組換えヒトインターフェロン様タンパク質
本願は組換えヒトインターフェロン様タンパク質に関する。一実施形態では、遺伝子シャッフリング技術により作製された組換えタンパク質は、自然発生的なヒトインターフェロンアルファ２ｂ（ＨｕＩＦＮ−α２ｂ）と比較して高い抗ウイルス活性及び抗増殖活性を有する。本発明は、前記タンパク質及び組換えベクターをコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを有する宿主細胞を包含する。好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、それぞれが配列番号１に対して少なくとも９３％同一である配列を含むポリヌクレオチドの群より選択され、前記タンパク質は、それぞれが配列番号２に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸を含むタンパク質の群より選択される。前記タンパク質及び前記タンパク質からなる組成物は、ウイルス性疾患及び癌のような、インターフェロン療法に対して反応性であるの病気の治療に使用され得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、ヒトインターフェロン様生物学的活性を有する組換えタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願において、インターフェロン（ＩＦＮ）という名称は、Ｎａｔｕｒｅ（１）に公開されたものを採用したものである。
１９５７年に、Ｉｓａａｃｓ及びＬｉｎｄｅｎｍａｎｎ（２）により見出されたヒトインターフェロン（ＨｕＩＦＮ）は、ウイルス感染やマイトジェン暴露のような様々な刺激に対する暴露の結果、様々な真核細胞により分泌される周知のサイトカインファミリーである。ＩＦＮは、細胞の増殖及び分化、及び免疫系の調節を含む細胞挙動から多くの変化を引き起こすことができる（３〜７）。ＨｕＩＦＮは、６つの下位グループ、すなわち、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−ω、ＩＦＮ−ε及びＩＦＮ−κに分類されている。ＨｕＩＦＮ−α（白血球由来のインターフェロン）はヒト白血球細胞内で、及び少量のＨｕＩＦＮ−β（線維芽細胞由来のインターフェロン）と共にリンパ芽球様細胞内で生成される。ＨｕＩＦＮは、化学的及び生物学的特性により、２つの一般的なカテゴリー、すなわち、Ｉ型及びＩＩ型に分類される。Ｉ型は、ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−βの下位グループのみならず、最近発見されたＩＦＮ−ω、ＩＦＮ−ε及びＩＦＮ−κの下位グループで構成される。ＩＩ型は、一つのメンバー：ＩＦＮ−γ（免疫インターフェロン）のみを有する。
【０００３】
異なるインターフェロン下位グループは異なる構造的及び生物学的特性を有する。ＨｕＩＦＮ−βはＮ−結合型糖タンパク質であり（８、９）、均質に精製されて特性分析されている。ＨｕＩＦＮ−βは、恐らくその炭水化物部分のために大きさの面では不均一である。しかしながら、１６６個のアミノ酸のタンパク質をエンコードするヒトＩＦＮ−β遺伝子は一つしか存在しない。ＩＦＮ−βはＩＦＮ−αと低い相同性を有し、約３０〜４０％の同一性を共有している。
【０００４】
ＩＦＮ−β遺伝子の単一性とは対照的に、ＨｕＩＦＮ−αは、本質的に１４遺伝子の多重遺伝子族で構成された下位グループである。一つ又は二つのアミノ酸の差異からなる少数の変異体は、複対立遺伝子の原因となる（１０）。偽遺伝子のＩＦＮＡＰ２２を除いては、１３個のタンパク質をエンコードする１３個の遺伝子がある。各タンパク質は、１６５〜１６６個のアミノ酸を含む。遺伝子ＩＦＮＡ１３でエンコードされるタンパク質は、タンパク質ＩＦＮＡ１と同一である。したがって、１２個の別個のインターフェロンアルファタンパク質、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、及びＩＦＮＡ２１が存在する。ＩＦＮ−αサブタイプにおけるアミノ酸配列の同一性は、一般的に８０〜８５％の相同性を有する（１１）。
【０００５】
成熟したＩＦＮ−ωは、ＩＦＮ−α種の群に対しては６０％のヌクレオチド配列相同性を示すが、Ｃ−末端では６アミノ酸ほど長い。ＩＦＮ−ωは、インターフェロン−βとの関連性がさらに薄い（約３０％の配列相同性を共有する）。ヒトＩＦＮ−ωは、ＩＦＮ−αグループに分類されない。なぜならＩＦＮ−αとは抗原的に区別され、Ｉ型ＩＦＮ−α受容体との相互作用において異なるからである（１２）。ＩＦＮ−ωは、ヒト白血球インターフェロンの主要成分として、ウイルス感染白血球により分泌される。
【０００６】
ヒトＩＦＮ−εの成熟タンパク質は１８５−アミノ酸を含有し、ＩＦＮ−α２及びＩＦＮ−βに対して、それぞれ約３３％及び３７％の配列相同性を共有する（１３、１４）。ＩＦＮ−εの機能及び生物物理学的特性は詳細には明らかにされていないが、Ｉ型インターフェロンのように機能する。さらに、ＩＦＮ−εは生殖機能における役割を果たすことができる（１５）。
【０００７】
ＩＦＮ−κは１８０アミノ酸ヒトサイトカインであって、最近、確認されたＩ型ＩＦＮである。ＩＦＮ−κのコード配列は、ヒトで発見された他のＩ型インターフェロンに対して〜３０％同一である。ＩＦＮ−κの際立った特徴は、非誘導性細胞、特に角化細胞における転写物の検出可能な構成的発現である。ＩＦＮ−κは、自然免疫系の細胞に対する効果を通じて、全身的又は局所的免疫機能を調節する役割を担うことができる（１６）。しかしながら、ＩＦＮ−κは、低い抗ウイルス活性を示す（１７）。
【０００８】
ヒトＩ型インターフェロンは、様々な細胞型の細胞表面に広く分布した二つの受容体サブユニットであるＩＦＮＡＲ−１及び−２に結合するものと思われる。リガンドの関与は、ＩＦＮＡＲ−１及び−２にそれぞれ結合するチロシンキナーゼＴＹＫ２及びＪＡＫ−１のリン酸化反応を誘発する。一旦リン酸化すると、ＳＴＡＴタンパク質が受容体から放出され、ヘテロ二量体及びホモ二量体を形成する（１８、１９）。一旦放出されると、ＳＴＡＴＡの二量体は、ＤＮＡ結合タンパク質であるインターフェロン応答因子９（ＩＲＦ−９）と結合し、ＩＦＮ−刺激遺伝子因子−３（ＩＳＧＦ−３）と呼ばれる複合体を形成し、その複合体が核内に移動する。次に、ＩＳＧＦ−３複合体は、全てのＩＦＮ誘導的遺伝子の上流側に存在するＤＮＡ要素に結合する。これは、いわゆる「古典的」シグナル伝達経路である。
【０００９】
Ｉ型ＩＦＮで制御される作用及び生化学的経路の新たな形態が発見され続けている。例えば、シグナル伝達経路におけるＰＩ３Ｋの下流で、核因子カッパ−Ｂ（ＮＦ−ｋＢ）及びＰＫＣ−ｄが、ＩＦＮ−βと共に培養された好中球において発見される抗アポトーシス効果と関連付けられている（２０）。
【００１０】
インターフェロン誘導遺伝子と呼ばれる３００個以上の遺伝子は、ＩＦＮ治療に対して反応性である。最も多く研究されたＩＦＮタンパク質は、抗ウイルス特性を有するものである。例えば、２、５オリゴシンテターゼファミリー（ＯＡＳ−１および−２）の酵素は、ウイルスＲＮＡ及び細胞ＲＮＡを分解する酵素であるＲＮＡｓｅＬと結合して活性化する短鎖オリゴアデニル酸の合成を触媒し、それによってタンパク質合成を阻害する。二本鎖ＲＮＡ活性化タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）も、翻訳開始因子ｅＩＦ２ａをリン酸化し、ウイルス及び細胞のタンパク質合成の阻害をもたらす。さらに最近になって、炎症性サイトカイン誘導、免疫調節、及びアポトーシスにおける中心的作用物質である転写因子ＮＦ−κＢの活性化にもＰＫＲが必要であることが判明した。Ｍｘ（ミクソウイルス耐性）タンパク質は、細胞内でのウイルス粒子の運搬又はウイルスＲＮＡの転写を阻害することにより、ＲＮＡウイルスの複製を阻害する。ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）は、アデノシンをイノシンに転換させ、ウイルスＲＮＡゲノム（２１）の高頻度変異を誘発する。
【００１１】
ＨｕＩＦＮは、抗ウイルス、抗腫瘍、及び免疫調節機能を含む広範囲の生物学的活性を持つ。ヒトインターフェロンの臨床的可能性は広く研究されてきており、以下のように要約される。
【００１２】
抗腫瘍への応用に対して、ＨｕＩＦＮは、免疫調節及び抗血管新生反応の調節により間接的に、又は、腫瘍細胞の増殖又は細胞分化に直接影響を及ぼすことにより、抗腫瘍効果を媒介する（２２）。インターフェロン療法は、様々な白血病（２３）、例えば、ヘアリー細胞白血病（２４）、急性及び慢性骨髄白血病（２５〜２７）、骨肉腫（２８）、基底細胞癌（２９）、神経膠腫（３０）、腎細胞癌（３１）、多発性骨髄腫（３２）、黒色腫（３３）、カポジ肉腫（２３）、及びホジキン病（３４）の治療に用いられてきた。シタラビン（ａｒａ−Ｃ）、５−ＦＵ、ヒドロキシウレア、及びＩＬ−２とＩＦＮ−αの併用療法は、広く研究されており、多くの場合、ＨｕＩＦＮ−α単独よりも有意に優れた結果を示す（３）。ＨｕＩＦＮ及びテモゾロマイドを併用した進行癌の相乗的治療も報告されている（３５）。
【００１３】
抗ウイルスの応用に関して、ＨｕＩＦＮは、抗ウイルス療法、例えば、エイズ（３６）、慢性Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎を含むウイルス感染（３７、３８）、乳頭腫ウイルス（３９）、ヘルペスウイルス感染（４０）、ウイルス性脳炎（４１）の治療、及び鼻炎及び呼吸器感染（４０）の予防において、臨床的に用いられてきた。
【００１４】
ＨｕＩＦＮは、抗バクテリア療法のためにも臨床的に用いられており（４２）、例えば、エアロゾル化されたＨｕＩＦＮ−γ（４３）及びＨｕＩＦＮ−αは、多剤耐性肺結核患者に用いられてきた（４４）。ＨｕＩＦＮ−γは、脳の多剤耐性結核の治療に用いられてきた（４５）。
【００１５】
ＨｕＩＦＮは、免疫調節療法に対しても臨床的に用いられており、例えば、移植片の対宿主拒絶反応の予防、又は多発性硬化症（４６、４７）及びシェーグレン症候群（４８）のような自己免疫疾患の進行の抑制に用いられてきた。ＩＦＮ−βは、多発性硬化症の治療に対して米国でＦＤＡにより認可されている。最近では、多発性硬化症にかかった患者は、Ｉ型インターフェロン及びインターロイキン−２の生成が減少すると報告されている（４９）。また、ＨｕＩＦＮ−αを用いた免疫調節療法は、骨髄移植後に再発する慢性骨髄白血病（ＣＭＬ）患者に対し効果的な治療法であるとされている（５０）。
【００１６】
ワクチンアジュバント療法に対して、ＨｕＩＦＮは、黒色腫（５１）の治療において補助剤として臨床的に用いられており、また、他の多くの疾患に対する予防的又は治療的なワクチン接種において、免疫反応を増強又は刺激するための補助剤又は共同補助剤として用いられ得る（５２）。
【００１７】
ＨｕＩＦＮ−α２ａは、臨床試験で用いられた最初の血管形成阻害薬であり、生命にかかわる血管腫の治療において子供にとって効果的であった（５３、５４）。別の治療的適応は、骨巨細胞腫である。Ｋａｂａｎらは、巨大で、急速に成長している、下顎の再発性巨細胞腫の劇的な退行を報告した（５５）。
【００１８】
ＨｕＩＦＮは多数の重要な臨床的用途を有するが、かなりの副作用及びその他の制限を示す。ＨｕＩＦＮを含む多くのサイトカインは、インビボで生成され、局所的かつ一時的に作用するため、比較的短い循環半減期を有する。通常、全身治療剤として投与されるので、ＨｕＩＦＮを頻繁に、しかも比較的大量に投与しなければならない。頻繁な経口投与は、不便かつ苦痛である。また、ＨｕＩＦＮの投与に伴う毒素の副作用が極めて激しいことも多いため、人によっては、治療に耐えることができない。このような副作用は、おそらく高容量の全身投与に関係している。また、臨床研究において、患者によっては、生物学的活性を中和させるｒＨｕＩＦＮに対する抗体を生成することが判明した（５６）。
【００１９】
明らかに、多くの応用用途、例えば、抗癌療法の他、抗ウイルス、免疫療法、抗寄生虫、抗バクテリア、又は、インターフェロン活性の増加及び／又は副作用の減少を必要とする病状又は医療状況のために、増強された効力を有する新規なインターフェロンタンパク質の開発が緊急に求められている。全体として、ＨｕＩＦＮは、次世代の新規な抗腫瘍及び抗ウイルス療法に重要な役割を担う可能性が極めて高い（１０）。
【００２０】
サイトカイン薬の薬剤学的特性を向上させるための最も効果的な手段は、サイトカインタンパク質そのものを突然変異させることであるということが、当技術分野において周知である。インターフェロンペプチドを突然変異させるための様々な戦略及び技術が長期間に渡り進展してきた。一般に、ＨｕＩＦＮ−α突然変異体を生成するために、現在、三つの戦略が用いられている。
【００２１】
第一の戦略は、ＩＦＮハイブリッドを作製することである。何人かの研究者は、ＩＦＮエンコード配列中の自然発生制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）切断部位の存在を利用して、同種のコード断片を共に接合した（５７、５８）。多数のハイブリッドＩＦＮの生産は、Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ及びＤｉ Ｍａｒｃｏ（１１）によって概説されており、この論文は、そのような分子の構築プロセスの概要を提示している。ハイブリッドインターフェロンの構築方法の特定の実施例が記載されている。何人かの研究者は、ＰＣＲ増幅を利用して突然変異ＩＦＮ−αを構築し、それにより特異的に所望される核酸断片を作出することで、異なるＩＦＮの新たな断片を接合する可能性を得た（５９）。特許文献１（６０）にも、ヒトＩＦＮハイブリッドを構築するためのＰＣＲ増幅技術が記載されている。インターフェロンハイブリッドは、特許文献２（６１）及び特許文献１（６０）に記載されているように、インターフェロン下位グループ内において作出され得、又は、特許文献３（６２）及び特許文献１（６０）に記載されているように、少なくとも二つの異なるインターフェロン分類グループ内において作出され得る。さらに、ハイブリッドの親遺伝子は、例えば、ＨｕＩＦＮ−αとＨｕＩＦＮ−ωとの間のハイブリッドのように、一つの種（大部分はヒト）に由来し、又は、例えば、ヒトインターフェロン−αとマウスインターフェロン−αとの間のハイブリッドのように２以上の動物種に由来してもよい（６３）。
【００２２】
インターフェロン突然変異体を構築するための第二の戦略は、ＩＦＮ ＤＮＡ分子内に一つ以上のヌクレオチドの変異を導入することにより、部位特異的な点突然変異生成を利用することである（６４）。最近では、タンパク質突然変異生成のためのガイドとして、系統的突然変異及び計算法が用いられている（６５）。
【００２３】
Ｉ型ＨｕＩＦＮを構築するための第三の戦略は、ＲＥ消化、ＰＣＲ増幅、化学的合成、又はＤＮａｓｅ消化により作出したＩＦＮ遺伝子断片をシャッフリングし、続いてＰＣＲによってこの断片を無作為に接合し、その後それらを増幅することである。その結果得られたＰＣＲ産物は、事実上、ＤＮＡライブラリーを構築するために用いられ得る再配列されたインターフェロンアルファ遺伝子断片のプールであり、このプールから所望の表現型を有するＤＮＡクローンを分離することができる（６６）。例えば、Ｃｈａｎｇらは、マウス細胞において高められた抗ウイルス及び抗増殖活性を有するＨｕＩＦＮ誘導体を同定するために、ＨｕＩＦＮシャッフリングライブラリーを構築し、スクリーニングする方法を記載している（６７）。
【００２４】
ヒトインターフェロンアルファコン−１（コンセンサスインターフェロン）は、１６６個アミノ酸を有する非自然発生組換えＨｕＩＦＮ−αである。ヒトインターフェロンアルファコン−１は、周知のクローン化ＨｕＩＦＮ−α配列に基づき、それぞれの対応部分内の極めて高度に保存されたアミノ酸を評価することにより生成されてきた。それはＨｕＩＦＮ−α２ｂに対し、アミノ酸レベルで８９％の配列相同性を有し、約１０９ＩＵ／ｍｇの特異的抗ウイルス活性を有する。ヒトインターフェロンアルファコン−１は、代償性肝疾患を有する１８歳以上の患者における慢性ＨＣＶ感染の治療に対して認可されている（６８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２５】
【特許文献１】米国特許第６６８５９３３号明細書
【特許文献２】米国特許第５１３７７２０号明細書
【特許文献３】米国特許第６１７４９９６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
たとえ先行技術において一部組換えインターフェロンタンパク質が知られていても、高められた生物学的活性を有する新規なインターフェロン様タンパク質及びタンパク質組成物が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明により、ヒトインターフェロン様生物学的活性を有するタンパク質をエンコードする分離されたポリヌクレオチドが開示される。一実施例において、ポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも９３％同一のヌクレオチド配列を含む。他の実施例において、ヌクレオチド配列は、配列番号１と少なくとも９５％同一又は少なくとも９８％同一である。
【００２８】
一実施例において、本発明は、配列番号２と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列をそれぞれ有するタンパク質からなる群より選択されるタンパク質を含む。好ましくは、タンパク質は非自然発生するものであり、ヒトインターフェロンアルファ２ｂ（ＨｕＩＦＮ−α２ｂ）と比較して高められた抗ウイルス及び抗増殖活性を有する。例えば、前記タンパク質は、ＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも少なくとも２倍高い抗ウイルス活性及びＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも少なくとも１０倍高い抗増殖活性を有していてもよい。特定の実施例において、タンパク質アミノ酸配列は、配列番号２と少なくとも９０％同一又は少なくとも９５％同一である。
【００２９】
本発明は、前記ポリヌクレオチドの配列を含む組換えベクター及び前記ベクターを含有する宿主細胞を含む。本発明は、さらに、ヒトインターフェロン様生物学的活性を示すポリペプチド断片を含む。本発明は、インターフェロン様生物学的活性を示すタンパク質構築物、及びその他の組成物、例えば、タンパク質及び無機高分子のような他の部分を含む接合体もさらに含む。本発明は、治療目的のための、例えば抗ウイルス剤又は抗癌剤としての前記タンパク質及び組成物の方法及び用途もさらに含む。本発明は、インターフェロン療法に対して反応性のその他の疾患の治療にも用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本明細書においてノバフェロン（Ｎｏｖａｆｅｒｏｎ、登録商標）（配列番号１）と称される本発明の新規なタンパク質をエンコードする完全ＤＮＡ配列を示す（Ａ）。また、ノバフェロン（配列番号２）の予測アミノ酸配列（Ｂ）、及びノバフェロンＤＮＡ配列とのノバフェロンアミノ酸配列アラインメント（Ｃ）を示す。成熟ノバフェロンタンパク質における第１アミノ酸であるシステインが残基１に指定されている。
【図２】ＨｕＩＦＮ−α１４遺伝子（ジーンバンク番号ＮＭ＿００２１７２）とのノバフェロン遺伝子のヌクレオチド配列アラインメント（Ａ）、及びＨｕＩＦＮ−α１４タンパク質（翻訳後、ジーンバンク番号ＮＭ＿００２１７２）とのノバフェロンタンパク質のアミノ酸配列アラインメントを示す（Ｂ）。成熟ノバフェロンタンパク質において、第１アミノ酸であるシステインが残基１に指定されている。ノバフェロンは、ＨｕＩＦＮ−α１４とヌクレオチドレベルで約９３％の配列同一性（４６２／４９８）を、アミノ酸レベルで約８７％の配列同一性（１４４／１６６）を共有する。一致しないヌクレオチドは、中段において空白で示されている。
【図３】ＨｕＩＦＮ−α２ｂ遺伝子（ジーンバンク番号ＮＭ＿０００６０５）とのノバフェロン遺伝子のヌクレオチド配列アラインメント（Ａ）、及びＨｕＩＦＮ−α２ｂタンパク質（ジーンバンク番号ＮＭ＿０００６０５のＨｕＩＦＮ−α２ｂ遺伝子から翻訳）とのノバフェロンタンパク質のアミノ酸配列アラインメント（Ｂ）を示す。成熟ノバフェロンタンパク質において、第１アミノ酸であるシステインは、残基１に指定されている。ノバフェロンは、ＨｕＩＦＮ−α２ｂとヌクレオチドレベルで約８９％の配列同一性（４４５／４９８）を、アミノ酸レベルで約８１％の配列同一性（１３５／１６６）を共有する。一致しないヌクレオチドは、中段において空白で示される。
【図４】ＨｕＩＦＮ−α２ｂと比較した、ノバフェロンによるＤａｕｄｉ細胞のインビトロ抗増殖阻害を示すグラフである。
【図５】ヒト前立腺癌ＰＣ−３異種移植片を有するヌードマウスにおけるノバフェロン及びＨｕＩＦＮ−α２ｂのインビボ抗腫瘍効果を示すグラフである。
【図６】ヒト肝臓癌Ｈｅｐ Ｇ２異種移植片を有するヌードマウスにおけるノバフェロン及びＨｕＩＦＮ−α２ｂのインビボ抗腫瘍効果を示すグラフである。
【図７】ヒト黒色腫Ａ−３７５異種移植片を有するヌードマウスにおけるノバフェロン及びＨｕＩＦＮ−α２ｂのインビボ抗腫瘍効果を示すグラフである。
【図８】結腸癌ＬＳ１８０異種移植片を有するヌードマウスにおけるノバフェロン及びＨｕＩＦＮ−α２ｂのインビボ抗腫瘍効果を示すグラフである。
【図９】ヒト白血病ＨＬ６０（Ｓ）異種移植片を有するヌードマウスにおけるノバフェロン及びＨｕＩＦＮ−α２ｂのインビボ抗腫瘍効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
下記の説明の全体を通して、特定の詳述は、本発明のより完全な理解のために記載されている。しかしながら、本発明は、このような詳述無しに実施され得る。他の例において、本発明を不必要に不明瞭にすることを避けるために、周知の要素は詳細に表示又は記載されていない。したがって、本明細書及び図面は、限定的な意味ではなく、例示的な意味としてみなされなければならない。
【００３２】
（用語の定義）
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、記述された特定のタンパク質分子、方法論、プロトコール、細胞株、ベクター、及び試薬に限定されるものではなく、変更され得ることが理解されなければならない。また、本明細書において用いられた用語は、特定の実施例のみを記述することを目的とし、添付の請求項によってのみ制限されるべき本発明の範囲を制限するように意図されたものではないことが理解されなければならない。
【００３３】
本明細書に記述された本発明をより完全に理解させるために、次の用語が用いられ、それらは以下に示される定義であるように意図されている。また、本明細書において用いられた用語は、特定の実施例のみを記述することを目的とし、添付の請求項によってのみ制限されるべき本発明の範囲を制限するように意図されたものではないことが理解されなければならない。
【００３４】
特に定義されない限り、本明細書において用いられた全ての技術的及び科学的用語は、本発明における当業者にとって通常理解されるところと同一の意味を有する。本明細書で言及された全ての刊行物は、該刊行物で報告され、本発明と関連して使用され得る細胞株、ベクター及び方法論を記述し、開示する目的で、参考として本明細書に組み込まれる。本明細書において、先行発明という理由で、本発明がそのような開示に先行できないという認定としてみなされるべきものは何もない。
【００３５】
「インターフェロン」という用語は、ウイルス感染又はマイトジェンに対する暴露を含む様々な環境刺激に対する暴露により、様々な真核細胞により生成される分泌タンパク質のファミリーを意味する。抗ウイルス特性を有するのみならず、インターフェロンは様々な細胞機能に影響を及ぼすことが示されている。全てのインターフェロンユニットは、ここではＷＨＯ国際標準を参照して、９４／７８６（ｒＨｕＩＦＮ−αコンセンサス）及び９５／６５０（ｒＨｕＩＦＮ−α２ａ）と表されている。
【００３６】
「インターフェロン様」という用語は、周知のインターフェロン又はインターフェロン類似体により示されるか、又は、これらと類似する機能的及び／又は構造的特徴を意味する。例えば、「インターフェロン様生物学的活性」は、抗ウイルス活性及び抗増殖活性を含む。インターフェロン様生物学的活性のその他の例示は、本明細書に記述され、当業者によって理解されるであろう。複数形の「活性等」は、単数形の「活性」を含む。すなわち、本発明は、少なくとも一つのインターフェロン様活性を示す組換えタンパク質又はその他のタンパク質構築物又は組成物を含む。
【００３７】
「コンセンサスインターフェロン」という用語は、全ての周知のヒトアルファインターフェロンサブタイプの配列の大まかな平均であるアミノ酸配列を有する合成インターフェロンの一種を意味する。コンセンサスインターフェロンは、いかなる天然ヒトＩＦＮ−αサブタイプよりも（約５倍）大きな抗ウイルス、抗増殖及びＮＫ細胞活性化活性を有すると報告されている。
【００３８】
本明細書で用いられる「分離された」という用語は、自然環境から除去されたＤＮＡ又はＲＮＡのような分子を意味する。例えば、ベクター内に含まれる組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために分離されたものと考えられる。分離されたＤＮＡ分子のさらに他の例は、異種宿主細胞内に保持される組換えＤＮＡ分子又は溶液内の（部分的又は実質的に）精製されたＤＮＡ分子を含む。「分離された」ＤＮＡは、化学的に合成された核酸のみならず、対象とする天然又は人工のＤＮＡ断片を含有し得るライブラリーから回収されたＤＮＡ分子も含む。したがって、分離された核酸を組換え技術によって製造することができる。
【００３９】
「ヌクレオチド配列」という用語は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド又は核酸分子、及びそれらの断片又は一部を含むヌクレオチドの配列を意味する。ＤＮＡ分子の場合、前記配列は一連のデオキシリボヌクレオチドを含み、ＲＮＡ分子の場合、前記配列は対応する一連のリボヌクレオチドを含むことができる。オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド又は核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であってもよく、ヌクレオチド配列は、センス鎖又はアンチセンス鎖を表していてもよい。
【００４０】
「オリゴヌクレオチド断片」又は「ポリヌクレオチド断片」、「一部」又は「セグメント」又は「プローブ」又は「プライマー」という用語は、置き替え可能に使用され、長さが少なくとも約５ヌクレオチドであるヌクレオチド残基の配列を意味する。好ましくは、断片は標的ヌクレオチド配列をハイブリダイズするために用いられ得る。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素により触媒されるヌクレオチド重合のための開始点として作用する。断片又はセグメントは、本発明の各ポリヌクレオチド配列を固有に識別することができる。好ましくは、断片は配列番号１と実質的に類似する配列を含む。
【００４１】
「タンパク質」又は「ペプチド」又は「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸配列を含む自然発生分子又は合成分子を意味する。
「オープンリーディングフレーム」又はＯＲＦという用語は、いずれの終止コドン無しにアミノ酸に対する一連のヌクレオチドトリプレット暗号を意味し、通常、タンパク質に翻訳可能な配列を意味する。
【００４２】
「成熟タンパク質コード配列」という用語は、シグナル又はリーダー配列無しにタンパク質又はペプチドをエンコードする配列を意味する。タンパク質は、あるリーダー／シグナル配列を除去する細胞内での処理により製造されることもあり得る。タンパク質は、合成的に又は成熟タンパク質コード配列のみをエンコードするポリヌクレオチドを用いて製造され得る。
【００４３】
本明細書で用いられた「精製」又は「実質的に精製」という用語は、示されるタンパク質が他の生物学的巨大分子、例えば、他のタンパク質、ポリペプチド等の実質的な不在下に存在することを意味する。タンパク質は、存在する生物学的巨大分子の少なくとも９５重量％をタンパク質が構成するように精製される（ただし、水、バッファ、及び他の小分子、特に１０００ダルトン未満の分子量を有する分子は存在してもよい）。
【００４４】
「組換え発現ビヒクル又はベクター」という用語は、ＤＮＡ（ＲＮＡ）配列からタンパク質を発現させるためのプラスミド又はファージ又はウイルス又はベクターを意味する。発現ビヒクルは、（１）遺伝子発現において調節的な役割を有する遺伝要素（複数の場合あり）、例えば、プロモーター又はエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される構造配列又はコード配列、及び（３）適切な転写開始及び終止配列、のアセンブリからなる転写ユニットを含むことができる。酵母又は真核生物発現系で用いるための構造ユニットは、好ましくは宿主細胞によって翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。或いは、組換えタンパク質がリーダー又は運搬配列無しに発現される場合、組換えタンパク質はアミノ末端メチオニン残基を含むことができる。この残基は、その後発現された組換えタンパク質から切断されても、又は切断されなくても最終産物を提供し得る。
【００４５】
「実質的な類似性」という用語は、核酸又はその断片を他の核酸又はその相補鎖と最適にアラインメントされたとき、この他の核酸と高度の配列同一性を有する核酸又はその断片を意味する。配列同一性又は相同性は、配列分析ソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴＮを用いて決定され得る。第１核酸は、最適にアラインメントされたとき、第２核酸と少なくとも約８５〜９５％以上の配列同一性を示す場合に実質的に類似すると見なされる。例えば、二つの異なる核酸間の配列同一性又は相同性を決定するために、ＢＬＡＳＴＮプログラムである「ＢＬＡＳＴ２配列」が用いられる。このプログラムは、インターネットを介して、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）から公共使用の目的で入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｈｔｔｐ．／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｗｂｌａｓｔ２．ｃｇｉ）（６９）。非限定例示として、デフォルト設定によるソフトウェアを用いて、このような比較を行うことができる（予想値＝１０、フィルタ＝デフォルト、オープンギャップ＝５、伸長ギャップ＝２ペナルティ、ギャップ×ドロップオフ＝５０）。同じように、デフォルト設定によるＢＬＡＳＴソフトウェア（ｂｌａｓｔｐ）を用いて、最適にアラインメント及び比較された際に、第１タンパク質又はポリペプチドが、第２タンパク質又はポリペプチドと少なくとも約８５％〜９５％以上の配列同一性を示す場合、第２タンパク質又はポリペプチドと実質的に類似するとみなされる。
【００４６】
追加的な例示として、配列タンパク質をエンコードする参照ヌクレオチドに対して、少なくとも、例えば９５％「同一の」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列がタンパク質をエンコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチド当たり５つまでの点突然変異を含み得ることを除き、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は参照配列と同一であることを意味する。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列内の５％までのヌクレオチドは除去されるか、別のヌクレオチドと置き換えられるか、又は参照配列内の全てのヌクレオチドの５％までの多数のヌクレオチドが参照配列内に挿入され得る。
【００４７】
本明細書で用いられた「相補的」又は「相補性」という用語は、許容される塩及び温度条件下での塩基対合によるポリヌクレオチドの自然結合を意味する。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は、相補的配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する。二つの一本鎖分子間の相補性は、核酸中のただ一部だけが結合する「部分的」であってもよく、又は、一本鎖分子間に完全な相補性が存在するときは完全であってもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に相当の影響を及ぼす。これは、核酸鎖間の結合に依存する増幅反応で特に重要である。
【００４８】
「形質転換」という用語は、染色体外要素として、又は染色体の統合によってＤＮＡが複製可能であるように、前記ＤＮＡを生命体内に導入することを意味する。「トランスフェクション」という用語は、あるコード配列が実際に発現されても発現されなくても、適切な宿主細胞により発現ベクターが吸収されることを意味する。
【００４９】
「治療」、「治療する」、及びこれらと文法的に同等の用語は、広い意味で使用され、望ましくないある症状又は状態の医療的治療、予防、防止及び改善を含む。
本明細書で用いられる「生物学的に活性」及び「生物学的活性」という用語は、例えば、自然発生又は非自然発生分子と類似又は同一の、生物系内での構造的、調節的、生化学的、又はその他の生物学的機能を意味する。
【００５０】
本明細書で用いられる「抗増殖」及び「抗増殖的」という用語は、細胞の成長及び分裂を緩和及び／又は予防し、その結果、いずれか一つ又は全ての細胞周期において、全細胞数の減少及び／又は標的細胞の比率の減少をもたらすことを意味する。細胞は、特定の細胞周期段階内で停止されるところにより、さらに、Ｇ１（ギャップ１）、Ｓ期（ＤＮＡ合成）、Ｇ２（ギャップ２）又はＭ期（有糸分裂）として特定される。本明細書で用いられる「抗増殖活性」という用語は、インビトロ又はインビボで細胞増殖、特に腫瘍性細胞増殖、例えば、癌細胞を阻害するタンパク質、タンパク質構築物、又は組成物の活性を意味する。
【００５１】
本明細書で用いる「抗腫瘍」又は「抗癌」という用語は、悪性腫瘍の形成を中和又は予防することを意味する。本明細書で用いられた「抗腫瘍活性」又は「抗癌活性」は、インビトロ又はインビボで、例えば、癌細胞の細胞増殖、特に腫瘍性細胞増殖を阻害するタンパク質、タンパク質構築物、又は組成物の活性を意味する。
【００５２】
「ＩＣ５０」又は「半数最大阻害濃度」という用語は、インビトロで細胞成長を５０％阻害するのに必要な、タンパク質のような阻害物質の濃度を示す。
本明細書で用いる「抗ウイルス性」及び「抗ウイルス」という用語は、インビトロ及び／又はインビボで細胞のウイルス感染を緩和及び／又は予防し、又は細胞内でのウイルス複製を妨害することにより、ウイルス増殖を緩和又は停止し、又はウイルス粒子の総数を減少させることを意味する。本明細書で用いる「抗ウイルス活性」とは、インビトロ及び／又はインビボでウイルス感染を阻害し、又はウイルス複製を妨害するタンパク質、タンパク質構築物、又は組成物を意味する。
【００５３】
（ノバフェロンタンパク質）
本発明は、本明細書で「ノバフェロン」（登録商標）と称する新規なヒトインターフェロン様タンパク質の調製及び特性決定に関する。以下に詳述するように、ノバフェロンタンパク質においては、標準インビトロ試験で測定されるように、自然発生ＨｕＩＦＮ−α２ｂと比較して高められた抗ウイルス及び抗増殖生物学的活性が示される。特に、Ｗｉｓｈ−ＶＳＶシステムで試験した場合、同じ試験システムにおけるＨｕＩＦＮ−α２ｂと比較して、ノバフェロンタンパク質は抗ウイルス活性では１２．５倍の増加を示し、Ｄａｕｄｉ細胞増殖の抗増殖阻害では約４００倍の向上を示す。
【００５４】
一実施形態において、ノバフェロンタンパク質は、配列番号１及び図１（Ａ）に示されるように４９８個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドによってエンコードされている。成熟ノバフェロンタンパク質は、配列番号２及び図１（Ｂ）に示されるように１６６個のアミノ酸からなる。本発明に含まれるポリヌクレオチド及びアミノ酸配列、及びその変異体について、以下にさらに詳述する。
【００５５】
比較のために、本発明者らは、自然発生ＨｕＩＦＮ及びノバフェロンの相同性を研究した。ＢＬＡＳＴ検索は、ノバフェロンがヌクレオチド及びアミノ酸の両方のレベルにおいて、ＨｕＩＦＮ−α１４に対して最も高い相同性を有することを明らかにした。図２に示されるように、ノバフェロンをエンコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１）は、ＨｕＩＦＮ−α１４に対して約９３％（４６２／４９８）の相同性を有し、アミノ酸配列は、ＨｕＩＦＮ−α１４に対して約８７％（１４４／１６６）の相同性を有する。最も広く用いられるヒトインターフェロン産物であるＨｕＩＦＮ−α２ｂと比較すると、図３に示されるように、ヌクレオチドレベル（４４５／４９８）で相同性は約８９％であり、アミノ酸レベルでは約８１％（１３５／１６６）である。
【００５６】
合成ＩＦＮアルファコン−１（コンセンサスインターフェロン）に対して、ノバフェロンは、ヌクレオチドレベル（４５３／４９８）で約９１％の配列同一性を、アミノ酸レベル（１４０／１６６）で約８４％の配列同一性を有する。
【００５７】
以下の実験の項において詳述するように、ポリヌクレオチド配列（配列番号１）は、Ｉ型ヒトインターフェロンのＤＮＡシャッフリングライブラリーから選択された。簡単に述べると、ノバフェロンタンパク質を、配列番号１の全ポリヌクレオチド配列を含有する組換えベクターでの宿主細胞のトランスフェクションにより製造した。宿主細胞の上澄み液に含まれるノバフェロンタンパク質を精製し、抗ウイルス及び抗増殖機能のようなヒトインターフェロン様生物学的活性を呈することを示した。
【００５８】
（ポリヌクレオチド及び変異体）
本発明の新規なポリヌクレオチド配列／核酸分子は、図１（配列番号１）に示されるように４９８個のヌクレオチドからなる。ヌクレオチド配列のような本明細書で提供する情報を利用し、ノバフェロンタンパク質（配列番号２）をエンコードする本発明の核酸分子を組換え発現、化学合成、又はＤＮＡ突然変異生成などのその他の標準分子生物学工程を用いて得ることができる。
【００５９】
分離された核酸分子（配列番号１）以外に、本発明は、配列番号１に開示されるＤＮＡ配列とは異なる配列も含むが、遺伝子コードの縮退により、依然としてノバフェロンタンパク質（配列番号２）と同一の又は実質的に同一のアミノ酸配列をエンコードする。遺伝子コード及び種特異的コドン選択は、この分野で良く知られている。したがって、当業者が、特定の宿主に対するコドン発現を最適化するために、例えば配列番号１のＤＮＡ配列とは異なるＤＮＡ配列の縮退性変異体を生成するのは日常的なことである（例えば、ヒトｍＲＮＡ内コドンを、大腸菌のようなバクテリア宿主が好むものに変更する）。
【００６０】
本発明は、図１に示されるヌクレオチド配列（配列番号１）を有する分離された核酸分子、又は、配列番号１内の核酸配列に対して相補的な配列を有する核酸分子をさらに提供する。本発明は、本発明の分離された核酸分子を含む組換えベクター、前記組換えベクターを含有する宿主細胞、及びそのようなベクターを製造し、ノバフェロンタンパク質を発現する宿主細胞を生成する方法、及び組換え技術により、ノバフェロンを製造するために前記宿主細胞を用いる方法に対する情報を提供し、またこれらに関する。
【００６１】
本発明の核酸配列（配列番号１、図１（Ａ））に基づき、本発明は、最適アラインメントの際に、配列番号１に少なくとも約８５〜９５％又はそれ以上の配列同一性を有する核酸のように、本発明の核酸配列と実質的に類似した核酸分子を含む。例えば、一態様において、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、約９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する核酸は、ノバフェロンと類似した生物学的活性（そのような活性は、ＨｕＩＦＮと比較して高められた抗ウイルス、抗増殖、及び抗腫瘍機能を含むが、これらに限定されない）を有するタンパク質又はポリペプチドをエンコードするか否かを問わず、本発明の範囲内である。そのような核酸分子は、例えば、ノバフェロンを製造するために本発明のヌクレオチド配列を含有するベクターが既にトランスフェクションされた細胞内で、ｍＲＮＡを検出するためのプローブとして用いられ得る。言い換えれば、配列番号１に示される配列と少なくとも約９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるこれらの核酸配列は、宿主細胞内で異種遺伝子の発現を判定するためのマーカーとして用いられ得る。
【００６２】
さらに、本発明は、配列番号１の任意の部分である少なくとも約３０個の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも約５０個の連続するヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含む。
【００６３】
より一般的に、本発明は、図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列の部分配列と同一である任意の及び全ての分離された核酸分子の断片を含み、かつこれらに及ぶ。一実施形態において、このような断片は、少なくとも約１５ヌクレオチドの長さであってもよく、本明細書に記載されるように、診断プローブ及びプライマーとして有用である。さらに、本発明は約５０個のヌクレオチド以上の長さのより大きな断片を含み、またこれに及ぶ。
【００６４】
ノバフェロンタンパク質をエンコードする配列番号１に開示される核酸配列以外に、本発明は、付加された分泌性リーダー配列等の余分のアミノ酸（複数の場合あり）／ペプチド（複数の場合あり）／ポリペプチド（複数の場合あり）と共に全ノバフェロンタンパク質のアミノ酸配列をエンコードする核酸配列も含むが、これらに限定されない。
【００６５】
本発明は、配列番号１に開示される核酸配列を有する核酸の配列と共に、例えばイントロン、及び転写、ｍＲＮＡプロセシング（すなわち、スプライシング及びポリアデニル化信号、ｍＲＮＡのリボソーム結合及び安定化）において役割を担う転写された非翻訳の配列のような非コード５’及び３’配列、及び、機能性を有する又は有さない付加的なアミノ酸をエンコードする付加的なコード配列を含む付加的な非コード配列も含むが、これらに限定されない。
【００６６】
本発明は、さらにノバフェロンタンパク質の一部、類似体又は誘導体をエンコードする本発明の核酸分子（配列番号１）の変異体に関するものでもある。変異体は、インターフェロンシャッフリングライブラリーのスクリーニングにより、又は突然変異誘発技術を用いて、又は／及びその他のこの技術分野において記述された周知の技術を用いて得られる。
【００６７】
上述したように、このような変異体は、ヌクレオチド挿入、欠失、又は置換により製造されたものを含んでもよい。挿入、欠失、又は置換は、一つ以上のヌクレオチドを伴ってもよい。これらの突然変異は、参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端部又はこれらの末端部の間のあらゆる位置で、参照配列内のヌクレオチド間で個別に、又は参照配列内の一つ又は複数の連続するグループ内に点在して発生し得る。変性は、保存又は非保存アミノ酸置換、欠失、付加を生成させることができる。これらの中で特に好ましいものは、サイレント置換、付加及び／又は欠失であり、これらはノバフェロンタンパク質又はその一部の特性及び活性を変化させない。また、このような面で特に好ましいものは、保存的置換である。
【００６８】
本発明の一態様は、（ａ）配列番号２の全アミノ酸配列（すなわち、配列番号２の第１〜１６６位）を有するノバフェロンタンパク質をエンコードするヌクレオチド配列、及び（ｂ）（ａ）のタンパク質の生物学的に活性である断片をエンコードするヌクレオチド配列、及び（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）内の任意のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも９３％同一であり、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む分離された核酸分子を提供する。
【００６９】
遺伝子コードの縮退により、図１に示される核酸配列（配列番号１）の核酸配列と少なくとも約９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を有する核酸分子の多くが、ノバフェロンタンパク質と類似又は同一の活性を有するタンパク質をエンコードするということを、当業者であれば直ちに認識する。実際、縮退性変異体は全て同一のタンパク質をエンコードするので、比較試験無しにもこの点は熟練者にとって明白である。また、縮退性変異体ではない核酸分子に関して、妥当な数がインターフェロン様生物学的活性を有するタンパク質をエンコードするであろうことが、当技術分野においてさらに認識される。その理由は、さらに後述されるように、タンパク質機能に相当の影響を及ぼす可能性が少ないか、又はその可能性がないアミノ酸置換（例えば、ある脂肪族アミノ酸を第２の脂肪族アミノ酸で置換すること）を、熟練者は十分認識しているからである。例えば、表現型についてサイレントなアミノ酸置換を行う方法に関する手引きがＢｏｗｉｅらによって提供されており（７０）、ここで、著者は多くのタンパク質がアミノ酸置換を許容することを示している。
【００７０】
（タンパク質及びポリペプチド変異体及び構築物）
本発明は、配列番号２のノバフェロンタンパク質、及び配列番号２に対して少なくとも約８５〜９５％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有する非自然発生タンパク質のように、配列番号２のノバフェロンタンパク質と実質的に類似のタンパク質又はポリペプチド変異体を含む。例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する非自然発生タンパク質は、本発明の範囲内である。さらに、本発明のノバフェロンタンパク質は、その機能及び特性を高める目的で、他のタンパク質又はタンパク質断片又は他の分子と融合させることにより、構造的に修飾され得る。例示は、ノバフェロンタンパク質の発現を増加させ、又はノバフェロンタンパク質をさらに安定化させるために、ノバフェロンタンパク質を他のタンパク質／タンパク質断片と融合させることを含むが、これらに限定されない。
【００７１】
一実施形態において、本発明によるノバフェロンをエンコードする核酸配列及び／又はノバフェロンタンパク質は、その骨格以外をラベルでラベリングされ得る。本明細書で「ラベリングされた」とは、核酸配列（配列番号１）又はノバフェロンタンパク質（配列番号２）の化合物の検出を可能とするため、前記化合物が少なくとも一つの要素、アイソトープ又はその他の化学物質（ラベル）を付されることを意味する。一般にラベルは、ａ）放射性又は重同位体であり得るアイソトープラベル、ｂ）抗体又は抗原であり得る免疫ラベル、及びｃ）着色又は蛍光染料の三つに分類される。前記ラベルは、任意の位置で前記化合物内に取り込まれることができる。
【００７２】
一旦製造されると、ノバフェロンタンパク質は共有結合的にも修飾され得る。共有結合修飾の一つの様式は、ノバフェロンタンパク質の選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬で、ノバフェロンタンパク質を処理することを含む。二官能性試薬での誘導体化は、例えば、抗ノバフェロン抗体の精製又はスクリーニング検定で用いるために、水不溶性の支持マトリクス又は表面にノバフェロンタンパク質を架橋するために有用である。通常用いられる架橋剤は、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル）、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。
【００７３】
ノバフェロンタンパク質のその他の修飾は、グルタミニル残基及びアスパラギニル残基の、対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基への脱アミド化；プロリン及びリシンのヒドロキシル化；セリル残基又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化；リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のアミノ基のメチル化（７１）；Ｎ末端アミンのアセチル化；及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【００７４】
本発明のノバフェロンタンパク質の共有結合修飾の別の様式は、ノバフェロンタンパク質の天然グリコシル化パターンの変更を含む。この変更は、例えば、（１）ノバフェロンタンパク質の天然配列に見られる１つ以上の炭水化物部分を欠失及び／又は付加することにより、あるいは（２）ノバフェロンタンパク質の天然配列には存在しない１つ以上のグリコシル化部位を欠失及び／又は付加することにより行われる。
【００７５】
ノバフェロンタンパク質に対するグリコシル化部位の付加は、ノバフェロンタンパク質のアミノ酸配列を変更させることにより行われ得る。この変更は、例えば、ノバフェロンタンパク質の天然配列（Ｏ−結合グリコシル化部位）に対して一つ以上のセリン又はトレオニル残基を付加又は置換することによってなされてもよい。ノバフェロンタンパク質のアミノ酸配列の変更は、ＤＮＡレベルでの変化、特に、予め選択されたヌクレオチド塩基においてノバフェロンタンパク質をエンコードするＤＮＡ配列を突然変異させることにより行われ、変更されたコドンは、所望のアミノ酸に翻訳される。
【００７６】
ノバフェロンタンパク質上に炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、グリコシドのタンパク質への化学的又は酵素的結合による。このような方法は、当技術分野において記述されており、例えば、早くも１９８１年にＡｐｌｉｎ ＪＤ及びＷｒｉｓｔｏｎ ＪＣ Ｊｒ．が、タンパク質及び脂質の炭水化物接合体の調製、特性、及び応用について記述した（７２）。
【００７７】
ノバフェロンタンパク質上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的となるアミノ酸残基をエンコードするコドンの突然変異的置換によってなされ得る。化学的脱グリコシル化技術は、当業者には周知であり、例えば、Ｅｄｇｅ ＡＳらによって記述されている（７３）。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａらによって記述されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
【００７８】
このような誘導体化された構築物は、溶解度、吸収性、脳血管関門を通過する透過性、生物学的半減期等を向上させる部分を含んでもよい。ノバフェロンタンパク質のこのような部分又は修飾は、起こりうる望ましくないタンパク質の副作用等を択一的に除去又は軽減することができる。このような効果を媒介できる部分は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙに開示されている（７５）。
【００７９】
ノバフェロンの共有結合修飾の別の様式は、例えば米国特許第４６４０８３５号明細書（７６）、第４４９６６８９号明細書（７７）、第４７９１１９２号明細書（７８）又は第４１７９３３７号明細書（７９）に記載された方法で、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレン等の種々の非タンパク質様ポリマーの一つにノバフェロンタンパク質を結合することを含む。
【００８０】
さらに、本発明のノバフェロンタンパク質は、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合されたノバフェロンタンパク質を含むキメラ分子を形成する方法で修飾されてもよい。一実施形態では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとノバフェロンタンパク質との融合化合物を含む。エピトープタグは、一般的にはノバフェロンタンパク質のアミノ末端又はカルボキシル末端に位置する。このようなノバフェロンタンパク質のエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する別の種類のアフィニティマトリクスを用いたアフィニティ精製によって、ノバフェロンタンパク質を容易に精製することを可能にする。代替の実施形態において、キメラ分子はノバフェロンタンパク質の免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域／断片との融合化合物を含む。例えば、キメラ分子の二価の形態を形成するために、ノバフェロンタンパク質をＩｇＧ分子のＦｃ領域内に融合することができる。
【００８１】
種々のタグポリペプチド及びそれらの各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；インフルエンザＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５（８０）；ｃ−ｍｙｃタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体（８１）；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体（８２）を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド（８３）、チューブリンエピトープペプチド（８４）及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ（８５）を含む。
【００８２】
さらに、本発明のノバフェロンタンパク質は、当業者に周知の化学合成工程を用いて製造され得る。例えば、約８０〜９０アミノ酸残基までの長さのポリペプチドは、市販のペプチド合成機モデル４３３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国 カリフォルニア州、フォスターシティ）で製造され得る。また、１２０残基までの、より長い化学合成ペプチドも、例えばＢｉｏ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社、米国 テキサス州、ルイスビルから商業的に入手可能である。したがって、容易に理解されるように、全長の成熟ノバフェロンタンパク質を合成的に製造することができる（例えば、その後互いに連結され得る断片として）。
【００８３】
したがって、本発明のノバフェロンタンパク質（配列番号２）は、配列番号２に開示されるものと同一のアミノ酸配列を有する全てのタンパク質及びポリペプチド調製物及び構築物を含むが、これらのノバフェロンタンパク質及びタンパク質誘導体は、化学合成的工程により製造されても、及び／又は原核又は真核宿主細胞、又はバクテリア、酵母、植物、昆虫及び哺乳動物細胞を含むがこれらに限定されない他の細胞及び宿主からの組換え技術により製造されても構わない。組換え生産方法で用いられた宿主によっては、本発明のタンパク質はグリコシル化されてもグリコシル化されなくてもよく、ペグ化してもペグ化しなくてもよい。また、本発明のタンパク質は、場合によっては、宿主媒介工程の結果、第１位修飾されたメチオニン残基をさらに含んでもよい。したがって、翻訳開始コドンによりエンコードされるＮ末端メチオニンは、全ての真核細胞内で翻訳後、任意のタンパク質から高効率で一般に除去されることが、当分野において周知である。殆どの原核細胞内でも、殆どのタンパク質のＮ末端メチオニンが効果的に除去されるのに対して、タンパク質によっては、Ｎ末端メチオニンが共有結合するそのアミノ酸の特性に基づき、この原核細胞での除去工程が効率的ではないものもある。
【００８４】
（生産）
本発明はまた、本発明の分離されたＤＮＡ分子からなる組換えベクター、組換えベクターで遺伝的に設計／トランスフェクションされた宿主細胞、及び組換え技術によるノバフェロンタンパク質又はその断片の生産方法に関する。ベクターは、例えば、プラスミド、ファージ、ウイルス、又はレトロウイルスベクターであってもよい。レトロウイルスベクターは、複製可能又は複製不能であってもよい。後者の場合、ウイルス増殖は、一般に相補的な宿主細胞内でのみ発生する。ノバフェロンの生産を詳述する例を以下に説明する。
【００８５】
本発明のノバフェロンタンパク質の発現のための好ましいベクターは、発現されるべきポリヌクレオチドに作動可能に結合された宿主細胞内で発現のために効果的なｃｉｓ作用制御領域を含むベクターを含むが、これに限定されない。適切なトランス作用因子は、宿主により、相補的なベクターにより、又はベクターそのものにより、宿主への導入時に供給される。
【００８６】
本発明に開示される核酸配列（配列番号１）は、適切なプロモーターに作動可能に結合され得る。本明細書で「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼに結合可能であり、ノバフェロンタンパク質のコード配列のエクストロン（ｅｘｔｒｏｎ）（通常、（３’）下流にある）のｍＲＮＡへの転写を開始できる任意の核酸配列を意味する。バクテリアプロモーターは、通常、コード配列の５’末端の近位に配置されている転写開始領域を有する。この転写開始領は、一般にＲＮＡポリメラーゼ結合部位及び転写開始部位を含む。代謝経路酵素をエンコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例示は、ガラクトース、ラクトース、及びマルトース等の糖類代謝酵素に由来したプロモーター配列及びトリプトファン等の生合成酵素に由来した配列を含む。バクテリオファージからのプロモーターも用いられ、これらは当分野において周知である。また、合成プロモーター及びハイブリッドプロモーターも有用であり、例えばｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーター配列とｌａｃプロモーター配列とのハイブリッドである。さらに、バクテリアプロモーターは、バクテリアＲＮＡポリメラーゼと結合して転写を開始する能力を有する非バクテリア由来の自然発生プロモーターを含んでもよい。好ましいバクテリアプロモーターは、大腸菌ｌａｃｉ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ及びｌａｃＺプロモーター、Ｔ３及びＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラムダＰＲ、ＰＬプロモーター及びｔｒｐプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【００８７】
真核細胞プロモーターは、通常コード配列の５’末端の近位に位置する転写開始領域、及び通常は転写開始部位の２５〜３０塩基対（ｂｐ）上流側にあるＴＡＴＡボックスを有する。ＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡ合成を正しい部位で始めるようにＲＮＡポリメラーゼＩＩに指示すると考えられている。哺乳類プロモーターは、一般にＴＡＴＡボックスの１００〜２００塩基対上流側に位置する上流側プロモーター要素（エンハンサー要素）も含む。上流側プロモーター要素は、転写が開始される速度を決定し、一方の方向で作用することができる。ウイルス遺伝子はしばしば高発現され、広い宿主範囲を有することから、哺乳類プロモーターとして哺乳類ウイルス遺伝子からのプロモーターが特に使用される。例示は、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーターを含む。好ましい細胞プロモーターは、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、及びＣＭＶプロモーターを含むが、これらに限定されない。周知の真核細胞プロモーターのうち、この点で適切なものは、ＣＭＶ前初期プロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ１Ａ）プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）等のレトロウイルスＬＴＲのプロモーターである。酵母内発現用として好ましいプロモーター配列は、誘導性ＧＡＬ１／１０プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼからのプロモーター、及び酸性ホスファターゼ遺伝子を含む。
【００８８】
増殖及び発現のためのベクターは、一般に一つ以上の選択マーカーをさらに含む。このようなマーカーは増幅に適切であるか、又はこのベクターはこの目的のために付加的マーカーを含んでもよい。これと関連して、発現ベクターは、好ましくは一つ以上の選択マーカー遺伝子を含み、トランスフェクションされた宿主細胞の選択のための遺伝的特性を提供するが、当業者は、特定のシステム選択マーカーが、個々のベクターに提供され得ることを認識する。好ましいマーカーは、例えば、大腸菌及びその他のバクテリアにおける培養のためのアンピシリン（Ａｍｐ）、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）又はハイグロマイシン（ＨＹＧ）耐性遺伝子を含む。酵母選択マーカーは、ツニカマイシンに対する耐性を付与するＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、及びＡＬＧ７；Ｇ４１８に対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子；及び酵母が銅イオンの存在下で成長することを可能にするＣＵＰ１遺伝子を含む。動物細胞選択マーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子、ネオマイシン（Ｎｅｏ）又はハイグロマイシン（ＨＹＧ）耐性遺伝子を含む。
【００８９】
さらに、増殖及び発現用ベクターは、通常、転写開始、終結のための一つ以上の部位、及び転写領域内に翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。構築物により発現された転写物のコード部分は、好ましくは、開始部における翻訳開始コドン及び翻訳されるＤＮＡ配列の末端における適切に配置された終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ又はＵＡＧ）を含む。プロモーター、ターミネータ、選択マーカー、ベクター及びその他の要素の選択は、この分野の通常の技術水準の範囲内で日常的な設計事項である。多数のこのような要素が文献に記載されており、商業的供給者から入手可能である。
【００９０】
以下のベクター、すなわちＳｈａｎｇｈａｉ Ｓａｎｇｏｎ社からのｐＢＶ２２０（８６）及びその誘導体；Ｑｉａｇｅｎ社からのｐＱＥシリーズ；Ｑｉａｇｅｎ社からのｐＥＴベクター；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社からのｐＢＳベクター、ファージスクリプトベクター、ブルースクリプトベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；及びＰｈａｒｍａｃｉａ社からのｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が市販されており、バクテリアでの使用のために好ましい。好ましい真核細胞ベクターには、Ｐｒｏｍｅｇａ社からのｐＣＩベクター、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社からのｐｃＤＮＡベクター、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社からのｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴｌ及びｐＳＧ；及びＰｈａｒｍａｃｉａからのｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬがある。これらのベクターは、市販されている周知の多数のベクターが、本発明に開示されたノバフェロンタンパク質の遺伝子／組換え方法による製造のために、当業者に入手可能であるということを明示するための例示として単に列挙されたものである。
【００９１】
これと関連して、特定の好ましい実施形態において、前記ベクターは、特異的発現のための手段を提供する。このような特異的発現は、誘導性発現でも、又は単に特定の種類の細胞のみでの発現でもよく、又は誘導性かつ細胞特異的であってもよい。誘導性ベクターのうち特に好ましいものは、温度及び栄養素添加物のように容易に操作可能な環境因子により発現するように誘導することができるベクターである。原核及び真核宿主細胞での使用のための構成的及び誘導性発現ベクターを含む、この応用用途に適合した様々なベクターが広く知られており、当業者により日常的に用いられる。
【００９２】
配列番号１に開示されるＤＡＮ配列を含むベクターは、例えば、適切なプロモーター、及びその他の適切な制御配列と共に、この分野で周知の様々な技術を用いて、所望のタンパク質の発現に適合した適切な宿主細胞内に導入され得る。このような適切な宿主の代表は、大腸菌、枯草菌、ストレプトマイセス細胞等のバクテリア細胞；メタノール資化性酵母細胞等の酵母細胞；ショウジョウバエＳ２及びヨトウガＳｆ９細胞等の昆虫細胞；ＣＨＯ及びＣＯＳ等の哺乳類細胞；及び植物細胞を含む。様々な発現構築物に対する宿主は、広く知られており、当業者は、本発明に開示される情報を用いて、配列番号２に開示されるノバフェロンタンパク質を発現するための宿主を容易に選択することができる。
【００９３】
宿主細胞は、ノバフェロン−エンコーディングポリヌクレオチドを取り込み、本発明のノバフェロンタンパク質を発現するように遺伝的に設計され得る。例えば、ノバフェロン−エンコーディングポリヌクレオチドは、この分野で知られているトランスフェクション技術を用いて、宿主細胞内に導入され得る。このような方法は、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ（８７）により論議されたように、多数の標準臨床マニュアルに記載されている。ノバフェロン−エンコーディングポリヌクレオチドは、単独で又は他のポリヌクレオチドと共に導入／トランスフェクションされ得る。このような他のポリヌクレオチドは、独立的に導入されてもよく、又は配列番号１に開示されるノバフェロン−エンコーディングポリヌクレオチドと共同導入又は連結して導入されてもよい。
【００９４】
例えば、本発明のノバフェロン−エンコーディングポリヌクレオチドは、哺乳類細胞内マーカーの共同トランスフェクション及び選択のための選択マーカーをエンコードする個々のポリヌクレオチドと共に、宿主細胞内にトランスフェクションされ得る。または、ノバフェロン−エンコーディングポリヌクレオチドは、宿主細胞内で増殖を誘導するための選択マーカー−エンコーディングＤＮＡ配列を含有するベクター内に導入され得る。
【００９５】
ノバフェロン−エンコーディングポリヌクレオチドを含有するベクターでトランスフェクションされるように設計された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換細胞を選択し、又は標的遺伝子を増幅させるために特異的に修飾され得る従来の栄養培地内で培養され得る。温度、ｐＨ等の培養条件は、本発明のノバフェロンタンパク質を発現させるために選択された宿主細胞に対して適切に調節される。
【００９６】
翻訳されたタンパク質ポリペプチドの小胞体内腔内、ペリプラスム空間内、又は細胞外環境内への分泌を促進するために、適切な分泌シグナルが取り込まれ、ノバフェロンタンパク質と共発現され得る。
【００９７】
（精製）
標的組換えタンパク質の発現のための適切な宿主細胞型は、通常、標的タンパク質の特性及びその他の条件、例えば製造費用、大規模製造の容易性、産業的生産の規模等の検討に基づいて選択される。その後、最高収率で標的タンパク質を発現するトランスフェクションされた細胞のクローンを選択し、最適発現率を有する最終クローンを標的タンパク質発現細胞株と命名し、標的タンパク質の製造に用いる。標的タンパク質を発現する細胞株を、様々な栄養素を含有する培地内で増殖させる。細胞の最適増殖及び／又は標的タンパク質の最適発現のために、様々な試薬及び条件が用いられ、トランスフェクションされたベクター内の標的タンパク質のｃＤＮＡ配列と共に取り込まれた選択的プロモーターを誘導する。宿主細胞型／発現系がバクテリアである場合、培養細胞は、一般に遠心分離により培地から回収される。回収された細胞体は物理的又は化学的手段で分解され、合成された標的タンパク質を含有する回収された粗抽出物は、タンパク質のさらなる精製のために保持される。微生物細胞の破壊に適用される方法は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破砕、又は細胞溶解剤の使用を含むが、これらに限定されない。このような方法は、当業者に良く知られている。
【００９８】
本発明者らは、組換えノバフェロンタンパク質の発現のための宿主細胞として、バクテリアの大腸菌を用いた。後述されるように、大腸菌は、ノバフェロン−エンコーディングポリヌクレオチド配列を含有するベクターでトランスフェクションされ、ノバフェロンタンパク質の最適発現を有する一つの大腸菌株が、ノバフェロンタンパク質の製造用として選択された。一旦合成されると、前記タンパク質は不溶性顆粒として細胞質内に保持されるか、又は可溶性形態で細胞質内に分泌され得る。前者の場合、顆粒は細胞体の溶解後に回収され、例えばグアニジンイソチオシアネート又は尿素を用いて変性される。変性したポリペプチド／ノバフェロンタンパク質のリフォールディングは、変性物の過剰の希釈溶液を用いた希釈、又は尿素溶液と還元及び酸化グルタチオンの組み合わせとの溶液に対する透析、及びその後の緩衝生理食塩溶液に対する透析により得られる。後者の場合、回収された細胞の破壊の後、タンパク質は変性することなくペリプラスム空間から可溶性及び機能性の状態で直接回収され得る。変性及びリフォールディング工程を回避することにより、可溶性ノバフェロンタンパク質は損傷せず、変形され、又は誤って折り畳まれたタンパク質分子を含有することはない。
【００９９】
本発明者らは、大腸菌細胞株で生成された合成ノバフェロンタンパク質のかなりの部分が細胞質内に分泌されることを発見した。この部分はその後、下記のように精製された。
（活性アッセイ及び医学的用途）
上述したように、ノバフェロンタンパク質は、インターフェロンファミリーの多くの構成員、特に、ＨｕＩＦＮ−α１４のｍＲＮＡ（図２）により翻訳されるインターフェロンタンパク質に対して配列相同性を示す。ＨｕＩＦＮ−αは、抗ウイルス、抗増殖、及び免疫調節活性を含む広範囲の生物学的活性を有することが示された（１０）。
【０１００】
ＨｕＩＦＮ−αに対するこのような相同性により、ノバフェロンは、腫瘍増殖阻害、抗ウイルス活性、ＮＫ細胞活性化、及び免疫系調節を含むが、これらに限定されないＨｕＩＦＮ−αと類似した生物学的機能を示すものと予想される。特に重要なものは、ＨｕＩＦＮ−α様機能特性の保持のみならず、ノバフェロンタンパク質のこれらの生物学的機能のＨｕＩＦＮ−αよりも高められた効力である。その機能特性の効力を確認及び決定するために、ノバフェロンタンパク質の生物学的活性を、抗ウイルス及び抗増殖特性を検出するように設計された古典的かつ日常的なインビトロアッセイを用いて測定した。以下の実験の項に示すように、ノバフェロンタンパク質の抗増殖特性のインビボ効力は、様々なヒト癌タイプの動物モデルでさらに観察され、実験によっては、化学的抗癌剤のみならず、ＨｕＩＦＮ−αとも比較された。
【０１０１】
ＨｕＩＦＮ活性を測定するための多くの適切なアッセイがこの分野で良く知られている。本発明者らは、抗ウイルス及び抗増殖活性を測定するために、インビトロ細胞ベースアッセイシステムを用いた。同じインビトロアッセイを、ヒトＩ型インターフェロン遺伝子シャッフリングライブラリーのスクリーニング、ヒトＩ型インターフェロン遺伝子シャッフリングライブラリーの発現タンパク質からのノバフェロンの選択、及び純組換えノバフェロンタンパク質の生物学的活性の測定を含むが、これらに限定されない本発明に関する全ての工程及び実験で用いた。
【０１０２】
検査試料／試薬の抗ウイルス活性を、ウイルスに対する細胞の耐性の程度を観察することにより測定する多数のアッセイがある（８８）。ＨｕＩＦＮ及びそのハイブリッドの抗ウイルス活性を測定するために、三つの主要なバイオアッセイが用いられてきた。これらは、培養細胞に対するウイルスの様々な様相を判定する方法によって分類される。
【０１０３】
ウイルスに誘導された細胞変性効果の阻害を判定するためのアッセイでは、ＩＦＮで前処理された培養細胞に対するウイルス誘導された溶解性細胞変性効果の減少程度を測定する。このアッセイは、９６ウェルプレート内で行われ（８９）、多数の試料をスクリーニングするための簡便な方法を提供することから、組換えＨｕＩＦＮ−αに対して広く用いられてきた。
【０１０４】
ウイルスプラーク形成の阻害は、組織培養物内のＨｕＩＦＮの抗ウイルス活性を定量する別の方法である。プラーク減少アッセイの結果は、感染の多重性とは独立的である。また、プラーク形成の５０％減少を高精度で測定可能である。プラーク形成を誘導するために、例えば遍在的水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を用いて、異なる動物種からの多数の細胞株をスクリーニングすることにより、特定の組換えＩＦＮの異種間活性のプロフィールを決定することができる（９０）。
【０１０５】
三番目のアッセイは、ウイルス収率の減少の測定に基づく。通常、単細胞成長周期の間、放出されたウイルス量によってウイルス生成量を測定する。このアッセイは、細胞変性効果を生じず、又は標的細胞培養物内にプラークを形成しないウイルスに対するＩＦＮの抗ウイルス活性を試験するために特に有用である。しかしながらこの試験では、感染の多重度が、ＩＦＮの固定濃度によって誘導された保護の見かけの程度に影響を及ぼす（９１）。
【０１０６】
ノバフェロンの抗ウイルス活性は、ＷＩＳＨ細胞及び水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を用いて、標準細胞変性効果阻害アッセイによって測定された。抗ウイルス活性は、ＷＨＯ国際標準の標準参照試料９５／６５０（ｒＨｕＩＦＮ−α２ａ）及び９４／７８６（ｒＨｕＩＦＮ−αコンセンサス）を用いて測定され、キャリブレートされた。抗ウイルス活性の一つの単位は、培養細胞においてＶＳＶの細胞変性効果の５０％阻害を達成するのに必要なタンパク質の量として定義される。さらに後述されるように、ノバフェロンタンパク質の活性は２．５×１０９ＩＵ／ｍｇであって、ＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも約１２．５倍高い。これらの試験は、ＨｕＩＦＮ−α２ｂに比べて、ノバフェロンの抗ウイルス特性がかなり高められることを立証する。ノバフェロンタンパク質が示すウイルスに対するこの高められた効力は、ヒトのインビボにおける高められた抗ウイルス効果の予測に対する根拠を提供する。ＨｕＩＦＮの特性に基づき、ノバフェロンに関して極めて広い抗ウイルスプロフィールを合理的に予想可能である。言い換えれば、ノバフェロンは、天然ＨｕＩＦＮよりも広範囲のウイルスに対してさらに強力である。ノバフェロンの高められた抗ウイルスの効力は、様々なウイルス性疾患の患者に対する臨床現場で、さらによい抗ウイルス効果又はさらによい治療効果につながり得る。
【０１０７】
上述したように、ＩＦＮは様々なメカニズムを通じて細胞増殖を抑制し、強力な抗腫瘍効果を示す。細胞培養系を用いて、いくつかのインビトロ抗増殖試験が確立され、この分野で良く記述されている。これらのアッセイにおける細胞増殖は、細胞数の計測、クリスタルバイオレットバイオアッセイ（９２、９３）、ニュートラルレッド色素に対する化学感度（９４〜９６）、放射ラベルヌクレオチドの取込み（９７）、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の増殖細胞ＤＮＡへの取込み（９８）、テトラゾリウム塩の使用（９９、１００）により測定され得る。
【０１０８】
ヒトリンパ芽球様Ｄａｕｄｉ細胞株は、ＨｕＩＦＮ−αの抗増殖効果に極めて敏感であり、懸濁培養物内でのその増殖は、その細胞数の定量を容易にする（１０１）。この細胞株は、長年にわたって、ＨｕＩＦＮ−α及びハイブリッドの抗増殖活性を測定するために用いられてきた（１０２）。その他の細胞株も、試験試薬の抗増殖活性を試験するために用いられている。
【０１０９】
ノバフェロンタンパク質の抗増殖活性は、様々なヒト腫瘍異種移植片を有する動物モデルに対するノバフェロン投与による腫瘍塊成長の阻害を観察することにより、インビボで測定された。ノバフェロンのインビボ抗腫瘍効果はＨｕＩＦＮ−α２ｂと比較され、一部異種移植片モデルでは化学的抗腫瘍剤とも比較された。
【０１１０】
以下に詳述されるように、本発明者らは、標準Ｄａｕｄｉ細胞方法を用いて測定されたインビトロ抗増殖活性が、おそらく全ての天然ＨｕＩＦＮの中で最も強力な抗増殖活性を示す天然ＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも、さらに４００倍強力であることを見出した。ノバフェロンは、本発明者らがインビトロで試験した全てのヒト癌細胞株について天然ＨｕＩＦＮ−α２ｂよりもさらに強力又は高められた阻害を示したため、ノバフェロンの増加された抗増殖強度は広く普遍的であった。これは、ノバフェロンによるヒト癌の強力な阻害が選択的ではないことを示す。全ての試験されたタイプのヒト癌細胞株に対するノバフェロンの増加された抗増殖活性の程度には幅があったが、ノバフェロンは、臨床現場で幅広い抗癌剤となる可能性を有している。これは、化学的抗癌剤、モノクローナル抗体及びその他の標的特異性抗癌剤よりも優れた大きな利点である。
【０１１１】
後述される異種移植片を有する動物モデル実験は、さらに以下を確証する。
（１）ノバフェロンのインビボ抗増殖効果は、天然ＨｕＩＦＮ−α２ｂと比較して顕著に高められ又はさらに強力であった。
【０１１２】
（２）遥かに低い用量において、ノバフェロンのインビボ抗増殖効果は、同一の異種移植片モデルで試験された化学的試薬である５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）よりも高かった。
【０１１３】
（３）ノバフェロンは、異種移植片モデルにおいて９０％以上の癌成長阻害を達成することができたが、処置動物において、体重減少、活性変化及びその他のマイナスの副作用を誘導することはなく、この点において、５−ＦＵ処理動物での相当な体重減少及び活性減少と極めて対照的であった。
【０１１４】
このような結果は、天然ＨｕＩＦＮ−α２ｂと比較して、ノバフェロンのインビトロ及びインビボ抗増殖特性が大いに高められることを意味する。ノバフェロンの高められた抗増殖効力は、マウス動物モデルにおけるヒト癌成長の効果的な阻害（＞９０％）につながり、このような阻害は、試験された全てのタイプのヒト癌に対して極めて広く作用し、古典的な化学的抗癌剤である５ＦＵよりも優れると考えられる。このような結果はまた、ノバフェロンによる癌細胞成長の強力な阻害が、癌細胞に対しては極めて特異的であるが、ノバフェロン処置動物における正常な摂食及び行動、及び減少しなかった体重により裏付けられるように、正常細胞に対してはそうではないことを示している。したがって、ノバフェロンは、全ての又は主要なヒト癌に対して作用する潜在力を有している。
【０１１５】
好ましい実施形態において、配列識別番号１のポリヌクレオチド配列を用いる組換え技術によって製造され、又は化学的に合成されたノバフェロンタンパク質（配列番号２）の完全又は部分的分子（複数の場合あり）は、ヒト及び／又は非ヒト種で、ヒト由来又は非ヒト由来の任意及び／又は全ての腫瘍及び癌の治療及び／又は予防に応用され得る。これらの腫瘍は、例えば、骨肉腫、多発性骨髄腫、ホジキン病、結節型かつ低分化型リンパ腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄白血病、乳房癌、黒色腫、乳頭腫、及び鼻咽頭癌腫、結腸癌、肝臓癌、及び黒色腫を含むが、これらに限定されない。
【０１１６】
別の実施形態において、配列識別番号１のポリヌクレオチド配列を用いる組換え技術によって製造され、又は化学的に合成されたノバフェロンタンパク質（配列番号２）の完全又は部分的分子（複数の場合あり）は、ヒト及び／又は非ヒト種で、任意の及び／又は全てのウイルス性疾患の治療及び／又は予防に応用され得る。感受性ウイルス感染の例は、ウイルス性脳心筋炎、インフルエンザ及びその他のウイルス性気道感染症、狂犬病及びその他のウイルス性動物原性感染症、及びアルボウイルス感染症、さらに単純ヘルペス性角膜炎、急性出血性結膜炎、帯状疱疹、及びＢ型及びＣ型感染、ＳＡＲＳ及び鳥インフルエンザ、ヒト免疫不全症候群（ＡＩＤＳ、ＨＩＶ）を含むが、これらに限定されない。
【０１１７】
別の実施形態において、配列識別番号１のポリヌクレオチド配列を用いる組換え技術によって製造され、又は化学的に合成されたノバフェロンタンパク質（配列番号２）の完全又は部分的分子（複数の場合あり）は、ヒトにおいて、任意の及び／又は全ての免疫系関連障害の治療及び／又は予防に応用され得る。免疫障害の例は、関節リウマチ、多発性硬化症、及びシェーグレン症候群糖尿病を含むが、これらに限定されない。ノバフェロンタンパク質は、移植片対宿主拒否反応の予防にも応用され得る。
【０１１８】
別の実施形態において、配列識別番号１のポリヌクレオチド配列を用いる組換え技術によって製造され、又は化学的に合成されたノバフェロンタンパク質（配列番号２）の完全又は部分的分子（複数の場合あり）は、任意の及び／又は全ての血管新生疾病に対して免疫補助剤として治療及び／又は予防に応用され得る。血管新生疾病の例は、血管腫、腫瘍誘導新生血管、加齢性黄斑変性症、及び糖尿病性網膜症を含むが、これらに限定されない。
【０１１９】
ノバフェロンタンパク質は、単独又は任意のその他のタンパク質／担体材料又はその他の構築物と共に、任意の投与／送達経路／方法で、任意の薬剤学的に許容可能な製剤／剤形としてヒト及び／又は非ヒト種に投与され得、それらは経口摂取、吸入、鼻内噴霧、腹腔内、静脈内、筋肉内、病巣内、又は皮下注射を含むが、これらに限定されない。
【０１２０】
活性成分としてのノバフェロンタンパク質を含有する薬剤学的製剤／剤形は、錠剤、丸薬、散剤、溶液又は懸濁剤、リポソーム、坐薬、注射剤、及び点滴液剤等の液体、固体、半固体、及び／又は任意のその他の臨床的に許容可能な形態である適切な固体又は液体担体を取り込むことにより製造され得る。ノバフェロン含有製剤／剤形は、この分野で記述されており、又は薬剤学的産業の実務において一般に許容される従来の担体、材料、方法を用いて製造され得る。ノバフェロン含有製剤／剤形は、この分野で記述されておらず、又は薬剤学的産業において使用されない非従来的な方法、材料を用いても製造され得る。
【０１２１】
例えば、非経口剤形は、通常、水、生理食塩水、その他の平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロール等の薬剤学的及び生理学的に許容可能な材料からなる注射可能な流体である。さらに、前記注射可能な流体は、ノバフェロンタンパク質以外にヒト血清アルブミン又は血漿製剤等のその他のタンパク質を担体として含み得る。前記薬剤学的製剤／剤形は、湿潤剤又は乳化剤、保存剤及びｐＨ緩衝剤（例えば、酢酸ナトリウム又はソルビタンモノラウレート）等の非毒性補助物質を少量含んでもよい。製剤化方法は、当業者には良く知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（７５）に開示されている。
【０１２２】
特定のノバフェロンタンパク質製剤／剤形は、意図する臨床応用及び／又は投与方法により決定され、周知の技術を用いて、いかなる当業者によっても製造され得る。例えば、注射可能な流体以外に、局所及び経口剤形も用いられ得る。局所製剤は、点眼剤、軟膏剤、及び噴霧剤を含むが、これらに限定されない。経口剤形は、液体（例えば、シロップ剤、溶液剤、又は懸濁剤）又は固体（例えば、散剤、丸薬、錠剤、又はカプセル剤）を含むが、これらに限定されない。固体製剤／剤形に対して、従来の非毒性固体担体は、薬剤学的等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、又はステアリン酸マグネシウムを含むが、これらに限定されない。これらの製剤／剤形を製造する実際の工程及び／又は方法は当業者に良く知られているか、又は自明である（７５）。
【０１２３】
ノバフェロンタンパク質の薬剤学的に許容可能な製剤／剤形は、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、経皮、腹腔内、筋肉内、肺内、膣内、直腸内又は眼球内送達を含むが、これらに限定されない様々な経路で、外傷治療の際に直接局所的にヒト及び／又は非ヒト種に投与されてもよい。
【０１２４】
前記製剤／剤形内のノバフェロンタンパク質の濃度／量は、臨床実務により、＞０〜１．０モラーまで、かつ／又は＞０〜１００％（重量／重量）まで多様であってよい。それぞれの及び／又は全てのノバフェロン製剤／剤形の正確な投与量、投与間隔、及び治療期間は、臨床実験、病状、患者の状態及び医療提供者により決定される。好ましい実施形態において、タンパク質分解、全身対局所的輸送、及び新たなプロテアーゼ合成速度のみならず、年齢、体重、全体的な健康、性別、食事、投与時間、薬物間相互作用、及び疾患の重症度等に応じて、個別及び／又は総投与量、投与間隔、治療期間、及び必要な治療コースを含むが、これらに限定されないノバフェロン投与に対する調節が必要であることがあり、当業者により日常的な実験によって決定され得る。
【０１２５】
好ましい実施形態において、ヒト及び／又は非ヒト種の体に投与後、ノバフェロンタンパク質の循環中の半減期は変更され得る。このような変更は、インビボでのノバフェロン半減期の延長又は短縮を含むが、これに限定されない。ノバフェロンタンパク質のインビボ半減期の延長は、以下のものを含む様々な方法で達成され得るが、これらに限定されない。
【０１２６】
（１）ノバフェロン分子とモノクローナル抗体との間の複合体の形成。このような抗体は、好ましくはノバフェロンタンパク質の治療的機能を実質的に損傷させない部位でノバフェロンタンパク質に連結される（１０３）。
【０１２７】
（２）ノバフェロンの他のタンパク質／ポリペプチドとの融合複合体。ノバフェロン分子は、免疫グロブリンの正常領域（Ｆｃ）の断片等の他のタンパク質／ポリペプチドに組換え的に融合され得る（１０４）。
【０１２８】
（３）ノバフェロンタンパク質の接合。例えば、ノバフェロンタンパク質は、ポリエチレングリコール又は関連ポリアルキレングリコール部分等の非抗原性ポリマーと接合され得る（１０５〜１０８）。
【０１２９】
別の好ましい実施形態において、治療化合物は抗体、好ましくは抗ノバフェロンタンパク質抗体に接合され得る。前記治療化合物は、細胞毒性剤であってもよい。この方法において、細胞毒性剤は、ノバフェロン分子に対する接合抗体の結合により、腫瘍組織又は細胞に対して標的化され得、それにより、病気にかかった細胞を破壊して個数を減少させ、癌症状の軽減をもたらす。前記細胞毒性剤は、細胞毒性薬物、毒素及びそのような毒素の活性断片、及び放射性化学物質を含むが、これらに限定されない。適切な毒素及びそれに該当する断片は、ジフテリアＡ鎖、エクソトクシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシン等を含む。
【０１３０】
好ましい実施形態において、ノバフェロンタンパク質−エンコーディングポリヌクレオチド配列（配列番号１）の全長配列、部分的配列、及び／又は調節的配列は、当業者によって遺伝子療法関連投与で用いられ得る。ノバフェロンタンパク質−エンコーディングポリヌクレオチド（配列番号１）に基づくアンチセンス適用は、遺伝子療法（すなわち、ゲノムへの取込みのための）又はアンチセンス組成物として用いられ得、当業者によって理解されるであろう。
【０１３１】
遺伝子療法応用において、遺伝子が細胞内に導入され、これらの遺伝子によりエンコードされる標的タンパク質のインビボ合成が達成される。従来の遺伝子療法は、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの単一治療又は反復投与により持続的治療効果を達成する。一方、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、インビボで特定の遺伝子の発現を封鎖するための治療剤としても用いられ得る。短鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが細胞内に送達され、そこで阻害剤として作用し得ることは既に知られている（１０９）。
【０１３２】
好ましい実施形態において、ノバフェロンタンパク質−エンコーディングポリヌクレオチド（配列番号１）は、全長又は部分長でＤＮＡワクチンとして用いられ得る。ネイキッドＤＮＡワクチンがこの分野で一般に知られている（１１０）。全長又は部分長のノバフェロン−エンコーディング遺伝子（配列番号１）のＤＮＡワクチンとしての適用方法は当業者に広く知られており、ヒト及び／又は非ヒト種において、ノバフェロン遺伝子又はノバフェロン遺伝子の一部をノバフェロンタンパク質の全長又は部分長を発現するためのプロモーターの制御下に配置することを含むが、これに限定されない。
（実施例）
下記の実施例は、上記の発明の使用態様をより十分に説明し、また本発明の様々な態様を実施するための最良の形態を記載するために提示されている。これらの実施例は本発明の実際の範囲を全く限定せず、むしろ例示の目的で提示されるものとして理解される。ここで引用される全ての参考文献は、その全体が参照として包含される。
【実施例１】
【０１３３】
実施例１．ヒト白血球ｃＤＮＡからのヒトＩＦＮ−α遺伝子のＰＣＲ増幅
ヒト末梢血白血球から総ｍＲＮＡを抽出した。アドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）（商標）ＲＴ−ｆｏｒ−ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、米国、カリフォルニア州、マウンテンビュー）及びｃＤＮＡ合成プライマー（オリゴｄＴ１８）を用い、メーカーの推奨に従ってｃＤＮＡの調製を行った。
【０１３４】
ヒトＩＦＮ−αｃＤＮＡの増幅は、ＭＪ ＰＴＣサーマルサイクラーでのＰＣＲ技術によって行い、下記の条件を用いた。すなわち、２．５μｌ １０×ｐｆｘ増幅バッファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国、カリフォルニア州、カールズバッド）、０．７５μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２５μｌ プラチナｐｆｘＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国、カリフォルニア州、カールズバッド）０．７５μｌ ｃＤＮＡ、０．７５μｌ ５’プライマー（１０μｌ；ＩＦＮａＯ５：５’−ＴＧＧＴＧＣＴＣＡＧＣＴ（Ａ／Ｇ）ＣＡＡＧＴＣ−３’）、（配列番号３）０．７５μｌ ３’プライマー混合物（各１．７μＭ；
ＩＦＮａＯ３−１：５’−ＡＡＴＣＡＴＴＴＣＣＡＴＧＴＴＧ（Ａ／Ｇ）ＡＣＣＡＧ−３’（配列番号４）；
ＩＦＮａＯ３−２：５’−ＡＡＴＣＡＴＴＴＣＣＣＧＧＴＴＧＴＡＣＣＡＧ−３’（配列番号５）；
ＩＦＮａＯ３−３：５’−ＡＡＴＣＡＴＴＴＣＣＡＴＧＴＴＧＡＡＡＣＡＧ−３’（配列番号６）；
ＩＦＮａＯ３−４：５’−ＡＡＴＣＡＴＴＴＣＡＡＧＡＴＧＡＧＣＣＣＡＧ−３’（配列番号７）；
ＩＦＮａＯ３−５：５’−ＡＡＴＧＡＴＴＴＴＣＡＴＧＴＴＧＡＡＣＣＡＧ−３’（配列番号８）；
ＩＦＮａＯ３−６：５’−ＡＡＴＣＡＴＴＴ（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ｇ）ＡＴＧＴＴＧＡＡＣＣＡＧ−３’（配列番号９）；
ＩＦＮａＯ３−７：５’−ＧＡＴＣＡＴＴＴＣＣＡＴＧＴＴＧＡＡＴＧＡＧ−３’（配列番号１０）；
ＩＦＮａＯ３−８：５’−ＧＡＧＴＣＧＴＴＴＣＴＧＴＧＴＴＧＧＡＴＣＡＧ−３’（配列番号１１）。
【０１３５】
増幅されたＰＣＲ生成物を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、切り取ってゲル精製し、メーカーの推奨に従ってｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ又はｐＣＲ−４−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国、カリフォルニア州、カールズバッド）にクローニングした。プリズム・レディ・リアクション・ダイ・ターミネーション・ミックス（Ｐｒｉｓｍ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｉｘ）で、ＡＢＩ自動シーケンサ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国、カリフォルニア州）により自動シーケンスを行った。
【０１３６】
上記のクローン中に、ＩＦＮａ６、ＩＦＮａ７及びＩＦＮａ１６をコードしている配列について所望の挿入がなかったため、型特異的プライマーを除く他は、上記の条件で再びＰＣＲを行った。ＩＦＮａ６の特異的増幅のために、５’及び３’プライマーはそれぞれ、ＩＦＮａＯ５：５’−ＴＧＧＴＧＣＴＣＡＧＣＴ（Ａ／Ｇ）ＣＡＡＧＴＣ−３’（配列番号３）、及びＩＦＮａＯ３−８：５’−ＧＡＧＴＣＧＴＴＴＣＴＧＴＧＴＴＧＧＡＴＣＡＧ−３’（配列番号１１）とした。ＩＦＮａ７特異的増幅のための５’及び３’プライマーは、それぞれＩＦＮａ７ＵＯ：５’−ＡＴＧＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＴＴＴＣＴＴＴＡＣ−３’（配列番号１２）、及び、ＩＦＮａＯ３−５及びＩＦＮａＯ３−６の等モルの混合物とした。ＩＦＮａ１６特異的増幅のための５’及び３’プライマーは、それぞれＩＦＮａ７ＵＯ、及びＩＦＮａＯ３−７：５’−ＧＡＴＣＡＴＴＴＣＣＡＴＧＴＴＧＡＡＴＧＡＧ−３’（配列番号１０）とした。増幅された断片をｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ又はｐＣＲ−４−ＴＯＰＯベクターにクローニングし、上記のようにシーケンスした。
【０１３７】
全てのクローンＩ型ヒトＩＦＮ−アルファ遺伝子を、それぞれジーンバンクにおけるそれらのＤＮＡ配列と共にアラインメントした。これらの遺伝子のジーンバンクヌクレオチド登録番号をここに参照すると、ＮＭ＿０２４０１３（ＩＦＮ−α１）、ＮＭ＿０００６０５（ＩＦＮ−α２）、ＮＭ＿０１０５０４（ＩＦＮ−α４）、ＮＭ＿０１０５０５（ＩＦＮ−α５）、ＮＭ＿００８３３５（ＩＦＮ−α６）、ＮＭ＿００８３３４（ＩＦＮ−α７）、ＮＭ＿００８３３６（ＩＦＮ−α８）、ＮＭ＿００２１７１（ＩＦＮ−α１０）、ＮＭ＿００２１７２（ＩＦＮ−α１４）、ＮＭ＿００２１７３（ＩＦＮ−α１６）、ＮＭ＿０２１２６８（ＩＦＮ−α１７）、ＮＭ＿００２１７５（ＩＦＮ−α２１）である。
【実施例２】
【０１３８】
実施例２．Ｉ型ＨｕＩＦＮ−含有プラスミドのシャッフリングライブラリーの構築
Ｉ型ヒトＩＦＮ−αの一つのコード配列を含有するプラスミドを構築するために、成熟ヒトＩ型ＩＦＮタンパク質の領域をコードする個々のｃＤＮＡに基づき、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位を有する１５対のオリゴヌクレオチドを合成した（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社、米国、カリフォルニア州、南サンフランシスコ）。これらのタンパク質のジーンバンクヌクレオチド登録番号をここに参照すると、ＮＭ＿０２４０１３（ＩＦＮ−α１）、ＮＭ＿０００６０５（ＩＦＮ−α２）、ＮＭ＿０１０５０４（ＩＦＮ−α４）、ＮＭ＿０１０５０５（ＩＦＮ−α５）、ＮＭ＿００８３３５（ＩＦＮ−α６）、ＮＭ＿００８３３４（ＩＦＮ−α７）、ＮＭ＿００８３３６（ＩＦＮ−α８）、ＮＭ＿００２１７１（ＩＦＮ−α１０）、ＮＭ＿００２１７２（ＩＦＮ−α１４）、ＮＭ＿００２１７３（ＩＦＮ−α１６）、ＮＭ＿０２１２６８（ＩＦＮ−α１７）、ＮＭ＿００２１７５（ＩＦＮ−α２１）である。実施例１でテンプレートとして構築したプライマー及びプラスミドを、標準的ＰＣＲ（１１１）で使用した。その結果得られた生成物を制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、多重クローニング領域にＢａｍＨＩ部位及びＥｃｏＲＩ部位を有するｐＢＶ２２０（８６）の派生体発現プラスミドである大腸菌の発現ベクターｐＢＶＢにクローニングした。これらの最終構築物を、全てＤＮＡシーケンス解析（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）で確認した。
【０１３９】
ヒトＩＦＮ ＯＲＦを含有するＤＮＡ断片を、一対のオリゴヌクレオチドＢＶＦ４：５’−ＡＧＧＧＣＡＧＣＡＴＴＣＡＡＡＧＣＡＧ−３’（配列番号１３）及びＢＶＲ３：５’−ＴＣＡＧＡＣＣＧＣＴＴＣＴＧＣＧＴＴＣＴＧ−３’（配列番号１４）を用いたＰＣＲによって、及び先に構築したＩ型ＨｕＩＦＮ含有プラスミドを使用して増幅した。その結果得られた生成物を同量ずつ混合し、Ｓｔｅｍｍｅｒによる手順（１１２）に従ってＤＮａｓｅＩ消化及びＰＣＲアセンブリに供した。
【０１４０】
アセンブリしたＰＣＲ生成物を、さらに一対のインナープライマー：ＢＶＦ：５’−ＧＡＡＧＧＣＴＴＴＧＧＧＧＴＧＴＧＴＧ−３’（配列番号１５）及びＢＶＲ：５’−ＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣ−３’（配列番号１６）を用いて増幅し、続いてＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ消化し、ＲＥのＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで切断した大腸菌発現ベクターｐＢＶＢに再びクローニングした。これらの最終構築物を、全てＤＮＡシーケンス解析で確認した。プラスミド含有シャッフルＨｕＩＦＮ−α遺伝子を大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換させた。
【０１４１】
上記の全てのＰＣＲ手順は、ＰＣＲ増幅又はＰＣＲアセンブリのいずれかであり、忠実度の高いＤＮＡポリメラーゼの代わりに通常のＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社、米国、マサチューセッツ州）を使用した。
【実施例３】
【０１４２】
実施例３．シャッフリングライブラリーのスクリーニング
新規に形質転換させた大腸菌ＤＨ５α細胞を３７℃で一晩、ＬＢプレートで増殖させた。単一コロニーを個別に採取し、９６ウェルプレート中５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１００μｌのＬＢ培地に播種した。コロニーを３０℃、２５０ｒｐｍで振とうした。一晩培養した後、９６ウェルプレート中５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１００μｌのＬＢ培地に、１０μｌのバクテリア培養物をデュプリケートで播種した。元のプレート（いわゆるストックプレート）はしばらく４度で保存した。デュプリケートのプレート中の細胞を、ＯＤ６００が０．４になるまで３０℃で増殖させ、その後４２℃で誘導した。４時間の熱誘導の後、凍結融解サイクルを開始するためバクテリア培養物を−８０℃の冷凍室へ直接入れた。２サイクルの凍結融解の後、バクテリア懸濁液／溶解物を所望の濃度に希釈し、抗増殖試験のためのＤａｕｄｉ細胞培養（１０１）又は抗ウイルス試験のためのＷｉｓｈ細胞培養（１１３）にさらした。
【０１４３】
スクリーニングの各段階において、２０，０００個のコロニーを最初にスクリーニングし、抗増殖活性又は抗ウイルス活性が最も高い約１００個のコロニーをさらなる確認試験のために選抜した。ストックプレート中の選抜したバクテリア培養物を、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢプレートにストリーキングした。単一コロニーを３７℃で一晩増殖させ、採取し、試験管中に５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１ｍｌのＬＢ培地に播種した。試験管中のバクテリアを３０℃で一晩、２５０ｒｐｍで振とうしながら増殖させた。その後、４０μｌの増殖バクテリアを、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含む１ｍｌのＬＢが入った別の試験管の組の一つに播種した。その後、試料を前記最初のスクリーニング段階に関して上述したような発現誘導、細胞培養回収、凍結融解サイクル処理、及び抗増殖又は抗ウイルス試験の各段階に供した。
【０１４４】
スクリーニングの各段階において、抗増殖活性又は抗ウイルス活性が最も高い約２０個のコロニーを、確認試験の後プラスミド作製のために選抜し、それらの挿入を自動シーケンスした。特有のＤＮＡ配列を有する挿入を、ＰＣＲプライマー対ＢＶＢＦ：５’−ＡＣＣＡＴＧＡＡＧＧＴＧＡＣＧＣＴＣ−３’（配列番号１７）；及びＢＶＲ：５’−ＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣ−３’（配列番号１６）を用いて増幅した。なお、これらはそれぞれｐＢＶＢベクターの多重クローニング部位の上流及び下流におけるフランキング配列である。増幅したＰＣＲ生成物を、次の段階のシャッフリングライブラリー構築に用いた。
【０１４５】
抗増殖又は抗ウイルス活性のいずれかの増加に基づき、５サイクルのスクリーニング段階を実施した。
【実施例４】
【０１４６】
実施例４．大腸菌における組換えタンパク質の発現及び精製
ノバフェロンタンパク質（配列番号２）は大腸菌で発現された。開始コドンＡＴＧを人工的に付加した配列番号１のリーディングフレームを、λＰＲＰＬプロモーター（１１４）の制御の下、温度誘導性ｐＢＶＢベクターにクローニングした。ノバフェロンの発現プラスミド、ｐＢＶＢＮＦをＤＨ５α細胞に形質転換させた。単一コロニーを個別に採取し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ｍｌのＬＢ培地に播種し、３０℃で８時間培養した。その後、培養バクテリアの２ｍｌを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌの培地で、撹拌しながらさらに３０℃で一晩培養した。翌朝、一晩培養したバクテリアを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む大量のＬＢ培地に１：１０〜１：２０の比率で播種し、撹拌しながら３０℃で培養した。培養物が増殖の対数期中期（Ａ５５０＝０．５〜０．６）に達した時、培養温度を急激に４２℃まで上昇させ、ノバフェロンの発現を誘導するために４時間保持した。４時間の熱誘導の後、バクテリア細胞を遠心分離し、ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）で３回洗浄した後、増殖段階を行うまで−８０℃で保存した。
【０１４７】
殆どのノバフェロンタンパク質分子がここに記載される大腸菌生産システムに溶解したが、細胞質では過剰に発現した。そこで、細胞を細胞溶解バッファＩ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ）（１１５）中でリゾチーム消化によって破壊した。残存する無傷の細胞及びスプライスＤＮＡ分子を破壊するため、溶解物をさらに超音波破砕した。その後溶解物を遠心分離した。
【０１４８】
その後、浮遊物中の可溶性ノバフェロンタンパク質分子を疎水性イオン交換クロマトグラフィ及びゲル濾過法によって実質的に精製した。第１に、前記浮遊物をフェニルセファロース６ファーストフローカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）に加え、通過させた。第２に、ノバフェロンタンパク質を含むフラクションをＰＯＲＯＳ５０Ｄカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）に適用した。第３に、前記ノバフェロン分子を含むフラクションをＰＯＲＯＳ５０ＨＳカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）による精製に供し、最後に、回収したノバフェロン分子をさらにハイロード２６／１００スーパーデックス７５ｐｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、米国）により精製した。
【０１４９】
純ノバフェロンタンパク質の純度を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって確認した。純組換えノバフェロンタンパク質は１９〜２０ＫＤａの分子量（ＭＷ）の単一バンドを示した。質量分析は、精製ノバフェロン分子の純度が＞９８％、分子量が１９３１３ダルトンであることを示し、そのアミノ酸配列から推定される分子量１９３１５ダルトンに一致した。
【実施例５】
【０１５０】
実施例５．大腸菌における組換えＨｕＩＦＮ−α２ｂの発現及び精製
ＨｕＩＦＮ−α２ｂの発現プラスミドｐＢＶ２ｂは、熱誘導性λＰＲＰＬプロモーターの制御下にあるＨｕＩＦＮ−α２ｂ（ジーンバンクヌクレオチド登録番号ＮＭ＿０００６０５）の成熟タンパク質のｃＤＮＡコード領域を含む。ＨｕＩＦＮ−α２ｂの発現は、Ｊｏｓｅｐｈ ＳとＤａｖｉｄ ＷＲによるプロトコル（１１６）に従って行われた。
【０１５１】
発現プラスミドｐＢＶ２ｂをＤＨ５−α細胞に形質転換させた。単一コロニーを個別に採取し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ｍｌのＬＢ培地に播種し、３０℃で８時間培養した。その後、培養バクテリアの２ｍｌを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌの培地で、撹拌しながらさらに３０℃で一晩培養した。翌朝、一晩培養したバクテリアを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む大量のＬＢ培地に１：１０〜１：２０の比率で播種し、撹拌しながら３０℃で培養した。培養物が増殖の対数期中期（Ａ５５０＝０．５〜０．６）に達した時、培養温度を急激に４２℃まで上昇させ、ＨｕＩＦＮ−α２ｂの発現を誘導するために４時間保持した。４時間の熱誘導の後、バクテリア細胞を遠心分離し、ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）で３回洗浄した後、増殖段階を行うまで−８０℃で保存した。
【０１５２】
ＨｕＩＦＮ−α２ｂタンパク質はここで説明される大腸菌発現システムに対して不溶性であったため、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇに記載のプロトコル（１１５）に従い、封入体再生及び洗浄の工程を実施した。簡単に述べると、回収したバクテリア細胞を細胞溶解バッファＩ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ）中に再懸濁し、リゾチーム及び超音波処理によって溶解した。封入体を氷冷細胞溶解バッファＩＩ（０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００を添加した細胞溶解バッファＩ）で３回洗浄した。
【０１５３】
再生された封入体を、７Ｎグアニジン中に室温で４時間撹拌しながら懸濁することにより破壊した。次に４℃で１５分間遠心分離し、変性したタンパク質を０．１５Ｍ、ｐＨ９．５のボレックスバッファ中で４８時間、４℃でリフォールディングさせた。リフォールディングの最終段階で、ｐＨをＨＣｌで７．４に調整した。
【０１５４】
その後、リフォールディングされたＨｕＩＦＮ−α２ｂを含む溶液を疎水性イオン交換クロマトグラフィ及びゲル濾過法によって精製した。第１に、前記溶液をフェニルセファロース６ファーストフローカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）に加え、通過させた。第２に、ＨｕｌＩＦＮ−α２ｂを含むフラクションをＰＯＲＯＳ５０Ｄカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）に適用した。第３に、前記ＨｕｌＩＦＮ−α２ｂを含むフラクションをＰＯＲＯＳ５０ＨＳカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）による精製に供した。最後に、回収したＨｕＩＦＮ−α２ｂ分子をさらにハイロード２６／１００スーパーデックス７５ｐｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、米国）により精製した。純ＨｕＩＦＮ−α２ｂタンパク質は、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって単一バンドを示し、質量分析によって確認されたように、その純度は＞９８％であった。
【実施例６】
【０１５５】
実施例６．ノバフェロンの抗ウイルス活性の測定
Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ＪＡによる古典的プロトコル（１１３）に記載されているようなＷＩＳＨ−ＶＳＶシステムを用いて抗ウイルス活性を測定した。１日目、ＷＩＳＨ細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＣＬ２５）を１４，０００細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播種し、３７℃で培養した。２４時間後、２倍ずつ連続希釈したノバフェロン、ＨｕＩＦＮ−α２ｂ、ＷＨＯヒトＩＦＮ国際基準又はブランク培養培地を各ウェルに加え、３７℃でさらに２４時間培養した。３日目、培地を除去し、１，０００ＰＦＵの水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ、ＡＴＣＣ、カタログ番号ＶＲ−１４２１）を含む培地と交換した。細胞を再び３７℃で２４時間培養し、その後０．８５％ＮａＣｌで洗浄して死細胞を除去した。次に、培養プレートをダイ・フィクサー溶液（０．５％クリスタルバイオレット、５％ホルマリン（Ｖ／Ｖ）、５０％エタノール（Ｖ／Ｖ）、及び０．８５％ＮａＣＬ）に１時間浸漬した。その後ダイ・フィクサー溶液を静かに移し、マイクロプレートを水道水で十分に洗浄し、乾燥させた。染色された細胞を０．２ｍｌの２−メトキシエタノールで溶解した。クリスタルバイオレットバイオアッセイのため、モデルオプシスＭＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）においてプレートを５５０ｎｍで読み取った。
【０１５６】
全ての実験はトリプリケートで実施され、ノバフェロン及びＨｕＩＦＮ−α２ｂ試料は同じプレート内で試験された。ここで調製されたノバフェロン及びＨｕＩＦＮ−α２ｂの抗ウイルス活性は同時に検査され、国立生物学的製剤研究所（ＮＩＢＳＣ、米国）から得られるＷＨＯ国際基準９４／７８４（ｒＨｕＩＦＮ−αコンセンサス）及び９５／６５０（ｒＨｕＩＦＮ−α２ａ）を参照し、抗ウイルス単位（国際単位、又はＩＵ）を決定した。
【０１５７】
ＷＩＳＨのＶＳＶに対する精製ノバフェロンタンパク質の測定された抗ウイルス活性は２．５×１０９ＩＵ／ｍｇであり、一方、ＨｕＩＦＮ−α２ｂの抗ウイルス活性は２．０×１０８ＩＵ／ｍｇである。このデータは、ノバフェロンタンパク質の抗ウイルス活性がＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも約１２．５倍強力であることを示している。
【実施例７】
【０１５８】
実施例７．ノバフェロンの抗増殖活性
抗増殖活性アッセイを、基本的にＥｖｉｎｇｅｒとＰｅｓｔｋａ（１０１）によって述べられているように実施した。
【０１５９】
Ａ．ヒト腫瘍細胞株の細胞培養
ヒト腫瘍細胞株を様々な組織、すなわち、ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、米国、２０１０８ バージニア州、マナサス、Ｐ．Ｏ．ボックス１５４９）、ＤＳＭＺ（ドイツ国立生物材料資源センター、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ、ドイツ国、３８１２４ ブラウンシュヴァイク、マシェローダー・ヴェーグ １ｂ）、ＪＣＲＢ（ジャパニーズ・コレクション・オブ・リサーチ・バイオリソーシズ−セルバンク、独立行政法人医薬基盤研究所、日本国、５６７−００８５ 大阪府、茨木市、彩都あさぎ７−６−８）から購入した（下記表１）。
【０１６０】
【表１】
抗増殖活性試験に用いた全ての細胞を、５％ＣＯ２を含む湿潤雰囲気において３７℃で培養した。５〜２０％加熱不活性化した米国Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製のウシ胎仔血清ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２Ｋ、及び１６４０又は１６４０プラスＦ１２（全てＧｉｂｃｏ ＢＲＬ社製、米国）等の基本増殖培地で、各細胞の増殖マニュアルに従い細胞を増殖させた。それぞれの細胞株のための前記基本増殖培地は下記表２に列挙されている。全ての細胞株を倒立顕微鏡下の培養プレート内で毎日検査した。細胞を回収し、トリパンブルー色素排除によって決定される生存能力が９０％を超える対数増殖期における実験に用いた。標準的な血球計数器で細胞数及び生存能力を検査した。
【０１６１】
【表２】
Ｂ．抗増殖アッセイのための工程
対数増殖期の細胞株を、２×１０３〜６×１０４細胞／ｍｌ（細胞株によって異なる。表２を参照）の濃度で、加温（３６℃）した培地に穏やかに懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、３７℃で６〜８時間培養した。続いて培養培地で希釈した同量（１００μｌ）のノバフェロン又はＨｕＩＦＮ−α２ｂをトリプリケートでウェルに添加した。プレートを４〜５秒穏やかに撹拌して内容物を混合し、３７℃で６日間培養した。比較可能性を保障するため、ノバフェロン及びＨｕＩＦＮ−α２ｂ試料を同じプレート内で試験した。
【０１６２】
二つの方法を用いて、細胞ウェル内の細胞数を測定し、細胞数に応じたノバフェロン及びＨｕＩＦＮ−α２ｂの抗増殖活性を算出した。
懸濁細胞の細胞数を測定するため、直接細胞計測法を用いた。培養６日後、懸濁細胞培養物をトリパンブルーで希釈し（最終濃度０．０２％）、血球計測器を用いて細胞数を直接計測した。
【０１６３】
接着細胞の細胞数を計測するため、クリスタルバイオレットバイオアッセイ法を用いた（９３）。培養６日後、ＰＢＳを培養ウェル内でピペッティングすることにより死細胞を除去した。次に、ウェルをダイ・フィクサー溶液で満たし、生細胞を１時間染色した。ダイ・フィクサー溶液は、蒸留水中に０．５％クリスタルバイオレット、５％ホルマリン（Ｖ／Ｖ）、５０％エタノール（Ｖ／Ｖ）、及び０．８５％ＮａＣｌを含む。その後、マイクロプレートを水道水で十分に洗浄し、乾燥させた。染色された細胞を０．２ｍｌの２−メトキシエタノールで溶解した。５５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ５５０）（モデルオプシスプレートリーダ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）を測定し、細胞数の相対指標として用いた。
【０１６４】
下記式によって増殖阻害率を算出した。阻害率％＝（１−（Ｅ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ））×１００（式中、Ｅは６日目のノバフェロン又はＨｕＩＦＮ−α２ｂ処理ウェルにおける細胞数又はＯＤ５５０値、Ｂは細胞培養０日目の細胞数又はＯＤ５５０値、Ｃは６日目の未処理ウェルにおける細胞数又はＯＤ５５０値）。
【０１６５】
阻害率は、組成物の濃度に連動して発現した。ノバフェロン又はＨｕＩＦＮ−α２ｂのＩＣ５０を試料濃度の範囲を用いて推定した。データは斜面曲線Ｙ＝ｍｉｎ＋（Ｍａｘ−ｍｉｎ）／（１＋１０＾（ＩＣ５０−Ｘ））（式中、Ｘは薬剤の対数濃度、Ｙは阻害率、Ｍｉｎ又はＭａｘは阻害率プラトーの最小値又は最大値）のＳ字曲線（１１７）に沿った。特定の標的に対する様々な組成物のＩＣ５０が比較され、ＩＣ５０が低いほど強力な組成物を示している。
【０１６６】
ノバフェロン又はＨｕＩＦＮ−α２ｂの濃度、及び対応するＤａｕｄｉ細胞株に対する細胞増殖阻害率が図４に示されている。このデータに基づき、Ｄａｕｄｉ細胞増殖を阻害するノバフェロン又はＨｕＩＦＮ−α２ｂのＩＣ５０は０．０１７４ｐｍｏｌ及び６．９５５０ｐｍｏｌと算出された。したがって、ノバフェロンのＩＣ５０はＨｕＩＦＮ−α２ｂのそれの約４００分の１であり、ＨｕＩＦＮ−α２ｂと比較してノバフェロンの抗増殖効力の約４００倍の増加を表している。
【０１６７】
黒色腫由来の４つの細胞株（Ａ−３７５、ＩＧＲ−１、ＩＧＲ−３７、ＩＰＣ−２９８）、５つの結腸直腸腺癌細胞株（ＨＣＴ−８、ＳＷ１１１６、ＬＳ１８０、ＤＬＤ−１、ＬＳ１７４Ｔ）、４つの肝臓癌細胞株（Ｈｅｐ Ｇ２、Ｈｅｐ ３Ｂ、ＨｕＨ−７、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５）、３つのリンパ腫細胞株（ＨＬ−６０（Ｓ）、Ｄａｕｄｉ、Ｌ−４２８）、２つの前立腺癌細胞株（ＤＵ１４５、ＰＣ−３）、２つの子宮頸癌細胞株（ＨｅＬａ、Ｃ−３３Ａ）、１つの胃腺癌細胞株（ＭＫＮ１）、１つの肺癌細胞株（Ａ５４９）及び１つの食道癌細胞株（ＫＹＳＥ３０）を含む２３の癌細胞株に対するノバフェロンの抗増殖活性を評価し、ＨｕＩＦＮ−α２ｂのそれと比較した。ノバフェロンは、試験した全ての癌細胞株に対してＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも遥かに強力な抗増殖活性を示した。効力の増強の程度は癌細胞株によって異なり、１６〜１１３４倍に及んだ（下記表３）。
【０１６８】
【表３】
【実施例８】
【０１６９】
実施例８．インビボ腫瘍モデル実験
Ａ．細胞培養及びインビボヒト腫瘍異種移植モデル
結腸癌細胞株（ＬＳ１８０）、黒色腫細胞株（Ａ−３７５）及び肝臓癌細胞株（Ｈｅｐ Ｇ２）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、メリーランド州、ロックビル）から入手した。前立腺癌細胞株（ＰＣ−３）はドイツ国立生物材料資源センター（ＤＳＭＺ、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ａｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ、ドイツ国）から入手した。リンパ腫細胞株（ＨＬ６０（ｓ））はジャパニーズ・コレクション・オブ・リサーチ・バイオリソーシズ−セルバンク（ＪＣＲＢ、日本）から購入した。全細胞を指示に従って培養した（表１参照）。簡単に述べると、ＬＳ１８０及びＨｅｐ Ｇ２をＭＥＭ培地で培養した。Ａ−３７５をＤＭＥＭで培養した。両培地に１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、及び１．０ｍＭピルビン酸ナトリウムを添加した。ＰＣ−３及びＨＬ６０（Ｓ）細胞を、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０で培養した。全細胞を５％ＣＯ２雰囲気中に３７℃で保持した。
【０１７０】
ヒト癌異種移植モデルをＢｅｖｅｒｌｙらによる方法（１１８）を用いて確立した。対数期増殖癌細胞を組織培養プレートから回収、洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．５、２０ｍＭ）中に再懸濁した。６週齢の無胸腺ヌードＢａｌｂ／ｃマウスにおいて、６×１０６細胞／０．３ｍｌ（ＰＣ−３、ＨｅｐＧ２）、４×１０６細胞／０．３ｍｌ（ＬＳ１８０）、２×１０７細胞／０．３ｍｌ（ＨＬ６０（ｓ））又は８×１０６細胞／０．３ｍｌ（Ａ−３７５）を脇腹領域の両側に皮下注射することにより、皮下腫瘍異種移植片を形成させた。
各インビボ腫瘍モデルについて、癌細胞播種から６日目に、癌保有マウス（腫瘍体積は約１００ｍｍ３）を各群で等しい頭数になるよう無作為に７〜８群に分別し、処理を開始した。
【０１７１】
ノバフェロン及びＨｕＩＦＮ−α２ｂをＰＢＳ溶液で処方した。ＰＢＳのみ、様々な用量のノバフェロン、又はＨｕＩＦＮ−α２ｂの毎日の皮下注射を、マウスの群分けの日から総計３０日間（ＰＣ−３、ＨｅｐＧ２、Ａ−３７５）、２８日間（ＬＳ１８０）、又は２１日間（ＨＬ６０（ｓ））継続した。５−ＦＵの処理については、３０ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵを２日に１回、合計５回静脈内投与した。群及び処理用量を以下にまとめる。
群１（対照）：ＰＢＳ、毎日
群２（低用量のノバフェロン）：１．２５μｇ／ｋｇ、毎日
群３（中用量のノバフェロン）：１２．５μｇ／ｋｇ、毎日
群４（高用量のノバフェロン）：１２５μｇ／ｋｇ、毎日
群５（低用量のＨｕＩＦＮ−α２ｂ）：１．２５μｇ／ｋｇ、毎日
群６（中用量のＨｕＩＦＮ−α２ｂ）：１２．５μｇ／ｋｇ、毎日
群７（高用量のＨｕＩＦＮ−α２ｂ）：１２５μｇ／ｋｇ、毎日
群８（５−ＦＵ）：３０ｍｇ／ｋｇ、２日に１回、計５回静脈内投与
処理を開始してから、週に１度キャリパーで腫瘍を測定した。下記式を用いて腫瘍体積を算出した。体積＝０．５×（幅）２×（長さ）。処理中止の日（処理開始から３０日後）にマウスを屠殺した。固形腫瘍を分離し、写真撮影して測定した。
【０１７２】
下記式を用いて増殖阻害率を算出した。阻害率＝［１−Ｔ／Ｃ］×１００％（式中、Ｔはノバフェロン、ＨｕＩＦＮ−α２ｂ、又は５−ＦＵ処理群の平均腫瘍重量、Ｃは対照群の処理後の平均腫瘍重量）。
【０１７３】
Ｂ．ヒト前立腺癌異種移植モデル
前立腺癌ＰＣ−３異種移植片を、１．２５、１２．５又は１２５μｇ／ｋｇのノバフェロンの３０日間の皮下注射で処理した。ノバフェロンはＰＣ−３腫瘍増殖の強力な用量依存的阻害を示した（Ｐ＜０．０５）。図５及び下記表４に示されるように、ノバフェロン処理群におけるＰＣ−３腫瘍増殖は、ＰＢＳ処理対照群と比較してかなり抑制された。例えば、ノバフェロン処理群（１２５μｇ／ｋｇ）におけるＰＣ−３異種移植腫瘍塊の平均重量は０．０９１±０．０８１ｇであり、対照動物の１．９４８±０．５６７ｇと比較して極めて有意に減少した（Ｐ＜０．００１）（表４）。言い換えると、１２５μｇ／ｋｇの３０日間の処理は、ＰＣ−３腫瘍増殖の９５．３％の阻害を達成した（表４）。
【０１７４】
【表４】
Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスに６×１０６生ＰＣ−３細胞を皮下注射で導入した後、マウスをノバフェロン（１．２５μｇ／ｋｇ、１２．５μｇ／ｋｇ又は１２５μｇ／ｋｇ）の毎日の皮下注射により３０日間処理した。結果を平均腫瘍体積（ｍｍ３）で表した。図５は、ＰＢＳ対照群と比較して、３種類のノバフェロン用量の全てがＰＣ−３腫瘍増殖の用量依存的阻害を呈することを示した（Ｐ＜０．０５）。１２５μｇ／ｋｇのノバフェロンは、同用量のＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも遥かに強力な、又はほぼ完全なＰＣ−３腫瘍増殖阻害を引き起こした（９５．３％対７５．６％、Ｐ＜０．０１）（表４）。
【０１７５】
高用量（１２５μｇ／ｋｇ）処理群において、ノバフェロン又はＨｕＩＦＮ−α２ｂのより長期間の処理が、腫瘍増殖阻害により大きな差異をもたらしたことは興味深い。２８日目のノバフェロン処理群におけるＰＣ−３腫瘍塊の平均体積が１０７．９±６８．７ｍｍ３であったのに対し、ＨｕＩＦＮ−α２ｂ処理群では６２０．７±２９６．６ｍｍ３、３０日目では１２２．１±１００．７ｍｍ３に対し６９１．９±４２８．３ｍｍ３（Ｐ＜０．００１）であった。このことは、平均腫瘍重量が観察の終了後に検討された場合にも該当した（ノバフェロン高用量群０．０９１±０．０８１ｇに対し、ＨｕＩＦＮ−α２ｂ高用量群０．４７６±０．２７１グラム、Ｐ＜０．００１）。このことは、この異種移植モデルにおけるノバフェロンのこの用量でのより長期間の処理が、ＰＣ−３腫瘍増殖のさらに良好な、又は完全な阻害を呈し得ることを示唆している。
【０１７６】
Ｃ．ヒト肝臓癌異種移植モデル
ノバフェロンのインビボ抗腫瘍活性を、さらに肝臓癌Ｈｅｐ Ｇ２異種移植モデルについて評価した。ノバフェロンは対照群と比較してＨｅｐ Ｇ２腫瘍増殖の有効な用量依存的阻害を示した（Ｐ＜０．００１）。ＰＢＳ対照群の２１２５．８±７４３．１ｍｍ３と比較して、ノバフェロン処理群（毎日１．２５、１２．５又は１２５μｇ／ｋｇで３０日間の皮下注射）における平均腫瘍体積は、それぞれ７８３．２±２７０．０、４５９．３±４１４．３、及び１０４．６±５６．５ｍｍ３であった。３０日間の１２５μｇ／ｋｇのノバフェロン処理はＨｅｐ Ｇ２の最も高い阻害を達成し（９６．６％）、ＨｕＩＦＮ−α２ｂの１２５μｇ／ｋｇよりも有意に高かった（８９．２％、Ｐ＜０．０１）。この用量でのより長期間のノバフェロンの処理は、さらに良好な又は完全な阻害の傾向を示した。観察期間の終了時の平均腫瘍重量は、１２５μｇ／ｋｇのノバフェロン処理群では０．０７４±０．０８３ｇであり、１２５μｇ／ｋｇのＨｕＩＦＮ−α２ｂ処理群よりも有意に小さかった（０．２３５±０．１９９グラム、Ｐ＜０．００１）（下記表５）。
【０１７７】
Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスに６×１０６生Ｈｅｐ Ｇ２細胞を皮下注射で導入した後、マウスをノバフェロン（１．２５μｇ／ｋｇ、１２．５μｇ／ｋｇ及び１２５μｇ／ｋｇ）の毎日の皮下注射により３０日間処理した。結果を平均腫瘍体積（ｍｍ３）で表した。図６は、ＰＢＳ対照群と比較して、３種類のノバフェロン用量の全てでＨｅｐ Ｇ２腫瘍増殖の用量依存的阻害を呈することを示した（Ｐ＜０．００１）。１２５μｇ／ｋｇのノバフェロンは、同用量のＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも遥かに強力な、又はほぼ完全なＨｅｐ Ｇ２腫瘍増殖阻害を引き起こした（９６．６％対８９．２％、Ｐ＜０．０５）（表５）。
【０１７８】
【表５】
Ｄ．ヒト黒色腫異種移植モデル
ノバフェロンのインビボ抗腫瘍活性を、さらに悪性黒色腫Ａ−３７５異種移植モデルにおいて評価した。Ａ−３７５細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６１９）はヒト悪性固形腫瘍から得られた。ノバフェロンは対照群と比較してＡ−３７５腫瘍増殖の有効な用量依存的阻害を示した（Ｐ＜０．００１）。ＰＢＳ対照群と比較すると、ノバフェロン処理群（毎日１．２５、１２．５又は１２５μｇ／ｋｇで２８日間の皮下注射）における阻害率は、それぞれ４０．１％、７５．０％、及び８２．８％であった（Ｐ＜０．００１）（下記表６）。３０日間の１２５μｇ／ｋｇのノバフェロン処理はＡ−３７５の最も高い阻害を達成し（８２．８％）、１２５μｇ／ｋｇのＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも有意に高かった（６９．９％、Ｐ＜０．００１）。
【０１７９】
興味深いことに、ノバフェロンは化学療法剤５−ＦＵよりも、より効果的な黒色腫細胞Ａ−３７５の増殖の阻害を示した（表６）。例えば、３０日目、１２．５μｇ／ｋｇ又は１２５μｇ／ｋｇのノバフェロンで処理された群の平均腫瘍重量は０．７６３±０．１８７（Ｐ＜０．０１）及び０．５２７±０．１４９（Ｐ＜０．００１）グラムであったのに対し、３０ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵで処理された群の平均腫瘍重量は１．００４±０．１０５グラムであった（表６）。これは、ヒト黒色腫Ａ−３７５の治療に対して、ノバフェロンが５−ＦＵよりも効果的であり得ることを示している。
【０１８０】
Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスに８×１０６のＡ−３７５細胞を皮下注射で導入した後、マウスをノバフェロン（１．２５μｇ／ｋｇ、１２．５μｇ／ｋｇ及び１２５μｇ／ｋｇ）の毎日の皮下注射により２８日間処理した。結果を平均腫瘍体積（ｍｍ３）で表した。図７は、ＰＢＳ対照群と比較して、３種類のノバフェロン用量の全てでＡ−３７５腫瘍増殖の用量依存的阻害を呈することを示した（Ｐ＜０．００１）。１２５μｇ／ｋｇのノバフェロンは、同用量のＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも強力なＡ−３７５腫瘍増殖阻害を引き起こした（８２．８％対６９．９％、Ｐ＜０．００１）（図７）。１２．５μｇ／ｋｇ及び１２５μｇ／ｋｇのノバフェロンは、両方とも、５−ＦＵ（６７．２％）よりも高い腫瘍増殖の抑制を示した（それぞれ７５．０％及び８２．８％、Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．００１）（図７）。
【０１８１】
【表６】
Ｅ．ヒト結腸癌異種移植モデル
ノバフェロンのインビボ抗腫瘍活性を、結腸癌ＬＳ１８０異種移植モデルにおいて評価した。ＬＳ１８０細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＬ−１８７）はヒト結腸癌から得られた。ノバフェロンは対照群と比較して結腸癌ＬＳ１８０腫瘍増殖の有効な用量依存的阻害を示した（Ｐ＜０．００１）。ＰＢＳ対照群と比較すると、ノバフェロン処理群（毎日１．２５、１２．５又は１２５μｇ／ｋｇで２８日間の皮下注射）における阻害率は、それぞれ７５．０％、８０．５％、及び９２．５％であった（Ｐ＜０．００１、下記表７）。２８日間の１２５μｇ／ｋｇのノバフェロン処理はＬＳ１８０腫瘍増殖の最も高い阻害を達成し（９２．５％）、１２５μｇ／ｋｇのＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも有意に高かった（８２．３％、Ｐ＜０．００１）。
【０１８２】
２８日間の処理に続き、平均腫瘍重量について、１２．５μｇ／ｋｇのノバフェロンがＬＳ１８０癌異種移植片の増殖を５０−ＦＵ（３０ｍｇ／ｋｇ）と同様に阻害した（０．８１５±０．２２１グラム対０．７５８±０．２２７グラム）。１２５μｇ／ｋｇのノバフェロンは、３０ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵよりもＬＳ１８０の腫瘍増殖を有意に阻害した（９２．５％対８１．８％、Ｐ＜０．００１）（表７及び図８）。結腸癌の患者に対する標準的な化学療法における５−ＦＵの日常的な臨床応用を考慮するに際し、これらの観察結果は極めて興味深い。動物モデルにおけるノバフェロンによるＬＳ１８０腫瘍増殖のより良好な抑制は、ノバフェロンが臨床において非常に効果的な抗結腸癌剤として作用する可能性を有することを示している。
【０１８３】
Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスに４×１０６１ＬＳ１８０細胞を皮下注射で導入した後、マウスをノバフェロン（１．２５μｇ／ｋｇ、１２．５μｇ／ｋｇ及び１２５μｇ／ｋｇ）の毎日の皮下注射により２８日間処理した。結果を平均腫瘍体積（ｍｍ３）で表した。図８は、ＰＢＳ対照群と比較して、３種類のノバフェロン用量の全てでＬＳ１８０腫瘍増殖の用量依存的阻害を呈することを示した（Ｐ＜０．００１）。１２５μｇ／ｋｇのノバフェロンは、同用量のＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも強力なＬＳ１８０腫瘍増殖阻害を引き起こした（９２．５％対８２．３％、Ｐ＜０．００１）（表７）。１．２５μｇ／ｋｇ及び１２．５μｇ／ｋｇのノバフェロンは両方とも、５−ＦＵ（８１．８％）と同様の腫瘍増殖の抑制を達成した（それぞれ７５．０％及び８０．５％）（表７、図８）。しかし、１２５μｇ／ｋｇのノバフェロンは、５−ＦＵよりも遥かに高いＬＳ１８０腫瘍増殖の阻害を呈した（９２．５％対８１．８％、Ｐ＜０．００１）。
【０１８４】
【表７】
Ｆ．ヒト白血病異種移植モデル
ノバフェロンのインビボ抗腫瘍活性を、さらにＨＬ６０（ｓ）リンパ性白血病異種移植モデルにおいて評価した。ノバフェロンは対照群と比較してＨＬ６０（ｓ）腫瘍増殖の有効な用量依存的阻害を呈した（Ｐ＜０．００１）。ＰＢＳ対照群と比較すると、ノバフェロン処理群（毎日１．２５、１２．５又は１２５μｇ／ｋｇで２８日間の皮下注射）における阻害率は、それぞれ４３．８％、５５．２％、及び８０．４％であった（Ｐ＜０．００１、下記表８）。２１日間の１２５μｇ／ｋｇのノバフェロン処理はＨＬ６０（ｓ）腫瘍増殖の最も高い阻害を達成し（８０．４％）、１２５μｇ／ｋｇのＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも有意に高かった（６９．８％、Ｐ＜０．０５）。
【０１８５】
Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスに２×１０７生ＨＬ６０（ｓ）細胞を皮下注射で導入した後、マウスをノバフェロン（１．２５μｇ／ｋｇ、１２．５μｇ／ｋｇ及び１２５μｇ／ｋｇ）の毎日の皮下注射により２１日間処理した。結果を平均腫瘍体積（ｍｍ３）で表した。図９は、ＰＢＳ対照群と比較して、３種類のノバフェロン用量の全てでＬＳ１８０腫瘍増殖の用量依存的阻害を呈することを示した（Ｐ＜０．００１）。１２５μｇ／ｋｇのノバフェロンは、同用量のＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも強力なＬＳ１８０腫瘍増殖阻害を引き起こし（８０．４％対６９．８％、Ｐ＜０．０５）、５−ＦＵと比較して同様の抑制を示した（図９、表８）。
【０１８６】
【表８】
Ｇ．ノバフェロン処理中のマウスの一般条件
ヒト癌の様々な異種移植片を伴うマウスを、ノバフェロン、ＨｕＩＦＮ−α２ｂ又は５−ＦＵ処理の期間中注意深く観察した。５−ＦＵ処理群とは異なり、全てのノバフェロン又はＨｕＩＦＮ−α２ｂ処理群のマウスは正常に摂食及び行動し、体重の減少はなかった。５−ＦＵ処理マウスは摂食及び行動の特徴的変化及び体重の減少を示した。これらの観察結果が示すことは、ノバフェロンが異種移植動物モデルにおいて５−ＦＵと同様の、又はさらに良好な抗癌性を示すと同時に、癌細胞の阻害に対してより特異的であり、かつ正常細胞及び／又は生理的機能に対する影響が遥かに小さい可能性があるということである。これらはヒトへの応用においてより優れた耐性及び治療効果につながるかもしれない。
【０１８７】
上記の開示に照らし、当業者には明らかであろうが、本発明の実施において、その趣旨又は範囲を逸脱することなく、多くの変更及び変形が可能である。したがって、本発明の範囲は添付の請求項に定義される内容に従って解釈される。
（参考文献）
1. Interferon nomenclature. Nature. 1980 ; 286 (5769): 110
2. Isaacs A and Lindenmann J. Production of virial interfering substance. US Pat No: 369922. October 17. 1972
3. Jonasch E and Haluska FG. Interferon in oncological practice: review of interferon biology, clinical applications, and toxicities. Oncologist. 2001 ; 6(l):34-55
4. Lengyel P. Biochemistry of interferons and their actions. Annu Rev Biochem. 1982; 51 :251-282
5. Gresser I and Tovey MG. Antitumor effects of interferon. Biochim Biophys Acta. 1978; 516(2):231-247
6. Samuel CE. Antiviral actions of interferons. Clin Microbiol Rev. 2001 ;14(4):778-809
7. Theofilopoulos AN, et al. Type I interferons (alpha/beta) in immunity and autoimmunity. Annu Rev Immunol. 2005; 23:307-336
8. Uze G, et al. Alpha and beta interferons and their receptor and their friends and relations. J Interferon Cytokine Res. 1995; 15(1): 3-26
9. Knight E Jr. Interferon: purification and initial characterization from human diploid cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1976; 73(2):520-523
10. Pestka S, et al. Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors. Immunol Rev. 2004; 202:8-32
11. Horisberger MA and Di Marco S. Interferon-alpha hybrids. Pharmacol Ther. 1995; 66(3):507-534
12. Horton HM, et al. Antitumor effects of interferon-omega: in vivo therapy of human tumor xenografts in nude mice. Cancer Res. 1999; 59(16):4064-4068
13. Hardy MP, et al. Characterization of the type I interferon locus and identification of novel genes. Genomics.2004; 84(2):331-345.
14. Chen J. et al. Human interferon- [epsilon]: a t> pe I interferon. US Pat No: 6569420. May 27. 2003
15. Pestka S, et al. Interleukin-10 and releated cytokines and receptors. Annu Rev Immunol 2004, 22:929-979
16. Nardelli B, et al. Regulatory effect of IFN-kappa, a novel type I IFN, on cytokine production by cells of the innate immune system. J. Immunol. 2002; 169(9):4822-4830
17. LaFleur DW, et al. Interferon-kappa, a novel type I interferon expressed in human keratinocytes. J Biol Chem. 2001 ; 276(43): 39765-39771
18. Subramaniam PS, Johnson HM. The IFNARl subunit of the type I IFN receptor complex contains a functional nuclear localization sequence. FEBS Lett. 2004;578(3):207-210
19. Goodbourn S, et al. Interferons: cell signalling, immune modulation, antiviral response and virus countermeasures. J Gen Virol. 2000; 81(Pt 10):2341-2364
20. Wang K, et al. Inhibition of neutrophil apoptosis by type 1 IFN depends on cross-talk between phosphoinositol 3-kinase, protein kinase C-delta, and NF-kappa B signaling pathways. J Immunol. 2003; 171 (2): 1035-1041
21. Katze MG Interferon, PKR, virology, and genomics: what is past and what is next in the new millennium? J Interferon Cytokine Res. 2002; 22(3):283-286
22. Chawla-Sarkar M, et al. Apoptosis and interferons: role of interferon-stimulated genes as mediators of apoptosis. Apoptosis. 2003; 8(3):237-249
23. Kirkwood J. Cancer immunotherapy: the interferon-alpha experience. Semin Oncol. 2002; 29(3 Suppl 7): 18-26
24. Hofmann V, et al. Hairy cell leukemia: an interferon deficient disease? Cancer Treat Rev. 1985; Suppl B: 33-37
25. Stone RM , et al. Recombinant human gamma interferon administered by continuous intravenous infusion in acute myelogenous leukemia and myelodysplastic syndromes. Am J Clin Oncol. 1993; 16(2):159-163
26. Talpaz M, et al. Human leukocyte interferon to control thrombocytosis in chronic myelogenous leukemia. Ann Intern Med. 1983; 99(6):789-792
27. Talpaz M, et al. Changes in granulocyte-monocyte colony-forming cells among leukocyte-interferon-treated chronic myelogenous leukemia patients. Exp Hematol. 1986; 14(7):668-671
28. Strander H, et al. Long-term adjuvant interferon treatment of human osteosarcoma. A pilot study. Acta Oncol. 1995; 34(6):877-880
29. Dogan B, et al. Intralesional alfa-2a interferon therapy for basal cell carcinoma. Cancer Lett. 1995; 91(2):215-219
30. Fetell MR, et al. Intratumor administration of beta-interferon in recurrent malignant gliomas. A phase I clinical and laboratory study. Cancer. 1990; 65(l):78-83
31. Muss HB. The use of interferon in renal cell carcinoma. Eur J Cancer. 1991 ; 27 (Suppl 4):S84-87
32. Peest D, et al. Cytokine therapy in multiple myeloma. Br. J Haematol. 1996; 94(3):425-432
33. Ikic D, et al. Local interferon therapy for melanoma patients. Int. J Dermatol. 1995;34(12):872-874
34. Rybak ME, et al. Interferon therapy of relapsed and refractory Hodgkin's disease: Cancer and Leukemia Group B Study 8652. J Biol. Response Mod. 1990; 9(1): 1-4
35. Kaufmann R, et al. Temozolomide in combination with interferon-alpha versus temozolomide alone in patients with advanced metastatic melanoma: a randomized, phase III, multicenter study from the Dermatologic Cooperative Oncology Group. J Clin Oncol. 2005; 23(35):9001 -9007
36. Lane HC. The role of alpha-interferon in patients with human immunodeficiency virus infection. Semin Oncol. 1991 ; 18(Suppl 7):46-52
37. Woo MH and Brunakis TG. Interferon alfa in the treatment of chronic viral hepatitis B and C. Ann. Pharmacother. 1997; 31(3):330-337
38. Gibas AL. Use of interferon in the treatment of chronic viral hepatitis. Gastroenterologist. 1993; 1(2): 129- 142
39. Levine LA, et al. Treatment of subclinical intraurethral human papilloma virus infection with interferon alfa-2b. Urology. 1996; 47(4):553-557
40. Ho M. Interferon for the treatment of infections. Annu Rev Med. 1987; 38:51 -59
41. Wintergerst U and Belohradsky BH. Acyclovir monotherapy versus acyclovir plus beta-interferon in focal viral encephalitis in children. Infection. 1992; 20(4):207-212
42. Bogdan C, et al. The role of type I interferons in non-viral infections. Immunol Rev. 2004; 202:33-48
43. Condos R, et al. Treatment of multidrug-resistant pulmonary tuberculosis with interferon-gamma via aerosol. Lancet. 1997; 349(9064): 1513-1515
44. Giosue S, et al. Aerosolized interferon-alpha treatment in patients with multi-drug-resistant pulmonary tuberculosis. Eur Cytokine Netw. 2000; 1 l(l):99-104
45. Raad I, et al. Use of adjunctive treatment with interferon-gamma in an immunocompromised patient who had refractory multidrug-resistant tuberculosis of the brain. Clin Infect Dis. 1996; 22:572-574
46. Fernandez O. et al. Treatment of relapsing-remitting multiple sclerosis with natural interferon beta: a multicenter, randomized clinical trial. Mult. Scler. 1995; Suppl l :S67-69;
47. Freedman MS, et al. Randomized study of once-weekly interferon beta-la therapy in relapsing multiple sclerosis: three-year data from the OWIMS study. Mult Scler.2005; l l(l):41-45
48. Shiozawa S, et al. Single-blinded controlled trial of low-dose oral IFN-alpha for the treatment of xerostomia in patients with Sjogren's syndrome. J Interferon Cytokine Res. 1998; 18(4):255-262
49. Wandinger KP, et al. Diminished production of type-I interferons and interleukin-2 in patients with multiple sclerosis. J Neurol Sci. 1997; 149(l):87-93
50. Steegmann JL, et al. Interferon alpha for chronic myeloid leukemia relapsing after allogeneic bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 1999; 23(5):483-488
51. Kirkwood JM, et al. High dose Interferon alfa 2b significantly prolongs relapse free survival compared with GM2-KLH/QS-21 vaccine in patients with resected stage IIB-III melanoma: Results of Intergroup Trial E1694/S9512/C509081. J Clin Oncol 2001 ; 19:2370-2380
52. Bonnem EM. alpha Interferon: the potential drug of adjuvant therapy: past achievements and future challenges. Eur J Cancer. 1991 ; 27 Suppl 4:S2-6
53. Folkman J. Successful treatment of an angiogenic disease. N Engl J Med. 1989; 320: 1211-1212
54. Clifford JL, et al. Retinoids and interferons as antiangiogenic cancer drugs. In: Teicher BA, ed. Antiangiogenic Agents in Cancer Therapy. Totowa, NJ: Humana Press Inc; 1999; 355-370
55. Kaban LB, et al. Antiangiogenic therapy of a recurrent giant cell tumor of the mandible with interferon alfa-2a. Pediatrics. 1999; 103:1145-1149
56. Sleijfer S, et al. Side effects of interferon-alpha therapy. Pharm World Sci. 2005; 27(6):423-431
57. Bell L. et al. Structure and properties of modified Interferons. US Pat No: 4914033. April 3. 1990
58. Me\ er F. et al. Hybrid Interferons. US Pat No: 5071761. December 10. 1991
59. Streuli M, et al. Target cell specificity of two species derived from them. Proc Natl Acad Sci USA. 1981 ; 78(5): 2848-2852
60. Zoon K. et al. interferon alpha hybrids. US Pat No: 6685933. February 3. 2004
61 . Gangenii JD. Antiviral combination, and method of treatment. US Pat No: 5137720 August 1 1. 1992
62. Johnson HM. et al. Hybrid interferon tau/t>pe I interferon polypeptides US Pat No: 6174996. Januan' 16. 2001
63. Raj, NB, et al. Synthesis, antiviral activity, and conformational characterization of mouse-human a-interferon hybrids. J Biol (Them. 1988; 263(18):8943-8952
64. Mark DF, et al. Site-specific mutagenesis of the human fibroblast interferon gene. Proc Natl Acad Sci USA 1984; 81 (18): 5662-5666
65. Bentzien J. et al. Recombinant interferon-beta mutants. US Pat No: 6514729. February 4. 2003
66. Stemmer WPC. Methods for in vitro recombination. US Pat No: 5605793. February 25. 1997
67. Chang CC, et al. Evolution of a cytokine using DNA family shuffling. Nat Biotechnol. 1999; 17(8):793-797
68. Blatt LM, et al. The biologic activity and molecular characterization of a novel synthetic interferon-alpha species, consensus interferon. J interferon cytokine Res. 1996; 16:489-499
69. Tatusova TA and Madden TL. BLAST 2 Sequences, a new tool for comparing protein and nucleotide sequences. FEMS Microbiol Lett. 1999; 174(2): 247-250
70. Bowie JU, et al. Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino acid Substitutions. Science 1990; 247(4948): 1306-1310
71. Creighton TE. Posttranslational covalent modification of polypeptide chains. In Proteins: Structure and Molecular Properties. Ed by Creighton TE. W. H. Freeman & Co. 1993; pp. 78-99. San Francisco, US
72. Aplin JD and Wriston JC Jr. Preparation, properties, and applications of carbohydrate conjugates of proteins and lipids. CRC Crit Rev Biochem. 1981 ; 10(4):259-306
73. Edge AS, et al. Deglycosylation of glycoproteins by trifluoromethanesulfonic acid. Anal Biochem. 1981 ; 118(1 ): 131 -137
74. Thotakura NP and Bohl OP. Enzymatic deglycosylation of glycoproteins. Meth Enzymol.1987; 138:350-359
75. Peck GE, et al. Pharmaceutical manufacturing. In Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 21<st> ed. Edited by University of the Sciences in Philadelphia (USIP),Lippincott Williams and Wilkins. 2006, page: 691-1094. PA, US
76. Shimizu K. et al. Plasminogen activator derivatives US Pat No: 4640835. February 3. 1987
77. Mitra G. Covalenth attached complex of alpha- 1 -proteinase inhibitor w ith a water soluble polv mer. US Pat No: 4496689. Januan 29. 1985
78. Nakagawa Y. et al. ChemicalK modified protein with polyeth\ leneglycol US Pat No: 4791 192. December 13. 1988
79. DavisF. et al. Non-immunogenic polypeptides US Pat No: 4179337. December 18. 1979
80. Field J, et al. Purification of a RAS-responsive adenylyl cyclase complex from Saccharomyces cerevisiae by use of an epitope addition method. MoI Cell Biol. 1988;8(5):215921-2165
81. Evan Gl, et al. Isolation of monoclonal antibodies specific for human c-myc proto-oncogene product. MoI Cell Biol. 1985; 5(12):3610-3616
82. Paborsky LR, et al. Mammalian cell transient expression of tissue factor for the production of antigen. Protein Eng. 1990; 3(6):547-553
83. Einhauer A and Jungbauer A. The FLAG peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins. J Biochem Biophys Methods. 2001 ; 49(l-3):455-465
84. Skinner H, et al. Use of the Glu-Glu-Phe C-terminal epitope for rapid purification of the catalytic domain of normal and mutant ras GTPase-activating proteins. J Biol Chem.1991 ; 266(22):14163-14166
85. Lutz-Freyermuth C, et al. Quantitative determination that one of two potential RNA-binding domains of the A protein component of the Ul small nuclear ribonucleoprotein complex binds with high affinity to stem-loop II of Ul RNA. Proc Natl Acad Sci USA. 1990; 87(16):6393-6397
86. Zhang ZQ. et al. Construction and application of a high level expression vector containing PRPL promoter. Chinese J of Virol. 1990: 2: 18-23
87. Kingston RE, et al. Introduction of DNA into mammalian cells. In Current Protocols In Molecular Biology edited by Ausubel FM, et al. 2003; page: 9.0.1 -9.15.20,Jhn Wiley & Sons, Inc. US
88. McNeill TA. Interferon assay. J Immunol Methods. 1981 ; 46(2):121-127
89. Rubinstein S, et al. Convenient assay for interferon. 1. Viral. 1981 ; 37: 755-758
90. Horisberger MA and de Staritzky K. A recombinant human interferon-[alpha] B/D hybrid with a broad hostrange. J Gen Virol. 1987; 68:945-948
91. Stitz L and Schellekens H. Influence of input multiplicity of infection on the antiviral activity of interferon. J Gen Virol. 1980; 46:205-210
92. Yeo EY, et al. Effect of short-term ethanol on the proliferative response of Swiss 3T3 cells to mitogenic growth factors, Exp MoI Med. 2000: 32: 161-169 93. Vignesh RC, et al. Effect of ethanol on human osteosarcoma cell proliferation, differentiation and mineralization. Toxicology. 2006; 220(1 ):63-70
94. Cavanaugh PF Jr, et al. A semi-automated neutral red based chemosensitivity assay for drug screening. Investigational New Drugs. 1990; 8(4):347-354
95. Raines EW and Ross R. Purification of human platelet-derived growth factor. Methods Enzymol. 1985; 109:749-773
96. Wahl AF, et al. Gene expression of human DNA polymerase alpha during cell proliferation and the cell cycle. MoI Cell Biol. 1988; 8(l l):5016-5025
97. Cook JA and Mitchel JB. Viability measurements in mammalian cell systems. Anal Biochem. 1989; 179(l):l-7
98. Porstmann T, et al. Quantitation of 5-bromo-2-deoxyuridine incorporation into DNA: an enzyme immunoassay for the assessment of the lymphoid cell proliferative response. J Immunol Methods. 1985; 82(1):169-179
99. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 1983; 65(l-2):55-63
100. Scudiero DA, et al. Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Cancer Res. 1988; 48(17):4827-4833
101. Evinger M And Pestka S. Assay of growth inhibition in lymphoblastoid cell cultures. Methods Enzymol. 1981; 79(Pt B):362-368
102. Meister A, et al. Biological activities and receptor binding of two human recombinant interferons and their hybrids. J Gen Virol. 1986; 67(Pt 8): 1633-43 )
103. Frincke J. et al. Interferon antibod} compositions having an extended serum half-life. US Pat No: 5055289.October 8. 1991
104. Chang T and Yu L. Hybrid w ith interferon-beta. and an immunoglobulin Fc joined by a peptide linker. US Pat No: 5908626. June 1. 1999
105. Nieforth KA, et al. Use of an indirect pharmacodynamic stimulation model of MX protein induction to compare in vivo activity of interferon alfa-2a and a polyethylene glycol-modified derivative in healthy subjects. Clin Pharmacol Ther. 1996; 59(6):636-646
106. Ekwuribe NN. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, deliver} and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same. US Pat No: 568181 1. October 28. 1997
107. Gilbert CW and Cho M-O. Interferon polymer conjugates. US Pat No: 571 1944. January 27. 1998
108. Greenwald R and Gilbert CW. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same. US Pat No: 5738846. April 14. 1998
109. Letsinger RL, et al. Cholesteryl-conjugated oligonucleotides: synthesis, properties, and activity as inhibitors of replication of human immunodeficiency virus in cell culture. Proc Natl Acad Sci USA. 1989; 86(17): 6553-6556
110. Brower V. Naked DNA vaccines come of age. Nat Biotechnol. 1998; 16(13):1304-1305
111. Coen DM. The polymerase chain reaction. In Current Protocols in Molecular Biology. Edited by Ausubel FM. 2001, page: 15.01 -15.7.8. Jhn Wiley & Sons, Inc. US
112. Stemmer WP. DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution. Proc Natl Acad Sci USA. 1994; 91(22): 10747-10751
113. Armstrong JA. Cytopathic effect inhibition assay for interferon: microculture plate assay. Methods Enzymol. 1981 ; 78(pt A): 381 -387
114. Sambrook J and Russell DW. in Molecular Cloning. 2001 ; page: 15.25-15.35, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, US
115. Sambrook J and Russell DW. in Molecular Cloning. 2001 ; page: 15.51-15.52, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, US
116. Sambrook J and Russell DW. in Molecular Cloning. 2001 ; page: 15.25-15.29 and 15-49-15-53, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, US
117. Chou TC, et al. Reversal of anticancer multidrug resistance by the ardeemins. Proc Natl Acad Sci USA. 1998; 95(14): 8369-8374
118. Corbell T, et al. in vivo methods for screening and preclinical testing: use of rodent solid tumors for drug discovery, in Anticancer Drug Development Guide: preclinical screening, clinical trails, and approval. Edited by Teicher BA and Andrews PA. 2004; page: 79-124. Humana Press, New Jersey, US
【技術分野】
【０００１】
本出願は、ヒトインターフェロン様生物学的活性を有する組換えタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願において、インターフェロン（ＩＦＮ）という名称は、Ｎａｔｕｒｅ（１）に公開されたものを採用したものである。
１９５７年に、Ｉｓａａｃｓ及びＬｉｎｄｅｎｍａｎｎ（２）により見出されたヒトインターフェロン（ＨｕＩＦＮ）は、ウイルス感染やマイトジェン暴露のような様々な刺激に対する暴露の結果、様々な真核細胞により分泌される周知のサイトカインファミリーである。ＩＦＮは、細胞の増殖及び分化、及び免疫系の調節を含む細胞挙動から多くの変化を引き起こすことができる（３〜７）。ＨｕＩＦＮは、６つの下位グループ、すなわち、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−ω、ＩＦＮ−ε及びＩＦＮ−κに分類されている。ＨｕＩＦＮ−α（白血球由来のインターフェロン）はヒト白血球細胞内で、及び少量のＨｕＩＦＮ−β（線維芽細胞由来のインターフェロン）と共にリンパ芽球様細胞内で生成される。ＨｕＩＦＮは、化学的及び生物学的特性により、２つの一般的なカテゴリー、すなわち、Ｉ型及びＩＩ型に分類される。Ｉ型は、ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−βの下位グループのみならず、最近発見されたＩＦＮ−ω、ＩＦＮ−ε及びＩＦＮ−κの下位グループで構成される。ＩＩ型は、一つのメンバー：ＩＦＮ−γ（免疫インターフェロン）のみを有する。
【０００３】
異なるインターフェロン下位グループは異なる構造的及び生物学的特性を有する。ＨｕＩＦＮ−βはＮ−結合型糖タンパク質であり（８、９）、均質に精製されて特性分析されている。ＨｕＩＦＮ−βは、恐らくその炭水化物部分のために大きさの面では不均一である。しかしながら、１６６個のアミノ酸のタンパク質をエンコードするヒトＩＦＮ−β遺伝子は一つしか存在しない。ＩＦＮ−βはＩＦＮ−αと低い相同性を有し、約３０〜４０％の同一性を共有している。
【０００４】
ＩＦＮ−β遺伝子の単一性とは対照的に、ＨｕＩＦＮ−αは、本質的に１４遺伝子の多重遺伝子族で構成された下位グループである。一つ又は二つのアミノ酸の差異からなる少数の変異体は、複対立遺伝子の原因となる（１０）。偽遺伝子のＩＦＮＡＰ２２を除いては、１３個のタンパク質をエンコードする１３個の遺伝子がある。各タンパク質は、１６５〜１６６個のアミノ酸を含む。遺伝子ＩＦＮＡ１３でエンコードされるタンパク質は、タンパク質ＩＦＮＡ１と同一である。したがって、１２個の別個のインターフェロンアルファタンパク質、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、及びＩＦＮＡ２１が存在する。ＩＦＮ−αサブタイプにおけるアミノ酸配列の同一性は、一般的に８０〜８５％の相同性を有する（１１）。
【０００５】
成熟したＩＦＮ−ωは、ＩＦＮ−α種の群に対しては６０％のヌクレオチド配列相同性を示すが、Ｃ−末端では６アミノ酸ほど長い。ＩＦＮ−ωは、インターフェロン−βとの関連性がさらに薄い（約３０％の配列相同性を共有する）。ヒトＩＦＮ−ωは、ＩＦＮ−αグループに分類されない。なぜならＩＦＮ−αとは抗原的に区別され、Ｉ型ＩＦＮ−α受容体との相互作用において異なるからである（１２）。ＩＦＮ−ωは、ヒト白血球インターフェロンの主要成分として、ウイルス感染白血球により分泌される。
【０００６】
ヒトＩＦＮ−εの成熟タンパク質は１８５−アミノ酸を含有し、ＩＦＮ−α２及びＩＦＮ−βに対して、それぞれ約３３％及び３７％の配列相同性を共有する（１３、１４）。ＩＦＮ−εの機能及び生物物理学的特性は詳細には明らかにされていないが、Ｉ型インターフェロンのように機能する。さらに、ＩＦＮ−εは生殖機能における役割を果たすことができる（１５）。
【０００７】
ＩＦＮ−κは１８０アミノ酸ヒトサイトカインであって、最近、確認されたＩ型ＩＦＮである。ＩＦＮ−κのコード配列は、ヒトで発見された他のＩ型インターフェロンに対して〜３０％同一である。ＩＦＮ−κの際立った特徴は、非誘導性細胞、特に角化細胞における転写物の検出可能な構成的発現である。ＩＦＮ−κは、自然免疫系の細胞に対する効果を通じて、全身的又は局所的免疫機能を調節する役割を担うことができる（１６）。しかしながら、ＩＦＮ−κは、低い抗ウイルス活性を示す（１７）。
【０００８】
ヒトＩ型インターフェロンは、様々な細胞型の細胞表面に広く分布した二つの受容体サブユニットであるＩＦＮＡＲ−１及び−２に結合するものと思われる。リガンドの関与は、ＩＦＮＡＲ−１及び−２にそれぞれ結合するチロシンキナーゼＴＹＫ２及びＪＡＫ−１のリン酸化反応を誘発する。一旦リン酸化すると、ＳＴＡＴタンパク質が受容体から放出され、ヘテロ二量体及びホモ二量体を形成する（１８、１９）。一旦放出されると、ＳＴＡＴＡの二量体は、ＤＮＡ結合タンパク質であるインターフェロン応答因子９（ＩＲＦ−９）と結合し、ＩＦＮ−刺激遺伝子因子−３（ＩＳＧＦ−３）と呼ばれる複合体を形成し、その複合体が核内に移動する。次に、ＩＳＧＦ−３複合体は、全てのＩＦＮ誘導的遺伝子の上流側に存在するＤＮＡ要素に結合する。これは、いわゆる「古典的」シグナル伝達経路である。
【０００９】
Ｉ型ＩＦＮで制御される作用及び生化学的経路の新たな形態が発見され続けている。例えば、シグナル伝達経路におけるＰＩ３Ｋの下流で、核因子カッパ−Ｂ（ＮＦ−ｋＢ）及びＰＫＣ−ｄが、ＩＦＮ−βと共に培養された好中球において発見される抗アポトーシス効果と関連付けられている（２０）。
【００１０】
インターフェロン誘導遺伝子と呼ばれる３００個以上の遺伝子は、ＩＦＮ治療に対して反応性である。最も多く研究されたＩＦＮタンパク質は、抗ウイルス特性を有するものである。例えば、２、５オリゴシンテターゼファミリー（ＯＡＳ−１および−２）の酵素は、ウイルスＲＮＡ及び細胞ＲＮＡを分解する酵素であるＲＮＡｓｅＬと結合して活性化する短鎖オリゴアデニル酸の合成を触媒し、それによってタンパク質合成を阻害する。二本鎖ＲＮＡ活性化タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）も、翻訳開始因子ｅＩＦ２ａをリン酸化し、ウイルス及び細胞のタンパク質合成の阻害をもたらす。さらに最近になって、炎症性サイトカイン誘導、免疫調節、及びアポトーシスにおける中心的作用物質である転写因子ＮＦ−κＢの活性化にもＰＫＲが必要であることが判明した。Ｍｘ（ミクソウイルス耐性）タンパク質は、細胞内でのウイルス粒子の運搬又はウイルスＲＮＡの転写を阻害することにより、ＲＮＡウイルスの複製を阻害する。ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）は、アデノシンをイノシンに転換させ、ウイルスＲＮＡゲノム（２１）の高頻度変異を誘発する。
【００１１】
ＨｕＩＦＮは、抗ウイルス、抗腫瘍、及び免疫調節機能を含む広範囲の生物学的活性を持つ。ヒトインターフェロンの臨床的可能性は広く研究されてきており、以下のように要約される。
【００１２】
抗腫瘍への応用に対して、ＨｕＩＦＮは、免疫調節及び抗血管新生反応の調節により間接的に、又は、腫瘍細胞の増殖又は細胞分化に直接影響を及ぼすことにより、抗腫瘍効果を媒介する（２２）。インターフェロン療法は、様々な白血病（２３）、例えば、ヘアリー細胞白血病（２４）、急性及び慢性骨髄白血病（２５〜２７）、骨肉腫（２８）、基底細胞癌（２９）、神経膠腫（３０）、腎細胞癌（３１）、多発性骨髄腫（３２）、黒色腫（３３）、カポジ肉腫（２３）、及びホジキン病（３４）の治療に用いられてきた。シタラビン（ａｒａ−Ｃ）、５−ＦＵ、ヒドロキシウレア、及びＩＬ−２とＩＦＮ−αの併用療法は、広く研究されており、多くの場合、ＨｕＩＦＮ−α単独よりも有意に優れた結果を示す（３）。ＨｕＩＦＮ及びテモゾロマイドを併用した進行癌の相乗的治療も報告されている（３５）。
【００１３】
抗ウイルスの応用に関して、ＨｕＩＦＮは、抗ウイルス療法、例えば、エイズ（３６）、慢性Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎を含むウイルス感染（３７、３８）、乳頭腫ウイルス（３９）、ヘルペスウイルス感染（４０）、ウイルス性脳炎（４１）の治療、及び鼻炎及び呼吸器感染（４０）の予防において、臨床的に用いられてきた。
【００１４】
ＨｕＩＦＮは、抗バクテリア療法のためにも臨床的に用いられており（４２）、例えば、エアロゾル化されたＨｕＩＦＮ−γ（４３）及びＨｕＩＦＮ−αは、多剤耐性肺結核患者に用いられてきた（４４）。ＨｕＩＦＮ−γは、脳の多剤耐性結核の治療に用いられてきた（４５）。
【００１５】
ＨｕＩＦＮは、免疫調節療法に対しても臨床的に用いられており、例えば、移植片の対宿主拒絶反応の予防、又は多発性硬化症（４６、４７）及びシェーグレン症候群（４８）のような自己免疫疾患の進行の抑制に用いられてきた。ＩＦＮ−βは、多発性硬化症の治療に対して米国でＦＤＡにより認可されている。最近では、多発性硬化症にかかった患者は、Ｉ型インターフェロン及びインターロイキン−２の生成が減少すると報告されている（４９）。また、ＨｕＩＦＮ−αを用いた免疫調節療法は、骨髄移植後に再発する慢性骨髄白血病（ＣＭＬ）患者に対し効果的な治療法であるとされている（５０）。
【００１６】
ワクチンアジュバント療法に対して、ＨｕＩＦＮは、黒色腫（５１）の治療において補助剤として臨床的に用いられており、また、他の多くの疾患に対する予防的又は治療的なワクチン接種において、免疫反応を増強又は刺激するための補助剤又は共同補助剤として用いられ得る（５２）。
【００１７】
ＨｕＩＦＮ−α２ａは、臨床試験で用いられた最初の血管形成阻害薬であり、生命にかかわる血管腫の治療において子供にとって効果的であった（５３、５４）。別の治療的適応は、骨巨細胞腫である。Ｋａｂａｎらは、巨大で、急速に成長している、下顎の再発性巨細胞腫の劇的な退行を報告した（５５）。
【００１８】
ＨｕＩＦＮは多数の重要な臨床的用途を有するが、かなりの副作用及びその他の制限を示す。ＨｕＩＦＮを含む多くのサイトカインは、インビボで生成され、局所的かつ一時的に作用するため、比較的短い循環半減期を有する。通常、全身治療剤として投与されるので、ＨｕＩＦＮを頻繁に、しかも比較的大量に投与しなければならない。頻繁な経口投与は、不便かつ苦痛である。また、ＨｕＩＦＮの投与に伴う毒素の副作用が極めて激しいことも多いため、人によっては、治療に耐えることができない。このような副作用は、おそらく高容量の全身投与に関係している。また、臨床研究において、患者によっては、生物学的活性を中和させるｒＨｕＩＦＮに対する抗体を生成することが判明した（５６）。
【００１９】
明らかに、多くの応用用途、例えば、抗癌療法の他、抗ウイルス、免疫療法、抗寄生虫、抗バクテリア、又は、インターフェロン活性の増加及び／又は副作用の減少を必要とする病状又は医療状況のために、増強された効力を有する新規なインターフェロンタンパク質の開発が緊急に求められている。全体として、ＨｕＩＦＮは、次世代の新規な抗腫瘍及び抗ウイルス療法に重要な役割を担う可能性が極めて高い（１０）。
【００２０】
サイトカイン薬の薬剤学的特性を向上させるための最も効果的な手段は、サイトカインタンパク質そのものを突然変異させることであるということが、当技術分野において周知である。インターフェロンペプチドを突然変異させるための様々な戦略及び技術が長期間に渡り進展してきた。一般に、ＨｕＩＦＮ−α突然変異体を生成するために、現在、三つの戦略が用いられている。
【００２１】
第一の戦略は、ＩＦＮハイブリッドを作製することである。何人かの研究者は、ＩＦＮエンコード配列中の自然発生制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）切断部位の存在を利用して、同種のコード断片を共に接合した（５７、５８）。多数のハイブリッドＩＦＮの生産は、Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ及びＤｉ Ｍａｒｃｏ（１１）によって概説されており、この論文は、そのような分子の構築プロセスの概要を提示している。ハイブリッドインターフェロンの構築方法の特定の実施例が記載されている。何人かの研究者は、ＰＣＲ増幅を利用して突然変異ＩＦＮ−αを構築し、それにより特異的に所望される核酸断片を作出することで、異なるＩＦＮの新たな断片を接合する可能性を得た（５９）。特許文献１（６０）にも、ヒトＩＦＮハイブリッドを構築するためのＰＣＲ増幅技術が記載されている。インターフェロンハイブリッドは、特許文献２（６１）及び特許文献１（６０）に記載されているように、インターフェロン下位グループ内において作出され得、又は、特許文献３（６２）及び特許文献１（６０）に記載されているように、少なくとも二つの異なるインターフェロン分類グループ内において作出され得る。さらに、ハイブリッドの親遺伝子は、例えば、ＨｕＩＦＮ−αとＨｕＩＦＮ−ωとの間のハイブリッドのように、一つの種（大部分はヒト）に由来し、又は、例えば、ヒトインターフェロン−αとマウスインターフェロン−αとの間のハイブリッドのように２以上の動物種に由来してもよい（６３）。
【００２２】
インターフェロン突然変異体を構築するための第二の戦略は、ＩＦＮ ＤＮＡ分子内に一つ以上のヌクレオチドの変異を導入することにより、部位特異的な点突然変異生成を利用することである（６４）。最近では、タンパク質突然変異生成のためのガイドとして、系統的突然変異及び計算法が用いられている（６５）。
【００２３】
Ｉ型ＨｕＩＦＮを構築するための第三の戦略は、ＲＥ消化、ＰＣＲ増幅、化学的合成、又はＤＮａｓｅ消化により作出したＩＦＮ遺伝子断片をシャッフリングし、続いてＰＣＲによってこの断片を無作為に接合し、その後それらを増幅することである。その結果得られたＰＣＲ産物は、事実上、ＤＮＡライブラリーを構築するために用いられ得る再配列されたインターフェロンアルファ遺伝子断片のプールであり、このプールから所望の表現型を有するＤＮＡクローンを分離することができる（６６）。例えば、Ｃｈａｎｇらは、マウス細胞において高められた抗ウイルス及び抗増殖活性を有するＨｕＩＦＮ誘導体を同定するために、ＨｕＩＦＮシャッフリングライブラリーを構築し、スクリーニングする方法を記載している（６７）。
【００２４】
ヒトインターフェロンアルファコン−１（コンセンサスインターフェロン）は、１６６個アミノ酸を有する非自然発生組換えＨｕＩＦＮ−αである。ヒトインターフェロンアルファコン−１は、周知のクローン化ＨｕＩＦＮ−α配列に基づき、それぞれの対応部分内の極めて高度に保存されたアミノ酸を評価することにより生成されてきた。それはＨｕＩＦＮ−α２ｂに対し、アミノ酸レベルで８９％の配列相同性を有し、約１０９ＩＵ／ｍｇの特異的抗ウイルス活性を有する。ヒトインターフェロンアルファコン−１は、代償性肝疾患を有する１８歳以上の患者における慢性ＨＣＶ感染の治療に対して認可されている（６８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２５】
【特許文献１】米国特許第６６８５９３３号明細書
【特許文献２】米国特許第５１３７７２０号明細書
【特許文献３】米国特許第６１７４９９６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
たとえ先行技術において一部組換えインターフェロンタンパク質が知られていても、高められた生物学的活性を有する新規なインターフェロン様タンパク質及びタンパク質組成物が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明により、ヒトインターフェロン様生物学的活性を有するタンパク質をエンコードする分離されたポリヌクレオチドが開示される。一実施例において、ポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも９３％同一のヌクレオチド配列を含む。他の実施例において、ヌクレオチド配列は、配列番号１と少なくとも９５％同一又は少なくとも９８％同一である。
【００２８】
一実施例において、本発明は、配列番号２と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列をそれぞれ有するタンパク質からなる群より選択されるタンパク質を含む。好ましくは、タンパク質は非自然発生するものであり、ヒトインターフェロンアルファ２ｂ（ＨｕＩＦＮ−α２ｂ）と比較して高められた抗ウイルス及び抗増殖活性を有する。例えば、前記タンパク質は、ＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも少なくとも２倍高い抗ウイルス活性及びＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも少なくとも１０倍高い抗増殖活性を有していてもよい。特定の実施例において、タンパク質アミノ酸配列は、配列番号２と少なくとも９０％同一又は少なくとも９５％同一である。
【００２９】
本発明は、前記ポリヌクレオチドの配列を含む組換えベクター及び前記ベクターを含有する宿主細胞を含む。本発明は、さらに、ヒトインターフェロン様生物学的活性を示すポリペプチド断片を含む。本発明は、インターフェロン様生物学的活性を示すタンパク質構築物、及びその他の組成物、例えば、タンパク質及び無機高分子のような他の部分を含む接合体もさらに含む。本発明は、治療目的のための、例えば抗ウイルス剤又は抗癌剤としての前記タンパク質及び組成物の方法及び用途もさらに含む。本発明は、インターフェロン療法に対して反応性のその他の疾患の治療にも用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本明細書においてノバフェロン（Ｎｏｖａｆｅｒｏｎ、登録商標）（配列番号１）と称される本発明の新規なタンパク質をエンコードする完全ＤＮＡ配列を示す（Ａ）。また、ノバフェロン（配列番号２）の予測アミノ酸配列（Ｂ）、及びノバフェロンＤＮＡ配列とのノバフェロンアミノ酸配列アラインメント（Ｃ）を示す。成熟ノバフェロンタンパク質における第１アミノ酸であるシステインが残基１に指定されている。
【図２】ＨｕＩＦＮ−α１４遺伝子（ジーンバンク番号ＮＭ＿００２１７２）とのノバフェロン遺伝子のヌクレオチド配列アラインメント（Ａ）、及びＨｕＩＦＮ−α１４タンパク質（翻訳後、ジーンバンク番号ＮＭ＿００２１７２）とのノバフェロンタンパク質のアミノ酸配列アラインメントを示す（Ｂ）。成熟ノバフェロンタンパク質において、第１アミノ酸であるシステインが残基１に指定されている。ノバフェロンは、ＨｕＩＦＮ−α１４とヌクレオチドレベルで約９３％の配列同一性（４６２／４９８）を、アミノ酸レベルで約８７％の配列同一性（１４４／１６６）を共有する。一致しないヌクレオチドは、中段において空白で示されている。
【図３】ＨｕＩＦＮ−α２ｂ遺伝子（ジーンバンク番号ＮＭ＿０００６０５）とのノバフェロン遺伝子のヌクレオチド配列アラインメント（Ａ）、及びＨｕＩＦＮ−α２ｂタンパク質（ジーンバンク番号ＮＭ＿０００６０５のＨｕＩＦＮ−α２ｂ遺伝子から翻訳）とのノバフェロンタンパク質のアミノ酸配列アラインメント（Ｂ）を示す。成熟ノバフェロンタンパク質において、第１アミノ酸であるシステインは、残基１に指定されている。ノバフェロンは、ＨｕＩＦＮ−α２ｂとヌクレオチドレベルで約８９％の配列同一性（４４５／４９８）を、アミノ酸レベルで約８１％の配列同一性（１３５／１６６）を共有する。一致しないヌクレオチドは、中段において空白で示される。
【図４】ＨｕＩＦＮ−α２ｂと比較した、ノバフェロンによるＤａｕｄｉ細胞のインビトロ抗増殖阻害を示すグラフである。
【図５】ヒト前立腺癌ＰＣ−３異種移植片を有するヌードマウスにおけるノバフェロン及びＨｕＩＦＮ−α２ｂのインビボ抗腫瘍効果を示すグラフである。
【図６】ヒト肝臓癌Ｈｅｐ Ｇ２異種移植片を有するヌードマウスにおけるノバフェロン及びＨｕＩＦＮ−α２ｂのインビボ抗腫瘍効果を示すグラフである。
【図７】ヒト黒色腫Ａ−３７５異種移植片を有するヌードマウスにおけるノバフェロン及びＨｕＩＦＮ−α２ｂのインビボ抗腫瘍効果を示すグラフである。
【図８】結腸癌ＬＳ１８０異種移植片を有するヌードマウスにおけるノバフェロン及びＨｕＩＦＮ−α２ｂのインビボ抗腫瘍効果を示すグラフである。
【図９】ヒト白血病ＨＬ６０（Ｓ）異種移植片を有するヌードマウスにおけるノバフェロン及びＨｕＩＦＮ−α２ｂのインビボ抗腫瘍効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
下記の説明の全体を通して、特定の詳述は、本発明のより完全な理解のために記載されている。しかしながら、本発明は、このような詳述無しに実施され得る。他の例において、本発明を不必要に不明瞭にすることを避けるために、周知の要素は詳細に表示又は記載されていない。したがって、本明細書及び図面は、限定的な意味ではなく、例示的な意味としてみなされなければならない。
【００３２】
（用語の定義）
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、記述された特定のタンパク質分子、方法論、プロトコール、細胞株、ベクター、及び試薬に限定されるものではなく、変更され得ることが理解されなければならない。また、本明細書において用いられた用語は、特定の実施例のみを記述することを目的とし、添付の請求項によってのみ制限されるべき本発明の範囲を制限するように意図されたものではないことが理解されなければならない。
【００３３】
本明細書に記述された本発明をより完全に理解させるために、次の用語が用いられ、それらは以下に示される定義であるように意図されている。また、本明細書において用いられた用語は、特定の実施例のみを記述することを目的とし、添付の請求項によってのみ制限されるべき本発明の範囲を制限するように意図されたものではないことが理解されなければならない。
【００３４】
特に定義されない限り、本明細書において用いられた全ての技術的及び科学的用語は、本発明における当業者にとって通常理解されるところと同一の意味を有する。本明細書で言及された全ての刊行物は、該刊行物で報告され、本発明と関連して使用され得る細胞株、ベクター及び方法論を記述し、開示する目的で、参考として本明細書に組み込まれる。本明細書において、先行発明という理由で、本発明がそのような開示に先行できないという認定としてみなされるべきものは何もない。
【００３５】
「インターフェロン」という用語は、ウイルス感染又はマイトジェンに対する暴露を含む様々な環境刺激に対する暴露により、様々な真核細胞により生成される分泌タンパク質のファミリーを意味する。抗ウイルス特性を有するのみならず、インターフェロンは様々な細胞機能に影響を及ぼすことが示されている。全てのインターフェロンユニットは、ここではＷＨＯ国際標準を参照して、９４／７８６（ｒＨｕＩＦＮ−αコンセンサス）及び９５／６５０（ｒＨｕＩＦＮ−α２ａ）と表されている。
【００３６】
「インターフェロン様」という用語は、周知のインターフェロン又はインターフェロン類似体により示されるか、又は、これらと類似する機能的及び／又は構造的特徴を意味する。例えば、「インターフェロン様生物学的活性」は、抗ウイルス活性及び抗増殖活性を含む。インターフェロン様生物学的活性のその他の例示は、本明細書に記述され、当業者によって理解されるであろう。複数形の「活性等」は、単数形の「活性」を含む。すなわち、本発明は、少なくとも一つのインターフェロン様活性を示す組換えタンパク質又はその他のタンパク質構築物又は組成物を含む。
【００３７】
「コンセンサスインターフェロン」という用語は、全ての周知のヒトアルファインターフェロンサブタイプの配列の大まかな平均であるアミノ酸配列を有する合成インターフェロンの一種を意味する。コンセンサスインターフェロンは、いかなる天然ヒトＩＦＮ−αサブタイプよりも（約５倍）大きな抗ウイルス、抗増殖及びＮＫ細胞活性化活性を有すると報告されている。
【００３８】
本明細書で用いられる「分離された」という用語は、自然環境から除去されたＤＮＡ又はＲＮＡのような分子を意味する。例えば、ベクター内に含まれる組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために分離されたものと考えられる。分離されたＤＮＡ分子のさらに他の例は、異種宿主細胞内に保持される組換えＤＮＡ分子又は溶液内の（部分的又は実質的に）精製されたＤＮＡ分子を含む。「分離された」ＤＮＡは、化学的に合成された核酸のみならず、対象とする天然又は人工のＤＮＡ断片を含有し得るライブラリーから回収されたＤＮＡ分子も含む。したがって、分離された核酸を組換え技術によって製造することができる。
【００３９】
「ヌクレオチド配列」という用語は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド又は核酸分子、及びそれらの断片又は一部を含むヌクレオチドの配列を意味する。ＤＮＡ分子の場合、前記配列は一連のデオキシリボヌクレオチドを含み、ＲＮＡ分子の場合、前記配列は対応する一連のリボヌクレオチドを含むことができる。オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド又は核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であってもよく、ヌクレオチド配列は、センス鎖又はアンチセンス鎖を表していてもよい。
【００４０】
「オリゴヌクレオチド断片」又は「ポリヌクレオチド断片」、「一部」又は「セグメント」又は「プローブ」又は「プライマー」という用語は、置き替え可能に使用され、長さが少なくとも約５ヌクレオチドであるヌクレオチド残基の配列を意味する。好ましくは、断片は標的ヌクレオチド配列をハイブリダイズするために用いられ得る。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素により触媒されるヌクレオチド重合のための開始点として作用する。断片又はセグメントは、本発明の各ポリヌクレオチド配列を固有に識別することができる。好ましくは、断片は配列番号１と実質的に類似する配列を含む。
【００４１】
「タンパク質」又は「ペプチド」又は「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸配列を含む自然発生分子又は合成分子を意味する。
「オープンリーディングフレーム」又はＯＲＦという用語は、いずれの終止コドン無しにアミノ酸に対する一連のヌクレオチドトリプレット暗号を意味し、通常、タンパク質に翻訳可能な配列を意味する。
【００４２】
「成熟タンパク質コード配列」という用語は、シグナル又はリーダー配列無しにタンパク質又はペプチドをエンコードする配列を意味する。タンパク質は、あるリーダー／シグナル配列を除去する細胞内での処理により製造されることもあり得る。タンパク質は、合成的に又は成熟タンパク質コード配列のみをエンコードするポリヌクレオチドを用いて製造され得る。
【００４３】
本明細書で用いられた「精製」又は「実質的に精製」という用語は、示されるタンパク質が他の生物学的巨大分子、例えば、他のタンパク質、ポリペプチド等の実質的な不在下に存在することを意味する。タンパク質は、存在する生物学的巨大分子の少なくとも９５重量％をタンパク質が構成するように精製される（ただし、水、バッファ、及び他の小分子、特に１０００ダルトン未満の分子量を有する分子は存在してもよい）。
【００４４】
「組換え発現ビヒクル又はベクター」という用語は、ＤＮＡ（ＲＮＡ）配列からタンパク質を発現させるためのプラスミド又はファージ又はウイルス又はベクターを意味する。発現ビヒクルは、（１）遺伝子発現において調節的な役割を有する遺伝要素（複数の場合あり）、例えば、プロモーター又はエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される構造配列又はコード配列、及び（３）適切な転写開始及び終止配列、のアセンブリからなる転写ユニットを含むことができる。酵母又は真核生物発現系で用いるための構造ユニットは、好ましくは宿主細胞によって翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。或いは、組換えタンパク質がリーダー又は運搬配列無しに発現される場合、組換えタンパク質はアミノ末端メチオニン残基を含むことができる。この残基は、その後発現された組換えタンパク質から切断されても、又は切断されなくても最終産物を提供し得る。
【００４５】
「実質的な類似性」という用語は、核酸又はその断片を他の核酸又はその相補鎖と最適にアラインメントされたとき、この他の核酸と高度の配列同一性を有する核酸又はその断片を意味する。配列同一性又は相同性は、配列分析ソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴＮを用いて決定され得る。第１核酸は、最適にアラインメントされたとき、第２核酸と少なくとも約８５〜９５％以上の配列同一性を示す場合に実質的に類似すると見なされる。例えば、二つの異なる核酸間の配列同一性又は相同性を決定するために、ＢＬＡＳＴＮプログラムである「ＢＬＡＳＴ２配列」が用いられる。このプログラムは、インターネットを介して、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）から公共使用の目的で入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｈｔｔｐ．／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｗｂｌａｓｔ２．ｃｇｉ）（６９）。非限定例示として、デフォルト設定によるソフトウェアを用いて、このような比較を行うことができる（予想値＝１０、フィルタ＝デフォルト、オープンギャップ＝５、伸長ギャップ＝２ペナルティ、ギャップ×ドロップオフ＝５０）。同じように、デフォルト設定によるＢＬＡＳＴソフトウェア（ｂｌａｓｔｐ）を用いて、最適にアラインメント及び比較された際に、第１タンパク質又はポリペプチドが、第２タンパク質又はポリペプチドと少なくとも約８５％〜９５％以上の配列同一性を示す場合、第２タンパク質又はポリペプチドと実質的に類似するとみなされる。
【００４６】
追加的な例示として、配列タンパク質をエンコードする参照ヌクレオチドに対して、少なくとも、例えば９５％「同一の」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列がタンパク質をエンコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチド当たり５つまでの点突然変異を含み得ることを除き、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は参照配列と同一であることを意味する。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列内の５％までのヌクレオチドは除去されるか、別のヌクレオチドと置き換えられるか、又は参照配列内の全てのヌクレオチドの５％までの多数のヌクレオチドが参照配列内に挿入され得る。
【００４７】
本明細書で用いられた「相補的」又は「相補性」という用語は、許容される塩及び温度条件下での塩基対合によるポリヌクレオチドの自然結合を意味する。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は、相補的配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する。二つの一本鎖分子間の相補性は、核酸中のただ一部だけが結合する「部分的」であってもよく、又は、一本鎖分子間に完全な相補性が存在するときは完全であってもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に相当の影響を及ぼす。これは、核酸鎖間の結合に依存する増幅反応で特に重要である。
【００４８】
「形質転換」という用語は、染色体外要素として、又は染色体の統合によってＤＮＡが複製可能であるように、前記ＤＮＡを生命体内に導入することを意味する。「トランスフェクション」という用語は、あるコード配列が実際に発現されても発現されなくても、適切な宿主細胞により発現ベクターが吸収されることを意味する。
【００４９】
「治療」、「治療する」、及びこれらと文法的に同等の用語は、広い意味で使用され、望ましくないある症状又は状態の医療的治療、予防、防止及び改善を含む。
本明細書で用いられる「生物学的に活性」及び「生物学的活性」という用語は、例えば、自然発生又は非自然発生分子と類似又は同一の、生物系内での構造的、調節的、生化学的、又はその他の生物学的機能を意味する。
【００５０】
本明細書で用いられる「抗増殖」及び「抗増殖的」という用語は、細胞の成長及び分裂を緩和及び／又は予防し、その結果、いずれか一つ又は全ての細胞周期において、全細胞数の減少及び／又は標的細胞の比率の減少をもたらすことを意味する。細胞は、特定の細胞周期段階内で停止されるところにより、さらに、Ｇ１（ギャップ１）、Ｓ期（ＤＮＡ合成）、Ｇ２（ギャップ２）又はＭ期（有糸分裂）として特定される。本明細書で用いられる「抗増殖活性」という用語は、インビトロ又はインビボで細胞増殖、特に腫瘍性細胞増殖、例えば、癌細胞を阻害するタンパク質、タンパク質構築物、又は組成物の活性を意味する。
【００５１】
本明細書で用いる「抗腫瘍」又は「抗癌」という用語は、悪性腫瘍の形成を中和又は予防することを意味する。本明細書で用いられた「抗腫瘍活性」又は「抗癌活性」は、インビトロ又はインビボで、例えば、癌細胞の細胞増殖、特に腫瘍性細胞増殖を阻害するタンパク質、タンパク質構築物、又は組成物の活性を意味する。
【００５２】
「ＩＣ５０」又は「半数最大阻害濃度」という用語は、インビトロで細胞成長を５０％阻害するのに必要な、タンパク質のような阻害物質の濃度を示す。
本明細書で用いる「抗ウイルス性」及び「抗ウイルス」という用語は、インビトロ及び／又はインビボで細胞のウイルス感染を緩和及び／又は予防し、又は細胞内でのウイルス複製を妨害することにより、ウイルス増殖を緩和又は停止し、又はウイルス粒子の総数を減少させることを意味する。本明細書で用いる「抗ウイルス活性」とは、インビトロ及び／又はインビボでウイルス感染を阻害し、又はウイルス複製を妨害するタンパク質、タンパク質構築物、又は組成物を意味する。
【００５３】
（ノバフェロンタンパク質）
本発明は、本明細書で「ノバフェロン」（登録商標）と称する新規なヒトインターフェロン様タンパク質の調製及び特性決定に関する。以下に詳述するように、ノバフェロンタンパク質においては、標準インビトロ試験で測定されるように、自然発生ＨｕＩＦＮ−α２ｂと比較して高められた抗ウイルス及び抗増殖生物学的活性が示される。特に、Ｗｉｓｈ−ＶＳＶシステムで試験した場合、同じ試験システムにおけるＨｕＩＦＮ−α２ｂと比較して、ノバフェロンタンパク質は抗ウイルス活性では１２．５倍の増加を示し、Ｄａｕｄｉ細胞増殖の抗増殖阻害では約４００倍の向上を示す。
【００５４】
一実施形態において、ノバフェロンタンパク質は、配列番号１及び図１（Ａ）に示されるように４９８個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドによってエンコードされている。成熟ノバフェロンタンパク質は、配列番号２及び図１（Ｂ）に示されるように１６６個のアミノ酸からなる。本発明に含まれるポリヌクレオチド及びアミノ酸配列、及びその変異体について、以下にさらに詳述する。
【００５５】
比較のために、本発明者らは、自然発生ＨｕＩＦＮ及びノバフェロンの相同性を研究した。ＢＬＡＳＴ検索は、ノバフェロンがヌクレオチド及びアミノ酸の両方のレベルにおいて、ＨｕＩＦＮ−α１４に対して最も高い相同性を有することを明らかにした。図２に示されるように、ノバフェロンをエンコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１）は、ＨｕＩＦＮ−α１４に対して約９３％（４６２／４９８）の相同性を有し、アミノ酸配列は、ＨｕＩＦＮ−α１４に対して約８７％（１４４／１６６）の相同性を有する。最も広く用いられるヒトインターフェロン産物であるＨｕＩＦＮ−α２ｂと比較すると、図３に示されるように、ヌクレオチドレベル（４４５／４９８）で相同性は約８９％であり、アミノ酸レベルでは約８１％（１３５／１６６）である。
【００５６】
合成ＩＦＮアルファコン−１（コンセンサスインターフェロン）に対して、ノバフェロンは、ヌクレオチドレベル（４５３／４９８）で約９１％の配列同一性を、アミノ酸レベル（１４０／１６６）で約８４％の配列同一性を有する。
【００５７】
以下の実験の項において詳述するように、ポリヌクレオチド配列（配列番号１）は、Ｉ型ヒトインターフェロンのＤＮＡシャッフリングライブラリーから選択された。簡単に述べると、ノバフェロンタンパク質を、配列番号１の全ポリヌクレオチド配列を含有する組換えベクターでの宿主細胞のトランスフェクションにより製造した。宿主細胞の上澄み液に含まれるノバフェロンタンパク質を精製し、抗ウイルス及び抗増殖機能のようなヒトインターフェロン様生物学的活性を呈することを示した。
【００５８】
（ポリヌクレオチド及び変異体）
本発明の新規なポリヌクレオチド配列／核酸分子は、図１（配列番号１）に示されるように４９８個のヌクレオチドからなる。ヌクレオチド配列のような本明細書で提供する情報を利用し、ノバフェロンタンパク質（配列番号２）をエンコードする本発明の核酸分子を組換え発現、化学合成、又はＤＮＡ突然変異生成などのその他の標準分子生物学工程を用いて得ることができる。
【００５９】
分離された核酸分子（配列番号１）以外に、本発明は、配列番号１に開示されるＤＮＡ配列とは異なる配列も含むが、遺伝子コードの縮退により、依然としてノバフェロンタンパク質（配列番号２）と同一の又は実質的に同一のアミノ酸配列をエンコードする。遺伝子コード及び種特異的コドン選択は、この分野で良く知られている。したがって、当業者が、特定の宿主に対するコドン発現を最適化するために、例えば配列番号１のＤＮＡ配列とは異なるＤＮＡ配列の縮退性変異体を生成するのは日常的なことである（例えば、ヒトｍＲＮＡ内コドンを、大腸菌のようなバクテリア宿主が好むものに変更する）。
【００６０】
本発明は、図１に示されるヌクレオチド配列（配列番号１）を有する分離された核酸分子、又は、配列番号１内の核酸配列に対して相補的な配列を有する核酸分子をさらに提供する。本発明は、本発明の分離された核酸分子を含む組換えベクター、前記組換えベクターを含有する宿主細胞、及びそのようなベクターを製造し、ノバフェロンタンパク質を発現する宿主細胞を生成する方法、及び組換え技術により、ノバフェロンを製造するために前記宿主細胞を用いる方法に対する情報を提供し、またこれらに関する。
【００６１】
本発明の核酸配列（配列番号１、図１（Ａ））に基づき、本発明は、最適アラインメントの際に、配列番号１に少なくとも約８５〜９５％又はそれ以上の配列同一性を有する核酸のように、本発明の核酸配列と実質的に類似した核酸分子を含む。例えば、一態様において、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して、約９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する核酸は、ノバフェロンと類似した生物学的活性（そのような活性は、ＨｕＩＦＮと比較して高められた抗ウイルス、抗増殖、及び抗腫瘍機能を含むが、これらに限定されない）を有するタンパク質又はポリペプチドをエンコードするか否かを問わず、本発明の範囲内である。そのような核酸分子は、例えば、ノバフェロンを製造するために本発明のヌクレオチド配列を含有するベクターが既にトランスフェクションされた細胞内で、ｍＲＮＡを検出するためのプローブとして用いられ得る。言い換えれば、配列番号１に示される配列と少なくとも約９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるこれらの核酸配列は、宿主細胞内で異種遺伝子の発現を判定するためのマーカーとして用いられ得る。
【００６２】
さらに、本発明は、配列番号１の任意の部分である少なくとも約３０個の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも約５０個の連続するヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含む。
【００６３】
より一般的に、本発明は、図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列の部分配列と同一である任意の及び全ての分離された核酸分子の断片を含み、かつこれらに及ぶ。一実施形態において、このような断片は、少なくとも約１５ヌクレオチドの長さであってもよく、本明細書に記載されるように、診断プローブ及びプライマーとして有用である。さらに、本発明は約５０個のヌクレオチド以上の長さのより大きな断片を含み、またこれに及ぶ。
【００６４】
ノバフェロンタンパク質をエンコードする配列番号１に開示される核酸配列以外に、本発明は、付加された分泌性リーダー配列等の余分のアミノ酸（複数の場合あり）／ペプチド（複数の場合あり）／ポリペプチド（複数の場合あり）と共に全ノバフェロンタンパク質のアミノ酸配列をエンコードする核酸配列も含むが、これらに限定されない。
【００６５】
本発明は、配列番号１に開示される核酸配列を有する核酸の配列と共に、例えばイントロン、及び転写、ｍＲＮＡプロセシング（すなわち、スプライシング及びポリアデニル化信号、ｍＲＮＡのリボソーム結合及び安定化）において役割を担う転写された非翻訳の配列のような非コード５’及び３’配列、及び、機能性を有する又は有さない付加的なアミノ酸をエンコードする付加的なコード配列を含む付加的な非コード配列も含むが、これらに限定されない。
【００６６】
本発明は、さらにノバフェロンタンパク質の一部、類似体又は誘導体をエンコードする本発明の核酸分子（配列番号１）の変異体に関するものでもある。変異体は、インターフェロンシャッフリングライブラリーのスクリーニングにより、又は突然変異誘発技術を用いて、又は／及びその他のこの技術分野において記述された周知の技術を用いて得られる。
【００６７】
上述したように、このような変異体は、ヌクレオチド挿入、欠失、又は置換により製造されたものを含んでもよい。挿入、欠失、又は置換は、一つ以上のヌクレオチドを伴ってもよい。これらの突然変異は、参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端部又はこれらの末端部の間のあらゆる位置で、参照配列内のヌクレオチド間で個別に、又は参照配列内の一つ又は複数の連続するグループ内に点在して発生し得る。変性は、保存又は非保存アミノ酸置換、欠失、付加を生成させることができる。これらの中で特に好ましいものは、サイレント置換、付加及び／又は欠失であり、これらはノバフェロンタンパク質又はその一部の特性及び活性を変化させない。また、このような面で特に好ましいものは、保存的置換である。
【００６８】
本発明の一態様は、（ａ）配列番号２の全アミノ酸配列（すなわち、配列番号２の第１〜１６６位）を有するノバフェロンタンパク質をエンコードするヌクレオチド配列、及び（ｂ）（ａ）のタンパク質の生物学的に活性である断片をエンコードするヌクレオチド配列、及び（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）内の任意のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも９３％同一であり、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む分離された核酸分子を提供する。
【００６９】
遺伝子コードの縮退により、図１に示される核酸配列（配列番号１）の核酸配列と少なくとも約９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を有する核酸分子の多くが、ノバフェロンタンパク質と類似又は同一の活性を有するタンパク質をエンコードするということを、当業者であれば直ちに認識する。実際、縮退性変異体は全て同一のタンパク質をエンコードするので、比較試験無しにもこの点は熟練者にとって明白である。また、縮退性変異体ではない核酸分子に関して、妥当な数がインターフェロン様生物学的活性を有するタンパク質をエンコードするであろうことが、当技術分野においてさらに認識される。その理由は、さらに後述されるように、タンパク質機能に相当の影響を及ぼす可能性が少ないか、又はその可能性がないアミノ酸置換（例えば、ある脂肪族アミノ酸を第２の脂肪族アミノ酸で置換すること）を、熟練者は十分認識しているからである。例えば、表現型についてサイレントなアミノ酸置換を行う方法に関する手引きがＢｏｗｉｅらによって提供されており（７０）、ここで、著者は多くのタンパク質がアミノ酸置換を許容することを示している。
【００７０】
（タンパク質及びポリペプチド変異体及び構築物）
本発明は、配列番号２のノバフェロンタンパク質、及び配列番号２に対して少なくとも約８５〜９５％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有する非自然発生タンパク質のように、配列番号２のノバフェロンタンパク質と実質的に類似のタンパク質又はポリペプチド変異体を含む。例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する非自然発生タンパク質は、本発明の範囲内である。さらに、本発明のノバフェロンタンパク質は、その機能及び特性を高める目的で、他のタンパク質又はタンパク質断片又は他の分子と融合させることにより、構造的に修飾され得る。例示は、ノバフェロンタンパク質の発現を増加させ、又はノバフェロンタンパク質をさらに安定化させるために、ノバフェロンタンパク質を他のタンパク質／タンパク質断片と融合させることを含むが、これらに限定されない。
【００７１】
一実施形態において、本発明によるノバフェロンをエンコードする核酸配列及び／又はノバフェロンタンパク質は、その骨格以外をラベルでラベリングされ得る。本明細書で「ラベリングされた」とは、核酸配列（配列番号１）又はノバフェロンタンパク質（配列番号２）の化合物の検出を可能とするため、前記化合物が少なくとも一つの要素、アイソトープ又はその他の化学物質（ラベル）を付されることを意味する。一般にラベルは、ａ）放射性又は重同位体であり得るアイソトープラベル、ｂ）抗体又は抗原であり得る免疫ラベル、及びｃ）着色又は蛍光染料の三つに分類される。前記ラベルは、任意の位置で前記化合物内に取り込まれることができる。
【００７２】
一旦製造されると、ノバフェロンタンパク質は共有結合的にも修飾され得る。共有結合修飾の一つの様式は、ノバフェロンタンパク質の選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬で、ノバフェロンタンパク質を処理することを含む。二官能性試薬での誘導体化は、例えば、抗ノバフェロン抗体の精製又はスクリーニング検定で用いるために、水不溶性の支持マトリクス又は表面にノバフェロンタンパク質を架橋するために有用である。通常用いられる架橋剤は、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル）、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。
【００７３】
ノバフェロンタンパク質のその他の修飾は、グルタミニル残基及びアスパラギニル残基の、対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基への脱アミド化；プロリン及びリシンのヒドロキシル化；セリル残基又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化；リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のアミノ基のメチル化（７１）；Ｎ末端アミンのアセチル化；及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【００７４】
本発明のノバフェロンタンパク質の共有結合修飾の別の様式は、ノバフェロンタンパク質の天然グリコシル化パターンの変更を含む。この変更は、例えば、（１）ノバフェロンタンパク質の天然配列に見られる１つ以上の炭水化物部分を欠失及び／又は付加することにより、あるいは（２）ノバフェロンタンパク質の天然配列には存在しない１つ以上のグリコシル化部位を欠失及び／又は付加することにより行われる。
【００７５】
ノバフェロンタンパク質に対するグリコシル化部位の付加は、ノバフェロンタンパク質のアミノ酸配列を変更させることにより行われ得る。この変更は、例えば、ノバフェロンタンパク質の天然配列（Ｏ−結合グリコシル化部位）に対して一つ以上のセリン又はトレオニル残基を付加又は置換することによってなされてもよい。ノバフェロンタンパク質のアミノ酸配列の変更は、ＤＮＡレベルでの変化、特に、予め選択されたヌクレオチド塩基においてノバフェロンタンパク質をエンコードするＤＮＡ配列を突然変異させることにより行われ、変更されたコドンは、所望のアミノ酸に翻訳される。
【００７６】
ノバフェロンタンパク質上に炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、グリコシドのタンパク質への化学的又は酵素的結合による。このような方法は、当技術分野において記述されており、例えば、早くも１９８１年にＡｐｌｉｎ ＪＤ及びＷｒｉｓｔｏｎ ＪＣ Ｊｒ．が、タンパク質及び脂質の炭水化物接合体の調製、特性、及び応用について記述した（７２）。
【００７７】
ノバフェロンタンパク質上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的となるアミノ酸残基をエンコードするコドンの突然変異的置換によってなされ得る。化学的脱グリコシル化技術は、当業者には周知であり、例えば、Ｅｄｇｅ ＡＳらによって記述されている（７３）。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａらによって記述されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
【００７８】
このような誘導体化された構築物は、溶解度、吸収性、脳血管関門を通過する透過性、生物学的半減期等を向上させる部分を含んでもよい。ノバフェロンタンパク質のこのような部分又は修飾は、起こりうる望ましくないタンパク質の副作用等を択一的に除去又は軽減することができる。このような効果を媒介できる部分は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙに開示されている（７５）。
【００７９】
ノバフェロンの共有結合修飾の別の様式は、例えば米国特許第４６４０８３５号明細書（７６）、第４４９６６８９号明細書（７７）、第４７９１１９２号明細書（７８）又は第４１７９３３７号明細書（７９）に記載された方法で、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレン等の種々の非タンパク質様ポリマーの一つにノバフェロンタンパク質を結合することを含む。
【００８０】
さらに、本発明のノバフェロンタンパク質は、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合されたノバフェロンタンパク質を含むキメラ分子を形成する方法で修飾されてもよい。一実施形態では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとノバフェロンタンパク質との融合化合物を含む。エピトープタグは、一般的にはノバフェロンタンパク質のアミノ末端又はカルボキシル末端に位置する。このようなノバフェロンタンパク質のエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する別の種類のアフィニティマトリクスを用いたアフィニティ精製によって、ノバフェロンタンパク質を容易に精製することを可能にする。代替の実施形態において、キメラ分子はノバフェロンタンパク質の免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域／断片との融合化合物を含む。例えば、キメラ分子の二価の形態を形成するために、ノバフェロンタンパク質をＩｇＧ分子のＦｃ領域内に融合することができる。
【００８１】
種々のタグポリペプチド及びそれらの各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；インフルエンザＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５（８０）；ｃ−ｍｙｃタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体（８１）；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体（８２）を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド（８３）、チューブリンエピトープペプチド（８４）及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ（８５）を含む。
【００８２】
さらに、本発明のノバフェロンタンパク質は、当業者に周知の化学合成工程を用いて製造され得る。例えば、約８０〜９０アミノ酸残基までの長さのポリペプチドは、市販のペプチド合成機モデル４３３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国 カリフォルニア州、フォスターシティ）で製造され得る。また、１２０残基までの、より長い化学合成ペプチドも、例えばＢｉｏ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社、米国 テキサス州、ルイスビルから商業的に入手可能である。したがって、容易に理解されるように、全長の成熟ノバフェロンタンパク質を合成的に製造することができる（例えば、その後互いに連結され得る断片として）。
【００８３】
したがって、本発明のノバフェロンタンパク質（配列番号２）は、配列番号２に開示されるものと同一のアミノ酸配列を有する全てのタンパク質及びポリペプチド調製物及び構築物を含むが、これらのノバフェロンタンパク質及びタンパク質誘導体は、化学合成的工程により製造されても、及び／又は原核又は真核宿主細胞、又はバクテリア、酵母、植物、昆虫及び哺乳動物細胞を含むがこれらに限定されない他の細胞及び宿主からの組換え技術により製造されても構わない。組換え生産方法で用いられた宿主によっては、本発明のタンパク質はグリコシル化されてもグリコシル化されなくてもよく、ペグ化してもペグ化しなくてもよい。また、本発明のタンパク質は、場合によっては、宿主媒介工程の結果、第１位修飾されたメチオニン残基をさらに含んでもよい。したがって、翻訳開始コドンによりエンコードされるＮ末端メチオニンは、全ての真核細胞内で翻訳後、任意のタンパク質から高効率で一般に除去されることが、当分野において周知である。殆どの原核細胞内でも、殆どのタンパク質のＮ末端メチオニンが効果的に除去されるのに対して、タンパク質によっては、Ｎ末端メチオニンが共有結合するそのアミノ酸の特性に基づき、この原核細胞での除去工程が効率的ではないものもある。
【００８４】
（生産）
本発明はまた、本発明の分離されたＤＮＡ分子からなる組換えベクター、組換えベクターで遺伝的に設計／トランスフェクションされた宿主細胞、及び組換え技術によるノバフェロンタンパク質又はその断片の生産方法に関する。ベクターは、例えば、プラスミド、ファージ、ウイルス、又はレトロウイルスベクターであってもよい。レトロウイルスベクターは、複製可能又は複製不能であってもよい。後者の場合、ウイルス増殖は、一般に相補的な宿主細胞内でのみ発生する。ノバフェロンの生産を詳述する例を以下に説明する。
【００８５】
本発明のノバフェロンタンパク質の発現のための好ましいベクターは、発現されるべきポリヌクレオチドに作動可能に結合された宿主細胞内で発現のために効果的なｃｉｓ作用制御領域を含むベクターを含むが、これに限定されない。適切なトランス作用因子は、宿主により、相補的なベクターにより、又はベクターそのものにより、宿主への導入時に供給される。
【００８６】
本発明に開示される核酸配列（配列番号１）は、適切なプロモーターに作動可能に結合され得る。本明細書で「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼに結合可能であり、ノバフェロンタンパク質のコード配列のエクストロン（ｅｘｔｒｏｎ）（通常、（３’）下流にある）のｍＲＮＡへの転写を開始できる任意の核酸配列を意味する。バクテリアプロモーターは、通常、コード配列の５’末端の近位に配置されている転写開始領域を有する。この転写開始領は、一般にＲＮＡポリメラーゼ結合部位及び転写開始部位を含む。代謝経路酵素をエンコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例示は、ガラクトース、ラクトース、及びマルトース等の糖類代謝酵素に由来したプロモーター配列及びトリプトファン等の生合成酵素に由来した配列を含む。バクテリオファージからのプロモーターも用いられ、これらは当分野において周知である。また、合成プロモーター及びハイブリッドプロモーターも有用であり、例えばｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーター配列とｌａｃプロモーター配列とのハイブリッドである。さらに、バクテリアプロモーターは、バクテリアＲＮＡポリメラーゼと結合して転写を開始する能力を有する非バクテリア由来の自然発生プロモーターを含んでもよい。好ましいバクテリアプロモーターは、大腸菌ｌａｃｉ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ及びｌａｃＺプロモーター、Ｔ３及びＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラムダＰＲ、ＰＬプロモーター及びｔｒｐプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【００８７】
真核細胞プロモーターは、通常コード配列の５’末端の近位に位置する転写開始領域、及び通常は転写開始部位の２５〜３０塩基対（ｂｐ）上流側にあるＴＡＴＡボックスを有する。ＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡ合成を正しい部位で始めるようにＲＮＡポリメラーゼＩＩに指示すると考えられている。哺乳類プロモーターは、一般にＴＡＴＡボックスの１００〜２００塩基対上流側に位置する上流側プロモーター要素（エンハンサー要素）も含む。上流側プロモーター要素は、転写が開始される速度を決定し、一方の方向で作用することができる。ウイルス遺伝子はしばしば高発現され、広い宿主範囲を有することから、哺乳類プロモーターとして哺乳類ウイルス遺伝子からのプロモーターが特に使用される。例示は、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーターを含む。好ましい細胞プロモーターは、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、及びＣＭＶプロモーターを含むが、これらに限定されない。周知の真核細胞プロモーターのうち、この点で適切なものは、ＣＭＶ前初期プロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ１Ａ）プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）等のレトロウイルスＬＴＲのプロモーターである。酵母内発現用として好ましいプロモーター配列は、誘導性ＧＡＬ１／１０プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼからのプロモーター、及び酸性ホスファターゼ遺伝子を含む。
【００８８】
増殖及び発現のためのベクターは、一般に一つ以上の選択マーカーをさらに含む。このようなマーカーは増幅に適切であるか、又はこのベクターはこの目的のために付加的マーカーを含んでもよい。これと関連して、発現ベクターは、好ましくは一つ以上の選択マーカー遺伝子を含み、トランスフェクションされた宿主細胞の選択のための遺伝的特性を提供するが、当業者は、特定のシステム選択マーカーが、個々のベクターに提供され得ることを認識する。好ましいマーカーは、例えば、大腸菌及びその他のバクテリアにおける培養のためのアンピシリン（Ａｍｐ）、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）又はハイグロマイシン（ＨＹＧ）耐性遺伝子を含む。酵母選択マーカーは、ツニカマイシンに対する耐性を付与するＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、及びＡＬＧ７；Ｇ４１８に対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子；及び酵母が銅イオンの存在下で成長することを可能にするＣＵＰ１遺伝子を含む。動物細胞選択マーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子、ネオマイシン（Ｎｅｏ）又はハイグロマイシン（ＨＹＧ）耐性遺伝子を含む。
【００８９】
さらに、増殖及び発現用ベクターは、通常、転写開始、終結のための一つ以上の部位、及び転写領域内に翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。構築物により発現された転写物のコード部分は、好ましくは、開始部における翻訳開始コドン及び翻訳されるＤＮＡ配列の末端における適切に配置された終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ又はＵＡＧ）を含む。プロモーター、ターミネータ、選択マーカー、ベクター及びその他の要素の選択は、この分野の通常の技術水準の範囲内で日常的な設計事項である。多数のこのような要素が文献に記載されており、商業的供給者から入手可能である。
【００９０】
以下のベクター、すなわちＳｈａｎｇｈａｉ Ｓａｎｇｏｎ社からのｐＢＶ２２０（８６）及びその誘導体；Ｑｉａｇｅｎ社からのｐＱＥシリーズ；Ｑｉａｇｅｎ社からのｐＥＴベクター；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社からのｐＢＳベクター、ファージスクリプトベクター、ブルースクリプトベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；及びＰｈａｒｍａｃｉａ社からのｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が市販されており、バクテリアでの使用のために好ましい。好ましい真核細胞ベクターには、Ｐｒｏｍｅｇａ社からのｐＣＩベクター、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社からのｐｃＤＮＡベクター、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社からのｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴｌ及びｐＳＧ；及びＰｈａｒｍａｃｉａからのｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬがある。これらのベクターは、市販されている周知の多数のベクターが、本発明に開示されたノバフェロンタンパク質の遺伝子／組換え方法による製造のために、当業者に入手可能であるということを明示するための例示として単に列挙されたものである。
【００９１】
これと関連して、特定の好ましい実施形態において、前記ベクターは、特異的発現のための手段を提供する。このような特異的発現は、誘導性発現でも、又は単に特定の種類の細胞のみでの発現でもよく、又は誘導性かつ細胞特異的であってもよい。誘導性ベクターのうち特に好ましいものは、温度及び栄養素添加物のように容易に操作可能な環境因子により発現するように誘導することができるベクターである。原核及び真核宿主細胞での使用のための構成的及び誘導性発現ベクターを含む、この応用用途に適合した様々なベクターが広く知られており、当業者により日常的に用いられる。
【００９２】
配列番号１に開示されるＤＡＮ配列を含むベクターは、例えば、適切なプロモーター、及びその他の適切な制御配列と共に、この分野で周知の様々な技術を用いて、所望のタンパク質の発現に適合した適切な宿主細胞内に導入され得る。このような適切な宿主の代表は、大腸菌、枯草菌、ストレプトマイセス細胞等のバクテリア細胞；メタノール資化性酵母細胞等の酵母細胞；ショウジョウバエＳ２及びヨトウガＳｆ９細胞等の昆虫細胞；ＣＨＯ及びＣＯＳ等の哺乳類細胞；及び植物細胞を含む。様々な発現構築物に対する宿主は、広く知られており、当業者は、本発明に開示される情報を用いて、配列番号２に開示されるノバフェロンタンパク質を発現するための宿主を容易に選択することができる。
【００９３】
宿主細胞は、ノバフェロン−エンコーディングポリヌクレオチドを取り込み、本発明のノバフェロンタンパク質を発現するように遺伝的に設計され得る。例えば、ノバフェロン−エンコーディングポリヌクレオチドは、この分野で知られているトランスフェクション技術を用いて、宿主細胞内に導入され得る。このような方法は、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ（８７）により論議されたように、多数の標準臨床マニュアルに記載されている。ノバフェロン−エンコーディングポリヌクレオチドは、単独で又は他のポリヌクレオチドと共に導入／トランスフェクションされ得る。このような他のポリヌクレオチドは、独立的に導入されてもよく、又は配列番号１に開示されるノバフェロン−エンコーディングポリヌクレオチドと共同導入又は連結して導入されてもよい。
【００９４】
例えば、本発明のノバフェロン−エンコーディングポリヌクレオチドは、哺乳類細胞内マーカーの共同トランスフェクション及び選択のための選択マーカーをエンコードする個々のポリヌクレオチドと共に、宿主細胞内にトランスフェクションされ得る。または、ノバフェロン−エンコーディングポリヌクレオチドは、宿主細胞内で増殖を誘導するための選択マーカー−エンコーディングＤＮＡ配列を含有するベクター内に導入され得る。
【００９５】
ノバフェロン−エンコーディングポリヌクレオチドを含有するベクターでトランスフェクションされるように設計された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換細胞を選択し、又は標的遺伝子を増幅させるために特異的に修飾され得る従来の栄養培地内で培養され得る。温度、ｐＨ等の培養条件は、本発明のノバフェロンタンパク質を発現させるために選択された宿主細胞に対して適切に調節される。
【００９６】
翻訳されたタンパク質ポリペプチドの小胞体内腔内、ペリプラスム空間内、又は細胞外環境内への分泌を促進するために、適切な分泌シグナルが取り込まれ、ノバフェロンタンパク質と共発現され得る。
【００９７】
（精製）
標的組換えタンパク質の発現のための適切な宿主細胞型は、通常、標的タンパク質の特性及びその他の条件、例えば製造費用、大規模製造の容易性、産業的生産の規模等の検討に基づいて選択される。その後、最高収率で標的タンパク質を発現するトランスフェクションされた細胞のクローンを選択し、最適発現率を有する最終クローンを標的タンパク質発現細胞株と命名し、標的タンパク質の製造に用いる。標的タンパク質を発現する細胞株を、様々な栄養素を含有する培地内で増殖させる。細胞の最適増殖及び／又は標的タンパク質の最適発現のために、様々な試薬及び条件が用いられ、トランスフェクションされたベクター内の標的タンパク質のｃＤＮＡ配列と共に取り込まれた選択的プロモーターを誘導する。宿主細胞型／発現系がバクテリアである場合、培養細胞は、一般に遠心分離により培地から回収される。回収された細胞体は物理的又は化学的手段で分解され、合成された標的タンパク質を含有する回収された粗抽出物は、タンパク質のさらなる精製のために保持される。微生物細胞の破壊に適用される方法は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破砕、又は細胞溶解剤の使用を含むが、これらに限定されない。このような方法は、当業者に良く知られている。
【００９８】
本発明者らは、組換えノバフェロンタンパク質の発現のための宿主細胞として、バクテリアの大腸菌を用いた。後述されるように、大腸菌は、ノバフェロン−エンコーディングポリヌクレオチド配列を含有するベクターでトランスフェクションされ、ノバフェロンタンパク質の最適発現を有する一つの大腸菌株が、ノバフェロンタンパク質の製造用として選択された。一旦合成されると、前記タンパク質は不溶性顆粒として細胞質内に保持されるか、又は可溶性形態で細胞質内に分泌され得る。前者の場合、顆粒は細胞体の溶解後に回収され、例えばグアニジンイソチオシアネート又は尿素を用いて変性される。変性したポリペプチド／ノバフェロンタンパク質のリフォールディングは、変性物の過剰の希釈溶液を用いた希釈、又は尿素溶液と還元及び酸化グルタチオンの組み合わせとの溶液に対する透析、及びその後の緩衝生理食塩溶液に対する透析により得られる。後者の場合、回収された細胞の破壊の後、タンパク質は変性することなくペリプラスム空間から可溶性及び機能性の状態で直接回収され得る。変性及びリフォールディング工程を回避することにより、可溶性ノバフェロンタンパク質は損傷せず、変形され、又は誤って折り畳まれたタンパク質分子を含有することはない。
【００９９】
本発明者らは、大腸菌細胞株で生成された合成ノバフェロンタンパク質のかなりの部分が細胞質内に分泌されることを発見した。この部分はその後、下記のように精製された。
（活性アッセイ及び医学的用途）
上述したように、ノバフェロンタンパク質は、インターフェロンファミリーの多くの構成員、特に、ＨｕＩＦＮ−α１４のｍＲＮＡ（図２）により翻訳されるインターフェロンタンパク質に対して配列相同性を示す。ＨｕＩＦＮ−αは、抗ウイルス、抗増殖、及び免疫調節活性を含む広範囲の生物学的活性を有することが示された（１０）。
【０１００】
ＨｕＩＦＮ−αに対するこのような相同性により、ノバフェロンは、腫瘍増殖阻害、抗ウイルス活性、ＮＫ細胞活性化、及び免疫系調節を含むが、これらに限定されないＨｕＩＦＮ−αと類似した生物学的機能を示すものと予想される。特に重要なものは、ＨｕＩＦＮ−α様機能特性の保持のみならず、ノバフェロンタンパク質のこれらの生物学的機能のＨｕＩＦＮ−αよりも高められた効力である。その機能特性の効力を確認及び決定するために、ノバフェロンタンパク質の生物学的活性を、抗ウイルス及び抗増殖特性を検出するように設計された古典的かつ日常的なインビトロアッセイを用いて測定した。以下の実験の項に示すように、ノバフェロンタンパク質の抗増殖特性のインビボ効力は、様々なヒト癌タイプの動物モデルでさらに観察され、実験によっては、化学的抗癌剤のみならず、ＨｕＩＦＮ−αとも比較された。
【０１０１】
ＨｕＩＦＮ活性を測定するための多くの適切なアッセイがこの分野で良く知られている。本発明者らは、抗ウイルス及び抗増殖活性を測定するために、インビトロ細胞ベースアッセイシステムを用いた。同じインビトロアッセイを、ヒトＩ型インターフェロン遺伝子シャッフリングライブラリーのスクリーニング、ヒトＩ型インターフェロン遺伝子シャッフリングライブラリーの発現タンパク質からのノバフェロンの選択、及び純組換えノバフェロンタンパク質の生物学的活性の測定を含むが、これらに限定されない本発明に関する全ての工程及び実験で用いた。
【０１０２】
検査試料／試薬の抗ウイルス活性を、ウイルスに対する細胞の耐性の程度を観察することにより測定する多数のアッセイがある（８８）。ＨｕＩＦＮ及びそのハイブリッドの抗ウイルス活性を測定するために、三つの主要なバイオアッセイが用いられてきた。これらは、培養細胞に対するウイルスの様々な様相を判定する方法によって分類される。
【０１０３】
ウイルスに誘導された細胞変性効果の阻害を判定するためのアッセイでは、ＩＦＮで前処理された培養細胞に対するウイルス誘導された溶解性細胞変性効果の減少程度を測定する。このアッセイは、９６ウェルプレート内で行われ（８９）、多数の試料をスクリーニングするための簡便な方法を提供することから、組換えＨｕＩＦＮ−αに対して広く用いられてきた。
【０１０４】
ウイルスプラーク形成の阻害は、組織培養物内のＨｕＩＦＮの抗ウイルス活性を定量する別の方法である。プラーク減少アッセイの結果は、感染の多重性とは独立的である。また、プラーク形成の５０％減少を高精度で測定可能である。プラーク形成を誘導するために、例えば遍在的水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を用いて、異なる動物種からの多数の細胞株をスクリーニングすることにより、特定の組換えＩＦＮの異種間活性のプロフィールを決定することができる（９０）。
【０１０５】
三番目のアッセイは、ウイルス収率の減少の測定に基づく。通常、単細胞成長周期の間、放出されたウイルス量によってウイルス生成量を測定する。このアッセイは、細胞変性効果を生じず、又は標的細胞培養物内にプラークを形成しないウイルスに対するＩＦＮの抗ウイルス活性を試験するために特に有用である。しかしながらこの試験では、感染の多重度が、ＩＦＮの固定濃度によって誘導された保護の見かけの程度に影響を及ぼす（９１）。
【０１０６】
ノバフェロンの抗ウイルス活性は、ＷＩＳＨ細胞及び水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を用いて、標準細胞変性効果阻害アッセイによって測定された。抗ウイルス活性は、ＷＨＯ国際標準の標準参照試料９５／６５０（ｒＨｕＩＦＮ−α２ａ）及び９４／７８６（ｒＨｕＩＦＮ−αコンセンサス）を用いて測定され、キャリブレートされた。抗ウイルス活性の一つの単位は、培養細胞においてＶＳＶの細胞変性効果の５０％阻害を達成するのに必要なタンパク質の量として定義される。さらに後述されるように、ノバフェロンタンパク質の活性は２．５×１０９ＩＵ／ｍｇであって、ＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも約１２．５倍高い。これらの試験は、ＨｕＩＦＮ−α２ｂに比べて、ノバフェロンの抗ウイルス特性がかなり高められることを立証する。ノバフェロンタンパク質が示すウイルスに対するこの高められた効力は、ヒトのインビボにおける高められた抗ウイルス効果の予測に対する根拠を提供する。ＨｕＩＦＮの特性に基づき、ノバフェロンに関して極めて広い抗ウイルスプロフィールを合理的に予想可能である。言い換えれば、ノバフェロンは、天然ＨｕＩＦＮよりも広範囲のウイルスに対してさらに強力である。ノバフェロンの高められた抗ウイルスの効力は、様々なウイルス性疾患の患者に対する臨床現場で、さらによい抗ウイルス効果又はさらによい治療効果につながり得る。
【０１０７】
上述したように、ＩＦＮは様々なメカニズムを通じて細胞増殖を抑制し、強力な抗腫瘍効果を示す。細胞培養系を用いて、いくつかのインビトロ抗増殖試験が確立され、この分野で良く記述されている。これらのアッセイにおける細胞増殖は、細胞数の計測、クリスタルバイオレットバイオアッセイ（９２、９３）、ニュートラルレッド色素に対する化学感度（９４〜９６）、放射ラベルヌクレオチドの取込み（９７）、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の増殖細胞ＤＮＡへの取込み（９８）、テトラゾリウム塩の使用（９９、１００）により測定され得る。
【０１０８】
ヒトリンパ芽球様Ｄａｕｄｉ細胞株は、ＨｕＩＦＮ−αの抗増殖効果に極めて敏感であり、懸濁培養物内でのその増殖は、その細胞数の定量を容易にする（１０１）。この細胞株は、長年にわたって、ＨｕＩＦＮ−α及びハイブリッドの抗増殖活性を測定するために用いられてきた（１０２）。その他の細胞株も、試験試薬の抗増殖活性を試験するために用いられている。
【０１０９】
ノバフェロンタンパク質の抗増殖活性は、様々なヒト腫瘍異種移植片を有する動物モデルに対するノバフェロン投与による腫瘍塊成長の阻害を観察することにより、インビボで測定された。ノバフェロンのインビボ抗腫瘍効果はＨｕＩＦＮ−α２ｂと比較され、一部異種移植片モデルでは化学的抗腫瘍剤とも比較された。
【０１１０】
以下に詳述されるように、本発明者らは、標準Ｄａｕｄｉ細胞方法を用いて測定されたインビトロ抗増殖活性が、おそらく全ての天然ＨｕＩＦＮの中で最も強力な抗増殖活性を示す天然ＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも、さらに４００倍強力であることを見出した。ノバフェロンは、本発明者らがインビトロで試験した全てのヒト癌細胞株について天然ＨｕＩＦＮ−α２ｂよりもさらに強力又は高められた阻害を示したため、ノバフェロンの増加された抗増殖強度は広く普遍的であった。これは、ノバフェロンによるヒト癌の強力な阻害が選択的ではないことを示す。全ての試験されたタイプのヒト癌細胞株に対するノバフェロンの増加された抗増殖活性の程度には幅があったが、ノバフェロンは、臨床現場で幅広い抗癌剤となる可能性を有している。これは、化学的抗癌剤、モノクローナル抗体及びその他の標的特異性抗癌剤よりも優れた大きな利点である。
【０１１１】
後述される異種移植片を有する動物モデル実験は、さらに以下を確証する。
（１）ノバフェロンのインビボ抗増殖効果は、天然ＨｕＩＦＮ−α２ｂと比較して顕著に高められ又はさらに強力であった。
【０１１２】
（２）遥かに低い用量において、ノバフェロンのインビボ抗増殖効果は、同一の異種移植片モデルで試験された化学的試薬である５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）よりも高かった。
【０１１３】
（３）ノバフェロンは、異種移植片モデルにおいて９０％以上の癌成長阻害を達成することができたが、処置動物において、体重減少、活性変化及びその他のマイナスの副作用を誘導することはなく、この点において、５−ＦＵ処理動物での相当な体重減少及び活性減少と極めて対照的であった。
【０１１４】
このような結果は、天然ＨｕＩＦＮ−α２ｂと比較して、ノバフェロンのインビトロ及びインビボ抗増殖特性が大いに高められることを意味する。ノバフェロンの高められた抗増殖効力は、マウス動物モデルにおけるヒト癌成長の効果的な阻害（＞９０％）につながり、このような阻害は、試験された全てのタイプのヒト癌に対して極めて広く作用し、古典的な化学的抗癌剤である５ＦＵよりも優れると考えられる。このような結果はまた、ノバフェロンによる癌細胞成長の強力な阻害が、癌細胞に対しては極めて特異的であるが、ノバフェロン処置動物における正常な摂食及び行動、及び減少しなかった体重により裏付けられるように、正常細胞に対してはそうではないことを示している。したがって、ノバフェロンは、全ての又は主要なヒト癌に対して作用する潜在力を有している。
【０１１５】
好ましい実施形態において、配列識別番号１のポリヌクレオチド配列を用いる組換え技術によって製造され、又は化学的に合成されたノバフェロンタンパク質（配列番号２）の完全又は部分的分子（複数の場合あり）は、ヒト及び／又は非ヒト種で、ヒト由来又は非ヒト由来の任意及び／又は全ての腫瘍及び癌の治療及び／又は予防に応用され得る。これらの腫瘍は、例えば、骨肉腫、多発性骨髄腫、ホジキン病、結節型かつ低分化型リンパ腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄白血病、乳房癌、黒色腫、乳頭腫、及び鼻咽頭癌腫、結腸癌、肝臓癌、及び黒色腫を含むが、これらに限定されない。
【０１１６】
別の実施形態において、配列識別番号１のポリヌクレオチド配列を用いる組換え技術によって製造され、又は化学的に合成されたノバフェロンタンパク質（配列番号２）の完全又は部分的分子（複数の場合あり）は、ヒト及び／又は非ヒト種で、任意の及び／又は全てのウイルス性疾患の治療及び／又は予防に応用され得る。感受性ウイルス感染の例は、ウイルス性脳心筋炎、インフルエンザ及びその他のウイルス性気道感染症、狂犬病及びその他のウイルス性動物原性感染症、及びアルボウイルス感染症、さらに単純ヘルペス性角膜炎、急性出血性結膜炎、帯状疱疹、及びＢ型及びＣ型感染、ＳＡＲＳ及び鳥インフルエンザ、ヒト免疫不全症候群（ＡＩＤＳ、ＨＩＶ）を含むが、これらに限定されない。
【０１１７】
別の実施形態において、配列識別番号１のポリヌクレオチド配列を用いる組換え技術によって製造され、又は化学的に合成されたノバフェロンタンパク質（配列番号２）の完全又は部分的分子（複数の場合あり）は、ヒトにおいて、任意の及び／又は全ての免疫系関連障害の治療及び／又は予防に応用され得る。免疫障害の例は、関節リウマチ、多発性硬化症、及びシェーグレン症候群糖尿病を含むが、これらに限定されない。ノバフェロンタンパク質は、移植片対宿主拒否反応の予防にも応用され得る。
【０１１８】
別の実施形態において、配列識別番号１のポリヌクレオチド配列を用いる組換え技術によって製造され、又は化学的に合成されたノバフェロンタンパク質（配列番号２）の完全又は部分的分子（複数の場合あり）は、任意の及び／又は全ての血管新生疾病に対して免疫補助剤として治療及び／又は予防に応用され得る。血管新生疾病の例は、血管腫、腫瘍誘導新生血管、加齢性黄斑変性症、及び糖尿病性網膜症を含むが、これらに限定されない。
【０１１９】
ノバフェロンタンパク質は、単独又は任意のその他のタンパク質／担体材料又はその他の構築物と共に、任意の投与／送達経路／方法で、任意の薬剤学的に許容可能な製剤／剤形としてヒト及び／又は非ヒト種に投与され得、それらは経口摂取、吸入、鼻内噴霧、腹腔内、静脈内、筋肉内、病巣内、又は皮下注射を含むが、これらに限定されない。
【０１２０】
活性成分としてのノバフェロンタンパク質を含有する薬剤学的製剤／剤形は、錠剤、丸薬、散剤、溶液又は懸濁剤、リポソーム、坐薬、注射剤、及び点滴液剤等の液体、固体、半固体、及び／又は任意のその他の臨床的に許容可能な形態である適切な固体又は液体担体を取り込むことにより製造され得る。ノバフェロン含有製剤／剤形は、この分野で記述されており、又は薬剤学的産業の実務において一般に許容される従来の担体、材料、方法を用いて製造され得る。ノバフェロン含有製剤／剤形は、この分野で記述されておらず、又は薬剤学的産業において使用されない非従来的な方法、材料を用いても製造され得る。
【０１２１】
例えば、非経口剤形は、通常、水、生理食塩水、その他の平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロール等の薬剤学的及び生理学的に許容可能な材料からなる注射可能な流体である。さらに、前記注射可能な流体は、ノバフェロンタンパク質以外にヒト血清アルブミン又は血漿製剤等のその他のタンパク質を担体として含み得る。前記薬剤学的製剤／剤形は、湿潤剤又は乳化剤、保存剤及びｐＨ緩衝剤（例えば、酢酸ナトリウム又はソルビタンモノラウレート）等の非毒性補助物質を少量含んでもよい。製剤化方法は、当業者には良く知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（７５）に開示されている。
【０１２２】
特定のノバフェロンタンパク質製剤／剤形は、意図する臨床応用及び／又は投与方法により決定され、周知の技術を用いて、いかなる当業者によっても製造され得る。例えば、注射可能な流体以外に、局所及び経口剤形も用いられ得る。局所製剤は、点眼剤、軟膏剤、及び噴霧剤を含むが、これらに限定されない。経口剤形は、液体（例えば、シロップ剤、溶液剤、又は懸濁剤）又は固体（例えば、散剤、丸薬、錠剤、又はカプセル剤）を含むが、これらに限定されない。固体製剤／剤形に対して、従来の非毒性固体担体は、薬剤学的等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、又はステアリン酸マグネシウムを含むが、これらに限定されない。これらの製剤／剤形を製造する実際の工程及び／又は方法は当業者に良く知られているか、又は自明である（７５）。
【０１２３】
ノバフェロンタンパク質の薬剤学的に許容可能な製剤／剤形は、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、経皮、腹腔内、筋肉内、肺内、膣内、直腸内又は眼球内送達を含むが、これらに限定されない様々な経路で、外傷治療の際に直接局所的にヒト及び／又は非ヒト種に投与されてもよい。
【０１２４】
前記製剤／剤形内のノバフェロンタンパク質の濃度／量は、臨床実務により、＞０〜１．０モラーまで、かつ／又は＞０〜１００％（重量／重量）まで多様であってよい。それぞれの及び／又は全てのノバフェロン製剤／剤形の正確な投与量、投与間隔、及び治療期間は、臨床実験、病状、患者の状態及び医療提供者により決定される。好ましい実施形態において、タンパク質分解、全身対局所的輸送、及び新たなプロテアーゼ合成速度のみならず、年齢、体重、全体的な健康、性別、食事、投与時間、薬物間相互作用、及び疾患の重症度等に応じて、個別及び／又は総投与量、投与間隔、治療期間、及び必要な治療コースを含むが、これらに限定されないノバフェロン投与に対する調節が必要であることがあり、当業者により日常的な実験によって決定され得る。
【０１２５】
好ましい実施形態において、ヒト及び／又は非ヒト種の体に投与後、ノバフェロンタンパク質の循環中の半減期は変更され得る。このような変更は、インビボでのノバフェロン半減期の延長又は短縮を含むが、これに限定されない。ノバフェロンタンパク質のインビボ半減期の延長は、以下のものを含む様々な方法で達成され得るが、これらに限定されない。
【０１２６】
（１）ノバフェロン分子とモノクローナル抗体との間の複合体の形成。このような抗体は、好ましくはノバフェロンタンパク質の治療的機能を実質的に損傷させない部位でノバフェロンタンパク質に連結される（１０３）。
【０１２７】
（２）ノバフェロンの他のタンパク質／ポリペプチドとの融合複合体。ノバフェロン分子は、免疫グロブリンの正常領域（Ｆｃ）の断片等の他のタンパク質／ポリペプチドに組換え的に融合され得る（１０４）。
【０１２８】
（３）ノバフェロンタンパク質の接合。例えば、ノバフェロンタンパク質は、ポリエチレングリコール又は関連ポリアルキレングリコール部分等の非抗原性ポリマーと接合され得る（１０５〜１０８）。
【０１２９】
別の好ましい実施形態において、治療化合物は抗体、好ましくは抗ノバフェロンタンパク質抗体に接合され得る。前記治療化合物は、細胞毒性剤であってもよい。この方法において、細胞毒性剤は、ノバフェロン分子に対する接合抗体の結合により、腫瘍組織又は細胞に対して標的化され得、それにより、病気にかかった細胞を破壊して個数を減少させ、癌症状の軽減をもたらす。前記細胞毒性剤は、細胞毒性薬物、毒素及びそのような毒素の活性断片、及び放射性化学物質を含むが、これらに限定されない。適切な毒素及びそれに該当する断片は、ジフテリアＡ鎖、エクソトクシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシン等を含む。
【０１３０】
好ましい実施形態において、ノバフェロンタンパク質−エンコーディングポリヌクレオチド配列（配列番号１）の全長配列、部分的配列、及び／又は調節的配列は、当業者によって遺伝子療法関連投与で用いられ得る。ノバフェロンタンパク質−エンコーディングポリヌクレオチド（配列番号１）に基づくアンチセンス適用は、遺伝子療法（すなわち、ゲノムへの取込みのための）又はアンチセンス組成物として用いられ得、当業者によって理解されるであろう。
【０１３１】
遺伝子療法応用において、遺伝子が細胞内に導入され、これらの遺伝子によりエンコードされる標的タンパク質のインビボ合成が達成される。従来の遺伝子療法は、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの単一治療又は反復投与により持続的治療効果を達成する。一方、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、インビボで特定の遺伝子の発現を封鎖するための治療剤としても用いられ得る。短鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが細胞内に送達され、そこで阻害剤として作用し得ることは既に知られている（１０９）。
【０１３２】
好ましい実施形態において、ノバフェロンタンパク質−エンコーディングポリヌクレオチド（配列番号１）は、全長又は部分長でＤＮＡワクチンとして用いられ得る。ネイキッドＤＮＡワクチンがこの分野で一般に知られている（１１０）。全長又は部分長のノバフェロン−エンコーディング遺伝子（配列番号１）のＤＮＡワクチンとしての適用方法は当業者に広く知られており、ヒト及び／又は非ヒト種において、ノバフェロン遺伝子又はノバフェロン遺伝子の一部をノバフェロンタンパク質の全長又は部分長を発現するためのプロモーターの制御下に配置することを含むが、これに限定されない。
（実施例）
下記の実施例は、上記の発明の使用態様をより十分に説明し、また本発明の様々な態様を実施するための最良の形態を記載するために提示されている。これらの実施例は本発明の実際の範囲を全く限定せず、むしろ例示の目的で提示されるものとして理解される。ここで引用される全ての参考文献は、その全体が参照として包含される。
【実施例１】
【０１３３】
実施例１．ヒト白血球ｃＤＮＡからのヒトＩＦＮ−α遺伝子のＰＣＲ増幅
ヒト末梢血白血球から総ｍＲＮＡを抽出した。アドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）（商標）ＲＴ−ｆｏｒ−ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、米国、カリフォルニア州、マウンテンビュー）及びｃＤＮＡ合成プライマー（オリゴｄＴ１８）を用い、メーカーの推奨に従ってｃＤＮＡの調製を行った。
【０１３４】
ヒトＩＦＮ−αｃＤＮＡの増幅は、ＭＪ ＰＴＣサーマルサイクラーでのＰＣＲ技術によって行い、下記の条件を用いた。すなわち、２．５μｌ １０×ｐｆｘ増幅バッファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国、カリフォルニア州、カールズバッド）、０．７５μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２５μｌ プラチナｐｆｘＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国、カリフォルニア州、カールズバッド）０．７５μｌ ｃＤＮＡ、０．７５μｌ ５’プライマー（１０μｌ；ＩＦＮａＯ５：５’−ＴＧＧＴＧＣＴＣＡＧＣＴ（Ａ／Ｇ）ＣＡＡＧＴＣ−３’）、（配列番号３）０．７５μｌ ３’プライマー混合物（各１．７μＭ；
ＩＦＮａＯ３−１：５’−ＡＡＴＣＡＴＴＴＣＣＡＴＧＴＴＧ（Ａ／Ｇ）ＡＣＣＡＧ−３’（配列番号４）；
ＩＦＮａＯ３−２：５’−ＡＡＴＣＡＴＴＴＣＣＣＧＧＴＴＧＴＡＣＣＡＧ−３’（配列番号５）；
ＩＦＮａＯ３−３：５’−ＡＡＴＣＡＴＴＴＣＣＡＴＧＴＴＧＡＡＡＣＡＧ−３’（配列番号６）；
ＩＦＮａＯ３−４：５’−ＡＡＴＣＡＴＴＴＣＡＡＧＡＴＧＡＧＣＣＣＡＧ−３’（配列番号７）；
ＩＦＮａＯ３−５：５’−ＡＡＴＧＡＴＴＴＴＣＡＴＧＴＴＧＡＡＣＣＡＧ−３’（配列番号８）；
ＩＦＮａＯ３−６：５’−ＡＡＴＣＡＴＴＴ（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ｇ）ＡＴＧＴＴＧＡＡＣＣＡＧ−３’（配列番号９）；
ＩＦＮａＯ３−７：５’−ＧＡＴＣＡＴＴＴＣＣＡＴＧＴＴＧＡＡＴＧＡＧ−３’（配列番号１０）；
ＩＦＮａＯ３−８：５’−ＧＡＧＴＣＧＴＴＴＣＴＧＴＧＴＴＧＧＡＴＣＡＧ−３’（配列番号１１）。
【０１３５】
増幅されたＰＣＲ生成物を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、切り取ってゲル精製し、メーカーの推奨に従ってｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ又はｐＣＲ−４−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国、カリフォルニア州、カールズバッド）にクローニングした。プリズム・レディ・リアクション・ダイ・ターミネーション・ミックス（Ｐｒｉｓｍ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｉｘ）で、ＡＢＩ自動シーケンサ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国、カリフォルニア州）により自動シーケンスを行った。
【０１３６】
上記のクローン中に、ＩＦＮａ６、ＩＦＮａ７及びＩＦＮａ１６をコードしている配列について所望の挿入がなかったため、型特異的プライマーを除く他は、上記の条件で再びＰＣＲを行った。ＩＦＮａ６の特異的増幅のために、５’及び３’プライマーはそれぞれ、ＩＦＮａＯ５：５’−ＴＧＧＴＧＣＴＣＡＧＣＴ（Ａ／Ｇ）ＣＡＡＧＴＣ−３’（配列番号３）、及びＩＦＮａＯ３−８：５’−ＧＡＧＴＣＧＴＴＴＣＴＧＴＧＴＴＧＧＡＴＣＡＧ−３’（配列番号１１）とした。ＩＦＮａ７特異的増幅のための５’及び３’プライマーは、それぞれＩＦＮａ７ＵＯ：５’−ＡＴＧＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＴＴＴＣＴＴＴＡＣ−３’（配列番号１２）、及び、ＩＦＮａＯ３−５及びＩＦＮａＯ３−６の等モルの混合物とした。ＩＦＮａ１６特異的増幅のための５’及び３’プライマーは、それぞれＩＦＮａ７ＵＯ、及びＩＦＮａＯ３−７：５’−ＧＡＴＣＡＴＴＴＣＣＡＴＧＴＴＧＡＡＴＧＡＧ−３’（配列番号１０）とした。増幅された断片をｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ又はｐＣＲ−４−ＴＯＰＯベクターにクローニングし、上記のようにシーケンスした。
【０１３７】
全てのクローンＩ型ヒトＩＦＮ−アルファ遺伝子を、それぞれジーンバンクにおけるそれらのＤＮＡ配列と共にアラインメントした。これらの遺伝子のジーンバンクヌクレオチド登録番号をここに参照すると、ＮＭ＿０２４０１３（ＩＦＮ−α１）、ＮＭ＿０００６０５（ＩＦＮ−α２）、ＮＭ＿０１０５０４（ＩＦＮ−α４）、ＮＭ＿０１０５０５（ＩＦＮ−α５）、ＮＭ＿００８３３５（ＩＦＮ−α６）、ＮＭ＿００８３３４（ＩＦＮ−α７）、ＮＭ＿００８３３６（ＩＦＮ−α８）、ＮＭ＿００２１７１（ＩＦＮ−α１０）、ＮＭ＿００２１７２（ＩＦＮ−α１４）、ＮＭ＿００２１７３（ＩＦＮ−α１６）、ＮＭ＿０２１２６８（ＩＦＮ−α１７）、ＮＭ＿００２１７５（ＩＦＮ−α２１）である。
【実施例２】
【０１３８】
実施例２．Ｉ型ＨｕＩＦＮ−含有プラスミドのシャッフリングライブラリーの構築
Ｉ型ヒトＩＦＮ−αの一つのコード配列を含有するプラスミドを構築するために、成熟ヒトＩ型ＩＦＮタンパク質の領域をコードする個々のｃＤＮＡに基づき、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位を有する１５対のオリゴヌクレオチドを合成した（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社、米国、カリフォルニア州、南サンフランシスコ）。これらのタンパク質のジーンバンクヌクレオチド登録番号をここに参照すると、ＮＭ＿０２４０１３（ＩＦＮ−α１）、ＮＭ＿０００６０５（ＩＦＮ−α２）、ＮＭ＿０１０５０４（ＩＦＮ−α４）、ＮＭ＿０１０５０５（ＩＦＮ−α５）、ＮＭ＿００８３３５（ＩＦＮ−α６）、ＮＭ＿００８３３４（ＩＦＮ−α７）、ＮＭ＿００８３３６（ＩＦＮ−α８）、ＮＭ＿００２１７１（ＩＦＮ−α１０）、ＮＭ＿００２１７２（ＩＦＮ−α１４）、ＮＭ＿００２１７３（ＩＦＮ−α１６）、ＮＭ＿０２１２６８（ＩＦＮ−α１７）、ＮＭ＿００２１７５（ＩＦＮ−α２１）である。実施例１でテンプレートとして構築したプライマー及びプラスミドを、標準的ＰＣＲ（１１１）で使用した。その結果得られた生成物を制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、多重クローニング領域にＢａｍＨＩ部位及びＥｃｏＲＩ部位を有するｐＢＶ２２０（８６）の派生体発現プラスミドである大腸菌の発現ベクターｐＢＶＢにクローニングした。これらの最終構築物を、全てＤＮＡシーケンス解析（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）で確認した。
【０１３９】
ヒトＩＦＮ ＯＲＦを含有するＤＮＡ断片を、一対のオリゴヌクレオチドＢＶＦ４：５’−ＡＧＧＧＣＡＧＣＡＴＴＣＡＡＡＧＣＡＧ−３’（配列番号１３）及びＢＶＲ３：５’−ＴＣＡＧＡＣＣＧＣＴＴＣＴＧＣＧＴＴＣＴＧ−３’（配列番号１４）を用いたＰＣＲによって、及び先に構築したＩ型ＨｕＩＦＮ含有プラスミドを使用して増幅した。その結果得られた生成物を同量ずつ混合し、Ｓｔｅｍｍｅｒによる手順（１１２）に従ってＤＮａｓｅＩ消化及びＰＣＲアセンブリに供した。
【０１４０】
アセンブリしたＰＣＲ生成物を、さらに一対のインナープライマー：ＢＶＦ：５’−ＧＡＡＧＧＣＴＴＴＧＧＧＧＴＧＴＧＴＧ−３’（配列番号１５）及びＢＶＲ：５’−ＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣ−３’（配列番号１６）を用いて増幅し、続いてＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ消化し、ＲＥのＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで切断した大腸菌発現ベクターｐＢＶＢに再びクローニングした。これらの最終構築物を、全てＤＮＡシーケンス解析で確認した。プラスミド含有シャッフルＨｕＩＦＮ−α遺伝子を大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換させた。
【０１４１】
上記の全てのＰＣＲ手順は、ＰＣＲ増幅又はＰＣＲアセンブリのいずれかであり、忠実度の高いＤＮＡポリメラーゼの代わりに通常のＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社、米国、マサチューセッツ州）を使用した。
【実施例３】
【０１４２】
実施例３．シャッフリングライブラリーのスクリーニング
新規に形質転換させた大腸菌ＤＨ５α細胞を３７℃で一晩、ＬＢプレートで増殖させた。単一コロニーを個別に採取し、９６ウェルプレート中５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１００μｌのＬＢ培地に播種した。コロニーを３０℃、２５０ｒｐｍで振とうした。一晩培養した後、９６ウェルプレート中５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１００μｌのＬＢ培地に、１０μｌのバクテリア培養物をデュプリケートで播種した。元のプレート（いわゆるストックプレート）はしばらく４度で保存した。デュプリケートのプレート中の細胞を、ＯＤ６００が０．４になるまで３０℃で増殖させ、その後４２℃で誘導した。４時間の熱誘導の後、凍結融解サイクルを開始するためバクテリア培養物を−８０℃の冷凍室へ直接入れた。２サイクルの凍結融解の後、バクテリア懸濁液／溶解物を所望の濃度に希釈し、抗増殖試験のためのＤａｕｄｉ細胞培養（１０１）又は抗ウイルス試験のためのＷｉｓｈ細胞培養（１１３）にさらした。
【０１４３】
スクリーニングの各段階において、２０，０００個のコロニーを最初にスクリーニングし、抗増殖活性又は抗ウイルス活性が最も高い約１００個のコロニーをさらなる確認試験のために選抜した。ストックプレート中の選抜したバクテリア培養物を、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢプレートにストリーキングした。単一コロニーを３７℃で一晩増殖させ、採取し、試験管中に５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１ｍｌのＬＢ培地に播種した。試験管中のバクテリアを３０℃で一晩、２５０ｒｐｍで振とうしながら増殖させた。その後、４０μｌの増殖バクテリアを、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含む１ｍｌのＬＢが入った別の試験管の組の一つに播種した。その後、試料を前記最初のスクリーニング段階に関して上述したような発現誘導、細胞培養回収、凍結融解サイクル処理、及び抗増殖又は抗ウイルス試験の各段階に供した。
【０１４４】
スクリーニングの各段階において、抗増殖活性又は抗ウイルス活性が最も高い約２０個のコロニーを、確認試験の後プラスミド作製のために選抜し、それらの挿入を自動シーケンスした。特有のＤＮＡ配列を有する挿入を、ＰＣＲプライマー対ＢＶＢＦ：５’−ＡＣＣＡＴＧＡＡＧＧＴＧＡＣＧＣＴＣ−３’（配列番号１７）；及びＢＶＲ：５’−ＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣ−３’（配列番号１６）を用いて増幅した。なお、これらはそれぞれｐＢＶＢベクターの多重クローニング部位の上流及び下流におけるフランキング配列である。増幅したＰＣＲ生成物を、次の段階のシャッフリングライブラリー構築に用いた。
【０１４５】
抗増殖又は抗ウイルス活性のいずれかの増加に基づき、５サイクルのスクリーニング段階を実施した。
【実施例４】
【０１４６】
実施例４．大腸菌における組換えタンパク質の発現及び精製
ノバフェロンタンパク質（配列番号２）は大腸菌で発現された。開始コドンＡＴＧを人工的に付加した配列番号１のリーディングフレームを、λＰＲＰＬプロモーター（１１４）の制御の下、温度誘導性ｐＢＶＢベクターにクローニングした。ノバフェロンの発現プラスミド、ｐＢＶＢＮＦをＤＨ５α細胞に形質転換させた。単一コロニーを個別に採取し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ｍｌのＬＢ培地に播種し、３０℃で８時間培養した。その後、培養バクテリアの２ｍｌを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌの培地で、撹拌しながらさらに３０℃で一晩培養した。翌朝、一晩培養したバクテリアを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む大量のＬＢ培地に１：１０〜１：２０の比率で播種し、撹拌しながら３０℃で培養した。培養物が増殖の対数期中期（Ａ５５０＝０．５〜０．６）に達した時、培養温度を急激に４２℃まで上昇させ、ノバフェロンの発現を誘導するために４時間保持した。４時間の熱誘導の後、バクテリア細胞を遠心分離し、ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）で３回洗浄した後、増殖段階を行うまで−８０℃で保存した。
【０１４７】
殆どのノバフェロンタンパク質分子がここに記載される大腸菌生産システムに溶解したが、細胞質では過剰に発現した。そこで、細胞を細胞溶解バッファＩ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ）（１１５）中でリゾチーム消化によって破壊した。残存する無傷の細胞及びスプライスＤＮＡ分子を破壊するため、溶解物をさらに超音波破砕した。その後溶解物を遠心分離した。
【０１４８】
その後、浮遊物中の可溶性ノバフェロンタンパク質分子を疎水性イオン交換クロマトグラフィ及びゲル濾過法によって実質的に精製した。第１に、前記浮遊物をフェニルセファロース６ファーストフローカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）に加え、通過させた。第２に、ノバフェロンタンパク質を含むフラクションをＰＯＲＯＳ５０Ｄカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）に適用した。第３に、前記ノバフェロン分子を含むフラクションをＰＯＲＯＳ５０ＨＳカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）による精製に供し、最後に、回収したノバフェロン分子をさらにハイロード２６／１００スーパーデックス７５ｐｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、米国）により精製した。
【０１４９】
純ノバフェロンタンパク質の純度を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって確認した。純組換えノバフェロンタンパク質は１９〜２０ＫＤａの分子量（ＭＷ）の単一バンドを示した。質量分析は、精製ノバフェロン分子の純度が＞９８％、分子量が１９３１３ダルトンであることを示し、そのアミノ酸配列から推定される分子量１９３１５ダルトンに一致した。
【実施例５】
【０１５０】
実施例５．大腸菌における組換えＨｕＩＦＮ−α２ｂの発現及び精製
ＨｕＩＦＮ−α２ｂの発現プラスミドｐＢＶ２ｂは、熱誘導性λＰＲＰＬプロモーターの制御下にあるＨｕＩＦＮ−α２ｂ（ジーンバンクヌクレオチド登録番号ＮＭ＿０００６０５）の成熟タンパク質のｃＤＮＡコード領域を含む。ＨｕＩＦＮ−α２ｂの発現は、Ｊｏｓｅｐｈ ＳとＤａｖｉｄ ＷＲによるプロトコル（１１６）に従って行われた。
【０１５１】
発現プラスミドｐＢＶ２ｂをＤＨ５−α細胞に形質転換させた。単一コロニーを個別に採取し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ｍｌのＬＢ培地に播種し、３０℃で８時間培養した。その後、培養バクテリアの２ｍｌを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌの培地で、撹拌しながらさらに３０℃で一晩培養した。翌朝、一晩培養したバクテリアを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む大量のＬＢ培地に１：１０〜１：２０の比率で播種し、撹拌しながら３０℃で培養した。培養物が増殖の対数期中期（Ａ５５０＝０．５〜０．６）に達した時、培養温度を急激に４２℃まで上昇させ、ＨｕＩＦＮ−α２ｂの発現を誘導するために４時間保持した。４時間の熱誘導の後、バクテリア細胞を遠心分離し、ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）で３回洗浄した後、増殖段階を行うまで−８０℃で保存した。
【０１５２】
ＨｕＩＦＮ−α２ｂタンパク質はここで説明される大腸菌発現システムに対して不溶性であったため、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇに記載のプロトコル（１１５）に従い、封入体再生及び洗浄の工程を実施した。簡単に述べると、回収したバクテリア細胞を細胞溶解バッファＩ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ）中に再懸濁し、リゾチーム及び超音波処理によって溶解した。封入体を氷冷細胞溶解バッファＩＩ（０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００を添加した細胞溶解バッファＩ）で３回洗浄した。
【０１５３】
再生された封入体を、７Ｎグアニジン中に室温で４時間撹拌しながら懸濁することにより破壊した。次に４℃で１５分間遠心分離し、変性したタンパク質を０．１５Ｍ、ｐＨ９．５のボレックスバッファ中で４８時間、４℃でリフォールディングさせた。リフォールディングの最終段階で、ｐＨをＨＣｌで７．４に調整した。
【０１５４】
その後、リフォールディングされたＨｕＩＦＮ−α２ｂを含む溶液を疎水性イオン交換クロマトグラフィ及びゲル濾過法によって精製した。第１に、前記溶液をフェニルセファロース６ファーストフローカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）に加え、通過させた。第２に、ＨｕｌＩＦＮ−α２ｂを含むフラクションをＰＯＲＯＳ５０Ｄカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）に適用した。第３に、前記ＨｕｌＩＦＮ−α２ｂを含むフラクションをＰＯＲＯＳ５０ＨＳカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）による精製に供した。最後に、回収したＨｕＩＦＮ−α２ｂ分子をさらにハイロード２６／１００スーパーデックス７５ｐｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、米国）により精製した。純ＨｕＩＦＮ−α２ｂタンパク質は、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって単一バンドを示し、質量分析によって確認されたように、その純度は＞９８％であった。
【実施例６】
【０１５５】
実施例６．ノバフェロンの抗ウイルス活性の測定
Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ＪＡによる古典的プロトコル（１１３）に記載されているようなＷＩＳＨ−ＶＳＶシステムを用いて抗ウイルス活性を測定した。１日目、ＷＩＳＨ細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＣＬ２５）を１４，０００細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播種し、３７℃で培養した。２４時間後、２倍ずつ連続希釈したノバフェロン、ＨｕＩＦＮ−α２ｂ、ＷＨＯヒトＩＦＮ国際基準又はブランク培養培地を各ウェルに加え、３７℃でさらに２４時間培養した。３日目、培地を除去し、１，０００ＰＦＵの水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ、ＡＴＣＣ、カタログ番号ＶＲ−１４２１）を含む培地と交換した。細胞を再び３７℃で２４時間培養し、その後０．８５％ＮａＣｌで洗浄して死細胞を除去した。次に、培養プレートをダイ・フィクサー溶液（０．５％クリスタルバイオレット、５％ホルマリン（Ｖ／Ｖ）、５０％エタノール（Ｖ／Ｖ）、及び０．８５％ＮａＣＬ）に１時間浸漬した。その後ダイ・フィクサー溶液を静かに移し、マイクロプレートを水道水で十分に洗浄し、乾燥させた。染色された細胞を０．２ｍｌの２−メトキシエタノールで溶解した。クリスタルバイオレットバイオアッセイのため、モデルオプシスＭＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）においてプレートを５５０ｎｍで読み取った。
【０１５６】
全ての実験はトリプリケートで実施され、ノバフェロン及びＨｕＩＦＮ−α２ｂ試料は同じプレート内で試験された。ここで調製されたノバフェロン及びＨｕＩＦＮ−α２ｂの抗ウイルス活性は同時に検査され、国立生物学的製剤研究所（ＮＩＢＳＣ、米国）から得られるＷＨＯ国際基準９４／７８４（ｒＨｕＩＦＮ−αコンセンサス）及び９５／６５０（ｒＨｕＩＦＮ−α２ａ）を参照し、抗ウイルス単位（国際単位、又はＩＵ）を決定した。
【０１５７】
ＷＩＳＨのＶＳＶに対する精製ノバフェロンタンパク質の測定された抗ウイルス活性は２．５×１０９ＩＵ／ｍｇであり、一方、ＨｕＩＦＮ−α２ｂの抗ウイルス活性は２．０×１０８ＩＵ／ｍｇである。このデータは、ノバフェロンタンパク質の抗ウイルス活性がＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも約１２．５倍強力であることを示している。
【実施例７】
【０１５８】
実施例７．ノバフェロンの抗増殖活性
抗増殖活性アッセイを、基本的にＥｖｉｎｇｅｒとＰｅｓｔｋａ（１０１）によって述べられているように実施した。
【０１５９】
Ａ．ヒト腫瘍細胞株の細胞培養
ヒト腫瘍細胞株を様々な組織、すなわち、ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、米国、２０１０８ バージニア州、マナサス、Ｐ．Ｏ．ボックス１５４９）、ＤＳＭＺ（ドイツ国立生物材料資源センター、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ、ドイツ国、３８１２４ ブラウンシュヴァイク、マシェローダー・ヴェーグ １ｂ）、ＪＣＲＢ（ジャパニーズ・コレクション・オブ・リサーチ・バイオリソーシズ−セルバンク、独立行政法人医薬基盤研究所、日本国、５６７−００８５ 大阪府、茨木市、彩都あさぎ７−６−８）から購入した（下記表１）。
【０１６０】
【表１】
抗増殖活性試験に用いた全ての細胞を、５％ＣＯ２を含む湿潤雰囲気において３７℃で培養した。５〜２０％加熱不活性化した米国Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製のウシ胎仔血清ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２Ｋ、及び１６４０又は１６４０プラスＦ１２（全てＧｉｂｃｏ ＢＲＬ社製、米国）等の基本増殖培地で、各細胞の増殖マニュアルに従い細胞を増殖させた。それぞれの細胞株のための前記基本増殖培地は下記表２に列挙されている。全ての細胞株を倒立顕微鏡下の培養プレート内で毎日検査した。細胞を回収し、トリパンブルー色素排除によって決定される生存能力が９０％を超える対数増殖期における実験に用いた。標準的な血球計数器で細胞数及び生存能力を検査した。
【０１６１】
【表２】
Ｂ．抗増殖アッセイのための工程
対数増殖期の細胞株を、２×１０３〜６×１０４細胞／ｍｌ（細胞株によって異なる。表２を参照）の濃度で、加温（３６℃）した培地に穏やかに懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、３７℃で６〜８時間培養した。続いて培養培地で希釈した同量（１００μｌ）のノバフェロン又はＨｕＩＦＮ−α２ｂをトリプリケートでウェルに添加した。プレートを４〜５秒穏やかに撹拌して内容物を混合し、３７℃で６日間培養した。比較可能性を保障するため、ノバフェロン及びＨｕＩＦＮ−α２ｂ試料を同じプレート内で試験した。
【０１６２】
二つの方法を用いて、細胞ウェル内の細胞数を測定し、細胞数に応じたノバフェロン及びＨｕＩＦＮ−α２ｂの抗増殖活性を算出した。
懸濁細胞の細胞数を測定するため、直接細胞計測法を用いた。培養６日後、懸濁細胞培養物をトリパンブルーで希釈し（最終濃度０．０２％）、血球計測器を用いて細胞数を直接計測した。
【０１６３】
接着細胞の細胞数を計測するため、クリスタルバイオレットバイオアッセイ法を用いた（９３）。培養６日後、ＰＢＳを培養ウェル内でピペッティングすることにより死細胞を除去した。次に、ウェルをダイ・フィクサー溶液で満たし、生細胞を１時間染色した。ダイ・フィクサー溶液は、蒸留水中に０．５％クリスタルバイオレット、５％ホルマリン（Ｖ／Ｖ）、５０％エタノール（Ｖ／Ｖ）、及び０．８５％ＮａＣｌを含む。その後、マイクロプレートを水道水で十分に洗浄し、乾燥させた。染色された細胞を０．２ｍｌの２−メトキシエタノールで溶解した。５５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ５５０）（モデルオプシスプレートリーダ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）を測定し、細胞数の相対指標として用いた。
【０１６４】
下記式によって増殖阻害率を算出した。阻害率％＝（１−（Ｅ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ））×１００（式中、Ｅは６日目のノバフェロン又はＨｕＩＦＮ−α２ｂ処理ウェルにおける細胞数又はＯＤ５５０値、Ｂは細胞培養０日目の細胞数又はＯＤ５５０値、Ｃは６日目の未処理ウェルにおける細胞数又はＯＤ５５０値）。
【０１６５】
阻害率は、組成物の濃度に連動して発現した。ノバフェロン又はＨｕＩＦＮ−α２ｂのＩＣ５０を試料濃度の範囲を用いて推定した。データは斜面曲線Ｙ＝ｍｉｎ＋（Ｍａｘ−ｍｉｎ）／（１＋１０＾（ＩＣ５０−Ｘ））（式中、Ｘは薬剤の対数濃度、Ｙは阻害率、Ｍｉｎ又はＭａｘは阻害率プラトーの最小値又は最大値）のＳ字曲線（１１７）に沿った。特定の標的に対する様々な組成物のＩＣ５０が比較され、ＩＣ５０が低いほど強力な組成物を示している。
【０１６６】
ノバフェロン又はＨｕＩＦＮ−α２ｂの濃度、及び対応するＤａｕｄｉ細胞株に対する細胞増殖阻害率が図４に示されている。このデータに基づき、Ｄａｕｄｉ細胞増殖を阻害するノバフェロン又はＨｕＩＦＮ−α２ｂのＩＣ５０は０．０１７４ｐｍｏｌ及び６．９５５０ｐｍｏｌと算出された。したがって、ノバフェロンのＩＣ５０はＨｕＩＦＮ−α２ｂのそれの約４００分の１であり、ＨｕＩＦＮ−α２ｂと比較してノバフェロンの抗増殖効力の約４００倍の増加を表している。
【０１６７】
黒色腫由来の４つの細胞株（Ａ−３７５、ＩＧＲ−１、ＩＧＲ−３７、ＩＰＣ−２９８）、５つの結腸直腸腺癌細胞株（ＨＣＴ−８、ＳＷ１１１６、ＬＳ１８０、ＤＬＤ−１、ＬＳ１７４Ｔ）、４つの肝臓癌細胞株（Ｈｅｐ Ｇ２、Ｈｅｐ ３Ｂ、ＨｕＨ−７、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５）、３つのリンパ腫細胞株（ＨＬ−６０（Ｓ）、Ｄａｕｄｉ、Ｌ−４２８）、２つの前立腺癌細胞株（ＤＵ１４５、ＰＣ−３）、２つの子宮頸癌細胞株（ＨｅＬａ、Ｃ−３３Ａ）、１つの胃腺癌細胞株（ＭＫＮ１）、１つの肺癌細胞株（Ａ５４９）及び１つの食道癌細胞株（ＫＹＳＥ３０）を含む２３の癌細胞株に対するノバフェロンの抗増殖活性を評価し、ＨｕＩＦＮ−α２ｂのそれと比較した。ノバフェロンは、試験した全ての癌細胞株に対してＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも遥かに強力な抗増殖活性を示した。効力の増強の程度は癌細胞株によって異なり、１６〜１１３４倍に及んだ（下記表３）。
【０１６８】
【表３】
【実施例８】
【０１６９】
実施例８．インビボ腫瘍モデル実験
Ａ．細胞培養及びインビボヒト腫瘍異種移植モデル
結腸癌細胞株（ＬＳ１８０）、黒色腫細胞株（Ａ−３７５）及び肝臓癌細胞株（Ｈｅｐ Ｇ２）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、メリーランド州、ロックビル）から入手した。前立腺癌細胞株（ＰＣ−３）はドイツ国立生物材料資源センター（ＤＳＭＺ、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ａｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ、ドイツ国）から入手した。リンパ腫細胞株（ＨＬ６０（ｓ））はジャパニーズ・コレクション・オブ・リサーチ・バイオリソーシズ−セルバンク（ＪＣＲＢ、日本）から購入した。全細胞を指示に従って培養した（表１参照）。簡単に述べると、ＬＳ１８０及びＨｅｐ Ｇ２をＭＥＭ培地で培養した。Ａ−３７５をＤＭＥＭで培養した。両培地に１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、及び１．０ｍＭピルビン酸ナトリウムを添加した。ＰＣ−３及びＨＬ６０（Ｓ）細胞を、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０で培養した。全細胞を５％ＣＯ２雰囲気中に３７℃で保持した。
【０１７０】
ヒト癌異種移植モデルをＢｅｖｅｒｌｙらによる方法（１１８）を用いて確立した。対数期増殖癌細胞を組織培養プレートから回収、洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．５、２０ｍＭ）中に再懸濁した。６週齢の無胸腺ヌードＢａｌｂ／ｃマウスにおいて、６×１０６細胞／０．３ｍｌ（ＰＣ−３、ＨｅｐＧ２）、４×１０６細胞／０．３ｍｌ（ＬＳ１８０）、２×１０７細胞／０．３ｍｌ（ＨＬ６０（ｓ））又は８×１０６細胞／０．３ｍｌ（Ａ−３７５）を脇腹領域の両側に皮下注射することにより、皮下腫瘍異種移植片を形成させた。
各インビボ腫瘍モデルについて、癌細胞播種から６日目に、癌保有マウス（腫瘍体積は約１００ｍｍ３）を各群で等しい頭数になるよう無作為に７〜８群に分別し、処理を開始した。
【０１７１】
ノバフェロン及びＨｕＩＦＮ−α２ｂをＰＢＳ溶液で処方した。ＰＢＳのみ、様々な用量のノバフェロン、又はＨｕＩＦＮ−α２ｂの毎日の皮下注射を、マウスの群分けの日から総計３０日間（ＰＣ−３、ＨｅｐＧ２、Ａ−３７５）、２８日間（ＬＳ１８０）、又は２１日間（ＨＬ６０（ｓ））継続した。５−ＦＵの処理については、３０ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵを２日に１回、合計５回静脈内投与した。群及び処理用量を以下にまとめる。
群１（対照）：ＰＢＳ、毎日
群２（低用量のノバフェロン）：１．２５μｇ／ｋｇ、毎日
群３（中用量のノバフェロン）：１２．５μｇ／ｋｇ、毎日
群４（高用量のノバフェロン）：１２５μｇ／ｋｇ、毎日
群５（低用量のＨｕＩＦＮ−α２ｂ）：１．２５μｇ／ｋｇ、毎日
群６（中用量のＨｕＩＦＮ−α２ｂ）：１２．５μｇ／ｋｇ、毎日
群７（高用量のＨｕＩＦＮ−α２ｂ）：１２５μｇ／ｋｇ、毎日
群８（５−ＦＵ）：３０ｍｇ／ｋｇ、２日に１回、計５回静脈内投与
処理を開始してから、週に１度キャリパーで腫瘍を測定した。下記式を用いて腫瘍体積を算出した。体積＝０．５×（幅）２×（長さ）。処理中止の日（処理開始から３０日後）にマウスを屠殺した。固形腫瘍を分離し、写真撮影して測定した。
【０１７２】
下記式を用いて増殖阻害率を算出した。阻害率＝［１−Ｔ／Ｃ］×１００％（式中、Ｔはノバフェロン、ＨｕＩＦＮ−α２ｂ、又は５−ＦＵ処理群の平均腫瘍重量、Ｃは対照群の処理後の平均腫瘍重量）。
【０１７３】
Ｂ．ヒト前立腺癌異種移植モデル
前立腺癌ＰＣ−３異種移植片を、１．２５、１２．５又は１２５μｇ／ｋｇのノバフェロンの３０日間の皮下注射で処理した。ノバフェロンはＰＣ−３腫瘍増殖の強力な用量依存的阻害を示した（Ｐ＜０．０５）。図５及び下記表４に示されるように、ノバフェロン処理群におけるＰＣ−３腫瘍増殖は、ＰＢＳ処理対照群と比較してかなり抑制された。例えば、ノバフェロン処理群（１２５μｇ／ｋｇ）におけるＰＣ−３異種移植腫瘍塊の平均重量は０．０９１±０．０８１ｇであり、対照動物の１．９４８±０．５６７ｇと比較して極めて有意に減少した（Ｐ＜０．００１）（表４）。言い換えると、１２５μｇ／ｋｇの３０日間の処理は、ＰＣ−３腫瘍増殖の９５．３％の阻害を達成した（表４）。
【０１７４】
【表４】
Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスに６×１０６生ＰＣ−３細胞を皮下注射で導入した後、マウスをノバフェロン（１．２５μｇ／ｋｇ、１２．５μｇ／ｋｇ又は１２５μｇ／ｋｇ）の毎日の皮下注射により３０日間処理した。結果を平均腫瘍体積（ｍｍ３）で表した。図５は、ＰＢＳ対照群と比較して、３種類のノバフェロン用量の全てがＰＣ−３腫瘍増殖の用量依存的阻害を呈することを示した（Ｐ＜０．０５）。１２５μｇ／ｋｇのノバフェロンは、同用量のＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも遥かに強力な、又はほぼ完全なＰＣ−３腫瘍増殖阻害を引き起こした（９５．３％対７５．６％、Ｐ＜０．０１）（表４）。
【０１７５】
高用量（１２５μｇ／ｋｇ）処理群において、ノバフェロン又はＨｕＩＦＮ−α２ｂのより長期間の処理が、腫瘍増殖阻害により大きな差異をもたらしたことは興味深い。２８日目のノバフェロン処理群におけるＰＣ−３腫瘍塊の平均体積が１０７．９±６８．７ｍｍ３であったのに対し、ＨｕＩＦＮ−α２ｂ処理群では６２０．７±２９６．６ｍｍ３、３０日目では１２２．１±１００．７ｍｍ３に対し６９１．９±４２８．３ｍｍ３（Ｐ＜０．００１）であった。このことは、平均腫瘍重量が観察の終了後に検討された場合にも該当した（ノバフェロン高用量群０．０９１±０．０８１ｇに対し、ＨｕＩＦＮ−α２ｂ高用量群０．４７６±０．２７１グラム、Ｐ＜０．００１）。このことは、この異種移植モデルにおけるノバフェロンのこの用量でのより長期間の処理が、ＰＣ−３腫瘍増殖のさらに良好な、又は完全な阻害を呈し得ることを示唆している。
【０１７６】
Ｃ．ヒト肝臓癌異種移植モデル
ノバフェロンのインビボ抗腫瘍活性を、さらに肝臓癌Ｈｅｐ Ｇ２異種移植モデルについて評価した。ノバフェロンは対照群と比較してＨｅｐ Ｇ２腫瘍増殖の有効な用量依存的阻害を示した（Ｐ＜０．００１）。ＰＢＳ対照群の２１２５．８±７４３．１ｍｍ３と比較して、ノバフェロン処理群（毎日１．２５、１２．５又は１２５μｇ／ｋｇで３０日間の皮下注射）における平均腫瘍体積は、それぞれ７８３．２±２７０．０、４５９．３±４１４．３、及び１０４．６±５６．５ｍｍ３であった。３０日間の１２５μｇ／ｋｇのノバフェロン処理はＨｅｐ Ｇ２の最も高い阻害を達成し（９６．６％）、ＨｕＩＦＮ−α２ｂの１２５μｇ／ｋｇよりも有意に高かった（８９．２％、Ｐ＜０．０１）。この用量でのより長期間のノバフェロンの処理は、さらに良好な又は完全な阻害の傾向を示した。観察期間の終了時の平均腫瘍重量は、１２５μｇ／ｋｇのノバフェロン処理群では０．０７４±０．０８３ｇであり、１２５μｇ／ｋｇのＨｕＩＦＮ−α２ｂ処理群よりも有意に小さかった（０．２３５±０．１９９グラム、Ｐ＜０．００１）（下記表５）。
【０１７７】
Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスに６×１０６生Ｈｅｐ Ｇ２細胞を皮下注射で導入した後、マウスをノバフェロン（１．２５μｇ／ｋｇ、１２．５μｇ／ｋｇ及び１２５μｇ／ｋｇ）の毎日の皮下注射により３０日間処理した。結果を平均腫瘍体積（ｍｍ３）で表した。図６は、ＰＢＳ対照群と比較して、３種類のノバフェロン用量の全てでＨｅｐ Ｇ２腫瘍増殖の用量依存的阻害を呈することを示した（Ｐ＜０．００１）。１２５μｇ／ｋｇのノバフェロンは、同用量のＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも遥かに強力な、又はほぼ完全なＨｅｐ Ｇ２腫瘍増殖阻害を引き起こした（９６．６％対８９．２％、Ｐ＜０．０５）（表５）。
【０１７８】
【表５】
Ｄ．ヒト黒色腫異種移植モデル
ノバフェロンのインビボ抗腫瘍活性を、さらに悪性黒色腫Ａ−３７５異種移植モデルにおいて評価した。Ａ−３７５細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６１９）はヒト悪性固形腫瘍から得られた。ノバフェロンは対照群と比較してＡ−３７５腫瘍増殖の有効な用量依存的阻害を示した（Ｐ＜０．００１）。ＰＢＳ対照群と比較すると、ノバフェロン処理群（毎日１．２５、１２．５又は１２５μｇ／ｋｇで２８日間の皮下注射）における阻害率は、それぞれ４０．１％、７５．０％、及び８２．８％であった（Ｐ＜０．００１）（下記表６）。３０日間の１２５μｇ／ｋｇのノバフェロン処理はＡ−３７５の最も高い阻害を達成し（８２．８％）、１２５μｇ／ｋｇのＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも有意に高かった（６９．９％、Ｐ＜０．００１）。
【０１７９】
興味深いことに、ノバフェロンは化学療法剤５−ＦＵよりも、より効果的な黒色腫細胞Ａ−３７５の増殖の阻害を示した（表６）。例えば、３０日目、１２．５μｇ／ｋｇ又は１２５μｇ／ｋｇのノバフェロンで処理された群の平均腫瘍重量は０．７６３±０．１８７（Ｐ＜０．０１）及び０．５２７±０．１４９（Ｐ＜０．００１）グラムであったのに対し、３０ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵで処理された群の平均腫瘍重量は１．００４±０．１０５グラムであった（表６）。これは、ヒト黒色腫Ａ−３７５の治療に対して、ノバフェロンが５−ＦＵよりも効果的であり得ることを示している。
【０１８０】
Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスに８×１０６のＡ−３７５細胞を皮下注射で導入した後、マウスをノバフェロン（１．２５μｇ／ｋｇ、１２．５μｇ／ｋｇ及び１２５μｇ／ｋｇ）の毎日の皮下注射により２８日間処理した。結果を平均腫瘍体積（ｍｍ３）で表した。図７は、ＰＢＳ対照群と比較して、３種類のノバフェロン用量の全てでＡ−３７５腫瘍増殖の用量依存的阻害を呈することを示した（Ｐ＜０．００１）。１２５μｇ／ｋｇのノバフェロンは、同用量のＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも強力なＡ−３７５腫瘍増殖阻害を引き起こした（８２．８％対６９．９％、Ｐ＜０．００１）（図７）。１２．５μｇ／ｋｇ及び１２５μｇ／ｋｇのノバフェロンは、両方とも、５−ＦＵ（６７．２％）よりも高い腫瘍増殖の抑制を示した（それぞれ７５．０％及び８２．８％、Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．００１）（図７）。
【０１８１】
【表６】
Ｅ．ヒト結腸癌異種移植モデル
ノバフェロンのインビボ抗腫瘍活性を、結腸癌ＬＳ１８０異種移植モデルにおいて評価した。ＬＳ１８０細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＬ−１８７）はヒト結腸癌から得られた。ノバフェロンは対照群と比較して結腸癌ＬＳ１８０腫瘍増殖の有効な用量依存的阻害を示した（Ｐ＜０．００１）。ＰＢＳ対照群と比較すると、ノバフェロン処理群（毎日１．２５、１２．５又は１２５μｇ／ｋｇで２８日間の皮下注射）における阻害率は、それぞれ７５．０％、８０．５％、及び９２．５％であった（Ｐ＜０．００１、下記表７）。２８日間の１２５μｇ／ｋｇのノバフェロン処理はＬＳ１８０腫瘍増殖の最も高い阻害を達成し（９２．５％）、１２５μｇ／ｋｇのＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも有意に高かった（８２．３％、Ｐ＜０．００１）。
【０１８２】
２８日間の処理に続き、平均腫瘍重量について、１２．５μｇ／ｋｇのノバフェロンがＬＳ１８０癌異種移植片の増殖を５０−ＦＵ（３０ｍｇ／ｋｇ）と同様に阻害した（０．８１５±０．２２１グラム対０．７５８±０．２２７グラム）。１２５μｇ／ｋｇのノバフェロンは、３０ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵよりもＬＳ１８０の腫瘍増殖を有意に阻害した（９２．５％対８１．８％、Ｐ＜０．００１）（表７及び図８）。結腸癌の患者に対する標準的な化学療法における５−ＦＵの日常的な臨床応用を考慮するに際し、これらの観察結果は極めて興味深い。動物モデルにおけるノバフェロンによるＬＳ１８０腫瘍増殖のより良好な抑制は、ノバフェロンが臨床において非常に効果的な抗結腸癌剤として作用する可能性を有することを示している。
【０１８３】
Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスに４×１０６１ＬＳ１８０細胞を皮下注射で導入した後、マウスをノバフェロン（１．２５μｇ／ｋｇ、１２．５μｇ／ｋｇ及び１２５μｇ／ｋｇ）の毎日の皮下注射により２８日間処理した。結果を平均腫瘍体積（ｍｍ３）で表した。図８は、ＰＢＳ対照群と比較して、３種類のノバフェロン用量の全てでＬＳ１８０腫瘍増殖の用量依存的阻害を呈することを示した（Ｐ＜０．００１）。１２５μｇ／ｋｇのノバフェロンは、同用量のＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも強力なＬＳ１８０腫瘍増殖阻害を引き起こした（９２．５％対８２．３％、Ｐ＜０．００１）（表７）。１．２５μｇ／ｋｇ及び１２．５μｇ／ｋｇのノバフェロンは両方とも、５−ＦＵ（８１．８％）と同様の腫瘍増殖の抑制を達成した（それぞれ７５．０％及び８０．５％）（表７、図８）。しかし、１２５μｇ／ｋｇのノバフェロンは、５−ＦＵよりも遥かに高いＬＳ１８０腫瘍増殖の阻害を呈した（９２．５％対８１．８％、Ｐ＜０．００１）。
【０１８４】
【表７】
Ｆ．ヒト白血病異種移植モデル
ノバフェロンのインビボ抗腫瘍活性を、さらにＨＬ６０（ｓ）リンパ性白血病異種移植モデルにおいて評価した。ノバフェロンは対照群と比較してＨＬ６０（ｓ）腫瘍増殖の有効な用量依存的阻害を呈した（Ｐ＜０．００１）。ＰＢＳ対照群と比較すると、ノバフェロン処理群（毎日１．２５、１２．５又は１２５μｇ／ｋｇで２８日間の皮下注射）における阻害率は、それぞれ４３．８％、５５．２％、及び８０．４％であった（Ｐ＜０．００１、下記表８）。２１日間の１２５μｇ／ｋｇのノバフェロン処理はＨＬ６０（ｓ）腫瘍増殖の最も高い阻害を達成し（８０．４％）、１２５μｇ／ｋｇのＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも有意に高かった（６９．８％、Ｐ＜０．０５）。
【０１８５】
Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスに２×１０７生ＨＬ６０（ｓ）細胞を皮下注射で導入した後、マウスをノバフェロン（１．２５μｇ／ｋｇ、１２．５μｇ／ｋｇ及び１２５μｇ／ｋｇ）の毎日の皮下注射により２１日間処理した。結果を平均腫瘍体積（ｍｍ３）で表した。図９は、ＰＢＳ対照群と比較して、３種類のノバフェロン用量の全てでＬＳ１８０腫瘍増殖の用量依存的阻害を呈することを示した（Ｐ＜０．００１）。１２５μｇ／ｋｇのノバフェロンは、同用量のＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも強力なＬＳ１８０腫瘍増殖阻害を引き起こし（８０．４％対６９．８％、Ｐ＜０．０５）、５−ＦＵと比較して同様の抑制を示した（図９、表８）。
【０１８６】
【表８】
Ｇ．ノバフェロン処理中のマウスの一般条件
ヒト癌の様々な異種移植片を伴うマウスを、ノバフェロン、ＨｕＩＦＮ−α２ｂ又は５−ＦＵ処理の期間中注意深く観察した。５−ＦＵ処理群とは異なり、全てのノバフェロン又はＨｕＩＦＮ−α２ｂ処理群のマウスは正常に摂食及び行動し、体重の減少はなかった。５−ＦＵ処理マウスは摂食及び行動の特徴的変化及び体重の減少を示した。これらの観察結果が示すことは、ノバフェロンが異種移植動物モデルにおいて５−ＦＵと同様の、又はさらに良好な抗癌性を示すと同時に、癌細胞の阻害に対してより特異的であり、かつ正常細胞及び／又は生理的機能に対する影響が遥かに小さい可能性があるということである。これらはヒトへの応用においてより優れた耐性及び治療効果につながるかもしれない。
【０１８７】
上記の開示に照らし、当業者には明らかであろうが、本発明の実施において、その趣旨又は範囲を逸脱することなく、多くの変更及び変形が可能である。したがって、本発明の範囲は添付の請求項に定義される内容に従って解釈される。
（参考文献）
1. Interferon nomenclature. Nature. 1980 ; 286 (5769): 110
2. Isaacs A and Lindenmann J. Production of virial interfering substance. US Pat No: 369922. October 17. 1972
3. Jonasch E and Haluska FG. Interferon in oncological practice: review of interferon biology, clinical applications, and toxicities. Oncologist. 2001 ; 6(l):34-55
4. Lengyel P. Biochemistry of interferons and their actions. Annu Rev Biochem. 1982; 51 :251-282
5. Gresser I and Tovey MG. Antitumor effects of interferon. Biochim Biophys Acta. 1978; 516(2):231-247
6. Samuel CE. Antiviral actions of interferons. Clin Microbiol Rev. 2001 ;14(4):778-809
7. Theofilopoulos AN, et al. Type I interferons (alpha/beta) in immunity and autoimmunity. Annu Rev Immunol. 2005; 23:307-336
8. Uze G, et al. Alpha and beta interferons and their receptor and their friends and relations. J Interferon Cytokine Res. 1995; 15(1): 3-26
9. Knight E Jr. Interferon: purification and initial characterization from human diploid cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1976; 73(2):520-523
10. Pestka S, et al. Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors. Immunol Rev. 2004; 202:8-32
11. Horisberger MA and Di Marco S. Interferon-alpha hybrids. Pharmacol Ther. 1995; 66(3):507-534
12. Horton HM, et al. Antitumor effects of interferon-omega: in vivo therapy of human tumor xenografts in nude mice. Cancer Res. 1999; 59(16):4064-4068
13. Hardy MP, et al. Characterization of the type I interferon locus and identification of novel genes. Genomics.2004; 84(2):331-345.
14. Chen J. et al. Human interferon- [epsilon]: a t> pe I interferon. US Pat No: 6569420. May 27. 2003
15. Pestka S, et al. Interleukin-10 and releated cytokines and receptors. Annu Rev Immunol 2004, 22:929-979
16. Nardelli B, et al. Regulatory effect of IFN-kappa, a novel type I IFN, on cytokine production by cells of the innate immune system. J. Immunol. 2002; 169(9):4822-4830
17. LaFleur DW, et al. Interferon-kappa, a novel type I interferon expressed in human keratinocytes. J Biol Chem. 2001 ; 276(43): 39765-39771
18. Subramaniam PS, Johnson HM. The IFNARl subunit of the type I IFN receptor complex contains a functional nuclear localization sequence. FEBS Lett. 2004;578(3):207-210
19. Goodbourn S, et al. Interferons: cell signalling, immune modulation, antiviral response and virus countermeasures. J Gen Virol. 2000; 81(Pt 10):2341-2364
20. Wang K, et al. Inhibition of neutrophil apoptosis by type 1 IFN depends on cross-talk between phosphoinositol 3-kinase, protein kinase C-delta, and NF-kappa B signaling pathways. J Immunol. 2003; 171 (2): 1035-1041
21. Katze MG Interferon, PKR, virology, and genomics: what is past and what is next in the new millennium? J Interferon Cytokine Res. 2002; 22(3):283-286
22. Chawla-Sarkar M, et al. Apoptosis and interferons: role of interferon-stimulated genes as mediators of apoptosis. Apoptosis. 2003; 8(3):237-249
23. Kirkwood J. Cancer immunotherapy: the interferon-alpha experience. Semin Oncol. 2002; 29(3 Suppl 7): 18-26
24. Hofmann V, et al. Hairy cell leukemia: an interferon deficient disease? Cancer Treat Rev. 1985; Suppl B: 33-37
25. Stone RM , et al. Recombinant human gamma interferon administered by continuous intravenous infusion in acute myelogenous leukemia and myelodysplastic syndromes. Am J Clin Oncol. 1993; 16(2):159-163
26. Talpaz M, et al. Human leukocyte interferon to control thrombocytosis in chronic myelogenous leukemia. Ann Intern Med. 1983; 99(6):789-792
27. Talpaz M, et al. Changes in granulocyte-monocyte colony-forming cells among leukocyte-interferon-treated chronic myelogenous leukemia patients. Exp Hematol. 1986; 14(7):668-671
28. Strander H, et al. Long-term adjuvant interferon treatment of human osteosarcoma. A pilot study. Acta Oncol. 1995; 34(6):877-880
29. Dogan B, et al. Intralesional alfa-2a interferon therapy for basal cell carcinoma. Cancer Lett. 1995; 91(2):215-219
30. Fetell MR, et al. Intratumor administration of beta-interferon in recurrent malignant gliomas. A phase I clinical and laboratory study. Cancer. 1990; 65(l):78-83
31. Muss HB. The use of interferon in renal cell carcinoma. Eur J Cancer. 1991 ; 27 (Suppl 4):S84-87
32. Peest D, et al. Cytokine therapy in multiple myeloma. Br. J Haematol. 1996; 94(3):425-432
33. Ikic D, et al. Local interferon therapy for melanoma patients. Int. J Dermatol. 1995;34(12):872-874
34. Rybak ME, et al. Interferon therapy of relapsed and refractory Hodgkin's disease: Cancer and Leukemia Group B Study 8652. J Biol. Response Mod. 1990; 9(1): 1-4
35. Kaufmann R, et al. Temozolomide in combination with interferon-alpha versus temozolomide alone in patients with advanced metastatic melanoma: a randomized, phase III, multicenter study from the Dermatologic Cooperative Oncology Group. J Clin Oncol. 2005; 23(35):9001 -9007
36. Lane HC. The role of alpha-interferon in patients with human immunodeficiency virus infection. Semin Oncol. 1991 ; 18(Suppl 7):46-52
37. Woo MH and Brunakis TG. Interferon alfa in the treatment of chronic viral hepatitis B and C. Ann. Pharmacother. 1997; 31(3):330-337
38. Gibas AL. Use of interferon in the treatment of chronic viral hepatitis. Gastroenterologist. 1993; 1(2): 129- 142
39. Levine LA, et al. Treatment of subclinical intraurethral human papilloma virus infection with interferon alfa-2b. Urology. 1996; 47(4):553-557
40. Ho M. Interferon for the treatment of infections. Annu Rev Med. 1987; 38:51 -59
41. Wintergerst U and Belohradsky BH. Acyclovir monotherapy versus acyclovir plus beta-interferon in focal viral encephalitis in children. Infection. 1992; 20(4):207-212
42. Bogdan C, et al. The role of type I interferons in non-viral infections. Immunol Rev. 2004; 202:33-48
43. Condos R, et al. Treatment of multidrug-resistant pulmonary tuberculosis with interferon-gamma via aerosol. Lancet. 1997; 349(9064): 1513-1515
44. Giosue S, et al. Aerosolized interferon-alpha treatment in patients with multi-drug-resistant pulmonary tuberculosis. Eur Cytokine Netw. 2000; 1 l(l):99-104
45. Raad I, et al. Use of adjunctive treatment with interferon-gamma in an immunocompromised patient who had refractory multidrug-resistant tuberculosis of the brain. Clin Infect Dis. 1996; 22:572-574
46. Fernandez O. et al. Treatment of relapsing-remitting multiple sclerosis with natural interferon beta: a multicenter, randomized clinical trial. Mult. Scler. 1995; Suppl l :S67-69;
47. Freedman MS, et al. Randomized study of once-weekly interferon beta-la therapy in relapsing multiple sclerosis: three-year data from the OWIMS study. Mult Scler.2005; l l(l):41-45
48. Shiozawa S, et al. Single-blinded controlled trial of low-dose oral IFN-alpha for the treatment of xerostomia in patients with Sjogren's syndrome. J Interferon Cytokine Res. 1998; 18(4):255-262
49. Wandinger KP, et al. Diminished production of type-I interferons and interleukin-2 in patients with multiple sclerosis. J Neurol Sci. 1997; 149(l):87-93
50. Steegmann JL, et al. Interferon alpha for chronic myeloid leukemia relapsing after allogeneic bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 1999; 23(5):483-488
51. Kirkwood JM, et al. High dose Interferon alfa 2b significantly prolongs relapse free survival compared with GM2-KLH/QS-21 vaccine in patients with resected stage IIB-III melanoma: Results of Intergroup Trial E1694/S9512/C509081. J Clin Oncol 2001 ; 19:2370-2380
52. Bonnem EM. alpha Interferon: the potential drug of adjuvant therapy: past achievements and future challenges. Eur J Cancer. 1991 ; 27 Suppl 4:S2-6
53. Folkman J. Successful treatment of an angiogenic disease. N Engl J Med. 1989; 320: 1211-1212
54. Clifford JL, et al. Retinoids and interferons as antiangiogenic cancer drugs. In: Teicher BA, ed. Antiangiogenic Agents in Cancer Therapy. Totowa, NJ: Humana Press Inc; 1999; 355-370
55. Kaban LB, et al. Antiangiogenic therapy of a recurrent giant cell tumor of the mandible with interferon alfa-2a. Pediatrics. 1999; 103:1145-1149
56. Sleijfer S, et al. Side effects of interferon-alpha therapy. Pharm World Sci. 2005; 27(6):423-431
57. Bell L. et al. Structure and properties of modified Interferons. US Pat No: 4914033. April 3. 1990
58. Me\ er F. et al. Hybrid Interferons. US Pat No: 5071761. December 10. 1991
59. Streuli M, et al. Target cell specificity of two species derived from them. Proc Natl Acad Sci USA. 1981 ; 78(5): 2848-2852
60. Zoon K. et al. interferon alpha hybrids. US Pat No: 6685933. February 3. 2004
61 . Gangenii JD. Antiviral combination, and method of treatment. US Pat No: 5137720 August 1 1. 1992
62. Johnson HM. et al. Hybrid interferon tau/t>pe I interferon polypeptides US Pat No: 6174996. Januan' 16. 2001
63. Raj, NB, et al. Synthesis, antiviral activity, and conformational characterization of mouse-human a-interferon hybrids. J Biol (Them. 1988; 263(18):8943-8952
64. Mark DF, et al. Site-specific mutagenesis of the human fibroblast interferon gene. Proc Natl Acad Sci USA 1984; 81 (18): 5662-5666
65. Bentzien J. et al. Recombinant interferon-beta mutants. US Pat No: 6514729. February 4. 2003
66. Stemmer WPC. Methods for in vitro recombination. US Pat No: 5605793. February 25. 1997
67. Chang CC, et al. Evolution of a cytokine using DNA family shuffling. Nat Biotechnol. 1999; 17(8):793-797
68. Blatt LM, et al. The biologic activity and molecular characterization of a novel synthetic interferon-alpha species, consensus interferon. J interferon cytokine Res. 1996; 16:489-499
69. Tatusova TA and Madden TL. BLAST 2 Sequences, a new tool for comparing protein and nucleotide sequences. FEMS Microbiol Lett. 1999; 174(2): 247-250
70. Bowie JU, et al. Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino acid Substitutions. Science 1990; 247(4948): 1306-1310
71. Creighton TE. Posttranslational covalent modification of polypeptide chains. In Proteins: Structure and Molecular Properties. Ed by Creighton TE. W. H. Freeman & Co. 1993; pp. 78-99. San Francisco, US
72. Aplin JD and Wriston JC Jr. Preparation, properties, and applications of carbohydrate conjugates of proteins and lipids. CRC Crit Rev Biochem. 1981 ; 10(4):259-306
73. Edge AS, et al. Deglycosylation of glycoproteins by trifluoromethanesulfonic acid. Anal Biochem. 1981 ; 118(1 ): 131 -137
74. Thotakura NP and Bohl OP. Enzymatic deglycosylation of glycoproteins. Meth Enzymol.1987; 138:350-359
75. Peck GE, et al. Pharmaceutical manufacturing. In Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 21<st> ed. Edited by University of the Sciences in Philadelphia (USIP),Lippincott Williams and Wilkins. 2006, page: 691-1094. PA, US
76. Shimizu K. et al. Plasminogen activator derivatives US Pat No: 4640835. February 3. 1987
77. Mitra G. Covalenth attached complex of alpha- 1 -proteinase inhibitor w ith a water soluble polv mer. US Pat No: 4496689. Januan 29. 1985
78. Nakagawa Y. et al. ChemicalK modified protein with polyeth\ leneglycol US Pat No: 4791 192. December 13. 1988
79. DavisF. et al. Non-immunogenic polypeptides US Pat No: 4179337. December 18. 1979
80. Field J, et al. Purification of a RAS-responsive adenylyl cyclase complex from Saccharomyces cerevisiae by use of an epitope addition method. MoI Cell Biol. 1988;8(5):215921-2165
81. Evan Gl, et al. Isolation of monoclonal antibodies specific for human c-myc proto-oncogene product. MoI Cell Biol. 1985; 5(12):3610-3616
82. Paborsky LR, et al. Mammalian cell transient expression of tissue factor for the production of antigen. Protein Eng. 1990; 3(6):547-553
83. Einhauer A and Jungbauer A. The FLAG peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins. J Biochem Biophys Methods. 2001 ; 49(l-3):455-465
84. Skinner H, et al. Use of the Glu-Glu-Phe C-terminal epitope for rapid purification of the catalytic domain of normal and mutant ras GTPase-activating proteins. J Biol Chem.1991 ; 266(22):14163-14166
85. Lutz-Freyermuth C, et al. Quantitative determination that one of two potential RNA-binding domains of the A protein component of the Ul small nuclear ribonucleoprotein complex binds with high affinity to stem-loop II of Ul RNA. Proc Natl Acad Sci USA. 1990; 87(16):6393-6397
86. Zhang ZQ. et al. Construction and application of a high level expression vector containing PRPL promoter. Chinese J of Virol. 1990: 2: 18-23
87. Kingston RE, et al. Introduction of DNA into mammalian cells. In Current Protocols In Molecular Biology edited by Ausubel FM, et al. 2003; page: 9.0.1 -9.15.20,Jhn Wiley & Sons, Inc. US
88. McNeill TA. Interferon assay. J Immunol Methods. 1981 ; 46(2):121-127
89. Rubinstein S, et al. Convenient assay for interferon. 1. Viral. 1981 ; 37: 755-758
90. Horisberger MA and de Staritzky K. A recombinant human interferon-[alpha] B/D hybrid with a broad hostrange. J Gen Virol. 1987; 68:945-948
91. Stitz L and Schellekens H. Influence of input multiplicity of infection on the antiviral activity of interferon. J Gen Virol. 1980; 46:205-210
92. Yeo EY, et al. Effect of short-term ethanol on the proliferative response of Swiss 3T3 cells to mitogenic growth factors, Exp MoI Med. 2000: 32: 161-169 93. Vignesh RC, et al. Effect of ethanol on human osteosarcoma cell proliferation, differentiation and mineralization. Toxicology. 2006; 220(1 ):63-70
94. Cavanaugh PF Jr, et al. A semi-automated neutral red based chemosensitivity assay for drug screening. Investigational New Drugs. 1990; 8(4):347-354
95. Raines EW and Ross R. Purification of human platelet-derived growth factor. Methods Enzymol. 1985; 109:749-773
96. Wahl AF, et al. Gene expression of human DNA polymerase alpha during cell proliferation and the cell cycle. MoI Cell Biol. 1988; 8(l l):5016-5025
97. Cook JA and Mitchel JB. Viability measurements in mammalian cell systems. Anal Biochem. 1989; 179(l):l-7
98. Porstmann T, et al. Quantitation of 5-bromo-2-deoxyuridine incorporation into DNA: an enzyme immunoassay for the assessment of the lymphoid cell proliferative response. J Immunol Methods. 1985; 82(1):169-179
99. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 1983; 65(l-2):55-63
100. Scudiero DA, et al. Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Cancer Res. 1988; 48(17):4827-4833
101. Evinger M And Pestka S. Assay of growth inhibition in lymphoblastoid cell cultures. Methods Enzymol. 1981; 79(Pt B):362-368
102. Meister A, et al. Biological activities and receptor binding of two human recombinant interferons and their hybrids. J Gen Virol. 1986; 67(Pt 8): 1633-43 )
103. Frincke J. et al. Interferon antibod} compositions having an extended serum half-life. US Pat No: 5055289.October 8. 1991
104. Chang T and Yu L. Hybrid w ith interferon-beta. and an immunoglobulin Fc joined by a peptide linker. US Pat No: 5908626. June 1. 1999
105. Nieforth KA, et al. Use of an indirect pharmacodynamic stimulation model of MX protein induction to compare in vivo activity of interferon alfa-2a and a polyethylene glycol-modified derivative in healthy subjects. Clin Pharmacol Ther. 1996; 59(6):636-646
106. Ekwuribe NN. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, deliver} and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same. US Pat No: 568181 1. October 28. 1997
107. Gilbert CW and Cho M-O. Interferon polymer conjugates. US Pat No: 571 1944. January 27. 1998
108. Greenwald R and Gilbert CW. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same. US Pat No: 5738846. April 14. 1998
109. Letsinger RL, et al. Cholesteryl-conjugated oligonucleotides: synthesis, properties, and activity as inhibitors of replication of human immunodeficiency virus in cell culture. Proc Natl Acad Sci USA. 1989; 86(17): 6553-6556
110. Brower V. Naked DNA vaccines come of age. Nat Biotechnol. 1998; 16(13):1304-1305
111. Coen DM. The polymerase chain reaction. In Current Protocols in Molecular Biology. Edited by Ausubel FM. 2001, page: 15.01 -15.7.8. Jhn Wiley & Sons, Inc. US
112. Stemmer WP. DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution. Proc Natl Acad Sci USA. 1994; 91(22): 10747-10751
113. Armstrong JA. Cytopathic effect inhibition assay for interferon: microculture plate assay. Methods Enzymol. 1981 ; 78(pt A): 381 -387
114. Sambrook J and Russell DW. in Molecular Cloning. 2001 ; page: 15.25-15.35, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, US
115. Sambrook J and Russell DW. in Molecular Cloning. 2001 ; page: 15.51-15.52, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, US
116. Sambrook J and Russell DW. in Molecular Cloning. 2001 ; page: 15.25-15.29 and 15-49-15-53, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, US
117. Chou TC, et al. Reversal of anticancer multidrug resistance by the ardeemins. Proc Natl Acad Sci USA. 1998; 95(14): 8369-8374
118. Corbell T, et al. in vivo methods for screening and preclinical testing: use of rodent solid tumors for drug discovery, in Anticancer Drug Development Guide: preclinical screening, clinical trails, and approval. Edited by Teicher BA and Andrews PA. 2004; page: 79-124. Humana Press, New Jersey, US
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインターフェロン様生物学的活性を有するタンパク質をエンコードする分離されたポリヌクレオチドにおいて、それぞれ配列番号１と少なくとも９３％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記配列は配列番号１と少なくとも９５％同一である請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記配列は配列番号１と少なくとも９８％同一である請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記タンパク質は非自然発生するものである請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記タンパク質は、ヒトインターフェロンアルファ２ｂ（ＨｕＩＦＮ−α２ｂ）と比較して高められた抗ウイルス及び抗増殖活性を有する請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記タンパク質は、ＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも少なくとも２倍高い抗ウイルス活性を有する請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記タンパク質は、ＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも少なくとも１０倍高い抗増殖活性を有する請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の組換えベクターを含有する宿主細胞。
【請求項１０】
ヒトインターフェロン様生物学的活性を示す非自然発生タンパク質において、それぞれ配列番号２と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質からなる群より選択されるタンパク質。
【請求項１１】
前記配列は配列番号２と少なくとも９０％同一である請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記配列は配列番号２と少なくとも９５％同一である請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項１３】
前記タンパク質は、ヒトインターフェロンアルファ２ｂ（ＨｕＩＦＮ−α２ｂ）と比較して高められた抗ウイルス及び抗増殖活性を有する請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１４】
前記タンパク質は、ＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも少なくとも２倍高い抗ウイルス活性を有する請求項１３に記載のタンパク質。
【請求項１５】
前記タンパク質は、ＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも少なくとも５倍高い抗ウイルス活性を有する請求項１４に記載のタンパク質。
【請求項１６】
前記タンパク質は、ＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも少なくとも１０倍高い抗ウイルス活性を有する請求項１５に記載のタンパク質。
【請求項１７】
前記タンパク質は、ＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも少なくとも１０倍高い抗増殖活性を有する請求項１３に記載のタンパク質。
【請求項１８】
前記タンパク質は、ＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも少なくとも５０倍高い抗増殖活性を有する請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項１９】
前記タンパク質は、ＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも少なくとも１００倍高い抗増殖活性を有する請求項１８に記載のタンパク質。
【請求項２０】
前記タンパク質は、ＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも少なくとも２００倍高い抗増殖活性を有する請求項１９に記載のタンパク質。
【請求項２１】
前記タンパク質は組換え体である請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項２２】
前記タンパク質は約１９３１５ダルトンの分子量である請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項２３】
任意でＮ末端にメチオニン残基を有する請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項２４】
配列番号２と０〜２５アミノ酸が異なる配列を有し、ヒトインターフェロン様生物学的活性を示す非自然発生タンパク質。
【請求項２５】
前記タンパク質は、ヒトインターフェロンアルファ２ｂ（ＨｕＩＦＮ−α２ｂ）と比較して高められた抗ウイルス及び抗増殖活性を有する請求項２４に記載のタンパク質。
【請求項２６】
前記タンパク質は、ＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも少なくとも２倍高い抗ウイルス活性を有する請求項２５に記載のタンパク質。
【請求項２７】
前記タンパク質は、ＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも少なくとも１０倍高い抗増殖活性を有する請求項２５に記載のタンパク質。
【請求項２８】
前記タンパク質はインターフェロン類似体である請求項２４に記載のタンパク質。
【請求項２９】
前記タンパク質は組換え体である請求項２４に記載のタンパク質。
【請求項３０】
請求項１０に記載のタンパク質の断片を含み、前記断片はヒトインターフェロン様生物学的活性を示すポリペプチド。
【請求項３１】
別の部分に結合された請求項１０に記載のタンパク質を含み、前記ヒトインターフェロン様生物学的活性を示すタンパク質構築物。
【請求項３２】
前記タンパク質はグリコシル化される請求項３１に記載のタンパク質構築物。
【請求項３３】
前記部分はポリペプチドである請求項３１に記載のタンパク質構築物。
【請求項３４】
前記部分は非ポリペプチドである請求項３１に記載のタンパク質構築物。
【請求項３５】
前記部分はポリマー分子である請求項３４に記載のタンパク質構築物。
【請求項３６】
前記ポリマー分子は、直鎖状又は分岐状のポリエチレングリコールである請求項３５に記載のタンパク質構築物。
【請求項３７】
前記部分はラベル分子である請求項３１に記載のタンパク質構築物。
【請求項３８】
請求項１０に記載のタンパク質及び製剤学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤からなる組成物。
【請求項３９】
請求項１０に記載のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチド。
【請求項４０】
抗ウイルス剤としての請求項１０に記載のタンパク質の使用方法。
【請求項４１】
抗増殖剤としての請求項１０に記載のタンパク質の使用方法。
【請求項４２】
抗癌剤としての請求項１０に記載のタンパク質の使用方法。
【請求項４３】
免疫調節剤としての請求項１０に記載のタンパク質の使用方法。
【請求項４４】
治療を必要とする患者に対し、治療有効量の請求項１０に記載のタンパク質を投与することからなる癌の治療方法。
【請求項４５】
治療を必要とする患者に対し、治療有効量の請求項１０に記載のタンパク質を投与することからなるウイルス性疾患の治療方法。
【請求項４６】
前記患者はヒトである請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記タンパク質は製剤学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と共に投与される請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項４８】
治療を必要とする患者に治療有効量の請求項１０に記載のタンパク質を投与することからなるインターフェロン療法に反応性である病気の治療方法。
【請求項４９】
前記タンパク質は幅広い様々な種類の癌に対して治療効果があり、前記癌は黒色腫、結腸直腸腺癌、肝細胞癌、肝臓癌、リンパ腫、前立腺癌、胃腺癌、食道癌、肺癌、子宮頸部腺癌、及び頸癌からなる群より選択される請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
ヒトインターフェロン様生物学的活性を示す非自然発生タンパク質において、配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有すると共に、ＨｕＩＦＮ−α２ｂと比較して高められた抗ウイルス及び抗増殖活性を有するタンパク質。
【請求項５１】
請求項５０に記載のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチド。
【請求項５２】
請求項５０に記載のタンパク質を有する組成物。
【請求項５３】
ヒトインターフェロン様生物学的活性を示す配列番号２のアミノ酸配列又はその断片を有するタンパク質。
【請求項５４】
請求項５３に記載のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチド。
【請求項５５】
配列番号３〜１７のポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチド。
【請求項１】
ヒトインターフェロン様生物学的活性を有するタンパク質をエンコードする分離されたポリヌクレオチドにおいて、それぞれ配列番号１と少なくとも９３％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記配列は配列番号１と少なくとも９５％同一である請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記配列は配列番号１と少なくとも９８％同一である請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記タンパク質は非自然発生するものである請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記タンパク質は、ヒトインターフェロンアルファ２ｂ（ＨｕＩＦＮ−α２ｂ）と比較して高められた抗ウイルス及び抗増殖活性を有する請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記タンパク質は、ＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも少なくとも２倍高い抗ウイルス活性を有する請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記タンパク質は、ＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも少なくとも１０倍高い抗増殖活性を有する請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の組換えベクターを含有する宿主細胞。
【請求項１０】
ヒトインターフェロン様生物学的活性を示す非自然発生タンパク質において、それぞれ配列番号２と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質からなる群より選択されるタンパク質。
【請求項１１】
前記配列は配列番号２と少なくとも９０％同一である請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記配列は配列番号２と少なくとも９５％同一である請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項１３】
前記タンパク質は、ヒトインターフェロンアルファ２ｂ（ＨｕＩＦＮ−α２ｂ）と比較して高められた抗ウイルス及び抗増殖活性を有する請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１４】
前記タンパク質は、ＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも少なくとも２倍高い抗ウイルス活性を有する請求項１３に記載のタンパク質。
【請求項１５】
前記タンパク質は、ＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも少なくとも５倍高い抗ウイルス活性を有する請求項１４に記載のタンパク質。
【請求項１６】
前記タンパク質は、ＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも少なくとも１０倍高い抗ウイルス活性を有する請求項１５に記載のタンパク質。
【請求項１７】
前記タンパク質は、ＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも少なくとも１０倍高い抗増殖活性を有する請求項１３に記載のタンパク質。
【請求項１８】
前記タンパク質は、ＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも少なくとも５０倍高い抗増殖活性を有する請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項１９】
前記タンパク質は、ＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも少なくとも１００倍高い抗増殖活性を有する請求項１８に記載のタンパク質。
【請求項２０】
前記タンパク質は、ＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも少なくとも２００倍高い抗増殖活性を有する請求項１９に記載のタンパク質。
【請求項２１】
前記タンパク質は組換え体である請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項２２】
前記タンパク質は約１９３１５ダルトンの分子量である請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項２３】
任意でＮ末端にメチオニン残基を有する請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項２４】
配列番号２と０〜２５アミノ酸が異なる配列を有し、ヒトインターフェロン様生物学的活性を示す非自然発生タンパク質。
【請求項２５】
前記タンパク質は、ヒトインターフェロンアルファ２ｂ（ＨｕＩＦＮ−α２ｂ）と比較して高められた抗ウイルス及び抗増殖活性を有する請求項２４に記載のタンパク質。
【請求項２６】
前記タンパク質は、ＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも少なくとも２倍高い抗ウイルス活性を有する請求項２５に記載のタンパク質。
【請求項２７】
前記タンパク質は、ＨｕＩＦＮ−α２ｂよりも少なくとも１０倍高い抗増殖活性を有する請求項２５に記載のタンパク質。
【請求項２８】
前記タンパク質はインターフェロン類似体である請求項２４に記載のタンパク質。
【請求項２９】
前記タンパク質は組換え体である請求項２４に記載のタンパク質。
【請求項３０】
請求項１０に記載のタンパク質の断片を含み、前記断片はヒトインターフェロン様生物学的活性を示すポリペプチド。
【請求項３１】
別の部分に結合された請求項１０に記載のタンパク質を含み、前記ヒトインターフェロン様生物学的活性を示すタンパク質構築物。
【請求項３２】
前記タンパク質はグリコシル化される請求項３１に記載のタンパク質構築物。
【請求項３３】
前記部分はポリペプチドである請求項３１に記載のタンパク質構築物。
【請求項３４】
前記部分は非ポリペプチドである請求項３１に記載のタンパク質構築物。
【請求項３５】
前記部分はポリマー分子である請求項３４に記載のタンパク質構築物。
【請求項３６】
前記ポリマー分子は、直鎖状又は分岐状のポリエチレングリコールである請求項３５に記載のタンパク質構築物。
【請求項３７】
前記部分はラベル分子である請求項３１に記載のタンパク質構築物。
【請求項３８】
請求項１０に記載のタンパク質及び製剤学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤からなる組成物。
【請求項３９】
請求項１０に記載のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチド。
【請求項４０】
抗ウイルス剤としての請求項１０に記載のタンパク質の使用方法。
【請求項４１】
抗増殖剤としての請求項１０に記載のタンパク質の使用方法。
【請求項４２】
抗癌剤としての請求項１０に記載のタンパク質の使用方法。
【請求項４３】
免疫調節剤としての請求項１０に記載のタンパク質の使用方法。
【請求項４４】
治療を必要とする患者に対し、治療有効量の請求項１０に記載のタンパク質を投与することからなる癌の治療方法。
【請求項４５】
治療を必要とする患者に対し、治療有効量の請求項１０に記載のタンパク質を投与することからなるウイルス性疾患の治療方法。
【請求項４６】
前記患者はヒトである請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記タンパク質は製剤学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と共に投与される請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項４８】
治療を必要とする患者に治療有効量の請求項１０に記載のタンパク質を投与することからなるインターフェロン療法に反応性である病気の治療方法。
【請求項４９】
前記タンパク質は幅広い様々な種類の癌に対して治療効果があり、前記癌は黒色腫、結腸直腸腺癌、肝細胞癌、肝臓癌、リンパ腫、前立腺癌、胃腺癌、食道癌、肺癌、子宮頸部腺癌、及び頸癌からなる群より選択される請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
ヒトインターフェロン様生物学的活性を示す非自然発生タンパク質において、配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有すると共に、ＨｕＩＦＮ−α２ｂと比較して高められた抗ウイルス及び抗増殖活性を有するタンパク質。
【請求項５１】
請求項５０に記載のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチド。
【請求項５２】
請求項５０に記載のタンパク質を有する組成物。
【請求項５３】
ヒトインターフェロン様生物学的活性を示す配列番号２のアミノ酸配列又はその断片を有するタンパク質。
【請求項５４】
請求項５３に記載のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチド。
【請求項５５】
配列番号３〜１７のポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１０−５１５４６６（Ｐ２０１０−５１５４６６Ａ）
【公表日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４５７６６（Ｐ２００９−５４５７６６）
【出願日】平成１９年６月２２日（２００７．６．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００１１２３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５４７１９
【国際公開日】平成２０年１２月２４日（２００８．１２．２４）
【出願人】（５０８２１８０３９）ノバジェン ホールディング コーポレイション (3)
【氏名又は名称原語表記】ＮＯＶＡＧＥＮ ＨＯＬＤＩＮＧ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月２２日（２００７．６．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００１１２３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５４７１９
【国際公開日】平成２０年１２月２４日（２００８．１２．２４）
【出願人】（５０８２１８０３９）ノバジェン ホールディング コーポレイション (3)
【氏名又は名称原語表記】ＮＯＶＡＧＥＮ ＨＯＬＤＩＮＧ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]