組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体、並びにそれを含有する人工酸素運搬体および赤血球代替物
【課題】酸素親和性を調整できる組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を提供する。
【解決手段】ヒト血清アルブミンのヘム結合サイトであるサブドメインＩＢにおいて、金属ポルフィリンと配位結合するヒスチジンが遺伝子組換え技術により、前記アルブミンの１４２イソロイシン、１８５ロイシン、１３８チロシン、１１５ロイシンおよび／または１３９ロイシンを置換して導入され、またそれとは別の位置に鍵アミノ酸が遺伝子組換え技術により少なくとも一つ導入され、さらに１６１チロシンがチロシン以外の疎水性アミノ酸で置換された組換えヒト血清アルブミンに、金属ポルフィリンを配位結合させた組換えヒト血清アルブミン−ポルフィリン金属錯体。
【解決手段】ヒト血清アルブミンのヘム結合サイトであるサブドメインＩＢにおいて、金属ポルフィリンと配位結合するヒスチジンが遺伝子組換え技術により、前記アルブミンの１４２イソロイシン、１８５ロイシン、１３８チロシン、１１５ロイシンおよび／または１３９ロイシンを置換して導入され、またそれとは別の位置に鍵アミノ酸が遺伝子組換え技術により少なくとも一つ導入され、さらに１６１チロシンがチロシン以外の疎水性アミノ酸で置換された組換えヒト血清アルブミンに、金属ポルフィリンを配位結合させた組換えヒト血清アルブミン−ポルフィリン金属錯体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体、並びにその組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を含有する人工酸素運搬体および人工赤血球代替物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、人間の体内において血液、皮膚、細胞間液など多くの場所に分布する分子量６６，５００の単純蛋白質であり、１７個のジスルフィド結合を含む５８５個のアミノ酸から構成されている。血中ではコロイド浸透圧の維持のほか、各種内因性物質・外因性薬物を運搬、貯蔵、分配する重要な役割を担っている。アルブミンに関する研究は古くから行われているが、Ｘ線結晶構造解析によりその三次元構造の全容が明らかにされたのは１９８９年のことであった（非特許文献１）。その後、１９９８年には、カリーらにより、脂肪酸が７分子結合したアルブミン−脂肪酸複合体の結晶構造が詳細に解明された（非特許文献２）。ＨＳＡは三つのドメイン（Ｉ、II、III）からなり、それらはさらに二つのサブドメイン（Ａ、Ｂ）から構成されている。
【０００３】
もし、血清アルブミンにヘモグロビン（Ｈｂ）のような酸素輸送能を付与することができれば、人工酸素運搬体（赤血球代替物）としての利用価値はきわめて高く、例えば救急医療現場における救命措置に汎用されれば、人類の医療福祉に大な貢献をもたらすことは間違いない。
【０００４】
血漿中には、ヘミン（鉄（III）プロトポルフィリン）を自発的に取り込んで、ヘム蛋白質を構成するヘモペキシンという糖蛋白質も存在する。酸化したＨｂ（メトＨｂ）から遊離したヘミンは細胞毒性があるため、このヘモペキシンにより速やかに捕捉され、肝臓へと運ばれる（非特許文献３）。ヘモペキシンに取り込まれたヘミン分子は、２つのヒスチジン残基との軸配位結合及びアミノ酸残基との多重水素結合により、非常に強く固定されている（Ｋ＞１０12Ｍ-1）（非特許文献４）。しかし、ヘモペキシンの血中濃度は＜１７μＭと低いため、これが飽和した際には、血清アルブミンがその機能を代替する（アルブミンとヘミンの結合定数は約１０8Ｍ-1、非特許文献５参照）。ごく最近、カーターらと本発明者らの研究グループは、独立に、アルブミン−ヘミン−ミリスチン酸錯体のＸ線結晶構造解析に成功した（非特許文献６、非特許文献７）。ヘミンはアルブミンのサブドメインＩＢに取り込まれ、１６１チロシンとの軸配位結合、及び３つの塩基性アミノ酸（リジン１９０、ヒスチジン１４６、アルギニン１１４）残基とプロピオン酸側鎖との間の静電的相互作用により固定されている。ヘミン結合サイトを取り囲む分子環境は、疎水性アミノ酸残基のみから構成されており、ミオグロビン（Ｍｂ）のヘムポケットとの構造類似性がある。窒素雰囲気下でＨＳＡ−ヘミン錯体水溶液に亜二チオン酸ナトリウム水溶液を添加し、ヘミンを鉄（II）プロトポルフィリン錯体（プロトヘム）へ還元すると、可視吸収スペクトルは１６１チロシンが配位した鉄（II）５配位高スピン錯体を形成する。しかし、そこへ酸素を通気しても中心鉄（II）は瞬時に酸化されてしまい、安定な酸素錯体を得ることはできない（非特許文献８）。
【０００５】
他方、本発明者らの研究グループは、４つの疎水性置換基と軸塩基配位子を分子内に共有結合した鉄（II）テトラフェニルポルフィリンがアルブミンに効率よく包接され、得られたアルブミン−ヘム複合体が生理条件下（生理塩水中、ｐＨ７．３、３７℃）でＨｂやＭｂと同じように酸素を吸脱着できることを明らかにしている（特許文献１、特許文献２）。また、本発明者らの研究グループは、赤外吸収、共鳴ラマン、磁気円偏光二色性スペクトルなどから、アルブミン−ヘム複合体の酸素配位錯体の電子状態を詳細に解析（非特許文献９）し、アルブミン−ヘム複合体が生体内でも酸素を運搬できる血清ヘム蛋白質として機能することを動物実験から定量的に実証している。
【０００６】
しかしながら、これらのアルブミン−ヘム複合体において酸素配位活性中心として作用する合成ヘムは、４つの疎水性置換基と軸塩基配位子を分子内に共有結合した特殊な立体構造を有する鉄（II）テトラフェニルポルフィリンに限定されていた。この種のヘム誘導体の合成方法は多段階からなることは言うまでもなく、量産が難しいなどの欠点があるばかりか、生体内へ投与した後の合成ヘム誘導体の代謝分解過程についても未だ不明な点が多いのも現状であった。天然の金属ポルフィリン、例えば鉄（II）プロトポルフィリン、またはその誘導体を血清アルブミンに固定して得たアルブミン−金属ポルフィリン錯体がＨｂやＭｂと同じような酸素配位能を発現することができれば、その生体適合性、生産性は大幅に向上し、極めて有用な材料となるものと考えられる。
【０００７】
そこで、本発明者らは、軸塩基を金属ポルフィリンの分子内に共有結合させなくとも、アルブミンのポルフィリン結合サイトであるサブドメインＩＢに、近位塩基として作用するヒスチジンを遺伝子組換え技術により導入すれば、金属ポルフィリンに、そのヒスチジンのイミダゾール基が軸配位して、５配位錯体が得られ、そこへ酸素を通気することによりＨｂやＭｂに見られる酸素配位錯体が生成するはずであると考えた。
【０００８】
カーターらは、ヒト血清アルブミンに遺伝子組換え技術により、親水性アミノ酸（ヒスチジンまたはグルタミン）を導入して、プロトヘムを配位固定させた組換えアルブミン−プロトヘム錯体を調製し、その酸素結合反応を検討している（特許文献３）。しかし、用いた酸素配位活性中心はプロトヘムのみであり、しかも酸素結合定数など、酸素配位能に関する定量的な解析は行っていない。さらに、本発明者らの研究グループは、永年にわたる合成ヘムを利用した人工酸素運搬体に関する研究の結果から、酸素配位座近傍に親水性基が存在すると、プロトンを媒介する中心金属（II）の酸化反応が促進され、酸素錯体の安定度が低下することを実証している（非特許文献１０）。
【０００９】
このような背景の下、本発明者らの研究グループは、アルブミンのポルフィリン結合サイトであるサブドメインＩＢ内に、近位塩基として作用するヒスチジンを遺伝子組換え技術により導入し、さらに酸素配位座側に結合している１６１チロシンを遺伝子組換え技術により、疎水的なアミノ酸に置換し、人工のヘムポケットを構築すれば、その内部へ金属ポルフィリン錯体が軸配位結合して、安定な酸素錯体を生成するばかりか、活性中心はプロトヘムのみならず、広く多くの金属ポルフィリンで普遍化できるのではないかと考え、組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を調製し、酸素の可逆的な結合解離を初めて明らかにした（非特許文献８、特許文献４）。
【００１０】
しかしながら、実際にこれら組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体の水溶液を人工酸素運搬体として実用化する場合には、酸素親和性などの酸素結合パラメータをそれぞれの使用条件、臨床上の適応にあわせて調整することが必要となってくる。前述した４つの疎水性置換基と軸塩基配位子を分子内に有する複雑な立体構造を有する金属テトラフェニルポルフィリンの場合、置換基構造や軸塩基配位子の化学構造を調節することにより、酸素親和性を調整できることが明らかにされている（非特許文献１０）。
【００１１】
すなわち、組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体については、酸素配位能を調節するための新しい技術の確立が待たれていた。
【非特許文献１】D. C. Carter et al., Science 244: 1195-1198 (1989)
【非特許文献２】S. Curry et al., Nature Struct. Biol. 5: 827-835 (1998)
【非特許文献３】E. Tolosano et al., DNA Cell Biol., 21: 297-306 (2002)
【非特許文献４】M. Paoli et al., Nature Struct. Biol. 6: 926-931 (1999)
【非特許文献５】P. A. Adams et al., Biochem. J. 191: 95-102 (1980)
【非特許文献６】M. Wardell et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 291: 813-819 (2002)
【非特許文献７】P. A. Zunszain et al., BMC Struct. Biol. 3: 6 (2003)
【非特許文献８】T. Komatsu et al., J. Am. Chem. Soc. 127: 15933-15942 (2005)
【非特許文献９】E. Tsuchida et al., Bioconjugate Chem. 10: 797-802 (1999)
【非特許文献１０】T. Komatsu et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 74: 1695-1702 (2001)
【特許文献１】特開平８−３０１８７３号公報
【特許文献２】特開２００３−４０８９３号公報
【特許文献３】特表２００２−５００８６２号公報
【特許文献４】特開２００６−４５１７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、本発明は、上記従来技術の問題点を解消し、酸素親和性を調整できる遺伝子組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体、並びにこの遺伝子組換えアルブミン−金属ポルフィリン錯体を含有する人工酸素運搬体および赤血球代替物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
酸素配位能を金属ポルフィリンに付与するための重要な要件は、軸塩基配位子となるイミダゾールがポルフィリン中心金属の第５配位座に結合されていることである。他方、酸素親和性は、酸素が結合する第６配位座近傍の分子環境に大きく影響を受ける。天然ヘム蛋白質であるＭｂの場合、配位酸素分子の酸素原子から２．７７〜２．９５Åの距離に位置するヒスチジン６４のＮ原子が、プロトンを介して配位酸素と水素結合を形成し、酸素錯体の安定化、及び酸素親和性の増大に寄与している（S. E. Phillips and B. P. Schoeborn, Nature 292:81-82 (1981)）。シュプリンガーらは、遺伝子組換え技術を駆使して、Ｍｂのヒスチジン６４を他のアミノ酸に変換した組換えＭｂを合成し、その酸素配位能を詳細に解析して、天然型であるヒスチジン６４の構造の時、最も酸素親和性が高くなることを明らかにした（B. A. Springer et al., Chem. Rev. 94:699-714 (1994)）。
【００１４】
本発明者らは、組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体の酸素親和性を制御するための分子環境設計と機能発現について鋭意研究を重ねた結果、アルブミンのポルフィリン結合サイトであるサブドメインＩＢに、金属ポルフィリンの近位塩基として作用するヒスチジンを遺伝子組換え技術により導入するとともに、それとは別の位置（特に配位酸素と相互作用し得る距離の位置）に、鍵アミノ酸を導入することにより、ＨｂやＭｂに見られる酸素配位錯体の生成が可能となるばかりか、鍵アミノ酸の位置と構造の調節により、組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体の酸素親和性を制御できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明の第１の側面によれば、ヒト血清アルブミンのヘム結合サイトであるサブドメインＩＢにおいて、金属ポルフィリンと配位結合するヒスチジンが遺伝子組換え技術により、前記アルブミンの１４２イソロイシン、１８５ロイシン、１３８チロシン、１１５ロイシンまたは１３９ロイシンを置換して導入され、またその導入位置とは別の位置に鍵アミノ酸が遺伝子組換え技術により少なくとも一つ導入され、さらに１６１チロシンがチロシン以外の疎水性アミノ酸で置換された組換えヒト血清アルブミンに、金属ポルフィリンを配位結合させた組換えヒト血清アルブミン−ポルフィリン金属錯体が提供される。
【００１６】
本発明の第２の側面によれば、本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を含有する人工酸素運搬体が提供される。この場合、金属ポルフィリンは、中心金属として鉄（II）またはコバルト（II）を有する。
【００１７】
また、本発明の第３の側面によれば、本発明の組換えヒト血清アルブミン-金属ポルフィリン錯体を含有する赤血球代替物が提供される。この場合、金属ポルフィリンは、中心金属として鉄（II）またはコバルト（II）を有する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係る組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体は、遺伝子組換え技術によりポルフィリン結合サイトであるサブドメインＩＢへ導入されたヒスチジンに中心金属が軸配位結合することにより、金属ポルフィリンがアルブミン内部に固定されて５配位高スピン錯体を形成し、酸素の通気により安定度の高い酸素配位錯体を形成することができるばかりか、配位酸素近傍に鍵アミノ酸が遺伝子組換え技術により導入されているため、酸素親和性の調節ができる特徴を有する。さらに、本発明の組換えヒト血清アルブミンは、Ｈｂの酸素結合部位であるプロトヘムはもちろん、合成の金属ポルフィリンでさえも、その内部に軸塩基配位を介して固定し、酸素結合能を発現させることができる上、鍵アミノ酸の種類及び位置の選定により、酸素親和性を制御することができる。また、本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を含有する人工酸素運搬体は、生体内に投与する場合も安全度の高い輸血用血液の代替物として利用できる。加えて、本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体は、移植臓器または組織の保存液、組織培養液、腫瘍の抗癌治療増感剤、術前血液希釈液、人工心肺など体外循環回路の補填液、移植臓器の灌流液、虚血部位への酸素供給液（心筋梗塞、脳梗塞、呼吸不全など）、慢性貧血治療剤、液体換気の環流液、として利用でき、またガス吸着剤、酸化還元触媒、酸素酸化反応触媒、酸素添加反応触媒としても有用なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明のアルブミン−金属ポルフィリン錯体は、ヘム結合サイトであるサブドメインＩＢにおいて、金属ポルフィリンと配位結合するヒスチジンを遺伝子組換え技術により所定の位置に導入し、またそれとは別の位置に鍵アミノ酸を遺伝子組換え技術により少なくとも一つ導入し、さらに１６１チロシンをチロシン以外の疎水性アミノ酸で置換した組換えヒト血清アルブミンに、金属ポルフィリンを軸配位により結合させることにより得られる。
【００２０】
使用する組換えヒト血清アルブミンは、サブドメインＩＢにおいて、１４２イソロイシン、１８５ロイシン、１３８チロシン、１１５ロイシンまたは１３９ロイシンがヒスチジンで置換され（これらの位置のいずれか１つに導入されたヒスチジンは金属ポルフィリンに対し軸配位子として作用する）、その導入位置とは別の位置に鍵アミノ酸が導入され（これらの鍵アミノ酸が配位性アミノ酸で、前記ヒスチジンの導入位置のうち、実際にヒスチジンが導入された位置以外の位置に導入された場合、金属ポリフィリンに軸配位することもあり得る）、しかも１６１チロシンが非配位性の疎水性アミノ酸で置換されている組換えアルブミンである。
【００２１】
上記鍵アミノ酸としては、極性アミノ酸、特にアスパラギン、グルタミン、リジン、ヒスチジン、アルギニンまたはプロリンが好ましい。また、１６１チロシンを置換するヒスチジン以外の非配位性の疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、またはフェニルアラニンを好適に使用することができる。
【００２２】
金属ポルフィリンは、好ましくは、金属プロトポルフィリン、金属デューテロポルフィリン、金属ジアセチルデューテロポルフィリン、金属メソポルフィリン、金属ジホルミルポルフィリン、金属テトラフェニルポルフィリン、金属オクタエチルポルフィリンである。また、その中心金属は。鉄またはコバルト、特に鉄（II）またはコバルト（II）が好ましい。
【００２３】
本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体の分子表面にポリエチレングリコール基を共有結合することにより、表面修飾組換え血清アルブミン−金属ポルフィリン複錯体が得られる。好ましくは、ポリエチレングリコール基がチオエーテル結合で導入されており、特に、血清アルブミンの分子表面に存在するリジン残基のアミノ基をイミノチオランでチオレート基に変換し、それに末端マレイミド基を有するポリエチレングリコールを反応させることによりポリエチレングリコール基をチオエーテル結合で導入して得た表面修飾組換え血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体が望ましい。
【００２４】
本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体は、水中でＨｂやＭｂのように酸素を結合解離できるので、完全合成系の人工酸素運搬体として機能する。もちろん体内へ投与した場合には、赤血球代替物としての役割を果たすばかりでなく、この組換えアルブミン−金属ポルフィリン錯体の水溶液中に、移植に適した臓器または組織を保存することで、移植前の臓器または組織の安全かつ長期の保存が可能となる。また、この組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体は組織の増殖を促進させる培養液として作用することもできるし、腫瘍の低酸素部位へ投与すれば、赤血球の進入できない細い毛細管内を通過できるので、腫瘍低酸素部位の酸素化が可能で、その後直ちに患部へ放射線を照射することにより、腫瘍を縮小または治癒することができる。
【００２５】
人工酸素運搬体の適用として、出血ショックの蘇生液（輸血用血液の代替物）はもちろんのこと、術前血液希釈液、人工心肺など体外循環回路の補填液、移植臓器の灌流液、虚血部位への酸素供給液（心筋梗塞、脳梗塞、呼吸不全など）、慢性貧血治療剤、液体換気の環流液、さらに、稀少血液型患者への利用、宗教上の理由による輸血拒否患者への対応、動物医療への応用が期待されている。人工酸素運搬体は、本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を生理食塩水に分散させることによって得られる。組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体の濃度は、その用途によって異なるが、赤血球代替物としては、ヘム濃度で９．２ｍＭ程度、その他では、それ以上の濃度で用いることができる。
【００２６】
加えて、金属ポルフィリンが例えば第４〜５周期に属する金属イオンの錯体である場合、酸化還元反応、酸素酸化反応または酸素添加反応の触媒としての付加価値も高い。従って、本発明のポルフィリン金属錯体は、人工酸素運搬体のほか、ガス吸着剤、酸化還元触媒、酸素酸化反応触媒、酸素添加反応触媒としての特徴を持つ。
【００２７】
本発明の組換えヒト血清アルブミンは、サブドメインＩＢにヒスチジンを置換または挿入すること、またそれとは別の位置に鍵アミノ酸を置換または挿入すること、さらには１６１チロシンを非配位性の疎水性アミノ酸で置換することによって得られる。特定位置へのアミノ酸の導入は、アルブミンにおけるかかる組換えを達成するために現在知られている種々の慣用手段によって達成される。さらに、本発明の組換えアルブミンの調製は、アルブミンをコードするＤＮＡを慣用の部位特異的突然変異誘発を使用して変異させることによって行うことができる。本変異は、アルブミン本来の立体構造、物性、特徴に影響を及ぼさない程度の小さな変異である。また、遺伝子組換えアルブミンは、酵母を利用した慣用の培養法を使用して産生できる。例えば、変異導入はQuick Change XL Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE社）を用いて行うことができ、発現はPichia Expression Kit（Invitrogen社）を使用して、C. E. Peterson et al., Biochemistry, 36, 7012-7017 (1997)に記載された方法に従って行うことができる。得られた組換えヒト血清アルブミンは、慣用の方法、例えばブルーセファロース６ファーストフローを充填したカラムクロマトグラフィー、続いて、ＳＵＰＥＲＤＥＸ ｐｇ７５を充填したカラムクロマトグラフィーにより精製することができる。
【００２８】
組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体の分子表面をポリエチレングリコール基で修飾することは、例えば特開２００６−４５１７３号公報に記載の方法により実施できる。アルブミン１分子当りのポリエチレングリコールの平均結合本数は１〜１５が好ましく、ポリエチレングリコールの平均分子量は２，０００〜５，０００が好ましい。
【００２９】
本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体は、例えば前述のT. Komatsu et al., J. Am. Chem. Soc. 127: 15933-15942 (2005)に記載の通常の方法により調製することができる。なお、金属ポルフィリンが鉄（III）錯体の形を有する場合は、適当な還元剤（亜二チオン酸ナトリウム、アスコルビン酸など）を用い、常法により中心金属を３価から２価へ還元すれば、酸素結合活性が付与できる。いずれの場合も酸素と接触すると速やかに安定な酸素錯体を生成する。また、これらの錯体は酸素分圧に応じて酸素を吸脱着できる。この酸素結合解離は可逆的に繰り返し行うことができ、酸素運搬体として作用する。
【００３０】
酸素以外にも、金属に配位性である気体の場合、相当する配位錯体を形成できる（例えば、一酸化炭素、一酸化窒素、二酸化窒素など）。これらの理由から、本発明の組換えアルブミン−金属ポルフィリン錯体は、特に鉄（II）またはコバルト（II）錯体の場合、人工酸素運搬体として上記した多くの用途に有効な機能を発揮することはもちろん、均一系、不均一系での酸化還元反応触媒、およびガス吸着剤としての応用が可能となる。
【実施例】
【００３１】
以下、この発明を実施例により詳細に説明する。なお、本発明が実施例のものに限定されないことは、言うまでもないことである。
【００３２】
例１
本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体の酸素結合反応を観測することを目的として、ヒト血清アルブミンの１４２イソロイシンをヒスチジンに置換し、１６１チロシンをロイシンに置換し、さらに１８５ロイシンをアスパラギンに置換した組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｎ）を慣用の部位特異的突然変異誘発とピキア酵母を用いた慣用の培養法により産生した。すなわち、変異導入は、Quick Change XL Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE社）を用いて実施し、発現はPichia Expression Kit（Invitrogen社）を使用し、C. E. Peterson et al., Biochemistry, 36, 7012-7017 (1997)に記載された方法に従って行った。
【００３３】
得られた組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｎ）をブルーセファロース６ファーストフローを充填したカラムクロマトグラフィーにより、続いて、ＳＵＰＥＲＤＥＸ ｐｇ７５を充填したカラムクロマトグラフィーにより精製した。この組換えアルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｎ）（２０μＭ、５０ｍＭリン酸緩衝水溶液）へ鉄（III）プロトポルフィリン（０．２６６ｍＭ、ＤＭＳＯ溶液）をポルフィリン／アルブミンのモル比が１．１／１になるように添加し、１２時間、暗所で回転攪拌しながら混合した。得られた混合溶液を限外濾過装置（限外分子量：１０ｋＤａ）で洗浄し、ＤＭＳＯ濃度が０．１％以下になるまで、５０ｍＭリン酸緩衝水溶液で濃縮・希釈を繰り返した。得られた水溶液の紫外可視吸収スペクトルを図１に示す（Ｆｅ3+として示す）。
【００３４】
この水溶液をアルゴンで十分に置換して脱酸素した後、亜ニチオン酸ナトリウム水溶液を添加して、中心鉄を鉄（II）に還元して、組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｎ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４２５、５３２、５５９ｎｍを示し、これがＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似したことから、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった（図１、Ｆｅ2+として示す）。１４２ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位し、デオキシ体が得られたものと考えられた。そこへ酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行（λmax：４１１、５３７、５７６ｎｍ）し（図１、Ｆｅ2+（Ｏ2）として示す）、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体（λmax：４１９、５３７、５６４ｎｍ）が得られた（図１、Ｆｅ2+（ＣＯ）として示す）。
【００３５】
例２
例１で調製した組換えアルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｎ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体水溶液に、レザーフラッシュ（ＮＤ：ＹＡＧレーザー、５３２ｎｍ、パルス幅６ｎｓ）を照射し、瞬時に起こる非平衡状態から平衡状態への可視吸収スペクトル変化の時間分解解析から、酸素親和性（Ｐ50）及び酸素結合解離速度定数（ｋon、ｋoff）を算出した。実際の測定は前記Komatsu et al., J. Am. Chem. Soc. 2005, 176, 30552-30265に記載の方法で行った。その結果、酸素の結合反応には二成分存在することがわかり、ヘムポケット内における鉄（II）プロトポルフィリンの配向構造が二つ存在する（Ｉ型とII型）ことが明らかとなった。Ｉ型のＰ50は１Torr（２２℃）で、Ｌ１８５Ｎを持たない組換えアルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体に比べて１／１８と低く（酸素親和性は１８倍高いことになる）、Ｍｂの値に近い。ｋonは１．３×１０7Ｍ-1ｓ-1、ｋoffは２１ｓ-1であり、これらの値もＭｂの値（ｋon：１．４×１０7Ｍ-1ｓ-1、ｋoff：１２ｓ-1）と類似した。また、II型のＰ50は１４Torr（２２℃）であり、Ｍｂの値に比べ２７倍高かった（酸素親和性は1／２７低いことになる）。これは、軸塩基配位子の歪みに基づく大きなｋoff値（２９０ｓ-1）に起因するものと推測された。
【００３６】
例３
例１において、ヒト血清アルブミンの１６１チロシンをロイシンに置換する代わりにフェニルアラニンに置換した組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｆ／Ｌ１８５Ｎ）を慣用の部位特異的突然変異誘発とピキア酵母を用いた慣用の培養法により産生した以外は、同様の手法に従い、組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｆ／Ｌ１８５Ｎ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４２５、５３２、５５９ｎｍを示し、これがＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似したことから、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった。1４２ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位しているものと考えられた。そこへ酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行（λmax：４１１、５４０、５７９ｎｍ）し、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体（λmax：４１９、５３９、５６６ｎｍ）が得られた。
【００３７】
例４
例２において、組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｎ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体の代わりに、組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｆ／Ｌ１８５Ｎ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体を用いた以外は、全く同様な方法に従って、酸素親和性（Ｐ50）及び酸素結合解離速度定数（ｋon、ｋoff）を算出した。その結果、酸素の結合反応には二成分存在することがわかり、ヘムポケット内における鉄（II）プロトポルフィリンの配向構造が二つ存在する（I型とII型）ことが明らかとなった。Ｉ型のＰ50は２．３Torr（２２℃）で、Ｍｂに比べて４．５倍高かった（酸素親和性は１／４．５低い）。
【００３８】
例５
例１において、ヒト血清アルブミンの１８５ロイシンをアスパラギンに置換する代わりに１８２ロイシンをヒスチジンに置換した組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８２Ｈ）を慣用の部位特異的突然変異誘発とピキア酵母を用いた慣用の培養法により産生した以外は、同様の手法に従い、組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８２Ｈ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４２６、５３２、５５７ｎｍを示し、これがＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似したことから、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった。1４２ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位しているものと考えられた。そこへ酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行（λmax：４１２、５４０、５７６ｎｍ）し、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体（λmax：４１９、５３９、５６５ｎｍ）が得られた。
【００３９】
例６
例１において、ヒト血清アルブミンの１８５ロイシンをアスパラギンに置換する代わりに１８６アルギニンをヒスチジンに置換し、１６１チロシンをロイシンに置換する代わりにフェニルアラニンに置換した組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｆ／Ｒ１８６Ｈ）を慣用の部位特異的突然変異誘発とピキア酵母を用いた慣用の培養法により産生した以外は、同様の手法に従い、組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｆ／Ｒ１８６Ｈ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４２６、５３３、５５８ｎｍを示し、これがＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似したことから、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった。1４２ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位しているものと考えられた。そこへ酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行（λmax：４１１、５４１、５７７ｎｍ）し、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体（λmax：４１９、５３８、５６６ｎｍ）が得られた。
【００４０】
例７
例１において、ヒト血清アルブミンの１６１チロシンをロイシンに置換する代わりにバリンに置換し、１８５ロイシンをアスパラギンに置換する代わりに１８２ロイシンをアルギニンに置換した組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｖ／Ｌ１８２Ｒ）を慣用の部位特異的突然変異誘発とピキア酵母を用いた慣用の培養法により産生した以外は、同様の手法に従い、組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｖ／Ｌ１８２Ｒ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４２７、５３４、５５７ｎｍを示し、これがＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似したことから、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった。1４２ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位しているものと考えられた。そこへ酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行（λmax：４１１、５４０、５７６ｎｍ）し、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体（λmax：４１９、５３７、５６５ｎｍ）が得られた。
【００４１】
例８
例１において、ヒト血清アルブミンの１４２イソロイシンをヒスチジンに置換する代わりにリジンに置換し、１６１チロシンをロイシンに置換する代わりにアラニンに置換し、１８５ロイシンをアスパラギンに置換する代わりにヒスチジンに置換した組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｋ／Ｙ１６１Ａ／Ｌ１８５Ｈ）を慣用の部位特異的突然変異誘発とピキア酵母を用いた慣用の培養法により産生した以外は、同様の手法に従い、組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｋ／Ｙ１６１Ａ／Ｌ１８５Ｈ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４２６、５３５、５５７ｎｍを示し、これがＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似したことから、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった。1８５ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位しているものと考えられた。そこへ酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行（λmax：４１２、５４１、５７８ｎｍ）し、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体（λmax：４１９、５３６、５６８ｎｍ）が得られた。
【００４２】
例９
例１において合成された（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｎ）−鉄（III）プロトポルフィリン錯体（アルブミン濃度：０．１ｗｔ％）のリン酸緩衝水溶液（ｐＨ７．０）にイミノチオラン（ピアスケミカル製、イミノチオラン／アルブミン：２０(モル／モル)）を加え、室温でゆっくりと４時間攪拌した。続いてアルブミンに対して小過剰モルの片末端マレイミド片末端メチル−ポリオエチレングリコール（サンブライトメマール５０−Ｈ、Ｍｗ：５，０００、日本油脂製）を添加し、同条件で２時間反応させた。得られた混合物を限外濾過装置（アドバンテック製、ＵＨＰ−７６Ｋ、限外分子量膜：５ｋＤａ）を用い、１Ｌのリン酸緩衝水溶液で濃縮・洗浄を繰り返し、所望の濃度に調整した。得られた赤色の表面修飾組換えヒト血清アルブミン−鉄（III）ポルフィリン錯体水溶液を０．４５μｍの除菌フィルター（アドバンテック製、ＤＩＳＭＩＣ ２５ＣＳ０４５ＡＳ）を通過させて最終調整した。
【００４３】
得られた表面修飾組換えヒト血清アルブミン−鉄（III）ポルフィリン錯体のマトリックス支援レーザー脱離イオン化法−質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）（島津製作所製、ＫＲＡＴＯＳ ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ）により、分子量を測定したところ、アルブミン表面に結合したポリエチレングリコール鎖の本数は平均６本であることがわかった。
【００４４】
この水溶液をアルゴンで十分に置換して脱酸素した後、亜ニチオン酸ナトリウム水溶液を添加して、中心鉄を鉄（II）に還元、表面修飾組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｎ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４２５、５３２、５５９ｎｍを示し、これがＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似したことから、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった。１４２ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位し、デオキシ体が得られたものと考えられた。そこへ酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行（λmax：４１２、５３７、５７６ｎｍ）し、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体（λmax：４１９、５３６、５６４ｎｍ）が得られた。
【００４５】
例１０
例１において、鉄（III）プロトポルフィリンの代わりに、鉄（III）デューテロポルフィリンを用いた以外は、同様の手法に従い、組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｎ）−鉄(II)デューテロポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４１３、５１７、５４６ｎｍを示し、これはＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似したことから、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった。１４２ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位し、デオキシ体が得られたものと考えられた。そこへ酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行（λmax：４０１、５２８、５６３ｎｍ）し、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体（λmax：４０９、５２８、５５６ｎｍ）が得られた。
【００４６】
例１１
例１において、鉄（III）プロトポルフィリンの代わりに、コバルト（II）プロトポルフィリンを用いた以外は、同様の手法に従い、組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｎ）−コバルト（II）プロトポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４０６、５５８ｎｍを示し、これはコバルトＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似したことから、Ｃｏ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった。１４２ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位し、デオキシ体が得られたものと考えられた。そこへ酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行した（λmax：４２６、５３９、５７８ｎｍ）。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】例１で得た種々の形態にある組換えヒト血清アルブミン−鉄プロトポルフィリン錯体の紫外可視吸収スペクトル。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体、並びにその組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を含有する人工酸素運搬体および人工赤血球代替物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、人間の体内において血液、皮膚、細胞間液など多くの場所に分布する分子量６６，５００の単純蛋白質であり、１７個のジスルフィド結合を含む５８５個のアミノ酸から構成されている。血中ではコロイド浸透圧の維持のほか、各種内因性物質・外因性薬物を運搬、貯蔵、分配する重要な役割を担っている。アルブミンに関する研究は古くから行われているが、Ｘ線結晶構造解析によりその三次元構造の全容が明らかにされたのは１９８９年のことであった（非特許文献１）。その後、１９９８年には、カリーらにより、脂肪酸が７分子結合したアルブミン−脂肪酸複合体の結晶構造が詳細に解明された（非特許文献２）。ＨＳＡは三つのドメイン（Ｉ、II、III）からなり、それらはさらに二つのサブドメイン（Ａ、Ｂ）から構成されている。
【０００３】
もし、血清アルブミンにヘモグロビン（Ｈｂ）のような酸素輸送能を付与することができれば、人工酸素運搬体（赤血球代替物）としての利用価値はきわめて高く、例えば救急医療現場における救命措置に汎用されれば、人類の医療福祉に大な貢献をもたらすことは間違いない。
【０００４】
血漿中には、ヘミン（鉄（III）プロトポルフィリン）を自発的に取り込んで、ヘム蛋白質を構成するヘモペキシンという糖蛋白質も存在する。酸化したＨｂ（メトＨｂ）から遊離したヘミンは細胞毒性があるため、このヘモペキシンにより速やかに捕捉され、肝臓へと運ばれる（非特許文献３）。ヘモペキシンに取り込まれたヘミン分子は、２つのヒスチジン残基との軸配位結合及びアミノ酸残基との多重水素結合により、非常に強く固定されている（Ｋ＞１０12Ｍ-1）（非特許文献４）。しかし、ヘモペキシンの血中濃度は＜１７μＭと低いため、これが飽和した際には、血清アルブミンがその機能を代替する（アルブミンとヘミンの結合定数は約１０8Ｍ-1、非特許文献５参照）。ごく最近、カーターらと本発明者らの研究グループは、独立に、アルブミン−ヘミン−ミリスチン酸錯体のＸ線結晶構造解析に成功した（非特許文献６、非特許文献７）。ヘミンはアルブミンのサブドメインＩＢに取り込まれ、１６１チロシンとの軸配位結合、及び３つの塩基性アミノ酸（リジン１９０、ヒスチジン１４６、アルギニン１１４）残基とプロピオン酸側鎖との間の静電的相互作用により固定されている。ヘミン結合サイトを取り囲む分子環境は、疎水性アミノ酸残基のみから構成されており、ミオグロビン（Ｍｂ）のヘムポケットとの構造類似性がある。窒素雰囲気下でＨＳＡ−ヘミン錯体水溶液に亜二チオン酸ナトリウム水溶液を添加し、ヘミンを鉄（II）プロトポルフィリン錯体（プロトヘム）へ還元すると、可視吸収スペクトルは１６１チロシンが配位した鉄（II）５配位高スピン錯体を形成する。しかし、そこへ酸素を通気しても中心鉄（II）は瞬時に酸化されてしまい、安定な酸素錯体を得ることはできない（非特許文献８）。
【０００５】
他方、本発明者らの研究グループは、４つの疎水性置換基と軸塩基配位子を分子内に共有結合した鉄（II）テトラフェニルポルフィリンがアルブミンに効率よく包接され、得られたアルブミン−ヘム複合体が生理条件下（生理塩水中、ｐＨ７．３、３７℃）でＨｂやＭｂと同じように酸素を吸脱着できることを明らかにしている（特許文献１、特許文献２）。また、本発明者らの研究グループは、赤外吸収、共鳴ラマン、磁気円偏光二色性スペクトルなどから、アルブミン−ヘム複合体の酸素配位錯体の電子状態を詳細に解析（非特許文献９）し、アルブミン−ヘム複合体が生体内でも酸素を運搬できる血清ヘム蛋白質として機能することを動物実験から定量的に実証している。
【０００６】
しかしながら、これらのアルブミン−ヘム複合体において酸素配位活性中心として作用する合成ヘムは、４つの疎水性置換基と軸塩基配位子を分子内に共有結合した特殊な立体構造を有する鉄（II）テトラフェニルポルフィリンに限定されていた。この種のヘム誘導体の合成方法は多段階からなることは言うまでもなく、量産が難しいなどの欠点があるばかりか、生体内へ投与した後の合成ヘム誘導体の代謝分解過程についても未だ不明な点が多いのも現状であった。天然の金属ポルフィリン、例えば鉄（II）プロトポルフィリン、またはその誘導体を血清アルブミンに固定して得たアルブミン−金属ポルフィリン錯体がＨｂやＭｂと同じような酸素配位能を発現することができれば、その生体適合性、生産性は大幅に向上し、極めて有用な材料となるものと考えられる。
【０００７】
そこで、本発明者らは、軸塩基を金属ポルフィリンの分子内に共有結合させなくとも、アルブミンのポルフィリン結合サイトであるサブドメインＩＢに、近位塩基として作用するヒスチジンを遺伝子組換え技術により導入すれば、金属ポルフィリンに、そのヒスチジンのイミダゾール基が軸配位して、５配位錯体が得られ、そこへ酸素を通気することによりＨｂやＭｂに見られる酸素配位錯体が生成するはずであると考えた。
【０００８】
カーターらは、ヒト血清アルブミンに遺伝子組換え技術により、親水性アミノ酸（ヒスチジンまたはグルタミン）を導入して、プロトヘムを配位固定させた組換えアルブミン−プロトヘム錯体を調製し、その酸素結合反応を検討している（特許文献３）。しかし、用いた酸素配位活性中心はプロトヘムのみであり、しかも酸素結合定数など、酸素配位能に関する定量的な解析は行っていない。さらに、本発明者らの研究グループは、永年にわたる合成ヘムを利用した人工酸素運搬体に関する研究の結果から、酸素配位座近傍に親水性基が存在すると、プロトンを媒介する中心金属（II）の酸化反応が促進され、酸素錯体の安定度が低下することを実証している（非特許文献１０）。
【０００９】
このような背景の下、本発明者らの研究グループは、アルブミンのポルフィリン結合サイトであるサブドメインＩＢ内に、近位塩基として作用するヒスチジンを遺伝子組換え技術により導入し、さらに酸素配位座側に結合している１６１チロシンを遺伝子組換え技術により、疎水的なアミノ酸に置換し、人工のヘムポケットを構築すれば、その内部へ金属ポルフィリン錯体が軸配位結合して、安定な酸素錯体を生成するばかりか、活性中心はプロトヘムのみならず、広く多くの金属ポルフィリンで普遍化できるのではないかと考え、組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を調製し、酸素の可逆的な結合解離を初めて明らかにした（非特許文献８、特許文献４）。
【００１０】
しかしながら、実際にこれら組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体の水溶液を人工酸素運搬体として実用化する場合には、酸素親和性などの酸素結合パラメータをそれぞれの使用条件、臨床上の適応にあわせて調整することが必要となってくる。前述した４つの疎水性置換基と軸塩基配位子を分子内に有する複雑な立体構造を有する金属テトラフェニルポルフィリンの場合、置換基構造や軸塩基配位子の化学構造を調節することにより、酸素親和性を調整できることが明らかにされている（非特許文献１０）。
【００１１】
すなわち、組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体については、酸素配位能を調節するための新しい技術の確立が待たれていた。
【非特許文献１】D. C. Carter et al., Science 244: 1195-1198 (1989)
【非特許文献２】S. Curry et al., Nature Struct. Biol. 5: 827-835 (1998)
【非特許文献３】E. Tolosano et al., DNA Cell Biol., 21: 297-306 (2002)
【非特許文献４】M. Paoli et al., Nature Struct. Biol. 6: 926-931 (1999)
【非特許文献５】P. A. Adams et al., Biochem. J. 191: 95-102 (1980)
【非特許文献６】M. Wardell et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 291: 813-819 (2002)
【非特許文献７】P. A. Zunszain et al., BMC Struct. Biol. 3: 6 (2003)
【非特許文献８】T. Komatsu et al., J. Am. Chem. Soc. 127: 15933-15942 (2005)
【非特許文献９】E. Tsuchida et al., Bioconjugate Chem. 10: 797-802 (1999)
【非特許文献１０】T. Komatsu et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 74: 1695-1702 (2001)
【特許文献１】特開平８−３０１８７３号公報
【特許文献２】特開２００３−４０８９３号公報
【特許文献３】特表２００２−５００８６２号公報
【特許文献４】特開２００６−４５１７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、本発明は、上記従来技術の問題点を解消し、酸素親和性を調整できる遺伝子組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体、並びにこの遺伝子組換えアルブミン−金属ポルフィリン錯体を含有する人工酸素運搬体および赤血球代替物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
酸素配位能を金属ポルフィリンに付与するための重要な要件は、軸塩基配位子となるイミダゾールがポルフィリン中心金属の第５配位座に結合されていることである。他方、酸素親和性は、酸素が結合する第６配位座近傍の分子環境に大きく影響を受ける。天然ヘム蛋白質であるＭｂの場合、配位酸素分子の酸素原子から２．７７〜２．９５Åの距離に位置するヒスチジン６４のＮ原子が、プロトンを介して配位酸素と水素結合を形成し、酸素錯体の安定化、及び酸素親和性の増大に寄与している（S. E. Phillips and B. P. Schoeborn, Nature 292:81-82 (1981)）。シュプリンガーらは、遺伝子組換え技術を駆使して、Ｍｂのヒスチジン６４を他のアミノ酸に変換した組換えＭｂを合成し、その酸素配位能を詳細に解析して、天然型であるヒスチジン６４の構造の時、最も酸素親和性が高くなることを明らかにした（B. A. Springer et al., Chem. Rev. 94:699-714 (1994)）。
【００１４】
本発明者らは、組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体の酸素親和性を制御するための分子環境設計と機能発現について鋭意研究を重ねた結果、アルブミンのポルフィリン結合サイトであるサブドメインＩＢに、金属ポルフィリンの近位塩基として作用するヒスチジンを遺伝子組換え技術により導入するとともに、それとは別の位置（特に配位酸素と相互作用し得る距離の位置）に、鍵アミノ酸を導入することにより、ＨｂやＭｂに見られる酸素配位錯体の生成が可能となるばかりか、鍵アミノ酸の位置と構造の調節により、組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体の酸素親和性を制御できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明の第１の側面によれば、ヒト血清アルブミンのヘム結合サイトであるサブドメインＩＢにおいて、金属ポルフィリンと配位結合するヒスチジンが遺伝子組換え技術により、前記アルブミンの１４２イソロイシン、１８５ロイシン、１３８チロシン、１１５ロイシンまたは１３９ロイシンを置換して導入され、またその導入位置とは別の位置に鍵アミノ酸が遺伝子組換え技術により少なくとも一つ導入され、さらに１６１チロシンがチロシン以外の疎水性アミノ酸で置換された組換えヒト血清アルブミンに、金属ポルフィリンを配位結合させた組換えヒト血清アルブミン−ポルフィリン金属錯体が提供される。
【００１６】
本発明の第２の側面によれば、本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を含有する人工酸素運搬体が提供される。この場合、金属ポルフィリンは、中心金属として鉄（II）またはコバルト（II）を有する。
【００１７】
また、本発明の第３の側面によれば、本発明の組換えヒト血清アルブミン-金属ポルフィリン錯体を含有する赤血球代替物が提供される。この場合、金属ポルフィリンは、中心金属として鉄（II）またはコバルト（II）を有する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係る組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体は、遺伝子組換え技術によりポルフィリン結合サイトであるサブドメインＩＢへ導入されたヒスチジンに中心金属が軸配位結合することにより、金属ポルフィリンがアルブミン内部に固定されて５配位高スピン錯体を形成し、酸素の通気により安定度の高い酸素配位錯体を形成することができるばかりか、配位酸素近傍に鍵アミノ酸が遺伝子組換え技術により導入されているため、酸素親和性の調節ができる特徴を有する。さらに、本発明の組換えヒト血清アルブミンは、Ｈｂの酸素結合部位であるプロトヘムはもちろん、合成の金属ポルフィリンでさえも、その内部に軸塩基配位を介して固定し、酸素結合能を発現させることができる上、鍵アミノ酸の種類及び位置の選定により、酸素親和性を制御することができる。また、本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を含有する人工酸素運搬体は、生体内に投与する場合も安全度の高い輸血用血液の代替物として利用できる。加えて、本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体は、移植臓器または組織の保存液、組織培養液、腫瘍の抗癌治療増感剤、術前血液希釈液、人工心肺など体外循環回路の補填液、移植臓器の灌流液、虚血部位への酸素供給液（心筋梗塞、脳梗塞、呼吸不全など）、慢性貧血治療剤、液体換気の環流液、として利用でき、またガス吸着剤、酸化還元触媒、酸素酸化反応触媒、酸素添加反応触媒としても有用なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明のアルブミン−金属ポルフィリン錯体は、ヘム結合サイトであるサブドメインＩＢにおいて、金属ポルフィリンと配位結合するヒスチジンを遺伝子組換え技術により所定の位置に導入し、またそれとは別の位置に鍵アミノ酸を遺伝子組換え技術により少なくとも一つ導入し、さらに１６１チロシンをチロシン以外の疎水性アミノ酸で置換した組換えヒト血清アルブミンに、金属ポルフィリンを軸配位により結合させることにより得られる。
【００２０】
使用する組換えヒト血清アルブミンは、サブドメインＩＢにおいて、１４２イソロイシン、１８５ロイシン、１３８チロシン、１１５ロイシンまたは１３９ロイシンがヒスチジンで置換され（これらの位置のいずれか１つに導入されたヒスチジンは金属ポルフィリンに対し軸配位子として作用する）、その導入位置とは別の位置に鍵アミノ酸が導入され（これらの鍵アミノ酸が配位性アミノ酸で、前記ヒスチジンの導入位置のうち、実際にヒスチジンが導入された位置以外の位置に導入された場合、金属ポリフィリンに軸配位することもあり得る）、しかも１６１チロシンが非配位性の疎水性アミノ酸で置換されている組換えアルブミンである。
【００２１】
上記鍵アミノ酸としては、極性アミノ酸、特にアスパラギン、グルタミン、リジン、ヒスチジン、アルギニンまたはプロリンが好ましい。また、１６１チロシンを置換するヒスチジン以外の非配位性の疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、またはフェニルアラニンを好適に使用することができる。
【００２２】
金属ポルフィリンは、好ましくは、金属プロトポルフィリン、金属デューテロポルフィリン、金属ジアセチルデューテロポルフィリン、金属メソポルフィリン、金属ジホルミルポルフィリン、金属テトラフェニルポルフィリン、金属オクタエチルポルフィリンである。また、その中心金属は。鉄またはコバルト、特に鉄（II）またはコバルト（II）が好ましい。
【００２３】
本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体の分子表面にポリエチレングリコール基を共有結合することにより、表面修飾組換え血清アルブミン−金属ポルフィリン複錯体が得られる。好ましくは、ポリエチレングリコール基がチオエーテル結合で導入されており、特に、血清アルブミンの分子表面に存在するリジン残基のアミノ基をイミノチオランでチオレート基に変換し、それに末端マレイミド基を有するポリエチレングリコールを反応させることによりポリエチレングリコール基をチオエーテル結合で導入して得た表面修飾組換え血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体が望ましい。
【００２４】
本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体は、水中でＨｂやＭｂのように酸素を結合解離できるので、完全合成系の人工酸素運搬体として機能する。もちろん体内へ投与した場合には、赤血球代替物としての役割を果たすばかりでなく、この組換えアルブミン−金属ポルフィリン錯体の水溶液中に、移植に適した臓器または組織を保存することで、移植前の臓器または組織の安全かつ長期の保存が可能となる。また、この組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体は組織の増殖を促進させる培養液として作用することもできるし、腫瘍の低酸素部位へ投与すれば、赤血球の進入できない細い毛細管内を通過できるので、腫瘍低酸素部位の酸素化が可能で、その後直ちに患部へ放射線を照射することにより、腫瘍を縮小または治癒することができる。
【００２５】
人工酸素運搬体の適用として、出血ショックの蘇生液（輸血用血液の代替物）はもちろんのこと、術前血液希釈液、人工心肺など体外循環回路の補填液、移植臓器の灌流液、虚血部位への酸素供給液（心筋梗塞、脳梗塞、呼吸不全など）、慢性貧血治療剤、液体換気の環流液、さらに、稀少血液型患者への利用、宗教上の理由による輸血拒否患者への対応、動物医療への応用が期待されている。人工酸素運搬体は、本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を生理食塩水に分散させることによって得られる。組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体の濃度は、その用途によって異なるが、赤血球代替物としては、ヘム濃度で９．２ｍＭ程度、その他では、それ以上の濃度で用いることができる。
【００２６】
加えて、金属ポルフィリンが例えば第４〜５周期に属する金属イオンの錯体である場合、酸化還元反応、酸素酸化反応または酸素添加反応の触媒としての付加価値も高い。従って、本発明のポルフィリン金属錯体は、人工酸素運搬体のほか、ガス吸着剤、酸化還元触媒、酸素酸化反応触媒、酸素添加反応触媒としての特徴を持つ。
【００２７】
本発明の組換えヒト血清アルブミンは、サブドメインＩＢにヒスチジンを置換または挿入すること、またそれとは別の位置に鍵アミノ酸を置換または挿入すること、さらには１６１チロシンを非配位性の疎水性アミノ酸で置換することによって得られる。特定位置へのアミノ酸の導入は、アルブミンにおけるかかる組換えを達成するために現在知られている種々の慣用手段によって達成される。さらに、本発明の組換えアルブミンの調製は、アルブミンをコードするＤＮＡを慣用の部位特異的突然変異誘発を使用して変異させることによって行うことができる。本変異は、アルブミン本来の立体構造、物性、特徴に影響を及ぼさない程度の小さな変異である。また、遺伝子組換えアルブミンは、酵母を利用した慣用の培養法を使用して産生できる。例えば、変異導入はQuick Change XL Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE社）を用いて行うことができ、発現はPichia Expression Kit（Invitrogen社）を使用して、C. E. Peterson et al., Biochemistry, 36, 7012-7017 (1997)に記載された方法に従って行うことができる。得られた組換えヒト血清アルブミンは、慣用の方法、例えばブルーセファロース６ファーストフローを充填したカラムクロマトグラフィー、続いて、ＳＵＰＥＲＤＥＸ ｐｇ７５を充填したカラムクロマトグラフィーにより精製することができる。
【００２８】
組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体の分子表面をポリエチレングリコール基で修飾することは、例えば特開２００６−４５１７３号公報に記載の方法により実施できる。アルブミン１分子当りのポリエチレングリコールの平均結合本数は１〜１５が好ましく、ポリエチレングリコールの平均分子量は２，０００〜５，０００が好ましい。
【００２９】
本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体は、例えば前述のT. Komatsu et al., J. Am. Chem. Soc. 127: 15933-15942 (2005)に記載の通常の方法により調製することができる。なお、金属ポルフィリンが鉄（III）錯体の形を有する場合は、適当な還元剤（亜二チオン酸ナトリウム、アスコルビン酸など）を用い、常法により中心金属を３価から２価へ還元すれば、酸素結合活性が付与できる。いずれの場合も酸素と接触すると速やかに安定な酸素錯体を生成する。また、これらの錯体は酸素分圧に応じて酸素を吸脱着できる。この酸素結合解離は可逆的に繰り返し行うことができ、酸素運搬体として作用する。
【００３０】
酸素以外にも、金属に配位性である気体の場合、相当する配位錯体を形成できる（例えば、一酸化炭素、一酸化窒素、二酸化窒素など）。これらの理由から、本発明の組換えアルブミン−金属ポルフィリン錯体は、特に鉄（II）またはコバルト（II）錯体の場合、人工酸素運搬体として上記した多くの用途に有効な機能を発揮することはもちろん、均一系、不均一系での酸化還元反応触媒、およびガス吸着剤としての応用が可能となる。
【実施例】
【００３１】
以下、この発明を実施例により詳細に説明する。なお、本発明が実施例のものに限定されないことは、言うまでもないことである。
【００３２】
例１
本発明の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体の酸素結合反応を観測することを目的として、ヒト血清アルブミンの１４２イソロイシンをヒスチジンに置換し、１６１チロシンをロイシンに置換し、さらに１８５ロイシンをアスパラギンに置換した組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｎ）を慣用の部位特異的突然変異誘発とピキア酵母を用いた慣用の培養法により産生した。すなわち、変異導入は、Quick Change XL Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE社）を用いて実施し、発現はPichia Expression Kit（Invitrogen社）を使用し、C. E. Peterson et al., Biochemistry, 36, 7012-7017 (1997)に記載された方法に従って行った。
【００３３】
得られた組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｎ）をブルーセファロース６ファーストフローを充填したカラムクロマトグラフィーにより、続いて、ＳＵＰＥＲＤＥＸ ｐｇ７５を充填したカラムクロマトグラフィーにより精製した。この組換えアルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｎ）（２０μＭ、５０ｍＭリン酸緩衝水溶液）へ鉄（III）プロトポルフィリン（０．２６６ｍＭ、ＤＭＳＯ溶液）をポルフィリン／アルブミンのモル比が１．１／１になるように添加し、１２時間、暗所で回転攪拌しながら混合した。得られた混合溶液を限外濾過装置（限外分子量：１０ｋＤａ）で洗浄し、ＤＭＳＯ濃度が０．１％以下になるまで、５０ｍＭリン酸緩衝水溶液で濃縮・希釈を繰り返した。得られた水溶液の紫外可視吸収スペクトルを図１に示す（Ｆｅ3+として示す）。
【００３４】
この水溶液をアルゴンで十分に置換して脱酸素した後、亜ニチオン酸ナトリウム水溶液を添加して、中心鉄を鉄（II）に還元して、組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｎ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４２５、５３２、５５９ｎｍを示し、これがＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似したことから、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった（図１、Ｆｅ2+として示す）。１４２ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位し、デオキシ体が得られたものと考えられた。そこへ酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行（λmax：４１１、５３７、５７６ｎｍ）し（図１、Ｆｅ2+（Ｏ2）として示す）、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体（λmax：４１９、５３７、５６４ｎｍ）が得られた（図１、Ｆｅ2+（ＣＯ）として示す）。
【００３５】
例２
例１で調製した組換えアルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｎ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体水溶液に、レザーフラッシュ（ＮＤ：ＹＡＧレーザー、５３２ｎｍ、パルス幅６ｎｓ）を照射し、瞬時に起こる非平衡状態から平衡状態への可視吸収スペクトル変化の時間分解解析から、酸素親和性（Ｐ50）及び酸素結合解離速度定数（ｋon、ｋoff）を算出した。実際の測定は前記Komatsu et al., J. Am. Chem. Soc. 2005, 176, 30552-30265に記載の方法で行った。その結果、酸素の結合反応には二成分存在することがわかり、ヘムポケット内における鉄（II）プロトポルフィリンの配向構造が二つ存在する（Ｉ型とII型）ことが明らかとなった。Ｉ型のＰ50は１Torr（２２℃）で、Ｌ１８５Ｎを持たない組換えアルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体に比べて１／１８と低く（酸素親和性は１８倍高いことになる）、Ｍｂの値に近い。ｋonは１．３×１０7Ｍ-1ｓ-1、ｋoffは２１ｓ-1であり、これらの値もＭｂの値（ｋon：１．４×１０7Ｍ-1ｓ-1、ｋoff：１２ｓ-1）と類似した。また、II型のＰ50は１４Torr（２２℃）であり、Ｍｂの値に比べ２７倍高かった（酸素親和性は1／２７低いことになる）。これは、軸塩基配位子の歪みに基づく大きなｋoff値（２９０ｓ-1）に起因するものと推測された。
【００３６】
例３
例１において、ヒト血清アルブミンの１６１チロシンをロイシンに置換する代わりにフェニルアラニンに置換した組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｆ／Ｌ１８５Ｎ）を慣用の部位特異的突然変異誘発とピキア酵母を用いた慣用の培養法により産生した以外は、同様の手法に従い、組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｆ／Ｌ１８５Ｎ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４２５、５３２、５５９ｎｍを示し、これがＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似したことから、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった。1４２ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位しているものと考えられた。そこへ酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行（λmax：４１１、５４０、５７９ｎｍ）し、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体（λmax：４１９、５３９、５６６ｎｍ）が得られた。
【００３７】
例４
例２において、組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｎ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体の代わりに、組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｆ／Ｌ１８５Ｎ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体を用いた以外は、全く同様な方法に従って、酸素親和性（Ｐ50）及び酸素結合解離速度定数（ｋon、ｋoff）を算出した。その結果、酸素の結合反応には二成分存在することがわかり、ヘムポケット内における鉄（II）プロトポルフィリンの配向構造が二つ存在する（I型とII型）ことが明らかとなった。Ｉ型のＰ50は２．３Torr（２２℃）で、Ｍｂに比べて４．５倍高かった（酸素親和性は１／４．５低い）。
【００３８】
例５
例１において、ヒト血清アルブミンの１８５ロイシンをアスパラギンに置換する代わりに１８２ロイシンをヒスチジンに置換した組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８２Ｈ）を慣用の部位特異的突然変異誘発とピキア酵母を用いた慣用の培養法により産生した以外は、同様の手法に従い、組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８２Ｈ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４２６、５３２、５５７ｎｍを示し、これがＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似したことから、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった。1４２ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位しているものと考えられた。そこへ酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行（λmax：４１２、５４０、５７６ｎｍ）し、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体（λmax：４１９、５３９、５６５ｎｍ）が得られた。
【００３９】
例６
例１において、ヒト血清アルブミンの１８５ロイシンをアスパラギンに置換する代わりに１８６アルギニンをヒスチジンに置換し、１６１チロシンをロイシンに置換する代わりにフェニルアラニンに置換した組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｆ／Ｒ１８６Ｈ）を慣用の部位特異的突然変異誘発とピキア酵母を用いた慣用の培養法により産生した以外は、同様の手法に従い、組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｆ／Ｒ１８６Ｈ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４２６、５３３、５５８ｎｍを示し、これがＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似したことから、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった。1４２ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位しているものと考えられた。そこへ酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行（λmax：４１１、５４１、５７７ｎｍ）し、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体（λmax：４１９、５３８、５６６ｎｍ）が得られた。
【００４０】
例７
例１において、ヒト血清アルブミンの１６１チロシンをロイシンに置換する代わりにバリンに置換し、１８５ロイシンをアスパラギンに置換する代わりに１８２ロイシンをアルギニンに置換した組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｖ／Ｌ１８２Ｒ）を慣用の部位特異的突然変異誘発とピキア酵母を用いた慣用の培養法により産生した以外は、同様の手法に従い、組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｖ／Ｌ１８２Ｒ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４２７、５３４、５５７ｎｍを示し、これがＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似したことから、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった。1４２ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位しているものと考えられた。そこへ酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行（λmax：４１１、５４０、５７６ｎｍ）し、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体（λmax：４１９、５３７、５６５ｎｍ）が得られた。
【００４１】
例８
例１において、ヒト血清アルブミンの１４２イソロイシンをヒスチジンに置換する代わりにリジンに置換し、１６１チロシンをロイシンに置換する代わりにアラニンに置換し、１８５ロイシンをアスパラギンに置換する代わりにヒスチジンに置換した組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｋ／Ｙ１６１Ａ／Ｌ１８５Ｈ）を慣用の部位特異的突然変異誘発とピキア酵母を用いた慣用の培養法により産生した以外は、同様の手法に従い、組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｋ／Ｙ１６１Ａ／Ｌ１８５Ｈ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４２６、５３５、５５７ｎｍを示し、これがＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似したことから、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった。1８５ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位しているものと考えられた。そこへ酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行（λmax：４１２、５４１、５７８ｎｍ）し、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体（λmax：４１９、５３６、５６８ｎｍ）が得られた。
【００４２】
例９
例１において合成された（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｎ）−鉄（III）プロトポルフィリン錯体（アルブミン濃度：０．１ｗｔ％）のリン酸緩衝水溶液（ｐＨ７．０）にイミノチオラン（ピアスケミカル製、イミノチオラン／アルブミン：２０(モル／モル)）を加え、室温でゆっくりと４時間攪拌した。続いてアルブミンに対して小過剰モルの片末端マレイミド片末端メチル−ポリオエチレングリコール（サンブライトメマール５０−Ｈ、Ｍｗ：５，０００、日本油脂製）を添加し、同条件で２時間反応させた。得られた混合物を限外濾過装置（アドバンテック製、ＵＨＰ−７６Ｋ、限外分子量膜：５ｋＤａ）を用い、１Ｌのリン酸緩衝水溶液で濃縮・洗浄を繰り返し、所望の濃度に調整した。得られた赤色の表面修飾組換えヒト血清アルブミン−鉄（III）ポルフィリン錯体水溶液を０．４５μｍの除菌フィルター（アドバンテック製、ＤＩＳＭＩＣ ２５ＣＳ０４５ＡＳ）を通過させて最終調整した。
【００４３】
得られた表面修飾組換えヒト血清アルブミン−鉄（III）ポルフィリン錯体のマトリックス支援レーザー脱離イオン化法−質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）（島津製作所製、ＫＲＡＴＯＳ ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ）により、分子量を測定したところ、アルブミン表面に結合したポリエチレングリコール鎖の本数は平均６本であることがわかった。
【００４４】
この水溶液をアルゴンで十分に置換して脱酸素した後、亜ニチオン酸ナトリウム水溶液を添加して、中心鉄を鉄（II）に還元、表面修飾組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｎ）−鉄（II）プロトポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４２５、５３２、５５９ｎｍを示し、これがＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似したことから、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった。１４２ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位し、デオキシ体が得られたものと考えられた。そこへ酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行（λmax：４１２、５３７、５７６ｎｍ）し、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体（λmax：４１９、５３６、５６４ｎｍ）が得られた。
【００４５】
例１０
例１において、鉄（III）プロトポルフィリンの代わりに、鉄（III）デューテロポルフィリンを用いた以外は、同様の手法に従い、組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｎ）−鉄(II)デューテロポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４１３、５１７、５４６ｎｍを示し、これはＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似したことから、Ｆｅ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった。１４２ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位し、デオキシ体が得られたものと考えられた。そこへ酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行（λmax：４０１、５２８、５６３ｎｍ）し、一酸化炭素を通気すると安定な一酸化炭素錯体（λmax：４０９、５２８、５５６ｎｍ）が得られた。
【００４６】
例１１
例１において、鉄（III）プロトポルフィリンの代わりに、コバルト（II）プロトポルフィリンを用いた以外は、同様の手法に従い、組換えヒト血清アルブミン（Ｉ１４２Ｈ／Ｙ１６１Ｌ／Ｌ１８５Ｎ）−コバルト（II）プロトポルフィリン錯体を調製した。この水溶液の紫外可視吸収スペクトルはλmax：４０６、５５８ｎｍを示し、これはコバルトＭｂのデオキシ型のスペクトルパターンとよく類似したことから、Ｃｏ（II）５配位高スピン錯体の形成が明らかとなった。１４２ヒスチジンのイミダゾール基が軸塩基として中心鉄に配位し、デオキシ体が得られたものと考えられた。そこへ酸素を通気すると、直ちに酸素錯体型のスペクトルへ移行した（λmax：４２６、５３９、５７８ｎｍ）。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】例１で得た種々の形態にある組換えヒト血清アルブミン−鉄プロトポルフィリン錯体の紫外可視吸収スペクトル。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血清アルブミンのヘム結合サイトであるサブドメインＩＢにおいて、金属ポルフィリンと配位結合するヒスチジンが遺伝子組換え技術により、前記アルブミンの１４２イソロイシン、１８５ロイシン、１３８チロシン、１１５ロイシンまたは１３９ロイシンを置換して導入され、またその導入位置とは別の位置に鍵アミノ酸が遺伝子組換え技術により少なくとも一つ導入され、さらに１６１チロシンがチロシン以外の疎水性アミノ酸で置換された組換えヒト血清アルブミンに、金属ポルフィリンを配位結合させた組換えヒト血清アルブミン−ポルフィリン金属錯体。
【請求項２】
前記鍵アミノ酸が、極性アミノ酸であることを特徴とする請求項１に記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体。
【請求項３】
前記金属ポルフィリンが、金属プロトポルフィリン、金属デューテロポルフィリン、金属ジアセチルデューテロポルフィリン、金属メソポルフィリン、金属ジホルミルポルフィリン、金属テトラフェニルポルフィリンおよび金属オクタエチルポルフィリンからなる群の中から選ばれる少なくとも１種の金属ポルフィリンであることを特徴とする請求項１または２に記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体。
【請求項４】
前記組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体の分子表面に、ポリエチレングリコール基が共有結合されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体。
【請求項５】
前記金属が、鉄またはコバルトであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体。
【請求項６】
前記金属が、鉄（II）またはコバルト（II）であることを特徴とする請求項５に記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を含有する人工酸素運搬体。
【請求項８】
請求項６に記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を含有する赤血球代替物。
【請求項１】
ヒト血清アルブミンのヘム結合サイトであるサブドメインＩＢにおいて、金属ポルフィリンと配位結合するヒスチジンが遺伝子組換え技術により、前記アルブミンの１４２イソロイシン、１８５ロイシン、１３８チロシン、１１５ロイシンまたは１３９ロイシンを置換して導入され、またその導入位置とは別の位置に鍵アミノ酸が遺伝子組換え技術により少なくとも一つ導入され、さらに１６１チロシンがチロシン以外の疎水性アミノ酸で置換された組換えヒト血清アルブミンに、金属ポルフィリンを配位結合させた組換えヒト血清アルブミン−ポルフィリン金属錯体。
【請求項２】
前記鍵アミノ酸が、極性アミノ酸であることを特徴とする請求項１に記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体。
【請求項３】
前記金属ポルフィリンが、金属プロトポルフィリン、金属デューテロポルフィリン、金属ジアセチルデューテロポルフィリン、金属メソポルフィリン、金属ジホルミルポルフィリン、金属テトラフェニルポルフィリンおよび金属オクタエチルポルフィリンからなる群の中から選ばれる少なくとも１種の金属ポルフィリンであることを特徴とする請求項１または２に記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体。
【請求項４】
前記組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体の分子表面に、ポリエチレングリコール基が共有結合されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体。
【請求項５】
前記金属が、鉄またはコバルトであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体。
【請求項６】
前記金属が、鉄（II）またはコバルト（II）であることを特徴とする請求項５に記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を含有する人工酸素運搬体。
【請求項８】
請求項６に記載の組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体を含有する赤血球代替物。
【図１】
【公開番号】特開２００７−３０２５６９（Ｐ２００７−３０２５６９Ａ）
【公開日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１２９４７１（Ｐ２００６−１２９４７１）
【出願日】平成１８年５月８日（２００６．５．８）
【出願人】（０００２１８７１９）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月８日（２００６．５．８）
【出願人】（０００２１８７１９）
【Ｆターム（参考）】
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