種子発生期における胚／内乳のサイズの改変
【課題】 種子発生期における胚／内乳のサイズの改変
【解決手段】 種子発生期における胚／内乳のサイズを改変するための単離された核酸フラグメントおよびそのようなフラグメントを含んで成る組換え構築物を、植物の種子発生期における胚／内乳のサイズを制御する方法と共に開示する。
【解決手段】 種子発生期における胚／内乳のサイズを改変するための単離された核酸フラグメントおよびそのようなフラグメントを含んで成る組換え構築物を、植物の種子発生期における胚／内乳のサイズを制御する方法と共に開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００１年６月５日に出願された米国仮出願第６０／２５９，９２１号（その内容全体が参考として本明細書に援用される）および２００１年１１月２８日に出願された米国仮出願第６０／３３４，３１７号（その内容全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、植物の育種および遺伝学の分野にあり、特に、種子発生期における胚／内乳のサイズを改変するのに有用な組換え構築物に関する。
【背景技術】
【０００３】
デンプンおよびタンパク質の貯蔵器官としての内乳の最終容積は穀物における胚のサイズの影響を受けるため、発生過程の胚のサイズが遺伝的にどのようにして調節されるかを解明することは重要である。研究者らは、胚のサイズに関連する遺伝子が内乳の発生の調節に寄与することを見出している。穀物の内乳は多くの国において主食であるため、これらの遺伝子について調査することは農業に重要である。また、様々な穀粒の胚は油を含む多くの価値のある栄養素の供給源であるため、重要である。
【０００４】
巨大胚（ｇｅ）変異については、（非特許文献１）に最初に記載された。胚のサイズが増加すると、ヒトの消費に所望される胚の油および栄養特性の増加を生じるため、巨大胚変異は穀物の品質改善に潜在的に有用な特徴である。また、胚を増大させると、穀粒のプロセシングにおいてしばしば重要な特徴である胚関連酵素の活性が増加する。変異は第７染色体に遺伝子的にマッピングされ（（非特許文献２）、（非特許文献３））、さらなるｇｅ対立遺伝子も第７染色体に位置決定された（（非特許文献４））。ｇｅ変異は、形態的および遺伝子レベルで、（非特許文献５）により解析された。この刊行物は、適切な内乳の発生に必要なＧＥ遺伝子に関連した。内乳および胚のサイズの両方は変異の影響を受けるため、ＧＥは、発生期の内乳および胚の調和した増殖を制御するようである。ｇｅにおける胚および内乳の形態学的変化と並んで、ｇｅの種子は野生型と比べてよりも多くの油を蓄積することも明らかにされた（（非特許文献６）、（非特許文献７））。
【０００５】
ＧＥ遺伝子の機能消失により内乳組織を犠牲にして胚組織が増大することが明らかにされている。この発生過程の変化は、種子植物中の油などの胚特異的代謝物の量を増加するのに有用であり得る。ＧＥ遺伝子の広範な遺伝子および形態学的特徴にもかかわらず、このタンパク質をコードする核酸の分子解析はない。ＧＥによってコードされるタンパク質の正体については報告されていない。ＧＥ遺伝子、および該遺伝子がコードするタンパク質をより良好に理解することは、イネの胚のサイズを制御するプロセスを完全に理解するのに必要であろう。
【０００６】
【非特許文献１】サトウ（Ｓａｔｏｈ）およびオムラ（Ｏｍｕｒａ）著、Ｊａｐ．Ｊ．Ｂｒｅｅｄ．第３１巻、（１９８１年）、ｐ．３１６−３２６
【非特許文献２】イワタ（Ｉｗａｔａ）およびオムラ（Ｏｍｕｒａ）著、Ｊａｐａｎ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．第５９巻、１９８４年、ｐ．１９９−２０４
【非特許文献３】サトウ（Ｓａｔｏｈ）およびイワタ（Ｉｗａｔａ）著、Ｊａｐａｎ．Ｊ．Ｂｒｅｅｄ．第４０巻（補遺２）、１９９０年、ｐ．２６８−２６９
【非特許文献４】コウ（Ｋｏｈ）ら著、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．第９３巻、１９９６年、ｐ．２５７−２６１
【非特許文献５】ホン（Ｈｏｎｇ）ら著、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ第１２２巻、１９９４年、ｐ．２０５１−２０５８
【非特許文献６】マツオ（Ｍａｔｓｕｏ）ら著、Ｊａｐａｎ．Ｊ．Ｂｒｅｅｄ．第３７巻、１９８７年、ｐ．１８５−１９１
【非特許文献７】オクノ（Ｏｋｕｎｏ）著、「稲学大成（Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｉｃｅ Ｐｌａｎｔ）」第３巻、マツオ（Ｍａｔｓｕｏ）ら編、食料・農業政策研究センター（Ｆｏｏｄ ａｎｄ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ｐｏｌｉｃｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｅｎｔｅｒ）、日本、東京（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、１９９７年、ｐ．４３３−４３５
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、
（ａ）種子発生期（ｄｕｒｉｎｇ ｓｅｅｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号２、７、１１、１９、２７、もしくは３３から成る群より選択される第２のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法に基づいて少なくとも６１％のアミノ酸同一性を有する核酸配列、または
（ｂ）種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号１５、１７、３１、９３、９５、９７、もしくは９９から成る群より選択される第３のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル法に基づいて少なくとも６５％のアミノ酸同一性を有する核酸配列、または
（ｃ）種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号９、１３、２３、２９、３５、もしくは４１から成る群より選択される第４のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル法に基づいて少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有する核酸配列、または
（ｄ）種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号２１、２５、３７、もしくは３９から成る群より選択される第２のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル法に基づいて少なくとも７７％のアミノ酸同一性を有する核酸配列
から成る群より選択される核酸配列を含んで成る単離されたヌクレオチドフラグメントに関する。
【０００８】
また、そのような単離されたヌクレオチドフラグメントの相補体も対象となる。
【０００９】
第２の実施態様では、本発明は、配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、９３、９５、９７、もしくは９９に記載のアミノ酸配列のいずれかに実質的に相当する少なくとも１つのモチーフを含んで成るそのような単離されたヌクレオチド配列またはその相補体に関し、前記モチーフは保存された部分配列である。特に同定することができるそのようなモチーフの例を配列番号８０〜９１に示す。また、形質転換された植物のシトクロムＰ４５０活性のアンチセンス阻害もしくは相互抑制（ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）におけるそのようなフラグメントまたはその一部の使用も対象となる。
【００１０】
第３の実施態様では、本発明は、請求項１に記載のそのような単離されたヌクレオチドフラグメントまたはその相補体に関し、該フラグメントまたはその一部は、形質転換された植物のシトクロムＰ４５０活性のアンチセンス阻害もしくは相互抑制（ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）において有用である。
【００１１】
第４の実施態様では、本発明は、種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連する第１のポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る単離されたヌクレオチド配列フ
ラグメントに関し、前記ポリペプチドは、配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、９３、９５、９７、もしくは９９から成る群より選択される第２のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル法に基づいて少なくとも５０％、５５％、６０％、６１％、６５％、７０％、７５％、７７％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のアミノ酸同一性を有する。また、そのような配列の相補体も対象となる。
【００１２】
第５の実施態様では、本発明は、配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、９３、９５、９７、もしくは９９に記載のアミノ酸配列のいずれかに実質的に相当する少なくとも１つのモチーフを含んで成る単離されたヌクレオチド配列またはその相補体に関し、前記モチーフは保存された部分配列である。これらのフラグメントもしくは相補体またはいずれかの一部のいずれかが形質転換された植物のシトクロムＰ４５０活性のアンチセンス阻害もしくは相互抑制（ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）において有用であることができる。
【００１３】
第６の実施態様では、本発明は、プロモーターを含んで成る単離された核酸フラグメントに関し、前記プロモーターは配列番号３、４、１０４、もしくは１０５に記載のヌクレオチド配列から本質的に成るか、あるいは前記プロモーターは、配列番号３、４、１０４、もしくは１０５に記載のヌクレオチド配列に実質的に類似するかまたは機能的に等価であるフラグメントもしくはサブフラグメントから本質的に成る。
【００１４】
第７の実施態様では、本発明は、少なくとも１つの調節配列に操作可能に連結された前記核酸フラグメントもしくは相補体のいずれかまたはいずれかの一部を含んで成るキメラ構築物に関する。また、ゲノム中にそのようなキメラ構築物を含んで成る植物、そのような植物から得られる植物組織または細胞、これらの植物から得られる種子およびそのような種子から得られる油も対象となる。
【００１５】
第８の実施態様では、本発明は、
（ａ）本発明のキメラ構築物で植物を形質転換し、
（ｂ）キメラ構築物の発現に適切な条件下で形質転換された植物を成長させ、そして
（ｃ）改変された胚／内乳のサイズを有する種子を産生する前記形質転換された植物を選択する、
ことを含んで成る、植物の種子発生期における胚／内乳のサイズの制御方法に関する。
【００１６】
第９の実施態様では、本発明は、
（ａ）配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、９３、９５、９７、または９９と種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連する他のポリペプチド配列とを比較し、
（ｂ）工程（ａ）において得られる保存配列すなわち４つもしくはそれ以上のアミノ酸を同定し、
（ｃ）工程（ｂ）において同定される保存配列に基づいて領域特異的ヌクレオチドプローブまたはオリゴマーを作製し、そして
（ｄ）工程（ｃ）のヌクレオチドプローブまたはオリゴマーを使用して、配列依存性プロトコルにより種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連する配列を単離する、ことを含んで成る、種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するポリペプチドをコードする核酸フラグメントの単離方法に関する。
【００１７】
第１０の実施態様では、本発明はまた、
（ａ）２種の植物種を交雑させ、そして
（ｂ）工程（ａ）の交雑から得られる子孫植物における、
（ｉ）配列番号１、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、もしくは１０５から成る群より選択される核酸配列、または
（ｉｉ）配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、８０〜９１、９３、９５、９７、もしくは９９から成る群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列、
について遺伝子の変異を評価することを含んで成り、その際、評価を、ＲＦＬＰ解析、ＳＮＰ解析、およびＰＣＲに基づく解析から成る群より選択される方法を使用して行う、胚／内乳のサイズを制御することおよび／または植物の油表現型を改変することに関する遺伝子の変異のマッピング方法にも関する。
【００１８】
第１１の実施態様では、本発明は、
（ａ）２種の植物種を交雑させ、そして
（ｂ）工程（ａ）の交雑から得られる子孫植物における、
（ｉ）配列番号１、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、もしくは１０５から成る群より選択される核酸配列、または
（ｉｉ）配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、８０〜９１、９３、９５、９７、もしくは９９から成る群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列、
について遺伝子の変異を評価することを含んで成り、その際、評価を、ＲＦＬＰ解析、ＳＮＰ解析、およびＰＣＲに基づく解析から成る群より選択される方法を使用して行う、種子発生期において改変された胚／内乳のサイズおよび／または植物の改変された油表現型を得るための分子育種方法に関する。
【００１９】
本発明は、本出願の一部をなす下記の詳細な説明および添付の図面および配列表によりさらに完全に理解することができる。
【００２０】
表１は、本明細書で記述されるポリペプチド、これらのポリペプチドの全部または実質的な部分を表すポリペプチドをコードする核酸フラグメントを含んで成るゲノムまたはｃＤＮＡクローンの呼称、および添付の配列表において使用される対応する識別名（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）（配列番号）を列挙する。配列の記述およびそれに付属された配列表は、米国特許法施行規則第３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１〜１．８２５に示されるような、特許出願におけるヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列の開示に適用される規則に従う。
【００２１】
【表１】
【００２２】
【表２】
【００２３】
配列番号１および２は、それぞれ、変異した場合に巨大胚表現型を担うイネのシトクロムＰ４５０遺伝子に対する野生型オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ＤＮＡ配列および翻訳されたアミノ酸配列を表す。配列番号３は、９１ヌクレオチドイントロン（９２７３〜９３６３）によって中断されるＧＥ ＯＲＦ（ヌクレオチド位置８３０１〜９９６９）を含有する１７ｋｂのゲノムＤＮＡ配列を表す。配列番号４は、遺伝子に対するプロモーターおよびＧＥ ｍＲＮＡの５’非翻訳（ＵＴＲ）部分を含有するＧＥ ＯＲＦの上流の８３００ヌクレオチドを表す。配列番号５は、遺伝子の３’ＵＴＲおよびポリアデニル化配列を含有するＧＥ ＯＲＦの下流の７２２４ヌクレオチドを表す。ＧＥの他には、ブラスト（ＢＬＡＳＴ）相同性によって検出されるイネゲノムのこの１７ｋｂ領域内に含有される他の遺伝子は存在しなかった。配列番号８０〜９１は、ＧＥの機能的相同物である、シトクロムＰ４５０遺伝子を同定するのにさらに有用な保存された配列モチーフである。配列番号１０４および１０５は、それぞれ、トウモロコシ相同物ｚｍＧＥ１およびｚｍＧＥ２に対する上流プロモーター配列である（詳細については実施例１３を参照のこと）。
【００２４】
配列表は、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３０２１−３０３０（１９８５）およびＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ２１９（Ｎｏ．２）：３４５−３７３（１９８４）（参考として本明細書に引用される）に記述されるＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＭＢ標準に従って規定される通り、ヌクレオチド配列文字の１文字記号およびアミノ酸の３文字記号を含有する。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列データに使用される記号および形式は米国特許法施行規則第３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に示される規則に従う。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本明細書において使用される「単離された核酸フラグメント」は、一本鎖もしくは二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであり、必要に応じて、合成、非天然または改変されたヌクレオチド塩基を含有する。ＤＮＡのポリマーの形態の単離された核酸フラグメントは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントから成り得る。ヌクレオチド（通常、５’一リン酸の形で見出される）については、次の一文字呼称、つまり（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡに対する）アデニル酸またはデオキシアデニル酸は「Ａ」、シチジル酸またはデオキシシチジル酸は「Ｃ」、グアニル酸またはデオキシグアニル酸は「Ｇ」、ウリジル酸は「Ｕ」、デオキシチミジル酸は「Ｔ」、プリンは「Ｒ」（ＡまたはＧ）、ピリミジンは「Ｙ」（ＣまたはＴ）、ＧまたはＴは「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴは「Ｈ」、イノシンは「Ｉ」、および任意のヌクレオチドは「Ｎ」で呼ばれる。
【００２６】
用語「機能的に等価なサブフラグメント」および「機能的等価サブフラグメント」は、本明細書において交換可能に使用される。これらの用語は、フラグメントまたはサブフラグメントが活性な酵素をコードするか否かにかかわらず、遺伝子発現を改変または所定の
表現型を産生する能力が保持されている単離された核酸フラグメントの一部分または部分配列を指す。例えば、フラグメントまたはサブフラグメントは、所望する表現型を形質転換した植物内に産生するためのキメラ構築物の設計に使用することができる。キメラ構築物は、活性な酵素をコードするか否かにかかわらず、植物プロモーター配列に関係する適当な配向で、核酸フラグメントもしくはそのサブフラグメントを連結して相互抑制（ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）またはアンチセンス的に使用するために設計することができる。
【００２７】
用語「相同性」、「相同的」、「実質的に類似」および「実質的に対応」は、本明細書において交換可能に使用される。それらは、１個以上のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現を媒介または所定の表現型を産生するための核酸フラグメントの能力に影響を及ぼさない核酸フラグメントを指す。これらの用語はまた、得られた核酸フラグメントの機能的性質を、当初の改質されていないフラグメントと比較して、実質的に改変しない１個以上のヌクレオチドの欠失または挿入のような本発明の核酸フラグメントの改質をも指す。従って、本技術分野の熟練者であれば、本発明が、特定の例示配列以上のものも包含することを認めることが理解される。
【００２８】
さらに、熟練者は、本発明に包含される本質的に類似した核酸配列は、中程度のストリンジェント条件（例えば、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃）下において、本明細書において例示する配列か、または本明細書に報告したヌクレオチド配列ならびに本発明の遺伝子およびプロモーターに機能的に等価なヌクレオチド配列の任意の部分にハイブリダイズする能力によっても規定されることを認める。ストリンジェンシーな条件を調整して、遠い関係の生物体由来の相同配列などの中等度に類似のフラグメントから、近い関係の生物体由来の機能的酵素を複製する遺伝子などの、高度に類似のフラグメントまでをスクリーニングすることができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄はストリンジェンシー条件を決定する。１組の好適な条件は、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、室温、１５分間で開始し、次いで、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、４５℃、３０分間で反復し、次いで、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５０℃、３０分間を２回反復する一連の洗浄を使用する。より好適な組のストリンジェントな条件は、より高い温度を使用し、ここで洗浄は、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳによる最後の２回の３０分間の洗浄の温度を６０℃にまで上昇させたことを除いて、上記の洗浄と同一である。もう１つの好適な組の高度にストリンジェントな条件は、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で最後の２回の洗浄を使用する。
【００２９】
標的（内因性）ｍＲＮＡと、標的ｍＲＮＡに相同性を有する構築物におけるＲＮＡ領域との間の実質的な類似性の程度について、そのような配列は、少なくとも２５ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド長、より好ましくは１００ヌクレオチド長、さらに好ましくは２００ヌクレオチド長、最も好ましくは３００ヌクレオチド長であるべきであり、少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、最も好ましくは少なくとも９５％同一であるべきである。
【００３０】
配列の整列および類似性のパーセントの計算は、レーザージーン（ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ）生物情報工学コンピュータ計算ソフトウェアパッケージ（ＤＮＡスター社（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ））のメガラ
イン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラムを含むがこれに限定されない相同配列を検出するために設計された様々な比較方法を使用して決定することができる。配列の複数の整列は、デフォルトのパラメータ（ギャップ ペナルティ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ）＝１０、ギャップ長ペナルティ（ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ）＝１０）を用いるクラスタル整列方法（ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３）を使用して実施する。クラスタル法を使用する対にした
整列ならびにタンパク質配列の同一性パーセントの計算のためのデフォルトのパラメータは、ケチュプル（ＫＴＵＰＬＥ）＝ １、ギャップ ペナルティ（ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ）＝３、ウィンドウ（ＷＩＮＤＯＷ）＝５およびダイアゴナルズ セイブ
ド（ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ）＝５である。核酸の場合、これらのパラメータは
ケチュプル（ＫＴＵＰＬＥ）＝ ２、ギャップ ペナルティ（ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ）＝５、ウィンドウ（ＷＩＮＤＯＷ）＝４およびダイアゴナルズ セイブド（
ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ）＝４である。
【００３１】
「遺伝子」は、コーディング配列の前（５’非コーディング配列）および後（３’非コーディング配列）に調節配列を含む特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを指す。「生来の遺伝子」は、それ自体の調節配列と共に天然に見出されるような遺伝子を指す。「キメラ構築物」は、天然では通常は一緒に見出されない核酸フラグメントの組み合わせを指す。従って、キメラ構築物は、異なる起源に由来する調節配列およびコーディング配列、または同じ起源から由来するが、しかし天然に見出されるものとは異なる様式で配列される調節配列およびコーディング配列を含んでいてもよい。「外来」遺伝子は、宿主生物体内に通常は見出されない遺伝子を指すが、しかしこれは遺伝子導入により宿主生物体内に導入される。外来遺伝子は、非生来の生物体内に挿入された生来の遺伝子、またはキメラ構築物を含むことができる。「導入遺伝子」は、形質転換操作によりゲノム中に導入されている遺伝子である。
【００３２】
「コーディング配列」は特定のアミノ配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「調節配列」は、コーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、内、または下流（３’非コーディング配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または関連するコーディング配列の翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。調節配列として、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
「プロモーター」は、コーディング配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。プロモーター配列は、近接およびより遠位の上流エレメントから成り、後者のエレメントはしばしばエンハンサーと称される。従って、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することが可能でありかつプロモーターのレベルもしくは組織特異性を高めるように挿入されたプロモーターの先天的エレメントまたは異種エレメントであってもよいＤＮＡ配列である。プロモーターは、遺伝子の転写される部分内、および・または転写される配列の下流に位置することができる。プロモーターはそっくりそのまま生来の遺伝子に由来してよいか、または、天然に見出される多様なプロモーター由来の多様なエレメントから構成されてよいか、または合成ＤＮＡセグメントさえ含むことができる。多様なプロモーターは、多様な組織もしくは細胞タイプにおいて、あるいは発生の多様な段階で、または多様な環境条件に応答して、単離された核酸フラグメントの発現を指令することができることが、当業者により理解される。大部分の時点での大部分の細胞タイプにおいて単離された核酸フラグメントを発現させるプロモーターは普遍的に「構成性プロモーター」と称される。植物細胞中で有用な多様なタイプの新規プロモーターが常に発見されており；多数の例をオカムロおおびゴールドベルグの総説（Ｏｋａｍｕｒｏ
ａｎｄ Ｇｏｌｄｂｅｒｇ（１９８９），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ１５：１−８２）中に見出すことができる。大部分の場合で調節配列の正確な境界が完全に規定されていないため、一部分の変形を持つＤＮＡフラグメントは、同じプロモーター活性を有していることがあることもさらに認められている。
【００３４】
本発明の核酸フラグメントを発現させるのに有用であり得るプロモーターの特定の例としては、本出願に開示されているＧＥプロモーター（配列番号４）、オレオシンプロモーター（ＰＣＴ公開ＷＯ９９／６５４７９、１９９９年１２月１２日公開）、トウモロコシ
２７ｋＤゼインプロモーター（ウエダ（Ｕｅｄａ）ら（１９９４）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ１４：４３５０−４３５９）、ユビキチンプロモーター（クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）ら（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １８：６７５−６８０）、ＳＡＭシンテターゼ（ＰＣＴ公開ＷＯ００／３７６６２、２０００年６月２９日公開）、またはＣａＭＶ３５Ｓ（オデル（Ｏｄｅｌｌ）ら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
「イントロン」は、タンパク質配列の一部分をコードしていない遺伝子中に介在する配列である。従って、この配列はＲＮＡ中に転写はされるが、しかし切り取られて翻訳されない。この用語はまた、切除されたＲＮＡ配列についても使用される。「エキソン」は、転写され、遺伝子に由来する成熟したメッセンジャーＲＮＡ中に見いだされるが、しかし必ずしも最終の遺伝子産物をコードする配列の一部分とはならない。
【００３６】
「翻訳リーダー配列」は、遺伝子のプロモーター配列とコーディング配列との間に配置されるＤＮＡ配列を指す。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列の上流の完全にプロセシングされたｍＲＮＡ中に存在する。翻訳リーダー配列は、一次転写物のｍＲＮＡへのプロセシング、ｍＲＮＡの安定性または翻訳効率に影響を及ぼすことができる。翻訳リーダー配列の例は記述されている（ターナー（Ｔｕｒｎｅｒ）およびフォスター（Ｆｏｓｔｅｒ）（１９９５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：２２５）。
【００３７】
「３’非コーディング配列」は、コーディング配列の下流に配置されるＤＮＡ配列を指し、かつ、ポリアデニル化認識配列、およびｍＲＮＡのプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことが可能な調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’端へのポリアデニル酸領域（ｔｒａｃｔ）の付加に影響を及ぼすことを特徴とする。多様な３’非コーディング配列の使用がインゲルベルヒト（Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ）ら（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ１：６７１−６８０により例示されている。
【００３８】
「ＲＮＡ転写物」はＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼに触媒される転写から生じる産物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と称されるか、またはそれは一次転写物の転写後プロセシング由来のＲＮＡ配列であることができ、そして成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンを含まずかつ細胞によりタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」はｍＲＮＡテンプレートに相補的でありかつ酵素である逆転写酵素を使用してｍＲＮＡテンプレートから合成されるＤＮＡを指す。ｃＤＮＡは一本鎖であり得るかまたはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて二本鎖に転換することもできる。「センス−ＲＮＡ」は、ｍＲＮＡを含み、そして、細胞内またはインビトロでタンパク質に翻訳させることができるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的の一次転写物もしくはｍＲＮＡの全部または一部に相補的でありかつ標的である単離された核酸フラグメントの発現を阻止するＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、すなわち５’非コーディング配列、３’非コーディング配列、イントロンまたはコーディング配列での特異的な遺伝子転写物のいずれかの部分であることができる。「機能的ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡまたは翻訳されなくてもよいが、しかし細胞の過程に対する影響をなお有し得る他のＲＮＡを指す。用語「相補的」および「逆相補的」は、ｍＲＮＡ転写物について本明細書において交換可能に使用され、メッセンジャーのアンチセンスＲＮＡを規定することを意味する。
【００３９】
用語「内因性ＲＮＡ」は、天然に存在するかまたは非天然に存在する（即ち、組換え手段、変異誘発などによって導入されている）かにかかわらず、本発明の組換え構築物による組換え前の宿主のゲノムに存在する任意の核酸配列によってコードされる任意のＲＮＡ
を指す。
【００４０】
用語「非天然に存在する」とは、天然において通常に見出されるものには一致しない人工物を意味する。
【００４１】
用語「操作可能に連結している」は、一方の機能が他方により調節されるような単一核酸フラグメント上の核酸配列の対合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を指す。例えば、プロモーターがコーディング配列の発現を調節することができる（即ち、コーディング配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、プロモーターはコーディング配列に操作可能に連結している。コーディング配列はセンスまたはアンチセンスの配向で調節配列に操作可能に連結することができる。別の例では、本発明の相補ＲＮＡ領域は、標的ｍＲＮＡの５’側、もしくは標的ｍＲＮＡの３’側、もしくは標的ｍＲＮＡ内に直接的かまたは間接的に操作可能に連結することができ、あるいは、第１の相補領域は、標的ｍＲＮＡの５’側であり、その相補体は３’側である。
【００４２】
本明細書において使用される用語「発現」は、機能的最終産物の産生を指す。単離された核酸フラグメントの発現は、単離された核酸フラグメントの転写および前駆体または成熟タンパク質への翻訳に関与する。「アンチセンス阻害」は、標的タンパク質の発現を抑制することが可能であるアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を指す。「相互抑制」は、同一または実質的に類似する外来または内因性遺伝子の発現を抑制することが可能であるセンスＲＮＡ転写物の産生を指す（米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。
【００４３】
「成熟」タンパク質は、転写後にプロセシングされたポリペプチド、即ち、一次翻訳産物中に存在するいかなるプレペプチドもしくはプロペプチドもそれから除去されているものを指す。「前駆体」タンパク質は、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物、即ち、プレペプチドおよびプロペプチドがなお存在するものを指す。プレペプチドおよびプロペプチドは、限定されるものでないが細胞内局在化シグナルであることができる。
【００４４】
「安定な形質転換」は、遺伝的に安定な遺伝を生じる核およびオルガネラゲノムの両方を含む宿主ゲノムへの核酸フラグメントの移入を指す。対照的に、「一過性形質転換」は、組込みもしくは安定な遺伝を伴わない遺伝子発現を生じる宿主生物体の核、またはＤＮＡ含有オルガネラへの核酸の移入を指す。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物体は「トランスジェニック」生物体と称される。イネ、トウモロコシおよび他の単子葉植物の細胞形質転換の好適な方法は、粒子加速または「遺伝子銃」形質転換技術（クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら、（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン（Ｌｏｎｄｏｎ））３２７：７０−７３；米国特許第４，９４５，０５０号明細書）、または導入遺伝子を含有する適切なＴｉプラスミドを使用するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介法（イシダ（Ｉｓｈｉｄａ Ｙ．）ら、１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：７４５−７５０）の使用である。本明細書において使用される用語「形質転換」は、安定な形質転換および一過性形質転換の両方を指す。
【００４５】
本明細書で使用される標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野で周知であり、かつ、サンブルックＪ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッシュＥ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティスＴ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）：コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、１９８９（以下「サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）」）に、より詳細に記述される。
【００４６】
用語「組換え体」は、例えば、化学合成または遺伝子操作による核酸の単離されたセグメントの操作による２つの異なる分離されたセグメントの配列の人工的な組み合わせを指す。
【００４７】
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、一連の反復サイクルから成る、大量の特定ＤＮＡセグメントの合成のための技術である（パーキン・エルマー・シータス・インスツルメンツ（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、コネチカット州ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＹ））。代表的には、二本鎖ＤＮＡを加熱変性し、標的セグメントの３’境界に相補的な２つのプライマーを低温でアニーリングし、次いで中間的な温度で延伸する。これらの３段の連続工程の１組が１サイクルを成す。
【００４８】
ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）は、短期間でテンプレートの複製を反復することによって、ＤＮＡを１００万倍に増幅するために使用される強力な技術である。（ミュリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら著、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３−２７３（１９８６）；アーリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）らによる欧州特許出願第５０，４２４号明細書；欧州特許出願第８４，７９６号明細書；欧州特許出願第２５８，０１７号明細書；欧州特許出願第２３７，３６２号明細書；ミュリス（Ｍｕｌｌｉｓ）による欧州特許出願第２０１，１８４号明細書、ミュリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らによる米国特許第４，６８３，２０２号明細書；アーリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）による米国特許第４，５８２，７８８号明細書；およびサイキ（Ｓａｉｋｉ）らによる米国特許第４，６８３，１９４号明細書）。プロセスは、ＤＮＡ合成を用意するために、特異的にインビトロ合成されたオリゴヌクレオチドの組を利用する。プライマーの設計は、解析を所望するＤＮＡの配列に依存する。該技術は、高温でテンプレートを融解し、テンプレート内の相補配列にプライマーをアニールさせ、次いで、ＤＮＡポリメラーゼでテンプレートを複製する（通常２０〜５０の）多くのサイクルを介して行われる。
【００４９】
ＰＣＲ反応の産物は、アガロースゲル中での分離、続いて臭化エチジウム染色およびＵＶ透過による可視化によって分析される。あるいは、産物に標識を組み入れるために、放射性ｄＮＴＰをＰＣＲに添加することもできる。この場合、ＰＣＲの産物はゲルのＸ線フィルムへの暴露によって可視化される。放射性標識ＰＣＲ産物のさらなる利点は、個々の増幅産物のレベルを定量することができることである。
【００５０】
用語「組換え構築物」、「発現構築物」および「組換え発現構築物」は、本明細書において交換可能に使用される。これらの用語は、当業者に周知の標準的方法論を使用して、細胞のゲノムに挿入することができる遺伝子材料の機能的単位を指す。そのような構築物はそれ自体であってもよく、またはベクターと組み合わせて使用してもよい。ベクターを使用する場合、ベクターの選択は、当業者に周知である宿主植物を形質転換するために使用する方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。熟練者は本発明の単離された核酸フラグメントのいずれかを含む宿主細胞を首尾よく形質転換、選択および増殖させるために、ベクター上に存在すべき遺伝子エレメントを良く知っている。熟練者はまた、異なる独立した形質転換事象が、発現の異なるレベルおよびパターンとなり（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：２４１１−２４１８；デ・アルメイダ（Ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａ）ら、（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ２１８：７８−８６）、従って望ましい発現レベルおよびパターンを示す株を得るために多重事象をスクリーニングしなければならないことを認めるであろう。かかるスクリーニングは、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のウエスタン分析、または表現型分析により達成できる。
【００５１】
植物における相互抑制構築物は、センス配向で内因性ＲＮＡに相同性を有する核酸配列
の過剰発現に集束することによって、先に設計されており、該構築物は、過剰発現された配列に相同性を有する全てのＲＮＡを減少させる（バウヘレット（Ｖａｕｃｈｅｒｅｔ）ら（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｊ１６：６５１−６５９；およびグラ（Ｇｕｒａ）（２０００）Ｎａｔｕｒｅ４０４：８０４−８０８）。この現象の全体的効率は低く、ＲＮＡの減少の程度は広範に変動する。最近の研究では、発現されたＲＮＡに対し潜在的「ステム−ループ」構造を生じる相補的配向でｍＲＮＡをコードする配列の全部、または一部を組み入れる「ヘアピン」構造の使用に関する記載がある（ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５３０５０、１９９９年１０月２１日公開）。これは、回収されたトランスジェニック植物における相互抑制の頻度を増加する。もう１つのバージョンは、近位ｍＲＮＡをコードする配列の抑制、または「サイレンシング」を指令するための植物ウイルスの配列の使用について記載している（ＰＣＴ公開ＷＯ９８／３６０８３、１９９８年８月２０日公開）。最近の遺伝子レベルの根拠によりこの複雑な状況の解明が始められたが、これらの相互抑制減少は両方ともその機構が解明されていない（エルマヤン（Ｅｌｍａｙａｎ）ら（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ１０：１７４７−１７５７）。
【００５２】
植物のシトクロムＰ４５０酵素は、植物における様々な化合物の酸化的代謝を担うＮＡＤＰＨ依存性モノオキシゲナーゼである。シトクロムＰ４５０は、一酸化炭素の存在下で４５０ｎｍで最大の独特な吸収スペクトルを担うヘム−チオラート錯体と呼ばれる鉄−イオウ配位子を含有する。動物系では、Ｐ４５０酵素は、肝臓における解毒経路、所定の発ガン性化合物の不活化および活性化、ならびに薬物およびホルモンの代謝を担う。植物では、シトクロムＰ４５０ファミリーは、除草剤の代謝、二次代謝、および傷害応答を担うがこれらに限定されない。
【００５３】
驚くべきことに、イネのシトクロムＰ４５０遺伝子の単一変異は、種子発生期における胚／内乳のサイズの改変を生じることができることが見出されている。この遺伝子は巨大胚（Ｇｉａｎｔ Ｅｍｂｒｙｏ）（ＧＥ）と命名されている。該遺伝子の機能を阻害すると、内乳組織の部分を犠牲にして、胚組織の拡大が生じる。従って、ＧＥ遺伝子およびタンパク質産物は、組織に対しネガティブおよびポジティブの両方で依存する増殖を調節することができる。胚が拡大されると、高含有量の油などの価値のある成分を有する種子を生じる。イネのＧＥ配列を有するジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）の調査により、相同であると思われる植物由来の多くの遺伝子が発掘されている。
【００５４】
「巨大胚様シトクロムＰ４５０」ポリペプチドは、イネＧＥポリペプチドに対し配列および／または機能的類似性を供給する他の植物由来のそれらの酵素を包含する。そのようなポリペプチドは、シトクロムＰ４５０ファミリーのサブセットを含むこと、およびこのメンバーの発現における改変は胚のサイズに影響を及ぼすことが考えられる。
【００５５】
「モチーフ」または「部分配列」は、より長い配列の一部を含む核酸またはアミノ酸の保存された配列の短い領域を指す。例えば、そのような保存された部分配列（例えば、配列番号８０〜９１）は機能に対し重要であり、植物におけるＧＥ様シトクロムＰ４５０の新規の相同物を同定するために使用することが可能であると予想される。エレメントのいくつかまたは全部はＧＥ相同物において見出すことができることが予想される。また、与えられた任意のモチーフにおける１または２個の保存されたアミノ酸は、真のＧＥ相同物において異なることも予想される。
【００５６】
従って、１つの局面では、本発明は、
（ａ）種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号２、７、１１、１９、２７、もしくは３３から成る群より選択される第２のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル法に基づいて少なくとも６１％のアミノ酸同一性を有する、核酸配列、または
（ｂ）種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号１５、１７、３１、９３、９５、９７、もしくは９９から成る群より選択される第３のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル法に基づいて少なくとも６５％のアミノ酸同一性を有する、核酸配列、または
（ｃ）種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号９、１３、２３、２９、３５、もしくは４１から成る群より選択される第３のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル法に基づいて少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有する、核酸配列、または
（ｄ）種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号２１、２５、３７、もしくは３９から成る群より選択される第２のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル法に基づいて少なくとも７７％のアミノ酸同一性を有する、核酸配列から成る群より選択される核酸配列を含んで成る、単離されたヌクレオチドフラグメントに関する。
【００５７】
多くのレベルの配列同一性が、関連するポリペプチド配列を同定するのに有用であることが、当業者によって良好に理解されている。同一性パーセントの有用な例には、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、または５５％〜１００％の任意の整数の百分率がある。
【００５８】
また、この単離されたヌクレオチドフラグメントの相補体も対象となる。
【００５９】
単離された核酸配列またはその相補体はまた、配列番号８０〜９１に記載のアミノ酸配列のいずれかに実質的に対応する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のモチーフを含むこともでき、ここで、前記モチーフは保存された配列である。もう１つの局面では、この単離されたヌクレオチドフラグメントもしくはその相補体（それらが上記のモチーフを含むか含まないかにかかわらず）または該フラグメントもしくはその相補体の一部を、形質転換された植物におけるシトクロムＰ４５０活性のアンチセンス阻害あるいは相互抑制に使用することができる。さらなる実施態様は、種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドを同定するために使用される配列番号８０〜９１に記載のアミノ酸配列のいずれかに実質的に対応する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のモチーフを含むことが理解される。
【００６０】
アンチセンス阻害または相互抑制のプロトコルは当業者に周知であり、上に記載されている。
【００６１】
なおさらなる局面では、本発明は、プロモーターを含んで成る単離された核酸フラグメントであって、ここで、前記プロモーターは、配列番号３、４、１０４、もしくは１０５に記載のヌクレオチド配列から本質的に成るか、あるいは前記プロモーターは、配列番号３、４、１０４、もしくは１０５に記載のヌクレオチド配列に実質的に類似するかまたは機能的に等価であるフラグメントまたはサブフラグメントから本質的に成る、単離された核酸フラグメントに関する。
【００６２】
また、少なくとも１つの調節配列に操作可能に連結された上記で同定された単離された核酸フラグメントもしくはその相補体のいずれかまたはそのようなフラグメントもしくは相補体の一部を含んで成るキメラ構築物も対象となる。
【００６３】
ゲノム中にそのようなキメラ構築物を含んで成る植物、植物組織または細胞もまた、本発明の範囲内にある。形質転換方法は当業者に周知であり、上に記載されている。いずれ
の植物、双子葉植物または単子葉植物は、そのようなキメラ構築物で形質転換することができる。
【００６４】
単子葉植物の例としては、トウモロコシ、コムギ、イネ、モロコシ、キビ、オオムギ、ヤシ、ユリ、アルストロメリア（Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ）、ライムギ、およびカラスムギが挙げられるが、これらに限定されない。双子葉植物の例としては、ダイズ、ナタネ、ヒマワリ、カノーラ、ブドウ、グアユール、オダマキ、ワタ、タバコ、エンドウ、豆類、アマ、ベニバナ、アルファルファが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
植物組織は分化および未分化の組織または植物を含み、根、幹、苗条、葉、花粉、種子、腫瘍組織、ならびに単一細胞、原形質、胚、およびカルス組織などの様々な形態の細胞および培養物を含む。植物組織は、植物または器官中であってもよく、組織もしくは細胞培養物であってもよい。
【００６６】
そのような植物から得られる種子およびこれらの種子から得られる油も本発明の範囲内にある。
【００６７】
もう１つの局面において、本発明は、
（ａ）本発明のキメラ構築物で植物を形質転換し、
（ｂ）キメラ構築物の発現に適した条件下で形質転換された植物を成長させ、そして
（ｃ）改変された胚／内乳のサイズを有する種子を産生する上記形質転換された植物を選択する、
ことを含んで成る、種子発生期における胚／内乳のサイズの制御方法に関する。
【００６８】
単一植物プロトプラスト形質転換体または様々な形質転換された外植片由来の植物の再生、発生、および培養については、当該分野において周知である（バイスバッハ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）およびバイスバッハ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）編：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ
Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、アカデミック出版社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、（１９８８））。この再生および成長プロセスは、典型的に、形質転換された細胞の選択、発根した小植物体の段階を介する胚の発生期の通常の段階を介してそれらの個別化された細胞を培養することを含む。トランスジェニック胚および種子も同様に再生される。得られるトランスジェニック発根茎は、その後、土壌などの適切な植物培養培地に移植される。
【００６９】
目的のタンパク質をコードする外来、外因性の単離された核酸フラグメントを含有する植物の発達または再生は、当該分野において周知である。好ましくは、再生植物は、ホモ接合トランスジェニック植物を提供するために自家受粉される。そうでなければ、再生植物から得られる花粉は、作物学的に重要な株の種子繁殖植物と交雑される。対照的に、これらの重要な株の植物由来の花粉を使用して、再生植物に受粉する。所望のポリペプチドを含有する本発明のトランスジェニック植物は、当業者に周知の方法を使用して培養される。
【００７０】
植物組織由来の植物の再生のための様々な方法が存在する。
【００７１】
再生の特定の方法は、開始植物組織および再生しようとする特定の植物種に依存する。
【００７２】
主にアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の使用によって双子葉植物を形質転換し、トランスジェニック植物を得るための方法は、ワタ（米国特許第５，００４，８６３号明細書、米国特許第５，１５９，１３５号明細書、米国特許第５，５１８，９
０８号明細書）；ダイズ（米国特許第５，５６９，８３４号明細書、米国特許第５，４１６，０１１号明細書、マックカベ（ＭｃＣａｂｅ）ら、ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：９２３（１９８８）、クリストウ（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１−６７４（１９８８））；アブラナ（米国特許第５，４６３，１７４号明細書）；ピーナツ（チェング（Ｃｈｅｎｇ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１５：６５３−６５７（１９９６）、マックケントリー（ＭｃＫｅｎｔｌｙ）ら、Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１４：６９９−７０３（１９９５））；パパイヤ；およびエンドウ（グラント（Ｇｒａｎｔ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１５：２５４−２５８，（１９９５））について公開されている。
【００７３】
エレクトロポレーション、粒子衝撃、およびアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を使用する単子葉植物の形質転換についても報告されている。形質転換および植物再生は、アスパラガス（バイテビア（Ｂｙｔｅｂｉｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８４：５３５４、（１９８７））；オオムギ（ワン（Ｗａｎ）およびレマックス（Ｌｅｍａｕｘ）、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ１０４：３７（１９９４））；ジー・メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）（ローデス（Ｒｈｏｄｅｓ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：２０４（１９８８）、ゴルドン−カム（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ２：６０３−６１８（１９９０）、フロム（Ｆｒｏｍｍ）ら、ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：８３３（１９９０）、コジール（Ｋｏｚｉｅｌ）ら、ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１：１９４，（１９９３）、アームストロング（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ）ら、Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ３５：５５０−５５７（１９９５））；カラスムギ（ソメルズ（Ｓｏｍｅｒｓ）ら、ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：１５ ８９（１９９２））；カモガヤ（ホルン（Ｈｏｒｎ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．７：４６９（１９８８））；イネ（トリヤマ（Ｔｏｒｉｙａｍａ）ら、ＴｈｅｏｒＡｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．２０５：３４，（１９８６）；パート（Ｐａｒｔ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：１１３５−１１４８，（１９９６）；アベディニア（Ａｂｅｄｉｎｉａ）ら、Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２４：１３３−１４１（１９９７）；ジャン（Ｚｈａｎｇ）およびウ（Ｗｕ）、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７６：８３５（１９８８）；ジャン（Ｚｈａｎｇ）らＰｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．７：３７９，（１９８８）；バッテロー（Ｂａｔｔｒａｗ）およびホール（Ｈａｌｌ）、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．８６：１９１−２０２（１９９２）；クリストウ（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：９５７（１９９１））；ライムギ（デ・ラ・ペネ（Ｄｅ ｌａ Ｐｅｎａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３２５：２７４（１９８７））；サトウキビ（ボーウェル（Ｂｏｗｅｒ）およびビルヒ（Ｂｉｒｃｈ）、Ｐｌａｎｔ Ｊ．２：４０９（１９９２））；ヒロハノウシノケグサ（ワン（Ｗａｎｇ）ら、ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：６９１（１９９２））、ならびにコムギ（バシル（Ｖａｓｉｌ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：６６７（１９９２）；米国特許第５，６３１，１５２号明細書）において達成されている。
【００７４】
クローニングされた核酸構築物の一過性発現に基づく遺伝子発現のためのアッセイは、ポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーション、または粒子衝撃により植物細胞に核酸分子を導入することによって、開発されている（マルコッティ（Ｍａｒｃｏｔｔｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３３５：４５４−４５７（１９８８）；マルコッティ（Ｍａｒｃｏｔｔｅ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：５２３−５３２（１９８９）；マッカルティ（ＭｃＣａｒｔｙ）ら、Ｃｅｌｌ６６：８９５−９０５（１９９１）；ハットリ（Ｈａｔｔｏｒｉ）ら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．６：６０９−６１８（１９９２）；ゴフ（Ｇｏｆｆ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ．９：２５１７−２５２２（１９９０））。
【００７５】
一過性発現形を使用して、単離された核酸フラグメント構築物を機能的に詳細に分析することができる（一般に、マリガ（Ｍａｌｉｇａ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎ
ｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、コールド・スプリング・ハーバー出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）（１９９５）を参照のこと）。ベクター、プロモーター、エンハンサーなどの他の遺伝子エレメントと組み合わせて、永久的または一過的様式で、本発明の核酸分子のいずれをも植物細胞に導入することができる。
【００７６】
上記の考察された手順に加えて、実施者は、高分子（例えば、ＤＮＡ分子、プラスミドなど）の構築、操作および単離、組換え生物体の作製ならびにクローンのスクリーニングおよび単離のための特定の条件および手順について記載している標準的な供給源材料をよく知っている（例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）（１９８９）；マリガ（Ｍａｌｉｇａ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、コールド・スプリング・ハーバー出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）（１９９５）；ビレン（Ｂｉｒｒｅｎ）ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ，１、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９９８）；ビレン（Ｂｉｒｒｅｎ）ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ＤＮＡ，２、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９９８）；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、クラーク（Ｃｌａｒｋ）編、ニューヨーク州スプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９９７）を参照のこと）。
【００７７】
なおさらなる局面では、本発明は、
（ａ）配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、９３、９５、９７、または９９と種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連する他のポリペプチド配列とを比較し、
（ｂ）工程（ａ）において得られる保存配列すなわち４つもしくはそれ以上のアミノ酸を同定し、
（ｃ）工程（ｂ）において同定される保存配列に基づいて領域特異的ヌクレオチドプローブまたはオリゴマーを作製し、そして
（ｄ）工程（ｃ）のヌクレオチドプローブまたはオリゴマーを使用して、配列依存性プロトコルにより種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連する配列を単離する、ことを含んで成る、種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するポリペプチドをコードする核酸フラグメントの単離方法に関する。
【００７８】
種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連する他の植物配列を同定するのに有用である保存された配列エレメントは、配列番号８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、または９１のポリペプチドをコードするヌクレオチドを含んで成るがそれらに限定されない群において見出すことができる。
【００７９】
もう１つの局面では、本発明はまた、
（ａ）２種の植物種を交雑させ、そして
（ｂ）工程（ａ）の交雑から得られる子孫植物における、
（ｉ）配列番号１、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、もしくは１０５から成る群より選択される核酸配列、または
（ｉｉ）配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４
７、８０〜９１、９３、９５、９７、もしくは９９から成る群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列、
について遺伝子の変異を評価することを含んで成り、その際、評価を、ＲＦＬＰ解析、ＳＮＰ解析、およびＰＣＲに基づく解析から成る群より選択される方法を使用して行う、種子発生期における胚／内乳のサイズを制御することおよび／または植物の油表現型を改変することに関する遺伝子の変異のマッピング方法にも関する。
【００８０】
もう１つの実施態様では、本発明は、
（ａ）２種の植物種を交雑させ、そして
（ｂ）工程（ａ）の交雑から得られる子孫植物における、
（ｉ）配列番号１、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、もしくは１０５から成る群より選択される核酸配列、または
（ｉｉ）配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、８０〜９１、９３、９５、９７、もしくは９９から成る群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列、
について遺伝子の変異を評価することを含んで成り、その際、評価を、ＲＦＬＰ解析、ＳＮＰ解析、およびＰＣＲに基づく解析から成る群より選択される方法を使用して行う、種子発生期における改変された胚／内乳のサイズおよび／または植物の改変された油表現型を得るための分子育種方法に関する。
【００８１】
用語「遺伝子の変異をマッピングする」または「遺伝子の変異性をマッピングする」は交換可能に使用され、異なる植物株、栽培変種、変種、科、または種間で識別する遺伝子領域内のＤＮＡ配列の変化（天然かもしくは誘導された原因由来にかかわらず）を同定するプロセスを規定する。より小さな塩基の変化による特定の座位（遺伝子）での遺伝子の変異性は、作製され得る制限酵素消化フラグメントのパターンを改変することができる。遺伝子型に対する病原性改変も、解析している遺伝子内の欠失または挿入あるいは制限酵素認識部位を作製もしくは削除することができる一ヌクレオチド置換により可能である。ＲＦＬＰ解析はこれを使用し、目的の単離されたヌクレオチドフラグメントに対応するプローブによるサザンブロッティングを利用する。
【００８２】
従って、多型（即ち、遺伝子またはＤＮＡのセグメントに通常存在する変異；また、同一種における遺伝子（対立遺伝子）のいくらかの形態の存在）が制限エンドヌクレアーゼ切断部位を作製もしくは破壊する場合か、あるいは該多型がＤＮＡの消失または挿入を生じる（例えば、可変性縦列重複配列数（ＶＮＴＲ）多型）場合、該多型は、制限エンドヌクレアーゼによる消化によって作製されるＤＮＡフラグメントのサイズまたはプロフィールを改変する。従って、変異配列を有する個体は、制限フラグメント分析によって、本来の配列を有する個体と区別することができる。この様式で同定することができる多型は、「制限酵素断片長多型」（「ＲＦＬＰ」）と称される。ＲＦＬＰは、ヒトおよび植物遺伝子解析において広範に使用されている（グラスベルグ（Ｇｌａｓｓｂｅｒｇ）英国特許出願第２１３５７７４号明細書；スコルニック（Ｓｋｏｌｎｉｃｋ）ら、Ｃｙｔｏｇｅｎ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．３２：５８−６７（１９８２）；ボットステイン（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ）ら、Ａｎｎ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３２：３１４−３３１（１９８０）；フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）ら（ＰＣＴ出願ＷＯ９０／１３６６８；ユーレン（Ｕｈｌｅｎ）、ＰＣＴ出願ＷＯ９０／１１３６９）。
【００８３】
「一ヌクレオチド多型」または「ＳＮＰ」の中心的特性は、多型の部位が単一のヌクレオチドに存在することである。ＳＮＰは、ＲＦＬＰまたはＶＮＴＲについて所定の報告された利点を有する。第１に、ＳＮＰは、他のクラスの多型よりも安定である。それらの自
発的変異率は約１０−９（コーンベルグ（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ）、ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｗ．Ｈ．フリードマン＆ Ｃｏ．（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．）、サンフランシスコ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、１９８０）であり、ＶＮＴＲよりも約１０００倍低い（米国特許第５，６７９，５２４号明細書）。第２に、ＳＮＰはより高頻度で発生し、ＲＦＬＰおよびＶＮＴＲよりも均一性が高い。ＳＮＰは配列の変異から生じるため、新規の多型はランダムゲノムまたはｃＤＮＡ分子を配列決定することによって同定することができる。ＳＮＰはまた、欠失、点変異および挿入からも生じ得る。原因が何であれ、いずれの位置塩基改変もＳＮＰと成り得る。ＳＮＰの頻度が大きいほど、ＳＮＰは、他のクラスの多型よりも容易に同定することができる。
【００８４】
ＳＮＰは、多様な方法のいずれかを使用して特徴付けることができる。そのような方法には、部位の直接的または間接的配列決定、制限酵素の使用（ここで、部位のそれぞれの対立遺伝子は制限部位を作製もしくは破壊する）、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションプローブの使用、多型の異なる対立遺伝子もしくは他の生化学的解釈によってコードされるタンパク質に特異的である抗体の使用が含まれる。ＳＮＰは、多くの方法によって配列決定することができる。ＤＮＡ配列決定に次の２つの基本的方法を使用することができる、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）７４：５４６３−５４６７（１９７７）のチェーンターミネーター法、およびマキサム（Ｍａｘａｍ）およびギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）７４：５６０−５６４（１９７７）の化学分解法。
【００８５】
さらに、リガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）およびＰＣＲ−一本鎖コンホメーション多型（「ＰＣＲ−ＳＳＣＰ」）解析などの修飾されたＰＣＲ技術によって、単一点変異を検出することができる。ＰＣＲ技術を使用して、極端に小さな材料サンプル（例えば、生体由来の組織または細胞）中の遺伝子の発現のレベルを検出することもできる。該技術は逆転者−ＰＣＲ（「ＲＴ−ＰＣＲ」）と称される。
【００８６】
「分子育種」は、育種プロセス中の分子マーカーを追跡するためのプロセスを規定する。分子マーカーは、所望される表現型形質に連結されるのが一般的である。分子マーカーまたは遺伝形質の分離を追跡することによって、表現型を評価する代わりに、より少ない植物を増殖させ、表現型変異のアッセイまたは目視調査を排除することによって、育種プロセスを加速することができる。本プロセスに有用な分子マーカーには、先に記載のマッピング可能な遺伝子変異を同定するのに有用な任意のマーカーおよび植物種にわたってシンテニー（ｓｙｎｔｅｎｙ）を示す緊密に連結した遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。用語「シンテニー」は、異なる生物体間の染色体上の遺伝子の置き換え／順序の変換を指す。これは、緊密に連結していてもよくまたは緊密に連結していなくてもよい２つ以上の遺伝子座が、異なる種間の同じ染色体上に見出されることを意味する。シンテニーに対するもう１つの用語は「ゲノムの共直線性」である。
【実施例】
【００８７】
本発明は以下の実施例でさらに規定され、ここでは、別の方法で述べられない限り、部およびパーセントは重量によるものであり、また、度は摂氏である。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示している一方で、具体的説明のみとして示されることが理解されるべきである。当業者は、上記の考察およびこれらの実施例から本発明の不可欠の特徴を確かめることが可能であり、また、その技術思想および範囲から逸脱することなく、それを多様な用途および条件に適合させるように本発明の多様な変更および改変をなすことが可能である。従って、本明細書に示されかつ記載されている改変の他にも本発明の多様な改変が存在することは、先の記載から当業者には明らかであろう。そのような改変についても添付の請求の範囲内にあることが意図される。
【００８８】
本明細書に掲載した各参考文献の開示内容は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【００８９】
実施例１
ｃＤＮＡライブラリーの組成；ｃＤＮＡクローンの単離および配列決定
様々なイネ、オダマキ、ブドウ、グアユール、ペルビアン・リリー（Ｐｅｒｕｖｉａｎ
ｌｉｌｙ）、トウモロコシ、ダイズ、ヒマワリ、およびコムギ組織由来のｍＲＮＡを表すｃＤＮＡライブラリーを調製した。ライブラリーの特徴を表２において下述する。
【００９０】
【表３】
【００９１】
【表４】
【００９２】
ｃＤＮＡライブラリーは利用可能な多くの方法のいずれか１つにより調製してよい。例えば、ｃＤＮＡは、最初に、製造元のプロトコル（ストラタジーン・クローニング・システムズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州ラホジャ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））に従ってユニザップ（Ｕｎｉ−ＺＡＰ）（商標）ＸＲベクター中でｃＤＮＡライブラリーを調製することによりプラスミドベクター中に導入してよい。ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により提供されたプロトコルに従って、ユニザップ（Ｕｎｉ−ＺＡＰ）（商標）ＸＲライブラリーをプラスミドライブラリーに転化する。転化に際して、ｃＤＮＡ挿入物はプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中に含有される。加えて、ｃＤＮＡは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングラン
ド・バイオラボズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））を使用して、予め切断されたＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ベクター（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））に直接導入することができ、次いで、製造元のプロトコル（ギブコＢＲＬプロダクツ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））に従ってＤＨ１０Ｂ細胞にトランスフェクションする。一旦、ｃＤＮＡ挿入物がプラスミドベクター中にあれば、組換えｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドを含有する無作為に拾われた細菌コロニーからプラスミドＤＮＡを調製するか、または、挿入されたｃＤＮＡ配列に隣接するベクター配列に特異的なプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応を介して挿入ｃＤＮＡ配列を増幅する。増幅された挿入ＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡを、色素−プライマー配列決定反応で配列決定して部分的ｃＤＮＡ配列を生じさせる（発現された配列標識(ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ)または「ＥＳＴ」；アダムス（Ａｄａｍｓ）ら（１９９１）
Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：１６５１−１６５６を参照されたい）。生じるＥＳＴは、パーキン エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）モデル３７７蛍光シークエンサーを使用して分析する。
【００９３】
修飾された転位プロトコルを利用して、完全挿入物配列（ＦＩＳ）データを作成する。ＦＩＳについて同定されたクローンを、保管されているグリセリンストックから単一のコロニーとして回収し、アルカリ溶解を介してプラスミドＤＮＡを単離する。単離されたＤＮＡテンプレートを、ＰＣＲに基づく配列決定反応においてベクタープライムドＭ１３前方および逆方向オリゴヌクレオチドと反応させ、自動化シークエンサーに充填する。クローン同定の確認は、ＦＩＴの要件が作成される本来のＥＳＴ配列に対する配列アラインメントによって実施する。
【００９４】
確認されたテンプレートを、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｔｙ１転位因子（デビン（Ｄｅｖｉｎｅ）およびボエク（Ｂｏｅｋｅ）（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：３７６５−３７７２）に基づくプライマーアイランド転位キット（ＰｒｉｍｅｒＩｓｌａｎｄ ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ｋｉｔ）（ＰＥアプライド・バイオシステムズ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州フォスター市（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））を介して転位させる。インビトロ転位システムは、大きなＤＮＡ分子の集団全体にわたって独特な結合部位を無作為に配置する。次いで、転位されたＤＮＡを使用し、エレクトロポレーションを介してＤＨ１０Ｂエレクトロ−コンピテント細胞（ギブコＢＲＬ／ライフテクノロジーズ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ））を形質転換する。転位因子は、さらなる選択マーカー（ＤＨＦＲと呼ばれる；フィリング（Ｆｌｉｎｇ）およびリチャード（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：５１４７−５１５８）を含有しており、組み込まれたトランスポゾンを含有するサブクローンのみの寒天プレート上での二重選択が可能である。それぞれの転位反応から複数のサブクローンを無作為に選択し、アルカリ溶解を介してプラスミドＤＮＡを調製し、トランスポゾン内の結合部位に特異的な独特なプライマーを利用して、転位事象部位より外側について、テンプレートを配列決定する（ＡＢＩプリズムダイ−ターミネーターレディリアクションミックス（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘ））。
【００９５】
配列データを回収（ＡＢＩプリズムコレクションズ（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ））し、フレッド／フラップ（Ｐｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐ）（Ｐ．グリーン、（Ｐ． Ｇｒｅｅｎ）、ワシントン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）、シアトル（Ｓｅａｔｔｌｅ））を使用して集成する。フレッド／フラップ（Ｐｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐ）は、ＡＢＩ配列データを再読取し、塩基を読み上げ、特性値を割り当て、そして塩基記号および特性値を編集可能な出力ファイルに書き込むパブリックドメインソフトウェアプログラムである。フラップ（Ｐｈｒａｐ）配列集成プログラムは、これらの特性値を使用して、集成された配列コンティグ（ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｎｔｉｇ）の正確度を上昇する。集成物をコンスド（Ｃｏｎｓｅｄ）配列エディター（Ｄ．ゴードン（Ｄ． Ｇｏｒｄｏｎ）、ワシントン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）、シアトル（Ｓｅａｔｔｌｅ））によって検討する。
【００９６】
実施例２
ｃＤＮＡクローンの同定
ＧＥ様シトクロムＰ４５０をコードするｃＤＮＡのクローンを、ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（全部の非冗長ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ＣＤＳ翻訳、三次元構造ブルックヘイブンタンパク質データバンク（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ
Ｂａｎｋ）由来の配列、スイスプロット（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）タンパク質配列デー
タベースの最近の主要な発表、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪデータベースを含んで成る）中に含有される配列に対する類似性についてＢＬＡＳＴ（基礎局部整列検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）；アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）検索を実施することにより同定した。実施例１で得られたｃＤＮＡ配列を、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）により提供されるＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用して「ｎｒ」データベース中に含有される全部の公的に利用可能なＤＮＡ配列に対する類似性について分析した。ＤＮＡ配列を全部の読み枠で翻訳し、そして、ＮＣＢＩにより提供されるＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（ギシュＷ．（Ｇｉｓｈ，Ｗ．）およびステイテスＤ．Ｊ．（Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ３
：２６６−２７２）を使用して、「ｎｒ」データベース中に含有される全部の公的に利用可能なタンパク質配列に対する類似性について比較した。便宜性のため、ＢＬＡＳＴにより算出されるような単に偶然で検索されたデータベース中に含有されたある配列に対するあるｃＤＮＡ配列の合致を観察するというＰ値（確率）を本明細書では「ｐＬｏｇ」値として報告し、これは報告されたＰ値の対数の負の数を表わす。従って、ｐＬｏｇ値が大きくなるほど、ｃＤＮＡ配列およびＢＬＡＳＴの「ヒット」が相同なタンパク質を表わす見込みが大きくなる。
【００９７】
分析に提出されたＥＳＴを上記のジェンバンクデータベースと比較する。配列相同性の共通または重複領域を共有するヌクレオチド配列を比較するデュポン（Ｄｕ Ｐｏｎｔ）専用のデータベースに対し、ＢＬＡＳＴｎアルゴリズム（アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）を使用することによって５−または３−プライム以上の配列を含有するＥＳＴを見出すことができる。共通または重複配列が２つかもしくはそれ以上の核酸フラグメントの間に存在する場合、該配列は単一の連続ヌクレオチド配列に集成することができ、従って、５または３プライム方向のいずれかで本来のフラグメントが伸長される。一旦、最大の５−プライムＥＳＴが同定されれば、実施例１に記載の完全挿入物配列決定によってその完全な配列を決定することができる。多様な種に属する相同遺伝子は、ｔＢＬＡＳＴｎアルゴリズムを使用して、ＥＳＴデータベースに対し（専用の供給源または公的データベースのいずれかに由来する）既知の遺伝子のアミノ酸配列を比較することによって見出すことができる。ｔＢＬＡＳＴｎアルゴリズムは、６つの全ての読み枠で翻訳されるヌクレオチドデータベースに対してアミノ酸検索事項を検索する。この検索により、多様な種間のヌクレオチドコドン使用の差異およびコドンの縮重を求めることが可能である。
【００９８】
実施例３
ＧＥ様シトクロムＰ４５０タンパク質をコードするｃＤＮＡクローンの特徴付け
表３に列挙したクローンからのＥＳＴ配列を使用するＢＬＡＳＴＸ検索は、当該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）［アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）］（ＮＣＢＩ一般識別番号（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）ｇｉ、［配列番号４２］（ｇｉ１
２３２５１３８およびｇｉ１５２２１１３２と同一である）；およびｇｉ１１２４９５１１、［配列番号４４］；ならびにｇｉ３８３１４４０、［配列番号４６］；ならびにｇｉ８９２０５７６、［配列番号４７］）由来のシトクロムＰ４５０タンパク質、ならびにラン［ファレノプシス（Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ）種ＳＭ９１０８］（ＮＣＢＩ一般識別番号（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）ｇｉ１１７３６２４、［配列番号４３］
）由来のシトクロムＰ４５０タンパク質、ならびにダイズ［グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）］（ＮＣＢＩ一般識別番号（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ
）ｇｉ５９２１９２６、［配列番号４５］）由来のシトクロムＰ４５０タンパク質に対する類似性を示した。個々のＥＳＴについてのＢＬＡＳＴの結果（「ＥＳＴ」）、示されたｃＤＮＡクローンを含んで成るｃＤＮＡ挿入物全体の配列（「ＦＩＳ」）、２種もしくはそれ以上のＥＳＴから集成されたコンティグの配列（「Ｃｏｎｔｉｇ」）、ＦＩＳおよび１種もしくはそれ以上のＥＳＴから集成されたコンティグの配列（「Ｃｏｎｔｉｇ＊」）、またはＦＩＳ、コンティグもしくはＦＩＳおよびＰＣＲ由来のタンパク質全体をコードする配列（「ＣＧＳ」）を表３に示す。
【００９９】
【表５】
【０１００】
表４のデータは、配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、および４１に示されるアミノ酸配列、ならびにアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）［アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）］（ＮＣＢＩ一般識別番号（Ｇｅｎｅｒａｌ
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）ｇｉ７１０９４６１、［配列番号４２］（ｇｉ１２３２５１３
８およびｇｉ１５２２１１３２と同一である）；およびｇｉ１１２４９５１１、［配列番号４４］；ならびにｇｉ３８３１４４０、［配列番号４６］；ならびにｇｉ８９２０５７６、［配列番号４７］）由来のシトクロムＰ４５０タンパク質、ならびにラン［ファレノプシス（Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ）種ＳＭ９１０８］（ＮＣＢＩ一般識別番号（Ｇｅｎ
ｅｒａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）ｇｉ１１７３６２４、［配列番号４３］）由来のシト
クロムＰ４５０タンパク質、ならびにダイズ［グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）］（ＮＣＢＩ一般識別番号（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）ｇｉ５９２
１９２６、［配列番号４５］）由来のシトクロムＰ４５０タンパク質の同一性パーセントの計算を表す。
【０１０１】
【表６】
【０１０２】
配列のアラインメントおよび同一性パーセントの計算は、レーザージーン（ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ）生物情報科学コンピュータ計算ソフトウェアパッケージ（ＤＮＡスター社（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））のメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラムを使用して実施した。配列の複数のアラインメントは、デフォルトのパラメータ（ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝１０）を用い、アラインメントのクラスタル法（ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ５：１５１−１５３）を使用して実施した。クラスタル法を使用する対にしたアラインメントのためのデフォルトのパラメータは、Ｋタプル１、ギャップペナルティ＝３、ウィンドウ＝５およびダイアゴナルズ セイブ
ド＝５であった。配列のアラインメント、ならびにＢＬＡＳＴのスコアおよび確率は、本発明のｃＤＮＡクローンを含んで成る核酸フラグメントが、変異した場合にイネに巨大胚の表現型を付与するイネタンパク質と相同性を共有する植物シトクロムＰ４５０の実質的な部分をコードすることを示す。
【０１０３】
実施例４
単子葉細胞におけるキメラ遺伝子の発現
該ｃＤＮＡフラグメントに対し５’に配置されているトウモロコシの２７ｋＤのゼイン、ユビキチン、またはＣａＭＶ ３５Ｓ遺伝子由来のプロモーターに関してセンスの向きで本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含んで成るキメラ遺伝子を構築することが可能である。１０ｋＤのゼイン由来の３’フラグメント［キリハラ（Ｋｉｒｉｈａｒａ）ら（１９８８）Ｇｅｎｅ７１：３５９−３７０］は該ｃＤＮＡフラグメントに対し３’に配置することができる。ＧＥに相同な遺伝子を過剰発現または相互抑制するために、そのような構築物が使用される。当業者であれば、多様なプロモーターおよび／または３’末端配列を用いて、匹敵する発現結果を達成することができることが認識される。ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを有する構築物は以下のようにして作製される：転写終結エレメントを、ＢｇｌＩＩおよびＡｓｐ７１８消化によりクローン（Ｉｎ２−１ Ａ）から遊離させる。リンカー（ＧＡＴＣＣＡＴＧ）を使用して、フラグメントを、３５Ｓプロモーターを担持するｐＭＬ１４１［ＰＣＴ出願Ｎｏ．ＷＯ００／０８１６２、２０００年２月１７日公開］のＳｐｈＩおよびＡｓｐ７１８認識部位に連結させ、ＢｇｌＩＩおよびＳｐｈＩ末端に接続する。次のプライマーの組（５’−ＡＧＡＡＴＴＣＴＴＣＣＣＡＴＧＧＣＧＣＴＣＴＣＣＴＣＣＡＴ−３’、配列番号４８；および５’−ＡＧＡＡＴＴＣＴＡＧＧＣＣＣＴＡＧＣＣＡＣＧＧＣＣＴＴＧ−３’、配列番号４９）ならびにテンプレートしてｃＤＮＡを使用するＰＣＲを介して、ＧＥ ＯＲＦを含有するＤＮＡを増幅する。次いで、フラグメントをＥｃｏＲＩで消化し、３５Ｓプロモーターと転写ターミネーターとの間のベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入する。挿入物の適切な配向を、配列決定によって確認する。
【０１０４】
ユビキチンプロモーターを有する構築物は以下のようにして作製される：転写終結エレメントを、ＢｃｌＩおよびＫｐｎＩ消化によりクローン（Ｉｎ２−１ Ａ）から遊離させる。リンカー（ＧＧＣＣＧＴＡＣ）を使用して、フラグメントを、ユビキチンプロモーター（トウモロコシＵｂｉ−１プロモーター、クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）およびクアイル（Ｑｕａｉｌ）（１９９６）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．５：２１３−２１８）を担持するＳＫ−ｕｂｉ（ＢｂｓＩ）のＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ認識部位に連結させ、ＮｏｔＩおよびＫｐｎＩ末端に接続する。次のプライマーの組（５’−ＡＧＧＴＣＴＣＣＣＡＴＧＧＣＧＣＴＣＴＣＣＴＣＣＡＴ−３’、配列番号５０；および５’−ＡＴＣＡＴＧＡＴＣＴＡＧＧＣＣＣＴＡＧＣＣＡＣＧＧＣＣＴＴＧ−３’、配列番号５１）ならびにテンプレートしてｃＤＮＡを使用するＰＣＲを介して、ＧＥ ＯＲＦを含有するＤＮＡを増幅する。次いで、フラグメントをＢｓｐＨＩおよびＢｓａＩで消化し、ユビキチンプロモーターと転写ターミネーターとの間のＢｂｓＩ部位に挿入する。
【０１０５】
プラスミドｐＭＬ１０３は、ブダペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ）の約
定のもとにＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．２０１１０−２２０９）に寄託され、そして受託番号ＡＴＣＣ９７３６６を有する。ｐＭＬ１０３からのＤＮＡセグメントは、ベクターｐＧｅｍ９Ｚｆ（＋）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））中にトウモロコシの２７ｋＤのゼイン遺伝子の１．０５ｋｂのＳａｌＩ−ＮｃｏＩプロモーターフラグメント［プラット（Ｐｒａｔ）ら（１９８７）Ｇｅｎｅ５２：５１−４９；ガラード（Ｇａｌｌａｒｄｏ）ら（１９８８）ＰｌａｎｔＳｃｉ．５４：２１１−２８１１］、およびトウモロコシの１０ｋＤのゼイン遺伝子の３’末端からの０．９６ｋｂのＳｍａＩ−ＳａｌＩフラグメントを含有する。ベクターおよび挿入ＤＮＡを、本質的に記述された（マニアティス「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）通り、１５℃で一夜連結することが可能である。次いで、連結されたＤＮＡを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（エピキュリアン
コライ ＸＬ−１ ブルー（Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（商標））
）；ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）） を形質転換してもよい。細菌の形質転
換体は、プラスミドＤＮＡの制限酵素消化およびジデオキシチェーンターミネーター法（シークェナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）））ＤＮＡ配列決定キット；Ｕ．Ｓ．バイオケミカル（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ））を使用する制限されたヌクレオチド配列分析によりスクリーニングすることが可能である。生じるプラスミド構築物は、５’から３’の向きで、トウモロコシの２７ｋＤのゼインプロモーター、本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡフラグメント、および１０ｋＤのゼインの３’領域をコードするキメラ構築物を含む。
【０１０６】
次いで、上述されたキメラ遺伝子を、以下の手順によりトウモロコシ細胞に導入することが可能である。トウモロコシの同系繁殖系Ｈ９９およびＬＨ１３２の交配由来の発生中の穎果から未熟なトウモロコシ胚を切断することが可能である。胚は、受粉後１０〜１１日に、それらが１．０〜１．５ｍｍ長である場合に単離する。次いで、軸側を下に向けかつアガロースで固化されたＮ６培地と接触させて胚を置く（チュ（Ｃｈｕ）ら（１９７５）Ｓｃｉ．Ｓｉｎ．Ｐｅｋｉｎｇ１８：６５９−６６８）。胚を暗所で２７℃に保つ。胚柄構造上に担持される体細胞の前胚および胚様体をもつ細胞の未分化の塊から成るもろい胚形成カルスが、これらの未熟な胚の胚盤から増殖する。一次外植体から単離された胚形成カルスをＮ６倍地上で培養し、そして２〜３週ごとにこの培地上で継代培養することが可能である。
【０１０７】
選択マーカーを提供するために、形質転換実験でプラスミドｐ３５Ｓ／Ａｃ（Ｈｏｅｃｈｓｔ Ａｇ、独国フランクフルト（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のピーター・エッケス博士（Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ Ｅｃｋｅｓ）より入手した）を使用してよい。このプラスミドは、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）をコードするＰａｔ遺伝子（欧州特許公開第０２４２２３６号明細書を参照されたい）を含有する。酵素ＰＡＴは、ホスフィノトリシンのような除草性のグルタミン合成酵素阻害剤に対する抵抗性を付与する。ｐ３５Ｓ／Ａｃ中のｐａｔ遺伝子は、カリフラワーモザイクウイルスからの３５Ｓプロモーター（オデル（Ｏｄｅｌｌ）ら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１３：８１０−８１２）およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡからのノパリンシンター
ゼ遺伝子の３’領域の制御下にある。
【０１０８】
カルス培養細胞に遺伝子を導入するために粒子衝撃法（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ）（クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３２７：７０−７３）を使用してよい。この方法によれば、以下の技術を使用して金粒子（直径１μｍ）をＤＮＡで被覆する。１０μｇのプラスミドＤＮＡを、金粒子の懸濁液（１ｍＬあたり６０ｍｇ）５０μＬに添加する。塩化カルシウム（２．５Ｍ溶液の５０μＬ）およびスペルミジンを含まない塩基（１．０Ｍ溶液の２０μＬ）を粒子に添加する。これらの溶液の添加のあいだ該懸濁液をボルテックス攪拌する。１０分後にチューブを短く遠心分離（１５，０００ｒｐｍで５秒間）し、そして上清を除去する。粒子を２００μＬの無水エタノールに再懸濁し、再度遠心分離し、そして上清を除去する。エタノールすすぎを再度実施し、そして粒子を最終体積３０μＬのエタノールに再懸濁する。ＤＮＡ被覆された金粒子のアリコート（５μＬ）をカプトン（Ｋａｐｔｏｎ（商標））フライングディスク(ｆｌｙｉｎｇ ｄｉｓｃ)（バイオ−ラド・ラボズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｓ））の中央に置くことが可能である。次いで、１０００ｐｓｉのヘリウム圧、０．５ｃｍのギャップ距離および１．０ｃｍの飛行距離を使用して、バイオリスティック（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ（商標））ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ（バイオ−ラド・インスツルメンツ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）カリフォルニア州ヘルクレス（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ））を用いて粒子をトウモロコシ組織中に加速する。
【０１０９】
衝撃のためには、胚形成組織を、アガロース固化されたＮ６培地上の濾紙上に置く。組
織は薄い芝生(ｌａｗｎ)状に配置し、そして直径約５ｃｍの円形領域を覆う。組織を含有するペトリ皿は、ＰＤＳ−１０００／Ｈｅのチャンバ中で停止スクリーン（ｓｔｏｐｐｉｎｇ ｓｃｒｅｅｎ）からおよそ８ｃｍに置くことが可能である。次いで、チャンバ中の空気をＨｇ２８インチの真空まで排気する。衝撃チューブ中のＨｅ圧が１０００ｐｓｉに達する場合に爆発する破裂膜（ｒｕｐｔｕｒｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を使用して、マクロキャリアー（ｍａｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ）をヘリウムショック波で加速する。
【０１１０】
衝撃７日後、バイアロホス（ｂｉａｌｏｐｈｏｓ）（１リットルあたり５ｍｇ）を含有しかつカゼインまたはプロリンを欠くＮ６培地に組織を移すことが可能である。組織をこの培地上でゆっくりと成長を続けさせる。さらに２週間後に、バイアロホスを含有する新鮮なＮ６培地に組織を移すことができる。６週間後に、バイアロホスを補充された培地を含有するプレートのいくつかで、活発に成長しているカルスの直径約１ｃｍの領域を同定することが可能である。これらのカルスは、選択培地上で継代培養される場合に成長を続けることができる。
【０１１１】
最初に、１リットルあたり０．２ｍｇの２，４−Ｄを補充されたＮ６培地に組織の集団を移すことにより、植物をトランスジェニックカルスから再生することが可能である。２週間後に組織を再生培地に移すことができる（フロム（Ｆｒｏｍｍ）ら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：８３３−８３９）。
【０１１２】
実施例５
双子葉細胞におけるキメラ遺伝子の発現
ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターを使用して、双子葉細胞において、ＧＥに相同な遺伝子を過剰発現および相互抑制することができる。ＧＥの過剰発現のために、ベクターＫＳ５０を使用して、ＧＥ ＯＲＦを３５Ｓプロモーターに融合することができる。ＧＥ ＯＲＦは、３’末端でＮｏｔＩ部位を有するプライマーの組、ＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＣＣＡＴＧＧＣＧＣＴＣＴＣＣＴ、配列番号５２、およびＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＧＣＣＣＴＡＧＣＣＡＣＧＧＣ、配列番号５３を使用するＰＣＲによって増幅する。増幅されたＤＮＡフラグメントをＮｏｔＩで消化し、ＫＳ５０のＮｏｔＩ部位に連結する。挿入物の正確な配向は、配列決定によって決定する。ＫＳ５０（７，４５３ｂｐ）は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）遺伝子を制御するＴ７プロモーター／Ｔ７ターミネーター、およびＨＰＴ遺伝子の発現を制御する３５ＳプロモーターＮＯＳターミネーターを含有するｐＫＳ１８ＨＨ（米国特許第５，８４６，７８４号明細書）の誘導体である。ＫＳ５０は、ＳａｌＩ部位において、ｐＡＷ２８より取得される３５Ｓプロモーター（９６０ｂｐ）／ＮＯＳターミネーター（７００ｂｐ）カセットから成る挿入物を有し、プロモーターとターミネーターとの間にＮｏｔＩ部位を有する。
【０１１３】
次いで、本ポリペプチドをコードする配列を含んで成る発現ベクターでダイズ胚を形質転換してよい。体細胞胚を誘導するために、ダイズ栽培変種作物Ａ２８７２の表面滅菌された未熟な種子から切断された長さ３〜５ｍｍの子葉を、適切な寒天培地上で明または暗所で２６℃で６〜１０週間培養することが可能である。次いで、二次胚を生じさせる体細胞胚を切除し、そして適する液体培地中に置く。初期球状胚として増殖した体細胞胚の集団についての反復された選択後に、懸濁液を下述される通り維持する。
【０１１４】
ダイズ胚形成懸濁培養物は、１５０ｒｐｍの回転振盪器上の３５ｍＬの液体培地中、２６℃で蛍光灯を用いて１６：８時間の明／暗スケジュールで維持することが可能である。培養物は、３５ｍＬの液体培地中におよそ３５ｍｇの組織を接種することにより２週間ごとに継代培養する。
【０１１５】
次いで、粒子銃衝撃法（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｇｕｎ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（クラ
イン（Ｋｌｅｉｎ）ら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０−７３、米国特許第４，９４５，０５０号明細書）により、ダイズ胚形成懸濁培養物を形質転換してよい。これらの形質転換にはデュポン（Ｄｕ Ｐｏｎｔ）のバイオリスティック（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ（商標））ＰＤＳ１０００／ＨＥ機器（ヘリウム改良（ｈｅｌｉｕｍ ｒｅｔｒｏｆｉｔ））を使用することが可能である。
【０１１６】
ダイズの形質転換を容易にするのに使用することが可能である選択マーカー遺伝子は、カリフラワーモザイクウイルスからの３５Ｓプロモーター（オデル（Ｏｄｅｌｌ）ら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１３：８１０−８１２）、プラスミドｐＪＲ２２５からのハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来；グリッツ（Ｇｒｉｔｚ）ら（１９８３）Ｇｅｎｅ２５：１７９−１８８）およびアグロバクテリウム・ ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡからのノパリンシンターゼ遺伝子の３’領域より構成されるキメラ構築物である。ファセオリンの５’領域、本ポリペプチドをコードするフラグメントおよびファセオリンの３’領域を含んで成る種子発現カセットを制限フラグメントとして単離することが可能である。次いで、このフラグメントを、該マーカー遺伝子を担持するベクターの独特な制限部位に挿入することが可能である。
【０１１７】
６０ｍｇ／ｍＬの１μｍ金粒子懸濁液５０μＬに、（この順で）５μＬのＤＮＡ（１μｇ／μＬ）、２０μｌのスペルミジン（０．１Ｍ）、および５０μＬのＣａＣｌ２（２．５Ｍ）を添加する。次いで、粒子調製物を３分間攪拌し、微小遠心機中で１０秒間回転し、そして上清を除去する。次いで、ＤＮＡで被覆された粒子を４００μＬの７０％エタノールで１回洗浄し、そして４０μＬの無水エタノール中に再懸濁する。ＤＮＡ／粒子懸濁液をそれぞれ１秒間３回超音波処理することが可能である。５μＬのＤＮＡ被覆された金粒子を、次いで、各マクロキャリアーディスク上に充填する。
【０１１８】
およそ３００〜４００ｍｇの２週齢の懸濁培養物を空の６０×１５ｍｍのペトリ皿に入れ、そしてピペットを用いて残余の液体を組織から除去する。各形質転換実験にはおよそ５〜１０枚の組織のプレートを通常衝撃する。膜破裂圧は１１００ｐｓｉに設定し、そしてチャンバを２８インチ水銀の真空まで排気する。組織を保持スクリーンからおよそ３．５インチ離して置き、そして３回衝撃する。衝撃後に組織を半分に分割しかつ液体中に戻し入れ、そして上述された通り培養することが可能である。
【０１１９】
衝撃の５〜７日後に液体培地を新鮮培地と、また、衝撃１１〜１２日後に５０ｍｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含有する新鮮培地と交換してよい。この選択培地は毎週新しくすることが可能である。衝撃７〜８週間後で、緑色の形質転換された組織が、形質転換されない壊死胚形成集団から成長するのを観察することができる。孤立した緑色組織を取り出し、そして別個のフラスコに接種して、新しいクローン的に増殖された形質転換された胚形成懸濁培養物を生じさせる。それぞれの新しい株は独立した形質転換事象として取り扱ってよい。次いで、これらの懸濁液を後継代培養し、そして未熟な胚の集団として維持するかまたは個々の体細胞胚の成熟および発芽により植物全体に再生することが可能である。
【０１２０】
実施例６
ｇｅ座位の最終マッピング
マイクロサテライトおよびＲＦＬＰマーカーを使用して、ｇｅ座位を、第７染色体上の８５ｃＭ周辺の領域にマッピングした（コウ（Ｋｏｈ）ら（１９９６）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９３：２５７−２６１）。多くのＲＦＬＰマーカーおよびＹＡＣコンティグがイネの染色体にマッピングされている（ハルシマ（Ｈａｒｕｓｈｉｍａ）ら（１９９８）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１４８：４７９−４９４；ｈｔｔｐ：／／ｒｇｐ．ｄｎａ．ａ
ｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ）が、ｇｅ領域は、これまで物理的マーカーが見出されていない５ｃＭ−ｌｏｎｇ領域に配置されていた。ｇｅ座位をマッピングするために、本発明者らは、２つのマッピング集団を作製した。ｇｅ−３（ジャポニカイネｃｖ．タイチュング６５（Ｊａｐｏｎｉｃａ ｒｉｃｅ ｃｖ．Ｔａｉｃｈｕｎｇ６５））およびｇｅ−５（ジャポニカイネｃｖ．キンマゼ（Ｊａｐｏｎｉｃａ ｒｉｃｅ ｃｖ． Ｋｉｎｍａｚｅ））のホモ接合変異植物を、雌性親として選択し、インディカイネ品種カサラツ（Ｋａｓａｌａｔｈ）を雄性親として選択した。得られたＦ１植物を自家受粉させてＦ２集団を得た。ｇｅのＦ２子孫（ｇｅに対してホモ接合）をＦ２集団から選択した。
【０１２１】
ｇｅ座位付近の組換えを担持するＦ２植物を得るために、ＰＣＲに基づくＤＮＡマーカーを開発した。イネゲノムプロジェクトグループ（ＲＧＰ）（ハルシマ（Ｈａｒｕｓｈｉｍａ）ら（１９９８）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１４８：４７９−４９４）より公開されている地図位置に基づいて、いくらかの既知のＲＦＬＰを選択した。ＲＦＬＰマーカー、Ｒ１２４５、Ｒ２６７７およびＢ２Ｆ２を遠位マーカーのために選択し、マーカーＳ１８４８およびＣ８４７を近位マーカーのために選択した。配列がジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）から利用可能であるこれらのマーカーに対応するゲノムＤＮＡを増幅するために、プライマーを設計した。オオムギＥＳＴクローンであるＢ２Ｆ２については、デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）ＥＳＴデータベースおよびＲＧＰ ＥＳＴデータベースからイネ相同物を得た。プライマーは、対応するイネＥＳＴ配列に基づいて設計した。
【０１２２】
Ｃ８４７およびＢ２Ｆ２のカサラツ（Ｋａｓａｌａｔｈ）の配列に特異的である２ｐｍｏｌｅのプライマーの２つの主要なマーカーの組によって、ＰＣＲ反応を行った。０．３％ゲルライト（ｇｅｌｒｉｔｅ）を含有するＮ６培地上で発芽したｇｅＦ２植物から得た若い葉組織を、中和工程でサンプルの沸騰時間を４分間まで延長する修飾を伴い、キリミク（Ｋｌｉｍｙｕｋ）ら（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｊ．３：４９３−４９４に記載の通りに直接ＰＣＲ反応に供した。１つの３０μｌのＰＣＲ反応は、２μｌの２．５ｍＭｄＮＴＰ、２μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、葉から抽出した２μｌのＤＮＡ、０．３μｌのアンプリタックゴールド（Ａｍｐｌｉｔａｑ ｇｏｌｄ）（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））および３μｌのＰＣＲ緩衝液を含有した。熱サイクル条件は、９５℃で１０分間、９４℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で３０秒間、７２℃で５分間であり、工程２〜４を４０回繰り返した。カサラツ（Ｋａｓａｌａｔｈ）ＤＮＡの増幅は２．５または３％アガロースゲル上で調べた。
【０１２３】
親ジャポニカ（Ｊａｐｏｎｉｃａ）およびインディカ（Ｉｎｄｉｃａ）品種由来のマーカー領域を増幅することによって、いくらかの一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を見出した。遠位側由来の主要なＰＣＲに基づくＤＮＡマーカーを開発するために、Ｃ８４７において見出された１つのＳＮＰを選択した。このＳＮＰにおいて、ジャポニカ（Ｊａｐｏｎｉｃａ）の配列はＡ残基を有するが、インディカ（Ｉｎｄｉｃａ）の配列はＴを有した。プライマー（５’ＧＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＡＡＡＴＴＧＡＣＴＣＴＴＴＴＴＣＡＧＴＡＡ３’；配列番号５４）は、インディカ（Ｉｎｄｉｃａ）特異的塩基がその３’末端に相補的である様式で設計した。このプライマーおよび他方のプライマー（５’ＧＣＡＡＡＴＡＡＴＴＡＴＴＴＣＴＡＴＡＴＡＣＡＧＧＡＣＡＧＧＣ３’；配列番号５５）を１組として使用し、インディカ（Ｉｎｄｉｃａ）のみから対応するＤＮＡを増幅することができた。近位側については、親ジャポニカ（Ｊａｐｏｎｉｃａ）品種（Ａ）とインディカ（Ｉｎｄｉｃａ）品種（Ｔ）との間にＳＮＰを担持するＢ２Ｆ２イネ相同物を選択した。設計されたプライマー（５’ＴＡＧＣＴＴＴＡＧＡＧＴＡＣＡＴＴＴＣＴＴＡＧＡＴＡＣＧＧＣＡ３’；配列番号５６）は、その３’末端でインディカ（Ｉｎｄｉｃａ）の配列に対し相補的であった。もう１つのプライマー（５’ＴＴＡＣＴＴＴＧＡＧＣＧＴＧＣＣＡＡＧＣＡＧＴＡＴＡＡＴＴＴＣＴ３’；配列番号５７）と組み合わせて、ジャポニカ（Ｊａｐｏｎｉｃａ）からではなくインディカ（Ｉｎｄｉｃａ）のみからＤＮＡを増幅させた。
【０１２４】
これらのインディカ（Ｉｎｄｉｃａ）特異的プライマー対を使用することによって、１２９０ｇｅホモ接合Ｆ２をスクリーニングし、合計で３３個の組換え体を得、近位のｇｅ領域から１５個、遠位のｇｅ領域から１８個を得た。
【０１２５】
実施例７
ＧＥの地図に基づくクローニング
ＧＥへの染色体歩行の開始点としての役割を果たす最も近い物理的マーカーを得るために、３つのＹＡＣクローン、Ｙ１９３１、Ｙ４０５２およびＹ４５６６の末端からＤＮＡを単離した。これらのクローンを、ＲＧＰによって、ｇｅ座位に比較的近い領域に予めマッピングした。ＰＣＲに基づく方法を使用して、本発明者らは、Ｙ４０５２およびＹ１９３１の両末端ならびにＹ４５６６の左末端を回収し、配列決定した（方法および材料を参照のこと）。単離された各末端に特異的なプライマーの組を使用することによって、これらのＹＡＣクローンの配向および重複を解析したところ、Ｙ４０５２の左末端はＹ４０５２およびＹ４５６６のコンティグの最も遠い末端であることが確立された。Ｙ４０５２のどの末端がｇｅ座位に近いかを決定するために、各末端についてＲＦＬＰを展開した。遠位領域由来の１０個の組換え体の分離解析により、Ｙ４０５２の左末端は、右末端よりもｇｅに近いことが示され、それぞれ３および９個の組換え破壊点を残している。
【０１２６】
酵母ＹＡＣ株由来の全てのＤＮＡを抽出した。１００ｎｇのＤＮＡをＡｌｕＩ、ＨａｅＩＩＩおよびＲｓａＩで消化し、ベクトレット（ｖｅｃｔｏｒｅｔｔｅ）アダプター（５’ＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧＴＣＴＧＴＣＧＡＡＧＧＴＡＡＧＧＡＡＣＧＧＡＣＧＡＧＡＧＡＡＧＧＧ３’；配列番号５８；および５’ＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣＴＣＧＡＡＴＣＧＴＡＡＣＣＧＴＴＣＧＴＡＣＧＡＧＡＡＴＣＧＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣＣＴＴ３’；配列番号５９）に連結した。１０ｎｇの連結されたＤＮＡをＰＣＲプレートとして使用し、ＹＡＣ末端を増幅した。１つのＰＣＲ反応は、ＹＡＣアームに特異的なプライマー（５’ＣＡＣＣＣＧＴＴＣＴＣＧＧＡＧＣＡＣＴＧＴＣＣＧＡＣＣＧＣ３’；配列番号６０）；または右アームに特異的なプライマー（５’ＡＴＡＴＡＧＧＣＧＣＣＡＧＣＡＡＣＣＧＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＧ３’；配列番号６１）の２０ｐｍｏｌｅを、１．６ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．０１％ゼラチンおよび２．５ｍＭｄＮＴＰと共に含有した。サイクル条件は、９５℃で１０分間、９２℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間であった。工程２〜４の１０サイクルを行った後、ベクトレット特異的プライマーは（５’ＣＧＡＡＴＣＧＴＡＡＣＣＧＴＴＣＧＴＡＣＧＡＧＡＡＴＣＧＣＴ３’；配列番号６２）であり、反応に添加して、９２℃で１分間、６０℃で１分間および７２℃で３分間を３０サイクルの条件でさらに増幅した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分離し、増幅されたＤＮＡを第２のＰＣＲ増幅のために抽出した。第２のＰＣＲは、１６ｐｍｏｌｅのベクトレット単位に特異的なプライマーおよびＹＡＣ左末端に特異的な３０ｐｍｏｌｅのネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマー（５’ＣＴＧＡＡＣＣＡＴＣＴＴＧＧＡＡＧＧＡＣ３’；配列番号６３）または右末端に特異的なプライマー（５’ＡＣＴＴＧＣＡＡＧＴＣＴＧＧＧＡＡＧＴＧ３’；配列番号６４）の存在下で行った。サイクリング条件は、９５℃で１０分間、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で１分間であり、工程２〜４を２０回繰り返した。回収した末端を、ｐＧＥＭ−Ｔイージー（Ｅａｓｙ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））にクローニングし、配列決定した。末端配列由来のプライマーは、ＹＡＣコンティグの重複した構造を解析するために使用した。また、これらのＤＮＡフラグメントを使用して、ＲＦＬＰを見出し、ｇｅ座位についてそれらをマッピングした。
【０１２７】
これらの結果に基づき、本発明者らは、Ｙ４０５２の左末端から染色体歩行を開始した。タックイック（ＴＱインディカ（Ｉｎｄｉｃａ）イネ）およびレモント（Ｌｅｍｏｎｔ）（ＬＭジャポニカ（Ｊａｐｏｎｉｃａ）イネ）から作製される２つのテキサス（Ｔｅｘ
ａｓ）Ａ＆Ｍ ＢＡＣライブラリーを使用して、ＤＮＡブロットハイブリダイゼーションによって対応するクローンをスクリーニングした。Ｙ４０５２の左末端をプローブとして使用し、２つのＢＡＣクローン、ＴＱ１−１９ＬおよびＴＱ２２−７Ｅを回収した。ＴＡＬＬ ＰＣＲによってＢＡＣクローンの末端を回収し、回収されたＤＮＡフラグメントを、配列決定のためにｐＧＥＭ−Ｔイージー（Ｅａｓｙ）にクローニングした（材料および方法を参照のこと）。これらの配列を使用して、ＢＡＣ末端特異的プライマーの組を設計し、コンティグにおけるこれらのＢＡＣクローンの配向を決定した。ＰＣＲ解析のデータは、ＴＱ１−１９Ｌの右側末端（ＳＰ６側）がｇｅに新たに最も近く、ＴＱ２２−７ＥおよびＹＡＣクローンには存在しないことを示した。
【０１２８】
ＴＱ１−１９Ｌの右末端は、重複ＢＡＣクローンの第２の配列決定のために使用した。３つのＢＡＣ、ＬＭ１０−２２Ｎ、ＬＭ１０−１１ＯおよびＬＭ１５−７Ｐを得た。ＢＡＣ末端を回収し、ＰＣＲごとにマッピングするプロセスを繰り返した。第３のスクリーニングでは、ＬＭ１５−７Ｐの左末端（Ｔ７側）を使用し、ＬＭ３−６Ｂを得た。第４のスクリーニングでは、ＬＭ３−６Ｂの左末端を使用し、ＬＭ２０−４Ｄ、ＬＭ１７−３Ｈを得た。ＬＭ２０−４Ｄの左末端はコンティグの末端にマッピングされた。第５のスクリーニングでは、反復配列が存在するため、重複ＢＡＣクローンを得るためにこの末端はプローブとして使用しなかった。ＬＭ２０−４Ｄから適切なＤＮＡプローブを得るために、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩでＢＡＣクローンを消化し、ｐＵＣ１８にサブクローニングした。ＤＮＡブロット分析によって、一方の１．６ｋｂ長のフラグメントは他方の重複クローンＬＭ３−６Ｂ上には存在しないことが見出され、フラグメントがＢＡＣコンティグの末端に向かって局在化されていることが示された。１．６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを第５のスクリーニングのプローブとして使用し、重複クローンとしてＴＱ１８−１ＩおよびＬＭ２−１５Ｊを単離した。第６のスクリーニングでは、ＴＱ１８−１Ｉの左末端をプローブとして使用し、２つのＢＡＣクローン、ＬＭ４−１２ＥおよびＬＭ１５−２０Ｊを単離した。
【０１２９】
タックイック、インディカ（Ｉｎｄｉｃａ）イネ；およびレモント（Ｌｅｍｏｎｔ）、ジャポニカ（Ｊａｐｏｎｉｃａ）イネから作製される２つのテキサス（Ｔｅｘａｓ）Ａ＆Ｍ ＢＡＣライブラリーのブロットを、標準的なＤＮＡハイブリダイゼーション条件（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ））を使用して、ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ＴＡＩＬ ＰＣＲにより、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１ベクターを使用して作製したＢＡＣクローンの末端を回収した。０．２μｌの拡張型高忠実度Ｔａｑポリメラーゼ（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ））を伴うＢＡＣベクター特異的プライマー（４ｐｍｏｌｅ）および任意の変性させた（ＡＤ）プライマー（５０ｐｍｏｌｅ）を含有する２０μｌ中で典型的なＴＡＩＬ ＰＣＲ反応を行った。ＢＡＣベクターに特異的な６つのネステッドプライマーを設計した：
ＢＡＣＬ１；ＡＴＴＣＡＧＧＣＴＧＣＧＣＡＡＣＴＧＴＴＧ 配列番号６５
ＢＡＣＬ２；ＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＡＡＧＴＴＧＧ 配列番号６６
ＢＡＣＬ３；ＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ 配列番号６７
ＢＡＣＲ１；ＴＧＡＧＴＴＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＴＴＡＧＧＧＡＣ 配列番号６８
ＢＡＣＲ２；ＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧ 配列番号６９
ＢＡＣＲ３；ＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣ 配列番号７０
【０１３０】
リュ（Ｌｉｕ）およびウィチール（Ｗｈｉｔｔｉｅｒ）（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ
２５：６７４−６８１、およびリュ（Ｌｉｕ）ら（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｊ．８：４５７−４６３によって設計された７つの異なるプライマー（ＡＤ１〜７）を使用した：
ＡＤ１；ＴＧＷＧＮＡＧＷＡＮＣＡＳＡＧＡ 配列番号７１
ＡＤ２；ＡＧＷＧＮＡＧＷＡＮＣＡＷＡＧＧ 配列番号７２
ＡＤ３；ＣＡＷＣＧＩＣＮＧＡＩＡＳＧＡＡ 配列番号７３
ＡＤ４；ＴＣＳＴＩＣＧＮＡＣＩＴＷＧＧＡ 配列番号７４
ＡＤ５；ＮＧＴＣＧＡＳＷＧＡＮＡＷＧＡＡ 配列番号７５
ＡＤ６；ＧＴＮＣＧＡＳＷＣＡＮＡＷＧＴＴ 配列番号７６
ＡＤ７；ＷＧＴＧＮＡＧＷＡＮＣＡＮＡＧＡ 配列番号７７
【０１３１】
第１ラウンドのＰＣＲの条件は、最初の５サイクルで６５℃にかつ最後の１５サイクルで６１℃に変更したアニーリング温度の修飾を伴い、リュ（Ｌｉｕ）およびウィチール（Ｗｈｉｔｔｉｅｒ）１９９５、ならびにリュ（Ｌｉｕ）ら１９９５に記載の通りである。第２のＰＣＲでは、本発明者らは、テンプレートとして１／３０希釈した１μｌの第１のＰＣＲ産物を使用した。２０μｌの反応は８ｐｍｏｌｅｎｏ第２のＢＡＣベクター特異的プライマー、２５ｐｍｏｌｅＡＤプライマー、および０．２μｌの拡張型高忠実度Ｔａｑポリメラーゼを含有した。熱サイクルの条件は、最初の２サイクルで６０℃に変更したアニーリング温度の修飾を伴い、リュ（Ｌｉｕ）およびウィチール（Ｗｈｉｔｔｉｅｒ）１９９５、ならびにリュ（Ｌｉｕ）ら１９９５に記載の通りである。
【０１３２】
通常のＰＣＲ熱サイクル工程で第３のＰＣＲを行った。反応は、第３のＢＡＣベクター特異的プライマーおよびＡＤプライマーを含有した。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔイージー（ｅａｓｙ）ベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））にクローニングし、それらのＤＮＡ配列を従来の配列決定方法によって決定した。
【０１３３】
ジャポニカ（Ｊａｐｏｎｉｃａ）およびインディカ（Ｉｎｄｉｃａ）品種間の多型を示すこれらのＢＡＣクローンから単離されるいくらかのＤＮＡフラグメントを使用して、単離された組換え体の組換え破壊点をマッピングした。結果として、１．６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＬＭ２０−４Ｄは３つの組換え破壊点を与えたが、ＴＱ１８−１Ｉの９５０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントは、１５個の遠位の組換え体の間で破壊点を与えなかった。ＴＱ１８−１Ｉの同一のフラグメントは近位の組換え体の間で１つの破壊点を与えたため、ｇｅ座位は２つのマーカー（ＬＭ２０−４Ｄの１．６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩおよびＴＱ１８−１Ｉの９５０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ）の間、即ち、２つのＢＡＣクローン、ＬＭ２０−４ＤおよびＴＱ１８−１１上にマッピングされた。
【０１３４】
実施例８
ＧＥ遺伝子の同定
２つのＢＡＣクローン、ＬＭ２０−４ＤおよびＴＱ１８−１１を含んで成る領域にマッピングされたＧＥ遺伝子を同定するために、これらのＢＡＣクローンの全ゲノム挿入物を配列決定した。この目的のために、ロー（Ｒｏｅ）ら１９９６（Ｒｏｅら（１９９６）“ＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ”ジョン・ワイリー（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ）およびサンズ（Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ））に記載の通り、高圧窒素ガスを使用して、ＢＡＣ ＤＮＡを霧状にした。１〜２ｋｂの長さのＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから回収し、ｐＵＣ１８にクローン化した。ＬＭ２０−４Ｄ由来の６８６個のクローンを無作為に単離し、配列決定した。同様に、ＴＱ１８−１Ｉ由来の７００個のクローンを単離し、配列決定した。ＬＭ２０−４Ｄから１２グループの連続配列が得られ、ＴＱ１８−１Ｉからは１６グループが得られた。ＰＣＲによっておよびまた、ＬＭ２０４ＤおよびＬＭ４−１２ＥのＨｉｎｄＩＩＩまたはＥｃｏＲＩフラグメントから誘導される他のサブクローンを得ることによって、ほとんどのギャップが充填された。これにより、２つのＤＮＡマーカー、１．６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ ＬＭ２０−４Ｄおよび９５０ｂｐＨｉｎｄＩＩＩ ＴＱ１８−１Ｉ間の９０ｋｂ長連続配列が構築された。
【０１３５】
９０ｋｂ内では、ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）および本発明者らのＥＳＴデータベースにファイルされた遺伝子に対し所定の類似性を示す１０を超える領域が同定された。領域の末端での組換え体の数およびこれらのＯＲＦの位置から判断すると、ＣＹＰ７８タンパク質に類似のタンパク質をコードする１つのＯＲＦは、Ｐ４５０のサブファミリーであり、ＧＥ遺伝子の候補であることが見出された。ＧＥとＰ４５０遺伝子との間の相関性を確認するために、変異体および野生型由来のゲノム領域をＰＣＲによって増幅した。これらの配列を比較して、９つの異なる対立遺伝子の変異を同定し、これらの全てがＰ４５０遺伝子に見出された；３つのナンセンスおよび６つのミスセンス変異が認められた（図１を参照のこと）。これらのデータから、このイネシトクロムＰ４５０遺伝子がＧＥ遺伝子であり、この遺伝子内の変異はＧＥの表現型を生じ得ることが確認される。
【０１３６】
ＧＥに相同性を示すジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）由来の多くのＰ４５０遺伝子が存在する。それらの中には、胚珠または茎分裂組織において発現されるものもある（ナデアル（Ｎａｄｅａｕ）ら（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：２１３−２３９；ゾンドロ（Ｚｏｎｄｌｏ）およびアイリッシュ（Ｉｒｉｓｈ）（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｊ．１９：２５９−２６８）。しかし、これらの遺伝子の機能は主として不明のままである。ある場合では、ＧＥに相同であるアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）遺伝子が過剰に発現され、得られる果実、または果皮は肥大する一方、種子または胚はもしあったとしても少数しか形成されない（イト（Ｉｔｏ）およびメエロウィツ（Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｚ）（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ１２：１５４１−１５５０）。しかし、このアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）遺伝子を破壊すると表現型は生じなかった。イネのシトクロムＰ４５０遺伝子の本発明における「巨大胚」としての特徴付けは、胚のサイズを直接制御する植物遺伝子の初めての例であると考えられる。
【０１３７】
実施例９
巨大胚表現型に関連するシトクロムＰ４５０タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニング
フェノールおよびグアニジンチオシアネートを含有するライフ・テクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）、メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）２０８４９（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）−ＢＲＬ）から得られるトリアゾール（ＴＲＩａｚｏｌ）（登録商標）試薬を使用して、受粉２〜５日後に回収した発生中の種子から全ＲＮＡを抽出した。オリゴ（ｄＴ）−セルローススピンカラムから成るアマシャム・ファルマシア・バイオテック社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）０８８５５から得られるｍＲＮＡ精製キット（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔｓ）により全ＲＮＡからポリＡ ｍＲＮＡを精製した。ｃＤＮＡライブラリーを作製するために、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）カリフォルニア州ラホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）９２０３７から得られるｃＤＮＡ合成キットに５．５μｇのポリＡ ＲＮＡを使用した。最初の工程では、ライフ・テクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）、メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）２０８４９（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）−ＢＲＬ）から得られるスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）（登録商標）逆転写酵素をＭＭＬＶ逆転写酵素の代わりに使用した。ＢＲＬ ｃＤＮＡサイズ・フラクション・カラム（ＢＲＬ ｃＤＮＡ Ｓｉｚｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ）（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）−ＢＲＬ）を使用して、サイズによってｃＤＮＡを分画し、フラクション１〜１３を沈殿させ、再懸濁し、１μｇのＵｎｉ−ＺＡＰ ＸＲベクターに連結した。連結の２日後、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）カリフォルニア州ラホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）９２０３７から得られるギガパックＩＩＩゴールド（登録商標）パケージング・エキストラクト（Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ（登録商標） ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｔ）にパッケージングした。増幅されていないライブラリーの力価は、１ｍｌあたり約７８０，０００プラー
クであった。増幅プロセスに全量を使用し、該手順は１５０ｍｌの増幅されたｃＤＮＡライブラリーを産生し、力価は５．５×１０８ｐｆｕ／ｍｌであった。
【０１３８】
ＧＥ ｃＤＮＡのスクリーニングは、当業者に周知である標準的プロトコル（アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら１９９３，“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”ジョン・ウィリー（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ）＆サンズ（Ｓｏｎｓ）、米国（ＵＳＡ）、またはサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ））に従う。簡単に説明すると、１．５×１０６ファージクローンをプレート化し、次いで、ナイロン膜に移し、放射性標識ＧＥプローブによるハイブリダイゼーションに供した。５０，０００個のプラークあたり５個を超えるポジティブが検出された。約１２５個のポジティブを単離し、ＧＥ特異的プライマーによるＰＣＲを介してＧＥ ｃＤＮＡとしての同一性について調べた。単離された核酸フラグメントの５’末端に特異的な一方のプライマー（ＧＧＧＡＡＧＣＧＴＴＣＧＣＧＡＡＧＴＧＡＧ、配列番号７８）およびｃＤＮＡ挿入物の５’の隣のクローニングベクターに特異的な他方のプライマー（ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ、配列番号７９）。ＰＣＲ反応からポジティブ結果を示す６個の最も長いｃＤＮＡクローンを単離し、配列を決定した。６個の全てのクローンはほぼ同一の長さを有し、もっとも長いｃＤＮＡは、ゲノム配列から推定されるＡＴＧ開始コドンの上流２８ヌクレオチドである。
【０１３９】
実施例１０
ＧＥ遺伝子の遺伝子の確認
イネシトクロムＰ４５０の単離された核酸フラグメントが巨大胚表現型を担うポリペプチドをコードすることの遺伝子確認は、単離されたシトクロムＰ４５０をクローニングした配列でｇｅ変異体を形質転換することによって達成した。この実験では、シトクロムＰ４５０がＧＥ遺伝子であること、形質転換に使用されたゲノム領域が通常のＧＥ発現に必要な調節エレメントの完全な組を含有したことが確認された。形質転換に使用されるゲノムＤＮＡは、コーディング配列の１．７ｋｂ上流、ＧＥコーディング配列、およびコーディング配列の１．６ｋｂ下流を含んだ。
【０１４０】
他の穀物種由来のＧＥ相同物も、完全遺伝子配列を入手し、イネのＧＥ変異体との相補性を調べることによって、この系で試験することができる。
【０１４１】
ＧＥ遺伝子の潜在的組織特異的発現を確認するために、様々な組織におけるＧＥ転写物の存在について、ＲＮＡブロット分析およびインサイチュハイブリダイゼーションにより分析した（実施例１１を参照のこと）。
【０１４２】
当業者に利用可能である高等植物の細胞にＤＮＡを形質転換するための１つの方法は、目的の核酸構築物を被覆された金属粒子を使用する高速弾道衝撃（ｈｉｇｈ−ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）である（クライン（Ｋｌｅｉｎ）らＮａｔｕｒｅ（１９８７）（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０−７３を参照のこと、また米国特許第４，９４５，０５０号明細書を参照のこと）。これらの相補性実験には、バイオリスティック（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）ＰＤＳ１０００／Ｈｅ（バイオラド・ラボラトリーズ（ＢｉｏＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）カリフォルニア州ヘルクレス（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））を使用した（さらに詳細については実施例４を参照のこと）。粒子衝撃技術を使用して、ＧＥコーディング配列の１．７ｋｂ上流、ＧＥコーディング配列＋イントロン、およびＧＥコーディング配列の１．６ｋｂ下流を含む野生型由来の５．１ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメント（配列番３のヌクレオチド６６０４−１１７３５）でｇｅ変異体を形質転換した。
【０１４３】
抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を付与するストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）由来の細菌性ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨｐｔＩＩ）遺伝子を、イネ形質転換のための選択マーカーとして使用した。ベクターｐＭＬ１８では、ＨｐｔＩＩ遺伝子を、カリフラワーモザイクウイルス（Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）由来の３５Ｓプロモーターおよびアグロバクテリウム・ ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のオクトピンシンターゼ遺伝子由来の終結およびポリ
アデニル化シグナルで操作した。ｐＭＬ１８については、１９９７年１２月１８日に公開されたＷＯ９７／４７７３１に記載されたが、その開示内容は参考として本明細書に援用されている。
【０１４４】
イネ種子を発芽させる胚盤由来の胚形成カルス培養物は、形質転換実験のための供給源材料としての役割を果たす。この材料は、カルス初期培地（ＭＳ塩、ニッチェ・アンド・ニッチェ（Ｎｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｎｉｔｓｃｈ）ビタミン、１．０ｍｇ／ｍｌ２，４−Ｄおよび１０μＭ ＡｇＮＯ３）上、暗所、２７〜２８℃で滅菌稲種子を発芽させることによって作製した。次いで、胚の胚盤から増殖する胚形成カルスをＣＭ培地（ＭＳ塩、ニッチェ・アンド・ニッチェ（Ｎｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｎｉｔｓｃｈ）ビタミン、１ｍｇ／ｍｌ２，４−Ｄ、チュ（Ｃｈｕ）ら、１９８５，Ｓｃｉ．Ｓｉｎｉｃａ１８：６５９−６６８）に移した。２週間間隔での通常の形態培養によってカルス培養物をＣＭ上で維持し、開始から１０週間以内に形質転換に使用した。
【０１４５】
ＣＭ培地上に配置されたワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）＃５４１ペーパーの円形の中央において直径約４ｃｍの円形領域に約１ｍｍ離して配列した０．５〜１．０ｍｍ片を継代培養することによって、形質転換のためのカルスを調製した。カルスを有するプレートを、暗所、２７〜２８℃で３〜５日間インキュベートした。衝撃前に、カルスを有するフィルターを、０．２５Ｍマンニトールおよび０．２５Ｍソルビトールを補充したＣＭに移し、暗所で３時間置いた。次いで、滅菌フード内でペトリ皿の蓋を２０〜４５分間少し開けておき、組織上の水分を消散させた。
【０１４６】
各ゲノムＤＮＡフラグメントを、イネ形質転換のための選択マーカーを含有するｐＭＬ１８で、金粒子表面上に共沈殿させた。これを達成するために、２：１の形質：選択マーカーＤＮＡ比で合計１０μｇのＤＮＡを、６０ｍｇ ｍｌ−１の濃度で再懸濁した５０μｌアリコートの金粒子に添加した。次いで、塩化カルシウム（５０μｌの２．５Ｍ溶液）およびスペルミジン（２０μｌの０．１Ｍ溶液）を金−ＤＮＡ懸濁液に添加し、チューブを３分間ボルテックス撹拌した。金粒子を微小遠心機中で１秒間遠心分離し、上清を除去した。次いで、金粒子を１ｍｌの無水エタノールで２回洗浄し、次いで、５０μｌの無水エタノールに再懸濁し、１秒間超音波処理（浴槽型超音波発生装置）して金粒子を分散させた。金懸濁液を−７０℃で５分間インキュベートし、粒子を分散する必要があれば超音波処理（浴槽型超音波発生装置）した。次いで、６μｌのＤＮＡ被服金粒子をマイヤー（ｍｙｌａｒ）マイクロキャリアディスク上に充填し、エタノールを蒸発させた。
【０１４７】
乾燥期間の終了時に、組織を含むペトリ皿をＰＤＳ−１０００Ｈｅのチャンバ内に置いた。次いで、チャンバ中の空気をＨｇ２８〜９インチの真空まで排気した。衝撃チューブ中のＨｅ圧が１０８０〜１１００ｐｓｉに達する場合に爆発する破裂膜（ｒｕｐｔｕｒｅ
ｍｅｍｂｒａｎｅ）を使用して、マクロキャリアー（ｍａｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ）をヘリウムショック波で加速した。組織を停止スクリーン（ｓｔｏｐｐｉｎｇ ｓｃｒｅｅｎ）からおよそ８ｃｍに配置し、カルスを２回衝撃した。２〜４プレートの組織を、ＤＮＡ被覆金粒子によるこの方法で衝撃した。衝撃後、カルス組織を、ソルビトールまたはマンニトールの補充を伴わないＣＭ培地に移した。
【０１４８】
衝撃後３〜５日以内に、カルス組織をＳＭ培地（５０ｍｇ／ｌハイグロマイシンを含有するＣＭ培地）に移した。これを達成するために、カルス組織をプレートから５０ｍｌ滅菌円錐管に移し、秤量する。２．５ｍｌのトップアガー／１００ｍｇのカルスを使用して、４０℃で融解したトップアガーを添加した。１０ｍｌのピペットで繰り返し分散させることによって、カルスの塊を直径２ｍｍ未満のフラグメントに破壊した。３ｍｌのアリコートのカルス懸濁液を新鮮ＳＭ培地上にプレート化し、プレートを２７〜２８℃、暗所で４週間インキュベートした。４週間後、トランスジェニックカルス事象を同定し、新鮮ＳＭプレートに移し、２７〜２８℃、暗所でさらに２週間、成長させた。
【０１４９】
成長しているカルスをＲＭ１培地（ＭＳ塩、ニッチェ・アンド・ニッチェ（Ｎｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｎｉｔｓｃｈ）ビタミン、２％ショ糖、３％ソルビトール、０．４％ゲルライト（ｇｅｌｒｉｔｅ）＋５０ｐｐｍハイグロマイシンＢ（ｈｙｇＢ））に移し、２週間、２５℃で暗所に置いた。２週間後、カルスをＲＭ２培地（ＭＳ塩、ニッチェ・アンド・ニッチェ（Ｎｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｎｉｔｓｃｈ）ビタミン、３％ショ糖、０．４％ゲルライト（ｇｅｌｒｉｔｅ）＋５０ｐｐｍハイグロマイシンＢ（ｈｙｇＢ））に移し、１２時間光周期での白色蛍光灯（約４０μＥｍ−２ｓ−１）下、２５℃および３０〜４０％湿度に配置した。照明下２〜４週間後、カルスが組織化し、苗条を形成し始めた。苗条を周囲のカルス／培地から取り出し、フィタトレイ（ｐｈｙｔａｔｒａｙ）（シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））中のＲＭ３培地（１／２×ＭＳ塩、ニッチェ・アンド・ニッチェ（Ｎｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｎｉｔｓｃｈ）ビタミン、１％ショ糖＋５０ｐｐｍハイグロマイシンＢ）に穏やかに移し、先の工程に記載されている条件と同一の条件を使用してインキュベーションを継続した。
【０１５０】
十分な根および苗条が生じた場合、２〜３週間後に、植物を、ＲＭ３からメトロ・ミックス（Ｍｅｔｒｏ ｍｉｘ）３５０を含有する４インチポットに移した。トランスジェニック植物から得られる種子を、ｇｅ変異のＧＥ遺伝子を含有する野生型ゲノムＤＮＡとの遺伝子相補性について調べた。野生型ＧＥの単離された核酸フラグメントを含有する５．１ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントで形質転換された変異ＧＥ株は、正常な胚を有するイネ穀粒を生じた。
【０１５１】
この結果より、シトクロムＰ４５０コーディング領域を含有する５．１ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントはｇｅ変異表現型との間に十分な相補性があることが確認される。さらに、この領域はｇｅ変異と完全な相補性があるため、遺伝子の「野生型」発現に必要な全ての調節エレメントは５．１ｋｂＥｃｏＲＩフラグメント内に存在するようである。
【０１５２】
実施例１１
ＧＥプロモーターの特徴付け
実施例１０に記載の５．１ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントには、ｇｅ変異との間に十分な相補性が認められた。このことは、ＧＥの適切な発現に必要なプロモーターがこの遺伝子領域においてコードされることを実証した。イネＧＥの２つのトウモロコシ相同物については実施例１３に記載されている。これらの遺伝子、ｚｍＧＥ１およびｚｍＧＥ２の両方の２ｋｂの上流配列を、それぞれ配列番号１０４および１０５に示す。正常なトウモロコシＧＥ発現に必要な調節エレメントは、配列番号１０４または１０５ならびにｚｍＧＥ１およびｚｍＧＥ２のコーディング領域内に含有されている。
【０１５３】
ＧＥ機能に必要な発現パターンについて調べるために、インサイチュハイブリダイゼーションにより、組織におけるＧＥ ＲＮＡの蓄積について分析した。弱いＧＥ発現の詳細なデータを得るために、サカイ（Ｓａｋａｉ）ら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ３７８：１９
９−２０３に従った放射能を使用する方法を用いた。ジャクソンＤ．Ｐ．（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｄ．Ｐ．）（１９９１）Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ．Ｉｎ：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”，（ボウレルズＤ．Ｊ．（Ｂｏｗｌｅｓ，Ｄ．Ｊ．，グルＳ．Ｊ．（Ｇｕｒｒ，Ｓ．Ｊ．）およびマックフェレソンＭ．（ＭｃＰｈｅｒｅｓｏｎ，Ｍ．）編）、オックスフォード大学出版（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）に従って、植物材料をプロトプラストに固定および包埋した。回転式ミクロトームを使用して、８μｍ厚の切片を調製した。ＧＥ特異的センスＲＮＡを検出するために、３’ＵＴＲを含有する領域をＰＣＲによって増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））にクローニングした。プローブに対する領域を増幅するために使用したプライマーは、ＧＥ３’ＲＶＱ：ＴＣＧＴＧＴＧＣＡＡＧＧＣＣＧＴＧＧＣＴＡ（配列番号１０６）およびＧＥ３’ＬＶＣ：ＧＣＡＣＧＡＴＣＣＡＴＴＴＡＧＣＡＣＡＣＣＡＧ（配列番号１０７）であった。増幅された配列は、配列番号３のヌクレオチド位置９９４１〜１０３００由来であった。
【０１５４】
ＳｐｅＩで消化することによりクローンを線状化し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼで転写することによって、センスＧＥ ＲＮＡを検出するためのアンチセンスＲＮＡプローブを合成した。ＮｃｏＩで消化することによりクローンを線状化し、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼで転写することによって、コントロールに対するセンスＲＮＡを合成した。
【０１５５】
ＮＢＴ２ Ｋｏｄａｋ（コダック）オートフォトグラフィーエマルジョンフィルムに対する暴露の３週間後、複式顕微鏡（ニコン（Ｎｉｋｏｎ）、エクリプス（Ｅｃｌｉｐｓｅ
Ｅ８００）を使用する暗視野顕微鏡検査によって、結果を解析した。発生中の胚および内乳組織においてＧＥ ＲＮＡの蓄積が検出された。検出された最も早期の発現は受粉２日後であった。胚において検出されたＧＥ発現は、球状期での頂部領域ならびに子葉（ｃｏｌｅｏｐｉｌａｒ）および後期での内乳組織に面する胚盤の表皮層に限定された。細胞期前の発生中の内乳では、胚組織付近の区域ではいくらかの濃度で領域全体においてＧＥ
ＲＮＡが検出された。その後、ＧＥの発現パターンはシフトし、胚に面する区域においてさらなる発現が認められた。さらに、極めて若い葉組織においてもＧＥの発現が認められた。
【０１５６】
実施例１２
オオムギＧＥ相同物の同定
遺伝子を同定するために、単離された全ＧＥ核酸フラグメントから作製されるＤＮＡプローブと、６５℃でハイブリダイズさせ、中程度のストリンジェンシー（５×ＳＳＰＥ、０．５％ＳＤＳ、６５℃、続いて、１×ＳＳＰＥ、０．５×ＳＤＳ、６５℃）で洗浄することによって、オオムギゲノムライブラリー（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カタログ番号９４６１０４）をスクリーニングした。ポジティブにハイブリダイズした５個のλクローンを単離した。制限酵素を介するこれらのクローンのマッピングにより、全ての５つのクローンは同じゲノム領域由来の重複クローンであることが確認された。イネＧＥに相同な領域を含有するＤＮＡフラグメントをさらにサブクローニングし、配列決定した。
【０１５７】
オオムギＧＥ相同物の推測されるコーディング配列および推測される翻訳産物を、それぞれ配列番号９２および９３に示す。オオムギＧＥ相同物は、イネＧＥタンパク質に対して高い程度の保存性（アラインメントのクラスタル法に基づいて７２．９％同一性）を有する。さらに、イネＧＥ遺伝子に見出される９１ヌクレオチドイントロンは、オオムギ遺伝子内での配置が保存されている（配列番号９２のヌクレオチド位置９９１と９９２との間、オオムギイントロンは１２５ヌクレオチドである）。このようなイントロンの配置の保存性は、ｚｍＧＥ１、ｚｍＧＥ２、およびｚｍＧＥ３においても見出されている（実施
例１３を参照のこと）。
【０１５８】
実施例１３
トウモロコシＧＥ相同物の同定
ＧＥに対して共同の相同性を示すＥＳＴクローンの解析によって、トウモロコシＧＥ相同物を同定した（実施例３を参照のこと）。ＥＳＴ、ｃｂｎ１０．ｐｋ００３４．ｆ８、トウモロコシＧＥ２（ｚｍＧＥ２、ヌクレオチドコーディング配列に対する配列番号９６、および推定翻訳産物に対する配列番号９７）ならびにｐ０１２１．ｃｆｒｍｎ６２ｒ、トウモロコシＧＥ１（ｚｍＧＥ１、ヌクレオチドコーディング配列に対する配列番号９４、および推定翻訳産物に対する配列番号９５）によって表される２つの遺伝子は、交差ハイブリダイゼーション分析によって、トウモロコシゲノムにおいて最も相同な遺伝子であることが示された。第３のクローンｃｐｌｓ１ｓ．ｐｋ００１．ｍ１９（ｚｍＧＥ３、ヌクレオチドコーディング配列に対する配列番号９８、および推定翻訳産物に対する配列番号９９）もまた、ＢＡＣゲノムクローンを解析することによって同定されている（以下を参照のこと）。３つのトウモロコシ遺伝子のそれぞれ内に含有される単一のイントロンが存在し、その配置は実施例１２で考察したイネおよびオオムギについて保存されている。ｚｍＧＥ１のイントロンは１２２ヌクレオチドであり、配列番号９４のヌクレオチド位置１１４３と１１４４との間に見出されており、ｚｍＧＥ２のイントロンは１９３ヌクレオチドであり、配列番号９６のヌクレオチド位置９４２と９４３との間に見出されており、ｚｍＧＥ３のイントロンのサイズは未だ決定されていないが、他の４つよりも相当大きい。
【０１５９】
以下に説明する交差ハイブリダイゼーション分析では、トウモロコシＤＮＡをいくらかの異なる制限酵素で消化し、０．７％アガロースゲル上で分離した。ＤＮＡをナイロン膜フィルターハイボンド（ＨｙＢｏｎｄ）Ｎ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））に移し、イネＧＥ遺伝子の全コーディング領域から作製される３２Ｐ標識プローブと５０℃で、ハイブリダイズさせた。１×ＳＳＰＥ、０．５％ＳＤＳ、６５℃でフィルターを洗浄後、該フィルターをホスホ・イメージャー（Ｐｈｏｓｐｈｏ Ｉｍａｇｅｒ）スキャナ（モレキュラー・ダイナミクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ））上に暴露し、ホスホ・イメージャー（Ｐｈｏｓｐｈｏ Ｉｍａｇｅｒ）スキャナ（モレキュラー・ダイナミクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ））を使用してシグナルを検出した。１バンドを超えるものからシグナルが検出され、これは、イネＧＥに極めて相同である１を超えるトウモロコシ遺伝子が存在する可能性を示す。
【０１６０】
トウモロコシゲノムにおいて相同遺伝子を同定するために、トウモロコシオオムギゲノムライブラリー（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カタログ番号９４６１０２）を、２×ＳＳＰＥ、０．５％ＳＤＳ、５０℃、次いで、１×ＳＳＰＥ、０．５×ＳＤＳ、６５℃で開始する中程度のストリンジェンシー条件でスクリーニングし、ポジティブなシグナルを示した９個のλクローンを得た。ＰＣＲ解析は、これらのクローンがｃｂｎ１０．ｐｋ００３４．ｆ８またはｐ０１２１．ｃｆｒｍｎ６２ｒのいずれかに特異的な配列を有することが示されることを示し、これらのＥＳＴがイネＧＥに最も相同なトウモロコシ遺伝子をコードすることを証明した。
【０１６１】
２つのＥＳＴクローンによって表わされるこれらの遺伝子の構造に関するさらなる情報を得るために、トウモロコシゲノムＢＡＣクローンをスクリーニングした。クローンｐ０１２１．ｃｆｒｍｎ６２ｒは、１つのコンティグに属するＢＡＣクローンにハイブリダイズした。クローンｃｂｎ１０．ｐｋ００３４．ｆ８は、２つの異なるコンティグから誘導されるＢＡＣクローンにハイブリダイズした。それぞれのコンティグ由来の１つのＢＡＣを選択し、全ＢＡＣ挿入物から配列決定のためのサブクローンを作製した。これらのＢＡＣは、ｐ０１２１．ｃｆｒｍｎ６２ｒ（ｚｍＧＥ１）に対するＢＡＣｂ９４ｄ．ｂ２およ
びｃｂｎ１０．ｐｋ００３４．ｆ８コンティグ（ｚｍＧＥ２）に対するＢＡＣｂ１５３ｃ．ｊ１７である。それぞれのＢＡＣの配列はトウモロコシＧＥ相同物のゲノム配列を示した。ＢＡＣｂ３７ｃ．ｆ１は、ｃｂｎ１０．ｐｋ００３４．ｆ８およびＢＡＣ ｂ１５３ｃ．ｊ１７によって表わされる遺伝子にほぼ同一であるが異なる配列であるＯＲＦを含有した。第３のトウモロコシ相同物はｚｍＧＥ３を命名した。
【０１６２】
実施例１４
ゲノムシンテニー解析によるＧＥ相同物の同定
シンテニー解析、つまり異なる生物体間の染色体上の遺伝子配置の保存性は、もう１つの緊密な関係の種由来の既知のゲノム領域と比較することによって、１つの種由来の相同な遺伝子またはゲノム領域を同定するための有用な道具であることが公知である。例えば、トウモロコシ由来のＧｅｎｅＡは、独特な活性を有することが公知であるが、大きな多遺伝子ファミリーに関連する。ＧｅｎｅＡの染色体解析は、該ＧｅｎｅＡがＧｅｎｅＢに緊密に連結していることを示す。イネにおけるＧｅｎｅＡの相同物（ＧｅｎｅＡ−ｒ）を見出すことを所望する場合、ＧｅｎｅＡ−ｒファミリーのメンバーは、ＧｅｎｅＢ−ｒに緊密に連結している可能性がある。イネおよびトウモロコシは、染色体構造、即ち、遺伝子の順序の保存性を大きな程度で示すことが公知である（アン（Ａｈｎ）およびサンクスレー（Ｔａｎｋｓｌｅｙ）ＰＮＡＳ（１９９３）９０：７９８０−７９８４）。そのようなシンテニー関係を利用して、緊密な関係の種間の相同物を同定するために、実施例１３に記載の３つのＢＡＣのゲノム配列を、実施例１に記載の１００ｋｂ長のイネＧＥゲノム配列と比較した。解析は、ＢＡＣｂ９４ｄ．ｂ２におけるＯＲＦを示し、イネＧＥに緊密に連結している遺伝子であるヒドロラーゼに対する類似性を示した（イネヒドロラーゼ遺伝子は、配列番号１００および１０１（それぞれヌクレオチドおよびポリペプチド）において示されており、トウモロコシヒドロラーゼは配列番号１０２および１０３に示されている）。従って、ｚｍＧＥ１も、ちょうどイネＧＥ遺伝子と同じようにヒドロラーゼ遺伝に緊密に連結している。このことは、ＧＥに緊密に連結しているイネ遺伝子をタグとして使用し、シンテニーを用いて保存された染色体構造を有する植物種からＧＥ相同物を単離しえることを実証した。
【０１６３】
実施例１５
ＧＥ相同物に特異的なタンパク質配列の同定
シトクロムＰ４５０タンパク質は、様々な機能を有する遺伝子のスーパーファミリーを含んで成る（ウェルク−レイヒハルト（Ｗｅｒｃｋ−Ｒｅｉｃｈｈａｒｔ）およびフェエレイセン（Ｆｅｙｅｒｅｉｓｅｎ）（２０００）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ１：ｒｅｖｉｅｗｓ３００３．１−３００３．９）。図２は、イネＧＥ（配列番号２）、オオムギＧＥ−相同物（配列番号９３）、トウモロコシＧＥ１−相同物（配列番号９５）、トウモロコシＧＥ２−相同物（配列番号９７）、トウモロコシＧＥ３−相同物（配列番号９９）、ユリＧＥ−相同物（配列番号４１）、ランｇｉ１１７３６２４（配列番号４３）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ｇｉ１２３５１３８（配列番号４２）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ｇｉ８９２０５７６（配列番号４７）、オダマキＧＥ−相同物（配列番号３５）、ダイズＧＥ−相同物（配列番号２３）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ｇｉ１１２４９５１１（配列番号４４）、ダイズｇｉ５９２１９２６（配列番号４５）、ダイズＧＥ−相同物（配列番号２５）、ダイズＧＥ−相同物（配列番号２１）、およびアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ｇｉ３８３１４４０（配列番号４６）のアラインメントを示す。囲み内の残基は、バイオスカウト（Ｂｉｏｓｃｏｕｔ）ＤＳＣプログラム（キング（Ｋｉｎｇ）およびスターンベルグ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ）（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ５：２２９８−２３１０）によって同定される推定されたヘリックス領域である。他の囲み内のエレメントは、「ＳＲＳ」またはシトクロムＰ４５０構造における高変異性配列である基質認識部位、シトクロムＰ４５０におけるプロリン（しばしばＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）の「ＰＰＰ」クラスター、基
質アクセスチャンネル（配列番号８３の保存された配列モチーフの部分）である「Ｆ−Ｇループ」、保存された「ＧＸＤＴ」（ヘム相互作用および酵素触媒に関与するプロトン移動溝）（配列番号８５の保存された配列モチーフの部分）、「ＥＸＸＲ」（ヘム安定化およびコア構造の安定性に必要な全てのシトクロムＰ４５０において保存されたＫ−ヘリックスモチーフ）（配列番号８８の保存された配列モチーフの部分）、ならびに「ＦＸＸＧＸＲＸＣＸＧ」（ヘムに接触するシステインを有する保存されたヘム結合部位）（配列番号９０の保存された配列モチーフの部分）を含む。
【０１６４】
配列のアラインメントおよび関連シトクロムＰ４５０配列との比較により、ＧＥ様シトクロムＰ４５０に独特であるモチーフを同定するための有用な方法が提供される。配列番号８０〜９１に見出される保存された配列モチーフの多くはヘリックスドメインの縁、またはＳＲＳ領域に見出される。
【０１６５】
実施例１６
高油種子形質に関連する座位に対するトウモロコシＧＥ相同物の遺伝子マッピング
高油トウモロコシ品質およびイネ巨大胚変異体は、それらの表現型において広範な類似性を有する。ＧＥ相同物をマッピングして、トウモロコシＧＥ相同物と高油形質を制御する座位との間の潜在的相関性について調べた。３’ＵＴＲ領域における多型ヌクレオチド配列（ＳＮＰ）を見出すことによって、マッピングを実施した。遺伝子特異的プライマーを作製し、マッピングペアレントのゲノムＤＮＡ由来の遺伝子をＰＣＲ増幅した：増幅には、次のプライマーを使用した：９０Ｆ：ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＣＡＣＣＴＧＣＴＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣ（配列番号１０８）および９１Ｒ：ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＡＣＴＧＣＣＣＡＴＴＴＣＧＴＡＧＣ（配列番号１０９）。染色ターミネーター化学（ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）によって、ＰＣＲ産物を直接配列決定し、次いで、配列を整列し、多型について解析した。
【０１６６】
ｚｍＧＥ１（ｐ０１２１．ｃｆｒｍｎ６２ｒ）で表わされる単離された核酸フラグメントでは、マッピングペアレントであるＧ６１／Ｇ３９間の多型が、コンセンサス７３位において、Ｇ６１のヌクレオチドＴで見出されたが、Ｇ３９のヌクレオチドＧでは認められなかった。
【０１６７】
多型の配置を以下に示す（ＳはＣまたはＧに対応し、ＫはＧまたはＴに対応する）：
ＣＡＣＣＴＧＣＴＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＴＴＣＧＣＧＣＣＣＴＣＳＧＧＡＧＡＣＧＣＧＣＡＣＴＧＧＣＧＣＧＧＧＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＴＣＫＣＣＧＣＣＡＡＣＣＡＣＣＴＧＴＴＣＧＧＣＣＣＧＣＧＣＣＧＣＧＴＧＧＣＧＧＧＴＧＣＣＧＣＧＣＡＣＣＡＣＣＧＣＧＣＣＴＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＧＣＣＧＡＣＧＴＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＡＴＧＧＣＧＣＧＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＧＴＣＣＣＴＣＴＣＡＡＧＣＧＣＧＴＧＣＴＧＣＡＴＧＴＣＧＣＧＴＣＴＣＴＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡＴＧＧＣＣＡＣＣＧＴＧＴＴＴＧＧＣＡＡＧＣＧＣＴＡＣＧＡＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＡＧＡＧＧＧＣＧＣＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＧＡＧＡＴＧＧＴＧＧＣＣＧＡＧＧＧＣＴＡＣＧＡＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＣＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＧＣＴＧＡＴＣＡＡＣ（配列番号１１０）。
【０１６８】
ピロシークエンシング（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（商標）（アップサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）、スウェーデン（Ｓｗｅｄｅｎ）；リッケルト（Ｒｉｃｋｅｒｔ）ら（２００２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ３２：５９２−６０３）によって、マッピング集団の９４個体を遺伝子型分類するために、多型に緊密な配列決定プライマーを作製した。配列決定プライマーＰＹ９０Ｒは、ＧＧＧＣＣＧＡＡＣＡＧＧＴＧＧＴＴＧ（配列番号１１０の７７〜９５位の相補配列、上記の下線を付した部分）である。次いで、伝承（ｈｅｒｉｔａｇｅ）スコアを使用し、マップメーカー（ＭＡＰＭＡＫＥＲ）（商標）またはジョイ
ンマップ（ＪＯＩＮＭＡＰ）（商標）を使用してコアトウモロコシ遺伝子地図上に遺伝子を配置した。クローンｐ０１２１．ｃｆｒｍｎ６２ｒを、ｂｉｎ７．０４におけるマーカーｂｎｌ８．３９の付近である第７染色体の底部にマッピングした。
【０１６９】
この地図上の位置は、高種子油に関連する量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）の１つと重複する。
【０１７０】
ＱＴＬマッピングの材料は、２つの株、４９．００７とＨ３１とを交雑させることによって開発した。４９．００７は、ＡＳＫＣ２８集団から開発された高油同系繁殖系（約２０％の核油（ｋｅｒｎｅｌ ｏｉｌ））である。Ｈ３１は、極めて低い核油含有量（約１％）を有するイリノイ・ロー・オイル（Ｉｌｌｉｎｏｉｓ Ｌｏｗ Ｏｉｌ）から誘導される公的株である（クアケンブッシュＦＷ（Ｑｕａｃｋｅｎｂｕｓｈ ＦＷ）、フィルヒＪＧ（Ｆｉｒｃｈ ＪＧ）、ブルンゾンＡＭ（Ｂｒｕｎｓｏｎ ＡＭ）およびハウスＬＲ．（Ｈｏｕｓｅ ＬＲ．）１９６３．Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍ．４０：２５０）。この交雑から、２世代の自己生殖を介して１８０のＦ２：３ファミリーを開発した。個々のＦ２植物由来のＦ３穀粒を、胚重量および他の油関連形質について評価した。核穂の中部より１００個の核部を殻から取り出し、約５％水分まで乾燥（４日間４０℃）させ、秤量し、ＮＭＲで油含有量を決定した。１００個の核部からの無作為の部分サンプルから２０個の胚を切り出し、胚重量を決定した。各Ｆ３ファミリーの２０個の実生を温室で成長させ、実生の葉を個々のファミリーに基づいてまとめた。葉のサンプルを凍結乾燥し、粉体に粉砕し、ＤＮＡ抽出に使用した。９６ウェル形式におけるミニＣＴＡＢ法によりゲノムＤＮＡを抽出した。ＳＳＲマーカーをこのマッピング研究に使用した。蛍光末端標識プライマー、ＡＢＩ３７７ ＤＮＡシークエンサー、ジーンスキャン（ＧｅｎｅＳｃａｎ）（商標）ならびにゲノタイパー（Ｇｅｎｏｔｙｐｅｒ）（商標）ソフトウェア上でのピーク検出および対立遺伝子同定の使用を含むＡＢＩ ＰＲＩＳＭ系を使用して、全ての遺伝子型を検出した。合計で８９の多型ＳＳＲをマッピング解析に使用した。連鎖地図はＭＡＰＭＡＫＥＲによって集成し、ＭＡＰＭＡＮＡＧＥＲで確認した。合成（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）インターバルマッピングを介して各形質の平均値に対してＱＴＬ解析を行った。ＱＴＬカートグラファー（Ｃａｒｔｏｇｒａｐｈｅｒ）を使用して、解析を実施した。解析に使用した重要なパラメータは以下の通りである：
マッピング機能：コサンビ（Ｋｏｓａｍｂｉ）
ＱＴＬマッピング方法：合成（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）インターバルマッピング
有意性閾値：ＬＯＤ＝２．５
直線回帰および変数減少（ｂａｃｋｗａｒｄ）・変数増減（ｓｔｅｐｗｉｓｅ）直線回帰のための有意検定：ａ＝０．０５
【０１７１】
高油種子の胚重量形質に対するＱＴＬは第７染色体上に存在すると思われた。推定ＱＴＬは、ＥＳＴ ｐ０１２１．ｃｆｒｎ６２ｒ（ｚｍＧＥ１）がマッピングされた領域にある。
【０１７２】
実施例１７
トウモロコシＧＥ相同物の発現解析
ＧＥ相同物と高油形質との間の潜在的相関性を調べるために、ｚｍＧＥ２の発現パターンを解析した。
【０１７３】
発現研究は、様々な株の様々なトウモロコシ組織から得たＭＰＳＳ（大規模並列サイン配列決定（Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ））データ（Ｂｒｅｎｎｅｒら２０００．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：６３０−６３４；Ｂｒｅｎｎｅｒら（２０００）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９７：１６６５−１６７０）と比較することによって行った。Ｍ
ＰＳＳデータは、それぞれのライブラリーについて１，０００，０００クローン間の大量の特定のｃＤＮＡデータクローンを考察する際の発現レベルの調査を可能にする。単一のＤＮＡに独特である比較的多量の特定のタグ付けされた配列は、該組織において対応するＲＮＡの蓄積の相対レベルに相関する。受粉１５日後に単離された胚組織由来のｃＤＮＡにおける特異的タグ配列ＧＡＴＣＧＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＴ（配列番号１１１）の存在下で、試験したすべての品種でＧＥ相同物ｚｍＧＥ２の発現を検出した。種子中に正常な油蓄積を有するトウモロコシ品種では、ｚｍＧＥ２は、野生型品種Ｂ７３で２３８／１，０００，０００の頻度（百万あたり２３８部または２３８ｐｐｍ）で発現され、野生型ＡＳＫ サイクル（ｃｙｃｌｅ）０では２６３ｐｐｍで発現された。対照的に、高油トウモロコシ株におけるｚｍＧＥ２の発現は、５０％を超えて減少した。高油株ＱＸ４７では、ｚｍＧＥ２は、８９ｐｐｍと有意に低い頻度で発現された。別の高油株ＡＳＫ ２８サイクルズ（ｃｙｃｌｅｓ）では、発現レベルは１１３ｐｐｍであった。第３の高油品種ＩＨＯは、７８ｐｐｍの蓄積率を示した。ＡＳＫ０（正常）および２８サイクルズ（ｃｙｃｌｅｓ）の２つの株は同じバックグランドから誘導されるため、発現の減少は、ＡＳＫ０（正常）と２８サイクルズ（ｃｙｃｌｅｓ）との間で特に顕著である。
【０１７４】
これらのデータは、トウモロコシＧＥ相同物の１つ、ｚｍＧＥ２が、高油株の発生中の胚での発現において実質的にダウンレギュレートされたことを示した。発現研究の結果から、このＧＥ相同物は、トウモロコシ種子中の高油形質と負の相関を有することが確認された。このことは、ＧＥ遺伝子の変異が胚の肥大および高油表現型を生じたイネの結果と一致する。
【０１７５】
なお、本発明の特徴または主な態様は次のとおりである。
１．（ａ）種子発生期（ｄｕｒｉｎｇ ｓｅｅｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号２、７、１１、１９、２７、もしくは３３から成る群より選択される第２のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法に基づいて少なくとも６１％のアミノ酸同一性を有する核酸配列、または
（ｂ）種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号１５、１７、３１、９３、９５、９７、もしくは９９から成る群より選択される第３のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル法に基づいて少なくとも６５％のアミノ酸同一性を有する核酸配列、
または
（ｃ）種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号９、１３、２３、２９、３５、もしくは４１から成る群より選択される第４のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル法に基づいて少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有する核酸配列、または
（ｄ）種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号２１、２５、３７、もしくは３９から成る群より選択される第２のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル法に基づいて少なくとも７７％のアミノ酸同一性を有する核酸配列、または
（ｅ）（ａ）もしくは（ｂ）もしくは（ｃ）もしくは（ｄ）の相補体、
から成る群より選択される核酸配列を含んで成る単離されたヌクレオチドフラグメント。２．配列番号８０〜９１に記載のアミノ酸配列のいずれかに実質的に対応する少なくとも１つのモチーフを含んで成り、前記モチーフが保存された部分配列である、前記第１項に記載の単離されたヌクレオチド配列、またはその相補体。
３．前記フラグメントまたはその部分が、形質転換された植物の種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドの相互抑制またはアンチセンス阻害に有用である前記第１項または２項に記載の単離されたヌクレオチド。
４．プロモーターを含んで成る単離された核酸フラグメントであって、前記プロモーター
が、配列番号３、４、１０４、もしくは１０５に記載のヌクレオチド配列から本質的に成るか、あるいは前記プロモーターが、配列番号３、４、１０４、もしくは１０５に記載のヌクレオチド配列に実質的に類似するかまたは機能的に等価であるフラグメントまたはサブフラグメントから本質的に成る単離された核酸フラグメント。
５．少なくとも１つの調節配列に操作可能に連結された前記第１項または２項に記載の単離された核酸フラグメントを含んで成るキメラ構築物。
６．少なくとも１つの調節配列に操作可能に連結された前記第３項に記載の単離された核酸フラグメントを含んで成るキメラ構築物。
７．前記単離された核酸フラグメントが、前記第４項に記載のプロモーターに操作可能に連結されている前記第５項に記載のキメラ構築物。
８．前記単離された核酸フラグメントが、前記第４項に記載のプロモーターに操作可能に連結されている前記第６項に記載のキメラ構築物。
９．ゲノム内に前記第５項に記載のキメラ構築物を含んで成る植物。
１０．ゲノム内に前記第６項に記載のキメラ構築物を含んで成る植物。
１１．ゲノム内に前記第７項に記載のキメラ構築物を含んで成る植物。
１２．ゲノム内に前記第８項に記載のキメラ構築物を含んで成る植物。
１３．前記第９項に記載の植物から得られる種子。
１４．前記第１０項に記載の植物から得られる種子。
１５．前記第１１項に記載の植物から得られる種子。
１６．前記第１２項に記載の植物から得られる種子。
１７．前記第１３項に記載の種子から得られる油。
１８．前記第１４項に記載の種子から得られる油。
１９．前記第１５項に記載の種子から得られる油。
２０．前記第１６項に記載の種子から得られる油。
２１．前記植物が、イネ、トウモロコシ、モロコシ、キビ、ライムギ、ダイズ、カノーラ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、豆類、およびナッツ類から成る群より選択される前記第９項に記載の植物。
２２．前記植物が、イネ、トウモロコシ、モロコシ、キビ、ライムギ、ダイズ、カノーラ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、豆類、およびナッツ類から成る群より選択される前記第１０項に記載の植物。
２３．前記植物が、イネ、トウモロコシ、モロコシ、キビ、ライムギ、ダイズ、カノーラ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、豆類、およびナッツ類から成る群より選択される前記第１１項に記載の植物。
２４．前記植物が、イネ、トウモロコシ、モロコシ、キビ、ライムギ、ダイズ、カノーラ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、豆類、およびナッツ類から成る群より選択される前記第１２項に記載の植物。
２５．前記第５項に記載のキメラ構築物を含んで成る、形質転換された植物組織または植物細胞。
２６．前記第６項に記載のキメラ構築物を含んで成る、形質転換された植物組織または植物細胞。
２７．前記第７項に記載のキメラ構築物を含んで成る、形質転換された植物組織または植物細胞。
２８．前記第８項に記載のキメラ構築物を含んで成る、形質転換された植物組織または植物細胞。
２９．植物が、イネ、トウモロコシ、モロコシ、キビ、ライムギ、ダイズ、カノーラ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、豆類、およびナッツ類から成る群より選択される前記第２５項に記載の植物組織または植物細胞。
３０．植物が、イネ、トウモロコシ、モロコシ、キビ、ライムギ、ダイズ、カノーラ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、豆類、およびナッツ類から成る群より選択される前記第２６項に記載の植物組織または植物細胞。
３１．植物が、イネ、トウモロコシ、モロコシ、キビ、ライムギ、ダイズ、カノーラ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、豆類、およびナッツ類から成る群より選択される前記第２７項に記載の植物組織または植物細胞。
３２．植物が、イネ、トウモロコシ、モロコシ、キビ、ライムギ、ダイズ、カノーラ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、豆類、およびナッツ類から成る群より選択される前記第２８項に記載の植物組織または植物細胞。
３３．（ａ）前記第５項に記載のキメラ構築物で植物を形質転換し、
（ｂ）キメラ構築物の発現に適切な条件下で形質転換された植物を成長させ、そして
（ｃ）改変された胚／内乳のサイズを有する種子を産生する上記形質転換された植物を選択する、
ことを含んで成る、植物の種子発生期における胚／内乳のサイズの制御方法。
３４．（ａ）前記第６項に記載のキメラ構築物で植物を形質転換し、
（ｂ）キメラ構築物の発現に適切な条件下で形質転換された植物を成長させ、そして
（ｃ）改変された胚／内乳のサイズを有する種子を産生する前記形質転換された植物を選択する、
ことを含んで成る、植物の種子発生期における胚／内乳のサイズの制御方法。
３５．（ａ）前記第７項に記載のキメラ構築物で植物を形質転換し、
（ｂ）キメラ構築物の発現に適切な条件下で形質転換された植物を成長させ、そして
（ｃ）改変された胚／内乳のサイズを有する種子を産生する前記形質転換された植物を選択する、
ことを含んで成る、植物の種子発生期における胚／内乳のサイズの制御方法。
３６．（ａ）前記第８項に記載のキメラ構築物で植物を形質転換し、
（ｂ）キメラ構築物の発現に適切な条件下で形質転換された植物を成長させ、そして
（ｃ）改変された胚／内乳のサイズを有する種子を産生する前記形質転換された植物を選択する、
ことを含んで成る、植物の種子発生期における胚／内乳のサイズの制御方法。
３７．（ａ）配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、９３、９５、９７、または９９と、種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連する他のポリペプチド配列とを比較し、
（ｂ）工程（ａ）において得られる保存配列すなわち４つもしくはそれ以上のアミノ酸
を同定し、
（ｃ）工程（ｂ）において同定される保存配列に基づいて領域特異的ヌクレオチドプロ
ーブまたはオリゴマーを作製し、そして
（ｄ）工程（ｃ）のヌクレオチドプローブまたはオリゴマーを使用して、配列依存性プロトコルにより種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連する配列を単離する、ことを含んで成る、種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するポリペプチドをコードする核酸フラグメントの単離方法。
３８．（ａ）２種の植物種を交雑させ、そして
（ｂ）工程（ａ）の交雑から得られる子孫植物における、
（ｉ）配列番号１、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、もしくは１０５から成る群より選択される核酸配列、または
（ｉｉ）配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、８０〜９１、９３、９５、９７、もしくは９９から成る群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列、
について遺伝子の変異を評価することを含んで成り、その際、評価を、ＲＦＬＰ解析、ＳＮＰ解析、およびＰＣＲに基づく解析から成る群より選択される方法を使用して行う、胚／内乳のサイズを制御することおよび／または植物の油表現型を改変することに関する遺
伝子の変異のマッピング方法。
３９．（ａ）２種の植物種を交雑させ、そして
（ｂ）工程（ａ）の交雑から得られる子孫植物における
（ｉ）配列番号１、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、もしくは１０５から成る群より選択される核酸配列、または
（ｉｉ）配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、８０〜９１、９３、９５、９７、もしくは９９から成る群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列、
について遺伝子の変異を評価することを含んで成り、その際、評価を、ＲＦＬＰ解析、ＳＮＰ解析、およびＰＣＲに基づく解析から成る群より選択される方法を使用して行う、胚／内乳のサイズを制御するための分子育種および／または植物の油表現型の改変方法。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】ＧＥ遺伝子およびｇｅ変異体対立遺伝子の配列のアラインメントを示す。巨大胚表現型を生じる対立遺伝子変異を相補鎖上において「＊」で示す。それぞれの変異を標識し、塩基の変化を示し（コーディング鎖における対応する相補塩基の変化を下部に示す）、得られるアミノ酸の変化を挿入して示す（即ち、野生型−＞変異型）。ｇｅ−１変異体はヌクレオチド位置１４８２のＧをＡに改変する変異を有し、対応するＴｒｐ残基を未熟な翻訳終止に変化した（ＵＧＧコドンからＵＧＡへ）。ｇｅ−２では、ヌクレオチド位置１４５１のＧはＡに改変され、これもコードされたＴｒｐを未熟な翻訳終止（ＵＡＧ）に変化した。ｇｅ−３およびｇｅ−９では、ヌクレオチド位置１１７７のＣはＴに改変され、シトクロムＰ４５０タンパク質間で高度に保存されているＰｒｏ残基を、Ｓｅｒに変化した。ｇｅ−４では、ヌクレオチド位置１３８８のＣはＧに改変され、Ｐｒｏ残基をＡｌａに変化した。ｇｅ−５では、ヌクレオチド位置２８のＣはＴに改変され、未熟な翻訳終止（ＵＡＡ）を生じた。ｇｅ−６では、ヌクレオチド位置１０６７のＡはＣに改変され、ＣＹＰ７８群間で保存されているＧｌｎのＰｒｏへの変化を生じた。ｇｅ−８では、本発明者らは次の２つの変異を見出した：ヌクレオチド位置５５９のＴがＣに改変されて、ＳｅｒのＰｒｏへの変化を生じ、ヌクレオチド位置１３２８のＣがＴに改変されて、ＰｒｏのＬｅｕへの変化を生じた。ヌクレオチド位置９７２と９７３との間に９１ヌクレオチド長のイントロンが見出された。
【図２】イネＧＥ（配列番号２）、オオムギＧＥ−相同物（配列番号９３）、トウモロコシＧＥ１−相同物（配列番号９５）、トウモロコシＧＥ２−相同物（配列番号９７）、トウモロコシＧＥ３−相同物（配列番号９９）、ユリＧＥ−相同物（配列番号４１）、ランｇｉ１１７３６２４（配列番号４３）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ｇｉ１２３５１３８（配列番号４２）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ｇｉ８９２０５７６（配列番号４７）、オダマキＧＥ−相同物（配列番号３５）、ダイズＧＥ−相同物（配列番号２３）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ｇｉ１１２４９５１１（配列番号４４）、ダイズｇｉ５９２１９２６（配列番号４５）、ダイズＧＥ−相同物（配列番号２５）、ダイズＧＥ−相同物（配列番号２１）、およびアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ｇｉ３８３１４４０（配列番号４６）のアラインメントを示す。囲み内の残基は、バイオスカウト（Ｂｉｏｓｃｏｕｔ）ＤＳＣプログラム（キング（Ｋｉｎｇ）およびスターンベルグ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ）（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ５：２２９８−２３１０）によって同定される推定されたヘリックス領域である。他の囲み内のエレメントは、「ＳＲＳ」またはシトクロムＰ４５０構造における高変異性配列である基質認識部位、シトクロムＰ４５０におけるプロリン（しばしばＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）の「ＰＰＰ」クラスター、基質アクセスチャンネル（配列番号８３の保存された配列モチーフの部分）である「Ｆ−Ｇループ」、保存された「ＧＸＤＴ」（ヘム相互作用および酵素触媒に関与するプロトン移動溝）（配列番号８５の保存された配列モチーフの部分）、「ＥＸＸＲ」（ヘム安定化およびコア構造の安定性に必要な全てのシトクロムＰ４５０において保存されたＫ−ヘリックスモチーフ）（配列番号８８の保存された配列モチーフの部分）、ならびに「ＦＸＸＧＸＲＸＣＸＧ」（ヘムに接触するシステインを有する保存されたヘム結合部位）（配列番号９０の保存された配列モチーフの部分）を含む。
【図１Ａ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図１Ｂ】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００１年６月５日に出願された米国仮出願第６０／２５９，９２１号（その内容全体が参考として本明細書に援用される）および２００１年１１月２８日に出願された米国仮出願第６０／３３４，３１７号（その内容全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、植物の育種および遺伝学の分野にあり、特に、種子発生期における胚／内乳のサイズを改変するのに有用な組換え構築物に関する。
【背景技術】
【０００３】
デンプンおよびタンパク質の貯蔵器官としての内乳の最終容積は穀物における胚のサイズの影響を受けるため、発生過程の胚のサイズが遺伝的にどのようにして調節されるかを解明することは重要である。研究者らは、胚のサイズに関連する遺伝子が内乳の発生の調節に寄与することを見出している。穀物の内乳は多くの国において主食であるため、これらの遺伝子について調査することは農業に重要である。また、様々な穀粒の胚は油を含む多くの価値のある栄養素の供給源であるため、重要である。
【０００４】
巨大胚（ｇｅ）変異については、（非特許文献１）に最初に記載された。胚のサイズが増加すると、ヒトの消費に所望される胚の油および栄養特性の増加を生じるため、巨大胚変異は穀物の品質改善に潜在的に有用な特徴である。また、胚を増大させると、穀粒のプロセシングにおいてしばしば重要な特徴である胚関連酵素の活性が増加する。変異は第７染色体に遺伝子的にマッピングされ（（非特許文献２）、（非特許文献３））、さらなるｇｅ対立遺伝子も第７染色体に位置決定された（（非特許文献４））。ｇｅ変異は、形態的および遺伝子レベルで、（非特許文献５）により解析された。この刊行物は、適切な内乳の発生に必要なＧＥ遺伝子に関連した。内乳および胚のサイズの両方は変異の影響を受けるため、ＧＥは、発生期の内乳および胚の調和した増殖を制御するようである。ｇｅにおける胚および内乳の形態学的変化と並んで、ｇｅの種子は野生型と比べてよりも多くの油を蓄積することも明らかにされた（（非特許文献６）、（非特許文献７））。
【０００５】
ＧＥ遺伝子の機能消失により内乳組織を犠牲にして胚組織が増大することが明らかにされている。この発生過程の変化は、種子植物中の油などの胚特異的代謝物の量を増加するのに有用であり得る。ＧＥ遺伝子の広範な遺伝子および形態学的特徴にもかかわらず、このタンパク質をコードする核酸の分子解析はない。ＧＥによってコードされるタンパク質の正体については報告されていない。ＧＥ遺伝子、および該遺伝子がコードするタンパク質をより良好に理解することは、イネの胚のサイズを制御するプロセスを完全に理解するのに必要であろう。
【０００６】
【非特許文献１】サトウ（Ｓａｔｏｈ）およびオムラ（Ｏｍｕｒａ）著、Ｊａｐ．Ｊ．Ｂｒｅｅｄ．第３１巻、（１９８１年）、ｐ．３１６−３２６
【非特許文献２】イワタ（Ｉｗａｔａ）およびオムラ（Ｏｍｕｒａ）著、Ｊａｐａｎ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．第５９巻、１９８４年、ｐ．１９９−２０４
【非特許文献３】サトウ（Ｓａｔｏｈ）およびイワタ（Ｉｗａｔａ）著、Ｊａｐａｎ．Ｊ．Ｂｒｅｅｄ．第４０巻（補遺２）、１９９０年、ｐ．２６８−２６９
【非特許文献４】コウ（Ｋｏｈ）ら著、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．第９３巻、１９９６年、ｐ．２５７−２６１
【非特許文献５】ホン（Ｈｏｎｇ）ら著、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ第１２２巻、１９９４年、ｐ．２０５１−２０５８
【非特許文献６】マツオ（Ｍａｔｓｕｏ）ら著、Ｊａｐａｎ．Ｊ．Ｂｒｅｅｄ．第３７巻、１９８７年、ｐ．１８５−１９１
【非特許文献７】オクノ（Ｏｋｕｎｏ）著、「稲学大成（Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｉｃｅ Ｐｌａｎｔ）」第３巻、マツオ（Ｍａｔｓｕｏ）ら編、食料・農業政策研究センター（Ｆｏｏｄ ａｎｄ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ｐｏｌｉｃｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｅｎｔｅｒ）、日本、東京（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、１９９７年、ｐ．４３３−４３５
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、
（ａ）種子発生期（ｄｕｒｉｎｇ ｓｅｅｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号２、７、１１、１９、２７、もしくは３３から成る群より選択される第２のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法に基づいて少なくとも６１％のアミノ酸同一性を有する核酸配列、または
（ｂ）種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号１５、１７、３１、９３、９５、９７、もしくは９９から成る群より選択される第３のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル法に基づいて少なくとも６５％のアミノ酸同一性を有する核酸配列、または
（ｃ）種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号９、１３、２３、２９、３５、もしくは４１から成る群より選択される第４のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル法に基づいて少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有する核酸配列、または
（ｄ）種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号２１、２５、３７、もしくは３９から成る群より選択される第２のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル法に基づいて少なくとも７７％のアミノ酸同一性を有する核酸配列
から成る群より選択される核酸配列を含んで成る単離されたヌクレオチドフラグメントに関する。
【０００８】
また、そのような単離されたヌクレオチドフラグメントの相補体も対象となる。
【０００９】
第２の実施態様では、本発明は、配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、９３、９５、９７、もしくは９９に記載のアミノ酸配列のいずれかに実質的に相当する少なくとも１つのモチーフを含んで成るそのような単離されたヌクレオチド配列またはその相補体に関し、前記モチーフは保存された部分配列である。特に同定することができるそのようなモチーフの例を配列番号８０〜９１に示す。また、形質転換された植物のシトクロムＰ４５０活性のアンチセンス阻害もしくは相互抑制（ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）におけるそのようなフラグメントまたはその一部の使用も対象となる。
【００１０】
第３の実施態様では、本発明は、請求項１に記載のそのような単離されたヌクレオチドフラグメントまたはその相補体に関し、該フラグメントまたはその一部は、形質転換された植物のシトクロムＰ４５０活性のアンチセンス阻害もしくは相互抑制（ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）において有用である。
【００１１】
第４の実施態様では、本発明は、種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連する第１のポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る単離されたヌクレオチド配列フ
ラグメントに関し、前記ポリペプチドは、配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、９３、９５、９７、もしくは９９から成る群より選択される第２のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル法に基づいて少なくとも５０％、５５％、６０％、６１％、６５％、７０％、７５％、７７％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のアミノ酸同一性を有する。また、そのような配列の相補体も対象となる。
【００１２】
第５の実施態様では、本発明は、配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、９３、９５、９７、もしくは９９に記載のアミノ酸配列のいずれかに実質的に相当する少なくとも１つのモチーフを含んで成る単離されたヌクレオチド配列またはその相補体に関し、前記モチーフは保存された部分配列である。これらのフラグメントもしくは相補体またはいずれかの一部のいずれかが形質転換された植物のシトクロムＰ４５０活性のアンチセンス阻害もしくは相互抑制（ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）において有用であることができる。
【００１３】
第６の実施態様では、本発明は、プロモーターを含んで成る単離された核酸フラグメントに関し、前記プロモーターは配列番号３、４、１０４、もしくは１０５に記載のヌクレオチド配列から本質的に成るか、あるいは前記プロモーターは、配列番号３、４、１０４、もしくは１０５に記載のヌクレオチド配列に実質的に類似するかまたは機能的に等価であるフラグメントもしくはサブフラグメントから本質的に成る。
【００１４】
第７の実施態様では、本発明は、少なくとも１つの調節配列に操作可能に連結された前記核酸フラグメントもしくは相補体のいずれかまたはいずれかの一部を含んで成るキメラ構築物に関する。また、ゲノム中にそのようなキメラ構築物を含んで成る植物、そのような植物から得られる植物組織または細胞、これらの植物から得られる種子およびそのような種子から得られる油も対象となる。
【００１５】
第８の実施態様では、本発明は、
（ａ）本発明のキメラ構築物で植物を形質転換し、
（ｂ）キメラ構築物の発現に適切な条件下で形質転換された植物を成長させ、そして
（ｃ）改変された胚／内乳のサイズを有する種子を産生する前記形質転換された植物を選択する、
ことを含んで成る、植物の種子発生期における胚／内乳のサイズの制御方法に関する。
【００１６】
第９の実施態様では、本発明は、
（ａ）配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、９３、９５、９７、または９９と種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連する他のポリペプチド配列とを比較し、
（ｂ）工程（ａ）において得られる保存配列すなわち４つもしくはそれ以上のアミノ酸を同定し、
（ｃ）工程（ｂ）において同定される保存配列に基づいて領域特異的ヌクレオチドプローブまたはオリゴマーを作製し、そして
（ｄ）工程（ｃ）のヌクレオチドプローブまたはオリゴマーを使用して、配列依存性プロトコルにより種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連する配列を単離する、ことを含んで成る、種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するポリペプチドをコードする核酸フラグメントの単離方法に関する。
【００１７】
第１０の実施態様では、本発明はまた、
（ａ）２種の植物種を交雑させ、そして
（ｂ）工程（ａ）の交雑から得られる子孫植物における、
（ｉ）配列番号１、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、もしくは１０５から成る群より選択される核酸配列、または
（ｉｉ）配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、８０〜９１、９３、９５、９７、もしくは９９から成る群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列、
について遺伝子の変異を評価することを含んで成り、その際、評価を、ＲＦＬＰ解析、ＳＮＰ解析、およびＰＣＲに基づく解析から成る群より選択される方法を使用して行う、胚／内乳のサイズを制御することおよび／または植物の油表現型を改変することに関する遺伝子の変異のマッピング方法にも関する。
【００１８】
第１１の実施態様では、本発明は、
（ａ）２種の植物種を交雑させ、そして
（ｂ）工程（ａ）の交雑から得られる子孫植物における、
（ｉ）配列番号１、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、もしくは１０５から成る群より選択される核酸配列、または
（ｉｉ）配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、８０〜９１、９３、９５、９７、もしくは９９から成る群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列、
について遺伝子の変異を評価することを含んで成り、その際、評価を、ＲＦＬＰ解析、ＳＮＰ解析、およびＰＣＲに基づく解析から成る群より選択される方法を使用して行う、種子発生期において改変された胚／内乳のサイズおよび／または植物の改変された油表現型を得るための分子育種方法に関する。
【００１９】
本発明は、本出願の一部をなす下記の詳細な説明および添付の図面および配列表によりさらに完全に理解することができる。
【００２０】
表１は、本明細書で記述されるポリペプチド、これらのポリペプチドの全部または実質的な部分を表すポリペプチドをコードする核酸フラグメントを含んで成るゲノムまたはｃＤＮＡクローンの呼称、および添付の配列表において使用される対応する識別名（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）（配列番号）を列挙する。配列の記述およびそれに付属された配列表は、米国特許法施行規則第３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１〜１．８２５に示されるような、特許出願におけるヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列の開示に適用される規則に従う。
【００２１】
【表１】
【００２２】
【表２】
【００２３】
配列番号１および２は、それぞれ、変異した場合に巨大胚表現型を担うイネのシトクロムＰ４５０遺伝子に対する野生型オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ＤＮＡ配列および翻訳されたアミノ酸配列を表す。配列番号３は、９１ヌクレオチドイントロン（９２７３〜９３６３）によって中断されるＧＥ ＯＲＦ（ヌクレオチド位置８３０１〜９９６９）を含有する１７ｋｂのゲノムＤＮＡ配列を表す。配列番号４は、遺伝子に対するプロモーターおよびＧＥ ｍＲＮＡの５’非翻訳（ＵＴＲ）部分を含有するＧＥ ＯＲＦの上流の８３００ヌクレオチドを表す。配列番号５は、遺伝子の３’ＵＴＲおよびポリアデニル化配列を含有するＧＥ ＯＲＦの下流の７２２４ヌクレオチドを表す。ＧＥの他には、ブラスト（ＢＬＡＳＴ）相同性によって検出されるイネゲノムのこの１７ｋｂ領域内に含有される他の遺伝子は存在しなかった。配列番号８０〜９１は、ＧＥの機能的相同物である、シトクロムＰ４５０遺伝子を同定するのにさらに有用な保存された配列モチーフである。配列番号１０４および１０５は、それぞれ、トウモロコシ相同物ｚｍＧＥ１およびｚｍＧＥ２に対する上流プロモーター配列である（詳細については実施例１３を参照のこと）。
【００２４】
配列表は、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３０２１−３０３０（１９８５）およびＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ２１９（Ｎｏ．２）：３４５−３７３（１９８４）（参考として本明細書に引用される）に記述されるＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＭＢ標準に従って規定される通り、ヌクレオチド配列文字の１文字記号およびアミノ酸の３文字記号を含有する。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列データに使用される記号および形式は米国特許法施行規則第３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に示される規則に従う。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本明細書において使用される「単離された核酸フラグメント」は、一本鎖もしくは二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであり、必要に応じて、合成、非天然または改変されたヌクレオチド塩基を含有する。ＤＮＡのポリマーの形態の単離された核酸フラグメントは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントから成り得る。ヌクレオチド（通常、５’一リン酸の形で見出される）については、次の一文字呼称、つまり（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡに対する）アデニル酸またはデオキシアデニル酸は「Ａ」、シチジル酸またはデオキシシチジル酸は「Ｃ」、グアニル酸またはデオキシグアニル酸は「Ｇ」、ウリジル酸は「Ｕ」、デオキシチミジル酸は「Ｔ」、プリンは「Ｒ」（ＡまたはＧ）、ピリミジンは「Ｙ」（ＣまたはＴ）、ＧまたはＴは「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴは「Ｈ」、イノシンは「Ｉ」、および任意のヌクレオチドは「Ｎ」で呼ばれる。
【００２６】
用語「機能的に等価なサブフラグメント」および「機能的等価サブフラグメント」は、本明細書において交換可能に使用される。これらの用語は、フラグメントまたはサブフラグメントが活性な酵素をコードするか否かにかかわらず、遺伝子発現を改変または所定の
表現型を産生する能力が保持されている単離された核酸フラグメントの一部分または部分配列を指す。例えば、フラグメントまたはサブフラグメントは、所望する表現型を形質転換した植物内に産生するためのキメラ構築物の設計に使用することができる。キメラ構築物は、活性な酵素をコードするか否かにかかわらず、植物プロモーター配列に関係する適当な配向で、核酸フラグメントもしくはそのサブフラグメントを連結して相互抑制（ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）またはアンチセンス的に使用するために設計することができる。
【００２７】
用語「相同性」、「相同的」、「実質的に類似」および「実質的に対応」は、本明細書において交換可能に使用される。それらは、１個以上のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現を媒介または所定の表現型を産生するための核酸フラグメントの能力に影響を及ぼさない核酸フラグメントを指す。これらの用語はまた、得られた核酸フラグメントの機能的性質を、当初の改質されていないフラグメントと比較して、実質的に改変しない１個以上のヌクレオチドの欠失または挿入のような本発明の核酸フラグメントの改質をも指す。従って、本技術分野の熟練者であれば、本発明が、特定の例示配列以上のものも包含することを認めることが理解される。
【００２８】
さらに、熟練者は、本発明に包含される本質的に類似した核酸配列は、中程度のストリンジェント条件（例えば、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃）下において、本明細書において例示する配列か、または本明細書に報告したヌクレオチド配列ならびに本発明の遺伝子およびプロモーターに機能的に等価なヌクレオチド配列の任意の部分にハイブリダイズする能力によっても規定されることを認める。ストリンジェンシーな条件を調整して、遠い関係の生物体由来の相同配列などの中等度に類似のフラグメントから、近い関係の生物体由来の機能的酵素を複製する遺伝子などの、高度に類似のフラグメントまでをスクリーニングすることができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄はストリンジェンシー条件を決定する。１組の好適な条件は、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、室温、１５分間で開始し、次いで、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、４５℃、３０分間で反復し、次いで、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５０℃、３０分間を２回反復する一連の洗浄を使用する。より好適な組のストリンジェントな条件は、より高い温度を使用し、ここで洗浄は、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳによる最後の２回の３０分間の洗浄の温度を６０℃にまで上昇させたことを除いて、上記の洗浄と同一である。もう１つの好適な組の高度にストリンジェントな条件は、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で最後の２回の洗浄を使用する。
【００２９】
標的（内因性）ｍＲＮＡと、標的ｍＲＮＡに相同性を有する構築物におけるＲＮＡ領域との間の実質的な類似性の程度について、そのような配列は、少なくとも２５ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド長、より好ましくは１００ヌクレオチド長、さらに好ましくは２００ヌクレオチド長、最も好ましくは３００ヌクレオチド長であるべきであり、少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、最も好ましくは少なくとも９５％同一であるべきである。
【００３０】
配列の整列および類似性のパーセントの計算は、レーザージーン（ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ）生物情報工学コンピュータ計算ソフトウェアパッケージ（ＤＮＡスター社（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ））のメガラ
イン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラムを含むがこれに限定されない相同配列を検出するために設計された様々な比較方法を使用して決定することができる。配列の複数の整列は、デフォルトのパラメータ（ギャップ ペナルティ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ）＝１０、ギャップ長ペナルティ（ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ）＝１０）を用いるクラスタル整列方法（ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３）を使用して実施する。クラスタル法を使用する対にした
整列ならびにタンパク質配列の同一性パーセントの計算のためのデフォルトのパラメータは、ケチュプル（ＫＴＵＰＬＥ）＝ １、ギャップ ペナルティ（ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ）＝３、ウィンドウ（ＷＩＮＤＯＷ）＝５およびダイアゴナルズ セイブ
ド（ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ）＝５である。核酸の場合、これらのパラメータは
ケチュプル（ＫＴＵＰＬＥ）＝ ２、ギャップ ペナルティ（ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ）＝５、ウィンドウ（ＷＩＮＤＯＷ）＝４およびダイアゴナルズ セイブド（
ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ）＝４である。
【００３１】
「遺伝子」は、コーディング配列の前（５’非コーディング配列）および後（３’非コーディング配列）に調節配列を含む特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを指す。「生来の遺伝子」は、それ自体の調節配列と共に天然に見出されるような遺伝子を指す。「キメラ構築物」は、天然では通常は一緒に見出されない核酸フラグメントの組み合わせを指す。従って、キメラ構築物は、異なる起源に由来する調節配列およびコーディング配列、または同じ起源から由来するが、しかし天然に見出されるものとは異なる様式で配列される調節配列およびコーディング配列を含んでいてもよい。「外来」遺伝子は、宿主生物体内に通常は見出されない遺伝子を指すが、しかしこれは遺伝子導入により宿主生物体内に導入される。外来遺伝子は、非生来の生物体内に挿入された生来の遺伝子、またはキメラ構築物を含むことができる。「導入遺伝子」は、形質転換操作によりゲノム中に導入されている遺伝子である。
【００３２】
「コーディング配列」は特定のアミノ配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「調節配列」は、コーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、内、または下流（３’非コーディング配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または関連するコーディング配列の翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。調節配列として、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
「プロモーター」は、コーディング配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。プロモーター配列は、近接およびより遠位の上流エレメントから成り、後者のエレメントはしばしばエンハンサーと称される。従って、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することが可能でありかつプロモーターのレベルもしくは組織特異性を高めるように挿入されたプロモーターの先天的エレメントまたは異種エレメントであってもよいＤＮＡ配列である。プロモーターは、遺伝子の転写される部分内、および・または転写される配列の下流に位置することができる。プロモーターはそっくりそのまま生来の遺伝子に由来してよいか、または、天然に見出される多様なプロモーター由来の多様なエレメントから構成されてよいか、または合成ＤＮＡセグメントさえ含むことができる。多様なプロモーターは、多様な組織もしくは細胞タイプにおいて、あるいは発生の多様な段階で、または多様な環境条件に応答して、単離された核酸フラグメントの発現を指令することができることが、当業者により理解される。大部分の時点での大部分の細胞タイプにおいて単離された核酸フラグメントを発現させるプロモーターは普遍的に「構成性プロモーター」と称される。植物細胞中で有用な多様なタイプの新規プロモーターが常に発見されており；多数の例をオカムロおおびゴールドベルグの総説（Ｏｋａｍｕｒｏ
ａｎｄ Ｇｏｌｄｂｅｒｇ（１９８９），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ１５：１−８２）中に見出すことができる。大部分の場合で調節配列の正確な境界が完全に規定されていないため、一部分の変形を持つＤＮＡフラグメントは、同じプロモーター活性を有していることがあることもさらに認められている。
【００３４】
本発明の核酸フラグメントを発現させるのに有用であり得るプロモーターの特定の例としては、本出願に開示されているＧＥプロモーター（配列番号４）、オレオシンプロモーター（ＰＣＴ公開ＷＯ９９／６５４７９、１９９９年１２月１２日公開）、トウモロコシ
２７ｋＤゼインプロモーター（ウエダ（Ｕｅｄａ）ら（１９９４）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ１４：４３５０−４３５９）、ユビキチンプロモーター（クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）ら（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １８：６７５−６８０）、ＳＡＭシンテターゼ（ＰＣＴ公開ＷＯ００／３７６６２、２０００年６月２９日公開）、またはＣａＭＶ３５Ｓ（オデル（Ｏｄｅｌｌ）ら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
「イントロン」は、タンパク質配列の一部分をコードしていない遺伝子中に介在する配列である。従って、この配列はＲＮＡ中に転写はされるが、しかし切り取られて翻訳されない。この用語はまた、切除されたＲＮＡ配列についても使用される。「エキソン」は、転写され、遺伝子に由来する成熟したメッセンジャーＲＮＡ中に見いだされるが、しかし必ずしも最終の遺伝子産物をコードする配列の一部分とはならない。
【００３６】
「翻訳リーダー配列」は、遺伝子のプロモーター配列とコーディング配列との間に配置されるＤＮＡ配列を指す。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列の上流の完全にプロセシングされたｍＲＮＡ中に存在する。翻訳リーダー配列は、一次転写物のｍＲＮＡへのプロセシング、ｍＲＮＡの安定性または翻訳効率に影響を及ぼすことができる。翻訳リーダー配列の例は記述されている（ターナー（Ｔｕｒｎｅｒ）およびフォスター（Ｆｏｓｔｅｒ）（１９９５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：２２５）。
【００３７】
「３’非コーディング配列」は、コーディング配列の下流に配置されるＤＮＡ配列を指し、かつ、ポリアデニル化認識配列、およびｍＲＮＡのプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことが可能な調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’端へのポリアデニル酸領域（ｔｒａｃｔ）の付加に影響を及ぼすことを特徴とする。多様な３’非コーディング配列の使用がインゲルベルヒト（Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ）ら（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ１：６７１−６８０により例示されている。
【００３８】
「ＲＮＡ転写物」はＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼに触媒される転写から生じる産物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と称されるか、またはそれは一次転写物の転写後プロセシング由来のＲＮＡ配列であることができ、そして成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンを含まずかつ細胞によりタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」はｍＲＮＡテンプレートに相補的でありかつ酵素である逆転写酵素を使用してｍＲＮＡテンプレートから合成されるＤＮＡを指す。ｃＤＮＡは一本鎖であり得るかまたはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて二本鎖に転換することもできる。「センス−ＲＮＡ」は、ｍＲＮＡを含み、そして、細胞内またはインビトロでタンパク質に翻訳させることができるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的の一次転写物もしくはｍＲＮＡの全部または一部に相補的でありかつ標的である単離された核酸フラグメントの発現を阻止するＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、すなわち５’非コーディング配列、３’非コーディング配列、イントロンまたはコーディング配列での特異的な遺伝子転写物のいずれかの部分であることができる。「機能的ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡまたは翻訳されなくてもよいが、しかし細胞の過程に対する影響をなお有し得る他のＲＮＡを指す。用語「相補的」および「逆相補的」は、ｍＲＮＡ転写物について本明細書において交換可能に使用され、メッセンジャーのアンチセンスＲＮＡを規定することを意味する。
【００３９】
用語「内因性ＲＮＡ」は、天然に存在するかまたは非天然に存在する（即ち、組換え手段、変異誘発などによって導入されている）かにかかわらず、本発明の組換え構築物による組換え前の宿主のゲノムに存在する任意の核酸配列によってコードされる任意のＲＮＡ
を指す。
【００４０】
用語「非天然に存在する」とは、天然において通常に見出されるものには一致しない人工物を意味する。
【００４１】
用語「操作可能に連結している」は、一方の機能が他方により調節されるような単一核酸フラグメント上の核酸配列の対合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を指す。例えば、プロモーターがコーディング配列の発現を調節することができる（即ち、コーディング配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、プロモーターはコーディング配列に操作可能に連結している。コーディング配列はセンスまたはアンチセンスの配向で調節配列に操作可能に連結することができる。別の例では、本発明の相補ＲＮＡ領域は、標的ｍＲＮＡの５’側、もしくは標的ｍＲＮＡの３’側、もしくは標的ｍＲＮＡ内に直接的かまたは間接的に操作可能に連結することができ、あるいは、第１の相補領域は、標的ｍＲＮＡの５’側であり、その相補体は３’側である。
【００４２】
本明細書において使用される用語「発現」は、機能的最終産物の産生を指す。単離された核酸フラグメントの発現は、単離された核酸フラグメントの転写および前駆体または成熟タンパク質への翻訳に関与する。「アンチセンス阻害」は、標的タンパク質の発現を抑制することが可能であるアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を指す。「相互抑制」は、同一または実質的に類似する外来または内因性遺伝子の発現を抑制することが可能であるセンスＲＮＡ転写物の産生を指す（米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。
【００４３】
「成熟」タンパク質は、転写後にプロセシングされたポリペプチド、即ち、一次翻訳産物中に存在するいかなるプレペプチドもしくはプロペプチドもそれから除去されているものを指す。「前駆体」タンパク質は、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物、即ち、プレペプチドおよびプロペプチドがなお存在するものを指す。プレペプチドおよびプロペプチドは、限定されるものでないが細胞内局在化シグナルであることができる。
【００４４】
「安定な形質転換」は、遺伝的に安定な遺伝を生じる核およびオルガネラゲノムの両方を含む宿主ゲノムへの核酸フラグメントの移入を指す。対照的に、「一過性形質転換」は、組込みもしくは安定な遺伝を伴わない遺伝子発現を生じる宿主生物体の核、またはＤＮＡ含有オルガネラへの核酸の移入を指す。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物体は「トランスジェニック」生物体と称される。イネ、トウモロコシおよび他の単子葉植物の細胞形質転換の好適な方法は、粒子加速または「遺伝子銃」形質転換技術（クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら、（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン（Ｌｏｎｄｏｎ））３２７：７０−７３；米国特許第４，９４５，０５０号明細書）、または導入遺伝子を含有する適切なＴｉプラスミドを使用するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介法（イシダ（Ｉｓｈｉｄａ Ｙ．）ら、１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：７４５−７５０）の使用である。本明細書において使用される用語「形質転換」は、安定な形質転換および一過性形質転換の両方を指す。
【００４５】
本明細書で使用される標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野で周知であり、かつ、サンブルックＪ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッシュＥ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティスＴ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）：コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、１９８９（以下「サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）」）に、より詳細に記述される。
【００４６】
用語「組換え体」は、例えば、化学合成または遺伝子操作による核酸の単離されたセグメントの操作による２つの異なる分離されたセグメントの配列の人工的な組み合わせを指す。
【００４７】
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、一連の反復サイクルから成る、大量の特定ＤＮＡセグメントの合成のための技術である（パーキン・エルマー・シータス・インスツルメンツ（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、コネチカット州ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＹ））。代表的には、二本鎖ＤＮＡを加熱変性し、標的セグメントの３’境界に相補的な２つのプライマーを低温でアニーリングし、次いで中間的な温度で延伸する。これらの３段の連続工程の１組が１サイクルを成す。
【００４８】
ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）は、短期間でテンプレートの複製を反復することによって、ＤＮＡを１００万倍に増幅するために使用される強力な技術である。（ミュリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら著、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３−２７３（１９８６）；アーリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）らによる欧州特許出願第５０，４２４号明細書；欧州特許出願第８４，７９６号明細書；欧州特許出願第２５８，０１７号明細書；欧州特許出願第２３７，３６２号明細書；ミュリス（Ｍｕｌｌｉｓ）による欧州特許出願第２０１，１８４号明細書、ミュリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らによる米国特許第４，６８３，２０２号明細書；アーリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）による米国特許第４，５８２，７８８号明細書；およびサイキ（Ｓａｉｋｉ）らによる米国特許第４，６８３，１９４号明細書）。プロセスは、ＤＮＡ合成を用意するために、特異的にインビトロ合成されたオリゴヌクレオチドの組を利用する。プライマーの設計は、解析を所望するＤＮＡの配列に依存する。該技術は、高温でテンプレートを融解し、テンプレート内の相補配列にプライマーをアニールさせ、次いで、ＤＮＡポリメラーゼでテンプレートを複製する（通常２０〜５０の）多くのサイクルを介して行われる。
【００４９】
ＰＣＲ反応の産物は、アガロースゲル中での分離、続いて臭化エチジウム染色およびＵＶ透過による可視化によって分析される。あるいは、産物に標識を組み入れるために、放射性ｄＮＴＰをＰＣＲに添加することもできる。この場合、ＰＣＲの産物はゲルのＸ線フィルムへの暴露によって可視化される。放射性標識ＰＣＲ産物のさらなる利点は、個々の増幅産物のレベルを定量することができることである。
【００５０】
用語「組換え構築物」、「発現構築物」および「組換え発現構築物」は、本明細書において交換可能に使用される。これらの用語は、当業者に周知の標準的方法論を使用して、細胞のゲノムに挿入することができる遺伝子材料の機能的単位を指す。そのような構築物はそれ自体であってもよく、またはベクターと組み合わせて使用してもよい。ベクターを使用する場合、ベクターの選択は、当業者に周知である宿主植物を形質転換するために使用する方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。熟練者は本発明の単離された核酸フラグメントのいずれかを含む宿主細胞を首尾よく形質転換、選択および増殖させるために、ベクター上に存在すべき遺伝子エレメントを良く知っている。熟練者はまた、異なる独立した形質転換事象が、発現の異なるレベルおよびパターンとなり（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：２４１１−２４１８；デ・アルメイダ（Ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａ）ら、（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ２１８：７８−８６）、従って望ましい発現レベルおよびパターンを示す株を得るために多重事象をスクリーニングしなければならないことを認めるであろう。かかるスクリーニングは、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のウエスタン分析、または表現型分析により達成できる。
【００５１】
植物における相互抑制構築物は、センス配向で内因性ＲＮＡに相同性を有する核酸配列
の過剰発現に集束することによって、先に設計されており、該構築物は、過剰発現された配列に相同性を有する全てのＲＮＡを減少させる（バウヘレット（Ｖａｕｃｈｅｒｅｔ）ら（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｊ１６：６５１−６５９；およびグラ（Ｇｕｒａ）（２０００）Ｎａｔｕｒｅ４０４：８０４−８０８）。この現象の全体的効率は低く、ＲＮＡの減少の程度は広範に変動する。最近の研究では、発現されたＲＮＡに対し潜在的「ステム−ループ」構造を生じる相補的配向でｍＲＮＡをコードする配列の全部、または一部を組み入れる「ヘアピン」構造の使用に関する記載がある（ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５３０５０、１９９９年１０月２１日公開）。これは、回収されたトランスジェニック植物における相互抑制の頻度を増加する。もう１つのバージョンは、近位ｍＲＮＡをコードする配列の抑制、または「サイレンシング」を指令するための植物ウイルスの配列の使用について記載している（ＰＣＴ公開ＷＯ９８／３６０８３、１９９８年８月２０日公開）。最近の遺伝子レベルの根拠によりこの複雑な状況の解明が始められたが、これらの相互抑制減少は両方ともその機構が解明されていない（エルマヤン（Ｅｌｍａｙａｎ）ら（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ１０：１７４７−１７５７）。
【００５２】
植物のシトクロムＰ４５０酵素は、植物における様々な化合物の酸化的代謝を担うＮＡＤＰＨ依存性モノオキシゲナーゼである。シトクロムＰ４５０は、一酸化炭素の存在下で４５０ｎｍで最大の独特な吸収スペクトルを担うヘム−チオラート錯体と呼ばれる鉄−イオウ配位子を含有する。動物系では、Ｐ４５０酵素は、肝臓における解毒経路、所定の発ガン性化合物の不活化および活性化、ならびに薬物およびホルモンの代謝を担う。植物では、シトクロムＰ４５０ファミリーは、除草剤の代謝、二次代謝、および傷害応答を担うがこれらに限定されない。
【００５３】
驚くべきことに、イネのシトクロムＰ４５０遺伝子の単一変異は、種子発生期における胚／内乳のサイズの改変を生じることができることが見出されている。この遺伝子は巨大胚（Ｇｉａｎｔ Ｅｍｂｒｙｏ）（ＧＥ）と命名されている。該遺伝子の機能を阻害すると、内乳組織の部分を犠牲にして、胚組織の拡大が生じる。従って、ＧＥ遺伝子およびタンパク質産物は、組織に対しネガティブおよびポジティブの両方で依存する増殖を調節することができる。胚が拡大されると、高含有量の油などの価値のある成分を有する種子を生じる。イネのＧＥ配列を有するジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）の調査により、相同であると思われる植物由来の多くの遺伝子が発掘されている。
【００５４】
「巨大胚様シトクロムＰ４５０」ポリペプチドは、イネＧＥポリペプチドに対し配列および／または機能的類似性を供給する他の植物由来のそれらの酵素を包含する。そのようなポリペプチドは、シトクロムＰ４５０ファミリーのサブセットを含むこと、およびこのメンバーの発現における改変は胚のサイズに影響を及ぼすことが考えられる。
【００５５】
「モチーフ」または「部分配列」は、より長い配列の一部を含む核酸またはアミノ酸の保存された配列の短い領域を指す。例えば、そのような保存された部分配列（例えば、配列番号８０〜９１）は機能に対し重要であり、植物におけるＧＥ様シトクロムＰ４５０の新規の相同物を同定するために使用することが可能であると予想される。エレメントのいくつかまたは全部はＧＥ相同物において見出すことができることが予想される。また、与えられた任意のモチーフにおける１または２個の保存されたアミノ酸は、真のＧＥ相同物において異なることも予想される。
【００５６】
従って、１つの局面では、本発明は、
（ａ）種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号２、７、１１、１９、２７、もしくは３３から成る群より選択される第２のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル法に基づいて少なくとも６１％のアミノ酸同一性を有する、核酸配列、または
（ｂ）種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号１５、１７、３１、９３、９５、９７、もしくは９９から成る群より選択される第３のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル法に基づいて少なくとも６５％のアミノ酸同一性を有する、核酸配列、または
（ｃ）種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号９、１３、２３、２９、３５、もしくは４１から成る群より選択される第３のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル法に基づいて少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有する、核酸配列、または
（ｄ）種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号２１、２５、３７、もしくは３９から成る群より選択される第２のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル法に基づいて少なくとも７７％のアミノ酸同一性を有する、核酸配列から成る群より選択される核酸配列を含んで成る、単離されたヌクレオチドフラグメントに関する。
【００５７】
多くのレベルの配列同一性が、関連するポリペプチド配列を同定するのに有用であることが、当業者によって良好に理解されている。同一性パーセントの有用な例には、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、または５５％〜１００％の任意の整数の百分率がある。
【００５８】
また、この単離されたヌクレオチドフラグメントの相補体も対象となる。
【００５９】
単離された核酸配列またはその相補体はまた、配列番号８０〜９１に記載のアミノ酸配列のいずれかに実質的に対応する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のモチーフを含むこともでき、ここで、前記モチーフは保存された配列である。もう１つの局面では、この単離されたヌクレオチドフラグメントもしくはその相補体（それらが上記のモチーフを含むか含まないかにかかわらず）または該フラグメントもしくはその相補体の一部を、形質転換された植物におけるシトクロムＰ４５０活性のアンチセンス阻害あるいは相互抑制に使用することができる。さらなる実施態様は、種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドを同定するために使用される配列番号８０〜９１に記載のアミノ酸配列のいずれかに実質的に対応する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のモチーフを含むことが理解される。
【００６０】
アンチセンス阻害または相互抑制のプロトコルは当業者に周知であり、上に記載されている。
【００６１】
なおさらなる局面では、本発明は、プロモーターを含んで成る単離された核酸フラグメントであって、ここで、前記プロモーターは、配列番号３、４、１０４、もしくは１０５に記載のヌクレオチド配列から本質的に成るか、あるいは前記プロモーターは、配列番号３、４、１０４、もしくは１０５に記載のヌクレオチド配列に実質的に類似するかまたは機能的に等価であるフラグメントまたはサブフラグメントから本質的に成る、単離された核酸フラグメントに関する。
【００６２】
また、少なくとも１つの調節配列に操作可能に連結された上記で同定された単離された核酸フラグメントもしくはその相補体のいずれかまたはそのようなフラグメントもしくは相補体の一部を含んで成るキメラ構築物も対象となる。
【００６３】
ゲノム中にそのようなキメラ構築物を含んで成る植物、植物組織または細胞もまた、本発明の範囲内にある。形質転換方法は当業者に周知であり、上に記載されている。いずれ
の植物、双子葉植物または単子葉植物は、そのようなキメラ構築物で形質転換することができる。
【００６４】
単子葉植物の例としては、トウモロコシ、コムギ、イネ、モロコシ、キビ、オオムギ、ヤシ、ユリ、アルストロメリア（Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ）、ライムギ、およびカラスムギが挙げられるが、これらに限定されない。双子葉植物の例としては、ダイズ、ナタネ、ヒマワリ、カノーラ、ブドウ、グアユール、オダマキ、ワタ、タバコ、エンドウ、豆類、アマ、ベニバナ、アルファルファが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
植物組織は分化および未分化の組織または植物を含み、根、幹、苗条、葉、花粉、種子、腫瘍組織、ならびに単一細胞、原形質、胚、およびカルス組織などの様々な形態の細胞および培養物を含む。植物組織は、植物または器官中であってもよく、組織もしくは細胞培養物であってもよい。
【００６６】
そのような植物から得られる種子およびこれらの種子から得られる油も本発明の範囲内にある。
【００６７】
もう１つの局面において、本発明は、
（ａ）本発明のキメラ構築物で植物を形質転換し、
（ｂ）キメラ構築物の発現に適した条件下で形質転換された植物を成長させ、そして
（ｃ）改変された胚／内乳のサイズを有する種子を産生する上記形質転換された植物を選択する、
ことを含んで成る、種子発生期における胚／内乳のサイズの制御方法に関する。
【００６８】
単一植物プロトプラスト形質転換体または様々な形質転換された外植片由来の植物の再生、発生、および培養については、当該分野において周知である（バイスバッハ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）およびバイスバッハ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）編：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ
Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、アカデミック出版社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、（１９８８））。この再生および成長プロセスは、典型的に、形質転換された細胞の選択、発根した小植物体の段階を介する胚の発生期の通常の段階を介してそれらの個別化された細胞を培養することを含む。トランスジェニック胚および種子も同様に再生される。得られるトランスジェニック発根茎は、その後、土壌などの適切な植物培養培地に移植される。
【００６９】
目的のタンパク質をコードする外来、外因性の単離された核酸フラグメントを含有する植物の発達または再生は、当該分野において周知である。好ましくは、再生植物は、ホモ接合トランスジェニック植物を提供するために自家受粉される。そうでなければ、再生植物から得られる花粉は、作物学的に重要な株の種子繁殖植物と交雑される。対照的に、これらの重要な株の植物由来の花粉を使用して、再生植物に受粉する。所望のポリペプチドを含有する本発明のトランスジェニック植物は、当業者に周知の方法を使用して培養される。
【００７０】
植物組織由来の植物の再生のための様々な方法が存在する。
【００７１】
再生の特定の方法は、開始植物組織および再生しようとする特定の植物種に依存する。
【００７２】
主にアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の使用によって双子葉植物を形質転換し、トランスジェニック植物を得るための方法は、ワタ（米国特許第５，００４，８６３号明細書、米国特許第５，１５９，１３５号明細書、米国特許第５，５１８，９
０８号明細書）；ダイズ（米国特許第５，５６９，８３４号明細書、米国特許第５，４１６，０１１号明細書、マックカベ（ＭｃＣａｂｅ）ら、ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：９２３（１９８８）、クリストウ（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１−６７４（１９８８））；アブラナ（米国特許第５，４６３，１７４号明細書）；ピーナツ（チェング（Ｃｈｅｎｇ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１５：６５３−６５７（１９９６）、マックケントリー（ＭｃＫｅｎｔｌｙ）ら、Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１４：６９９−７０３（１９９５））；パパイヤ；およびエンドウ（グラント（Ｇｒａｎｔ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１５：２５４−２５８，（１９９５））について公開されている。
【００７３】
エレクトロポレーション、粒子衝撃、およびアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を使用する単子葉植物の形質転換についても報告されている。形質転換および植物再生は、アスパラガス（バイテビア（Ｂｙｔｅｂｉｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８４：５３５４、（１９８７））；オオムギ（ワン（Ｗａｎ）およびレマックス（Ｌｅｍａｕｘ）、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ１０４：３７（１９９４））；ジー・メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）（ローデス（Ｒｈｏｄｅｓ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：２０４（１９８８）、ゴルドン−カム（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ２：６０３−６１８（１９９０）、フロム（Ｆｒｏｍｍ）ら、ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：８３３（１９９０）、コジール（Ｋｏｚｉｅｌ）ら、ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１：１９４，（１９９３）、アームストロング（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ）ら、Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ３５：５５０−５５７（１９９５））；カラスムギ（ソメルズ（Ｓｏｍｅｒｓ）ら、ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：１５ ８９（１９９２））；カモガヤ（ホルン（Ｈｏｒｎ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．７：４６９（１９８８））；イネ（トリヤマ（Ｔｏｒｉｙａｍａ）ら、ＴｈｅｏｒＡｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．２０５：３４，（１９８６）；パート（Ｐａｒｔ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：１１３５−１１４８，（１９９６）；アベディニア（Ａｂｅｄｉｎｉａ）ら、Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２４：１３３−１４１（１９９７）；ジャン（Ｚｈａｎｇ）およびウ（Ｗｕ）、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７６：８３５（１９８８）；ジャン（Ｚｈａｎｇ）らＰｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．７：３７９，（１９８８）；バッテロー（Ｂａｔｔｒａｗ）およびホール（Ｈａｌｌ）、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．８６：１９１−２０２（１９９２）；クリストウ（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：９５７（１９９１））；ライムギ（デ・ラ・ペネ（Ｄｅ ｌａ Ｐｅｎａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３２５：２７４（１９８７））；サトウキビ（ボーウェル（Ｂｏｗｅｒ）およびビルヒ（Ｂｉｒｃｈ）、Ｐｌａｎｔ Ｊ．２：４０９（１９９２））；ヒロハノウシノケグサ（ワン（Ｗａｎｇ）ら、ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：６９１（１９９２））、ならびにコムギ（バシル（Ｖａｓｉｌ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：６６７（１９９２）；米国特許第５，６３１，１５２号明細書）において達成されている。
【００７４】
クローニングされた核酸構築物の一過性発現に基づく遺伝子発現のためのアッセイは、ポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーション、または粒子衝撃により植物細胞に核酸分子を導入することによって、開発されている（マルコッティ（Ｍａｒｃｏｔｔｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３３５：４５４−４５７（１９８８）；マルコッティ（Ｍａｒｃｏｔｔｅ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：５２３−５３２（１９８９）；マッカルティ（ＭｃＣａｒｔｙ）ら、Ｃｅｌｌ６６：８９５−９０５（１９９１）；ハットリ（Ｈａｔｔｏｒｉ）ら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．６：６０９−６１８（１９９２）；ゴフ（Ｇｏｆｆ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ．９：２５１７−２５２２（１９９０））。
【００７５】
一過性発現形を使用して、単離された核酸フラグメント構築物を機能的に詳細に分析することができる（一般に、マリガ（Ｍａｌｉｇａ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎ
ｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、コールド・スプリング・ハーバー出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）（１９９５）を参照のこと）。ベクター、プロモーター、エンハンサーなどの他の遺伝子エレメントと組み合わせて、永久的または一過的様式で、本発明の核酸分子のいずれをも植物細胞に導入することができる。
【００７６】
上記の考察された手順に加えて、実施者は、高分子（例えば、ＤＮＡ分子、プラスミドなど）の構築、操作および単離、組換え生物体の作製ならびにクローンのスクリーニングおよび単離のための特定の条件および手順について記載している標準的な供給源材料をよく知っている（例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）（１９８９）；マリガ（Ｍａｌｉｇａ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、コールド・スプリング・ハーバー出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）（１９９５）；ビレン（Ｂｉｒｒｅｎ）ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ，１、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９９８）；ビレン（Ｂｉｒｒｅｎ）ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ＤＮＡ，２、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９９８）；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、クラーク（Ｃｌａｒｋ）編、ニューヨーク州スプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９９７）を参照のこと）。
【００７７】
なおさらなる局面では、本発明は、
（ａ）配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、９３、９５、９７、または９９と種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連する他のポリペプチド配列とを比較し、
（ｂ）工程（ａ）において得られる保存配列すなわち４つもしくはそれ以上のアミノ酸を同定し、
（ｃ）工程（ｂ）において同定される保存配列に基づいて領域特異的ヌクレオチドプローブまたはオリゴマーを作製し、そして
（ｄ）工程（ｃ）のヌクレオチドプローブまたはオリゴマーを使用して、配列依存性プロトコルにより種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連する配列を単離する、ことを含んで成る、種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するポリペプチドをコードする核酸フラグメントの単離方法に関する。
【００７８】
種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連する他の植物配列を同定するのに有用である保存された配列エレメントは、配列番号８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、または９１のポリペプチドをコードするヌクレオチドを含んで成るがそれらに限定されない群において見出すことができる。
【００７９】
もう１つの局面では、本発明はまた、
（ａ）２種の植物種を交雑させ、そして
（ｂ）工程（ａ）の交雑から得られる子孫植物における、
（ｉ）配列番号１、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、もしくは１０５から成る群より選択される核酸配列、または
（ｉｉ）配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４
７、８０〜９１、９３、９５、９７、もしくは９９から成る群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列、
について遺伝子の変異を評価することを含んで成り、その際、評価を、ＲＦＬＰ解析、ＳＮＰ解析、およびＰＣＲに基づく解析から成る群より選択される方法を使用して行う、種子発生期における胚／内乳のサイズを制御することおよび／または植物の油表現型を改変することに関する遺伝子の変異のマッピング方法にも関する。
【００８０】
もう１つの実施態様では、本発明は、
（ａ）２種の植物種を交雑させ、そして
（ｂ）工程（ａ）の交雑から得られる子孫植物における、
（ｉ）配列番号１、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、もしくは１０５から成る群より選択される核酸配列、または
（ｉｉ）配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、８０〜９１、９３、９５、９７、もしくは９９から成る群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列、
について遺伝子の変異を評価することを含んで成り、その際、評価を、ＲＦＬＰ解析、ＳＮＰ解析、およびＰＣＲに基づく解析から成る群より選択される方法を使用して行う、種子発生期における改変された胚／内乳のサイズおよび／または植物の改変された油表現型を得るための分子育種方法に関する。
【００８１】
用語「遺伝子の変異をマッピングする」または「遺伝子の変異性をマッピングする」は交換可能に使用され、異なる植物株、栽培変種、変種、科、または種間で識別する遺伝子領域内のＤＮＡ配列の変化（天然かもしくは誘導された原因由来にかかわらず）を同定するプロセスを規定する。より小さな塩基の変化による特定の座位（遺伝子）での遺伝子の変異性は、作製され得る制限酵素消化フラグメントのパターンを改変することができる。遺伝子型に対する病原性改変も、解析している遺伝子内の欠失または挿入あるいは制限酵素認識部位を作製もしくは削除することができる一ヌクレオチド置換により可能である。ＲＦＬＰ解析はこれを使用し、目的の単離されたヌクレオチドフラグメントに対応するプローブによるサザンブロッティングを利用する。
【００８２】
従って、多型（即ち、遺伝子またはＤＮＡのセグメントに通常存在する変異；また、同一種における遺伝子（対立遺伝子）のいくらかの形態の存在）が制限エンドヌクレアーゼ切断部位を作製もしくは破壊する場合か、あるいは該多型がＤＮＡの消失または挿入を生じる（例えば、可変性縦列重複配列数（ＶＮＴＲ）多型）場合、該多型は、制限エンドヌクレアーゼによる消化によって作製されるＤＮＡフラグメントのサイズまたはプロフィールを改変する。従って、変異配列を有する個体は、制限フラグメント分析によって、本来の配列を有する個体と区別することができる。この様式で同定することができる多型は、「制限酵素断片長多型」（「ＲＦＬＰ」）と称される。ＲＦＬＰは、ヒトおよび植物遺伝子解析において広範に使用されている（グラスベルグ（Ｇｌａｓｓｂｅｒｇ）英国特許出願第２１３５７７４号明細書；スコルニック（Ｓｋｏｌｎｉｃｋ）ら、Ｃｙｔｏｇｅｎ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．３２：５８−６７（１９８２）；ボットステイン（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ）ら、Ａｎｎ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３２：３１４−３３１（１９８０）；フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）ら（ＰＣＴ出願ＷＯ９０／１３６６８；ユーレン（Ｕｈｌｅｎ）、ＰＣＴ出願ＷＯ９０／１１３６９）。
【００８３】
「一ヌクレオチド多型」または「ＳＮＰ」の中心的特性は、多型の部位が単一のヌクレオチドに存在することである。ＳＮＰは、ＲＦＬＰまたはＶＮＴＲについて所定の報告された利点を有する。第１に、ＳＮＰは、他のクラスの多型よりも安定である。それらの自
発的変異率は約１０−９（コーンベルグ（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ）、ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｗ．Ｈ．フリードマン＆ Ｃｏ．（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．）、サンフランシスコ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、１９８０）であり、ＶＮＴＲよりも約１０００倍低い（米国特許第５，６７９，５２４号明細書）。第２に、ＳＮＰはより高頻度で発生し、ＲＦＬＰおよびＶＮＴＲよりも均一性が高い。ＳＮＰは配列の変異から生じるため、新規の多型はランダムゲノムまたはｃＤＮＡ分子を配列決定することによって同定することができる。ＳＮＰはまた、欠失、点変異および挿入からも生じ得る。原因が何であれ、いずれの位置塩基改変もＳＮＰと成り得る。ＳＮＰの頻度が大きいほど、ＳＮＰは、他のクラスの多型よりも容易に同定することができる。
【００８４】
ＳＮＰは、多様な方法のいずれかを使用して特徴付けることができる。そのような方法には、部位の直接的または間接的配列決定、制限酵素の使用（ここで、部位のそれぞれの対立遺伝子は制限部位を作製もしくは破壊する）、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションプローブの使用、多型の異なる対立遺伝子もしくは他の生化学的解釈によってコードされるタンパク質に特異的である抗体の使用が含まれる。ＳＮＰは、多くの方法によって配列決定することができる。ＤＮＡ配列決定に次の２つの基本的方法を使用することができる、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）７４：５４６３−５４６７（１９７７）のチェーンターミネーター法、およびマキサム（Ｍａｘａｍ）およびギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）７４：５６０−５６４（１９７７）の化学分解法。
【００８５】
さらに、リガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）およびＰＣＲ−一本鎖コンホメーション多型（「ＰＣＲ−ＳＳＣＰ」）解析などの修飾されたＰＣＲ技術によって、単一点変異を検出することができる。ＰＣＲ技術を使用して、極端に小さな材料サンプル（例えば、生体由来の組織または細胞）中の遺伝子の発現のレベルを検出することもできる。該技術は逆転者−ＰＣＲ（「ＲＴ−ＰＣＲ」）と称される。
【００８６】
「分子育種」は、育種プロセス中の分子マーカーを追跡するためのプロセスを規定する。分子マーカーは、所望される表現型形質に連結されるのが一般的である。分子マーカーまたは遺伝形質の分離を追跡することによって、表現型を評価する代わりに、より少ない植物を増殖させ、表現型変異のアッセイまたは目視調査を排除することによって、育種プロセスを加速することができる。本プロセスに有用な分子マーカーには、先に記載のマッピング可能な遺伝子変異を同定するのに有用な任意のマーカーおよび植物種にわたってシンテニー（ｓｙｎｔｅｎｙ）を示す緊密に連結した遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。用語「シンテニー」は、異なる生物体間の染色体上の遺伝子の置き換え／順序の変換を指す。これは、緊密に連結していてもよくまたは緊密に連結していなくてもよい２つ以上の遺伝子座が、異なる種間の同じ染色体上に見出されることを意味する。シンテニーに対するもう１つの用語は「ゲノムの共直線性」である。
【実施例】
【００８７】
本発明は以下の実施例でさらに規定され、ここでは、別の方法で述べられない限り、部およびパーセントは重量によるものであり、また、度は摂氏である。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示している一方で、具体的説明のみとして示されることが理解されるべきである。当業者は、上記の考察およびこれらの実施例から本発明の不可欠の特徴を確かめることが可能であり、また、その技術思想および範囲から逸脱することなく、それを多様な用途および条件に適合させるように本発明の多様な変更および改変をなすことが可能である。従って、本明細書に示されかつ記載されている改変の他にも本発明の多様な改変が存在することは、先の記載から当業者には明らかであろう。そのような改変についても添付の請求の範囲内にあることが意図される。
【００８８】
本明細書に掲載した各参考文献の開示内容は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【００８９】
実施例１
ｃＤＮＡライブラリーの組成；ｃＤＮＡクローンの単離および配列決定
様々なイネ、オダマキ、ブドウ、グアユール、ペルビアン・リリー（Ｐｅｒｕｖｉａｎ
ｌｉｌｙ）、トウモロコシ、ダイズ、ヒマワリ、およびコムギ組織由来のｍＲＮＡを表すｃＤＮＡライブラリーを調製した。ライブラリーの特徴を表２において下述する。
【００９０】
【表３】
【００９１】
【表４】
【００９２】
ｃＤＮＡライブラリーは利用可能な多くの方法のいずれか１つにより調製してよい。例えば、ｃＤＮＡは、最初に、製造元のプロトコル（ストラタジーン・クローニング・システムズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州ラホジャ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））に従ってユニザップ（Ｕｎｉ−ＺＡＰ）（商標）ＸＲベクター中でｃＤＮＡライブラリーを調製することによりプラスミドベクター中に導入してよい。ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により提供されたプロトコルに従って、ユニザップ（Ｕｎｉ−ＺＡＰ）（商標）ＸＲライブラリーをプラスミドライブラリーに転化する。転化に際して、ｃＤＮＡ挿入物はプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中に含有される。加えて、ｃＤＮＡは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングラン
ド・バイオラボズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））を使用して、予め切断されたＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ベクター（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））に直接導入することができ、次いで、製造元のプロトコル（ギブコＢＲＬプロダクツ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））に従ってＤＨ１０Ｂ細胞にトランスフェクションする。一旦、ｃＤＮＡ挿入物がプラスミドベクター中にあれば、組換えｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドを含有する無作為に拾われた細菌コロニーからプラスミドＤＮＡを調製するか、または、挿入されたｃＤＮＡ配列に隣接するベクター配列に特異的なプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応を介して挿入ｃＤＮＡ配列を増幅する。増幅された挿入ＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡを、色素−プライマー配列決定反応で配列決定して部分的ｃＤＮＡ配列を生じさせる（発現された配列標識(ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ)または「ＥＳＴ」；アダムス（Ａｄａｍｓ）ら（１９９１）
Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：１６５１−１６５６を参照されたい）。生じるＥＳＴは、パーキン エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）モデル３７７蛍光シークエンサーを使用して分析する。
【００９３】
修飾された転位プロトコルを利用して、完全挿入物配列（ＦＩＳ）データを作成する。ＦＩＳについて同定されたクローンを、保管されているグリセリンストックから単一のコロニーとして回収し、アルカリ溶解を介してプラスミドＤＮＡを単離する。単離されたＤＮＡテンプレートを、ＰＣＲに基づく配列決定反応においてベクタープライムドＭ１３前方および逆方向オリゴヌクレオチドと反応させ、自動化シークエンサーに充填する。クローン同定の確認は、ＦＩＴの要件が作成される本来のＥＳＴ配列に対する配列アラインメントによって実施する。
【００９４】
確認されたテンプレートを、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｔｙ１転位因子（デビン（Ｄｅｖｉｎｅ）およびボエク（Ｂｏｅｋｅ）（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：３７６５−３７７２）に基づくプライマーアイランド転位キット（ＰｒｉｍｅｒＩｓｌａｎｄ ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ｋｉｔ）（ＰＥアプライド・バイオシステムズ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州フォスター市（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））を介して転位させる。インビトロ転位システムは、大きなＤＮＡ分子の集団全体にわたって独特な結合部位を無作為に配置する。次いで、転位されたＤＮＡを使用し、エレクトロポレーションを介してＤＨ１０Ｂエレクトロ−コンピテント細胞（ギブコＢＲＬ／ライフテクノロジーズ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ））を形質転換する。転位因子は、さらなる選択マーカー（ＤＨＦＲと呼ばれる；フィリング（Ｆｌｉｎｇ）およびリチャード（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：５１４７−５１５８）を含有しており、組み込まれたトランスポゾンを含有するサブクローンのみの寒天プレート上での二重選択が可能である。それぞれの転位反応から複数のサブクローンを無作為に選択し、アルカリ溶解を介してプラスミドＤＮＡを調製し、トランスポゾン内の結合部位に特異的な独特なプライマーを利用して、転位事象部位より外側について、テンプレートを配列決定する（ＡＢＩプリズムダイ−ターミネーターレディリアクションミックス（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘ））。
【００９５】
配列データを回収（ＡＢＩプリズムコレクションズ（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ））し、フレッド／フラップ（Ｐｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐ）（Ｐ．グリーン、（Ｐ． Ｇｒｅｅｎ）、ワシントン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）、シアトル（Ｓｅａｔｔｌｅ））を使用して集成する。フレッド／フラップ（Ｐｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐ）は、ＡＢＩ配列データを再読取し、塩基を読み上げ、特性値を割り当て、そして塩基記号および特性値を編集可能な出力ファイルに書き込むパブリックドメインソフトウェアプログラムである。フラップ（Ｐｈｒａｐ）配列集成プログラムは、これらの特性値を使用して、集成された配列コンティグ（ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｎｔｉｇ）の正確度を上昇する。集成物をコンスド（Ｃｏｎｓｅｄ）配列エディター（Ｄ．ゴードン（Ｄ． Ｇｏｒｄｏｎ）、ワシントン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）、シアトル（Ｓｅａｔｔｌｅ））によって検討する。
【００９６】
実施例２
ｃＤＮＡクローンの同定
ＧＥ様シトクロムＰ４５０をコードするｃＤＮＡのクローンを、ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（全部の非冗長ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ＣＤＳ翻訳、三次元構造ブルックヘイブンタンパク質データバンク（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ
Ｂａｎｋ）由来の配列、スイスプロット（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）タンパク質配列デー
タベースの最近の主要な発表、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪデータベースを含んで成る）中に含有される配列に対する類似性についてＢＬＡＳＴ（基礎局部整列検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）；アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）検索を実施することにより同定した。実施例１で得られたｃＤＮＡ配列を、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）により提供されるＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用して「ｎｒ」データベース中に含有される全部の公的に利用可能なＤＮＡ配列に対する類似性について分析した。ＤＮＡ配列を全部の読み枠で翻訳し、そして、ＮＣＢＩにより提供されるＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（ギシュＷ．（Ｇｉｓｈ，Ｗ．）およびステイテスＤ．Ｊ．（Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ３
：２６６−２７２）を使用して、「ｎｒ」データベース中に含有される全部の公的に利用可能なタンパク質配列に対する類似性について比較した。便宜性のため、ＢＬＡＳＴにより算出されるような単に偶然で検索されたデータベース中に含有されたある配列に対するあるｃＤＮＡ配列の合致を観察するというＰ値（確率）を本明細書では「ｐＬｏｇ」値として報告し、これは報告されたＰ値の対数の負の数を表わす。従って、ｐＬｏｇ値が大きくなるほど、ｃＤＮＡ配列およびＢＬＡＳＴの「ヒット」が相同なタンパク質を表わす見込みが大きくなる。
【００９７】
分析に提出されたＥＳＴを上記のジェンバンクデータベースと比較する。配列相同性の共通または重複領域を共有するヌクレオチド配列を比較するデュポン（Ｄｕ Ｐｏｎｔ）専用のデータベースに対し、ＢＬＡＳＴｎアルゴリズム（アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）を使用することによって５−または３−プライム以上の配列を含有するＥＳＴを見出すことができる。共通または重複配列が２つかもしくはそれ以上の核酸フラグメントの間に存在する場合、該配列は単一の連続ヌクレオチド配列に集成することができ、従って、５または３プライム方向のいずれかで本来のフラグメントが伸長される。一旦、最大の５−プライムＥＳＴが同定されれば、実施例１に記載の完全挿入物配列決定によってその完全な配列を決定することができる。多様な種に属する相同遺伝子は、ｔＢＬＡＳＴｎアルゴリズムを使用して、ＥＳＴデータベースに対し（専用の供給源または公的データベースのいずれかに由来する）既知の遺伝子のアミノ酸配列を比較することによって見出すことができる。ｔＢＬＡＳＴｎアルゴリズムは、６つの全ての読み枠で翻訳されるヌクレオチドデータベースに対してアミノ酸検索事項を検索する。この検索により、多様な種間のヌクレオチドコドン使用の差異およびコドンの縮重を求めることが可能である。
【００９８】
実施例３
ＧＥ様シトクロムＰ４５０タンパク質をコードするｃＤＮＡクローンの特徴付け
表３に列挙したクローンからのＥＳＴ配列を使用するＢＬＡＳＴＸ検索は、当該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）［アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）］（ＮＣＢＩ一般識別番号（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）ｇｉ、［配列番号４２］（ｇｉ１
２３２５１３８およびｇｉ１５２２１１３２と同一である）；およびｇｉ１１２４９５１１、［配列番号４４］；ならびにｇｉ３８３１４４０、［配列番号４６］；ならびにｇｉ８９２０５７６、［配列番号４７］）由来のシトクロムＰ４５０タンパク質、ならびにラン［ファレノプシス（Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ）種ＳＭ９１０８］（ＮＣＢＩ一般識別番号（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）ｇｉ１１７３６２４、［配列番号４３］
）由来のシトクロムＰ４５０タンパク質、ならびにダイズ［グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）］（ＮＣＢＩ一般識別番号（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ
）ｇｉ５９２１９２６、［配列番号４５］）由来のシトクロムＰ４５０タンパク質に対する類似性を示した。個々のＥＳＴについてのＢＬＡＳＴの結果（「ＥＳＴ」）、示されたｃＤＮＡクローンを含んで成るｃＤＮＡ挿入物全体の配列（「ＦＩＳ」）、２種もしくはそれ以上のＥＳＴから集成されたコンティグの配列（「Ｃｏｎｔｉｇ」）、ＦＩＳおよび１種もしくはそれ以上のＥＳＴから集成されたコンティグの配列（「Ｃｏｎｔｉｇ＊」）、またはＦＩＳ、コンティグもしくはＦＩＳおよびＰＣＲ由来のタンパク質全体をコードする配列（「ＣＧＳ」）を表３に示す。
【００９９】
【表５】
【０１００】
表４のデータは、配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、および４１に示されるアミノ酸配列、ならびにアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）［アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）］（ＮＣＢＩ一般識別番号（Ｇｅｎｅｒａｌ
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）ｇｉ７１０９４６１、［配列番号４２］（ｇｉ１２３２５１３
８およびｇｉ１５２２１１３２と同一である）；およびｇｉ１１２４９５１１、［配列番号４４］；ならびにｇｉ３８３１４４０、［配列番号４６］；ならびにｇｉ８９２０５７６、［配列番号４７］）由来のシトクロムＰ４５０タンパク質、ならびにラン［ファレノプシス（Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ）種ＳＭ９１０８］（ＮＣＢＩ一般識別番号（Ｇｅｎ
ｅｒａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）ｇｉ１１７３６２４、［配列番号４３］）由来のシト
クロムＰ４５０タンパク質、ならびにダイズ［グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）］（ＮＣＢＩ一般識別番号（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）ｇｉ５９２
１９２６、［配列番号４５］）由来のシトクロムＰ４５０タンパク質の同一性パーセントの計算を表す。
【０１０１】
【表６】
【０１０２】
配列のアラインメントおよび同一性パーセントの計算は、レーザージーン（ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ）生物情報科学コンピュータ計算ソフトウェアパッケージ（ＤＮＡスター社（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））のメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラムを使用して実施した。配列の複数のアラインメントは、デフォルトのパラメータ（ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝１０）を用い、アラインメントのクラスタル法（ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ５：１５１−１５３）を使用して実施した。クラスタル法を使用する対にしたアラインメントのためのデフォルトのパラメータは、Ｋタプル１、ギャップペナルティ＝３、ウィンドウ＝５およびダイアゴナルズ セイブ
ド＝５であった。配列のアラインメント、ならびにＢＬＡＳＴのスコアおよび確率は、本発明のｃＤＮＡクローンを含んで成る核酸フラグメントが、変異した場合にイネに巨大胚の表現型を付与するイネタンパク質と相同性を共有する植物シトクロムＰ４５０の実質的な部分をコードすることを示す。
【０１０３】
実施例４
単子葉細胞におけるキメラ遺伝子の発現
該ｃＤＮＡフラグメントに対し５’に配置されているトウモロコシの２７ｋＤのゼイン、ユビキチン、またはＣａＭＶ ３５Ｓ遺伝子由来のプロモーターに関してセンスの向きで本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含んで成るキメラ遺伝子を構築することが可能である。１０ｋＤのゼイン由来の３’フラグメント［キリハラ（Ｋｉｒｉｈａｒａ）ら（１９８８）Ｇｅｎｅ７１：３５９−３７０］は該ｃＤＮＡフラグメントに対し３’に配置することができる。ＧＥに相同な遺伝子を過剰発現または相互抑制するために、そのような構築物が使用される。当業者であれば、多様なプロモーターおよび／または３’末端配列を用いて、匹敵する発現結果を達成することができることが認識される。ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを有する構築物は以下のようにして作製される：転写終結エレメントを、ＢｇｌＩＩおよびＡｓｐ７１８消化によりクローン（Ｉｎ２−１ Ａ）から遊離させる。リンカー（ＧＡＴＣＣＡＴＧ）を使用して、フラグメントを、３５Ｓプロモーターを担持するｐＭＬ１４１［ＰＣＴ出願Ｎｏ．ＷＯ００／０８１６２、２０００年２月１７日公開］のＳｐｈＩおよびＡｓｐ７１８認識部位に連結させ、ＢｇｌＩＩおよびＳｐｈＩ末端に接続する。次のプライマーの組（５’−ＡＧＡＡＴＴＣＴＴＣＣＣＡＴＧＧＣＧＣＴＣＴＣＣＴＣＣＡＴ−３’、配列番号４８；および５’−ＡＧＡＡＴＴＣＴＡＧＧＣＣＣＴＡＧＣＣＡＣＧＧＣＣＴＴＧ−３’、配列番号４９）ならびにテンプレートしてｃＤＮＡを使用するＰＣＲを介して、ＧＥ ＯＲＦを含有するＤＮＡを増幅する。次いで、フラグメントをＥｃｏＲＩで消化し、３５Ｓプロモーターと転写ターミネーターとの間のベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入する。挿入物の適切な配向を、配列決定によって確認する。
【０１０４】
ユビキチンプロモーターを有する構築物は以下のようにして作製される：転写終結エレメントを、ＢｃｌＩおよびＫｐｎＩ消化によりクローン（Ｉｎ２−１ Ａ）から遊離させる。リンカー（ＧＧＣＣＧＴＡＣ）を使用して、フラグメントを、ユビキチンプロモーター（トウモロコシＵｂｉ−１プロモーター、クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）およびクアイル（Ｑｕａｉｌ）（１９９６）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．５：２１３−２１８）を担持するＳＫ−ｕｂｉ（ＢｂｓＩ）のＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ認識部位に連結させ、ＮｏｔＩおよびＫｐｎＩ末端に接続する。次のプライマーの組（５’−ＡＧＧＴＣＴＣＣＣＡＴＧＧＣＧＣＴＣＴＣＣＴＣＣＡＴ−３’、配列番号５０；および５’−ＡＴＣＡＴＧＡＴＣＴＡＧＧＣＣＣＴＡＧＣＣＡＣＧＧＣＣＴＴＧ−３’、配列番号５１）ならびにテンプレートしてｃＤＮＡを使用するＰＣＲを介して、ＧＥ ＯＲＦを含有するＤＮＡを増幅する。次いで、フラグメントをＢｓｐＨＩおよびＢｓａＩで消化し、ユビキチンプロモーターと転写ターミネーターとの間のＢｂｓＩ部位に挿入する。
【０１０５】
プラスミドｐＭＬ１０３は、ブダペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ）の約
定のもとにＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．２０１１０−２２０９）に寄託され、そして受託番号ＡＴＣＣ９７３６６を有する。ｐＭＬ１０３からのＤＮＡセグメントは、ベクターｐＧｅｍ９Ｚｆ（＋）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））中にトウモロコシの２７ｋＤのゼイン遺伝子の１．０５ｋｂのＳａｌＩ−ＮｃｏＩプロモーターフラグメント［プラット（Ｐｒａｔ）ら（１９８７）Ｇｅｎｅ５２：５１−４９；ガラード（Ｇａｌｌａｒｄｏ）ら（１９８８）ＰｌａｎｔＳｃｉ．５４：２１１−２８１１］、およびトウモロコシの１０ｋＤのゼイン遺伝子の３’末端からの０．９６ｋｂのＳｍａＩ−ＳａｌＩフラグメントを含有する。ベクターおよび挿入ＤＮＡを、本質的に記述された（マニアティス「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）通り、１５℃で一夜連結することが可能である。次いで、連結されたＤＮＡを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（エピキュリアン
コライ ＸＬ−１ ブルー（Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（商標））
）；ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）） を形質転換してもよい。細菌の形質転
換体は、プラスミドＤＮＡの制限酵素消化およびジデオキシチェーンターミネーター法（シークェナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）））ＤＮＡ配列決定キット；Ｕ．Ｓ．バイオケミカル（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ））を使用する制限されたヌクレオチド配列分析によりスクリーニングすることが可能である。生じるプラスミド構築物は、５’から３’の向きで、トウモロコシの２７ｋＤのゼインプロモーター、本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡフラグメント、および１０ｋＤのゼインの３’領域をコードするキメラ構築物を含む。
【０１０６】
次いで、上述されたキメラ遺伝子を、以下の手順によりトウモロコシ細胞に導入することが可能である。トウモロコシの同系繁殖系Ｈ９９およびＬＨ１３２の交配由来の発生中の穎果から未熟なトウモロコシ胚を切断することが可能である。胚は、受粉後１０〜１１日に、それらが１．０〜１．５ｍｍ長である場合に単離する。次いで、軸側を下に向けかつアガロースで固化されたＮ６培地と接触させて胚を置く（チュ（Ｃｈｕ）ら（１９７５）Ｓｃｉ．Ｓｉｎ．Ｐｅｋｉｎｇ１８：６５９−６６８）。胚を暗所で２７℃に保つ。胚柄構造上に担持される体細胞の前胚および胚様体をもつ細胞の未分化の塊から成るもろい胚形成カルスが、これらの未熟な胚の胚盤から増殖する。一次外植体から単離された胚形成カルスをＮ６倍地上で培養し、そして２〜３週ごとにこの培地上で継代培養することが可能である。
【０１０７】
選択マーカーを提供するために、形質転換実験でプラスミドｐ３５Ｓ／Ａｃ（Ｈｏｅｃｈｓｔ Ａｇ、独国フランクフルト（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のピーター・エッケス博士（Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ Ｅｃｋｅｓ）より入手した）を使用してよい。このプラスミドは、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）をコードするＰａｔ遺伝子（欧州特許公開第０２４２２３６号明細書を参照されたい）を含有する。酵素ＰＡＴは、ホスフィノトリシンのような除草性のグルタミン合成酵素阻害剤に対する抵抗性を付与する。ｐ３５Ｓ／Ａｃ中のｐａｔ遺伝子は、カリフラワーモザイクウイルスからの３５Ｓプロモーター（オデル（Ｏｄｅｌｌ）ら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１３：８１０−８１２）およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡからのノパリンシンター
ゼ遺伝子の３’領域の制御下にある。
【０１０８】
カルス培養細胞に遺伝子を導入するために粒子衝撃法（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ）（クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３２７：７０−７３）を使用してよい。この方法によれば、以下の技術を使用して金粒子（直径１μｍ）をＤＮＡで被覆する。１０μｇのプラスミドＤＮＡを、金粒子の懸濁液（１ｍＬあたり６０ｍｇ）５０μＬに添加する。塩化カルシウム（２．５Ｍ溶液の５０μＬ）およびスペルミジンを含まない塩基（１．０Ｍ溶液の２０μＬ）を粒子に添加する。これらの溶液の添加のあいだ該懸濁液をボルテックス攪拌する。１０分後にチューブを短く遠心分離（１５，０００ｒｐｍで５秒間）し、そして上清を除去する。粒子を２００μＬの無水エタノールに再懸濁し、再度遠心分離し、そして上清を除去する。エタノールすすぎを再度実施し、そして粒子を最終体積３０μＬのエタノールに再懸濁する。ＤＮＡ被覆された金粒子のアリコート（５μＬ）をカプトン（Ｋａｐｔｏｎ（商標））フライングディスク(ｆｌｙｉｎｇ ｄｉｓｃ)（バイオ−ラド・ラボズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｓ））の中央に置くことが可能である。次いで、１０００ｐｓｉのヘリウム圧、０．５ｃｍのギャップ距離および１．０ｃｍの飛行距離を使用して、バイオリスティック（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ（商標））ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ（バイオ−ラド・インスツルメンツ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）カリフォルニア州ヘルクレス（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ））を用いて粒子をトウモロコシ組織中に加速する。
【０１０９】
衝撃のためには、胚形成組織を、アガロース固化されたＮ６培地上の濾紙上に置く。組
織は薄い芝生(ｌａｗｎ)状に配置し、そして直径約５ｃｍの円形領域を覆う。組織を含有するペトリ皿は、ＰＤＳ−１０００／Ｈｅのチャンバ中で停止スクリーン（ｓｔｏｐｐｉｎｇ ｓｃｒｅｅｎ）からおよそ８ｃｍに置くことが可能である。次いで、チャンバ中の空気をＨｇ２８インチの真空まで排気する。衝撃チューブ中のＨｅ圧が１０００ｐｓｉに達する場合に爆発する破裂膜（ｒｕｐｔｕｒｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を使用して、マクロキャリアー（ｍａｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ）をヘリウムショック波で加速する。
【０１１０】
衝撃７日後、バイアロホス（ｂｉａｌｏｐｈｏｓ）（１リットルあたり５ｍｇ）を含有しかつカゼインまたはプロリンを欠くＮ６培地に組織を移すことが可能である。組織をこの培地上でゆっくりと成長を続けさせる。さらに２週間後に、バイアロホスを含有する新鮮なＮ６培地に組織を移すことができる。６週間後に、バイアロホスを補充された培地を含有するプレートのいくつかで、活発に成長しているカルスの直径約１ｃｍの領域を同定することが可能である。これらのカルスは、選択培地上で継代培養される場合に成長を続けることができる。
【０１１１】
最初に、１リットルあたり０．２ｍｇの２，４−Ｄを補充されたＮ６培地に組織の集団を移すことにより、植物をトランスジェニックカルスから再生することが可能である。２週間後に組織を再生培地に移すことができる（フロム（Ｆｒｏｍｍ）ら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：８３３−８３９）。
【０１１２】
実施例５
双子葉細胞におけるキメラ遺伝子の発現
ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターを使用して、双子葉細胞において、ＧＥに相同な遺伝子を過剰発現および相互抑制することができる。ＧＥの過剰発現のために、ベクターＫＳ５０を使用して、ＧＥ ＯＲＦを３５Ｓプロモーターに融合することができる。ＧＥ ＯＲＦは、３’末端でＮｏｔＩ部位を有するプライマーの組、ＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＣＣＡＴＧＧＣＧＣＴＣＴＣＣＴ、配列番号５２、およびＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＧＣＣＣＴＡＧＣＣＡＣＧＧＣ、配列番号５３を使用するＰＣＲによって増幅する。増幅されたＤＮＡフラグメントをＮｏｔＩで消化し、ＫＳ５０のＮｏｔＩ部位に連結する。挿入物の正確な配向は、配列決定によって決定する。ＫＳ５０（７，４５３ｂｐ）は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）遺伝子を制御するＴ７プロモーター／Ｔ７ターミネーター、およびＨＰＴ遺伝子の発現を制御する３５ＳプロモーターＮＯＳターミネーターを含有するｐＫＳ１８ＨＨ（米国特許第５，８４６，７８４号明細書）の誘導体である。ＫＳ５０は、ＳａｌＩ部位において、ｐＡＷ２８より取得される３５Ｓプロモーター（９６０ｂｐ）／ＮＯＳターミネーター（７００ｂｐ）カセットから成る挿入物を有し、プロモーターとターミネーターとの間にＮｏｔＩ部位を有する。
【０１１３】
次いで、本ポリペプチドをコードする配列を含んで成る発現ベクターでダイズ胚を形質転換してよい。体細胞胚を誘導するために、ダイズ栽培変種作物Ａ２８７２の表面滅菌された未熟な種子から切断された長さ３〜５ｍｍの子葉を、適切な寒天培地上で明または暗所で２６℃で６〜１０週間培養することが可能である。次いで、二次胚を生じさせる体細胞胚を切除し、そして適する液体培地中に置く。初期球状胚として増殖した体細胞胚の集団についての反復された選択後に、懸濁液を下述される通り維持する。
【０１１４】
ダイズ胚形成懸濁培養物は、１５０ｒｐｍの回転振盪器上の３５ｍＬの液体培地中、２６℃で蛍光灯を用いて１６：８時間の明／暗スケジュールで維持することが可能である。培養物は、３５ｍＬの液体培地中におよそ３５ｍｇの組織を接種することにより２週間ごとに継代培養する。
【０１１５】
次いで、粒子銃衝撃法（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｇｕｎ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（クラ
イン（Ｋｌｅｉｎ）ら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０−７３、米国特許第４，９４５，０５０号明細書）により、ダイズ胚形成懸濁培養物を形質転換してよい。これらの形質転換にはデュポン（Ｄｕ Ｐｏｎｔ）のバイオリスティック（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ（商標））ＰＤＳ１０００／ＨＥ機器（ヘリウム改良（ｈｅｌｉｕｍ ｒｅｔｒｏｆｉｔ））を使用することが可能である。
【０１１６】
ダイズの形質転換を容易にするのに使用することが可能である選択マーカー遺伝子は、カリフラワーモザイクウイルスからの３５Ｓプロモーター（オデル（Ｏｄｅｌｌ）ら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１３：８１０−８１２）、プラスミドｐＪＲ２２５からのハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来；グリッツ（Ｇｒｉｔｚ）ら（１９８３）Ｇｅｎｅ２５：１７９−１８８）およびアグロバクテリウム・ ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡからのノパリンシンターゼ遺伝子の３’領域より構成されるキメラ構築物である。ファセオリンの５’領域、本ポリペプチドをコードするフラグメントおよびファセオリンの３’領域を含んで成る種子発現カセットを制限フラグメントとして単離することが可能である。次いで、このフラグメントを、該マーカー遺伝子を担持するベクターの独特な制限部位に挿入することが可能である。
【０１１７】
６０ｍｇ／ｍＬの１μｍ金粒子懸濁液５０μＬに、（この順で）５μＬのＤＮＡ（１μｇ／μＬ）、２０μｌのスペルミジン（０．１Ｍ）、および５０μＬのＣａＣｌ２（２．５Ｍ）を添加する。次いで、粒子調製物を３分間攪拌し、微小遠心機中で１０秒間回転し、そして上清を除去する。次いで、ＤＮＡで被覆された粒子を４００μＬの７０％エタノールで１回洗浄し、そして４０μＬの無水エタノール中に再懸濁する。ＤＮＡ／粒子懸濁液をそれぞれ１秒間３回超音波処理することが可能である。５μＬのＤＮＡ被覆された金粒子を、次いで、各マクロキャリアーディスク上に充填する。
【０１１８】
およそ３００〜４００ｍｇの２週齢の懸濁培養物を空の６０×１５ｍｍのペトリ皿に入れ、そしてピペットを用いて残余の液体を組織から除去する。各形質転換実験にはおよそ５〜１０枚の組織のプレートを通常衝撃する。膜破裂圧は１１００ｐｓｉに設定し、そしてチャンバを２８インチ水銀の真空まで排気する。組織を保持スクリーンからおよそ３．５インチ離して置き、そして３回衝撃する。衝撃後に組織を半分に分割しかつ液体中に戻し入れ、そして上述された通り培養することが可能である。
【０１１９】
衝撃の５〜７日後に液体培地を新鮮培地と、また、衝撃１１〜１２日後に５０ｍｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含有する新鮮培地と交換してよい。この選択培地は毎週新しくすることが可能である。衝撃７〜８週間後で、緑色の形質転換された組織が、形質転換されない壊死胚形成集団から成長するのを観察することができる。孤立した緑色組織を取り出し、そして別個のフラスコに接種して、新しいクローン的に増殖された形質転換された胚形成懸濁培養物を生じさせる。それぞれの新しい株は独立した形質転換事象として取り扱ってよい。次いで、これらの懸濁液を後継代培養し、そして未熟な胚の集団として維持するかまたは個々の体細胞胚の成熟および発芽により植物全体に再生することが可能である。
【０１２０】
実施例６
ｇｅ座位の最終マッピング
マイクロサテライトおよびＲＦＬＰマーカーを使用して、ｇｅ座位を、第７染色体上の８５ｃＭ周辺の領域にマッピングした（コウ（Ｋｏｈ）ら（１９９６）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９３：２５７−２６１）。多くのＲＦＬＰマーカーおよびＹＡＣコンティグがイネの染色体にマッピングされている（ハルシマ（Ｈａｒｕｓｈｉｍａ）ら（１９９８）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１４８：４７９−４９４；ｈｔｔｐ：／／ｒｇｐ．ｄｎａ．ａ
ｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ）が、ｇｅ領域は、これまで物理的マーカーが見出されていない５ｃＭ−ｌｏｎｇ領域に配置されていた。ｇｅ座位をマッピングするために、本発明者らは、２つのマッピング集団を作製した。ｇｅ−３（ジャポニカイネｃｖ．タイチュング６５（Ｊａｐｏｎｉｃａ ｒｉｃｅ ｃｖ．Ｔａｉｃｈｕｎｇ６５））およびｇｅ−５（ジャポニカイネｃｖ．キンマゼ（Ｊａｐｏｎｉｃａ ｒｉｃｅ ｃｖ． Ｋｉｎｍａｚｅ））のホモ接合変異植物を、雌性親として選択し、インディカイネ品種カサラツ（Ｋａｓａｌａｔｈ）を雄性親として選択した。得られたＦ１植物を自家受粉させてＦ２集団を得た。ｇｅのＦ２子孫（ｇｅに対してホモ接合）をＦ２集団から選択した。
【０１２１】
ｇｅ座位付近の組換えを担持するＦ２植物を得るために、ＰＣＲに基づくＤＮＡマーカーを開発した。イネゲノムプロジェクトグループ（ＲＧＰ）（ハルシマ（Ｈａｒｕｓｈｉｍａ）ら（１９９８）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１４８：４７９−４９４）より公開されている地図位置に基づいて、いくらかの既知のＲＦＬＰを選択した。ＲＦＬＰマーカー、Ｒ１２４５、Ｒ２６７７およびＢ２Ｆ２を遠位マーカーのために選択し、マーカーＳ１８４８およびＣ８４７を近位マーカーのために選択した。配列がジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）から利用可能であるこれらのマーカーに対応するゲノムＤＮＡを増幅するために、プライマーを設計した。オオムギＥＳＴクローンであるＢ２Ｆ２については、デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）ＥＳＴデータベースおよびＲＧＰ ＥＳＴデータベースからイネ相同物を得た。プライマーは、対応するイネＥＳＴ配列に基づいて設計した。
【０１２２】
Ｃ８４７およびＢ２Ｆ２のカサラツ（Ｋａｓａｌａｔｈ）の配列に特異的である２ｐｍｏｌｅのプライマーの２つの主要なマーカーの組によって、ＰＣＲ反応を行った。０．３％ゲルライト（ｇｅｌｒｉｔｅ）を含有するＮ６培地上で発芽したｇｅＦ２植物から得た若い葉組織を、中和工程でサンプルの沸騰時間を４分間まで延長する修飾を伴い、キリミク（Ｋｌｉｍｙｕｋ）ら（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｊ．３：４９３−４９４に記載の通りに直接ＰＣＲ反応に供した。１つの３０μｌのＰＣＲ反応は、２μｌの２．５ｍＭｄＮＴＰ、２μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、葉から抽出した２μｌのＤＮＡ、０．３μｌのアンプリタックゴールド（Ａｍｐｌｉｔａｑ ｇｏｌｄ）（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））および３μｌのＰＣＲ緩衝液を含有した。熱サイクル条件は、９５℃で１０分間、９４℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で３０秒間、７２℃で５分間であり、工程２〜４を４０回繰り返した。カサラツ（Ｋａｓａｌａｔｈ）ＤＮＡの増幅は２．５または３％アガロースゲル上で調べた。
【０１２３】
親ジャポニカ（Ｊａｐｏｎｉｃａ）およびインディカ（Ｉｎｄｉｃａ）品種由来のマーカー領域を増幅することによって、いくらかの一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を見出した。遠位側由来の主要なＰＣＲに基づくＤＮＡマーカーを開発するために、Ｃ８４７において見出された１つのＳＮＰを選択した。このＳＮＰにおいて、ジャポニカ（Ｊａｐｏｎｉｃａ）の配列はＡ残基を有するが、インディカ（Ｉｎｄｉｃａ）の配列はＴを有した。プライマー（５’ＧＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＡＡＡＴＴＧＡＣＴＣＴＴＴＴＴＣＡＧＴＡＡ３’；配列番号５４）は、インディカ（Ｉｎｄｉｃａ）特異的塩基がその３’末端に相補的である様式で設計した。このプライマーおよび他方のプライマー（５’ＧＣＡＡＡＴＡＡＴＴＡＴＴＴＣＴＡＴＡＴＡＣＡＧＧＡＣＡＧＧＣ３’；配列番号５５）を１組として使用し、インディカ（Ｉｎｄｉｃａ）のみから対応するＤＮＡを増幅することができた。近位側については、親ジャポニカ（Ｊａｐｏｎｉｃａ）品種（Ａ）とインディカ（Ｉｎｄｉｃａ）品種（Ｔ）との間にＳＮＰを担持するＢ２Ｆ２イネ相同物を選択した。設計されたプライマー（５’ＴＡＧＣＴＴＴＡＧＡＧＴＡＣＡＴＴＴＣＴＴＡＧＡＴＡＣＧＧＣＡ３’；配列番号５６）は、その３’末端でインディカ（Ｉｎｄｉｃａ）の配列に対し相補的であった。もう１つのプライマー（５’ＴＴＡＣＴＴＴＧＡＧＣＧＴＧＣＣＡＡＧＣＡＧＴＡＴＡＡＴＴＴＣＴ３’；配列番号５７）と組み合わせて、ジャポニカ（Ｊａｐｏｎｉｃａ）からではなくインディカ（Ｉｎｄｉｃａ）のみからＤＮＡを増幅させた。
【０１２４】
これらのインディカ（Ｉｎｄｉｃａ）特異的プライマー対を使用することによって、１２９０ｇｅホモ接合Ｆ２をスクリーニングし、合計で３３個の組換え体を得、近位のｇｅ領域から１５個、遠位のｇｅ領域から１８個を得た。
【０１２５】
実施例７
ＧＥの地図に基づくクローニング
ＧＥへの染色体歩行の開始点としての役割を果たす最も近い物理的マーカーを得るために、３つのＹＡＣクローン、Ｙ１９３１、Ｙ４０５２およびＹ４５６６の末端からＤＮＡを単離した。これらのクローンを、ＲＧＰによって、ｇｅ座位に比較的近い領域に予めマッピングした。ＰＣＲに基づく方法を使用して、本発明者らは、Ｙ４０５２およびＹ１９３１の両末端ならびにＹ４５６６の左末端を回収し、配列決定した（方法および材料を参照のこと）。単離された各末端に特異的なプライマーの組を使用することによって、これらのＹＡＣクローンの配向および重複を解析したところ、Ｙ４０５２の左末端はＹ４０５２およびＹ４５６６のコンティグの最も遠い末端であることが確立された。Ｙ４０５２のどの末端がｇｅ座位に近いかを決定するために、各末端についてＲＦＬＰを展開した。遠位領域由来の１０個の組換え体の分離解析により、Ｙ４０５２の左末端は、右末端よりもｇｅに近いことが示され、それぞれ３および９個の組換え破壊点を残している。
【０１２６】
酵母ＹＡＣ株由来の全てのＤＮＡを抽出した。１００ｎｇのＤＮＡをＡｌｕＩ、ＨａｅＩＩＩおよびＲｓａＩで消化し、ベクトレット（ｖｅｃｔｏｒｅｔｔｅ）アダプター（５’ＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧＴＣＴＧＴＣＧＡＡＧＧＴＡＡＧＧＡＡＣＧＧＡＣＧＡＧＡＧＡＡＧＧＧ３’；配列番号５８；および５’ＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣＴＣＧＡＡＴＣＧＴＡＡＣＣＧＴＴＣＧＴＡＣＧＡＧＡＡＴＣＧＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣＣＴＴ３’；配列番号５９）に連結した。１０ｎｇの連結されたＤＮＡをＰＣＲプレートとして使用し、ＹＡＣ末端を増幅した。１つのＰＣＲ反応は、ＹＡＣアームに特異的なプライマー（５’ＣＡＣＣＣＧＴＴＣＴＣＧＧＡＧＣＡＣＴＧＴＣＣＧＡＣＣＧＣ３’；配列番号６０）；または右アームに特異的なプライマー（５’ＡＴＡＴＡＧＧＣＧＣＣＡＧＣＡＡＣＣＧＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＧ３’；配列番号６１）の２０ｐｍｏｌｅを、１．６ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．０１％ゼラチンおよび２．５ｍＭｄＮＴＰと共に含有した。サイクル条件は、９５℃で１０分間、９２℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間であった。工程２〜４の１０サイクルを行った後、ベクトレット特異的プライマーは（５’ＣＧＡＡＴＣＧＴＡＡＣＣＧＴＴＣＧＴＡＣＧＡＧＡＡＴＣＧＣＴ３’；配列番号６２）であり、反応に添加して、９２℃で１分間、６０℃で１分間および７２℃で３分間を３０サイクルの条件でさらに増幅した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分離し、増幅されたＤＮＡを第２のＰＣＲ増幅のために抽出した。第２のＰＣＲは、１６ｐｍｏｌｅのベクトレット単位に特異的なプライマーおよびＹＡＣ左末端に特異的な３０ｐｍｏｌｅのネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマー（５’ＣＴＧＡＡＣＣＡＴＣＴＴＧＧＡＡＧＧＡＣ３’；配列番号６３）または右末端に特異的なプライマー（５’ＡＣＴＴＧＣＡＡＧＴＣＴＧＧＧＡＡＧＴＧ３’；配列番号６４）の存在下で行った。サイクリング条件は、９５℃で１０分間、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で１分間であり、工程２〜４を２０回繰り返した。回収した末端を、ｐＧＥＭ−Ｔイージー（Ｅａｓｙ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））にクローニングし、配列決定した。末端配列由来のプライマーは、ＹＡＣコンティグの重複した構造を解析するために使用した。また、これらのＤＮＡフラグメントを使用して、ＲＦＬＰを見出し、ｇｅ座位についてそれらをマッピングした。
【０１２７】
これらの結果に基づき、本発明者らは、Ｙ４０５２の左末端から染色体歩行を開始した。タックイック（ＴＱインディカ（Ｉｎｄｉｃａ）イネ）およびレモント（Ｌｅｍｏｎｔ）（ＬＭジャポニカ（Ｊａｐｏｎｉｃａ）イネ）から作製される２つのテキサス（Ｔｅｘ
ａｓ）Ａ＆Ｍ ＢＡＣライブラリーを使用して、ＤＮＡブロットハイブリダイゼーションによって対応するクローンをスクリーニングした。Ｙ４０５２の左末端をプローブとして使用し、２つのＢＡＣクローン、ＴＱ１−１９ＬおよびＴＱ２２−７Ｅを回収した。ＴＡＬＬ ＰＣＲによってＢＡＣクローンの末端を回収し、回収されたＤＮＡフラグメントを、配列決定のためにｐＧＥＭ−Ｔイージー（Ｅａｓｙ）にクローニングした（材料および方法を参照のこと）。これらの配列を使用して、ＢＡＣ末端特異的プライマーの組を設計し、コンティグにおけるこれらのＢＡＣクローンの配向を決定した。ＰＣＲ解析のデータは、ＴＱ１−１９Ｌの右側末端（ＳＰ６側）がｇｅに新たに最も近く、ＴＱ２２−７ＥおよびＹＡＣクローンには存在しないことを示した。
【０１２８】
ＴＱ１−１９Ｌの右末端は、重複ＢＡＣクローンの第２の配列決定のために使用した。３つのＢＡＣ、ＬＭ１０−２２Ｎ、ＬＭ１０−１１ＯおよびＬＭ１５−７Ｐを得た。ＢＡＣ末端を回収し、ＰＣＲごとにマッピングするプロセスを繰り返した。第３のスクリーニングでは、ＬＭ１５−７Ｐの左末端（Ｔ７側）を使用し、ＬＭ３−６Ｂを得た。第４のスクリーニングでは、ＬＭ３−６Ｂの左末端を使用し、ＬＭ２０−４Ｄ、ＬＭ１７−３Ｈを得た。ＬＭ２０−４Ｄの左末端はコンティグの末端にマッピングされた。第５のスクリーニングでは、反復配列が存在するため、重複ＢＡＣクローンを得るためにこの末端はプローブとして使用しなかった。ＬＭ２０−４Ｄから適切なＤＮＡプローブを得るために、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩでＢＡＣクローンを消化し、ｐＵＣ１８にサブクローニングした。ＤＮＡブロット分析によって、一方の１．６ｋｂ長のフラグメントは他方の重複クローンＬＭ３−６Ｂ上には存在しないことが見出され、フラグメントがＢＡＣコンティグの末端に向かって局在化されていることが示された。１．６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを第５のスクリーニングのプローブとして使用し、重複クローンとしてＴＱ１８−１ＩおよびＬＭ２−１５Ｊを単離した。第６のスクリーニングでは、ＴＱ１８−１Ｉの左末端をプローブとして使用し、２つのＢＡＣクローン、ＬＭ４−１２ＥおよびＬＭ１５−２０Ｊを単離した。
【０１２９】
タックイック、インディカ（Ｉｎｄｉｃａ）イネ；およびレモント（Ｌｅｍｏｎｔ）、ジャポニカ（Ｊａｐｏｎｉｃａ）イネから作製される２つのテキサス（Ｔｅｘａｓ）Ａ＆Ｍ ＢＡＣライブラリーのブロットを、標準的なＤＮＡハイブリダイゼーション条件（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ））を使用して、ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ＴＡＩＬ ＰＣＲにより、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１ベクターを使用して作製したＢＡＣクローンの末端を回収した。０．２μｌの拡張型高忠実度Ｔａｑポリメラーゼ（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ））を伴うＢＡＣベクター特異的プライマー（４ｐｍｏｌｅ）および任意の変性させた（ＡＤ）プライマー（５０ｐｍｏｌｅ）を含有する２０μｌ中で典型的なＴＡＩＬ ＰＣＲ反応を行った。ＢＡＣベクターに特異的な６つのネステッドプライマーを設計した：
ＢＡＣＬ１；ＡＴＴＣＡＧＧＣＴＧＣＧＣＡＡＣＴＧＴＴＧ 配列番号６５
ＢＡＣＬ２；ＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＡＡＧＴＴＧＧ 配列番号６６
ＢＡＣＬ３；ＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ 配列番号６７
ＢＡＣＲ１；ＴＧＡＧＴＴＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＴＴＡＧＧＧＡＣ 配列番号６８
ＢＡＣＲ２；ＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧ 配列番号６９
ＢＡＣＲ３；ＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣ 配列番号７０
【０１３０】
リュ（Ｌｉｕ）およびウィチール（Ｗｈｉｔｔｉｅｒ）（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ
２５：６７４−６８１、およびリュ（Ｌｉｕ）ら（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｊ．８：４５７−４６３によって設計された７つの異なるプライマー（ＡＤ１〜７）を使用した：
ＡＤ１；ＴＧＷＧＮＡＧＷＡＮＣＡＳＡＧＡ 配列番号７１
ＡＤ２；ＡＧＷＧＮＡＧＷＡＮＣＡＷＡＧＧ 配列番号７２
ＡＤ３；ＣＡＷＣＧＩＣＮＧＡＩＡＳＧＡＡ 配列番号７３
ＡＤ４；ＴＣＳＴＩＣＧＮＡＣＩＴＷＧＧＡ 配列番号７４
ＡＤ５；ＮＧＴＣＧＡＳＷＧＡＮＡＷＧＡＡ 配列番号７５
ＡＤ６；ＧＴＮＣＧＡＳＷＣＡＮＡＷＧＴＴ 配列番号７６
ＡＤ７；ＷＧＴＧＮＡＧＷＡＮＣＡＮＡＧＡ 配列番号７７
【０１３１】
第１ラウンドのＰＣＲの条件は、最初の５サイクルで６５℃にかつ最後の１５サイクルで６１℃に変更したアニーリング温度の修飾を伴い、リュ（Ｌｉｕ）およびウィチール（Ｗｈｉｔｔｉｅｒ）１９９５、ならびにリュ（Ｌｉｕ）ら１９９５に記載の通りである。第２のＰＣＲでは、本発明者らは、テンプレートとして１／３０希釈した１μｌの第１のＰＣＲ産物を使用した。２０μｌの反応は８ｐｍｏｌｅｎｏ第２のＢＡＣベクター特異的プライマー、２５ｐｍｏｌｅＡＤプライマー、および０．２μｌの拡張型高忠実度Ｔａｑポリメラーゼを含有した。熱サイクルの条件は、最初の２サイクルで６０℃に変更したアニーリング温度の修飾を伴い、リュ（Ｌｉｕ）およびウィチール（Ｗｈｉｔｔｉｅｒ）１９９５、ならびにリュ（Ｌｉｕ）ら１９９５に記載の通りである。
【０１３２】
通常のＰＣＲ熱サイクル工程で第３のＰＣＲを行った。反応は、第３のＢＡＣベクター特異的プライマーおよびＡＤプライマーを含有した。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔイージー（ｅａｓｙ）ベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））にクローニングし、それらのＤＮＡ配列を従来の配列決定方法によって決定した。
【０１３３】
ジャポニカ（Ｊａｐｏｎｉｃａ）およびインディカ（Ｉｎｄｉｃａ）品種間の多型を示すこれらのＢＡＣクローンから単離されるいくらかのＤＮＡフラグメントを使用して、単離された組換え体の組換え破壊点をマッピングした。結果として、１．６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＬＭ２０−４Ｄは３つの組換え破壊点を与えたが、ＴＱ１８−１Ｉの９５０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントは、１５個の遠位の組換え体の間で破壊点を与えなかった。ＴＱ１８−１Ｉの同一のフラグメントは近位の組換え体の間で１つの破壊点を与えたため、ｇｅ座位は２つのマーカー（ＬＭ２０−４Ｄの１．６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩおよびＴＱ１８−１Ｉの９５０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ）の間、即ち、２つのＢＡＣクローン、ＬＭ２０−４ＤおよびＴＱ１８−１１上にマッピングされた。
【０１３４】
実施例８
ＧＥ遺伝子の同定
２つのＢＡＣクローン、ＬＭ２０−４ＤおよびＴＱ１８−１１を含んで成る領域にマッピングされたＧＥ遺伝子を同定するために、これらのＢＡＣクローンの全ゲノム挿入物を配列決定した。この目的のために、ロー（Ｒｏｅ）ら１９９６（Ｒｏｅら（１９９６）“ＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ”ジョン・ワイリー（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ）およびサンズ（Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ））に記載の通り、高圧窒素ガスを使用して、ＢＡＣ ＤＮＡを霧状にした。１〜２ｋｂの長さのＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから回収し、ｐＵＣ１８にクローン化した。ＬＭ２０−４Ｄ由来の６８６個のクローンを無作為に単離し、配列決定した。同様に、ＴＱ１８−１Ｉ由来の７００個のクローンを単離し、配列決定した。ＬＭ２０−４Ｄから１２グループの連続配列が得られ、ＴＱ１８−１Ｉからは１６グループが得られた。ＰＣＲによっておよびまた、ＬＭ２０４ＤおよびＬＭ４−１２ＥのＨｉｎｄＩＩＩまたはＥｃｏＲＩフラグメントから誘導される他のサブクローンを得ることによって、ほとんどのギャップが充填された。これにより、２つのＤＮＡマーカー、１．６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ ＬＭ２０−４Ｄおよび９５０ｂｐＨｉｎｄＩＩＩ ＴＱ１８−１Ｉ間の９０ｋｂ長連続配列が構築された。
【０１３５】
９０ｋｂ内では、ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）および本発明者らのＥＳＴデータベースにファイルされた遺伝子に対し所定の類似性を示す１０を超える領域が同定された。領域の末端での組換え体の数およびこれらのＯＲＦの位置から判断すると、ＣＹＰ７８タンパク質に類似のタンパク質をコードする１つのＯＲＦは、Ｐ４５０のサブファミリーであり、ＧＥ遺伝子の候補であることが見出された。ＧＥとＰ４５０遺伝子との間の相関性を確認するために、変異体および野生型由来のゲノム領域をＰＣＲによって増幅した。これらの配列を比較して、９つの異なる対立遺伝子の変異を同定し、これらの全てがＰ４５０遺伝子に見出された；３つのナンセンスおよび６つのミスセンス変異が認められた（図１を参照のこと）。これらのデータから、このイネシトクロムＰ４５０遺伝子がＧＥ遺伝子であり、この遺伝子内の変異はＧＥの表現型を生じ得ることが確認される。
【０１３６】
ＧＥに相同性を示すジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）由来の多くのＰ４５０遺伝子が存在する。それらの中には、胚珠または茎分裂組織において発現されるものもある（ナデアル（Ｎａｄｅａｕ）ら（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：２１３−２３９；ゾンドロ（Ｚｏｎｄｌｏ）およびアイリッシュ（Ｉｒｉｓｈ）（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｊ．１９：２５９−２６８）。しかし、これらの遺伝子の機能は主として不明のままである。ある場合では、ＧＥに相同であるアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）遺伝子が過剰に発現され、得られる果実、または果皮は肥大する一方、種子または胚はもしあったとしても少数しか形成されない（イト（Ｉｔｏ）およびメエロウィツ（Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｚ）（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ１２：１５４１−１５５０）。しかし、このアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）遺伝子を破壊すると表現型は生じなかった。イネのシトクロムＰ４５０遺伝子の本発明における「巨大胚」としての特徴付けは、胚のサイズを直接制御する植物遺伝子の初めての例であると考えられる。
【０１３７】
実施例９
巨大胚表現型に関連するシトクロムＰ４５０タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニング
フェノールおよびグアニジンチオシアネートを含有するライフ・テクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）、メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）２０８４９（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）−ＢＲＬ）から得られるトリアゾール（ＴＲＩａｚｏｌ）（登録商標）試薬を使用して、受粉２〜５日後に回収した発生中の種子から全ＲＮＡを抽出した。オリゴ（ｄＴ）−セルローススピンカラムから成るアマシャム・ファルマシア・バイオテック社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）０８８５５から得られるｍＲＮＡ精製キット（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔｓ）により全ＲＮＡからポリＡ ｍＲＮＡを精製した。ｃＤＮＡライブラリーを作製するために、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）カリフォルニア州ラホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）９２０３７から得られるｃＤＮＡ合成キットに５．５μｇのポリＡ ＲＮＡを使用した。最初の工程では、ライフ・テクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）、メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）２０８４９（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）−ＢＲＬ）から得られるスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）（登録商標）逆転写酵素をＭＭＬＶ逆転写酵素の代わりに使用した。ＢＲＬ ｃＤＮＡサイズ・フラクション・カラム（ＢＲＬ ｃＤＮＡ Ｓｉｚｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ）（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）−ＢＲＬ）を使用して、サイズによってｃＤＮＡを分画し、フラクション１〜１３を沈殿させ、再懸濁し、１μｇのＵｎｉ−ＺＡＰ ＸＲベクターに連結した。連結の２日後、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）カリフォルニア州ラホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）９２０３７から得られるギガパックＩＩＩゴールド（登録商標）パケージング・エキストラクト（Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ（登録商標） ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｔ）にパッケージングした。増幅されていないライブラリーの力価は、１ｍｌあたり約７８０，０００プラー
クであった。増幅プロセスに全量を使用し、該手順は１５０ｍｌの増幅されたｃＤＮＡライブラリーを産生し、力価は５．５×１０８ｐｆｕ／ｍｌであった。
【０１３８】
ＧＥ ｃＤＮＡのスクリーニングは、当業者に周知である標準的プロトコル（アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら１９９３，“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”ジョン・ウィリー（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ）＆サンズ（Ｓｏｎｓ）、米国（ＵＳＡ）、またはサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ））に従う。簡単に説明すると、１．５×１０６ファージクローンをプレート化し、次いで、ナイロン膜に移し、放射性標識ＧＥプローブによるハイブリダイゼーションに供した。５０，０００個のプラークあたり５個を超えるポジティブが検出された。約１２５個のポジティブを単離し、ＧＥ特異的プライマーによるＰＣＲを介してＧＥ ｃＤＮＡとしての同一性について調べた。単離された核酸フラグメントの５’末端に特異的な一方のプライマー（ＧＧＧＡＡＧＣＧＴＴＣＧＣＧＡＡＧＴＧＡＧ、配列番号７８）およびｃＤＮＡ挿入物の５’の隣のクローニングベクターに特異的な他方のプライマー（ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ、配列番号７９）。ＰＣＲ反応からポジティブ結果を示す６個の最も長いｃＤＮＡクローンを単離し、配列を決定した。６個の全てのクローンはほぼ同一の長さを有し、もっとも長いｃＤＮＡは、ゲノム配列から推定されるＡＴＧ開始コドンの上流２８ヌクレオチドである。
【０１３９】
実施例１０
ＧＥ遺伝子の遺伝子の確認
イネシトクロムＰ４５０の単離された核酸フラグメントが巨大胚表現型を担うポリペプチドをコードすることの遺伝子確認は、単離されたシトクロムＰ４５０をクローニングした配列でｇｅ変異体を形質転換することによって達成した。この実験では、シトクロムＰ４５０がＧＥ遺伝子であること、形質転換に使用されたゲノム領域が通常のＧＥ発現に必要な調節エレメントの完全な組を含有したことが確認された。形質転換に使用されるゲノムＤＮＡは、コーディング配列の１．７ｋｂ上流、ＧＥコーディング配列、およびコーディング配列の１．６ｋｂ下流を含んだ。
【０１４０】
他の穀物種由来のＧＥ相同物も、完全遺伝子配列を入手し、イネのＧＥ変異体との相補性を調べることによって、この系で試験することができる。
【０１４１】
ＧＥ遺伝子の潜在的組織特異的発現を確認するために、様々な組織におけるＧＥ転写物の存在について、ＲＮＡブロット分析およびインサイチュハイブリダイゼーションにより分析した（実施例１１を参照のこと）。
【０１４２】
当業者に利用可能である高等植物の細胞にＤＮＡを形質転換するための１つの方法は、目的の核酸構築物を被覆された金属粒子を使用する高速弾道衝撃（ｈｉｇｈ−ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）である（クライン（Ｋｌｅｉｎ）らＮａｔｕｒｅ（１９８７）（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０−７３を参照のこと、また米国特許第４，９４５，０５０号明細書を参照のこと）。これらの相補性実験には、バイオリスティック（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）ＰＤＳ１０００／Ｈｅ（バイオラド・ラボラトリーズ（ＢｉｏＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）カリフォルニア州ヘルクレス（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））を使用した（さらに詳細については実施例４を参照のこと）。粒子衝撃技術を使用して、ＧＥコーディング配列の１．７ｋｂ上流、ＧＥコーディング配列＋イントロン、およびＧＥコーディング配列の１．６ｋｂ下流を含む野生型由来の５．１ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメント（配列番３のヌクレオチド６６０４−１１７３５）でｇｅ変異体を形質転換した。
【０１４３】
抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を付与するストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）由来の細菌性ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨｐｔＩＩ）遺伝子を、イネ形質転換のための選択マーカーとして使用した。ベクターｐＭＬ１８では、ＨｐｔＩＩ遺伝子を、カリフラワーモザイクウイルス（Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）由来の３５Ｓプロモーターおよびアグロバクテリウム・ ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のオクトピンシンターゼ遺伝子由来の終結およびポリ
アデニル化シグナルで操作した。ｐＭＬ１８については、１９９７年１２月１８日に公開されたＷＯ９７／４７７３１に記載されたが、その開示内容は参考として本明細書に援用されている。
【０１４４】
イネ種子を発芽させる胚盤由来の胚形成カルス培養物は、形質転換実験のための供給源材料としての役割を果たす。この材料は、カルス初期培地（ＭＳ塩、ニッチェ・アンド・ニッチェ（Ｎｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｎｉｔｓｃｈ）ビタミン、１．０ｍｇ／ｍｌ２，４−Ｄおよび１０μＭ ＡｇＮＯ３）上、暗所、２７〜２８℃で滅菌稲種子を発芽させることによって作製した。次いで、胚の胚盤から増殖する胚形成カルスをＣＭ培地（ＭＳ塩、ニッチェ・アンド・ニッチェ（Ｎｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｎｉｔｓｃｈ）ビタミン、１ｍｇ／ｍｌ２，４−Ｄ、チュ（Ｃｈｕ）ら、１９８５，Ｓｃｉ．Ｓｉｎｉｃａ１８：６５９−６６８）に移した。２週間間隔での通常の形態培養によってカルス培養物をＣＭ上で維持し、開始から１０週間以内に形質転換に使用した。
【０１４５】
ＣＭ培地上に配置されたワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）＃５４１ペーパーの円形の中央において直径約４ｃｍの円形領域に約１ｍｍ離して配列した０．５〜１．０ｍｍ片を継代培養することによって、形質転換のためのカルスを調製した。カルスを有するプレートを、暗所、２７〜２８℃で３〜５日間インキュベートした。衝撃前に、カルスを有するフィルターを、０．２５Ｍマンニトールおよび０．２５Ｍソルビトールを補充したＣＭに移し、暗所で３時間置いた。次いで、滅菌フード内でペトリ皿の蓋を２０〜４５分間少し開けておき、組織上の水分を消散させた。
【０１４６】
各ゲノムＤＮＡフラグメントを、イネ形質転換のための選択マーカーを含有するｐＭＬ１８で、金粒子表面上に共沈殿させた。これを達成するために、２：１の形質：選択マーカーＤＮＡ比で合計１０μｇのＤＮＡを、６０ｍｇ ｍｌ−１の濃度で再懸濁した５０μｌアリコートの金粒子に添加した。次いで、塩化カルシウム（５０μｌの２．５Ｍ溶液）およびスペルミジン（２０μｌの０．１Ｍ溶液）を金−ＤＮＡ懸濁液に添加し、チューブを３分間ボルテックス撹拌した。金粒子を微小遠心機中で１秒間遠心分離し、上清を除去した。次いで、金粒子を１ｍｌの無水エタノールで２回洗浄し、次いで、５０μｌの無水エタノールに再懸濁し、１秒間超音波処理（浴槽型超音波発生装置）して金粒子を分散させた。金懸濁液を−７０℃で５分間インキュベートし、粒子を分散する必要があれば超音波処理（浴槽型超音波発生装置）した。次いで、６μｌのＤＮＡ被服金粒子をマイヤー（ｍｙｌａｒ）マイクロキャリアディスク上に充填し、エタノールを蒸発させた。
【０１４７】
乾燥期間の終了時に、組織を含むペトリ皿をＰＤＳ−１０００Ｈｅのチャンバ内に置いた。次いで、チャンバ中の空気をＨｇ２８〜９インチの真空まで排気した。衝撃チューブ中のＨｅ圧が１０８０〜１１００ｐｓｉに達する場合に爆発する破裂膜（ｒｕｐｔｕｒｅ
ｍｅｍｂｒａｎｅ）を使用して、マクロキャリアー（ｍａｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ）をヘリウムショック波で加速した。組織を停止スクリーン（ｓｔｏｐｐｉｎｇ ｓｃｒｅｅｎ）からおよそ８ｃｍに配置し、カルスを２回衝撃した。２〜４プレートの組織を、ＤＮＡ被覆金粒子によるこの方法で衝撃した。衝撃後、カルス組織を、ソルビトールまたはマンニトールの補充を伴わないＣＭ培地に移した。
【０１４８】
衝撃後３〜５日以内に、カルス組織をＳＭ培地（５０ｍｇ／ｌハイグロマイシンを含有するＣＭ培地）に移した。これを達成するために、カルス組織をプレートから５０ｍｌ滅菌円錐管に移し、秤量する。２．５ｍｌのトップアガー／１００ｍｇのカルスを使用して、４０℃で融解したトップアガーを添加した。１０ｍｌのピペットで繰り返し分散させることによって、カルスの塊を直径２ｍｍ未満のフラグメントに破壊した。３ｍｌのアリコートのカルス懸濁液を新鮮ＳＭ培地上にプレート化し、プレートを２７〜２８℃、暗所で４週間インキュベートした。４週間後、トランスジェニックカルス事象を同定し、新鮮ＳＭプレートに移し、２７〜２８℃、暗所でさらに２週間、成長させた。
【０１４９】
成長しているカルスをＲＭ１培地（ＭＳ塩、ニッチェ・アンド・ニッチェ（Ｎｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｎｉｔｓｃｈ）ビタミン、２％ショ糖、３％ソルビトール、０．４％ゲルライト（ｇｅｌｒｉｔｅ）＋５０ｐｐｍハイグロマイシンＢ（ｈｙｇＢ））に移し、２週間、２５℃で暗所に置いた。２週間後、カルスをＲＭ２培地（ＭＳ塩、ニッチェ・アンド・ニッチェ（Ｎｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｎｉｔｓｃｈ）ビタミン、３％ショ糖、０．４％ゲルライト（ｇｅｌｒｉｔｅ）＋５０ｐｐｍハイグロマイシンＢ（ｈｙｇＢ））に移し、１２時間光周期での白色蛍光灯（約４０μＥｍ−２ｓ−１）下、２５℃および３０〜４０％湿度に配置した。照明下２〜４週間後、カルスが組織化し、苗条を形成し始めた。苗条を周囲のカルス／培地から取り出し、フィタトレイ（ｐｈｙｔａｔｒａｙ）（シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））中のＲＭ３培地（１／２×ＭＳ塩、ニッチェ・アンド・ニッチェ（Ｎｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｎｉｔｓｃｈ）ビタミン、１％ショ糖＋５０ｐｐｍハイグロマイシンＢ）に穏やかに移し、先の工程に記載されている条件と同一の条件を使用してインキュベーションを継続した。
【０１５０】
十分な根および苗条が生じた場合、２〜３週間後に、植物を、ＲＭ３からメトロ・ミックス（Ｍｅｔｒｏ ｍｉｘ）３５０を含有する４インチポットに移した。トランスジェニック植物から得られる種子を、ｇｅ変異のＧＥ遺伝子を含有する野生型ゲノムＤＮＡとの遺伝子相補性について調べた。野生型ＧＥの単離された核酸フラグメントを含有する５．１ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントで形質転換された変異ＧＥ株は、正常な胚を有するイネ穀粒を生じた。
【０１５１】
この結果より、シトクロムＰ４５０コーディング領域を含有する５．１ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントはｇｅ変異表現型との間に十分な相補性があることが確認される。さらに、この領域はｇｅ変異と完全な相補性があるため、遺伝子の「野生型」発現に必要な全ての調節エレメントは５．１ｋｂＥｃｏＲＩフラグメント内に存在するようである。
【０１５２】
実施例１１
ＧＥプロモーターの特徴付け
実施例１０に記載の５．１ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントには、ｇｅ変異との間に十分な相補性が認められた。このことは、ＧＥの適切な発現に必要なプロモーターがこの遺伝子領域においてコードされることを実証した。イネＧＥの２つのトウモロコシ相同物については実施例１３に記載されている。これらの遺伝子、ｚｍＧＥ１およびｚｍＧＥ２の両方の２ｋｂの上流配列を、それぞれ配列番号１０４および１０５に示す。正常なトウモロコシＧＥ発現に必要な調節エレメントは、配列番号１０４または１０５ならびにｚｍＧＥ１およびｚｍＧＥ２のコーディング領域内に含有されている。
【０１５３】
ＧＥ機能に必要な発現パターンについて調べるために、インサイチュハイブリダイゼーションにより、組織におけるＧＥ ＲＮＡの蓄積について分析した。弱いＧＥ発現の詳細なデータを得るために、サカイ（Ｓａｋａｉ）ら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ３７８：１９
９−２０３に従った放射能を使用する方法を用いた。ジャクソンＤ．Ｐ．（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｄ．Ｐ．）（１９９１）Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ．Ｉｎ：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”，（ボウレルズＤ．Ｊ．（Ｂｏｗｌｅｓ，Ｄ．Ｊ．，グルＳ．Ｊ．（Ｇｕｒｒ，Ｓ．Ｊ．）およびマックフェレソンＭ．（ＭｃＰｈｅｒｅｓｏｎ，Ｍ．）編）、オックスフォード大学出版（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）に従って、植物材料をプロトプラストに固定および包埋した。回転式ミクロトームを使用して、８μｍ厚の切片を調製した。ＧＥ特異的センスＲＮＡを検出するために、３’ＵＴＲを含有する領域をＰＣＲによって増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））にクローニングした。プローブに対する領域を増幅するために使用したプライマーは、ＧＥ３’ＲＶＱ：ＴＣＧＴＧＴＧＣＡＡＧＧＣＣＧＴＧＧＣＴＡ（配列番号１０６）およびＧＥ３’ＬＶＣ：ＧＣＡＣＧＡＴＣＣＡＴＴＴＡＧＣＡＣＡＣＣＡＧ（配列番号１０７）であった。増幅された配列は、配列番号３のヌクレオチド位置９９４１〜１０３００由来であった。
【０１５４】
ＳｐｅＩで消化することによりクローンを線状化し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼで転写することによって、センスＧＥ ＲＮＡを検出するためのアンチセンスＲＮＡプローブを合成した。ＮｃｏＩで消化することによりクローンを線状化し、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼで転写することによって、コントロールに対するセンスＲＮＡを合成した。
【０１５５】
ＮＢＴ２ Ｋｏｄａｋ（コダック）オートフォトグラフィーエマルジョンフィルムに対する暴露の３週間後、複式顕微鏡（ニコン（Ｎｉｋｏｎ）、エクリプス（Ｅｃｌｉｐｓｅ
Ｅ８００）を使用する暗視野顕微鏡検査によって、結果を解析した。発生中の胚および内乳組織においてＧＥ ＲＮＡの蓄積が検出された。検出された最も早期の発現は受粉２日後であった。胚において検出されたＧＥ発現は、球状期での頂部領域ならびに子葉（ｃｏｌｅｏｐｉｌａｒ）および後期での内乳組織に面する胚盤の表皮層に限定された。細胞期前の発生中の内乳では、胚組織付近の区域ではいくらかの濃度で領域全体においてＧＥ
ＲＮＡが検出された。その後、ＧＥの発現パターンはシフトし、胚に面する区域においてさらなる発現が認められた。さらに、極めて若い葉組織においてもＧＥの発現が認められた。
【０１５６】
実施例１２
オオムギＧＥ相同物の同定
遺伝子を同定するために、単離された全ＧＥ核酸フラグメントから作製されるＤＮＡプローブと、６５℃でハイブリダイズさせ、中程度のストリンジェンシー（５×ＳＳＰＥ、０．５％ＳＤＳ、６５℃、続いて、１×ＳＳＰＥ、０．５×ＳＤＳ、６５℃）で洗浄することによって、オオムギゲノムライブラリー（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カタログ番号９４６１０４）をスクリーニングした。ポジティブにハイブリダイズした５個のλクローンを単離した。制限酵素を介するこれらのクローンのマッピングにより、全ての５つのクローンは同じゲノム領域由来の重複クローンであることが確認された。イネＧＥに相同な領域を含有するＤＮＡフラグメントをさらにサブクローニングし、配列決定した。
【０１５７】
オオムギＧＥ相同物の推測されるコーディング配列および推測される翻訳産物を、それぞれ配列番号９２および９３に示す。オオムギＧＥ相同物は、イネＧＥタンパク質に対して高い程度の保存性（アラインメントのクラスタル法に基づいて７２．９％同一性）を有する。さらに、イネＧＥ遺伝子に見出される９１ヌクレオチドイントロンは、オオムギ遺伝子内での配置が保存されている（配列番号９２のヌクレオチド位置９９１と９９２との間、オオムギイントロンは１２５ヌクレオチドである）。このようなイントロンの配置の保存性は、ｚｍＧＥ１、ｚｍＧＥ２、およびｚｍＧＥ３においても見出されている（実施
例１３を参照のこと）。
【０１５８】
実施例１３
トウモロコシＧＥ相同物の同定
ＧＥに対して共同の相同性を示すＥＳＴクローンの解析によって、トウモロコシＧＥ相同物を同定した（実施例３を参照のこと）。ＥＳＴ、ｃｂｎ１０．ｐｋ００３４．ｆ８、トウモロコシＧＥ２（ｚｍＧＥ２、ヌクレオチドコーディング配列に対する配列番号９６、および推定翻訳産物に対する配列番号９７）ならびにｐ０１２１．ｃｆｒｍｎ６２ｒ、トウモロコシＧＥ１（ｚｍＧＥ１、ヌクレオチドコーディング配列に対する配列番号９４、および推定翻訳産物に対する配列番号９５）によって表される２つの遺伝子は、交差ハイブリダイゼーション分析によって、トウモロコシゲノムにおいて最も相同な遺伝子であることが示された。第３のクローンｃｐｌｓ１ｓ．ｐｋ００１．ｍ１９（ｚｍＧＥ３、ヌクレオチドコーディング配列に対する配列番号９８、および推定翻訳産物に対する配列番号９９）もまた、ＢＡＣゲノムクローンを解析することによって同定されている（以下を参照のこと）。３つのトウモロコシ遺伝子のそれぞれ内に含有される単一のイントロンが存在し、その配置は実施例１２で考察したイネおよびオオムギについて保存されている。ｚｍＧＥ１のイントロンは１２２ヌクレオチドであり、配列番号９４のヌクレオチド位置１１４３と１１４４との間に見出されており、ｚｍＧＥ２のイントロンは１９３ヌクレオチドであり、配列番号９６のヌクレオチド位置９４２と９４３との間に見出されており、ｚｍＧＥ３のイントロンのサイズは未だ決定されていないが、他の４つよりも相当大きい。
【０１５９】
以下に説明する交差ハイブリダイゼーション分析では、トウモロコシＤＮＡをいくらかの異なる制限酵素で消化し、０．７％アガロースゲル上で分離した。ＤＮＡをナイロン膜フィルターハイボンド（ＨｙＢｏｎｄ）Ｎ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））に移し、イネＧＥ遺伝子の全コーディング領域から作製される３２Ｐ標識プローブと５０℃で、ハイブリダイズさせた。１×ＳＳＰＥ、０．５％ＳＤＳ、６５℃でフィルターを洗浄後、該フィルターをホスホ・イメージャー（Ｐｈｏｓｐｈｏ Ｉｍａｇｅｒ）スキャナ（モレキュラー・ダイナミクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ））上に暴露し、ホスホ・イメージャー（Ｐｈｏｓｐｈｏ Ｉｍａｇｅｒ）スキャナ（モレキュラー・ダイナミクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ））を使用してシグナルを検出した。１バンドを超えるものからシグナルが検出され、これは、イネＧＥに極めて相同である１を超えるトウモロコシ遺伝子が存在する可能性を示す。
【０１６０】
トウモロコシゲノムにおいて相同遺伝子を同定するために、トウモロコシオオムギゲノムライブラリー（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カタログ番号９４６１０２）を、２×ＳＳＰＥ、０．５％ＳＤＳ、５０℃、次いで、１×ＳＳＰＥ、０．５×ＳＤＳ、６５℃で開始する中程度のストリンジェンシー条件でスクリーニングし、ポジティブなシグナルを示した９個のλクローンを得た。ＰＣＲ解析は、これらのクローンがｃｂｎ１０．ｐｋ００３４．ｆ８またはｐ０１２１．ｃｆｒｍｎ６２ｒのいずれかに特異的な配列を有することが示されることを示し、これらのＥＳＴがイネＧＥに最も相同なトウモロコシ遺伝子をコードすることを証明した。
【０１６１】
２つのＥＳＴクローンによって表わされるこれらの遺伝子の構造に関するさらなる情報を得るために、トウモロコシゲノムＢＡＣクローンをスクリーニングした。クローンｐ０１２１．ｃｆｒｍｎ６２ｒは、１つのコンティグに属するＢＡＣクローンにハイブリダイズした。クローンｃｂｎ１０．ｐｋ００３４．ｆ８は、２つの異なるコンティグから誘導されるＢＡＣクローンにハイブリダイズした。それぞれのコンティグ由来の１つのＢＡＣを選択し、全ＢＡＣ挿入物から配列決定のためのサブクローンを作製した。これらのＢＡＣは、ｐ０１２１．ｃｆｒｍｎ６２ｒ（ｚｍＧＥ１）に対するＢＡＣｂ９４ｄ．ｂ２およ
びｃｂｎ１０．ｐｋ００３４．ｆ８コンティグ（ｚｍＧＥ２）に対するＢＡＣｂ１５３ｃ．ｊ１７である。それぞれのＢＡＣの配列はトウモロコシＧＥ相同物のゲノム配列を示した。ＢＡＣｂ３７ｃ．ｆ１は、ｃｂｎ１０．ｐｋ００３４．ｆ８およびＢＡＣ ｂ１５３ｃ．ｊ１７によって表わされる遺伝子にほぼ同一であるが異なる配列であるＯＲＦを含有した。第３のトウモロコシ相同物はｚｍＧＥ３を命名した。
【０１６２】
実施例１４
ゲノムシンテニー解析によるＧＥ相同物の同定
シンテニー解析、つまり異なる生物体間の染色体上の遺伝子配置の保存性は、もう１つの緊密な関係の種由来の既知のゲノム領域と比較することによって、１つの種由来の相同な遺伝子またはゲノム領域を同定するための有用な道具であることが公知である。例えば、トウモロコシ由来のＧｅｎｅＡは、独特な活性を有することが公知であるが、大きな多遺伝子ファミリーに関連する。ＧｅｎｅＡの染色体解析は、該ＧｅｎｅＡがＧｅｎｅＢに緊密に連結していることを示す。イネにおけるＧｅｎｅＡの相同物（ＧｅｎｅＡ−ｒ）を見出すことを所望する場合、ＧｅｎｅＡ−ｒファミリーのメンバーは、ＧｅｎｅＢ−ｒに緊密に連結している可能性がある。イネおよびトウモロコシは、染色体構造、即ち、遺伝子の順序の保存性を大きな程度で示すことが公知である（アン（Ａｈｎ）およびサンクスレー（Ｔａｎｋｓｌｅｙ）ＰＮＡＳ（１９９３）９０：７９８０−７９８４）。そのようなシンテニー関係を利用して、緊密な関係の種間の相同物を同定するために、実施例１３に記載の３つのＢＡＣのゲノム配列を、実施例１に記載の１００ｋｂ長のイネＧＥゲノム配列と比較した。解析は、ＢＡＣｂ９４ｄ．ｂ２におけるＯＲＦを示し、イネＧＥに緊密に連結している遺伝子であるヒドロラーゼに対する類似性を示した（イネヒドロラーゼ遺伝子は、配列番号１００および１０１（それぞれヌクレオチドおよびポリペプチド）において示されており、トウモロコシヒドロラーゼは配列番号１０２および１０３に示されている）。従って、ｚｍＧＥ１も、ちょうどイネＧＥ遺伝子と同じようにヒドロラーゼ遺伝に緊密に連結している。このことは、ＧＥに緊密に連結しているイネ遺伝子をタグとして使用し、シンテニーを用いて保存された染色体構造を有する植物種からＧＥ相同物を単離しえることを実証した。
【０１６３】
実施例１５
ＧＥ相同物に特異的なタンパク質配列の同定
シトクロムＰ４５０タンパク質は、様々な機能を有する遺伝子のスーパーファミリーを含んで成る（ウェルク−レイヒハルト（Ｗｅｒｃｋ−Ｒｅｉｃｈｈａｒｔ）およびフェエレイセン（Ｆｅｙｅｒｅｉｓｅｎ）（２０００）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ１：ｒｅｖｉｅｗｓ３００３．１−３００３．９）。図２は、イネＧＥ（配列番号２）、オオムギＧＥ−相同物（配列番号９３）、トウモロコシＧＥ１−相同物（配列番号９５）、トウモロコシＧＥ２−相同物（配列番号９７）、トウモロコシＧＥ３−相同物（配列番号９９）、ユリＧＥ−相同物（配列番号４１）、ランｇｉ１１７３６２４（配列番号４３）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ｇｉ１２３５１３８（配列番号４２）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ｇｉ８９２０５７６（配列番号４７）、オダマキＧＥ−相同物（配列番号３５）、ダイズＧＥ−相同物（配列番号２３）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ｇｉ１１２４９５１１（配列番号４４）、ダイズｇｉ５９２１９２６（配列番号４５）、ダイズＧＥ−相同物（配列番号２５）、ダイズＧＥ−相同物（配列番号２１）、およびアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ｇｉ３８３１４４０（配列番号４６）のアラインメントを示す。囲み内の残基は、バイオスカウト（Ｂｉｏｓｃｏｕｔ）ＤＳＣプログラム（キング（Ｋｉｎｇ）およびスターンベルグ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ）（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ５：２２９８−２３１０）によって同定される推定されたヘリックス領域である。他の囲み内のエレメントは、「ＳＲＳ」またはシトクロムＰ４５０構造における高変異性配列である基質認識部位、シトクロムＰ４５０におけるプロリン（しばしばＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）の「ＰＰＰ」クラスター、基
質アクセスチャンネル（配列番号８３の保存された配列モチーフの部分）である「Ｆ−Ｇループ」、保存された「ＧＸＤＴ」（ヘム相互作用および酵素触媒に関与するプロトン移動溝）（配列番号８５の保存された配列モチーフの部分）、「ＥＸＸＲ」（ヘム安定化およびコア構造の安定性に必要な全てのシトクロムＰ４５０において保存されたＫ−ヘリックスモチーフ）（配列番号８８の保存された配列モチーフの部分）、ならびに「ＦＸＸＧＸＲＸＣＸＧ」（ヘムに接触するシステインを有する保存されたヘム結合部位）（配列番号９０の保存された配列モチーフの部分）を含む。
【０１６４】
配列のアラインメントおよび関連シトクロムＰ４５０配列との比較により、ＧＥ様シトクロムＰ４５０に独特であるモチーフを同定するための有用な方法が提供される。配列番号８０〜９１に見出される保存された配列モチーフの多くはヘリックスドメインの縁、またはＳＲＳ領域に見出される。
【０１６５】
実施例１６
高油種子形質に関連する座位に対するトウモロコシＧＥ相同物の遺伝子マッピング
高油トウモロコシ品質およびイネ巨大胚変異体は、それらの表現型において広範な類似性を有する。ＧＥ相同物をマッピングして、トウモロコシＧＥ相同物と高油形質を制御する座位との間の潜在的相関性について調べた。３’ＵＴＲ領域における多型ヌクレオチド配列（ＳＮＰ）を見出すことによって、マッピングを実施した。遺伝子特異的プライマーを作製し、マッピングペアレントのゲノムＤＮＡ由来の遺伝子をＰＣＲ増幅した：増幅には、次のプライマーを使用した：９０Ｆ：ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＣＡＣＣＴＧＣＴＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣ（配列番号１０８）および９１Ｒ：ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＡＣＴＧＣＣＣＡＴＴＴＣＧＴＡＧＣ（配列番号１０９）。染色ターミネーター化学（ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）によって、ＰＣＲ産物を直接配列決定し、次いで、配列を整列し、多型について解析した。
【０１６６】
ｚｍＧＥ１（ｐ０１２１．ｃｆｒｍｎ６２ｒ）で表わされる単離された核酸フラグメントでは、マッピングペアレントであるＧ６１／Ｇ３９間の多型が、コンセンサス７３位において、Ｇ６１のヌクレオチドＴで見出されたが、Ｇ３９のヌクレオチドＧでは認められなかった。
【０１６７】
多型の配置を以下に示す（ＳはＣまたはＧに対応し、ＫはＧまたはＴに対応する）：
ＣＡＣＣＴＧＣＴＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＴＴＣＧＣＧＣＣＣＴＣＳＧＧＡＧＡＣＧＣＧＣＡＣＴＧＧＣＧＣＧＧＧＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＴＣＫＣＣＧＣＣＡＡＣＣＡＣＣＴＧＴＴＣＧＧＣＣＣＧＣＧＣＣＧＣＧＴＧＧＣＧＧＧＴＧＣＣＧＣＧＣＡＣＣＡＣＣＧＣＧＣＣＴＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＧＣＣＧＡＣＧＴＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＡＴＧＧＣＧＣＧＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＧＴＣＣＣＴＣＴＣＡＡＧＣＧＣＧＴＧＣＴＧＣＡＴＧＴＣＧＣＧＴＣＴＣＴＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡＴＧＧＣＣＡＣＣＧＴＧＴＴＴＧＧＣＡＡＧＣＧＣＴＡＣＧＡＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＡＧＡＧＧＧＣＧＣＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＧＡＧＡＴＧＧＴＧＧＣＣＧＡＧＧＧＣＴＡＣＧＡＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＣＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＧＣＴＧＡＴＣＡＡＣ（配列番号１１０）。
【０１６８】
ピロシークエンシング（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（商標）（アップサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）、スウェーデン（Ｓｗｅｄｅｎ）；リッケルト（Ｒｉｃｋｅｒｔ）ら（２００２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ３２：５９２−６０３）によって、マッピング集団の９４個体を遺伝子型分類するために、多型に緊密な配列決定プライマーを作製した。配列決定プライマーＰＹ９０Ｒは、ＧＧＧＣＣＧＡＡＣＡＧＧＴＧＧＴＴＧ（配列番号１１０の７７〜９５位の相補配列、上記の下線を付した部分）である。次いで、伝承（ｈｅｒｉｔａｇｅ）スコアを使用し、マップメーカー（ＭＡＰＭＡＫＥＲ）（商標）またはジョイ
ンマップ（ＪＯＩＮＭＡＰ）（商標）を使用してコアトウモロコシ遺伝子地図上に遺伝子を配置した。クローンｐ０１２１．ｃｆｒｍｎ６２ｒを、ｂｉｎ７．０４におけるマーカーｂｎｌ８．３９の付近である第７染色体の底部にマッピングした。
【０１６９】
この地図上の位置は、高種子油に関連する量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）の１つと重複する。
【０１７０】
ＱＴＬマッピングの材料は、２つの株、４９．００７とＨ３１とを交雑させることによって開発した。４９．００７は、ＡＳＫＣ２８集団から開発された高油同系繁殖系（約２０％の核油（ｋｅｒｎｅｌ ｏｉｌ））である。Ｈ３１は、極めて低い核油含有量（約１％）を有するイリノイ・ロー・オイル（Ｉｌｌｉｎｏｉｓ Ｌｏｗ Ｏｉｌ）から誘導される公的株である（クアケンブッシュＦＷ（Ｑｕａｃｋｅｎｂｕｓｈ ＦＷ）、フィルヒＪＧ（Ｆｉｒｃｈ ＪＧ）、ブルンゾンＡＭ（Ｂｒｕｎｓｏｎ ＡＭ）およびハウスＬＲ．（Ｈｏｕｓｅ ＬＲ．）１９６３．Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍ．４０：２５０）。この交雑から、２世代の自己生殖を介して１８０のＦ２：３ファミリーを開発した。個々のＦ２植物由来のＦ３穀粒を、胚重量および他の油関連形質について評価した。核穂の中部より１００個の核部を殻から取り出し、約５％水分まで乾燥（４日間４０℃）させ、秤量し、ＮＭＲで油含有量を決定した。１００個の核部からの無作為の部分サンプルから２０個の胚を切り出し、胚重量を決定した。各Ｆ３ファミリーの２０個の実生を温室で成長させ、実生の葉を個々のファミリーに基づいてまとめた。葉のサンプルを凍結乾燥し、粉体に粉砕し、ＤＮＡ抽出に使用した。９６ウェル形式におけるミニＣＴＡＢ法によりゲノムＤＮＡを抽出した。ＳＳＲマーカーをこのマッピング研究に使用した。蛍光末端標識プライマー、ＡＢＩ３７７ ＤＮＡシークエンサー、ジーンスキャン（ＧｅｎｅＳｃａｎ）（商標）ならびにゲノタイパー（Ｇｅｎｏｔｙｐｅｒ）（商標）ソフトウェア上でのピーク検出および対立遺伝子同定の使用を含むＡＢＩ ＰＲＩＳＭ系を使用して、全ての遺伝子型を検出した。合計で８９の多型ＳＳＲをマッピング解析に使用した。連鎖地図はＭＡＰＭＡＫＥＲによって集成し、ＭＡＰＭＡＮＡＧＥＲで確認した。合成（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）インターバルマッピングを介して各形質の平均値に対してＱＴＬ解析を行った。ＱＴＬカートグラファー（Ｃａｒｔｏｇｒａｐｈｅｒ）を使用して、解析を実施した。解析に使用した重要なパラメータは以下の通りである：
マッピング機能：コサンビ（Ｋｏｓａｍｂｉ）
ＱＴＬマッピング方法：合成（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）インターバルマッピング
有意性閾値：ＬＯＤ＝２．５
直線回帰および変数減少（ｂａｃｋｗａｒｄ）・変数増減（ｓｔｅｐｗｉｓｅ）直線回帰のための有意検定：ａ＝０．０５
【０１７１】
高油種子の胚重量形質に対するＱＴＬは第７染色体上に存在すると思われた。推定ＱＴＬは、ＥＳＴ ｐ０１２１．ｃｆｒｎ６２ｒ（ｚｍＧＥ１）がマッピングされた領域にある。
【０１７２】
実施例１７
トウモロコシＧＥ相同物の発現解析
ＧＥ相同物と高油形質との間の潜在的相関性を調べるために、ｚｍＧＥ２の発現パターンを解析した。
【０１７３】
発現研究は、様々な株の様々なトウモロコシ組織から得たＭＰＳＳ（大規模並列サイン配列決定（Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ））データ（Ｂｒｅｎｎｅｒら２０００．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：６３０−６３４；Ｂｒｅｎｎｅｒら（２０００）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９７：１６６５−１６７０）と比較することによって行った。Ｍ
ＰＳＳデータは、それぞれのライブラリーについて１，０００，０００クローン間の大量の特定のｃＤＮＡデータクローンを考察する際の発現レベルの調査を可能にする。単一のＤＮＡに独特である比較的多量の特定のタグ付けされた配列は、該組織において対応するＲＮＡの蓄積の相対レベルに相関する。受粉１５日後に単離された胚組織由来のｃＤＮＡにおける特異的タグ配列ＧＡＴＣＧＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＴ（配列番号１１１）の存在下で、試験したすべての品種でＧＥ相同物ｚｍＧＥ２の発現を検出した。種子中に正常な油蓄積を有するトウモロコシ品種では、ｚｍＧＥ２は、野生型品種Ｂ７３で２３８／１，０００，０００の頻度（百万あたり２３８部または２３８ｐｐｍ）で発現され、野生型ＡＳＫ サイクル（ｃｙｃｌｅ）０では２６３ｐｐｍで発現された。対照的に、高油トウモロコシ株におけるｚｍＧＥ２の発現は、５０％を超えて減少した。高油株ＱＸ４７では、ｚｍＧＥ２は、８９ｐｐｍと有意に低い頻度で発現された。別の高油株ＡＳＫ ２８サイクルズ（ｃｙｃｌｅｓ）では、発現レベルは１１３ｐｐｍであった。第３の高油品種ＩＨＯは、７８ｐｐｍの蓄積率を示した。ＡＳＫ０（正常）および２８サイクルズ（ｃｙｃｌｅｓ）の２つの株は同じバックグランドから誘導されるため、発現の減少は、ＡＳＫ０（正常）と２８サイクルズ（ｃｙｃｌｅｓ）との間で特に顕著である。
【０１７４】
これらのデータは、トウモロコシＧＥ相同物の１つ、ｚｍＧＥ２が、高油株の発生中の胚での発現において実質的にダウンレギュレートされたことを示した。発現研究の結果から、このＧＥ相同物は、トウモロコシ種子中の高油形質と負の相関を有することが確認された。このことは、ＧＥ遺伝子の変異が胚の肥大および高油表現型を生じたイネの結果と一致する。
【０１７５】
なお、本発明の特徴または主な態様は次のとおりである。
１．（ａ）種子発生期（ｄｕｒｉｎｇ ｓｅｅｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号２、７、１１、１９、２７、もしくは３３から成る群より選択される第２のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法に基づいて少なくとも６１％のアミノ酸同一性を有する核酸配列、または
（ｂ）種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号１５、１７、３１、９３、９５、９７、もしくは９９から成る群より選択される第３のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル法に基づいて少なくとも６５％のアミノ酸同一性を有する核酸配列、
または
（ｃ）種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号９、１３、２３、２９、３５、もしくは４１から成る群より選択される第４のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル法に基づいて少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有する核酸配列、または
（ｄ）種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号２１、２５、３７、もしくは３９から成る群より選択される第２のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル法に基づいて少なくとも７７％のアミノ酸同一性を有する核酸配列、または
（ｅ）（ａ）もしくは（ｂ）もしくは（ｃ）もしくは（ｄ）の相補体、
から成る群より選択される核酸配列を含んで成る単離されたヌクレオチドフラグメント。２．配列番号８０〜９１に記載のアミノ酸配列のいずれかに実質的に対応する少なくとも１つのモチーフを含んで成り、前記モチーフが保存された部分配列である、前記第１項に記載の単離されたヌクレオチド配列、またはその相補体。
３．前記フラグメントまたはその部分が、形質転換された植物の種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドの相互抑制またはアンチセンス阻害に有用である前記第１項または２項に記載の単離されたヌクレオチド。
４．プロモーターを含んで成る単離された核酸フラグメントであって、前記プロモーター
が、配列番号３、４、１０４、もしくは１０５に記載のヌクレオチド配列から本質的に成るか、あるいは前記プロモーターが、配列番号３、４、１０４、もしくは１０５に記載のヌクレオチド配列に実質的に類似するかまたは機能的に等価であるフラグメントまたはサブフラグメントから本質的に成る単離された核酸フラグメント。
５．少なくとも１つの調節配列に操作可能に連結された前記第１項または２項に記載の単離された核酸フラグメントを含んで成るキメラ構築物。
６．少なくとも１つの調節配列に操作可能に連結された前記第３項に記載の単離された核酸フラグメントを含んで成るキメラ構築物。
７．前記単離された核酸フラグメントが、前記第４項に記載のプロモーターに操作可能に連結されている前記第５項に記載のキメラ構築物。
８．前記単離された核酸フラグメントが、前記第４項に記載のプロモーターに操作可能に連結されている前記第６項に記載のキメラ構築物。
９．ゲノム内に前記第５項に記載のキメラ構築物を含んで成る植物。
１０．ゲノム内に前記第６項に記載のキメラ構築物を含んで成る植物。
１１．ゲノム内に前記第７項に記載のキメラ構築物を含んで成る植物。
１２．ゲノム内に前記第８項に記載のキメラ構築物を含んで成る植物。
１３．前記第９項に記載の植物から得られる種子。
１４．前記第１０項に記載の植物から得られる種子。
１５．前記第１１項に記載の植物から得られる種子。
１６．前記第１２項に記載の植物から得られる種子。
１７．前記第１３項に記載の種子から得られる油。
１８．前記第１４項に記載の種子から得られる油。
１９．前記第１５項に記載の種子から得られる油。
２０．前記第１６項に記載の種子から得られる油。
２１．前記植物が、イネ、トウモロコシ、モロコシ、キビ、ライムギ、ダイズ、カノーラ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、豆類、およびナッツ類から成る群より選択される前記第９項に記載の植物。
２２．前記植物が、イネ、トウモロコシ、モロコシ、キビ、ライムギ、ダイズ、カノーラ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、豆類、およびナッツ類から成る群より選択される前記第１０項に記載の植物。
２３．前記植物が、イネ、トウモロコシ、モロコシ、キビ、ライムギ、ダイズ、カノーラ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、豆類、およびナッツ類から成る群より選択される前記第１１項に記載の植物。
２４．前記植物が、イネ、トウモロコシ、モロコシ、キビ、ライムギ、ダイズ、カノーラ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、豆類、およびナッツ類から成る群より選択される前記第１２項に記載の植物。
２５．前記第５項に記載のキメラ構築物を含んで成る、形質転換された植物組織または植物細胞。
２６．前記第６項に記載のキメラ構築物を含んで成る、形質転換された植物組織または植物細胞。
２７．前記第７項に記載のキメラ構築物を含んで成る、形質転換された植物組織または植物細胞。
２８．前記第８項に記載のキメラ構築物を含んで成る、形質転換された植物組織または植物細胞。
２９．植物が、イネ、トウモロコシ、モロコシ、キビ、ライムギ、ダイズ、カノーラ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、豆類、およびナッツ類から成る群より選択される前記第２５項に記載の植物組織または植物細胞。
３０．植物が、イネ、トウモロコシ、モロコシ、キビ、ライムギ、ダイズ、カノーラ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、豆類、およびナッツ類から成る群より選択される前記第２６項に記載の植物組織または植物細胞。
３１．植物が、イネ、トウモロコシ、モロコシ、キビ、ライムギ、ダイズ、カノーラ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、豆類、およびナッツ類から成る群より選択される前記第２７項に記載の植物組織または植物細胞。
３２．植物が、イネ、トウモロコシ、モロコシ、キビ、ライムギ、ダイズ、カノーラ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、豆類、およびナッツ類から成る群より選択される前記第２８項に記載の植物組織または植物細胞。
３３．（ａ）前記第５項に記載のキメラ構築物で植物を形質転換し、
（ｂ）キメラ構築物の発現に適切な条件下で形質転換された植物を成長させ、そして
（ｃ）改変された胚／内乳のサイズを有する種子を産生する上記形質転換された植物を選択する、
ことを含んで成る、植物の種子発生期における胚／内乳のサイズの制御方法。
３４．（ａ）前記第６項に記載のキメラ構築物で植物を形質転換し、
（ｂ）キメラ構築物の発現に適切な条件下で形質転換された植物を成長させ、そして
（ｃ）改変された胚／内乳のサイズを有する種子を産生する前記形質転換された植物を選択する、
ことを含んで成る、植物の種子発生期における胚／内乳のサイズの制御方法。
３５．（ａ）前記第７項に記載のキメラ構築物で植物を形質転換し、
（ｂ）キメラ構築物の発現に適切な条件下で形質転換された植物を成長させ、そして
（ｃ）改変された胚／内乳のサイズを有する種子を産生する前記形質転換された植物を選択する、
ことを含んで成る、植物の種子発生期における胚／内乳のサイズの制御方法。
３６．（ａ）前記第８項に記載のキメラ構築物で植物を形質転換し、
（ｂ）キメラ構築物の発現に適切な条件下で形質転換された植物を成長させ、そして
（ｃ）改変された胚／内乳のサイズを有する種子を産生する前記形質転換された植物を選択する、
ことを含んで成る、植物の種子発生期における胚／内乳のサイズの制御方法。
３７．（ａ）配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、９３、９５、９７、または９９と、種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連する他のポリペプチド配列とを比較し、
（ｂ）工程（ａ）において得られる保存配列すなわち４つもしくはそれ以上のアミノ酸
を同定し、
（ｃ）工程（ｂ）において同定される保存配列に基づいて領域特異的ヌクレオチドプロ
ーブまたはオリゴマーを作製し、そして
（ｄ）工程（ｃ）のヌクレオチドプローブまたはオリゴマーを使用して、配列依存性プロトコルにより種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連する配列を単離する、ことを含んで成る、種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するポリペプチドをコードする核酸フラグメントの単離方法。
３８．（ａ）２種の植物種を交雑させ、そして
（ｂ）工程（ａ）の交雑から得られる子孫植物における、
（ｉ）配列番号１、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、もしくは１０５から成る群より選択される核酸配列、または
（ｉｉ）配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、８０〜９１、９３、９５、９７、もしくは９９から成る群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列、
について遺伝子の変異を評価することを含んで成り、その際、評価を、ＲＦＬＰ解析、ＳＮＰ解析、およびＰＣＲに基づく解析から成る群より選択される方法を使用して行う、胚／内乳のサイズを制御することおよび／または植物の油表現型を改変することに関する遺
伝子の変異のマッピング方法。
３９．（ａ）２種の植物種を交雑させ、そして
（ｂ）工程（ａ）の交雑から得られる子孫植物における
（ｉ）配列番号１、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、もしくは１０５から成る群より選択される核酸配列、または
（ｉｉ）配列番号２、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、８０〜９１、９３、９５、９７、もしくは９９から成る群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列、
について遺伝子の変異を評価することを含んで成り、その際、評価を、ＲＦＬＰ解析、ＳＮＰ解析、およびＰＣＲに基づく解析から成る群より選択される方法を使用して行う、胚／内乳のサイズを制御するための分子育種および／または植物の油表現型の改変方法。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】ＧＥ遺伝子およびｇｅ変異体対立遺伝子の配列のアラインメントを示す。巨大胚表現型を生じる対立遺伝子変異を相補鎖上において「＊」で示す。それぞれの変異を標識し、塩基の変化を示し（コーディング鎖における対応する相補塩基の変化を下部に示す）、得られるアミノ酸の変化を挿入して示す（即ち、野生型−＞変異型）。ｇｅ−１変異体はヌクレオチド位置１４８２のＧをＡに改変する変異を有し、対応するＴｒｐ残基を未熟な翻訳終止に変化した（ＵＧＧコドンからＵＧＡへ）。ｇｅ−２では、ヌクレオチド位置１４５１のＧはＡに改変され、これもコードされたＴｒｐを未熟な翻訳終止（ＵＡＧ）に変化した。ｇｅ−３およびｇｅ−９では、ヌクレオチド位置１１７７のＣはＴに改変され、シトクロムＰ４５０タンパク質間で高度に保存されているＰｒｏ残基を、Ｓｅｒに変化した。ｇｅ−４では、ヌクレオチド位置１３８８のＣはＧに改変され、Ｐｒｏ残基をＡｌａに変化した。ｇｅ−５では、ヌクレオチド位置２８のＣはＴに改変され、未熟な翻訳終止（ＵＡＡ）を生じた。ｇｅ−６では、ヌクレオチド位置１０６７のＡはＣに改変され、ＣＹＰ７８群間で保存されているＧｌｎのＰｒｏへの変化を生じた。ｇｅ−８では、本発明者らは次の２つの変異を見出した：ヌクレオチド位置５５９のＴがＣに改変されて、ＳｅｒのＰｒｏへの変化を生じ、ヌクレオチド位置１３２８のＣがＴに改変されて、ＰｒｏのＬｅｕへの変化を生じた。ヌクレオチド位置９７２と９７３との間に９１ヌクレオチド長のイントロンが見出された。
【図２】イネＧＥ（配列番号２）、オオムギＧＥ−相同物（配列番号９３）、トウモロコシＧＥ１−相同物（配列番号９５）、トウモロコシＧＥ２−相同物（配列番号９７）、トウモロコシＧＥ３−相同物（配列番号９９）、ユリＧＥ−相同物（配列番号４１）、ランｇｉ１１７３６２４（配列番号４３）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ｇｉ１２３５１３８（配列番号４２）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ｇｉ８９２０５７６（配列番号４７）、オダマキＧＥ−相同物（配列番号３５）、ダイズＧＥ−相同物（配列番号２３）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ｇｉ１１２４９５１１（配列番号４４）、ダイズｇｉ５９２１９２６（配列番号４５）、ダイズＧＥ−相同物（配列番号２５）、ダイズＧＥ−相同物（配列番号２１）、およびアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ｇｉ３８３１４４０（配列番号４６）のアラインメントを示す。囲み内の残基は、バイオスカウト（Ｂｉｏｓｃｏｕｔ）ＤＳＣプログラム（キング（Ｋｉｎｇ）およびスターンベルグ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ）（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ５：２２９８−２３１０）によって同定される推定されたヘリックス領域である。他の囲み内のエレメントは、「ＳＲＳ」またはシトクロムＰ４５０構造における高変異性配列である基質認識部位、シトクロムＰ４５０におけるプロリン（しばしばＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）の「ＰＰＰ」クラスター、基質アクセスチャンネル（配列番号８３の保存された配列モチーフの部分）である「Ｆ−Ｇループ」、保存された「ＧＸＤＴ」（ヘム相互作用および酵素触媒に関与するプロトン移動溝）（配列番号８５の保存された配列モチーフの部分）、「ＥＸＸＲ」（ヘム安定化およびコア構造の安定性に必要な全てのシトクロムＰ４５０において保存されたＫ−ヘリックスモチーフ）（配列番号８８の保存された配列モチーフの部分）、ならびに「ＦＸＸＧＸＲＸＣＸＧ」（ヘムに接触するシステインを有する保存されたヘム結合部位）（配列番号９０の保存された配列モチーフの部分）を含む。
【図１Ａ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図１Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）種子発生期（ｄｕｒｉｎｇ ｓｅｅｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号７、１１、１９、２７、もしくは３３から成る群より選択される第２のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法に基づいて少なくとも６１％のアミノ酸同一性を有する核酸配列、または
（ｂ）種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号１５、１７、３１、９３、９５、９７、もしくは９９から成る群より選択される第３のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル法に基づいて少なくとも６５％のアミノ酸同一性を有する核酸配列、または
（ｃ）種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号９、１３、２３、２９、３５、もしくは４１から成る群より選択される第４のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル法に基づいて少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有する核酸配列、または
（ｄ）種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号２１、２５、３７、もしくは３９から成る群より選択される第２のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル法に基づいて少なくとも７７％のアミノ酸同一性を有する核酸配列、または
（ｅ）（ａ）もしくは（ｂ）もしくは（ｃ）もしくは（ｄ）の相補体、
から成る群より選択される核酸配列を含んで成る単離されたヌクレオチドフラグメント。
【請求項２】
プロモーターを含んで成る単離された核酸フラグメントであって、前記プロモーターが、配列番号１０４、もしくは１０５に記載のヌクレオチド配列から本質的に成るか、あるいは前記プロモーターが、配列番号１０４、もしくは１０５に記載のヌクレオチド配列に実質的に類似するかまたは機能的に等価であるフラグメントまたはサブフラグメントから本質的に成る単離された核酸フラグメント。
【請求項３】
少なくとも１つの調節配列に操作可能に連結された請求項１に記載の単離された核酸フラグメントを含んで成るキメラ構築物。
【請求項４】
前記単離された核酸フラグメントが請求項２に記載のプロモーターに操作可能に連結されている請求項３に記載のキメラ構築物。
【請求項５】
ゲノム内に請求項３もしくは４に記載のキメラ構築物を含んで成る植物。
【請求項６】
請求項５に記載の植物から得られる種子。
【請求項７】
請求項６に記載の種子から得られる油。
【請求項８】
請求項３もしくは４に記載のキメラ構築物を含んで成る、形質転換された植物組織または植物細胞。
【請求項９】
（ａ）請求項３もしくは４に記載のキメラ構築物で植物を形質転換し、
（ｂ）キメラ構築物の発現に適切な条件下で形質転換された植物を成長させ、そして
（ｃ）改変された胚／内乳のサイズを有する種子を産生する上記形質転換された植物を選択する、
ことを含んで成る植物の種子発生期における胚／内乳のサイズの制御方法。
【請求項１０】
（ａ）配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、９３、９５、９７、または９９と、種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連する他のポリペプチド配列とを比較し、
（ｂ）工程（ａ）において得られる保存配列すなわち４つもしくはそれ以上のアミノ酸を同定し、
（ｃ）工程（ｂ）において同定される保存配列に基づいて領域特異的ヌクレオチドプローブまたはオリゴマーを作製し、そして
（ｄ）工程（ｃ）のヌクレオチドプローブまたはオリゴマーを使用して、配列依存性プロトコルにより種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連する配列を単離する、ことを含んで成る種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するポリペプチドをコードする核酸フラグメントの単離方法。
【請求項１１】
（ａ）２種の植物種を交雑させ、そして
（ｂ）工程（ａ）の交雑から得られる子孫植物における、
（ｉ）配列番号５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、もしくは１０５から成る群より選択される核酸配列、または
（ｉｉ）配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、８０〜９１、９３、９５、９７、もしくは９９から成る群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列、
について遺伝子の変異を評価することを含んで成り、その際、評価をＲＦＬＰ解析、ＳＮＰ解析、およびＰＣＲに基づく解析から成る群より選択される方法を使用して行う、胚／内乳のサイズを制御することおよび／または植物の油表現型を改変することに関する遺伝子の変異のマッピング方法。
【請求項１２】
（ａ）２種の植物種を交雑させ、そして
（ｂ）工程（ａ）の交雑から得られる子孫植物における
（ｉ）配列番号５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、もしくは１０５から成る群より選択される核酸配列、または
（ｉｉ）配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、８０〜９１、９３、９５、９７、もしくは９９から成る群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列、
について遺伝子の変異を評価することを含んで成り、その際、評価をＲＦＬＰ解析、ＳＮＰ解析、およびＰＣＲに基づく解析から成る群より選択される方法を使用して行う、胚／内乳のサイズを制御するための分子育種および／または植物の油表現型の改変方法。
【請求項１】
（ａ）種子発生期（ｄｕｒｉｎｇ ｓｅｅｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号７、１１、１９、２７、もしくは３３から成る群より選択される第２のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法に基づいて少なくとも６１％のアミノ酸同一性を有する核酸配列、または
（ｂ）種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号１５、１７、３１、９３、９５、９７、もしくは９９から成る群より選択される第３のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル法に基づいて少なくとも６５％のアミノ酸同一性を有する核酸配列、または
（ｃ）種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号９、１３、２３、２９、３５、もしくは４１から成る群より選択される第４のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル法に基づいて少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有する核酸配列、または
（ｄ）種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列であって、配列番号２１、２５、３７、もしくは３９から成る群より選択される第２のポリペプチドと比較した場合、アラインメントのクラスタル法に基づいて少なくとも７７％のアミノ酸同一性を有する核酸配列、または
（ｅ）（ａ）もしくは（ｂ）もしくは（ｃ）もしくは（ｄ）の相補体、
から成る群より選択される核酸配列を含んで成る単離されたヌクレオチドフラグメント。
【請求項２】
プロモーターを含んで成る単離された核酸フラグメントであって、前記プロモーターが、配列番号１０４、もしくは１０５に記載のヌクレオチド配列から本質的に成るか、あるいは前記プロモーターが、配列番号１０４、もしくは１０５に記載のヌクレオチド配列に実質的に類似するかまたは機能的に等価であるフラグメントまたはサブフラグメントから本質的に成る単離された核酸フラグメント。
【請求項３】
少なくとも１つの調節配列に操作可能に連結された請求項１に記載の単離された核酸フラグメントを含んで成るキメラ構築物。
【請求項４】
前記単離された核酸フラグメントが請求項２に記載のプロモーターに操作可能に連結されている請求項３に記載のキメラ構築物。
【請求項５】
ゲノム内に請求項３もしくは４に記載のキメラ構築物を含んで成る植物。
【請求項６】
請求項５に記載の植物から得られる種子。
【請求項７】
請求項６に記載の種子から得られる油。
【請求項８】
請求項３もしくは４に記載のキメラ構築物を含んで成る、形質転換された植物組織または植物細胞。
【請求項９】
（ａ）請求項３もしくは４に記載のキメラ構築物で植物を形質転換し、
（ｂ）キメラ構築物の発現に適切な条件下で形質転換された植物を成長させ、そして
（ｃ）改変された胚／内乳のサイズを有する種子を産生する上記形質転換された植物を選択する、
ことを含んで成る植物の種子発生期における胚／内乳のサイズの制御方法。
【請求項１０】
（ａ）配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、９３、９５、９７、または９９と、種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連する他のポリペプチド配列とを比較し、
（ｂ）工程（ａ）において得られる保存配列すなわち４つもしくはそれ以上のアミノ酸を同定し、
（ｃ）工程（ｂ）において同定される保存配列に基づいて領域特異的ヌクレオチドプローブまたはオリゴマーを作製し、そして
（ｄ）工程（ｃ）のヌクレオチドプローブまたはオリゴマーを使用して、配列依存性プロトコルにより種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連する配列を単離する、ことを含んで成る種子発生期における胚／内乳のサイズの制御に関連するポリペプチドをコードする核酸フラグメントの単離方法。
【請求項１１】
（ａ）２種の植物種を交雑させ、そして
（ｂ）工程（ａ）の交雑から得られる子孫植物における、
（ｉ）配列番号５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、もしくは１０５から成る群より選択される核酸配列、または
（ｉｉ）配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、８０〜９１、９３、９５、９７、もしくは９９から成る群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列、
について遺伝子の変異を評価することを含んで成り、その際、評価をＲＦＬＰ解析、ＳＮＰ解析、およびＰＣＲに基づく解析から成る群より選択される方法を使用して行う、胚／内乳のサイズを制御することおよび／または植物の油表現型を改変することに関する遺伝子の変異のマッピング方法。
【請求項１２】
（ａ）２種の植物種を交雑させ、そして
（ｂ）工程（ａ）の交雑から得られる子孫植物における
（ｉ）配列番号５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、もしくは１０５から成る群より選択される核酸配列、または
（ｉｉ）配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、８０〜９１、９３、９５、９７、もしくは９９から成る群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列、
について遺伝子の変異を評価することを含んで成り、その際、評価をＲＦＬＰ解析、ＳＮＰ解析、およびＰＣＲに基づく解析から成る群より選択される方法を使用して行う、胚／内乳のサイズを制御するための分子育種および／または植物の油表現型の改変方法。
【公開番号】特開２００７−１９００３２（Ｐ２００７−１９００３２Ａ）
【公開日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１０３２５０（Ｐ２００７−１０３２５０）
【出願日】平成１９年４月１０日（２００７．４．１０）
【分割の表示】特願２００３−５０２１７３（Ｐ２００３−５０２１７３）の分割
【原出願日】平成１４年６月４日（２００２．６．４）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月１０日（２００７．４．１０）
【分割の表示】特願２００３−５０２１７３（Ｐ２００３−５０２１７３）の分割
【原出願日】平成１４年６月４日（２００２．６．４）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
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