細胞培養のための表面
【課題】細胞／組織の培養および患者への転移のために理想的なビヒクルの全ての必要条件を満たし得る基板を提供すること。
【解決手段】本発明は、細胞が接着し、そして増殖する細胞培養表面に関し、そしてこれは、種々の治療的および美容的な組織工学／外科的手順のために、この表面からの接着細胞の脱着を可能にする。本発明はまた、組織工学で使用する治療的ビヒクルであって、このビヒクルはプラズマ重合によって得られる細胞培養表面に一体化、または適用され、それに対して少なくとも１つの細胞が可逆的に接着され得、該表面は少なくとも５％の酸性官能基を含むことで特徴付けられるビヒクルを提供する。
【解決手段】本発明は、細胞が接着し、そして増殖する細胞培養表面に関し、そしてこれは、種々の治療的および美容的な組織工学／外科的手順のために、この表面からの接着細胞の脱着を可能にする。本発明はまた、組織工学で使用する治療的ビヒクルであって、このビヒクルはプラズマ重合によって得られる細胞培養表面に一体化、または適用され、それに対して少なくとも１つの細胞が可逆的に接着され得、該表面は少なくとも５％の酸性官能基を含むことで特徴付けられるビヒクルを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞、好ましくは哺乳動物細胞が接着および増殖し、そして上記接着細胞が表面から脱離することを可能にする表面に関連し、それは様々な治療的および美容組織工学／外科処置に使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
組織工学は、臨床および美容外科の多くの領域に関して密接な関係を有する新興の科学である。より具体的には、組織工学は、組織および／または器官を機能的な状態に戻すための、損傷したおよび／または病的な組織の置換および／または復元（ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ）および／または修復（ｒｅｐａｉｒ）に関連する。例えば、そして制限のためでなく、組織工学は挫傷、または熱傷、または静脈または糖尿病性潰瘍による組織の治癒の失敗の結果として起こる創傷を修復するための皮膚移植片の供給に有用である。さらに、組織工学はまた、関節炎のような変性疾患による関節の置換；様々な環境要因（例えば喫煙、食事）および／または動脈／心臓弁の置換を含む先天的な心疾患の結果としての損傷による冠動脈の置換；臓器移植；消化性潰瘍の修復；骨粗鬆症のような疾患によって起こる骨組織の置換；神経筋疾患または傷害による損傷の結果としての筋肉および神経の置換、および泌尿器科学の疾患を阻止するための膀胱材料の置換の間に実施される。
【０００３】
残念ながら、インビトロで細胞／組織を培養することは、組織工学が直面する問題の一部分のみをあらわす。多くの例で、培養中の細胞の増殖は主な障害ではない。さらにより面倒な問題は、細胞／組織が治療される患者に組み込まれるように、適当なビヒクル（例えば、そして制限のためでなく、培養ウェア（ｃｕｌｔｕｒｅ ｗｅａｒ）、人工器官、移植片、三次元マトリックス支持体、細胞外マトリックスタンパク質をコートした包帯剤（ｄｒｅｓｓｉｎｇ）、包帯、硬膏）を介する細胞／組織の転移である。置換組織の転移に適切なビヒクルは、それらが組織工学で有用である場合、ある必要条件を満たさなければならない。例えば、転移ビヒクルは任意で以下の特徴を有する；
ｉ）それらは細胞がしっかりと接着し得る表面を提供する；
ｉｉ）それらは接着細胞が接着表面に妨害されずに増殖および分裂することを可能にする；
ｉｉｉ）適当な場合、それらは接着細胞の分化（または未分化）状態に影響を与えない接着表面を提供する；
ｉｖ）それらは細胞を滅菌および免疫学的に無症候性状態に維持する；
ｖ）それらは患者に対して最小限に毒性である；
ｖｉ）それらは細菌またはウイルス性疾患を伝達しない；そして
ｖｉｉ）それらは接着細胞が容易に脱離し、そして続いて置換、復元または修復が必要な組織部位に侵入する表面を提供する。
【０００４】
細胞が接着、成長、および培養中で増殖する基板を提供する多くの表面が同定され、そして前述の特徴を発現する細胞型のすぐれた例はケラチノサイトである。
【０００５】
細胞の接着および増殖および成長を支持する好ましい基板はコラーゲンＩであるが、他のものも調査された（１）。例えば、コラーゲン−グリコサミノグリカン（Ｃ−ＧＡＧ）基板に播種または沈着させ、そして熱傷に移植して培養代用皮膚（ＣＳＳ）を形成して、１４−２８日後に永続する皮膚組織に発展した（２）。ケラチノサイトはまた、インビトロで、合成親水性ポリマー支持体上で成長し得る（３）。ケラチノサイトは、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）支持体上に移植され、そしてこれらは再構築されていない表皮および正常ヒト皮膚のサイトケラチンパターンにおいて違いのない、改善した創傷床の治癒を示した（４）。以前の研究が、どのようにカルボン酸含有プラズマコポリマーが７日間ケラチノサイトの接着および増殖を促進するのか示した（５）。
【０００６】
細胞外マトリックスタンパク質の、ヒトケラチノサイトの接着、増殖および皮膚創傷床モデルへの転移に対する影響も研究された（６）。Ｍａｔｒｉｇｅｌ、コラーゲンＩおよびＩＶは、最初の接着を増強し、ＲＧＤ、ビトロネクチン、フィブロネクチン、および照射３Ｔ３線維芽細胞はしないことが見出された。細胞の増殖はまた、ｍａｔｒｉｇｅｌ、コラーゲンＩおよびＩＶ、および照射３Ｔ３線維芽細胞上で積極的に影響される（最初の接着より低い程度であるが）ことが見出された。後者の基板上で増殖するケラチノサイトは、単純なインビトロ創傷床モデルへ転移する能力を維持していた。
【０００７】
限定された表面における細胞の培養は、分化した細胞の課題に的をしぼらなかった。例えば、分化した細胞型の研究に通常使用される線維芽細胞は、培養中でかなりの多形質発現を維持し、そして比較的培養しやすい。対照的に、ケラチノサイトは通常、インビボで基底表皮層（ここでケラチノサイトは、下にある真皮と接着している基底膜と接触している）から上部表皮層へ、上向きに移動しながらプログラムされた分化を受ける。後者の層で、ケラチノサイトは核を失い、そして最終分化を受ける。一旦ある分化のポイントを通過すると、それらは移動または増殖できず、そして主に皮膚のバリア機能を果たす。
【０００８】
培養中のケラチノサイトは、ほとんどの培養条件で最終分化を受け、そして不利な条件には未熟な分化によって反応する。従って、課題は、理想的にはそれ自身は分化を促進せず、そして理想的には適当な培地と共に、ケラチノサイトのような細胞を増殖する表現型に維持し得る表面を確立することである。そこでそれらは接着、そして続いてインビトロ創傷床モデルに転移することが可能である。
【０００９】
組織工学および創傷修復を考える場合、いくつかの異なるアプローチが可能である。現在調査されている製品および可能性のある治療は、一般的に３つのカテゴリーに入る：表皮置換、真皮置換および代用皮膚である。
【００１０】
表皮置換は、シート単独として、またはビヒクルとともに培養したケラチノサイトからなり、そして通常インビトロでコンフルエントになるまで増殖した自己由来（患者自身の）上皮細胞を培養することを含む。「既成の」解決として非自己由来のバージョンが利用可能であるが、非自己由来細胞が適合性である証拠はない。しかし、それらは生物学的包帯として作用し得る。これらの理由のために、非自己由来の製品（ＥｐｉｃｅｌtmおよびＡｃｔｉｃｅｌtm）の臨床的成功は、まちまちであった。調査中の別の製品、Ｌａｓｅｒｓｋｉｎは、ケラチノサイト送達システムとしてヒアルロン酸を使用するが、当業者が使用する場合、そのキャリアを照射３Ｔ３線維芽細胞の層と共にプライムしてケラチノサイトの増殖を促進する。他もまた、インタクトなシートを形成する前のケラチノサイト転移のためのフィルムキャリアを調査している。
【００１１】
真皮置換は、線維芽細胞（およびいくつかの場合には内皮細胞）による浸入、接着、増殖および新マトリックス産生のための、支持構造または埋め込まれたマトリックスを含む。Ｉｎｔｅｇｒａtmは、シリコンで裏打ちしたシート上でコンドロイチン−６−硫酸と架橋したウシ真皮コラーゲンＩの真皮成分を使用する。線維芽細胞および表皮細胞と共に播種された改変体も検討中である。合成マトリックスは３／４週後に分解し、そして分層メッシュ移植の前の新真皮形成を促進する。Ａｌｌｏｄｅｒｍtmは、ドナーの線維芽細胞（スクリーニングした皮膚バンクドナー由来）を含む、凍結乾燥ヒト脱表皮化（ｄｅ−ｅｐｉｄｅｒｍｉｓｅｄ）真皮である。Ｘｅｎｏｄｅｒｍtmは、同様に、ブタ真皮を利用する。それはマトリックスの創傷床への組み込みを可能にし、低い免疫原性を示し、そして宿主細胞との再集合（ｒｅ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を可能にする。他はまた、支持体としてコラーゲンを基にしたポリマー、または合成マトリックスを、実験的創傷に播種されないで（ｕｎｓｅｅｄｅｄ）埋め込まれた場合に細胞内への成長を支持することが示された、ケラチノサイトおよび線維芽細胞の伝達のために開発中である。
【００１２】
現在検討されている最も有望な製品、Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔtmは、同種線維芽細胞と共に播種されたＰＧＡ／ＰＬＡマトリックスを利用する。４週後に埋め込まれたマトリックスの完全な吸収が見られ、そして細胞はコラーゲンＩ−ＩＩＩ−ＶＩ、エラスチン、フィブロネクチン、およびデコリンを沈着させる。播種されないバージョンは、移植片のつきを支持しなかった。この製品の利点は、ケラチノサイトと共に播種された場合、創傷の収縮を遅らせることができることであり、そして非コラーゲン性のマトリックスは免疫原性／ＢＳＥ転移に関連する問題を克服する。
【００１３】
代用皮膚は、真皮および表皮置換を両方組み合わせる。Ａｐｐｌｉｇｒａｆtmは、同種異系の線維芽細胞を播種したコラーゲンＩゲルを同種異系のケラチノサイトのコンフルエントなシートと組み合わせる。真皮病変（ｌｅｓｉｏｎ）における同種異系のケラチノサイトおよび線維芽細胞の長期生存率について疑問があるが、生存能力のある同種細胞が修復過程を促進し得る生物学的メディエーター（例えば成長因子）を伝達し得ることが可能である。
【００１４】
創傷治癒システムを提供する上記の解決（患者組織、すなわち自己組織由来の材料を使用するもの以外）は、感染性薬剤を寄付供給源から治療される患者へ転移させる可能性に悩むことが、当業者に明らかである。さらに、異種移植は依然として、組織工学においてヒト組織の使用の代替として、一般社会による一般的な受け入れが必要である。
【００１５】
創傷の前治療、マトリックス支持体の選択（細胞増殖のための）、および同種異系の細胞の使用に関するいくつかの問題はまた完全に解決されていないが、創傷修復に対する組織工学アプローチは、存在する治療に比べて有意な治療的有用性を示すことに疑いはほとんどない。上記の記述から、ケラチノサイトは組織工学で使用する組織の研究にすぐれたモデルシステムを提供することが明らかである。しかし、組織工学が直面する最も重要な問題は、細胞／組織の培養および患者への転移のために理想的なビヒクルの、全ての必要条件を満たし得る基板の供給である。
【００１６】
細胞培養ウェアおよび生物学的移植片またはビヒクルは、典型的には細胞の接着、成長および増殖を可能にするポリマーから製造、またはそれでコートされる。多くの場合、その基板／ビヒクルが培養細胞／組織を埋め込む手段として使用される場合、それと結合して使用される埋め込みマトリックスは生物分解性であり得る（第ＷＯ９０／１２６０３号を参照のこと）。さらに、細胞の接着および増殖を促進する基板の処理は、上記分野で周知である。例えば第ＷＯ８９／０２４５７号および第ＷＯ９０／０２１４５号は、細胞の接着を促進する表面の化学的修飾を開示している。第ＷＯ８９／０２４５７号は、ポリテトラフルオロエチレン（Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）tm）および他のフルオロカーボンポリマーの化学的修飾およびその内皮細胞培養における使用に関連する。第ＷＯ９０／０２１４５号は、細胞／組織培養に使用する様々な型の基板をコートするのに使用する、中和されたパーフルオロ−３，６−ジオキサ−４−メチル−７−オクテンスルホニルフッ化物のコポリマーおよびモノマーテトラフルオロエチレンの使用を記載している。
【００１７】
米国特許第４，９１９，６５９号は、細胞が接着および増殖する表面をコートするための、プラズマ重合可能ガス（例えば、アセトン、メタノール、エチレンオキシド）の使用を記載している。コートした表面は、増強されたフィブロネクチン（細胞接着ポリペプチド）の結合を示し、そして従って処理表面への細胞の接着を促進する。このように処理した表面は、生物学的移植片および細胞培養ウェアのための品物を提供するのに有用である。典型的には、ポリエステル、ポリテトラフルオロエチレンまたはポリウレタンのような材料を、プラズマ重合ガスでコートし、そして次いでフィブロネクチンと接触させる。フィブロネクチン吸着表面は、コントロール表面と比べた場合、増強されたマウス３Ｔ３細胞の接着を示す。
【００１８】
プラズマは通常電場によって活性化されたイオン化ガスである。それらはイオン、電子、中性のもの（ｎｅｕｔｒａｌｓ）（ラジカル、準安定のもの、基底および励起状態の種）および電磁放射を含む、高度に反応性の化学的環境である。減圧下でレジメが達成され得、ここで電子の温度はイオンおよび中性のものの温度と実質的に異なる。このようなプラズマは、「コールド」または「非平衡」プラズマと呼ばれる。そのような環境において、多くの揮発性有機化合物（ニート、または他のガス（例えば、Ａｒ）と共に）は、重合化してプラズマおよびその放電の下流と接触して両方の表面をコートすることが示された（Ｈ．Ｋ．Ｙａｓｕｄａ、Ｐｌａｓｍａ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８５）。その有機化合物は、多くの場合「モノマー」と呼ばれる。沈着物は多くの場合「プラズマポリマー」と呼ばれる。そのような重合の様式の利点は、以下のものを含む：超薄層のピンホールのないフィルム沈着；プラズマポリマーは広い範囲の基板に沈着し得る；その過程は溶媒を含まず、そしてプラズマポリマーは夾雑物を含まない。
【００１９】
本発明者らは、細胞／組織培養に使用するのに適当な基板をコートするための、プラズマポリマー沈着を開発した（５、７、８）。薄いポリマーフィルムは揮発性有機化合物のプラズマから得ることができる（１０-2ｍｍｂａｒの減圧下、そして理想的には＜１００℃）。プラズマポリマー沈着において、一般的に出発化合物またはイオン化ガスの広範囲のフラグメンテーションおよび広い範囲の得られたフラグメントが存在し、または官能基が望ましくなく沈着に組み込まれる。本発明者らは、低いプラズマ入力パワー（低いプラズマパワー／モノマー流速比）を採用することによって、高い程度の官能基保持を有するフィルムを作ることが可能であることを示した。そのような低いパワー／速度比の例は、２Ｗ／２．０ｓｃｃｍである。しかし、他の比較的低い比が使用され得、そして当業者に公知である。
【００２０】
これはアクリル酸に関して示された（９）。炭化水素（例えば１，７−オクタジエン）とアクリル酸の共重合は、得られたプラズマコポリマー（ＰＣＰ）における表面官能基の濃度に対してある程度のコントロールを可能にする（７）。ＰＣＰは、ジオメトリーに関係なくほとんどの表面に直接沈着し得、これはＰＣＰを、ガーゼおよび線維、ならびに細胞培養のためのプラスチックウェアのような表面を処理するのに理想的にさせる。これは明らかに、ＰＣＰを臨床的適用のために有用にする。ここで細胞は、創傷床または組織修復／復元の部位へ適用する前に、ＰＣＰでコートした２次元または３次元支持体上で増殖し得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、プラズマポリマー／コポリマーでコートした表面上でヒトケラチノサイトを培養した。低いパワー／モノマー流速比の使用は、酸を含むモノマー（この例ではアクリル酸）の酸性官能基が、プラズマ−ガスからプラズマポリマー／コポリマー沈着までほとんど完全に保存される（保持される）プラズマポリマー／コポリマーを産生する。これらの沈着は他の官能基（例えば、後プラズマ酸化によって起こるヒドロキシル基）を含むが、「高酸性官能基」と記載され、プラズマガスからプラズマポリマーフィルムまでの高い程度の酸保持の程度を反映する。「高酸性官能基」は、酸を含むモノマー／炭化水素の共重合化比に依存する、プラズマポリマー／コポリマー中の酸性官能基の量（濃度／密度）をいわない。
【００２２】
これらの表面上で培養したケラチノサイトは、未分化の状態で接着、成長、および増殖するだけでなく、表面から脱離してそして創傷床モデルに転移する。この方法でケラチノサイトの転移を促進する表面は、創傷治癒の分野で非常に有望であることを示す。本発明者らは、これらの好ましい特徴を、本発明者らの処理表面の高酸性官能基および細胞の脱離を促進する接着表面の性質に帰する。
【００２３】
本明細書中における高酸性官能基への言及は、５−２０％の表面酸性官能基、およびより理想的には２０％より多い表面酸性官能基の量を有する表面を含むよう意図される。そのパーセンテージは、この型の環境における炭素原子のパーセントをいう。例えば、２０％の酸性官能基は、プラズマポリマー中１００個の炭素中２０個が酸性型環境にあることを意味する。
【００２４】
本発明の最初の局面によって、少なくとも１つの細胞が放出可能に接着し得、そして高酸性官能基を有する少なくとも１つの細胞培養表面が提供される。
【００２５】
本明細書中において、高酸性官能基への言及は、５−２０％の間または２０％より多い表面酸性官能基を含む表面に関連する。
【００２６】
接着表面における酸性官能基は、増強された細胞の接着を引き起こすことが当業者に明らかである（５、７、１０−１２）。本発明者らは、低いプラズマパワー／モノマー流速比における細胞培養表面のプラズマ重合が、ポリマーでコートされた表面における高酸性官能基の保持を生じることを見出した。１００％のアクリル酸で処理した細胞培養表面で培養された細胞は、増強された処理表面からの脱離を示し、それによって脱上皮化（ｄｅ−ｅｐｉｄｅｒｍｉｓｅｄ）真皮（ＤＥＤ）のケラチノサイトの浸透を促進する。１００％のアクリル酸から産生されたプラズマポリマーは、細胞接着のために最適な酸性官能基の割合を含まないかもしれない。しかし、アクリル酸と炭化水素のプラズマ共重合（例えば、そして制限のためでなく、１，７−オクタジエン）は、沈着過程に対してある程度のコントロールを可能にし、およびケラチノサイトが接着、増殖、およびそれから脱離する表面の供給を可能にする。典型的には、モノマーフロー中５０％を超えるアクリル酸で処理した細胞培養表面は、使用した酸の濃度に依存して、５−２１％の間の酸性官能基を有するプラズマポリマー表面を産生する。例えば、１００％のアクリル酸で処理した表面は、約２１％の酸性表面官能基を産生する。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態では、上記表面は、少なくとも１つの細胞が成長および増殖し得る基板を提供する。好ましくは、上記表面は、上記細胞の成長および増殖を未分化状態で促進する。あるいは、上記表面は、組織の型に依存して、上記細胞の成長および増殖を分化状態において促進する。
【００２８】
本発明のなおさらなる好ましい実施形態では、上記表面は、それに接着する細胞に免疫反応を誘発せず、その結果これらは、患者に伝達された場合に、免疫反応を引き起こさない。
【００２９】
本発明のなおさらなる好ましい実施形態では、上記表面は、最低限の患者毒性を有し、そしてそのためそれに接着した細胞が患者に伝達される場合、好ましくない反応を誘発しない。
【００３０】
本発明のなおさらなる好ましい実施形態では、上記表面は、哺乳類由来の細胞、そしてより好ましくはヒト由来の細胞とともに使用するのに適当である。
【００３１】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、上記表面は、以下の細胞型のいずれか１つと共に使用するのに適当である；ケラチノサイト；軟骨細胞；骨芽細胞；内皮細胞。理想的には、上記細胞はケラチノサイトである。
【００３２】
本発明のなおさらなる好ましい実施形態では、上記表面酸性官能基は、カルボン酸官能基によって提供される。
【００３３】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、上記表面酸性官能基は、少なくとも５％、そしてより通常には５〜２０％の間の表面酸性官能基である。より理想的には、まだ上記表面酸性官能基は、２０％より多い。理想的には上記酸性官能基は、アクリル酸によって提供される。あるいは、上記酸性官能基は、プロピオン酸によって提供される。
【００３４】
本発明のなおまたさらなる好ましい実施形態では、典型的には上記表面は、基板を酸性モノマーのプラズマコポリマーでコートすることによって提供される。例えば、そして制限のためでなく、アクリル酸および炭化水素、例えば、そして制限のためでなく、１，７−オクタジエンである。理想的には、アクリル酸は、５０〜１００％で提供され、そして１，７−オクタジエンはガスフィード中で０〜５０％で提供される。
【００３５】
本発明の細胞培養表面は、例えば、そして制限のためでなく、急性および／または慢性および／または軽度のおよび／または重度の皮膚創傷（静脈および糖尿病性潰瘍を含む）；および／または軟骨修復；および／または骨修復；および／または筋肉修復；および／または神経修復；および／または結合組織修復；および／または血管修復；および／または膀胱修復に対する適用の前に、コートした基板上で細胞が増殖し得る臨床的適用に有用であることが、当業者に明らかである。本発明はまた、組織工学ビヒクルの不可欠の部分として上記表面を提供することによって、任意の前述の細胞培養表面を提供する。
【００３６】
本発明の２番目の局面に従って、組織工学で使用するビヒクルが提供され、ここで上記ビヒクルは、上記表面が高酸性官能基を有することで特徴付けられる、少なくとも１つの細胞が可逆的に接着し得る細胞培養表面と一体化、またはそれに適用される。
【００３７】
ビヒクルは、本発明によって表面で培養された細胞を組織工学で使用し得る、あらゆる構造として定義され得る。例えば、そして制限のためでなく、人工器官、移植片、マトリックス、ステント、細胞培養皿、ガーゼ、包帯、硬膏、生物分解性マトリックスおよびポリマーフィルム。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態では、選択された細胞が接着する本発明による表面を含む治療的ビヒクルが提供される。ここで上記治療的ビヒクルは、治療的組織工学を必要とする患者に適用および／または埋め込むために適合させられる。
【００３９】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、外科的埋め込み処置で使用するために細胞が接着した本発明による表面を含むマトリックス材料（例えば、そして制限のためでなく、合成または天然に存在する、および長期間有効な、または生物分解性のマトリックス材料）を含む治療的ビヒクルが提供される。
【００４０】
本発明のなおまたさらなる好ましい実施形態では、上記ビヒクルは以下の細胞型のいずれか１つと共に使用するのに適当である：ケラチノサイト、軟骨細胞、骨芽細胞、内皮細胞、尿路上皮細胞、上皮細胞。
【００４１】
本発明のなおさらなる好ましい実施形態では、上記治療的ビヒクルはケラチノサイトを含む。
【００４２】
本発明の第３の局面によって、美容組織工学で使用するための、本発明の任意の局面または実施形態による細胞培養表面を含む美容ビヒクルが提供される。
【００４３】
本発明の第４の局面によって、本発明の任意の以前の局面または実施形態による表面を調製する方法が提供され、この方法は以下を包含する：
ｉ）選択された比の酸を含むモノマーおよび炭化水素をガスフィード中で混合する工程；
ｉｉ）この混合物のプラズマを産生する工程；および
ｉｉｉ）適当な基板をこのプラズマでコーティングして高酸性官能基を保持する表面ポリマー／コポリマーを提供する工程。
【００４４】
プラズマの産生は、低いかまたは高いパワーのいずれか、そして持続波またはパルスプラズマのいずれかを使用し得ることが、当業者に明らかである。
【００４５】
好ましくは、このプラズマパワーは０〜５０Ｗのプラズマパワーおよび０〜２０ｓｃｃｍの流速を用いて、通常は持続波条件下で産生される。しかし、パルス波が使用される場合、当業者に公知であるようにプラズマパワーおよび流速について対応する補正が行われる。
【００４６】
本発明の好ましい方法では、酸はアクリル酸であり、そして炭化水素はジエン、そして特にジ−不飽和アルケン、例えば１，７−オクタジエンである。
【００４７】
本発明のさらなる好ましい方法では、プラズマはガスフィード中に５０〜１００％の不飽和酸（例えばアクリル酸）、および０〜５０％のヘキサンまたはジエン（例えば１，７−オクタジエン）を含む。
【００４８】
本発明のなおさらなる好ましい実施形態では、プラズマは、ガスフィード中に以下の比；
酸（例えばアクリル酸）％ アルケン（例えば１，７−オクタジエン）％
５０ ５０
６０ ４０
７０ ３０
８０ ２０
９０ １０
１００ ０
の酸（例えばアクリル酸）およびヘキサンまたはジエン（例えば１，７−オクタジエン）を含む。
本発明は例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）少なくとも１つの細胞が放出可能に接着し得る細胞培養表面であって、該表面は、高酸性官能基を有する、細胞培養表面。
（項目２）前記表面が、少なくとも１つの細胞が成長および増殖し得る基板を提供する、項目１に記載の細胞培養表面。
（項目３）前記表面は、前記細胞の成長および増殖を未分化状態で促進する、項目１または２に記載の細胞培養表面。
（項目４）前記表面は、前記細胞の成長および増殖を分化状態において促進する、項目１または２に記載の細胞培養表面。
（項目５）前記表面は、それに接着する細胞に免疫反応を誘発しない、項目１〜４のいずれかに記載の細胞培養表面。
（項目６）前記表面は、最低限の患者毒性を有する、項目１〜５のいずれかに記載の細胞培養表面。
（項目７）前記表面が哺乳類起源の細胞と使用するのに適当である、項目１〜６のいずれかに記載の細胞培養表面。
（項目８）前記哺乳類細胞がヒトである、項目７に記載の細胞培養表面。
（項目９）前記表面が以下の細胞型のいずれか１つと使用するのに適当である、項目１〜８のいずれかに記載の細胞培養表面：ケラチノサイト；軟骨細胞；骨芽細胞；内皮細胞；尿路上皮細胞；上皮細胞。
（項目１０）前記細胞型がケラチノサイトである、項目９に記載の細胞培養表面。
（項目１１）前記表面の酸性官能基がカルボン酸によって提供される、項目１〜１０のいずれかに記載の細胞培養表面。
（項目１２）カルボン酸のプラズマ重合によって得られる細胞培養表面。
（項目１３）前記表面の酸性官能基が５〜２０％の間の酸性官能基である、項目１〜１２のいずれかに記載の細胞培養表面。
（項目１４）前記表面の酸性官能基が２０％より多い酸性官能基である、項目１〜１２のいずれかに記載の細胞培養表面。
（項目１５）前記酸性官能基がプロピオン酸によって提供される、項目１〜１４のいずれかに記載の細胞培養表面。
（項目１６）前記酸性官能基がアクリル酸によって提供される、項目１〜１４のいずれかに記載の細胞培養表面。
（項目１７）前記表面が、酸含有モノマーのプラズマコポリマーで基板をコーティングすることによって提供される、項目１〜１６のいずれかに記載の細胞培養表面。
（項目１８）前記コポリマーがアクリル酸および炭化水素の混合物である、項目１７に記載の細胞培養表面。
（項目１９）前記炭化水素が１，７−オクタジエンである、項目１８に記載の細胞培養表面。
（項目２０）ガスフィード中でアクリル酸が５０〜１００％で提供され、そして１，７−オクタジエンが０〜５０％で提供される、項目１８または１９に記載の細胞培養表面。
（項目２１）項目１〜２０のいずれかに記載の細胞培養表面を含む、組織工学において使用するためのビヒクル。
（項目２２）項目２１に記載のビヒクルであって、該ビヒクルが、選択された細胞が接着する項目１〜２０のいずれかに記載の細胞培養表面を含む治療的ビヒクルであり、該治療的ビヒクルが、治療的組織工学を必要とする患者に適用および／または埋め込むために適合させられる、ビヒクル。
（項目２３）前記治療的ビヒクルがマトリックス材料を含み、そして、前記細胞が外科的埋め込み処置で使用するためのものである、項目２２に記載の治療的ビヒクル。
（項目２４）項目２２または２３に記載の治療的ビヒクルであって、該ビヒクルが以下の細胞型のいずれか１つと共に使用するのに適当である：ケラチノサイト、軟骨細胞、骨芽細胞、内皮細胞、尿路上皮細胞、上皮細胞。
（項目２５）項目１〜２０のいずれかに記載の細胞培養表面を含む美容ビヒクル。
（項目２６）項目１〜２０のいずれかに記載の細胞培養表面を調製する方法であって、以下：
ｉ）酸を提供する工程；
ｉｉ）該酸のプラズマを産生する工程；および
ｉｉｉ）基板を該プラズマでコーティングして、高い酸性官能基を有する表面ポリマーを提供する工程
を包含する、方法。
（項目２７）前記酸がアクリル酸またはプロピオン酸である、項目２７に記載の方法。
（項目２８）項目１〜２０のいずれかに記載の細胞培養表面を調製する方法であって、以下：
ｉ．ガスフィード中で選択された比の酸を含むモノマーおよび炭化水素を混合する工程；
ｉｉ．該混合物のプラズマを産生する工程；および
ｉｉｉ．適当な基板を該プラズマでコーティングして、高い酸性官能基を有する表面ポリマー／コポリマーを提供する工程、
を包含する、方法。
（項目２９）前記プラズマが０〜５０Ｗのプラズマパワーおよび０〜２０ｓｃｃｍの流速を用いて持続波条件下で産生される、項目２６〜２８のいずれかに記載の方法。
（項目３０）前記プラズマがパルス波条件を用いて産生される、項目２６〜２８のいずれかに記載の方法。
（項目３１）前記酸がアクリル酸であり、そして前記炭化水素が１，７−オクタジエンである、項目２８〜３０のいずれかに記載の方法。
（項目３２）前記プラズマが前記ガスフィード中で５０〜１００％のアクリル酸および０〜５０％の１，７−オクタジエンを含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）前記プラズマが以下の比：
アクリル酸％ １，７−オクタジエン％
５０ ５０
６０ ４０
７０ ３０
８０ ２０
９０ １０
１００ ０
のアクリル酸および１，７−オクタジエンを含む、項目３１に記載の方法。
（項目３４）前記プラズマが以下の比：
酸％ 炭化水素％
５０ ５０
６０ ４０
７０ ３０
８０ ２０
９０ １０
１００ ０
の酸および炭化水素を含む、項目２８に記載の方法。
【００４９】
本発明の実施形態が、例示のみによって、そして以下の表および図への参照と共にここで記載される；
表１は、アクリル酸および１，７−オクタジエンから形成されたＰＣＰのＸＰＳ結果のまとめを示す；
表２は、プロピオン酸から調製したＰＰのＸＰＳ結果のまとめを示す；
表３は、パルス（ｐｕｌｓｅｄ）アクリル酸から調製されたＰＰのＸＰＳ結果のまとめを示す；
表４は、高パワーアクリル酸から調製されたＰＰのＸＰＳ結果のまとめを示す；
表５は、接触して４日後の、種々の表面のＤＥＤに対する接着を示す。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、種々の表面へのケラチノサイトの接着を示す。
【図２】図２は、高パワーアクリル酸、パルスアクリル酸、およびプロピオン酸の表面へのケラチノサイトの接着を示す。
【図３】図３は、転移後のＤＥＤにおけるケラチノサイト保持の測定である。
【図４ａ】図４ａは、ＤＥＤとの接触から４日後の、コラーゲンＩ、キャリアおよび炭化水素の表面からＤＥＤへのケラチノサイト転移による染色を示す。
【図４ｂ】図４ｂは、ＤＥＤとの接触から４日後の、酸を含む表面からＤＥＤへのケラチノサイト転移による染色を示す。
【図５】図５は、ＤＥＤとの接触から４日後の、パルスアクリル酸表面からＤＥＤへのケラチノサイト転移による染色を示す。
【図６】図６は、ＤＥＤとの接触から４日後の、プロピオン酸表面からＤＥＤへのケラチノサイト転移による染色を示す。
【図７】図７は、ＤＥＤとの接触から４日後の、高パワーアクリル酸表面からのケラチノサイト転移による染色を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
（材料および方法）
（プラズマ共重合）
アクリル酸および１，７−オクタジエンおよびプロピオン酸を、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ＵＫ）から得た。全てのモノマーは、数回の凍結−ポンプ／解凍サイクルの後、一般に認められたように使用した。２段階回転ポンプによって排出される円筒形の反応容器（直径８ｃｍおよび長さ５０ｃｍ）で重合を行った。プラズマを、反応容器に誘導的に連結した無線周波数（１３．５６ＭＨｚ）シグナル発生器および増幅器によって維持した。反応器中の基礎圧は３×１０-3ｍｂａｒであった。
【００５２】
アクリル酸および１，７−オクタジエンを、２Ｗのプラズマパワーおよび２．０ｓｃｃｍの全流速で共重合した。プラズマコポリマーを、キャリアポリマー、ポリヒドロキシブチレート（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）および清潔なアルミホイル（ＸＰＳ分析のために）に沈着させた。共重合中の圧は、典型的には４．０×１０-2ｍｂａｒであった。プロピオン酸を沈着させるためのさらなる重合を、同じ条件を用いて行った。それに加えて、アクリル酸を、パルスプラズマ条件を用いて沈着させた。プラズマパワーは５０Ｗであり、５ｍｓのプラズマオンタイムおよび４０ｍｓのプラズマオフタイムのデューティーサイクルを用いた。モノマー流速は２．０ｓｃｃｍであった。最後に、アクリル酸を持続波高パワー条件下で沈着させた。使用したパワーは７．５Ｗ、流速２．０ｓｃｃｍであった。
【００５３】
全ての共重合に関して、２０分の沈着時間を用いた。プラズマをスイッチオフした後、モノマー混合物を、さらに２０分間流れさせた。これは、研究室の大気に曝露された時に沈着による大気酸素の取り込みを最低限にするために行った。
【００５４】
（Ｘ線光電子分光学）
ＸＰスペクトルを、ＭｇＫαＸ線を採用するＶＧ ＣＬＡＭ２光電子分光計で得た。各試料についての調査スキャンスペクトル（０〜１１００ｅＶ）および狭スペクトル（ｎａｒｒｏｗ ｓｐｅｃｔｒａ）を、それぞれ５０および２０ｅｖの分析器通過エネルギーを用いて得た。スペクトルをＳｐｅｃｔｒａ６．０ソフトウェア（Ｒ．Ｕｎｗｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｃｈｅｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を用いて得た。続く処理を、Ｓｃｉｅｎｔａデータ処理ソフトウェア（Ｓｃｉｅｎｔａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて行った。分光計を、８４．００ｅＶにおけるＡｕ４ｆ７／２ピークポジション、および３９７．２ｅＶで測定したＰＴＦＥの試料中のＣｌｓとＦｌｓとの間のピークポジションの分離を用いて較正した。これはＢｅａｍｓｏｎおよびＢｒｉｇｇｓ（１３）によって報告された３９７．１９ｅＶの値とよく匹敵する。
【００５５】
（細胞培養）
正常ヒト成人ケラチノサイト（乳房整復および腹壁形成術から得た）を、以前に記載されたように（１４）真皮／表皮接合部から単離した。細胞を完全Ｇｒｅｅｎ培地で培養した。これはコレラ毒素（０．１ｎＭ）、ヒドロコルチゾン（０．４μｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、アデニン（１．８×１０-4Ｍ）、トリヨード−ｌ−チロニン（２×１０-7Ｍ）、インスリン（５ｍｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）、グルタミン（２×１０-3Ｍ）、ファンギゾン（０．６２５μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１０００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１０００μｇ／ｍｌ）および１０％胎児ウシ血清を含んでいた。細胞を３７℃、５％ＣＯ2雰囲気で培養した。全細胞計測および生存能力のある細胞の数を、トリパンブルー染色および標準的な血球計算器箱（ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）を用いて決定した。
【００５６】
細胞培養実験のために新しく単離した細胞のみを使用した。コラーゲンでコーティングしたキャリアポリマー試料を、０．１Ｍの酢酸（２００μｇ／ｍｌ）中のコラーゲンＩ溶液（３２μｇ／ｃｍ2）を、層流キャビネット中で一晩空気乾燥させることによって調製した。
【００５７】
細胞を、１２．０×１０6細胞／ｍｌの密度で、６ウェル組織培養皿中で試料を平らに保つために直径１０ｍｍのステンレススチール環を用いて、３組の表面に播種した。培養２４時間後、各３組からの１つの試料におけるケラチノサイトの接着を、ＭＴＴ−ＥＳＴＡアッセイ（１５）を用いて決定した。これは、生存可能な細胞数を見積もり、以前にヒトケラチノサイトの細胞数の増加と相関することを示したアッセイである（１６）。細胞をＰＢＳ中０．５ｍｇ ｍｌ-1のＭＴＴで４０分間インキュベートした。染色を次いで酸性化イソプロピルアルコールで溶出した。次いで光学密度測定を５４０ｎｍで、６３０ｎｍのタンパク質参照波長を引いて行った。
【００５８】
各３組の残る２つの試料を、ＤＥＤと接触させて置き、表面が空気／液体界面にくるようにＧｒｅｅｎ培地を加えた。ＤＥＤ／表面創傷床モデルを３７℃のインキュベーターに４日間置き、その後表面をＤＥＤから分離して、そして表面からＤＥＤへの細胞転移のレベルを、上記で記載したようにＭＴＴアッセイを用いて評価した。ＤＥＤのＭＴＴは、染色の溶出の前にＤＥＤをＭＴＴと１２０分間インキュベートすることを必要とした。
【００５９】
（結果）
（ＸＰＳ特徴付け）
アクリル酸および１，７−オクタジエンから調製したＰＣＰのＸＰ調査スキャンスペクトルは、沈着物における炭素および酸素のみを示した。Ｏ／Ｃ比を表１に示す。Ｏ／Ｃ比はモノマーフィード中のアクリル酸のモル画分が増加するにつれて増加した。ＰＣＰのＣｌｓコアレベルスペクトルを、様々な酸素を含む官能基に関してピークフィット（ｐｅａｋ ｆｉｔｔｅｄ）させた。最初に、炭化水素シグナルを２８５ｅＶにセットして試料荷電に関してスペクトルを補正した。次いで以下の官能基をフィットさせた：＋１．５ｅＶのシフトでアルコール／エーテル（Ｃ−ＯＨ／Ｒ）；＋３．０ｅＶでカルボニル（Ｃ＝Ｏ）；＋４．０ｅＶでカルボン酸／エステル（ＣＯＯＨ／Ｒ）；および＋０．７ｅＶでカルボキシレートに結合したβシフトした炭素（Ｃ−ＣＯＯＨ／Ｒ）。ピークフィッティングの結果および例のピークフィット（Ｆaa／Ｆtot＝１）を表１に示した。ピークフィットにおいて成分ピークのＦＷＨＭを等しく保ち、そしてそれは１．４〜１．６ｅＶの範囲であった。成分ピークのＧａｕｓｓｉａｎ対Ｌｏｒｅｎｔｚｉａｎ比（Ｇ／Ｌ比）も一定に保ち、そしてそれは０．８〜０．９の範囲であった。ＸＰＳはカルボン酸とエステル基との間を区別できないが、プラズマ重合アクリル酸のかすめ角赤外分光学は、この研究で採用された低パワーでは、ＸＰスペクトルのカルボキシレートピークは、エステルよりもむしろカルボン酸に割り当てられ得ることを示した（１０）。ＰＣＰに存在する他の炭素−酸素官能基としては（カルボン酸以外に）、カルボニルおよびアルコール／エーテルが挙げられる。これらは、プラズマにおけるモノマーのフラグメンテーションの結果として起こる。沈着物と水との間の反応がプラズマ容器の壁から脱着し（重合中）、そして大気酸素および水（重合後）もまた寄与する。Ｃ−ＯＨ／Ｒピークは、主にヒドロキシル基であると考えられる。以前の研究で、本発明者らは、アクリル酸／１，７−オクタジエンのＰＣＰ（モノマーフィード中アクリル酸の様々なモル画分を用いて調製した）における酸素を含む官能基の同一性について、より詳しく調査した（１１）。この研究に基づいて、本発明者らは、ＰＣＰ表面において、ケラチノサイトはＣ−ＯＨでなくカルボン酸官能基に対して反応すると考える。Ｃ−ＯＨは、細胞接着を促進するためには高い濃度（２５％）で存在しなければならない（８）。
【００６０】
ｉ）プロピオン酸の持続波沈着、ｉｉ）パルスアクリル酸、およびｉｉｉ）高パワーアクリル酸からのＸＰスペクトルもまた、沈着中に炭素および酸素のみを示し、そして上記でアクリル酸について概略を述べた同じ基準を用いてフィットさせた。プロピオン酸、パルスアクリル酸、および高パワーアクリル酸に関するカーブフィッティングの結果をそれぞれ表２、３、および４に示す。本発明者らの研究室におけるパルスプラズマの以前の研究に基づいて、パルスプラズマにおけるより低いデューティーサイクル（ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ）が、より高いカルボキシル保持の値を産生することが予期される（２１）。表１および４を比較することによって、プラズマパワーの増加は、約５０％のカルボキシル官能基保持の低下、およびアルコール／エーテルおよびカルボニル官能基の対応する増加をもたらすことが明らかである。
【００６１】
表１ アクリル酸および１，７−オクタジエンから調製したＰＣＰについてのＸＰＳ結果のまとめ
Ｃｌｓコアレベルにおける官能基％
【００６２】
【表１】
カルボキシレートと同じ大きさの、カルボキシレートに結合したβシフト炭素（炭化水素由来の＋０．７ｅＶにおける（Ｃ−ＣＯＯＨ／Ｒ））をピークフィットに加えた。
【００６３】
表２ プロピオン酸から調製したＰＰについてのＸＰＳ結果のまとめ
Ｃｌｓコアレベルにおける官能基％
【００６４】
【表２】
カルボキシレートと同じ大きさの、カルボキシレートに結合したβシフト炭素（炭化水素由来の＋０．７ｅＶにおける（Ｃ−ＣＯＯＨ／Ｒ））をピークフィットに加えた。
【００６５】
表３ アクリル酸のパルスＰＰについてのＸＰＳ結果のまとめ
Ｃｌｓコアレベルにおける官能基％
【００６６】
【表３】
カルボキシレートと同じ大きさの、カルボキシレートに結合したβシフト炭素（炭化水素由来の＋０．７ｅＶにおける（Ｃ−ＣＯＯＨ／Ｒ））をピークフィットに加えた。
【００６７】
表４ 高パワーアクリル酸のＰＰに関するＸＰＳ結果のまとめ
Ｃｌｓコアレベルにおける官能基％
【００６８】
【表４】
カルボキシレートと同じ大きさの、カルボキシレートに結合したβシフト炭素（炭化水素由来の＋０．７ｅＶにおける（Ｃ−ＣＯＯＨ／Ｒ））をピークフィットに加えた。
【００６９】
（表面における細胞接着）
全ての表面に関して、ケラチノサイトの単離後、血球計算器を用いて細胞計測を行った。それは９７％の細胞生存（２．５×１０7全細胞）を示した。２４時間後に表面を、ＭＴＴアッセイを用いて調査した。
ｉ）アクリル酸／１，７−オクタジエン
結果を図１に示す。データは、モノマーフロー中５０％および１００％のアクリル酸で調製した酸含有表面は、コラーゲンＩよりわずかによく機能したことを示す。フロー中２５％の酸で作成した表面はＴＣＰＳに匹敵したが、炭化水素表面におけるケラチノサイトの接着は不十分であった。
【００７０】
（ｉｉ）プロピオン酸、高パワーアクリル酸、パルスアクリル酸）
結果を図２に示す。全ての表面に対して細胞が接着したが、コラーゲンＩが最も高いレベルの接着を示した。細胞接着のレベルは表面からＤＥＤへのその後の転移の程度についての予測変数ではないが、異なる前駆体モノマーおよび／またはプラズマ条件を用いて産生した表面が、ケラチノサイトの接着を支持することを記載することは重要である。細胞接着は明らかに、続く転移が成功するための必要条件である。
【００７１】
（ＤＥＤへの細胞の転移）
表５は、キャリアポリマー表面をＤＥＤから分離した結果をまとめる。コラーゲンＩ表面およびガスフロー中１００％で調製した表面は、ＤＥＤによく接着し、ケラチノサイトの表面からＤＥＤへの実質的な転移が起こったことを示す。モノマーフロー中より少ない量の酸を含有する表面は、よりよく接着しなかったが、キャリアおよび炭化水素表面は容易にＤＥＤからはがれ、より低い程度の細胞転移が起こったことを示す。
【００７２】
【表５】
表面およびＤＥＤの並置から４日後、２つを分離し、そして図２は表面におけるＭＴＴアッセイの結果を示し、そして図３はＤＥＤにおけるＭＴＴアッセイを示す。表面に残る細胞の光学密度は、ＤＥＤに転移した細胞でみられるものと比べて、全ての場合で非常に低かった。コラーゲンＩ上で増殖した細胞は、ＤＥＤへの転移に関して調査した場合最も高い値を示し、キャリア単独でみられるものよりも約４倍高かった。２５％の酸で処理した表面で増殖した細胞について、転移は、キャリア単独で増殖した細胞でみられるものと同程度であった。しかし、５０％および１００％の酸で処理した表面で増殖した細胞は、有意に高いＤＥＤへの転移を示した。炭化水素で処理した表面で増殖した細胞は、非常に低いＤＥＤへの転移しか示さなかった。
【００７３】
アクリル酸／１，７−オクタジエンＰＰからＤＥＤへのケラチノサイト転移の写真の証拠を図４ａおよび図４ｂに示す。炭化水素（１，７−オクタジエン）およびキャリア（ｂｉｏｐｏｌ）表面は染色されないが、コラーゲンＩおよび酸を含む表面は、ＤＥＤ上のケラチノサイトによる特徴的な紫の染色を示す。図５は、パルスアクリル酸ＰＰからの細胞転移によるＤＥＤ染色を示す。図６は、プロピオン酸ＰＰを用いた同じ結果を示す。図７に示したのは、高パワーアクリル酸ＰＰ（不織布に沈着）からの転移によるＤＥＤ染色である。
【００７４】
（考察）
この研究の目的は、この研究室からの以前の研究を発展させることである。それは、ケラチノサイトの接着および増殖のためのＰＣＰ表面の使用を開示したが、これらの細胞のＤＥＤへの転移を扱わなかった。ケラチノサイトは、多くの基盤上で不可逆的な最終分化を受けるので、そのような研究に特に難題となる。そのような細胞は、移動またはコロニーを形成する能力−再上皮形成を達成するためにケラチノサイトの支持表面から創傷床への転移を考える時に必要な特性を失う。したがって、本発明者らの目的は、接着を促進する表面が、単純なインビトロ創傷モデルにおいて細胞の転移を促進する程度を調査することである。
【００７５】
ヒトケラチノサイトを、様々な濃度のカルボン酸基を含むＰＣＰ表面でうまく培養した。接着した細胞の数は、ケラチノサイト培養の好ましい基盤であるコラーゲンＩ上での細胞の能力に匹敵した。
【００７６】
以前の研究がＴＣＰＳのコントロールとしての安定性に疑いを生じさせたので、炭化水素プラズマポリマーをネガティブコントロールとして使用することが重要である（１７）。これらの心配は、製造中にＴＣＰＳに与えられる表面処理のために生じた。それは、表面における酸化レベルに依存して、ＴＣＰＳを水性溶液に対して不安定にし得る。異なるバッチのＴＣＰＳが正確に同じ量の表面酸化を受けるかどうか、またはこの表面酸化が経年変化を受けやすいかどうかは不明である。
【００７７】
細胞接着の官能基濃度に対する依存性はまだ完全に調査されていないが、ケラチノサイトは以前に、低い２〜３％量の酸性官能基を有する表面上で接着が増強されることが示された（１１）。しかし、この研究で２１％の酸を含む表面でも接着が高いことが示された。酸性ＰＣＰは他のＯ−Ｃ官能基、主にＣ−ＯＨも含むことを思い出すべきである。そうとしても、本発明者らの以前の研究は、酸性ＰＣＰが、コンフルエンシーの程度および細胞数（ＤＮＡアッセイによって決定された）に関してコラーゲンＩと匹敵することを示した。
【００７８】
本発明者らが他で示すように、水性溶媒中で、酸性ＰＣＰは水和し得る（１８）。酸性ＰＣＰの安定性は、モノマーフロー中のアクリル酸濃度に依存することが示された。高濃度の酸（全フローの＞６０％）は、より安定でない表面を生じる。この必要条件は、接着およびその後の増殖を促進するのに「理想的」であるといわれるような低濃度酸性表面（＜５％）の開発を導いた。しかし、酸性表面からの細胞転移に関しては、異なる基準が適用されるようである。酸性基の低濃度は表面に安定性を与えるが、ケラチノサイトは十分によく接着し得て、転移が阻害される。この主張は、転移実験の結果において支持される。ここでモノマーフィード中２５％の酸フロー（ＰＣＰ表面において２．６％のカルボン酸）は、最も低い程度のＤＥＤへの転移を示した。対照的に、モノマー中１００％の酸フロー（ＰＣＰ表面において＞２０％のカルボン酸）は、細胞の転移は有意により高かった。コラーゲンＩのみがこれらの表面よりすぐれていた。モノマーフロー中５０％の酸では、予期されたように、転移は高および低酸性官能基表面の中間であった。これらの結果は、接着および増殖を促進する最適な表面は、最も高い程度のＰＣＰからＤＥＤへのケラチノサイト転移を引き起こすものではないかもしれないことを示す。炭化水素ＰＰからの少ない量の転移は、そのような表面がケラチノサイトを増殖状態で支持できないことを確認する。官能基濃度に対する細胞転移の依存は、まだ完全に調査されていないが、ケラチノサイトは多量の酸性官能基を有する表面から増強された転移を示す。従って、増殖を促進する表面（低酸性官能基）と転移を促進する表面（高酸性官能基）との間に妥協点が存在することが明らかである。
【００７９】
血清を含む培地で、細胞は、基盤自体に対して直接より、タンパク質の吸着層に反応することが示された（１９）。この界面のタンパク質層は、（ほとんど）自然に吸着する。調査している基盤に対する細胞反応の違いは、吸着するタンパク質の組成、またはこれらタンパク質の吸着後の活性のいずれか、あるいはこれら両方の組み合わせに変化が存在することを示唆する。細胞接着は、フィブロネクチンおよびビトロネクチンのような、多くの接着性タンパク質によって支持されることが示された。Ｔｉｄｗｅｌｌら（１２）は、異なる末端化学的性質のアルカンチオレートを用いるＳＡＭに発達するタンパク質層における違い、およびそれらは今度異なるレベルのウシ大動脈内皮細胞接着を支持することを示した。細胞接着および拡散は、細胞増殖のための重要な条件であるが、それらは排他的条件ではない。血清はまた、成長因子の供給源であり、そしてこれらは一次哺乳類細胞の増殖に不可欠であることが示された。成長因子の細胞外マトリックス材料への吸着が、その活性化に役割を果たすことが示唆された（２０）。
【００８０】
結果は、カルボン酸官能基が広い範囲の開始モノマーから提供され得ることを示す。アクリル酸は、有機酸の不飽和ファミリーのメンバーであるが、プロピオン酸は飽和有機酸である。従って、モノマーがプラズマ容器を流れるのに十分揮発性であるなら、任意の有機酸を、ケラチノサイト接着および続くＤＥＤへの転移を示し得るＰＰ表面の製造に使用し得ることが予期される。さらに、その結果は広い範囲のプラズマ条件が、必要な細胞接着および転移を促進する表面を調製することができることを示す。本発明者らは、持続波条件下で、望ましい特徴を有するＰＰをうまく調製するために、低および高パワーレジメを両方使用し得ることを示した。それに加えて、プラズマをパルスすることは酸性官能基を表面に沈着させる別の経路を提供する。他の考慮すべき事は、ある範囲のキャリア表面をプラズマ沈着のために使用し得ることである。この研究で、生物分解性キャリア（ｂｉｏｐｏｌ）、および非生物分解性キャリア（ポリプロピレン、Ｄｅｌｎｅｔ−ＡＥＴ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｎｅｔｓから提供）はいずれも、それらがＤＥＤへのケラチノサイト細胞転移を促進するＰＰでコートされ得ることを示した。データは、キャリアフィルムがその性質が異なり得るが（例えば溶解性、吸収性）、細胞の挙動に影響するのは主にこれらキャリア上のＰＰ沈着であることを示唆する（しかし織り方／孔径のような形態学的効果が、ＰＰコーティングは均一な「平らな」表面ではなく、キャリアの外形に沈着することを意味し得る。従って、細胞は、ＰＰコートキャリアをそれに適用した時にＤＥＤと接触しないかもしれない場所に接着し得る）。転移現象のあらゆる外科的使用は、キャリア材料のコートされた外形内よりも、ＰＰ表面における細胞の最大限の接着を保証するために、メッシュよりもフィルム様のキャリアを必要とすることが認識される。
【００８１】
上記の考察に基づいて、ケラチノサイト接着および転移を支持することにおける酸性ＰＣＰの成功は多因子であることが明らかである。しかし、本発明者らの結果は、ケラチノサイト接着および転移は、カルボン酸官能基によって特異的に促進されることを示す。これはおそらく血清から形成する界面タンパク質層の調節による。
【００８２】
高濃度の酸性基（典型的にはカルボキシル）を含むＰＣＰ表面は、炭化水素表面と比べて、ケラチノサイト接着およびＤＥＤへの転移を促進した。約２０％の酸性基を含む表面における最初の細胞接着は、培養中２４時間後に、コラーゲンＩ基盤における細胞接着と匹敵した。
【００８３】
ＰＣＰからＤＥＤへの細胞転移は、高濃度のカルボン酸官能基を含む表面で最も高かったが、転移はまた低酸性官能基濃度を有する表面からも観察された。細胞転移は、飽和および不飽和有機酸から沈着されたＰＰを用いて達成された。持続波条件下で、低および高パワーレジメはいずれも、細胞転移を促進するＰＰを産生することができた。パルスされたプラズマもまた、転移を促進するＰＰ表面を製造する経路を提供した。
【００８４】
【表６】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞、好ましくは哺乳動物細胞が接着および増殖し、そして上記接着細胞が表面から脱離することを可能にする表面に関連し、それは様々な治療的および美容組織工学／外科処置に使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
組織工学は、臨床および美容外科の多くの領域に関して密接な関係を有する新興の科学である。より具体的には、組織工学は、組織および／または器官を機能的な状態に戻すための、損傷したおよび／または病的な組織の置換および／または復元（ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ）および／または修復（ｒｅｐａｉｒ）に関連する。例えば、そして制限のためでなく、組織工学は挫傷、または熱傷、または静脈または糖尿病性潰瘍による組織の治癒の失敗の結果として起こる創傷を修復するための皮膚移植片の供給に有用である。さらに、組織工学はまた、関節炎のような変性疾患による関節の置換；様々な環境要因（例えば喫煙、食事）および／または動脈／心臓弁の置換を含む先天的な心疾患の結果としての損傷による冠動脈の置換；臓器移植；消化性潰瘍の修復；骨粗鬆症のような疾患によって起こる骨組織の置換；神経筋疾患または傷害による損傷の結果としての筋肉および神経の置換、および泌尿器科学の疾患を阻止するための膀胱材料の置換の間に実施される。
【０００３】
残念ながら、インビトロで細胞／組織を培養することは、組織工学が直面する問題の一部分のみをあらわす。多くの例で、培養中の細胞の増殖は主な障害ではない。さらにより面倒な問題は、細胞／組織が治療される患者に組み込まれるように、適当なビヒクル（例えば、そして制限のためでなく、培養ウェア（ｃｕｌｔｕｒｅ ｗｅａｒ）、人工器官、移植片、三次元マトリックス支持体、細胞外マトリックスタンパク質をコートした包帯剤（ｄｒｅｓｓｉｎｇ）、包帯、硬膏）を介する細胞／組織の転移である。置換組織の転移に適切なビヒクルは、それらが組織工学で有用である場合、ある必要条件を満たさなければならない。例えば、転移ビヒクルは任意で以下の特徴を有する；
ｉ）それらは細胞がしっかりと接着し得る表面を提供する；
ｉｉ）それらは接着細胞が接着表面に妨害されずに増殖および分裂することを可能にする；
ｉｉｉ）適当な場合、それらは接着細胞の分化（または未分化）状態に影響を与えない接着表面を提供する；
ｉｖ）それらは細胞を滅菌および免疫学的に無症候性状態に維持する；
ｖ）それらは患者に対して最小限に毒性である；
ｖｉ）それらは細菌またはウイルス性疾患を伝達しない；そして
ｖｉｉ）それらは接着細胞が容易に脱離し、そして続いて置換、復元または修復が必要な組織部位に侵入する表面を提供する。
【０００４】
細胞が接着、成長、および培養中で増殖する基板を提供する多くの表面が同定され、そして前述の特徴を発現する細胞型のすぐれた例はケラチノサイトである。
【０００５】
細胞の接着および増殖および成長を支持する好ましい基板はコラーゲンＩであるが、他のものも調査された（１）。例えば、コラーゲン−グリコサミノグリカン（Ｃ−ＧＡＧ）基板に播種または沈着させ、そして熱傷に移植して培養代用皮膚（ＣＳＳ）を形成して、１４−２８日後に永続する皮膚組織に発展した（２）。ケラチノサイトはまた、インビトロで、合成親水性ポリマー支持体上で成長し得る（３）。ケラチノサイトは、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）支持体上に移植され、そしてこれらは再構築されていない表皮および正常ヒト皮膚のサイトケラチンパターンにおいて違いのない、改善した創傷床の治癒を示した（４）。以前の研究が、どのようにカルボン酸含有プラズマコポリマーが７日間ケラチノサイトの接着および増殖を促進するのか示した（５）。
【０００６】
細胞外マトリックスタンパク質の、ヒトケラチノサイトの接着、増殖および皮膚創傷床モデルへの転移に対する影響も研究された（６）。Ｍａｔｒｉｇｅｌ、コラーゲンＩおよびＩＶは、最初の接着を増強し、ＲＧＤ、ビトロネクチン、フィブロネクチン、および照射３Ｔ３線維芽細胞はしないことが見出された。細胞の増殖はまた、ｍａｔｒｉｇｅｌ、コラーゲンＩおよびＩＶ、および照射３Ｔ３線維芽細胞上で積極的に影響される（最初の接着より低い程度であるが）ことが見出された。後者の基板上で増殖するケラチノサイトは、単純なインビトロ創傷床モデルへ転移する能力を維持していた。
【０００７】
限定された表面における細胞の培養は、分化した細胞の課題に的をしぼらなかった。例えば、分化した細胞型の研究に通常使用される線維芽細胞は、培養中でかなりの多形質発現を維持し、そして比較的培養しやすい。対照的に、ケラチノサイトは通常、インビボで基底表皮層（ここでケラチノサイトは、下にある真皮と接着している基底膜と接触している）から上部表皮層へ、上向きに移動しながらプログラムされた分化を受ける。後者の層で、ケラチノサイトは核を失い、そして最終分化を受ける。一旦ある分化のポイントを通過すると、それらは移動または増殖できず、そして主に皮膚のバリア機能を果たす。
【０００８】
培養中のケラチノサイトは、ほとんどの培養条件で最終分化を受け、そして不利な条件には未熟な分化によって反応する。従って、課題は、理想的にはそれ自身は分化を促進せず、そして理想的には適当な培地と共に、ケラチノサイトのような細胞を増殖する表現型に維持し得る表面を確立することである。そこでそれらは接着、そして続いてインビトロ創傷床モデルに転移することが可能である。
【０００９】
組織工学および創傷修復を考える場合、いくつかの異なるアプローチが可能である。現在調査されている製品および可能性のある治療は、一般的に３つのカテゴリーに入る：表皮置換、真皮置換および代用皮膚である。
【００１０】
表皮置換は、シート単独として、またはビヒクルとともに培養したケラチノサイトからなり、そして通常インビトロでコンフルエントになるまで増殖した自己由来（患者自身の）上皮細胞を培養することを含む。「既成の」解決として非自己由来のバージョンが利用可能であるが、非自己由来細胞が適合性である証拠はない。しかし、それらは生物学的包帯として作用し得る。これらの理由のために、非自己由来の製品（ＥｐｉｃｅｌtmおよびＡｃｔｉｃｅｌtm）の臨床的成功は、まちまちであった。調査中の別の製品、Ｌａｓｅｒｓｋｉｎは、ケラチノサイト送達システムとしてヒアルロン酸を使用するが、当業者が使用する場合、そのキャリアを照射３Ｔ３線維芽細胞の層と共にプライムしてケラチノサイトの増殖を促進する。他もまた、インタクトなシートを形成する前のケラチノサイト転移のためのフィルムキャリアを調査している。
【００１１】
真皮置換は、線維芽細胞（およびいくつかの場合には内皮細胞）による浸入、接着、増殖および新マトリックス産生のための、支持構造または埋め込まれたマトリックスを含む。Ｉｎｔｅｇｒａtmは、シリコンで裏打ちしたシート上でコンドロイチン−６−硫酸と架橋したウシ真皮コラーゲンＩの真皮成分を使用する。線維芽細胞および表皮細胞と共に播種された改変体も検討中である。合成マトリックスは３／４週後に分解し、そして分層メッシュ移植の前の新真皮形成を促進する。Ａｌｌｏｄｅｒｍtmは、ドナーの線維芽細胞（スクリーニングした皮膚バンクドナー由来）を含む、凍結乾燥ヒト脱表皮化（ｄｅ−ｅｐｉｄｅｒｍｉｓｅｄ）真皮である。Ｘｅｎｏｄｅｒｍtmは、同様に、ブタ真皮を利用する。それはマトリックスの創傷床への組み込みを可能にし、低い免疫原性を示し、そして宿主細胞との再集合（ｒｅ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を可能にする。他はまた、支持体としてコラーゲンを基にしたポリマー、または合成マトリックスを、実験的創傷に播種されないで（ｕｎｓｅｅｄｅｄ）埋め込まれた場合に細胞内への成長を支持することが示された、ケラチノサイトおよび線維芽細胞の伝達のために開発中である。
【００１２】
現在検討されている最も有望な製品、Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔtmは、同種線維芽細胞と共に播種されたＰＧＡ／ＰＬＡマトリックスを利用する。４週後に埋め込まれたマトリックスの完全な吸収が見られ、そして細胞はコラーゲンＩ−ＩＩＩ−ＶＩ、エラスチン、フィブロネクチン、およびデコリンを沈着させる。播種されないバージョンは、移植片のつきを支持しなかった。この製品の利点は、ケラチノサイトと共に播種された場合、創傷の収縮を遅らせることができることであり、そして非コラーゲン性のマトリックスは免疫原性／ＢＳＥ転移に関連する問題を克服する。
【００１３】
代用皮膚は、真皮および表皮置換を両方組み合わせる。Ａｐｐｌｉｇｒａｆtmは、同種異系の線維芽細胞を播種したコラーゲンＩゲルを同種異系のケラチノサイトのコンフルエントなシートと組み合わせる。真皮病変（ｌｅｓｉｏｎ）における同種異系のケラチノサイトおよび線維芽細胞の長期生存率について疑問があるが、生存能力のある同種細胞が修復過程を促進し得る生物学的メディエーター（例えば成長因子）を伝達し得ることが可能である。
【００１４】
創傷治癒システムを提供する上記の解決（患者組織、すなわち自己組織由来の材料を使用するもの以外）は、感染性薬剤を寄付供給源から治療される患者へ転移させる可能性に悩むことが、当業者に明らかである。さらに、異種移植は依然として、組織工学においてヒト組織の使用の代替として、一般社会による一般的な受け入れが必要である。
【００１５】
創傷の前治療、マトリックス支持体の選択（細胞増殖のための）、および同種異系の細胞の使用に関するいくつかの問題はまた完全に解決されていないが、創傷修復に対する組織工学アプローチは、存在する治療に比べて有意な治療的有用性を示すことに疑いはほとんどない。上記の記述から、ケラチノサイトは組織工学で使用する組織の研究にすぐれたモデルシステムを提供することが明らかである。しかし、組織工学が直面する最も重要な問題は、細胞／組織の培養および患者への転移のために理想的なビヒクルの、全ての必要条件を満たし得る基板の供給である。
【００１６】
細胞培養ウェアおよび生物学的移植片またはビヒクルは、典型的には細胞の接着、成長および増殖を可能にするポリマーから製造、またはそれでコートされる。多くの場合、その基板／ビヒクルが培養細胞／組織を埋め込む手段として使用される場合、それと結合して使用される埋め込みマトリックスは生物分解性であり得る（第ＷＯ９０／１２６０３号を参照のこと）。さらに、細胞の接着および増殖を促進する基板の処理は、上記分野で周知である。例えば第ＷＯ８９／０２４５７号および第ＷＯ９０／０２１４５号は、細胞の接着を促進する表面の化学的修飾を開示している。第ＷＯ８９／０２４５７号は、ポリテトラフルオロエチレン（Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）tm）および他のフルオロカーボンポリマーの化学的修飾およびその内皮細胞培養における使用に関連する。第ＷＯ９０／０２１４５号は、細胞／組織培養に使用する様々な型の基板をコートするのに使用する、中和されたパーフルオロ−３，６−ジオキサ−４−メチル−７−オクテンスルホニルフッ化物のコポリマーおよびモノマーテトラフルオロエチレンの使用を記載している。
【００１７】
米国特許第４，９１９，６５９号は、細胞が接着および増殖する表面をコートするための、プラズマ重合可能ガス（例えば、アセトン、メタノール、エチレンオキシド）の使用を記載している。コートした表面は、増強されたフィブロネクチン（細胞接着ポリペプチド）の結合を示し、そして従って処理表面への細胞の接着を促進する。このように処理した表面は、生物学的移植片および細胞培養ウェアのための品物を提供するのに有用である。典型的には、ポリエステル、ポリテトラフルオロエチレンまたはポリウレタンのような材料を、プラズマ重合ガスでコートし、そして次いでフィブロネクチンと接触させる。フィブロネクチン吸着表面は、コントロール表面と比べた場合、増強されたマウス３Ｔ３細胞の接着を示す。
【００１８】
プラズマは通常電場によって活性化されたイオン化ガスである。それらはイオン、電子、中性のもの（ｎｅｕｔｒａｌｓ）（ラジカル、準安定のもの、基底および励起状態の種）および電磁放射を含む、高度に反応性の化学的環境である。減圧下でレジメが達成され得、ここで電子の温度はイオンおよび中性のものの温度と実質的に異なる。このようなプラズマは、「コールド」または「非平衡」プラズマと呼ばれる。そのような環境において、多くの揮発性有機化合物（ニート、または他のガス（例えば、Ａｒ）と共に）は、重合化してプラズマおよびその放電の下流と接触して両方の表面をコートすることが示された（Ｈ．Ｋ．Ｙａｓｕｄａ、Ｐｌａｓｍａ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８５）。その有機化合物は、多くの場合「モノマー」と呼ばれる。沈着物は多くの場合「プラズマポリマー」と呼ばれる。そのような重合の様式の利点は、以下のものを含む：超薄層のピンホールのないフィルム沈着；プラズマポリマーは広い範囲の基板に沈着し得る；その過程は溶媒を含まず、そしてプラズマポリマーは夾雑物を含まない。
【００１９】
本発明者らは、細胞／組織培養に使用するのに適当な基板をコートするための、プラズマポリマー沈着を開発した（５、７、８）。薄いポリマーフィルムは揮発性有機化合物のプラズマから得ることができる（１０-2ｍｍｂａｒの減圧下、そして理想的には＜１００℃）。プラズマポリマー沈着において、一般的に出発化合物またはイオン化ガスの広範囲のフラグメンテーションおよび広い範囲の得られたフラグメントが存在し、または官能基が望ましくなく沈着に組み込まれる。本発明者らは、低いプラズマ入力パワー（低いプラズマパワー／モノマー流速比）を採用することによって、高い程度の官能基保持を有するフィルムを作ることが可能であることを示した。そのような低いパワー／速度比の例は、２Ｗ／２．０ｓｃｃｍである。しかし、他の比較的低い比が使用され得、そして当業者に公知である。
【００２０】
これはアクリル酸に関して示された（９）。炭化水素（例えば１，７−オクタジエン）とアクリル酸の共重合は、得られたプラズマコポリマー（ＰＣＰ）における表面官能基の濃度に対してある程度のコントロールを可能にする（７）。ＰＣＰは、ジオメトリーに関係なくほとんどの表面に直接沈着し得、これはＰＣＰを、ガーゼおよび線維、ならびに細胞培養のためのプラスチックウェアのような表面を処理するのに理想的にさせる。これは明らかに、ＰＣＰを臨床的適用のために有用にする。ここで細胞は、創傷床または組織修復／復元の部位へ適用する前に、ＰＣＰでコートした２次元または３次元支持体上で増殖し得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、プラズマポリマー／コポリマーでコートした表面上でヒトケラチノサイトを培養した。低いパワー／モノマー流速比の使用は、酸を含むモノマー（この例ではアクリル酸）の酸性官能基が、プラズマ−ガスからプラズマポリマー／コポリマー沈着までほとんど完全に保存される（保持される）プラズマポリマー／コポリマーを産生する。これらの沈着は他の官能基（例えば、後プラズマ酸化によって起こるヒドロキシル基）を含むが、「高酸性官能基」と記載され、プラズマガスからプラズマポリマーフィルムまでの高い程度の酸保持の程度を反映する。「高酸性官能基」は、酸を含むモノマー／炭化水素の共重合化比に依存する、プラズマポリマー／コポリマー中の酸性官能基の量（濃度／密度）をいわない。
【００２２】
これらの表面上で培養したケラチノサイトは、未分化の状態で接着、成長、および増殖するだけでなく、表面から脱離してそして創傷床モデルに転移する。この方法でケラチノサイトの転移を促進する表面は、創傷治癒の分野で非常に有望であることを示す。本発明者らは、これらの好ましい特徴を、本発明者らの処理表面の高酸性官能基および細胞の脱離を促進する接着表面の性質に帰する。
【００２３】
本明細書中における高酸性官能基への言及は、５−２０％の表面酸性官能基、およびより理想的には２０％より多い表面酸性官能基の量を有する表面を含むよう意図される。そのパーセンテージは、この型の環境における炭素原子のパーセントをいう。例えば、２０％の酸性官能基は、プラズマポリマー中１００個の炭素中２０個が酸性型環境にあることを意味する。
【００２４】
本発明の最初の局面によって、少なくとも１つの細胞が放出可能に接着し得、そして高酸性官能基を有する少なくとも１つの細胞培養表面が提供される。
【００２５】
本明細書中において、高酸性官能基への言及は、５−２０％の間または２０％より多い表面酸性官能基を含む表面に関連する。
【００２６】
接着表面における酸性官能基は、増強された細胞の接着を引き起こすことが当業者に明らかである（５、７、１０−１２）。本発明者らは、低いプラズマパワー／モノマー流速比における細胞培養表面のプラズマ重合が、ポリマーでコートされた表面における高酸性官能基の保持を生じることを見出した。１００％のアクリル酸で処理した細胞培養表面で培養された細胞は、増強された処理表面からの脱離を示し、それによって脱上皮化（ｄｅ−ｅｐｉｄｅｒｍｉｓｅｄ）真皮（ＤＥＤ）のケラチノサイトの浸透を促進する。１００％のアクリル酸から産生されたプラズマポリマーは、細胞接着のために最適な酸性官能基の割合を含まないかもしれない。しかし、アクリル酸と炭化水素のプラズマ共重合（例えば、そして制限のためでなく、１，７−オクタジエン）は、沈着過程に対してある程度のコントロールを可能にし、およびケラチノサイトが接着、増殖、およびそれから脱離する表面の供給を可能にする。典型的には、モノマーフロー中５０％を超えるアクリル酸で処理した細胞培養表面は、使用した酸の濃度に依存して、５−２１％の間の酸性官能基を有するプラズマポリマー表面を産生する。例えば、１００％のアクリル酸で処理した表面は、約２１％の酸性表面官能基を産生する。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態では、上記表面は、少なくとも１つの細胞が成長および増殖し得る基板を提供する。好ましくは、上記表面は、上記細胞の成長および増殖を未分化状態で促進する。あるいは、上記表面は、組織の型に依存して、上記細胞の成長および増殖を分化状態において促進する。
【００２８】
本発明のなおさらなる好ましい実施形態では、上記表面は、それに接着する細胞に免疫反応を誘発せず、その結果これらは、患者に伝達された場合に、免疫反応を引き起こさない。
【００２９】
本発明のなおさらなる好ましい実施形態では、上記表面は、最低限の患者毒性を有し、そしてそのためそれに接着した細胞が患者に伝達される場合、好ましくない反応を誘発しない。
【００３０】
本発明のなおさらなる好ましい実施形態では、上記表面は、哺乳類由来の細胞、そしてより好ましくはヒト由来の細胞とともに使用するのに適当である。
【００３１】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、上記表面は、以下の細胞型のいずれか１つと共に使用するのに適当である；ケラチノサイト；軟骨細胞；骨芽細胞；内皮細胞。理想的には、上記細胞はケラチノサイトである。
【００３２】
本発明のなおさらなる好ましい実施形態では、上記表面酸性官能基は、カルボン酸官能基によって提供される。
【００３３】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、上記表面酸性官能基は、少なくとも５％、そしてより通常には５〜２０％の間の表面酸性官能基である。より理想的には、まだ上記表面酸性官能基は、２０％より多い。理想的には上記酸性官能基は、アクリル酸によって提供される。あるいは、上記酸性官能基は、プロピオン酸によって提供される。
【００３４】
本発明のなおまたさらなる好ましい実施形態では、典型的には上記表面は、基板を酸性モノマーのプラズマコポリマーでコートすることによって提供される。例えば、そして制限のためでなく、アクリル酸および炭化水素、例えば、そして制限のためでなく、１，７−オクタジエンである。理想的には、アクリル酸は、５０〜１００％で提供され、そして１，７−オクタジエンはガスフィード中で０〜５０％で提供される。
【００３５】
本発明の細胞培養表面は、例えば、そして制限のためでなく、急性および／または慢性および／または軽度のおよび／または重度の皮膚創傷（静脈および糖尿病性潰瘍を含む）；および／または軟骨修復；および／または骨修復；および／または筋肉修復；および／または神経修復；および／または結合組織修復；および／または血管修復；および／または膀胱修復に対する適用の前に、コートした基板上で細胞が増殖し得る臨床的適用に有用であることが、当業者に明らかである。本発明はまた、組織工学ビヒクルの不可欠の部分として上記表面を提供することによって、任意の前述の細胞培養表面を提供する。
【００３６】
本発明の２番目の局面に従って、組織工学で使用するビヒクルが提供され、ここで上記ビヒクルは、上記表面が高酸性官能基を有することで特徴付けられる、少なくとも１つの細胞が可逆的に接着し得る細胞培養表面と一体化、またはそれに適用される。
【００３７】
ビヒクルは、本発明によって表面で培養された細胞を組織工学で使用し得る、あらゆる構造として定義され得る。例えば、そして制限のためでなく、人工器官、移植片、マトリックス、ステント、細胞培養皿、ガーゼ、包帯、硬膏、生物分解性マトリックスおよびポリマーフィルム。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態では、選択された細胞が接着する本発明による表面を含む治療的ビヒクルが提供される。ここで上記治療的ビヒクルは、治療的組織工学を必要とする患者に適用および／または埋め込むために適合させられる。
【００３９】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、外科的埋め込み処置で使用するために細胞が接着した本発明による表面を含むマトリックス材料（例えば、そして制限のためでなく、合成または天然に存在する、および長期間有効な、または生物分解性のマトリックス材料）を含む治療的ビヒクルが提供される。
【００４０】
本発明のなおまたさらなる好ましい実施形態では、上記ビヒクルは以下の細胞型のいずれか１つと共に使用するのに適当である：ケラチノサイト、軟骨細胞、骨芽細胞、内皮細胞、尿路上皮細胞、上皮細胞。
【００４１】
本発明のなおさらなる好ましい実施形態では、上記治療的ビヒクルはケラチノサイトを含む。
【００４２】
本発明の第３の局面によって、美容組織工学で使用するための、本発明の任意の局面または実施形態による細胞培養表面を含む美容ビヒクルが提供される。
【００４３】
本発明の第４の局面によって、本発明の任意の以前の局面または実施形態による表面を調製する方法が提供され、この方法は以下を包含する：
ｉ）選択された比の酸を含むモノマーおよび炭化水素をガスフィード中で混合する工程；
ｉｉ）この混合物のプラズマを産生する工程；および
ｉｉｉ）適当な基板をこのプラズマでコーティングして高酸性官能基を保持する表面ポリマー／コポリマーを提供する工程。
【００４４】
プラズマの産生は、低いかまたは高いパワーのいずれか、そして持続波またはパルスプラズマのいずれかを使用し得ることが、当業者に明らかである。
【００４５】
好ましくは、このプラズマパワーは０〜５０Ｗのプラズマパワーおよび０〜２０ｓｃｃｍの流速を用いて、通常は持続波条件下で産生される。しかし、パルス波が使用される場合、当業者に公知であるようにプラズマパワーおよび流速について対応する補正が行われる。
【００４６】
本発明の好ましい方法では、酸はアクリル酸であり、そして炭化水素はジエン、そして特にジ−不飽和アルケン、例えば１，７−オクタジエンである。
【００４７】
本発明のさらなる好ましい方法では、プラズマはガスフィード中に５０〜１００％の不飽和酸（例えばアクリル酸）、および０〜５０％のヘキサンまたはジエン（例えば１，７−オクタジエン）を含む。
【００４８】
本発明のなおさらなる好ましい実施形態では、プラズマは、ガスフィード中に以下の比；
酸（例えばアクリル酸）％ アルケン（例えば１，７−オクタジエン）％
５０ ５０
６０ ４０
７０ ３０
８０ ２０
９０ １０
１００ ０
の酸（例えばアクリル酸）およびヘキサンまたはジエン（例えば１，７−オクタジエン）を含む。
本発明は例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）少なくとも１つの細胞が放出可能に接着し得る細胞培養表面であって、該表面は、高酸性官能基を有する、細胞培養表面。
（項目２）前記表面が、少なくとも１つの細胞が成長および増殖し得る基板を提供する、項目１に記載の細胞培養表面。
（項目３）前記表面は、前記細胞の成長および増殖を未分化状態で促進する、項目１または２に記載の細胞培養表面。
（項目４）前記表面は、前記細胞の成長および増殖を分化状態において促進する、項目１または２に記載の細胞培養表面。
（項目５）前記表面は、それに接着する細胞に免疫反応を誘発しない、項目１〜４のいずれかに記載の細胞培養表面。
（項目６）前記表面は、最低限の患者毒性を有する、項目１〜５のいずれかに記載の細胞培養表面。
（項目７）前記表面が哺乳類起源の細胞と使用するのに適当である、項目１〜６のいずれかに記載の細胞培養表面。
（項目８）前記哺乳類細胞がヒトである、項目７に記載の細胞培養表面。
（項目９）前記表面が以下の細胞型のいずれか１つと使用するのに適当である、項目１〜８のいずれかに記載の細胞培養表面：ケラチノサイト；軟骨細胞；骨芽細胞；内皮細胞；尿路上皮細胞；上皮細胞。
（項目１０）前記細胞型がケラチノサイトである、項目９に記載の細胞培養表面。
（項目１１）前記表面の酸性官能基がカルボン酸によって提供される、項目１〜１０のいずれかに記載の細胞培養表面。
（項目１２）カルボン酸のプラズマ重合によって得られる細胞培養表面。
（項目１３）前記表面の酸性官能基が５〜２０％の間の酸性官能基である、項目１〜１２のいずれかに記載の細胞培養表面。
（項目１４）前記表面の酸性官能基が２０％より多い酸性官能基である、項目１〜１２のいずれかに記載の細胞培養表面。
（項目１５）前記酸性官能基がプロピオン酸によって提供される、項目１〜１４のいずれかに記載の細胞培養表面。
（項目１６）前記酸性官能基がアクリル酸によって提供される、項目１〜１４のいずれかに記載の細胞培養表面。
（項目１７）前記表面が、酸含有モノマーのプラズマコポリマーで基板をコーティングすることによって提供される、項目１〜１６のいずれかに記載の細胞培養表面。
（項目１８）前記コポリマーがアクリル酸および炭化水素の混合物である、項目１７に記載の細胞培養表面。
（項目１９）前記炭化水素が１，７−オクタジエンである、項目１８に記載の細胞培養表面。
（項目２０）ガスフィード中でアクリル酸が５０〜１００％で提供され、そして１，７−オクタジエンが０〜５０％で提供される、項目１８または１９に記載の細胞培養表面。
（項目２１）項目１〜２０のいずれかに記載の細胞培養表面を含む、組織工学において使用するためのビヒクル。
（項目２２）項目２１に記載のビヒクルであって、該ビヒクルが、選択された細胞が接着する項目１〜２０のいずれかに記載の細胞培養表面を含む治療的ビヒクルであり、該治療的ビヒクルが、治療的組織工学を必要とする患者に適用および／または埋め込むために適合させられる、ビヒクル。
（項目２３）前記治療的ビヒクルがマトリックス材料を含み、そして、前記細胞が外科的埋め込み処置で使用するためのものである、項目２２に記載の治療的ビヒクル。
（項目２４）項目２２または２３に記載の治療的ビヒクルであって、該ビヒクルが以下の細胞型のいずれか１つと共に使用するのに適当である：ケラチノサイト、軟骨細胞、骨芽細胞、内皮細胞、尿路上皮細胞、上皮細胞。
（項目２５）項目１〜２０のいずれかに記載の細胞培養表面を含む美容ビヒクル。
（項目２６）項目１〜２０のいずれかに記載の細胞培養表面を調製する方法であって、以下：
ｉ）酸を提供する工程；
ｉｉ）該酸のプラズマを産生する工程；および
ｉｉｉ）基板を該プラズマでコーティングして、高い酸性官能基を有する表面ポリマーを提供する工程
を包含する、方法。
（項目２７）前記酸がアクリル酸またはプロピオン酸である、項目２７に記載の方法。
（項目２８）項目１〜２０のいずれかに記載の細胞培養表面を調製する方法であって、以下：
ｉ．ガスフィード中で選択された比の酸を含むモノマーおよび炭化水素を混合する工程；
ｉｉ．該混合物のプラズマを産生する工程；および
ｉｉｉ．適当な基板を該プラズマでコーティングして、高い酸性官能基を有する表面ポリマー／コポリマーを提供する工程、
を包含する、方法。
（項目２９）前記プラズマが０〜５０Ｗのプラズマパワーおよび０〜２０ｓｃｃｍの流速を用いて持続波条件下で産生される、項目２６〜２８のいずれかに記載の方法。
（項目３０）前記プラズマがパルス波条件を用いて産生される、項目２６〜２８のいずれかに記載の方法。
（項目３１）前記酸がアクリル酸であり、そして前記炭化水素が１，７−オクタジエンである、項目２８〜３０のいずれかに記載の方法。
（項目３２）前記プラズマが前記ガスフィード中で５０〜１００％のアクリル酸および０〜５０％の１，７−オクタジエンを含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）前記プラズマが以下の比：
アクリル酸％ １，７−オクタジエン％
５０ ５０
６０ ４０
７０ ３０
８０ ２０
９０ １０
１００ ０
のアクリル酸および１，７−オクタジエンを含む、項目３１に記載の方法。
（項目３４）前記プラズマが以下の比：
酸％ 炭化水素％
５０ ５０
６０ ４０
７０ ３０
８０ ２０
９０ １０
１００ ０
の酸および炭化水素を含む、項目２８に記載の方法。
【００４９】
本発明の実施形態が、例示のみによって、そして以下の表および図への参照と共にここで記載される；
表１は、アクリル酸および１，７−オクタジエンから形成されたＰＣＰのＸＰＳ結果のまとめを示す；
表２は、プロピオン酸から調製したＰＰのＸＰＳ結果のまとめを示す；
表３は、パルス（ｐｕｌｓｅｄ）アクリル酸から調製されたＰＰのＸＰＳ結果のまとめを示す；
表４は、高パワーアクリル酸から調製されたＰＰのＸＰＳ結果のまとめを示す；
表５は、接触して４日後の、種々の表面のＤＥＤに対する接着を示す。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、種々の表面へのケラチノサイトの接着を示す。
【図２】図２は、高パワーアクリル酸、パルスアクリル酸、およびプロピオン酸の表面へのケラチノサイトの接着を示す。
【図３】図３は、転移後のＤＥＤにおけるケラチノサイト保持の測定である。
【図４ａ】図４ａは、ＤＥＤとの接触から４日後の、コラーゲンＩ、キャリアおよび炭化水素の表面からＤＥＤへのケラチノサイト転移による染色を示す。
【図４ｂ】図４ｂは、ＤＥＤとの接触から４日後の、酸を含む表面からＤＥＤへのケラチノサイト転移による染色を示す。
【図５】図５は、ＤＥＤとの接触から４日後の、パルスアクリル酸表面からＤＥＤへのケラチノサイト転移による染色を示す。
【図６】図６は、ＤＥＤとの接触から４日後の、プロピオン酸表面からＤＥＤへのケラチノサイト転移による染色を示す。
【図７】図７は、ＤＥＤとの接触から４日後の、高パワーアクリル酸表面からのケラチノサイト転移による染色を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
（材料および方法）
（プラズマ共重合）
アクリル酸および１，７−オクタジエンおよびプロピオン酸を、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ＵＫ）から得た。全てのモノマーは、数回の凍結−ポンプ／解凍サイクルの後、一般に認められたように使用した。２段階回転ポンプによって排出される円筒形の反応容器（直径８ｃｍおよび長さ５０ｃｍ）で重合を行った。プラズマを、反応容器に誘導的に連結した無線周波数（１３．５６ＭＨｚ）シグナル発生器および増幅器によって維持した。反応器中の基礎圧は３×１０-3ｍｂａｒであった。
【００５２】
アクリル酸および１，７−オクタジエンを、２Ｗのプラズマパワーおよび２．０ｓｃｃｍの全流速で共重合した。プラズマコポリマーを、キャリアポリマー、ポリヒドロキシブチレート（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）および清潔なアルミホイル（ＸＰＳ分析のために）に沈着させた。共重合中の圧は、典型的には４．０×１０-2ｍｂａｒであった。プロピオン酸を沈着させるためのさらなる重合を、同じ条件を用いて行った。それに加えて、アクリル酸を、パルスプラズマ条件を用いて沈着させた。プラズマパワーは５０Ｗであり、５ｍｓのプラズマオンタイムおよび４０ｍｓのプラズマオフタイムのデューティーサイクルを用いた。モノマー流速は２．０ｓｃｃｍであった。最後に、アクリル酸を持続波高パワー条件下で沈着させた。使用したパワーは７．５Ｗ、流速２．０ｓｃｃｍであった。
【００５３】
全ての共重合に関して、２０分の沈着時間を用いた。プラズマをスイッチオフした後、モノマー混合物を、さらに２０分間流れさせた。これは、研究室の大気に曝露された時に沈着による大気酸素の取り込みを最低限にするために行った。
【００５４】
（Ｘ線光電子分光学）
ＸＰスペクトルを、ＭｇＫαＸ線を採用するＶＧ ＣＬＡＭ２光電子分光計で得た。各試料についての調査スキャンスペクトル（０〜１１００ｅＶ）および狭スペクトル（ｎａｒｒｏｗ ｓｐｅｃｔｒａ）を、それぞれ５０および２０ｅｖの分析器通過エネルギーを用いて得た。スペクトルをＳｐｅｃｔｒａ６．０ソフトウェア（Ｒ．Ｕｎｗｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｃｈｅｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を用いて得た。続く処理を、Ｓｃｉｅｎｔａデータ処理ソフトウェア（Ｓｃｉｅｎｔａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて行った。分光計を、８４．００ｅＶにおけるＡｕ４ｆ７／２ピークポジション、および３９７．２ｅＶで測定したＰＴＦＥの試料中のＣｌｓとＦｌｓとの間のピークポジションの分離を用いて較正した。これはＢｅａｍｓｏｎおよびＢｒｉｇｇｓ（１３）によって報告された３９７．１９ｅＶの値とよく匹敵する。
【００５５】
（細胞培養）
正常ヒト成人ケラチノサイト（乳房整復および腹壁形成術から得た）を、以前に記載されたように（１４）真皮／表皮接合部から単離した。細胞を完全Ｇｒｅｅｎ培地で培養した。これはコレラ毒素（０．１ｎＭ）、ヒドロコルチゾン（０．４μｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、アデニン（１．８×１０-4Ｍ）、トリヨード−ｌ−チロニン（２×１０-7Ｍ）、インスリン（５ｍｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）、グルタミン（２×１０-3Ｍ）、ファンギゾン（０．６２５μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１０００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１０００μｇ／ｍｌ）および１０％胎児ウシ血清を含んでいた。細胞を３７℃、５％ＣＯ2雰囲気で培養した。全細胞計測および生存能力のある細胞の数を、トリパンブルー染色および標準的な血球計算器箱（ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）を用いて決定した。
【００５６】
細胞培養実験のために新しく単離した細胞のみを使用した。コラーゲンでコーティングしたキャリアポリマー試料を、０．１Ｍの酢酸（２００μｇ／ｍｌ）中のコラーゲンＩ溶液（３２μｇ／ｃｍ2）を、層流キャビネット中で一晩空気乾燥させることによって調製した。
【００５７】
細胞を、１２．０×１０6細胞／ｍｌの密度で、６ウェル組織培養皿中で試料を平らに保つために直径１０ｍｍのステンレススチール環を用いて、３組の表面に播種した。培養２４時間後、各３組からの１つの試料におけるケラチノサイトの接着を、ＭＴＴ−ＥＳＴＡアッセイ（１５）を用いて決定した。これは、生存可能な細胞数を見積もり、以前にヒトケラチノサイトの細胞数の増加と相関することを示したアッセイである（１６）。細胞をＰＢＳ中０．５ｍｇ ｍｌ-1のＭＴＴで４０分間インキュベートした。染色を次いで酸性化イソプロピルアルコールで溶出した。次いで光学密度測定を５４０ｎｍで、６３０ｎｍのタンパク質参照波長を引いて行った。
【００５８】
各３組の残る２つの試料を、ＤＥＤと接触させて置き、表面が空気／液体界面にくるようにＧｒｅｅｎ培地を加えた。ＤＥＤ／表面創傷床モデルを３７℃のインキュベーターに４日間置き、その後表面をＤＥＤから分離して、そして表面からＤＥＤへの細胞転移のレベルを、上記で記載したようにＭＴＴアッセイを用いて評価した。ＤＥＤのＭＴＴは、染色の溶出の前にＤＥＤをＭＴＴと１２０分間インキュベートすることを必要とした。
【００５９】
（結果）
（ＸＰＳ特徴付け）
アクリル酸および１，７−オクタジエンから調製したＰＣＰのＸＰ調査スキャンスペクトルは、沈着物における炭素および酸素のみを示した。Ｏ／Ｃ比を表１に示す。Ｏ／Ｃ比はモノマーフィード中のアクリル酸のモル画分が増加するにつれて増加した。ＰＣＰのＣｌｓコアレベルスペクトルを、様々な酸素を含む官能基に関してピークフィット（ｐｅａｋ ｆｉｔｔｅｄ）させた。最初に、炭化水素シグナルを２８５ｅＶにセットして試料荷電に関してスペクトルを補正した。次いで以下の官能基をフィットさせた：＋１．５ｅＶのシフトでアルコール／エーテル（Ｃ−ＯＨ／Ｒ）；＋３．０ｅＶでカルボニル（Ｃ＝Ｏ）；＋４．０ｅＶでカルボン酸／エステル（ＣＯＯＨ／Ｒ）；および＋０．７ｅＶでカルボキシレートに結合したβシフトした炭素（Ｃ−ＣＯＯＨ／Ｒ）。ピークフィッティングの結果および例のピークフィット（Ｆaa／Ｆtot＝１）を表１に示した。ピークフィットにおいて成分ピークのＦＷＨＭを等しく保ち、そしてそれは１．４〜１．６ｅＶの範囲であった。成分ピークのＧａｕｓｓｉａｎ対Ｌｏｒｅｎｔｚｉａｎ比（Ｇ／Ｌ比）も一定に保ち、そしてそれは０．８〜０．９の範囲であった。ＸＰＳはカルボン酸とエステル基との間を区別できないが、プラズマ重合アクリル酸のかすめ角赤外分光学は、この研究で採用された低パワーでは、ＸＰスペクトルのカルボキシレートピークは、エステルよりもむしろカルボン酸に割り当てられ得ることを示した（１０）。ＰＣＰに存在する他の炭素−酸素官能基としては（カルボン酸以外に）、カルボニルおよびアルコール／エーテルが挙げられる。これらは、プラズマにおけるモノマーのフラグメンテーションの結果として起こる。沈着物と水との間の反応がプラズマ容器の壁から脱着し（重合中）、そして大気酸素および水（重合後）もまた寄与する。Ｃ−ＯＨ／Ｒピークは、主にヒドロキシル基であると考えられる。以前の研究で、本発明者らは、アクリル酸／１，７−オクタジエンのＰＣＰ（モノマーフィード中アクリル酸の様々なモル画分を用いて調製した）における酸素を含む官能基の同一性について、より詳しく調査した（１１）。この研究に基づいて、本発明者らは、ＰＣＰ表面において、ケラチノサイトはＣ−ＯＨでなくカルボン酸官能基に対して反応すると考える。Ｃ−ＯＨは、細胞接着を促進するためには高い濃度（２５％）で存在しなければならない（８）。
【００６０】
ｉ）プロピオン酸の持続波沈着、ｉｉ）パルスアクリル酸、およびｉｉｉ）高パワーアクリル酸からのＸＰスペクトルもまた、沈着中に炭素および酸素のみを示し、そして上記でアクリル酸について概略を述べた同じ基準を用いてフィットさせた。プロピオン酸、パルスアクリル酸、および高パワーアクリル酸に関するカーブフィッティングの結果をそれぞれ表２、３、および４に示す。本発明者らの研究室におけるパルスプラズマの以前の研究に基づいて、パルスプラズマにおけるより低いデューティーサイクル（ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ）が、より高いカルボキシル保持の値を産生することが予期される（２１）。表１および４を比較することによって、プラズマパワーの増加は、約５０％のカルボキシル官能基保持の低下、およびアルコール／エーテルおよびカルボニル官能基の対応する増加をもたらすことが明らかである。
【００６１】
表１ アクリル酸および１，７−オクタジエンから調製したＰＣＰについてのＸＰＳ結果のまとめ
Ｃｌｓコアレベルにおける官能基％
【００６２】
【表１】
カルボキシレートと同じ大きさの、カルボキシレートに結合したβシフト炭素（炭化水素由来の＋０．７ｅＶにおける（Ｃ−ＣＯＯＨ／Ｒ））をピークフィットに加えた。
【００６３】
表２ プロピオン酸から調製したＰＰについてのＸＰＳ結果のまとめ
Ｃｌｓコアレベルにおける官能基％
【００６４】
【表２】
カルボキシレートと同じ大きさの、カルボキシレートに結合したβシフト炭素（炭化水素由来の＋０．７ｅＶにおける（Ｃ−ＣＯＯＨ／Ｒ））をピークフィットに加えた。
【００６５】
表３ アクリル酸のパルスＰＰについてのＸＰＳ結果のまとめ
Ｃｌｓコアレベルにおける官能基％
【００６６】
【表３】
カルボキシレートと同じ大きさの、カルボキシレートに結合したβシフト炭素（炭化水素由来の＋０．７ｅＶにおける（Ｃ−ＣＯＯＨ／Ｒ））をピークフィットに加えた。
【００６７】
表４ 高パワーアクリル酸のＰＰに関するＸＰＳ結果のまとめ
Ｃｌｓコアレベルにおける官能基％
【００６８】
【表４】
カルボキシレートと同じ大きさの、カルボキシレートに結合したβシフト炭素（炭化水素由来の＋０．７ｅＶにおける（Ｃ−ＣＯＯＨ／Ｒ））をピークフィットに加えた。
【００６９】
（表面における細胞接着）
全ての表面に関して、ケラチノサイトの単離後、血球計算器を用いて細胞計測を行った。それは９７％の細胞生存（２．５×１０7全細胞）を示した。２４時間後に表面を、ＭＴＴアッセイを用いて調査した。
ｉ）アクリル酸／１，７−オクタジエン
結果を図１に示す。データは、モノマーフロー中５０％および１００％のアクリル酸で調製した酸含有表面は、コラーゲンＩよりわずかによく機能したことを示す。フロー中２５％の酸で作成した表面はＴＣＰＳに匹敵したが、炭化水素表面におけるケラチノサイトの接着は不十分であった。
【００７０】
（ｉｉ）プロピオン酸、高パワーアクリル酸、パルスアクリル酸）
結果を図２に示す。全ての表面に対して細胞が接着したが、コラーゲンＩが最も高いレベルの接着を示した。細胞接着のレベルは表面からＤＥＤへのその後の転移の程度についての予測変数ではないが、異なる前駆体モノマーおよび／またはプラズマ条件を用いて産生した表面が、ケラチノサイトの接着を支持することを記載することは重要である。細胞接着は明らかに、続く転移が成功するための必要条件である。
【００７１】
（ＤＥＤへの細胞の転移）
表５は、キャリアポリマー表面をＤＥＤから分離した結果をまとめる。コラーゲンＩ表面およびガスフロー中１００％で調製した表面は、ＤＥＤによく接着し、ケラチノサイトの表面からＤＥＤへの実質的な転移が起こったことを示す。モノマーフロー中より少ない量の酸を含有する表面は、よりよく接着しなかったが、キャリアおよび炭化水素表面は容易にＤＥＤからはがれ、より低い程度の細胞転移が起こったことを示す。
【００７２】
【表５】
表面およびＤＥＤの並置から４日後、２つを分離し、そして図２は表面におけるＭＴＴアッセイの結果を示し、そして図３はＤＥＤにおけるＭＴＴアッセイを示す。表面に残る細胞の光学密度は、ＤＥＤに転移した細胞でみられるものと比べて、全ての場合で非常に低かった。コラーゲンＩ上で増殖した細胞は、ＤＥＤへの転移に関して調査した場合最も高い値を示し、キャリア単独でみられるものよりも約４倍高かった。２５％の酸で処理した表面で増殖した細胞について、転移は、キャリア単独で増殖した細胞でみられるものと同程度であった。しかし、５０％および１００％の酸で処理した表面で増殖した細胞は、有意に高いＤＥＤへの転移を示した。炭化水素で処理した表面で増殖した細胞は、非常に低いＤＥＤへの転移しか示さなかった。
【００７３】
アクリル酸／１，７−オクタジエンＰＰからＤＥＤへのケラチノサイト転移の写真の証拠を図４ａおよび図４ｂに示す。炭化水素（１，７−オクタジエン）およびキャリア（ｂｉｏｐｏｌ）表面は染色されないが、コラーゲンＩおよび酸を含む表面は、ＤＥＤ上のケラチノサイトによる特徴的な紫の染色を示す。図５は、パルスアクリル酸ＰＰからの細胞転移によるＤＥＤ染色を示す。図６は、プロピオン酸ＰＰを用いた同じ結果を示す。図７に示したのは、高パワーアクリル酸ＰＰ（不織布に沈着）からの転移によるＤＥＤ染色である。
【００７４】
（考察）
この研究の目的は、この研究室からの以前の研究を発展させることである。それは、ケラチノサイトの接着および増殖のためのＰＣＰ表面の使用を開示したが、これらの細胞のＤＥＤへの転移を扱わなかった。ケラチノサイトは、多くの基盤上で不可逆的な最終分化を受けるので、そのような研究に特に難題となる。そのような細胞は、移動またはコロニーを形成する能力−再上皮形成を達成するためにケラチノサイトの支持表面から創傷床への転移を考える時に必要な特性を失う。したがって、本発明者らの目的は、接着を促進する表面が、単純なインビトロ創傷モデルにおいて細胞の転移を促進する程度を調査することである。
【００７５】
ヒトケラチノサイトを、様々な濃度のカルボン酸基を含むＰＣＰ表面でうまく培養した。接着した細胞の数は、ケラチノサイト培養の好ましい基盤であるコラーゲンＩ上での細胞の能力に匹敵した。
【００７６】
以前の研究がＴＣＰＳのコントロールとしての安定性に疑いを生じさせたので、炭化水素プラズマポリマーをネガティブコントロールとして使用することが重要である（１７）。これらの心配は、製造中にＴＣＰＳに与えられる表面処理のために生じた。それは、表面における酸化レベルに依存して、ＴＣＰＳを水性溶液に対して不安定にし得る。異なるバッチのＴＣＰＳが正確に同じ量の表面酸化を受けるかどうか、またはこの表面酸化が経年変化を受けやすいかどうかは不明である。
【００７７】
細胞接着の官能基濃度に対する依存性はまだ完全に調査されていないが、ケラチノサイトは以前に、低い２〜３％量の酸性官能基を有する表面上で接着が増強されることが示された（１１）。しかし、この研究で２１％の酸を含む表面でも接着が高いことが示された。酸性ＰＣＰは他のＯ−Ｃ官能基、主にＣ−ＯＨも含むことを思い出すべきである。そうとしても、本発明者らの以前の研究は、酸性ＰＣＰが、コンフルエンシーの程度および細胞数（ＤＮＡアッセイによって決定された）に関してコラーゲンＩと匹敵することを示した。
【００７８】
本発明者らが他で示すように、水性溶媒中で、酸性ＰＣＰは水和し得る（１８）。酸性ＰＣＰの安定性は、モノマーフロー中のアクリル酸濃度に依存することが示された。高濃度の酸（全フローの＞６０％）は、より安定でない表面を生じる。この必要条件は、接着およびその後の増殖を促進するのに「理想的」であるといわれるような低濃度酸性表面（＜５％）の開発を導いた。しかし、酸性表面からの細胞転移に関しては、異なる基準が適用されるようである。酸性基の低濃度は表面に安定性を与えるが、ケラチノサイトは十分によく接着し得て、転移が阻害される。この主張は、転移実験の結果において支持される。ここでモノマーフィード中２５％の酸フロー（ＰＣＰ表面において２．６％のカルボン酸）は、最も低い程度のＤＥＤへの転移を示した。対照的に、モノマー中１００％の酸フロー（ＰＣＰ表面において＞２０％のカルボン酸）は、細胞の転移は有意により高かった。コラーゲンＩのみがこれらの表面よりすぐれていた。モノマーフロー中５０％の酸では、予期されたように、転移は高および低酸性官能基表面の中間であった。これらの結果は、接着および増殖を促進する最適な表面は、最も高い程度のＰＣＰからＤＥＤへのケラチノサイト転移を引き起こすものではないかもしれないことを示す。炭化水素ＰＰからの少ない量の転移は、そのような表面がケラチノサイトを増殖状態で支持できないことを確認する。官能基濃度に対する細胞転移の依存は、まだ完全に調査されていないが、ケラチノサイトは多量の酸性官能基を有する表面から増強された転移を示す。従って、増殖を促進する表面（低酸性官能基）と転移を促進する表面（高酸性官能基）との間に妥協点が存在することが明らかである。
【００７９】
血清を含む培地で、細胞は、基盤自体に対して直接より、タンパク質の吸着層に反応することが示された（１９）。この界面のタンパク質層は、（ほとんど）自然に吸着する。調査している基盤に対する細胞反応の違いは、吸着するタンパク質の組成、またはこれらタンパク質の吸着後の活性のいずれか、あるいはこれら両方の組み合わせに変化が存在することを示唆する。細胞接着は、フィブロネクチンおよびビトロネクチンのような、多くの接着性タンパク質によって支持されることが示された。Ｔｉｄｗｅｌｌら（１２）は、異なる末端化学的性質のアルカンチオレートを用いるＳＡＭに発達するタンパク質層における違い、およびそれらは今度異なるレベルのウシ大動脈内皮細胞接着を支持することを示した。細胞接着および拡散は、細胞増殖のための重要な条件であるが、それらは排他的条件ではない。血清はまた、成長因子の供給源であり、そしてこれらは一次哺乳類細胞の増殖に不可欠であることが示された。成長因子の細胞外マトリックス材料への吸着が、その活性化に役割を果たすことが示唆された（２０）。
【００８０】
結果は、カルボン酸官能基が広い範囲の開始モノマーから提供され得ることを示す。アクリル酸は、有機酸の不飽和ファミリーのメンバーであるが、プロピオン酸は飽和有機酸である。従って、モノマーがプラズマ容器を流れるのに十分揮発性であるなら、任意の有機酸を、ケラチノサイト接着および続くＤＥＤへの転移を示し得るＰＰ表面の製造に使用し得ることが予期される。さらに、その結果は広い範囲のプラズマ条件が、必要な細胞接着および転移を促進する表面を調製することができることを示す。本発明者らは、持続波条件下で、望ましい特徴を有するＰＰをうまく調製するために、低および高パワーレジメを両方使用し得ることを示した。それに加えて、プラズマをパルスすることは酸性官能基を表面に沈着させる別の経路を提供する。他の考慮すべき事は、ある範囲のキャリア表面をプラズマ沈着のために使用し得ることである。この研究で、生物分解性キャリア（ｂｉｏｐｏｌ）、および非生物分解性キャリア（ポリプロピレン、Ｄｅｌｎｅｔ−ＡＥＴ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｎｅｔｓから提供）はいずれも、それらがＤＥＤへのケラチノサイト細胞転移を促進するＰＰでコートされ得ることを示した。データは、キャリアフィルムがその性質が異なり得るが（例えば溶解性、吸収性）、細胞の挙動に影響するのは主にこれらキャリア上のＰＰ沈着であることを示唆する（しかし織り方／孔径のような形態学的効果が、ＰＰコーティングは均一な「平らな」表面ではなく、キャリアの外形に沈着することを意味し得る。従って、細胞は、ＰＰコートキャリアをそれに適用した時にＤＥＤと接触しないかもしれない場所に接着し得る）。転移現象のあらゆる外科的使用は、キャリア材料のコートされた外形内よりも、ＰＰ表面における細胞の最大限の接着を保証するために、メッシュよりもフィルム様のキャリアを必要とすることが認識される。
【００８１】
上記の考察に基づいて、ケラチノサイト接着および転移を支持することにおける酸性ＰＣＰの成功は多因子であることが明らかである。しかし、本発明者らの結果は、ケラチノサイト接着および転移は、カルボン酸官能基によって特異的に促進されることを示す。これはおそらく血清から形成する界面タンパク質層の調節による。
【００８２】
高濃度の酸性基（典型的にはカルボキシル）を含むＰＣＰ表面は、炭化水素表面と比べて、ケラチノサイト接着およびＤＥＤへの転移を促進した。約２０％の酸性基を含む表面における最初の細胞接着は、培養中２４時間後に、コラーゲンＩ基盤における細胞接着と匹敵した。
【００８３】
ＰＣＰからＤＥＤへの細胞転移は、高濃度のカルボン酸官能基を含む表面で最も高かったが、転移はまた低酸性官能基濃度を有する表面からも観察された。細胞転移は、飽和および不飽和有機酸から沈着されたＰＰを用いて達成された。持続波条件下で、低および高パワーレジメはいずれも、細胞転移を促進するＰＰを産生することができた。パルスされたプラズマもまた、転移を促進するＰＰ表面を製造する経路を提供した。
【００８４】
【表６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１１−１２５３５１（Ｐ２０１１−１２５３５１Ａ）
【公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−７３４２１（Ｐ２０１１−７３４２１）
【出願日】平成２３年３月２９日（２０１１．３．２９）
【分割の表示】特願２００１−５０５６７２（Ｐ２００１−５０５６７２）の分割
【原出願日】平成１２年６月２３日（２０００．６．２３）
【出願人】（５１１０６９１７２）アルトリカ リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−７３４２１（Ｐ２０１１−７３４２１）
【出願日】平成２３年３月２９日（２０１１．３．２９）
【分割の表示】特願２００１−５０５６７２（Ｐ２００１−５０５６７２）の分割
【原出願日】平成１２年６月２３日（２０００．６．２３）
【出願人】（５１１０６９１７２）アルトリカ リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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