立体保護を利用したオリゴ糖の合成方法
【課題】 本発明は、糖のグリコシル化反応に関する。具体的には、本発明は、立体保護を利用して、糖の任意の炭素位置に存在する遊離の水酸基において、位置選択的にグリコシル化反応を生じさせる方法に関する。
【解決手段】本発明は、糖の少なくとも１つの遊離水酸基に嵩高い保護基を導入することにより、該遊離水酸基及び該遊離水酸基に近接する遊離水酸基以外の遊離水酸基選択的にグリコシル化反応が起こる糖鎖受容体を製造する方法を提供するものである。「嵩高い保護基」としては、例えば、ｔＢｕ（Ｄｂｐ）２Ｓｉ基などを挙げることができる。
【解決手段】本発明は、糖の少なくとも１つの遊離水酸基に嵩高い保護基を導入することにより、該遊離水酸基及び該遊離水酸基に近接する遊離水酸基以外の遊離水酸基選択的にグリコシル化反応が起こる糖鎖受容体を製造する方法を提供するものである。「嵩高い保護基」としては、例えば、ｔＢｕ（Ｄｂｐ）２Ｓｉ基などを挙げることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖のグリコシル化反応に関する。具体的には、本発明は、立体保護を利用して、糖の任意の炭素位置に存在する遊離の水酸基において、位置選択的にグリコシル化反応を生じさせる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖は、生体内において、様々な重要な役割を担う分子である。例えば、生体のエネルギー源として、グルコースを多数含んだアミロース、アミロペクチン、グリコーゲンなどの糖が利用されている。また、タンパク質や脂質に結合し、糖タンパク質や糖脂質の一部として、生体内の重要な生理作用を担っている。さらに、細胞表面に存在し、細胞接着因子の一部として、抗原抗体反応の認識対象として、あるいは、ウイルス感染における認識分子としての役割も果たしており、細胞内外の情報伝達を仲介する分子としても重要である。このように、糖鎖は、糖タンパク質や糖脂質の重要な機能性分子として、細胞表面におけるシグナル伝達の仲立ちとして機能することで、生体の発生、分化、老化などの現象に関与し、また、免疫疾患や感染症など生体異常の発生又は抑制等にも関与している。
【０００３】
糖鎖の広範囲に及ぶ生体内での機能は、その複雑な構造に起因する糖鎖の多様性により実現されている。二糖以上のオリゴ糖は、様々な単糖の組合せにより、様々な種類のオリゴ糖として構築されるが、単糖の組合せに加え、単糖同士を結合するグリコシド結合の形成される位置によっても、異なる特徴を持つオリゴ糖となる。例えば、インフルエンザウイルスが動物に感染する際、ウイルスのヘマグルチニンが動物細胞表面に存在するシアル酸を認識し、細胞内へと侵入していく。この場合、動物細胞側のシアル酸が、いわば、ウイルスに対するレセプターの役割を果たしていることになるが、レセプターとしての特異性は、シアル酸残基が結合するガラクトースとの結合位置によって決定されている。例えば、ヒト由来のインフルエンザウイルスのヘマグルチニンは、シアル酸とガラクトースがα２→６結合をしたものだけを認識するのに対し、トリ由来のインフルエンザウイルスは、α２→３結合をしたものだけを認識する。このように、オリゴ糖は、構成する単糖の種類は同じであっても、単糖同士を結合するグリコシド結合の位置が異なると全く異なる機能を発揮する。
従って、糖鎖の生体内における機能を明らかにするためには、グリコシド結合の位置を明確にした上で、その構造を決定する必要がある。そして、決定された構造を有する糖鎖を合成するためには、糖残基間を結合させるグリコシル化反応をいかに位置選択的に行わせるかが鍵となってくる。従来、位置選択的にグリコシル化反応を生じさせるために、様々な保護基を使い分けて結合位置の制御を行っていた。そのため、合成が多段階にわたり、手間、コスト面における負担が大きかった。
【０００４】
糖に存在する遊離の水酸基に対し、位置選択的に置換基を導入する方法は、これまでも、いくつか報告されている。糖鎖受容体の６位の遊離の水酸基に導入した保護基と４位の水素との間で水素結合を形成させ、４位以外の炭素位置に置換基を導入させる試みが行われている（非特許文献１）。この方法は、水素結合によって４位がマスクされる影響を利用するものであるが、反応を行わせる溶媒の極性によって置換基が導入される位置に変化が生じてしまうため、特定の位置選択的に安定に置換基を導入する方法としては確立されていない。また、嵩高い保護基として、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）基を利用し、該保護基の立体保護効果（又は、立体障害効果）により、位置選択的なグリコシル化反応を行わせる方法に関する報告がある。しかし、この方法においても、ある程度位置選択的な糖への置換基の導入は可能となっているが、その他の炭素位に存在する水酸基にも置換基が導入され、高い位置選択性があるとまでは言い難い（非特許文献２〜４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍｏｉｔｅｓｓｉｅｒ及びＣｈａｐｌｅｕｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４４：１７３１−１７３５，２００３
【非特許文献２】Ｍｏｉｔｅｓｓｉｅｒら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，６１：６８３９−６８５３，２００５
【非特許文献３】Ｃｍｏｃｈ及びＰａｋｕｌｓｋｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ／Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，１９：１４９４−１５０３，２００８
【非特許文献４】Ｂｏｈｎら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３４２：２５２２−２５３６，２００７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のように、糖鎖の合成において、グリコシル化反応を位置選択的に行わせることが非常に重要となる。
そこで、本発明では、任意の炭素位の遊離の水酸基に嵩高い保護基を導入した糖鎖受容体を使用し、位置選択的にグリコシル化反応を生じさせる方法の提供を目的とする。
また、本発明は、位置選択的なグリコシル化反応に有用な糖鎖受容体の提供を目的とする。
さらに、本発明は、位置選択的なグリコシル化反応に利用可能な保護基の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本出願の発明者らは、嵩高い保護基であるｔＢｕ（Ｄｂｐ）２Ｓｉ基を糖鎖受容体のＣ−６位の水酸基に導入し、隣接位の炭素に結合する水酸基を立体的に保護すれば、Ｃ−４位におけるグリコシル化反応を回避できるのではないかと考え、本課題の解決に着手した。その結果、Ｃ−４位におけるグリコシル化反応をほぼ抑えることに成功した。
また、ｔＢｕ（Ｄｂｐ）２Ｓｉ基を保護基として導入した糖鎖受容体は、その結晶性が向上していることを見出した。糖誘導体は粘性が高く、通常、精製を行うのが困難であるが、高い結晶性を有する糖鎖受容体であれば、再結晶化により簡便に精製することが可能となる。
以上の結果から、発明者らは、これまで利用されていた保護基であるＴＢＤＰＳ基と本発明で見出したｔＢｕ（Ｄｂｐ）２Ｓｉ基の立体保護効果及び結晶性の差に着目し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、糖の少なくとも１つの遊離水酸基に嵩高い保護基を導入することにより、該遊離水酸基及び該遊離水酸基に近接する遊離水酸基以外の遊離水酸基選択的にグリコシル化反応が起こる糖鎖受容体を製造する方法である。
【０００９】
また、本発明は、前記保護基が以下の式（Ｉ）であることを特徴とする糖鎖受容体を製造する方法である。
【化１】
［式（Ｉ）において、Ｒ１は、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ネオペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、イソアミル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、ｓｅｃ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基であり、ｎは０又は１若しくは２の整数である。また、Ｘは式（ＩＩ）の置換基、
【化２】
（式（ＩＩ）において、Ｒ２は、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ネオペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、イソアミル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、ｓｅｃ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基であり、ｍは１〜３のいずれかの整数であり、Ｒ２とベンゼン環の間には、エーテル結合、チオエーテル結合を含んでも良い）、
又は、アダマンチル基であり、 Ｅは、ケイ素又はゲルマニウムである］
【００１０】
さらに、本発明は、以下の式（Ｉ）で示される糖鎖受容体用保護基である。
【化３】
［式（Ｉ）において、Ｒ１は、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ネオペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、イソアミル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、ｓｅｃ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基であり、ｎは０又は１若しくは２の整数である。また、Ｘは式（ＩＩ）の置換基、
【化４】
（式（ＩＩ）において、Ｒ２は、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ネオペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、イソアミル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、ｓｅｃ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基であり、ｍは１〜３のいずれかの整数であり、Ｒ２とベンゼン環の間には、エーテル結合、チオエーテル結合を含んでも良い）、
又は、アダマンチル基であり、 Ｅは、ケイ素又はゲルマニウムである］
【発明の効果】
【００１１】
本発明の糖鎖受容体を用いると、多段階のステップを経由せず、所望の位置にグリコシド結合を形成させることができるので、目的の糖鎖を簡便かつ低コストにて合成することができる。
【００１２】
本発明の糖鎖受容体のうち、結晶化する特徴を有するものは、容易に精製することができるため、粘性が高く非結晶性の従来の糖鎖受容体と比較すると、扱いが容易である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の第１の形態は、糖の少なくとも１つの遊離水酸基に嵩高い保護基を導入することにより、該遊離水酸基及び該遊離水酸基に近接又は隣接する遊離水酸基（例えば、Ｃ−６位の遊離水酸基に保護基を導入した場合、Ｃ−４位、Ｃ−１位の遊離水酸基がＣ−６位の遊離水酸基に近接又は隣接する遊離水酸基である）以外の遊離水酸基に選択的にグリコシル化反応が起こる（又はグリコシド結合が形成される）糖鎖受容体を製造する方法である。
糖のグリコシル化反応は、アノマー位に脱離基を有する糖（糖鎖供与体）と遊離の水酸基をもつ糖（糖鎖受容体）との縮合反応である。この場合、糖鎖受容体の遊離の水酸基が複数存在すると、いずれの水酸基においても縮合反応が生じる可能性がある。そのため、特定の水酸基とのみ縮合反応を行わせるためには、該特定の水酸基以外の水酸基を適当な保護基によって保護する必要がある。本発明は、糖鎖受容体の任意の炭素位に存在する水酸基に、嵩高い保護基を導入し、その嵩高さにより保護基と近接する遊離の水酸基を保護し、グリコシル化反応が生じないようにすることで、他の遊離の水酸基とのグリコシル化反応を優先的に誘導することにより達成される。
【００１４】
本発明で利用可能な「嵩高い保護基」とは、例えば、分子軌道法によって計算される保護基の嵩高さ（糖鎖受容体側の酸素と結合する原子（例えば、ケイ素、ゲルマニウム、一般式（Ｉ）のＥに相当する）から最も離れた位置に存在する原子（例えば、一般式（Ｉ）のＲ１又はＸに含まれる原子であってＥからの直線距離で最も遠くに位置する原子）までの距離）が、例えば、６．０Å以上、好ましくは、７．０Å以上であって、実際に、糖鎖受容体の遊離の水酸基に導入可能な保護基のことである。
【００１５】
「嵩高い保護基」としては、例えば、以下の式（Ｉ）で表される置換基を挙げることができる。
【化５】
ここで、式（Ｉ）において、Ｒ１として、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ネオペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、イソアミル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、ｓｅｃ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基などを例示することができ、好ましくは、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基である。式（Ｉ）中の「ｎ」は、０又は１若しくは２の整数である。
また、Ｘとして、式（ＩＩ）で表される置換基又はアダマンチル基を挙げることができる。
【化６】
ここで、式（ＩＩ）において、Ｒ２は、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ネオペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、イソアミル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、ｓｅｃ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基などを例示することができ、好ましくは、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基である。式（ＩＩ）中のｍは、１〜３のいずれかの整数であり、Ｒ２とベンゼン環の間には、エーテル結合、チオエーテル結合を含んでも良い。Ｒ２の結合位置は、オルト位、パラ位、メタ位のいずれでもよい。
Ｅは、ケイ素又はゲルマニウムである。
【００１６】
本発明の嵩高い保護基として、より具体的には、下記式（ＩＩＩ）のビス（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−ｔｅｒｔ−ブチルシリル（ｔＢｕ（Ｄｂｐ）２Ｓｉ）基を例示することができる。
【化７】
【００１７】
例えば、本発明の糖鎖受容体が、Ｃ−６位の水酸基に嵩高い保護基が導入されているものである場合、Ｃ−６位の水酸基に近接するＣ−４位の水酸基は嵩高い保護基により立体的に保護され、グリコシル化反応がほとんど生じなくなる。その結果、Ｃ−３位とＣ−２位においてグリコシル化反応が起こり易くなる。また、予め、Ｃ−２位の水酸基に嵩高い保護基を導入しておけば、Ｃ−３位の水酸基が立体的に保護され、その結果、Ｃ−６位とＣ−４位におけるグリコシル化反応が優先的に生じることになる。つまり、嵩高い置換基に隣接する水酸基へのグリコシル化反応が抑制されることになる。
糖鎖受容体のＣ−６位の水酸基に嵩高い保護基を導入し、さらに、例えば、Ｃ−３位を従来の保護基（例えば、アセチル基、ベンジル基など）で保護すれば、Ｃ−２位のみでグリコシル化反応が生じ、Ｃ−２位のみにグリコシド結合ができることになる。あるいは、糖鎖受容体のＣ−６位の水酸基に嵩高い保護基を導入し、さらに、Ｃ−１位に嵩高い保護基を導入すれば、Ｃ−３位に選択的にグリコシド結合ができることになる。
【００１８】
さらに、本発明の糖鎖受容体には、結晶化する特徴を有するものが含まれる。一般に、糖誘導体は高い粘性を示すため、精製が非常に困難である。本発明の糖鎖受容体のうち、結晶化する特徴を有する糖鎖受容体は、再結晶による簡便かつ低コストな方法により精製することが可能である。
また、一般式（Ｉ）で示される保護基は、糖鎖受容体に導入する際のハロゲン化物（例えば、Ｅがケイ素の場合には、クロロシラン。例えば、ｔＢｕ（Ｄｂｐ）２ＳｉＣｌ）が空気中で加水分解しにくくなり、安定性が向上するといった利点をも有する。
【００１９】
本発明の他の実施形態は、本発明によって製造される糖鎖受容体、又は嵩高い保護基（ハロゲン化物などの安定供給に適した形態のもの）からなる糖鎖合成用試薬である。本発明で開示される嵩高い保護基によって任意の水酸基が保護された糖鎖受容体は、様々な糖鎖合成に利用することができる。さらに、本発明で開示される嵩高い保護基は、ハロゲン化物（フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物）などの形態で、所望の遊離水酸基が保護された所望の糖鎖受容体の合成に利用することができる。
本発明の試薬は、本発明の糖鎖受容体又は嵩高い保護基の他、これらを安定化するためのバッファーなどを含んでいてもよい。さらに、本発明の試薬は、他の試薬と共に、糖鎖合成用のキットとして供給することも可能である。このようなキットも本発明の範囲に含まれる。
【００２０】
以下に実施例を示し本発明についてより具体的に説明を行うが、本発明の範囲は、実施例の範囲に限定されるものではない。
【実施例】
【００２１】
１．ベンジル ６−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−β−Ｄ−グルコピラノシド（５）の合成
まず、本実施例においてコントロールの糖鎖受容体として用いるベンジル ６−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−β−Ｄ−グルコピラノシド（化合物５）の合成を行った。
【００２２】
ペンタ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノース（２）
【化８】
酢酸ナトリウム（２６．３ｇ，０．３２０ｍｏｌ）を無水酢酸（１９３ｍｌ，２．０５ｍｏｌ）に懸濁し、１１０℃に加熱した。そこへ、Ｄ−グルコース（１）（４６．１ｇ，０．２５６ｍｏｌ）を温度上昇に気をつけながら少しずつ加え、３時間撹拌した。反応終了後、反応液を氷水にあけ撹拌し、溶液から濾取し、水で十分洗浄した後、ジエチルエーテルで軽く洗浄し減圧乾燥した。粗結晶をエタノールで再結晶し、化合物（２）（６１．５ｇ，６２％）を得た。
1H NMR (CDCl3, 200MHz) :δ5.70 (d, 1H, J1,2 = 8.2 Hz, H-1), 5.43 (d, 1H, J3,4=3.2 Hz, H-4), 5.34 (dd, 1H, J1,2 = 8.2 Hz, J2,3 = 10.4 Hz, H-2), 5.08 (dd, 1H, J2,3 = 10.4 Hz, J3,4 = 3.2 Hz, H-3), 4.02-4.17 (m, 3H, H-5, H-6), 2.17, 2.13, 2.05, 2.05, 2.00 (each s, 15H, -OAc).
【００２３】
ベンジル Ｏ−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（３）
【化９】
アルゴン雰囲気下、化合物（２）（８．９０ｇ，２２．８ｍｍｏｌ）をｄｒｙ−ジクロロメタン（８０ｍｌ）に溶解させ、ベンジルアルコール（４．７２ｍｌ，４５．６ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を−１１℃に冷却し、温度上昇に気をつけながら三フッ化ホウ素−ジエチルエーテル錯体（８．６７ｍｌ，６８．４ｍｍｏｌ）を滴下した。滴下終了後、氷浴に変え１時間撹拌し、さらに室温で一晩撹拌した。反応終了後、反応液を氷水にあけ、クロロホルムで有機層の抽出をした。有機層を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水の順に洗浄したのち、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。有機層を濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し、１位にベンジル基が導入された化合物（３）（３．３９ｇ，３４％）を得た。
Rf 0.36 [2:1 (v/v) hexane-ethyl acetate]
1H NMR (CDCl3, 200MHz) :δ7.20-7.32 (m, 5H, CH2-Ph), 5.32 (d, 1H, J3,4 = 3.2 Hz, H-4), 5.22 (dd, 1H, J1,2 = 8.0 Hz, J2,3 = 10.4 Hz, H-2), 4.92 (dd, 1H, J2,3 = 10.4 Hz, J3,4 = 3.2 Hz, H-3 ), 4.85 (d, 1H, J = 12.2 Hz, OCH2Ph), 4.57 (d, 1H, J = 12.2 Hz, OCH2Ph), 4.45 (d, 1H, J1,2 = 8.0 Hz, H-1), 4.03-4.20 (m, 2H, H-5, H-6a), 3.79-3.85 (m, 1H, H-6b), 2.09, 2.00, 1.94, 1.91 (each s, 12H, -OAc).
【００２４】
ベンジル Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（４）
【化１０】
アルゴン雰囲気下、化合物（３）（２．８０ｇ，６．３９ｍｍｏｌ）をｄｒｙ−メタノール（１５ｍｌ）に溶解させ、ナトリウムメトキシド（０．１３８ｇ，２．５５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１晩撹拌した。反応終了後、陽イオン交換樹脂を加え、反応溶液を中和した。綿栓濾過で樹脂を除き、濾液を濃縮し、粗生成物（４）（１．７３ｇ，１００％）を得た。この段階では精製は行わずにそのまま次の反応に用いた。
【００２５】
ベンジル ６−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−β−Ｄ−グルコピラノシド（５）
【化１１】
アルゴン雰囲気下、化合物（４）（２６６ｍｇ，０．９８ｍｍｏｌ）、イミダゾール（１３４ｍｇ，１．９７ｍｍｏｌ）をｄｒｙ−ＤＭＦ（６ｍｌ）に溶解させ、ｄｒｙ−ＤＭＦ（４ｍｌ）に溶解させた市販のＴＢＤＰＳＣｌ（０．３８ｍｌ，１．４８ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で一晩攪拌した。反応終了後、酢酸エチルを用いて有機層を抽出し、水、飽和食塩水で順次洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。有機層を濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：３）で精製し、化合物（５）（４３２ｍｇ，８６％）を得た。化合物（５）は非晶質であった。
mp 56.5-57.5℃
Rf 0.34 [1:3 (v/v) hexane-ethyl acetate]
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) :δ7.68-7.73 (m, 4H, Si-Ph), 7.32-7.44 (m, 6H, Si-Ph), 7.30-7.32 (m, 5H, CH2-Ph), 4.88 (d, 1H, J = 11.6 Hz, OCH2Ph), 4.57 (d, 1H, J = 11.6 Hz, OCH2Ph), 4.37 (d, J1,2 = 7.6 Hz, H-1), 3.95(m, 2H, H-6a, H-6b), 3.68 (dd, 1H, J3,4 = 9.2 Hz, J4,5 = 9.2 Hz, H-4), 3.58 (dd, 1H, J2,3 = 8.8 Hz, J3,4 = 9.2 Hz, H-3), 3.42-3.48 (m, 2H, H-2, H-5), 1.07 (s, 9H, Si-C(CH3)3)
13C-NMR (CDCl3, 100MHz) :δ 136.85, 135.66, 135.58, 133.64, 132.85, 132.69, 130.17, 129.93, 128.54, 128.48, 128.22, 128.10, 127.84, 127.82, 101.15 (C-1), 77.23, 76.23, 74.61, 73.61, 72.17, 70.89, 64.77, 26.77, 19.22, 0.01
【００２６】
２．ビス（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−ｔｅｒｔ−ブチルクロロシラン（１０）の合成
本発明の「嵩高い保護基」の塩化物の一例として、ビス（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−ｔｅｒｔ−ブチルクロロシラン（化合物１０）を以下の様に合成した。
【００２７】
１，３，５−トリ−ｔｅｒｔ−ブチルベンゼン（７）
【化１２】
アルゴン雰囲気下、化合物（６）（２．０２ｍｌ，２２．６ｍｍｏｌ）と２−メチル−２−クロロプロパン（２０．０ｍｌ，１８１．６ｍｍｏｌ）の混合溶液を−５℃に冷却し、塩化アルミニウム（３．０２ｇ，２２．６ｍｍｏｌ）を２時間かけて添加し、１時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を氷水にあけ、酢酸エチルを用いて有機層を抽出し、水、飽和食塩水で順次洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。有機層を濃縮し、ショートカラムによりおおまかに精製した後、エタノールで再結晶し、化合物（７）（４．３７ｇ，７８％）を得た。
Rf 0.57 [hexane]
1H-NMR (CDCl3, 200MHz) :δ7.26 (s, 3H, Ph), 1.34 (s, 27H, C(CH3)3)
【００２８】
ブロモ−３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルベンゼン（８）
【化１３】
アルゴン雰囲気下、化合物（７）（２４．０ｇ，９７．４ｍｍｏｌ）をｄｒｙ−四塩化炭素（４８ｍｌ）に溶解させ、鉄粉（５．７２ｇ，１０２ｍｍｏｌ）を加え０℃に冷却した。その後、臭素（１０．５ｍｌ，２０５ｍｍｏｌ）のｄｒｙ−四塩化炭素溶液（１２ｍｌ）を滴下し、徐々に室温に戻しながら４時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を氷水にあけ、クロロホルムを用いて有機層を抽出し、水、０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、水、チオ硫酸ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。有機層を濃縮し、ショートカラムによりおおまかに精製した後、減圧蒸留（０．９ｍｍＨｇ，９０℃）で精製し、化合物（８）（２２．３ｇ，８５％）を得た。
Rf 0.68 [hexane]
1H-NMR (CDCl3, 200MHz) :δ7.32 (s, 3H, Ph), 1.30 (s, 18H, C(CH3)3)
【００２９】
ビス（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−ｔｅｒｔ−ブチルシラン（９）
【化１４】
アルゴン雰囲気下、化合物（８）（２．８０ｇ，１０．４ｍｍｏｌ）をｄｒｙ−エーテル（１７ｍｌ）に溶解させ、−７８℃に冷却した。Ｔｅｒｔ−ブチルリチウム（１．７６ｍｏｌ／ｌ ペンタン溶液）（１１．８ｍｌ，２０．８ｍｍｏｌ）を滴下し、２時間攪拌した後、室温まで戻した。反応溶液を、−７８℃に冷却したトリクロロシラン（０．５０ｍｌ，４．９５ｍｍｏｌ）のｄｒｙ−エーテル溶液（６ｍｌ）に滴下し、−７８℃で２時間攪拌した後、徐々に室温まで戻しながら一晩攪拌した。再度、反応溶液を−７８℃まで冷却してＴｅｒｔ−ブチルリチウム（１．７６ｍｏｌ／ｌ ペンタン溶液）（３．０９ｍｌ，５．４５ｍｍｏｌ）を滴下し、１．５時間攪拌した後、徐々に室温まで戻しながら一晩攪拌した。反応終了後、酢酸エチルを用いて有機層を抽出し、水、飽和食塩水で順次洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。有機層を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン）で精製し、化合物（９）（１．０５ｇ，４６％）を白色の結晶として得た。
Rf 0.51 [hexane]
1H-NMR (CDCl3, 500MHz) :δ7.54 (d, 4H, Ph), 7.43 (t, 2H, Ph), 4.61 (s, 1H, SiH ), 1.32 (s, 36H, Ph-C(CH3)3), 1.04 (s, 9H, Si-C(CH3)3)
13C-NMR (CDCl3, 125MHz) :δ149.44, 133.06, 129.77, 34.79, 31.51, 27.65, 17.86
【００３０】
ビス（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−ｔｅｒｔ−ブチルクロロシラン（１０）
【化１５】
アルゴン雰囲気下、化合物（９）（１．５０ｇ，３．２３ｍｍｏｌ）をｄｒｙ−四塩化炭素（６ｍｌ）に溶解させ、塩化パラジウム（５７．０ｍｇ，０．３２３ｍｍｏｌ）加え、撹拌しながら２日間加熱還流した。アルゴン雰囲気下でフィルター濾過し、四塩化炭素を減圧留去した後、精製せずに次の反応に用いた。１Ｈ−ＮＭＲにより定量的に化合物（１０）が得られたことを確認した。
1H-NMR (CDCl3, 200MHz) :δ7.64 (d, 4H, Ph), 7.48 (t, 2H, Ph), 1.32 (s, 36H, Ph-C(CH3)3), 1.10 (s, 9H, Si-C(CH3)3)
【００３１】
３．ベンジル ６−Ｏ−ビス（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−ｔｅｒｔ−ブチルシリル−β−Ｄ−グルコピラノシド（１１）の合成
上記２で合成した化合物（１０）を使用して、本発明の糖鎖受容体の一例として、ベンジル ６−Ｏ−ビス（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−ｔｅｒｔ−ブチルシリル−β−Ｄ−グルコピラノシド（化合物１１）の合成を行った。
【化１６】
アルゴン雰囲気下、化合物（４）（６２４ｍｇ，２．３１ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルイミダゾール（７９６ｍｇ，９．６９ｍｍｏｌ）、ヨウ素（１．２３ｇ，９．６９ｍｍｏｌ）をｄｒｙ−ピリジン（１０ｍｌ）に溶解させ、化合物（１０）（１．６１ｇ，３．２３ｍｍｏｌ）のｄｒｙ−ピリジン溶液（６ｍｌ）を滴下し、室温で２時間攪拌した。反応終了後、酢酸エチルを用いて有機層を抽出し、チオ硫酸ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で順次洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。有機層を濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製し、化合物（１１）（１．３６ｇ，８１％）を白色の結晶として得た。
mp 88.9-89.2℃
Rf 0.42 [1:1 (v/v) hexane-ethyl acetate]
1H-NMR (CDCl3, 500MHz) :δ7.59 (d, 2H, Si-Ph), 7.57(d, 2H, Si-Ph), 7.49 (t, 1H, Si-Ph), 7.49 (t, 1H, Si-Ph), 7.27-7.32 (m, 2H, CH2-Ph), 4.83 (d, 1H, CH2-Ph), 4.52 (d, 1H, CH2-Ph), 4.34 (d, 1H, J1,2 = 7.5 Hz, H-1), 3.92-4.00 (m, 2H, J1,2 = 8.0 Hz, H-6a, H-6b), 3.67 (dd, 1H, J3,4 = 9.0 Hz, J4,5 = 9.0 Hz, H-4), 3.59 (dd, 1H, J2,3 = 9.5 Hz, J3,4 = 9.0 Hz, H-3), 3.44-3.46 (m, 2H, H-2, H-5), 1.33 (s, 36H, Ph-C(CH3)3), 1.03 (s, 9H, Si-C(CH3)3)
13C-NMR (CDCl3, 125MHz) :δ149.64, 136.85, 131.32, 129.61, 129.52, 128.47, 128.15, 128.01, 123.73, 123.68, 101.38 (C-1), 76.28, 73.97, 73.59, 73.48, 70.95, 65.51, 34.84, 31.53, 26.78, 19.01
【００３２】
４．２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−グルコピラノシル ２，２，２−トリクロロアセトアミデート（１４）の合成
本実施例で糖鎖供与体として使用した２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−グルコピラノシル ２，２，２−トリクロロアセトアミデート（化合物１４）を以下の様に合成した。
【００３３】
ペンタ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−グルコピラノース（１２）
【化１７】
アルゴン雰囲気下、Ｄ−グルコース（１）（３．００ｇ，１６．７ｍｍｏｌ）をｄｒｙ−ピリジン（５０．０ｍｌ）に溶解し０℃に冷却した。０℃で塩化ベンゾイル（１４．６ｍｌ，１２５ ｍｍｏｌ）を加え、室温に戻し一晩撹拌した。反応終了後、水を加え過剰の酸塩化物を中和した。反応溶液を酢酸エチルで抽出し、有機層を１Ｎ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水の順に洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。有機層を濃縮した後、ショートカラムによりおおまかに精製した後、２−プロパノールで再結晶し、化合物（１２）（１０．９ｇ，９４％）を得た。
Rf 0.48 [2:1 (v/v) hexane-ethyl acetate]
1H-NMR (CDCl3, 200MHz) :δ7.87-8.19, 7.30-7.67 (each m, 25H, Ph), 6.85 (d, 1H, J1,2 = 3.8 Hz, H-1), 6.32 (t, 1H, J2,3 = 10.0 Hz, J3.4 = 9.8 Hz, H-3), 5.86 (t, 1H, J3,4 = 9.8 Hz, J4,5 = 10.0 Hz, H-4), 5.68 (dd, 1H, J1,2 = 3.8 Hz, J2,3 = 10.0 Hz, H-2), 4.42-4.65 (m, 3H, H-5, H-6a, H-6b)
【００３４】
２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンゾイル−α，β−Ｄ−グルコピラノース（１３）
【化１８】
化合物（１２）（４．７０ｇ，６．７１ｍｍｏｌ）をｄｒｙ−ジクロロエタン（２０ｍｌ）に溶解させ、密栓し０℃に冷却した。臭化水素（３３％ 酢酸溶液）（５．００ｍｌ，２７．８ｍｍｏｌ）を加え、室温にて４時間攪拌した。反応終了後、クロロホルムで抽出し、水、炭酸水素ナトリウム、飽和食塩水で順次洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。有機層を濃縮し、アセトン（３５ｍｌ）、水（１．５ｍｌ）、炭酸銀（３．０６ｇ，１１．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌した。反応終了後、フィルター濾過し、有機層を濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝９：１）で精製し、化合物（１３）（３．９７ｇ， ９９％）を白色の結晶として得た。
Rf 0.20 [9:1 (v/v) toluene-ethyl acetate]
1H-NMR (CDCl3, 200MHz) :δ7.29-7.56, 7.86-8.01 (each m, 24H, Ph), 6.26 (t, 1H, J2,3 = 10 Hz, J3,4 = 10 Hz, α-H-3), 5.97(t, 0.2H, β-H-3), 5.67-5.79 (m, 2.2H, α-H-1, α-H-4, β-H-4), 5.32 (m, 1.2H, α-H-2, β-H-2), 4.15-4.69 (m, 3.6H, α-H-5, α-H-6a, α-H-6b, β-H-5, β-H-6a, β-H-6b), 4.00 (d, 0.2H, β-OH), 3.36 (d, 1H, α-OH)
【００３５】
２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−グルコピラノシル ２，２，２−トリクロロアセトアミデート（１４）
【化１９】
アルゴン雰囲気下、化合物（１３）（８８６ｍｇ，１．４８ｍｍｏｌ）をｄｒｙ−ジクロロメタン（１５ｍｌ）に溶解させ、炭酸セシウム（４８．９ｍｇ，０．１５ｇ）、トリクロロアセトニトリル（０．９０ｍｌ，８．８８ｍｍｏｌ）を加えて室温にて一晩攪拌した。反応終了後、フィルター濾過し濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝２０：１）で精製し、化合物（１４）（９８２ｍｇ，８９％）を白色の結晶として得た。
Rf 0.37 [20:1 (v/v) toluene-ethyl acetate]
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) :δ8.64 (s, 1H, N-H), 7.29-7.57, 7.89-8.05 (each m, 20H, Ph), 6.84 (d, 1H, J1,2 = 3.6 Hz, H-1), 6.28 (t, 1H, J2,3 = 10.4 Hz, J3,4 = 10.4 Hz, H-3), 5.83 (t, 1H, J3,4 = 10.4 Hz, J4,5 = 10.4 Hz, H-4), 5.62 (dd, 1H, J1,2 = 3.6 Hz, J2,3 = 10.4 Hz,H-2), 4.63-4.66 (m, 2H, H-5, H-6a), 4.47-4.51 (dd, 1H, H-6b)
【００３６】
５．嵩高い置換基を有する本発明の糖鎖受容体（化合物（１１））の位置選択的グリコシル化反応
本発明の嵩高い置換基を有する糖鎖受容体の一例として合成した化合物（１１）を用いて、位置選択的にグリコシル化反応が生じるかどうか検討した。糖鎖供与体として化合物（１４）を用いた。また、コントロールの糖鎖受容体として従来から利用されている保護基を有する化合物（５）を使用した。
【００３７】
５−１．化合物（５）を糖鎖受容体とした場合のグリコシル化反応の位置選択性
【化２０】
アルゴン雰囲気下、糖鎖供与体（１４）（７８２ｍｇ，１．０６ｍｍｏｌ）、糖鎖受容体（５）（４８８ｍｇ，０．９６ｍｍｏｌ）をｄｒｙ−ジクロロメタン（２０ｍｌ）に溶解させ、ＭＳ４Å（１２００ｍｇ）を加えて室温で１時間攪拌した。その後、溶液を−４０℃まで冷却し、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（４８．０μｌ，０．２６ｍｍｏｌ）を加え２時間攪拌した。反応終了後、トリエチルアミン（１．００ｍｌ）を加えフィルター濾過し、濃縮した後にフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝９：１）で精製し、１→２結合異性体（２００ｍｇ，１９％）、１→３結合異性体（３９２ｍｇ，３８％）、１→４結合異性体（８８ｍｇ，８％）を得た。生成物はいずれも非晶質として得られた。
1→2 linked isomer
Rf 0.23 [2:1 (v/v) hexane-ethyl acetate]
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) :δ 7.27-7.53, 7.66-7.68, 7.81-7.85, 7.95-8.00 (each m, 35H, Ph), 5.88 (t, 1H, J2’,3’ = 9.6 Hz, J3’,4’ = 9.6 Hz, H-3’), 5.71 (t, 1H, J3’,4’ = 9.6 Hz, J4’,5’ = 10 Hz, H-4’), 5.71 (dd, 1H, J1’,2’ = 8.0 Hz, J2’,3’ = 9.6 Hz, H-2’), 5.20 (d, 1H, J1’,2’ = 8.0 Hz, H-1’), 4.93 (d, 1H, J = 11.6 Hz, CH2-Ph), 4.59 (d, 1H, J = 11.6 Hz, CH2-Ph), 4.57 (d, 1H, J1’,2’ = 7.2 Hz, H-1), 4.44 (dd, 1H, J5’,6a’ = 3.6 Hz, J6a’,6b’ = 12.4 Hz, H-6a’), 4.21 (dd, 1H, J5’,6b’ = 3.6 Hz, J6a’,6b’ = 12.4 Hz, H-6b’), 3.80-3.92 (m, 3H, H-5’, H-6a, H-6b), 3.48-3.62 (m, 3H, H-2, H-3, H-4), 3.35-3.39 (m, 1H, H-5), 2.92 (s, 1H, C4-OH ), 2.85 (d, 1H, C3-OH ), 1.03 (s, 9H, Si-C(CH3)3)
13C-NMR (CDCl3, 100MHz) :δ 166.06, 165.77, 165.00, 137.38, 135.59, 135.52, 133.49, 133.37, 133.26, 133.05, 132.91, 132,79, 129.80, 129.74, 129.70, 129.45, 128.93, 128.72, 128.67, 128.50, 128.40, 128.36, 128.29, 127.74, 127.70, 127.68, 127.21, 101.42, 100.69, 82.15, 75.62, 74.55, 72.97, 72.62, 72.10, 71.17, 70.80, 69.14, 64.33, 62.57, 26.71 (Si-C(CH3)3), 19.17 (Si-C(CH3)3)
1→3 linked isomer
Rf 0.38 [2:1 (v/v) hexane-ethyl acetate]
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) :δ 7.28-7.52, 7.71-7.73, 7.81-7.83, 7.91-7.97, 8.07-8.08 (each m, 35H, Ph), 5.93 (t, 1H, J2’,3’ = 9.6 Hz, J3’,4’ = 9.6 Hz, H-3’), 5.62 (t, 1H, J3’,4’ = 9.6 Hz, J4’,5’ = 10.4 Hz, H-4’), 5.57 (dd, 1H, J1’,2’ = 8.0 Hz, J2’,3’ = 9.6 Hz, H-2’), 5.03 (d, 1H, J1’,2’ = 8.0 Hz, H-1’), 4.89 (d, 1H, J = 11.6 Hz, CH2-Ph), 4.78 (dd, 1H, J5’,6a’ = 6.4 Hz, J6a’,6b’ = 12.4 Hz, H-6a’), 4.56 (d, 1H, J = 11.6 Hz, CH2-Ph), 4.36 (dd, 1H, J5’,6b’ = 6.4 Hz, J6a’,6b’ = 12.4 Hz, H-6b’), 4.29 (d, 1H, J1,2 = 7.6 Hz, H-1), 4.04 (br d, 1H, H-6a), 3.89 (dd, 1H, H-6b), 3.71 (s, 1H, C4-OH ), 3.60 (t, 1H, J3,4 = 9.2 Hz, J4,5 = 8.8 Hz, H-4), 3.50 (t, 1H, J2,3 = 8.4 Hz, J3,4 = 9.2 Hz, H-3), 3.35-3.45 (m, 2H, H-2, H-5), 2.03 (d, 1H, C2-OH ), 1.06 (s, 9H, Si-C(CH3)3)
13C-NMR (CDCl3, 100MHz) :δ 166.14, 165.66, 165.19, 136.80, 135.67, 135.61, 133.61, 133.57, 133.32, 129.96, 129.87, 129,78, 129.74, 129.57, 129.20, 129.02, 128.60, 128.48, 128.44, 128.31, 128.27, 128.01, 127.62, 127.59, 102.64, 100.87, 88.77, 76.43, 72.65, 72.46, 71.68, 70.42, 69.34, 68.60, 63.40, 62.80, 26.74 (Si-C(CH3)3), 19.33 (Si-C(CH3)3)
1→4 linked isomer
Rf 0.15 [2:1 (v/v) hexane-ethyl acetate]
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) :δ 7.28-7.59, 7.74-7.83, 7.93-7.95, 8.11-8.13 (each m, 35H, Ph), 5.89 (t, 1H, J2’,3’ = 9.6 Hz, J3’,4’ = 9.6 Hz, H-3’), 5.67 (t, 1H, J3’,4’ = 9.6 Hz, J4’,5’ = 10 Hz, H-4’), 5.61 (dd, 1H, J1’,2’ = 8.0 Hz, J2’,3’ = 9.6 Hz, H-2’), 5.16 (d, 1H, J1’,2’ = 8.0 Hz, H-1’), 4.85 (d, 1H, J = 11.6 Hz, CH2-Ph), 4.80 (dd, 1H, J5’,6a’ = 2.4 Hz, J6a’,6b’ = 12.4 Hz, H-6a’), 4.47 (d, 1H, J = 11.6 Hz, CH2-Ph), 4.42 (dd, 1H, J5’,6b’ = 6.0 Hz, J6a’,6b’ = 12.4 Hz, H-6b’), 4.34 (d, 1H, J1,2 = 8.0 Hz, H-1), 4.05-4.13 (m, 2H, H-5’, H-4), 3.78 (br s, 2H, H-6a, H-6b), 3.67-3.72 (m, 2H, H-3, C3-OH ), 3.50 (br t, 1H, H-2), 3.23 (br d, 1H, H-5), 2.54 (s, 1H, C2-OH), 1.06 (s, 9H, Si-C(CH3)3)
13C-NMR (CDCl3, 100MHz) :δ 166.05, 165.59, 165.16, 164.80, 136.94, 135.94, 135.39, 133.74, 133.61, 133.33, 132.38, 130,05, 129.95, 129.88, 129.83, 129.70, 129.30, 128.59, 128.47, 128.40, 128.31, 128.02, 127.93, 127.64, 100.76, 100.66, 78.36, 74.46, 74.08, 73.91, 72.87, 72.58, 71.51, 70.41, 69.18, 62.33, 61.39, 69.14, 26.77 (Si-C(CH3)3), 19.50 (Si-C(CH3)3)
【００３８】
５−２．化合物（１１）を糖鎖受容体とした場合のグリコシル化反応の位置選択性
【化２１】
アルゴン雰囲気下、糖鎖供与体（１４）（７３４ｍｇ，０．９９ｍｍｏｌ）、糖鎖受容体（１１）（６６０ｍｇ，０．９０ｍｍｏｌ）をｄｒｙ−ジクロロメタン（１８ｍｌ）に溶解させ、ＭＳ４Å（１０００ｍｇ）を加えて室温で１時間攪拌した。その後、溶液を０℃まで冷却し、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（４４．０μｌ，０．２４ｍｍｏｌ）を加え３０分攪拌した。反応終了後、トリエチルアミン（１．００ｍｌ）を加えフィルター濾過し、濃縮した後にフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝４０：１）で精製し、１→２結合異性体（３０８ｍｇ，２６％）、１→３結合異性体（７１１ｍｇ，６０％）を得た。生成物はいずれも非晶質として得られた。
1→2 linked isomer
Rf 0.25 [2:1 (v/v) hexane-ethyl acetate]
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) :δ 7.24-7.55, 7.81-7.85, 7.95-7.98 (each m, 31H, Ph), 5.87 (t, 1H, J2’,3’ = 9.5 Hz, J3’,4’ = 9.5 Hz, H-3’), 5.70 (t, 1H, J3’,4’ = 9.5 Hz, J4’,5’ = 10 Hz, H-4’), 5.51 (dd, 1H, J1’,2’ = 8.0 Hz, J2’,3’ = 9.5 Hz, H-2’), 5.22 (d, 1H, J1’,2’ = 8.0 Hz, H-1’), 4.88 (d, 1H, J = 12 Hz, CH2-Ph), 4.56 (d, 1H, J = 12 Hz, CH2-Ph), 4.53 (d, 1H, J1,2 = 7.5 Hz, H-1), 4.41 (dd, 1H, J5’,6a’ = 3.5 Hz, J6a’,6b’ = 12.5 Hz, H-6a’), 4.22 (dd, 1H, J5’,6b’ = 3.5 Hz, J6a’,6b’ = 12.5 Hz, H-6b’), 3.89-3.91 (m, 2H, H-6a, H-6b), 3.83 (tt, 1H, J4’,5’ = 10 Hz, J5’,6a’ = J5’,6b’ = 3.5 Hz, H-5’), 3.50-3.61 (m, 3H, H-2, H-3, H-4), 3.37-3.41 (m, 1H, H-5), 3.17 (d, 1H, OH ), 2.72 (d, 1H, OH ), 1.29, 1.30 (each s, 36H, Ph-C(CH 3)3), 0.99 (s, 9H, Si-C(CH3)3)
1→3 linked isomer
Rf 0.32 [2:1 (v/v) hexane-ethyl acetate]
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) :δ 7.23-7.52, 7.60-7.61, 7.80-8.00 (each m, 31H, Ph), 5.92 (t, 1H, J2’,3’ = 9.5 Hz, J3’,4’ = 9.5 Hz, H-3’), 5.63 (t, 1H, J3’,4’ = 9.5 Hz, J4’,5’ = 10 Hz, H-4’), 5.56 (dd, 1H, J1’,2’ = 8.0 Hz, J2’,3’ = 9.5 Hz, H-2’), 5.07 (d, 1H, J1’,2’ = 8.0 Hz, H-1’), 4.86 (d, 1H, J = 11.5 Hz, CH2-Ph), 4.73 (dd, 1H, J5’,6a’ = 2.5 Hz, J6a’,6b’ = 12.5 Hz, H-6a’), 4.54 (d, 1H, J = 11.5 Hz, CH2-Ph), 4.37 (dd, 1H, J5’,6b’ = 6.0 Hz, J6a’,6b’ = 12.5 Hz, H-6b’), 4.29 (d, 1H, J1,2 = 8.0 Hz, H-1), 4.17-4.21 (m, 1H, H-5’), 4.11 (dd, 1H, J5,6b = 2.0 Hz, J6a,6b = 11 Hz, H-6a), 4.11 (dd, 1H, J5,6b = 6.5 Hz, J6a,6b = 11 Hz, H-6b), 3.57-3.60 (m, 2H, H-4, C4-OH ), 3.52 (t, 1H, J2,3 = 8.5 Hz, J3,4 = 9.0 Hz, H-3), 3.41-3.45 (m, 2H, H-2, H-5), 2.10 (d, 1H, C2-OH ), 1.29, 1.30 (each s, 36H, Ph-C(CH 3)3), 1.02 (s, 9H, Si-C(CH3)3)
13C-NMR (CDCl3, 100MHz) :δ 166.10, 165.71, 165.20, 163.55, 149.26, 136.84, 133.55, 133.27, 132.25, 129.89, 129.85, 129,77, 129.73, 129.59, 129.12, 129.02, 128.68, 128.57, 128.41, 128.27, 128.21, 127.93, 125.28, 123.24, 123.16, 102.43, 101.08, 88.28, 72.82, 72.65, 72.57, 71.80, 70.49, 69.42, 69.13, 63.58, 62.77, 34.78, 31.51, 26.78, 19.18
【００３９】
上記５−１及び５−２の結果を下記の表に示す。
【表１】
表より、保護基として、より嵩高いｔＢｕ（Ｄｂｐ）２Ｓｉ基をＣ−６位に導入すると、Ｃ−４位におけるグリコシル化反応は生じず、Ｃ−３位及びＣ−２位におけるグリコシル化反応が選択的に生じていた。一方、従来から用いられているＴＢＤＰＳ基を保護基として用いた場合は、Ｃ−３位の反応性が比較的高いものの、Ｃ−４位における反応もある程度生じている。
この結果から、嵩高い保護基を導入した糖鎖受容体は、グリコシル化反応の位置選択性が増大していることが確認された。つまり、嵩高い置換基に隣接する水酸基へのグリコシル化反応が抑制されることになる。また、本発明の糖鎖受容体（化合物（１１））のＣ−２位又はＣ−３位を従来の保護基、例えば、ベンジル基やアセチル基で保護すると、他方の遊離水酸基について、選択的にグリコシル化反応を生じさせることが可能である。
また、ＴＢＤＰＳとｔＢｕ（Ｄｂｐ）２Ｓｉの保護基の嵩高さを分子軌道法で計算すると（ソフトウェア：Ｃｈｅｍ３Ｄ（ChembridgeSoft）を使用）、各々、約５．７３６Å、約７．２４３Åとなる。従って、本発明の「嵩高い保護基」としては、その保護基の嵩高さが少なくとも６．０Å以上あるものが望ましい。
【００４０】
なお、ｔＢｕ（Ｄｂｐ）２Ｓｉ基で糖鎖受容体を保護した後得られたオリゴ糖からの脱保護は、従来の方法により下記の様に、容易に行うことができる。
ビス（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−ｔｅｒｔ−ブチルシリル基の脱保護
【化２２】
アルゴン雰囲気下、化合物（１６）（３００ｍｇ，０．２３ｍｌ）、酢酸（０．０２ｍｌ，０．３５ｍｍｏｌ）をｄｒｙ−ＴＨＦ（５ｍｌ）に溶解させ、フッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム（０．５６ｍｌ，０．５６ｍｍｏｌ）を加えて室温で一晩攪拌した。反応終了後、酢酸エチルを用いて有機層を抽出し、水、飽和食塩水で順次洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。有機層を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝３：１→１：３）で精製し、化合物（１７）（１３９ｍｇ，７１％）を得た。
Rf 0.76 [1:3 (v/v) hexane-ethyl acetate]
1H-NMR (CDCl3, 200MHz) :δ 7.21-7.61, 7.79-7.84, 7.89-7.98, 8.06-8.10 (each m, 25H, Ph), 5.93 (t, 1H, J2’,3’ = 9.6 Hz, J3’,4’ = 9.6 Hz, H-3’), 5.61 (t, 1H, J3’,4’ = 9.6 Hz, J4’,5’ = 10.2 Hz, H-4’), 5.58 (dd, 1H, J1’,2’ = 7.8 Hz, J2’,3’ = 9.6 Hz, H-2’), 5.01 (d, 1H, J1’,2’ = 7.8 Hz, H-1’), 4.83 (d, 1H, J = 11.8 Hz, CH2-Ph), 4.78 (dd, 1H, J5’,6a’ = 2.4 Hz, J6a’,6b’ = 12.2 Hz, H-6a’), 4.58 (d, 1H, J = 11.6 Hz, CH2-Ph), 4.17-4.42 (m, 3H, H-1, H-6a, H-6b’), 3.27-3.93 (m, 7H, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6b, OH ), 1.98-2.04 (m, 2H, OH )
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明により、グリコシル化反応の位置選択性を高めることが可能となるため、所望の構造を有する糖鎖を製造する技術のさらなる進展に寄与することが期待できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖のグリコシル化反応に関する。具体的には、本発明は、立体保護を利用して、糖の任意の炭素位置に存在する遊離の水酸基において、位置選択的にグリコシル化反応を生じさせる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖は、生体内において、様々な重要な役割を担う分子である。例えば、生体のエネルギー源として、グルコースを多数含んだアミロース、アミロペクチン、グリコーゲンなどの糖が利用されている。また、タンパク質や脂質に結合し、糖タンパク質や糖脂質の一部として、生体内の重要な生理作用を担っている。さらに、細胞表面に存在し、細胞接着因子の一部として、抗原抗体反応の認識対象として、あるいは、ウイルス感染における認識分子としての役割も果たしており、細胞内外の情報伝達を仲介する分子としても重要である。このように、糖鎖は、糖タンパク質や糖脂質の重要な機能性分子として、細胞表面におけるシグナル伝達の仲立ちとして機能することで、生体の発生、分化、老化などの現象に関与し、また、免疫疾患や感染症など生体異常の発生又は抑制等にも関与している。
【０００３】
糖鎖の広範囲に及ぶ生体内での機能は、その複雑な構造に起因する糖鎖の多様性により実現されている。二糖以上のオリゴ糖は、様々な単糖の組合せにより、様々な種類のオリゴ糖として構築されるが、単糖の組合せに加え、単糖同士を結合するグリコシド結合の形成される位置によっても、異なる特徴を持つオリゴ糖となる。例えば、インフルエンザウイルスが動物に感染する際、ウイルスのヘマグルチニンが動物細胞表面に存在するシアル酸を認識し、細胞内へと侵入していく。この場合、動物細胞側のシアル酸が、いわば、ウイルスに対するレセプターの役割を果たしていることになるが、レセプターとしての特異性は、シアル酸残基が結合するガラクトースとの結合位置によって決定されている。例えば、ヒト由来のインフルエンザウイルスのヘマグルチニンは、シアル酸とガラクトースがα２→６結合をしたものだけを認識するのに対し、トリ由来のインフルエンザウイルスは、α２→３結合をしたものだけを認識する。このように、オリゴ糖は、構成する単糖の種類は同じであっても、単糖同士を結合するグリコシド結合の位置が異なると全く異なる機能を発揮する。
従って、糖鎖の生体内における機能を明らかにするためには、グリコシド結合の位置を明確にした上で、その構造を決定する必要がある。そして、決定された構造を有する糖鎖を合成するためには、糖残基間を結合させるグリコシル化反応をいかに位置選択的に行わせるかが鍵となってくる。従来、位置選択的にグリコシル化反応を生じさせるために、様々な保護基を使い分けて結合位置の制御を行っていた。そのため、合成が多段階にわたり、手間、コスト面における負担が大きかった。
【０００４】
糖に存在する遊離の水酸基に対し、位置選択的に置換基を導入する方法は、これまでも、いくつか報告されている。糖鎖受容体の６位の遊離の水酸基に導入した保護基と４位の水素との間で水素結合を形成させ、４位以外の炭素位置に置換基を導入させる試みが行われている（非特許文献１）。この方法は、水素結合によって４位がマスクされる影響を利用するものであるが、反応を行わせる溶媒の極性によって置換基が導入される位置に変化が生じてしまうため、特定の位置選択的に安定に置換基を導入する方法としては確立されていない。また、嵩高い保護基として、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）基を利用し、該保護基の立体保護効果（又は、立体障害効果）により、位置選択的なグリコシル化反応を行わせる方法に関する報告がある。しかし、この方法においても、ある程度位置選択的な糖への置換基の導入は可能となっているが、その他の炭素位に存在する水酸基にも置換基が導入され、高い位置選択性があるとまでは言い難い（非特許文献２〜４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍｏｉｔｅｓｓｉｅｒ及びＣｈａｐｌｅｕｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４４：１７３１−１７３５，２００３
【非特許文献２】Ｍｏｉｔｅｓｓｉｅｒら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，６１：６８３９−６８５３，２００５
【非特許文献３】Ｃｍｏｃｈ及びＰａｋｕｌｓｋｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ／Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，１９：１４９４−１５０３，２００８
【非特許文献４】Ｂｏｈｎら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３４２：２５２２−２５３６，２００７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のように、糖鎖の合成において、グリコシル化反応を位置選択的に行わせることが非常に重要となる。
そこで、本発明では、任意の炭素位の遊離の水酸基に嵩高い保護基を導入した糖鎖受容体を使用し、位置選択的にグリコシル化反応を生じさせる方法の提供を目的とする。
また、本発明は、位置選択的なグリコシル化反応に有用な糖鎖受容体の提供を目的とする。
さらに、本発明は、位置選択的なグリコシル化反応に利用可能な保護基の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本出願の発明者らは、嵩高い保護基であるｔＢｕ（Ｄｂｐ）２Ｓｉ基を糖鎖受容体のＣ−６位の水酸基に導入し、隣接位の炭素に結合する水酸基を立体的に保護すれば、Ｃ−４位におけるグリコシル化反応を回避できるのではないかと考え、本課題の解決に着手した。その結果、Ｃ−４位におけるグリコシル化反応をほぼ抑えることに成功した。
また、ｔＢｕ（Ｄｂｐ）２Ｓｉ基を保護基として導入した糖鎖受容体は、その結晶性が向上していることを見出した。糖誘導体は粘性が高く、通常、精製を行うのが困難であるが、高い結晶性を有する糖鎖受容体であれば、再結晶化により簡便に精製することが可能となる。
以上の結果から、発明者らは、これまで利用されていた保護基であるＴＢＤＰＳ基と本発明で見出したｔＢｕ（Ｄｂｐ）２Ｓｉ基の立体保護効果及び結晶性の差に着目し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、糖の少なくとも１つの遊離水酸基に嵩高い保護基を導入することにより、該遊離水酸基及び該遊離水酸基に近接する遊離水酸基以外の遊離水酸基選択的にグリコシル化反応が起こる糖鎖受容体を製造する方法である。
【０００９】
また、本発明は、前記保護基が以下の式（Ｉ）であることを特徴とする糖鎖受容体を製造する方法である。
【化１】
［式（Ｉ）において、Ｒ１は、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ネオペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、イソアミル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、ｓｅｃ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基であり、ｎは０又は１若しくは２の整数である。また、Ｘは式（ＩＩ）の置換基、
【化２】
（式（ＩＩ）において、Ｒ２は、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ネオペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、イソアミル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、ｓｅｃ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基であり、ｍは１〜３のいずれかの整数であり、Ｒ２とベンゼン環の間には、エーテル結合、チオエーテル結合を含んでも良い）、
又は、アダマンチル基であり、 Ｅは、ケイ素又はゲルマニウムである］
【００１０】
さらに、本発明は、以下の式（Ｉ）で示される糖鎖受容体用保護基である。
【化３】
［式（Ｉ）において、Ｒ１は、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ネオペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、イソアミル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、ｓｅｃ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基であり、ｎは０又は１若しくは２の整数である。また、Ｘは式（ＩＩ）の置換基、
【化４】
（式（ＩＩ）において、Ｒ２は、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ネオペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、イソアミル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、ｓｅｃ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基であり、ｍは１〜３のいずれかの整数であり、Ｒ２とベンゼン環の間には、エーテル結合、チオエーテル結合を含んでも良い）、
又は、アダマンチル基であり、 Ｅは、ケイ素又はゲルマニウムである］
【発明の効果】
【００１１】
本発明の糖鎖受容体を用いると、多段階のステップを経由せず、所望の位置にグリコシド結合を形成させることができるので、目的の糖鎖を簡便かつ低コストにて合成することができる。
【００１２】
本発明の糖鎖受容体のうち、結晶化する特徴を有するものは、容易に精製することができるため、粘性が高く非結晶性の従来の糖鎖受容体と比較すると、扱いが容易である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の第１の形態は、糖の少なくとも１つの遊離水酸基に嵩高い保護基を導入することにより、該遊離水酸基及び該遊離水酸基に近接又は隣接する遊離水酸基（例えば、Ｃ−６位の遊離水酸基に保護基を導入した場合、Ｃ−４位、Ｃ−１位の遊離水酸基がＣ−６位の遊離水酸基に近接又は隣接する遊離水酸基である）以外の遊離水酸基に選択的にグリコシル化反応が起こる（又はグリコシド結合が形成される）糖鎖受容体を製造する方法である。
糖のグリコシル化反応は、アノマー位に脱離基を有する糖（糖鎖供与体）と遊離の水酸基をもつ糖（糖鎖受容体）との縮合反応である。この場合、糖鎖受容体の遊離の水酸基が複数存在すると、いずれの水酸基においても縮合反応が生じる可能性がある。そのため、特定の水酸基とのみ縮合反応を行わせるためには、該特定の水酸基以外の水酸基を適当な保護基によって保護する必要がある。本発明は、糖鎖受容体の任意の炭素位に存在する水酸基に、嵩高い保護基を導入し、その嵩高さにより保護基と近接する遊離の水酸基を保護し、グリコシル化反応が生じないようにすることで、他の遊離の水酸基とのグリコシル化反応を優先的に誘導することにより達成される。
【００１４】
本発明で利用可能な「嵩高い保護基」とは、例えば、分子軌道法によって計算される保護基の嵩高さ（糖鎖受容体側の酸素と結合する原子（例えば、ケイ素、ゲルマニウム、一般式（Ｉ）のＥに相当する）から最も離れた位置に存在する原子（例えば、一般式（Ｉ）のＲ１又はＸに含まれる原子であってＥからの直線距離で最も遠くに位置する原子）までの距離）が、例えば、６．０Å以上、好ましくは、７．０Å以上であって、実際に、糖鎖受容体の遊離の水酸基に導入可能な保護基のことである。
【００１５】
「嵩高い保護基」としては、例えば、以下の式（Ｉ）で表される置換基を挙げることができる。
【化５】
ここで、式（Ｉ）において、Ｒ１として、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ネオペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、イソアミル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、ｓｅｃ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基などを例示することができ、好ましくは、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基である。式（Ｉ）中の「ｎ」は、０又は１若しくは２の整数である。
また、Ｘとして、式（ＩＩ）で表される置換基又はアダマンチル基を挙げることができる。
【化６】
ここで、式（ＩＩ）において、Ｒ２は、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ネオペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、イソアミル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、ｓｅｃ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基などを例示することができ、好ましくは、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基である。式（ＩＩ）中のｍは、１〜３のいずれかの整数であり、Ｒ２とベンゼン環の間には、エーテル結合、チオエーテル結合を含んでも良い。Ｒ２の結合位置は、オルト位、パラ位、メタ位のいずれでもよい。
Ｅは、ケイ素又はゲルマニウムである。
【００１６】
本発明の嵩高い保護基として、より具体的には、下記式（ＩＩＩ）のビス（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−ｔｅｒｔ−ブチルシリル（ｔＢｕ（Ｄｂｐ）２Ｓｉ）基を例示することができる。
【化７】
【００１７】
例えば、本発明の糖鎖受容体が、Ｃ−６位の水酸基に嵩高い保護基が導入されているものである場合、Ｃ−６位の水酸基に近接するＣ−４位の水酸基は嵩高い保護基により立体的に保護され、グリコシル化反応がほとんど生じなくなる。その結果、Ｃ−３位とＣ−２位においてグリコシル化反応が起こり易くなる。また、予め、Ｃ−２位の水酸基に嵩高い保護基を導入しておけば、Ｃ−３位の水酸基が立体的に保護され、その結果、Ｃ−６位とＣ−４位におけるグリコシル化反応が優先的に生じることになる。つまり、嵩高い置換基に隣接する水酸基へのグリコシル化反応が抑制されることになる。
糖鎖受容体のＣ−６位の水酸基に嵩高い保護基を導入し、さらに、例えば、Ｃ−３位を従来の保護基（例えば、アセチル基、ベンジル基など）で保護すれば、Ｃ−２位のみでグリコシル化反応が生じ、Ｃ−２位のみにグリコシド結合ができることになる。あるいは、糖鎖受容体のＣ−６位の水酸基に嵩高い保護基を導入し、さらに、Ｃ−１位に嵩高い保護基を導入すれば、Ｃ−３位に選択的にグリコシド結合ができることになる。
【００１８】
さらに、本発明の糖鎖受容体には、結晶化する特徴を有するものが含まれる。一般に、糖誘導体は高い粘性を示すため、精製が非常に困難である。本発明の糖鎖受容体のうち、結晶化する特徴を有する糖鎖受容体は、再結晶による簡便かつ低コストな方法により精製することが可能である。
また、一般式（Ｉ）で示される保護基は、糖鎖受容体に導入する際のハロゲン化物（例えば、Ｅがケイ素の場合には、クロロシラン。例えば、ｔＢｕ（Ｄｂｐ）２ＳｉＣｌ）が空気中で加水分解しにくくなり、安定性が向上するといった利点をも有する。
【００１９】
本発明の他の実施形態は、本発明によって製造される糖鎖受容体、又は嵩高い保護基（ハロゲン化物などの安定供給に適した形態のもの）からなる糖鎖合成用試薬である。本発明で開示される嵩高い保護基によって任意の水酸基が保護された糖鎖受容体は、様々な糖鎖合成に利用することができる。さらに、本発明で開示される嵩高い保護基は、ハロゲン化物（フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物）などの形態で、所望の遊離水酸基が保護された所望の糖鎖受容体の合成に利用することができる。
本発明の試薬は、本発明の糖鎖受容体又は嵩高い保護基の他、これらを安定化するためのバッファーなどを含んでいてもよい。さらに、本発明の試薬は、他の試薬と共に、糖鎖合成用のキットとして供給することも可能である。このようなキットも本発明の範囲に含まれる。
【００２０】
以下に実施例を示し本発明についてより具体的に説明を行うが、本発明の範囲は、実施例の範囲に限定されるものではない。
【実施例】
【００２１】
１．ベンジル ６−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−β−Ｄ−グルコピラノシド（５）の合成
まず、本実施例においてコントロールの糖鎖受容体として用いるベンジル ６−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−β−Ｄ−グルコピラノシド（化合物５）の合成を行った。
【００２２】
ペンタ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノース（２）
【化８】
酢酸ナトリウム（２６．３ｇ，０．３２０ｍｏｌ）を無水酢酸（１９３ｍｌ，２．０５ｍｏｌ）に懸濁し、１１０℃に加熱した。そこへ、Ｄ−グルコース（１）（４６．１ｇ，０．２５６ｍｏｌ）を温度上昇に気をつけながら少しずつ加え、３時間撹拌した。反応終了後、反応液を氷水にあけ撹拌し、溶液から濾取し、水で十分洗浄した後、ジエチルエーテルで軽く洗浄し減圧乾燥した。粗結晶をエタノールで再結晶し、化合物（２）（６１．５ｇ，６２％）を得た。
1H NMR (CDCl3, 200MHz) :δ5.70 (d, 1H, J1,2 = 8.2 Hz, H-1), 5.43 (d, 1H, J3,4=3.2 Hz, H-4), 5.34 (dd, 1H, J1,2 = 8.2 Hz, J2,3 = 10.4 Hz, H-2), 5.08 (dd, 1H, J2,3 = 10.4 Hz, J3,4 = 3.2 Hz, H-3), 4.02-4.17 (m, 3H, H-5, H-6), 2.17, 2.13, 2.05, 2.05, 2.00 (each s, 15H, -OAc).
【００２３】
ベンジル Ｏ−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（３）
【化９】
アルゴン雰囲気下、化合物（２）（８．９０ｇ，２２．８ｍｍｏｌ）をｄｒｙ−ジクロロメタン（８０ｍｌ）に溶解させ、ベンジルアルコール（４．７２ｍｌ，４５．６ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を−１１℃に冷却し、温度上昇に気をつけながら三フッ化ホウ素−ジエチルエーテル錯体（８．６７ｍｌ，６８．４ｍｍｏｌ）を滴下した。滴下終了後、氷浴に変え１時間撹拌し、さらに室温で一晩撹拌した。反応終了後、反応液を氷水にあけ、クロロホルムで有機層の抽出をした。有機層を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水の順に洗浄したのち、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。有機層を濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し、１位にベンジル基が導入された化合物（３）（３．３９ｇ，３４％）を得た。
Rf 0.36 [2:1 (v/v) hexane-ethyl acetate]
1H NMR (CDCl3, 200MHz) :δ7.20-7.32 (m, 5H, CH2-Ph), 5.32 (d, 1H, J3,4 = 3.2 Hz, H-4), 5.22 (dd, 1H, J1,2 = 8.0 Hz, J2,3 = 10.4 Hz, H-2), 4.92 (dd, 1H, J2,3 = 10.4 Hz, J3,4 = 3.2 Hz, H-3 ), 4.85 (d, 1H, J = 12.2 Hz, OCH2Ph), 4.57 (d, 1H, J = 12.2 Hz, OCH2Ph), 4.45 (d, 1H, J1,2 = 8.0 Hz, H-1), 4.03-4.20 (m, 2H, H-5, H-6a), 3.79-3.85 (m, 1H, H-6b), 2.09, 2.00, 1.94, 1.91 (each s, 12H, -OAc).
【００２４】
ベンジル Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（４）
【化１０】
アルゴン雰囲気下、化合物（３）（２．８０ｇ，６．３９ｍｍｏｌ）をｄｒｙ−メタノール（１５ｍｌ）に溶解させ、ナトリウムメトキシド（０．１３８ｇ，２．５５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１晩撹拌した。反応終了後、陽イオン交換樹脂を加え、反応溶液を中和した。綿栓濾過で樹脂を除き、濾液を濃縮し、粗生成物（４）（１．７３ｇ，１００％）を得た。この段階では精製は行わずにそのまま次の反応に用いた。
【００２５】
ベンジル ６−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−β−Ｄ−グルコピラノシド（５）
【化１１】
アルゴン雰囲気下、化合物（４）（２６６ｍｇ，０．９８ｍｍｏｌ）、イミダゾール（１３４ｍｇ，１．９７ｍｍｏｌ）をｄｒｙ−ＤＭＦ（６ｍｌ）に溶解させ、ｄｒｙ−ＤＭＦ（４ｍｌ）に溶解させた市販のＴＢＤＰＳＣｌ（０．３８ｍｌ，１．４８ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で一晩攪拌した。反応終了後、酢酸エチルを用いて有機層を抽出し、水、飽和食塩水で順次洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。有機層を濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：３）で精製し、化合物（５）（４３２ｍｇ，８６％）を得た。化合物（５）は非晶質であった。
mp 56.5-57.5℃
Rf 0.34 [1:3 (v/v) hexane-ethyl acetate]
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) :δ7.68-7.73 (m, 4H, Si-Ph), 7.32-7.44 (m, 6H, Si-Ph), 7.30-7.32 (m, 5H, CH2-Ph), 4.88 (d, 1H, J = 11.6 Hz, OCH2Ph), 4.57 (d, 1H, J = 11.6 Hz, OCH2Ph), 4.37 (d, J1,2 = 7.6 Hz, H-1), 3.95(m, 2H, H-6a, H-6b), 3.68 (dd, 1H, J3,4 = 9.2 Hz, J4,5 = 9.2 Hz, H-4), 3.58 (dd, 1H, J2,3 = 8.8 Hz, J3,4 = 9.2 Hz, H-3), 3.42-3.48 (m, 2H, H-2, H-5), 1.07 (s, 9H, Si-C(CH3)3)
13C-NMR (CDCl3, 100MHz) :δ 136.85, 135.66, 135.58, 133.64, 132.85, 132.69, 130.17, 129.93, 128.54, 128.48, 128.22, 128.10, 127.84, 127.82, 101.15 (C-1), 77.23, 76.23, 74.61, 73.61, 72.17, 70.89, 64.77, 26.77, 19.22, 0.01
【００２６】
２．ビス（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−ｔｅｒｔ−ブチルクロロシラン（１０）の合成
本発明の「嵩高い保護基」の塩化物の一例として、ビス（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−ｔｅｒｔ−ブチルクロロシラン（化合物１０）を以下の様に合成した。
【００２７】
１，３，５−トリ−ｔｅｒｔ−ブチルベンゼン（７）
【化１２】
アルゴン雰囲気下、化合物（６）（２．０２ｍｌ，２２．６ｍｍｏｌ）と２−メチル−２−クロロプロパン（２０．０ｍｌ，１８１．６ｍｍｏｌ）の混合溶液を−５℃に冷却し、塩化アルミニウム（３．０２ｇ，２２．６ｍｍｏｌ）を２時間かけて添加し、１時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を氷水にあけ、酢酸エチルを用いて有機層を抽出し、水、飽和食塩水で順次洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。有機層を濃縮し、ショートカラムによりおおまかに精製した後、エタノールで再結晶し、化合物（７）（４．３７ｇ，７８％）を得た。
Rf 0.57 [hexane]
1H-NMR (CDCl3, 200MHz) :δ7.26 (s, 3H, Ph), 1.34 (s, 27H, C(CH3)3)
【００２８】
ブロモ−３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルベンゼン（８）
【化１３】
アルゴン雰囲気下、化合物（７）（２４．０ｇ，９７．４ｍｍｏｌ）をｄｒｙ−四塩化炭素（４８ｍｌ）に溶解させ、鉄粉（５．７２ｇ，１０２ｍｍｏｌ）を加え０℃に冷却した。その後、臭素（１０．５ｍｌ，２０５ｍｍｏｌ）のｄｒｙ−四塩化炭素溶液（１２ｍｌ）を滴下し、徐々に室温に戻しながら４時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を氷水にあけ、クロロホルムを用いて有機層を抽出し、水、０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、水、チオ硫酸ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。有機層を濃縮し、ショートカラムによりおおまかに精製した後、減圧蒸留（０．９ｍｍＨｇ，９０℃）で精製し、化合物（８）（２２．３ｇ，８５％）を得た。
Rf 0.68 [hexane]
1H-NMR (CDCl3, 200MHz) :δ7.32 (s, 3H, Ph), 1.30 (s, 18H, C(CH3)3)
【００２９】
ビス（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−ｔｅｒｔ−ブチルシラン（９）
【化１４】
アルゴン雰囲気下、化合物（８）（２．８０ｇ，１０．４ｍｍｏｌ）をｄｒｙ−エーテル（１７ｍｌ）に溶解させ、−７８℃に冷却した。Ｔｅｒｔ−ブチルリチウム（１．７６ｍｏｌ／ｌ ペンタン溶液）（１１．８ｍｌ，２０．８ｍｍｏｌ）を滴下し、２時間攪拌した後、室温まで戻した。反応溶液を、−７８℃に冷却したトリクロロシラン（０．５０ｍｌ，４．９５ｍｍｏｌ）のｄｒｙ−エーテル溶液（６ｍｌ）に滴下し、−７８℃で２時間攪拌した後、徐々に室温まで戻しながら一晩攪拌した。再度、反応溶液を−７８℃まで冷却してＴｅｒｔ−ブチルリチウム（１．７６ｍｏｌ／ｌ ペンタン溶液）（３．０９ｍｌ，５．４５ｍｍｏｌ）を滴下し、１．５時間攪拌した後、徐々に室温まで戻しながら一晩攪拌した。反応終了後、酢酸エチルを用いて有機層を抽出し、水、飽和食塩水で順次洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。有機層を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン）で精製し、化合物（９）（１．０５ｇ，４６％）を白色の結晶として得た。
Rf 0.51 [hexane]
1H-NMR (CDCl3, 500MHz) :δ7.54 (d, 4H, Ph), 7.43 (t, 2H, Ph), 4.61 (s, 1H, SiH ), 1.32 (s, 36H, Ph-C(CH3)3), 1.04 (s, 9H, Si-C(CH3)3)
13C-NMR (CDCl3, 125MHz) :δ149.44, 133.06, 129.77, 34.79, 31.51, 27.65, 17.86
【００３０】
ビス（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−ｔｅｒｔ−ブチルクロロシラン（１０）
【化１５】
アルゴン雰囲気下、化合物（９）（１．５０ｇ，３．２３ｍｍｏｌ）をｄｒｙ−四塩化炭素（６ｍｌ）に溶解させ、塩化パラジウム（５７．０ｍｇ，０．３２３ｍｍｏｌ）加え、撹拌しながら２日間加熱還流した。アルゴン雰囲気下でフィルター濾過し、四塩化炭素を減圧留去した後、精製せずに次の反応に用いた。１Ｈ−ＮＭＲにより定量的に化合物（１０）が得られたことを確認した。
1H-NMR (CDCl3, 200MHz) :δ7.64 (d, 4H, Ph), 7.48 (t, 2H, Ph), 1.32 (s, 36H, Ph-C(CH3)3), 1.10 (s, 9H, Si-C(CH3)3)
【００３１】
３．ベンジル ６−Ｏ−ビス（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−ｔｅｒｔ−ブチルシリル−β−Ｄ−グルコピラノシド（１１）の合成
上記２で合成した化合物（１０）を使用して、本発明の糖鎖受容体の一例として、ベンジル ６−Ｏ−ビス（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−ｔｅｒｔ−ブチルシリル−β−Ｄ−グルコピラノシド（化合物１１）の合成を行った。
【化１６】
アルゴン雰囲気下、化合物（４）（６２４ｍｇ，２．３１ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルイミダゾール（７９６ｍｇ，９．６９ｍｍｏｌ）、ヨウ素（１．２３ｇ，９．６９ｍｍｏｌ）をｄｒｙ−ピリジン（１０ｍｌ）に溶解させ、化合物（１０）（１．６１ｇ，３．２３ｍｍｏｌ）のｄｒｙ−ピリジン溶液（６ｍｌ）を滴下し、室温で２時間攪拌した。反応終了後、酢酸エチルを用いて有機層を抽出し、チオ硫酸ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で順次洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。有機層を濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製し、化合物（１１）（１．３６ｇ，８１％）を白色の結晶として得た。
mp 88.9-89.2℃
Rf 0.42 [1:1 (v/v) hexane-ethyl acetate]
1H-NMR (CDCl3, 500MHz) :δ7.59 (d, 2H, Si-Ph), 7.57(d, 2H, Si-Ph), 7.49 (t, 1H, Si-Ph), 7.49 (t, 1H, Si-Ph), 7.27-7.32 (m, 2H, CH2-Ph), 4.83 (d, 1H, CH2-Ph), 4.52 (d, 1H, CH2-Ph), 4.34 (d, 1H, J1,2 = 7.5 Hz, H-1), 3.92-4.00 (m, 2H, J1,2 = 8.0 Hz, H-6a, H-6b), 3.67 (dd, 1H, J3,4 = 9.0 Hz, J4,5 = 9.0 Hz, H-4), 3.59 (dd, 1H, J2,3 = 9.5 Hz, J3,4 = 9.0 Hz, H-3), 3.44-3.46 (m, 2H, H-2, H-5), 1.33 (s, 36H, Ph-C(CH3)3), 1.03 (s, 9H, Si-C(CH3)3)
13C-NMR (CDCl3, 125MHz) :δ149.64, 136.85, 131.32, 129.61, 129.52, 128.47, 128.15, 128.01, 123.73, 123.68, 101.38 (C-1), 76.28, 73.97, 73.59, 73.48, 70.95, 65.51, 34.84, 31.53, 26.78, 19.01
【００３２】
４．２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−グルコピラノシル ２，２，２−トリクロロアセトアミデート（１４）の合成
本実施例で糖鎖供与体として使用した２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−グルコピラノシル ２，２，２−トリクロロアセトアミデート（化合物１４）を以下の様に合成した。
【００３３】
ペンタ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−グルコピラノース（１２）
【化１７】
アルゴン雰囲気下、Ｄ−グルコース（１）（３．００ｇ，１６．７ｍｍｏｌ）をｄｒｙ−ピリジン（５０．０ｍｌ）に溶解し０℃に冷却した。０℃で塩化ベンゾイル（１４．６ｍｌ，１２５ ｍｍｏｌ）を加え、室温に戻し一晩撹拌した。反応終了後、水を加え過剰の酸塩化物を中和した。反応溶液を酢酸エチルで抽出し、有機層を１Ｎ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水の順に洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。有機層を濃縮した後、ショートカラムによりおおまかに精製した後、２−プロパノールで再結晶し、化合物（１２）（１０．９ｇ，９４％）を得た。
Rf 0.48 [2:1 (v/v) hexane-ethyl acetate]
1H-NMR (CDCl3, 200MHz) :δ7.87-8.19, 7.30-7.67 (each m, 25H, Ph), 6.85 (d, 1H, J1,2 = 3.8 Hz, H-1), 6.32 (t, 1H, J2,3 = 10.0 Hz, J3.4 = 9.8 Hz, H-3), 5.86 (t, 1H, J3,4 = 9.8 Hz, J4,5 = 10.0 Hz, H-4), 5.68 (dd, 1H, J1,2 = 3.8 Hz, J2,3 = 10.0 Hz, H-2), 4.42-4.65 (m, 3H, H-5, H-6a, H-6b)
【００３４】
２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンゾイル−α，β−Ｄ−グルコピラノース（１３）
【化１８】
化合物（１２）（４．７０ｇ，６．７１ｍｍｏｌ）をｄｒｙ−ジクロロエタン（２０ｍｌ）に溶解させ、密栓し０℃に冷却した。臭化水素（３３％ 酢酸溶液）（５．００ｍｌ，２７．８ｍｍｏｌ）を加え、室温にて４時間攪拌した。反応終了後、クロロホルムで抽出し、水、炭酸水素ナトリウム、飽和食塩水で順次洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。有機層を濃縮し、アセトン（３５ｍｌ）、水（１．５ｍｌ）、炭酸銀（３．０６ｇ，１１．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌した。反応終了後、フィルター濾過し、有機層を濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝９：１）で精製し、化合物（１３）（３．９７ｇ， ９９％）を白色の結晶として得た。
Rf 0.20 [9:1 (v/v) toluene-ethyl acetate]
1H-NMR (CDCl3, 200MHz) :δ7.29-7.56, 7.86-8.01 (each m, 24H, Ph), 6.26 (t, 1H, J2,3 = 10 Hz, J3,4 = 10 Hz, α-H-3), 5.97(t, 0.2H, β-H-3), 5.67-5.79 (m, 2.2H, α-H-1, α-H-4, β-H-4), 5.32 (m, 1.2H, α-H-2, β-H-2), 4.15-4.69 (m, 3.6H, α-H-5, α-H-6a, α-H-6b, β-H-5, β-H-6a, β-H-6b), 4.00 (d, 0.2H, β-OH), 3.36 (d, 1H, α-OH)
【００３５】
２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−グルコピラノシル ２，２，２−トリクロロアセトアミデート（１４）
【化１９】
アルゴン雰囲気下、化合物（１３）（８８６ｍｇ，１．４８ｍｍｏｌ）をｄｒｙ−ジクロロメタン（１５ｍｌ）に溶解させ、炭酸セシウム（４８．９ｍｇ，０．１５ｇ）、トリクロロアセトニトリル（０．９０ｍｌ，８．８８ｍｍｏｌ）を加えて室温にて一晩攪拌した。反応終了後、フィルター濾過し濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝２０：１）で精製し、化合物（１４）（９８２ｍｇ，８９％）を白色の結晶として得た。
Rf 0.37 [20:1 (v/v) toluene-ethyl acetate]
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) :δ8.64 (s, 1H, N-H), 7.29-7.57, 7.89-8.05 (each m, 20H, Ph), 6.84 (d, 1H, J1,2 = 3.6 Hz, H-1), 6.28 (t, 1H, J2,3 = 10.4 Hz, J3,4 = 10.4 Hz, H-3), 5.83 (t, 1H, J3,4 = 10.4 Hz, J4,5 = 10.4 Hz, H-4), 5.62 (dd, 1H, J1,2 = 3.6 Hz, J2,3 = 10.4 Hz,H-2), 4.63-4.66 (m, 2H, H-5, H-6a), 4.47-4.51 (dd, 1H, H-6b)
【００３６】
５．嵩高い置換基を有する本発明の糖鎖受容体（化合物（１１））の位置選択的グリコシル化反応
本発明の嵩高い置換基を有する糖鎖受容体の一例として合成した化合物（１１）を用いて、位置選択的にグリコシル化反応が生じるかどうか検討した。糖鎖供与体として化合物（１４）を用いた。また、コントロールの糖鎖受容体として従来から利用されている保護基を有する化合物（５）を使用した。
【００３７】
５−１．化合物（５）を糖鎖受容体とした場合のグリコシル化反応の位置選択性
【化２０】
アルゴン雰囲気下、糖鎖供与体（１４）（７８２ｍｇ，１．０６ｍｍｏｌ）、糖鎖受容体（５）（４８８ｍｇ，０．９６ｍｍｏｌ）をｄｒｙ−ジクロロメタン（２０ｍｌ）に溶解させ、ＭＳ４Å（１２００ｍｇ）を加えて室温で１時間攪拌した。その後、溶液を−４０℃まで冷却し、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（４８．０μｌ，０．２６ｍｍｏｌ）を加え２時間攪拌した。反応終了後、トリエチルアミン（１．００ｍｌ）を加えフィルター濾過し、濃縮した後にフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝９：１）で精製し、１→２結合異性体（２００ｍｇ，１９％）、１→３結合異性体（３９２ｍｇ，３８％）、１→４結合異性体（８８ｍｇ，８％）を得た。生成物はいずれも非晶質として得られた。
1→2 linked isomer
Rf 0.23 [2:1 (v/v) hexane-ethyl acetate]
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) :δ 7.27-7.53, 7.66-7.68, 7.81-7.85, 7.95-8.00 (each m, 35H, Ph), 5.88 (t, 1H, J2’,3’ = 9.6 Hz, J3’,4’ = 9.6 Hz, H-3’), 5.71 (t, 1H, J3’,4’ = 9.6 Hz, J4’,5’ = 10 Hz, H-4’), 5.71 (dd, 1H, J1’,2’ = 8.0 Hz, J2’,3’ = 9.6 Hz, H-2’), 5.20 (d, 1H, J1’,2’ = 8.0 Hz, H-1’), 4.93 (d, 1H, J = 11.6 Hz, CH2-Ph), 4.59 (d, 1H, J = 11.6 Hz, CH2-Ph), 4.57 (d, 1H, J1’,2’ = 7.2 Hz, H-1), 4.44 (dd, 1H, J5’,6a’ = 3.6 Hz, J6a’,6b’ = 12.4 Hz, H-6a’), 4.21 (dd, 1H, J5’,6b’ = 3.6 Hz, J6a’,6b’ = 12.4 Hz, H-6b’), 3.80-3.92 (m, 3H, H-5’, H-6a, H-6b), 3.48-3.62 (m, 3H, H-2, H-3, H-4), 3.35-3.39 (m, 1H, H-5), 2.92 (s, 1H, C4-OH ), 2.85 (d, 1H, C3-OH ), 1.03 (s, 9H, Si-C(CH3)3)
13C-NMR (CDCl3, 100MHz) :δ 166.06, 165.77, 165.00, 137.38, 135.59, 135.52, 133.49, 133.37, 133.26, 133.05, 132.91, 132,79, 129.80, 129.74, 129.70, 129.45, 128.93, 128.72, 128.67, 128.50, 128.40, 128.36, 128.29, 127.74, 127.70, 127.68, 127.21, 101.42, 100.69, 82.15, 75.62, 74.55, 72.97, 72.62, 72.10, 71.17, 70.80, 69.14, 64.33, 62.57, 26.71 (Si-C(CH3)3), 19.17 (Si-C(CH3)3)
1→3 linked isomer
Rf 0.38 [2:1 (v/v) hexane-ethyl acetate]
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) :δ 7.28-7.52, 7.71-7.73, 7.81-7.83, 7.91-7.97, 8.07-8.08 (each m, 35H, Ph), 5.93 (t, 1H, J2’,3’ = 9.6 Hz, J3’,4’ = 9.6 Hz, H-3’), 5.62 (t, 1H, J3’,4’ = 9.6 Hz, J4’,5’ = 10.4 Hz, H-4’), 5.57 (dd, 1H, J1’,2’ = 8.0 Hz, J2’,3’ = 9.6 Hz, H-2’), 5.03 (d, 1H, J1’,2’ = 8.0 Hz, H-1’), 4.89 (d, 1H, J = 11.6 Hz, CH2-Ph), 4.78 (dd, 1H, J5’,6a’ = 6.4 Hz, J6a’,6b’ = 12.4 Hz, H-6a’), 4.56 (d, 1H, J = 11.6 Hz, CH2-Ph), 4.36 (dd, 1H, J5’,6b’ = 6.4 Hz, J6a’,6b’ = 12.4 Hz, H-6b’), 4.29 (d, 1H, J1,2 = 7.6 Hz, H-1), 4.04 (br d, 1H, H-6a), 3.89 (dd, 1H, H-6b), 3.71 (s, 1H, C4-OH ), 3.60 (t, 1H, J3,4 = 9.2 Hz, J4,5 = 8.8 Hz, H-4), 3.50 (t, 1H, J2,3 = 8.4 Hz, J3,4 = 9.2 Hz, H-3), 3.35-3.45 (m, 2H, H-2, H-5), 2.03 (d, 1H, C2-OH ), 1.06 (s, 9H, Si-C(CH3)3)
13C-NMR (CDCl3, 100MHz) :δ 166.14, 165.66, 165.19, 136.80, 135.67, 135.61, 133.61, 133.57, 133.32, 129.96, 129.87, 129,78, 129.74, 129.57, 129.20, 129.02, 128.60, 128.48, 128.44, 128.31, 128.27, 128.01, 127.62, 127.59, 102.64, 100.87, 88.77, 76.43, 72.65, 72.46, 71.68, 70.42, 69.34, 68.60, 63.40, 62.80, 26.74 (Si-C(CH3)3), 19.33 (Si-C(CH3)3)
1→4 linked isomer
Rf 0.15 [2:1 (v/v) hexane-ethyl acetate]
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) :δ 7.28-7.59, 7.74-7.83, 7.93-7.95, 8.11-8.13 (each m, 35H, Ph), 5.89 (t, 1H, J2’,3’ = 9.6 Hz, J3’,4’ = 9.6 Hz, H-3’), 5.67 (t, 1H, J3’,4’ = 9.6 Hz, J4’,5’ = 10 Hz, H-4’), 5.61 (dd, 1H, J1’,2’ = 8.0 Hz, J2’,3’ = 9.6 Hz, H-2’), 5.16 (d, 1H, J1’,2’ = 8.0 Hz, H-1’), 4.85 (d, 1H, J = 11.6 Hz, CH2-Ph), 4.80 (dd, 1H, J5’,6a’ = 2.4 Hz, J6a’,6b’ = 12.4 Hz, H-6a’), 4.47 (d, 1H, J = 11.6 Hz, CH2-Ph), 4.42 (dd, 1H, J5’,6b’ = 6.0 Hz, J6a’,6b’ = 12.4 Hz, H-6b’), 4.34 (d, 1H, J1,2 = 8.0 Hz, H-1), 4.05-4.13 (m, 2H, H-5’, H-4), 3.78 (br s, 2H, H-6a, H-6b), 3.67-3.72 (m, 2H, H-3, C3-OH ), 3.50 (br t, 1H, H-2), 3.23 (br d, 1H, H-5), 2.54 (s, 1H, C2-OH), 1.06 (s, 9H, Si-C(CH3)3)
13C-NMR (CDCl3, 100MHz) :δ 166.05, 165.59, 165.16, 164.80, 136.94, 135.94, 135.39, 133.74, 133.61, 133.33, 132.38, 130,05, 129.95, 129.88, 129.83, 129.70, 129.30, 128.59, 128.47, 128.40, 128.31, 128.02, 127.93, 127.64, 100.76, 100.66, 78.36, 74.46, 74.08, 73.91, 72.87, 72.58, 71.51, 70.41, 69.18, 62.33, 61.39, 69.14, 26.77 (Si-C(CH3)3), 19.50 (Si-C(CH3)3)
【００３８】
５−２．化合物（１１）を糖鎖受容体とした場合のグリコシル化反応の位置選択性
【化２１】
アルゴン雰囲気下、糖鎖供与体（１４）（７３４ｍｇ，０．９９ｍｍｏｌ）、糖鎖受容体（１１）（６６０ｍｇ，０．９０ｍｍｏｌ）をｄｒｙ−ジクロロメタン（１８ｍｌ）に溶解させ、ＭＳ４Å（１０００ｍｇ）を加えて室温で１時間攪拌した。その後、溶液を０℃まで冷却し、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（４４．０μｌ，０．２４ｍｍｏｌ）を加え３０分攪拌した。反応終了後、トリエチルアミン（１．００ｍｌ）を加えフィルター濾過し、濃縮した後にフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝４０：１）で精製し、１→２結合異性体（３０８ｍｇ，２６％）、１→３結合異性体（７１１ｍｇ，６０％）を得た。生成物はいずれも非晶質として得られた。
1→2 linked isomer
Rf 0.25 [2:1 (v/v) hexane-ethyl acetate]
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) :δ 7.24-7.55, 7.81-7.85, 7.95-7.98 (each m, 31H, Ph), 5.87 (t, 1H, J2’,3’ = 9.5 Hz, J3’,4’ = 9.5 Hz, H-3’), 5.70 (t, 1H, J3’,4’ = 9.5 Hz, J4’,5’ = 10 Hz, H-4’), 5.51 (dd, 1H, J1’,2’ = 8.0 Hz, J2’,3’ = 9.5 Hz, H-2’), 5.22 (d, 1H, J1’,2’ = 8.0 Hz, H-1’), 4.88 (d, 1H, J = 12 Hz, CH2-Ph), 4.56 (d, 1H, J = 12 Hz, CH2-Ph), 4.53 (d, 1H, J1,2 = 7.5 Hz, H-1), 4.41 (dd, 1H, J5’,6a’ = 3.5 Hz, J6a’,6b’ = 12.5 Hz, H-6a’), 4.22 (dd, 1H, J5’,6b’ = 3.5 Hz, J6a’,6b’ = 12.5 Hz, H-6b’), 3.89-3.91 (m, 2H, H-6a, H-6b), 3.83 (tt, 1H, J4’,5’ = 10 Hz, J5’,6a’ = J5’,6b’ = 3.5 Hz, H-5’), 3.50-3.61 (m, 3H, H-2, H-3, H-4), 3.37-3.41 (m, 1H, H-5), 3.17 (d, 1H, OH ), 2.72 (d, 1H, OH ), 1.29, 1.30 (each s, 36H, Ph-C(CH 3)3), 0.99 (s, 9H, Si-C(CH3)3)
1→3 linked isomer
Rf 0.32 [2:1 (v/v) hexane-ethyl acetate]
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) :δ 7.23-7.52, 7.60-7.61, 7.80-8.00 (each m, 31H, Ph), 5.92 (t, 1H, J2’,3’ = 9.5 Hz, J3’,4’ = 9.5 Hz, H-3’), 5.63 (t, 1H, J3’,4’ = 9.5 Hz, J4’,5’ = 10 Hz, H-4’), 5.56 (dd, 1H, J1’,2’ = 8.0 Hz, J2’,3’ = 9.5 Hz, H-2’), 5.07 (d, 1H, J1’,2’ = 8.0 Hz, H-1’), 4.86 (d, 1H, J = 11.5 Hz, CH2-Ph), 4.73 (dd, 1H, J5’,6a’ = 2.5 Hz, J6a’,6b’ = 12.5 Hz, H-6a’), 4.54 (d, 1H, J = 11.5 Hz, CH2-Ph), 4.37 (dd, 1H, J5’,6b’ = 6.0 Hz, J6a’,6b’ = 12.5 Hz, H-6b’), 4.29 (d, 1H, J1,2 = 8.0 Hz, H-1), 4.17-4.21 (m, 1H, H-5’), 4.11 (dd, 1H, J5,6b = 2.0 Hz, J6a,6b = 11 Hz, H-6a), 4.11 (dd, 1H, J5,6b = 6.5 Hz, J6a,6b = 11 Hz, H-6b), 3.57-3.60 (m, 2H, H-4, C4-OH ), 3.52 (t, 1H, J2,3 = 8.5 Hz, J3,4 = 9.0 Hz, H-3), 3.41-3.45 (m, 2H, H-2, H-5), 2.10 (d, 1H, C2-OH ), 1.29, 1.30 (each s, 36H, Ph-C(CH 3)3), 1.02 (s, 9H, Si-C(CH3)3)
13C-NMR (CDCl3, 100MHz) :δ 166.10, 165.71, 165.20, 163.55, 149.26, 136.84, 133.55, 133.27, 132.25, 129.89, 129.85, 129,77, 129.73, 129.59, 129.12, 129.02, 128.68, 128.57, 128.41, 128.27, 128.21, 127.93, 125.28, 123.24, 123.16, 102.43, 101.08, 88.28, 72.82, 72.65, 72.57, 71.80, 70.49, 69.42, 69.13, 63.58, 62.77, 34.78, 31.51, 26.78, 19.18
【００３９】
上記５−１及び５−２の結果を下記の表に示す。
【表１】
表より、保護基として、より嵩高いｔＢｕ（Ｄｂｐ）２Ｓｉ基をＣ−６位に導入すると、Ｃ−４位におけるグリコシル化反応は生じず、Ｃ−３位及びＣ−２位におけるグリコシル化反応が選択的に生じていた。一方、従来から用いられているＴＢＤＰＳ基を保護基として用いた場合は、Ｃ−３位の反応性が比較的高いものの、Ｃ−４位における反応もある程度生じている。
この結果から、嵩高い保護基を導入した糖鎖受容体は、グリコシル化反応の位置選択性が増大していることが確認された。つまり、嵩高い置換基に隣接する水酸基へのグリコシル化反応が抑制されることになる。また、本発明の糖鎖受容体（化合物（１１））のＣ−２位又はＣ−３位を従来の保護基、例えば、ベンジル基やアセチル基で保護すると、他方の遊離水酸基について、選択的にグリコシル化反応を生じさせることが可能である。
また、ＴＢＤＰＳとｔＢｕ（Ｄｂｐ）２Ｓｉの保護基の嵩高さを分子軌道法で計算すると（ソフトウェア：Ｃｈｅｍ３Ｄ（ChembridgeSoft）を使用）、各々、約５．７３６Å、約７．２４３Åとなる。従って、本発明の「嵩高い保護基」としては、その保護基の嵩高さが少なくとも６．０Å以上あるものが望ましい。
【００４０】
なお、ｔＢｕ（Ｄｂｐ）２Ｓｉ基で糖鎖受容体を保護した後得られたオリゴ糖からの脱保護は、従来の方法により下記の様に、容易に行うことができる。
ビス（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−ｔｅｒｔ−ブチルシリル基の脱保護
【化２２】
アルゴン雰囲気下、化合物（１６）（３００ｍｇ，０．２３ｍｌ）、酢酸（０．０２ｍｌ，０．３５ｍｍｏｌ）をｄｒｙ−ＴＨＦ（５ｍｌ）に溶解させ、フッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム（０．５６ｍｌ，０．５６ｍｍｏｌ）を加えて室温で一晩攪拌した。反応終了後、酢酸エチルを用いて有機層を抽出し、水、飽和食塩水で順次洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。有機層を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝３：１→１：３）で精製し、化合物（１７）（１３９ｍｇ，７１％）を得た。
Rf 0.76 [1:3 (v/v) hexane-ethyl acetate]
1H-NMR (CDCl3, 200MHz) :δ 7.21-7.61, 7.79-7.84, 7.89-7.98, 8.06-8.10 (each m, 25H, Ph), 5.93 (t, 1H, J2’,3’ = 9.6 Hz, J3’,4’ = 9.6 Hz, H-3’), 5.61 (t, 1H, J3’,4’ = 9.6 Hz, J4’,5’ = 10.2 Hz, H-4’), 5.58 (dd, 1H, J1’,2’ = 7.8 Hz, J2’,3’ = 9.6 Hz, H-2’), 5.01 (d, 1H, J1’,2’ = 7.8 Hz, H-1’), 4.83 (d, 1H, J = 11.8 Hz, CH2-Ph), 4.78 (dd, 1H, J5’,6a’ = 2.4 Hz, J6a’,6b’ = 12.2 Hz, H-6a’), 4.58 (d, 1H, J = 11.6 Hz, CH2-Ph), 4.17-4.42 (m, 3H, H-1, H-6a, H-6b’), 3.27-3.93 (m, 7H, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6b, OH ), 1.98-2.04 (m, 2H, OH )
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明により、グリコシル化反応の位置選択性を高めることが可能となるため、所望の構造を有する糖鎖を製造する技術のさらなる進展に寄与することが期待できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖の少なくとも１つの遊離水酸基に嵩高い保護基を導入することにより、該遊離水酸基及び該遊離水酸基に近接する遊離水酸基以外の遊離水酸基選択的にグリコシル化反応が起こる糖鎖受容体を製造する方法
【請求項２】
前記保護基が以下の式（Ｉ）であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【化１】
［式（Ｉ）において、Ｒ１は、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ネオペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、イソアミル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、ｓｅｃ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基であり、ｎは０又は１若しくは２の整数である。また、Ｘは式（ＩＩ）の置換基、
【化２】
（式（ＩＩ）において、Ｒ２は、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ネオペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、イソアミル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、ｓｅｃ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基であり、ｍは１〜３のいずれかの整数であり、Ｒ２とベンゼン環の間には、エーテル結合、チオエーテル結合を含んでも良い）、
又は、アダマンチル基であり、 Ｅは、ケイ素又はゲルマニウムである］
【請求項３】
前記Ｒ１がｔｅｒｔ−ブチル基、Ｅがケイ素、ＸはＲ２がｔｅｒｔ−ブチル基でありｍが２であってメタ位に結合している式（ＩＩ）の置換基であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記保護基の導入位置が糖鎖受容体のＣ−６位であり、反応性が抑制される位置がＣ−４位であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
位置選択的なグリコシル化反応が糖鎖受容体のＣ−３位及び／又はＣ−２位で生じることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記糖鎖受容体が結晶質であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかの方法により製造される糖鎖受容体。
【請求項８】
以下の式（Ｉ）で示される糖鎖受容体用保護基。
【化３】
［式（Ｉ）において、Ｒ１は、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ネオペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、イソアミル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、ｓｅｃ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基であり、ｎは０又は１若しくは２の整数である。また、Ｘは式（ＩＩ）の置換基、
【化４】
（式（ＩＩ）において、Ｒ２は、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ネオペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、イソアミル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、ｓｅｃ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基であり、ｍは１〜３のいずれかの整数であり、Ｒ２とベンゼン環の間には、エーテル結合、チオエーテル結合を含んでも良い）、
又は、アダマンチル基であり、 Ｅは、ケイ素又はゲルマニウムである］
【請求項９】
請求項７に記載の糖鎖受容体又は請求項８に記載の保護基を含んでなる糖鎖合成用試薬。
【請求項１】
糖の少なくとも１つの遊離水酸基に嵩高い保護基を導入することにより、該遊離水酸基及び該遊離水酸基に近接する遊離水酸基以外の遊離水酸基選択的にグリコシル化反応が起こる糖鎖受容体を製造する方法
【請求項２】
前記保護基が以下の式（Ｉ）であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【化１】
［式（Ｉ）において、Ｒ１は、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ネオペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、イソアミル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、ｓｅｃ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基であり、ｎは０又は１若しくは２の整数である。また、Ｘは式（ＩＩ）の置換基、
【化２】
（式（ＩＩ）において、Ｒ２は、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ネオペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、イソアミル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、ｓｅｃ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基であり、ｍは１〜３のいずれかの整数であり、Ｒ２とベンゼン環の間には、エーテル結合、チオエーテル結合を含んでも良い）、
又は、アダマンチル基であり、 Ｅは、ケイ素又はゲルマニウムである］
【請求項３】
前記Ｒ１がｔｅｒｔ−ブチル基、Ｅがケイ素、ＸはＲ２がｔｅｒｔ−ブチル基でありｍが２であってメタ位に結合している式（ＩＩ）の置換基であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記保護基の導入位置が糖鎖受容体のＣ−６位であり、反応性が抑制される位置がＣ−４位であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
位置選択的なグリコシル化反応が糖鎖受容体のＣ−３位及び／又はＣ−２位で生じることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記糖鎖受容体が結晶質であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかの方法により製造される糖鎖受容体。
【請求項８】
以下の式（Ｉ）で示される糖鎖受容体用保護基。
【化３】
［式（Ｉ）において、Ｒ１は、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ネオペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、イソアミル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、ｓｅｃ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基であり、ｎは０又は１若しくは２の整数である。また、Ｘは式（ＩＩ）の置換基、
【化４】
（式（ＩＩ）において、Ｒ２は、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ネオペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、イソアミル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、ｓｅｃ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基であり、ｍは１〜３のいずれかの整数であり、Ｒ２とベンゼン環の間には、エーテル結合、チオエーテル結合を含んでも良い）、
又は、アダマンチル基であり、 Ｅは、ケイ素又はゲルマニウムである］
【請求項９】
請求項７に記載の糖鎖受容体又は請求項８に記載の保護基を含んでなる糖鎖合成用試薬。
【公開番号】特開２０１２−２５０９３５（Ｐ２０１２−２５０９３５Ａ）
【公開日】平成２４年１２月２０日（２０１２．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１２４８６０（Ｐ２０１１−１２４８６０）
【出願日】平成２３年６月３日（２０１１．６．３）
【出願人】（５０４１９０５４８）国立大学法人埼玉大学 (292)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１２月２０日（２０１２．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年６月３日（２０１１．６．３）
【出願人】（５０４１９０５４８）国立大学法人埼玉大学 (292)
【Ｆターム（参考）】
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