簡易迅速培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法
【課題】 本発明では、培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法による微生物検査の簡易化および効率化をはかるための、メンブレンフィルターの扱いにくさを改善することを課題とする。
【解決手段】 培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法において、従来のメンブレンフィルターに代え、外枠付きメンブレンフィルターを使用することにより培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法を簡易化することに成功した。
【解決手段】 培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法において、従来のメンブレンフィルターに代え、外枠付きメンブレンフィルターを使用することにより培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法を簡易化することに成功した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品や環境分野等での微生物検査において様々な種類の微生物を検出対象にでき、検出対象微生物の数の測定を、迅速で、かつ、簡易に実施できる検査キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌、サルモネラ、リステリア、腸炎ビブリオ、腸内細菌など特定微生物の検出あるいは計数する微生物検査は、食品や環境中の衛生評価のために必須である。一般に、これらの検査は、培養法により行われ、陽性確定に至るまで複数の項目（増菌培養、分離培養、推定試験、確認試験）の実施と、それに伴う1日〜8日間の日数を要し、手間と時間とがかかった。
【０００３】
近年、検出対象微生物のrRNAの標的塩基配列の相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに蛍光物質を標識したもの（プローブ）を用いる蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法（Fluorescence in situ hybridization 法）により、試料中の検出対象微生物を迅速に検出あるいは計数する方法が開発された（非特許文献1Amann, R., Snaidr, J., Wagner, M., Ludwig, W. and Schleifer, K.-H. (1996) In situ visualization of high genetic diversity in a natural microbial community. Journal of Bacteriology 178, 3496-3500.）。
【０００４】
本方法により、使用プローブの種類を変えることで様々な微生物をそれぞれ特定して検出および計数ができる。蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法による微生物の検出あるいは計数は、培養をせずに迅速（約5時間）に実施できる。この手法は主に微生物生態学の研究分野で用いられている。しかし、この方法は、検出された微生物の生死を区別できない（非特許文献2：Tolker-Nielsen, T., Larsen, M. H., Kyed, H. and Molin, S. (1997) Effect of stress treatments on the detection of Salmonella typhimurium by in situ hybridization. International Journal of Food Microbiology 35, 251-258）。また、試料のおかれた環境により検出対象細菌細胞内のｒRNAコピー数が少なくなった場合、検出対象細菌を検出できないなどの問題があり（非特許文献3：Amann, R. I., Ludwig, W. and Schleifer, K.-H. (1995) Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59, 143-169.）、細菌検査への応用は困難であった。
【０００５】
一方、本発明者らは、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法の細菌検査への応用の問題を解決するために、培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法を開発した（非特許文献4：Ootsubo et al. Journal of Applied Microbiology 2003, 95, 1182-1190）。この方法は、微生物懸濁試料を濾過しメンブレンフィルター上に微生物を捕集後、培養して微生物のマイクロコロニーを形成させた後に、蛍光インサイチューハイブリダーゼーションさせるものである。
【０００６】
培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法は、従来の蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法に比較し、（イ）培養によりメンブレンフィルター上に微生物のマイクロコロニーが形成されれば、微生物が生存していることを確認でき、（ロ）試料中の微生物細胞内ｒRNAコピー数が少なくなった場合でも、培養により、微生物細胞内ｒRNAコピー数が増加し、検出対象微生物の強い蛍光シグナルが得られ、検出および計数が可能となるという利点がある。
【０００７】
なお、特表2003-530830（特許文献1）では、微生物の保持に適した膜で液体サンプルを濾過し、これをインキュベートし、存在する微生物コロニーにPNAハイブリダイゼーションを適応し、微生物を計数し同定するための方法が記載されている。しかしながら、PNAを用いるために擬陽性が発生することが指摘され、計数に大きく影響するものである。これに対し、上述した培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法は、蛍光標識DNAオリゴヌレオチドプローブを用いているが擬陽性はほとんどなく計数に影響をあたえない。
【０００８】
【特許文献１】特表2003-530830
【非特許文献１】Amann, R., Snaidr, J., Wagner, M., Ludwig, W. and Schleifer, K.-H. (1996) In situ visualization of high genetic diversity in a natural microbial community. Journal of Bacteriology 178, 3496-3500.
【非特許文献２】Tolker-Nielsen, T., Larsen, M. H., Kyed, H. and Molin, S. (1997) Effect of stress treatments on the detection of Salmonella typhimurium by in situ hybridization. International Journal of Food Microbiology 35, 251-258
【非特許文献３】Amann, R. I., Ludwig, W. and Schleifer, K.-H. (1995) Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59, 143-169.
【非特許文献４】Ootsubo etal. Journal of Applied Microbiology 2003, 95, 1182-1190
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法（以下培養併用FISH法と記されることもある）は、凡そ、（イ）微生物懸濁液試料のろ過、（ロ）寒天培地上での培養、（ハ）固定処理、（ニ）ハイブリダイゼーション、（ホ）洗浄、（ヘ）標本作成、及び（ト）蛍光顕微鏡を用いる観察、の一連の作業で進められている。
【００１０】
現状では、ポリカーボネート製やセルロースアセテート製のメンブレンフィルターに試料を捕集し、試料をメンブレンフィルター上に保持して上記（ロ）〜（ト）の作業を進めている。
【００１１】
しかしながら、（イ）微生物懸濁液試料のろ過においては、ファンネル、メンブレンフィルター、フィルターベース、クランプからなる減圧濾過ユニットの一式を組立て、濾過の準備をしなければならない。さらに濾過後、減圧濾過ユニットを分解し、フィルターを取り出さなければならない。これら濾過器の組立、分解は手間がかかる。さらに（ロ）寒天培地上での培養、（ハ）固定処理、（ニ）ハイブリダイゼーション、並びに（ホ）洗浄のそれぞれの作業では、工程が進むたびにピンセットを用いてメンブレンフィルターを移動しなければならない。このときメンブレンフィルターを落としたり、あるいは、傷つけたりしやすく、しかも表裏を間違える可能性が大きい。メンブレンは薄いため、そのままでは変形しやすく、扱いづらく、しわ状になり、計測に不適格となることもある。（ヘ）また、標本作成では、フィルターをスライドガラス上に置き、その上に封入剤を加え、次いでカバーガラスを被せこれを標本とする。その作業自体が手間となる。
【００１２】
以上のように、培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法の一連の操作には、作業者の熟練と手間を要するものとなっている。
【００１３】
そこで、本発明では、培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法による微生物検査の簡易化および効率化をはかるための、メンブレンフィルターの扱いにくさを改善することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法において、従来のメンブレンフィルターに代え、１．「外枠付きメンブレンフィルター」を使用することにより培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法を簡易化することに成功した。
【００１５】
また、従来型のメンブレンフィルターを吸引濾過器にセットするのに代え、２．外枠付きメンブレンフィルター及びパットがセットされた使い捨て濾過器を用いて、該方法をさらに簡易化することに成功した。
【発明の効果】
【００１６】
外枠付きメンブレンフィルターを用いる培養併用FISH法、及び使い捨て濾過器を用いる培養併用FISH法により、培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法の各工程（試料濾過、培養、固定、ハイブリダイゼーション、洗浄、蛍光観察）を簡易化できた。これにより、細菌検査が、従来の培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法による細菌検査より、作業能率が向上し、1日あたりの検査する試料の数をより多くすることができる。
【００１７】
従来の培養しない通常のFISHでは、蛍光スポットが小さいので、蛍光顕微鏡での観察においては40倍以上の対物レンズを用いなければならず、その場合、対物体レンズのワーキングディスタンスが1mm程度となり、たとえ外枠つきのメンブレンフィルターを用いたとしても液を保持するための枠に対物体レンズが接触することとなる。他方、外枠付きメンブレンフィルターを培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーションで用いることにより、マイクロコロニーが形成されるので、蛍光顕微鏡観察に低倍率の対物レンズを使用でき、低倍率レンズの使用により標本とレンズとの距離が大きくなるので、対物レンズにぶつからない高さの外枠つきメンブレンフィルターが観察に用いることができるようになる。これにより、外枠付きメンブレンフィルターに接触せずに蛍光顕微鏡で観察できることから、本願発明は、フィルターの全面積にわたりスポットを計測できるようになるという格段に優れた効果も奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本願発明は、これら培養併用インサイチューハイブリダイゼーション用外枠付きメンブレンフィルター又は使い捨て濾過器を用いた培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法を包含する。
【００１９】
更に、本願発明は、培養併用インサイチューハイブリダイゼーション用外枠付きメンブレンフィルターを包含する。本願発明には、培養併用インサイチューハイブリダイゼーション用外枠付きメンブレンフィルターが着脱可能である使い捨て濾過器を包含する。
【００２０】
本願発明の培養併用インサイチューハイブリダイゼーション用外枠付きメンブレンフィルター及び使い捨て濾過器は、好適には、蛍光標識したDNAオリゴヌクレオチドプローブを用いる培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法に用いることができるが、他の任意の標識、例えば、放射線標識培養併用インサイチューハイブリダイゼーションなどにも用いることができる。
【００２１】
以下に、培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法を中心に説明するが、他の標識の場合も同様に用いることができる。
【００２２】
１．外枠付きメンブレンフィルターを用いる培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法
（１）高さのある外枠付きメンブレンフィルター
メンブレンフィルターの少なくとも表側の面に、その外部に高さのある外枠（以下外枠と言う。）を設ける。
【００２３】
メンブレンフィルターの素材は、通常市販されているいずれのものでよく、例えば、ポリカーボネート又はセルロースアセテートを用いることができる。平均ポアサイズは、細菌を捕集できるように、0.2μm〜0.5μmが望ましい。フィルター面積は、任意でよいが、好適には300ｍｍ2〜2500mm2のものを用いることができる。またメンブレンフィルターの底面は、吸引濾過フィルターベースに設置でき、固体培養時に固体培地に密接でき、顕微鏡の操作台に設置できる形状であればよい。底面は、例えば、平面とできる。メンブレンフィルターの底面にも、必要に応じ、培地を含む容器を装着できる高さのある外枠を設けてもよい。
【００２４】
外枠の素材は、プラスチック、金属、セルロースなど、一定の硬さとフィルターをたるみなく張らせるための一定のテンションに耐えられる素材で液体が透過しない素材であればよい。外枠の高さは、対物レンズ（×２倍〜×10倍）を用いて外枠付フィルター面に焦点を合わせたとき、対物レンズが該外枠に接触しない高さで、通常の蛍光顕微鏡用であれば、例えば、3ｍｍ〜30ｍｍとすることができる（図1、図2）。
【００２５】
外枠の形状は、例えば、円柱状、四角などに形成でき任意であるが、円柱状の外枠とすることが望ましい。円柱状の外枠は、メンブレンフィルターの面積よりも開口部の面積が大きくなるように、例えば、ファンネル状、漏斗状に形成することもできる。また手で持ちやすいように外枠に把手部を設けることもできる。
【００２６】
また、外枠をメンブレンフィルターに付けることにより、一定量の液体をメンブレン上に収容可能であることができる（図1）。このように構成することでメンブレンフィルター上にハイブリダイゼーション用及び洗浄用の溶液が保持できるようになる。また、この外枠により、メンブレンフィルターはたるみのない状態で保持できる。つまり、外枠は、メンブレンフィルター上でハイブリダイゼーション及び洗浄が行うことができる程度の量の溶液をメンブレンフィルター上に収納可能で、しかもメンブレンフィルターがたるまないようにすることができる方法であれば、いかなる方法でメンブレンフィルターに取り付けてもよい。例えば、外枠をメンブレンフィルターに隙間なく直接に接着することもできるが、メンブレンフィルターの周囲にメンブレンフィルターをたるまないように保持する保持枠を設けその上に高さを持った外枠を設けることもできる。
【００２７】
外枠付きメンブレンフィルターとしては、メンブレンフィルターに外壁を設けた市販品、例えば、パーミアブルサポート（corning社）を用いることもできる。
【００２８】
（２）外枠付きメンブレンフィルターを用いる培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法
従来のメンブレンフィルターに代え、（１）「外枠付きメンブレンフィルター」を使用することにより、外枠付きメンブレンフィルター上に微生物を捕集し、当該外枠付きメンブレンフィルター上に微生物を保持したまま、微生物を培養し、固定化し、蛍光プローブとハイブリダイゼーション、洗浄し、蛍光顕微鏡で観察することができる。
以下、外枠を円柱状とした外枠を用いた場合について、具体的に説明する。他の形状でも同様である。
【００２９】
（イ）試料の濾過
外枠付きメンブレンフィルターを吸引濾過用フィルターベースに置き、試料液を濾過する。このとき、従来のメンブレンフィルターでの吸引濾過では事前に必要だったフィルターホルダー、メンブレンフィルター、吸引濾過用フィルターベース、クランプから構成される吸引濾過フィルターユニット一式の組立作業、また、濾過後の分解作業が不要となり、試料液の濾過が簡易にできる。
【００３０】
（ロ）培養
次にベース上の外枠付きメンブレンフィルターを固形の培地（ゲル状培地、あるいは液体培地を含む繊維状パット）の上に置き、フィルターの他方の面（裏側面）と培地を接触させる。所定条件で培養し、マイクロコロニーをフィルターの表側の面上に形成させる。例えば、外枠つきメンブレンフィルターを寒天培地上で、６時間程度培養することにより、マイクロコロニーをメンブレンフィルターの表側に形成させることができる。
【００３１】
従来は、濾過ユニット一式の分解作業後、ピンセットを用いて、メンブレンフィルターを、フィルターにしわが発生しないよう、寒天培地へ慎重に載せる必要があり、これらは作業に熟練と手間を要した。本願外枠付きメンブレンフィルターを用いることで、未熟練者であっても、微生物を捕集したメンブレンフィルターを吸引濾過用フィルターベースから固体培地に容易に移すことができる。
【００３２】
（ハ）固定
次に外枠付きメンブレンフィルターを適切な固定液（エタノールなど）に浸す。その後乾燥させる。このとき従来、試料濾過後のメンブレンフィルターは、外枠がないために、丸まる性質があり、固定後の乾燥において丸まらないように対応しなければならず、作業が煩雑で熟練を要していたが、枠を取り付けたメンブレンフィルターは丸まることがないので、簡易にできる。
【００３３】
（ニ）ハイブリダイゼーション
次に高さのある外枠付きフィルター上に特定細菌検出用プローブとハイブリダイゼーション緩衝液を添加し、所定の温度で反応させる。このとき枠はハイブリダイゼーション緩衝液をフィルター内に容量を維持できる効果を有する。従来は、メンブレンフィルターを、ピンセットを用いて、専用の容器に移し、その中でフィルターをハイブリダイゼーション緩衝液とプローブに浸して行う必要があった。
【００３４】
（ホ）洗浄
次に高さのある外枠付きフィルター上に洗浄液を添加し、所定の温度で反応させる。このとき枠は洗浄液をフィルター内にとどめる効果を有する。従来は、メンブレンフィルターを、ピンセットを用いて、専用の容器に移し、その中でフィルターを洗浄液に浸して行う必要があった。
【００３５】
（ヘ）標本作成
従来標本作成は、フィルターが丸まらず、平滑にするために必須で、その作業は手間だった。従来法では、フィルターをスライドガラス上に置き、その上に封入剤を加え、次いでカバーガラスを被せこれを標本としていた。しかし、本手法では、その作業は不要となる。
【００３６】
（ト）蛍光顕微鏡による観察
外枠付きメンブレンフィルターを取り出し、これを蛍光観察装置（蛍光顕微鏡など）に供し特定細菌の検出・計数する。
【００３７】
なお、この際、蛍光顕微鏡観察に低倍率の対物レンズを使用でき、低倍率レンズの使用により標本とレンズとの距離が大きくなるので、対物レンズにぶつからない高さの外枠つきメンブレンフィルターが観察に用いることができるようになる。これにより、外枠付きメンブレンフィルターに接触せずにフィルターの全面積にわたりスポットを計測できる。
【００３８】
２．培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法−２
（１）使い捨て濾過器
本発明の使い捨て濾過器は、上記1．（１）の「外枠付きメンブレンフィルター」が着脱可能で、該外枠付きメンブレンフィルターを取り付けることにより微生物を捕集できるものであればいずれの使い捨て濾過器であってもよい。さらに、本発明の使い捨て濾過器に、培地保持材を前記メンブレンフィルター下部に密接するように取り付け、本使い捨て濾過器の下部から培養液を注入することにより、メンブレンフィルター上に捕集し微生物を培養できる構造のものとすることもできる。例えば、外枠付きメンブレンフィルター及び該外枠付きメンブレンフィルターの裏面に密接するように培地保持材を収納でき（３１）、さらに使い捨て濾過器に下部（３２）に開口部を有し、該下面が培地保持材と液通可能である構造とすることができる。前記使い捨て濾過器下部の開口部は、蓋部材（３３）により開閉可能に構成することが望ましい（図３）。
【００３９】
外枠付きメンブレンフィルターとしては、前記した１．（１）の外枠付きメンブレンフィルター、好適には外枠つきメンブレンフィルターを用いることができる。
【００４０】
培地保持材は、培地に浸漬すると、培地を保持し、培地をメンブレンフィルターに供給できる材料であれば、いずれでもよく、例えば、繊維状物、あるいは多孔質状構造物、具体的には、パットで構成できる。
【００４１】
（２）使い捨て濾過器を用いる簡易な培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法
従来のメンブレンフィルターに代え、2．（１）の「使い捨て濾過器」を使用することにより、使い捨て濾過器内の外枠付きメンブレンフィルター上に微生物を捕集し、使い捨て濾過器内の当該外枠付きメンブレンフィルター上に微生物を保持したまま、微生物を培養し、固定化し、蛍光プローブとハイブリダイゼーション、洗浄し、該外枠付きメンブレンフィルターを使い捨て濾過器から取り外して蛍光顕微鏡で観察することができる。
【００４２】
（イ）試料の濾過
試料液を、使い捨てフィルター濾過器を用いて、濾過する。このとき、従来のメンブレンフィルターの吸引濾過前に必要だったフィルターホルダー、メンブレンフィルター、吸引濾過フィルターベース、クランプから構成される吸引濾過フィルターユニット一式の組立作業が不要となり、試料液の濾過が簡易にできる。
【００４３】
（ロ）培養
使い捨て濾過器の底辺部から培地成分を注入し、パットに培地をしみ込ませ所定条件で培養し、マイクロコロニーをフィルターの表の面に形成させる。その後、培地成分を吸引除去する。このとき従来は、フィルターホルダー、メンブレンフィルター、ベース、クランプから構成される吸引濾過フィルターユニット一式の分解作業、ならびにその後のメンブレンフィルターの寒天培地上への移動において、フィルターにしわが発生しないように行う慎重さが必要でこれらは作業がやりづらく手間がかかり、熟練が必要だが、これらは不要となる。
【００４４】
（ハ）固定
次に使い捨て濾過器の上部から適切な固定液（エタノールなど）を含ませ、その後乾燥させる。このとき従来、メンブレンフィルターを別容器に移し、その場において実施する必要があったが、使い捨て濾過器の場合は、フィルターの移動の必要がない。
【００４５】
（ニ）ハイブリダイゼーション
次に使い捨て濾過器に蛍光標識オリゴDNAヌクレオチドからなる特定細菌検出用プローブとハイブリダイゼーション緩衝液を含ませ、所定の温度で反応させる。従来は、メンブレンフィルターを専用の容器に移し、その中でフィルターをハイブリダイゼーション緩衝液とプローブに浸して行う必要があった。使い捨て濾過器の場合は、フィルターの移動の必要がない。
【００４６】
（ホ）洗浄
次に使い捨て濾過器に洗浄液を添加し、所定の温度で洗浄させる。従来は、メンブレンフィルターを専用の容器に移し、その中でフィルターを洗浄液に浸して行う必要があった。使い捨て濾過器の場合は、フィルターの移動の必要がない。
【００４７】
（ヘ）特定細菌の検出・計数
使い捨て濾過器から外枠付きメンブレンフィルターを取り出し、これを蛍光観察装置（蛍光顕微鏡など）に供し特定細菌の検出・計数する。このとき従来は、標本作成の工程が必要だったが、その作業は不要となる。
【００４８】
なお、この際、蛍光顕微鏡観察に低倍率の対物レンズを使用でき、低倍率レンズの使用により標本とレンズとの距離が大きくなるので、対物レンズにぶつからない高さの外枠つきメンブレンフィルターが観察に用いることができるようになる。これにより、外枠付きメンブレンフィルターに接触せずにフィルターの全面積にわたりスポットを計測できる。
【００４９】
以下に実施例を用いて、本願発明をより詳細に説明するが、本願発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５０】
外枠付きメンブレンフィルターを用いる簡易な培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法による簡易迅速な腸内細菌科細菌の検査
（１）方法
（イ）供試菌株 腸内細菌科細菌としてEscherichia coli ATCC11775を用いた。
（ロ）供試食品試料として、水産食品（タイ、イカ、ホタテ、スモークサーモン、すり身、マグロ）、食肉製品（豚肉、鳥カツレツ、ハム）野菜（キャベツ、レタス）、飲料水（ビール、オレンジジュース、サイダー）を用いた。飲料水を除く各食品試料の場合、試料10gに滅菌生理食塩水90ｍｌ加え（10倍希釈）、ストマッカーで懸濁後、これに供試菌株Escherichia coli ATCC11775を添加し、食品試料調製液として調製した。飲料水の場合は、試料を希釈せず、供試菌株Escherichia coli ATCC11775を直接添加して食品試料調製液として調製した。
【００５１】
（ロ）培養法
クロモカルトコリフォーム寒天培地（メルク社）を使用した。食品試料調製液1mlをシャーレに入れ、次に、煮沸溶解後50℃に保温したクロモカルトコリフォーム寒天培地をシャーレに注ぎ、混和し固化後、37℃、２４時間培養後、紫コロニーを大腸菌として計数した。
【００５２】
（ハ）簡易な培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法
外枠付きメンブレンフィルターとして、パーミアブルサポート（corning社）を用いた。食品試料調製液1mlを、メンブレンの直径が25mm、ポアサイズが0.4μmであるメンブレンフィルターを有するトランスウェルインサートで吸引濾過後、トランスウェルインサートを寒天培地上に置き、37℃，６時間、培養し、フィルター表面上にコロニーを形成させた。培養後、トランスウェルインサートを100%エタノールで浸潤させたろ紙上に置き、室温で細胞固定を５分間行った。次にトランスウェルインサートをマルチプルウェルに装着し、トランスウェルインサート内にハイブリダイゼーションバッファー（0.9M NaCl、20% formamide、200mM Tris-HCl (pH7.4)、0.01% SDS）900μlを静かに注入し60℃でプレハイブリダイゼーションを10分間行った。その後さらにTAMRA(N,N,N',N'-Tetramethyl-6-6carboxyrhodamine)で標識したオリゴDNAヌクレオチドからなる腸内細菌科細菌検出用プローブ[5'-TGCTCTCGCGAGGTCGCTTCTCTT-3']（特開2001−136969）を50 pmol添加し、60℃でハイブリダイゼーションを45分間行った。トランスウェルインサートを傾けてハイブリダイゼーションバッファーを除去後、洗浄用バッファー（（20mM Tris HCl (pH7.4)、180mM NaCl、0.01% SDS））5ｍｌを加え60℃、15分間静置した。トランスウェルインサートを傾け洗浄用バッファーを除き、蒸留水で同様の洗浄操作後(ただし、静置時間を数秒内とする)、トランスウェルインサートを蛍光顕微鏡ステージに直接置き、プローブ特有の赤色蛍光を発するコロニーを計数した。なお、蛍光顕微鏡観察は対物レンズ4倍を用いて行った。
【００５３】
（２）結果
（イ）外枠付きメンブレンフィルターを用いる簡易な培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法と培養法との測定結果比較
表題について、各種の食品試料調製液を用いて、行った。その結果（表１）、培養法での生菌数と外枠付きメンブレンフィルターを利用した培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション 法での生菌数には有意な差は認められなかった(P>0.05またはP>0.01)。従って、外枠付きメンブレンフィルターを用いる培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法は、正確な生菌数測定ができた。また、その操作は従来の培養蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法に比べ熟練の必要なく簡易に行うことができた。
【００５４】
【表１】
【実施例２】
【００５５】
使い捨て濾過器を用いる簡易な培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法による簡易迅速なClostridium perfringensの検査
表題についての実施例を以下に示す。
【００５６】
（１）方法
（イ）供試食品試料として、ひき肉を用いた。試料10gに滅菌生理食塩水90ｍｌ加え、ストマッカーで懸濁後、これに供試菌株Clostridium perfringens ATCC3624またはClostridium perfringens NCTC8679を添加し、ひき肉10倍希釈懸濁液を調製した。
【００５７】
（ロ）培養法
非選択培地にGAM寒天培地（日水製薬），選択培地にカナマイシン含CW寒天基礎培地（日水製薬）を使用した。Cl. perfringens懸濁液を10倍段階希釈し、0.1mlを寒天平板上に塗沫し37℃，24時間嫌気培養（アエロパック嫌気ジャー，三菱ガス化学）を行い、コロニーを計数した。
【００５８】
（ハ）簡易な培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法
ひき肉10倍希釈懸濁液1mlを簡易濾過器（例えば、外枠付きメンブレンフィルター（直径37mm，孔径0.45μm）を装着できるように改造した37mmモニター（ADVANTEC社）で濾過し、37mmモニターの底面側からGAM液体培地1mlを静かに注入した。これを37℃，7時間嫌気培養（アエロパック嫌気ジャー，三菱ガス化学）し、フィルター表面上にコロニーを形成させた。培養後、モニター内に残存する液体培地を吸引除去し、37mmモニター上部から100%エタノールを静かに注入し、室温で細胞固定を20分間行った。エタノールを吸引除去した後、ハイブリダイゼーションバッファー（0.9M NaCl、20% formamide、200mM Tris-HCl (pH7.4)、0.01% SDS）900μlを37mmモニター上部から静かにを注入し46℃でプレハイブリダイゼーションを10分間行った。その後さらにTAMRA(N,N,N',N'-Tetramethyl-6-6carboxyrhodamine）で標識したオリゴDNAヌクレオチドからなるCl. perfringens検出用プローブCLP-180[5'-AATGATGATGCCATCTTTCAACA-3']（特願2004−336584）を50pmol添加し、46℃でハイブリダイゼーションを45分間行った。ハイブリダイゼーションバッファーを吸引除去後、洗浄用バッファー（（20mM Tris HCl (pH7.4)、180mM NaCl、0.01% SDS））900μlを加え15分間静かに吸引洗浄した。乾燥後、37mmモニターから取り出した外枠付きメンブレンフィルターを蛍光顕微鏡ステージに直接置き、プローブ特有の赤色蛍光を発するコロニーを計数した。なお、蛍光顕微鏡観察は対物レンズ4倍を用いて行った。
【００５９】
（２）結果
（イ）使い捨て濾過器を用いる簡易な培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法と培養法との比較
使い捨て濾過器を用いる簡易な培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法と公定法に準拠した培養法として寒天平板塗抹法でのコロニー数の比較を、試料にClostridium perfringens添加ひき肉を用いて、行った。その結果（表２）、培養法での生菌数と37mmモニターシステムを利用した培養併用FISH (FISH-FC-Broth)法での生菌数には有意な差は認められなかった（P>0.05）。従って、使い捨て濾過器を用いる簡易な培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法は、正確な生菌数測定ができた。また、その操作は従来の培養蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法に比べ熟練の必要なく簡易に行うことができた。
【００６０】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】高さのある外枠付きメンブレンフィルター及び底面に培地を含む容器を装着できる高さのある外枠を設けた高さのある外枠付きメンブレンフィルター。
【図２】対物レンズを用いて外枠付フィルター面に焦点を合わせる時の対物体レンズと外枠付きメンブレンフィルターとの関係。
【図３】使い捨て濾過器、（３１）底面に外枠を有する培地保持材を設けた高さのある外枠付きメンブレンフィルター、（３２）濾過器下部の開口部、（３３）蓋部材
【配列表フリーテキスト】
【００６２】
ST.25の数字見出し<233>（他の情報の内容）を日本語で記載
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品や環境分野等での微生物検査において様々な種類の微生物を検出対象にでき、検出対象微生物の数の測定を、迅速で、かつ、簡易に実施できる検査キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌、サルモネラ、リステリア、腸炎ビブリオ、腸内細菌など特定微生物の検出あるいは計数する微生物検査は、食品や環境中の衛生評価のために必須である。一般に、これらの検査は、培養法により行われ、陽性確定に至るまで複数の項目（増菌培養、分離培養、推定試験、確認試験）の実施と、それに伴う1日〜8日間の日数を要し、手間と時間とがかかった。
【０００３】
近年、検出対象微生物のrRNAの標的塩基配列の相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに蛍光物質を標識したもの（プローブ）を用いる蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法（Fluorescence in situ hybridization 法）により、試料中の検出対象微生物を迅速に検出あるいは計数する方法が開発された（非特許文献1Amann, R., Snaidr, J., Wagner, M., Ludwig, W. and Schleifer, K.-H. (1996) In situ visualization of high genetic diversity in a natural microbial community. Journal of Bacteriology 178, 3496-3500.）。
【０００４】
本方法により、使用プローブの種類を変えることで様々な微生物をそれぞれ特定して検出および計数ができる。蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法による微生物の検出あるいは計数は、培養をせずに迅速（約5時間）に実施できる。この手法は主に微生物生態学の研究分野で用いられている。しかし、この方法は、検出された微生物の生死を区別できない（非特許文献2：Tolker-Nielsen, T., Larsen, M. H., Kyed, H. and Molin, S. (1997) Effect of stress treatments on the detection of Salmonella typhimurium by in situ hybridization. International Journal of Food Microbiology 35, 251-258）。また、試料のおかれた環境により検出対象細菌細胞内のｒRNAコピー数が少なくなった場合、検出対象細菌を検出できないなどの問題があり（非特許文献3：Amann, R. I., Ludwig, W. and Schleifer, K.-H. (1995) Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59, 143-169.）、細菌検査への応用は困難であった。
【０００５】
一方、本発明者らは、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法の細菌検査への応用の問題を解決するために、培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法を開発した（非特許文献4：Ootsubo et al. Journal of Applied Microbiology 2003, 95, 1182-1190）。この方法は、微生物懸濁試料を濾過しメンブレンフィルター上に微生物を捕集後、培養して微生物のマイクロコロニーを形成させた後に、蛍光インサイチューハイブリダーゼーションさせるものである。
【０００６】
培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法は、従来の蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法に比較し、（イ）培養によりメンブレンフィルター上に微生物のマイクロコロニーが形成されれば、微生物が生存していることを確認でき、（ロ）試料中の微生物細胞内ｒRNAコピー数が少なくなった場合でも、培養により、微生物細胞内ｒRNAコピー数が増加し、検出対象微生物の強い蛍光シグナルが得られ、検出および計数が可能となるという利点がある。
【０００７】
なお、特表2003-530830（特許文献1）では、微生物の保持に適した膜で液体サンプルを濾過し、これをインキュベートし、存在する微生物コロニーにPNAハイブリダイゼーションを適応し、微生物を計数し同定するための方法が記載されている。しかしながら、PNAを用いるために擬陽性が発生することが指摘され、計数に大きく影響するものである。これに対し、上述した培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法は、蛍光標識DNAオリゴヌレオチドプローブを用いているが擬陽性はほとんどなく計数に影響をあたえない。
【０００８】
【特許文献１】特表2003-530830
【非特許文献１】Amann, R., Snaidr, J., Wagner, M., Ludwig, W. and Schleifer, K.-H. (1996) In situ visualization of high genetic diversity in a natural microbial community. Journal of Bacteriology 178, 3496-3500.
【非特許文献２】Tolker-Nielsen, T., Larsen, M. H., Kyed, H. and Molin, S. (1997) Effect of stress treatments on the detection of Salmonella typhimurium by in situ hybridization. International Journal of Food Microbiology 35, 251-258
【非特許文献３】Amann, R. I., Ludwig, W. and Schleifer, K.-H. (1995) Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59, 143-169.
【非特許文献４】Ootsubo etal. Journal of Applied Microbiology 2003, 95, 1182-1190
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法（以下培養併用FISH法と記されることもある）は、凡そ、（イ）微生物懸濁液試料のろ過、（ロ）寒天培地上での培養、（ハ）固定処理、（ニ）ハイブリダイゼーション、（ホ）洗浄、（ヘ）標本作成、及び（ト）蛍光顕微鏡を用いる観察、の一連の作業で進められている。
【００１０】
現状では、ポリカーボネート製やセルロースアセテート製のメンブレンフィルターに試料を捕集し、試料をメンブレンフィルター上に保持して上記（ロ）〜（ト）の作業を進めている。
【００１１】
しかしながら、（イ）微生物懸濁液試料のろ過においては、ファンネル、メンブレンフィルター、フィルターベース、クランプからなる減圧濾過ユニットの一式を組立て、濾過の準備をしなければならない。さらに濾過後、減圧濾過ユニットを分解し、フィルターを取り出さなければならない。これら濾過器の組立、分解は手間がかかる。さらに（ロ）寒天培地上での培養、（ハ）固定処理、（ニ）ハイブリダイゼーション、並びに（ホ）洗浄のそれぞれの作業では、工程が進むたびにピンセットを用いてメンブレンフィルターを移動しなければならない。このときメンブレンフィルターを落としたり、あるいは、傷つけたりしやすく、しかも表裏を間違える可能性が大きい。メンブレンは薄いため、そのままでは変形しやすく、扱いづらく、しわ状になり、計測に不適格となることもある。（ヘ）また、標本作成では、フィルターをスライドガラス上に置き、その上に封入剤を加え、次いでカバーガラスを被せこれを標本とする。その作業自体が手間となる。
【００１２】
以上のように、培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法の一連の操作には、作業者の熟練と手間を要するものとなっている。
【００１３】
そこで、本発明では、培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法による微生物検査の簡易化および効率化をはかるための、メンブレンフィルターの扱いにくさを改善することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法において、従来のメンブレンフィルターに代え、１．「外枠付きメンブレンフィルター」を使用することにより培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法を簡易化することに成功した。
【００１５】
また、従来型のメンブレンフィルターを吸引濾過器にセットするのに代え、２．外枠付きメンブレンフィルター及びパットがセットされた使い捨て濾過器を用いて、該方法をさらに簡易化することに成功した。
【発明の効果】
【００１６】
外枠付きメンブレンフィルターを用いる培養併用FISH法、及び使い捨て濾過器を用いる培養併用FISH法により、培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法の各工程（試料濾過、培養、固定、ハイブリダイゼーション、洗浄、蛍光観察）を簡易化できた。これにより、細菌検査が、従来の培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法による細菌検査より、作業能率が向上し、1日あたりの検査する試料の数をより多くすることができる。
【００１７】
従来の培養しない通常のFISHでは、蛍光スポットが小さいので、蛍光顕微鏡での観察においては40倍以上の対物レンズを用いなければならず、その場合、対物体レンズのワーキングディスタンスが1mm程度となり、たとえ外枠つきのメンブレンフィルターを用いたとしても液を保持するための枠に対物体レンズが接触することとなる。他方、外枠付きメンブレンフィルターを培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーションで用いることにより、マイクロコロニーが形成されるので、蛍光顕微鏡観察に低倍率の対物レンズを使用でき、低倍率レンズの使用により標本とレンズとの距離が大きくなるので、対物レンズにぶつからない高さの外枠つきメンブレンフィルターが観察に用いることができるようになる。これにより、外枠付きメンブレンフィルターに接触せずに蛍光顕微鏡で観察できることから、本願発明は、フィルターの全面積にわたりスポットを計測できるようになるという格段に優れた効果も奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本願発明は、これら培養併用インサイチューハイブリダイゼーション用外枠付きメンブレンフィルター又は使い捨て濾過器を用いた培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法を包含する。
【００１９】
更に、本願発明は、培養併用インサイチューハイブリダイゼーション用外枠付きメンブレンフィルターを包含する。本願発明には、培養併用インサイチューハイブリダイゼーション用外枠付きメンブレンフィルターが着脱可能である使い捨て濾過器を包含する。
【００２０】
本願発明の培養併用インサイチューハイブリダイゼーション用外枠付きメンブレンフィルター及び使い捨て濾過器は、好適には、蛍光標識したDNAオリゴヌクレオチドプローブを用いる培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法に用いることができるが、他の任意の標識、例えば、放射線標識培養併用インサイチューハイブリダイゼーションなどにも用いることができる。
【００２１】
以下に、培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法を中心に説明するが、他の標識の場合も同様に用いることができる。
【００２２】
１．外枠付きメンブレンフィルターを用いる培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法
（１）高さのある外枠付きメンブレンフィルター
メンブレンフィルターの少なくとも表側の面に、その外部に高さのある外枠（以下外枠と言う。）を設ける。
【００２３】
メンブレンフィルターの素材は、通常市販されているいずれのものでよく、例えば、ポリカーボネート又はセルロースアセテートを用いることができる。平均ポアサイズは、細菌を捕集できるように、0.2μm〜0.5μmが望ましい。フィルター面積は、任意でよいが、好適には300ｍｍ2〜2500mm2のものを用いることができる。またメンブレンフィルターの底面は、吸引濾過フィルターベースに設置でき、固体培養時に固体培地に密接でき、顕微鏡の操作台に設置できる形状であればよい。底面は、例えば、平面とできる。メンブレンフィルターの底面にも、必要に応じ、培地を含む容器を装着できる高さのある外枠を設けてもよい。
【００２４】
外枠の素材は、プラスチック、金属、セルロースなど、一定の硬さとフィルターをたるみなく張らせるための一定のテンションに耐えられる素材で液体が透過しない素材であればよい。外枠の高さは、対物レンズ（×２倍〜×10倍）を用いて外枠付フィルター面に焦点を合わせたとき、対物レンズが該外枠に接触しない高さで、通常の蛍光顕微鏡用であれば、例えば、3ｍｍ〜30ｍｍとすることができる（図1、図2）。
【００２５】
外枠の形状は、例えば、円柱状、四角などに形成でき任意であるが、円柱状の外枠とすることが望ましい。円柱状の外枠は、メンブレンフィルターの面積よりも開口部の面積が大きくなるように、例えば、ファンネル状、漏斗状に形成することもできる。また手で持ちやすいように外枠に把手部を設けることもできる。
【００２６】
また、外枠をメンブレンフィルターに付けることにより、一定量の液体をメンブレン上に収容可能であることができる（図1）。このように構成することでメンブレンフィルター上にハイブリダイゼーション用及び洗浄用の溶液が保持できるようになる。また、この外枠により、メンブレンフィルターはたるみのない状態で保持できる。つまり、外枠は、メンブレンフィルター上でハイブリダイゼーション及び洗浄が行うことができる程度の量の溶液をメンブレンフィルター上に収納可能で、しかもメンブレンフィルターがたるまないようにすることができる方法であれば、いかなる方法でメンブレンフィルターに取り付けてもよい。例えば、外枠をメンブレンフィルターに隙間なく直接に接着することもできるが、メンブレンフィルターの周囲にメンブレンフィルターをたるまないように保持する保持枠を設けその上に高さを持った外枠を設けることもできる。
【００２７】
外枠付きメンブレンフィルターとしては、メンブレンフィルターに外壁を設けた市販品、例えば、パーミアブルサポート（corning社）を用いることもできる。
【００２８】
（２）外枠付きメンブレンフィルターを用いる培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法
従来のメンブレンフィルターに代え、（１）「外枠付きメンブレンフィルター」を使用することにより、外枠付きメンブレンフィルター上に微生物を捕集し、当該外枠付きメンブレンフィルター上に微生物を保持したまま、微生物を培養し、固定化し、蛍光プローブとハイブリダイゼーション、洗浄し、蛍光顕微鏡で観察することができる。
以下、外枠を円柱状とした外枠を用いた場合について、具体的に説明する。他の形状でも同様である。
【００２９】
（イ）試料の濾過
外枠付きメンブレンフィルターを吸引濾過用フィルターベースに置き、試料液を濾過する。このとき、従来のメンブレンフィルターでの吸引濾過では事前に必要だったフィルターホルダー、メンブレンフィルター、吸引濾過用フィルターベース、クランプから構成される吸引濾過フィルターユニット一式の組立作業、また、濾過後の分解作業が不要となり、試料液の濾過が簡易にできる。
【００３０】
（ロ）培養
次にベース上の外枠付きメンブレンフィルターを固形の培地（ゲル状培地、あるいは液体培地を含む繊維状パット）の上に置き、フィルターの他方の面（裏側面）と培地を接触させる。所定条件で培養し、マイクロコロニーをフィルターの表側の面上に形成させる。例えば、外枠つきメンブレンフィルターを寒天培地上で、６時間程度培養することにより、マイクロコロニーをメンブレンフィルターの表側に形成させることができる。
【００３１】
従来は、濾過ユニット一式の分解作業後、ピンセットを用いて、メンブレンフィルターを、フィルターにしわが発生しないよう、寒天培地へ慎重に載せる必要があり、これらは作業に熟練と手間を要した。本願外枠付きメンブレンフィルターを用いることで、未熟練者であっても、微生物を捕集したメンブレンフィルターを吸引濾過用フィルターベースから固体培地に容易に移すことができる。
【００３２】
（ハ）固定
次に外枠付きメンブレンフィルターを適切な固定液（エタノールなど）に浸す。その後乾燥させる。このとき従来、試料濾過後のメンブレンフィルターは、外枠がないために、丸まる性質があり、固定後の乾燥において丸まらないように対応しなければならず、作業が煩雑で熟練を要していたが、枠を取り付けたメンブレンフィルターは丸まることがないので、簡易にできる。
【００３３】
（ニ）ハイブリダイゼーション
次に高さのある外枠付きフィルター上に特定細菌検出用プローブとハイブリダイゼーション緩衝液を添加し、所定の温度で反応させる。このとき枠はハイブリダイゼーション緩衝液をフィルター内に容量を維持できる効果を有する。従来は、メンブレンフィルターを、ピンセットを用いて、専用の容器に移し、その中でフィルターをハイブリダイゼーション緩衝液とプローブに浸して行う必要があった。
【００３４】
（ホ）洗浄
次に高さのある外枠付きフィルター上に洗浄液を添加し、所定の温度で反応させる。このとき枠は洗浄液をフィルター内にとどめる効果を有する。従来は、メンブレンフィルターを、ピンセットを用いて、専用の容器に移し、その中でフィルターを洗浄液に浸して行う必要があった。
【００３５】
（ヘ）標本作成
従来標本作成は、フィルターが丸まらず、平滑にするために必須で、その作業は手間だった。従来法では、フィルターをスライドガラス上に置き、その上に封入剤を加え、次いでカバーガラスを被せこれを標本としていた。しかし、本手法では、その作業は不要となる。
【００３６】
（ト）蛍光顕微鏡による観察
外枠付きメンブレンフィルターを取り出し、これを蛍光観察装置（蛍光顕微鏡など）に供し特定細菌の検出・計数する。
【００３７】
なお、この際、蛍光顕微鏡観察に低倍率の対物レンズを使用でき、低倍率レンズの使用により標本とレンズとの距離が大きくなるので、対物レンズにぶつからない高さの外枠つきメンブレンフィルターが観察に用いることができるようになる。これにより、外枠付きメンブレンフィルターに接触せずにフィルターの全面積にわたりスポットを計測できる。
【００３８】
２．培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法−２
（１）使い捨て濾過器
本発明の使い捨て濾過器は、上記1．（１）の「外枠付きメンブレンフィルター」が着脱可能で、該外枠付きメンブレンフィルターを取り付けることにより微生物を捕集できるものであればいずれの使い捨て濾過器であってもよい。さらに、本発明の使い捨て濾過器に、培地保持材を前記メンブレンフィルター下部に密接するように取り付け、本使い捨て濾過器の下部から培養液を注入することにより、メンブレンフィルター上に捕集し微生物を培養できる構造のものとすることもできる。例えば、外枠付きメンブレンフィルター及び該外枠付きメンブレンフィルターの裏面に密接するように培地保持材を収納でき（３１）、さらに使い捨て濾過器に下部（３２）に開口部を有し、該下面が培地保持材と液通可能である構造とすることができる。前記使い捨て濾過器下部の開口部は、蓋部材（３３）により開閉可能に構成することが望ましい（図３）。
【００３９】
外枠付きメンブレンフィルターとしては、前記した１．（１）の外枠付きメンブレンフィルター、好適には外枠つきメンブレンフィルターを用いることができる。
【００４０】
培地保持材は、培地に浸漬すると、培地を保持し、培地をメンブレンフィルターに供給できる材料であれば、いずれでもよく、例えば、繊維状物、あるいは多孔質状構造物、具体的には、パットで構成できる。
【００４１】
（２）使い捨て濾過器を用いる簡易な培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法
従来のメンブレンフィルターに代え、2．（１）の「使い捨て濾過器」を使用することにより、使い捨て濾過器内の外枠付きメンブレンフィルター上に微生物を捕集し、使い捨て濾過器内の当該外枠付きメンブレンフィルター上に微生物を保持したまま、微生物を培養し、固定化し、蛍光プローブとハイブリダイゼーション、洗浄し、該外枠付きメンブレンフィルターを使い捨て濾過器から取り外して蛍光顕微鏡で観察することができる。
【００４２】
（イ）試料の濾過
試料液を、使い捨てフィルター濾過器を用いて、濾過する。このとき、従来のメンブレンフィルターの吸引濾過前に必要だったフィルターホルダー、メンブレンフィルター、吸引濾過フィルターベース、クランプから構成される吸引濾過フィルターユニット一式の組立作業が不要となり、試料液の濾過が簡易にできる。
【００４３】
（ロ）培養
使い捨て濾過器の底辺部から培地成分を注入し、パットに培地をしみ込ませ所定条件で培養し、マイクロコロニーをフィルターの表の面に形成させる。その後、培地成分を吸引除去する。このとき従来は、フィルターホルダー、メンブレンフィルター、ベース、クランプから構成される吸引濾過フィルターユニット一式の分解作業、ならびにその後のメンブレンフィルターの寒天培地上への移動において、フィルターにしわが発生しないように行う慎重さが必要でこれらは作業がやりづらく手間がかかり、熟練が必要だが、これらは不要となる。
【００４４】
（ハ）固定
次に使い捨て濾過器の上部から適切な固定液（エタノールなど）を含ませ、その後乾燥させる。このとき従来、メンブレンフィルターを別容器に移し、その場において実施する必要があったが、使い捨て濾過器の場合は、フィルターの移動の必要がない。
【００４５】
（ニ）ハイブリダイゼーション
次に使い捨て濾過器に蛍光標識オリゴDNAヌクレオチドからなる特定細菌検出用プローブとハイブリダイゼーション緩衝液を含ませ、所定の温度で反応させる。従来は、メンブレンフィルターを専用の容器に移し、その中でフィルターをハイブリダイゼーション緩衝液とプローブに浸して行う必要があった。使い捨て濾過器の場合は、フィルターの移動の必要がない。
【００４６】
（ホ）洗浄
次に使い捨て濾過器に洗浄液を添加し、所定の温度で洗浄させる。従来は、メンブレンフィルターを専用の容器に移し、その中でフィルターを洗浄液に浸して行う必要があった。使い捨て濾過器の場合は、フィルターの移動の必要がない。
【００４７】
（ヘ）特定細菌の検出・計数
使い捨て濾過器から外枠付きメンブレンフィルターを取り出し、これを蛍光観察装置（蛍光顕微鏡など）に供し特定細菌の検出・計数する。このとき従来は、標本作成の工程が必要だったが、その作業は不要となる。
【００４８】
なお、この際、蛍光顕微鏡観察に低倍率の対物レンズを使用でき、低倍率レンズの使用により標本とレンズとの距離が大きくなるので、対物レンズにぶつからない高さの外枠つきメンブレンフィルターが観察に用いることができるようになる。これにより、外枠付きメンブレンフィルターに接触せずにフィルターの全面積にわたりスポットを計測できる。
【００４９】
以下に実施例を用いて、本願発明をより詳細に説明するが、本願発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５０】
外枠付きメンブレンフィルターを用いる簡易な培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法による簡易迅速な腸内細菌科細菌の検査
（１）方法
（イ）供試菌株 腸内細菌科細菌としてEscherichia coli ATCC11775を用いた。
（ロ）供試食品試料として、水産食品（タイ、イカ、ホタテ、スモークサーモン、すり身、マグロ）、食肉製品（豚肉、鳥カツレツ、ハム）野菜（キャベツ、レタス）、飲料水（ビール、オレンジジュース、サイダー）を用いた。飲料水を除く各食品試料の場合、試料10gに滅菌生理食塩水90ｍｌ加え（10倍希釈）、ストマッカーで懸濁後、これに供試菌株Escherichia coli ATCC11775を添加し、食品試料調製液として調製した。飲料水の場合は、試料を希釈せず、供試菌株Escherichia coli ATCC11775を直接添加して食品試料調製液として調製した。
【００５１】
（ロ）培養法
クロモカルトコリフォーム寒天培地（メルク社）を使用した。食品試料調製液1mlをシャーレに入れ、次に、煮沸溶解後50℃に保温したクロモカルトコリフォーム寒天培地をシャーレに注ぎ、混和し固化後、37℃、２４時間培養後、紫コロニーを大腸菌として計数した。
【００５２】
（ハ）簡易な培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法
外枠付きメンブレンフィルターとして、パーミアブルサポート（corning社）を用いた。食品試料調製液1mlを、メンブレンの直径が25mm、ポアサイズが0.4μmであるメンブレンフィルターを有するトランスウェルインサートで吸引濾過後、トランスウェルインサートを寒天培地上に置き、37℃，６時間、培養し、フィルター表面上にコロニーを形成させた。培養後、トランスウェルインサートを100%エタノールで浸潤させたろ紙上に置き、室温で細胞固定を５分間行った。次にトランスウェルインサートをマルチプルウェルに装着し、トランスウェルインサート内にハイブリダイゼーションバッファー（0.9M NaCl、20% formamide、200mM Tris-HCl (pH7.4)、0.01% SDS）900μlを静かに注入し60℃でプレハイブリダイゼーションを10分間行った。その後さらにTAMRA(N,N,N',N'-Tetramethyl-6-6carboxyrhodamine)で標識したオリゴDNAヌクレオチドからなる腸内細菌科細菌検出用プローブ[5'-TGCTCTCGCGAGGTCGCTTCTCTT-3']（特開2001−136969）を50 pmol添加し、60℃でハイブリダイゼーションを45分間行った。トランスウェルインサートを傾けてハイブリダイゼーションバッファーを除去後、洗浄用バッファー（（20mM Tris HCl (pH7.4)、180mM NaCl、0.01% SDS））5ｍｌを加え60℃、15分間静置した。トランスウェルインサートを傾け洗浄用バッファーを除き、蒸留水で同様の洗浄操作後(ただし、静置時間を数秒内とする)、トランスウェルインサートを蛍光顕微鏡ステージに直接置き、プローブ特有の赤色蛍光を発するコロニーを計数した。なお、蛍光顕微鏡観察は対物レンズ4倍を用いて行った。
【００５３】
（２）結果
（イ）外枠付きメンブレンフィルターを用いる簡易な培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法と培養法との測定結果比較
表題について、各種の食品試料調製液を用いて、行った。その結果（表１）、培養法での生菌数と外枠付きメンブレンフィルターを利用した培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション 法での生菌数には有意な差は認められなかった(P>0.05またはP>0.01)。従って、外枠付きメンブレンフィルターを用いる培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法は、正確な生菌数測定ができた。また、その操作は従来の培養蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法に比べ熟練の必要なく簡易に行うことができた。
【００５４】
【表１】
【実施例２】
【００５５】
使い捨て濾過器を用いる簡易な培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法による簡易迅速なClostridium perfringensの検査
表題についての実施例を以下に示す。
【００５６】
（１）方法
（イ）供試食品試料として、ひき肉を用いた。試料10gに滅菌生理食塩水90ｍｌ加え、ストマッカーで懸濁後、これに供試菌株Clostridium perfringens ATCC3624またはClostridium perfringens NCTC8679を添加し、ひき肉10倍希釈懸濁液を調製した。
【００５７】
（ロ）培養法
非選択培地にGAM寒天培地（日水製薬），選択培地にカナマイシン含CW寒天基礎培地（日水製薬）を使用した。Cl. perfringens懸濁液を10倍段階希釈し、0.1mlを寒天平板上に塗沫し37℃，24時間嫌気培養（アエロパック嫌気ジャー，三菱ガス化学）を行い、コロニーを計数した。
【００５８】
（ハ）簡易な培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法
ひき肉10倍希釈懸濁液1mlを簡易濾過器（例えば、外枠付きメンブレンフィルター（直径37mm，孔径0.45μm）を装着できるように改造した37mmモニター（ADVANTEC社）で濾過し、37mmモニターの底面側からGAM液体培地1mlを静かに注入した。これを37℃，7時間嫌気培養（アエロパック嫌気ジャー，三菱ガス化学）し、フィルター表面上にコロニーを形成させた。培養後、モニター内に残存する液体培地を吸引除去し、37mmモニター上部から100%エタノールを静かに注入し、室温で細胞固定を20分間行った。エタノールを吸引除去した後、ハイブリダイゼーションバッファー（0.9M NaCl、20% formamide、200mM Tris-HCl (pH7.4)、0.01% SDS）900μlを37mmモニター上部から静かにを注入し46℃でプレハイブリダイゼーションを10分間行った。その後さらにTAMRA(N,N,N',N'-Tetramethyl-6-6carboxyrhodamine）で標識したオリゴDNAヌクレオチドからなるCl. perfringens検出用プローブCLP-180[5'-AATGATGATGCCATCTTTCAACA-3']（特願2004−336584）を50pmol添加し、46℃でハイブリダイゼーションを45分間行った。ハイブリダイゼーションバッファーを吸引除去後、洗浄用バッファー（（20mM Tris HCl (pH7.4)、180mM NaCl、0.01% SDS））900μlを加え15分間静かに吸引洗浄した。乾燥後、37mmモニターから取り出した外枠付きメンブレンフィルターを蛍光顕微鏡ステージに直接置き、プローブ特有の赤色蛍光を発するコロニーを計数した。なお、蛍光顕微鏡観察は対物レンズ4倍を用いて行った。
【００５９】
（２）結果
（イ）使い捨て濾過器を用いる簡易な培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法と培養法との比較
使い捨て濾過器を用いる簡易な培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法と公定法に準拠した培養法として寒天平板塗抹法でのコロニー数の比較を、試料にClostridium perfringens添加ひき肉を用いて、行った。その結果（表２）、培養法での生菌数と37mmモニターシステムを利用した培養併用FISH (FISH-FC-Broth)法での生菌数には有意な差は認められなかった（P>0.05）。従って、使い捨て濾過器を用いる簡易な培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法は、正確な生菌数測定ができた。また、その操作は従来の培養蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法に比べ熟練の必要なく簡易に行うことができた。
【００６０】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】高さのある外枠付きメンブレンフィルター及び底面に培地を含む容器を装着できる高さのある外枠を設けた高さのある外枠付きメンブレンフィルター。
【図２】対物レンズを用いて外枠付フィルター面に焦点を合わせる時の対物体レンズと外枠付きメンブレンフィルターとの関係。
【図３】使い捨て濾過器、（３１）底面に外枠を有する培地保持材を設けた高さのある外枠付きメンブレンフィルター、（３２）濾過器下部の開口部、（３３）蓋部材
【配列表フリーテキスト】
【００６２】
ST.25の数字見出し<233>（他の情報の内容）を日本語で記載
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外枠付きメンブレンフィルターを用いることを特徴とする標識DNAオリゴヌクレオチドプローブを使用する培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法。
【請求項２】
標識が蛍光標識である請求項１記載の培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法。
【請求項３】
外枠付きメンブレンフィルター上に微生物を捕集し、当該外枠付きメンブレンフィルター上に微生物を保持したまま、微生物を培養、固定化、蛍光プローブとハイブリダイゼーション、洗浄及び蛍光顕微鏡による観察をすることを特徴とする培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法。
【請求項４】
外枠付きメンブレンフィルターが、蛍光顕微鏡観察において使用する対物レンズと接触しない外枠の高さを有する外枠付きメンブレンフィルターである請求項３記載の培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法。
【請求項５】
外枠付きメンブレンフィルターが着脱可能に取り付けられた使い捨て濾過器を用いることを特徴とする標識DNAオリゴヌクレオチドプローブを使用する培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法。
【請求項６】
標識が蛍光標識である請求項４記載の培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法。
【請求項７】
使い捨て濾過器に着けられた外枠付きメンブレンフィルター上に微生物を捕集し、使い捨て濾過器の当該外枠付きメンブレンフィルター上に微生物を保持したまま、微生物を培養し、固定化し、蛍光プローブとハイブリダイゼーションし、洗浄した後、該外枠付きメンブレンフィルターを使い捨て濾過器から取り外して蛍光顕微鏡で観察することを特徴とする培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法。
【請求項８】
外枠付きメンブレンフィルターが、蛍光顕微鏡観察において使用する対物レンズと接触しない外枠の高さを有する外枠付きメンブレンフィルターである請求項７記載の培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法。
【請求項９】
請求項１記載の培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法に使用する外枠により液体を収容可能な外周枠付きメンブレンフィルター。
【請求項１０】
外枠が円柱状又は漏斗状であることを特徴とする請求項９記載の外枠付きメンブレンフィルター。
【請求項１１】
請求項５記載の培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法に使用する外枠により液体を収容可能な外枠付きメンブレンフィルター及び培地の保持体を備えた使い捨て濾過器。
【請求項１２】
使い捨て濾過器の外枠が円柱状又は漏斗状であることを特徴とする請求項１１の使い捨て濾過器。
【請求項１】
外枠付きメンブレンフィルターを用いることを特徴とする標識DNAオリゴヌクレオチドプローブを使用する培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法。
【請求項２】
標識が蛍光標識である請求項１記載の培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法。
【請求項３】
外枠付きメンブレンフィルター上に微生物を捕集し、当該外枠付きメンブレンフィルター上に微生物を保持したまま、微生物を培養、固定化、蛍光プローブとハイブリダイゼーション、洗浄及び蛍光顕微鏡による観察をすることを特徴とする培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法。
【請求項４】
外枠付きメンブレンフィルターが、蛍光顕微鏡観察において使用する対物レンズと接触しない外枠の高さを有する外枠付きメンブレンフィルターである請求項３記載の培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法。
【請求項５】
外枠付きメンブレンフィルターが着脱可能に取り付けられた使い捨て濾過器を用いることを特徴とする標識DNAオリゴヌクレオチドプローブを使用する培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法。
【請求項６】
標識が蛍光標識である請求項４記載の培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法。
【請求項７】
使い捨て濾過器に着けられた外枠付きメンブレンフィルター上に微生物を捕集し、使い捨て濾過器の当該外枠付きメンブレンフィルター上に微生物を保持したまま、微生物を培養し、固定化し、蛍光プローブとハイブリダイゼーションし、洗浄した後、該外枠付きメンブレンフィルターを使い捨て濾過器から取り外して蛍光顕微鏡で観察することを特徴とする培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法。
【請求項８】
外枠付きメンブレンフィルターが、蛍光顕微鏡観察において使用する対物レンズと接触しない外枠の高さを有する外枠付きメンブレンフィルターである請求項７記載の培養併用蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法。
【請求項９】
請求項１記載の培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法に使用する外枠により液体を収容可能な外周枠付きメンブレンフィルター。
【請求項１０】
外枠が円柱状又は漏斗状であることを特徴とする請求項９記載の外枠付きメンブレンフィルター。
【請求項１１】
請求項５記載の培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法に使用する外枠により液体を収容可能な外枠付きメンブレンフィルター及び培地の保持体を備えた使い捨て濾過器。
【請求項１２】
使い捨て濾過器の外枠が円柱状又は漏斗状であることを特徴とする請求項１１の使い捨て濾過器。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００６−２９６２８５（Ｐ２００６−２９６２８５Ａ）
【公開日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１２２３９１（Ｐ２００５−１２２３９１）
【出願日】平成１７年４月２０日（２００５．４．２０）
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人 北海道大学 (971)
【出願人】（０００１７３５１１）財団法人函館地域産業振興財団 (32)
【出願人】（０００１５１９４４）株式会社東和電機製作所 (16)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年４月２０日（２００５．４．２０）
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人 北海道大学 (971)
【出願人】（０００１７３５１１）財団法人函館地域産業振興財団 (32)
【出願人】（０００１５１９４４）株式会社東和電機製作所 (16)
【Ｆターム（参考）】
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