腫瘍組織選択性及び生分解性のポリホスファゼン−白金（ＩＩ）抱合錯体抗腫瘍剤、及びその製法
式（１）
（式中、ｘはポリエチレンオキシド繰り返し単位の数を示し、７、１２又は１６であり、ｙは０、１又は２であり、ｚは０．５〜１．５の範囲における、ポリエチレングリコールのモル含量を示し、ｎは、３０〜１００の範囲における、ポリホスファゼンの重合度を示し、Ａ−Ａはジアミンを示す。）
で表される、新しいクラスのポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体抗腫瘍剤（該抗腫瘍剤は、その強められる透過性及び保持性効果により、高い腫瘍組織選択性を有する）、及びその製法が開示されている。
（式中、ｘはポリエチレンオキシド繰り返し単位の数を示し、７、１２又は１６であり、ｙは０、１又は２であり、ｚは０．５〜１．５の範囲における、ポリエチレングリコールのモル含量を示し、ｎは、３０〜１００の範囲における、ポリホスファゼンの重合度を示し、Ａ−Ａはジアミンを示す。）
で表される、新しいクラスのポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体抗腫瘍剤（該抗腫瘍剤は、その強められる透過性及び保持性効果により、高い腫瘍組織選択性を有する）、及びその製法が開示されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍組織選択性及び生分解性のポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体抗腫瘍剤、及びその製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
白金（II）系抗腫瘍剤、例えば、シスプラチン又はカルボプラチンは、全世界的に、最も広く使用されている抗癌剤の１つであり、特に、睾丸癌、卵巣癌、膀胱癌などに優れた坑腫瘍活性を示すことが知られている。
【０００３】
第１世代の白金系抗腫瘍剤であり、単純な構造を有するシスプラチンは、腎臓、骨髄及び神経系統に対する強い副作用により、その外に長期使用時に獲得される薬剤耐性及び水に対する低い溶解度により、癌治療の使用に限界がある点で、不利である（D. Lebwohl, R. Canetta, Eur. J. Cancer., 34, 1522(1998)）。
【０００４】
従って、低毒性及び水に対する高い溶解度を有し、その外に、薬剤耐性を克服できる、新しい白金錯化合物の開発のための、多くの研究が全世界的に活発に行われている。その結果、第２世代の白金系抗腫瘍剤として、カルボプラチンが開発され、現在臨床で使用されている（E. Wong, C. M. Giandomenico, Chem. Rev., 99, 2451(1999)）。カルボプラチンにおいて、クロリド陰イオンがジカルボキシラート陰イオンに置換され、それにより、水中の溶解度を改善し、毒性を下げる。
【０００５】
しかしながら、毒性が減少されたにもかかわらず、カルボプラチンは、シスプラチンに比べ、骨髄により強い有害な効果を示し、抗腫瘍活性が低く、そのスペクトルが狭い。それ故、腎臓障害のある卵巣癌又は肺癌患者のみに使用されている。従って、低毒性、高水溶性、高腫瘍組織選択性などを有する次世代抗腫瘍剤の開発が緊急に求められている。
【０００６】
一方、適切な分子量を有する高分子が、固形腫瘍組織における、優先的に強められる浸透性及び保持性を示す発見（L.W. Seymour, Y. Miyamoto, H. Maeda, M. Brereton, J. Strohalem, K. Ulbrich and R. Duncan, Eur. J. Cancer, 31A, 766 (1995)）以来、高腫瘍組織選択性を示す、新たな高分子物質の開発のため、多くの研究が全世界的に行われている。
【０００７】
適切な分子量を有する高分子が、高い腫瘍組織選択性を示すことに、多分２つ理由がある。第１の理由は、高分子の、ナノ粒子などの巨大分子が、通常に配列する細胞からなる正常組織の血管壁は通過できないが、腫瘍組織内の粗悪な血管壁により、その外に、腫瘍組織内の高い血圧により、それが、腫瘍組織内の血管壁を通過できることである。第２の理由は、腫瘍組織には生体高分子及び高分子体の排出路であるリンパ管がないことである。従って、腫瘍組織では、組織の内部に浸透される高分子粒子が正常細胞に比べて、放出され難く（R. Duncan, Parm. Sci. Technol. Today., 2, 441(1999)）、結果的に、血管壁を通して浸透される高分子粒子は腫瘍組織内に選択的に蓄積され（H. Maeda, J. Fang, T. Inutsuka, Inter Immun 3, 319(2003)）、腫瘍組織に対して、高分子の高い選択性を得る。
【０００８】
高分子粒子の、そのような強められる浸透性と保持性（ＥＰＲ）の効果の程度は、血液と組織内の残留時間に密接に依存する。長い血液循環時間を有する高分子は、その強められる浸透性と保持性効果により、潜在的な腫瘍組織選択性を有する高分子とみなし得る。腫瘍組織内の、高分子粒子の長残留時間は、腫瘍組織選択性の必須条件であることが知られている（E. Marecos, R. Weissleder, Bioconjugate Chem. 9, 184 (1998)）。上記効果は特定の高分子において知られており、このことは、ヒトの腫瘍組織における最近の臨床試験から、これら高分子が腫瘍組織に対する高い選択性を有し、それ故、選択的腫瘍治療剤に応用され得ることを提示した。
【０００９】
従って、特定の生体親和性高分子物質を利用する薬物送達システムの開発のための、多くの研究が、全世界的に活発に行われている（A. S. Lundberg and R. A. Weinberg, Eur, J, Cancer, 35, 531-539(1999)）。その試みの幾つかの例は、日本で開発されたＳＭＡＮＣＳ（neocarzinostatin bound to styren-maleinanhydride copolymer)(K. Tsuchia, H. Maeda, Urology, 55, 495(2000)）及びＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）とドキソルビシンの抱合錯体（P. A. Vasey, C. Twelves, Clin. Cancer Res., 5, 83(1999)）を含む。前者のＳＭＡＮＣＳは、最近日本で承認されたが、まだ広く使用されておらず、後者は、まだ臨床での使用について、承認されていない。このような従来の有機高分子の主な不利な点は、これらが生分解性がなく、腫瘍組織に対する選択性が低いということである。
【００１０】
ポリホスファゼンは、米国のオールコックグループ（H. R. Allcock, R. L. Kugel, J. Am. Chem. Soc., 87, 4216(1965)）により最初に合成された、新しいクラスの無機／有機ハイブリッド高分子である。ポリホスファゼンは、高分子の主要要素が燐原子と窒素原子とから相互になり、有機置換基が側鎖として燐原子に結合してなる線状高分子であり、側鎖基の分子構造によって多様に異なる物理的性質を示す。ポリホスファゼン類は、有機高分子が有していない良好な物理的性質を有するが、高価であるために広く使用されず、限定された目的にのみ、使用されてきた。特に、薬物送達物質としてのポリマーは、生体適合性のために５０，０００〜７０，０００ダルトンの最大分子量を有することを求められる一方で、ポリホスファゼン類は、通常の方法で製造される場合、高分子量（Ｍｗ＞１０6ダルトン）のため、薬物送達システムとして開発されなかった。
【００１１】
本発明者らは、ヘキサクロロシクロトリホスファゼン（Ｎ3Ｐ3Ｃｌ6）を出発原料とし、熱重合して、ポリ（ジクロロホスファゼン）、（ＮＰＣｌ2）ｎを製造するため、触媒として使用される塩化アルミニウムの量により、ポリホスファゼンの分子量が調節されることを発見した（Youn Soo Sohn, et al., Macromolecules, 28, 7566 (1995)）。この発見に基づいて、本発明者らは、種々の、新規な薬物伝達物質を開発する研究をしている。特に、最近、本発明者らは、ポリホスファゼンの水溶性及び生分解性が、ポリ（ジクロロポリホスファゼン）の求核置換により、ポリホスファゼンの主要要素に、親水性ポリ（エチレングリコール）と親脂肪性アミノ酸を導入することにより、調節され得ることを発見した（Youn Soo Sohn, et al., Macromolecules, 32, 2188(1999)）。本発明者らは、種々の目的のため、それらを応用する研究を行っている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、その強められる透過性及び保持性効果により、高い腫瘍組織選択性を有する高分子薬物伝達物質を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、高い腫瘍組織選択性及び抗腫瘍効果の能力を有する高分子白金抱合錯体（conjugate）抗腫瘍剤を提供し、そこでは、白金錯体抗腫瘍剤が、前記高分子薬物伝達物質に化学的につながっており、そしてそれらの製法を提供する。
【００１４】
明細書に具体的に記載され、広く記述されている、本発明の上記の及びその他の目的は、ナノサイズ（１０〜１００nm）のポリホスファゼンに白金錯体抗腫瘍剤を抱合させて（conjugate）、高い腫瘍組織選択性を有する、新しいクラスのポリホスファゼン−白金抱合錯体抗腫瘍剤を提供することにより達成される。
【００１５】
本発明の上記の及びその他の目的、特徴、態様（aspect）及び有利な点は、以下の発明の詳細な説明からより明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明により、高い腫瘍組織選択性を有する、新しい高分子抗腫瘍剤が提供され、そこには、白金錯体抗腫瘍剤がナノサイズ（１０〜１００nm）のポリホスファゼンに抱合している（conjugateｄ）。より詳細には、高い腫瘍選択性及び抗腫瘍活性を有するポリホスファゼン−白金抱合錯体が提供され、ここで、白金（II）錯化合物は、ポリジクロロホスファゼンの塩素イオン（Youn Soo Sohn, et al. Macromolecules, 28, 7566 (1995)）をポリ（エチレグリコール）及びジペプチドエチルエステルで置換することにより得られる水溶性の、ナノサイズのポリホスファゼンに化学的につながっている。
【００１７】
従って、本発明は、腫瘍組織に対し、優れた透過性と保持性効果を有し、その外に顕著な抗腫瘍活性を有する新しいクラスのポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体抗腫瘍剤及びその製法に関し、ここで、親水性ポリ（エチレングリコール）と疎水性ジペプチドエチルエステルのモル比が、ポリホスファゼンにおいて最適化されており、スペーサーとして、加水分解されるジペプチドを用いて、このポリホスファゼンに抱合している（conjugated）。
【００１８】
特に、本発明は、下記化学式（１）で表される、腫瘍組織選択性及び生分解性を有するポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体抗癌剤、並びにその製法に関する。
【化４】
【００１９】
上記式中、ｘは、ポリ（エチレングリコール）中のエチレンオキシド繰り返し単位の数を示し、７、１２又は１６であり、ｙは、０〜２の整数であり、ｚは、０．５〜１．５の範囲における、ポリ（エチレングリコール）のモル含量を示し、ｎは、３０〜１００の範囲における、ポリホスファゼンの重合度を示し、Ａ−Ａは、トランス（±）−１，２−ジアミノシクロヘキサン、２，２−ジメチル−１，３−プロパンジアミン及びエチレンジアミンからなる群から選択される、ジアミンを示す。
【００２０】
前記化学式（１）で表されるポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体は、水溶液中で、１０〜１００nmの直径の流体力学体積を有する。
【００２１】
また、本発明は、腫瘍の治療のための、前記化学式（１）で表されるポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体の使用に関する。
【００２２】
前記化学式（１）で表される高分子型ポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体は、以下のように、製造され得る：
【００２３】
本発明による高分子型ポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体を製造する全ての反応工程は、好ましくは、反応系から水分を排除するため、シュレンク管（schlenk line）を使用して、不活性ガス雰囲気で、グローブボックス内で行われ、使用される全ての溶媒は、微量の水分を除去するため、使用前に完全に乾燥される。
【００２４】
第１段階では、下記化学式（２）で表わされるホスファゼン３量体が、既知の方法（Youn Soo Sohn、et al. Macromolecules, 28、7566(1995)）に従い、熱重合され、１０4〜１０5の平均分子量を有する、化学式（３）で表される、線形のポリ（ジクロロホスファゼン）を得る。
【００２５】
【化５】
ここで、ｎは、３０〜１００の範囲における重合度を表わす。
【００２６】
前記の熱重合反応は、前記化学式（２）で表わされるヘキサクロロシクロトリホスファゼン（Ｎ＝ＰＣｌ2）3と、３〜１００重量％の塩化アルミニウム（ＡｌＣｌ3）を、パイレックス（登録商標）反応管中で、混合し、密封し、反応オーブン中、２３０〜２５０℃で３〜５時間、溶融反応に付すことにより行われ、ここで、反応管は、１０〜２０rpmで回転される。
【００２７】
一方、７０〜８０℃の油浴中で、１〜２日間真空乾燥された、化学式（４）で表わされるポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテルを、１．５当量の金属ナトリウムと、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ベンゼン又はトルエンような溶媒中で、反応させ、化学式（５）で表されるポリ（エチレングリコール）のナトリウム塩を得る。
【００２８】
【化６】
【００２９】
上記式中、ｘは、７、１２又は１６の、（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）の繰り返し数を示す。
【００３０】
第２段階では、化学式（５）で表されるナトリウム塩の溶液を、−６０〜−７８℃の温度範囲で、トリエチルアミンの存在下に、化学式（３）で表されるポリ（ジクロロホスファゼン）の溶液に加え、その後、得られる溶液混合物を、室温で、１５〜２０時間攪拌する。使用されるポリ（エチレングリコール）のナトリウム塩の量は、ポリ（ジクロロホスファゼン）のモルあたり、０．５〜１．５当量である。
【００３１】
第３段階では、前記の反応からの部分置換生成物を、１．５〜２．０当量の化学式（６）で表されるジペプチドエステル及び置換されずに残っている塩素１原子当たり３当量のトリエチルアミンと、クロロホルム中、室温で反応させ、化学式（７）で表されるポリホスファゼン誘導体を得る。
【００３２】
【化７】
上記式中、ｙは、０、１又は２である。
【００３３】
前記化学式（６）で表されるジペプチドエチルエステルは、ｙ＝０の場合、グリシルアミノマロナートであり、ｙ＝１の場合、グリシルアスパルタートであり、ｙ＝２の場合、グリシルグルタマートである。
【００３４】
【化８】
上記式中、ｎ、ｘ、ｙ及びｚは、化学式（１）で定義されたものと同じである。
【００３５】
第４段階では、化学式（７）で表されるポリホスファゼン誘導体のジペプチドエチルエステルを、メタノール中で、アルカリを使用して、加水分解し、ジペプチドのアルカリ金属塩を得る。アルカリとして、水酸化バリウム又は水酸化ナトリウムを、化学式（７）で表されるポリホスファゼン誘導体中に存在するジペプチドのモル当たり２．４〜３．０当量の量で、使用することが好ましい。
【００３６】
最後に、上記で得られたジペプチドの金属塩を、水溶液中で、光を遮断し、ジペプチドのモル当たり１．２〜１．５モル量で、下記化学式（８）で表される白金錯体と反応させ、化学式（１）で表される本発明のポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体を得る。
【００３７】
（Ａ−Ａ）ＰｔＬ
（８）
【００３８】
上記式中、Ａ−Ａは、化学式（１）で定義されたものと同じであり、Ｌは、好ましくは、スルファートイオン（ＳＯ42−）及びナイトラートイオン（ＮＯ3−）から選択される、１つ又は２つの陰イオンリガンドを示す。
【００３９】
前述したポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体の製法は、下記反応スキーム（１）に示され得る。
【００４０】
反応スキーム（１）：
【化９】
【００４１】
下記反応スキーム（２）は、ジペプチドエチルエステルの加水分解に、水酸化バリウムの代わりに水酸化ナトリウムを使用する反応工程を示す。
【００４２】
反応スキーム（２）：
【化１０】
上記反応スキーム（１）及び（２）において、ｎ、ｘ、ｙ、ｚ及びＡ−Ａは、化学式（１）で定義されたものと同じである。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明は、次の実施例及び実施態様（embodiment）に言及して、より詳しく説明される。しかしながら、本発明は、それらに限定されない。
以下の実施例において、本発明の化合物の炭素、水素及び窒素の元素分析は、Perkin-Elmer C、H及びＮ分析機を用いて行われた。一方、水素核磁気共鳴スペクトルはBruker DPX-250 NMR分光機を用いて測定され、白金（リン）核磁気共鳴スペクトルはVarian Gemini-300 NMR分光機を用いて測定された。赤外線吸収スペクトルはNicolet Impact 400 FT-IR分光機を用いて測定された。
【００４４】
実施例１
ポリ｛［メトキシポリ（エチレングリコール）３５０］［グリシルグルタマート−トランス（±）−１，２−ジアミノシクロヘキサン白金（II）］ホスファゼン｝、｛ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）1.5［（ＧｌｙＧｌｕ）Ｐｔ（ｄａｃｈ）］0.5）｝nの製造
【００４５】
平均分子量３５０のメトキシポリ（エチレングリコール）（８．８０ｇ、２５．９mmol）及びナトリウム片（０．７ｇ、３０．０mmol）を、乾燥したテトラヒドロフランに加え、得られた混合物をアルゴン気流下で２４時間還流させ、メトキシポリ（エチレングリコール）のナトリウム塩を得た。
【００４６】
触媒として、１０％ＡｌＣｌ3を用いて、製造されたポリ（ジクロロホスファゼン）（２．００ｇ、１７．２mmol）を、乾燥したテトラヒドロフラン（８０ml）に溶解させ、ドライアイス−アセトン浴（−７８℃）中の、得られた溶液に、上記のメトキシポリ（エチレングリコール）のナトリウム塩溶液を３０分間かけて滴下した。３０分後、ドライアイス−アセトン浴を除去し、反応溶液をさらに、室温で、８時間攪拌させた。この溶液に、トリエチルアミン（８．４ｇ、８４．４mmol）とグリシルグルタミン酸ジエチルエステル（４．５ｇ、１５mmol）のクロロホルム（１００ml）溶液を加えた。得られた溶液混合物を、室温で１２時間攪拌させ、その後、さらに、７０℃で、４８時間反応させた。
【００４７】
反応混合物中に生成された沈殿物（Ｅｔ3Ｎ・ＨＣｌ／ＮａＣｌ）を濾過して除去し、濾液を減圧濃縮した。この濃縮液をテトラヒドロフランに溶解させ、それに過剰のエーテル又はヘキサンを加え、沈殿を誘発させた。この工程を２回繰り返した後、沈殿物を少量の水（１００ml）に溶解させ、透析膜（ＭＷＣＯ：３５００）を用いて、１８時間透析し、その後、凍結乾燥して、油状のポリホスファゼン誘導体［ＮＰ（ＭＰＥＧ）1.5（ＧｌｙＧｌｕＥｔ2）0.5］を得た（収率８０％）。
【００４８】
得られたポリホスファゼン誘導体（２．００ｇ、３mmol）をメタノール（５０ml）に溶解させ、それに、Ｂａ（ＯＨ）2・８Ｈ2Ｏ（０．７９ｇ、２．５mmol）のメタノール溶液を加え、加水分解を行った。反応混合物を減圧で濃縮し、メタノールと過剰のエーテルを加え、ポリホスファゼン誘導体のバリウム塩の沈殿を誘発させた。このバリウム塩を少量の水（５０ml）に溶解させ、それに、トランス（±）−１，２−ジアミノシクロヘキサンの白金（II）スルファート、（Ｐｔ（ｄａｃｈ）ＳＯ4 （１．１ｇ、２．５mmol）の水溶液（３０ml）を、０℃で、１０分間かけて、ｐＨ７を維持しながら、滴下した。得られた溶液を４〜６時間攪拌させた後、沈殿物（ＢａＳＯ4）を減圧濾過して除去した。濾液を透析膜（ＭＷＣＯ：３５００）を用いて、蒸留水中で、８時間透析した後、１日間、凍結乾燥して、求める最終生成物、ポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体［ＮＰ（（ＯＣＨ2ＣＨ2）7ＯＣＨ3）1.5−（ＮＨＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯ）ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯ（Ｐｔ（ｄａｃｈ））0.5）］を１．９０ｇ（収率７４％）得た。
【００４９】
組成式：Ｃ29Ｈ58Ｎ3Ｏ14ＰＰｔ
元素分析値：Ｃ（４０．４８），Ｈ（８．１８），Ｎ（６．３３），Ｐｔ（１３．２０）
理論値：Ｃ（４１．１６），Ｈ（７．０８），Ｎ（６．０７），Ｐｔ（１２．８０）
Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：
【化１１】
31Ｐ−核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：δ２０．９１，１８．２
分子量（Ｍｗ）：３６，２１３。
【００５０】
実施例２
ポリ｛［メトキシポリ（エチレングリコール）３５０］［グリシルグルタマート−トランス（±）−１，２−ジアミノシクロヘキサン白金（II）］ホスファゼン｝、｛ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）1.2［（ＧｌｙＧｌｕ）Ｐｔ（ｄａｃｈ）］0.8｝nの製造
【００５１】
実施例１の記載と同一の方法により、分子量３５０のメトキシポリ（エチレングリコール）（７．２４ｇ、２５．３mmol）、ナトリウム金属片（０．６９ｇ、３０mmol）、ポリ（ジクロロホスファゼン）（１０％ＡｌＣｌ3、２．００ｇ、１７．２mmol）、トリエチルアミン（１８．８６ｇ、１８６．３mmol）、及びグリシルグルタミン酸エチルエステル（６．０ｇ、２０．３３mmol）を用いて、ポリホスファゼン誘導体のエチルエステルを製造した。ポリホスファゼン誘導体のエチルエステル（２．０ｇ、２．９７mmol）をＮａＯＨ（０．２ｇ、５．０mmol）で加水分解させ、実施例１の記載の方法により、加水分解物をＰｔ（ｄａｃｈ）ＳＯ4（１．０１ｇ、２．５mmol）と反応させ、目的の生成物であるポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体を収率７０％で得た。
【００５２】
組成式：Ｃ28Ｈ54Ｎ5Ｏ13ＰＰｔ
元素分析値：Ｃ（３８．４５），Ｈ（６．８６），Ｎ（６．６８），Ｐｔ（１３．４）
理論値：Ｃ（３９．５６），Ｈ（６．０８），Ｎ（６．８３），Ｐｔ（１７．８１）
Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：
【化１２】
31Ｐ−核磁気共鳴スペクトル：δ１８．２，２２．３ ppm
分子量（Ｍｗ）：３５，２１３。
【００５３】
実施例３
ポリ｛［メトキシポリ（エチレングリコール）３５０］［グリシルグルタマート−トランス（±）−１，２−ジアミノシクロヘキサン白金（II）］ホスファゼン｝、｛ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）1.0［（ＧｌｙＧｌｕ）Ｐｔ（ｄａｃｈ）］1.0｝nの製造
【００５４】
実施例１の記載と同一の方法により、分子量３５０のメトキシポリ（エチレングリコール）（６．３５ｇ、１７．３mmol）、ナトリウム金属片（１．０ｇ、２５mmol）、ポリ（ジクロロホスファゼン）（１０％ＡｌＣｌ3、２．００ｇ、１７．２mmol）、トリエチルアミン（１８．８６ｇ、１８６．３mmol）、グリシルグルタミン酸エチルエステル（６．１０ｇ、２０．８mmol）、Ｂａ（ＯＨ）2・８Ｈ2Ｏ（１．１１ｇ、３．５mmol）及びＰｔ（ｄａｃｈ）ＳＯ4（１．４２ｇ、３．５mmol）を用いて、目的の生成物である標記ポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体を収率７８．０％で得た。
【００５５】
組成式：Ｃ29Ｈ55Ｎ5Ｏ13ＰＰｔ
元素分析値：Ｃ（３７．５８），Ｈ（６．０８），Ｎ（７．８３），Ｐｔ（２１．１）
理論値：Ｃ（３８．３７），Ｈ（６．１１），Ｎ（７．７１），Ｐｔ（２１．４９）
Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：
【化１３】
31Ｐ−核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：δ２１．８，１８．１
分子量（Ｍｗ）：２４，１９３。
【００５６】
実施例４
ポリ｛［メトキシポリ（エチレングリコール）３５０］［グリシルグルタマート−トランス（±）−１，２−ジアミノシクロヘキサン白金（II）］ホスファゼン｝
、｛ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）1.2［（ＧｌｙＧｌｕ）Ｐｔ（ｄａｃｈ）0.8］｝nの製造
実施例１の記載と同一の方法により、分子量３５０のメトキシポリ（エチレングリコール）（７．２５ｇ、２０．７mmol）、ナトリウム金属片（１．０ｇ、２５mmol）、ポリ（ジクロロホスファゼン）（５％ＡｌＣｌ3、２．００ｇ、１７．２mmol）、トリエチルアミン（１８．８６ｇ、１８６．３mmol）、グリシルグルタミン酸エチルエステル（６．１５ｇ、２０．７mmol）、Ｂａ（ＯＨ）2・８Ｈ2Ｏ（０．７９ｇ、２．５mmol）及びＰｔ（ｄａｃｈ）ＳＯ4（１．１ｇ、２．５mmol）を用いて、目的の生成物である標記のポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体を収率７６％で得た。
【００５７】
組成式：Ｃ28Ｈ54Ｎ5Ｏ14ＰＰｔ・３Ｈ2Ｏ
元素分析値：Ｃ（３６．４５），Ｈ（６．３６），Ｎ（６．６８），Ｐｔ（１３．７）
理論値：Ｃ（３７．１６），Ｈ（６．９３），Ｎ（７．７８），Ｐｔ（１７．０１）
Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：
【化１４】
31Ｐ核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：δ２２．３，１８．３
分子量：６６，５８４。
【００５８】
実施例５
ポリ｛［メトキシポリ（エチレングリコール）３５０］［グリシルグルタマート−トランス（±）−１，２−ジアミノシクロヘキサン白金（II）］ホスファゼン｝、｛ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）1.4［（ＧｌｙＧｌｕ）Ｐｔ（ｄａｃｈ）0.6］nの製造
【００５９】
実施例１の記載と同一の方法により、分子量３５０のメトキシポリ（エチレングリコール）（７．２５ｇ、２０．７mmol）、ナトリウム金属片（１０ｇ、２５mmol）、ポリ（ジクロロホスファゼン）（５％ＡｌＣｌ3、２．００ｇ、１７．２mmol）、トリエチルアミン（１８．８６ｇ、１８６．３mmol）、グリシルグルタミン酸エチルエステル（６．１０ｇ、２０．７mmol）、Ｂａ（ＯＨ）2・８Ｈ2Ｏ（０．７ｇ、２．２mmol）及びＰｔ（ｄａｃｈ）ＳＯ4（０．８９ｇ、２．２mmol）を用いて、目的の生成物であるポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体を収率６９％で得た。
【００６０】
組成式：Ｃ29Ｈ57Ｎ5Ｏ13ＰＰｔ・６Ｈ2Ｏ
元素分析値：Ｃ（３５．６６），Ｈ（６．１８），Ｎ（５．６６），Ｐｔ（１０．６）
理論値：Ｃ（３６．３９），Ｈ（７．０８），Ｎ（６．０９），Ｐｔ（１２．３２）
Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：
【化１５】
31Ｐ核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：δ２２．０，１８．９
分子量：４６，５２７。
【００６１】
実施例６
ポリ｛［メトキシポリ（エチレングリコール）３５０］［グリシルグルタマート−トランス（±）−１，２−ジアミノシクロヘキサン白金（II）］ホスファゼン｝、｛ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）1.12［（ＧｌｙＧｌｕ）Ｐｔ（ｄａｃｈ）0.88］nの製造
実施例１の記載と同一の方法により、分子量３５０のメトキシポリ（エチレングリコール）（６．７８ｇ、１９．３mmol）、ナトリウム金属片（０．５７ｇ、２４．８mmol）、ポリ（ジクロロホスファゼン）（３％ＡｌＣｌ3、２．００ｇ、１７．２mmol）、トリエチルアミン（１８．８６ｇ、１８６．３mmol）、グリシルグルタミン酸エチルエステル（９．０ｇ、２９．０mmol）、Ｂａ（ＯＨ）2・８Ｈ2Ｏ（０．６３ｇ、２．０mmol）及びＰｔ（ｄａｃｈ）ＳＯ4（０．８１ｇ、２．０mmol）を用いて、目的の生成物である標記ポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体を収率７０％で得た。
【００６２】
組成式：Ｃ28Ｈ54Ｎ5Ｏ13ＰＰｔ
元素分析値：Ｃ（３９．４６），Ｈ（６．５６），Ｎ（７．０６）
理論値：Ｃ（３９．５６），Ｈ（６．４５），Ｎ（６．８３）
Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：
【化１６】
31Ｐ核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：δ２３．０，１８．９
分子量（Ｍｗ）：７８，１１９。
【００６３】
実施例７
ポリ｛［メトキシポリ（エチレングリコール）５５０］［（グリシルグルタマート−トランス（±）−１，２−ジアミノシクロヘキサン白金（II）］ホスファゼン｝、｛ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）1.12［（ＧｌｙＧｌｕ）Ｐｔ（ｄａｃｈ）］0.88］nの製造
実施例１の記載と同一の方法により、分子量５５０のメトキシポリ（エチレングリコール）（６．７８ｇ、１９．３mmol）、ナトリウム金属片（０．９ｇ、２２．５mmol）、ポリ（ジクロロホスファゼン）（３％ＡｌＣｌ3、２．００ｇ、１７．３mmol）、トリエチルアミン（１８．９ｇ、１８６．３mmol）、グリシルグルタミン酸エチルエステル（８．４ｇ、２７．０mmol）、Ｂａ（ＯＨ）2・８Ｈ2Ｏ（０．７９ｇ、２．５mmol）及びＰｔ（ｄａｃｈ）ＳＯ4（１．１ｇ、２．５mmol）を用いて、目的の生成物である標記ポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体を収率７０％で得た。
【００６４】
組成式：Ｃ37Ｈ73Ｎ5Ｏ17ＰＰｔ
元素分析値：Ｃ（４０．８６），Ｈ（６．６４），Ｎ（６．４６），Ｐｔ（１９．２５）
理論値：Ｃ（４０．１７），Ｈ（６．６４），Ｎ（８．３３），Ｐｔ（１９．４６）
Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：
【化１７】
31Ｐ核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：δ２２．３，１８．４
分子量（Ｍｗ）：８８，３０４。
【００６５】
実施例８
ポリ｛［メトキシポリ（エチレングリコール）３５０］［グリシルアスパルタート−トランス（±）−１，２−ジアミノシクロヘキサン白金（II）］ホスファゼン｝、｛ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）1.1［（ＧｌｙＡｓｐ）Ｐｔ（ｄａｃｈ）0.9］］nの製造
実施例１の記載と同一の方法により、分子量３５０のメトキシポリ（エチレングリコール）（５．７０ｇ、１９．０mmol）、ナトリウム金属片（１．０ｇ、２５mmol）、ポリ（ジクロロホスファゼン）（３％ＡｌＣｌ3、２ｇ、１７．２mmol）、トリエチルアミン（１８．９ｇ、１８６．３mmol）、グリシルアスパラギン酸エチルエステル（６．１０ｇ、２０．７mmol）、Ｂａ（ＯＨ）2・８Ｈ2Ｏ（０．７９ｇ、２．５mmol）及びＰｔ（ｄａｃｈ）ＳＯ4（１．１ｇ、２．５mmol）を用いて、目的の生成物である標記ポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体を収率７０％で得た。
【００６６】
組成式：Ｃ28Ｈ55Ｎ5Ｏ13ＰＰｔ・６Ｈ2Ｏ
元素分析値：Ｃ（３２．７９），Ｈ（５．２２），Ｎ（６．４８）
理論値：Ｃ（３３．３１），Ｈ（６．５６），Ｎ（７．３５），Ｐｔ（２０．０４）
Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：
【化１８】
31Ｐ核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：δ２２．５，１８．５
分子量（Ｍｗ）：１７１，２３０。
【００６７】
実施例９
ポリ｛［メトキシポリ（エチレングリコール）３５０）［グリシルアミノマロナート−トランス（±）−１，２−ジアミノシクロヘキサン白金（II）］ホスファゼン｝、［ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）1.0（ＧｌｙＭａｌＰｔ（ｄａｃｈ）1.0）］nの製造
実施例１の記載と同一の方法により、分子量３５０のメトキシポリ（エチレングリコール）（６．３５ｇ、１７．３mmol）、ナトリウム金属片（１．０ｇ、２５mmol）、ポリ（ジクロロホスファゼン）（１０％ＡｌＣｌ3、２．００ｇ、１７．２mmol）、トリエチルアミン（１８．８６ｇ、１８６．３mmol）、ジエチルアミノマロン酸（４．２ｇ、２０．８mmol）、Ｂａ（ＯＨ）2・８Ｈ2Ｏ（０．７９ｇ、２．５mmol）及びＰｔ（ｄａｃｈ）ＳＯ4（１．１ｇ、２．５mmol）を用いて、目的の生成物である標記ポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体を収率７８．０％で得た。
【００６８】
組成式：Ｃ29Ｈ55Ｎ5Ｏ13ＰＰｔ
元素分析値：Ｃ（３７．５８），Ｈ（６．０８），Ｎ（７．８３），Ｐｔ（２１．１）
理論値：Ｃ（３８．３７），Ｈ（６．１１），Ｎ（７．７１），Ｐｔ（２１．４９）
Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：
【化１９】
31Ｐ核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：δ２１．８，１８．１
分子量（Ｍｗ）：２４，１９３。
【００６９】
実施例１０
ポリ｛［メトキシポリ（エチレングリコール）７５０］［グリシルグルタマート−トランス（±）−１，２−ジアミノシクロヘキサン白金（II）］ホスファゼン｝、｛ＮＰ（ＭＰＥＧ７５０）1.0［（ＧｌｙＧｌｕ）Ｐｔ（ｄａｃｈ）］1.0］nの製造
【００７０】
実施例１の記載と同一の方法により、分子量７５０のメトキシポリ（エチレングリコール）（１２．９５ｇ、１７．３mmol）、ナトリウム金属片（０．８ｇ、２０mmol）、ポリ（ジクロロホスファゼン）（１０％ＡｌＣｌ3、２．００ｇ、１７．２mmol）、トリエチルアミン（１８．８６ｇ、１８６．３mmol）、グリシルグルタミン酸エチルエステル（７．６３ｇ、２５．９mmol）、Ｂａ（ＯＨ）2・８Ｈ2Ｏ（０．９５ｇ、３．０mmol）及びＰｔ（ｄａｃｈ）ＳＯ4（１．２１ｇ、３．０mmol）を用いて、目的の生成物である標記ポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体を収率７０％で得た。
【００７１】
組成式：Ｃ46Ｈ90Ｎ5Ｏ22ＰＰｔ・６Ｈ2Ｏ
元素分析値：Ｃ（３９．７８１），Ｈ（６．６６），Ｎ（５．６１）
理論値：Ｃ（４０．７３），Ｈ（７．２１），Ｎ（６．１），Ｐｔ（１５．４６）
Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：
【化２０】
31Ｐ核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：δ２２．３，１９．２
分子量（Ｍｗ）：３３，４３３。
【００７２】
実施例１１
ポリ｛［メトキシポリ（エチレングリコール）３５０）［グリシルグルタマート−（２，２−ジメチル−１，３−プロパンジアミン）白金（II）］ホスファゼン｝、｛ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）1.0［（ＧｌｙＧｌｕ）Ｐｔ（dmpda）］1.0］nの製造
実施例１の記載と同一の方法により、分子量３５０のメトキシポリ（エチレングリコール）（５．０１ｇ、１４．３０mmol）、ナトリウム金属片（０．８ｇ、２０mmol）、ポリ（ジクロロホスファゼン）（５％ＡｌＣｌ3、２．００ｇ、１７．２mmol）、トリエチルアミン（１８．９ｇ、１８６．３mmol）、グリシルグルタミン酸エチルエステル（７．６ｇ、２５．９mmol）、Ｂａ（ＯＨ）2・８Ｈ2Ｏ（０．６３ｇ、２．０mmol）及び２，２−ジメチル−１，３−プロパンジアミン（dmpda）の白金（II）硫酸塩、（（dmpda）ＰｔＳＯ4、（０．８１ｇ、２．０mmol）を用いて、目的の生成物である標記ポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体を収率７０％で得た。
【００７３】
組成式：Ｃ28Ｈ54Ｎ5Ｏ14ＰＰｔ・４Ｈ2Ｏ
元素分析値：Ｃ（３５．４１），Ｈ（５．３５２），Ｎ（７．８３１）
理論値：Ｃ（３５．４６），Ｈ（６．８０），Ｎ（７．６４）
Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：
【化２１】
31Ｐ核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：δ２２．４，１８．４
分子量（Ｍｗ）：３２，５５９。
【００７４】
実施例１２
ポリ｛［メトキシポリ（エチレングリコール）３５０］［グリシルグルタマート−エチレンジアミン白金（II）］ホスファゼン｝、｛ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）1.0［（ＧｌｙＧｌｕ）Ｐｔ（ｅｎ）］1.0｝nの製造
【００７５】
実施例１の記載と同一の方法により、分子量３５０のメトキシポリ（エチレングリコール）（５．０１ｇ、１４．３mmol）、ナトリウム金属片（０．８ｇ、２０mmol）、ポリ（ジクロロホスファゼン）（５％ＡｌＣｌ3、２．００ｇ、１７．２mmol）、トリエチルアミン（１８．９ｇ、１８６．３mmol）、グリシルグルタミン酸エチルエステル（７．６ｇ、２５．９mmol）、Ｂａ（ＯＨ）2・８Ｈ2Ｏ（０．９２ｇ、２．９mmol）及びエチレンジアミン（ｅｎ）の白金（II）硫酸塩（Ｐｔ（ｅｎ）ＳＯ4、１．１３ｇ、２．９mmol）を用いて、目的の生成物である標記ポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体を収率７０％で得た。
【００７６】
組成式：Ｃ25Ｈ54Ｎ4Ｏ13ＰＰｔ・４Ｈ2Ｏ
元素分析値：Ｃ（３３．４１），Ｈ（５．３５），Ｎ（７．８３１）
理論値：Ｃ（３３．９２），Ｈ（６．９５３），Ｎ（７．８８）
Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：
【化２２】
31Ｐ核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：δ２２．４，１８．４
分子量（Ｍｗ）：１８，１８２。
【００７７】
実施例１３
ポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体の強められる透過性及び保持性効果の評価
オスのＣ５７ ＢＬ／６Ｎマウス（８−９週令、２５−２７ｇ）を１２時間の間隔の明暗で、４日間順応させ、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞（ＰＢＳに懸濁させた１ｘ１０6細胞）を背部に皮下的に接種した。２週間経過後、腫瘍が直径１０ｍｍに成長した時に、生理食塩に溶かした薬剤（２０mg／kg）を尾静脈に注射した。薬剤投与後、２時間及び２４時間に、動物を犠牲にした。シリンジで、心臓細孔（ｐｕｎｃｔｕｒｅ）により、血液サンプルを採取した。腫瘍組織及び筋肉（正常組織）を動物から除去し、分析のため、−８０℃で保存した。生物サンプル中の薬剤の分析は白金（II）の測定に基づいた。ｃ−Ｈ２ＳＯ４，ｃ−ＨＮＯ３及び最後に王水で処理した後、白金の含量をＩＣＰ−ＭＳで測定した（モデルELAN5000,Perkin Elmwer, Norwalk, CT）。
【００７８】
表１は、ＴＴＲ（（腫瘍組織／正常組織の分布）を示す。表１から、ポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体の分子量が８０，０００〜１００，０００の範囲のときに、最良の腫瘍選択性が達成されたことが分かる。
【００７９】
【表１】
【００８０】
実施例１４
白血病Ｌ１２１０細胞に対するポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体の抗腫瘍活性の評価
白血病Ｌ１２１０細胞に対する、本発明のポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体の抗腫瘍活性を、公知の方法（S. S. Lee, O. -S. Jung, C. O. Lee, S. U. Choi, M. -J. Jun, Y. S. Sohn, Inorg. Chim. Acta, 239, 133(1995)）にしたがって、評価した。その結果を表２に示す。
【００８１】
【表２】
【００８２】
実施例１５
胃腫瘍細胞（ＹＣＣ−３）に対するポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体の抗腫瘍活性の生体内（in vivo）異種移植（xenograft）
胃腫瘍細胞（ＹＣＣ−３）に対する本抱合錯体薬剤の生体内感受性を、ｎｕ／ｎｕマウス（６−８週令、２０−２５ｇ）を用いて、評価した。０．２５％のトリプシン−ＥＤＴＡで処理した後、培養された腫瘍細胞を、ＰＢＳ溶液で５分間遠心分離した。この工程を３回以上繰り返した後、腫瘍細胞を単一浮遊腫瘍細胞にした。ＰＢＳ溶液中の腫瘍細胞の濃度を血球計により測定された細胞数から計算した。１００μlのＰＢＳ溶液中の単一浮遊腫瘍細胞（４ｘ１０7）を、１mlのシリンジを用いて、各」マウスの右側に、皮下的に注射した。
【００８３】
腫瘍が０．５cm3の大きさになるように成長したときに、試験薬剤を、１００μlのＰＢＳ溶液中の２つの投与量（６０mg／kg及び３０mg／kg）で、腹腔内注射で、投与した。対照群の場合には、同一量のＰＢＳ溶液のみを注射した。２日毎に、マウスの体重と腫瘍の大きさを測定した。腫瘍の大きさは、長さ×広さ×広さ／２の式により計算した。
【００８４】
その結果を表３に示す。表から、従来のシスプラチンの場合、腫瘍組織の成長速度は、対照群のそれと大きな差がなく、一方、本発明の実施例３の化合物の場合、腫瘍組織の成長速度の阻害効果が、試験薬剤の注射から６０日後において、シスプラチンのそれと比べて、優れていた。したがって、本発明の化合物の抗腫瘍活性が従来の抗腫瘍剤のそれより優れていることが発見された。
【００８５】
【表３】
上述のように、良好な腫瘍選択性及び抗癌活性を有する、本発明のポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体が提供された。本発明のポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体は高い腫瘍選択性を示し、よって、それは、高い応答速度と低い不利な効果をともなう新しい抗腫瘍剤として、広く使用され得る。
【００８６】
本発明は、それの特質又は本質的な特徴から外れることなく、種々の形態で、実施態様化されているから、他に特定されないなら、上述の実施態様が前記の記述の詳細により限定されないと理解され、むしろ、添えられているクレームで定義されているように、その特質及び範囲内で、広く解釈されるべきである。ゆえに、クレームの境界及び領域内入るすべての変更及び修飾、又はそのような変更及び修飾の均等物は、添えられているクレームに包含されるように意図されている。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍組織選択性及び生分解性のポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体抗腫瘍剤、及びその製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
白金（II）系抗腫瘍剤、例えば、シスプラチン又はカルボプラチンは、全世界的に、最も広く使用されている抗癌剤の１つであり、特に、睾丸癌、卵巣癌、膀胱癌などに優れた坑腫瘍活性を示すことが知られている。
【０００３】
第１世代の白金系抗腫瘍剤であり、単純な構造を有するシスプラチンは、腎臓、骨髄及び神経系統に対する強い副作用により、その外に長期使用時に獲得される薬剤耐性及び水に対する低い溶解度により、癌治療の使用に限界がある点で、不利である（D. Lebwohl, R. Canetta, Eur. J. Cancer., 34, 1522(1998)）。
【０００４】
従って、低毒性及び水に対する高い溶解度を有し、その外に、薬剤耐性を克服できる、新しい白金錯化合物の開発のための、多くの研究が全世界的に活発に行われている。その結果、第２世代の白金系抗腫瘍剤として、カルボプラチンが開発され、現在臨床で使用されている（E. Wong, C. M. Giandomenico, Chem. Rev., 99, 2451(1999)）。カルボプラチンにおいて、クロリド陰イオンがジカルボキシラート陰イオンに置換され、それにより、水中の溶解度を改善し、毒性を下げる。
【０００５】
しかしながら、毒性が減少されたにもかかわらず、カルボプラチンは、シスプラチンに比べ、骨髄により強い有害な効果を示し、抗腫瘍活性が低く、そのスペクトルが狭い。それ故、腎臓障害のある卵巣癌又は肺癌患者のみに使用されている。従って、低毒性、高水溶性、高腫瘍組織選択性などを有する次世代抗腫瘍剤の開発が緊急に求められている。
【０００６】
一方、適切な分子量を有する高分子が、固形腫瘍組織における、優先的に強められる浸透性及び保持性を示す発見（L.W. Seymour, Y. Miyamoto, H. Maeda, M. Brereton, J. Strohalem, K. Ulbrich and R. Duncan, Eur. J. Cancer, 31A, 766 (1995)）以来、高腫瘍組織選択性を示す、新たな高分子物質の開発のため、多くの研究が全世界的に行われている。
【０００７】
適切な分子量を有する高分子が、高い腫瘍組織選択性を示すことに、多分２つ理由がある。第１の理由は、高分子の、ナノ粒子などの巨大分子が、通常に配列する細胞からなる正常組織の血管壁は通過できないが、腫瘍組織内の粗悪な血管壁により、その外に、腫瘍組織内の高い血圧により、それが、腫瘍組織内の血管壁を通過できることである。第２の理由は、腫瘍組織には生体高分子及び高分子体の排出路であるリンパ管がないことである。従って、腫瘍組織では、組織の内部に浸透される高分子粒子が正常細胞に比べて、放出され難く（R. Duncan, Parm. Sci. Technol. Today., 2, 441(1999)）、結果的に、血管壁を通して浸透される高分子粒子は腫瘍組織内に選択的に蓄積され（H. Maeda, J. Fang, T. Inutsuka, Inter Immun 3, 319(2003)）、腫瘍組織に対して、高分子の高い選択性を得る。
【０００８】
高分子粒子の、そのような強められる浸透性と保持性（ＥＰＲ）の効果の程度は、血液と組織内の残留時間に密接に依存する。長い血液循環時間を有する高分子は、その強められる浸透性と保持性効果により、潜在的な腫瘍組織選択性を有する高分子とみなし得る。腫瘍組織内の、高分子粒子の長残留時間は、腫瘍組織選択性の必須条件であることが知られている（E. Marecos, R. Weissleder, Bioconjugate Chem. 9, 184 (1998)）。上記効果は特定の高分子において知られており、このことは、ヒトの腫瘍組織における最近の臨床試験から、これら高分子が腫瘍組織に対する高い選択性を有し、それ故、選択的腫瘍治療剤に応用され得ることを提示した。
【０００９】
従って、特定の生体親和性高分子物質を利用する薬物送達システムの開発のための、多くの研究が、全世界的に活発に行われている（A. S. Lundberg and R. A. Weinberg, Eur, J, Cancer, 35, 531-539(1999)）。その試みの幾つかの例は、日本で開発されたＳＭＡＮＣＳ（neocarzinostatin bound to styren-maleinanhydride copolymer)(K. Tsuchia, H. Maeda, Urology, 55, 495(2000)）及びＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）とドキソルビシンの抱合錯体（P. A. Vasey, C. Twelves, Clin. Cancer Res., 5, 83(1999)）を含む。前者のＳＭＡＮＣＳは、最近日本で承認されたが、まだ広く使用されておらず、後者は、まだ臨床での使用について、承認されていない。このような従来の有機高分子の主な不利な点は、これらが生分解性がなく、腫瘍組織に対する選択性が低いということである。
【００１０】
ポリホスファゼンは、米国のオールコックグループ（H. R. Allcock, R. L. Kugel, J. Am. Chem. Soc., 87, 4216(1965)）により最初に合成された、新しいクラスの無機／有機ハイブリッド高分子である。ポリホスファゼンは、高分子の主要要素が燐原子と窒素原子とから相互になり、有機置換基が側鎖として燐原子に結合してなる線状高分子であり、側鎖基の分子構造によって多様に異なる物理的性質を示す。ポリホスファゼン類は、有機高分子が有していない良好な物理的性質を有するが、高価であるために広く使用されず、限定された目的にのみ、使用されてきた。特に、薬物送達物質としてのポリマーは、生体適合性のために５０，０００〜７０，０００ダルトンの最大分子量を有することを求められる一方で、ポリホスファゼン類は、通常の方法で製造される場合、高分子量（Ｍｗ＞１０6ダルトン）のため、薬物送達システムとして開発されなかった。
【００１１】
本発明者らは、ヘキサクロロシクロトリホスファゼン（Ｎ3Ｐ3Ｃｌ6）を出発原料とし、熱重合して、ポリ（ジクロロホスファゼン）、（ＮＰＣｌ2）ｎを製造するため、触媒として使用される塩化アルミニウムの量により、ポリホスファゼンの分子量が調節されることを発見した（Youn Soo Sohn, et al., Macromolecules, 28, 7566 (1995)）。この発見に基づいて、本発明者らは、種々の、新規な薬物伝達物質を開発する研究をしている。特に、最近、本発明者らは、ポリホスファゼンの水溶性及び生分解性が、ポリ（ジクロロポリホスファゼン）の求核置換により、ポリホスファゼンの主要要素に、親水性ポリ（エチレングリコール）と親脂肪性アミノ酸を導入することにより、調節され得ることを発見した（Youn Soo Sohn, et al., Macromolecules, 32, 2188(1999)）。本発明者らは、種々の目的のため、それらを応用する研究を行っている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、その強められる透過性及び保持性効果により、高い腫瘍組織選択性を有する高分子薬物伝達物質を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、高い腫瘍組織選択性及び抗腫瘍効果の能力を有する高分子白金抱合錯体（conjugate）抗腫瘍剤を提供し、そこでは、白金錯体抗腫瘍剤が、前記高分子薬物伝達物質に化学的につながっており、そしてそれらの製法を提供する。
【００１４】
明細書に具体的に記載され、広く記述されている、本発明の上記の及びその他の目的は、ナノサイズ（１０〜１００nm）のポリホスファゼンに白金錯体抗腫瘍剤を抱合させて（conjugate）、高い腫瘍組織選択性を有する、新しいクラスのポリホスファゼン−白金抱合錯体抗腫瘍剤を提供することにより達成される。
【００１５】
本発明の上記の及びその他の目的、特徴、態様（aspect）及び有利な点は、以下の発明の詳細な説明からより明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明により、高い腫瘍組織選択性を有する、新しい高分子抗腫瘍剤が提供され、そこには、白金錯体抗腫瘍剤がナノサイズ（１０〜１００nm）のポリホスファゼンに抱合している（conjugateｄ）。より詳細には、高い腫瘍選択性及び抗腫瘍活性を有するポリホスファゼン−白金抱合錯体が提供され、ここで、白金（II）錯化合物は、ポリジクロロホスファゼンの塩素イオン（Youn Soo Sohn, et al. Macromolecules, 28, 7566 (1995)）をポリ（エチレグリコール）及びジペプチドエチルエステルで置換することにより得られる水溶性の、ナノサイズのポリホスファゼンに化学的につながっている。
【００１７】
従って、本発明は、腫瘍組織に対し、優れた透過性と保持性効果を有し、その外に顕著な抗腫瘍活性を有する新しいクラスのポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体抗腫瘍剤及びその製法に関し、ここで、親水性ポリ（エチレングリコール）と疎水性ジペプチドエチルエステルのモル比が、ポリホスファゼンにおいて最適化されており、スペーサーとして、加水分解されるジペプチドを用いて、このポリホスファゼンに抱合している（conjugated）。
【００１８】
特に、本発明は、下記化学式（１）で表される、腫瘍組織選択性及び生分解性を有するポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体抗癌剤、並びにその製法に関する。
【化４】
【００１９】
上記式中、ｘは、ポリ（エチレングリコール）中のエチレンオキシド繰り返し単位の数を示し、７、１２又は１６であり、ｙは、０〜２の整数であり、ｚは、０．５〜１．５の範囲における、ポリ（エチレングリコール）のモル含量を示し、ｎは、３０〜１００の範囲における、ポリホスファゼンの重合度を示し、Ａ−Ａは、トランス（±）−１，２−ジアミノシクロヘキサン、２，２−ジメチル−１，３−プロパンジアミン及びエチレンジアミンからなる群から選択される、ジアミンを示す。
【００２０】
前記化学式（１）で表されるポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体は、水溶液中で、１０〜１００nmの直径の流体力学体積を有する。
【００２１】
また、本発明は、腫瘍の治療のための、前記化学式（１）で表されるポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体の使用に関する。
【００２２】
前記化学式（１）で表される高分子型ポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体は、以下のように、製造され得る：
【００２３】
本発明による高分子型ポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体を製造する全ての反応工程は、好ましくは、反応系から水分を排除するため、シュレンク管（schlenk line）を使用して、不活性ガス雰囲気で、グローブボックス内で行われ、使用される全ての溶媒は、微量の水分を除去するため、使用前に完全に乾燥される。
【００２４】
第１段階では、下記化学式（２）で表わされるホスファゼン３量体が、既知の方法（Youn Soo Sohn、et al. Macromolecules, 28、7566(1995)）に従い、熱重合され、１０4〜１０5の平均分子量を有する、化学式（３）で表される、線形のポリ（ジクロロホスファゼン）を得る。
【００２５】
【化５】
ここで、ｎは、３０〜１００の範囲における重合度を表わす。
【００２６】
前記の熱重合反応は、前記化学式（２）で表わされるヘキサクロロシクロトリホスファゼン（Ｎ＝ＰＣｌ2）3と、３〜１００重量％の塩化アルミニウム（ＡｌＣｌ3）を、パイレックス（登録商標）反応管中で、混合し、密封し、反応オーブン中、２３０〜２５０℃で３〜５時間、溶融反応に付すことにより行われ、ここで、反応管は、１０〜２０rpmで回転される。
【００２７】
一方、７０〜８０℃の油浴中で、１〜２日間真空乾燥された、化学式（４）で表わされるポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテルを、１．５当量の金属ナトリウムと、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ベンゼン又はトルエンような溶媒中で、反応させ、化学式（５）で表されるポリ（エチレングリコール）のナトリウム塩を得る。
【００２８】
【化６】
【００２９】
上記式中、ｘは、７、１２又は１６の、（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）の繰り返し数を示す。
【００３０】
第２段階では、化学式（５）で表されるナトリウム塩の溶液を、−６０〜−７８℃の温度範囲で、トリエチルアミンの存在下に、化学式（３）で表されるポリ（ジクロロホスファゼン）の溶液に加え、その後、得られる溶液混合物を、室温で、１５〜２０時間攪拌する。使用されるポリ（エチレングリコール）のナトリウム塩の量は、ポリ（ジクロロホスファゼン）のモルあたり、０．５〜１．５当量である。
【００３１】
第３段階では、前記の反応からの部分置換生成物を、１．５〜２．０当量の化学式（６）で表されるジペプチドエステル及び置換されずに残っている塩素１原子当たり３当量のトリエチルアミンと、クロロホルム中、室温で反応させ、化学式（７）で表されるポリホスファゼン誘導体を得る。
【００３２】
【化７】
上記式中、ｙは、０、１又は２である。
【００３３】
前記化学式（６）で表されるジペプチドエチルエステルは、ｙ＝０の場合、グリシルアミノマロナートであり、ｙ＝１の場合、グリシルアスパルタートであり、ｙ＝２の場合、グリシルグルタマートである。
【００３４】
【化８】
上記式中、ｎ、ｘ、ｙ及びｚは、化学式（１）で定義されたものと同じである。
【００３５】
第４段階では、化学式（７）で表されるポリホスファゼン誘導体のジペプチドエチルエステルを、メタノール中で、アルカリを使用して、加水分解し、ジペプチドのアルカリ金属塩を得る。アルカリとして、水酸化バリウム又は水酸化ナトリウムを、化学式（７）で表されるポリホスファゼン誘導体中に存在するジペプチドのモル当たり２．４〜３．０当量の量で、使用することが好ましい。
【００３６】
最後に、上記で得られたジペプチドの金属塩を、水溶液中で、光を遮断し、ジペプチドのモル当たり１．２〜１．５モル量で、下記化学式（８）で表される白金錯体と反応させ、化学式（１）で表される本発明のポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体を得る。
【００３７】
（Ａ−Ａ）ＰｔＬ
（８）
【００３８】
上記式中、Ａ−Ａは、化学式（１）で定義されたものと同じであり、Ｌは、好ましくは、スルファートイオン（ＳＯ42−）及びナイトラートイオン（ＮＯ3−）から選択される、１つ又は２つの陰イオンリガンドを示す。
【００３９】
前述したポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体の製法は、下記反応スキーム（１）に示され得る。
【００４０】
反応スキーム（１）：
【化９】
【００４１】
下記反応スキーム（２）は、ジペプチドエチルエステルの加水分解に、水酸化バリウムの代わりに水酸化ナトリウムを使用する反応工程を示す。
【００４２】
反応スキーム（２）：
【化１０】
上記反応スキーム（１）及び（２）において、ｎ、ｘ、ｙ、ｚ及びＡ−Ａは、化学式（１）で定義されたものと同じである。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明は、次の実施例及び実施態様（embodiment）に言及して、より詳しく説明される。しかしながら、本発明は、それらに限定されない。
以下の実施例において、本発明の化合物の炭素、水素及び窒素の元素分析は、Perkin-Elmer C、H及びＮ分析機を用いて行われた。一方、水素核磁気共鳴スペクトルはBruker DPX-250 NMR分光機を用いて測定され、白金（リン）核磁気共鳴スペクトルはVarian Gemini-300 NMR分光機を用いて測定された。赤外線吸収スペクトルはNicolet Impact 400 FT-IR分光機を用いて測定された。
【００４４】
実施例１
ポリ｛［メトキシポリ（エチレングリコール）３５０］［グリシルグルタマート−トランス（±）−１，２−ジアミノシクロヘキサン白金（II）］ホスファゼン｝、｛ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）1.5［（ＧｌｙＧｌｕ）Ｐｔ（ｄａｃｈ）］0.5）｝nの製造
【００４５】
平均分子量３５０のメトキシポリ（エチレングリコール）（８．８０ｇ、２５．９mmol）及びナトリウム片（０．７ｇ、３０．０mmol）を、乾燥したテトラヒドロフランに加え、得られた混合物をアルゴン気流下で２４時間還流させ、メトキシポリ（エチレングリコール）のナトリウム塩を得た。
【００４６】
触媒として、１０％ＡｌＣｌ3を用いて、製造されたポリ（ジクロロホスファゼン）（２．００ｇ、１７．２mmol）を、乾燥したテトラヒドロフラン（８０ml）に溶解させ、ドライアイス−アセトン浴（−７８℃）中の、得られた溶液に、上記のメトキシポリ（エチレングリコール）のナトリウム塩溶液を３０分間かけて滴下した。３０分後、ドライアイス−アセトン浴を除去し、反応溶液をさらに、室温で、８時間攪拌させた。この溶液に、トリエチルアミン（８．４ｇ、８４．４mmol）とグリシルグルタミン酸ジエチルエステル（４．５ｇ、１５mmol）のクロロホルム（１００ml）溶液を加えた。得られた溶液混合物を、室温で１２時間攪拌させ、その後、さらに、７０℃で、４８時間反応させた。
【００４７】
反応混合物中に生成された沈殿物（Ｅｔ3Ｎ・ＨＣｌ／ＮａＣｌ）を濾過して除去し、濾液を減圧濃縮した。この濃縮液をテトラヒドロフランに溶解させ、それに過剰のエーテル又はヘキサンを加え、沈殿を誘発させた。この工程を２回繰り返した後、沈殿物を少量の水（１００ml）に溶解させ、透析膜（ＭＷＣＯ：３５００）を用いて、１８時間透析し、その後、凍結乾燥して、油状のポリホスファゼン誘導体［ＮＰ（ＭＰＥＧ）1.5（ＧｌｙＧｌｕＥｔ2）0.5］を得た（収率８０％）。
【００４８】
得られたポリホスファゼン誘導体（２．００ｇ、３mmol）をメタノール（５０ml）に溶解させ、それに、Ｂａ（ＯＨ）2・８Ｈ2Ｏ（０．７９ｇ、２．５mmol）のメタノール溶液を加え、加水分解を行った。反応混合物を減圧で濃縮し、メタノールと過剰のエーテルを加え、ポリホスファゼン誘導体のバリウム塩の沈殿を誘発させた。このバリウム塩を少量の水（５０ml）に溶解させ、それに、トランス（±）−１，２−ジアミノシクロヘキサンの白金（II）スルファート、（Ｐｔ（ｄａｃｈ）ＳＯ4 （１．１ｇ、２．５mmol）の水溶液（３０ml）を、０℃で、１０分間かけて、ｐＨ７を維持しながら、滴下した。得られた溶液を４〜６時間攪拌させた後、沈殿物（ＢａＳＯ4）を減圧濾過して除去した。濾液を透析膜（ＭＷＣＯ：３５００）を用いて、蒸留水中で、８時間透析した後、１日間、凍結乾燥して、求める最終生成物、ポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体［ＮＰ（（ＯＣＨ2ＣＨ2）7ＯＣＨ3）1.5−（ＮＨＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯ）ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯ（Ｐｔ（ｄａｃｈ））0.5）］を１．９０ｇ（収率７４％）得た。
【００４９】
組成式：Ｃ29Ｈ58Ｎ3Ｏ14ＰＰｔ
元素分析値：Ｃ（４０．４８），Ｈ（８．１８），Ｎ（６．３３），Ｐｔ（１３．２０）
理論値：Ｃ（４１．１６），Ｈ（７．０８），Ｎ（６．０７），Ｐｔ（１２．８０）
Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：
【化１１】
31Ｐ−核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：δ２０．９１，１８．２
分子量（Ｍｗ）：３６，２１３。
【００５０】
実施例２
ポリ｛［メトキシポリ（エチレングリコール）３５０］［グリシルグルタマート−トランス（±）−１，２−ジアミノシクロヘキサン白金（II）］ホスファゼン｝、｛ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）1.2［（ＧｌｙＧｌｕ）Ｐｔ（ｄａｃｈ）］0.8｝nの製造
【００５１】
実施例１の記載と同一の方法により、分子量３５０のメトキシポリ（エチレングリコール）（７．２４ｇ、２５．３mmol）、ナトリウム金属片（０．６９ｇ、３０mmol）、ポリ（ジクロロホスファゼン）（１０％ＡｌＣｌ3、２．００ｇ、１７．２mmol）、トリエチルアミン（１８．８６ｇ、１８６．３mmol）、及びグリシルグルタミン酸エチルエステル（６．０ｇ、２０．３３mmol）を用いて、ポリホスファゼン誘導体のエチルエステルを製造した。ポリホスファゼン誘導体のエチルエステル（２．０ｇ、２．９７mmol）をＮａＯＨ（０．２ｇ、５．０mmol）で加水分解させ、実施例１の記載の方法により、加水分解物をＰｔ（ｄａｃｈ）ＳＯ4（１．０１ｇ、２．５mmol）と反応させ、目的の生成物であるポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体を収率７０％で得た。
【００５２】
組成式：Ｃ28Ｈ54Ｎ5Ｏ13ＰＰｔ
元素分析値：Ｃ（３８．４５），Ｈ（６．８６），Ｎ（６．６８），Ｐｔ（１３．４）
理論値：Ｃ（３９．５６），Ｈ（６．０８），Ｎ（６．８３），Ｐｔ（１７．８１）
Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：
【化１２】
31Ｐ−核磁気共鳴スペクトル：δ１８．２，２２．３ ppm
分子量（Ｍｗ）：３５，２１３。
【００５３】
実施例３
ポリ｛［メトキシポリ（エチレングリコール）３５０］［グリシルグルタマート−トランス（±）−１，２−ジアミノシクロヘキサン白金（II）］ホスファゼン｝、｛ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）1.0［（ＧｌｙＧｌｕ）Ｐｔ（ｄａｃｈ）］1.0｝nの製造
【００５４】
実施例１の記載と同一の方法により、分子量３５０のメトキシポリ（エチレングリコール）（６．３５ｇ、１７．３mmol）、ナトリウム金属片（１．０ｇ、２５mmol）、ポリ（ジクロロホスファゼン）（１０％ＡｌＣｌ3、２．００ｇ、１７．２mmol）、トリエチルアミン（１８．８６ｇ、１８６．３mmol）、グリシルグルタミン酸エチルエステル（６．１０ｇ、２０．８mmol）、Ｂａ（ＯＨ）2・８Ｈ2Ｏ（１．１１ｇ、３．５mmol）及びＰｔ（ｄａｃｈ）ＳＯ4（１．４２ｇ、３．５mmol）を用いて、目的の生成物である標記ポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体を収率７８．０％で得た。
【００５５】
組成式：Ｃ29Ｈ55Ｎ5Ｏ13ＰＰｔ
元素分析値：Ｃ（３７．５８），Ｈ（６．０８），Ｎ（７．８３），Ｐｔ（２１．１）
理論値：Ｃ（３８．３７），Ｈ（６．１１），Ｎ（７．７１），Ｐｔ（２１．４９）
Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：
【化１３】
31Ｐ−核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：δ２１．８，１８．１
分子量（Ｍｗ）：２４，１９３。
【００５６】
実施例４
ポリ｛［メトキシポリ（エチレングリコール）３５０］［グリシルグルタマート−トランス（±）−１，２−ジアミノシクロヘキサン白金（II）］ホスファゼン｝
、｛ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）1.2［（ＧｌｙＧｌｕ）Ｐｔ（ｄａｃｈ）0.8］｝nの製造
実施例１の記載と同一の方法により、分子量３５０のメトキシポリ（エチレングリコール）（７．２５ｇ、２０．７mmol）、ナトリウム金属片（１．０ｇ、２５mmol）、ポリ（ジクロロホスファゼン）（５％ＡｌＣｌ3、２．００ｇ、１７．２mmol）、トリエチルアミン（１８．８６ｇ、１８６．３mmol）、グリシルグルタミン酸エチルエステル（６．１５ｇ、２０．７mmol）、Ｂａ（ＯＨ）2・８Ｈ2Ｏ（０．７９ｇ、２．５mmol）及びＰｔ（ｄａｃｈ）ＳＯ4（１．１ｇ、２．５mmol）を用いて、目的の生成物である標記のポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体を収率７６％で得た。
【００５７】
組成式：Ｃ28Ｈ54Ｎ5Ｏ14ＰＰｔ・３Ｈ2Ｏ
元素分析値：Ｃ（３６．４５），Ｈ（６．３６），Ｎ（６．６８），Ｐｔ（１３．７）
理論値：Ｃ（３７．１６），Ｈ（６．９３），Ｎ（７．７８），Ｐｔ（１７．０１）
Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：
【化１４】
31Ｐ核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：δ２２．３，１８．３
分子量：６６，５８４。
【００５８】
実施例５
ポリ｛［メトキシポリ（エチレングリコール）３５０］［グリシルグルタマート−トランス（±）−１，２−ジアミノシクロヘキサン白金（II）］ホスファゼン｝、｛ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）1.4［（ＧｌｙＧｌｕ）Ｐｔ（ｄａｃｈ）0.6］nの製造
【００５９】
実施例１の記載と同一の方法により、分子量３５０のメトキシポリ（エチレングリコール）（７．２５ｇ、２０．７mmol）、ナトリウム金属片（１０ｇ、２５mmol）、ポリ（ジクロロホスファゼン）（５％ＡｌＣｌ3、２．００ｇ、１７．２mmol）、トリエチルアミン（１８．８６ｇ、１８６．３mmol）、グリシルグルタミン酸エチルエステル（６．１０ｇ、２０．７mmol）、Ｂａ（ＯＨ）2・８Ｈ2Ｏ（０．７ｇ、２．２mmol）及びＰｔ（ｄａｃｈ）ＳＯ4（０．８９ｇ、２．２mmol）を用いて、目的の生成物であるポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体を収率６９％で得た。
【００６０】
組成式：Ｃ29Ｈ57Ｎ5Ｏ13ＰＰｔ・６Ｈ2Ｏ
元素分析値：Ｃ（３５．６６），Ｈ（６．１８），Ｎ（５．６６），Ｐｔ（１０．６）
理論値：Ｃ（３６．３９），Ｈ（７．０８），Ｎ（６．０９），Ｐｔ（１２．３２）
Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：
【化１５】
31Ｐ核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：δ２２．０，１８．９
分子量：４６，５２７。
【００６１】
実施例６
ポリ｛［メトキシポリ（エチレングリコール）３５０］［グリシルグルタマート−トランス（±）−１，２−ジアミノシクロヘキサン白金（II）］ホスファゼン｝、｛ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）1.12［（ＧｌｙＧｌｕ）Ｐｔ（ｄａｃｈ）0.88］nの製造
実施例１の記載と同一の方法により、分子量３５０のメトキシポリ（エチレングリコール）（６．７８ｇ、１９．３mmol）、ナトリウム金属片（０．５７ｇ、２４．８mmol）、ポリ（ジクロロホスファゼン）（３％ＡｌＣｌ3、２．００ｇ、１７．２mmol）、トリエチルアミン（１８．８６ｇ、１８６．３mmol）、グリシルグルタミン酸エチルエステル（９．０ｇ、２９．０mmol）、Ｂａ（ＯＨ）2・８Ｈ2Ｏ（０．６３ｇ、２．０mmol）及びＰｔ（ｄａｃｈ）ＳＯ4（０．８１ｇ、２．０mmol）を用いて、目的の生成物である標記ポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体を収率７０％で得た。
【００６２】
組成式：Ｃ28Ｈ54Ｎ5Ｏ13ＰＰｔ
元素分析値：Ｃ（３９．４６），Ｈ（６．５６），Ｎ（７．０６）
理論値：Ｃ（３９．５６），Ｈ（６．４５），Ｎ（６．８３）
Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：
【化１６】
31Ｐ核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：δ２３．０，１８．９
分子量（Ｍｗ）：７８，１１９。
【００６３】
実施例７
ポリ｛［メトキシポリ（エチレングリコール）５５０］［（グリシルグルタマート−トランス（±）−１，２−ジアミノシクロヘキサン白金（II）］ホスファゼン｝、｛ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）1.12［（ＧｌｙＧｌｕ）Ｐｔ（ｄａｃｈ）］0.88］nの製造
実施例１の記載と同一の方法により、分子量５５０のメトキシポリ（エチレングリコール）（６．７８ｇ、１９．３mmol）、ナトリウム金属片（０．９ｇ、２２．５mmol）、ポリ（ジクロロホスファゼン）（３％ＡｌＣｌ3、２．００ｇ、１７．３mmol）、トリエチルアミン（１８．９ｇ、１８６．３mmol）、グリシルグルタミン酸エチルエステル（８．４ｇ、２７．０mmol）、Ｂａ（ＯＨ）2・８Ｈ2Ｏ（０．７９ｇ、２．５mmol）及びＰｔ（ｄａｃｈ）ＳＯ4（１．１ｇ、２．５mmol）を用いて、目的の生成物である標記ポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体を収率７０％で得た。
【００６４】
組成式：Ｃ37Ｈ73Ｎ5Ｏ17ＰＰｔ
元素分析値：Ｃ（４０．８６），Ｈ（６．６４），Ｎ（６．４６），Ｐｔ（１９．２５）
理論値：Ｃ（４０．１７），Ｈ（６．６４），Ｎ（８．３３），Ｐｔ（１９．４６）
Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：
【化１７】
31Ｐ核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：δ２２．３，１８．４
分子量（Ｍｗ）：８８，３０４。
【００６５】
実施例８
ポリ｛［メトキシポリ（エチレングリコール）３５０］［グリシルアスパルタート−トランス（±）−１，２−ジアミノシクロヘキサン白金（II）］ホスファゼン｝、｛ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）1.1［（ＧｌｙＡｓｐ）Ｐｔ（ｄａｃｈ）0.9］］nの製造
実施例１の記載と同一の方法により、分子量３５０のメトキシポリ（エチレングリコール）（５．７０ｇ、１９．０mmol）、ナトリウム金属片（１．０ｇ、２５mmol）、ポリ（ジクロロホスファゼン）（３％ＡｌＣｌ3、２ｇ、１７．２mmol）、トリエチルアミン（１８．９ｇ、１８６．３mmol）、グリシルアスパラギン酸エチルエステル（６．１０ｇ、２０．７mmol）、Ｂａ（ＯＨ）2・８Ｈ2Ｏ（０．７９ｇ、２．５mmol）及びＰｔ（ｄａｃｈ）ＳＯ4（１．１ｇ、２．５mmol）を用いて、目的の生成物である標記ポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体を収率７０％で得た。
【００６６】
組成式：Ｃ28Ｈ55Ｎ5Ｏ13ＰＰｔ・６Ｈ2Ｏ
元素分析値：Ｃ（３２．７９），Ｈ（５．２２），Ｎ（６．４８）
理論値：Ｃ（３３．３１），Ｈ（６．５６），Ｎ（７．３５），Ｐｔ（２０．０４）
Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：
【化１８】
31Ｐ核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：δ２２．５，１８．５
分子量（Ｍｗ）：１７１，２３０。
【００６７】
実施例９
ポリ｛［メトキシポリ（エチレングリコール）３５０）［グリシルアミノマロナート−トランス（±）−１，２−ジアミノシクロヘキサン白金（II）］ホスファゼン｝、［ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）1.0（ＧｌｙＭａｌＰｔ（ｄａｃｈ）1.0）］nの製造
実施例１の記載と同一の方法により、分子量３５０のメトキシポリ（エチレングリコール）（６．３５ｇ、１７．３mmol）、ナトリウム金属片（１．０ｇ、２５mmol）、ポリ（ジクロロホスファゼン）（１０％ＡｌＣｌ3、２．００ｇ、１７．２mmol）、トリエチルアミン（１８．８６ｇ、１８６．３mmol）、ジエチルアミノマロン酸（４．２ｇ、２０．８mmol）、Ｂａ（ＯＨ）2・８Ｈ2Ｏ（０．７９ｇ、２．５mmol）及びＰｔ（ｄａｃｈ）ＳＯ4（１．１ｇ、２．５mmol）を用いて、目的の生成物である標記ポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体を収率７８．０％で得た。
【００６８】
組成式：Ｃ29Ｈ55Ｎ5Ｏ13ＰＰｔ
元素分析値：Ｃ（３７．５８），Ｈ（６．０８），Ｎ（７．８３），Ｐｔ（２１．１）
理論値：Ｃ（３８．３７），Ｈ（６．１１），Ｎ（７．７１），Ｐｔ（２１．４９）
Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：
【化１９】
31Ｐ核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：δ２１．８，１８．１
分子量（Ｍｗ）：２４，１９３。
【００６９】
実施例１０
ポリ｛［メトキシポリ（エチレングリコール）７５０］［グリシルグルタマート−トランス（±）−１，２−ジアミノシクロヘキサン白金（II）］ホスファゼン｝、｛ＮＰ（ＭＰＥＧ７５０）1.0［（ＧｌｙＧｌｕ）Ｐｔ（ｄａｃｈ）］1.0］nの製造
【００７０】
実施例１の記載と同一の方法により、分子量７５０のメトキシポリ（エチレングリコール）（１２．９５ｇ、１７．３mmol）、ナトリウム金属片（０．８ｇ、２０mmol）、ポリ（ジクロロホスファゼン）（１０％ＡｌＣｌ3、２．００ｇ、１７．２mmol）、トリエチルアミン（１８．８６ｇ、１８６．３mmol）、グリシルグルタミン酸エチルエステル（７．６３ｇ、２５．９mmol）、Ｂａ（ＯＨ）2・８Ｈ2Ｏ（０．９５ｇ、３．０mmol）及びＰｔ（ｄａｃｈ）ＳＯ4（１．２１ｇ、３．０mmol）を用いて、目的の生成物である標記ポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体を収率７０％で得た。
【００７１】
組成式：Ｃ46Ｈ90Ｎ5Ｏ22ＰＰｔ・６Ｈ2Ｏ
元素分析値：Ｃ（３９．７８１），Ｈ（６．６６），Ｎ（５．６１）
理論値：Ｃ（４０．７３），Ｈ（７．２１），Ｎ（６．１），Ｐｔ（１５．４６）
Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：
【化２０】
31Ｐ核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：δ２２．３，１９．２
分子量（Ｍｗ）：３３，４３３。
【００７２】
実施例１１
ポリ｛［メトキシポリ（エチレングリコール）３５０）［グリシルグルタマート−（２，２−ジメチル−１，３−プロパンジアミン）白金（II）］ホスファゼン｝、｛ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）1.0［（ＧｌｙＧｌｕ）Ｐｔ（dmpda）］1.0］nの製造
実施例１の記載と同一の方法により、分子量３５０のメトキシポリ（エチレングリコール）（５．０１ｇ、１４．３０mmol）、ナトリウム金属片（０．８ｇ、２０mmol）、ポリ（ジクロロホスファゼン）（５％ＡｌＣｌ3、２．００ｇ、１７．２mmol）、トリエチルアミン（１８．９ｇ、１８６．３mmol）、グリシルグルタミン酸エチルエステル（７．６ｇ、２５．９mmol）、Ｂａ（ＯＨ）2・８Ｈ2Ｏ（０．６３ｇ、２．０mmol）及び２，２−ジメチル−１，３−プロパンジアミン（dmpda）の白金（II）硫酸塩、（（dmpda）ＰｔＳＯ4、（０．８１ｇ、２．０mmol）を用いて、目的の生成物である標記ポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体を収率７０％で得た。
【００７３】
組成式：Ｃ28Ｈ54Ｎ5Ｏ14ＰＰｔ・４Ｈ2Ｏ
元素分析値：Ｃ（３５．４１），Ｈ（５．３５２），Ｎ（７．８３１）
理論値：Ｃ（３５．４６），Ｈ（６．８０），Ｎ（７．６４）
Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：
【化２１】
31Ｐ核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：δ２２．４，１８．４
分子量（Ｍｗ）：３２，５５９。
【００７４】
実施例１２
ポリ｛［メトキシポリ（エチレングリコール）３５０］［グリシルグルタマート−エチレンジアミン白金（II）］ホスファゼン｝、｛ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）1.0［（ＧｌｙＧｌｕ）Ｐｔ（ｅｎ）］1.0｝nの製造
【００７５】
実施例１の記載と同一の方法により、分子量３５０のメトキシポリ（エチレングリコール）（５．０１ｇ、１４．３mmol）、ナトリウム金属片（０．８ｇ、２０mmol）、ポリ（ジクロロホスファゼン）（５％ＡｌＣｌ3、２．００ｇ、１７．２mmol）、トリエチルアミン（１８．９ｇ、１８６．３mmol）、グリシルグルタミン酸エチルエステル（７．６ｇ、２５．９mmol）、Ｂａ（ＯＨ）2・８Ｈ2Ｏ（０．９２ｇ、２．９mmol）及びエチレンジアミン（ｅｎ）の白金（II）硫酸塩（Ｐｔ（ｅｎ）ＳＯ4、１．１３ｇ、２．９mmol）を用いて、目的の生成物である標記ポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体を収率７０％で得た。
【００７６】
組成式：Ｃ25Ｈ54Ｎ4Ｏ13ＰＰｔ・４Ｈ2Ｏ
元素分析値：Ｃ（３３．４１），Ｈ（５．３５），Ｎ（７．８３１）
理論値：Ｃ（３３．９２），Ｈ（６．９５３），Ｎ（７．８８）
Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：
【化２２】
31Ｐ核磁気共鳴スペクトル（Ｄ2Ｏ，ppm）：δ２２．４，１８．４
分子量（Ｍｗ）：１８，１８２。
【００７７】
実施例１３
ポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体の強められる透過性及び保持性効果の評価
オスのＣ５７ ＢＬ／６Ｎマウス（８−９週令、２５−２７ｇ）を１２時間の間隔の明暗で、４日間順応させ、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞（ＰＢＳに懸濁させた１ｘ１０6細胞）を背部に皮下的に接種した。２週間経過後、腫瘍が直径１０ｍｍに成長した時に、生理食塩に溶かした薬剤（２０mg／kg）を尾静脈に注射した。薬剤投与後、２時間及び２４時間に、動物を犠牲にした。シリンジで、心臓細孔（ｐｕｎｃｔｕｒｅ）により、血液サンプルを採取した。腫瘍組織及び筋肉（正常組織）を動物から除去し、分析のため、−８０℃で保存した。生物サンプル中の薬剤の分析は白金（II）の測定に基づいた。ｃ−Ｈ２ＳＯ４，ｃ−ＨＮＯ３及び最後に王水で処理した後、白金の含量をＩＣＰ−ＭＳで測定した（モデルELAN5000,Perkin Elmwer, Norwalk, CT）。
【００７８】
表１は、ＴＴＲ（（腫瘍組織／正常組織の分布）を示す。表１から、ポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体の分子量が８０，０００〜１００，０００の範囲のときに、最良の腫瘍選択性が達成されたことが分かる。
【００７９】
【表１】
【００８０】
実施例１４
白血病Ｌ１２１０細胞に対するポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体の抗腫瘍活性の評価
白血病Ｌ１２１０細胞に対する、本発明のポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体の抗腫瘍活性を、公知の方法（S. S. Lee, O. -S. Jung, C. O. Lee, S. U. Choi, M. -J. Jun, Y. S. Sohn, Inorg. Chim. Acta, 239, 133(1995)）にしたがって、評価した。その結果を表２に示す。
【００８１】
【表２】
【００８２】
実施例１５
胃腫瘍細胞（ＹＣＣ−３）に対するポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体の抗腫瘍活性の生体内（in vivo）異種移植（xenograft）
胃腫瘍細胞（ＹＣＣ−３）に対する本抱合錯体薬剤の生体内感受性を、ｎｕ／ｎｕマウス（６−８週令、２０−２５ｇ）を用いて、評価した。０．２５％のトリプシン−ＥＤＴＡで処理した後、培養された腫瘍細胞を、ＰＢＳ溶液で５分間遠心分離した。この工程を３回以上繰り返した後、腫瘍細胞を単一浮遊腫瘍細胞にした。ＰＢＳ溶液中の腫瘍細胞の濃度を血球計により測定された細胞数から計算した。１００μlのＰＢＳ溶液中の単一浮遊腫瘍細胞（４ｘ１０7）を、１mlのシリンジを用いて、各」マウスの右側に、皮下的に注射した。
【００８３】
腫瘍が０．５cm3の大きさになるように成長したときに、試験薬剤を、１００μlのＰＢＳ溶液中の２つの投与量（６０mg／kg及び３０mg／kg）で、腹腔内注射で、投与した。対照群の場合には、同一量のＰＢＳ溶液のみを注射した。２日毎に、マウスの体重と腫瘍の大きさを測定した。腫瘍の大きさは、長さ×広さ×広さ／２の式により計算した。
【００８４】
その結果を表３に示す。表から、従来のシスプラチンの場合、腫瘍組織の成長速度は、対照群のそれと大きな差がなく、一方、本発明の実施例３の化合物の場合、腫瘍組織の成長速度の阻害効果が、試験薬剤の注射から６０日後において、シスプラチンのそれと比べて、優れていた。したがって、本発明の化合物の抗腫瘍活性が従来の抗腫瘍剤のそれより優れていることが発見された。
【００８５】
【表３】
上述のように、良好な腫瘍選択性及び抗癌活性を有する、本発明のポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体が提供された。本発明のポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体は高い腫瘍選択性を示し、よって、それは、高い応答速度と低い不利な効果をともなう新しい抗腫瘍剤として、広く使用され得る。
【００８６】
本発明は、それの特質又は本質的な特徴から外れることなく、種々の形態で、実施態様化されているから、他に特定されないなら、上述の実施態様が前記の記述の詳細により限定されないと理解され、むしろ、添えられているクレームで定義されているように、その特質及び範囲内で、広く解釈されるべきである。ゆえに、クレームの境界及び領域内入るすべての変更及び修飾、又はそのような変更及び修飾の均等物は、添えられているクレームに包含されるように意図されている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式（１）
【化１】
（式中、ｘは、エチレンオキシド繰り返し単位の数を示し、７、１２又は１６であり、ｙは、０、１又は２であり、ｚは、０．５〜１．５の範囲における、ポリエチレングリコールのモル含量を示し、ｎは、３０〜１００の範囲における、ポリホスファゼンの重合度を示し、Ａ−Ａはジアミンを示す。）
で表されるポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体。
【請求項２】
水溶液中で、１０〜１００nmの直径の流体力学体積を有し、腫瘍組織選択性を示す、請求項１記載のポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体。
【請求項３】
前記ジアミンが、トランス（±）−１，２−ジアミノシクロヘキサン、２，２−ジメチル−１，３−プロパンジアミン及びエチレンジアミンからなる群から選択される、請求項１記載のポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体
【請求項４】
腫瘍の治療のための、下記化学式（１）
【化２】
（式中、ｘは、エチレンオキシド繰り返し単位の数を示し、７、１２又は１６であり、ｙは、０、１又は２であり、ｚは、０．５〜１．５の範囲における、ポリエチレングリコールのモル含量を示し、ｎは、３０〜１００の範囲における、ポリホスファゼンの重合度を示し、Ａ−Ａはジアミンを示す。）
で表されるポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体の使用。
【請求項５】
化学式（１）で表されるポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体の製法であって、
（ａ）化学式（３）のポリ（ジクロロホスファゼン）を、化学式（５）のメトキシポリ（エチレングリコール）のナトリウム塩及び化学式（６）のジペプチドエステルと連続的に反応させて、化学式（７）のポリホスファゼン誘導体を得る工程、
（ｂ）化学式（７）のポリホスファゼン誘導体中に存在するエステル基をアルコール溶液中のアルカリを用いて加水分解し、化学式（７）のポリホスファゼン誘導体の加水分解物を得る工程および
（ｃ）工程（ｂ）で得られる加水分解物を化学式（８）の白金（II）錯化合物と反応させ、化学式（１）のポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体を得る工程：
【化３】
（式中、ｘは、エチレンオキシド繰り返し単位の数を示し、７、１２又は１６であり、ｙは、０、１又は２であり、ｚは、０．５〜１．５の範囲における、ポリエチレングリコールのモル含量を示し、ｎは、３０〜１００の範囲における、ポリホスファゼンの重合度を示し、Ａ−Ａはジアミンを示し、Ｌは１つ又は２つの陰イオンリガンドを示す。）
を含む、製法。
【請求項６】
前記アルカリが、水酸化バリウム又は水酸化ナトリウムである請求項５記載の製法。
【請求項７】
前記陰イオンリガンドが、スルファート又はナイトラートである請求項５記載の製法。
【請求項８】
前記ジアミンが、トランス（±）−１，２−ジアミノシクロヘキサン、２，２−ジメチル−１，３−プロパンジアミン及びエチレンジアミンからなる群から選択される、請求項７記載の製法。
【請求項９】
メトキシポリ（エチレングリコール）の分子量が、３５０、５５０又は７５０である、請求項５記載の製法。
【請求項１０】
化学式（６）のジペプチドエチルエステルが、グリシルグルタマート、グリシルアスパルタート及びグリシルアミノマロナートからなる群から選択される、請求項５記載の製法。
【請求項１１】
工程（ｂ）及び工程（ｃ）が、化学式（７）のポリホスファゼン誘導体中に存在するエステル基を水酸化バリウムで加水分解し、加水分解物を、Ｌがスルファートである、化学式（８）の（ジアミン）白金（II）錯化合物と反応させ、硫酸バリウム沈殿物を濾過により除去することを含む、請求項６記載の製法。
【請求項１】
下記化学式（１）
【化１】
（式中、ｘは、エチレンオキシド繰り返し単位の数を示し、７、１２又は１６であり、ｙは、０、１又は２であり、ｚは、０．５〜１．５の範囲における、ポリエチレングリコールのモル含量を示し、ｎは、３０〜１００の範囲における、ポリホスファゼンの重合度を示し、Ａ−Ａはジアミンを示す。）
で表されるポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体。
【請求項２】
水溶液中で、１０〜１００nmの直径の流体力学体積を有し、腫瘍組織選択性を示す、請求項１記載のポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体。
【請求項３】
前記ジアミンが、トランス（±）−１，２−ジアミノシクロヘキサン、２，２−ジメチル−１，３−プロパンジアミン及びエチレンジアミンからなる群から選択される、請求項１記載のポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体
【請求項４】
腫瘍の治療のための、下記化学式（１）
【化２】
（式中、ｘは、エチレンオキシド繰り返し単位の数を示し、７、１２又は１６であり、ｙは、０、１又は２であり、ｚは、０．５〜１．５の範囲における、ポリエチレングリコールのモル含量を示し、ｎは、３０〜１００の範囲における、ポリホスファゼンの重合度を示し、Ａ−Ａはジアミンを示す。）
で表されるポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体の使用。
【請求項５】
化学式（１）で表されるポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体の製法であって、
（ａ）化学式（３）のポリ（ジクロロホスファゼン）を、化学式（５）のメトキシポリ（エチレングリコール）のナトリウム塩及び化学式（６）のジペプチドエステルと連続的に反応させて、化学式（７）のポリホスファゼン誘導体を得る工程、
（ｂ）化学式（７）のポリホスファゼン誘導体中に存在するエステル基をアルコール溶液中のアルカリを用いて加水分解し、化学式（７）のポリホスファゼン誘導体の加水分解物を得る工程および
（ｃ）工程（ｂ）で得られる加水分解物を化学式（８）の白金（II）錯化合物と反応させ、化学式（１）のポリホスファゼン−白金（II）抱合錯体を得る工程：
【化３】
（式中、ｘは、エチレンオキシド繰り返し単位の数を示し、７、１２又は１６であり、ｙは、０、１又は２であり、ｚは、０．５〜１．５の範囲における、ポリエチレングリコールのモル含量を示し、ｎは、３０〜１００の範囲における、ポリホスファゼンの重合度を示し、Ａ−Ａはジアミンを示し、Ｌは１つ又は２つの陰イオンリガンドを示す。）
を含む、製法。
【請求項６】
前記アルカリが、水酸化バリウム又は水酸化ナトリウムである請求項５記載の製法。
【請求項７】
前記陰イオンリガンドが、スルファート又はナイトラートである請求項５記載の製法。
【請求項８】
前記ジアミンが、トランス（±）−１，２−ジアミノシクロヘキサン、２，２−ジメチル−１，３−プロパンジアミン及びエチレンジアミンからなる群から選択される、請求項７記載の製法。
【請求項９】
メトキシポリ（エチレングリコール）の分子量が、３５０、５５０又は７５０である、請求項５記載の製法。
【請求項１０】
化学式（６）のジペプチドエチルエステルが、グリシルグルタマート、グリシルアスパルタート及びグリシルアミノマロナートからなる群から選択される、請求項５記載の製法。
【請求項１１】
工程（ｂ）及び工程（ｃ）が、化学式（７）のポリホスファゼン誘導体中に存在するエステル基を水酸化バリウムで加水分解し、加水分解物を、Ｌがスルファートである、化学式（８）の（ジアミン）白金（II）錯化合物と反応させ、硫酸バリウム沈殿物を濾過により除去することを含む、請求項６記載の製法。
【公表番号】特表２００６−５２５２２４（Ｐ２００６−５２５２２４Ａ）
【公表日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５７１３５５（Ｐ２００４−５７１３５５）
【出願日】平成１５年１２月３０日（２００３．１２．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００３／００２９０１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９６８２０
【国際公開日】平成１６年１１月１１日（２００４．１１．１１）
【出願人】（５０５４０５９２８）ボード・オブ・トラスティーズ・イファ・ウーマンズ・ユニバーシティ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＢＯＡＲＤ ＯＦ ＴＲＵＳＴＥＥＳ，ＥＷＨＡ ＷＯＭＡＮＳ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１２月３０日（２００３．１２．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００３／００２９０１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９６８２０
【国際公開日】平成１６年１１月１１日（２００４．１１．１１）
【出願人】（５０５４０５９２８）ボード・オブ・トラスティーズ・イファ・ウーマンズ・ユニバーシティ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＢＯＡＲＤ ＯＦ ＴＲＵＳＴＥＥＳ，ＥＷＨＡ ＷＯＭＡＮＳ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【Ｆターム（参考）】
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