移植腎の拒絶の早期認識のためのポリペプチドマーカー
分子量および泳動時間（ＣＥ時間）についての値によって特徴づけられるポリペプチドマーカーがマーカー１ないし２４２（頻度マーカー）から選択される、試料中の少なくとも一つのポリペプチドマーカーの存在または非存在を測定する段階を含み、またはマーカー２４３ないし７６７（振幅マーカー）から選択される少なくとも一つのポリペプチドマーカーの振幅を測定する段階を含む、腎臓移植（ＮＴｘ）後の拒絶を認識するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移植腎の拒絶の早期認識のための被験者由来の試料中の一種類以上のペプチドマーカーの存在または非存在の使用および、一または複数のペプチドマーカーの存在または非存在が腎臓移植（ＮＴｘ）後の拒絶の存在を示す移植腎の拒絶の早期認識のための方法に関する。
【０００２】
腎臓移植はドイツで最も高頻度に実施されている臓器移植である。にもかかわらず、新しい腎臓のための待ち時間は約６〜８年である。腎臓移植（ＮＴｘ）が実施された後の治療の目的は、可能な限り長期にわたる機能の維持、および移植片の拒絶の防止である。平均して、さまざまな合併症のためにＮＴｘ後に腎臓の１０〜１５％が失われる。したがって、その時が来たら拒絶の開始の認識が極めて重要であり、なぜなら移植片を失わないためには即時の医薬的介入が必要だからである。
【０００３】
驚くべきことに、被験者に由来する試料中の特定のペプチドマーカーが、移植腎の拒絶を認識するために使用されうることが現在見出されている。
【０００４】
そのため、本発明は、移植腎の拒絶を認識するための、被験者に由来する試料中の少なくとも一つのポリペプチドマーカーの存在または非存在および振幅の使用に関し、前記ポリペプチドマーカーは表１に示す通りの分子量および泳動時間によって特徴づけられるポリペプチドマーカー１ないし７６７から選択される。
表１：移植腎の拒絶を認識するためのポリペプチドマーカーおよびその分子量（Ｄａ）および泳動時間（ＣＥ時間（分））：
【０００５】
本発明を用いて、拒絶を非常に早期に診断することが可能である。したがって、開始しつつある拒絶は薬物によって早期に治療されうる。本発明はさらに、一部非侵襲的な、または最小限に侵襲的な操作だけで、低い費用で迅速なおよび信頼性の高い拒絶の認識を可能にする。
【０００６】
泳動時間は、たとえば、実施例に項目２として示される通り、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって測定される。この実施例では、長さ９０ｃｍおよび内径（ＩＤ）５０μｍおよび外径（ＯＤ）３６０μｍのガラスキャピラリーが付加電圧２５または３０ｋＶにて操作される。移動相溶媒として３０％メタノール、０．５％ギ酸または２０％アセトニトリルおよび０．２５Ｍギ酸を含む水が使用される。
【０００７】
ＣＥ泳動時間は変動しうることが知られている。にもかかわらず、ポリペプチドマーカーが溶出される順序は典型的には使用される任意のＣＥ系について記載の条件下で同一である。泳動時間にそれにもかかわらず起こりうる何らかの差のバランスを取るために、系は泳動時間が正確に知られている標準物質を用いて正規化されうる。これらの標準物質は、たとえば、実施例に記載されるポリペプチドでありうる（実施例の項目３を参照）。
【０００８】
表１から２に示されるポリペプチドの特徴づけは、たとえばノイホフ（Ｎｅｕｈｏｆｆ）ら（Ｒａｐｉｄ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，２００４，Ｖｏｌ．２０，ｐａｇｅｓ １４９−１５６）によって詳細に記載されている方法である、キャピラリー電気泳動−質量分析（ＣＥ−ＭＳ）を用いて測定された。各測定間または異なる質量分析計間の分子量の変動は、較正が正確である場合には相対的に小さく、典型的には(０．１％の範囲内、好ましくは(０．０５％の範囲内、より好ましくは±０．０３％である。
【０００９】
本発明に記載のポリペプチドマーカーは、タンパク質またはペプチド、またはタンパク質またはペプチドの分解産物である。それらは、たとえば、グリコシル化、リン酸化、アルキル化またはジスルフィド架橋といった翻訳後修飾によって、または、たとえば分解の範囲内の他の反応によって、化学的に修飾されうる。加えて、ポリペプチドマーカーはまた、試料の精製中に化学的に変化、たとえば、酸化されうる。
【００１０】
ポリペプチドマーカーを決定するパラメーター（分子量および泳動時間）から進んで、対応するポリペプチドの配列を同定することが先行技術で公知の方法によって可能である。
【００１１】
本発明に記載のポリペプチド（表１から４を参照）が、移植片の拒絶の始まりを診断するのに用いられる。「診断」とは、症状または現象を疾患または傷害に割り当てることによって知識を得る過程を意味する。この場合には、拒絶が特定のポリペプチドマーカーの存在または非存在、または振幅の差から結論される。このように、本発明に記載のポリペプチドマーカーが被験者由来の試料において測定され、その存在または非存在およびシグナル強度／振幅が、拒絶の存在を結論することを可能にする。ポリペプチドマーカーの存在または非存在および振幅は、先行技術で公知である任意の方法によって測定されうる。使用されうる方法が下記に例示される。
【００１２】
ポリペプチドマーカーは、その測定値が少なくともその閾値と同じ高さであるならば、存在するとみなされる。測定値がより低いならば、ポリペプチドマーカーは存在しないとみなされる。閾値は測定法の感度（検出限界）によって決定されうるかまたは経験的に定義されうる。
【００１３】
本発明に関連して、好ましくはある分子量について試料の測定値がブランク試料（たとえば、緩衝液または溶媒のみ）の測定値より少なくとも２倍高いならば、閾値を超えるとみなされる。
【００１４】
一または複数のポリペプチドマーカーが、その存在または非存在が測定される方法で用いられ、存在または非存在が拒絶を示す（頻度マーカー番号１ないし２４２；表２）。このように、ポリペプチドマーカー番号１から５といった、典型的には腎臓移植（ＮＴｘ）および拒絶後の患者（疾患）に豊富であるが、腎臓移植（ＮＴｘ）後の拒絶無しの被験者（対照）ではより少ないポリペプチドマーカーがある。加えて、拒絶の無い被験者に豊富であるが、拒絶を有する被験者にはより少ないかまたは存在しない、たとえば、番号６から１５（表２）のようなポリペプチドマーカーがある。
表２：移植腎の拒絶の認識のためのポリペプチドマーカー（頻度マーカー）、その分子量および泳動時間、およびＮＴｘ後の拒絶有りの患者の群および対照群すなわちＮＴｘ後の拒絶無しの患者における係数としてその存在および非存在（１＝１００％，０＝０％；実施例に記載の通り試料処理および測定）。
【００１５】
頻度マーカー（存在または非存在の測定）に加えてまたは代替的に、表３ および ４に記載の振幅マーカーもまた移植腎の拒絶の診断に使用されうる（番号２４３−７６７）。振幅マーカーは、存在または非存在が決定的でなく、シグナルの高さ（振幅）がそのシグナルが両方の群で存在するかどうかを決定するような方法で使用される。別々に濃縮された試料または異なる測定法間の比較可能性を達成するためには二つの正規化法が可能である：
【００１６】
最初の方法では、試料のすべてのペプチドシグナルは総振幅１００万カウントに対して正規化される。したがって、各マーカーそれぞれの平均振幅は百万分率（ｐｐｍ）として示される。この方法によって得られた振幅マーカーを表３に示す（番号２４３−６２７）。加えて、代替的な正規化法によって他の振幅マーカーを定義することが可能である：
【００１７】
この場合は、試料のすべてのペプチドシグナルは共通の正規化係数が掛けられる。そのようにして、各試料のペプチド振幅と試料中の既知のポリペプチドの参照値との直線回帰が作製される。回帰直線の傾きは相対濃度にちょうど相当し、およびこの試料についての正規化係数として用いられる。この方法によって特徴づけられるマーカーを表４に示す。
【００１８】
使用したすべての群は、信頼性のある平均振幅を得るために、少なくとも１９、好ましくは 少なくとも２０の個別の患者または対照試料から成る。診断についての決定（移植腎の拒絶またはそうでない）は、対照群または拒絶群における平均振幅と比較して患者試料中の各ポリペプチドマーカーの振幅がどのくらい高いかの関数として行われる。振幅が拒絶群の平均振幅により対応すれば、移植腎の拒絶が考慮されるべきであり、および振幅が対照群の平均振幅により対応すれば、拒絶は考慮されるべきでない。より正確な定義は、マーカー番号２４７（表３）によって与えられる。本マーカーの平均振幅は移植腎が拒絶されている場合に顕著に上昇する（６５４ｐｐｍに対し拒絶無し群では７５ｐｐｍ）。ここで、患者試料中のこのマーカーについての値が０ないし７５ｐｐｍであるかまたはこの範囲を最大２０％超える、すなわち、０ないし９０ｐｐｍであるならば、この試料は拒絶無しの対照群に属する。その値が６５４ｐｐｍまたは最大２０％下回るまたはより高い、すなわち、５２３ないし非常に高値であるならば、腎臓移植後の拒絶が考慮されるべきである。
表３：振幅マーカー（ｐｐｍ正規化）
表４：振幅マーカー（正規化機能を有する）
【００１９】
一種類以上のポリペプチドマーカーの存在または非存在または振幅が測定される試料が由来する被験者は、ＮＴｘ後の拒絶に罹患することのできる任意の対象、たとえば、動物またはヒトでありうる。好ましくは、被験者は哺乳類であり、および非常に好ましくは、被験者はヒトである。
【００２０】
本発明の好ましい一実施形態では、一つのポリペプチドマーカーだけでなく、マーカーの組み合わせがＮＴｘ後の拒絶に用いられ、ＮＴｘ後の拒絶の存在がそれらの存在または非存在および振幅の差から結論される。複数のポリペプチドマーカーを比較することによって、患者または対照における典型的な存在確率からのいくつかの個別の変動から生じる全体結果の偏りが低減または回避されうる。
【００２１】
本発明に記載の一または複数のポリペプチドマーカーの存在または非存在が測定される試料は、被験者の体から得られる任意の試料でありうる。試料は、被験者の状態についての情報（ＮＴｘ後の拒絶またはそうでない）を提供するのに適したポリペプチド組成を有する試料である。たとえば、試料は血液、尿、滑液、組織液、耐分泌物、汗、脳脊髄液、リンパ液、腸液、胃液または膵液、胆汁、涙液、組織試料、精子、膣液または糞便試料でありうる。好ましくは、試料は液体試料である。
【００２２】
好ましい一実施形態では、試料は尿試料または血液試料であり、および前記血液試料は（血液）血清または（血液）血漿試料でありうる。
【００２３】
尿試料は先行技術で公知の通り採取されうる。好ましくは、中間尿試料が本発明に関連して用いられる。たとえば、尿試料はカテーテルによって、またはＷＯ ０１／７４２７５に記載の排尿器具によってもまた、採取されうる。
【００２４】
血液試料は先行技術で公知の方法によって、たとえば、静脈、動脈または毛細管から採取されうる。通常は、血液試料は静脈血をシリンジを用いて、たとえば、被験者の腕から採取することによって得られる。「血液試料」の語は、血漿または血清といった、さらなる精製および分離方法によって血液から得られた試料を含む。
【００２５】
試料中のポリペプチドマーカーの存在または非存在および振幅は、ポリペプチドマーカーの測定に適した先行技術で公知の任意の方法によって測定されうる。そのような方法は当業者に公知である。原則的に、ポリペプチドマーカーの存在または非存在および振幅は、質量分析のような直接的方法、または、たとえばリガンドを用いるような間接的方法によって測定されうる。
【００２６】
必要であればまたは望ましければ、被験者由来の試料、たとえば尿試料は、任意の適当な方法で前処理することができ、および、一または複数のポリペプチドマーカーの存在または非存在および振幅が測定される前にたとえば精製または分離されうる。処理は、たとえば、精製、分離、希釈または濃縮を含みうる。方法は、たとえば、遠心分離、ろ過、限外ろ過、透析、沈澱、または、アフィニティ分離またはイオン交換クロマトグラフィーによる分離といったクロマトグラフィー法、または電気泳動分離でありうる。その具体例は、ゲル電気泳動、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）、キャピラリー電気泳動、金属アフィニティクロマトグラフィー、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、レクチンを用いるアフィニティクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、順相および逆相ＨＰＬＣ、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび表面への選択的結合である。これらの方法のすべてが当業者に公知であり、および当業者はその方法を、使用する試料および一または複数のポリペプチドマーカーの存在または非存在を測定するための方法の関数として選択することができる。
【００２７】
本発明の一実施形態では、試料は、測定される前に、キャピラリー電気泳動によって分離され、超遠心分離によって精製されおよび／または限外ろ過によって特定の分子サイズのポリペプチドマーカーを含む画分へと分割される。
【００２８】
好ましくは、ポリペプチドマーカーの存在または非存在および振幅を測定するために質量分析法が用いられ、試料の精製または分離がその方法の上流で実施されうる。現在用いられている方法と比較して、質量分析は、試料の多数の（＞１００）ポリペプチドが単一の分析によって測定されうるという長所を有する。任意の種類の質量分析計が使用されうる。質量分析によって、１０ｆｍｏｌのポリペプチドマーカー、すなわち、０．１ｎｇの１０ｋＤａタンパク質を、複雑な混合物中で約(０．０１％の測定精度でルーチンとして測定することが可能である。質量分析計では、イオン生成部が適当な分析装置と連結されている。たとえば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）インターフェイスは主に液体試料中のイオンを測定するのに用いられ、一方、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）法はマトリクスと結晶化した試料由来のイオンを測定するのに用いられる。生成したイオンを分析するためには、四重極、イオントラップまたは飛行時間（ＴＯＦ）分析器が使用されうる。
【００２９】
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）では、溶液中に存在する分子は、特に高電圧（たとえば、１〜８ｋＶ）の影響下で噴霧され、荷電した小滴を形成し、小滴は溶媒の蒸発からさらに小さくなる。最後に、いわゆるクーロン爆発が遊離イオンの形成を引き起こし、遊離イオンはその後分析および検出されうる。
【００３０】
ＴＯＦによるイオンの分析では、イオンに等量の運動エネルギーを与える一定の加速電圧が加えられる。その後、各イオンが肥厚チューブを通じて特定の漂流距離を移動するのに要する時間が非常に正確に測定される。等量の運動エネルギーでは、イオンの速度は質量に依存するため、したがって質量が測定されうる。ＴＯＦ分析器は非常に高いスキャン速度を有し、およびしたがって非常に高い分解能に達する。
【００３１】
ポリペプチドマーカーの存在および非存在の測定のための好ましい方法は、気相イオンスペクトル法、たとえばレーザー脱離／イオン化質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（表面増強レーザー脱離／イオン化）、ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー／質量分析）、２Ｄ−ＰＡＧＥ／ＭＳおよびキャピラリー電気泳動−質量分析（ＣＥ−ＭＳ）を含む。上記のすべての方法が当業者に公知である。
【００３２】
特に好ましい方法が、キャピラリー電気泳動が質量分析と組み合わされるＣＥ−ＭＳである。この方法は、たとえば、独国特許出願ＤＥ １００２１７３７に、カイゼル（Ｋａｉｓｅｒ）ら（Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ，２００３，Ｖｏｌ．１０１３： １５７−１７１，および Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２００４，２５： ２０４４−２０５５）に、およびウィトケ（Ｗｉｔｔｋｅ）ら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，２００３，１０１３： １７３−１８１）にある程度詳細に記載されている。ＣＥ−ＭＳ技術は、試料の数百のポリペプチドマーカーの存在および振幅を同時に短時間内におよび少量で高感度で測定することを可能にする。試料が測定された後、測定されたポリペプチドマーカーのパターンが作成される。このパターンは、患者または健常者の参照パターンと比較されうる。大部分の場合で、ＮＴｘ後の拒絶を認識するためには、限ら@0032
れた数のポリペプチドマーカーを使用するので十分である。ＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ装置にオンラインで連結されたＣＥを含むＣＥ−ＭＳ法がさらに好ましい。
【００３３】
ＣＥ−ＭＳのためには、揮発性溶媒の使用が好ましく、および本質的に塩を含まない条件下で最も良く働く。適した溶媒の例は、アセトニトリル、メタノールなどを含む。溶媒は、水で希釈されうるかまたは、分析物、好ましくはポリペプチドをプロトン化するために弱酸（たとえば、０．１％ないし１％ギ酸）と混合されうる。
【００３４】
キャピラリー電気泳動を用いて、分子を電荷およびサイズによって分離することが可能である。中性粒子は電流を加える際に電気浸透流動の速度で泳動し、一方で陽イオンは正極に向かって加速し、および陰イオンは遅延する。電気泳動におけるキャピラリーの長所は、体積に対する表面の比が有利なことにあり、これは電流フローの間に生じるジュール熱の良好な損失を可能にする。これは今度は高電圧（通常は最大３０ｋＶ）の付加を可能にし、およびそのようにして高い分離性能および短い分析時間を可能にする。
【００３５】
キャピラリー電気泳動では、典型的には５０ないし７５μｍの内径を有するシリカガラスキャピラリーが通常用いられる。使用される長さは３０ないし１００ｃｍである。加えて、キャピラリーは通常はプラスチック被覆シリカガラス製である。キャピラリーは、未処理、すなわち内表面上の親水基を曝露しているか、または内表面が被覆されているかの両方でありうる。疎水性コーティングは分解能を改善するために使用されうる。電圧に加えて、圧力もまた加えることができ、圧力は典型的には０ないし１ｐｓｉの範囲内である。圧力もまた、実施中にのみ加えることができるか、または途中で変化させることができる。
【００３６】
ポリペプチドマーカーの測定のための好ましい方法では、試料のマーカーはキャピラリー電気泳動を用いて分離され、次いで直接にイオン化され、および検出のために連結された質量分析計へオンラインで移送される。
【００３７】
本発明に記載の方法では、ＮＴｘ後の拒絶を認識するためにいくつかのポリペプチドマーカーを使用することが有利である。特に、たとえば、マーカー１、２および３；１、２および４；などといった、少なくとも３種類のポリペプチドマーカーが使用されうる。
【００３８】
より好ましいのは、少なくとも４、５または６種類のマーカーの使用である。
【００３９】
さらにより好ましいのは、少なくとも１０種類のマーカー、たとえば、マーカー１から１０の使用である。
【００４０】
非常に好ましいのは、表１および２に列記された７６７種類のマーカーすべての使用である。
【００４１】
いくつかのマーカーが用いられる場合にＮＴｘ後の拒絶の存在の確率を測定するためには、当業者に公知である統計的手法が使用されうる。たとえば、ワイシンガー（Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ）らによって記載されたランダムフォレスト法（Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．，２００４，６５： ２４２６−２４３４）が、Ｓ−プラスといったコンピュータープログラムを用いることによって使用されうる。
【実施例】
【００４２】
１．試料調製
ＮＴｘ後の拒絶を認識するためのポリペプチドマーカーを検出するために、尿を用いた。尿はＮＴｘ後の拒絶を有する患者から、およびＮＴｘ後の拒絶無しの患者（対照群）から採取された。
【００４３】
両方の群の患者についての移植時点での臨床データを下記の表５に示す：
表５：使用された患者の群についての移植中の臨床データ
【００４４】
以降のＣＥ−ＭＳ測定のために、アルブミンおよび免疫グロブリンといった、より高濃度で患者の尿に含まれるタンパク質は限外ろ過によって分離除去されなければならなかった。したがって、尿７００μｌを取り、および７００ｍｌのろ過緩衝液（２Ｍ尿素、１０ｍＭアンモニア、０．０２％ＳＤＳ）と混合した。この１．４ｍｌの試料量を限外ろ過した（２０ｋＤａ、ザルトリウス社（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）ドイツ、ゲッチンゲン（Ｇoｔｔｉｎｇｅｎ））。限外ろ過は３０００ｒｐｍにて遠心分離機で、限外ろ液１．１ｍｌが得られるまで実施された。
【００４５】
得られたろ液１．１ｍｌを次いで脱塩のためにＰＤ−１０カラム（アマシャム・バイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、スウェーデン、ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ））に加え、および０．０１％ＮＨ4ＯＨ水溶液２．５ｍｌで溶出し、および溶出液を続いて凍結乾燥した。ＣＥ−ＭＳ測定のために、ポリペプチドをその後、水（ＨＰＬＣグレード、メルク社（Ｍｅｒｃｋ））２０μｌで再懸濁した。
【００４６】
２．ＣＥ−ＭＳ測定
ＣＥ−ＭＳ測定は、ベックマン・コールター社のキャピラリー電気泳動システム（Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱシステム；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．，米国フラートン（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ））およびブルカーＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析計（ｍｉｃｒｏ−ＴＯＦＭＳ、ブルカー・ダルトニクス社（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ）、ドイツ、ブレーメン）を用いて実施された。
【００４７】
ＣＥキャピラリーはベックマン・コールター社から調達され、およびＩＤ／ＯＤ５０／３６０μｍおよび長さ９０ｃｍであった。ＣＥ分離のための移動相は、２０％アセトニトリルおよび０．２５Ｍギ酸を含む水から成った。ＭＳでの「シース流」用には、０．５％ギ酸を含む３０％イソプロパノールが流速２μｌ／分にて用いられた。ＣＥおよびＭＳの連結はＣＥ−ＥＳＩ−ＭＳスプレイヤー・キット（アジレント・テクノロジーズ社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ドイツ、ワルドブロン（Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ））によって実現された。
【００４８】
試料を注入するには、１ないし最大６ｐｓｉの圧力が加えられ、および注入の持続時間は９９秒であった。これらのパラメーターを用いて、試料約１５０ｎｌがキャピラリーに注入され、これは、キャピラリー体積の約１０％に相当する。キャピラリー中の試料を濃縮するためにスタッキング法が用いられた。このように、試料が注入される前に、１Ｍ ＮＨ3溶液が７秒間（１ｐｓｉにて）注入され、および試料が注入された後に、２Ｍギ酸溶液が５秒間注入された。分離電圧（３０ｋＶ）が加えられた後、分析物はこれらの溶液の間で自動的に濃縮された。
【００４９】
以降のＣＥ分離は圧力法を用いて実施された：０ｐｓｉにて４０分、次いで０．１ｐｓｉにて２分、０．２ｐｓｉにて２分、０．３ｐｓｉにて２分、０．４ｐｓｉにて２分、および最後に０．５ｐｓｉにて３２分。分離実行の合計時間はしたがって８０分であった。
【００５０】
ＭＳの側で可能な限り良好なシグナル強度を得るために、ネブライザーガスは可能な最低値に設定された。エレクトロスプレーを生じるためにスプレーニードルに加えられた電圧は３７００〜４１００Ｖであった。質量分析計でのその他の設定は、取扱説明書に従ってペプチド検出用に最適化された。スペクトルは質量範囲ｍ／ｚ４００からｍ／ｚ３０００に渡って記録され、および３秒毎に蓄積された。
【００５１】
３．ＣＥ測定用標準
ＣＥ測定を点検および較正するために、選択された条件下での記載のＣＥ泳動時間によって特徴づけられる下記のタンパク質またはポリペプチドが用いられた：
タンパク質／ポリペプチド ＣＥ泳動時間
アプロチニン（シグマ社（ＳＩＧＭＡ）、ドイツ・タウフキルヒェン（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ）、品番Ａ１１５３） ９．２分
リボヌクレアーゼ（シグマ社、ドイツ・タウフキルヒェン、品番Ｒ４８７５）１０．９分
リゾチーム（シグマ社、ドイツ・タウフキルヒェン、品番Ｌ７６５１） ８．９分
"ＲＥＶ"、配列：ＲＥＶＱＳＫＩＧＹＧＲＱＩＩＳ １５．６分
"ＥＬＭ"、配列：ＥＬＭＴＧＥＬＰＹＳＨＩＮＮＲＤＱＩＩＦＭＶＧＲ ２３．４分
"ＫＩＮＣＯＮ"、配列：ＴＧＳＬＰＹＳＨＩＧＳＲＤＱＩＩＦＭＶＧＲ ２０．０分
"ＧＩＶＬＹ"配列：ＧＩＶＬＹＥＬＭＴＧＥＬＰＹＳＨＩＮ ３６．８分
【００５２】
タンパク質／ポリペプチドはそれぞれ１０ｐｍｏｌ／μｌ水の濃度にて使用された。"ＲＥＶ"、 "ＥＬＭ"、 "ＫＩＮＣＯＮ"および"ＧＩＶＬＹ"は合成ペプチドである。
【００５３】
ペプチドの分子量およびＭＳで見られる各荷電状態のｍ／ｚ比を下記の表に列記する：
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移植腎の拒絶の早期認識のための被験者由来の試料中の一種類以上のペプチドマーカーの存在または非存在の使用および、一または複数のペプチドマーカーの存在または非存在が腎臓移植（ＮＴｘ）後の拒絶の存在を示す移植腎の拒絶の早期認識のための方法に関する。
【０００２】
腎臓移植はドイツで最も高頻度に実施されている臓器移植である。にもかかわらず、新しい腎臓のための待ち時間は約６〜８年である。腎臓移植（ＮＴｘ）が実施された後の治療の目的は、可能な限り長期にわたる機能の維持、および移植片の拒絶の防止である。平均して、さまざまな合併症のためにＮＴｘ後に腎臓の１０〜１５％が失われる。したがって、その時が来たら拒絶の開始の認識が極めて重要であり、なぜなら移植片を失わないためには即時の医薬的介入が必要だからである。
【０００３】
驚くべきことに、被験者に由来する試料中の特定のペプチドマーカーが、移植腎の拒絶を認識するために使用されうることが現在見出されている。
【０００４】
そのため、本発明は、移植腎の拒絶を認識するための、被験者に由来する試料中の少なくとも一つのポリペプチドマーカーの存在または非存在および振幅の使用に関し、前記ポリペプチドマーカーは表１に示す通りの分子量および泳動時間によって特徴づけられるポリペプチドマーカー１ないし７６７から選択される。
表１：移植腎の拒絶を認識するためのポリペプチドマーカーおよびその分子量（Ｄａ）および泳動時間（ＣＥ時間（分））：
【０００５】
本発明を用いて、拒絶を非常に早期に診断することが可能である。したがって、開始しつつある拒絶は薬物によって早期に治療されうる。本発明はさらに、一部非侵襲的な、または最小限に侵襲的な操作だけで、低い費用で迅速なおよび信頼性の高い拒絶の認識を可能にする。
【０００６】
泳動時間は、たとえば、実施例に項目２として示される通り、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって測定される。この実施例では、長さ９０ｃｍおよび内径（ＩＤ）５０μｍおよび外径（ＯＤ）３６０μｍのガラスキャピラリーが付加電圧２５または３０ｋＶにて操作される。移動相溶媒として３０％メタノール、０．５％ギ酸または２０％アセトニトリルおよび０．２５Ｍギ酸を含む水が使用される。
【０００７】
ＣＥ泳動時間は変動しうることが知られている。にもかかわらず、ポリペプチドマーカーが溶出される順序は典型的には使用される任意のＣＥ系について記載の条件下で同一である。泳動時間にそれにもかかわらず起こりうる何らかの差のバランスを取るために、系は泳動時間が正確に知られている標準物質を用いて正規化されうる。これらの標準物質は、たとえば、実施例に記載されるポリペプチドでありうる（実施例の項目３を参照）。
【０００８】
表１から２に示されるポリペプチドの特徴づけは、たとえばノイホフ（Ｎｅｕｈｏｆｆ）ら（Ｒａｐｉｄ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，２００４，Ｖｏｌ．２０，ｐａｇｅｓ １４９−１５６）によって詳細に記載されている方法である、キャピラリー電気泳動−質量分析（ＣＥ−ＭＳ）を用いて測定された。各測定間または異なる質量分析計間の分子量の変動は、較正が正確である場合には相対的に小さく、典型的には(０．１％の範囲内、好ましくは(０．０５％の範囲内、より好ましくは±０．０３％である。
【０００９】
本発明に記載のポリペプチドマーカーは、タンパク質またはペプチド、またはタンパク質またはペプチドの分解産物である。それらは、たとえば、グリコシル化、リン酸化、アルキル化またはジスルフィド架橋といった翻訳後修飾によって、または、たとえば分解の範囲内の他の反応によって、化学的に修飾されうる。加えて、ポリペプチドマーカーはまた、試料の精製中に化学的に変化、たとえば、酸化されうる。
【００１０】
ポリペプチドマーカーを決定するパラメーター（分子量および泳動時間）から進んで、対応するポリペプチドの配列を同定することが先行技術で公知の方法によって可能である。
【００１１】
本発明に記載のポリペプチド（表１から４を参照）が、移植片の拒絶の始まりを診断するのに用いられる。「診断」とは、症状または現象を疾患または傷害に割り当てることによって知識を得る過程を意味する。この場合には、拒絶が特定のポリペプチドマーカーの存在または非存在、または振幅の差から結論される。このように、本発明に記載のポリペプチドマーカーが被験者由来の試料において測定され、その存在または非存在およびシグナル強度／振幅が、拒絶の存在を結論することを可能にする。ポリペプチドマーカーの存在または非存在および振幅は、先行技術で公知である任意の方法によって測定されうる。使用されうる方法が下記に例示される。
【００１２】
ポリペプチドマーカーは、その測定値が少なくともその閾値と同じ高さであるならば、存在するとみなされる。測定値がより低いならば、ポリペプチドマーカーは存在しないとみなされる。閾値は測定法の感度（検出限界）によって決定されうるかまたは経験的に定義されうる。
【００１３】
本発明に関連して、好ましくはある分子量について試料の測定値がブランク試料（たとえば、緩衝液または溶媒のみ）の測定値より少なくとも２倍高いならば、閾値を超えるとみなされる。
【００１４】
一または複数のポリペプチドマーカーが、その存在または非存在が測定される方法で用いられ、存在または非存在が拒絶を示す（頻度マーカー番号１ないし２４２；表２）。このように、ポリペプチドマーカー番号１から５といった、典型的には腎臓移植（ＮＴｘ）および拒絶後の患者（疾患）に豊富であるが、腎臓移植（ＮＴｘ）後の拒絶無しの被験者（対照）ではより少ないポリペプチドマーカーがある。加えて、拒絶の無い被験者に豊富であるが、拒絶を有する被験者にはより少ないかまたは存在しない、たとえば、番号６から１５（表２）のようなポリペプチドマーカーがある。
表２：移植腎の拒絶の認識のためのポリペプチドマーカー（頻度マーカー）、その分子量および泳動時間、およびＮＴｘ後の拒絶有りの患者の群および対照群すなわちＮＴｘ後の拒絶無しの患者における係数としてその存在および非存在（１＝１００％，０＝０％；実施例に記載の通り試料処理および測定）。
【００１５】
頻度マーカー（存在または非存在の測定）に加えてまたは代替的に、表３ および ４に記載の振幅マーカーもまた移植腎の拒絶の診断に使用されうる（番号２４３−７６７）。振幅マーカーは、存在または非存在が決定的でなく、シグナルの高さ（振幅）がそのシグナルが両方の群で存在するかどうかを決定するような方法で使用される。別々に濃縮された試料または異なる測定法間の比較可能性を達成するためには二つの正規化法が可能である：
【００１６】
最初の方法では、試料のすべてのペプチドシグナルは総振幅１００万カウントに対して正規化される。したがって、各マーカーそれぞれの平均振幅は百万分率（ｐｐｍ）として示される。この方法によって得られた振幅マーカーを表３に示す（番号２４３−６２７）。加えて、代替的な正規化法によって他の振幅マーカーを定義することが可能である：
【００１７】
この場合は、試料のすべてのペプチドシグナルは共通の正規化係数が掛けられる。そのようにして、各試料のペプチド振幅と試料中の既知のポリペプチドの参照値との直線回帰が作製される。回帰直線の傾きは相対濃度にちょうど相当し、およびこの試料についての正規化係数として用いられる。この方法によって特徴づけられるマーカーを表４に示す。
【００１８】
使用したすべての群は、信頼性のある平均振幅を得るために、少なくとも１９、好ましくは 少なくとも２０の個別の患者または対照試料から成る。診断についての決定（移植腎の拒絶またはそうでない）は、対照群または拒絶群における平均振幅と比較して患者試料中の各ポリペプチドマーカーの振幅がどのくらい高いかの関数として行われる。振幅が拒絶群の平均振幅により対応すれば、移植腎の拒絶が考慮されるべきであり、および振幅が対照群の平均振幅により対応すれば、拒絶は考慮されるべきでない。より正確な定義は、マーカー番号２４７（表３）によって与えられる。本マーカーの平均振幅は移植腎が拒絶されている場合に顕著に上昇する（６５４ｐｐｍに対し拒絶無し群では７５ｐｐｍ）。ここで、患者試料中のこのマーカーについての値が０ないし７５ｐｐｍであるかまたはこの範囲を最大２０％超える、すなわち、０ないし９０ｐｐｍであるならば、この試料は拒絶無しの対照群に属する。その値が６５４ｐｐｍまたは最大２０％下回るまたはより高い、すなわち、５２３ないし非常に高値であるならば、腎臓移植後の拒絶が考慮されるべきである。
表３：振幅マーカー（ｐｐｍ正規化）
表４：振幅マーカー（正規化機能を有する）
【００１９】
一種類以上のポリペプチドマーカーの存在または非存在または振幅が測定される試料が由来する被験者は、ＮＴｘ後の拒絶に罹患することのできる任意の対象、たとえば、動物またはヒトでありうる。好ましくは、被験者は哺乳類であり、および非常に好ましくは、被験者はヒトである。
【００２０】
本発明の好ましい一実施形態では、一つのポリペプチドマーカーだけでなく、マーカーの組み合わせがＮＴｘ後の拒絶に用いられ、ＮＴｘ後の拒絶の存在がそれらの存在または非存在および振幅の差から結論される。複数のポリペプチドマーカーを比較することによって、患者または対照における典型的な存在確率からのいくつかの個別の変動から生じる全体結果の偏りが低減または回避されうる。
【００２１】
本発明に記載の一または複数のポリペプチドマーカーの存在または非存在が測定される試料は、被験者の体から得られる任意の試料でありうる。試料は、被験者の状態についての情報（ＮＴｘ後の拒絶またはそうでない）を提供するのに適したポリペプチド組成を有する試料である。たとえば、試料は血液、尿、滑液、組織液、耐分泌物、汗、脳脊髄液、リンパ液、腸液、胃液または膵液、胆汁、涙液、組織試料、精子、膣液または糞便試料でありうる。好ましくは、試料は液体試料である。
【００２２】
好ましい一実施形態では、試料は尿試料または血液試料であり、および前記血液試料は（血液）血清または（血液）血漿試料でありうる。
【００２３】
尿試料は先行技術で公知の通り採取されうる。好ましくは、中間尿試料が本発明に関連して用いられる。たとえば、尿試料はカテーテルによって、またはＷＯ ０１／７４２７５に記載の排尿器具によってもまた、採取されうる。
【００２４】
血液試料は先行技術で公知の方法によって、たとえば、静脈、動脈または毛細管から採取されうる。通常は、血液試料は静脈血をシリンジを用いて、たとえば、被験者の腕から採取することによって得られる。「血液試料」の語は、血漿または血清といった、さらなる精製および分離方法によって血液から得られた試料を含む。
【００２５】
試料中のポリペプチドマーカーの存在または非存在および振幅は、ポリペプチドマーカーの測定に適した先行技術で公知の任意の方法によって測定されうる。そのような方法は当業者に公知である。原則的に、ポリペプチドマーカーの存在または非存在および振幅は、質量分析のような直接的方法、または、たとえばリガンドを用いるような間接的方法によって測定されうる。
【００２６】
必要であればまたは望ましければ、被験者由来の試料、たとえば尿試料は、任意の適当な方法で前処理することができ、および、一または複数のポリペプチドマーカーの存在または非存在および振幅が測定される前にたとえば精製または分離されうる。処理は、たとえば、精製、分離、希釈または濃縮を含みうる。方法は、たとえば、遠心分離、ろ過、限外ろ過、透析、沈澱、または、アフィニティ分離またはイオン交換クロマトグラフィーによる分離といったクロマトグラフィー法、または電気泳動分離でありうる。その具体例は、ゲル電気泳動、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）、キャピラリー電気泳動、金属アフィニティクロマトグラフィー、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、レクチンを用いるアフィニティクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、順相および逆相ＨＰＬＣ、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび表面への選択的結合である。これらの方法のすべてが当業者に公知であり、および当業者はその方法を、使用する試料および一または複数のポリペプチドマーカーの存在または非存在を測定するための方法の関数として選択することができる。
【００２７】
本発明の一実施形態では、試料は、測定される前に、キャピラリー電気泳動によって分離され、超遠心分離によって精製されおよび／または限外ろ過によって特定の分子サイズのポリペプチドマーカーを含む画分へと分割される。
【００２８】
好ましくは、ポリペプチドマーカーの存在または非存在および振幅を測定するために質量分析法が用いられ、試料の精製または分離がその方法の上流で実施されうる。現在用いられている方法と比較して、質量分析は、試料の多数の（＞１００）ポリペプチドが単一の分析によって測定されうるという長所を有する。任意の種類の質量分析計が使用されうる。質量分析によって、１０ｆｍｏｌのポリペプチドマーカー、すなわち、０．１ｎｇの１０ｋＤａタンパク質を、複雑な混合物中で約(０．０１％の測定精度でルーチンとして測定することが可能である。質量分析計では、イオン生成部が適当な分析装置と連結されている。たとえば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）インターフェイスは主に液体試料中のイオンを測定するのに用いられ、一方、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）法はマトリクスと結晶化した試料由来のイオンを測定するのに用いられる。生成したイオンを分析するためには、四重極、イオントラップまたは飛行時間（ＴＯＦ）分析器が使用されうる。
【００２９】
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）では、溶液中に存在する分子は、特に高電圧（たとえば、１〜８ｋＶ）の影響下で噴霧され、荷電した小滴を形成し、小滴は溶媒の蒸発からさらに小さくなる。最後に、いわゆるクーロン爆発が遊離イオンの形成を引き起こし、遊離イオンはその後分析および検出されうる。
【００３０】
ＴＯＦによるイオンの分析では、イオンに等量の運動エネルギーを与える一定の加速電圧が加えられる。その後、各イオンが肥厚チューブを通じて特定の漂流距離を移動するのに要する時間が非常に正確に測定される。等量の運動エネルギーでは、イオンの速度は質量に依存するため、したがって質量が測定されうる。ＴＯＦ分析器は非常に高いスキャン速度を有し、およびしたがって非常に高い分解能に達する。
【００３１】
ポリペプチドマーカーの存在および非存在の測定のための好ましい方法は、気相イオンスペクトル法、たとえばレーザー脱離／イオン化質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（表面増強レーザー脱離／イオン化）、ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー／質量分析）、２Ｄ−ＰＡＧＥ／ＭＳおよびキャピラリー電気泳動−質量分析（ＣＥ−ＭＳ）を含む。上記のすべての方法が当業者に公知である。
【００３２】
特に好ましい方法が、キャピラリー電気泳動が質量分析と組み合わされるＣＥ−ＭＳである。この方法は、たとえば、独国特許出願ＤＥ １００２１７３７に、カイゼル（Ｋａｉｓｅｒ）ら（Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ，２００３，Ｖｏｌ．１０１３： １５７−１７１，および Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２００４，２５： ２０４４−２０５５）に、およびウィトケ（Ｗｉｔｔｋｅ）ら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，２００３，１０１３： １７３−１８１）にある程度詳細に記載されている。ＣＥ−ＭＳ技術は、試料の数百のポリペプチドマーカーの存在および振幅を同時に短時間内におよび少量で高感度で測定することを可能にする。試料が測定された後、測定されたポリペプチドマーカーのパターンが作成される。このパターンは、患者または健常者の参照パターンと比較されうる。大部分の場合で、ＮＴｘ後の拒絶を認識するためには、限ら@0032
れた数のポリペプチドマーカーを使用するので十分である。ＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ装置にオンラインで連結されたＣＥを含むＣＥ−ＭＳ法がさらに好ましい。
【００３３】
ＣＥ−ＭＳのためには、揮発性溶媒の使用が好ましく、および本質的に塩を含まない条件下で最も良く働く。適した溶媒の例は、アセトニトリル、メタノールなどを含む。溶媒は、水で希釈されうるかまたは、分析物、好ましくはポリペプチドをプロトン化するために弱酸（たとえば、０．１％ないし１％ギ酸）と混合されうる。
【００３４】
キャピラリー電気泳動を用いて、分子を電荷およびサイズによって分離することが可能である。中性粒子は電流を加える際に電気浸透流動の速度で泳動し、一方で陽イオンは正極に向かって加速し、および陰イオンは遅延する。電気泳動におけるキャピラリーの長所は、体積に対する表面の比が有利なことにあり、これは電流フローの間に生じるジュール熱の良好な損失を可能にする。これは今度は高電圧（通常は最大３０ｋＶ）の付加を可能にし、およびそのようにして高い分離性能および短い分析時間を可能にする。
【００３５】
キャピラリー電気泳動では、典型的には５０ないし７５μｍの内径を有するシリカガラスキャピラリーが通常用いられる。使用される長さは３０ないし１００ｃｍである。加えて、キャピラリーは通常はプラスチック被覆シリカガラス製である。キャピラリーは、未処理、すなわち内表面上の親水基を曝露しているか、または内表面が被覆されているかの両方でありうる。疎水性コーティングは分解能を改善するために使用されうる。電圧に加えて、圧力もまた加えることができ、圧力は典型的には０ないし１ｐｓｉの範囲内である。圧力もまた、実施中にのみ加えることができるか、または途中で変化させることができる。
【００３６】
ポリペプチドマーカーの測定のための好ましい方法では、試料のマーカーはキャピラリー電気泳動を用いて分離され、次いで直接にイオン化され、および検出のために連結された質量分析計へオンラインで移送される。
【００３７】
本発明に記載の方法では、ＮＴｘ後の拒絶を認識するためにいくつかのポリペプチドマーカーを使用することが有利である。特に、たとえば、マーカー１、２および３；１、２および４；などといった、少なくとも３種類のポリペプチドマーカーが使用されうる。
【００３８】
より好ましいのは、少なくとも４、５または６種類のマーカーの使用である。
【００３９】
さらにより好ましいのは、少なくとも１０種類のマーカー、たとえば、マーカー１から１０の使用である。
【００４０】
非常に好ましいのは、表１および２に列記された７６７種類のマーカーすべての使用である。
【００４１】
いくつかのマーカーが用いられる場合にＮＴｘ後の拒絶の存在の確率を測定するためには、当業者に公知である統計的手法が使用されうる。たとえば、ワイシンガー（Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ）らによって記載されたランダムフォレスト法（Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．，２００４，６５： ２４２６−２４３４）が、Ｓ−プラスといったコンピュータープログラムを用いることによって使用されうる。
【実施例】
【００４２】
１．試料調製
ＮＴｘ後の拒絶を認識するためのポリペプチドマーカーを検出するために、尿を用いた。尿はＮＴｘ後の拒絶を有する患者から、およびＮＴｘ後の拒絶無しの患者（対照群）から採取された。
【００４３】
両方の群の患者についての移植時点での臨床データを下記の表５に示す：
表５：使用された患者の群についての移植中の臨床データ
【００４４】
以降のＣＥ−ＭＳ測定のために、アルブミンおよび免疫グロブリンといった、より高濃度で患者の尿に含まれるタンパク質は限外ろ過によって分離除去されなければならなかった。したがって、尿７００μｌを取り、および７００ｍｌのろ過緩衝液（２Ｍ尿素、１０ｍＭアンモニア、０．０２％ＳＤＳ）と混合した。この１．４ｍｌの試料量を限外ろ過した（２０ｋＤａ、ザルトリウス社（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）ドイツ、ゲッチンゲン（Ｇoｔｔｉｎｇｅｎ））。限外ろ過は３０００ｒｐｍにて遠心分離機で、限外ろ液１．１ｍｌが得られるまで実施された。
【００４５】
得られたろ液１．１ｍｌを次いで脱塩のためにＰＤ−１０カラム（アマシャム・バイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、スウェーデン、ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ））に加え、および０．０１％ＮＨ4ＯＨ水溶液２．５ｍｌで溶出し、および溶出液を続いて凍結乾燥した。ＣＥ−ＭＳ測定のために、ポリペプチドをその後、水（ＨＰＬＣグレード、メルク社（Ｍｅｒｃｋ））２０μｌで再懸濁した。
【００４６】
２．ＣＥ−ＭＳ測定
ＣＥ−ＭＳ測定は、ベックマン・コールター社のキャピラリー電気泳動システム（Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱシステム；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．，米国フラートン（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ））およびブルカーＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析計（ｍｉｃｒｏ−ＴＯＦＭＳ、ブルカー・ダルトニクス社（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ）、ドイツ、ブレーメン）を用いて実施された。
【００４７】
ＣＥキャピラリーはベックマン・コールター社から調達され、およびＩＤ／ＯＤ５０／３６０μｍおよび長さ９０ｃｍであった。ＣＥ分離のための移動相は、２０％アセトニトリルおよび０．２５Ｍギ酸を含む水から成った。ＭＳでの「シース流」用には、０．５％ギ酸を含む３０％イソプロパノールが流速２μｌ／分にて用いられた。ＣＥおよびＭＳの連結はＣＥ−ＥＳＩ−ＭＳスプレイヤー・キット（アジレント・テクノロジーズ社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ドイツ、ワルドブロン（Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ））によって実現された。
【００４８】
試料を注入するには、１ないし最大６ｐｓｉの圧力が加えられ、および注入の持続時間は９９秒であった。これらのパラメーターを用いて、試料約１５０ｎｌがキャピラリーに注入され、これは、キャピラリー体積の約１０％に相当する。キャピラリー中の試料を濃縮するためにスタッキング法が用いられた。このように、試料が注入される前に、１Ｍ ＮＨ3溶液が７秒間（１ｐｓｉにて）注入され、および試料が注入された後に、２Ｍギ酸溶液が５秒間注入された。分離電圧（３０ｋＶ）が加えられた後、分析物はこれらの溶液の間で自動的に濃縮された。
【００４９】
以降のＣＥ分離は圧力法を用いて実施された：０ｐｓｉにて４０分、次いで０．１ｐｓｉにて２分、０．２ｐｓｉにて２分、０．３ｐｓｉにて２分、０．４ｐｓｉにて２分、および最後に０．５ｐｓｉにて３２分。分離実行の合計時間はしたがって８０分であった。
【００５０】
ＭＳの側で可能な限り良好なシグナル強度を得るために、ネブライザーガスは可能な最低値に設定された。エレクトロスプレーを生じるためにスプレーニードルに加えられた電圧は３７００〜４１００Ｖであった。質量分析計でのその他の設定は、取扱説明書に従ってペプチド検出用に最適化された。スペクトルは質量範囲ｍ／ｚ４００からｍ／ｚ３０００に渡って記録され、および３秒毎に蓄積された。
【００５１】
３．ＣＥ測定用標準
ＣＥ測定を点検および較正するために、選択された条件下での記載のＣＥ泳動時間によって特徴づけられる下記のタンパク質またはポリペプチドが用いられた：
タンパク質／ポリペプチド ＣＥ泳動時間
アプロチニン（シグマ社（ＳＩＧＭＡ）、ドイツ・タウフキルヒェン（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ）、品番Ａ１１５３） ９．２分
リボヌクレアーゼ（シグマ社、ドイツ・タウフキルヒェン、品番Ｒ４８７５）１０．９分
リゾチーム（シグマ社、ドイツ・タウフキルヒェン、品番Ｌ７６５１） ８．９分
"ＲＥＶ"、配列：ＲＥＶＱＳＫＩＧＹＧＲＱＩＩＳ １５．６分
"ＥＬＭ"、配列：ＥＬＭＴＧＥＬＰＹＳＨＩＮＮＲＤＱＩＩＦＭＶＧＲ ２３．４分
"ＫＩＮＣＯＮ"、配列：ＴＧＳＬＰＹＳＨＩＧＳＲＤＱＩＩＦＭＶＧＲ ２０．０分
"ＧＩＶＬＹ"配列：ＧＩＶＬＹＥＬＭＴＧＥＬＰＹＳＨＩＮ ３６．８分
【００５２】
タンパク質／ポリペプチドはそれぞれ１０ｐｍｏｌ／μｌ水の濃度にて使用された。"ＲＥＶ"、 "ＥＬＭ"、 "ＫＩＮＣＯＮ"および"ＧＩＶＬＹ"は合成ペプチドである。
【００５３】
ペプチドの分子量およびＭＳで見られる各荷電状態のｍ／ｚ比を下記の表に列記する：
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子量および泳動時間（ＣＥ時間）について下記の値によって特徴づけられるポリペプチドマーカーがマーカー１ないし２４２（頻度マーカー）から選択される、試料中の少なくとも一つのポリペプチドマーカーの存在または非存在を測定する段階を含み、またはマーカー２４３ないし７６７（振幅マーカー）から選択される少なくとも一つのポリペプチドマーカーの振幅を測定する段階を含む、腎臓移植（ＮＴｘ）後の拒絶を認識するための方法：
【請求項２】
マーカー１ないし２４２の測定された存在または非存在の評価が下記の参照値を用いて実施される、請求項１に記載の方法：
【請求項３】
マーカー２４３ないし７６７の振幅の評価が下記の参照値を用いて実施される、請求項１に記載の方法：
または、
【請求項４】
請求項１で定義される少なくとも２種類または少なくとも３種類または少なくとも５種類または少なくとも１０種類またはすべてのポリペプチドマーカーが用いられる、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
被験者由来の試料が尿試料または血液試料（血清または血漿試料）である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
キャピラリー電気泳動、ＨＰＬＣ、気相イオンスペクトル法および／または質量分析が、一または複数のポリペプチドマーカーの存在または非存在を検出するのに用いられる、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
キャピラリー電気泳動が、ポリペプチドマーカーの分子量が測定される前に実施される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
質量分析が、一または複数のポリペプチドマーカーの存在または非存在を検出するのに用いられる、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＣＥ時間が、２０％アセトニトリル・０．２５Ｍギ酸水溶液が移動溶媒として用いられる付加電圧２５ｋＶにて長さ９０ｃｍおよび内径（ＩＤ）５０μｍのガラスキャピラリーに基づく点で特徴づけられる、請求項１から８のうち少なくとも一つに記載の方法。
【請求項１０】
ＮＴｘ後の拒絶を認識するための、分子量および泳動時間について下記の値によって特徴づけられるマーカー番号１ないし７６７から選択される少なくとも一つのポリペプチドマーカーの使用：
【請求項１１】
以下から選択される少なくとも3つのマーカーを含むマーカーの組み合わせ。
【請求項１】
分子量および泳動時間（ＣＥ時間）について下記の値によって特徴づけられるポリペプチドマーカーがマーカー１ないし２４２（頻度マーカー）から選択される、試料中の少なくとも一つのポリペプチドマーカーの存在または非存在を測定する段階を含み、またはマーカー２４３ないし７６７（振幅マーカー）から選択される少なくとも一つのポリペプチドマーカーの振幅を測定する段階を含む、腎臓移植（ＮＴｘ）後の拒絶を認識するための方法：
【請求項２】
マーカー１ないし２４２の測定された存在または非存在の評価が下記の参照値を用いて実施される、請求項１に記載の方法：
【請求項３】
マーカー２４３ないし７６７の振幅の評価が下記の参照値を用いて実施される、請求項１に記載の方法：
または、
【請求項４】
請求項１で定義される少なくとも２種類または少なくとも３種類または少なくとも５種類または少なくとも１０種類またはすべてのポリペプチドマーカーが用いられる、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
被験者由来の試料が尿試料または血液試料（血清または血漿試料）である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
キャピラリー電気泳動、ＨＰＬＣ、気相イオンスペクトル法および／または質量分析が、一または複数のポリペプチドマーカーの存在または非存在を検出するのに用いられる、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
キャピラリー電気泳動が、ポリペプチドマーカーの分子量が測定される前に実施される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
質量分析が、一または複数のポリペプチドマーカーの存在または非存在を検出するのに用いられる、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＣＥ時間が、２０％アセトニトリル・０．２５Ｍギ酸水溶液が移動溶媒として用いられる付加電圧２５ｋＶにて長さ９０ｃｍおよび内径（ＩＤ）５０μｍのガラスキャピラリーに基づく点で特徴づけられる、請求項１から８のうち少なくとも一つに記載の方法。
【請求項１０】
ＮＴｘ後の拒絶を認識するための、分子量および泳動時間について下記の値によって特徴づけられるマーカー番号１ないし７６７から選択される少なくとも一つのポリペプチドマーカーの使用：
【請求項１１】
以下から選択される少なくとも3つのマーカーを含むマーカーの組み合わせ。
【公表番号】特表２００８−５４５１３０（Ｐ２００８−５４５１３０Ａ）
【公表日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１８８２７（Ｐ２００８−５１８８２７）
【出願日】平成１８年６月２８日（２００６．６．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６３６３５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０００４６６
【国際公開日】平成１９年１月４日（２００７．１．４）
【出願人】（５０６０７４８０８）モザイクヴェス ディアグノシュティクス アンド テラポイティクス アクチェン ゲゼルシャフト (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月２８日（２００６．６．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６３６３５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０００４６６
【国際公開日】平成１９年１月４日（２００７．１．４）
【出願人】（５０６０７４８０８）モザイクヴェス ディアグノシュティクス アンド テラポイティクス アクチェン ゲゼルシャフト (6)
【Ｆターム（参考）】
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