糖型バイオサーファクタント生産能を有する微生物及びそれを用いる糖型バイオサーファクタントの製造方法
【課題】 化粧品、食品、農畜産業など、生体に対する安全性がより求められる用途に対して、従来よりも適応性に優れたバイオサーファクタントを提供するべく、食用植物から単離したバイオサーファクタントを生産する能力を有する微生物ならびにそれを用いるバイオサーファクタントの造方法の提供。
【解決手段】 マンノシルエリスリトールリピッドを生産することなくバイオサーファクタントを生産する能力を有するウスチラゴ属に属する微生物。該微生物を培養しバイオサーファクタントを生産することを特徴とする、バイオサーファクタントの製造方法。
【解決手段】 マンノシルエリスリトールリピッドを生産することなくバイオサーファクタントを生産する能力を有するウスチラゴ属に属する微生物。該微生物を培養しバイオサーファクタントを生産することを特徴とする、バイオサーファクタントの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオサーファクタントを生産する能力を有するウスチラゴ属に属する微生物、特にバイオサーファクタントを生産する能力を有するマコモ属に属する植物から単離した微生物、ならびに、古くから食品として利用されてきた植物であるマコモ由来の微生物を使用することで、食品産業、農業、畜産業等への利用も期待できるバイオサーファクタント（微生物由来の両親媒性脂質）を製造する方法、より具体的には、古くから食品として利用されてきた植物であるマコモ由来の微生物の使用により、バイオサーファクタントの一種であるセロビオースリピッドを、副生物を含まず選択的に発酵生産する製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖脂質は、脂質に１〜１０数個の単糖が結合した物質であり、生体内において細胞間の情報伝達に関与し、神経系・免疫系の機能維持にも重要な役割を果たしていること等が明らかにされつつある。一方で、糖脂質は、糖の性質に由来する親水性と脂質の性質に由来する親油性の二つの性質を合わせ持つ両親媒性物質であり、このような性質を有する物質は界面活性物質と呼ばれている。
【０００３】
一方、一部の微生物はこれらの界面活性物質を効率良く生産することが知られており、この生物由来界面活性剤（バイオサーファクタント）は、安全性が高く、環境に対する負荷が少ない生分解性に優れた環境先進型界面活性剤として研究が進められている。現在、微生物が生産する界面活性物質としては、糖型系の一つである糖脂質系、アシルペプチド系、リン脂質系、脂肪酸系及び高分子化合物系の５つに分類されているが、特にこの内の糖脂質系の界面活性剤については、最もよく研究され、細菌及び酵母によって生産された多くの種類の物質が報告されている。
【０００４】
これらの糖脂質等のバイオサーファクタントは、生分解性が高く、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能を持つといわれている。このことから、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等にこれらのバイオサーファクタントを幅広く適用することは、持続可能社会の実現と高機能製品の提供という、両面を兼ね備えており極めて有意義である。
【０００５】
糖脂質型のバイオサーファクタントには、次のようなものが例として挙げられる。
【０００６】
ラムノリピッド（Rhamnolipid；以下、RLと省略する。）は、結核菌の抗生物質としてシュードモナス アエルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）（緑膿菌）の培養液から最初に発見されている（非特許文献１参照）。
また、これまでにシュードモナス（Pseudomonas）属の細菌から４種類の同族体が報告されており、当初は数ｇ／Ｌ程度の生産量であったが、現在では１００ｇ／Ｌ以上の生産を可能にしている（非特許文献２参照）。
【０００７】
トレハロースリピッド（Trehalose lipid；以下、TLと省略する。）は、コリネバクテリウム（Corynebacterium）等の細胞表層物質として発見された。また、類似の物質が、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、ノカルディア（Nocardia）、ロドコッカス（Rodococcus）属細菌からも報告されている（非特許文献３参照）。
一般的に、細胞壁に結合しているために生産量は低いが、ロドコッカス エリスロポリス（Rodococcus erythropolis）を窒素制限下で培養を行うとサクシノイルトレハロースリピッドを３２ｇ／Ｌ生産することが報告されている（非特許文献４参照）。
【０００８】
ソホロースリピッド（Sophorose lipids；「ソホロリピッド」とも言われる；以下、ＳＬと省略する。）は、Ｐ．Ａ．Ｇｏｒｉｎらによってスターメレラ（キャンディダ）・ボンビコーラ（Starmerella（Candida）bombicola）の培養液から発見されている（非特許文献５参照）。
その後、その他の酵母菌、例えば、キャンディダ・ボゴリエンシス（Candida bogoriensis）、キャンディダ・マグノリエ（Candida magnoliae）、キャンディダ・グロペンギッセリ（Candida gropengisseri）、キャンディダ・アピコーラ（Candida apicola）によっても、その培養液中に比較的多量に生産されることが報告されている（非特許文献６参照）。
さらに、現在では、３００ｇ／Ｌ以上の生産を可能にしている（非特許文献７、８参照）。
【０００９】
セロビオースリピッド（Cellobiose lipid；以下、CLと省略する。）は、ウスチラジン酸（ustilagic acid）、フロキュロシン（flocculosin）とも呼ばれる抗微生物活性の高い糖脂質である。
また、CLはウスチラゴ マイディス（Ustilago maydis）により１５ｇ／Ｌ（非特許文献９、１０および１１参照）以上生産されるほか、クリプトコッカス・フミコーラ（Cryptococcus humicola）（非特許文献１２参照）、シュードザイマ・フロキュローサ（Pseudozyma flocculosa）（非特許文献１３、１４参照）、シュードザイマ・フジフォルメータ（Pseudozyma fusiformata）（非特許文献１５参照）などからも生産されることが報告されている。
さらに、Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ（ツカムレラ）属の酵母により３０ｇ／Ｌ生産される（非特許文献１６参照）オリゴ糖リピッドについても報告例がある。
【００１０】
このCLは、セロビオースあるいはヒドロキシル基が一部アセチル化したセロビオースと、１ないし２分子のヒドロキシ脂肪酸とからなる糖脂質である。セロビオースとは、β１→４結合した２分子のブドウ糖からなる糖であり、ヒドロキシ脂肪酸は、構造中にヒドロキシル基を有する脂肪酸である。CLには、ヒドロキシ脂肪酸の水酸基の数及び位置、末端カルボキシル基のエステル化度などの異なる同族体が存在する。セロビオースリピッドの一般式１を化１に示す。
【化１】
一般式１中のR１は水素原子かメチル基、エチル基などのアルキル基を示し、R２、R３は水素原子か水酸基を示す。R４は水素原子またはアセチル基を示し、R５、R６は水素原子、もしくは下記一般式２で示される基を示す。ｎは１−３０の整数である。一般式２を化２に示す。
【化２】
一般式２中のR７は水素原子もしくは水酸基を示し、ｍは０−６の整数である。
【００１１】
現在CLは、洗剤、化粧品等幅広い分野で工業利用が進められており、セロビオースリピッドの遺伝子導入剤としての利用（特許文献１参照）およびリポソーム形成剤としての利用（特許文献２参照）、CLを配合した洗浄剤（特許文献３参照）、乳化剤・可溶化剤（特許文献４参照）、タンパク質分離用担体（特許文献５参照）などの報告がある。
【００１２】
しかしながら、現時点で上記CL生産微生物について、同じ糖脂質型バイオサーファクタントの一種であるマンノシルエリスリトールリピッド(ウスチラジックリピッド(Ustilagic lipids)またはウスチリピッド（Ustilipids）とも言われる；以下、MELと称する)の生産なしにCLを生産するという報告はない。すなわち、MELの生産によりCLの収量が低下するほか、原料以外にMELを分離する精製工程が必要である。例えばウスチラゴ・マイディス(Ustilago maydis)を用いた発酵生産方法では、培地成分の検討により、MEL/CL比を1/9まで向上できるという報告があるが（非特許文献１０）、MELの生成を完全に抑制する技術は未だ報告されていない。
【００１３】
CLを幅広い用途で用いるためには、生産コストを抑え効率良く発酵生産する必要がある。したがって、CLを生産する際にCLのみを生産できる微生物を用いて発酵生産することができれば、MELを生産する発酵生産方法と比べて、目的産物であるCLの収量が向上し、また精製工程の簡略化によって生産コストの低減にも繋がることから、極めて有効である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２００３−０４７６７号公報
【特許文献２】特開２００６−０２８０６９号公報
【特許文献３】特開平０５−０９３９４号公報
【特許文献４】特開２００７−１８１７８９号公報
【特許文献５】特開２００６−２１９４５５号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】「ジャーナル オブ ザ アメリカン ケミカル ソサイティ（Ｊ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）」，７１巻，ｐ４１２４−４１２６（１９４９）．
【非特許文献２】「アプライド マイクロバイオロジー アンド バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，５１巻，ｐ２２−３２（１９９９）．
【非特許文献３】「バイオサーファクタント アンド バイオテクノロジー（Ｂｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」，（米国），マーシャルデッカー インコーポレーション ニューヨーク（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９８７）．
【非特許文献４】「ジャーナル オブ バイオテクノロジー（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，（英国），１３巻，ｐ２５７−２６６（１９９０）．
【非特許文献５】「カナデアン ジャーナル オブ ケミストリー（Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．）」，３９巻，ｐ８４６−８５５（１９６１）．
【非特許文献６】「バイオデグラデーション（Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）」，１巻，ｐ１０７−１１９（１９９０）．
【非特許文献７】「アプライド マイクロバイオロジー アンド バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，４７巻，ｐ４９６−５０１（１９９７）．
【非特許文献８】「バイテクノロジー レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．）」，２０巻，ｐ１１５３−１１５６（１９９８）．
【非特許文献９】「バイオテクノロジー レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．）」，（オランダ），クルーワーアカデミック パブリッシャー（ＫＬＵＷＥＲ ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ），８巻，ｐ７５７−７６２（１９８６）．
【非特許文献１０】「アプライド マイクロバイオロジー アンド バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，（ドイツ），スプリンガー−バーラグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ），５１巻，ｐ３３−３９（１９９９）．
【非特許文献１１】「モルキュラー バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）」，ブラックウェル（ＢｌａｃｋｗｅｌｌＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ），６６巻，ｐ５２５−５３３（２００７）．
【非特許文献１２】「バイオキミカ エト バイオフィジカ アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ）」，（オランダ），エルゼビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ），１５５８巻，ｐ１６１−１７０（２００２）．
【非特許文献１３】「アプライド エンバイアメント アンド マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）」，（米国），アメリカ微生物学会（ＡｍｅｒｃａｎＳｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｇｙ），６９巻，ｐ２５９５−２６０２（２００３）．
【非特許文献１４】「アンチマイクロバイアル・エージェンツ・アンド・ケモセラピー（Antimicrobial Agents and Chemiotherapy）４９巻、ｐ１５９７−１５９９（２００５）
【非特許文献１５】「フェムス イースト リサーチ（ＦＥＭＳ ＹＥＡＳＴ Ｒｅｓ．）」，（オランダ），エルゼビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ），５巻，ｐ９１９−９２３（２００５）．
【非特許文献１６】「フェット／リピッド（Ｆｅｔｔ／Ｌｉｐｉｄ．）」，１０１巻，ｐ３８９−３９４（１９９９）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
ところで、バイオサーファクタントには汎用の界面活性剤と比較して環境適合性、生体適合性に優れ、様々な生理活性が認められているが、既存の界面活性剤と同様の幅広い用途に利用されているかと言うと決してそうとは限らない。例えば食品用途等には制約がある。これは、多くの場合生産微生物に病原性は知られていないものの、自然界からの単離源が明確でないため、安全性に対する知見に乏しいことによる。特に微生物生産物を食品用途等に展開するためには、使用微生物の単離源が重要視される。例えば、酒類やパンの製造に利用される出芽酵母、乳酸菌や枯草菌（納豆菌）等は、食品分野で活躍する微生物として一般的に良く知られている。これらの微生物は全て食品中から容易に単離可能な微生物である。また、CL生産微生物は、クリプトコッカス・フミコーラを除いて、副生物としてMELを生成する。そのため、CLの収量が低下するほか、原料以外にMELを分離する精製工程が必要であり、余分なエネルギーの消費ならびにコスト上昇を引き起こしているが、MELを生産することなくCLを生産できれば、それらの問題の解消につながる。
【００１７】
そこで、食用植物または日常的に接触する植物群から単離した微生物を用いてMELを生産することなくバイオサーファクタントを製造する技術を開発することができれば、得られるバイオサーファクタントは安全性の面及び生産コストの面で大きな利点を獲得することとなり、生産微生物も含めた生産物全体の適用用途が大きく拡充されるものと期待される。
【００１８】
以上事情を鑑みて、本発明では、化粧品、食品、食品添加物、医薬、農畜水産業関連品（飼料、飼料添加物、肥料、農薬、魚餌）、洗剤など、生体に対する安全性がより求められる用途に対して、従来よりも適応性に優れたバイオサーファクタントを提供するべく、食用植物から単離した微生物、ならびにそれを用いるバイオサーファクタントの発酵製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、池や沼などに茂生するイネ科の水生植物であり、肥大した新芽が「マコモタケ」として古くから日常的に食用されている「マコモ」から、ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）を採取し単離すること、当該微生物がCLを生産すること、及び既存のCL生産菌のほとんどがMELを生産するのに対して、MELを生産することなしにCLのみを生産できることを見出し、本発明をなすに至ったものである。
【００２０】
すなわち、本発明の微生物は、以下の〔１〕〜〔６〕に示される。
〔１〕 マンノシルエリスリトールリピッドを生産することなくバイオサーファクタントを生産する能力を有するウスチラゴ属に属する微生物。
〔２〕 バイオサーファクタントを生産する能力がマンノシルエリスリトールリピッド（MEL）を生産することなくセロビオースリピッド（CL）を生産する能力である〔１〕に記載の微生物。
〔３〕 マコモ属に属する植物から単離した微生物である〔１〕または〔２〕に記載の微生物。
〔４〕 ウスチラゴ エスキュレンタ（Ustilago esculenta）に属する微生物である〔１〕、〔２〕または〔３〕に記載の微生物。
〔５〕 下記の菌学的性質を有する〔１〕ないし〔４〕のいずれかに記載の微生物。
記
（１）YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地上にて25℃で7日間培養後に、波型、半レンズ状、湿性でクリーム色のコロニーを形成する。
（２）YM液体培地およびPD液体培地にて、25℃で、３日間培養後に、幅4-5μm程度の菌糸の形成が確認される。
（３）YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地の平板培地上においても、25℃で7日間培養後に、隔壁のある菌糸ならびに偽菌糸の形成が認められる。
（４）また、前記（１）、（２）及び（３）のいずれの場合も、明らかな有性生殖器の形成は認められない。
（５）生理性状試験の結果は、上記の表１に示す通りである。
〔６〕 ウスチラゴ エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1（受託番号 FERM P-21725）である〔１〕ないし〔５〕のいずれかに記載の微生物。
【００２１】
また、本発明のバイオサーファクタント製造方法は、以下の〔７〕〜〔１２〕に示される。
〔７〕 マンノシルエリスリトールリピッドを生産することなくバイオサーファクタントを生産する能力を有するウスチラゴ属に属する微生物を培養しバイオサーファクタントを生産することを特徴とする、バイオサーファクタントの製造方法。
〔８〕 バイオサーファクタントを生産することがマンノシルエリスリトールリピッド（MEL）を生産することなくセロビオースリピッド（CL）を生産することである〔７〕に記載のバイオサーファクタントの製造方法。
〔９〕 上記のウスチラゴ属に属する微生物が、マコモ属に属する植物から単離した微生物である〔７〕または〔８〕に記載のバイオサーファクタントの製造方法。
〔１０〕 上記のウスチラゴ属に属する微生物が、ウスチラゴ エスキュレンタ（Ustilago esculenta）に属する微生物である 〔７〕、〔８〕または〔９〕に記載のバイオサーファクタントの製造方法。
〔１１〕 上記のウスチラゴ属に属する微生物が、下記の菌学的性質を有する微生物である〔７〕ないし〔１０〕のいずれかに記載のバイオサーファクタントの製造方法。
記
（１） YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地上にて25℃で7日間培養後に、波型、半レンズ状、湿性でクリーム色のコロニーを形成する。
（２） YM液体培地およびPD液体培地にて、25℃で、３日間培養後に、幅4-5μm程度の菌糸の形成が確認される。
（３） YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地の平板培地上においても、25℃で7日間培養後に、隔壁のある菌糸ならびに偽菌糸の形成が認められる。
（４） また、前記（１）、（２）及び（３）のいずれの場合も、明らかな有性生殖器の形成は認められない。
（５） 生理性状試験の結果は、上記の表１に示す通りである。
〔１２〕上記のウスチラゴ属に属する微生物が、ウスチラゴ エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1（受託番号 FERM P-21725）である〔７〕ないし〔１１〕のいずれかに記載の微生物バイオサーファクタントの製造方法。
【００２２】
また、本発明のバイオサーファクタントを含有する食品、化粧品、または飼料は、以下の〔１３〕、〔１４〕または〔１５〕に示される。
〔１３〕 〔１〕ないし〔６〕のいずれかに記載の微生物を培養することにより得られたバイオサーファクタントを含有する食品。
〔１４〕 〔１〕ないし〔６〕のいずれかに記載の微生物を培養することにより得られたバイオサーファクタントを含有する化粧品。
〔１５〕 〔１〕ないし〔６〕のいずれかに記載の微生物を培養することにより得られたバイオサーファクタントを含有する飼料。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、古くから広く食される食用植物であるマコモタケ（黒穂菌に寄生されて肥大したマコモの新芽）の可食部分の本体を構成する微生物、より具体的にはウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）を提供することができる。
当該微生物を発酵微生物として用いることにより、得られたバイオサーファクタントの安全性を確保するとともに、これまで利用に制限があった食品用途や家畜飼料、魚餌、農業用途に直接使用できる界面活性剤としての利用が見込まれ、バイオサーファクタントの普及の拡大に著しく貢献できるものと期待される。
さらに本発明に係る製造方法によれば、従来の方法において副生物として混入していたMELを含まないCLのみの発酵生産物を得ることが可能となる。特に、油脂等の疎水性基質を用いず、糖質(グルコースやショ糖)を炭素源として含有する培地を用いることにより、効率的にCLを生産することが可能であり、CLの単離も簡便となる。
以上のように本発明を利用することで、MELを生産しないことで、CLの収量が良くなり、生産効率が向上すること、精製ステップの簡略化が可能であることから、CL生産コストの大幅な低減が可能となり、より低価格なCLを市場に提供し、これまで制約のあった食品、農畜産業も含む幅広い分野へのバイオサーファクタントの利用拡大が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】実施例１において、培地中の酵母エキス濃度に対するCL生産試験の結果を示すグラフである。
【図２】実施例２において、三角フラスコを用いて行った流加培養試験の結果を培養時間に沿って追跡したグラフである。
【図３】実施例３において、培養液から抽出直後の糖脂質成分と精製後の糖脂質成分をTLC分析によって解析した図である。
【図４】実施例４において、各濃度の成分（ａ）の表面張力値を方対数グラフにスポットした図である。
【図５】実施例５において、ジャーファーメンターを用いて行った流加培養試験の結果を培養時間に沿って追跡したグラフである。
【図６】実施例６において、発酵大麦エキスを用いた天然培地を用いて、流加培養試験を行った結果を培養時間に沿って追跡したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明につきさらに詳しく説明する。
〈微生物〉
本発明に該当する微生物としては、バイオサーファクタント（但し、マンノシルエリスリトールリピッドを除く）を生産する能力を有するものであればよく、好ましくは当該バイオサーファクタント以外のバイオサーファクタントを生産することがないものであれば特に限定されるものではない。上記に該当するバイオサーファクタントについては、一般的に生産量が高く、原料が比較的安価な糖質や植物油脂等で生産できる糖脂質型のバイオサーファクタントが好ましく、ソホロースリピッド、トレハロースリピッド、セロビオースリピッド、ラムノリピッド等が挙げられる。特にセロビオースリピッド（CL）は生理活性が高いことから望ましい。上記に該当する微生物としては、ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）に属する微生物が好ましく、ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）NBRC9887株、ウスチラゴ・エスキュレンタ MK-1株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M17株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M18株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M19株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M20株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M21株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M22株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M23株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M24株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M25株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M26株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M27株、ウスチラゴ・エスキュレンタ MAFF305616株、ウスチラゴ・エスキュレンタ MAFF305618株、ウスチラゴ・エスキュレンタ MAFF305619株、ウスチラゴ・エスキュレンタ MAFF305621株、などが例示される。
ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1株は、本発明者等が日本国内で採取した植物（マコモ）から分離した。本菌株は、YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地上にて25℃で7日間培養後に、波型、半レンズ状、湿性でクリーム色のコロニーを形成する。YM液体培地およびPD液体培地にて、25℃で、３日間培養後に、幅4-5μm程度の菌糸の形成が確認される。YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地の平板培地上においても、25℃で7日間培養後に、隔壁のある菌糸ならびに偽菌糸の形成が認められる。また、いずれの場合も、明らかな有性生殖器の形成は認められない。
ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1株は、リボゾームRNA遺伝子の26SrDNA−D1/D2領域の塩基配列（rDNA配列）を決定し、DNAデータベース（DDBJ）にアクセスし、FASTAプログラム（http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/fasta-j.html）を用いて相同性検索を行ったところ、ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）のrDNA配列と100％一致した。MK-1の生理性状試験の結果も合わせて、本菌株は担子菌門の一種であるウスチラゴ・エスキュレンタに属することがわかり、ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1株と命名した。生理性状試験の結果は、表１に示す通りである。本菌株は、平成20年11月17日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（IPOD）（茨城県つくば市東１−１−３）に受託番号FERM P-21725として寄託されている。
なお、本発明に該当するバイオサーファクタント（但し、マンノシルエリスリトールリピッドを除く）を生産する能力を有するウスチラゴ属に属する微生物は、マコモ等の天然の植物から単離された菌株、または保存機関から分譲された菌株によらず、あるいはその継代培養であってもよい。
【表１】
+ ：試験開始後に数日で反応が陽性、 - ： 反応が陰性、 S ： 試験開始後に2週間から3週間以上にかけて徐々に陽性反応が認められた、 L ： 試験開始2週間以降に急速に陽性反応が認められた。
【００２６】
〈バイオサーファクタント生産培地・培養条件〉
本発明の微生物の培養形態は液体培地を用いた回分培養あるいは培養系に糖質および/または有機窒素源を連続添加する流加培養であり、通気攪拌することが望ましい。培地の初期ｐHは酸性から中性の範囲であれば特に問題は無いが、３．０−９．０に調整することが好ましく、６．０−８．０に調整することがより望ましい。培養に適した温度範囲は２０−３５℃、より好ましくは２５−２８℃である。
【００２７】
本発明において、培地は一般的な半合成培地を用いればよい、CL生産を効率よく行うためには主原料である炭素原料にグルコース、ショ糖、廃糖蜜などの糖質を用いることが望ましい。糖質に加えて、もしくは置き換えて、油脂類などを炭素源として用いてもかまわない。窒素源としては、有機窒素源と無機窒素源を組み合わせて用いることが望ましい。
糖類は当該酵母が資化できるものあれば特に限定されるものではない。例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトースなどの単糖類、ショ糖、マルトースなどの二糖類が用いられるが、好ましくはグルコースである。培養初発濃度は１０−１５０ｇ／Ｌ、好ましくは３０−１００ｇ／Ｌで用いられる。
用いる油脂類としては、特に限定されるものではない。植物油、脂肪酸またはそのエステル類を用いても良い。
使用する植物油としては、例えばダイズ油、ナタネ油、コーン油、綿実油、ヒマワリ油、カポック油、ゴマ油、コメ油、落花生油、ベニバナ油、オリーブ油、アマニ油、キリ油、ヒマシ油、パーム油、パーム核油、ヤシ油もしくはこれらの混合物等が挙げられる。
使用する脂肪酸および脂肪酸エステルには、炭素鎖が１０−２４のもの、好ましくは炭素鎖が１６−１８の脂肪酸または脂肪酸エステルを用いることができる。これらの脂肪酸または脂肪酸エステルは分子内に１−３個の不飽和結合を含んでいてもよい。例えば、デカン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸などの飽和脂肪酸またはそのエステル、あるいはトウハク酸、リンデル酸、ツズ酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、ペトロセリン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、エルカ酸、ソルビン酸、リノール酸、リノエライジン酸、γ―リノレン酸、リノレン酸、アラキドン酸などの不飽和脂肪酸またはそのエステルが挙げられる。
培地に添加する上記油脂類の濃度は、２０−２００ｇ／Ｌ、好ましくは５０−１５０ｇ／Ｌの範囲である。流加培養の様式をとる場合には、培地中濃度が上記の範囲に収まるように培養期間中に連続的もしくは断続的に添加する。
使用する有機窒素源としては、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、ポリペプトン、コーンスティープリカー、カザミノ酸、尿素などの内、一種類もしくは二種類以上を組み合わせて用いることができる。好ましくは酵母エキスを1−８ ｇ／Ｌの濃度範囲で用いるとよい。
無機窒素源としては、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、アンモニアなどの内、一種類もしくは二種類以上を組み合わせて用いることができる。好ましくは硝酸ナトリウムを用いるとよい。
【００２８】
〈セロビオースリピッドの回収・精製方法〉
培養液からのCLの抽出・精製は以下のように行う。培養液と等量の酢酸エチルを加え、CLおよび疎水性成分を抽出し、酢酸エチル相を分取する。酢酸エチルをエバポレーター等で取り除くことで、CLおよび疎水性成分を含む画分を得る。さらに、得られた画分をヘキサンによって洗浄することで、CL以外の疎水性成分を除去し、残渣を乾燥することでCL標品を得る。CL標品を再び、メタノールに溶かし、アンスロン硫酸法を用いて、CL量を測定する。ヘキサン洗浄液についても、エバポレーター等でヘキサンを除去することでCL以外の疎水性成分を回収し、重量を測定することで培地中に残存する疎水性成分の量を得る。
【００２９】
〈セロビオースリピッドの構造決定〉
上記により得られる糖脂質成分の構造決定は、以下のようにして行う（ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）NBRC9887株を用いてグルコースを炭素源として培養して得られた酸型CLの構造決定手法を例にして以下説明する）。
単離した糖脂質成分は、TLCプレート上で、アンスロン硫酸試薬で青緑色に呈色することにより糖脂質成分であると判断できる。この糖脂質について、1Ｈ、13Ｃ、二次元ＮＭＲ解析を行い、得られたスペクトルと、構造既知であるCLのデータ（非特許文献２から５参照）とを比較することで、構造解析を行う。
【００３０】
〈セロビオースリピッドの定量分析方法〉
全糖脂質量はアンスロン硫酸法を用いることで測定できる。CL同属体の含有量と存在比は薄相クロマトグラフィー（TLC）法および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することで測定できる。
【００３１】
以下に、本発明について実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例１】
【００３２】
（ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）を用いた、CLの選択的発酵生産；酵母エキス濃度の影響)
〈種培養〉
ディープフリーザー（-８０℃）で冷凍保存されたウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）NBRC9887株を３０ ｍＬのＹＭ培地（グルコース１０ ｇ／Ｌ、酵母エキス３ ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ ｇ／Ｌ、ペプトン５ ｇ／Ｌ）に０．５ｍＬ播種し、２８℃で１日間、振蕩培養した。
〈本培養〉
３００ｍＬ容量の三角フラスコに３０ ｍＬの酵母エキス濃度を変えたCL生産用培地を表２（CL生産培地組成）のごとく調製し、１２１℃、２０分間オートクレーブで滅菌した培地を用意した。上述の種培養液を１．５ｍＬを播種し、２８℃で４日間、振蕩培養を行った。培養終了後の培養液から上述の分離・精製方法を用いてCL標品を精製し、CL標品をアンスロン硫酸法にて、測定することで、培地体積あたりのCL生産量を算出した。酢酸エチルで抽出された培養液に含まれる菌体をメタノールおよび水で洗浄後、１０５℃で一晩乾燥させた後、重量を測定することで菌体量を測定した。
【００３３】
【表２】
【００３４】
〈薄層クロマトグラフィー分析〉
図１に示すように、酵母エキスを８ｇ／Ｌ添加した培地で、２,５００mｇ／ＬのCLを生産することができた。酵母エキスの濃度をコントロールすることで、効率的にCLを生産できることが示された。いずれの条件でもMELは検出されなかった。
【実施例２】
【００３５】
（ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）を用いた、CLの選択的発酵生産；流加培養法）
３００ｍＬ容量の三角フラスコに30 mlのCL生産用培地を表３〔CL生産培地組成(流加培養初期培地)〕のごとく調製し、１２１℃、２０分間オートクレーブで滅菌した培地を用意した。実施例１と同様に調製したウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）NBRC9887株の種培養液を１．５ ｍＬ播種し、培養期間の間、２日おきに最終濃度が５０ｇ/Ｌ相当する滅菌濃縮グルコース溶液〔表４；CL生産培地組成(流加培地)〕ならびに最終濃度が２ g/Lに相当する滅菌濃縮酵母エキス溶液を添加しながら培養を実施した。培養途中でサンプルを抜き出し、培地中CL濃度、菌体濃度、グルコース濃度を測定した。CL濃度、菌体濃度に関しては上述の実施例１と同様に測定した。
【００３６】
〈グルコースの定量〉
培養液を遠心分離し、水溶液相を分取した。分取した水溶液相を市販のグルコース検出キット（グルコーステストワコーＣ−ＩＩ、和光純薬工業）を用いて、水溶液相に含まれるグルコース量を測定した。
【００３７】
【表３】
【００３８】
【表４】
【００３９】
図２に示すように、流加培養法を適用することで、CL生産量は、８日間で６,１００mg/Lであった。MELは検出されなかった。
【００４０】
比較例１
（従来株ウスチラゴ・マイディス(Ustilago maydis)を用いたCL生産）
〈種培養〉
ディープフリーザー（-８０℃）で冷凍保存されたウスチラゴ・マイディス(Ustilago maydis) NBRC6907株について、実施例１と同様の方法を用いて行った。
〈本培養〉
本培養に用いる培地はビー・フラウツらの論文（非特許文献１）を参考に表５（培地組成）のごとく調製し、１２１℃、２０分間オートクレーブで滅菌した培地を用意した。種培養液を１．５ ｍＬを播種し、２８℃で７日間、振蕩培養を行った。CLの抽出および分析方法は実施例１と同様に行った。MELの定量はＨＰＬCを用いて分析した。
【００４１】
【表５】
【００４２】
〈ＨＰＬＣによるMEL生産量の定量〉
培養終了後の培養液から培養液と同量の酢酸エチルを用いてMEL画分の抽出を行った。抽出液中のMEL濃度はシリカゲルカラム（イナートシルＳｉｌ−１００Ａ）を接続したＨＰＬＣを用い、定量分析を行った。溶離液にはクロロホルム／メタノール混合溶媒を用い、流速１ｍＬ／ｍｉｎで混合比が１０：０から０：１０まで変化するように設定したグラジエントシステムにより溶出した。検出は蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ−ＬＴ、島津製作所製）を用いた。精製したMELを用いて検量線を作成し、ピークエリアからMEL濃度を算出した。
【００４３】
実施例１，２および比較例１で生産された糖脂質の定量結果を表６（実施例１、２、及び比較例１において、グルコースもしくは植物油を炭素原料として行ったCL生産試験の結果）に示す。従来の生産微生物であるウスチラゴ・マイディス(Ustilago maydis) NBRC6907株を用いて糖脂質を生産した比較例１ではCLと同時にMELを副生産したが、ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）NBRC9887株を用いて生産した実施例１および２ではMEL等のCL以外のバイオサーファクタントを生産しなかった。これらの結果から、ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）NBRC9887株をCL生産菌として利用することで、CLのみを選択的に生産できることがわかる。
【００４４】
【表６】
【実施例３】
【００４５】
ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）が生産する糖脂質の構造解析
（糖脂質（セロビオースリピド）の精製）
実施例２と同様に培養した培養液から、酢酸エチルを用いて糖脂質を抽出・回収し、シリカゲルカラムを用いて、各成分を抽出した。抽出された糖脂質成分をTLC分析により分析した結果を図３に示す。より成分(a)を含む精製画分Aと成分(b)を含む精製画分Bを得た。
（糖脂質成分のＮＭＲ解析）
上記で得られた成分（a）、成分（ｂ）について、重水素化メタノール（CD3OD）を溶媒とするＮＭＲ解析により構造の同定を行った。1H、1３C、1H−1H COSY、HMQC、HMBCの各NMRスペクトル解析を行うことで、本糖脂質の構造を完全帰属した。その結果、ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）NBRC9887株が生産する糖脂質は全てCLであることがわかった。成分(a)中に２種類のCL同属体（成分‐（ａ）‐１および成分‐（ａ）‐２）が混在していることがわかった。同様に成分（ｂ）に関しても２種類のCL同属体（成分‐（ｂ）‐１および成分‐（ｂ）−２）が含まれていることがわかった。化３に一般式３を示す。それぞれの糖脂質に関して、帰属された化学シフトをまとめて表７（成分（ａ）‐１のＮＭＲ分析結果）、表８（成分（ａ）‐２のＮＭＲ分析結果）、表９（成分（ｂ）‐１のＮＭＲ分析結果）、および表１０（成分（ｂ）‐２のＮＭＲ分析結果）に示す。
【００４６】
【化３】
【００４７】
【表７】
【００４８】
【表８】
【００４９】
【表９】
【００５０】
【表１０】
【実施例４】
【００５１】
（CLの界面活性測定）
〈表面張力測定〉
実施例３において、精製した成分（ａ）の表面張力低下能を調べた。種々の濃度の成分(a)の水溶液を作成し、その表面張力をペンダントドロップ方式の表面張力計（Ｄｒｏｐ Ｍａｓｔｅｒ ＤＭ５００, 協和界面科学製）を用いて測定した。
【００５２】
成分（ａ）について、上記の方法を用いて表面張力低下能を測定した。各濃度の成分(ａ)に対する表面張力は図４に示す値を示した。図４の曲線から成分（ａ）の臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）は５８．３ｍｇ／Ｌであり、その時の表面張力値（γｃｍｃ値）は３６．４ ｍＮ／ｍであった。既存の合成界面活性剤とくらべて、十分小さいｃｍｃ値ならびにγｃｍｃ値を示したことから、本発明で生産されるCLは界面活性剤として十分な機能を発揮できることが推察できる。
【実施例５】
【００５３】
（発酵槽を用いたCL生産）
食用として用いうるマコモから、新たに分離したウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1株を用いて培養試験を実施した。３００ ｍＬ容量の三角フラスコ３本にグルコース濃度を５０g/Lにした発酵槽用CL生産用培地（流加培養初期培地）３０ mlを表１１〔発酵槽用CL生産培地組成(流加培養初期培地)〕のごとく調製し、１２１℃、２０分間オートクレーブで滅菌した。実施例１と同様に調製した種培養液を１．５ｍＬ播種し、２日間培養したものを種培養液とした。５Lジャーファーメンターに２L分の発酵槽用CL生産培地組成(流加培養初期培地)の培地を作成し、１２１℃、２０分間オートクレーブで滅菌した。種培養をジャーファーメンターに播種し、培養温度２５℃、攪拌回転速度５００ ｒｐｍ、通気速度 ２ L/min （１ ＶＶＭ）の条件で培養した。培養５５時間で、オートクレーブした５０％（ｗ／ｖ）グルコース溶液を400 ｍｌ添加した。培養途中でサンプルを抜き出し、培地中CL濃度、菌体濃度、グルコース濃度を測定した。CL濃度、菌体濃度、グルコース濃度に関しては上述の実施例２と同様に測定した。
【００５４】
【表１１】
【００５５】
図５に示したように、食用として用いうるマコモから分離したウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1株を用いて、ジャーファーメンターでCLを生産した場合、５日間で、１３,０００mｇ／ＬのCLを培地中に蓄積した。５日目における、培地体積当たりのCL生産性は２,５８０mｇ／Ｌ／ｄａｙであった。また、TLC,HPLC,NMRの結果、MEL等のCL以外のバイオサーファクタントは検出されなかった。食用として用いうるマコモから分離した微生物株を利用して、適当な条件でCLを生産した場合、効率的にCLを生産できることが確認された。
【実施例６】
【００５６】
焼酎製造の際、副生する発酵大麦エキスを用いたCL発行生産を実施した。３００ｍＬ容量の三角フラスコ３本にグルコース濃度を５０g/Lにした発酵槽用CL生産用培地３０ mlを実施例５と同様に調製し、１２１℃、２０分間オートクレーブで滅菌した。実施例１と同様に調製したウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1株の種培養液を１．５ ｍＬ播種し、２日間培養したものを種培養液とした。５Lジャーファーメンターに手持ち屈折計を用いて５％Brix。に濃度を調整した発酵大麦エキス１．５Lを作成し、１２１℃、２０分間オートクレーブで滅菌した。別にオートクレーブ滅菌した５０％（ｗ／ｖ）グルコース溶液を４００ ｍｌ添加し、種培養をジャーファーメンターに播種し、培養温度２５℃、攪拌回転速度５００ ｒｐｍ、通気速度 ２ L/min （１ ＶＶＭ）の条件で培養した。培養６５時間で、オートクレーブした５０％（ｗ／ｖ）グルコース溶液を400 ｍＬ添加した。培養途中でサンプルを抜き出し、培地中CL濃度、菌体濃度、グルコース濃度を測定した。CL濃度、菌体濃度、グルコース濃度に関しては上述の実施例２と同様に測定した。
【００５７】
図６に示したように、食用として用いうるマコモから分離したウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1株を用いて、ジャーファーメンターでCLを生産した場合、７日間で、３６,０００mｇ／ＬのCLを培地中に蓄積した。７日目における、培地体積当たりのCL生産性は５,１００mｇ/Ｌ/ｄａｙであった。また、TLC,HPLC,NMRの結果、MEL等のCL以外のバイオサーファクタントは検出されなかった。これまでの報告では、ウスチラゴ・マイディス(Ustilago maydis)を用いた培養によって７日間で30 g/Lの糖脂質を生産できるという報告例（Appl. Microbiol. Biotechnol., 51, 33-39 (1999)）があるが、この場合、得られる糖脂質はMELとCLの混合物であり、その含有比はMEL/CL = 9/1となる。つまり、純粋なCLの生産量は約3 g/Lにしか満たない。また最近、別の属の酵母であるシュードザイマ・フロキュローサ（Pseudozyma flocculosa）を用いた培養によって、これまでの最高値である７日間で15 g/Lのフロキュロシンが生産できると言う報告がある（Appl. Microbiol. Biotechnol., 80, 307-315 (2008)）が、本技術では従来技術の２倍以上の生産量で簡便にCLのみを生産することができる。すなわち、発酵大麦エキスを用いた天然培地にて、本菌株を用いて効率的にCLを生産できることが確認された。さらに培養終了後の発酵液から、酢酸エチル・2-プロパノール混合溶媒（混合比４：１）を用いて、CLを回収したところ、９０．１ ｇのCLを回収することができた。
【実施例７】
【００５８】
（その他新規分離株、登録保存株によるCLの生産）
愛媛県今治産マコモの黒穂菌嬰より、ポテトデキストロール寒天培地を用いて、分離した１１株のウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）に属する微生物株（M１７〜M２７）、ならびに、農林水産省ジーンバンクに登録されているウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）に属する微生物株(ＭＡＦＦ ３０５６１６株, ＭＡＦＦ ３０５６１８株、ＭＡＦＦ ３０５６１９株、ＭＡＦＦ ３０５６２１株)のCL生産性の有無を確認するため、実施例１と同様の方法で、以下の実験を行い、CL生産性を確認した。
【００５９】
その結果、前記１５株すべてにおいて、CL生産を確認できた。その生産量は４６０ｍｇ/Ｌから２,５００mｇ／Ｌであった。また、TLC,HPLC,NMRの結果、MEL等のCL以外のバイオサーファクタントは検出されなかった。以上のごとく、新たにマコモ属に属する植物から分離したウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）株や、保存機関に寄託されている株でも、MEL等のCL以外のバイオサーファクタントを生産することなくCLを生産できることがわかった。分離株ならびに農林水産省ジーンバンク保存ウスチラゴ・エスキュレンタ株のCL生産量と菌体量を表１２に示す。
【００６０】
【表１２】
【受託番号】
【００６１】
FERM P-21725
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオサーファクタントを生産する能力を有するウスチラゴ属に属する微生物、特にバイオサーファクタントを生産する能力を有するマコモ属に属する植物から単離した微生物、ならびに、古くから食品として利用されてきた植物であるマコモ由来の微生物を使用することで、食品産業、農業、畜産業等への利用も期待できるバイオサーファクタント（微生物由来の両親媒性脂質）を製造する方法、より具体的には、古くから食品として利用されてきた植物であるマコモ由来の微生物の使用により、バイオサーファクタントの一種であるセロビオースリピッドを、副生物を含まず選択的に発酵生産する製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖脂質は、脂質に１〜１０数個の単糖が結合した物質であり、生体内において細胞間の情報伝達に関与し、神経系・免疫系の機能維持にも重要な役割を果たしていること等が明らかにされつつある。一方で、糖脂質は、糖の性質に由来する親水性と脂質の性質に由来する親油性の二つの性質を合わせ持つ両親媒性物質であり、このような性質を有する物質は界面活性物質と呼ばれている。
【０００３】
一方、一部の微生物はこれらの界面活性物質を効率良く生産することが知られており、この生物由来界面活性剤（バイオサーファクタント）は、安全性が高く、環境に対する負荷が少ない生分解性に優れた環境先進型界面活性剤として研究が進められている。現在、微生物が生産する界面活性物質としては、糖型系の一つである糖脂質系、アシルペプチド系、リン脂質系、脂肪酸系及び高分子化合物系の５つに分類されているが、特にこの内の糖脂質系の界面活性剤については、最もよく研究され、細菌及び酵母によって生産された多くの種類の物質が報告されている。
【０００４】
これらの糖脂質等のバイオサーファクタントは、生分解性が高く、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能を持つといわれている。このことから、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等にこれらのバイオサーファクタントを幅広く適用することは、持続可能社会の実現と高機能製品の提供という、両面を兼ね備えており極めて有意義である。
【０００５】
糖脂質型のバイオサーファクタントには、次のようなものが例として挙げられる。
【０００６】
ラムノリピッド（Rhamnolipid；以下、RLと省略する。）は、結核菌の抗生物質としてシュードモナス アエルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）（緑膿菌）の培養液から最初に発見されている（非特許文献１参照）。
また、これまでにシュードモナス（Pseudomonas）属の細菌から４種類の同族体が報告されており、当初は数ｇ／Ｌ程度の生産量であったが、現在では１００ｇ／Ｌ以上の生産を可能にしている（非特許文献２参照）。
【０００７】
トレハロースリピッド（Trehalose lipid；以下、TLと省略する。）は、コリネバクテリウム（Corynebacterium）等の細胞表層物質として発見された。また、類似の物質が、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、ノカルディア（Nocardia）、ロドコッカス（Rodococcus）属細菌からも報告されている（非特許文献３参照）。
一般的に、細胞壁に結合しているために生産量は低いが、ロドコッカス エリスロポリス（Rodococcus erythropolis）を窒素制限下で培養を行うとサクシノイルトレハロースリピッドを３２ｇ／Ｌ生産することが報告されている（非特許文献４参照）。
【０００８】
ソホロースリピッド（Sophorose lipids；「ソホロリピッド」とも言われる；以下、ＳＬと省略する。）は、Ｐ．Ａ．Ｇｏｒｉｎらによってスターメレラ（キャンディダ）・ボンビコーラ（Starmerella（Candida）bombicola）の培養液から発見されている（非特許文献５参照）。
その後、その他の酵母菌、例えば、キャンディダ・ボゴリエンシス（Candida bogoriensis）、キャンディダ・マグノリエ（Candida magnoliae）、キャンディダ・グロペンギッセリ（Candida gropengisseri）、キャンディダ・アピコーラ（Candida apicola）によっても、その培養液中に比較的多量に生産されることが報告されている（非特許文献６参照）。
さらに、現在では、３００ｇ／Ｌ以上の生産を可能にしている（非特許文献７、８参照）。
【０００９】
セロビオースリピッド（Cellobiose lipid；以下、CLと省略する。）は、ウスチラジン酸（ustilagic acid）、フロキュロシン（flocculosin）とも呼ばれる抗微生物活性の高い糖脂質である。
また、CLはウスチラゴ マイディス（Ustilago maydis）により１５ｇ／Ｌ（非特許文献９、１０および１１参照）以上生産されるほか、クリプトコッカス・フミコーラ（Cryptococcus humicola）（非特許文献１２参照）、シュードザイマ・フロキュローサ（Pseudozyma flocculosa）（非特許文献１３、１４参照）、シュードザイマ・フジフォルメータ（Pseudozyma fusiformata）（非特許文献１５参照）などからも生産されることが報告されている。
さらに、Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ（ツカムレラ）属の酵母により３０ｇ／Ｌ生産される（非特許文献１６参照）オリゴ糖リピッドについても報告例がある。
【００１０】
このCLは、セロビオースあるいはヒドロキシル基が一部アセチル化したセロビオースと、１ないし２分子のヒドロキシ脂肪酸とからなる糖脂質である。セロビオースとは、β１→４結合した２分子のブドウ糖からなる糖であり、ヒドロキシ脂肪酸は、構造中にヒドロキシル基を有する脂肪酸である。CLには、ヒドロキシ脂肪酸の水酸基の数及び位置、末端カルボキシル基のエステル化度などの異なる同族体が存在する。セロビオースリピッドの一般式１を化１に示す。
【化１】
一般式１中のR１は水素原子かメチル基、エチル基などのアルキル基を示し、R２、R３は水素原子か水酸基を示す。R４は水素原子またはアセチル基を示し、R５、R６は水素原子、もしくは下記一般式２で示される基を示す。ｎは１−３０の整数である。一般式２を化２に示す。
【化２】
一般式２中のR７は水素原子もしくは水酸基を示し、ｍは０−６の整数である。
【００１１】
現在CLは、洗剤、化粧品等幅広い分野で工業利用が進められており、セロビオースリピッドの遺伝子導入剤としての利用（特許文献１参照）およびリポソーム形成剤としての利用（特許文献２参照）、CLを配合した洗浄剤（特許文献３参照）、乳化剤・可溶化剤（特許文献４参照）、タンパク質分離用担体（特許文献５参照）などの報告がある。
【００１２】
しかしながら、現時点で上記CL生産微生物について、同じ糖脂質型バイオサーファクタントの一種であるマンノシルエリスリトールリピッド(ウスチラジックリピッド(Ustilagic lipids)またはウスチリピッド（Ustilipids）とも言われる；以下、MELと称する)の生産なしにCLを生産するという報告はない。すなわち、MELの生産によりCLの収量が低下するほか、原料以外にMELを分離する精製工程が必要である。例えばウスチラゴ・マイディス(Ustilago maydis)を用いた発酵生産方法では、培地成分の検討により、MEL/CL比を1/9まで向上できるという報告があるが（非特許文献１０）、MELの生成を完全に抑制する技術は未だ報告されていない。
【００１３】
CLを幅広い用途で用いるためには、生産コストを抑え効率良く発酵生産する必要がある。したがって、CLを生産する際にCLのみを生産できる微生物を用いて発酵生産することができれば、MELを生産する発酵生産方法と比べて、目的産物であるCLの収量が向上し、また精製工程の簡略化によって生産コストの低減にも繋がることから、極めて有効である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２００３−０４７６７号公報
【特許文献２】特開２００６−０２８０６９号公報
【特許文献３】特開平０５−０９３９４号公報
【特許文献４】特開２００７−１８１７８９号公報
【特許文献５】特開２００６−２１９４５５号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】「ジャーナル オブ ザ アメリカン ケミカル ソサイティ（Ｊ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）」，７１巻，ｐ４１２４−４１２６（１９４９）．
【非特許文献２】「アプライド マイクロバイオロジー アンド バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，５１巻，ｐ２２−３２（１９９９）．
【非特許文献３】「バイオサーファクタント アンド バイオテクノロジー（Ｂｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」，（米国），マーシャルデッカー インコーポレーション ニューヨーク（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９８７）．
【非特許文献４】「ジャーナル オブ バイオテクノロジー（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，（英国），１３巻，ｐ２５７−２６６（１９９０）．
【非特許文献５】「カナデアン ジャーナル オブ ケミストリー（Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．）」，３９巻，ｐ８４６−８５５（１９６１）．
【非特許文献６】「バイオデグラデーション（Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）」，１巻，ｐ１０７−１１９（１９９０）．
【非特許文献７】「アプライド マイクロバイオロジー アンド バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，４７巻，ｐ４９６−５０１（１９９７）．
【非特許文献８】「バイテクノロジー レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．）」，２０巻，ｐ１１５３−１１５６（１９９８）．
【非特許文献９】「バイオテクノロジー レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．）」，（オランダ），クルーワーアカデミック パブリッシャー（ＫＬＵＷＥＲ ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ），８巻，ｐ７５７−７６２（１９８６）．
【非特許文献１０】「アプライド マイクロバイオロジー アンド バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，（ドイツ），スプリンガー−バーラグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ），５１巻，ｐ３３−３９（１９９９）．
【非特許文献１１】「モルキュラー バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）」，ブラックウェル（ＢｌａｃｋｗｅｌｌＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ），６６巻，ｐ５２５−５３３（２００７）．
【非特許文献１２】「バイオキミカ エト バイオフィジカ アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ）」，（オランダ），エルゼビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ），１５５８巻，ｐ１６１−１７０（２００２）．
【非特許文献１３】「アプライド エンバイアメント アンド マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）」，（米国），アメリカ微生物学会（ＡｍｅｒｃａｎＳｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｇｙ），６９巻，ｐ２５９５−２６０２（２００３）．
【非特許文献１４】「アンチマイクロバイアル・エージェンツ・アンド・ケモセラピー（Antimicrobial Agents and Chemiotherapy）４９巻、ｐ１５９７−１５９９（２００５）
【非特許文献１５】「フェムス イースト リサーチ（ＦＥＭＳ ＹＥＡＳＴ Ｒｅｓ．）」，（オランダ），エルゼビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ），５巻，ｐ９１９−９２３（２００５）．
【非特許文献１６】「フェット／リピッド（Ｆｅｔｔ／Ｌｉｐｉｄ．）」，１０１巻，ｐ３８９−３９４（１９９９）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
ところで、バイオサーファクタントには汎用の界面活性剤と比較して環境適合性、生体適合性に優れ、様々な生理活性が認められているが、既存の界面活性剤と同様の幅広い用途に利用されているかと言うと決してそうとは限らない。例えば食品用途等には制約がある。これは、多くの場合生産微生物に病原性は知られていないものの、自然界からの単離源が明確でないため、安全性に対する知見に乏しいことによる。特に微生物生産物を食品用途等に展開するためには、使用微生物の単離源が重要視される。例えば、酒類やパンの製造に利用される出芽酵母、乳酸菌や枯草菌（納豆菌）等は、食品分野で活躍する微生物として一般的に良く知られている。これらの微生物は全て食品中から容易に単離可能な微生物である。また、CL生産微生物は、クリプトコッカス・フミコーラを除いて、副生物としてMELを生成する。そのため、CLの収量が低下するほか、原料以外にMELを分離する精製工程が必要であり、余分なエネルギーの消費ならびにコスト上昇を引き起こしているが、MELを生産することなくCLを生産できれば、それらの問題の解消につながる。
【００１７】
そこで、食用植物または日常的に接触する植物群から単離した微生物を用いてMELを生産することなくバイオサーファクタントを製造する技術を開発することができれば、得られるバイオサーファクタントは安全性の面及び生産コストの面で大きな利点を獲得することとなり、生産微生物も含めた生産物全体の適用用途が大きく拡充されるものと期待される。
【００１８】
以上事情を鑑みて、本発明では、化粧品、食品、食品添加物、医薬、農畜水産業関連品（飼料、飼料添加物、肥料、農薬、魚餌）、洗剤など、生体に対する安全性がより求められる用途に対して、従来よりも適応性に優れたバイオサーファクタントを提供するべく、食用植物から単離した微生物、ならびにそれを用いるバイオサーファクタントの発酵製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、池や沼などに茂生するイネ科の水生植物であり、肥大した新芽が「マコモタケ」として古くから日常的に食用されている「マコモ」から、ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）を採取し単離すること、当該微生物がCLを生産すること、及び既存のCL生産菌のほとんどがMELを生産するのに対して、MELを生産することなしにCLのみを生産できることを見出し、本発明をなすに至ったものである。
【００２０】
すなわち、本発明の微生物は、以下の〔１〕〜〔６〕に示される。
〔１〕 マンノシルエリスリトールリピッドを生産することなくバイオサーファクタントを生産する能力を有するウスチラゴ属に属する微生物。
〔２〕 バイオサーファクタントを生産する能力がマンノシルエリスリトールリピッド（MEL）を生産することなくセロビオースリピッド（CL）を生産する能力である〔１〕に記載の微生物。
〔３〕 マコモ属に属する植物から単離した微生物である〔１〕または〔２〕に記載の微生物。
〔４〕 ウスチラゴ エスキュレンタ（Ustilago esculenta）に属する微生物である〔１〕、〔２〕または〔３〕に記載の微生物。
〔５〕 下記の菌学的性質を有する〔１〕ないし〔４〕のいずれかに記載の微生物。
記
（１）YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地上にて25℃で7日間培養後に、波型、半レンズ状、湿性でクリーム色のコロニーを形成する。
（２）YM液体培地およびPD液体培地にて、25℃で、３日間培養後に、幅4-5μm程度の菌糸の形成が確認される。
（３）YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地の平板培地上においても、25℃で7日間培養後に、隔壁のある菌糸ならびに偽菌糸の形成が認められる。
（４）また、前記（１）、（２）及び（３）のいずれの場合も、明らかな有性生殖器の形成は認められない。
（５）生理性状試験の結果は、上記の表１に示す通りである。
〔６〕 ウスチラゴ エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1（受託番号 FERM P-21725）である〔１〕ないし〔５〕のいずれかに記載の微生物。
【００２１】
また、本発明のバイオサーファクタント製造方法は、以下の〔７〕〜〔１２〕に示される。
〔７〕 マンノシルエリスリトールリピッドを生産することなくバイオサーファクタントを生産する能力を有するウスチラゴ属に属する微生物を培養しバイオサーファクタントを生産することを特徴とする、バイオサーファクタントの製造方法。
〔８〕 バイオサーファクタントを生産することがマンノシルエリスリトールリピッド（MEL）を生産することなくセロビオースリピッド（CL）を生産することである〔７〕に記載のバイオサーファクタントの製造方法。
〔９〕 上記のウスチラゴ属に属する微生物が、マコモ属に属する植物から単離した微生物である〔７〕または〔８〕に記載のバイオサーファクタントの製造方法。
〔１０〕 上記のウスチラゴ属に属する微生物が、ウスチラゴ エスキュレンタ（Ustilago esculenta）に属する微生物である 〔７〕、〔８〕または〔９〕に記載のバイオサーファクタントの製造方法。
〔１１〕 上記のウスチラゴ属に属する微生物が、下記の菌学的性質を有する微生物である〔７〕ないし〔１０〕のいずれかに記載のバイオサーファクタントの製造方法。
記
（１） YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地上にて25℃で7日間培養後に、波型、半レンズ状、湿性でクリーム色のコロニーを形成する。
（２） YM液体培地およびPD液体培地にて、25℃で、３日間培養後に、幅4-5μm程度の菌糸の形成が確認される。
（３） YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地の平板培地上においても、25℃で7日間培養後に、隔壁のある菌糸ならびに偽菌糸の形成が認められる。
（４） また、前記（１）、（２）及び（３）のいずれの場合も、明らかな有性生殖器の形成は認められない。
（５） 生理性状試験の結果は、上記の表１に示す通りである。
〔１２〕上記のウスチラゴ属に属する微生物が、ウスチラゴ エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1（受託番号 FERM P-21725）である〔７〕ないし〔１１〕のいずれかに記載の微生物バイオサーファクタントの製造方法。
【００２２】
また、本発明のバイオサーファクタントを含有する食品、化粧品、または飼料は、以下の〔１３〕、〔１４〕または〔１５〕に示される。
〔１３〕 〔１〕ないし〔６〕のいずれかに記載の微生物を培養することにより得られたバイオサーファクタントを含有する食品。
〔１４〕 〔１〕ないし〔６〕のいずれかに記載の微生物を培養することにより得られたバイオサーファクタントを含有する化粧品。
〔１５〕 〔１〕ないし〔６〕のいずれかに記載の微生物を培養することにより得られたバイオサーファクタントを含有する飼料。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、古くから広く食される食用植物であるマコモタケ（黒穂菌に寄生されて肥大したマコモの新芽）の可食部分の本体を構成する微生物、より具体的にはウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）を提供することができる。
当該微生物を発酵微生物として用いることにより、得られたバイオサーファクタントの安全性を確保するとともに、これまで利用に制限があった食品用途や家畜飼料、魚餌、農業用途に直接使用できる界面活性剤としての利用が見込まれ、バイオサーファクタントの普及の拡大に著しく貢献できるものと期待される。
さらに本発明に係る製造方法によれば、従来の方法において副生物として混入していたMELを含まないCLのみの発酵生産物を得ることが可能となる。特に、油脂等の疎水性基質を用いず、糖質(グルコースやショ糖)を炭素源として含有する培地を用いることにより、効率的にCLを生産することが可能であり、CLの単離も簡便となる。
以上のように本発明を利用することで、MELを生産しないことで、CLの収量が良くなり、生産効率が向上すること、精製ステップの簡略化が可能であることから、CL生産コストの大幅な低減が可能となり、より低価格なCLを市場に提供し、これまで制約のあった食品、農畜産業も含む幅広い分野へのバイオサーファクタントの利用拡大が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】実施例１において、培地中の酵母エキス濃度に対するCL生産試験の結果を示すグラフである。
【図２】実施例２において、三角フラスコを用いて行った流加培養試験の結果を培養時間に沿って追跡したグラフである。
【図３】実施例３において、培養液から抽出直後の糖脂質成分と精製後の糖脂質成分をTLC分析によって解析した図である。
【図４】実施例４において、各濃度の成分（ａ）の表面張力値を方対数グラフにスポットした図である。
【図５】実施例５において、ジャーファーメンターを用いて行った流加培養試験の結果を培養時間に沿って追跡したグラフである。
【図６】実施例６において、発酵大麦エキスを用いた天然培地を用いて、流加培養試験を行った結果を培養時間に沿って追跡したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明につきさらに詳しく説明する。
〈微生物〉
本発明に該当する微生物としては、バイオサーファクタント（但し、マンノシルエリスリトールリピッドを除く）を生産する能力を有するものであればよく、好ましくは当該バイオサーファクタント以外のバイオサーファクタントを生産することがないものであれば特に限定されるものではない。上記に該当するバイオサーファクタントについては、一般的に生産量が高く、原料が比較的安価な糖質や植物油脂等で生産できる糖脂質型のバイオサーファクタントが好ましく、ソホロースリピッド、トレハロースリピッド、セロビオースリピッド、ラムノリピッド等が挙げられる。特にセロビオースリピッド（CL）は生理活性が高いことから望ましい。上記に該当する微生物としては、ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）に属する微生物が好ましく、ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）NBRC9887株、ウスチラゴ・エスキュレンタ MK-1株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M17株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M18株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M19株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M20株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M21株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M22株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M23株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M24株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M25株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M26株、ウスチラゴ・エスキュレンタ M27株、ウスチラゴ・エスキュレンタ MAFF305616株、ウスチラゴ・エスキュレンタ MAFF305618株、ウスチラゴ・エスキュレンタ MAFF305619株、ウスチラゴ・エスキュレンタ MAFF305621株、などが例示される。
ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1株は、本発明者等が日本国内で採取した植物（マコモ）から分離した。本菌株は、YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地上にて25℃で7日間培養後に、波型、半レンズ状、湿性でクリーム色のコロニーを形成する。YM液体培地およびPD液体培地にて、25℃で、３日間培養後に、幅4-5μm程度の菌糸の形成が確認される。YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地の平板培地上においても、25℃で7日間培養後に、隔壁のある菌糸ならびに偽菌糸の形成が認められる。また、いずれの場合も、明らかな有性生殖器の形成は認められない。
ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1株は、リボゾームRNA遺伝子の26SrDNA−D1/D2領域の塩基配列（rDNA配列）を決定し、DNAデータベース（DDBJ）にアクセスし、FASTAプログラム（http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/fasta-j.html）を用いて相同性検索を行ったところ、ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）のrDNA配列と100％一致した。MK-1の生理性状試験の結果も合わせて、本菌株は担子菌門の一種であるウスチラゴ・エスキュレンタに属することがわかり、ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1株と命名した。生理性状試験の結果は、表１に示す通りである。本菌株は、平成20年11月17日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（IPOD）（茨城県つくば市東１−１−３）に受託番号FERM P-21725として寄託されている。
なお、本発明に該当するバイオサーファクタント（但し、マンノシルエリスリトールリピッドを除く）を生産する能力を有するウスチラゴ属に属する微生物は、マコモ等の天然の植物から単離された菌株、または保存機関から分譲された菌株によらず、あるいはその継代培養であってもよい。
【表１】
+ ：試験開始後に数日で反応が陽性、 - ： 反応が陰性、 S ： 試験開始後に2週間から3週間以上にかけて徐々に陽性反応が認められた、 L ： 試験開始2週間以降に急速に陽性反応が認められた。
【００２６】
〈バイオサーファクタント生産培地・培養条件〉
本発明の微生物の培養形態は液体培地を用いた回分培養あるいは培養系に糖質および/または有機窒素源を連続添加する流加培養であり、通気攪拌することが望ましい。培地の初期ｐHは酸性から中性の範囲であれば特に問題は無いが、３．０−９．０に調整することが好ましく、６．０−８．０に調整することがより望ましい。培養に適した温度範囲は２０−３５℃、より好ましくは２５−２８℃である。
【００２７】
本発明において、培地は一般的な半合成培地を用いればよい、CL生産を効率よく行うためには主原料である炭素原料にグルコース、ショ糖、廃糖蜜などの糖質を用いることが望ましい。糖質に加えて、もしくは置き換えて、油脂類などを炭素源として用いてもかまわない。窒素源としては、有機窒素源と無機窒素源を組み合わせて用いることが望ましい。
糖類は当該酵母が資化できるものあれば特に限定されるものではない。例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトースなどの単糖類、ショ糖、マルトースなどの二糖類が用いられるが、好ましくはグルコースである。培養初発濃度は１０−１５０ｇ／Ｌ、好ましくは３０−１００ｇ／Ｌで用いられる。
用いる油脂類としては、特に限定されるものではない。植物油、脂肪酸またはそのエステル類を用いても良い。
使用する植物油としては、例えばダイズ油、ナタネ油、コーン油、綿実油、ヒマワリ油、カポック油、ゴマ油、コメ油、落花生油、ベニバナ油、オリーブ油、アマニ油、キリ油、ヒマシ油、パーム油、パーム核油、ヤシ油もしくはこれらの混合物等が挙げられる。
使用する脂肪酸および脂肪酸エステルには、炭素鎖が１０−２４のもの、好ましくは炭素鎖が１６−１８の脂肪酸または脂肪酸エステルを用いることができる。これらの脂肪酸または脂肪酸エステルは分子内に１−３個の不飽和結合を含んでいてもよい。例えば、デカン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸などの飽和脂肪酸またはそのエステル、あるいはトウハク酸、リンデル酸、ツズ酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、ペトロセリン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、エルカ酸、ソルビン酸、リノール酸、リノエライジン酸、γ―リノレン酸、リノレン酸、アラキドン酸などの不飽和脂肪酸またはそのエステルが挙げられる。
培地に添加する上記油脂類の濃度は、２０−２００ｇ／Ｌ、好ましくは５０−１５０ｇ／Ｌの範囲である。流加培養の様式をとる場合には、培地中濃度が上記の範囲に収まるように培養期間中に連続的もしくは断続的に添加する。
使用する有機窒素源としては、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、ポリペプトン、コーンスティープリカー、カザミノ酸、尿素などの内、一種類もしくは二種類以上を組み合わせて用いることができる。好ましくは酵母エキスを1−８ ｇ／Ｌの濃度範囲で用いるとよい。
無機窒素源としては、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、アンモニアなどの内、一種類もしくは二種類以上を組み合わせて用いることができる。好ましくは硝酸ナトリウムを用いるとよい。
【００２８】
〈セロビオースリピッドの回収・精製方法〉
培養液からのCLの抽出・精製は以下のように行う。培養液と等量の酢酸エチルを加え、CLおよび疎水性成分を抽出し、酢酸エチル相を分取する。酢酸エチルをエバポレーター等で取り除くことで、CLおよび疎水性成分を含む画分を得る。さらに、得られた画分をヘキサンによって洗浄することで、CL以外の疎水性成分を除去し、残渣を乾燥することでCL標品を得る。CL標品を再び、メタノールに溶かし、アンスロン硫酸法を用いて、CL量を測定する。ヘキサン洗浄液についても、エバポレーター等でヘキサンを除去することでCL以外の疎水性成分を回収し、重量を測定することで培地中に残存する疎水性成分の量を得る。
【００２９】
〈セロビオースリピッドの構造決定〉
上記により得られる糖脂質成分の構造決定は、以下のようにして行う（ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）NBRC9887株を用いてグルコースを炭素源として培養して得られた酸型CLの構造決定手法を例にして以下説明する）。
単離した糖脂質成分は、TLCプレート上で、アンスロン硫酸試薬で青緑色に呈色することにより糖脂質成分であると判断できる。この糖脂質について、1Ｈ、13Ｃ、二次元ＮＭＲ解析を行い、得られたスペクトルと、構造既知であるCLのデータ（非特許文献２から５参照）とを比較することで、構造解析を行う。
【００３０】
〈セロビオースリピッドの定量分析方法〉
全糖脂質量はアンスロン硫酸法を用いることで測定できる。CL同属体の含有量と存在比は薄相クロマトグラフィー（TLC）法および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することで測定できる。
【００３１】
以下に、本発明について実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例１】
【００３２】
（ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）を用いた、CLの選択的発酵生産；酵母エキス濃度の影響)
〈種培養〉
ディープフリーザー（-８０℃）で冷凍保存されたウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）NBRC9887株を３０ ｍＬのＹＭ培地（グルコース１０ ｇ／Ｌ、酵母エキス３ ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ ｇ／Ｌ、ペプトン５ ｇ／Ｌ）に０．５ｍＬ播種し、２８℃で１日間、振蕩培養した。
〈本培養〉
３００ｍＬ容量の三角フラスコに３０ ｍＬの酵母エキス濃度を変えたCL生産用培地を表２（CL生産培地組成）のごとく調製し、１２１℃、２０分間オートクレーブで滅菌した培地を用意した。上述の種培養液を１．５ｍＬを播種し、２８℃で４日間、振蕩培養を行った。培養終了後の培養液から上述の分離・精製方法を用いてCL標品を精製し、CL標品をアンスロン硫酸法にて、測定することで、培地体積あたりのCL生産量を算出した。酢酸エチルで抽出された培養液に含まれる菌体をメタノールおよび水で洗浄後、１０５℃で一晩乾燥させた後、重量を測定することで菌体量を測定した。
【００３３】
【表２】
【００３４】
〈薄層クロマトグラフィー分析〉
図１に示すように、酵母エキスを８ｇ／Ｌ添加した培地で、２,５００mｇ／ＬのCLを生産することができた。酵母エキスの濃度をコントロールすることで、効率的にCLを生産できることが示された。いずれの条件でもMELは検出されなかった。
【実施例２】
【００３５】
（ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）を用いた、CLの選択的発酵生産；流加培養法）
３００ｍＬ容量の三角フラスコに30 mlのCL生産用培地を表３〔CL生産培地組成(流加培養初期培地)〕のごとく調製し、１２１℃、２０分間オートクレーブで滅菌した培地を用意した。実施例１と同様に調製したウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）NBRC9887株の種培養液を１．５ ｍＬ播種し、培養期間の間、２日おきに最終濃度が５０ｇ/Ｌ相当する滅菌濃縮グルコース溶液〔表４；CL生産培地組成(流加培地)〕ならびに最終濃度が２ g/Lに相当する滅菌濃縮酵母エキス溶液を添加しながら培養を実施した。培養途中でサンプルを抜き出し、培地中CL濃度、菌体濃度、グルコース濃度を測定した。CL濃度、菌体濃度に関しては上述の実施例１と同様に測定した。
【００３６】
〈グルコースの定量〉
培養液を遠心分離し、水溶液相を分取した。分取した水溶液相を市販のグルコース検出キット（グルコーステストワコーＣ−ＩＩ、和光純薬工業）を用いて、水溶液相に含まれるグルコース量を測定した。
【００３７】
【表３】
【００３８】
【表４】
【００３９】
図２に示すように、流加培養法を適用することで、CL生産量は、８日間で６,１００mg/Lであった。MELは検出されなかった。
【００４０】
比較例１
（従来株ウスチラゴ・マイディス(Ustilago maydis)を用いたCL生産）
〈種培養〉
ディープフリーザー（-８０℃）で冷凍保存されたウスチラゴ・マイディス(Ustilago maydis) NBRC6907株について、実施例１と同様の方法を用いて行った。
〈本培養〉
本培養に用いる培地はビー・フラウツらの論文（非特許文献１）を参考に表５（培地組成）のごとく調製し、１２１℃、２０分間オートクレーブで滅菌した培地を用意した。種培養液を１．５ ｍＬを播種し、２８℃で７日間、振蕩培養を行った。CLの抽出および分析方法は実施例１と同様に行った。MELの定量はＨＰＬCを用いて分析した。
【００４１】
【表５】
【００４２】
〈ＨＰＬＣによるMEL生産量の定量〉
培養終了後の培養液から培養液と同量の酢酸エチルを用いてMEL画分の抽出を行った。抽出液中のMEL濃度はシリカゲルカラム（イナートシルＳｉｌ−１００Ａ）を接続したＨＰＬＣを用い、定量分析を行った。溶離液にはクロロホルム／メタノール混合溶媒を用い、流速１ｍＬ／ｍｉｎで混合比が１０：０から０：１０まで変化するように設定したグラジエントシステムにより溶出した。検出は蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ−ＬＴ、島津製作所製）を用いた。精製したMELを用いて検量線を作成し、ピークエリアからMEL濃度を算出した。
【００４３】
実施例１，２および比較例１で生産された糖脂質の定量結果を表６（実施例１、２、及び比較例１において、グルコースもしくは植物油を炭素原料として行ったCL生産試験の結果）に示す。従来の生産微生物であるウスチラゴ・マイディス(Ustilago maydis) NBRC6907株を用いて糖脂質を生産した比較例１ではCLと同時にMELを副生産したが、ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）NBRC9887株を用いて生産した実施例１および２ではMEL等のCL以外のバイオサーファクタントを生産しなかった。これらの結果から、ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）NBRC9887株をCL生産菌として利用することで、CLのみを選択的に生産できることがわかる。
【００４４】
【表６】
【実施例３】
【００４５】
ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）が生産する糖脂質の構造解析
（糖脂質（セロビオースリピド）の精製）
実施例２と同様に培養した培養液から、酢酸エチルを用いて糖脂質を抽出・回収し、シリカゲルカラムを用いて、各成分を抽出した。抽出された糖脂質成分をTLC分析により分析した結果を図３に示す。より成分(a)を含む精製画分Aと成分(b)を含む精製画分Bを得た。
（糖脂質成分のＮＭＲ解析）
上記で得られた成分（a）、成分（ｂ）について、重水素化メタノール（CD3OD）を溶媒とするＮＭＲ解析により構造の同定を行った。1H、1３C、1H−1H COSY、HMQC、HMBCの各NMRスペクトル解析を行うことで、本糖脂質の構造を完全帰属した。その結果、ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）NBRC9887株が生産する糖脂質は全てCLであることがわかった。成分(a)中に２種類のCL同属体（成分‐（ａ）‐１および成分‐（ａ）‐２）が混在していることがわかった。同様に成分（ｂ）に関しても２種類のCL同属体（成分‐（ｂ）‐１および成分‐（ｂ）−２）が含まれていることがわかった。化３に一般式３を示す。それぞれの糖脂質に関して、帰属された化学シフトをまとめて表７（成分（ａ）‐１のＮＭＲ分析結果）、表８（成分（ａ）‐２のＮＭＲ分析結果）、表９（成分（ｂ）‐１のＮＭＲ分析結果）、および表１０（成分（ｂ）‐２のＮＭＲ分析結果）に示す。
【００４６】
【化３】
【００４７】
【表７】
【００４８】
【表８】
【００４９】
【表９】
【００５０】
【表１０】
【実施例４】
【００５１】
（CLの界面活性測定）
〈表面張力測定〉
実施例３において、精製した成分（ａ）の表面張力低下能を調べた。種々の濃度の成分(a)の水溶液を作成し、その表面張力をペンダントドロップ方式の表面張力計（Ｄｒｏｐ Ｍａｓｔｅｒ ＤＭ５００, 協和界面科学製）を用いて測定した。
【００５２】
成分（ａ）について、上記の方法を用いて表面張力低下能を測定した。各濃度の成分(ａ)に対する表面張力は図４に示す値を示した。図４の曲線から成分（ａ）の臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）は５８．３ｍｇ／Ｌであり、その時の表面張力値（γｃｍｃ値）は３６．４ ｍＮ／ｍであった。既存の合成界面活性剤とくらべて、十分小さいｃｍｃ値ならびにγｃｍｃ値を示したことから、本発明で生産されるCLは界面活性剤として十分な機能を発揮できることが推察できる。
【実施例５】
【００５３】
（発酵槽を用いたCL生産）
食用として用いうるマコモから、新たに分離したウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1株を用いて培養試験を実施した。３００ ｍＬ容量の三角フラスコ３本にグルコース濃度を５０g/Lにした発酵槽用CL生産用培地（流加培養初期培地）３０ mlを表１１〔発酵槽用CL生産培地組成(流加培養初期培地)〕のごとく調製し、１２１℃、２０分間オートクレーブで滅菌した。実施例１と同様に調製した種培養液を１．５ｍＬ播種し、２日間培養したものを種培養液とした。５Lジャーファーメンターに２L分の発酵槽用CL生産培地組成(流加培養初期培地)の培地を作成し、１２１℃、２０分間オートクレーブで滅菌した。種培養をジャーファーメンターに播種し、培養温度２５℃、攪拌回転速度５００ ｒｐｍ、通気速度 ２ L/min （１ ＶＶＭ）の条件で培養した。培養５５時間で、オートクレーブした５０％（ｗ／ｖ）グルコース溶液を400 ｍｌ添加した。培養途中でサンプルを抜き出し、培地中CL濃度、菌体濃度、グルコース濃度を測定した。CL濃度、菌体濃度、グルコース濃度に関しては上述の実施例２と同様に測定した。
【００５４】
【表１１】
【００５５】
図５に示したように、食用として用いうるマコモから分離したウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1株を用いて、ジャーファーメンターでCLを生産した場合、５日間で、１３,０００mｇ／ＬのCLを培地中に蓄積した。５日目における、培地体積当たりのCL生産性は２,５８０mｇ／Ｌ／ｄａｙであった。また、TLC,HPLC,NMRの結果、MEL等のCL以外のバイオサーファクタントは検出されなかった。食用として用いうるマコモから分離した微生物株を利用して、適当な条件でCLを生産した場合、効率的にCLを生産できることが確認された。
【実施例６】
【００５６】
焼酎製造の際、副生する発酵大麦エキスを用いたCL発行生産を実施した。３００ｍＬ容量の三角フラスコ３本にグルコース濃度を５０g/Lにした発酵槽用CL生産用培地３０ mlを実施例５と同様に調製し、１２１℃、２０分間オートクレーブで滅菌した。実施例１と同様に調製したウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1株の種培養液を１．５ ｍＬ播種し、２日間培養したものを種培養液とした。５Lジャーファーメンターに手持ち屈折計を用いて５％Brix。に濃度を調整した発酵大麦エキス１．５Lを作成し、１２１℃、２０分間オートクレーブで滅菌した。別にオートクレーブ滅菌した５０％（ｗ／ｖ）グルコース溶液を４００ ｍｌ添加し、種培養をジャーファーメンターに播種し、培養温度２５℃、攪拌回転速度５００ ｒｐｍ、通気速度 ２ L/min （１ ＶＶＭ）の条件で培養した。培養６５時間で、オートクレーブした５０％（ｗ／ｖ）グルコース溶液を400 ｍＬ添加した。培養途中でサンプルを抜き出し、培地中CL濃度、菌体濃度、グルコース濃度を測定した。CL濃度、菌体濃度、グルコース濃度に関しては上述の実施例２と同様に測定した。
【００５７】
図６に示したように、食用として用いうるマコモから分離したウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1株を用いて、ジャーファーメンターでCLを生産した場合、７日間で、３６,０００mｇ／ＬのCLを培地中に蓄積した。７日目における、培地体積当たりのCL生産性は５,１００mｇ/Ｌ/ｄａｙであった。また、TLC,HPLC,NMRの結果、MEL等のCL以外のバイオサーファクタントは検出されなかった。これまでの報告では、ウスチラゴ・マイディス(Ustilago maydis)を用いた培養によって７日間で30 g/Lの糖脂質を生産できるという報告例（Appl. Microbiol. Biotechnol., 51, 33-39 (1999)）があるが、この場合、得られる糖脂質はMELとCLの混合物であり、その含有比はMEL/CL = 9/1となる。つまり、純粋なCLの生産量は約3 g/Lにしか満たない。また最近、別の属の酵母であるシュードザイマ・フロキュローサ（Pseudozyma flocculosa）を用いた培養によって、これまでの最高値である７日間で15 g/Lのフロキュロシンが生産できると言う報告がある（Appl. Microbiol. Biotechnol., 80, 307-315 (2008)）が、本技術では従来技術の２倍以上の生産量で簡便にCLのみを生産することができる。すなわち、発酵大麦エキスを用いた天然培地にて、本菌株を用いて効率的にCLを生産できることが確認された。さらに培養終了後の発酵液から、酢酸エチル・2-プロパノール混合溶媒（混合比４：１）を用いて、CLを回収したところ、９０．１ ｇのCLを回収することができた。
【実施例７】
【００５８】
（その他新規分離株、登録保存株によるCLの生産）
愛媛県今治産マコモの黒穂菌嬰より、ポテトデキストロール寒天培地を用いて、分離した１１株のウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）に属する微生物株（M１７〜M２７）、ならびに、農林水産省ジーンバンクに登録されているウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）に属する微生物株(ＭＡＦＦ ３０５６１６株, ＭＡＦＦ ３０５６１８株、ＭＡＦＦ ３０５６１９株、ＭＡＦＦ ３０５６２１株)のCL生産性の有無を確認するため、実施例１と同様の方法で、以下の実験を行い、CL生産性を確認した。
【００５９】
その結果、前記１５株すべてにおいて、CL生産を確認できた。その生産量は４６０ｍｇ/Ｌから２,５００mｇ／Ｌであった。また、TLC,HPLC,NMRの結果、MEL等のCL以外のバイオサーファクタントは検出されなかった。以上のごとく、新たにマコモ属に属する植物から分離したウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）株や、保存機関に寄託されている株でも、MEL等のCL以外のバイオサーファクタントを生産することなくCLを生産できることがわかった。分離株ならびに農林水産省ジーンバンク保存ウスチラゴ・エスキュレンタ株のCL生産量と菌体量を表１２に示す。
【００６０】
【表１２】
【受託番号】
【００６１】
FERM P-21725
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンノシルエリスリトールリピッドを生産することなくバイオサーファクタントを生産する能力を有するウスチラゴ属に属する微生物。
【請求項２】
バイオサーファクタントを生産する能力がマンノシルエリスリトールリピッドを生産することなくセロビオースリピッドを生産する能力である請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
マコモ属に属する植物から単離した微生物である請求項１または２に記載の微生物。
【請求項４】
ウスチラゴ エスキュレンタ（Ustilago esculenta）に属する微生物である請求項１、２または３に記載の微生物。
【請求項５】
下記の菌学的性質を有する請求項１ないし４のいずれかに記載の微生物。
記
（１）YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地上にて25℃で7日間培養後に、波型、半レンズ状、湿性でクリーム色のコロニーを形成する。
（２）YM液体培地およびPD液体培地にて、25℃で、３日間培養後に、幅4-5μm程度の菌糸の形成が確認される。
（３）YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地の平板培地上においても、25℃で7日間培養後に、隔壁のある菌糸ならびに偽菌糸の形成が認められる。
（４）また、前記（１）、（２）及び（３）のいずれの場合も、明らかな有性生殖器の形成は認められない。
（５）生理性状試験の結果は、表１に示す通りである。
【表１】
+ ：試験開始後に数日で反応が陽性、 - ： 反応が陰性、 S ： 試験開始後に2週間から3週間以上にかけて徐々に陽性反応が認められた、 L ： 試験開始2週間以降に急速に陽性反応が認められた。
【請求項６】
ウスチラゴ エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1（受託番号 FERM P-21725）である請求項１ないし５のいずれかに記載の微生物。
【請求項７】
マンノシルエリスリトールリピッドを生産することなくバイオサーファクタントを生産する能力を有するウスチラゴ属に属する微生物を培養しバイオサーファクタントを生産することを特徴とする、バイオサーファクタントの製造方法。
【請求項８】
バイオサーファクタントを生産することがマンノシルエリスリトールリピッドを生産することなくセロビオースリピッドを生産することである請求項７に記載のバイオサーファクタントの製造方法。
【請求項９】
ウスチラゴ属に属する微生物が、マコモ属に属する植物から単離した微生物である請求項７または８に記載のバイオサーファクタントの製造方法。
【請求項１０】
ウスチラゴ属に属する微生物が、ウスチラゴ エスキュレンタ（Ustilago esculenta）に属する微生物である請求項７、８または９に記載のバイオサーファクタントの製造方法。
【請求項１１】
ウスチラゴ属に属する微生物が、下記の菌学的性質を有する微生物である請求項７ないし１０のいずれかに記載のバイオサーファクタントの製造方法。
記
（１）YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地上にて25℃で7日間培養後に、波型、半レンズ状、湿性でクリーム色のコロニーを形成する。
（２）YM液体培地およびPD液体培地にて、25℃で３日間培養後に、幅4-5μm程度の菌糸の形成が確認される。
（３）YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地の平板培地上においても、25℃で7日間培養後に、隔壁のある菌糸ならびに偽菌糸の形成が認められる。
（４）また、前記（１）、（２）及び（３）のいずれの場合も、明らかな有性生殖器の形成は認められない。
（５）生理性状試験の結果は、上記の表１に示す通りである。
【請求項１２】
ウスチラゴ属に属する微生物が、ウスチラゴ エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1（受託番号 FERM P-21725）である請求項７ないし１１のいずれかに記載の微生物バイオサーファクタントの製造方法。
【請求項１３】
請求項１ないし６のいずれかに記載の微生物を培養することにより得られたバイオサーファクタントを含有する食品。
【請求項１４】
請求項１ないし６のいずれかに記載の微生物を培養することにより得られたバイオサーファクタントを含有する化粧品。
【請求項１５】
請求項１ないし６のいずれかに記載の微生物を培養することにより得られたバイオサーファクタントを含有する飼料。
【請求項１】
マンノシルエリスリトールリピッドを生産することなくバイオサーファクタントを生産する能力を有するウスチラゴ属に属する微生物。
【請求項２】
バイオサーファクタントを生産する能力がマンノシルエリスリトールリピッドを生産することなくセロビオースリピッドを生産する能力である請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
マコモ属に属する植物から単離した微生物である請求項１または２に記載の微生物。
【請求項４】
ウスチラゴ エスキュレンタ（Ustilago esculenta）に属する微生物である請求項１、２または３に記載の微生物。
【請求項５】
下記の菌学的性質を有する請求項１ないし４のいずれかに記載の微生物。
記
（１）YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地上にて25℃で7日間培養後に、波型、半レンズ状、湿性でクリーム色のコロニーを形成する。
（２）YM液体培地およびPD液体培地にて、25℃で、３日間培養後に、幅4-5μm程度の菌糸の形成が確認される。
（３）YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地の平板培地上においても、25℃で7日間培養後に、隔壁のある菌糸ならびに偽菌糸の形成が認められる。
（４）また、前記（１）、（２）及び（３）のいずれの場合も、明らかな有性生殖器の形成は認められない。
（５）生理性状試験の結果は、表１に示す通りである。
【表１】
+ ：試験開始後に数日で反応が陽性、 - ： 反応が陰性、 S ： 試験開始後に2週間から3週間以上にかけて徐々に陽性反応が認められた、 L ： 試験開始2週間以降に急速に陽性反応が認められた。
【請求項６】
ウスチラゴ エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1（受託番号 FERM P-21725）である請求項１ないし５のいずれかに記載の微生物。
【請求項７】
マンノシルエリスリトールリピッドを生産することなくバイオサーファクタントを生産する能力を有するウスチラゴ属に属する微生物を培養しバイオサーファクタントを生産することを特徴とする、バイオサーファクタントの製造方法。
【請求項８】
バイオサーファクタントを生産することがマンノシルエリスリトールリピッドを生産することなくセロビオースリピッドを生産することである請求項７に記載のバイオサーファクタントの製造方法。
【請求項９】
ウスチラゴ属に属する微生物が、マコモ属に属する植物から単離した微生物である請求項７または８に記載のバイオサーファクタントの製造方法。
【請求項１０】
ウスチラゴ属に属する微生物が、ウスチラゴ エスキュレンタ（Ustilago esculenta）に属する微生物である請求項７、８または９に記載のバイオサーファクタントの製造方法。
【請求項１１】
ウスチラゴ属に属する微生物が、下記の菌学的性質を有する微生物である請求項７ないし１０のいずれかに記載のバイオサーファクタントの製造方法。
記
（１）YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地上にて25℃で7日間培養後に、波型、半レンズ状、湿性でクリーム色のコロニーを形成する。
（２）YM液体培地およびPD液体培地にて、25℃で３日間培養後に、幅4-5μm程度の菌糸の形成が確認される。
（３）YM寒天培地、PDB寒天培地および5%麦芽エキス培地の平板培地上においても、25℃で7日間培養後に、隔壁のある菌糸ならびに偽菌糸の形成が認められる。
（４）また、前記（１）、（２）及び（３）のいずれの場合も、明らかな有性生殖器の形成は認められない。
（５）生理性状試験の結果は、上記の表１に示す通りである。
【請求項１２】
ウスチラゴ属に属する微生物が、ウスチラゴ エスキュレンタ（Ustilago esculenta）MK-1（受託番号 FERM P-21725）である請求項７ないし１１のいずれかに記載の微生物バイオサーファクタントの製造方法。
【請求項１３】
請求項１ないし６のいずれかに記載の微生物を培養することにより得られたバイオサーファクタントを含有する食品。
【請求項１４】
請求項１ないし６のいずれかに記載の微生物を培養することにより得られたバイオサーファクタントを含有する化粧品。
【請求項１５】
請求項１ないし６のいずれかに記載の微生物を培養することにより得られたバイオサーファクタントを含有する飼料。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−１５８１９２（Ｐ２０１０−１５８１９２Ａ）
【公開日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１９１４（Ｐ２００９−１９１４）
【出願日】平成２１年１月７日（２００９．１．７）
【出願人】（０００１７７５０８）三和酒類株式会社 (11)
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月７日（２００９．１．７）
【出願人】（０００１７７５０８）三和酒類株式会社 (11)
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
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