【課題】
【解決手段】
我々は、細胞の状態をモニタリングする方法を記載し、この方法は、細胞から分泌された選択されたmicroRNA（miRNA）種について、（a）このmiRNA種の前駆形態（pre-miRNA）対（b）このmiRNA種の成熟形態（成熟miRNA）の比を確立することを含み、ここで確立されたpre-miRNA対成熟miRNA比は、この細胞の状態の指標である。我々はまた、（a）間葉系幹細胞（MSC）を提供する工程及び（b）この間葉系幹細胞内に癌遺伝子を導入して形質転換させる工程を含む方法を記載し、ここで、この形質転換された間葉系幹細胞は、自身が増殖する培地中に癌遺伝子の遺伝子産物を分泌しない。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の状態をモニタリングする方法であって、前記方法は、前記細胞によって分泌された選択されたmicroRNA（miRNA）種について、（a）前記miRNA種の前駆形態（pre-miRNA）対（b）前記miRNA種の成熟形態（成熟miRNA）の比を確立することを包含し、ここで確立された前記pre-miRNA対成熟miRNA比は、前記細胞の状態の指標である方法。
【請求項２】
（a）前記細胞が、細胞集団、組織、器官若しくは生物に含まれていて、前記pre-miRNA対成熟miRNA比が、それぞれ前記細胞集団、組織、器官又は生物の状態の指標であるか、又は（b）前記miRNA種が、前記細胞によって分泌されたエキソソームに含まれていて、前記方法が、このようなエキソソームを得ること及び前記エキソソームから前記miRNA種の前駆形態及び成熟形態を得ることを含み、ここで、例えば、前記エキソソームが前記細胞を含む生物のサンプルから得られ、前記サンプルが、例えば、血液サンプル、血清サンプル、唾液サンプル又は尿サンプルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（a）前記pre-miRNA対成熟miRNA比が、前記miRNA種の前駆形態と成熟形態とに結合可能であり且つこれらを識別可能である核酸配列を含むアレイへのハイブリダイゼーションによって確立されるか、或いは（b）前記pre-miRNA対成熟miRNA比が、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）によって確立される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
複数の選択されたmiRNA種についての複数のpre-miRNA対成熟miRNA比を含むプロフィールを、例えば、前記複数の前記選択されたmiRNA種の前駆形態と成熟形態とに結合可能であり且つこれらを識別可能である複数のプローブを含むアレイへのハイブリダイゼーションによって確立することを含み、前記複数のpre-miRNA対成熟miRNA比のそれぞれは、前記細胞の状態の指標である、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞の状態が、細胞周期状態、分化状態、発生状態若しくは代謝状態のような生理学的状態、又は、疾患状態、ヒト疾患状態、糖尿病状態、免疫障害状態、神経変性障害状態、癌化状態、癌性状態若しくは腫瘍状態のような病理学的状態を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
（a）細胞の状態における変化を検出するための方法であって、前記細胞のpre-miRNA対成熟miRNA比（又はこのような比を含むプロフィール）における変化を検出することを包含し、ここで、このような変化は、前記細胞の状態における変化を指し示す方法；
（b）特定の状態にある細胞を確立するための方法であって、前記細胞のpre-miRNA対成熟miRNA比（又はこのような比を含むプロフィール）と特定の状態であることが分かっている細胞のpre-miRNA対成熟miRNA比（又はこのような比を含むプロフィール）とを比較することを包含する方法；
（c）生物の状態をモニタリングする方法であって、前記生物由来のサンプル又は前記生物のサンプルを得ること、前記サンプルに対し請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法を実施すること、及びそれによって得られた前記pre-miRNA対成熟miRNA比から前記生物の状態を確立することを包含する方法；
（d）生物の疾患を検出する方法であって、前記生物由来のサンプル又は前記生物のサンプルを得ること、前記サンプルに対し請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法を実施すること、及びそれによって得られた前記pre-miRNA対成熟miRNA比と疾患を有する生物のものであるか又は疾患を有する生物由来のものであることが分かっているサンプルのpre-miRNA対成熟miRNA比とを比較することを包含する方法；或いは
（e）生物における疾患の処置又は予防の方法であって、（d）に従って生物における疾患を検出すること、及び前記生物に対し前記疾患のための処置を施すことを包含する方法。
【請求項７】
（a）前記細胞が、間葉系幹細胞（MSC）を含むか；（b）前記細胞の状態が、非形質転換状態と形質転換状態、例えばc-myc形質転換状態とを含むか；（c）前記microRNAが、hsa-let-7b microRNA（miRBase登録番号MI0000063）を含むか；又は（d）前記比が、形質転換状態において正常状態と比較して2.8倍高いか；或いはこれらの任意の組み合わせである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
複数のmiRNA種の前駆形態と成熟形態とに結合可能であり且つこれらを識別可能である複数の核酸配列を含むアレイ。
【請求項９】
（a）間葉系幹細胞（MSC）を提供する工程；及び（b）前記間葉系幹細胞に癌遺伝子を導入して形質転換させる工程を包含し、ここで、形質転換された前記間葉系幹細胞が、自身が増殖する培地中に前記癌遺伝子の遺伝子産物を分泌しない方法。
【請求項１０】
（a）前記癌遺伝子がc-mycを含むか；（b）前記間葉系幹細胞（MSC）がhuES9.E1のような樹立された細胞株を含むか；又は（c）前記間葉系幹細胞（MSC）が臍帯に由来する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
形質転換された間葉系幹細胞が、形質転換されていない間葉系幹細胞と比較して、（a）老化を回避可能であるか；（b）増大した増殖速度を有するか；（c）２４時間のような縮小した集団倍加時間を有するか；又は（d）増大したテロメラーゼ活性を有する、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
馴化培地を提供する方法であって、請求項９、１０又は１１に記載の工程を包含し、その後、前記形質転換された間葉系幹細胞又はその子孫細胞を、細胞培養培地中で培養して馴化させ、馴化させた培地（conditioned）を前記形質転換された間葉系幹細胞から分離することを包含する方法。
【請求項１３】
エキソソームを提供する方法であって、（a）間葉系幹細胞馴化培地（MSC-CM）を請求項１２に記載の方法によって得ること；（b）前記間葉系幹細胞馴化培地を、例えば、1000 kDaより粗い膜を通した限外濾過によって濃縮すること；（c）濃縮した前記間葉系幹細胞馴化培地を、例えばTSK GuardカラムSWXL, 6 x 40 mm又はTSK gel G4000 SWXL, 7.8 x 300 mmカラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーにかけること；及び（d）UV吸光度画分、例えば220 nmで、例えば擬弾性光散乱（QELS）によって検出される動的光散乱を示す画分を選択することを包含し、前記工程（d）は、例えば、１１〜１３分間、例えば１２分間の保持時間で溶出する画分を回収することを包含する、方法。
【請求項１４】
薬学的組成物を調製する方法であって、請求項１２に記載の方法によって間葉系幹細胞馴化培地（MSC-CM）を得るか、又は請求項１３に記載の方法によってエキソソームを得ること、及び、場合によっては、前記MSC-CM又は前記エキソソームを、薬学的に許容される担体又は希釈剤と混合することを包含する方法。
【請求項１５】
形質転換された間葉系幹細胞、前記馴化培地、前記エキソソーム若しくは前記薬学的組成物が、間葉系幹細胞の少なくとも１つの生物学的特性、例えば心臓保護を含むか、又は前記馴化培地、前記エキソソーム若しくは前記薬学的組成物が、例えば心筋虚血及び再灌流傷害のマウスモデル若しくはブタモデルにおいてアッセイされたように、梗塞サイズを縮小可能であるか、又は例えば過酸化水素（H₂O₂）誘導性細胞死のインビトロアッセイにおいてアッセイされたような酸化ストレスを軽減可能である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項９、１０又は１１に記載の方法によって得られる不死化間葉系幹細胞、請求項１２に記載の方法によって得られる馴化培地、請求項１３に記載の方法によって得られるエキソソーム、又は請求項１４に記載の方法によって得られる薬学的組成物。
【請求項１７】
本書中で添付の図面の図１〜１３を参照して実質的に記載され、そしてこれらの図面において示される方法、アレイ、不死化間葉系幹細胞、馴化培地、エキソソーム又は薬学的組成物。

【図２】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図３Ｃ】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図４Ｃ】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図５Ｃ】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【公表番号】特表２０１３−５０９１７９（Ｐ２０１３−５０９１７９Ａ）
【公表日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３６７６３（Ｐ２０１２−５３６７６３）
【出願日】平成２２年１１月２日（２０１０．１１．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２０１０／０００４２２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５３２５７
【国際公開日】平成２３年５月５日（２０１１．５．５）
【出願人】（５０３２３１８８２）エージェンシー　フォー　サイエンス，テクノロジー　アンド　リサーチ (179)
【Ｆターム（参考）】