糖吸収調節剤及び薬学的組成物
本発明は糖吸収調節剤、これを含む薬学的組成物及び前記組成物の有効量を哺乳類に投与して哺乳類の糖尿病または糖尿病合併症を治療する方法に関するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は糖吸収調節剤、これを含む薬学的組成物及び前記組成物の有効量を哺乳類に投与して哺乳類の糖尿病または糖尿病合併症を治療する方法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
インシュリンに共に多様なホルモンまたは生理学的因子は糖吸収を促進することができる。例えば、運動はインシュリンに独立的な経路を通じて骨格筋に糖吸収を誘導し、α1−アドレナリンまたはアンドセリンA受容体もインシュリンと独立的な経路を通じて糖吸収率を増加させる。このような物質代謝反応に関与する信号伝達メカニズムのうちの一部はインシュリンのそれと類似しているが、大部分はインシュリンのそれと相異している。例えば、ペルオキシソーム増殖体活性化受容体γ作用剤(peroxisome proliferators activated receptor γ agonist)であるアラキドン酸で処理された脂肪細胞では糖吸収の促進が発生するが、これは特異的なでインシュリンと独立的な信号伝達メカニズムと関連されている。
【0003】
数年間脂肪組織は身体の全般的脂質及びエネルギー恒常性に重要な役割を果たしてきた。身体内の循環から超過した糖の除去を通じて脂肪組織及び筋肉組織内に糖輸送が促進される。タイプ2糖尿病(type 2 diabete)で糖耐性は脂肪組織内に糖輸送が円滑でなくて現れたものであると思われている。したがって、脂肪細胞で糖輸送を調節する新たな内在的因子を探すことは糖尿病の発生過程をさらに理解し、改善された治療戦略を通じて治療剤を開発するのに必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
ホルモン、神経伝達物質及びサイトカインなどの生体活性分子は生物体内の多くの調節過程で重要な役割を果たし、細胞間の信号伝達に必須構成要素で、さらに人間の疾病を診断及び治療するのに利用されている。新たな生体活性分子をスクリーニングする方法としては、一般に連続カラム−クロマトグラフィーが使用されているが、多くのカラム段階によって不充分な目的分子の回収率が低いという限界があった。
【0005】
このような問題を解決するために本発明者らは、本発明に先立ち多様な内在的リガンドをスクリーニングすることができる新たな統合方法であるリガンド検出及び同定(Profiling and Identification、LPI)法を開発した。平行カラムクロマトグラフィー及び高感度MS分析方法に基づくこのような方法は、迅速で同時に不充分な生体活性分子をスクリーニングするのに適合する。最近は前記生体活性分子を効率的に精製するためにプロテアーゼフィルタリング工程を追加して前記LPI技術を発展させた。したがって、本発明者らはこのような体系的で高感度の分析器術が組織または体液内の新規の生体活性分子をスクリーニングするのに効果的に使用されると考えた。
【0006】
このような分析器術は先行文献に参照として含まれているので、本明細書では具体的に言及したり食欲抑制剤とインシュリン敏感化剤を結合させて結合による効能については言及しなかった。副作用がなくて優れた糖尿病治療効果を有する薬として十分に改良された優れた薬を開発することが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明では血清から3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を促進する新たなリガンドをスクリーニングし、糖吸収を促進する新規のリガンドであるリソフォスファチジルコリン(LPC)を検出した。本発明ではまた、前記LPCが脂肪細胞の糖吸収を促進させて糖尿病マウスモデルの血糖数値を下げる可能性があることを最初に確認し、さらにこのようなLPCの物質代謝調節にはPKCδの活性が必要であることを明らかにした。
【0008】
本発明の一側面で、周辺のウロコルチン(urocortin、UCN)の役割については糖恒常性で調査された。UCNは人間インシュリン受容体が過発現されたRat−1細胞(hIRcB細胞)及びC2C12繊維亜細胞でインシュリンによって誘導されたIRの燐酸化及び以降細胞内信号伝達を促進させた。さらに、本発明の生体外実験結果と同様にUCNをSTZマウスの尻尾静脈内に投与する場合、インシュリンによって誘導された血糖数値の減少が促進された。したがって、本発明では内在的ペプチドをスクリーニングしてインシュリン敏感化剤を検出した。
【0009】
本発明の目的は、リソフォスファチジルコリン(LPC)、リゾホスファチジルセリン(LPS)、リソホスファチジン酸(LPA)及びウロコルチン(UCN)からなる群の中で選択されたいずれか1つの化合物を含む糖吸収促進剤を提供することにある。前記リソフォスファチジルコリン、リゾホスファチジルセリン及びリソホスファチジン酸はインシュリンなくても糖吸収を促進させ、ウロコルチンは糖恒常性調節でインシュリンの活性のための補助剤として作用する。
【0010】
前記リソフォスファチジルコリンはAkt燐酸化にいかなる影響も与えず、リソホスファチジルのアシル基は14個乃至16個の炭素数を有する。ミリストイル(myristoyl)LPCとパルミトイルLPCは糖吸収を促進させるが、反面ステアロイル(stearoyl)LPCは複数のリゾリン脂質(lysophospholipid)が処理された3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を促進させなかった。
【0011】
パルミトイルリソホスファチジルエタノールアミン(LPE)、パルミトイルリソホスファチジルグリセロール(LPG)及びパルミトイルリソホスファチジルイノシトール(LPI)は全て3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を促進させなかったが、これはLPCのヘッド基が3T3−L1脂肪細胞でLPCによる糖吸収の促進と関する構造的選択性に影響を与えたものと思われる。
【0012】
【化1】
【0013】
本発明の他の目的は、リソフォスファチジルコリン、リゾホスファチジルセリン、リソホスファチジン酸及びウロコルチンからなる群の中で選択されたいずれかの化合物を含む薬学的組成物を提供することにある。前記薬学的組成物は希釈剤または賦形剤を追加的に含み、インシュリン分泌強化剤、ビグアナイド剤(biguanide)及びα−グルコシダーゼ抑制剤からなる群の中で選択された少なくともいずれかの化合物をさらに含む。
【0014】
本発明の他の目的は、ウロコルチンとインシュリンを混合した薬学的組成物を提供することにある。
【0015】
本発明の他の目的は、リソフォスファチジルコリン、リゾホスファチジルセリン、リソホスファチジン酸及びウロコルチンからなる群の中で選択されたいずれかのインシュリン敏感化剤の有効量を哺乳類に投与して哺乳類の糖尿病または糖尿病合併症を治療する方法を提供することにある。前記糖尿病合併症は肥満、高脂血症、動脈硬化症、高血圧または心臓病である。前記方法はインシュリン分泌強化剤、ビグアナイド剤及びα−グルコシダーゼ抑制剤からなる群の中で選択された少なくともいずれかの化合物を混合して製造されたインシュリン敏感化剤の有効量を哺乳類に投与する段階を追加的に含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【0016】
以下、本発明を下記の実施例によって詳しく説明する。
本明細書で糖吸収調節剤とはインシュリンに対する組織反応を増加させて血糖数値を下げる物質のことを意味する。
【0017】
インシュリン耐性高血圧に敏感な患者とはインシュリンに耐性を現わして高血圧にかかりやすい患者のことを意味し、このような患者は当該技術分野における通常の知識を有する医者によく知らされて簡単に判断される。
【0018】
治療とはインシュリン耐性及び/または高循環インシュリン数値によって生じた血圧を下げることを意味し、予防とは疾病の深刻性によってインシュリン耐性患者に現れる高血圧を現れないようにすることを意味する。
【0019】
“単位投与量”とは医学的または獣医学的用途で投与するために適切な形態で糖吸収調節剤を分離した量を意味する。したがって、実際の単位投与量は、例えば、抗−糖尿病治療剤の使用後に生じた肥満を予防または治療する特定用途で使用される糖吸収調節剤の定量を含む1つの単位またはその全量を意味する。薬剤学を専攻した通常の知識を有する者には自明なことであるように、糖吸収調節剤は従来の単位投与量で公式化されることができる。このような単位投与量は多様な梯形、例えば、タブレット、硬質ゼラチンカプセル、ホイルパケット及びガラスアンプルなどで製造されることができる。類似に、前記単位投与量は薬品点滴器またはポンプスプレーで伝達することができる。その後、前記多様な単位投与量は薬学的に許容可能な多様な形態の液状物で経口または非経口投与することができる。例えば、一定量のホイルパケットを水に溶かして口腔投与することができ、一定量のガラスアンプルを投与することができる。類似に、薬品点滴器またはポンプスプレーのような不連続的な量の梯形は水に溶解され得る。
【0020】
“哺乳動物”とは乳泉から分泌される牛乳で子を育てて通常皮膚が毛である程度覆われている人とその他の全ての動物を含む高等脊椎動物のある部類(哺乳類)を意味する。特に、このような定義に含まれる人は忍耐心、精力または運動能力が哺乳類の中で最適の状態ではない。このような人及び人を除いた動物は当該技術分野の医師または獣医師によって簡単に診断できる。
【0021】
糖恒常性は肝臓の糖生産と細胞の糖吸収の最適の調和を通じて維持され、もし人間の身体で糖恒常性が維持されなければ、人間の身体は高血糖症または多様な代謝的不均衡状態になり得る。3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を促進する新たな因子をスクリングすることにおいて、本発明者らは体系的な平行カラムクロマトグラフィー、プロテアーゼフィルタリング、高感度MS分析及び同定されたLPCに基づく新たな統合方法を用いた。
【0022】
本発明者らはLPCが濃度及び時間に応じて糖吸収を促進するという事実を明らかにした。LPC処理による糖吸収の促進はアシル基の長さ変化及びLPCの極性ヘッド基差に敏感に反応する。3T3−L1脂肪細胞にLPCを処理する場合、細胞膜でのGLUT4数値は顕著に増加し、糖吸収に対するLPCのこのような効能はPKCδ抑制剤のロットレリン及び優性陰性的PKCδの発現によって阻害される。また、LPCをマウスに投与する場合、血糖数値は顕著に減少し、特にタイプI糖尿病(インシュリン−依存性糖尿病)及びタイプII糖尿病(インシュリン−非依存性糖尿病)のマウスモデルで血糖数値が改善された。このような結果はLPCが糖恒常性及び糖尿病の治療因子として新しく提示できることを意味する。
【0023】
リゾリン脂質は細胞増殖、腫瘍細胞の浸潤及び炎症を含む多様な生物学的過程を調節する。ホスホリパーゼA2(PLA2)の活性によって生産されたLPCは膜脂質の主要構成成分であり、脂肪酸とコリンを組織内に輸送する。また、LPCは糖恒常性調節と密接に関連していると知られている。最近はLPCが膵臓細胞で糖依存性インシュリンの分泌を促進するという報告がある。今まで報告されたLPCの生理学的活性のうちの1つは膵臓細胞からインシュリンの分泌を誘導することである。最近TakatoshiなどはLPCに対する新規のGs−蛋白質結合受容体として孤児G−蛋白質結合受容体であるGPR119を特定した。前記GPR119は膵臓細胞で顕著に発現し、LPCによって活性化して糖−依存性インシュリンの分泌を誘導する。
【0024】
LPAは特異のG−蛋白質結合受容体を経由する幾多の細胞上のイベントを調節すると知られている強力で多面的な生体活性燐脂質である。LPAは血小板凝集、アクチン細胞骨格活性、繊維亜細胞増殖及び神経突起収縮を調節することができる。LPAは2種類の主な経路を通じて細胞外で生産されると見なされている。第1経路としてLPAは活性化した血小板によって放出され、第2経路として前記LPAはオートタキシン(lyso−PLD)によってリゾリン脂質から生産される。最近LPAはオートタキシンの分泌によって脂肪細胞の細胞外培養液で生産されると報告された。したがって、LPAは全般的なエネルギー均衡を調節するのに重要な役割を果たす脂肪組織の発達を調節するのに関与することができる。
【0025】
生体活性リゾリン脂質のうちの1つとしてリゾホスファチジルセリン(LPS)は免疫調節と関連していると思われている。しかし、細胞活性に対するLPSの効能及びLPSの標的分子の同定については明確に調査されたことがない。LPSはまた、卵巣ガン患者の腹水で発見され、卵巣ガン及び乳癌細胞株で細胞内カルシウム濃度を一時的に増加させるという報告がある。LPSはまた、JurkatT細胞でインターロイキン−2の生産を促進し、さらに神経促進因子に誘導されたラットの肥満細胞でのヒスタミン放出と神経促進因子に誘導されたPC12細胞の分化を促進する。このようにいくつかの生物学的反応を調節するLPSの機能については制限的に研究されてきたので、多様な細胞活性に対するLPSの機能及びその活性メカニズムについて調査されなければならない。
【0026】
本発明は糖恒常性を調節するインシュリンの活性のための補助因子としてウロコルチン(UCN)の新規の機能を調査した。UCNは血糖強化剤としてよく知られているが、UCNがインシュリン受容体(IR)が過発現されたhIRcB細胞及びC2C12繊維亜細胞でインシュリン受容体(IR)、インシュリン受容体基質(IRS)及び蛋白質キナーゼB(AKT)のようなインシュリンによって誘導された信号伝達分子の活性を促進させることができるということについては知らされたことがないので、これについて調査した。興味深く、生体内でウロコルチンの効能は血糖数値を調節することにおいてその投与量と差があった。つまり、ウロコルチンを低濃度(0.1pM)で投与する場合、ウロコルチンは血糖数値を低くしてマウスの骨格筋でインシュリン受容体(IR)の燐酸化を増加させた。結論的に、本発明者らはインシュリンに対する敏感性を強化させるウロコルチンの生理的な現象を示しながら、これによってウロコルチンが糖尿病治療の標的として有用に使用される可能性があることを提示しようとした。
【0027】
ウロコルチン(UCN)はコルチコトロフィン放出因子(CRF)類のうちの1つで、40個のアミノ酸を有するペプチドであり、視床下部脳下垂体副腎(HPA)軸調節に関与する主要視床下部因子として知られている。UCNは食欲を抑制し、カテコールアミン性システムを通じた体熱発生及び空腹状態を活性化し、そして多様な動物モデルで結腸のモータ機能を促進する。最近は骨格筋のような周辺組織でもUCNが発現すると報告されているが、このようなUCNの発現が糖調節と関連しているかどうかについては依然として知らされたことがない。
【0028】
リゾリン脂質は細胞増殖及び腫瘍細胞の浸潤を含む多様な生物学的過程を調節する。ホスファチジルコリン上でホスホリパーゼA2(PLA2)の活性によって生産されたリソフォスファチジルコリン(LPC)は血管内皮細胞固着分子の発現増加と成長因子、単核球走化性及び大食細胞の活性を含む炎症効能を促進する。本発明はLPCが糖恒常性と関する血管媒介ホルモンであることを最初に証明しようとし、このために本発明者らは平行カラムクロマトグラフィー、プロテアーゼフィルタリング及び高感度MS分析を含む新たな統合方法を用いた(Baek, M.C., et al., Proteomics 6, pp1741−1749, 2006)。3T3−L1脂肪細胞にLPCを処理する場合、PI3−キナーゼに独立的なPKCδ活性を通じて3T3−L1脂肪細胞での糖吸収は速かに促進され、さらに糖尿病マウスモデルにLPCを投与する場合、血糖数値が顕著に減少した。LPCの他にも多くのリゾリン脂質(LPL)は多様な生理的及び病理的機能を持っていると知られているが、これらが糖吸収の調節と関連しているということは報告されたことがなかった。糖代謝と関する内在的脂質としては副腎皮質生殖ホルモン(DHEA)が報告されたことがあり、最近の研究結果によるとDHEAが脂肪細胞で糖吸収率を増加させると報告したが、動物モデルでDHEAの効能を証明することはできなかった。したがって、本発明者らはLPCが正常マウスだけでなく糖尿病マウスモデルで血糖数値を調節する最初の内在的脂質であることを提示した。
【0029】
新たな活性リガンドをスクリーニングするために、本発明者らは本発明に先立って平行HPLC及びMS分析を用いた活性切片検出に基づいたLPIと呼ばれる新たな方法を考案した。前記平行HPLCは上述した発明に記載された通りに収率を増加させて活性分子を特定する効果的な方法で、本発明者らは前記活性分子をより効率的に精製するために前記平衡HPLCにプロテアーゼフィルタリング工程を追加した。プロテアーゼは蛋白質マッピングまたは蛋白質同定に通常使用されるが、前記プロテアーゼフィルタリング工程ではカラムクロマトグラフィーのような精製道具としてプロテアーゼが使用される。特に、プロテアーゼフィルタリングは活性分子と類似な物理化学的特徴を有する不活性ペプチドを除去するのに効果的である。前記不活性ペプチドは通常の連続クロマトグラフィーによって簡単には除去されないが、プロテアーゼの処理による不活性ペプチドが切断されて不活性ペプチドの構造的な変化がまねかれ、引き続くカラムクロマトグラフィーによって活性分子から分離できる。このようなプロテアーゼフィルタリング工程及び平行HPLCを結合して本発明者らは新規のリガンドの同定方法を考案してLPCをより簡単に特定した。したがって、このような統合方法は少量の出発物質を用いて孤児G−蛋白質結合受容体(GPCR)研究のような多様な生体活性分子をスクリーニングするのに有用に使用することができる。
【0030】
LPC処理による3T3−L1脂肪細胞での糖吸収促進とマウスでの血糖減少はLPCアシル基の長さ変化に敏感に反応する。パルミトイルLPC及びミリストイルLPCは3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を促進させたが、ステアロイルLPCは3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を促進させなかった。パルミトイルLPCと極性ヘッド基が構造的に異なる幾つかのリゾリン脂質を3T3−L1脂肪細胞に処理した時にも糖吸収が促進されなかったが、このようなLPCの構造的特異性もまたマウスモデルで確認された。このような結果はLPCのアシル基長さ及びホスファチジルコリンのヘッド基が全て3T3−L1脂肪細胞での糖吸収促進及びマウスでの血糖数値減少に非常に重要であることを意味する。
LPC作用での速い開始と構造的特異性に基づいて、本発明者らはLPCの生物学的活性はLPCと細胞表面にある特異的なLPC受容体の結合によって説明できると考えた。このようなG−蛋白質結合受容体(GPCR)部類に対するリガンドとしていくつかのリゾリン脂質が報告され、LPCはG2A及びGPR4に直接結合して活性化させるリガンドとして知られている。しかし、最近他の研究結果によるとLPCはG2A及びGPR4と直接結合しない投与量でも活性化できると報告された。したがって、LPCがG2A及びGPR4と直接結合する経路を通じて糖吸収を促進するかまたは知られていない他の経路を通じて糖吸収を促進するかについての未解決問題が残っている。
【0031】
脂肪細胞及び筋肉細胞で糖吸収の促進とPKCζ活性の関連性は長い間よく知られているが、PKCδの活性もまた糖輸送を調節する。糖輸送の活性とPKCδとの関連性は薬剤及びインシュリンを利用する研究で本来評価された。インシュリンをラットの骨格筋細胞に処理する場合、インシュリンによる前記細胞の細胞膜に対するGLUT4の転座及び糖吸収の促進はロットレリンによって阻害された。さらに、インシュリンによって過発現されたPKCδは細胞膜に対するGLUT4の転座を誘導し、糖吸収数値を増加させた。
本発明において、LPCによって誘導された糖吸収の促進はロットレリン及び優性陰性的PKCδの発現によって阻害されたが、従来のPKC抑制剤であるGo6976を前処理したりまたは優性陰性的PKCζを発現させる場合、LPCによる糖吸収の促進にいかなる影響も与えなかった。これはPKCδがLPCによる糖吸収の促進に必須の要素であることを意味する。
【0032】
今まで報告されたLPCの生理学的活性のうちの1つは膵臓β−細胞からインシュリンの分泌を誘導することである。最近TakatoshiなどはLPCに対する新規のGs−蛋白質結合受容体として孤児G−蛋白質結合受容体であるGPR119を特定した(Soga, T., et al., Biochem Biophys Res Commun 326, pp744−751、2005)。前記GPR119は膵臓β−細胞で顕著に発現され、LPCによって活性化して糖−依存性インシュリンの分泌を誘導する。本発明において本発明者らは断食状態(fasting condition)にあるマウスにLPCを投与し、投与後血清内でインシュリンの濃度変化が殆どないことを確認した。これはマウスでの血糖減少はインシュリンの分泌によるものでなく、LPCの促進によるLPCの直接的な機能によるものであることを意味する。
【0033】
要約すると、本発明はLPCが3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を促進するということを示すもので、このような効能はPI3−キナーゼに独立的なPKCδ依存性信号伝達経路によって行われる。さらに、LPCは糖尿病マウスモデルで血糖数値を直接的に減少させたが、このようなLPCの新規の機能は糖恒常性及び糖代謝関連生物学分野で新しく認識できる。LPCと代謝症候群間の関連性もまたさらに研究する価値がある。最後に、本発明の結果はLPCが糖尿病に対する薬品治療法を開発するのに有用なターゲットになり得るより高い可能性を提示する。
【0034】
UCNは血糖強化剤として知られているが、本発明では正常ICRマウスにUCNを投与する場合に血糖数値が減少し(図14A)、特にストレプトゾトキシン(STZ)−マウスにUCNとインシュリンを共に投与する場合、インシュリンを単独で投与した場合に比べて血糖数値がさらに減少した(図14B)。さらに、本発明ではUCNと関する血糖数値減少の分子的メカニズムを調査しようとし、その結果、本発明者はUCNがインシュリン受容体(IR)が過発現されたRat−1細胞(hIRcB細胞)及び分化するC2C12繊維亜細胞でIRの活性化に影響を与える、インシュリンによるIRの燐酸化を促進するということを確認した(図12、13)。そして、このような効果はC2C12繊維亜細胞で糖吸収と関連されていた。したがって、本発明はG−蛋白質結合受容体(GPCR)リガンドがインシュリンによって誘導されたIRの活性及び生理的機能の糖調節に特異的に敏感に反応するということを最初に明らかにした。
【0035】
インシュリンは血液内に存在する主要糖調節剤として知られているが、血糖数値を効率的で正確に調節するためには、インシュリンの機能を補助する補助因子などが必要であると提案されてきた。このような補助因子などは生理的及び病理的条件の間で互いに異なる機能的特徴を有することができる。正常的な生理的条件でインシュリンは主要糖調節剤の役割を果たすので、前記補助因子などは糖恒常性調節で付随的な役割を果たすことができる。しかし、糖尿病及び肥満のような病理的条件でインシュリンの機能は顕著に減少するので、前記補助因子はインシュリン作用を強化させて糖を調節する非常に重要な役割を果たすことができる。
【0036】
インシュリンをSTZ−マウスに投与して糖調節をする場合、一部マウス及び補助的な効果が現れたが、UCNは低血糖効果を示した。したがって、UCNは病理的条件で糖を調節するのにさらに強力な効能を有することができる。結論的に、本発明ではインシュリンと関する糖調節の新規のメカニズム及びUCNの新規の機能を明らかにした。糖恒常性側面から見る時、G−蛋白質結合受容体(GPCR)とUCNによって調節できるIRの活性が中枢神経系(CNS)と周辺システムの間で現れる機能と互いに相反するというのは非常に興味深いことである。
【0037】
本発明の薬学的組成物は糖尿病または糖尿病合併症を予防または治療するための薬剤として使用することができる。前記糖尿病の例としてはインシュリン−依存型糖尿病及びインシュリン−非依存型糖尿病などがある。特に、本発明の薬学的組成物は糖尿病合併症(例えば、神経病症、腎臓病、網膜症、巨大血管病症、冠状動脈疾患、骨粗しょう症など)を予防または治療するための薬剤として使用することができ、また糖耐性損傷を治療するための薬剤として使用することができる。
【0038】
さらに、本発明の薬学的組成物をインシュリン分泌強化剤、ビグアナイド剤及びα−グルコシダーゼ抑制剤などと混合して処理するとより優れた血糖阻害効果を提供することができる。
【0039】
本発明の薬学的組成物またはこれらそれぞれの活性成分の投与形態はタブレット、カプセル(軟質カプセル及び微細カプセルを含む)、パウダー、顆粒及びシロップなどのような経口投与形態;及び注射剤(例えば、皮下注射剤、静脈注射剤、筋肉内注射剤及び腹腔内注射剤など)、外部適用剤(例えば、鼻噴霧剤、経皮吸収剤及び軟膏など)、座剤(例えば、直腸座剤及び膣座剤など)、ペレット及び点滴注入などのような非経口投与形態を含む。
【0040】
本発明の薬学的組成物の投与量は前記各薬剤に応じて勧告された投与量を参照して適切に決定することができ、投与対象、投与対象の年齢及び体重、現在の臨床的状態、投与時間、投与形態、投与方法及び薬剤の組み合わせなどに応じて適切に選択することができる。インシュリン敏感化剤及び食欲抑制剤の投与量は臨床的に使用される投与量に基づいて適切に選択される。インシュリン敏感化剤を成人糖尿病患者(体重:50kg)に投与する場合、1日当たり0.01乃至1000mg、好ましくは0.1乃至500mgがよく、前記投与量は一日に複数回に分けて投与することができる。
【0041】
本発明を下記の実施例によってより詳しく説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するために過ぎず、本発明が下記の実施例に限定されるわけではない。
【実施例】
【0042】
[物質]
合成14:0、18:0、18:1リソフォスファチジルコリン(LPC)、インシュリン及びストレプトゾトシン(STZ)はシグマ(セントルイス、MO)から購入し、他のリゾリン脂質はAvanti polar lipids社から購入した。全てのリピドを50mMの固定濃度でメタノールに溶解してガラスバイアールに1回分量で分株した後、−70℃の窒素に貯蔵して一ケ月内に使用した。Go6976及びロットレリンはカルバイオケム(Calbiochem)から購入し、抗体は下記の会社から購入した:多クローン抗−GLUT4抗体はバイオゼニシスLtd(サンダウン、NH)から購入し、抗−ホスホ−Ser473AKT1抗体はシグマから購入し、抗−ホスホ−Tyr989IRS1は本実験室で製造し、[14C]2−デオキシ−D−グルコース(300mCi/mmol)はモラベクバイオケミカル(Moravek Biochemiacl)から購入し、トリプシンはロッシュ(マンハイム、ドイツ)から購入し、組織培養培地及び牛胎児血清はGIBCOから購入した。その他の全ての試薬は分析用級で準備した。
【0043】
[細胞培養]
3T3−L1繊維亜細胞は高い糖濃度、10%の牛胎児血清、50U/mlのペニシリンと50ug/mlのストレプトマイシンを含むDMEM培地と37℃、5%の二酸化炭素が供給される湿気のある空気条件で維持されたまま増殖した。3T3−L1細胞を脂肪細胞に分化させるために、前記で記述された方法を用いた(van den Berghe, N., et al., Mol Cell Biol 14、pp.2372−2377、1994)。
【0044】
[動物]
雄ICRマウスはヒョチャン科学(ROK)から購入し、C57BLKSJ−db/dbマウスはSLC(日本)から購入した。LPCをマウス尻尾静脈内に投与した後、尻尾の端部を切断して携帯用糖測定器(Gluco−Dr、ROK)を用いて定期的に血糖を測定した。血清内インシュリンの濃度を測定するためにマウスの血液試料をインシュリン−RIAキット(LINCO、Missouri)で分析した。インシュリン欠乏マウスはクエン酸ナトリウム(pH5.5)に溶解されたSTZ(200mg/kg)を毎日2回連続的に雄ICRマウスの腹腔内に投与して誘導した。最後のSTZを投与した後から3日目になる日に前記のような方法でビヒクル(vehicle)、LPCまたはインシュリンをマウス尻尾静脈内に投与して急性糖阻害効果を分析した。
【0045】
[HPLC精製]
約350mlの新鮮な人間血清を70%(v/v)のアセトン、1Mの酢酸及び20mMの塩酸と混合して20,000g、30分間4℃で遠心分離し、これから得られた上澄み液を収集した後、ジエチルエーテルで3回抽出した。抽出された液状部位を再び20,000g、30分間4℃で遠心分離し、これから得られた上澄み液を事前洗浄のためにSepPakC18(水)カートリッジに積載し、溶出するためにC18逆相HPLCカラム(Vydac 218TP1022、22mmx250mm)に直接積載した。10mlの分画物を収集し、各分画物の1%未満を3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を分析するのに使用した。活性分画物は37℃で12時間トリプシンで処理した後、同一量をC4逆相HPLCカラム(Vydac 214TP5215、2.1mmx150mm)及び陽イオン−交換HPLCカラム(Amersham Pharmacia Min−S HR5/5、4.6mmx50mm)に使用した。
【0046】
[質量分析及びデータ分析]
電気噴射イオン化質量分析(ESI−MS)及び連続質量分析(MS/MS)はナノ−電気噴射イオン化(nano−ESI)基質が装着されたQSTAR PULSAR I hybrid Q−TOFMS/MS(バイオシステム社から供給されたPE SCIEX、トロント、オンタリオ)を用いて行った。準備された試料はプロタナナノ噴霧チップ(オデンス、デンマーク)を用いてESI基質内に伝達された0.1%のトリフルオロ酢酸に溶解された。QSTARによって検出された全ての試料の質量はバイオシステム社から供給された分析用QSソフトウェアを用いて測定した。QSTARは24時間維持される外部目盛り(external calibration)を用いて10〜30ppmの質量精密度と8,000−10,000の解像度で作動された。前記噴射チップの電圧を2300Vに調節し、質量情報による通常の質量を確認するために結合されたオンライン−データベース;Dictionary of Natural Products(Chapman & Hall/CRC)を用いた。
【0047】
[糖吸収測定]
3T3−L1脂肪細胞での糖吸収を測定するために、細胞を血清が含有されていないDMEMで16時間増殖させた後、インシュリンまたはリゾリン脂質を添加したり添加せずに37℃で指示された時間の間に培養した。吸収率は1μCiの[14C]2−デオキシ−D−グルコース及び3mMの2−デオキシ−D−グルコースを添加して測定し、添加されて10分後冷たいPBSで2回急速に洗浄して前記反応を終結した。細胞は0.5NのNaOH及び0.1%のSDSが含まれた0.5mlの粉砕溶液を用いて粉砕し、粉砕された細胞粉砕物を液体閃光係数を測定するのに用い、非特異的な吸収率は10μMのサイトカラシンBの存在下で分析された。
【0048】
[脂肪細胞の膜分離]
3T3−L1脂肪細胞から全体膜(TM)を得るために、細胞を10mlの冷たいHES溶液(250mMのスクロース、1mMのEDTA、1mMのフェニルメチルスルホニルフルオライド[PMSF]、1μMのペプスタチン、1μMのアプロチニン、1μMのロイペプチン及び20mMのHEPES、pH7.4)内で収集した後、4℃のガラスダウンスホモジナイザーを用いて30ストロークで均質化した。粉砕されない細胞を除去するために4℃、1,000gで5分間遠心分離し、これから得られた上澄み液を4℃、212,000gで90分間遠心分離し、全体細胞の膜を収得した。3T3−L1脂肪細胞から原形質膜細胞以下の分画物を得るために、前記に記述された通りに差別的な超遠心分離を用いた(Perrini, S., et al., Diabetes53, pp.41−52,2004)。
【0049】
[PKC同種体(isoform)のアデノウイルス感染]
PKCδまたはPKCζ再組み合わせアデノウイルスを製造するためのアデノウイルス発現ベクターは前記で記述されたことがある。培養した3T3−L1脂肪細胞を分化させた後、培養液を除去してPKCδまたはPKCζ再組み合わせアデノウイルスを含むウイルス培養液を24時間前記細胞に感染させた。その後、前記感染された細胞をDMEMで2回洗浄し、48時間感染させた後に培養して糖吸収または免疫反応に使用した。
【0050】
[免疫反応]
全体細胞粉砕物を準備するために3T3−L1脂肪細胞をカルシウム/マグネシウムが添加されていないPBSで洗浄し、粉砕溶液(50mMのHEPES、pH7.2、150mMのNaCl、50mMのNaF、1mMのNa3VO4、10%のグリセロール、1%のトリトンX−100)内で粉砕した後、前記細胞粉砕物を4℃、15,000rpmで15分間遠心分離した。蛋白質をlaemmliサンプル溶液と混合して95℃で5分間加熱して変成させた後、SDS−PAGEから分離した。ホファーウェットトランスシステム(Hoefer wet transfer system)を用いてSDS−ゲルをニトロセルロース膜に伝達し、前記膜を5%の脱脂乳パウダーを含むTTBS溶液(20mMのTris−HCl、pH7.6、150mMのNaCl、0.05%のTween20)の中で所々に集めた後、3時間続けて抗体と反応させた。TTBSを用いて前記膜を複数回洗浄した後、HRP(西洋ワサビ過酸化水素)−結合された塩素抗−ウサギ抗体と1時間反応させ、再びTTBSで洗浄してECLで発色した。
【0051】
[統計分析]
全てのデータは平均±標準誤差で表記し、統計分析はStuden'stテストで行った。*P<0.01は統計的有意性があることを意味する。
【0052】
[実施例1]人間血清内の3T3−L1脂肪細胞から糖吸収促進因子であるリソホスファチジルコリンの同定
3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を促進する内在的因子を調査するために、本発明者らは体系的な平行カラムクロマトグラフィー、プロテアーゼフィルタリング、高感度MS分析に基づく新たな統合方法を用いた(図1A)。平行HPLCの基本的な原理は従来の連続的な分離(Baek, M.C., et al., Proteomics 6, pp, 1741−1749,2006)の代わりにターゲット分子を確認するために検出分析を利用することである。多段階の連続カラムによる低い収率は精製するのに非常に大きな短所となるが、これは各カラムによる収率が精製過程でも急激に減少するためである。このような新たな方法は連続的なHPLC段階を最少化し、ターゲット分子を特定するために一部精製されたHPLC分画物を用い、連続的なHPLCに比べて単に少量の出発物質が要求される。
【0053】
平行HPLCと共に本発明者らは効率的な精製のためにプロテアーゼフィルタリング法を用いた。つまり、特異プロテアーゼを処理した後、活性分画物の活性が消失しなければ、本発明者らは活性分子を含む分画物と次いで行われるカラムクロマトグラフィーを用いて多様な不活性ペプチドから前記活性分画物を確実に分離することができる。したがって、このような方法は脂質、アミン及び炭水化物のような非−ペプチド分子を分離するのに有用である。このような新たな方法で本発明者らは最初にC18逆相HPLCによって人間血清からアセトン抽出物を分画した。分画されたHPLC分画物は3T3−L1脂肪細胞で処理され、糖吸収率は[14C]2−デオキシ−D−グルコース吸収率の増加を通じて測定された(van den Berghe, N., et al., Mol Cell Biol 14, pp.2372−2377, 1994)。
【0054】
図1Bに示したように、少なくとも4種類の活性分画物が検出され(A−D)、これらの活性がトリプシン処理によって減少したかどうかを調べた結果、分画物Dの活性のみがトリプシン処理によって影響を受けなかった。したがって、前記分画物Dをトリプシンで処理し、平行状態にあるC4HPLC及び陽イオン−交換(SCX)HPLCを用いて追加的に分離した。C4HPLC及びSCXHPLCの全ての分画物は3T3−L1脂肪細胞から糖吸収を測定してスクリーニングされた(図1C及び1D)。
【0055】
各カラム(C4からは37分、SCXからは6分)から得られた活性分画物をESI−QTOF質量分析器で分析し、標準質量を探すために各質量スペクトルを比較した結果、単一同位元素質量として495.33の単に1つの標準質量値があった(図1E−上端の絵及び図1E−中央の絵)。このような質量情報を用いて本発明者らは結合されたオンライン−データベース(Dictionary of Natural Products)で検索し、パルミトイルリソフォスファチジルコリン(LPC)を特定した。ターゲット分子がLPCであるかどうかを確認するために、本発明者らはMS/MSスペクトル上で標準LPCと495.33質量の各断片化様相を分析した(図1F)。陽性−イオンモードで標準LPC産物−イオンスペクトルはm/z183で最も強いピークを含むホスホコリンヘッド基の衝突によって誘導された分離から発生した複数のイオンを現わした(図1F−下端パネル及び1G)。C4HPLC及びSCXHPLCから得られた495.33質量の断片化様相は標準LPCと正確に一致した(図1F−上端パネル及び1F−中央パネル)。前記で言及した物理的特徴に基づいて本発明者らは活性基質がLPCであると決めた。
【0056】
図1A乃至1Eは血清から新規の糖吸収促進剤を特定したものを示し、図1Aは3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を促進する血清因子の同定方法を概略的に示したもので、図1Bは血清のC18逆相HPLC(Vydac 218TP1022、22mmx250mm)の溶出様相を示したものである。相対的な2−デオキシ−D−グルコース吸収率は3T3−L1脂肪細胞でビヒクル処理に対する各分画物処理によって得られた増加比率として現わした。活性分画物Dは無作為に選択され、追加的な精製のためにトリプシンで処理された。図1Cは分画物DのC4逆相HPLC(Amersham Pharmacia Mini−SHR5/5、4.6mmx50mm)の溶出様相を示し、図1EはESI−TOF質量分析器による質量分析を示す。図1C(上端)、図1D(中央)及び標準パルミトイル16:0LPC(下端)は活性分画物の質量スペクトルを示し、図1Fは図1Eの各質量スペクトルで質量断片化及び495.33質量のMS/MSスペクトルの様相分析を示したものである。
【0057】
[実施例2]3T3−L1脂肪細胞で糖吸収に対するLPCの効能
糖吸収に対するLPCの効能を調査するために、3T3−L1脂肪細胞を多様な濃度の標準LPC存在下で時間に応じて培養した。LPCは3T3−L1脂肪細胞で時間及び濃度に応じて糖吸収の増加を促進した。糖吸収に対するLPCの初期の統計的な有効量は1μMであり、最適の有効量は20μMで確認された(図2A)。20μMのLPCで処理する場合、10分後に糖吸収が最大に増加した(図2B)。このようなLPC濃度は細胞毒性が現れず、40乃至50μMの臨界ミセル濃度(critical micellar concentration)より低濃度である(Chaudhuri, P., et al., Circ Res 97, 674−681,2005)。
【0058】
骨格筋は糖代謝で中枢的な役割を担当すると知られており、骨格筋で糖代謝の損傷はしばしば糖尿病を招く(Petersen, K.F., et al., Am J Cardiol 90,11G−18G, 2002;Beck−Nielsen, H., et al., Diabetologia 37, pp217−221,1994)。このような研究報告は3T3−L1脂肪細胞に限定されてきたが、本発明者らはまたLPCがC2C12筋肉細胞で濃度依存的に糖吸収率を増加させることを確認した。このような結果はLPCが脂肪細胞及び筋肉細胞全てで糖を調節することを意味する。
【0059】
LPCのアシル基長さ変化が糖吸収に影響を与えるかどうかを知るためにいくつかのLPCを対象として試験した。興味深く、ミリストイルLPC及びパルミトイルLPCは3T3−L1細胞で糖吸収を促進させたが、ステアロイルLPCは糖吸収を促進させなかった(図2C)。他のリゾリン脂質に対しても3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を促進させるかどうかを調査するために複数のリゾリン脂質を3T3−L1脂肪細胞に処理した。図2Dに示したように、パルミトイルLPE、パルミトイルLPG及びパルミトイルLPIは3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を促進させなかったが、これはLPCのヘッド基が3T3−L1脂肪細胞でLPCによる糖吸収促進に構造的な選択性を付与していることを意味する。
【0060】
図2A乃至2Dは3T3−L1脂肪細胞で糖吸収に対するLPCの効能を現わすもので、図2Aは6−ウォールプレートで増殖させた3T3−L1脂肪細胞に糖のないKrebs−Ringer溶液で1時間平衡化させ、LPC(0乃至30μM)またはインシュリン10nM)を10分間処理した後、物質方法に記述されたように[14C]2−デオキシ−D−グルコース吸収率を10分間の測定した結果を示したものであり、図2Bは3T3−L1脂肪細胞にLPC(20μM)を0乃至20分間処理及び培養した結果を示したものである。図2C及び2Dは3T3−L1脂肪細胞に等モル濃度のミリストイルリソフォスファチジルコリン(14:0LPC)、パルミトイルリソフォスファチジルコリン(16:0LPC)、ステアロイルリソフォスファチジルコリン(18:0LPC)、パルミトイルリゾホスファチジルエタノールアミン(16:0LPE)、パルミトイルリソホスファチジルイノシトール(16:0LPI)、パルミトイルリソホスファチジルグリセロール(16:0LPG)を10分間の処理するか処理せずに(対照群)培養して相対的な[14C]2−デオキシ−D−グルコース吸収率の測定結果を示したものである。測定値は3回の独立的な実験を行って得られた結果を平均±標準誤差で示す値である。*P<0.05vs.対照群。
【0061】
[実施例3]3T3−L1脂肪細胞でGLUT4転座を促進するLPC
3T3−L1脂肪細胞で糖輸送を促進するLPCの機能がLPCによって誘導された前記細胞表面にある糖輸送蛋白質量の変化と関連されているかどうかを調査するために、3T3−L1脂肪細胞で発現する主要糖輸送同種体であるGLUT4蛋白質の数値をLPCまたはインシュリンを処理するか処理しない基底状態の原形質膜(PM)分画物で測定した。LPCはインシュリンのようにGLUT4蛋白質のPM濃度(対照群の180%)を顕著に増加させた(図3A及び3B)。このような結果はインシュリン及びLPC全てGLUT4転座を促進させ、糖吸収実験で観察されたことと一致していることが分かる。
【0062】
図3A及び3BはLPCが3T3−L1脂肪細胞でGLUT4転座を促進していることを示したものである。A)3T3−L1脂肪細胞の原形質膜(PM)でGLU4転座に対するインシュリンの効能。LDM、低濃度ミクロソーム。3T3−L1脂肪細胞を100nMのインシュリンまたは20μMのリゾリン脂質で10分間処理して促進させた後、GLU4の統合密度値(IDV)の相対的な減少または増加を測定した。B)相対的に増加された値を定量化して表記。測定値は3回の独立的な実験を行って得られた結果を平均±標準誤差で示した値である。*P<0.05。
【0063】
[実施例4]PKCδ活性化を通じて糖吸収を促進するLPC
脂肪細胞でインシュリンが糖吸収を促進するためにはIRS1、PI3−キナーゼ及び次に起こるAKTの活性が必要である(Burgering, B.M., et al., Nature 376, pp.599−602,1995;Baumann, C.A., et al., Nature 407、pp202−207, 2000)。したがって、LPCによって増加された糖吸収がインシュリン依存型信号伝達経路、IRS1及びAKT燐酸化と関連されているかどうかを調査しようとした。予想通りに3T3−L1脂肪細胞に10nMのインシュリンを処理する場合、IRS1及びAKT燐酸化が促進された。反面、脂肪細胞にLPCを処理する場合、IRS1及びAKT燐酸化にいかなる影響も与えなかったが、これはLPCが多様な細胞で従来及び新規のPKCを活性化するためであり(Chaudhuri, P., et al., cell migration. Circ Res 97, 674−681,2005)、LPCによって誘導された糖輸送の増加とこのようなPKCの関連性については次に調査した。3T3−L1脂肪細胞に従来のPKC抑制剤である2μMのGo6976を30分間前処理する場合、LPCは糖吸収を促進させなかったが、PKCδ抑制剤である10μMのロットレリンを前処理する場合にはLPCによって促進された糖吸収が完全に抑制された(図4A)。
【0064】
PKCの機能をより直接的に調査するために、本発明者らは3T3−L1脂肪細胞に特異のPKC同種体及び優性陰性的PKC同種体を過発現させるアデノウイルス発現システムを用い、自然型(wild−type)、優性陰性的PKCδまたは優性陰性的PKCζを過発現する3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を分析した。自然型PKCδ発現は対照群3T3−L1脂肪細胞のそれと比較した時、LPCによって促進された糖輸送活性を微々に増加させ、優性陰性的PKCδの発現はLPCによって促進された糖輸送活性を顕著に減少させた。反面、優性陰性的PKCζの発現はLPC及びインシュリンによって誘導された糖吸収にいかなる影響も与えなかった(図4B)。このような結果はPKCδがLPCによって誘導された糖輸送活性に関与していることを意味する。
【0065】
図4A及び4BはLPCがPKCδを活性化して、糖吸収を促進するのを示すことで、図4Aは6−ウォールプレートで増殖させた3T3−L1脂肪細胞に糖のないKrebs−Ringer溶液で1時間平衡化させ、2μMのGo6976、10μMのロットレリンまたは溶液単独を30分間処理した後、前記細胞にビヒクル(開放棒)または20μMのLPC(満たされた棒)を10分間処理して物質方法に記述された通りに[14C]2−デオキシ−D−グルコース吸収率を10分間測定した結果を示したものであり、図4BはPKCδ及びPKCζ蛋白質の発現数値を示したものである。対照群3T3−L1脂肪細胞及び自然型PKCδ、優性陰性的PKCδまたは優性陰性的PKCζを発現する3T3−L1脂肪細胞から得られた細胞粉砕物をそれぞれ抗−PKCδ抗体または抗−PKCζ抗体と免疫反応させ(上端)、3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を測定した(下端)。前記各細胞にビヒクル、20μMのLPCまたは10nMのインシュリンを10分間処理及び培養した。測定値は3回の独立的な実験を行って得られた結果を平均±標準誤差で示した値である。*P<0.05。
【0066】
[実施例5]マウスでLPCの糖阻害効能
LPCの生体内効能は雄アルビノICR(癌研究学会)マウスを用いて調査した。前記マウスの尻尾静脈内にLPCを投与する場合、30分以内に血糖数値が統計的に留意に減少したが(図5A)、このような効能は濃度に依存的であるが、血液内インシュリン数値の変化によるものではない(図5C)。
【0067】
LPCの種類に応じてその活性が異なるかどうかを調査するために多様な長さのアシル基を有するLPCまたは他のリゾリン脂質であるリソホスファチジルエタノールアミンを30μmol/kgの等モル濃度でマウスの尻尾静脈内に投与した。興味深く、単にパルミトイルLPCのみが血糖を顕著に減少させた(図5B)。次いで、本発明者らは30μmol/kgのLPCをストレプトゾトキシン(STZ)−処理されたインシュリン欠乏マウスに投与し、その結果LPCが血糖濃度を顕著に減少させ、このような効果はインシュリンを投与した結果と類似していた(図5D)。
【0068】
次に、本発明者らはLPCの投与がインシュリン−耐性の肥満db/dbマウスの血糖症(glycemia)にも影響を与えるかどうかを調査し、その結果LPC投与後に血糖がほとんど正常数値に落ちることを確認した(図5E)。総合してみると、このような結果はLPCが正常マウスだけでなくタイプI及びタイプII糖尿病マウスモデルでも血糖数値を調節することができることを意味する。
【0069】
図5A乃至5Eは糖尿病マウスモデルで尻尾静脈内に投与されたLPCの抗−糖尿効能を示したもので、図5A及び5BはICRマウスでLPCによる急性糖阻害効能を示したものである。8周齢の雄マウスにPBS、インシュリン、LPCまたはLPEを尻尾静脈内に投与し、血糖は投与した後にモニターした(0乃至120分)。図5Cは8周齢の雄マウスの尻尾静脈内にLPCを単一投与した後に血清内インシュリン数値を示したものであり、図5Dはストレプトゾトキシン(STZ)−処理されたインシュリン欠乏ICR雄マウスでLPCによる急性糖阻害効能を示したものであり、図5Eはインシュリン−耐性の肥満C57BLKSJ−db/dbマウスでLPCによる急性糖阻害効能を示したものである。全ての動物は水を自由に摂取し、国際的な指針にしたがって保護された。全てのデータは平均±標準誤差で示した(n=5−6)。*P<0.05。
【0070】
[実施例6]糖吸収に対するLPSの効能
(6−1)3T3−L1脂肪細胞で糖吸収に対するLPSの効能
LPCと関する実施例と実質的に同様な方法で3T3−L1脂肪細胞でLPSの効能を調査し、その結果を図6A及び6Bに示した。
【0071】
6−ウォールプレートで増殖させた3T3−L1脂肪細胞に糖のないKrebs−Ringer溶液で1時間平衡化させ、等モル濃度(20μM)のリソフォスファチジルコリン(LPC)、リゾホスファチジルセリン(LPS)、リソホスファチジルエタノールアミン(LPE)、リソホスファチジルイノシトール(LPI)、リソホスファチジルグリセロール(LPG)をそれぞれ10分間処理及び培養した。図6AはLPC及びLPSが3T3−L1脂肪細胞で特異的に糖吸収を促進することを示したもので、図6BはLPSが濃度依存的に糖吸収を促進することを示したものである(0乃至30μM)。測定値は3回の独立的な実験を行って得られた結果を平均±標準誤差で示した値である。*P<0.05vs.対照群。
【0072】
(6−2)糖尿病マウスモデルでLPSの糖阻害効能
LPCと関する実施例と実質的に同様な方法でマウスでLPSの効能を調査し、その結果を図7A乃至7Dに示した。
【0073】
図7A乃至7Bは糖尿病マウスモデルで尻尾静脈内に投与されたLPSの糖阻害効能を示したものである。8周齢の雄マウスにPBS、インシュリン、LPSを尻尾静脈内に投与し、血糖は投与した後にモニターした(0乃至120分)。図7Aに示したようにLPSは濃度−依存的に正常マウスの血糖数値を減少させた。S1P及びLPEのような他のリゾリン脂質は正常マウスで血糖数値を減少させなかった(図7B)。次に、8周齢の雄マウスの尻尾静脈内にLPSを単一投与した後、血清内インシュリン数値を測定し、その結果血糖数値が統計的に有意に減少したが、このような効能は血液内インシュリン数値の変化によるものではない(図7C)。次いで、本発明者らはLPSをストレプトゾトキシン(STZ)−処理されたインシュリン欠乏マウスに投与し、その結果LPSが血糖濃度を顕著に減少させ、このような効果はインシュリンを投与した結果と類似していた(図7D)。このような結果からLPSは血糖数値を濃度−依存的に阻害させ、インシュリン分泌に影響を与えず、特にインシュリンが欠乏したタイプI糖尿病マウスモデルで糖を調節する効能があった。全ての動物は水を自由に摂取し、国際的な指針にしたがって保護された。全てのデータは平均±標準誤差で示した(n=5−6)。*P<0.05。
【0074】
[実施例7]3T3−L1脂肪細胞で糖吸収に対するLPAの効能
(7−1)3T3−L1脂肪細胞で糖吸収に対するLPAの効能
LPCと関する実施例と実質的に同様な方法で3T3−L1脂肪細胞でLPAの効能を調査し、その結果を図8A及び8Bに示した。糖吸収に対するLPAの効能を調査するために3T3−L1脂肪細胞を多様な濃度の標準LPAの存在下で時間に応じて培養した。LPAは3T3−L1脂肪細胞で時間及び濃度に応じて糖吸収の増加を促進させた。糖吸収に対するLPAの初期の統計的な有効量は1μMであり、最適の有効量は20μMで確認された(図8A)。20μMのLPAに処理する場合、10分後に糖吸収が最大に増加した(図8B)。図9Aは6−ウォールプレートで増殖させた3T3−L1脂肪細胞に糖のないKrebs−Ringer溶液で1時間平衡化させ、LPA(0乃至20μM)またはインシュリン(10nM)を10分間処理した後、物質方法に記述されたように[14C]2−デオキシ−D−グルコース吸収率を10分間の測定した結果を示したものであり、図9Bは3T3−L1脂肪細胞にLPA(20μM)を0乃至20分間処理及び培養した結果を示したものである。
【0075】
(7−2)LPAによる糖吸収促進の信号伝達メカニズム
LPCと関する実施例と実質的に同様な方法で3T3−L1脂肪細胞でLPAの効能を調査し、その結果を図9A及び9B、図10A及び10Bに示した。LPAがその受容体を通じて糖吸収に影響を与えるかどうかを調査するために、本発明者らはLPA受容体拮抗剤であるKi16425を用いた。図9AはLPAによって促進された糖吸収がKi16425前処理によって完全に抑制されることを示したものである。次いで、本発明者らはLPAがGαi抑制剤である百日咳毒素(pertussi toxin)を用いてGαiと結合したLPA受容体を活性化するかどうかを調査した。
【0076】
図9BはLPAがGαiを活性化させて糖吸収を促進することを示したものである。
インシュリンがPI3−キナーゼ依存型信号伝達経路を通じて糖吸収を促進するということはよく知られているので、このような信号伝達経路を通じてLPAが糖吸収を促進するかどうかを調査するために、本発明者らはPI3−キナーゼの下位信号であるAKtを確認し、その結果AktがLPAによって影響を受けることを確認した。図10AはLPAがAkt燐酸化を促進していることを示したもので、このような燐酸化はPI3−キナーゼ抑制剤であるLY294002前処理を通じて抑制された。次いで、LPAがPI3−キナーゼ信号伝達経路を通じて実質的に糖吸収を促進するかどうかを調査するために本発明者らは3T3−L1脂肪細胞にLY294002を前処理し、糖吸収を測定した。図10BはLPAによって促進された糖吸収がPI3−キナーゼ活性に依存的であることを示したものである。
【0077】
(7−3)マウスモデルでLPAの糖阻害効能
LPCと関する実施例と実質的に同様な方法で動物モデルでLPAの糖−阻害効能を調査し、その結果を図11A乃至11Dに示した。
【0078】
図11A乃至11Bはマウスモデルで尻尾静脈内に投与されたLPAの糖阻害効能を示したものである。8周齢の雄マウスにPBS、インシュリン、LPAを尻尾静脈内に投与し、血糖は投与後モニターした(0乃至120分)。図11Aは8周齢の雄マウスの尻尾静脈内にLPAを単一投与した後に血清内インシュリン数値を示したもので、LPAは正常マウスで濃度−依存的に血糖数値を減少させた。S1P及びLPEのような他のリゾリン脂質は正常マウスで血糖数値を減少させなかった(図11B)。このような効能は血液内インシュリン数値の変化によるものではない(図11C)。
【0079】
最後に、本発明者らはLPAによる糖阻害効能がLPA受容体の活性に依存的であるかどうかを調査しようとした。LPAを投与する前、LPA受容体抑制剤であるKi16425を投与した。図11DはLPAによって促進された糖吸収がLPA受容体抑制剤によって抑制されることを示したものである。このような結果から、LPAは血糖数値を濃度−依存的に阻害させ、インシュリン分泌に影響を与えず、特に、LPAによる血糖阻害はLPA受容体活性と関していた。全ての動物は水を自由に摂取し、国際的な指針にしたがって保護された。全てのデータは平均±標準誤差で示した(n=5−6)。*P<0.05。
【0080】
[実施例8]hIRcB細胞でIR自動燐酸化に対するUCNの効能
物質:Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)はBioWhittaker社から購入し、牛胎児血清(FBS)及び馬血清(ES)はHyClone社(Logan、UT)から購入した。コルチコトロフィン放出因子(CRF)、ウロコルチン(UCN)、ストレスコルピン防虫ペプチド(SRP)及びストレスコルピンはアニゲン(光州、韓国)で合成し、ホスホ−インシュリン受容体抗体、IRS抗体、IR抗体及びAKT抗体はセルシグナル社(ビーバーリ、MA)から購入し、[14C]2−デオキシ−D−グルコースはモラベック(マーキュリー、CA)から購入した。その他の全ての試薬はシグマ(セントルイス、MO)から入手した。
【0081】
免疫反応を含む全ての実験は独立的に少なくとも3回反復実施し、本発明の免疫反応は3回以上の独立的な実験の中で代表的なものである。定量的なデータは平均±標準誤差で表記し、”Student'stテスト”を適切に使用した。P<0.05は統計的有意性があることを意味する。
【0082】
図12Aは1mMのCRF類及び/または2nMのインシュリンまたは培地単独を1分間処理して培養した細胞から収得したCRF類の中でインシュリンに対する敏感性を比較した結果を示したものである。インシュリンに対するUCNの敏感性は濃度(12B、12C)及び時間(12D)によって増加した。図12Bは2nMのインシュリン及び多様な濃度のUCN(2nM乃至1mM)を1分間処理して培養した細胞から得られた結果であり、図12Cは100nM及び多様な濃度のインシュリンを1分間処理して培養した細胞から得られた結果である。IRの燐酸化は抗−pTyr抗体を用いた“ウェスタンブロット”で分析した。図13Dは100nMのUCN及び/または10nMのインシュリンを0、2、10、30及び60分間処理して培養した細胞から得られた結果で、この時、IRの燐酸化は抗−pIR抗体を用いた“ウェスタンブロット”で分析した。IR自動燐酸化の定量はイメージゲージソフトウェア(富士フィルム)を用いて測定した。測定値は3回の独立的な実験から得られた結果を平均±標準誤差で示した値である(n=5−6)。*,P<0.05。
【0083】
[細胞培養]
hIRcB細胞は10%(v/v)FBSを含むDMEMと37℃、5%の二酸化炭素及び95%の空気が供給される湿気のある空気条件で維持されたまま増殖した。
【0084】
[免疫沈澱及び免疫反応]
指示された時間及び濃度でリガンドを処理した後、細胞を冷たいPBSで洗浄してプロテアーゼ抑制剤(0.5mMのPMSF、1mg/mlのロイペプチン及び5mg/mlのアプロチニン)及びフォスファターゼ抑制剤(30mMのNaF、1mMのNa3VO4及び30mMのNa4O7P2)を含む粉砕溶液(50mMのHEPES、pH7.5、150mMのNaCl、1%のトリトンX−100,1mMのEDTA、10%のグリセロール)内で粉砕した。粉砕された前記細胞粉砕物を4℃で1時間反応させて14,000rpmで15分間遠心分離した後、同量の液状抽出物を5mg抗−IR抗体及び30mlレジン体積の固定蛋白質Aと共に4時間反応させた。ゲル電気泳動を行うために前記沈殿物をレムルリサンプル溶液と混合してSDS−PAGEから分離した後、ニトロセルロース膜(Schleicher and Schuell社、BA85)に伝達した。ブロッキングは5%の脱脂乳パウダーを含むTTBS溶液(10mMのTris/HCl、pH7.5、150mMのNaCl及び0.05%のTween20)で行い、前記膜を3時間室温で1次抗体と反応させた。次いで、前記防止する洗浄して西洋ワサビ過酸化水素−結合された2次抗体と1時間室温で反応させた後、TTBS溶液で4回洗浄し、西洋ワサビ過酸化水素−依存型化学発光試薬(Amersham International, United Kingdom)で発色した。
【0085】
本実施例でウロコルチン(UCN)及びコルチコトロピンフィン放出因子(CRF)はIR過発現されたhIRcB細胞で他の類、つまり、ストレス−関連ペプチド(SRP)及びストレスコルピン(SCP)に比べてインシュリンによるIR燐酸化に優勢に作用していることを確認した(図12A)。UCN及びCRF単独はIR燐酸化にいかなる影響も与えなかった。UCN及びCRFがインシュリンによるIR燐酸化に優勢に作用するとしてもUCNはCRFに比べてCRF受容体1(CRFR1)により高い親和性を持っている。UCNによって誘導されたインシュリンによるIR燐酸化は濃度(図12B)及び時間(図12D)に応じて促進された。特に、図12Cに示したようにIR燐酸化に対するUCNの効能は低濃度のインシュリン存在下でさらに強力であるが、これはUCNがhIRcB細胞で特異的にインシュリンによるIR燐酸化に敏感に反応するためである。
【0086】
[実施例9]C2C12繊維亜細胞で糖吸収及びIR燐酸化に対するUCNの効能
UCNはインシュリンによって誘導された糖吸収及びIR燐酸化、IRS及びAktを促進させた。繊維亜細胞は2nMのUCN及び/または多様なインシュリン濃度(0乃至20nM)で1分間培養され、IRS及びAktの燐酸化は抗−pIRS抗体及び抗−pAkt抗体を用いたウェスタンブロットで分析した。糖吸収は下記のように行った。
【0087】
[細胞培養]
C2C12細胞は10%(v/v)のFBSを含むDMEMと37℃、5%の二酸化炭素及び95%の空気が供給される湿気のある空気条件で維持されたまま増殖した。C2C12細胞の分化のために増殖用培地を2%(v/v)のESを含むDMEMで変えて7日間培養した。
【0088】
[糖吸収分析]
細胞を分化させた後、細胞を洗浄して130mMのNaCl、5mMのKCl、1.3mMのCaCl2・2H2O、1.3mMのMgSO4・7H2O及び10mMのNa2HPO4・7H2O、pH7.4を含む2mlのKrebs−Ringer phosphate(KRP)で3時間培養した。糖吸収に対するUCNの効能を分析するために指示された条件で1mlのKRPで10分間培養して行った。前記反応は[14C]2−DG(1mCi/ml)及び非−放射能2−DG(最終濃度:20mM)の混合物を10分間添加して行い、溶媒を除去した後に冷たい燐酸緩衝溶液(水1Lに8gのNaCl、0.2gのKCl、1.15gのNa2HPO4・12H2O及び0.2gのKH2PO4を含むPBS)で急速に2回洗浄した。細胞−連関放射能は1NのNaOHで細胞を粉砕した後、閃光係数で測定し、非特異的な吸収率は全体吸収率値から特異的な吸収率の値を除いて測定した。
【0089】
免疫沈澱及び免疫反応は実施例8の方法によって行った。
IR活性は筋肉で糖吸収に中枢的な役割を担当すると知られており、UCNはインシュリンによるIR活性化を促進させて糖吸収を調節すると見なされている。これを確認するために本発明者らはC2C12繊維亜細胞で糖吸収及びインシュリンによる信号伝達を調査した。UCNの存在下でインシュリンによるIR燐酸化は強化され、インシュリンによる糖吸収もまた顕著に増加したが(図13)、UCN単独ではこのような効果が現れなかった。このような結果はUCNがC2C12繊維亜細胞でインシュリンによって促進された糖吸収に優勢に作用してインシュリン−媒介信号伝達経路でインシュリンの敏感化剤として作用して誘導されたものであると言える。
【0090】
[実施例10]正常及びSTZ−マウスで原形質糖調節に対するUCNの効能
UCNはHPA軸を促進させて血糖を強化させる強化剤としてよく知られており、UCNの生体内機能は血糖数値を抑制するという本発明の生体内結果とは相反する。したがって、これらの間の不一致を区別するために本発明者らはマウスに多様な濃度のUCNを投与し、血糖数値の変化を調査した。
【0091】
図14AはICRマウスでUCNによって減少した血糖を示したものであり、挿入された免疫反応データは骨格筋でUCNによるIR燐酸化を示したものである。マウスにビヒクル(0.1%のBSAを含む食塩水)またはUCN(0.1−100pM)を尻尾静脈内に投与し、測定値は4匹の対照群及び4匹のUCN−処理されたマウスから得られた結果を平均±標準誤差で示した値である。図14BはSTZマウスでUCNによって減少した血糖を示したものであり、挿入された免疫反応データはSTZマウスの骨格筋でUCN処理によるIR燐酸化を示したものである。マウスにビヒクル(0.1%のBSAを含む食塩水)、UCN(0.1pM)及び/またはインシュリン(1nM)を尻尾静脈内に投与し、糖の原形質数値を45分間測定した。測定値は6匹の各群から得られた結果を平均±標準誤差で示した値である。*,P<0.05。
【0092】
(10−1)試験動物準備
正常試験動物を準備するために体重が20〜25gで8周齢の雄ICR(癌研究学会)マウスをヒョチャン科学から購入し、温度及び光が調節された部屋(20〜22℃;12時間の照明と12時間の暗黒サイクル;午前7時に照明開始)にあるケージ内で4日間適応させ、一般的な平常時食事と水を自由に供給した。動物実験の手続は実験動物使用及び管理に関する韓国政府の指針にしたがって行われた。生体内実験で一晩断食させたマウスに0.1%のBSAを含む食塩水またはUCNを尻尾静脈内に投与した後、糖分析器(モデルAGM−2100,almedicus社、安養、韓国)を用いて時間に応じる原形質糖を測定した。
【0093】
STZ−マウスを準備するために体重が20〜25gで8周齢の雄ICR(癌研究学会)マウスをヒョチャン科学から購入した。STZによって誘導された糖尿病マウスは1日間断食させた雄ICRマウスにSTZ(シグマ社、セントルイス、MO)(75mg/kg)を尻尾静脈内に投与して準備し、翌日STZをさらに一回投与した。原形質濃度が280mg/dlであるマウスをタイプI糖尿病を有するマウスに決めた。全ての試験はSTZ投与した後、3日間行った。
【0094】
(10−2)マウス骨格組織でIR信号伝達分析
一晩断食させたマウスに作用剤を尻尾静脈内に投与して15分後に殺した後、ヒラメ筋(soleus muscle)を迅速に切開して液体窒素で凍結させた。細胞粉砕物はプロテアーゼ抑制剤(0.5mMのPMSF、1mg/mlのロイペプチン及び5mg/mlのアプロチニン)及びフォスファターゼ抑制剤(30mMのNaF、1mMのNa3VO4及び30mMのNa4O7P2)を含む粉砕溶液(50mMのHEPES、pH7.5、150mMのNaCl、1%のトリトンX−100、1mMのEDTA、10%のグリセロール)内で前記組織を均質化して準備した。破片は4℃、14,000rpmで10分間遠心分離して除去し、免疫沈澱及びウェスタンブロットは前記で記述された方法で行った。
【0095】
予想の通り100pM以上のUCNを単独処理すると血糖数値を増加させたが、興味深く0.1pMのUCNを単独処理すると血糖数値を減少させた。生体内システムと反対に血液内には基底インシュリンが存在するために本発明者らはUCNがマウスで基底血中インシュリンを有することによって糖阻害効能を有し、HPA軸はピコモル以下の濃度では活性化しないと予想した。また、UCNがインシュリン分泌を調節することができ、インシュリンに独立的に血糖数値を阻害することができるといういくつかの可能性もある。したがって、本発明者らはインシュリン−媒介生理学でUCNの機能を調査するためにインシュリン−欠乏モデルシステムであるストレプトゾトキシン(STZ)−処理されたマウスを用いた。
【0096】
図14Bに示したように、UCNを単独処理すると血糖数値変化にいかなる影響も与えなかった。これはUCNが血糖数値調節でインシュリンと独立的に作用しないことを意味する。しかし、UCNを不活性濃度のインシュリンと共にSTZ−マウスに投与する場合、血糖数値が顕著に減少した。このような結果はマウス骨格筋でのIR燐酸化と非常に密接な関係があり、UCNはマウス骨格筋でインシュリンによって誘導されたIR燐酸化に非常に敏感に反応した。このような結果はウロコルチンもまた生体内でインシュリンに敏感な効能を有していることを意味する。
【図面の簡単な説明】
【0097】
【図1A】図1Aは、血清から新規の糖吸収促進剤を特定したことを示す。
【図1B】図1Bは、血清から新規の糖吸収促進剤を特定したことを示す。
【図1C】図1Cは、血清から新規の糖吸収促進剤を特定したことを示す。
【図1D】図1Dは、血清から新規の糖吸収促進剤を特定したことを示す。
【図2A】図2Aは、3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を促進するLPCの効能を示す。
【図2B】図2Bは、3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を促進するLPCの効能を示す。
【図2C】図2Cは、3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を促進するLPCの効能を示す。
【図2D】図2Dは、3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を促進するLPCの効能を示す。
【図3A】図3Aは、3T3−L1脂肪細胞でGLUT4の転座を促進するLPCを示す。
【図3B】図3Bは、3T3−L1脂肪細胞でGLUT4の転座を促進するLPCを示す。
【図4A】図4Aは、PKCδを活性化して糖吸収を促進するLPCを示す。
【図4B】図4Bは、PKCδを活性化して糖吸収を促進するLPCを示す。
【図5A】図5Aは、正常マウスとタイプI及びタイプII糖尿病マウスモデルでそれぞれ尻尾静脈内に投与されたLPCの抗−糖尿効果を示す。
【図5B】図5Bは、正常マウスとタイプI及びタイプII糖尿病マウスモデルでそれぞれ尻尾静脈内に投与されたLPCの抗−糖尿効果を示す。
【図5C】図5Cは、正常マウスとタイプI及びタイプII糖尿病マウスモデルでそれぞれ尻尾静脈内に投与されたLPCの抗−糖尿効果を示す。
【図5D】図5Dは、正常マウスとタイプI及びタイプII糖尿病マウスモデルでそれぞれ尻尾静脈内に投与されたLPCの抗−糖尿効果を示す。
【図5E】図5Eは、正常マウスとタイプI及びタイプII糖尿病マウスモデルでそれぞれ尻尾静脈内に投与されたLPCの抗−糖尿効果を示す。
【図6A】図6Aは、3T3−L1脂肪細胞で特異的に糖吸収を促進するLPSを示す。
【図6B】図6Bは、3T3−L1脂肪細胞で濃度による糖吸収を促進するLPSを示す。
【図7A】図7Aは、正常マウス及びタイプI糖尿病マウスモデルで血糖数値を下げるLPCを示す。
【図7B】図7Bは、正常マウス及びタイプI糖尿病マウスモデルで血糖数値を下げるLPCを示す。
【図7C】図7Cは、正常マウス及びタイプI糖尿病マウスモデルで血糖数値を下げるLPCを示す。
【図7D】図7Dは、正常マウス及びタイプI糖尿病マウスモデルで血糖数値を下げるLPCを示す。
【図8A】図8Aは、3T3−L1脂肪細胞で濃度及び時間による糖吸収を促進するLPAを示す。
【図8B】図8Bは、3T3−L1脂肪細胞で濃度及び時間による糖吸収を促進するLPAを示す。
【図9A】図9Aは、3T3−L1脂肪細胞でLPA受容体及びGαiを活性化させて糖吸収を促進するLPAを示す。
【図9B】図9Bは、3T3−L1脂肪細胞でLPA受容体及びGαiを活性化させて糖吸収を促進するLPAを示す。
【図10A】図10Aは、3T3−L1脂肪細胞でPI3−キナーゼ依存型信号伝達経路を通じて糖吸収を促進するLPAを示す。
【図10B】図10Bは、3T3−L1脂肪細胞でPI3−キナーゼ依存型信号伝達経路を通じて糖吸収を促進するLPAを示す。
【図11A】図11Aは、正常マウスでLPA受容体を活性化させて血糖数値を下げるLPAを示す。
【図11B】図11Bは、正常マウスでLPA受容体を活性化させて血糖数値を下げるLPAを示す。
【図11C】図11Cは、正常マウスでLPA受容体を活性化させて血糖数値を下げるLPAを示す。
【図11D】図11Dは、正常マウスでLPA受容体を活性化させて血糖数値を下げるLPAを示す。
【図12A】図12Aは、hIRcB細胞でIR自動燐酸化に対するUCNの効能を示す。
【図12B】図12Bは、hIRcB細胞でIR自動燐酸化に対するUCNの効能を示す。
【図12C】図12Cは、hIRcB細胞でIR自動燐酸化に対するUCNの効能を示す。
【図12D】図12Dは、hIRcB細胞でIR自動燐酸化に対するUCNの効能を示す。
【図13A】図13Aは、C2C12繊維亜細胞でIR燐酸化及び糖吸収に対するUCNの効能を示す。
【図13B】図13Bは、C2C12繊維亜細胞でIR燐酸化及び糖吸収に対するUCNの効能を示す。
【図14A】図14Aは、正常マウス及びSTZマウス血糖調節に対するUCNの効能を示す。
【図14B】図14Bは、正常マウス及びSTZマウス血糖調節に対するUCNの効能を示す。
【技術分野】
【0001】
本発明は糖吸収調節剤、これを含む薬学的組成物及び前記組成物の有効量を哺乳類に投与して哺乳類の糖尿病または糖尿病合併症を治療する方法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
インシュリンに共に多様なホルモンまたは生理学的因子は糖吸収を促進することができる。例えば、運動はインシュリンに独立的な経路を通じて骨格筋に糖吸収を誘導し、α1−アドレナリンまたはアンドセリンA受容体もインシュリンと独立的な経路を通じて糖吸収率を増加させる。このような物質代謝反応に関与する信号伝達メカニズムのうちの一部はインシュリンのそれと類似しているが、大部分はインシュリンのそれと相異している。例えば、ペルオキシソーム増殖体活性化受容体γ作用剤(peroxisome proliferators activated receptor γ agonist)であるアラキドン酸で処理された脂肪細胞では糖吸収の促進が発生するが、これは特異的なでインシュリンと独立的な信号伝達メカニズムと関連されている。
【0003】
数年間脂肪組織は身体の全般的脂質及びエネルギー恒常性に重要な役割を果たしてきた。身体内の循環から超過した糖の除去を通じて脂肪組織及び筋肉組織内に糖輸送が促進される。タイプ2糖尿病(type 2 diabete)で糖耐性は脂肪組織内に糖輸送が円滑でなくて現れたものであると思われている。したがって、脂肪細胞で糖輸送を調節する新たな内在的因子を探すことは糖尿病の発生過程をさらに理解し、改善された治療戦略を通じて治療剤を開発するのに必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
ホルモン、神経伝達物質及びサイトカインなどの生体活性分子は生物体内の多くの調節過程で重要な役割を果たし、細胞間の信号伝達に必須構成要素で、さらに人間の疾病を診断及び治療するのに利用されている。新たな生体活性分子をスクリーニングする方法としては、一般に連続カラム−クロマトグラフィーが使用されているが、多くのカラム段階によって不充分な目的分子の回収率が低いという限界があった。
【0005】
このような問題を解決するために本発明者らは、本発明に先立ち多様な内在的リガンドをスクリーニングすることができる新たな統合方法であるリガンド検出及び同定(Profiling and Identification、LPI)法を開発した。平行カラムクロマトグラフィー及び高感度MS分析方法に基づくこのような方法は、迅速で同時に不充分な生体活性分子をスクリーニングするのに適合する。最近は前記生体活性分子を効率的に精製するためにプロテアーゼフィルタリング工程を追加して前記LPI技術を発展させた。したがって、本発明者らはこのような体系的で高感度の分析器術が組織または体液内の新規の生体活性分子をスクリーニングするのに効果的に使用されると考えた。
【0006】
このような分析器術は先行文献に参照として含まれているので、本明細書では具体的に言及したり食欲抑制剤とインシュリン敏感化剤を結合させて結合による効能については言及しなかった。副作用がなくて優れた糖尿病治療効果を有する薬として十分に改良された優れた薬を開発することが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明では血清から3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を促進する新たなリガンドをスクリーニングし、糖吸収を促進する新規のリガンドであるリソフォスファチジルコリン(LPC)を検出した。本発明ではまた、前記LPCが脂肪細胞の糖吸収を促進させて糖尿病マウスモデルの血糖数値を下げる可能性があることを最初に確認し、さらにこのようなLPCの物質代謝調節にはPKCδの活性が必要であることを明らかにした。
【0008】
本発明の一側面で、周辺のウロコルチン(urocortin、UCN)の役割については糖恒常性で調査された。UCNは人間インシュリン受容体が過発現されたRat−1細胞(hIRcB細胞)及びC2C12繊維亜細胞でインシュリンによって誘導されたIRの燐酸化及び以降細胞内信号伝達を促進させた。さらに、本発明の生体外実験結果と同様にUCNをSTZマウスの尻尾静脈内に投与する場合、インシュリンによって誘導された血糖数値の減少が促進された。したがって、本発明では内在的ペプチドをスクリーニングしてインシュリン敏感化剤を検出した。
【0009】
本発明の目的は、リソフォスファチジルコリン(LPC)、リゾホスファチジルセリン(LPS)、リソホスファチジン酸(LPA)及びウロコルチン(UCN)からなる群の中で選択されたいずれか1つの化合物を含む糖吸収促進剤を提供することにある。前記リソフォスファチジルコリン、リゾホスファチジルセリン及びリソホスファチジン酸はインシュリンなくても糖吸収を促進させ、ウロコルチンは糖恒常性調節でインシュリンの活性のための補助剤として作用する。
【0010】
前記リソフォスファチジルコリンはAkt燐酸化にいかなる影響も与えず、リソホスファチジルのアシル基は14個乃至16個の炭素数を有する。ミリストイル(myristoyl)LPCとパルミトイルLPCは糖吸収を促進させるが、反面ステアロイル(stearoyl)LPCは複数のリゾリン脂質(lysophospholipid)が処理された3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を促進させなかった。
【0011】
パルミトイルリソホスファチジルエタノールアミン(LPE)、パルミトイルリソホスファチジルグリセロール(LPG)及びパルミトイルリソホスファチジルイノシトール(LPI)は全て3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を促進させなかったが、これはLPCのヘッド基が3T3−L1脂肪細胞でLPCによる糖吸収の促進と関する構造的選択性に影響を与えたものと思われる。
【0012】
【化1】
【0013】
本発明の他の目的は、リソフォスファチジルコリン、リゾホスファチジルセリン、リソホスファチジン酸及びウロコルチンからなる群の中で選択されたいずれかの化合物を含む薬学的組成物を提供することにある。前記薬学的組成物は希釈剤または賦形剤を追加的に含み、インシュリン分泌強化剤、ビグアナイド剤(biguanide)及びα−グルコシダーゼ抑制剤からなる群の中で選択された少なくともいずれかの化合物をさらに含む。
【0014】
本発明の他の目的は、ウロコルチンとインシュリンを混合した薬学的組成物を提供することにある。
【0015】
本発明の他の目的は、リソフォスファチジルコリン、リゾホスファチジルセリン、リソホスファチジン酸及びウロコルチンからなる群の中で選択されたいずれかのインシュリン敏感化剤の有効量を哺乳類に投与して哺乳類の糖尿病または糖尿病合併症を治療する方法を提供することにある。前記糖尿病合併症は肥満、高脂血症、動脈硬化症、高血圧または心臓病である。前記方法はインシュリン分泌強化剤、ビグアナイド剤及びα−グルコシダーゼ抑制剤からなる群の中で選択された少なくともいずれかの化合物を混合して製造されたインシュリン敏感化剤の有効量を哺乳類に投与する段階を追加的に含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【0016】
以下、本発明を下記の実施例によって詳しく説明する。
本明細書で糖吸収調節剤とはインシュリンに対する組織反応を増加させて血糖数値を下げる物質のことを意味する。
【0017】
インシュリン耐性高血圧に敏感な患者とはインシュリンに耐性を現わして高血圧にかかりやすい患者のことを意味し、このような患者は当該技術分野における通常の知識を有する医者によく知らされて簡単に判断される。
【0018】
治療とはインシュリン耐性及び/または高循環インシュリン数値によって生じた血圧を下げることを意味し、予防とは疾病の深刻性によってインシュリン耐性患者に現れる高血圧を現れないようにすることを意味する。
【0019】
“単位投与量”とは医学的または獣医学的用途で投与するために適切な形態で糖吸収調節剤を分離した量を意味する。したがって、実際の単位投与量は、例えば、抗−糖尿病治療剤の使用後に生じた肥満を予防または治療する特定用途で使用される糖吸収調節剤の定量を含む1つの単位またはその全量を意味する。薬剤学を専攻した通常の知識を有する者には自明なことであるように、糖吸収調節剤は従来の単位投与量で公式化されることができる。このような単位投与量は多様な梯形、例えば、タブレット、硬質ゼラチンカプセル、ホイルパケット及びガラスアンプルなどで製造されることができる。類似に、前記単位投与量は薬品点滴器またはポンプスプレーで伝達することができる。その後、前記多様な単位投与量は薬学的に許容可能な多様な形態の液状物で経口または非経口投与することができる。例えば、一定量のホイルパケットを水に溶かして口腔投与することができ、一定量のガラスアンプルを投与することができる。類似に、薬品点滴器またはポンプスプレーのような不連続的な量の梯形は水に溶解され得る。
【0020】
“哺乳動物”とは乳泉から分泌される牛乳で子を育てて通常皮膚が毛である程度覆われている人とその他の全ての動物を含む高等脊椎動物のある部類(哺乳類)を意味する。特に、このような定義に含まれる人は忍耐心、精力または運動能力が哺乳類の中で最適の状態ではない。このような人及び人を除いた動物は当該技術分野の医師または獣医師によって簡単に診断できる。
【0021】
糖恒常性は肝臓の糖生産と細胞の糖吸収の最適の調和を通じて維持され、もし人間の身体で糖恒常性が維持されなければ、人間の身体は高血糖症または多様な代謝的不均衡状態になり得る。3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を促進する新たな因子をスクリングすることにおいて、本発明者らは体系的な平行カラムクロマトグラフィー、プロテアーゼフィルタリング、高感度MS分析及び同定されたLPCに基づく新たな統合方法を用いた。
【0022】
本発明者らはLPCが濃度及び時間に応じて糖吸収を促進するという事実を明らかにした。LPC処理による糖吸収の促進はアシル基の長さ変化及びLPCの極性ヘッド基差に敏感に反応する。3T3−L1脂肪細胞にLPCを処理する場合、細胞膜でのGLUT4数値は顕著に増加し、糖吸収に対するLPCのこのような効能はPKCδ抑制剤のロットレリン及び優性陰性的PKCδの発現によって阻害される。また、LPCをマウスに投与する場合、血糖数値は顕著に減少し、特にタイプI糖尿病(インシュリン−依存性糖尿病)及びタイプII糖尿病(インシュリン−非依存性糖尿病)のマウスモデルで血糖数値が改善された。このような結果はLPCが糖恒常性及び糖尿病の治療因子として新しく提示できることを意味する。
【0023】
リゾリン脂質は細胞増殖、腫瘍細胞の浸潤及び炎症を含む多様な生物学的過程を調節する。ホスホリパーゼA2(PLA2)の活性によって生産されたLPCは膜脂質の主要構成成分であり、脂肪酸とコリンを組織内に輸送する。また、LPCは糖恒常性調節と密接に関連していると知られている。最近はLPCが膵臓細胞で糖依存性インシュリンの分泌を促進するという報告がある。今まで報告されたLPCの生理学的活性のうちの1つは膵臓細胞からインシュリンの分泌を誘導することである。最近TakatoshiなどはLPCに対する新規のGs−蛋白質結合受容体として孤児G−蛋白質結合受容体であるGPR119を特定した。前記GPR119は膵臓細胞で顕著に発現し、LPCによって活性化して糖−依存性インシュリンの分泌を誘導する。
【0024】
LPAは特異のG−蛋白質結合受容体を経由する幾多の細胞上のイベントを調節すると知られている強力で多面的な生体活性燐脂質である。LPAは血小板凝集、アクチン細胞骨格活性、繊維亜細胞増殖及び神経突起収縮を調節することができる。LPAは2種類の主な経路を通じて細胞外で生産されると見なされている。第1経路としてLPAは活性化した血小板によって放出され、第2経路として前記LPAはオートタキシン(lyso−PLD)によってリゾリン脂質から生産される。最近LPAはオートタキシンの分泌によって脂肪細胞の細胞外培養液で生産されると報告された。したがって、LPAは全般的なエネルギー均衡を調節するのに重要な役割を果たす脂肪組織の発達を調節するのに関与することができる。
【0025】
生体活性リゾリン脂質のうちの1つとしてリゾホスファチジルセリン(LPS)は免疫調節と関連していると思われている。しかし、細胞活性に対するLPSの効能及びLPSの標的分子の同定については明確に調査されたことがない。LPSはまた、卵巣ガン患者の腹水で発見され、卵巣ガン及び乳癌細胞株で細胞内カルシウム濃度を一時的に増加させるという報告がある。LPSはまた、JurkatT細胞でインターロイキン−2の生産を促進し、さらに神経促進因子に誘導されたラットの肥満細胞でのヒスタミン放出と神経促進因子に誘導されたPC12細胞の分化を促進する。このようにいくつかの生物学的反応を調節するLPSの機能については制限的に研究されてきたので、多様な細胞活性に対するLPSの機能及びその活性メカニズムについて調査されなければならない。
【0026】
本発明は糖恒常性を調節するインシュリンの活性のための補助因子としてウロコルチン(UCN)の新規の機能を調査した。UCNは血糖強化剤としてよく知られているが、UCNがインシュリン受容体(IR)が過発現されたhIRcB細胞及びC2C12繊維亜細胞でインシュリン受容体(IR)、インシュリン受容体基質(IRS)及び蛋白質キナーゼB(AKT)のようなインシュリンによって誘導された信号伝達分子の活性を促進させることができるということについては知らされたことがないので、これについて調査した。興味深く、生体内でウロコルチンの効能は血糖数値を調節することにおいてその投与量と差があった。つまり、ウロコルチンを低濃度(0.1pM)で投与する場合、ウロコルチンは血糖数値を低くしてマウスの骨格筋でインシュリン受容体(IR)の燐酸化を増加させた。結論的に、本発明者らはインシュリンに対する敏感性を強化させるウロコルチンの生理的な現象を示しながら、これによってウロコルチンが糖尿病治療の標的として有用に使用される可能性があることを提示しようとした。
【0027】
ウロコルチン(UCN)はコルチコトロフィン放出因子(CRF)類のうちの1つで、40個のアミノ酸を有するペプチドであり、視床下部脳下垂体副腎(HPA)軸調節に関与する主要視床下部因子として知られている。UCNは食欲を抑制し、カテコールアミン性システムを通じた体熱発生及び空腹状態を活性化し、そして多様な動物モデルで結腸のモータ機能を促進する。最近は骨格筋のような周辺組織でもUCNが発現すると報告されているが、このようなUCNの発現が糖調節と関連しているかどうかについては依然として知らされたことがない。
【0028】
リゾリン脂質は細胞増殖及び腫瘍細胞の浸潤を含む多様な生物学的過程を調節する。ホスファチジルコリン上でホスホリパーゼA2(PLA2)の活性によって生産されたリソフォスファチジルコリン(LPC)は血管内皮細胞固着分子の発現増加と成長因子、単核球走化性及び大食細胞の活性を含む炎症効能を促進する。本発明はLPCが糖恒常性と関する血管媒介ホルモンであることを最初に証明しようとし、このために本発明者らは平行カラムクロマトグラフィー、プロテアーゼフィルタリング及び高感度MS分析を含む新たな統合方法を用いた(Baek, M.C., et al., Proteomics 6, pp1741−1749, 2006)。3T3−L1脂肪細胞にLPCを処理する場合、PI3−キナーゼに独立的なPKCδ活性を通じて3T3−L1脂肪細胞での糖吸収は速かに促進され、さらに糖尿病マウスモデルにLPCを投与する場合、血糖数値が顕著に減少した。LPCの他にも多くのリゾリン脂質(LPL)は多様な生理的及び病理的機能を持っていると知られているが、これらが糖吸収の調節と関連しているということは報告されたことがなかった。糖代謝と関する内在的脂質としては副腎皮質生殖ホルモン(DHEA)が報告されたことがあり、最近の研究結果によるとDHEAが脂肪細胞で糖吸収率を増加させると報告したが、動物モデルでDHEAの効能を証明することはできなかった。したがって、本発明者らはLPCが正常マウスだけでなく糖尿病マウスモデルで血糖数値を調節する最初の内在的脂質であることを提示した。
【0029】
新たな活性リガンドをスクリーニングするために、本発明者らは本発明に先立って平行HPLC及びMS分析を用いた活性切片検出に基づいたLPIと呼ばれる新たな方法を考案した。前記平行HPLCは上述した発明に記載された通りに収率を増加させて活性分子を特定する効果的な方法で、本発明者らは前記活性分子をより効率的に精製するために前記平衡HPLCにプロテアーゼフィルタリング工程を追加した。プロテアーゼは蛋白質マッピングまたは蛋白質同定に通常使用されるが、前記プロテアーゼフィルタリング工程ではカラムクロマトグラフィーのような精製道具としてプロテアーゼが使用される。特に、プロテアーゼフィルタリングは活性分子と類似な物理化学的特徴を有する不活性ペプチドを除去するのに効果的である。前記不活性ペプチドは通常の連続クロマトグラフィーによって簡単には除去されないが、プロテアーゼの処理による不活性ペプチドが切断されて不活性ペプチドの構造的な変化がまねかれ、引き続くカラムクロマトグラフィーによって活性分子から分離できる。このようなプロテアーゼフィルタリング工程及び平行HPLCを結合して本発明者らは新規のリガンドの同定方法を考案してLPCをより簡単に特定した。したがって、このような統合方法は少量の出発物質を用いて孤児G−蛋白質結合受容体(GPCR)研究のような多様な生体活性分子をスクリーニングするのに有用に使用することができる。
【0030】
LPC処理による3T3−L1脂肪細胞での糖吸収促進とマウスでの血糖減少はLPCアシル基の長さ変化に敏感に反応する。パルミトイルLPC及びミリストイルLPCは3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を促進させたが、ステアロイルLPCは3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を促進させなかった。パルミトイルLPCと極性ヘッド基が構造的に異なる幾つかのリゾリン脂質を3T3−L1脂肪細胞に処理した時にも糖吸収が促進されなかったが、このようなLPCの構造的特異性もまたマウスモデルで確認された。このような結果はLPCのアシル基長さ及びホスファチジルコリンのヘッド基が全て3T3−L1脂肪細胞での糖吸収促進及びマウスでの血糖数値減少に非常に重要であることを意味する。
LPC作用での速い開始と構造的特異性に基づいて、本発明者らはLPCの生物学的活性はLPCと細胞表面にある特異的なLPC受容体の結合によって説明できると考えた。このようなG−蛋白質結合受容体(GPCR)部類に対するリガンドとしていくつかのリゾリン脂質が報告され、LPCはG2A及びGPR4に直接結合して活性化させるリガンドとして知られている。しかし、最近他の研究結果によるとLPCはG2A及びGPR4と直接結合しない投与量でも活性化できると報告された。したがって、LPCがG2A及びGPR4と直接結合する経路を通じて糖吸収を促進するかまたは知られていない他の経路を通じて糖吸収を促進するかについての未解決問題が残っている。
【0031】
脂肪細胞及び筋肉細胞で糖吸収の促進とPKCζ活性の関連性は長い間よく知られているが、PKCδの活性もまた糖輸送を調節する。糖輸送の活性とPKCδとの関連性は薬剤及びインシュリンを利用する研究で本来評価された。インシュリンをラットの骨格筋細胞に処理する場合、インシュリンによる前記細胞の細胞膜に対するGLUT4の転座及び糖吸収の促進はロットレリンによって阻害された。さらに、インシュリンによって過発現されたPKCδは細胞膜に対するGLUT4の転座を誘導し、糖吸収数値を増加させた。
本発明において、LPCによって誘導された糖吸収の促進はロットレリン及び優性陰性的PKCδの発現によって阻害されたが、従来のPKC抑制剤であるGo6976を前処理したりまたは優性陰性的PKCζを発現させる場合、LPCによる糖吸収の促進にいかなる影響も与えなかった。これはPKCδがLPCによる糖吸収の促進に必須の要素であることを意味する。
【0032】
今まで報告されたLPCの生理学的活性のうちの1つは膵臓β−細胞からインシュリンの分泌を誘導することである。最近TakatoshiなどはLPCに対する新規のGs−蛋白質結合受容体として孤児G−蛋白質結合受容体であるGPR119を特定した(Soga, T., et al., Biochem Biophys Res Commun 326, pp744−751、2005)。前記GPR119は膵臓β−細胞で顕著に発現され、LPCによって活性化して糖−依存性インシュリンの分泌を誘導する。本発明において本発明者らは断食状態(fasting condition)にあるマウスにLPCを投与し、投与後血清内でインシュリンの濃度変化が殆どないことを確認した。これはマウスでの血糖減少はインシュリンの分泌によるものでなく、LPCの促進によるLPCの直接的な機能によるものであることを意味する。
【0033】
要約すると、本発明はLPCが3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を促進するということを示すもので、このような効能はPI3−キナーゼに独立的なPKCδ依存性信号伝達経路によって行われる。さらに、LPCは糖尿病マウスモデルで血糖数値を直接的に減少させたが、このようなLPCの新規の機能は糖恒常性及び糖代謝関連生物学分野で新しく認識できる。LPCと代謝症候群間の関連性もまたさらに研究する価値がある。最後に、本発明の結果はLPCが糖尿病に対する薬品治療法を開発するのに有用なターゲットになり得るより高い可能性を提示する。
【0034】
UCNは血糖強化剤として知られているが、本発明では正常ICRマウスにUCNを投与する場合に血糖数値が減少し(図14A)、特にストレプトゾトキシン(STZ)−マウスにUCNとインシュリンを共に投与する場合、インシュリンを単独で投与した場合に比べて血糖数値がさらに減少した(図14B)。さらに、本発明ではUCNと関する血糖数値減少の分子的メカニズムを調査しようとし、その結果、本発明者はUCNがインシュリン受容体(IR)が過発現されたRat−1細胞(hIRcB細胞)及び分化するC2C12繊維亜細胞でIRの活性化に影響を与える、インシュリンによるIRの燐酸化を促進するということを確認した(図12、13)。そして、このような効果はC2C12繊維亜細胞で糖吸収と関連されていた。したがって、本発明はG−蛋白質結合受容体(GPCR)リガンドがインシュリンによって誘導されたIRの活性及び生理的機能の糖調節に特異的に敏感に反応するということを最初に明らかにした。
【0035】
インシュリンは血液内に存在する主要糖調節剤として知られているが、血糖数値を効率的で正確に調節するためには、インシュリンの機能を補助する補助因子などが必要であると提案されてきた。このような補助因子などは生理的及び病理的条件の間で互いに異なる機能的特徴を有することができる。正常的な生理的条件でインシュリンは主要糖調節剤の役割を果たすので、前記補助因子などは糖恒常性調節で付随的な役割を果たすことができる。しかし、糖尿病及び肥満のような病理的条件でインシュリンの機能は顕著に減少するので、前記補助因子はインシュリン作用を強化させて糖を調節する非常に重要な役割を果たすことができる。
【0036】
インシュリンをSTZ−マウスに投与して糖調節をする場合、一部マウス及び補助的な効果が現れたが、UCNは低血糖効果を示した。したがって、UCNは病理的条件で糖を調節するのにさらに強力な効能を有することができる。結論的に、本発明ではインシュリンと関する糖調節の新規のメカニズム及びUCNの新規の機能を明らかにした。糖恒常性側面から見る時、G−蛋白質結合受容体(GPCR)とUCNによって調節できるIRの活性が中枢神経系(CNS)と周辺システムの間で現れる機能と互いに相反するというのは非常に興味深いことである。
【0037】
本発明の薬学的組成物は糖尿病または糖尿病合併症を予防または治療するための薬剤として使用することができる。前記糖尿病の例としてはインシュリン−依存型糖尿病及びインシュリン−非依存型糖尿病などがある。特に、本発明の薬学的組成物は糖尿病合併症(例えば、神経病症、腎臓病、網膜症、巨大血管病症、冠状動脈疾患、骨粗しょう症など)を予防または治療するための薬剤として使用することができ、また糖耐性損傷を治療するための薬剤として使用することができる。
【0038】
さらに、本発明の薬学的組成物をインシュリン分泌強化剤、ビグアナイド剤及びα−グルコシダーゼ抑制剤などと混合して処理するとより優れた血糖阻害効果を提供することができる。
【0039】
本発明の薬学的組成物またはこれらそれぞれの活性成分の投与形態はタブレット、カプセル(軟質カプセル及び微細カプセルを含む)、パウダー、顆粒及びシロップなどのような経口投与形態;及び注射剤(例えば、皮下注射剤、静脈注射剤、筋肉内注射剤及び腹腔内注射剤など)、外部適用剤(例えば、鼻噴霧剤、経皮吸収剤及び軟膏など)、座剤(例えば、直腸座剤及び膣座剤など)、ペレット及び点滴注入などのような非経口投与形態を含む。
【0040】
本発明の薬学的組成物の投与量は前記各薬剤に応じて勧告された投与量を参照して適切に決定することができ、投与対象、投与対象の年齢及び体重、現在の臨床的状態、投与時間、投与形態、投与方法及び薬剤の組み合わせなどに応じて適切に選択することができる。インシュリン敏感化剤及び食欲抑制剤の投与量は臨床的に使用される投与量に基づいて適切に選択される。インシュリン敏感化剤を成人糖尿病患者(体重:50kg)に投与する場合、1日当たり0.01乃至1000mg、好ましくは0.1乃至500mgがよく、前記投与量は一日に複数回に分けて投与することができる。
【0041】
本発明を下記の実施例によってより詳しく説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するために過ぎず、本発明が下記の実施例に限定されるわけではない。
【実施例】
【0042】
[物質]
合成14:0、18:0、18:1リソフォスファチジルコリン(LPC)、インシュリン及びストレプトゾトシン(STZ)はシグマ(セントルイス、MO)から購入し、他のリゾリン脂質はAvanti polar lipids社から購入した。全てのリピドを50mMの固定濃度でメタノールに溶解してガラスバイアールに1回分量で分株した後、−70℃の窒素に貯蔵して一ケ月内に使用した。Go6976及びロットレリンはカルバイオケム(Calbiochem)から購入し、抗体は下記の会社から購入した:多クローン抗−GLUT4抗体はバイオゼニシスLtd(サンダウン、NH)から購入し、抗−ホスホ−Ser473AKT1抗体はシグマから購入し、抗−ホスホ−Tyr989IRS1は本実験室で製造し、[14C]2−デオキシ−D−グルコース(300mCi/mmol)はモラベクバイオケミカル(Moravek Biochemiacl)から購入し、トリプシンはロッシュ(マンハイム、ドイツ)から購入し、組織培養培地及び牛胎児血清はGIBCOから購入した。その他の全ての試薬は分析用級で準備した。
【0043】
[細胞培養]
3T3−L1繊維亜細胞は高い糖濃度、10%の牛胎児血清、50U/mlのペニシリンと50ug/mlのストレプトマイシンを含むDMEM培地と37℃、5%の二酸化炭素が供給される湿気のある空気条件で維持されたまま増殖した。3T3−L1細胞を脂肪細胞に分化させるために、前記で記述された方法を用いた(van den Berghe, N., et al., Mol Cell Biol 14、pp.2372−2377、1994)。
【0044】
[動物]
雄ICRマウスはヒョチャン科学(ROK)から購入し、C57BLKSJ−db/dbマウスはSLC(日本)から購入した。LPCをマウス尻尾静脈内に投与した後、尻尾の端部を切断して携帯用糖測定器(Gluco−Dr、ROK)を用いて定期的に血糖を測定した。血清内インシュリンの濃度を測定するためにマウスの血液試料をインシュリン−RIAキット(LINCO、Missouri)で分析した。インシュリン欠乏マウスはクエン酸ナトリウム(pH5.5)に溶解されたSTZ(200mg/kg)を毎日2回連続的に雄ICRマウスの腹腔内に投与して誘導した。最後のSTZを投与した後から3日目になる日に前記のような方法でビヒクル(vehicle)、LPCまたはインシュリンをマウス尻尾静脈内に投与して急性糖阻害効果を分析した。
【0045】
[HPLC精製]
約350mlの新鮮な人間血清を70%(v/v)のアセトン、1Mの酢酸及び20mMの塩酸と混合して20,000g、30分間4℃で遠心分離し、これから得られた上澄み液を収集した後、ジエチルエーテルで3回抽出した。抽出された液状部位を再び20,000g、30分間4℃で遠心分離し、これから得られた上澄み液を事前洗浄のためにSepPakC18(水)カートリッジに積載し、溶出するためにC18逆相HPLCカラム(Vydac 218TP1022、22mmx250mm)に直接積載した。10mlの分画物を収集し、各分画物の1%未満を3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を分析するのに使用した。活性分画物は37℃で12時間トリプシンで処理した後、同一量をC4逆相HPLCカラム(Vydac 214TP5215、2.1mmx150mm)及び陽イオン−交換HPLCカラム(Amersham Pharmacia Min−S HR5/5、4.6mmx50mm)に使用した。
【0046】
[質量分析及びデータ分析]
電気噴射イオン化質量分析(ESI−MS)及び連続質量分析(MS/MS)はナノ−電気噴射イオン化(nano−ESI)基質が装着されたQSTAR PULSAR I hybrid Q−TOFMS/MS(バイオシステム社から供給されたPE SCIEX、トロント、オンタリオ)を用いて行った。準備された試料はプロタナナノ噴霧チップ(オデンス、デンマーク)を用いてESI基質内に伝達された0.1%のトリフルオロ酢酸に溶解された。QSTARによって検出された全ての試料の質量はバイオシステム社から供給された分析用QSソフトウェアを用いて測定した。QSTARは24時間維持される外部目盛り(external calibration)を用いて10〜30ppmの質量精密度と8,000−10,000の解像度で作動された。前記噴射チップの電圧を2300Vに調節し、質量情報による通常の質量を確認するために結合されたオンライン−データベース;Dictionary of Natural Products(Chapman & Hall/CRC)を用いた。
【0047】
[糖吸収測定]
3T3−L1脂肪細胞での糖吸収を測定するために、細胞を血清が含有されていないDMEMで16時間増殖させた後、インシュリンまたはリゾリン脂質を添加したり添加せずに37℃で指示された時間の間に培養した。吸収率は1μCiの[14C]2−デオキシ−D−グルコース及び3mMの2−デオキシ−D−グルコースを添加して測定し、添加されて10分後冷たいPBSで2回急速に洗浄して前記反応を終結した。細胞は0.5NのNaOH及び0.1%のSDSが含まれた0.5mlの粉砕溶液を用いて粉砕し、粉砕された細胞粉砕物を液体閃光係数を測定するのに用い、非特異的な吸収率は10μMのサイトカラシンBの存在下で分析された。
【0048】
[脂肪細胞の膜分離]
3T3−L1脂肪細胞から全体膜(TM)を得るために、細胞を10mlの冷たいHES溶液(250mMのスクロース、1mMのEDTA、1mMのフェニルメチルスルホニルフルオライド[PMSF]、1μMのペプスタチン、1μMのアプロチニン、1μMのロイペプチン及び20mMのHEPES、pH7.4)内で収集した後、4℃のガラスダウンスホモジナイザーを用いて30ストロークで均質化した。粉砕されない細胞を除去するために4℃、1,000gで5分間遠心分離し、これから得られた上澄み液を4℃、212,000gで90分間遠心分離し、全体細胞の膜を収得した。3T3−L1脂肪細胞から原形質膜細胞以下の分画物を得るために、前記に記述された通りに差別的な超遠心分離を用いた(Perrini, S., et al., Diabetes53, pp.41−52,2004)。
【0049】
[PKC同種体(isoform)のアデノウイルス感染]
PKCδまたはPKCζ再組み合わせアデノウイルスを製造するためのアデノウイルス発現ベクターは前記で記述されたことがある。培養した3T3−L1脂肪細胞を分化させた後、培養液を除去してPKCδまたはPKCζ再組み合わせアデノウイルスを含むウイルス培養液を24時間前記細胞に感染させた。その後、前記感染された細胞をDMEMで2回洗浄し、48時間感染させた後に培養して糖吸収または免疫反応に使用した。
【0050】
[免疫反応]
全体細胞粉砕物を準備するために3T3−L1脂肪細胞をカルシウム/マグネシウムが添加されていないPBSで洗浄し、粉砕溶液(50mMのHEPES、pH7.2、150mMのNaCl、50mMのNaF、1mMのNa3VO4、10%のグリセロール、1%のトリトンX−100)内で粉砕した後、前記細胞粉砕物を4℃、15,000rpmで15分間遠心分離した。蛋白質をlaemmliサンプル溶液と混合して95℃で5分間加熱して変成させた後、SDS−PAGEから分離した。ホファーウェットトランスシステム(Hoefer wet transfer system)を用いてSDS−ゲルをニトロセルロース膜に伝達し、前記膜を5%の脱脂乳パウダーを含むTTBS溶液(20mMのTris−HCl、pH7.6、150mMのNaCl、0.05%のTween20)の中で所々に集めた後、3時間続けて抗体と反応させた。TTBSを用いて前記膜を複数回洗浄した後、HRP(西洋ワサビ過酸化水素)−結合された塩素抗−ウサギ抗体と1時間反応させ、再びTTBSで洗浄してECLで発色した。
【0051】
[統計分析]
全てのデータは平均±標準誤差で表記し、統計分析はStuden'stテストで行った。*P<0.01は統計的有意性があることを意味する。
【0052】
[実施例1]人間血清内の3T3−L1脂肪細胞から糖吸収促進因子であるリソホスファチジルコリンの同定
3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を促進する内在的因子を調査するために、本発明者らは体系的な平行カラムクロマトグラフィー、プロテアーゼフィルタリング、高感度MS分析に基づく新たな統合方法を用いた(図1A)。平行HPLCの基本的な原理は従来の連続的な分離(Baek, M.C., et al., Proteomics 6, pp, 1741−1749,2006)の代わりにターゲット分子を確認するために検出分析を利用することである。多段階の連続カラムによる低い収率は精製するのに非常に大きな短所となるが、これは各カラムによる収率が精製過程でも急激に減少するためである。このような新たな方法は連続的なHPLC段階を最少化し、ターゲット分子を特定するために一部精製されたHPLC分画物を用い、連続的なHPLCに比べて単に少量の出発物質が要求される。
【0053】
平行HPLCと共に本発明者らは効率的な精製のためにプロテアーゼフィルタリング法を用いた。つまり、特異プロテアーゼを処理した後、活性分画物の活性が消失しなければ、本発明者らは活性分子を含む分画物と次いで行われるカラムクロマトグラフィーを用いて多様な不活性ペプチドから前記活性分画物を確実に分離することができる。したがって、このような方法は脂質、アミン及び炭水化物のような非−ペプチド分子を分離するのに有用である。このような新たな方法で本発明者らは最初にC18逆相HPLCによって人間血清からアセトン抽出物を分画した。分画されたHPLC分画物は3T3−L1脂肪細胞で処理され、糖吸収率は[14C]2−デオキシ−D−グルコース吸収率の増加を通じて測定された(van den Berghe, N., et al., Mol Cell Biol 14, pp.2372−2377, 1994)。
【0054】
図1Bに示したように、少なくとも4種類の活性分画物が検出され(A−D)、これらの活性がトリプシン処理によって減少したかどうかを調べた結果、分画物Dの活性のみがトリプシン処理によって影響を受けなかった。したがって、前記分画物Dをトリプシンで処理し、平行状態にあるC4HPLC及び陽イオン−交換(SCX)HPLCを用いて追加的に分離した。C4HPLC及びSCXHPLCの全ての分画物は3T3−L1脂肪細胞から糖吸収を測定してスクリーニングされた(図1C及び1D)。
【0055】
各カラム(C4からは37分、SCXからは6分)から得られた活性分画物をESI−QTOF質量分析器で分析し、標準質量を探すために各質量スペクトルを比較した結果、単一同位元素質量として495.33の単に1つの標準質量値があった(図1E−上端の絵及び図1E−中央の絵)。このような質量情報を用いて本発明者らは結合されたオンライン−データベース(Dictionary of Natural Products)で検索し、パルミトイルリソフォスファチジルコリン(LPC)を特定した。ターゲット分子がLPCであるかどうかを確認するために、本発明者らはMS/MSスペクトル上で標準LPCと495.33質量の各断片化様相を分析した(図1F)。陽性−イオンモードで標準LPC産物−イオンスペクトルはm/z183で最も強いピークを含むホスホコリンヘッド基の衝突によって誘導された分離から発生した複数のイオンを現わした(図1F−下端パネル及び1G)。C4HPLC及びSCXHPLCから得られた495.33質量の断片化様相は標準LPCと正確に一致した(図1F−上端パネル及び1F−中央パネル)。前記で言及した物理的特徴に基づいて本発明者らは活性基質がLPCであると決めた。
【0056】
図1A乃至1Eは血清から新規の糖吸収促進剤を特定したものを示し、図1Aは3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を促進する血清因子の同定方法を概略的に示したもので、図1Bは血清のC18逆相HPLC(Vydac 218TP1022、22mmx250mm)の溶出様相を示したものである。相対的な2−デオキシ−D−グルコース吸収率は3T3−L1脂肪細胞でビヒクル処理に対する各分画物処理によって得られた増加比率として現わした。活性分画物Dは無作為に選択され、追加的な精製のためにトリプシンで処理された。図1Cは分画物DのC4逆相HPLC(Amersham Pharmacia Mini−SHR5/5、4.6mmx50mm)の溶出様相を示し、図1EはESI−TOF質量分析器による質量分析を示す。図1C(上端)、図1D(中央)及び標準パルミトイル16:0LPC(下端)は活性分画物の質量スペクトルを示し、図1Fは図1Eの各質量スペクトルで質量断片化及び495.33質量のMS/MSスペクトルの様相分析を示したものである。
【0057】
[実施例2]3T3−L1脂肪細胞で糖吸収に対するLPCの効能
糖吸収に対するLPCの効能を調査するために、3T3−L1脂肪細胞を多様な濃度の標準LPC存在下で時間に応じて培養した。LPCは3T3−L1脂肪細胞で時間及び濃度に応じて糖吸収の増加を促進した。糖吸収に対するLPCの初期の統計的な有効量は1μMであり、最適の有効量は20μMで確認された(図2A)。20μMのLPCで処理する場合、10分後に糖吸収が最大に増加した(図2B)。このようなLPC濃度は細胞毒性が現れず、40乃至50μMの臨界ミセル濃度(critical micellar concentration)より低濃度である(Chaudhuri, P., et al., Circ Res 97, 674−681,2005)。
【0058】
骨格筋は糖代謝で中枢的な役割を担当すると知られており、骨格筋で糖代謝の損傷はしばしば糖尿病を招く(Petersen, K.F., et al., Am J Cardiol 90,11G−18G, 2002;Beck−Nielsen, H., et al., Diabetologia 37, pp217−221,1994)。このような研究報告は3T3−L1脂肪細胞に限定されてきたが、本発明者らはまたLPCがC2C12筋肉細胞で濃度依存的に糖吸収率を増加させることを確認した。このような結果はLPCが脂肪細胞及び筋肉細胞全てで糖を調節することを意味する。
【0059】
LPCのアシル基長さ変化が糖吸収に影響を与えるかどうかを知るためにいくつかのLPCを対象として試験した。興味深く、ミリストイルLPC及びパルミトイルLPCは3T3−L1細胞で糖吸収を促進させたが、ステアロイルLPCは糖吸収を促進させなかった(図2C)。他のリゾリン脂質に対しても3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を促進させるかどうかを調査するために複数のリゾリン脂質を3T3−L1脂肪細胞に処理した。図2Dに示したように、パルミトイルLPE、パルミトイルLPG及びパルミトイルLPIは3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を促進させなかったが、これはLPCのヘッド基が3T3−L1脂肪細胞でLPCによる糖吸収促進に構造的な選択性を付与していることを意味する。
【0060】
図2A乃至2Dは3T3−L1脂肪細胞で糖吸収に対するLPCの効能を現わすもので、図2Aは6−ウォールプレートで増殖させた3T3−L1脂肪細胞に糖のないKrebs−Ringer溶液で1時間平衡化させ、LPC(0乃至30μM)またはインシュリン10nM)を10分間処理した後、物質方法に記述されたように[14C]2−デオキシ−D−グルコース吸収率を10分間の測定した結果を示したものであり、図2Bは3T3−L1脂肪細胞にLPC(20μM)を0乃至20分間処理及び培養した結果を示したものである。図2C及び2Dは3T3−L1脂肪細胞に等モル濃度のミリストイルリソフォスファチジルコリン(14:0LPC)、パルミトイルリソフォスファチジルコリン(16:0LPC)、ステアロイルリソフォスファチジルコリン(18:0LPC)、パルミトイルリゾホスファチジルエタノールアミン(16:0LPE)、パルミトイルリソホスファチジルイノシトール(16:0LPI)、パルミトイルリソホスファチジルグリセロール(16:0LPG)を10分間の処理するか処理せずに(対照群)培養して相対的な[14C]2−デオキシ−D−グルコース吸収率の測定結果を示したものである。測定値は3回の独立的な実験を行って得られた結果を平均±標準誤差で示す値である。*P<0.05vs.対照群。
【0061】
[実施例3]3T3−L1脂肪細胞でGLUT4転座を促進するLPC
3T3−L1脂肪細胞で糖輸送を促進するLPCの機能がLPCによって誘導された前記細胞表面にある糖輸送蛋白質量の変化と関連されているかどうかを調査するために、3T3−L1脂肪細胞で発現する主要糖輸送同種体であるGLUT4蛋白質の数値をLPCまたはインシュリンを処理するか処理しない基底状態の原形質膜(PM)分画物で測定した。LPCはインシュリンのようにGLUT4蛋白質のPM濃度(対照群の180%)を顕著に増加させた(図3A及び3B)。このような結果はインシュリン及びLPC全てGLUT4転座を促進させ、糖吸収実験で観察されたことと一致していることが分かる。
【0062】
図3A及び3BはLPCが3T3−L1脂肪細胞でGLUT4転座を促進していることを示したものである。A)3T3−L1脂肪細胞の原形質膜(PM)でGLU4転座に対するインシュリンの効能。LDM、低濃度ミクロソーム。3T3−L1脂肪細胞を100nMのインシュリンまたは20μMのリゾリン脂質で10分間処理して促進させた後、GLU4の統合密度値(IDV)の相対的な減少または増加を測定した。B)相対的に増加された値を定量化して表記。測定値は3回の独立的な実験を行って得られた結果を平均±標準誤差で示した値である。*P<0.05。
【0063】
[実施例4]PKCδ活性化を通じて糖吸収を促進するLPC
脂肪細胞でインシュリンが糖吸収を促進するためにはIRS1、PI3−キナーゼ及び次に起こるAKTの活性が必要である(Burgering, B.M., et al., Nature 376, pp.599−602,1995;Baumann, C.A., et al., Nature 407、pp202−207, 2000)。したがって、LPCによって増加された糖吸収がインシュリン依存型信号伝達経路、IRS1及びAKT燐酸化と関連されているかどうかを調査しようとした。予想通りに3T3−L1脂肪細胞に10nMのインシュリンを処理する場合、IRS1及びAKT燐酸化が促進された。反面、脂肪細胞にLPCを処理する場合、IRS1及びAKT燐酸化にいかなる影響も与えなかったが、これはLPCが多様な細胞で従来及び新規のPKCを活性化するためであり(Chaudhuri, P., et al., cell migration. Circ Res 97, 674−681,2005)、LPCによって誘導された糖輸送の増加とこのようなPKCの関連性については次に調査した。3T3−L1脂肪細胞に従来のPKC抑制剤である2μMのGo6976を30分間前処理する場合、LPCは糖吸収を促進させなかったが、PKCδ抑制剤である10μMのロットレリンを前処理する場合にはLPCによって促進された糖吸収が完全に抑制された(図4A)。
【0064】
PKCの機能をより直接的に調査するために、本発明者らは3T3−L1脂肪細胞に特異のPKC同種体及び優性陰性的PKC同種体を過発現させるアデノウイルス発現システムを用い、自然型(wild−type)、優性陰性的PKCδまたは優性陰性的PKCζを過発現する3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を分析した。自然型PKCδ発現は対照群3T3−L1脂肪細胞のそれと比較した時、LPCによって促進された糖輸送活性を微々に増加させ、優性陰性的PKCδの発現はLPCによって促進された糖輸送活性を顕著に減少させた。反面、優性陰性的PKCζの発現はLPC及びインシュリンによって誘導された糖吸収にいかなる影響も与えなかった(図4B)。このような結果はPKCδがLPCによって誘導された糖輸送活性に関与していることを意味する。
【0065】
図4A及び4BはLPCがPKCδを活性化して、糖吸収を促進するのを示すことで、図4Aは6−ウォールプレートで増殖させた3T3−L1脂肪細胞に糖のないKrebs−Ringer溶液で1時間平衡化させ、2μMのGo6976、10μMのロットレリンまたは溶液単独を30分間処理した後、前記細胞にビヒクル(開放棒)または20μMのLPC(満たされた棒)を10分間処理して物質方法に記述された通りに[14C]2−デオキシ−D−グルコース吸収率を10分間測定した結果を示したものであり、図4BはPKCδ及びPKCζ蛋白質の発現数値を示したものである。対照群3T3−L1脂肪細胞及び自然型PKCδ、優性陰性的PKCδまたは優性陰性的PKCζを発現する3T3−L1脂肪細胞から得られた細胞粉砕物をそれぞれ抗−PKCδ抗体または抗−PKCζ抗体と免疫反応させ(上端)、3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を測定した(下端)。前記各細胞にビヒクル、20μMのLPCまたは10nMのインシュリンを10分間処理及び培養した。測定値は3回の独立的な実験を行って得られた結果を平均±標準誤差で示した値である。*P<0.05。
【0066】
[実施例5]マウスでLPCの糖阻害効能
LPCの生体内効能は雄アルビノICR(癌研究学会)マウスを用いて調査した。前記マウスの尻尾静脈内にLPCを投与する場合、30分以内に血糖数値が統計的に留意に減少したが(図5A)、このような効能は濃度に依存的であるが、血液内インシュリン数値の変化によるものではない(図5C)。
【0067】
LPCの種類に応じてその活性が異なるかどうかを調査するために多様な長さのアシル基を有するLPCまたは他のリゾリン脂質であるリソホスファチジルエタノールアミンを30μmol/kgの等モル濃度でマウスの尻尾静脈内に投与した。興味深く、単にパルミトイルLPCのみが血糖を顕著に減少させた(図5B)。次いで、本発明者らは30μmol/kgのLPCをストレプトゾトキシン(STZ)−処理されたインシュリン欠乏マウスに投与し、その結果LPCが血糖濃度を顕著に減少させ、このような効果はインシュリンを投与した結果と類似していた(図5D)。
【0068】
次に、本発明者らはLPCの投与がインシュリン−耐性の肥満db/dbマウスの血糖症(glycemia)にも影響を与えるかどうかを調査し、その結果LPC投与後に血糖がほとんど正常数値に落ちることを確認した(図5E)。総合してみると、このような結果はLPCが正常マウスだけでなくタイプI及びタイプII糖尿病マウスモデルでも血糖数値を調節することができることを意味する。
【0069】
図5A乃至5Eは糖尿病マウスモデルで尻尾静脈内に投与されたLPCの抗−糖尿効能を示したもので、図5A及び5BはICRマウスでLPCによる急性糖阻害効能を示したものである。8周齢の雄マウスにPBS、インシュリン、LPCまたはLPEを尻尾静脈内に投与し、血糖は投与した後にモニターした(0乃至120分)。図5Cは8周齢の雄マウスの尻尾静脈内にLPCを単一投与した後に血清内インシュリン数値を示したものであり、図5Dはストレプトゾトキシン(STZ)−処理されたインシュリン欠乏ICR雄マウスでLPCによる急性糖阻害効能を示したものであり、図5Eはインシュリン−耐性の肥満C57BLKSJ−db/dbマウスでLPCによる急性糖阻害効能を示したものである。全ての動物は水を自由に摂取し、国際的な指針にしたがって保護された。全てのデータは平均±標準誤差で示した(n=5−6)。*P<0.05。
【0070】
[実施例6]糖吸収に対するLPSの効能
(6−1)3T3−L1脂肪細胞で糖吸収に対するLPSの効能
LPCと関する実施例と実質的に同様な方法で3T3−L1脂肪細胞でLPSの効能を調査し、その結果を図6A及び6Bに示した。
【0071】
6−ウォールプレートで増殖させた3T3−L1脂肪細胞に糖のないKrebs−Ringer溶液で1時間平衡化させ、等モル濃度(20μM)のリソフォスファチジルコリン(LPC)、リゾホスファチジルセリン(LPS)、リソホスファチジルエタノールアミン(LPE)、リソホスファチジルイノシトール(LPI)、リソホスファチジルグリセロール(LPG)をそれぞれ10分間処理及び培養した。図6AはLPC及びLPSが3T3−L1脂肪細胞で特異的に糖吸収を促進することを示したもので、図6BはLPSが濃度依存的に糖吸収を促進することを示したものである(0乃至30μM)。測定値は3回の独立的な実験を行って得られた結果を平均±標準誤差で示した値である。*P<0.05vs.対照群。
【0072】
(6−2)糖尿病マウスモデルでLPSの糖阻害効能
LPCと関する実施例と実質的に同様な方法でマウスでLPSの効能を調査し、その結果を図7A乃至7Dに示した。
【0073】
図7A乃至7Bは糖尿病マウスモデルで尻尾静脈内に投与されたLPSの糖阻害効能を示したものである。8周齢の雄マウスにPBS、インシュリン、LPSを尻尾静脈内に投与し、血糖は投与した後にモニターした(0乃至120分)。図7Aに示したようにLPSは濃度−依存的に正常マウスの血糖数値を減少させた。S1P及びLPEのような他のリゾリン脂質は正常マウスで血糖数値を減少させなかった(図7B)。次に、8周齢の雄マウスの尻尾静脈内にLPSを単一投与した後、血清内インシュリン数値を測定し、その結果血糖数値が統計的に有意に減少したが、このような効能は血液内インシュリン数値の変化によるものではない(図7C)。次いで、本発明者らはLPSをストレプトゾトキシン(STZ)−処理されたインシュリン欠乏マウスに投与し、その結果LPSが血糖濃度を顕著に減少させ、このような効果はインシュリンを投与した結果と類似していた(図7D)。このような結果からLPSは血糖数値を濃度−依存的に阻害させ、インシュリン分泌に影響を与えず、特にインシュリンが欠乏したタイプI糖尿病マウスモデルで糖を調節する効能があった。全ての動物は水を自由に摂取し、国際的な指針にしたがって保護された。全てのデータは平均±標準誤差で示した(n=5−6)。*P<0.05。
【0074】
[実施例7]3T3−L1脂肪細胞で糖吸収に対するLPAの効能
(7−1)3T3−L1脂肪細胞で糖吸収に対するLPAの効能
LPCと関する実施例と実質的に同様な方法で3T3−L1脂肪細胞でLPAの効能を調査し、その結果を図8A及び8Bに示した。糖吸収に対するLPAの効能を調査するために3T3−L1脂肪細胞を多様な濃度の標準LPAの存在下で時間に応じて培養した。LPAは3T3−L1脂肪細胞で時間及び濃度に応じて糖吸収の増加を促進させた。糖吸収に対するLPAの初期の統計的な有効量は1μMであり、最適の有効量は20μMで確認された(図8A)。20μMのLPAに処理する場合、10分後に糖吸収が最大に増加した(図8B)。図9Aは6−ウォールプレートで増殖させた3T3−L1脂肪細胞に糖のないKrebs−Ringer溶液で1時間平衡化させ、LPA(0乃至20μM)またはインシュリン(10nM)を10分間処理した後、物質方法に記述されたように[14C]2−デオキシ−D−グルコース吸収率を10分間の測定した結果を示したものであり、図9Bは3T3−L1脂肪細胞にLPA(20μM)を0乃至20分間処理及び培養した結果を示したものである。
【0075】
(7−2)LPAによる糖吸収促進の信号伝達メカニズム
LPCと関する実施例と実質的に同様な方法で3T3−L1脂肪細胞でLPAの効能を調査し、その結果を図9A及び9B、図10A及び10Bに示した。LPAがその受容体を通じて糖吸収に影響を与えるかどうかを調査するために、本発明者らはLPA受容体拮抗剤であるKi16425を用いた。図9AはLPAによって促進された糖吸収がKi16425前処理によって完全に抑制されることを示したものである。次いで、本発明者らはLPAがGαi抑制剤である百日咳毒素(pertussi toxin)を用いてGαiと結合したLPA受容体を活性化するかどうかを調査した。
【0076】
図9BはLPAがGαiを活性化させて糖吸収を促進することを示したものである。
インシュリンがPI3−キナーゼ依存型信号伝達経路を通じて糖吸収を促進するということはよく知られているので、このような信号伝達経路を通じてLPAが糖吸収を促進するかどうかを調査するために、本発明者らはPI3−キナーゼの下位信号であるAKtを確認し、その結果AktがLPAによって影響を受けることを確認した。図10AはLPAがAkt燐酸化を促進していることを示したもので、このような燐酸化はPI3−キナーゼ抑制剤であるLY294002前処理を通じて抑制された。次いで、LPAがPI3−キナーゼ信号伝達経路を通じて実質的に糖吸収を促進するかどうかを調査するために本発明者らは3T3−L1脂肪細胞にLY294002を前処理し、糖吸収を測定した。図10BはLPAによって促進された糖吸収がPI3−キナーゼ活性に依存的であることを示したものである。
【0077】
(7−3)マウスモデルでLPAの糖阻害効能
LPCと関する実施例と実質的に同様な方法で動物モデルでLPAの糖−阻害効能を調査し、その結果を図11A乃至11Dに示した。
【0078】
図11A乃至11Bはマウスモデルで尻尾静脈内に投与されたLPAの糖阻害効能を示したものである。8周齢の雄マウスにPBS、インシュリン、LPAを尻尾静脈内に投与し、血糖は投与後モニターした(0乃至120分)。図11Aは8周齢の雄マウスの尻尾静脈内にLPAを単一投与した後に血清内インシュリン数値を示したもので、LPAは正常マウスで濃度−依存的に血糖数値を減少させた。S1P及びLPEのような他のリゾリン脂質は正常マウスで血糖数値を減少させなかった(図11B)。このような効能は血液内インシュリン数値の変化によるものではない(図11C)。
【0079】
最後に、本発明者らはLPAによる糖阻害効能がLPA受容体の活性に依存的であるかどうかを調査しようとした。LPAを投与する前、LPA受容体抑制剤であるKi16425を投与した。図11DはLPAによって促進された糖吸収がLPA受容体抑制剤によって抑制されることを示したものである。このような結果から、LPAは血糖数値を濃度−依存的に阻害させ、インシュリン分泌に影響を与えず、特に、LPAによる血糖阻害はLPA受容体活性と関していた。全ての動物は水を自由に摂取し、国際的な指針にしたがって保護された。全てのデータは平均±標準誤差で示した(n=5−6)。*P<0.05。
【0080】
[実施例8]hIRcB細胞でIR自動燐酸化に対するUCNの効能
物質:Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)はBioWhittaker社から購入し、牛胎児血清(FBS)及び馬血清(ES)はHyClone社(Logan、UT)から購入した。コルチコトロフィン放出因子(CRF)、ウロコルチン(UCN)、ストレスコルピン防虫ペプチド(SRP)及びストレスコルピンはアニゲン(光州、韓国)で合成し、ホスホ−インシュリン受容体抗体、IRS抗体、IR抗体及びAKT抗体はセルシグナル社(ビーバーリ、MA)から購入し、[14C]2−デオキシ−D−グルコースはモラベック(マーキュリー、CA)から購入した。その他の全ての試薬はシグマ(セントルイス、MO)から入手した。
【0081】
免疫反応を含む全ての実験は独立的に少なくとも3回反復実施し、本発明の免疫反応は3回以上の独立的な実験の中で代表的なものである。定量的なデータは平均±標準誤差で表記し、”Student'stテスト”を適切に使用した。P<0.05は統計的有意性があることを意味する。
【0082】
図12Aは1mMのCRF類及び/または2nMのインシュリンまたは培地単独を1分間処理して培養した細胞から収得したCRF類の中でインシュリンに対する敏感性を比較した結果を示したものである。インシュリンに対するUCNの敏感性は濃度(12B、12C)及び時間(12D)によって増加した。図12Bは2nMのインシュリン及び多様な濃度のUCN(2nM乃至1mM)を1分間処理して培養した細胞から得られた結果であり、図12Cは100nM及び多様な濃度のインシュリンを1分間処理して培養した細胞から得られた結果である。IRの燐酸化は抗−pTyr抗体を用いた“ウェスタンブロット”で分析した。図13Dは100nMのUCN及び/または10nMのインシュリンを0、2、10、30及び60分間処理して培養した細胞から得られた結果で、この時、IRの燐酸化は抗−pIR抗体を用いた“ウェスタンブロット”で分析した。IR自動燐酸化の定量はイメージゲージソフトウェア(富士フィルム)を用いて測定した。測定値は3回の独立的な実験から得られた結果を平均±標準誤差で示した値である(n=5−6)。*,P<0.05。
【0083】
[細胞培養]
hIRcB細胞は10%(v/v)FBSを含むDMEMと37℃、5%の二酸化炭素及び95%の空気が供給される湿気のある空気条件で維持されたまま増殖した。
【0084】
[免疫沈澱及び免疫反応]
指示された時間及び濃度でリガンドを処理した後、細胞を冷たいPBSで洗浄してプロテアーゼ抑制剤(0.5mMのPMSF、1mg/mlのロイペプチン及び5mg/mlのアプロチニン)及びフォスファターゼ抑制剤(30mMのNaF、1mMのNa3VO4及び30mMのNa4O7P2)を含む粉砕溶液(50mMのHEPES、pH7.5、150mMのNaCl、1%のトリトンX−100,1mMのEDTA、10%のグリセロール)内で粉砕した。粉砕された前記細胞粉砕物を4℃で1時間反応させて14,000rpmで15分間遠心分離した後、同量の液状抽出物を5mg抗−IR抗体及び30mlレジン体積の固定蛋白質Aと共に4時間反応させた。ゲル電気泳動を行うために前記沈殿物をレムルリサンプル溶液と混合してSDS−PAGEから分離した後、ニトロセルロース膜(Schleicher and Schuell社、BA85)に伝達した。ブロッキングは5%の脱脂乳パウダーを含むTTBS溶液(10mMのTris/HCl、pH7.5、150mMのNaCl及び0.05%のTween20)で行い、前記膜を3時間室温で1次抗体と反応させた。次いで、前記防止する洗浄して西洋ワサビ過酸化水素−結合された2次抗体と1時間室温で反応させた後、TTBS溶液で4回洗浄し、西洋ワサビ過酸化水素−依存型化学発光試薬(Amersham International, United Kingdom)で発色した。
【0085】
本実施例でウロコルチン(UCN)及びコルチコトロピンフィン放出因子(CRF)はIR過発現されたhIRcB細胞で他の類、つまり、ストレス−関連ペプチド(SRP)及びストレスコルピン(SCP)に比べてインシュリンによるIR燐酸化に優勢に作用していることを確認した(図12A)。UCN及びCRF単独はIR燐酸化にいかなる影響も与えなかった。UCN及びCRFがインシュリンによるIR燐酸化に優勢に作用するとしてもUCNはCRFに比べてCRF受容体1(CRFR1)により高い親和性を持っている。UCNによって誘導されたインシュリンによるIR燐酸化は濃度(図12B)及び時間(図12D)に応じて促進された。特に、図12Cに示したようにIR燐酸化に対するUCNの効能は低濃度のインシュリン存在下でさらに強力であるが、これはUCNがhIRcB細胞で特異的にインシュリンによるIR燐酸化に敏感に反応するためである。
【0086】
[実施例9]C2C12繊維亜細胞で糖吸収及びIR燐酸化に対するUCNの効能
UCNはインシュリンによって誘導された糖吸収及びIR燐酸化、IRS及びAktを促進させた。繊維亜細胞は2nMのUCN及び/または多様なインシュリン濃度(0乃至20nM)で1分間培養され、IRS及びAktの燐酸化は抗−pIRS抗体及び抗−pAkt抗体を用いたウェスタンブロットで分析した。糖吸収は下記のように行った。
【0087】
[細胞培養]
C2C12細胞は10%(v/v)のFBSを含むDMEMと37℃、5%の二酸化炭素及び95%の空気が供給される湿気のある空気条件で維持されたまま増殖した。C2C12細胞の分化のために増殖用培地を2%(v/v)のESを含むDMEMで変えて7日間培養した。
【0088】
[糖吸収分析]
細胞を分化させた後、細胞を洗浄して130mMのNaCl、5mMのKCl、1.3mMのCaCl2・2H2O、1.3mMのMgSO4・7H2O及び10mMのNa2HPO4・7H2O、pH7.4を含む2mlのKrebs−Ringer phosphate(KRP)で3時間培養した。糖吸収に対するUCNの効能を分析するために指示された条件で1mlのKRPで10分間培養して行った。前記反応は[14C]2−DG(1mCi/ml)及び非−放射能2−DG(最終濃度:20mM)の混合物を10分間添加して行い、溶媒を除去した後に冷たい燐酸緩衝溶液(水1Lに8gのNaCl、0.2gのKCl、1.15gのNa2HPO4・12H2O及び0.2gのKH2PO4を含むPBS)で急速に2回洗浄した。細胞−連関放射能は1NのNaOHで細胞を粉砕した後、閃光係数で測定し、非特異的な吸収率は全体吸収率値から特異的な吸収率の値を除いて測定した。
【0089】
免疫沈澱及び免疫反応は実施例8の方法によって行った。
IR活性は筋肉で糖吸収に中枢的な役割を担当すると知られており、UCNはインシュリンによるIR活性化を促進させて糖吸収を調節すると見なされている。これを確認するために本発明者らはC2C12繊維亜細胞で糖吸収及びインシュリンによる信号伝達を調査した。UCNの存在下でインシュリンによるIR燐酸化は強化され、インシュリンによる糖吸収もまた顕著に増加したが(図13)、UCN単独ではこのような効果が現れなかった。このような結果はUCNがC2C12繊維亜細胞でインシュリンによって促進された糖吸収に優勢に作用してインシュリン−媒介信号伝達経路でインシュリンの敏感化剤として作用して誘導されたものであると言える。
【0090】
[実施例10]正常及びSTZ−マウスで原形質糖調節に対するUCNの効能
UCNはHPA軸を促進させて血糖を強化させる強化剤としてよく知られており、UCNの生体内機能は血糖数値を抑制するという本発明の生体内結果とは相反する。したがって、これらの間の不一致を区別するために本発明者らはマウスに多様な濃度のUCNを投与し、血糖数値の変化を調査した。
【0091】
図14AはICRマウスでUCNによって減少した血糖を示したものであり、挿入された免疫反応データは骨格筋でUCNによるIR燐酸化を示したものである。マウスにビヒクル(0.1%のBSAを含む食塩水)またはUCN(0.1−100pM)を尻尾静脈内に投与し、測定値は4匹の対照群及び4匹のUCN−処理されたマウスから得られた結果を平均±標準誤差で示した値である。図14BはSTZマウスでUCNによって減少した血糖を示したものであり、挿入された免疫反応データはSTZマウスの骨格筋でUCN処理によるIR燐酸化を示したものである。マウスにビヒクル(0.1%のBSAを含む食塩水)、UCN(0.1pM)及び/またはインシュリン(1nM)を尻尾静脈内に投与し、糖の原形質数値を45分間測定した。測定値は6匹の各群から得られた結果を平均±標準誤差で示した値である。*,P<0.05。
【0092】
(10−1)試験動物準備
正常試験動物を準備するために体重が20〜25gで8周齢の雄ICR(癌研究学会)マウスをヒョチャン科学から購入し、温度及び光が調節された部屋(20〜22℃;12時間の照明と12時間の暗黒サイクル;午前7時に照明開始)にあるケージ内で4日間適応させ、一般的な平常時食事と水を自由に供給した。動物実験の手続は実験動物使用及び管理に関する韓国政府の指針にしたがって行われた。生体内実験で一晩断食させたマウスに0.1%のBSAを含む食塩水またはUCNを尻尾静脈内に投与した後、糖分析器(モデルAGM−2100,almedicus社、安養、韓国)を用いて時間に応じる原形質糖を測定した。
【0093】
STZ−マウスを準備するために体重が20〜25gで8周齢の雄ICR(癌研究学会)マウスをヒョチャン科学から購入した。STZによって誘導された糖尿病マウスは1日間断食させた雄ICRマウスにSTZ(シグマ社、セントルイス、MO)(75mg/kg)を尻尾静脈内に投与して準備し、翌日STZをさらに一回投与した。原形質濃度が280mg/dlであるマウスをタイプI糖尿病を有するマウスに決めた。全ての試験はSTZ投与した後、3日間行った。
【0094】
(10−2)マウス骨格組織でIR信号伝達分析
一晩断食させたマウスに作用剤を尻尾静脈内に投与して15分後に殺した後、ヒラメ筋(soleus muscle)を迅速に切開して液体窒素で凍結させた。細胞粉砕物はプロテアーゼ抑制剤(0.5mMのPMSF、1mg/mlのロイペプチン及び5mg/mlのアプロチニン)及びフォスファターゼ抑制剤(30mMのNaF、1mMのNa3VO4及び30mMのNa4O7P2)を含む粉砕溶液(50mMのHEPES、pH7.5、150mMのNaCl、1%のトリトンX−100、1mMのEDTA、10%のグリセロール)内で前記組織を均質化して準備した。破片は4℃、14,000rpmで10分間遠心分離して除去し、免疫沈澱及びウェスタンブロットは前記で記述された方法で行った。
【0095】
予想の通り100pM以上のUCNを単独処理すると血糖数値を増加させたが、興味深く0.1pMのUCNを単独処理すると血糖数値を減少させた。生体内システムと反対に血液内には基底インシュリンが存在するために本発明者らはUCNがマウスで基底血中インシュリンを有することによって糖阻害効能を有し、HPA軸はピコモル以下の濃度では活性化しないと予想した。また、UCNがインシュリン分泌を調節することができ、インシュリンに独立的に血糖数値を阻害することができるといういくつかの可能性もある。したがって、本発明者らはインシュリン−媒介生理学でUCNの機能を調査するためにインシュリン−欠乏モデルシステムであるストレプトゾトキシン(STZ)−処理されたマウスを用いた。
【0096】
図14Bに示したように、UCNを単独処理すると血糖数値変化にいかなる影響も与えなかった。これはUCNが血糖数値調節でインシュリンと独立的に作用しないことを意味する。しかし、UCNを不活性濃度のインシュリンと共にSTZ−マウスに投与する場合、血糖数値が顕著に減少した。このような結果はマウス骨格筋でのIR燐酸化と非常に密接な関係があり、UCNはマウス骨格筋でインシュリンによって誘導されたIR燐酸化に非常に敏感に反応した。このような結果はウロコルチンもまた生体内でインシュリンに敏感な効能を有していることを意味する。
【図面の簡単な説明】
【0097】
【図1A】図1Aは、血清から新規の糖吸収促進剤を特定したことを示す。
【図1B】図1Bは、血清から新規の糖吸収促進剤を特定したことを示す。
【図1C】図1Cは、血清から新規の糖吸収促進剤を特定したことを示す。
【図1D】図1Dは、血清から新規の糖吸収促進剤を特定したことを示す。
【図2A】図2Aは、3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を促進するLPCの効能を示す。
【図2B】図2Bは、3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を促進するLPCの効能を示す。
【図2C】図2Cは、3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を促進するLPCの効能を示す。
【図2D】図2Dは、3T3−L1脂肪細胞で糖吸収を促進するLPCの効能を示す。
【図3A】図3Aは、3T3−L1脂肪細胞でGLUT4の転座を促進するLPCを示す。
【図3B】図3Bは、3T3−L1脂肪細胞でGLUT4の転座を促進するLPCを示す。
【図4A】図4Aは、PKCδを活性化して糖吸収を促進するLPCを示す。
【図4B】図4Bは、PKCδを活性化して糖吸収を促進するLPCを示す。
【図5A】図5Aは、正常マウスとタイプI及びタイプII糖尿病マウスモデルでそれぞれ尻尾静脈内に投与されたLPCの抗−糖尿効果を示す。
【図5B】図5Bは、正常マウスとタイプI及びタイプII糖尿病マウスモデルでそれぞれ尻尾静脈内に投与されたLPCの抗−糖尿効果を示す。
【図5C】図5Cは、正常マウスとタイプI及びタイプII糖尿病マウスモデルでそれぞれ尻尾静脈内に投与されたLPCの抗−糖尿効果を示す。
【図5D】図5Dは、正常マウスとタイプI及びタイプII糖尿病マウスモデルでそれぞれ尻尾静脈内に投与されたLPCの抗−糖尿効果を示す。
【図5E】図5Eは、正常マウスとタイプI及びタイプII糖尿病マウスモデルでそれぞれ尻尾静脈内に投与されたLPCの抗−糖尿効果を示す。
【図6A】図6Aは、3T3−L1脂肪細胞で特異的に糖吸収を促進するLPSを示す。
【図6B】図6Bは、3T3−L1脂肪細胞で濃度による糖吸収を促進するLPSを示す。
【図7A】図7Aは、正常マウス及びタイプI糖尿病マウスモデルで血糖数値を下げるLPCを示す。
【図7B】図7Bは、正常マウス及びタイプI糖尿病マウスモデルで血糖数値を下げるLPCを示す。
【図7C】図7Cは、正常マウス及びタイプI糖尿病マウスモデルで血糖数値を下げるLPCを示す。
【図7D】図7Dは、正常マウス及びタイプI糖尿病マウスモデルで血糖数値を下げるLPCを示す。
【図8A】図8Aは、3T3−L1脂肪細胞で濃度及び時間による糖吸収を促進するLPAを示す。
【図8B】図8Bは、3T3−L1脂肪細胞で濃度及び時間による糖吸収を促進するLPAを示す。
【図9A】図9Aは、3T3−L1脂肪細胞でLPA受容体及びGαiを活性化させて糖吸収を促進するLPAを示す。
【図9B】図9Bは、3T3−L1脂肪細胞でLPA受容体及びGαiを活性化させて糖吸収を促進するLPAを示す。
【図10A】図10Aは、3T3−L1脂肪細胞でPI3−キナーゼ依存型信号伝達経路を通じて糖吸収を促進するLPAを示す。
【図10B】図10Bは、3T3−L1脂肪細胞でPI3−キナーゼ依存型信号伝達経路を通じて糖吸収を促進するLPAを示す。
【図11A】図11Aは、正常マウスでLPA受容体を活性化させて血糖数値を下げるLPAを示す。
【図11B】図11Bは、正常マウスでLPA受容体を活性化させて血糖数値を下げるLPAを示す。
【図11C】図11Cは、正常マウスでLPA受容体を活性化させて血糖数値を下げるLPAを示す。
【図11D】図11Dは、正常マウスでLPA受容体を活性化させて血糖数値を下げるLPAを示す。
【図12A】図12Aは、hIRcB細胞でIR自動燐酸化に対するUCNの効能を示す。
【図12B】図12Bは、hIRcB細胞でIR自動燐酸化に対するUCNの効能を示す。
【図12C】図12Cは、hIRcB細胞でIR自動燐酸化に対するUCNの効能を示す。
【図12D】図12Dは、hIRcB細胞でIR自動燐酸化に対するUCNの効能を示す。
【図13A】図13Aは、C2C12繊維亜細胞でIR燐酸化及び糖吸収に対するUCNの効能を示す。
【図13B】図13Bは、C2C12繊維亜細胞でIR燐酸化及び糖吸収に対するUCNの効能を示す。
【図14A】図14Aは、正常マウス及びSTZマウス血糖調節に対するUCNの効能を示す。
【図14B】図14Bは、正常マウス及びSTZマウス血糖調節に対するUCNの効能を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
リソフォスファチジルコリン(LPC)、リゾホスファチジルセリン(LPS)、リソホスファチジン酸(LPA)及びウロコルチン(UCN)からなる群の中から選択されたいずれかの化合物を含むことを特徴とする糖吸収調節剤。
【請求項2】
LPCに対する糖吸収調節はPKCδ抑制剤であるロットレリン及びPKCδの優性陰性的発現によって阻害され、PI3−キナーゼ依存型信号伝達経路に独立的であることを特徴とする、請求項1に記載の糖吸収調節剤。
【請求項3】
前記リソフォスファチジルコリンはミリストイルLPCまたはパルミトイルLPCであることを特徴とする、請求項1に記載の糖吸収調節剤。
【請求項4】
ウロコルチンはインシュリンと共にインシュリン−敏感化剤として作用することを特徴とする、請求項1に記載の糖吸収調節剤。
【請求項5】
リソフォスファチジルコリン、リゾホスファチジルセリン、リソホスファチジン酸及びウロコルチンからなる群の中で選択された少なくともいずれか1つの糖吸収調節剤を含むことを特徴とする薬学的組成物。
【請求項6】
薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤をさらに含むことを特徴とする、請求項5に記載の薬学的組成物。
【請求項7】
インシュリン分泌強化剤、ビグアナイド剤及びα−グルコシダーゼ抑制剤からなる群の中で選択された少なくともいずれか1つの化合物をさらに含むことを特徴とする、請求項5に記載の薬学的組成物。
【請求項8】
前記糖吸収調節剤はインシュリンと混合して使用されることを特徴とする請求項5に記載の、薬学的組成物。
【請求項9】
リソフォスファチジルコリン、リゾホスファチジルセリン、リソホスファチジン酸及びウロコルチンからなる群の中で選択されたいずれか1つの糖吸収調節剤を有効量で哺乳類に投与することを含む哺乳類の糖尿病または糖尿病合併症の治療方法。
【請求項10】
前記糖尿病はインシュリン−依存型糖尿病またはインシュリン−非依存型糖尿病であることを特徴とする、請求項9に記載の治療方法。
【請求項11】
前記糖尿病合併症は肥満、高脂血症、動脈硬化症、高血圧または心臓病であることを特徴とする、請求項10に記載の治療方法。
【請求項12】
インシュリン分泌強化剤、ビグアナイド剤及びα−グルコシダーゼ抑制剤からなる群の中で選択された少なくともいずれか1つの化合物を混合して製造された糖吸収調節剤を有効量で哺乳類に投与することをさらに含むことを特徴とする、請求項11に記載の治療方法。
【請求項13】
前記ウロコルチンはインシュリンと混合して投与されることを特徴とする、請求項9に記載の治療方法。
【請求項1】
リソフォスファチジルコリン(LPC)、リゾホスファチジルセリン(LPS)、リソホスファチジン酸(LPA)及びウロコルチン(UCN)からなる群の中から選択されたいずれかの化合物を含むことを特徴とする糖吸収調節剤。
【請求項2】
LPCに対する糖吸収調節はPKCδ抑制剤であるロットレリン及びPKCδの優性陰性的発現によって阻害され、PI3−キナーゼ依存型信号伝達経路に独立的であることを特徴とする、請求項1に記載の糖吸収調節剤。
【請求項3】
前記リソフォスファチジルコリンはミリストイルLPCまたはパルミトイルLPCであることを特徴とする、請求項1に記載の糖吸収調節剤。
【請求項4】
ウロコルチンはインシュリンと共にインシュリン−敏感化剤として作用することを特徴とする、請求項1に記載の糖吸収調節剤。
【請求項5】
リソフォスファチジルコリン、リゾホスファチジルセリン、リソホスファチジン酸及びウロコルチンからなる群の中で選択された少なくともいずれか1つの糖吸収調節剤を含むことを特徴とする薬学的組成物。
【請求項6】
薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤をさらに含むことを特徴とする、請求項5に記載の薬学的組成物。
【請求項7】
インシュリン分泌強化剤、ビグアナイド剤及びα−グルコシダーゼ抑制剤からなる群の中で選択された少なくともいずれか1つの化合物をさらに含むことを特徴とする、請求項5に記載の薬学的組成物。
【請求項8】
前記糖吸収調節剤はインシュリンと混合して使用されることを特徴とする請求項5に記載の、薬学的組成物。
【請求項9】
リソフォスファチジルコリン、リゾホスファチジルセリン、リソホスファチジン酸及びウロコルチンからなる群の中で選択されたいずれか1つの糖吸収調節剤を有効量で哺乳類に投与することを含む哺乳類の糖尿病または糖尿病合併症の治療方法。
【請求項10】
前記糖尿病はインシュリン−依存型糖尿病またはインシュリン−非依存型糖尿病であることを特徴とする、請求項9に記載の治療方法。
【請求項11】
前記糖尿病合併症は肥満、高脂血症、動脈硬化症、高血圧または心臓病であることを特徴とする、請求項10に記載の治療方法。
【請求項12】
インシュリン分泌強化剤、ビグアナイド剤及びα−グルコシダーゼ抑制剤からなる群の中で選択された少なくともいずれか1つの化合物を混合して製造された糖吸収調節剤を有効量で哺乳類に投与することをさらに含むことを特徴とする、請求項11に記載の治療方法。
【請求項13】
前記ウロコルチンはインシュリンと混合して投与されることを特徴とする、請求項9に記載の治療方法。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図12C】
【図12D】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図3A】
【図10A】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図12C】
【図12D】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図3A】
【図10A】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【公表番号】特表2009−500401(P2009−500401A)
【公表日】平成21年1月8日(2009.1.8)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2008−520187(P2008−520187)
【出願日】平成18年7月7日(2006.7.7)
【国際出願番号】PCT/KR2006/002656
【国際公開番号】WO2007/007982
【国際公開日】平成19年1月18日(2007.1.18)
【出願人】(503367099)ポステック ファンデーション (15)
【出願人】(502258417)ポスコ (73)
【Fターム(参考)】
【公表日】平成21年1月8日(2009.1.8)
【国際特許分類】
【出願日】平成18年7月7日(2006.7.7)
【国際出願番号】PCT/KR2006/002656
【国際公開番号】WO2007/007982
【国際公開日】平成19年1月18日(2007.1.18)
【出願人】(503367099)ポステック ファンデーション (15)
【出願人】(502258417)ポスコ (73)
【Fターム(参考)】
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