糖鎖の製造法
【課題】 医薬品あるいは機能性素材となり得る糖鎖、特にシアル酸含有糖鎖の安価で効率的な製造法を提供する。
【解決手段】複数の糖転移酵素を用いて、糖供与体としての糖ヌクレオチドの糖部分（Ａ１）を糖受容体（Ｂ）に転移させて糖鎖（Ａ１−Ｂ）を合成し、次いで別の糖供与体としての糖ヌクレオチドの糖部分（Ａ２）を得られた糖鎖（Ａ１−Ｂ）に転移させて新たな糖鎖（Ａ２−Ａ１−Ｂ）を合成し、このような反応を複数回繰り返して目的とする糖鎖（Ａｎ−・・・Ａ２−Ａ１−Ｂ）（ただし、ｎは整数を示す）を製造する方法において、（ａ）酵母菌体を併用する、（ｂ）糖ヌクレオチドをヌクレオチドと糖から系内で合成及び再生する、（ｃ）途中で精製処理を行わない、ことを特徴とする目的とする糖鎖の製造法を提供する。
【解決手段】複数の糖転移酵素を用いて、糖供与体としての糖ヌクレオチドの糖部分（Ａ１）を糖受容体（Ｂ）に転移させて糖鎖（Ａ１−Ｂ）を合成し、次いで別の糖供与体としての糖ヌクレオチドの糖部分（Ａ２）を得られた糖鎖（Ａ１−Ｂ）に転移させて新たな糖鎖（Ａ２−Ａ１−Ｂ）を合成し、このような反応を複数回繰り返して目的とする糖鎖（Ａｎ−・・・Ａ２−Ａ１−Ｂ）（ただし、ｎは整数を示す）を製造する方法において、（ａ）酵母菌体を併用する、（ｂ）糖ヌクレオチドをヌクレオチドと糖から系内で合成及び再生する、（ｃ）途中で精製処理を行わない、ことを特徴とする目的とする糖鎖の製造法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖、特にシアル酸含有糖鎖の製造法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、糖鎖についての研究が急速に進み、その機能が明らかになるにつれ、生理活性を有する糖鎖あるいは複合糖質の医薬品または機能性素材としての用途開発が注目を集めている。特に細胞表面のシアル酸を含有する糖鎖（シアル酸含有糖鎖）は、多くの微生物、ウイルス、毒素等の受容体として機能することが明らかであり、特定のシアル酸含有糖鎖（オリゴ糖）及びその類似体は、それらの感染や結合を阻止するのに有用と考えられている。
【０００３】
シアル酸含有糖鎖の１つであるシアリルＮ−アセチルラクトサミン（ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ、「ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ」）は、リンパ組織や炎症部位への白血球の集積に関与する接着分子・セレクチンのリガンドとして機能することが知られ、またセレクチンとの相互作用を介して癌転移に関与すると言われているシアリルルイスＸ（ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃ）やシアリルルイスＡ（ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮＡｃ）の前駆体となる糖鎖である。
【０００４】
さらに、ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃは、インフルエンザウイルス感染時の宿主受容体である複合糖質の糖鎖構造でもあり、ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃをポリグルタミン酸に付与した所謂人工ムチンは、極めて高いインフルエンザウイルス吸着活性を示すことが報告されている。
【０００５】
このように、ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃは、機能糖鎖のコア構造であり、複合糖質の医薬品あるいは機能素材としての開発、商品化の重要な基材となる糖鎖（オリゴ糖）である。
【０００６】
ところで、現在市販されている糖鎖はごく限られた種類のものしかなく、しかも極めて高価である。たとえば、ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃは、試薬レベルでしか製造できず、その大量製造法が確立されていない。
【０００７】
従来、糖鎖の製造は、天然物からの抽出法、化学合成法あるいは酵素合成法、さらにはそれらの併用により行われていたが、その中でも酵素合成法が大量製造に適した方法であると考えられている。すなわち、（１）酵素合成法が化学合成法にみられる保護、脱保護といった煩雑な手順を必要とせず、速やかに目的の糖鎖を合成できる点、（２）酵素の基質特異性により、きわめて構造特異性の高い糖鎖を合成できる点などが他の方法より有利と考えられるためである。さらに、近年のＤＮＡ組換え技術の発達により種々の合成酵素が安価にしかも大量に生産できるようになりつつあることが、酵素合成法の優位性をさらに押し上げる結果となっている。
【０００８】
酵素合成法により糖鎖を合成する方法としては、糖鎖の加水分解酵素の逆反応を利用する方法および糖転移酵素を利用する方法の２通りの方法が考えられている。前者の方法は、基質として単価の安い単糖を用いることができるという利点はあるものの、反応自体は分解反応の逆反応を利用するものであり、合成収率や複雑な構造を持つ糖鎖合成への応用といった点では必ずしも最良の方法とは考えられていない。
【０００９】
一方、後者の糖転移酵素を用いる合成法は、合成収率や複雑な構造を持つ糖鎖合成への応用といった点で前者の方法よりも有利であると考えられており、また、近年のＤＮＡ組換え技術の進歩により各種糖転移酵素の量産化も該技術の実現化への後押しとなっている。しかしながら、糖転移酵素を利用した合成法で用いる糖供与体である糖ヌクレオチドは、一部のものを除き依然として高価で、量的にも試薬レベルのわずかな供給量でしか提供し得ないと言う問題点も指摘されていた。
【００１０】
たとえば、糖ヌクレオチドを糖供与体とし、糖転移酵素によりＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃを合成する場合、第１段階として糖受容体としてＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、糖供与体としてウリジン５’−二リン酸ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）、糖転移酵素としてβ１，４−ガラクトース転移酵素を用いてガラクトースを転移させてＮ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）を合成する。
【００１１】
次に、Ｎ−アセチルラクトサミンを糖受容体とし、シチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を糖供与体とし、シアル酸転移酵素によりシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸、以後「ＮｅｕＡｃ」とも略記）を転移させることで、目的とするＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃを合成する。
【００１２】
糖転移酵素反応で生成・蓄積するヌクレオチドは、一般には更なる糖転移反応を阻害する。例えば、シアル酸転移反応によりシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）が生成するが、ＣＭＰはシアル酸転移酵素活性を阻害するため、ＣＭＰを反応系より除去しないとシアル酸転移反応の効率は低下する。そのため、通常、ホスファターゼなどの添加によりＣＭＰを分解するなどの操作も必要となり、このような理由からも、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃなどの高価な糖ヌクレオチドを直接原料としてＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃを合成することは、実用的な方法とは到底なり得なかった。
【００１３】
このため、糖ヌクレオチドのサイクル合成と糖転移反応の組み合せによる糖鎖の合成法が考案されている。糖ヌクレオチドのサイクル合成は、糖転移反応により生成するヌクレオシド５’−ジリン酸（ＮＤＰ）あるいはヌクレオシド５’−モノリン酸（ＮＭＰ）をリン酸化して糖転移酵素活性を阻害するＮＤＰあるいはＮＭＰの蓄積を排除するとともに、糖ヌクレオチド合成の基質となるヌクレオシド５’−トリリン酸（ＮＴＰ）まで再生し、酵素的に糖ヌクレオチドを再生させるというものである。
【００１４】
ＮＭＰもしくはＮＤＰからのＮＴＰの再生には、（１）MyokinaseやPyruvate kinaseなどの酵素、及びアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）あるいはホスホエノールピルビン酸などのリン酸供与体を用いてＮＭＰもしくはＮＤＰを酵素的にリン酸化する方法（Pure & Appl. Chem., 65, 803-808 (1993), J. Am. Chem., 113, 6300-6302 (1991), U.S. Patent 5,728,554、Nature Biotech., 16, 769-772 (1998)）、（２）微生物生菌体（Corynebacterium ammnoniagenusや大腸菌）を用いてＮＭＰもしくはＮＤＰをリン酸化する方法（Nature Biotech. 16, 847-850 (1998), Carbohydorate Res. 316, 179-183 (1999), Appl. Microbiol. Biotechnol., 53: 257-261 (2000), Org. Biomol. Chem., 1, 3058 (2003), Appl. Environ. Microbiol., 69, 2110 (2003)）、及び（３）酵母菌体を用いる方法（特開２００２−３３５９８８）が報告されている。
【００１５】
しかしながら、上記（１）の方法は、リン酸供与体となるＡＴＰあるいはホスホエノールピルビン酸が高価であるという問題がある。また、ＮＴＰを基質とした糖ヌクレオチド合成の際にピロリン酸が生成するが、蓄積したピロリン酸は糖ヌクレオチド合成を抑制するため、ピロリン酸分解酵素を添加して無機リン酸に分解する必要がある。さらに、無機リン酸は反応の進行と共に蓄積するが、糖転移酵素反応に必要な金属イオン（マグネシウムあるいはマンガンなど）と不溶性沈殿を形成するため、酵素反応の進行が抑制される。そのため、反応途中に金属イオンを再添加するなど煩雑な工程とならざるを得ない問題もあり、実用化に適していない。
【００１６】
また、上記（２）の方法においては、ＮＭＰもしくはＮＤＰのリン酸化反応に膨大な微生物菌体量が必要であるため、その調製のための設備及びコスト面での問題がある。また、Corynebacterium菌や大腸菌自身のピロリン酸分解活性は低く、pyrophophatase添加あるいは該酵素生産菌の添加も必要となる問題がある。
【００１７】
さらに、上記（１）〜（３）の方法では、１種類の糖ヌクレオチドをサイクル合成させて糖転移反応を行わせた報告のみで、複数の糖ヌクレオチドをサイクル合成させて、複数の異なる糖転移反応を起こさせ、オリゴ糖の伸長に成功した例は報告されていない。
【００１８】
従って、ＵＤＰ−Ｇａｌのサイクル合成に伴うガラクトース転移反応のみで合成できるＮ−アセチルラクトサミンの大量製造は可能である（Carbohydr. Res., 316, 179 (1999)、特開２００２−３３５９８８）が、２段階の異なる糖転移反応を必要とするＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃを合成できるかは不明であり、効率的な製造法は確立されていない。
【００１９】
一方、シアル酸含有糖鎖製造上の問題として、シアル酸転移反応の際使用するシアル酸の供与体であるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃが高価な原料であることは前述したが、糖部分であるＮｅｕＡｃ自身も高価であり、糖ヌクレオチドのサイクル合成を利用したとしてもＮｅｕＡｃの直接使用は製造コストを押し上げる要因となる。そのため、安価な原料であるＧｌｃＮＡｃを原料とするＮｅｕＡｃの製造法（特開平５−２１１８８４、特開平２００１−１３６９８２）、及びＧｌｃＮＡｃとＣＭＰを原料とするＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造法（国際公開ＷＯ２００１／００９８３０）が開発されているが、これらの系を利用したＣＮＰ−ＮｅｕＡｃのサイクル合成をオリゴ糖へのシアル酸転移反応に適用できるかどうかは不明であり、そのことに関する報告もない。
【００２０】
【特許文献１】特開２００２−３３５９８８
【特許文献２】特開平５−２１１８８４
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００１／００９８３０
【特許文献４】U.S.Patent 5,728,554
【特許文献５】特開平２００１−１３６９８２
【非特許文献１】Pure & Appl. Chem., 65, 803-808 (1993)
【非特許文献２】J. Am. Chem., 113, 6300-6302 (1991)
【非特許文献３】Nature Biotech., 16, 769-772 (1998)
【非特許文献４】Nature Biotech. 16, 847-850 (1998)
【非特許文献５】Carbohydorate Res. 316, 179-183 (1999)
【非特許文献６】Appl. Microbiol. Biotechnol., 53: 257-261 (2000)
【非特許文献７】Org. Biomol. Chem., 1, 3058 (2003)
【非特許文献８】Appl. Environ. Microbiol., 69, 2110 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
このように、ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃを糖転移酵素を用いて製造する場合、現状ではＧｌｃＮＡｃへのガラクト−ス転移反応を行わせ、Ｎ−アセチルラクトサミンを生成させ、合成反応液からＮ−アセチルラクトサミンを精製し、次にシアル酸転移反応によりシアル酸（ＮｅｕＡｃ）を付与させてＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃを合成し、合成反応液から目的物質を精製するという２段階の煩雑な製造工程が必要であり、必ずしも実用的な製法とは言えない。
【００２２】
また、原料として使用するシアル酸（ＮｅｕＡｃ）は高価であり、ＮｅｕＡｃの直接使用も工業化においては大きな問題となる。
【００２３】
従って、ＵＤＰ−ＧａｌとＣＭＰ−ＮｅｕＡｃのサイクル合成と糖転移酵素を組み合わせたＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの実用的な製造法、より効率的には、糖原料としてＮｅｕＡｃを使用せず、代わりにＧｌｃＮＡｃを原料とするＮｅｕＡｃ合成を伴うＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの製造法を提供することができれば、工業的に極めて有利な方法となり得る。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明者らは上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、（１）酵母菌体は、長時間に渡り高いヌクレオチドのリン酸化活性及びピロリン酸分解活性を保持し、酵母菌体を利用することで連続的な複数の糖ヌクレオチドのサイクル合成が可能であり、連続的な複数の糖転移反応をワンポットで実行できること、（２）このような系は３糖以上のすべての糖鎖合成に利用できること、（３）さらに、ＧｌｃＮＡｃを原料とするＮｅｕＡｃ合成系を上記糖鎖合成系に組み合わせることで、高価なＮｅｕＡｃを使用せずにシアル酸含有糖鎖が製造可能であることを見出し、本発明を完成させた。したがって、本発明は、以下の通りのものである。
【００２５】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］ 複数の糖転移酵素を用いて、糖供与体としての糖ヌクレオチドの糖部分（Ａ１）を糖受容体（Ｂ）に転移させて糖鎖（Ａ１−Ｂ）を合成し、次いで糖供与体としての別の糖ヌクレオチドの糖部分（Ａ２）を得られた糖鎖（Ａ１−Ｂ）に転移させて新たな糖鎖（Ａ２−Ａ１−Ｂ）を合成し、このような反応を複数回繰り返して目的とする糖鎖（Ａｎ−・・・Ａ２−Ａ１−Ｂ）（ただし、ｎは整数を示す）を製造する方法において、（ａ）酵母菌体を併用する、（ｂ）糖ヌクレオチドをヌクレオチドと糖から系内で合成及び再生する、（ｃ）途中で精製処理を行わない、ことを特徴とする糖鎖の製造法。
【００２６】
［２］ １以上の糖転移酵素と糖ヌクレオチドを用いて、糖ヌクレオチドの糖部分（Ａ）を糖受容体（Ｂ）に転移させて糖鎖（Ａｍ・・・Ａ１−Ｂ）（ただし、ｍは１以上の整数を示す）を調製し、最後に糖供与体としてシチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を用い、シアル酸転移酵素によりシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）を糖鎖（Ａｍ−・・・−Ａ１−Ｂ）に転移させ、目的とするシアル酸含有糖鎖（シアリル化Ａｍ−・・・−Ａ１−Ｂ）を合成する、上記［１］記載の製造法。
【００２７】
［３］ 糖供与体としてウリジン５’−二リン酸ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）、糖転移酵素としてガラクトース転移酵素を用いてガラクトースを糖受容のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に転移させてＮ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）を合成し、次いで、糖供与体としてシチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を用い、シアル酸転移酵素によりシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）をＮ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）転移させ、シアリルＮ−アセチルラクトサミン（ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）を合成する、上記［１］記載の製造法。
【００２８】
［４］Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）とシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を原料としてシチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を合成及び再生する、上記［２］又は［３］記載の製造法。
［５］Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）とウリジン５’−モノリン酸（ＵＭＰ）を原料としてシチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を合成及び再生する、上記［２］又は［３］記載の製造法。
【００２９】
［６］Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を原料としてシチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を合成及び再生する、上記［２］又は［３］記載の製造法。
［７］Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とウリジン５’−モノリン酸（ＵＭＰ）を原料としてシチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を合成及び再生する、上記［２］又は［３］記載の製造法。
【発明の効果】
【００３０】
本発明により、医薬品あるいは機能性素材となる複合糖質の用途開発、製造のための基材となる糖鎖、特にシアル酸含有糖鎖、具体的にはＳｉｌｙｌＬａｃＮＡｃの安価かつ効率的に製造することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明は、上述したように、複数の糖転移酵素を用いて、糖供与体としての糖ヌクレオチドの糖部分（Ａ１）を糖受容体（Ｂ）に転移させて糖鎖（Ａ１−Ｂ）を合成し、次いで糖供与体としての別の糖ヌクレオチドの糖部分（Ａ２）を得られた糖鎖（Ａ１−Ｂ）に転移させて新たな糖鎖（Ａ２−Ａ１−Ｂ）を合成し、このような反応を複数回繰り返して目的とする糖鎖（Ａｎ−・・・Ａ２−Ａ１−Ｂ）（ただし、ｎは整数を示す）を製造する方法において、（ａ）酵母菌体を併用する、（ｂ）糖ヌクレオチドをヌクレオチドと糖から系内で合成及び再生する、（ｃ）途中で精製処理を行わない、ことを特徴とする糖鎖の製造法に関するものである。
【００３２】
使用する糖転移酵素としては、目的とする糖鎖に応じ、公知の糖転移酵素の中から適宜選択して使用すればよい。そのような糖転移酵素としては、グルコース転移酵素、ガラクトース転移酵素、Ｎ−アセチルクルコサミン転移酵素、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、シアル酸転移酵素、フコース転移酵素、マンノース転移酵素、グルクロン酸転移酵素などを例示することができる。
【００３３】
このような糖転移酵素は、当該活性を有する限りどのような形態であってもよい。なお、酵素調製の簡便さと共に調製効率を高めるため、該酵素遺伝子をクローン化し、微生物菌体内で大量発現させ、該酵素の大量調製を行う、いわゆる遺伝子操作技術を用いた酵素生産が最も都合が良い。使用する酵素標品としては具体的には、微生物の菌体、該菌体の処理物または該処理物から得られる酵素調製物などを例示することができる。
【００３４】
微生物の菌体の調製は、当該微生物が生育可能な培地を用い、常法により培養後、遠心分離等で集菌する方法で行うことができる。具体的に、大腸菌（Escherichia coli）属する細菌を例に挙げ説明すれば、培地としてはブイヨン培地、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％食塩）または２×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イーストエキストラクト、０．５％食塩）などを使用することができ、当該培地に種菌を接種後、２０〜５０℃で５〜５０時間程度必要により撹拌しながら培養し、得られた培養液を遠心分離して微生物菌体を集菌することにより糖転移酵素活性を有する微生物菌体を調製することができる。
【００３５】
微生物の菌体処理物としては、上記微生物菌体を機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法に従って処理して得られる菌体の破壊物または菌体の細胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示することができる。
【００３６】
酵素調製物としては、上記菌体処理物から当該酵素活性を有する画分を通常の酵素の精製手段（塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理など）を施して得られる粗酵素または精製酵素を例示することができる。
【００３７】
糖供与体としての糖ヌクレオチドは、糖ヌクレオチドそのものを反応系に添加するのではなく、酵母菌体や合成酵素を用いてヌクレオチドと糖から系内で合成及び再生する。
使用するヌクレオチド（ＮＭＰ，ＮＤＰ，ＮＴＰ）は、糖ヌクレオチドに応じて市販の製品を使用することができる。具体的には、ウリジン５’−モノリン酸、シチジン５’−モノリン酸、グアノシン５’−モノリン酸などを例示することができ、使用濃度としては１〜２００ｍＭ、好ましくは１０〜５０ｍＭの範囲から適宜設定できる。
また、糖も糖ヌクレオチドに応じて対応する市販の製品が使用できる。具体的には、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、マンノースなど例示することでき、使用濃度としては、１〜２００ｍＭ、好ましくは２０〜１００ｍＭの範囲から適宜設定できる。
【００３８】
添加する酵母菌体としては、市販のパン酵母あるいはワイン酵母などを使用することができる。このような酵母菌体は、生酵母、乾燥酵母いずれであってもかまわないが、反応収率の点からは乾燥酵母を用いるのが好ましい。添加量は１〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは２〜５％の範囲から適宜設定できる。
【００３９】
上記酵母菌体によりヌクレオチドと糖をから目的とする糖ヌクレオチドを合成できない場合には、合成に必要な公知の酵素を反応系に添加する。そのような酵素としては、ガラクトキナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼ等のキナーゼ類、ヘキソース１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ等のトランスフェラーゼ類、ＵＤＰグルコースピロホスホリラーゼ、ＧＤＰマンノースピロホスホリラーゼ等の糖ヌクレオチドピロホスホリラーゼ類、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ（合成酵素）、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｐ２−エピメラーゼなどのエピメラ−ゼ類、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼなどを例示することができ、目的とする糖鎖に必要な糖ヌクレオチドの合成に必須な各種酵素を前記転移酵素と同様に調製して使用すればよい。
【００４０】
糖受容体としては、目的とする糖鎖に応じて、単糖、オリゴ糖、およびそれらを直接又はスペーサーを介して担体に結合させた担持物を使用することができる。
【００４１】
単糖としては、ガラクトース、グルコース、マンノース、フルクトース、リボース、アラビノース、キシロース、キシリロース、リブロース、エリトロース、トレオース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、タガトース、ソルボース、プシコース、Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトヘプトース、Ｄ−グリセロ−グルコヘプトース、ＤＬ−グリセロ−Ｄ−マンノヘプトース、アロヘプツロース、アルトヘプツロース、タロヘプツロース、マンノヘプツロース、オクツロース、ノヌロース、Ｄ−グリセロ−Ｌ−ガラクトオクツロース、Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノオクツロース、ノムロース、フコース、ラムノース、アロメチロース、キノボース、アンチアロース、タロメチロース、ジキタロース、ジギドキソース、シマロース、チベロース、アベロース、パラトース、コリトース、アスカリロース、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、イズロン酸、グルロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、ノイラミン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−アセチル−Ｏ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコイルノイラミン酸、ムラミン酸、並びにその誘導体が挙げられる。
【００４２】
オリゴ糖としては、例えばマルトース、セロビオース、ラクトース、キシロビオース、イソマルトース、ケンチオビオース、メリビオース、プランテオビオース、ルチノース、プリメベロース、ビシアノース、ニゲロース、ラミナリビオース、ツラノース、コージビオース、ソホロース、スクロース、トレハロース、キトビース、ヒアロビオウロン酸、コンドロシン、セロビオウロン酸、ラフィノース、ゲンチアノース、メレジトース、ブランテオース、ケストース、マルトトリオース、パノース、イソマルトトリオース、スタキオース、ベルバスコース、シクロデキストリン、デンプン、セルロース、キチン、キトサン、乳汁オリゴ糖（例えばフコシルラクトース、シアリルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−フコペンタオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオースなど）、ヒアルロン酸、コンドロイチン、デルマタンなどのグリコサミノグリカン、ＡＢＯ型血液型糖鎖、各種Ｎ−結合型糖鎖、各種ムチン（Ｏ−結合）型糖鎖、スフィンゴ糖脂質、グリセロ糖脂質などの糖脂質糖鎖、並びに以上の誘導体などが挙げられる。
【００４３】
担体としては、例えば、タンパク質、脂質、核酸などの生体試料、金、白金などの金属微粒子、鉄、酸化鉄などの磁性金属微粒子、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、アガロース、デキストランなどの高分子ポリマーなどが挙げられる。これらの担体と糖鎖とのスペーサーとしては、例えば（ポリ）エチレングリコール、種々のアルキル鎖（例えば、炭素数１〜２０のアルキル）などが挙げられる。
【００４４】
上記ヌクレオチド、糖、酵母菌体、糖受容体以外に、好ましくは無機リン酸とエネルギー源を反応系に添加する。使用する無機リン酸としては、リン酸カリウムなどをそのまま使用することもできるが、リン酸緩衝液の形態で使用するのが好ましい。使用濃度は、たとえば１〜５００ｍＭ、好ましくは５０〜２００ｍＭの範囲から適宜設定することができる。また、リン酸緩衝液のｐＨも６．０〜８．０の範囲から適宜設定すればよい。また、エネルギー源としては、グルコース、フラクトースなどの糖類、酢酸、クエン酸などの有機酸を使用することができる。
【００４５】
糖鎖の合成反応は、転移酵素毎に、リン酸緩衝液などの緩衝液中、５〜３５℃以下、好ましくは１０〜３０℃で１〜４０時間程度、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。なお、各転移反応間で単離精製処理を行う必要はない。
【００４６】
ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃを例に挙げ、本発明を具体的に説明すると、ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの製造の第１段階のＮ−アセチルラクトサミンの合成には、リン酸緩衝液中に酵母、ウリジン５’−モノリン酸（ＵＭＰ）、ガラクトース、ガラクトース転移の基質（受容体）となるＧｌｃＮＡｃ、エネルギー源としてグルコースなどの糖類、ウリジン５’−ジリン酸（ＵＤＰ）−グルコースからのＵＤＰ−ガラクトース合成に関与する酵素（ガラクトキナーゼ及びヘキソース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ），さらにβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを添加し、５〜３５℃以下、好ましくは１０〜３０℃で１〜４０時間程度、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。
【００４７】
次ぎに、第２段階として、Ｎ−アセチルラクトサミン生成後、これを単離精製することなく、当該合成液にＣＭＰ、ＮｅｕＡｃ、シアリルトランスフェラーゼを添加し、エネルギー源として糖類をさらに添加し、５〜３５℃以下、好ましくは１０〜３０℃で１〜４０時間程度、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。なお、３’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ合成の場合にはα２，３−シアリルトランスフェラーゼ、６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃを合成する場合には、α２，６−シアリルトランスフェラーゼを用いれば良い。
【００４８】
第２段階のシアル酸転移反応を行う際、ＣＭＰ添加の代わりに、ＣＴＰ合成酵素とグルタミンなどアミノ基の供与体を添加することにより合成反応液中に生成しているＵＴＰをＣＴＰに変換させること（国際公開ＷＯ９９／４９０７３）でＣＭＰ−ＮｅｕＡｃのサイクル合成を可能ならしめシアル酸転移反応を実施することもできる。
【００４９】
さらに、第２段階のＮｅｕＡｃ添加の代わりに公知のＧｌｃＮＡｃからのＮｅｕＡｃ変換活性を有する組換え大腸菌（国際公開ＷＯ２００４／００９８３０）などＮｅｕＡｃ合成系を添加して残存するＧｌｃＮＡｃをＮｅｕＡｃへ変換させることで、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃのサイクル合成を可能ならしめシアル酸転移反応を実施することも可能である。
【００５０】
こうして合成して得られたＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ等の糖鎖は、通常のオリゴ糖の精製法（ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、塩析など）を用いて単離精製することができる。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。なお、実施例において、反応液中のオリゴ糖の定量はＤＩＯＮＥＸ法により行った。すなわち、分離には日本ダイオネクス社製のＣａｒｂｏＰａｃＰＡ１カラムを用い、溶出液として０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液および０．１Ｍ水酸化ナトリウム＋０．５Ｍ酢酸ナトリウム水溶液を用いた。
【００５２】
本実施例で使用した糖転移酵素（β１，４−ガラクトース転移酵素及びα２，３−シアル酸転移酵素）及びＵＤＰ−Ｇａｌ合成に使用した大腸菌酵素（ガラクトキナーゼ及びヘキソース１―リン酸ウリジルトランスフェラーゼ）、並びに大腸菌ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素の調製及び活性の測定は、公知の方法（特開２００２−３３５９８８）に従って実施した。また、大腸菌ＣＴＰ合成酵素は、公知の方法（国際公開ＷＯ９９／４９０７３）に従って調製し、活性を測定した。
【００５３】
実施例１：３’-ＳｉｌａｙｌＬＡｃＮＡｃの合成（１）
（ＮｅｕＡｃとＣＭＰからのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの再生利用）
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭ ＵＭＰ、５０ｍＭガラクトース、１００ｍＭ ＧｌｃＮＡｃ、４００ｍＭグルコースを含む溶液に、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素液（０．１ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）、ガラクトキナーゼ活性（７．５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）及びヘキソース１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素液（３．２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）および乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業）３．０％（ｗ／ｖ）を添加し、２５℃で撹拌しつつ反応を行った。反応開始１８時間後にＮ−アセチルラクトサミンは、３０．３ｍＭ生成していた。
【００５４】
次に、このＮ−アセチルラクトサミン合成液に５０ｍＭ ＮｅｕＡｃ、３０ｍＭ ＣＭＰ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素液（１．５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）及びα２，３−シアリルトランスフェラーゼ酵素液（０．４ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）を添加し、２５℃で攪拌を続けた。また、反応１８、２８、４０時間後にグルコースを２００ｍＭ添加した。その結果、反応開始４８時間後に２５．３ｍＭ（１７．１ｇ／Ｌ）の３’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの生成が認められた。
【００５５】
実施例２：３’-ＳｉｌａｙｌＬＡｃＮＡｃの合成（２）
（ＮｅｕＡｃとＵＭＰからのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの再生利用）
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭ ＵＭＰ、５０ｍＭガラクトース、１００ｍＭ ＧｌｃＮＡｃ、４００ｍＭグルコースを含む溶液に、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素液（０．１ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）、ガラクトキナーゼ（７．５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）及びヘキソース１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（３．２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）および乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業）３．０％を添加し、２５℃で撹拌しつつ反応を行った。
【００５６】
反応開始１８時間後（Ｎ−アセチルラクトサミンは、２９．９ｍＭ生成）に、５０ｍＭ ＮｅｕＡｃ、３０ｍＭグルタミン、大腸菌ＣＴＰ合成酵素液（１．５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素液（１．５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）及びα２，３−シアリルトランスフェラーゼ酵素液（０．４ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）を添加し、２５℃で撹拌を継続した。また、反応１８、２６、４０時間後にグルコースを２００ｍＭ添加した。その結果、反応開始４６時間後に３８．０ｍＭ（２５．７ｇ／Ｌ）の３’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの生成が確認された。
【００５７】
実施例３：３’-ＳｉｌａｙｌＬＡｃＮＡｃの合成（３）
（ＧｌｃＮＡｃとＣＭＰからのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの再生利用）
Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｐ２−エピメラーゼ、及びＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＴｒｃ−ＮＥＮＢ（国際公開番号ＷＯ２００４／００９８３０）を用いて大腸菌ＤＨ１株（ＡＴＣＣ３３８４９）を常法（「Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition」(Sambrookら編、Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)）に従い形質転換し、アンピシリン耐性の形質転換体ＤＨ１／ｐＴｒｃ−ＮＥＮＢを取得した。得られた形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ｘＹＴ培地５００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。菌体数が４ｘ１０８個／ｍｌに達した時点で、培養液に最終濃度０．２ｍＭになるようにＩＰＴＧ（isopropylβ-D-thiogalactopyranoside）を添加し、さらに３７℃で１８時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ、１０分）により菌体を回収した。
【００５８】
２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭ ＵＭＰ、５０ｍＭガラクトース、１００ｍＭ ＧｌｃＮＡｃ、２００ｍＭフルクトースを含む溶液に、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素液（０．１ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）、ガラクトキナーゼ（２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）及びヘキソース１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）および乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業）４．０％（ｗ／ｖ）を添加し、２８℃で撹拌しつつ反応を行った。
【００５９】
反応開始８時間後（Ｎ−アセチルラクトサミンは３１．３ｍＭ生成）に、１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、２０ｍＭ ＣＭＰ、０．５％キシレン、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素液（１．７ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）、α２，３−シアリルトランスフェラーゼ（０．１ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）及び前述の回収した大腸菌ＤＨ１／ｐＴｒｃ−ＮＥＮＢ菌体（反応液の５倍量の培養液分の菌体）を添加した。また、反応開始８、２８、４０時間後にグルコースを２００ｍＭ添加した。反応５０時間後に１３．４ｍＭ（９．０ｇ／Ｌ）の３’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの生成が確認された。
【００６０】
実施例４：６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの合成
（１）フォトバクテリウム・ダムセラ由来β-ガラクトシドα２，６-シアリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子のクローニング
フォトバクテリウム・ダムセラ ｓｕｂｓｐ. ｄａｍｓｅｌａ (ＮＢＲＣ Ｎｏ.１５６３３叉はＡＴＣＣ ３３５３９)からの染色体ＤＮＡの調製は、該菌の凍結乾燥菌体を１００μLの５０ｍM トリス塩酸緩衝液(ｐＨ ８．０), ２０ｍＭ ＥＤＴＡに懸濁したのちに１０μLの１０％ＳＤＳ溶液を添加して室温で５分静置により溶菌させ、この溶菌液からフェノール抽出ならびにエタノール沈殿により得られた沈殿を２０μLのＴＥバッファー(１０ｍM トリス塩酸緩衝液(ｐＨ ８．０), １ｍＭ ＥＤＴＡ)に溶解することにより行った。
【００６１】
以上のように調製したＤＮＡを鋳型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡ（A）および(B)を常法に従って合成し、ＰＣＲ法によりフォトバクテリウム・ダムセラのβ-ガラクトシドα２，６-シアリルトランスフェラーゼをコードするｂｓｔ遺伝子（Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ ｔｏ ＮＣＢＩ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ０１２２８５）を含む領域のＤＮＡを増幅した。
【００６２】
プライマー（Ａ）：５’-GTGTGGCATAGTACGCACTT-３’
プライマー（Ｂ）：５’-AGGTCGCCACATTTACGATG-３’
【００６３】
ＰＣＲによるｂｓｔ遺伝子を含む領域のＤＮＡ増幅は、反応液１００μｌ（１０ｘＰｙｒｏｂｅｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ(タカラバイオ社) １０μｌ、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、鋳型ＤＮＡ ０．１ｎｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）および（Ｂ）各々０．２μＭ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ(タカラバイオ社) ２．５ｕｎｉｔｓ）をＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（タカラバイオ社）を用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（４７℃、１分）、伸長反応（７２℃、２分）のステップを３６回繰り返すことにより行った。
【００６４】
増幅後のＤＮＡを、文献（Molecular Cloning、(Maniatisら編、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、New YorK(1982)）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、２．３ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを鋳型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡ（C）および（D）を使って、ＰＣＲ法によりフォトバクテリウム・ダムセラのｂｓｔ遺伝子を増幅した。
【００６５】
プライマー（C）：５’-CTTGGATCCTGTAATAGTGACAATACCAGC-３’
プライマー（D）：５’-TAAGTCGACTTAAGCCCAGAACAGAACATC-３’
【００６６】
ＰＣＲによるｂｓｔ遺伝子の増幅は、反応液１００μｌ（１０ｘＰｙｒｏｂｅｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ(タカラバイオ社) １０μｌ、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、鋳型ＤＮＡ ０．１ｎｇ、プライマーＤＮＡ（Ｃ）および（Ｄ）各々０．２μＭ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ(タカラバイオ社) ２．５ｕｎｉｔｓ）をＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ(タカラバイオ社)を用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５２℃、１分）、伸長反応（７２℃、２分）のステップを３０回繰り返すことにより行った。
【００６７】
遺伝子増幅後、ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、１．５ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで切断し、同じく制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ１２-６（特開２００１−１０３９７３）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９菌（タカラバイオ株式会社より入手）を形質転換し、得られたカナマイシン耐性形質転換体よりプラスミドｐ１２-６-ｐｓｔΔＮを単離した。
【００６８】
（２）α２,６-シアリルトランスフェラーゼ酵素液の調製
プラスミドｐ１２-６-ｐｓｔΔＮを保持する大腸菌ＪＭ１０９株を、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する培地（２％ペプトン、１％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、０．１５％グルコース）１００ｍｌに植菌し、３０℃で振とう培養した。５時間後培養液に最終濃度０．２ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに１８℃で２０時間振盪培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、２．５ｍｌの緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５））に懸濁した。ブランソン社製超音波破砕機（モデル４５０ソニファー）を用いて氷冷下で超音波処理を行い（５０Ｗ，２分，３回）、４℃、１２，０００ｘｇの条件下で２０分間遠心分離し、可溶性画分（上清）を回収した。
【００６９】
このように得られた上清画分を酵素標品とし、酵素標品におけるα２，６シアリルトランスフェラーゼ活性を測定した。その結果、０．４４ ｕｎｉｔｓ／ｍｉｎ／ｍｌ 酵素液であった。
【００７０】
なお、α２，６シアリルトランスフェラーゼ活性は、以下に示す方法でＣＭＰ−ＮｅｕＡｃとＮ−アセチルラクトサミンから６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃへの転換活性を測定、算出したものである。すなわち、２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ５．５）、５０ｍＭ ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ、１０ｍＭ Ｎ−アセチルラクトサミンにα２，６シアリルトランスフェラーゼ酵素標品を添加して３７℃で１０分反応させる。反応液を３分間の煮沸にて反応を停止し、ＨＰＡＥＣ−ＣＤ（High-perfoemance anione-exchange chromatography coupled with conductimetric detection）による糖分析を行う。分離にはダイオネクス社製のＣａｒｂｏｐａｃ ＰＡ１カラム（４×２５０ｍｍ）を用い、溶出液として（Ａ）０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液と（Ｂ）０．１Ｍ ＮａＯＨ，０．５Ｍ 酢酸ナトリウム溶液の濃度勾配（０−１０分：Ｂ＝０％、１０−２５分：Ｂ＝４５％、２５−３０分：Ｂ＝１００％）を用いる。ＨＰＡＥＣ−ＣＤ分析結果から反応液中のＬａｃＮＡｃ消費量および６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの生成量を算出し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＮｅｕＡｃをＮ−アセチルラクトサミンに転移させる活性を１ｕｎｉｔとする。
【００７１】
（３）６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの合成
２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ ＵＭＰ、５０ｍＭガラクトース、５０ｍＭ ＧｌｃＮＡｃ、２００ｍＭフルクトースを含む液にβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素液（０．１８ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）、ガラクトキナーゼ活性（４５．６ｕｎｉｔｓ/ｍｌ反応液）及びヘキソース１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性（２６．５ｕｎｉｔｓ/ｍｌ反応液）を有する酵素液、および乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業）３．０％（ｗ/ｖ）を添加し、２８℃で攪拌しつつ反応を行った。反応開始７時間後にＮ−アセチルラクトサミンは、２０．２ｍＭ生成していた。
【００７２】
次に、このＮ−アセチルラクトサミン合成液に５０ｍＭ ＮｅｕＡｃ、１０ｍＭ ＣＭＰ、ＣＭＰ-ＮｅｕＡｃ合成酵素液（５．８ｕｎｉｔｓ/ｍｌ反応液）及びα２，６−シアリルトランスフェラーゼ酵素液（０．０４ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）を添加し、２８℃で攪拌を続けた。また、反応開始７、２２、３０時間後にグルコースを２００ｍM添加した。その結果、反応開始４６時間後に３５．６ｍM（２４．１ｇ/Ｌ）の６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの生成が認められた。
なお、フォトバクテリウム・ダムセラ ｓｕｂｓｐ. ｄａｍｓｅｌａは独立行政法人製品評価技術機構より入手可能である。
【００７３】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖、特にシアル酸含有糖鎖の製造法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、糖鎖についての研究が急速に進み、その機能が明らかになるにつれ、生理活性を有する糖鎖あるいは複合糖質の医薬品または機能性素材としての用途開発が注目を集めている。特に細胞表面のシアル酸を含有する糖鎖（シアル酸含有糖鎖）は、多くの微生物、ウイルス、毒素等の受容体として機能することが明らかであり、特定のシアル酸含有糖鎖（オリゴ糖）及びその類似体は、それらの感染や結合を阻止するのに有用と考えられている。
【０００３】
シアル酸含有糖鎖の１つであるシアリルＮ−アセチルラクトサミン（ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ、「ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ」）は、リンパ組織や炎症部位への白血球の集積に関与する接着分子・セレクチンのリガンドとして機能することが知られ、またセレクチンとの相互作用を介して癌転移に関与すると言われているシアリルルイスＸ（ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃ）やシアリルルイスＡ（ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮＡｃ）の前駆体となる糖鎖である。
【０００４】
さらに、ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃは、インフルエンザウイルス感染時の宿主受容体である複合糖質の糖鎖構造でもあり、ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃをポリグルタミン酸に付与した所謂人工ムチンは、極めて高いインフルエンザウイルス吸着活性を示すことが報告されている。
【０００５】
このように、ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃは、機能糖鎖のコア構造であり、複合糖質の医薬品あるいは機能素材としての開発、商品化の重要な基材となる糖鎖（オリゴ糖）である。
【０００６】
ところで、現在市販されている糖鎖はごく限られた種類のものしかなく、しかも極めて高価である。たとえば、ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃは、試薬レベルでしか製造できず、その大量製造法が確立されていない。
【０００７】
従来、糖鎖の製造は、天然物からの抽出法、化学合成法あるいは酵素合成法、さらにはそれらの併用により行われていたが、その中でも酵素合成法が大量製造に適した方法であると考えられている。すなわち、（１）酵素合成法が化学合成法にみられる保護、脱保護といった煩雑な手順を必要とせず、速やかに目的の糖鎖を合成できる点、（２）酵素の基質特異性により、きわめて構造特異性の高い糖鎖を合成できる点などが他の方法より有利と考えられるためである。さらに、近年のＤＮＡ組換え技術の発達により種々の合成酵素が安価にしかも大量に生産できるようになりつつあることが、酵素合成法の優位性をさらに押し上げる結果となっている。
【０００８】
酵素合成法により糖鎖を合成する方法としては、糖鎖の加水分解酵素の逆反応を利用する方法および糖転移酵素を利用する方法の２通りの方法が考えられている。前者の方法は、基質として単価の安い単糖を用いることができるという利点はあるものの、反応自体は分解反応の逆反応を利用するものであり、合成収率や複雑な構造を持つ糖鎖合成への応用といった点では必ずしも最良の方法とは考えられていない。
【０００９】
一方、後者の糖転移酵素を用いる合成法は、合成収率や複雑な構造を持つ糖鎖合成への応用といった点で前者の方法よりも有利であると考えられており、また、近年のＤＮＡ組換え技術の進歩により各種糖転移酵素の量産化も該技術の実現化への後押しとなっている。しかしながら、糖転移酵素を利用した合成法で用いる糖供与体である糖ヌクレオチドは、一部のものを除き依然として高価で、量的にも試薬レベルのわずかな供給量でしか提供し得ないと言う問題点も指摘されていた。
【００１０】
たとえば、糖ヌクレオチドを糖供与体とし、糖転移酵素によりＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃを合成する場合、第１段階として糖受容体としてＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、糖供与体としてウリジン５’−二リン酸ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）、糖転移酵素としてβ１，４−ガラクトース転移酵素を用いてガラクトースを転移させてＮ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）を合成する。
【００１１】
次に、Ｎ−アセチルラクトサミンを糖受容体とし、シチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を糖供与体とし、シアル酸転移酵素によりシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸、以後「ＮｅｕＡｃ」とも略記）を転移させることで、目的とするＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃを合成する。
【００１２】
糖転移酵素反応で生成・蓄積するヌクレオチドは、一般には更なる糖転移反応を阻害する。例えば、シアル酸転移反応によりシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）が生成するが、ＣＭＰはシアル酸転移酵素活性を阻害するため、ＣＭＰを反応系より除去しないとシアル酸転移反応の効率は低下する。そのため、通常、ホスファターゼなどの添加によりＣＭＰを分解するなどの操作も必要となり、このような理由からも、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃなどの高価な糖ヌクレオチドを直接原料としてＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃを合成することは、実用的な方法とは到底なり得なかった。
【００１３】
このため、糖ヌクレオチドのサイクル合成と糖転移反応の組み合せによる糖鎖の合成法が考案されている。糖ヌクレオチドのサイクル合成は、糖転移反応により生成するヌクレオシド５’−ジリン酸（ＮＤＰ）あるいはヌクレオシド５’−モノリン酸（ＮＭＰ）をリン酸化して糖転移酵素活性を阻害するＮＤＰあるいはＮＭＰの蓄積を排除するとともに、糖ヌクレオチド合成の基質となるヌクレオシド５’−トリリン酸（ＮＴＰ）まで再生し、酵素的に糖ヌクレオチドを再生させるというものである。
【００１４】
ＮＭＰもしくはＮＤＰからのＮＴＰの再生には、（１）MyokinaseやPyruvate kinaseなどの酵素、及びアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）あるいはホスホエノールピルビン酸などのリン酸供与体を用いてＮＭＰもしくはＮＤＰを酵素的にリン酸化する方法（Pure & Appl. Chem., 65, 803-808 (1993), J. Am. Chem., 113, 6300-6302 (1991), U.S. Patent 5,728,554、Nature Biotech., 16, 769-772 (1998)）、（２）微生物生菌体（Corynebacterium ammnoniagenusや大腸菌）を用いてＮＭＰもしくはＮＤＰをリン酸化する方法（Nature Biotech. 16, 847-850 (1998), Carbohydorate Res. 316, 179-183 (1999), Appl. Microbiol. Biotechnol., 53: 257-261 (2000), Org. Biomol. Chem., 1, 3058 (2003), Appl. Environ. Microbiol., 69, 2110 (2003)）、及び（３）酵母菌体を用いる方法（特開２００２−３３５９８８）が報告されている。
【００１５】
しかしながら、上記（１）の方法は、リン酸供与体となるＡＴＰあるいはホスホエノールピルビン酸が高価であるという問題がある。また、ＮＴＰを基質とした糖ヌクレオチド合成の際にピロリン酸が生成するが、蓄積したピロリン酸は糖ヌクレオチド合成を抑制するため、ピロリン酸分解酵素を添加して無機リン酸に分解する必要がある。さらに、無機リン酸は反応の進行と共に蓄積するが、糖転移酵素反応に必要な金属イオン（マグネシウムあるいはマンガンなど）と不溶性沈殿を形成するため、酵素反応の進行が抑制される。そのため、反応途中に金属イオンを再添加するなど煩雑な工程とならざるを得ない問題もあり、実用化に適していない。
【００１６】
また、上記（２）の方法においては、ＮＭＰもしくはＮＤＰのリン酸化反応に膨大な微生物菌体量が必要であるため、その調製のための設備及びコスト面での問題がある。また、Corynebacterium菌や大腸菌自身のピロリン酸分解活性は低く、pyrophophatase添加あるいは該酵素生産菌の添加も必要となる問題がある。
【００１７】
さらに、上記（１）〜（３）の方法では、１種類の糖ヌクレオチドをサイクル合成させて糖転移反応を行わせた報告のみで、複数の糖ヌクレオチドをサイクル合成させて、複数の異なる糖転移反応を起こさせ、オリゴ糖の伸長に成功した例は報告されていない。
【００１８】
従って、ＵＤＰ−Ｇａｌのサイクル合成に伴うガラクトース転移反応のみで合成できるＮ−アセチルラクトサミンの大量製造は可能である（Carbohydr. Res., 316, 179 (1999)、特開２００２−３３５９８８）が、２段階の異なる糖転移反応を必要とするＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃを合成できるかは不明であり、効率的な製造法は確立されていない。
【００１９】
一方、シアル酸含有糖鎖製造上の問題として、シアル酸転移反応の際使用するシアル酸の供与体であるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃが高価な原料であることは前述したが、糖部分であるＮｅｕＡｃ自身も高価であり、糖ヌクレオチドのサイクル合成を利用したとしてもＮｅｕＡｃの直接使用は製造コストを押し上げる要因となる。そのため、安価な原料であるＧｌｃＮＡｃを原料とするＮｅｕＡｃの製造法（特開平５−２１１８８４、特開平２００１−１３６９８２）、及びＧｌｃＮＡｃとＣＭＰを原料とするＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造法（国際公開ＷＯ２００１／００９８３０）が開発されているが、これらの系を利用したＣＮＰ−ＮｅｕＡｃのサイクル合成をオリゴ糖へのシアル酸転移反応に適用できるかどうかは不明であり、そのことに関する報告もない。
【００２０】
【特許文献１】特開２００２−３３５９８８
【特許文献２】特開平５−２１１８８４
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００１／００９８３０
【特許文献４】U.S.Patent 5,728,554
【特許文献５】特開平２００１−１３６９８２
【非特許文献１】Pure & Appl. Chem., 65, 803-808 (1993)
【非特許文献２】J. Am. Chem., 113, 6300-6302 (1991)
【非特許文献３】Nature Biotech., 16, 769-772 (1998)
【非特許文献４】Nature Biotech. 16, 847-850 (1998)
【非特許文献５】Carbohydorate Res. 316, 179-183 (1999)
【非特許文献６】Appl. Microbiol. Biotechnol., 53: 257-261 (2000)
【非特許文献７】Org. Biomol. Chem., 1, 3058 (2003)
【非特許文献８】Appl. Environ. Microbiol., 69, 2110 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
このように、ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃを糖転移酵素を用いて製造する場合、現状ではＧｌｃＮＡｃへのガラクト−ス転移反応を行わせ、Ｎ−アセチルラクトサミンを生成させ、合成反応液からＮ−アセチルラクトサミンを精製し、次にシアル酸転移反応によりシアル酸（ＮｅｕＡｃ）を付与させてＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃを合成し、合成反応液から目的物質を精製するという２段階の煩雑な製造工程が必要であり、必ずしも実用的な製法とは言えない。
【００２２】
また、原料として使用するシアル酸（ＮｅｕＡｃ）は高価であり、ＮｅｕＡｃの直接使用も工業化においては大きな問題となる。
【００２３】
従って、ＵＤＰ−ＧａｌとＣＭＰ−ＮｅｕＡｃのサイクル合成と糖転移酵素を組み合わせたＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの実用的な製造法、より効率的には、糖原料としてＮｅｕＡｃを使用せず、代わりにＧｌｃＮＡｃを原料とするＮｅｕＡｃ合成を伴うＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの製造法を提供することができれば、工業的に極めて有利な方法となり得る。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明者らは上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、（１）酵母菌体は、長時間に渡り高いヌクレオチドのリン酸化活性及びピロリン酸分解活性を保持し、酵母菌体を利用することで連続的な複数の糖ヌクレオチドのサイクル合成が可能であり、連続的な複数の糖転移反応をワンポットで実行できること、（２）このような系は３糖以上のすべての糖鎖合成に利用できること、（３）さらに、ＧｌｃＮＡｃを原料とするＮｅｕＡｃ合成系を上記糖鎖合成系に組み合わせることで、高価なＮｅｕＡｃを使用せずにシアル酸含有糖鎖が製造可能であることを見出し、本発明を完成させた。したがって、本発明は、以下の通りのものである。
【００２５】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］ 複数の糖転移酵素を用いて、糖供与体としての糖ヌクレオチドの糖部分（Ａ１）を糖受容体（Ｂ）に転移させて糖鎖（Ａ１−Ｂ）を合成し、次いで糖供与体としての別の糖ヌクレオチドの糖部分（Ａ２）を得られた糖鎖（Ａ１−Ｂ）に転移させて新たな糖鎖（Ａ２−Ａ１−Ｂ）を合成し、このような反応を複数回繰り返して目的とする糖鎖（Ａｎ−・・・Ａ２−Ａ１−Ｂ）（ただし、ｎは整数を示す）を製造する方法において、（ａ）酵母菌体を併用する、（ｂ）糖ヌクレオチドをヌクレオチドと糖から系内で合成及び再生する、（ｃ）途中で精製処理を行わない、ことを特徴とする糖鎖の製造法。
【００２６】
［２］ １以上の糖転移酵素と糖ヌクレオチドを用いて、糖ヌクレオチドの糖部分（Ａ）を糖受容体（Ｂ）に転移させて糖鎖（Ａｍ・・・Ａ１−Ｂ）（ただし、ｍは１以上の整数を示す）を調製し、最後に糖供与体としてシチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を用い、シアル酸転移酵素によりシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）を糖鎖（Ａｍ−・・・−Ａ１−Ｂ）に転移させ、目的とするシアル酸含有糖鎖（シアリル化Ａｍ−・・・−Ａ１−Ｂ）を合成する、上記［１］記載の製造法。
【００２７】
［３］ 糖供与体としてウリジン５’−二リン酸ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）、糖転移酵素としてガラクトース転移酵素を用いてガラクトースを糖受容のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に転移させてＮ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）を合成し、次いで、糖供与体としてシチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を用い、シアル酸転移酵素によりシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）をＮ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）転移させ、シアリルＮ−アセチルラクトサミン（ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）を合成する、上記［１］記載の製造法。
【００２８】
［４］Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）とシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を原料としてシチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を合成及び再生する、上記［２］又は［３］記載の製造法。
［５］Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）とウリジン５’−モノリン酸（ＵＭＰ）を原料としてシチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を合成及び再生する、上記［２］又は［３］記載の製造法。
【００２９】
［６］Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を原料としてシチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を合成及び再生する、上記［２］又は［３］記載の製造法。
［７］Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とウリジン５’−モノリン酸（ＵＭＰ）を原料としてシチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を合成及び再生する、上記［２］又は［３］記載の製造法。
【発明の効果】
【００３０】
本発明により、医薬品あるいは機能性素材となる複合糖質の用途開発、製造のための基材となる糖鎖、特にシアル酸含有糖鎖、具体的にはＳｉｌｙｌＬａｃＮＡｃの安価かつ効率的に製造することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明は、上述したように、複数の糖転移酵素を用いて、糖供与体としての糖ヌクレオチドの糖部分（Ａ１）を糖受容体（Ｂ）に転移させて糖鎖（Ａ１−Ｂ）を合成し、次いで糖供与体としての別の糖ヌクレオチドの糖部分（Ａ２）を得られた糖鎖（Ａ１−Ｂ）に転移させて新たな糖鎖（Ａ２−Ａ１−Ｂ）を合成し、このような反応を複数回繰り返して目的とする糖鎖（Ａｎ−・・・Ａ２−Ａ１−Ｂ）（ただし、ｎは整数を示す）を製造する方法において、（ａ）酵母菌体を併用する、（ｂ）糖ヌクレオチドをヌクレオチドと糖から系内で合成及び再生する、（ｃ）途中で精製処理を行わない、ことを特徴とする糖鎖の製造法に関するものである。
【００３２】
使用する糖転移酵素としては、目的とする糖鎖に応じ、公知の糖転移酵素の中から適宜選択して使用すればよい。そのような糖転移酵素としては、グルコース転移酵素、ガラクトース転移酵素、Ｎ−アセチルクルコサミン転移酵素、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、シアル酸転移酵素、フコース転移酵素、マンノース転移酵素、グルクロン酸転移酵素などを例示することができる。
【００３３】
このような糖転移酵素は、当該活性を有する限りどのような形態であってもよい。なお、酵素調製の簡便さと共に調製効率を高めるため、該酵素遺伝子をクローン化し、微生物菌体内で大量発現させ、該酵素の大量調製を行う、いわゆる遺伝子操作技術を用いた酵素生産が最も都合が良い。使用する酵素標品としては具体的には、微生物の菌体、該菌体の処理物または該処理物から得られる酵素調製物などを例示することができる。
【００３４】
微生物の菌体の調製は、当該微生物が生育可能な培地を用い、常法により培養後、遠心分離等で集菌する方法で行うことができる。具体的に、大腸菌（Escherichia coli）属する細菌を例に挙げ説明すれば、培地としてはブイヨン培地、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％食塩）または２×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イーストエキストラクト、０．５％食塩）などを使用することができ、当該培地に種菌を接種後、２０〜５０℃で５〜５０時間程度必要により撹拌しながら培養し、得られた培養液を遠心分離して微生物菌体を集菌することにより糖転移酵素活性を有する微生物菌体を調製することができる。
【００３５】
微生物の菌体処理物としては、上記微生物菌体を機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法に従って処理して得られる菌体の破壊物または菌体の細胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示することができる。
【００３６】
酵素調製物としては、上記菌体処理物から当該酵素活性を有する画分を通常の酵素の精製手段（塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理など）を施して得られる粗酵素または精製酵素を例示することができる。
【００３７】
糖供与体としての糖ヌクレオチドは、糖ヌクレオチドそのものを反応系に添加するのではなく、酵母菌体や合成酵素を用いてヌクレオチドと糖から系内で合成及び再生する。
使用するヌクレオチド（ＮＭＰ，ＮＤＰ，ＮＴＰ）は、糖ヌクレオチドに応じて市販の製品を使用することができる。具体的には、ウリジン５’−モノリン酸、シチジン５’−モノリン酸、グアノシン５’−モノリン酸などを例示することができ、使用濃度としては１〜２００ｍＭ、好ましくは１０〜５０ｍＭの範囲から適宜設定できる。
また、糖も糖ヌクレオチドに応じて対応する市販の製品が使用できる。具体的には、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、マンノースなど例示することでき、使用濃度としては、１〜２００ｍＭ、好ましくは２０〜１００ｍＭの範囲から適宜設定できる。
【００３８】
添加する酵母菌体としては、市販のパン酵母あるいはワイン酵母などを使用することができる。このような酵母菌体は、生酵母、乾燥酵母いずれであってもかまわないが、反応収率の点からは乾燥酵母を用いるのが好ましい。添加量は１〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは２〜５％の範囲から適宜設定できる。
【００３９】
上記酵母菌体によりヌクレオチドと糖をから目的とする糖ヌクレオチドを合成できない場合には、合成に必要な公知の酵素を反応系に添加する。そのような酵素としては、ガラクトキナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼ等のキナーゼ類、ヘキソース１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ等のトランスフェラーゼ類、ＵＤＰグルコースピロホスホリラーゼ、ＧＤＰマンノースピロホスホリラーゼ等の糖ヌクレオチドピロホスホリラーゼ類、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ（合成酵素）、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｐ２−エピメラーゼなどのエピメラ−ゼ類、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼなどを例示することができ、目的とする糖鎖に必要な糖ヌクレオチドの合成に必須な各種酵素を前記転移酵素と同様に調製して使用すればよい。
【００４０】
糖受容体としては、目的とする糖鎖に応じて、単糖、オリゴ糖、およびそれらを直接又はスペーサーを介して担体に結合させた担持物を使用することができる。
【００４１】
単糖としては、ガラクトース、グルコース、マンノース、フルクトース、リボース、アラビノース、キシロース、キシリロース、リブロース、エリトロース、トレオース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、タガトース、ソルボース、プシコース、Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトヘプトース、Ｄ−グリセロ−グルコヘプトース、ＤＬ−グリセロ−Ｄ−マンノヘプトース、アロヘプツロース、アルトヘプツロース、タロヘプツロース、マンノヘプツロース、オクツロース、ノヌロース、Ｄ−グリセロ−Ｌ−ガラクトオクツロース、Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノオクツロース、ノムロース、フコース、ラムノース、アロメチロース、キノボース、アンチアロース、タロメチロース、ジキタロース、ジギドキソース、シマロース、チベロース、アベロース、パラトース、コリトース、アスカリロース、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、イズロン酸、グルロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、ノイラミン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−アセチル−Ｏ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコイルノイラミン酸、ムラミン酸、並びにその誘導体が挙げられる。
【００４２】
オリゴ糖としては、例えばマルトース、セロビオース、ラクトース、キシロビオース、イソマルトース、ケンチオビオース、メリビオース、プランテオビオース、ルチノース、プリメベロース、ビシアノース、ニゲロース、ラミナリビオース、ツラノース、コージビオース、ソホロース、スクロース、トレハロース、キトビース、ヒアロビオウロン酸、コンドロシン、セロビオウロン酸、ラフィノース、ゲンチアノース、メレジトース、ブランテオース、ケストース、マルトトリオース、パノース、イソマルトトリオース、スタキオース、ベルバスコース、シクロデキストリン、デンプン、セルロース、キチン、キトサン、乳汁オリゴ糖（例えばフコシルラクトース、シアリルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−フコペンタオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオースなど）、ヒアルロン酸、コンドロイチン、デルマタンなどのグリコサミノグリカン、ＡＢＯ型血液型糖鎖、各種Ｎ−結合型糖鎖、各種ムチン（Ｏ−結合）型糖鎖、スフィンゴ糖脂質、グリセロ糖脂質などの糖脂質糖鎖、並びに以上の誘導体などが挙げられる。
【００４３】
担体としては、例えば、タンパク質、脂質、核酸などの生体試料、金、白金などの金属微粒子、鉄、酸化鉄などの磁性金属微粒子、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、アガロース、デキストランなどの高分子ポリマーなどが挙げられる。これらの担体と糖鎖とのスペーサーとしては、例えば（ポリ）エチレングリコール、種々のアルキル鎖（例えば、炭素数１〜２０のアルキル）などが挙げられる。
【００４４】
上記ヌクレオチド、糖、酵母菌体、糖受容体以外に、好ましくは無機リン酸とエネルギー源を反応系に添加する。使用する無機リン酸としては、リン酸カリウムなどをそのまま使用することもできるが、リン酸緩衝液の形態で使用するのが好ましい。使用濃度は、たとえば１〜５００ｍＭ、好ましくは５０〜２００ｍＭの範囲から適宜設定することができる。また、リン酸緩衝液のｐＨも６．０〜８．０の範囲から適宜設定すればよい。また、エネルギー源としては、グルコース、フラクトースなどの糖類、酢酸、クエン酸などの有機酸を使用することができる。
【００４５】
糖鎖の合成反応は、転移酵素毎に、リン酸緩衝液などの緩衝液中、５〜３５℃以下、好ましくは１０〜３０℃で１〜４０時間程度、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。なお、各転移反応間で単離精製処理を行う必要はない。
【００４６】
ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃを例に挙げ、本発明を具体的に説明すると、ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの製造の第１段階のＮ−アセチルラクトサミンの合成には、リン酸緩衝液中に酵母、ウリジン５’−モノリン酸（ＵＭＰ）、ガラクトース、ガラクトース転移の基質（受容体）となるＧｌｃＮＡｃ、エネルギー源としてグルコースなどの糖類、ウリジン５’−ジリン酸（ＵＤＰ）−グルコースからのＵＤＰ−ガラクトース合成に関与する酵素（ガラクトキナーゼ及びヘキソース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ），さらにβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを添加し、５〜３５℃以下、好ましくは１０〜３０℃で１〜４０時間程度、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。
【００４７】
次ぎに、第２段階として、Ｎ−アセチルラクトサミン生成後、これを単離精製することなく、当該合成液にＣＭＰ、ＮｅｕＡｃ、シアリルトランスフェラーゼを添加し、エネルギー源として糖類をさらに添加し、５〜３５℃以下、好ましくは１０〜３０℃で１〜４０時間程度、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。なお、３’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ合成の場合にはα２，３−シアリルトランスフェラーゼ、６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃを合成する場合には、α２，６−シアリルトランスフェラーゼを用いれば良い。
【００４８】
第２段階のシアル酸転移反応を行う際、ＣＭＰ添加の代わりに、ＣＴＰ合成酵素とグルタミンなどアミノ基の供与体を添加することにより合成反応液中に生成しているＵＴＰをＣＴＰに変換させること（国際公開ＷＯ９９／４９０７３）でＣＭＰ−ＮｅｕＡｃのサイクル合成を可能ならしめシアル酸転移反応を実施することもできる。
【００４９】
さらに、第２段階のＮｅｕＡｃ添加の代わりに公知のＧｌｃＮＡｃからのＮｅｕＡｃ変換活性を有する組換え大腸菌（国際公開ＷＯ２００４／００９８３０）などＮｅｕＡｃ合成系を添加して残存するＧｌｃＮＡｃをＮｅｕＡｃへ変換させることで、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃのサイクル合成を可能ならしめシアル酸転移反応を実施することも可能である。
【００５０】
こうして合成して得られたＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃ等の糖鎖は、通常のオリゴ糖の精製法（ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、塩析など）を用いて単離精製することができる。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。なお、実施例において、反応液中のオリゴ糖の定量はＤＩＯＮＥＸ法により行った。すなわち、分離には日本ダイオネクス社製のＣａｒｂｏＰａｃＰＡ１カラムを用い、溶出液として０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液および０．１Ｍ水酸化ナトリウム＋０．５Ｍ酢酸ナトリウム水溶液を用いた。
【００５２】
本実施例で使用した糖転移酵素（β１，４−ガラクトース転移酵素及びα２，３−シアル酸転移酵素）及びＵＤＰ−Ｇａｌ合成に使用した大腸菌酵素（ガラクトキナーゼ及びヘキソース１―リン酸ウリジルトランスフェラーゼ）、並びに大腸菌ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素の調製及び活性の測定は、公知の方法（特開２００２−３３５９８８）に従って実施した。また、大腸菌ＣＴＰ合成酵素は、公知の方法（国際公開ＷＯ９９／４９０７３）に従って調製し、活性を測定した。
【００５３】
実施例１：３’-ＳｉｌａｙｌＬＡｃＮＡｃの合成（１）
（ＮｅｕＡｃとＣＭＰからのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの再生利用）
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭ ＵＭＰ、５０ｍＭガラクトース、１００ｍＭ ＧｌｃＮＡｃ、４００ｍＭグルコースを含む溶液に、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素液（０．１ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）、ガラクトキナーゼ活性（７．５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）及びヘキソース１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素液（３．２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）および乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業）３．０％（ｗ／ｖ）を添加し、２５℃で撹拌しつつ反応を行った。反応開始１８時間後にＮ−アセチルラクトサミンは、３０．３ｍＭ生成していた。
【００５４】
次に、このＮ−アセチルラクトサミン合成液に５０ｍＭ ＮｅｕＡｃ、３０ｍＭ ＣＭＰ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素液（１．５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）及びα２，３−シアリルトランスフェラーゼ酵素液（０．４ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）を添加し、２５℃で攪拌を続けた。また、反応１８、２８、４０時間後にグルコースを２００ｍＭ添加した。その結果、反応開始４８時間後に２５．３ｍＭ（１７．１ｇ／Ｌ）の３’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの生成が認められた。
【００５５】
実施例２：３’-ＳｉｌａｙｌＬＡｃＮＡｃの合成（２）
（ＮｅｕＡｃとＵＭＰからのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの再生利用）
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭ ＵＭＰ、５０ｍＭガラクトース、１００ｍＭ ＧｌｃＮＡｃ、４００ｍＭグルコースを含む溶液に、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素液（０．１ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）、ガラクトキナーゼ（７．５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）及びヘキソース１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（３．２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）および乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業）３．０％を添加し、２５℃で撹拌しつつ反応を行った。
【００５６】
反応開始１８時間後（Ｎ−アセチルラクトサミンは、２９．９ｍＭ生成）に、５０ｍＭ ＮｅｕＡｃ、３０ｍＭグルタミン、大腸菌ＣＴＰ合成酵素液（１．５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素液（１．５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）及びα２，３−シアリルトランスフェラーゼ酵素液（０．４ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）を添加し、２５℃で撹拌を継続した。また、反応１８、２６、４０時間後にグルコースを２００ｍＭ添加した。その結果、反応開始４６時間後に３８．０ｍＭ（２５．７ｇ／Ｌ）の３’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの生成が確認された。
【００５７】
実施例３：３’-ＳｉｌａｙｌＬＡｃＮＡｃの合成（３）
（ＧｌｃＮＡｃとＣＭＰからのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの再生利用）
Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｐ２−エピメラーゼ、及びＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＴｒｃ−ＮＥＮＢ（国際公開番号ＷＯ２００４／００９８３０）を用いて大腸菌ＤＨ１株（ＡＴＣＣ３３８４９）を常法（「Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition」(Sambrookら編、Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)）に従い形質転換し、アンピシリン耐性の形質転換体ＤＨ１／ｐＴｒｃ−ＮＥＮＢを取得した。得られた形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ｘＹＴ培地５００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。菌体数が４ｘ１０８個／ｍｌに達した時点で、培養液に最終濃度０．２ｍＭになるようにＩＰＴＧ（isopropylβ-D-thiogalactopyranoside）を添加し、さらに３７℃で１８時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ、１０分）により菌体を回収した。
【００５８】
２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭ ＵＭＰ、５０ｍＭガラクトース、１００ｍＭ ＧｌｃＮＡｃ、２００ｍＭフルクトースを含む溶液に、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素液（０．１ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）、ガラクトキナーゼ（２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）及びヘキソース１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）および乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業）４．０％（ｗ／ｖ）を添加し、２８℃で撹拌しつつ反応を行った。
【００５９】
反応開始８時間後（Ｎ−アセチルラクトサミンは３１．３ｍＭ生成）に、１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、２０ｍＭ ＣＭＰ、０．５％キシレン、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素液（１．７ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）、α２，３−シアリルトランスフェラーゼ（０．１ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）及び前述の回収した大腸菌ＤＨ１／ｐＴｒｃ−ＮＥＮＢ菌体（反応液の５倍量の培養液分の菌体）を添加した。また、反応開始８、２８、４０時間後にグルコースを２００ｍＭ添加した。反応５０時間後に１３．４ｍＭ（９．０ｇ／Ｌ）の３’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの生成が確認された。
【００６０】
実施例４：６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの合成
（１）フォトバクテリウム・ダムセラ由来β-ガラクトシドα２，６-シアリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子のクローニング
フォトバクテリウム・ダムセラ ｓｕｂｓｐ. ｄａｍｓｅｌａ (ＮＢＲＣ Ｎｏ.１５６３３叉はＡＴＣＣ ３３５３９)からの染色体ＤＮＡの調製は、該菌の凍結乾燥菌体を１００μLの５０ｍM トリス塩酸緩衝液(ｐＨ ８．０), ２０ｍＭ ＥＤＴＡに懸濁したのちに１０μLの１０％ＳＤＳ溶液を添加して室温で５分静置により溶菌させ、この溶菌液からフェノール抽出ならびにエタノール沈殿により得られた沈殿を２０μLのＴＥバッファー(１０ｍM トリス塩酸緩衝液(ｐＨ ８．０), １ｍＭ ＥＤＴＡ)に溶解することにより行った。
【００６１】
以上のように調製したＤＮＡを鋳型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡ（A）および(B)を常法に従って合成し、ＰＣＲ法によりフォトバクテリウム・ダムセラのβ-ガラクトシドα２，６-シアリルトランスフェラーゼをコードするｂｓｔ遺伝子（Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ ｔｏ ＮＣＢＩ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ０１２２８５）を含む領域のＤＮＡを増幅した。
【００６２】
プライマー（Ａ）：５’-GTGTGGCATAGTACGCACTT-３’
プライマー（Ｂ）：５’-AGGTCGCCACATTTACGATG-３’
【００６３】
ＰＣＲによるｂｓｔ遺伝子を含む領域のＤＮＡ増幅は、反応液１００μｌ（１０ｘＰｙｒｏｂｅｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ(タカラバイオ社) １０μｌ、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、鋳型ＤＮＡ ０．１ｎｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）および（Ｂ）各々０．２μＭ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ(タカラバイオ社) ２．５ｕｎｉｔｓ）をＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（タカラバイオ社）を用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（４７℃、１分）、伸長反応（７２℃、２分）のステップを３６回繰り返すことにより行った。
【００６４】
増幅後のＤＮＡを、文献（Molecular Cloning、(Maniatisら編、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、New YorK(1982)）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、２．３ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを鋳型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡ（C）および（D）を使って、ＰＣＲ法によりフォトバクテリウム・ダムセラのｂｓｔ遺伝子を増幅した。
【００６５】
プライマー（C）：５’-CTTGGATCCTGTAATAGTGACAATACCAGC-３’
プライマー（D）：５’-TAAGTCGACTTAAGCCCAGAACAGAACATC-３’
【００６６】
ＰＣＲによるｂｓｔ遺伝子の増幅は、反応液１００μｌ（１０ｘＰｙｒｏｂｅｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ(タカラバイオ社) １０μｌ、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、鋳型ＤＮＡ ０．１ｎｇ、プライマーＤＮＡ（Ｃ）および（Ｄ）各々０．２μＭ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ(タカラバイオ社) ２．５ｕｎｉｔｓ）をＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ(タカラバイオ社)を用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５２℃、１分）、伸長反応（７２℃、２分）のステップを３０回繰り返すことにより行った。
【００６７】
遺伝子増幅後、ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、１．５ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで切断し、同じく制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ１２-６（特開２００１−１０３９７３）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９菌（タカラバイオ株式会社より入手）を形質転換し、得られたカナマイシン耐性形質転換体よりプラスミドｐ１２-６-ｐｓｔΔＮを単離した。
【００６８】
（２）α２,６-シアリルトランスフェラーゼ酵素液の調製
プラスミドｐ１２-６-ｐｓｔΔＮを保持する大腸菌ＪＭ１０９株を、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する培地（２％ペプトン、１％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、０．１５％グルコース）１００ｍｌに植菌し、３０℃で振とう培養した。５時間後培養液に最終濃度０．２ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに１８℃で２０時間振盪培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、２．５ｍｌの緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５））に懸濁した。ブランソン社製超音波破砕機（モデル４５０ソニファー）を用いて氷冷下で超音波処理を行い（５０Ｗ，２分，３回）、４℃、１２，０００ｘｇの条件下で２０分間遠心分離し、可溶性画分（上清）を回収した。
【００６９】
このように得られた上清画分を酵素標品とし、酵素標品におけるα２，６シアリルトランスフェラーゼ活性を測定した。その結果、０．４４ ｕｎｉｔｓ／ｍｉｎ／ｍｌ 酵素液であった。
【００７０】
なお、α２，６シアリルトランスフェラーゼ活性は、以下に示す方法でＣＭＰ−ＮｅｕＡｃとＮ−アセチルラクトサミンから６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃへの転換活性を測定、算出したものである。すなわち、２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ５．５）、５０ｍＭ ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ、１０ｍＭ Ｎ−アセチルラクトサミンにα２，６シアリルトランスフェラーゼ酵素標品を添加して３７℃で１０分反応させる。反応液を３分間の煮沸にて反応を停止し、ＨＰＡＥＣ−ＣＤ（High-perfoemance anione-exchange chromatography coupled with conductimetric detection）による糖分析を行う。分離にはダイオネクス社製のＣａｒｂｏｐａｃ ＰＡ１カラム（４×２５０ｍｍ）を用い、溶出液として（Ａ）０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液と（Ｂ）０．１Ｍ ＮａＯＨ，０．５Ｍ 酢酸ナトリウム溶液の濃度勾配（０−１０分：Ｂ＝０％、１０−２５分：Ｂ＝４５％、２５−３０分：Ｂ＝１００％）を用いる。ＨＰＡＥＣ−ＣＤ分析結果から反応液中のＬａｃＮＡｃ消費量および６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの生成量を算出し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＮｅｕＡｃをＮ−アセチルラクトサミンに転移させる活性を１ｕｎｉｔとする。
【００７１】
（３）６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの合成
２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ ＵＭＰ、５０ｍＭガラクトース、５０ｍＭ ＧｌｃＮＡｃ、２００ｍＭフルクトースを含む液にβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素液（０．１８ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）、ガラクトキナーゼ活性（４５．６ｕｎｉｔｓ/ｍｌ反応液）及びヘキソース１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ活性（２６．５ｕｎｉｔｓ/ｍｌ反応液）を有する酵素液、および乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業）３．０％（ｗ/ｖ）を添加し、２８℃で攪拌しつつ反応を行った。反応開始７時間後にＮ−アセチルラクトサミンは、２０．２ｍＭ生成していた。
【００７２】
次に、このＮ−アセチルラクトサミン合成液に５０ｍＭ ＮｅｕＡｃ、１０ｍＭ ＣＭＰ、ＣＭＰ-ＮｅｕＡｃ合成酵素液（５．８ｕｎｉｔｓ/ｍｌ反応液）及びα２，６−シアリルトランスフェラーゼ酵素液（０．０４ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）を添加し、２８℃で攪拌を続けた。また、反応開始７、２２、３０時間後にグルコースを２００ｍM添加した。その結果、反応開始４６時間後に３５．６ｍM（２４．１ｇ/Ｌ）の６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの生成が認められた。
なお、フォトバクテリウム・ダムセラ ｓｕｂｓｐ. ｄａｍｓｅｌａは独立行政法人製品評価技術機構より入手可能である。
【００７３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の糖転移酵素を用いて、糖供与体としての糖ヌクレオチドの糖部分（Ａ１）を糖受容体（Ｂ）に転移させて糖鎖（Ａ１−Ｂ）を合成し、次いで別の糖供与体としての糖ヌクレオチドの糖部分（Ａ２）を得られた糖鎖（Ａ１−Ｂ）に転移させて新たな糖鎖（Ａ２−Ａ１−Ｂ）を合成し、このような反応を複数回繰り返して目的とする糖鎖（Ａｎ−・・・Ａ２−Ａ１−Ｂ）（ただし、ｎは整数を示す）を製造する方法において、（ａ）酵母菌体を併用する、（ｂ）糖ヌクレオチドをヌクレオチドと糖から系内で合成及び再生する、（ｃ）途中で精製処理を行わない、ことを特徴とする糖鎖の製造法。
【請求項２】
１以上の糖転移酵素と糖ヌクレオチドを用いて、糖ヌクレオチドの糖部分（Ａ）を糖受容体（Ｂ）に転移させて糖鎖（Ａｍ・・・Ａ１−Ｂ）（ただし、ｍは１以上の整数を示す）を調製し、最後に糖供与体としてシチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を用い、シアル酸転移酵素によりシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）を糖鎖（Ａｍ−・・・−Ａ１−Ｂ）に転移させ、目的とするシアル酸含有糖鎖（シアリル化Ａｍ−・・・−Ａ１−Ｂ）を合成する、請求項１記載の製造法。
【請求項３】
糖供与体としてウリジン５’−二リン酸ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）、糖転移酵素としてガラクトース転移酵素を用いてガラクトースを糖受容のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に転移させてＮ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）を合成し、次いで、糖供与体としてシチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を用い、シアル酸転移酵素によりシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）をＮ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）転移させ、シアリルＮ−アセチルラクトサミン（ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）を合成する、請求項１記載の製造法。
【請求項４】
Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）とシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を原料としてシチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を合成及び再生する、請求項２又は３記載の製造法。
【請求項５】
Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）とウリジン５’−モノリン酸（ＵＭＰ）を原料としてシチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を合成及び再生する、請求項２又は３記載の製造法。
【請求項６】
Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を原料としてシチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を合成及び再生する、請求項２又は３記載の製造法。
【請求項７】
Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とウリジン５’−モノリン酸（ＵＭＰ）を原料としてシチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を合成及び再生する、請求項２又は３記載の製造法。
【請求項１】
複数の糖転移酵素を用いて、糖供与体としての糖ヌクレオチドの糖部分（Ａ１）を糖受容体（Ｂ）に転移させて糖鎖（Ａ１−Ｂ）を合成し、次いで別の糖供与体としての糖ヌクレオチドの糖部分（Ａ２）を得られた糖鎖（Ａ１−Ｂ）に転移させて新たな糖鎖（Ａ２−Ａ１−Ｂ）を合成し、このような反応を複数回繰り返して目的とする糖鎖（Ａｎ−・・・Ａ２−Ａ１−Ｂ）（ただし、ｎは整数を示す）を製造する方法において、（ａ）酵母菌体を併用する、（ｂ）糖ヌクレオチドをヌクレオチドと糖から系内で合成及び再生する、（ｃ）途中で精製処理を行わない、ことを特徴とする糖鎖の製造法。
【請求項２】
１以上の糖転移酵素と糖ヌクレオチドを用いて、糖ヌクレオチドの糖部分（Ａ）を糖受容体（Ｂ）に転移させて糖鎖（Ａｍ・・・Ａ１−Ｂ）（ただし、ｍは１以上の整数を示す）を調製し、最後に糖供与体としてシチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を用い、シアル酸転移酵素によりシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）を糖鎖（Ａｍ−・・・−Ａ１−Ｂ）に転移させ、目的とするシアル酸含有糖鎖（シアリル化Ａｍ−・・・−Ａ１−Ｂ）を合成する、請求項１記載の製造法。
【請求項３】
糖供与体としてウリジン５’−二リン酸ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）、糖転移酵素としてガラクトース転移酵素を用いてガラクトースを糖受容のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に転移させてＮ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）を合成し、次いで、糖供与体としてシチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を用い、シアル酸転移酵素によりシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）をＮ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）転移させ、シアリルＮ−アセチルラクトサミン（ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）を合成する、請求項１記載の製造法。
【請求項４】
Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）とシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を原料としてシチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を合成及び再生する、請求項２又は３記載の製造法。
【請求項５】
Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）とウリジン５’−モノリン酸（ＵＭＰ）を原料としてシチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を合成及び再生する、請求項２又は３記載の製造法。
【請求項６】
Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を原料としてシチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を合成及び再生する、請求項２又は３記載の製造法。
【請求項７】
Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とウリジン５’−モノリン酸（ＵＭＰ）を原料としてシチジン５’−モノホスホリルＮ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を合成及び再生する、請求項２又は３記載の製造法。
【公開番号】特開２００６−２７１３７２（Ｐ２００６−２７１３７２Ａ）
【公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３６５９９１（Ｐ２００５−３６５９９１）
【出願日】平成１７年１２月２０日（２００５．１２．２０）
【出願人】（０００００６７７０）ヤマサ醤油株式会社 (56)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月２０日（２００５．１２．２０）
【出願人】（０００００６７７０）ヤマサ醤油株式会社 (56)
【Ｆターム（参考）】
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