２．５〜２５ｎｇの濃度になるように希釈した。次に、その試料を沸騰水浴中９５〜１００℃に５分間加熱し、その試料を氷上に５分間置いて急冷した後、それを短時間遠心分離して内容物を反応チューブの底に移動させることにより、ＤＮＡを変性させた。変性させたＤＮＡの全量を、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、エキソヌクレアーゼフリーのクレノウ酵素およびランダムプライマーの緩衝溶液が乾燥安定化された形で入っている反応チューブに、５μｌのＲｅｄｉｖｕｅ［^３２Ｐ］ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｄ．）と共に加えた。ピペットチップを溶液中で動かして上下に２回ピペット操作することによってその溶液を混合し、その反応混合物を３７℃で１０分間インキュベートした。５μｌの０．２Ｍ ＥＤＴＡを添加することによって標識反応を停止した。ハイブリダイゼーションプローブとして使用するために、そのＤＮＡ試料を９５〜１００℃に５分間加熱した後、そのＤＮＡ試料を氷上で５分間急冷することにより、標識ＤＮＡを一本鎖に変性させた。そのチューブを遠心分離し、その内容物をよく混合した。最後に、一本鎖ＤＮＡプローブを、ヌクレオチド除去キット（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ； Ｑｉａｇｅｎ）を使って精製した。
【０２１５】
ハイブリダイゼーション技術：調製済のノーザンブロットを商業的供給者から購入し（「マルチプル・ティシュー・ノーザン・ブロッツ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｓ）」米国Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；カタログ番号７７６０−１および７７６９−１）、製造者の指示に従い、上で調製したニューブラスチン^３２Ｐ標識プローブを使ってハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションには、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液（米国Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用し、約３ｎｇ／ｍｌの濃度の標識プローブを使用した。ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液を６８℃に加熱した後、撹拌してすべての沈殿物を溶解させた。各ノーザンブロットメンブレン（１０×１０ｃｍ）を、製造者の指示に従い、Ｈｙｂａｉｄハイブリダイゼーションオーブンにて、少なくとも５ｍｌのＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液中、６８℃で３０分間プレハイブリダイズした。ニューブラスチン^３２Ｐ標識プローブを９５〜１００℃で２時間変性させ、次に氷上で急冷した。１４μｌの標識プローブを５ｍｌの新しいＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂに加え、よく混合した。標識ＤＮＡプローブを含有する上記５ｍｌの新しいＥｘｐｅｒｓｓＨｙｂ溶液をブロットの上に均等に分配することにより、プレハイブリダイゼーションに使用したＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液を置き換えた。ブロットをＨｙｂａｉｄハイブリダイゼーションオーブン中、６８℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後に、ブロットを濯ぎ、低ストリンジェンシー（０．０５％ＳＤＳを含む室温の２×ＳＳＣ緩衝液）で数回洗浄した後、高ストリンジェンシー洗浄（０．１％ＳＤＳを含む５０℃の０．１×ＳＳＣ）を行なった［２０×ＳＳＣは０．３Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸Ｎａ（ｐＨ７．０）である］。そのブロットを、増感紙を使って−８０℃でＨｙｐｅｒｆｉｌｍ ＭＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｄ．）に接触させた。
【０２１６】
このノーザンブロットハイブリダイゼーション実験の結果を図１に示す。図１Ａ（左）および図１Ｂ（右）は、実施例３に記述したように^３２Ｐ標識ニューブラスチンｃＤＮＡでプローブしたポリＡ^＋ＲＮＡのノーザンブロットである。マーカーは１．３５キロ塩基対（「ｋｂ」）、２．４ｋｂ、４．４ｋｂ、７．５ｋｂおよび９．５ｋｂのサイズのポリヌクレオチドを表す。図１Ａのメンブレンは、様々な成人組織から抽出されたｍＲＮＡで調製したものである。このノーザンブロットハイブリダイゼーション分析の結果より、本出願人らは、ニューブラスチンｍＲＮＡは多くの成人組織で発現されると結論する。最高レベルのニューブラスチン発現は、心臓、骨格筋および膵臓に検出される。図１Ｂのメンブレンは、成人脳の様々な領域から抽出されたＲＮＡを使って調製したものである。成人脳内では、最高レベルの発現は尾状核および視床に見られる。約５ｋｂのｍＲＮＡ転写物が、脳内で発現されるニューブラスチンｍＲＮＡの主な形である。
【０２１７】
組織におけるインサイチューハイブリダイゼーションによってニューブラスチンＲＮＡ発現を検出する方法：
以下の技術は動物組織（例えばげっ歯類組織）におけるニューブラスチンＲＮＡの発現をニューブラスチンアンチセンスプローブによって測定するために使用される。
【０２１８】
マウスにおける発現：
組織試料の調製：同期妊娠（ｔｉｍｅ−ｐｒｅｇｎａｎｔ）マウス（Ｂ＆Ｋ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ，スウェーデン・ストックホルム）を、妊娠１３．５日または１８．５日に頸椎脱臼によって屠殺した。滅菌条件下での切開によって胚を摘出し、直ちに４％パラホルムアルデヒド（「ＰＦＡ」）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ）の溶液に２４〜３０時間浸漬した後、ＰＦＡから取り出してＰＢＳ中に保存した。その組織を３０％ショ糖の溶液に浸漬し、次にＴｉｓｓｕｅＴｅｃｈ（ＯＣＴ化合物、Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ ＵＳＡ，カリフォルニア州トランス）に包埋した。６系列の冠状または矢状切片（各１２μｍ）をクリオスタットで切断し、正に荷電したガラススライド上に解凍してのせた。新生仔頭部／脳（Ｐ１、Ｐ７）を胚段階と同じプロトコールで固定し、成体脳組織は解剖して直ちにドライアイスで凍結し、前もって包埋を行なわずにクリオスタットで切断した。
【０２１９】
ニューブラスチンリボプローブの調製：アンチセンスニューブラスチンＲＮＡプローブ（以下「ニューブラスチンリボプローブ」という）を以下のように作成した。マウスニューブラスチンｃＤＮＡ配列［配列番号１５］のヌクレオチド１１０９〜１８６３をＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングした。得られたプラスミドをＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで切断して直線状ＤＮＡにした。そのＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片を、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼとジゴキシゲニン（「ＤＩＧ」）ＲＮＡラベリングキットにより、製造者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の指示に従ってインビトロで転写した。
【０２２０】
ハイブリダイゼーション：クリオスタット切片を４％ＰＦＡで１０分間固定し、１０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫで５分間処理し、７０％および９５％エタノールで、それぞれ５分間と２分間、順次脱水した後、風乾した。１μｇ／ｍｌのＤＩＧ標識プローブを含むハイブリダイゼーション緩衝液（５０％脱イオンホルムアミド、１０％の５０％デキストラン硫酸溶液、１％デンハート液、２５０μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＮａＰＯ_４、１％サルコシル）を８０℃に２分間加熱し、各切片に適用した。次に、それらの切片をパラフィルムで覆い、５５℃で１６〜１８時間インキュベートした。
【０２２１】
翌日、それらの切片を、高ストリンジェンシー（５０％ホルムアミドを含む２×ＳＳＣ）で５５℃で３０分間洗浄した後、ＲＮａｓｅ緩衝液中で洗浄し、２０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａと共に３７℃で３０分間インキュベートした。ＤＩＧ標識プローブを検出するために、切片をブロッキング溶液（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０および１０％熱非働化ヤギ血清を含むＰＢＳ）中で１時間プレインキュベートした後、アルカリホスファターゼ結合抗ＤＩＧ抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の１：５０００希釈液と共に４℃で終夜インキュベートした。翌日、各切片に、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳでの２時間の洗浄を４回行ない、次にＮＴＭＴ緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で１０分間の洗浄を２回行なった。次に、それらの切片を、０．５ｍｇ／ｍｌのレバミゾールを含むＢＭパープル基質中で４８時間インキュベートした。ＰＢＳ中で洗浄することによって、発色反応を停止した。切片を風乾し、ＤＰＸ（スウェーデンＫＥＢＯ−ｌａｂ）を使ってカバーガラスで覆った。
【０２２２】
このインサイチューハイブリダイゼーション反応の結果を表１に記載する。
【０２２３】
（表１）
【０２２４】
【表１】

表１に示すように、胎生１３．５日（「Ｅ１３．５」）で、ニューブラスチンは脊髄と後脳に発現され、前脳に弱く発現された。ニューブラスチン発現は、発生中の網膜および感覚神経節（後根神経節および三叉神経節（Ｖ））でも検出された。神経系の外では、腎臓、肺および腸に弱い発現が認められ、ニューブラスチンがこれらの組織でも発現されることが示された。
【０２２５】
胎生１８．５日（「Ｅ１８．５」）では、ニューブラスチンは、三叉神経節（Ｖ）に最も顕著に発現された。ニューブラスチン発現は、網膜、線条体および皮質にも検出された。また発現は歯原基にも見られた。
【０２２６】
再び表１について述べると、Ｅ１８．５の時点から生後１日および７日までは、増加したニューブラスチン発現が皮質、線条体および三叉神経節（Ｖ）に見られた。ニューブラスチン発現は、皮質の外側の層の方が、皮質の内側の層よりも顕著だった。Ｐ７では、生後１日と同じ構造に発現が見出されたが、それに加えて、海馬、特に歯状回および小脳にもニューブラスチン発現が見出された。ネズミ成体脳では、歯状回にニューブラスチンが強く発現され、試験した他の組織ではニューブラスチン発現は極めて低いレベルか、検出不可能だった。
【０２２７】
ラットにおける発現：
以下の実験では、アルカリホスファターゼ標識オリゴデオキシヌクレチドニューブラスチンアンチセンスプローブによるラット組織のハイブリダイゼーションを説明する。
【０２２８】
組織試料の調製：ペントバルビタール麻酔後に妊娠ウィスターラット（デンマーク、Ｍｏｌｌｅｇａａｒｄ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ）からラット胚（Ｅ１４）を得た。出生後ラット（Ｐ０、Ｐ７、成体）は断頭によって屠殺した。解剖した脳および頭部全体を直ちに冷０．９％ＮａＣｌに浸漬し、新鮮凍結し、クリオスタットで２０μｍに切片化した（冠状および矢状切片、１０系列）。
【０２２９】
インサイチューハイブリダイゼーション：２系列の切片を、アンチセンスアルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合オリゴデオキシヌクレオチドプローブ（５’−ＮＣＡ ＧＧＴ ＧＧＴ ＣＣＧ ＴＧＧ ＧＧＧ ＧＣＧ ＣＣＡ ＡＧＡ ＣＣＧ Ｇ−３’［配列番号２７］、オリゴ番号１６４６７５、デンマーク・ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使ってハイブリダイズさせた。このプローブは、配列番号１５のマウスニューブラスチンｃＤＮＡの塩基１１４０〜１１６９に相補的である。
【０２３０】
ハイブリダイゼーションに先立って、切片を室温で風乾し、５５℃で１０分間加熱した後、９６％エタノールで４℃で終夜処理した。次に、それらの切片を風乾し、ハイブリダイゼーション媒質（５．０ｐｍｏｌプローブ／ｍｌ）中３９℃終夜インキュベートした（Ｆｉｎｓｅｎら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９２，４７，１０５−１１３；Ｗｅｓｔら，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１９９６，３７０，１１−２２）。
【０２３１】
ハイブリダイゼーション後の処理は、１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸Ｎａ）中５５℃で３０分間のすすぎを３回の後、室温の Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）中で１０分間のすすぎを３回行ない、次にＡＰ発色剤を添加することからなった。ＡＰ発色剤は使用直前に調製し、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ，Ｓｉｇｍａ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ，Ｓｉｇｍａ）および Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−ＭｇＣｌ_２緩衝液（ｐＨ９．５）を含んだ（Ｆｉｎｓｅｎら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９２，４７，１０５−１１３）。ＡＰ発色は暗所室温にて４８時間行なった。切片を蒸留水で濯ぐことによって、発色反応を停止した。切片をアセトン系列中で脱水し、キシレン−フェノールクレオソート（英国Ａｌｌｃｈｅｍ）中で軟化させ、キシレンで透徹し、Ｅｕｋｉｔｔ（デンマークＢｉｅ ＆ Ｂｅｒｎｔｓｅｎ）を使ってカバーガラスで覆った。
【０２３２】
対照反応は、（１）ハイブリダイゼーションに先立って切片をＲＮａｓｅ Ａ（５０μｇ／ｍｌ，スウェーデン・Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で前処理すること、（２）１００倍過剰の非標識プローブを使って切片をハイブリダイズさせること、および（３）ハイブリダイゼーション緩衝液のみを使って切片をハイブリダイズさせることからなった。このハイブリダイゼーション反応の結果を表２に記載する。
【０２３３】
（表２）
【０２３４】
【表２】

胎生１４日（Ｅ１４）で、ニューブラスチンはラット胚の前脳、後脳および脊髄に弱く発現された。ニューブラスチンｍＲＮＡは眼（網膜）、後根神経節、三叉神経節（Ｖ）ならびに腎臓、肺、心臓、肝臓および腸でも検出された。新生仔（Ｐ０）ラットでは、顕著なニューブラスチン発現が、皮質および線条体に認められた。ニューブラスチン発現は、嗅球および海馬でも検出された。７日齢（Ｐ７）ラットでは、ニューブラスチンが皮質、線条体、嗅球および小脳に発現された。顕著なシグナルが海馬に見られた。成体ラットの場合、脳のほとんどの領域で、ニューブラスチン発現は、極めて低いレベルまたは検出不可能なレベルだった。弱いシグナルが視床核に検出され、顕著なニューブラスチン発現が海馬に検出された。
【０２３５】
実施例４：ニューブラスチンポリペプチド
配列番号８に同定されるオープンリーディングフレームまたはコード領域（ＣＤＳ）は、プレプロポリペプチド（「プレプロニューブラスチン」と呼ぶ）をコード化する。このオープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列を配列番号９に示す。配列番号９に基づき、ニューブラスチンポリペプチドの３つの変異体が同定された。それらの変異体には、以下のポリペプチドが含まれる：
（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を有し、本明細書でＮＢＮ１４０と呼ばれるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を有し、本明細書でＮＢＮ１１６と呼ばれるポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を有し、本明細書でＮＢＮ１１３と呼ばれるポリペプチド。
【０２３６】
同様に、（配列番号４の）アミノ酸配列を有するプレプロポリペプチドをコード化する配列番号３に同定されるコード領域（ＣＤＳ）に基づいて、ニューブラスチンの３つの変異体が同定された。それらの変異体には、以下のポリペプチドが含まれる：
（ｉ）配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【０２３７】
Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（１．７５）による多重配列整列に基づき、配列番号９をＧＤＮＦ、パーセフィンおよびニュールツリンと整列させた。このアラインメントを表３に示す。
（表３）
（ニューブラスチンとパーセフィン、ニュールツリンおよびＧＤＮＦとのアミノ酸配列比較）
【０２３８】
【表３】

★ 完全に保存された単一の残基を持つ位置を示す。
： 次の「強（ｓｔｒｏｎｇ）」グループの一つが完全に保存されていることを示す：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷ。
． 次の「弱（ｗｅａｋｅｒ）」グループの一つが完全に保存されていることを示す：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＶＬＩＭ、ＨＦＹ。
【０２３９】
表３に示すアミノ酸配列アラインメントから、ニューブラスチンは７つの保存されたシステイン残基を、ＴＧＦ−βスーパーファミリー内で保存されている位置に持つことがわかる。一態様として、好ましいニューロブラスチンポリペプチドは、配列番号２の８、３５、３９、７２、７３、１０１および１０３位、または配列番号４および９の４３、７０、７４、１０７、１０８、１３６および１３８位に保存された（７つの）システイン残基を含有する。これら７つの保存されたシステイン残基は、ＴＧＦ−βスーパーファミリー内で３つの単量体ジスルフィド結合（例えば配列番号２ではシステイン残基８−７３、３５−１０１および３９−１０１間、また例えば配列番号４および９ではシステイン残基４３−１０８、７０−１３６および７４−１３８間が考えられる）と、１つの単量体間ジスルフィド結合（例えば配列番号２ではシステイン残基７２−７２間、また例えば配列番号４および９ではシステイン１０７−１０７間が考えられる）を形成し、それらは、伸展したβストランド領域と共にＴＧＦ−βスーパーファミリーの保存された構造モチーフを構成することが知られている。例えばＤａｏｐｉｎら，Ｐｒｏｔｅｉｎ １９９３，１７，１７６−１９２を参照されたい。
【０２４０】
この配列アラインメントに基づいて、ニューブラスチンは神経栄養因子のＧＤＮＦサブファミリーの一メンバーであることが示された（表３では、ＧＤＮＦサブファミリーフィンガープリントであるＬＧＬＧ−ＦＲ（Ｙ／Ｆ）ＣＳＧＳＣ−ＱｘＣＣＲＰ−ＳＡｘｘＣＧＣに下線を引いている）。
【０２４１】
ＧＤＮＦファミリーの他のメンバーに対するニューブラスチンの相同性を計算した。その結果を下記表４に記載する。
【０２４２】
（表４）
（ＧＤＮＦファミリーの他のメンバーに対するニューブラスチンポリペプチドの相同性）
【０２４３】
【表４】

ＧＤＮＦ＝グリア細胞系由来栄養因子
ＮＴＮ＝ニュールツリン
ＰＳＰ＝パーセフィン
ＩＨＡ＝インヒビン−α
ＴＧＦ−β２＝トランスフォーミング成長因子β２
「強い相同性」は、次の「強（ｓｔｒｏｎｇ）」グループの一つが保存されていることを示す：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷ。
【０２４４】
実施例５：ニューブラスチンの生産
本発明者らは、真核細胞と原核細胞の両方で、下記のようにニューブラスチンを生産した。
【０２４５】
発現ベクター：ニューブラスチンをコード化する完全長ｃＤＮＡを真核細胞用発現ベクターｐＵｂｉ１Ｚに挿入した。このベクターは、ヒトＵｂＣプロモーターを改変型のｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏにクローニングすることによって作成された。無改変のｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏは市販されている（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。改変型ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏは、アンピシリン遺伝子（３９３３〜５０１５位）と２８３８〜３１３４位の配列が除去されているために、親ベクターより小さい。この改変型ｐｃＤＮＡ３．１／ＺｅｏのＣＭＶプロモーターをｐＴＥＪ−８（Ｊｏｈａｎｓｅｎら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９０，２６７，２８９−２９４）由来のＵｂＣプロモーターで置き換えてｐＵｂｉ１Ｚを得た。
【０２４６】
哺乳類細胞発現：次に、ニューブラスチンコード配列を含む上記ｐＵｂｉ１Ｚベクターを、不死化ラットニューロン細胞系である哺乳類細胞系ＨｉＢ５にトランスフェクトした（Ｒｅｎｆｒａｎｚら，Ｃｅｌｌ，１９９１，６６，７１３−７２９）。ニューブラスチンを安定に発現する数系統のＨｉＢ５細胞系（ＲＴ−ＰＣＲによって決定）を樹立した。ノーザンブロット上の全ＲＮＡを^３２Ｐ標識ニューブラスチンプローブとハイブリダイズさせることにより、上記安定細胞系のうちの一つに、ＨｉＢ５ｐＵｂ１ｚＮＢＮ２２発現が確認された。これらの研究の結果を図２に示す。次に、ＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２を、ニューブラスチン神経栄養活性研究用のニューブラスチン源として使用した。
【０２４７】
図２は、ＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２クローン中のニューブラスチンｃＤＮＡの発現（すなわち、後述するように本発明の^３２Ｐ標識ニューブラスチンｃＤＮＡでプローブしたノーザンブロット）を示している。このブロットは、表示されているように、それぞれ非トランスフェクトＨｉＢ５細胞、ＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２細胞およびＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＧＤＮＦ１４から抽出された全ＲＮＡによって調製した。それぞれ４．１ｋｂおよび１．９ｋｂに相当する２８Ｓおよび１８Ｓ ｒＲＮＡバンドの位置をブロットの上に示してある。
【０２４８】
図３に示すように、ニューブラスチン由来ポリペプチドに対して産生された抗体も、ＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２クローンから得た調整培地中に約１３キロダルトン（「ｋＤ」）のタンパク質を認識したが、非トランスフェクトＨｉＢ５細胞から得た調整培地にはこれが認められなかった（実施例６参照）。
【０２４９】
未修飾（すなわち翻訳後修飾を受けていない）ニューブラスチンポリペプチドＮＢＮ１４０［配列番号１０］およびＮＢＮ１１６［配列番号１１］およびＮＢＮ１１３［配列番号１２］の予想分子量は、それぞれ１４．７キロダルトン（「ｋＤ」）、１２．４ｋＤおよび１２．１ｋＤであると決定された。
【０２５０】
方法：非トランスフェクトＨｉＢ５細胞およびＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２クローンから得た全ＲＮＡ（１０μｇ）によるノーザンブロットを、０．８％ホルムアルデヒドアガロースゲルでの電気泳動によって調製し、ナイロンメンブレン（Ｄｕｒａｌｏｎｅ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にブロットした。そのブロットを、配列番号８とニューブラスチンｃＤＮＡの５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲに由来する追加のヌクレオチドとを含む、ランダムラベリング法で調製した１．３ｋｂの^３２Ｐ標識プローブと、実施例３に記載したようにハイブリダイズさせ、洗浄した。そのブロットをＨｙｐｅｒｆｉｌｍ ＭＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に増感紙を使って−８０℃で接触させた。
【０２５１】
Ｎ２サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した無血清培地中で終夜培養したＨｉｂ５ｐＵｂｉ１ＮＢＮ２２または非トランスフェクトＨｉｂ５細胞から得た調整培地を濃縮し、１５％ポリアクリルアミドゲル（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ；カタログ番号８０−１２６２−０１）で分離した。タンパク質をＰＶＤＦメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ；カタログ番号ＲＰＮ−３０３Ｆ）に転写し、非特異的タンパク質結合部位を、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中の５％脱脂粉乳でブロックした。メンブレンをポリクローナルニューブラスチン抗体（１：１０００）と共に終夜インキュベートした後、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合した抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ；カタログ番号ＮＡ９３４）（１：２０００）と共にインキュベートした。ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ；カタログ番号ＲＰＮ２１０９）またはＥＣＬ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ； カタログ番号ＲＰＮ２１３２）を製造者の指示（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に従って使用することにより、免疫染色を可視化した。
【０２５２】
これらの実験の結果を図３に示す。図３Ａおよび３Ｂは、トランスフェクトされたＨｉＢ５細胞におけるニューブラスチンタンパク質の発現を示す図である。非トランスフェクトＨｉＢ５細胞［レーン１］またはニューブラスチンｃＤＮＡをトランスフェクトされた安定なＨｉＢ５クローン［レーン２］から得た終夜培養培地を後述のように濃縮した。次に、その培地を、ニューブラスチンに特異的な実施例１０に記載の２種類のポリクローナル抗体Ａｂ−１およびＡｂ−２を使って、ウェスタンブロット法で分析した。トランスフェクト細胞から得た培地では、どちらの抗体も約１５ｋＤａの分子量を持つタンパク質を認識することがわかった。このタンパク質は非トランスフェクトＨｉＢ５細胞には見られなかった。
【０２５３】
ニューブラスチンをコード化するクローン化ｃＤＮＡを、他の真核細胞用発現ベクター、例えば真核細胞用発現ベクターＴＥＪ−８（Ｊｏｈａｎｓｅｎら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９０，２６７，２８９−２９４）またはｐｃＤＮＡ−３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入して、得られた発現プラスミドを別の哺乳類細胞株、例えばチャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ、ＰＣ１２またはＲＮ３３ｂ細胞系、またはヒト神経幹細胞などにトランスフェクトすることもできる。ニューブラスチンを発現させる安定な細胞系は、例えばニューブラスチンタンパク質の生産に使用される。
【０２５４】
ＣＨＯ細胞での発現
プラスミドｐＪＣ０７０．１４の構築
チャイニーズハムスター卵巣細胞中でニューブラスチンｃＤＮＡを発現させるために、プレプロ型のヒトニューブラスチンをコード化するｃＤＮＡ断片を、哺乳類発現ベクターｐＥＡＧ３４７に挿入して、プラスミドｐＪＣ０７０．１４を作成した。ｐＥＡＧ３４７は、タンデムなＳＶ４０初期およびアデノウイルス主要後期プロモーター（プラスミドｐＡＤ２ｂｅｔａ由来：ＮｏｒｔｏｎおよびＣｏｆｆｉｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９８５，５，２８１）、ユニークなＮｏｔＩクローニング部位を含み、その後ろにＳＶ４０後期転写ターミネーターおよびポリＡシグナル（プラスミドｐＣＭＶｂｅｔａ由来：ＭａｃＧｒｅｇｏｒおよびＣａｓｋｅｙ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ １９８９，１７，２３６５）が続いている。その他にｐＥＡＧ３４７は、ｐＵＣ１９由来のプラスミド骨格と、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞でのＭＴＸ選択および増殖用のｐＳＶ２ｄｈｆ由来のｄｈｆｒを含む。
【０２５５】
プラスミドｐＪＣ０７０．１４を２段階で作成した。まず、ヒトニューブラスチンのプレプロ型をコード化する断片を、オリゴヌクレオチドＫＤ２−８２４、５’ ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡ ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡ ＴＧＧＡＡＣＴＴＧＧ ＡＣＴＴＧＧＡＧＧ ３’［配列番号３１］、ＫＤ２−８２５、５’ ＴＴＴＴＴＴＣＣＴＴ ＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴ ＣＡＧＣＣＣＡＧＧＣ ＡＧＣＣＧＣＡＧＧ ３’［配列番号３２］およびＰＦＵポリメラーゼによるポリメラーゼ連鎖反応を使って、プラスミドｐＵｂｉ１Ｚ−ＮＢＮから単離した。その断片をｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）のＳｒｆ−１部位にクローニングして、プラスミドｐＪＣ０６９を作成した。第二段階として、部分Ｎｏｔ−１消化をプラスミドｐＪＣ０６９に行なって、６８５ｂｐ断片（ニューブラスチン遺伝子を含む）を生成し、それをプラスミドｐＥＡＧ３４７のＮｏｔ−１部位にクローニングして、プラスミドｐＪＣ０７０．１４を作成した。プラスミドｐＪＣ０７０．１４中のニューブラスチン遺伝子の転写は、アデノウイルス主要後期プロモーターによって制御される。
【０２５６】
ニューブラスチンを発現するＣＨＯ細胞系の作成 ２００μｇのｐＪＣ０７０．１４を、制限エンドヌクレアーゼＭｌｕ−１での消化によって直線化した。そのＤＮＡをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出し、エタノール沈殿した。直線化したそのＤＮＡを２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０５）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、０．７ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、６ｍＭデキストロース（ＨＥＢＳ）に再懸濁し、約４×１０^７個のＣＨＯ ｄｕｋｘ Ｂ１（ｄｈｆｒ−）細胞（ｐ２３）にエレクトロポレーション（２８０Ｖおよび９６０μＦ）によって導入した。エレクトロポレーションの後、細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したα＋改変イーグル培地（ＭＥＭ）に戻して２日間培養した。次に、それらの細胞をトリプシン処理し、１０％透析ＦＢＳを添加したα−ＭＥＭ（リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドを欠くもの）中、１００ｍｍ培養皿（１００，０００細胞／プレート）で、５日間培養した。次いでそれらの細胞を１００，０００細胞／１００ｍｍプレートの密度に分割し、２００ｎＭメトトレキセート中で選択した。耐性コロニーを拾い、６ウェルプレートに拡大培養し、各クローンから得た調整培地を、ニューブラスチンに関する後述の特異的測定法を用いてスクリーニングした。最高レベルのニューブラスチンを発現する１２個のクローンをＴ１６２フラスコに拡大培養した後、再測定した。図１０に示すように、ＣＨＯ細胞系は２５〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲のニューブラスチンを産生した。
【０２５７】
ニューブラスチンに関する三元複合体測定法 本発明者らは、Ｓａｎｉｃｏｌａらが記載した三元複合体測定法（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９７，９４，６２３８）の変法を用いて、ＣＨＯ細胞系上清の培地中のニューブラスチンの存在について調べた。
【０２５８】
この測定法では、ＧＤＮＦ様分子の能力を、ＲＥＴの細胞外ドメインと様々な補助受容体ＧＦＲα１、ＧＦＲα２およびＧＦＲα３との間の結合を媒介するその能力について評価することができる。可溶型ＲＥＴと補助受容体を融合タンパク質として作成した。ラットＲＥＴの細胞外ドメインと胎盤性アルカリホスファターゼとの融合タンパク質（ＲＥＴ−ＡＰ）およびラットＧＦＲα１の細胞外ドメイン（ＷＯ９７４４３５６；１９９７年１１月２７日、参考文献としてここに援用する）とヒトＩｇＧ１のＦｃドメインとの融合タンパク質（ｒＧＦＲα１−Ｉｇ）は記載されている（Ｓａｎｉｃｏｌａら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９７，９４，６２３８）。
【０２５９】
ネズミＧＦＲα３の細胞外ドメインとヒトＩｇＧ１との融合タンパク質（ｍＧＦＲα３−Ｉｇ）を作成するために、ネズミＲＥＴＬ３のアミノ酸１〜３５９をコード化するＤＮＡ断片を、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含む断片に結合し、発現ベクターｐＥＡＧ３４７にクローニングして、プラスミドｐＧＪ１４４を得た。プラスミドｐＧＪ１４４をチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）にトランスフェクトして、上記融合タンパク質を産生する安定細胞系を作成し、その融合タンパク質をプロテインＡセファロース免疫アフィニティーカラムで標準的方法によって精製した。要約すると、そのＧＤＮＦ様分子がこの測定法でＲＥＴへの補助受容体の結合を媒介できるのであれば、ＲＥＴ−ＡＰ融合タンパク質はプレート上に保持され、保持される量はアルカリホスファターゼの化学発光性基質を使って測定することができる。
【０２６０】
Ｄｙｎｅｘ Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ−１ ＥＬＩＳＡプレート（Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を５０ｍＭ重炭酸塩／炭酸塩（ｐＨ９．６）中１μｇ／ｍｌのヒトＦｃに特異的なヤギ抗体で１６時間被覆した。そのプレートを空にし、３００μｌの１％Ｉ−Ｂｌｏｃｋ（Ｔｒｏｐｉｘ）ＴＢＳ溶液／０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）を１時間満たした。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、ＲＥＴ−ＡＰ融合遺伝子を発現する２９３ＥＢＮＡ細胞から得た調整培地に希釈した１００μｌの１μｇ／ｍｌ ｒＧＦＲα１−ＩｇまたはｍＧＦＲα３−Ｉｇで各ウェルを満たし、次に、ＣＨＯニューブラスチンクローンから得た１００μｌの調整培地をウェルの縦列の最上部のウェルに加え、各横列を下向きに２倍段階希釈し、室温で１．５時間インキュベートした。次に、そのプレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、２００ｍＭトリス（ｐＨ９．８）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２（ＣＳＰＤ緩衝液）で２回洗浄した。次に、その洗浄溶液を、１ｍｇ／ｍｌ Ｓａｐｐｈｉｒｅ化学発光増強剤（Ｔｒｏｐｉｘ）を含むＣＳＰＤ緩衝液中の４２５μＭ ＣＳＰＤ（Ｔｒｏｐｉｘ）で置換し、室温で３０分間インキュベートした。化学発光量はＤｙｎａｔｅｃｈ照度計を用いて測定した。
【０２６１】
最初の実験では、本発明者らは、ＣＨＯ細胞系によって産生されたニューブラスチンがＲＥＴの細胞外ドメインへのＧＦＲα１またはＧＦＲα３の結合を媒介できるかどうかを調べた。図１１に示すように、ＣＨＯ細胞クローン＃５３から得られた調整培地は、ｍＧＦＲα３−Ｉｇ融合タンパク質を含めた場合は上記三元複合体測定法で強いシグナルを生じたが、ｒＧＦＲα１−Ｉｇ融合タンパク質を含めた場合にはシグナルを生じなかったことから、ニューブラスチンはＧＦＲα３に結合するが、ＧＦＲα１には結合しないことが示された。この挙動によりニューブラスチンはＧＤＮＦとは明確に区別される。図１１に示すように、ＧＤＮＦはＧＦＲα１に結合するが、ＧＦＲα３には結合しない。親ＣＨＯ細胞系から得られた調整培地または未調整の培地を測定した場合は、どちらの補助受容体融合タンパク質でもシグナルは観察されなかった。
【０２６２】
ＣＨＯ細胞系におけるニューブラスチンの発現レベルを定量するために、１ｎｇ／ｍｌの濃度から始まるｒＧＦＲα１−ＩｇおよびＧＤＮＦを使って標準曲線を作成した。次に、様々なＣＨＯ細胞株に関するニューブラスチン濃度を、この標準曲線を用いて計算した。５つのＣＨＯ細胞系による産生レベルを図１０に示す。この推定値は、ＧＤＮＦとＧＦＲα１の間の結合親和力がニューブラスチンとＧＦＲα３の間の結合親和力に類似しているという未検証の仮定に依存しているので、これらのレベルは概算値でしかない。
【０２６３】
ＣＨＯ細胞系上清から得られるニューブラスチンの分析
ＣＨＯ細胞系によって産生されるニューブラスチンをさらに分析するために、このタンパク質をＧＦＲα３−Ｉｇ融合タンパク質を使って培地から抽出し、ニューブラスチンペプチドに対して産生させたポリクローナル抗体を使ったウェスタンブロットで分析した。
【０２６４】
第１の実験では、セファロースビーズに結合したｍＧＦＲα３−Ｉｇでニューブラスチンを抽出した。ｍＧＦＲα３−Ｉｇはセファロースビーズに、その製造者であるＰｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．が提案する条件を使って結合した。１００μＬのｍＧＦＲα３−Ｉｇ−セファロースを、陰性対照ＣＨＯ細胞系またはニューブラスチン産生ＣＨＯ細胞系＃１６から得られる調整培地の試料１．０ｍＬに加えた。その懸濁液を振盪台の上で２時間インキュベートした。各懸濁液を遠心分離し、上清を除去した後、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）１ｍＬによる洗浄を３回行なった。各樹脂を１００μＬの２×還元試料緩衝液に再懸濁し、１００℃に５分間加熱した。２０μＬの試料緩衝液上清および１０μＬの分子量標準（ＦＭＣ）を、１０〜２０％既成ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｏｗｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに充填した。そのゲルを４０ｍＡの一定電流で７２分間電気泳動した。
【０２６５】
ウェスタンブロット分析のために、Ｈｏｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ装置で、１０ｍＭ ＣＡＰＳ、１０％メタノール、０．０５％ＳＤＳ、ｐＨ１１．２緩衝系中、ニトロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）にタンパク質をエレクトロブロットした（４００ｍＡの一定電流で４５分）。転写後、そのニトロセルロースフィルターをカセットから取り出し、１％酢酸中の０．１％Ｐｏｎｃｅａｕ Ｓの溶液で６０秒間染色することにより、分子量マーカーを可視化した。そのメンブレンを２片に切断し、蒸留水中で穏やかに撹拌することによって、過剰な染料を除去した。それらのメンブレンをＴＢＳ中の２％脱脂粉乳で４℃で終夜ブロックした。それらのメンブレンを、２％脱脂粉乳／ＴＢＳ中に１．０μｇ／ｍＬの濃度の、アフィニティー精製した２種類の抗ニューブラスチンペプチド抗体（Ｒ３０およびＲ３１）と共に、個別にインキュベートした。それらのメンブレンにＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１０分間の洗浄を３回行ない、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート（Ｂｉｏｒａｄ）の１：５０００希釈液中で３０分間インキュベートした。それらのメンブレンにＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１０分間の洗浄を３回行ない、ＥＣＬ基質（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で発色させた。図１２に示すように、陰性対照細胞系から得た抽出タンパク質に観察されるバンド（レーン１および３）と比較すると、どちらの抗体でも、ニューブラスチン産生ＣＨＯ細胞株から抽出したタンパク質に、特異的なバンドが検出された（レーン２および４）。
【０２６６】
低い方の分子種の分子量は約１３ｋＤであり、これはおそらく、プロドメインの切断後に生成するニューブラスチンの成熟ドメインに相当するのだろう。この切断は、プレプロニューブラスチンタンパク質の３つのＡｒｇ−＿（例えば−ＲＸＸＲ↓−）残基のいずれか一つの後ろで起こって、それぞれ配列番号１０、１１または１２に示すような、１４０ＡＡ、１１６ＡＡまたは１１３ＡＡ型を生成するのだろう。非修飾（すなわち翻訳後修飾を受けていない）ニューブラスチンポリペプチドＮＢＮ１４０［配列番号１０］、ＮＢＮ１１６［配列番号１１］およびＮＢＮ１１３［配列番号２１］の予想分子量は、それぞれ１４．７ｋＤ、１２．４ｋＤおよび１２．１ｋＤと決定された。この分子種と他のニューブラスチン特異的バンドの構造を確認するには、さらなる分析が必要だろう。
【０２６７】
第２の実験では、ＥＬＩＳＡプレート上に捕捉したｈＧＦＲα３−Ｉｇで、ニューブラスチンを抽出した。ヒトＧＦＲα３の細胞外ドメイン（出願公開ＷＯ９７／４４３５６（１９９７年１１月２７日、参考文献としてここに援用する）に開示されている）とヒトＩｇＧ１のＦｃドメインとの融合タンパク質（ｈＧＦＲα３−Ｉｇ）を作成するために、ヒトＧＦＲα３のアミノ酸１〜３６４をコード化するＤＮＡ断片を、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含む断片に結合し、Ｓａｎｉｃｏｌａらが記載した発現ベクターＣＨ２６９（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９７，９４，６２３８）にクローニングした。このプラスミドによってコードされる融合タンパク質を、２９３エプシュタインバーウイルスコード核抗原（ＥＢＮＡ）細胞中で一過性に発現させ、標準的方法によりプロテインＡセファロース免疫アフィニティーカラムで精製した。
【０２６８】
９６ウェルプレートの６ウェルを、ＰＢＳ中２５ｍｇ／ｍｌの濃度のヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ断片特異的；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｕｌｏｇｉｃｓ）（３００ｍｌ／ウェル）で、４℃で終夜被覆した。そのウェルを４００ｍｌの１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で室温で１時間ブロックした。ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄した後、３００ｍｌのｈＧＦＲα３−Ｉｇ（０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに加えた。そのプレートを室温で１時間インキュベートし、結合を最大にするために穏やかに振盪（２００往復／分）した。次にそのウェルを空にし、再びＰＢＳＴで３回洗浄した。陰性対照ＣＨＯ細胞またはニューブラスチン産生ＣＨＯ細胞系＃２５から得た２５０ｍｌの調整培地を３つのウェルのそれぞれに加えた。そのプレートを室温で３時間インキュベートし、穏やかに振盪（３００往復／分）した。次に、ウェルをＰＢＳＴで２回洗浄した。２５ｍｌの非還元Ｌａｅｍｌｉローディング緩衝液を第１のウェルに加え、結合しているタンパク質を溶出させるために、そのプレートを５分間速く振盪した（１３００往復／分）。内容物を次のウェルに移し、第２および第３のウェルで、結合しているタンパク質を溶出させるために、この処置を繰返した。β−メルカプトエタノール（最終５％）を加えた後、試料を５分間煮沸し、１０−２０％ポリアクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０２６９】
ウェスタンブロット分析を行なうために、タンパク質をニトロセルロースに転写した。そのメンブレンを５％脱脂粉乳、ＰＢＳＴ中でブロックおよびプローブし、ＰＢＳＴで洗浄した。ニューブラスチンは、２つのニューブラスチンペプチドに対して産生させたポリクローナル抗体（Ｒ３０およびＲ３１）（１μｇ／ｍｌ）との反応に続いて、ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ抗体（ＢｉｏＲａｄ）との反応を行なった後、電気化学発光によって検出した。図１３に示すように、５本のニューブラスチン特異的バンドが、ニューブラスチン産生ＣＨＯ細胞系から得た抽出タンパク質に検出された（レーン２）。下側の２本のバンドは図１２に観察されるバンドと極めて似ている。ここでも、下側のバンドはおそらく、プロドメインの切断後に生成するニューブラスチンの成熟ドメインに相当するのだろう。
【０２７０】
図１３のバンドをさらに分析すると（データの記載なし）、ＰＧＮａｓｅ Ｆによる約１８ｋＤバンドの脱グリコシル化が、そのバンドを、図１３のゲルで最も下にあるバンドに相当するサイズまで減少させることがわかる。このことからニューブラスチンは哺乳類細胞中でグリコシル化タンパク質として産生されることが示唆される。
【０２７１】
大腸菌におけるニューブラスチンの発現
大腸菌中でニューブラスチン遺伝子を発現させるために、ＧＣ含量が低く好ましい大腸菌コドンを持つシンジーン（ｓｙｎｇｅｎｅ；合成遺伝子）を構築した。このシンジーンは２つのベクターｐＥＴ１９ｂと、ｐＥＴ１９ｂの誘導体であるｐＭＪＢ１６４にクローニングされている。ｐＥＴ１９ｂを使った構築を図１４に示す。この構築体では、ニューブラスチンの成熟ドメイン（ＮＢＮ１１３）をコードする配列が開始メチオニンに直接融合している。ｐＭＪＢ１６４を使った構築を図１５に示す。この構築体では、ニューブラスチンの成熟ドメインが、エンテロキナーゼ切断部位によって隔てられたヒスチジンタグ（すなわち１０個のヒスチジン）に融合している。開始メチオニンはそのヒスチジンタグの前にある。
図１４でニューブラスチンをコード化しているヌクレオチド配列
【０２７２】
【化９】

図１５でｈｉｓ標識ニューブラスチンをコード化しているヌクレオチド配列
【０２７３】
【化１０】

実施例６：ラット胚ドーパミン作動性ニューロンの生存に対するニューブラスチンの効果とＣｈＡＴ活性
この一連の実験では、上記のニューブラスチン産生ＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２細胞から得られる調整培地の効果を評価した。
【０２７４】
培養物の調製：中脳腹側または脊髄をラットＥ１４胚から冷ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中で切り出した。組織片を、滅菌ろ過した０．１％トリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｏｎ）および０．０５％ＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）／ＨＢＳＳ溶液中、３７℃で２０分間インキュベートした。次に、組織片をＨＢＳＳ＋０．５％ＤＮａｓｅで４回すすぎ、１ｍｌの自動ピペットを使って解離させた。次にその懸濁液を６００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ペレットを血清調整培地（ＳＣＭ；１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ）に再懸濁した。細胞の総数をトリパンブルー色素排除法で測定し、ドーパミン作動性ニューロンの生存の評価についてはポリ−Ｌ−リジン被覆８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ）に１００，０００細胞／ｃｍ^２の密度で、またＣｈＡＴ活性測定については４８ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に２００，０００細胞／ｃｍ^２の密度で播種した。細胞をＳＣＭ中、５％ＣＯ_２／９５％Ｏ_２および湿度９５％、３７℃で２４〜４８時間インキュベートした後、無血清培地（ＳＦＭ）に変えて神経栄養因子類を添加した。
【０２７５】
ドーパミン作動性ニューロン生存評価用の細胞は、ＳＦＭ＋栄養因子添加物中に５日間放置した後、４％ＰＦＡ中で５分間固定し、免疫組織化学によりチロシンヒドロキシラーゼについて染色した。
【０２７６】
ＣｈＡＴ活性用の細胞はＳＦＭと共に３日間放置した後、ＨＢＳＳ＋０．１％トリトンＸ−１００中で溶解し、直ちにドライアイスでＣｈＡＴ活性測定まで凍結しておいた。
【０２７７】
栄養因子の添加：非トランスフェクトＨｉＢ５対照もしくはニューブラスチン（ＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２）またはＧＤＮＦ（ＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＧＤＮＦ−Ｌ１７）を産生するＨｉＢ５から、調整培地を集めた。ＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２は、その細胞から集めた調整培地をＧＤＮＦ−ＥＬＩＳＡで測定すると、約２０ｎｇ／２４時間／１０^５細胞のＧＤＮＦを産生する。各細胞系をＤＭＥＭ＋１％ＦＣＳと共に終夜培養し、上清を取り出し、使用時まで−２０℃で保存した。その上清は、細胞に添加するときにＳＦＭで１：５０に希釈した。別個のウェルをＨｉＢ５対照上清（１：５０）＋精製組換えラットＧＤＮＦ（０．０３〜１０ｎｇ／ｍｌ）で処理した。
【０２７８】
これらの実験の結果を図４に示す。図４Ａ〜４Ｃは、下記実施例５．１に記述するように、培養ラット胚ドーパミン作動性中脳腹側ニューロンの生存および無血清培地中の脳神経運動ニューロンのＣｈＡＴ活性に対するＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２細胞から分泌されるニューブラスチンの効果を示す図である。
【０２７９】
図４Ａは、Ｅ１４中脳腹側から最初に樹立された無血清培養物中の、ＤＩＶ５で測定したＣｈＡＴ活性（ｄｐｍ／時）に対する組換えＧＤＮＦの用量反応曲線を示す図である［すなわちＨｉＢ５；ＧＤＮＦ ０．０３ｎｇ／ｍｌ；ＧＤＮＦ ０．１ｎｇ／ｍｌ；ＧＤＮＦ ０．３ｎｇ／ｍｌ；ＧＤＮＦ １ｎｇ／ｍｌ；ＧＤＮＦ １０ｎｇ／ｍｌ；ＧＤＮＦ １００ｎｇ／ｍｌ］。
【０２８０】
図４Ｂは、Ｅ１４中脳腹側から最初に樹立された無血清培養物中の、ＤＩＶ５で測定したＣＡＴ活性（ｄｐｍ／時）を示す図である。ニューブラスチン産生ＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２細胞（ニューブラスチン）またはＧＤＮＦ産生ＨｉＢ５ＧＤＮＦＬ−１７（ＧＤＮＦＬ−１７）細胞から得た希釈調整培地を、図に表示したように添加した［すなわちニューブラスチン１：１０；ニューブラスチン１：５０；ＧＤＮＦ Ｌ−１７ １：５０］。
【０２８１】
図４Ｃは、Ｅ１４ラット中脳腹側から最初に樹立された無血清培養物中のＤＩＶ７での１ウェルあたりのチロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性細胞の数［ＴＨ＋ 細胞数／ウェル］を示す図である。非トランスフェクトＨｉＢ５細胞（ＨｉＢ５）またはニューブラスチン産生ＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２細胞（ニューブラスチン）から得た希釈調整培地を、様々な濃度で、図に表示したように添加した［すなわちＨｉＢ５ １：５０；ＨｉＢ５ １：４０；ＧＤＮＦ ０．１ｎｇ／ｍｌ；ＧＤＮＦ １０ｎｇ／ｍｌ；ＧＤＮＦ １００ｎｇ／ｍｌおよびニューブラスチン１：４０］。
【０２８２】
ニューブラスチンをトランスフェクトしたＨｉＢ５細胞から得られる調整培地の１：４０希釈液は、同じ希釈率および低い希釈率（１：１０および１：４０）の対照（非トランスフェクト）ＨｉＢ５細胞と比較して、ＴＨ免疫反応性細胞数を有意に増加させる（例えば図４Ｂ参照）。ＴＨ免疫反応性細胞数の増加は、最大ＧＤＮＦ濃度（１０ｎｇ／ｍｌ）で見られる増加に匹敵する。このことは、培地に分泌されたニューブラスチンがラット胚中脳腹側に由来するドーパミン作動性ニューロン集団の生存に効果を持つことを示している。これに対し、トランスフェクトされたＨｉＢ５細胞から分泌されるＧＤＮＦとは異なり、ニューブラスチンをトランスフェクトしたＨｉＢ５細胞から得られる調整培地の影響は、同じ培養物中のもう一つのニューロン集団であるコリン作動性ニューロンには見られない（例えば図４Ａ参照）。
【０２８３】
実施例７：ブタ胚ドーパミン作動性中脳腹側ニューロンの切片培養の生存に対するニューブラスチンの効果
この実験では、ニューブラスチン産生ＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２細胞とブタ胚由来の中脳腹側の切片培養物との共培養の効果を評価した。
【０２８４】
培養物の調製：ブタ胚（Ｅ２８；ｎ＝１２）から滅菌条件下に中脳腹側（ＶＭ）を摘出し、４００μｍの切片に切断し、グルコース（６．５ｍｇ／ｍｌ）を含む冷ゲイ平衡塩類溶液（ＧＩＢＣＯ）に入れた。その組織切片をＳｔｏｐｐｉｎｉらが最初に開発した界面培養法［Ｌ．Ｓｔｏｐｐｉｎｉ，Ｐ．Ａ．Ｂｕｃｈｓ，Ｄ．Ｍｕｌｌｅｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９１，３７，１７３−１８２］によって培養した。
【０２８５】
簡単に述べると、血清含有培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）と共に６ウェルプレート（Ｃｏｓｔｅｒ）中にインサートとして入れられた半多孔性膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，０．３μｍ；８切片／膜が１ＶＭに相当）上に、切片を置いた。各ウェルは、最終濃度が２５ｍＭになるようにＤ−グルコースを添加した１ｍｌの培地（５０％Ｏｐｔｉｍｅｍ、２５％ハンクス平衡塩類溶液（全てＧＩＢＣＯ））を含んだ。第０日に、７０００個のトランスフェクトＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２細胞（ニューブラスチン）または７０００個の非トランスフェクトＨｉＢ５細胞（対照）を各組織切片に接種した。その共培養を、まず３３℃の培養器中で４８時間生育して、温度感受性癌遺伝子で不死化したＨｉＢ５細胞を増殖させた後、３７℃の培養器に入れ、そこでＨｉＢ５細胞を分化させた。培地を毎週２回交換した。有糸分裂阻害剤と抗生物質はどの段階でも使用しなかった。
【０２８６】
ＨＰＬＣによるドーパミンの測定：インビトロ第１２日および第２１日に培養培地を集め、ＨＰＬＣを用いて電気化学的検出法でドーパミンについて分析した（Ｗ．Ｎ．Ｓｌｏｏｔｈ，Ｊ．Ｂ．Ｐ．Ｇｒａｍｓｂｅｒｇｅｎ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈ．１９９５，６０，１４１−４９）。
【０２８７】
組織処理と免疫組織化学：第２１日に培養物をリン酸緩衝液中の４％ホルムアルデヒドで６０分間固定し、２０％ショ糖溶液で２４時間脱水し、凍結し、２０μｍにクリオスタット切片化（４系列）し、ゼラチン被覆顕微鏡スライドにのせた。１系列の切片をチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）に関して免疫染色した。簡単に述べると、切片に、１％トリトンＸ−１００を含む０．０５Ｍトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ，ｐＨ７．４）中で１５分間の洗浄を三回行ない、ＴＢＳ中、１０％フェトル（ｆｅｔｔｌｅ）ウシ血清（ＦＢＳ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に３０分間インキュベートした。次に、１０％ＦＢＳを含むＴＢＳに１：６００希釈したモノクローナルマウス抗ＴＨ抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）と共に、組織を４℃で２４時間インキュベートした。１％トリトンＸ−１００を含むＴＢＳでの１５分間のすすぎを３回行なった後、１０％ＦＢＳを含むＴＢＳに１：２００希釈したビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共に、切片を６０分間インキュベートした。次に１％トリトンＸ−１００を含むＴＢＳで洗浄（１５分間を３回）し、１０％ＦＢＳを含むＴＢＳに１：２００希釈したストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（Ｄａｋｏ）と共に６０分間インキュベートした。ＴＢＳで洗浄（１５分間を３回）した後、０．０１％Ｈ_２Ｏ_２を含むＴＢＳ中の０．０５％３，３−ジアミノベンジジン（Ｓｉｇｍａ）で処理することによって、結合している抗体を可視化した。最後に、切片をアルコール中で脱水し、キシレンで透徹し、Ｅｕｋｉｔｔを使ってカバーガラスで覆った。
【０２８８】
細胞数および形態計測的分析：免疫反応性ＴＨ−ｉｒニューロンの定量を、明視野顕微鏡（オリンパス）を使って行なった。十分に保たれた細胞構造と明確な核を持ち強い染色を示す細胞だけを数えた。２０倍の対物レンズを用いて４培養切片ごとの細胞数に基づいて概算した。ＴＨ−ｉｒニューロン中の核の平均直径（６．６±０．２μｍ，ｎ＝３０）を使用し、Ａｂｅｒｃｒｏｍｂｉｅの式（Ｍ．Ａｂｅｒｃｒｏｍｂｉｅ，Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．１９４６，９４，２３９−４７）に従って、細胞数を二重計数について補正した。核のサイズはニューロン追跡システム（Ｎｅｕｒｏｌｕｃｉｄａ，ＭｉｃｒｏＢｒｉｇｈｔＦｉｅｌｄ，Ｉｎｃ．）を使って見積もった。
【０２８９】
これらの実験の結果を図５に示す。図５Ａ〜５Ｃは、後述するようにＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ＮＢＮ２２細胞（ニューブラスチン）またはＨｉＢ５細胞（対照）と共培養したブタ胚ドーパミン作動性中脳腹側ニューロンの切片培養物の機能および生存に対する、ＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２細胞から分泌されたニューブラスチンの効果を示す図である。図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれＤＩＶ１２［ドーパミン（ｐｍｏｌ／ｍｌ）−第１２日］およびＤＩＶ２１［ドーパミン（ｐｍｏｌ／ｍｌ）−第２１日］に、培地に放出されたドーパミンを示す図である。図５Ｃは、ＤＩＶ２１での１培養あたりのチロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性細胞の数［ＴＨ−ｉｒ細胞／培養］を示す図である。
【０２９０】
第１２日の時点で、ＨｉＢ５−ニューブラスチン共培養物から得られる培地は、ＨｉＢ５−Ｃ共培養物から得られる培地よりも８４％多いドーパミンを含むことが、ＨＰＬＣ分析によって明らかになった（図５Ａ）。第２１日の時点で相違は７８％（図５Ｂ）であり、細胞数は、ＨｉＢ５−ニューブラスチン共培養物がＨｉＢ５−Ｃ共培養物よりも６６％多いチロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性ニューロンを含むことを示した（Ｐ＜０．０５）（図５Ｃ）。これは、ＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２クローンから分泌されたニューブラスチンが、ブタ胚ドーパミン作動性ニューロンに対して強力な生存効果を持つことを示している。
【０２９１】
実施例８：無血清培地中の後根神経節の生存
この実施例では、既知の神経栄養因子類と比較したニューブラスチンポリペプチドの神経栄養活性を示す。
【０２９２】
妊娠したメスマウスを頸椎脱臼によって屠殺した。培養のために胚を次のように処理した。
【０２９３】
電解研磨したタングステン針を使って、表示した段階のＣ５７／Ｂ１６マウス（デンマークＭｏｌｌｅｇａａｒｄ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ）から後根神経節を切り出した。胚性神経節をカルシウムおよびマグネシウム不含のハンクス平衡塩類溶液中、０．０５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）と共に３７℃で５分間インキュベートした。生後神経節はコラゲナーゼ／ディスパーゼ１ｍｇ／ｍｌで３０〜４５分間処理した後、トリプシン／ＤＮＡｓｅ ０．２５％で１５分間処理した。トリプシン溶液を除去した後、１０％熱非働化ウマ血清を含む１０ｍｌのＤＭＥＭで神経節を１回洗浄し、先端熱加工したパスツールピペットで穏やかに砕いて、単細胞懸濁液を得た。
【０２９４】
ポリオルニチン（０．５ｍｇ／ｍｌ、終夜）およびラミニン（２０ｍｇ／ｍｌで４時間；Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）でプレコーティングした２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に、細胞を播種した。それらのニューロンを、２ｍＭグルタミン、０．３５％ウシ血清アルブミン、６０ｎｇ／ｍｌプロゲステロン、１６ｍｇ／ｍｌプトレシン、４００ｎｇ／ｍｌ Ｌ−チロキシン、３８ｎｇ／ｍｌ亜セレン酸ナトリウム、３４０ｎｇ／ｍｌトリヨードチロニン、６０ｍｇ／ｍｌペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したハムのＦ１４からなる合成培地にて、湿潤５％ＣＯ_２培養器中、３７℃で培養した。
【０２９５】
培養４８時間後に、ニューロンは、位相差顕微鏡下にその双極性の形態により、明確に認められた。栄養因子類（ニューロンの播種に先立って１０ｎｇ／ｍｌの濃度で培養培地に添加）またはニューブラスチン産生ＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２細胞から得た調製培地の存在下もしくは不在下でのニューロンの生存百分率を、４８時間の時点でウェル中のニューロン数を数えることによって評価した。
【０２９６】
これらの実験の結果を図９に示す。図中、
０は対照実験（因子類不在下）を表し、
１はＧＤＮＦ存在下での実験を表し、
２はニュールツリン存在下での実験を表し、
３は本発明のニューブラスチン存在下での実験を表し、
Ｅ１２は胎生１２日で単離したＤＲＧ細胞に対して行なった実験から得られたデータを表し、
Ｅ１６は胎生１６日で単離したＤＲＧ細胞に対して行なった実験から得られたデータを表し、
Ｐ０は出生日に単離したＤＲＧ細胞に対して行なった実験から得られたデータを表し、
Ｐ７は生後７日で単離したＤＲＧ細胞に対して行なった実験から得られたデータを表し、
Ｐ１５は生後１５日で単離したＤＲＧ細胞に対して行なった実験から得られたデータを表す。
【０２９７】
これらの結果から、本発明の神経栄養因子が、確立した神経栄養因子に匹敵するか、さらにはそれを上回る活性を示すことが、明らかにわかる。
【０２９８】
実施例９：黒質ドーパミンニューロンに対するニューブラスチンのインビボ効果
成熟した黒質ドーパミン（ＤＡ）ニューロンを６−ヒドロキシドーパミン誘導性の変性から保護するニューブラスチン（ニューブラスチン）の能力を調べるために、本発明者らは、パーキンソン病のラットモデル（ＳａｕｅｒおよびＯｅｒｔｅｌ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １９９４，５４，４０１−４１５）と、ニューブラスチンのレンチウイルス遺伝子導入を使用した。
【０２９９】
レンチウイルスの作成：ニューブラスチンをコード化するレンチウイルス導入ベクターｐＨＲ’−ニューブラスチンを作成するために、ニューブラスチンｃＤＮＡから得られる１３３１ｂｐのＢｍａＨ１断片を、ｐＳＬ３０１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨ１／ＢｇｌＩＩ部位にサブクローニングした。この構築体から１５１９ｂｐのＢａｍＨ１／Ｘｈｏ１断片を切り出し、ウッドチャック肝炎ウイルス翻訳後断片（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ Ｒ，Ｄｏｎｅｌｌｏ ＪＥ，Ｔｒｏｎｏ Ｄ，Ｈｏｐｅ ＴＪ「Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ（ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節配列はレトロウイルスベクターによって送達された導入遺伝子の発現を増進させる）」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９９，７３（４），２８８６−２８９２）を保持するｐＨＲ’のＢａｍＨ１／Ｘｈｏ１部位に結合させた。
【０３００】
レンチウイルスベクターの作成は、例えばＺｕｆｆｅｒｅｙら（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ Ｒ，Ｎａｇｙ Ｄ，Ｍａｎｄｅｌ ＲＪ，Ｎａｌｄｉｎｉ Ｌ，Ｔｒｏｎｏ Ｄ「Ｍｕｌｔｉｐｌｙ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ａｃｈｉｅｖｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ ｖｉｖｏ（多重に弱毒化されたレンチウイルスベクターによりインビボで効率のよい遺伝子送達が達成される）」Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７，１５（９），８７１−８７５）によって記載されている。簡単に述べると、導入構築体とヘルパープラスミドｐＲ８．９１およびｐＭＤＧを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後と７２時間後に、培地に放出されたウイルス粒子を集めた。ウイルスを濃縮するために、培地を１４１，０００ｇで１．５時間遠心分離し、そのペレットをＤＭＥＭに溶解した。緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）の遺伝子を保持する対照の力価は、２９３Ｔ細胞中のＧＦＰ蛍光により、１０^８形質転換単位（ＴＵ）／ｍｌと決定された。ＲＮＡスロットブロット法（ｖｏｎ Ｓｃｈｗｅｄｌｅｒ Ｕ，Ｓｏｎｇ Ｊ，Ａｉｋｅｎ Ｃ，Ｔｒｏｎｏ Ｄ「Ｖｉｆ ｉｓ ｃｒｕｃｉａｌ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｐｒｏｖｉｒａｌ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌｓ（Ｖｉｆは感染細胞でのＩ型ヒト免疫不全ウイルスのプロウイルスＤＮＡ合成にとって極めて重要である）」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９３，６７（８）４９４５−４９５５）を使って、ウイルス粒子力価を決定した。ＧＤＮＦ上清およびニューブラスチン上清には、ＧＦＰ上清と比較して１０分の１量の粒子が見出された。
【０３０１】
手術法：動物が関わる全ての作業は、ルンド（Ｌｕｎｄ）大学の実験動物の利用に関する倫理委員会によって設定された規則に従って行なわれた。
【０３０２】
２１匹の若い雌スプレーグ・ドーリー成体ラット（Ｂ＆Ｋ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ、スウェーデン・ストックホルム）を使用し、ラット用固形飼料と水を自由に摂取させて１２時間の明暗周期で飼育した。ＳａｕｅｒおよびＯｅｒｔｅｌ（ＳａｕｅｒおよびＯｅｒｔｅｌ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １９９４，５９，４０１−４１５）に従って、損傷の３週間前に、逆行性標識と６−ＯＨＤＡ損傷を行なった。簡単に述べると、エクイセシン（Ｅｑｕｉｔｈｅｓｉｎ）麻酔（０．３ｍｌ／１００ｇ）下に、逆行性トレーサーＦｌｕｏｒｏ−Ｇｏｌｄ（ＦＧ；Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ，Ｉｎｃ．，コロラド州エングルウッド）の２％溶液（０．９％ＮａＣｌに溶解）０．２μｌを、ラットに両側から注入した。注入は、２μｌハミルトンシリンジを使用し、ＡＰ＝＋０．５ｍｍ；ブレグマに対してＭＬ＝±３．４ｍｍ；硬膜に対してＤＶ＝−５．０ｍｍの座標に、切歯バー（ｉｎｃｉｓｏｒ ｂａｒ）を０．０ｍｍに設定して行なった。また、針を引き抜く前に、さらに５分間放置して、０．０５μｌ／分の注入を行なった。
【０３０３】
ＦＧ注入の１４日後に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、合計５デポジット（１μｌ／デポジット）の、ニューブラスチンまたはＧＤＮＦの遺伝子を保持するレンチウイルスベクターを、動物に与えた。それらデポジットのうち４つは、２本の針管に沿って、次の座標で線条体に与えられた：ＡＰ＝＋１．０ｍｍ、ＭＬ＝−２．６ｍｍ、ＤＶ_１＝−５．０ｍｍ、ＤＶ_２＝−４．５ｍｍおよびＡＰ＝０．０ｍｍ、ＭＬ＝−３．７ｍｍ、ＤＶ_１＝−５．０ｍｍ、ＤＶ_２＝−４．５ｍｍ。黒質上デポジットはＡＰ＝−５．２ｍｍ、ＭＬ＝−２．０ｍｍ、ＤＶ_１＝−６．３ｍｍに施した。歯バー（ｔｏｏｔｈ ｂａｒ）は−２．３ｍｍに設定した。
【０３０４】
逆行性標識の２１日後かつレンチウイルス注入の７日後に動物を再び麻酔し、１０μｌハミルトンシリンジで２０μｇの６−ＯＨＤＡ（Ｓｉｇｍａ；遊離塩基として計算し、０．０２％アスコルビン酸を添加した氷冷食塩水３μｌに溶解した）の１デポジットを、右線条体のＦＧデポジットと同じ位置に注入した。注入速度は１μｌ／分とし、針を引き抜く前にさらに３分間放置した。
【０３０５】
組織処理：６−ＯＨＤＡ注入の２１日後に、動物を抱水クロラールで深く麻酔し、経心臓的に食塩水（ｐＨ７．４、室温）を１分間灌流した後、２００ｍｌの氷冷ホルムアルデヒド溶液（０．１％リン酸緩衝液（ｐｈ７．４）中の４％パラホルムアルデヒド）を灌流した。脳を解剖し、同じ固定液中で３〜４時間、後固定した後、２５％ショ糖／０．１Ｍリン酸緩衝液に４８時間移した。線条体および黒質（ＳＮ）にわたって５系列の４０μｍ切片を凍結ミクロトームで切断した。
【０３０６】
ＳＮ中のドーパミン作動性ニューロンの定量的評価：黒質緻密部中のＦＧ標識ニューロンの数は、先に記載されているように盲検者によって評価された（ＳａｕｅｒおよびＯｅｒｔｅｌ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １９９４，５９，４０１−４１５）。簡単に述べると、副視索の内側終止核（ＭＴＮ；ＰａｘｉｎｏｓおよびＷａｔｓｏｎのアトラス（１９９７）で−５．３）のレベルを中心とする３つの連続切片を使用し、ＭＴＮに対して外側の全ての標識／染色ニューロンを倍率４０倍で数えた（ｎ＝６−７／群）。３３０ｎｍでの落射照明下に明るく蛍光を発し、ニューロンの側面を示して、少なくとも一つの神経突起を延ばすものを、ＦＧ標識ニューロンに含めた。
【０３０７】
ＧＦＰを保持するレンチウイルスの注入を受けた動物の損傷側では、ＦＧ陽性黒質ニューロンの数が無傷の側の１８％まで減少した。これに対し、レンチ−ニューブラスチンを注入した動物では、ＦＧ陽性黒質ニューロンの数がほとんど完全に保護された（８９％）。これは、損傷側で逆行性標識されたニューロンの８７％が保たれたレンチ−ＧＤＮＦ処置動物と同程度の効率だった。これは、ニューブラスチンが損傷を受けた成熟黒質ドーパミンニューロンにとって強力な生存因子であり、ＧＤＮＦと同程度に強力であることを示している。
【０３０８】
図６は黒質ドーパミンニューロンに対するレンチウイルス産生ニューブラスチンのインビボ効果を示す図である。雌スプレーグ・ドーリーラットにおける黒質緻密部のニューロンを、右線条体への６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）の単回注入の３週間前に、Ｆｌｕｏｒｏｇｏｌｄ（ＦＧ）で逆行性標識した。６−ＯＨＤＡ注入の１週間前に、動物に、図に示すようにニューブラスチン［ニューブラスチン］、ＧＤＮＦ［ＧＤＮＦ］または緑色蛍光タンパク質［ＧＦＰ］を発現するレンチウイルスベクターを注入した。６−ＯＨＤＡ注入の２１日後に、線条体の両側のＦＧ標識ニューロンの数を決定した。この図は、３つの動物群の線条体の損傷（右）側対無傷（左）側のＦＧ標識ニューロンの百分率［％ＦＧ損傷／無傷］を示す。
【０３０９】
実施例１０：抗体の産生
ニューブラスチンに対する抗体を作成するために、２匹のウサギを、担体タンパク質に結合したペプチド１：ＣＲＰＴＲＹＥＡＶＳＦＭＤＶＮＳＴ（配列番号９のアミノ酸１０８〜１２４）またはペプチド２：ＡＬＲＰＰＰＧＳＲＰＶＳＱＰＣ（配列番号９のアミノ酸９３〜１０７）で、３週間間隔で免疫化した。各ペプチドにつき２匹のウサギを第０週、３週、６週および１０週に免疫化し、第７週および１１週に血液を採取した。２回目の採血液をペプチドアフィニティーカラムでアフィニティー精製した。それらの抗体をペプチドに準じてＡｂ−１およびＡｂ−２と名付けた。
【０３１０】
ウェスタンブロット：ニューブラスチンのｃＤＮＡを安定にトランスフェクトした２×１０^６個のＨｉＢ５細胞（Ｈｉｂ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２）または非トランスフェクトＨｉＢ５細胞を、Ｎ_２サプリメントを添加した無血清培地で終夜インキュベートした。５ｋＤａのカットオフメンブレンを持つ小濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，マサチューセッツ州ベッドフォード）で培地を濃縮した。濃縮試料に５×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液を加え、９５℃に５分間加熱した。試料を１５％アクリルアミドゲルでのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ＰＶＤＦメンブレンに転写した。残留タンパク質結合部位を、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中の５％脱脂粉乳でブロックした。メンブレンをニューブラスチン抗体（１：１０００）と共に終夜インキュベートした後、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合した二次抗ウサギまたは抗マウスＩｇＧ抗体（１：２０００）と共にインキュベートした。
【０３１１】
免疫染色は、ＥＣＬ＋（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｏｌｕｍｉｎｉｓｃｅｎｃｅ Ｐｌｕｓ）を使用し、製造者の指示（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に従って可視化した。これらの実験の結果を図３および実施例５に示す。
【０３１２】
標準的技術を使って、本発明者らは、次のペプチドに対するウサギポリクローナル抗体も産生させた。
【０３１３】
【化１１】

Ｃ末端に比較的近いＲ３０およびＲ３１だけが、ウェスタンブロット上、還元条件下で、変性タンパク質を認識した。
【図面の簡単な説明】
【０３１４】
【図１】^３２Ｐ標識ニューブラスチンｃＤＮＡでプローブされた２枚のノーザンブロットの写真画像であって、様々な成人組織タイプ（図Ａ）および様々な成人脳領域（図Ｂ）におけるニューブラスチン遺伝子の相対的発現レベルを比較したものである。
【図２】^３２Ｐ標識ニューブラスチンｃＤＮＡでプローブされたノーザンブロットの写真画像であって、非トランスフェクト細胞系ＨｉＢ５で発現されるニューブラスチンｃＤＮＡの量を、ニューブラスチンｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞系で発現されるニューブラスチンｃＤＮＡの量およびＧＤＮＦ−ｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞系と比較したものである。
【図３】ニューブラスチンタンパク質が非トランスフェクトＨｉＢ５細胞（レーン１）で発現される程度を、ニューブラスチンｃＤＮＡを安定にトランスフェクトしたＨｉＢ５細胞系（レーン２）と比較する、２枚のウェスタンブロットの写真画像であって、ニューブラスチン特異抗体Ａｂ−２（左側のブロット；図Ａ）またはニューブラスチン特異抗体Ａｂ−１（右側のブロット；図Ｂ）でプローブしたものである。
【図４】無血清培地における培養ラット胎仔ドーパミン作動性中脳腹側ニューロンの生存およびコリン作動性脳神経運動ニューロンのＣｈＡＴ活性に対するニューブラスチンの影響を示す図。具体的に述べると、図４ＡはＣｈＡＴ活性（ｄｐｍ／時間）に対する組換えＧＤＮＦの用量反応曲線を示す図である。図４Ｂはニューブラスチン産生細胞またはＧＤＮＦ産生細胞から得られる希釈調整培地を使ったＣｈＡＴ活性（ｄｐｍ／時間）を示す図である。図４Ｃは１ウェルあたりのチロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性細胞の数を示す図である。
【図５Ａ】ＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２細胞（ニューブラスチン）またはＨｉＢ５細胞（対照）と同時培養したブタ胎仔ドーパミン作動性中脳腹側ニューロンの切片培養物の機能および生存に対する、ＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２細胞から分泌されたニューブラスチンの影響を示す図。図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれＤＩＶ１２［ドーパミン（ｐｍｏｌ／ｍｌ）−第１２日］およびＤＩＶ２１［ドーパミン（ｐｍｏｌ／ｍｌ）−第２１日］の時点で、培地に放出されたドーパミンを表す。図５ＣはＤＩＶ２１での１培養あたりのチロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性細胞の数を示す図である。
【図５Ｂ】ＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２細胞（ニューブラスチン）またはＨｉＢ５細胞（対照）と同時培養したブタ胎仔ドーパミン作動性中脳腹側ニューロンの切片培養物の機能および生存に対する、ＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２細胞から分泌されたニューブラスチンの影響を示す図。図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれＤＩＶ１２［ドーパミン（ｐｍｏｌ／ｍｌ）−第１２日］およびＤＩＶ２１［ドーパミン（ｐｍｏｌ／ｍｌ）−第２１日］の時点で、培地に放出されたドーパミンを表す。図５ＣはＤＩＶ２１での１培養あたりのチロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性細胞の数を示す図である。
【図５Ｃ】ＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２細胞（ニューブラスチン）またはＨｉＢ５細胞（対照）と同時培養したブタ胎仔ドーパミン作動性中脳腹側ニューロンの切片培養物の機能および生存に対する、ＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２細胞から分泌されたニューブラスチンの影響を示す図。図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれＤＩＶ１２［ドーパミン（ｐｍｏｌ／ｍｌ）−第１２日］およびＤＩＶ２１［ドーパミン（ｐｍｏｌ／ｍｌ）−第２１日］の時点で、培地に放出されたドーパミンを表す。図５ＣはＤＩＶ２１での１培養あたりのチロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性細胞の数を示す図である。
【図６】黒質ドーパミンニューロンに対するレンチウイルス産生ニューブラスチンのインビボ効果を示す図である。
【図７】完全長ニューブラスチン遺伝子の同定に使用できる核酸プライマーと、ゲノムニューブラスチンコード配列（すなわち遺伝子）に対するそれらの空間的な向きを含む、ニューブラスチン遺伝子のゲノム構造の模式図である。
【図８】ニューブラスチンポリペプチドをコード化する核酸にはハイブリダイズするが、他の既知のＧＤＮＦファミリーメンバー（すなわちＧＤＮＦ、パーセフィンおよびニュールツリン）をコード化する核酸にはハイブリダイズしないニューブラスチン特異的プライマーであって、ヒトニューブラスチンポリペプチドをコード化するｃＤＮＡクローンを同定するために使用したものを示す図である。
【図９】様々な発生段階から得た解離ラット後根神経節細胞の培養物に対する本発明ポリペプチドの神経栄養活性を、既知の神経栄養因子で得られるものと比較して示す図［０ 対照実験（因子類不在下）；１ ＧＤＮＦ存在下；２ ニュールツリン存在下；３ 本発明ニューブラスチンの存在下；Ｅ１２ 胎生１２日；Ｅ１６ 胎生１６日；Ｐ０ 出生日；Ｐ７ 生後７日；Ｐ１５ 生後１５日］である。
【図１０】ＣＨＯ細胞系からのニューブラスチンの産生を示す図である。
【図１１】ＧＦＲα−１受容体およびＧＦＲα−３受容体へのニューブラスチンおよびＧＤＮＦの結合の比較を示す図である。
【図１２】ニューブラスチンへのＲ３０抗ペプチド抗体およびＲ３１抗ペプチド抗体の結合を図示するウェスタンブロットの写真画像である。
【図１３】ＲＥＴＬ３−Ｉｇへのアフィニティー結合によるニューブラスチンの抽出を示すゲルの写真である。
【図１４】ｐＥＴ１９ｂ−ニューブラスチンのプラスミド地図と、ニューブラスチンの合成遺伝子の配列である。
【図１５】ｐＭＪＢ１６４−Ｈｉｓニューブラスチンのプラスミド地図と、Ｈｉｓニューブラスチンの合成遺伝子の配列である。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）：１のヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号：２のＡＡ_１−ＡＡ_１０５に対して少なくとも９０％の相同性を含むニューブラスチンポリペプチド又はそこから誘導されるポリペプチドを発現時にコードするオープンリーディングフレームを含む核酸配列；
（ｃ）配列番号：１のヌクレオチド配列を含む核酸に高ストリンジェンシー溶液ハイブリダイゼーション条件で特異的にハイブリダイズする核酸、又はその相補ストランド；
（ｄ）配列番号：１として存在するポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の相同性である核酸
より成る群から選ばれた配列を含む、単離されたニューブラスチン核酸。
【請求項２】
コード化されたポリペプチドが、配列番号：２のＡＡ_１−ＡＡ_１０５、及び配列番号：５，６及び７のＡＡ_１−ＡＡ_１０５より成る群から選ばれる、請求項１記載の核酸。
【請求項３】
配列番号：３の配列を含む、請求項１記載の核酸。
【請求項４】
配列番号：１として存在するポリヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の相同性である，請求項１記載の核酸。
【請求項５】
配列番号：１として存在するポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の相同性である，請求項１記載の核酸。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１つに記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項７】
当該核酸によってコード化されるポリペプチドを、インビトロで当該核酸から発現させる段階を含む、請求項６記載のベクターを使用する方法。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１つに記載の核酸及び（又は）請求項６記載の発現ベクターを用いてインビトロで形質転換させた細胞。
【請求項９】
該細胞が真核細胞である、請求項８記載の細胞。
【請求項１０】
該細胞が哺乳類細胞、真菌細胞及び酵母細胞より成る群から選ばれる、請求項９記載の細胞。
【請求項１１】
哺乳類細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＰＣ１２、ＨｉＢ５、ＲＮ３３ｂ及びヒト神経幹細胞より成る群から選ばれる、請求項１０記載の細胞。
【請求項１２】
配列番号：２のアミノ酸１〜１０５に対して少なくとも９０％相同するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号：２，４，５，６及び７に記載のアミノ酸配列のいずれか１つを含むニューブラスチン神経栄養因子ポリペプチド。
【請求項１４】
当該ポリペプチドがグリコシル化されている、請求項１２又は１３記載のポリペプチド。
【請求項１５】
当該ポリペプチドが請求項１〜５のいずれか１つに記載の核酸によってコードされる、請求項１２記載のポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１２〜１５のいずれか１つに記載のポリペプチドを製造する方法であって、当該方法が上記ポリペプチドをニューブラスチン神経栄養因子核酸から発現させる工程を含む、上記方法。
【請求項１７】
上記ニューブラスチン神経栄養因子核酸を含む細胞を、当該ポリペプチドの産生が可能な培養培地で培養する工程を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
当該ポリペプチドを、上記培養培地から回収する工程をさらに含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
請求項１８記載の方法によって得られる精製されたポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１２〜１５又は１９のいずれか１つに記載のポリペプチドおよび薬学的に許容し得る担体を含む調合物。
【請求項２１】
請求項１２〜１５又は１９のいずれか１つに記載のポリペプチドを医薬の製造に使用する方法。
【請求項２２】
損傷性及び外傷性ニューロンに係わる神経変性疾患、たとえば末梢神経系、延髄及び（又は）脊髄の外傷性障害、脳虚血ニューロン損傷、神経障害及び特に末梢神経障、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症又はその他のあらゆる神経変性障害、及び痴呆に関連する記憶障害の治療ために、請求項２１記載の使用する方法。
【請求項２３】
配列番号：１７、１８、１９、２０、２３、２４、２５、２６または２８に記載の配列のいずれか１つを含む、ＰＣＲプライマー核酸配列。
【請求項２４】
配列番号 ２、４、５、６又は７に記載のポリペプチドのいずれか１つを製造する方法であって、配列番号：１又は３に記載の核酸配列のいずれか１つを含む細胞を、上記ポリペプチドの産生が可能な条件で培養し、その培養培地から上記ポリペプチドを回収することを含む、上記方法。
【請求項２５】
（ａ）ニューブラスチンポリペプチドを発現時にコードするポリヌクレオチドを細胞に導入するか、または調節配列をその調節配列が内因性ニューブラスチン遺伝子の発現を調節するように相同組換えによって細胞に導入して、ニューブラスチン産生細胞を作成し、
（ｂ）そのニューブラスチン産生細胞をニューブラスチンポリペプチドの発現をもたらす培養条件で培養すること、
を含む、請求項１２〜１５のいずれか１つに記載のニューブラスチンポリペプチドを製造する方法。
【請求項２６】
配列番号：２９または３０に記載の配列を含む、ニューブラスチンポリペプチドをコード化する合成遺伝子。
【請求項２７】
次の配列：
【化１】

のいずれかを有するニューブラスチンペプチド。
【請求項２８】
請求項２７のペプチドのいずれかに対して産生される抗体。
【請求項２９】
配列番号：２、４、５、６、７、９、１０、１１、１２及び１６に記載の配列のいずれか１つに対して少なくとも７０％の相同性であるアミノ酸配列を有するニューブラスチン神経栄養因子を、黄斑変性、色素性痒疹、及び緑内障を患う患者の網膜で光受容体損失を含む、眼疾患の治療用医薬の製造に使用する方法。
【請求項３０】
配列番号：２、４、５、６、７、９、１０、１１、１２及び１６に記載の配列のいずれか１つに対して少なくとも７０％の相同性であるアミノ酸配列を有するニューブラスチンポリペプチドを発現時にコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を、黄斑変性、色素性痒疹、及び緑内障を患う患者の網膜で光受容体損失を含む、眼疾患の治療用医薬の製造に使用する方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図５Ｃ】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【公開番号】特開２００６−１２２０５３（Ｐ２００６−１２２０５３Ａ）
【公開日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３２６７４５（Ｐ２００５−３２６７４５）
【出願日】平成１７年１１月１０日（２００５．１１．１０）
【分割の表示】特願２００５−１６１１５５（Ｐ２００５−１６１１５５）の分割
【原出願日】平成１１年７月５日（１９９９．７．５）
【出願人】（５０１００８７０５）エヌエスゲーネ・アクティーゼルスカブ (6)
【Ｆターム（参考）】