腹部大動脈瘤の治療のためのトリアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン化合物
本発明は、Ｐ２Ｔ（Ｐ２Ｙ１２）受容体アンタゴニストとして作用する、トリアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン化合物を提供する。該化合物は、腹部大動脈瘤の治療または予防に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腹部大動脈瘤の治療または予防における、特定のＰ２Ｙ１２受容体（Ｐ２Ｔ、Ｐ２ＹＡＤＰまたはＰ２ＴＡＣとしても知られる）アンタゴニストの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）は、年齢および性別に非常に関連するアテローム血栓性疾患の頻出する型である（Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ Ｈら（１９９６）， Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８００：１−２４）。ＡＡＡ病態生理は、細胞外マトリックスタンパク質分解（Ｍｉｃｈｅｌ ＪＢ（２００１）， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２１：１３８９−１３９２）、平滑筋細胞（ＳＭＣ）消失（Ｍｉｃｈｅｌ ＪＢ（２００３）， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２３：２１４６−２１５４）、炎症細胞浸潤、ならびに細胞コロニー形成および治癒の欠如（Ｆｏｎｔａｉｎｅ Ｖら（２００４）， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６４：２０７７−２０８７）を伴う。管腔側線維形成（Ｔｏｕａｔ Ｚら（２００６）， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６８：１０２２−１０３０）および反管腔側線維素溶解（Ｃａｒｒｅｌｌ ＴＷら（２００６）， Ｖａｓｃｕｌａｒ １４：９−１６； Ｆｏｎｔａｉｎｅ Ｖら（２００２）， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６１：１７０１−１７１０）を含む壁在血栓の動的生物学が、ＡＡＡ進行に重要な役割を果たすことが最近示された。これに関連して、活性化血小板凝集体および多核白血球（ＰＭＮ）補充間の相互作用（Ｓａｒｄａ−Ｍａｎｔｅｌ Ｌら（２００６）， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２６：２１５３−２１５９； Ｔｏｕａｔら， ２００６）は、細胞性治癒の欠如（Ｆｏｎｔａｉｎｅ Ｖら（２００４）， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６４：２０７７−２０８７）において大きな役割を果たす。
【０００３】
アデノシン５’−二リン酸（ＡＤＰ）が血栓症の重要な仲介因子として作用することが見出されてきている。ＡＤＰ誘導性血小板凝集は、血小板膜上に位置するＰ２Ｙ１２受容体サブタイプによって仲介される。Ｐ２Ｙ１２受容体（Ｐ２Ｔ、Ｐ２ＹＡＤＰまたはＰ２ＴＡＣとしても知られる）は、血小板活性化／凝集を仲介する際に主に関与するＧタンパク質共役型受容体である。この受容体の薬理学的性質は、例えば、Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓら（１９９４）， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， １１３， １０５７−１０６３、およびＦａｇｕｒａら（１９９８）， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， １２４， １５７−１６４による参考文献に記載されてきている。この受容体のアンタゴニストは、他の抗血栓剤に勝る有意な改善を提供することが示されてきている（Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．（１９９９） ４２， ２１３を参照されたい）。
【０００４】
国際特許出願ＷＯ ９９／０５１４３は、Ｐ２Ｔ（Ｐ２Ｙ１２、Ｐ２ＹＡＤＰまたはＰ２ＴＡＣとしても知られる）アンタゴニストとしての活性を有する、一連のトリアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン化合物を一般的に開示する。近年、直接（非プロドラッグ）Ｐ２Ｔ受容体アンタゴニストの新規クラスが記載されてきており、これによって、他の抗血栓剤に勝る有意な改善が提供される。国際特許出願ＷＯ ００／３４２８３は、式（Ｉ）の化合物を含む新規「直接」Ｐ２Ｔ受容体アンタゴニストを開示する。トリアゾロ（４，５−ｄ）ピリミジン化合物の結晶型および無定形型が、ＷＯ ０１／９２２６２に開示される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ ９９／０５１４３
【特許文献２】ＷＯ ００／３４２８３
【特許文献３】ＷＯ ０１／９２２６２
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ Ｈら（１９９６）， Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８００：１−２４
【非特許文献２】Ｍｉｃｈｅｌ ＪＢ（２００１）， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２１：１３８９−１３９２
【非特許文献３】Ｍｉｃｈｅｌ ＪＢ（２００３）， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２３：２１４６−２１５４
【非特許文献４】Ｆｏｎｔａｉｎｅ Ｖら（２００４）， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６４：２０７７−２０８７
【非特許文献５】Ｔｏｕａｔ Ｚら（２００６）， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６８：１０２２−１０３０
【非特許文献６】Ｃａｒｒｅｌｌ ＴＷら（２００６）， Ｖａｓｃｕｌａｒ １４：９−１６
【非特許文献７】Ｆｏｎｔａｉｎｅ Ｖら（２００２）， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６１：１７０１−１７１０
【非特許文献８】Ｓａｒｄａ−Ｍａｎｔｅｌ Ｌら（２００６）， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２６：２１５３−２１５９
【非特許文献９】Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓら（１９９４）， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， １１３， １０５７−１０６３
【非特許文献１０】Ｆａｇｕｒａら（１９９８）， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， １２４， １５７−１６４
【非特許文献１１】Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．（１９９９） ４２， ２１３
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、腹部大動脈瘤の治療または予防のための、式（Ｉ）：
【０００８】
【化１】
【０００９】
（Ｉ）
［式中：
Ｒは、ＣＨ２ＯＨまたはＯ（ＣＨ２）２ＯＨであり；
Ｒ１は、３つのハロゲン原子により置換されていてもよいＣ３−４アルキルであり；
Ｒ２は、フェニルまたは３，４−ジフルオロフェニルである］
の化合物、またはその薬学的に許容されうる誘導体の使用に関する。
【００１０】
式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容されうる誘導体には、塩（例えば、薬学的に許容されうる非毒性有機または無機酸付加塩、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸または酢酸の塩）、溶媒和物および塩の溶媒和物が含まれる。
【００１１】
本発明の１つの態様は、腹部大動脈瘤の治療または予防のための式（Ｉ）の化合物である。
本発明の１つの態様は、腹部大動脈瘤の治療または予防のための薬剤製造のための、式（Ｉ）の化合物の使用である。
【００１２】
本発明の１つの態様は、腹部大動脈瘤の治療方法または予防方法であって、薬学的および薬理学的に有効な量の式（Ｉ）の化合物をこうした治療または予防が必要な被験体に投与する、前記方法である。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、腹部大動脈瘤の治療方法または予防方法であって、式（Ｉ）の化合物をこうした治療または予防が必要な被験体に投与する、前記方法である。
１つの態様において、Ｒ１は、ｎ−プロピル、３，３，３−トリフルオロプロピルまたはｎ−ブチルである。１つの態様において、Ｒ２は、３，４−ジフルオロフェニルである。１つの態様において、式（Ｉ）の化合物は、化合物（Ａ）：
【００１４】
【化２】
【００１５】
（Ａ）
である。上記化合物（Ａ）は、慣用的に、｛１Ｓ−［１α，２α，３β（１Ｓ＊，２Ｒ＊），５β］｝−３−（７−｛［２−（３，４−ジフルオロフェニル）シクロプロピル］アミノ｝−５−（プロピルチオ）−３Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル）−５−（２−ヒドロキシエトキシ）シクロペンタン−１，２−ジオールと命名される。
【００１６】
式（Ｉ）の化合物を投与するのに適した配合物が当該技術分野に知られ、そしてこれには、ＷＯ００／３４２８３、ＷＯ２００８／０２４０４４およびＷＯ２００８／０２４０４５から知られるものが含まれる。化合物（Ｉ）の薬学的配合物は、当該技術分野に知られる多様な他の成分、例えば保存剤、安定化剤、粘性制御剤、乳化剤または緩衝剤を含有してもよいし、そして実際、通常、含有するであろう。したがって、化合物（Ｉ）の薬学的配合物は、典型的には、０．０５〜９９％ｗ（重量パーセント）、例えば０．１０〜７０％ｗの範囲、または０．１０〜５０％ｗの範囲で、式（Ｉ）の化合物の総量を含み、ここで、すべての重量パーセントは、総配合物に基づく。
【００１７】
式（Ｉ）の化合物の適切な用量を開業医または他の当業者が決定してもよく、そしてこの用量は、状態の重症度、および治療しようとするヒト、ならびに使用している化合物（単数または複数）に応じるであろう。哺乳動物患者、特にヒト患者の療法的および／または予防的治療における活性化合物の適切な用量には、関連する状態の治療経過に渡って、最大１０μｍｏｌ／Ｌ、例えば０．００１〜１０μｍｏｌ／Ｌの範囲の平均血漿濃度を生じるものが含まれる。いずれにしても、医師または当業者は、個々のヒトに最も適切であろう実際の投薬量を決定可能であり、これは治療しようとする状態、ならびに治療しようとする特定のヒトの年齢、体重、性別および応答によって多様である可能性が高い。上述の投薬量は、平均的な症例の典型である。もちろん、より高いまたはより低い投薬量範囲が適当である個々の例もありうるし、そしてこうしたものが本発明の範囲内である。
【００１８】
誤解を避けるために、用語「治療」には、療法的および／または予防的治療が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】化合物（Ａ）治療による動脈瘤拡大の予防。動脈瘤誘導の１０日後（ａ）および４２日後（ｂ）の動脈瘤外径の測定値。外径は、１０日後（ａ）、対照（白抜きの正方形）および化合物（Ａ）治療（黒塗りの正方形）ラットで同様であったが、治療の４２日後（ｂ）、化合物（Ａ）群で有意に低かった。（ｃ）第１０日、動脈瘤直径増加は、２つの群に関して同様であったが、第４２日、化合物（Ａ）治療ラット（黒塗りのバー）で有意に減少した。実際、化合物（Ａ）治療ラットに関しては、第１０日〜第４２日の間に、動脈瘤直径増加はまったく観察されなかった。＊＊、Ｐ＜０．００１。
【図２−１】化合物（Ａ）治療による壁在血栓発展の阻害。（ａ）第４２日、対照（左）および化合物（Ａ）治療ラット（右）由来の代表的な動脈瘤のピクロシリウスレッド染色。化合物（Ａ）治療ラットに比較した際、対照由来の動脈瘤において、大動脈直径および血栓（Ｔ）面積が、より大きかった。血栓内のコラーゲン沈着（赤色染色）は、化合物（Ａ）群でのみ観察されることに注目されたい。（ｂ）血栓面積／壁面積は、両群のラットにおいて、第１０日〜第４２日の間に増加したが、第１０日および第４２日の両方で、化合物（Ａ）治療（黒塗りのバー）によって有意に減少した。（ｃ）群内分析によって、第４２日のより大きい動脈瘤直径は、より大きい血栓面積と関連することが示された（対照（白抜きの円）および化合物（Ａ）治療ラット（黒塗りの円）に関して、それぞれ、Ｒ２＝０．１３およびＲ２＝０．４０、Ｐ＜０．０５）。
【図２−２】（ｄ）第４２日、対照（左）および化合物（Ａ）治療ラット（右）由来の動脈瘤の壁在血栓内のＣＤ４１（インテグリンαＩｉｂ、血小板マーカー）の免疫染色。Ｌ：大動脈管腔。染色定量化によって、化合物（Ａ）での４２日間の治療が、対照群で見られるものに比較した際、壁在血栓内のＣＤ４１陽性面積の相対サイズを有意に減少させたことが示される。元来の倍率、ｘ２００。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１。
【図３−１】化合物（Ａ）治療による炎症性浸潤の阻害。（ａ）第４２日、対照（左）および化合物（Ａ）治療ラット（右）由来の動脈瘤の壁在血栓内のＰＭＮの免疫染色。第１０日（中央のパネル）および第４２日（下部のパネル）、壁在血栓内および壁内のＰＭＮ浸潤の定量化。１０日後および４２日後、ＰＭＮは、大部分、対照動脈瘤の壁在血栓（白抜きのバー）内に見られた。化合物（Ａ）治療（黒塗りのバー）は、どちらの時点でも、血栓内部へのＰＭＮの浸潤を阻害した。
【図３−２】（ｂ）第４２日、対照（左）および化合物（Ａ）治療ラット（右）由来の動脈瘤の壁在血栓内のマクロファージの免疫染色。第１０日（中央のパネル）および第４２日（下部のパネル）の壁在血栓内および壁内へのマクロファージ浸潤の定量化。マクロファージは、対照動脈瘤の壁在血栓内ならびに壁中に見られた（白抜きのバー）。４２日後、より多くのマクロファージが、血栓中よりも壁内に存在した。化合物（Ａ）治療（黒塗りのバー）は、どちらの時点でも、血栓内へのマクロファージの浸潤を阻害した。化合物（Ａ）治療の１０日後または４２日後の壁内のマクロファージ含量の減少は、統計的有意性には到達しなかった。Ｌ：大動脈管腔。元来の倍率、ｘ２００。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１。
【図４】化合物（Ａ）治療でのＭＭＰ−９発現減少。（ａ）第４２日、対照（左）および化合物（Ａ）治療ラット（右）由来の動脈瘤の壁在血栓内のＭＭＰ−９免疫染色。第４２日のＭＭＰ−９染色の定量化によって、対照動脈瘤において、壁面積に比較した、ＭＭＰ−９染色によって占められる面積が、壁内よりも血栓内でより大きいことが示された（白抜きのバー）。化合物（Ａ）治療は、血栓内および壁内の両方で、ＭＭＰ−９陽性面積のサイズを非常に減少させた（黒塗りのバー）。Ｌ：大動脈管腔。元来の倍率、ｘ２００。＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。（ｂ）第４２日、すべてのラットを考慮した際、血栓内のＭＭＰ−９陽性面積および総血栓面積のサイズの間に正の相関があった（対照、白抜きの円；化合物（Ａ）治療、黒塗りの円、Ｒ２＝０．７９、Ｐ＜０．０００１）。
【図５−１】化合物（Ａ）治療での動脈瘤壁内の壁在血栓のＳＭＣコロニー形成および弾性層板の保持。（ａ）第４２日、対照（左）および化合物（Ａ）治療ラット（右）由来の動脈瘤のオルセイン染色。矢印は、弾性層板を示す。弾性層板面積の定量化によって、第１０日および第４２日の両方で、化合物（Ａ）治療（黒塗りのバー）の有益な効果が示された。
【図５−２】（ｂ）第４２日、対照（左）および化合物（Ａ）治療ラット（右）由来の動脈瘤の壁在血栓内のＳＭＣ免疫染色。矢印は、血栓内のＳＭＣを示す。第１０日（中央のパネル）および第４２日（下部のパネル）の壁在血栓内および壁内のＳＭＣの密度は、どちらの群でも、第１０日〜第４２日の間に増加した。化合物（Ａ）治療（黒塗りのバー）は、対照（白抜きのバー）に比較した際、４２日後、ＳＭＣによる血栓コロニー形成を改善する一方、壁内では化合物（Ａ）の効果はまったく観察不能であった。Ｌ：管腔；Ｍ：中膜；Ａ：外膜。元来の倍率、ｘ１００。＊＊、Ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
生物学的評価
血小板凝集
健康な雄Ｌｅｗｉｓラット（Ｉｆｆａ Ｃｒｅｄｏ、フランス・リヨン）に、化合物（Ａ）（１０ｍｇ／ｋｇ体重）の単回経口用量を投与した。２匹のラットから新鮮な静脈血を、化合物（Ａ）投与前、ならびに投与２時間後、１０時間後、および２４時間後に試料採取し、そして周囲温度で、２５０ｇで３分間遠心分離した。先に記載されるように（Ｅｃｋｌｙら、２００１）、血小板リッチ血漿を調製した。４５０μｌの血小板懸濁物を１１００ｒｐｍで攪拌し、そして最終体積５００μｌ中、５μＭ ＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ、フランス・サンカンタンファラビエ）の添加によって活性化した。二重チャネル血小板凝集計（Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ、米国ペンシルバニア州ウェストハーバータウン）中、比濁法によって、周囲温度で凝集を測定した。ベースラインを超える最大曲線高を測定することによって、凝集の度合いを概算した。
【００２１】
ＡＡＡモデル
ラット大動脈において、ドデシル硫酸ナトリウム脱細胞化モルモット大動脈（異種マトリックス）のセグメントを移植することによって、実験的大動脈瘤を誘導した（Ａｌｌａｉｒｅ Ｅ．ら（１９９４）， Ｊ Ｖａｓｃ Ｓｕｒｇ １９：４４６−４５６）。このＡＡＡモデルは、異種細胞外マトリックスの免疫炎症性損傷によって特徴付けられる（Ａｌｌａｉｒｅ Ｅら（１９９７）， Ｓｕｒｇｅｒｙ １２２：７３−８１； Ａｌｌａｉｒｅ Ｅら（１９９６）， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６２：７９４−８０３）。簡潔には、欧州連合によって策定された実験動物管理方針にしたがって、４６匹の雄Ｌｅｗｉｓラット（２５０ｇ）および４６匹のモルモット（２８０ｇ）（Ｉｆｆａ Ｃｒｅｄｏ、フランス・リヨン）を飼育した。ベントバルビタール（５ｍｇ／１００ｇ体重）の腹腔内注射によって、動物を麻酔した。モルモット腎臓下大動脈（１．５ｃｍ）を試料採取し、そしてドデシル硫酸ナトリウム処理によって脱細胞化して、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）細胞外マトリックスの管を得て、これを、１０／０ナイロン結節縫合で、Ｌｅｗｉｓラットの大動脈内に同所性に移植した（異種移植）（Ａｌｌａｉｒｅら、１９９７； Ａｌｌａｉｒｅら、１９９６）。クランプを外した直後、双眼顕微鏡下で、移植片の最初の直径をｉｎ ｓｉｔｕで測定した。２４時間後、ラットをランダムに２つの等しい群に分け、化合物（Ａ）（１０ｍｇ／ｋｇ体重、経口投与によって１日２回）または化合物（Ａ）の希釈液（水中の１％カルボキシメチルセルロース／０．１％Ｔｗｅｅｎ−８０）を１０日間（第１０日、各群に関してｎ＝９）または６週間（第４２日、各群に関してｎ＝１４）治療した。屠殺時、ラットを深く麻酔し、移植片直径を再び測定し、そして大動脈を切り出して、そして４％パラホルムアルデヒド中で固定した。大動脈試料をパラフィン中に包埋し、そして５μｍでカットした。
【００２２】
組織学的および免疫組織化学的分析
切片をピクロシリウスレッドで染色してコラーゲンおよびフィブリンを視覚化し、そしてオルセインで染色してエラスチンを視覚化した。一次抗体として、抗ヒトα−アクチン（希釈１：５００、Ｄａｋｏ、フランス・トラップ）、抗ＣＤ６８（マクロファージ、希釈１：１０００、Ｓｅｒｏｔｅｃ、フランス・セルジーサンクリストフ）、抗ラット多核白血球（希釈１：３０００、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、カナダ・オンタリオ）、抗ＣＤ４１（インテグリンαＩＩｂ、血小板、希釈１：５０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および抗ＭＭＰ−９（希釈１：５０、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ドイツ・ダルムシュタット）を、そして検出のため、ペルオキシダーゼＶｅｃｔｏｒ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、米国カリフォルニア州バーリンゲーム）を用いて、免疫組織化学を行った。顕微鏡接眼レンズ中のグリッドを用いて細胞を計数し、そして同じスライド上の４つの対称視野において平均した。Ｈｉｓｔｏｌａｂソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、フランス・エブリー）を用いた形態計測的分析によって、血栓、弾性線維、ＡＡＡ壁、ならびにＭＭＰ−９およびＣＤ４１陽性染色に相当する面積サイズを測定した。シリウスレッドスライド上で、血栓面積を決定した。内部血栓および外部壁において、コンピュータプログラムの色検出モードによって、陽性染色によって占められる面積を定量化した。
【００２３】
統計分析
結果を平均±Ｓ．Ｄ．で表す。直径増加パーセントを以下のように計算する：（回収時の直径−移植時の直径）ｘ１００／移植時の直径。ノンパラメトリックＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定（Ｓｔａｔｖｉｅｗ、バージョン４．５）を用いて、２つの群間の比較を行った。異なる群において直径が大きい動脈瘤の頻度を、Χ２検定によって分析した。単純回帰分析を用いて、多様なパラメータ間の相関に関して検定した。Ｐ＜０．０５を有意と見なした。
【００２４】
結果
動脈瘤直径
移植１０日後（２０４．６±７１．２％、ｎ＝９）および４２日後（３５９．１±１１３．３％、ｎ＝１４）、未治療対照ラットで観察される動脈瘤外径の増加によって示されるように、脱細胞化細胞外マトリックス異種移植片は動脈瘤に発展した（図１）。１０日間の化合物（Ａ）治療は、未治療ラットに比較した際、動脈瘤外径の増加を修飾しなかった（１９７．３±５２．８％、ｎ＝９）；平均動脈瘤外径は、２つの群間で同様であった（化合物（Ａ）治療および対照ラットにおいて、それぞれ、２．２２±０．５６ｍｍ対２．２２±０．７０ｍｍ）（図１ａ、ｃ）。しかし、治療４２日後、平均動脈瘤外径は、化合物（Ａ）治療群において、有意により低く（化合物（Ａ）治療および対照ラットにおいて、それぞれ、３．６１±１．４６ｍｍ、ｎ＝１４対５．２１±１．２２ｍｍ、ｎ＝１４）、そして外径のパーセント増加は有意に減少した（図１ｂ、ｃ）。したがって、第１０日〜第４２日の間で、対照ラットにおいて動脈直径パーセント増加が観察されるが、化合物（Ａ）群では減少しているような相違によって示されるように、化合物（Ａ）治療は動脈瘤拡大を予防した（図１ｃ）。さらに、化合物（Ａ）治療群に比較した際に、第４２日のより大きい動脈瘤（直径＞４ｍｍ）の発生率は、対照群で優位であった（Χ２＝１１．６、Ｐ＜０．００１）。
【００２５】
壁在血栓形成
脱細胞化細胞外マトリックス異種移植片から発展する実験的動脈瘤は、先に記載されるように（Ｔｏｕａｔら、２００６）、壁在血栓の存在によって特徴付けられる（図２ａ）。対照群において、血栓面積／壁面積の率は、第１０日で０．２２±０．１４によって示され、そして第４２日には０．７８±０．８９に増加した（図２ｂ）。化合物（Ａ）での治療は、第１０日および第４２日の両方で、血栓／壁面積を有意に減少させた（それぞれ、０．０７±０．０５および０．３５±０．４４）（図２ｂ）。血栓面積中のこの相対的減少は、第４２日の血栓内のＣＤ４１陽性面積（インテグリンαＩＩｂ、血小板マーカー）の有意な減少と関連した（化合物（Ａ）治療および対照群ラットに関して、それぞれ、０．１３±０．１６および０．６８±１．３６、Ｐ＝０．００５）（図２ｃ）。最後に、第４２日、すべてのラットを考慮した際、血栓面積および動脈瘤直径間には有意な相関があった（Ｒ２＝０．２５、Ｐ＝０．０００３）。群内分析によって、化合物（Ａ）治療は、対照群と比較した際、相関の傾斜を有意に減少させることが示された（化合物（Ａ）：ｓ＝０．１７、Ｒ２＝０．４０；対照ｓ＝０．３０、Ｒ２＝０．１３）（図２ｃ）ことから、化合物（Ａ）による血小板活性化の阻害が実験的ＡＡＡ進行を制限する証拠が提供された。
【００２６】
炎症性浸潤
動脈瘤発展は、多核白血球（ＰＭＮ）およびマクロファージを伴う炎症プロセスに関連する。どちらの炎症細胞も、壁在血栓内および動脈瘤壁内に存在した（図３）。しかし、ＰＭＮは壁在血栓内で見られるものがほとんどであり、ここではこれらが主な炎症細胞タイプであった。対照的に、マクロファージは壁内で優位であった。ＰＭＮ密度は第１０日〜第４２日の間で減少したが、マクロファージ密度は増加した（図３）。化合物（Ａ）治療は、第１０日および第４２日、壁在血栓内へのＰＭＮおよびマクロファージの浸潤を有意に阻害した（図３）。動脈瘤壁内へのマクロファージ浸潤には変化はまったくなかった。
【００２７】
動脈瘤におけるＭＭＰ−９発現および中膜において保持される弾性線維
ＭＭＰ−９発現は、免疫染色によって明らかになり、血栓および動脈瘤壁両方において、対照ラットで検出された（図４ａ）。第４２日、ＭＭＰ−９陽性面積は、壁におけるよりも血栓内でより大きかった。化合物（Ａ）治療は、血栓および壁両方において、ＭＭＰ−９陽性面積を顕著に減少させた（図４ａ）。さらに、第４２日、すべてのラットを考慮した際、血栓面積および血栓内のＭＭＰ−９発現間には有意な正の相関があった（Ｒ２＝０．７９、Ｐ＜０．０００１）（図４ｂ）。どちらの時点でも、化合物（Ａ）治療に伴って、ＭＭＰ−９発現減少を反映して、中膜の弾性線維の有意な保持が観察された（図５ａ）。第１０日〜第４２日の間、対照ラットにおいて、弾性線維によって占められる相対面積は一定のままであったが、化合物（Ａ）治療ラットにおいては、弾性線維面積が非常に増加した（図５ａ）。
【００２８】
壁在血栓のＶＳＭＣコロニー形成
ＳＭＣは、壁内および血栓内のα−アクチン陽性染色によって明らかになるように、脱細胞化移植片および壁に近接して発展する壁在血栓の部分にコロニー形成した（図５ｂ）。さらに、ＳＭＣの密度は、壁内および血栓内の両方で、第１０日から第４２日に増加し、このモデルが、経時的な自発的治癒プロセスを開始する傾向がある証拠を提供した。１０日間の化合物（Ａ）治療では、対照に比較して、血栓内のＳＭＣ密度は修飾されなかったが、４２日間の治療は、血栓のＳＭＣコロニー形成を有意に改善した（図５ｂ）。これは、シリウスレッド染色によって示されるように、コラーゲンの沈着と関連した（図２ａ）。対照的に、化合物（Ａ）での治療は、１０日後または４２日後のいずれでも、壁のＳＭＣコロニー形成に影響を及ぼさなかった（図５ｂ）。
【００２９】
結論
化合物（Ａ）による血小板活性化の阻害を通じたＡＡＡ壁在血栓形成の予防によって、実験的ＡＡＡ進行が制限された。血小板活性化を遮断し、そして壁在血栓形成を減少させることによって、化合物（Ａ）は、血栓における白血球の補充およびそれに続くプロテアーゼの濃縮を減少させ、壁完全性の保持、および間葉細胞コロニー形成の増進によって明らかになるような治癒の開始を導いた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腹部大動脈瘤の治療または予防における、特定のＰ２Ｙ１２受容体（Ｐ２Ｔ、Ｐ２ＹＡＤＰまたはＰ２ＴＡＣとしても知られる）アンタゴニストの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）は、年齢および性別に非常に関連するアテローム血栓性疾患の頻出する型である（Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ Ｈら（１９９６）， Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８００：１−２４）。ＡＡＡ病態生理は、細胞外マトリックスタンパク質分解（Ｍｉｃｈｅｌ ＪＢ（２００１）， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２１：１３８９−１３９２）、平滑筋細胞（ＳＭＣ）消失（Ｍｉｃｈｅｌ ＪＢ（２００３）， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２３：２１４６−２１５４）、炎症細胞浸潤、ならびに細胞コロニー形成および治癒の欠如（Ｆｏｎｔａｉｎｅ Ｖら（２００４）， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６４：２０７７−２０８７）を伴う。管腔側線維形成（Ｔｏｕａｔ Ｚら（２００６）， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６８：１０２２−１０３０）および反管腔側線維素溶解（Ｃａｒｒｅｌｌ ＴＷら（２００６）， Ｖａｓｃｕｌａｒ １４：９−１６； Ｆｏｎｔａｉｎｅ Ｖら（２００２）， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６１：１７０１−１７１０）を含む壁在血栓の動的生物学が、ＡＡＡ進行に重要な役割を果たすことが最近示された。これに関連して、活性化血小板凝集体および多核白血球（ＰＭＮ）補充間の相互作用（Ｓａｒｄａ−Ｍａｎｔｅｌ Ｌら（２００６）， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２６：２１５３−２１５９； Ｔｏｕａｔら， ２００６）は、細胞性治癒の欠如（Ｆｏｎｔａｉｎｅ Ｖら（２００４）， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６４：２０７７−２０８７）において大きな役割を果たす。
【０００３】
アデノシン５’−二リン酸（ＡＤＰ）が血栓症の重要な仲介因子として作用することが見出されてきている。ＡＤＰ誘導性血小板凝集は、血小板膜上に位置するＰ２Ｙ１２受容体サブタイプによって仲介される。Ｐ２Ｙ１２受容体（Ｐ２Ｔ、Ｐ２ＹＡＤＰまたはＰ２ＴＡＣとしても知られる）は、血小板活性化／凝集を仲介する際に主に関与するＧタンパク質共役型受容体である。この受容体の薬理学的性質は、例えば、Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓら（１９９４）， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， １１３， １０５７−１０６３、およびＦａｇｕｒａら（１９９８）， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， １２４， １５７−１６４による参考文献に記載されてきている。この受容体のアンタゴニストは、他の抗血栓剤に勝る有意な改善を提供することが示されてきている（Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．（１９９９） ４２， ２１３を参照されたい）。
【０００４】
国際特許出願ＷＯ ９９／０５１４３は、Ｐ２Ｔ（Ｐ２Ｙ１２、Ｐ２ＹＡＤＰまたはＰ２ＴＡＣとしても知られる）アンタゴニストとしての活性を有する、一連のトリアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン化合物を一般的に開示する。近年、直接（非プロドラッグ）Ｐ２Ｔ受容体アンタゴニストの新規クラスが記載されてきており、これによって、他の抗血栓剤に勝る有意な改善が提供される。国際特許出願ＷＯ ００／３４２８３は、式（Ｉ）の化合物を含む新規「直接」Ｐ２Ｔ受容体アンタゴニストを開示する。トリアゾロ（４，５−ｄ）ピリミジン化合物の結晶型および無定形型が、ＷＯ ０１／９２２６２に開示される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ ９９／０５１４３
【特許文献２】ＷＯ ００／３４２８３
【特許文献３】ＷＯ ０１／９２２６２
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ Ｈら（１９９６）， Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８００：１−２４
【非特許文献２】Ｍｉｃｈｅｌ ＪＢ（２００１）， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２１：１３８９−１３９２
【非特許文献３】Ｍｉｃｈｅｌ ＪＢ（２００３）， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２３：２１４６−２１５４
【非特許文献４】Ｆｏｎｔａｉｎｅ Ｖら（２００４）， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６４：２０７７−２０８７
【非特許文献５】Ｔｏｕａｔ Ｚら（２００６）， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６８：１０２２−１０３０
【非特許文献６】Ｃａｒｒｅｌｌ ＴＷら（２００６）， Ｖａｓｃｕｌａｒ １４：９−１６
【非特許文献７】Ｆｏｎｔａｉｎｅ Ｖら（２００２）， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６１：１７０１−１７１０
【非特許文献８】Ｓａｒｄａ−Ｍａｎｔｅｌ Ｌら（２００６）， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２６：２１５３−２１５９
【非特許文献９】Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓら（１９９４）， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， １１３， １０５７−１０６３
【非特許文献１０】Ｆａｇｕｒａら（１９９８）， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， １２４， １５７−１６４
【非特許文献１１】Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．（１９９９） ４２， ２１３
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、腹部大動脈瘤の治療または予防のための、式（Ｉ）：
【０００８】
【化１】
【０００９】
（Ｉ）
［式中：
Ｒは、ＣＨ２ＯＨまたはＯ（ＣＨ２）２ＯＨであり；
Ｒ１は、３つのハロゲン原子により置換されていてもよいＣ３−４アルキルであり；
Ｒ２は、フェニルまたは３，４−ジフルオロフェニルである］
の化合物、またはその薬学的に許容されうる誘導体の使用に関する。
【００１０】
式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容されうる誘導体には、塩（例えば、薬学的に許容されうる非毒性有機または無機酸付加塩、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸または酢酸の塩）、溶媒和物および塩の溶媒和物が含まれる。
【００１１】
本発明の１つの態様は、腹部大動脈瘤の治療または予防のための式（Ｉ）の化合物である。
本発明の１つの態様は、腹部大動脈瘤の治療または予防のための薬剤製造のための、式（Ｉ）の化合物の使用である。
【００１２】
本発明の１つの態様は、腹部大動脈瘤の治療方法または予防方法であって、薬学的および薬理学的に有効な量の式（Ｉ）の化合物をこうした治療または予防が必要な被験体に投与する、前記方法である。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、腹部大動脈瘤の治療方法または予防方法であって、式（Ｉ）の化合物をこうした治療または予防が必要な被験体に投与する、前記方法である。
１つの態様において、Ｒ１は、ｎ−プロピル、３，３，３−トリフルオロプロピルまたはｎ−ブチルである。１つの態様において、Ｒ２は、３，４−ジフルオロフェニルである。１つの態様において、式（Ｉ）の化合物は、化合物（Ａ）：
【００１４】
【化２】
【００１５】
（Ａ）
である。上記化合物（Ａ）は、慣用的に、｛１Ｓ−［１α，２α，３β（１Ｓ＊，２Ｒ＊），５β］｝−３−（７−｛［２−（３，４−ジフルオロフェニル）シクロプロピル］アミノ｝−５−（プロピルチオ）−３Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル）−５−（２−ヒドロキシエトキシ）シクロペンタン−１，２−ジオールと命名される。
【００１６】
式（Ｉ）の化合物を投与するのに適した配合物が当該技術分野に知られ、そしてこれには、ＷＯ００／３４２８３、ＷＯ２００８／０２４０４４およびＷＯ２００８／０２４０４５から知られるものが含まれる。化合物（Ｉ）の薬学的配合物は、当該技術分野に知られる多様な他の成分、例えば保存剤、安定化剤、粘性制御剤、乳化剤または緩衝剤を含有してもよいし、そして実際、通常、含有するであろう。したがって、化合物（Ｉ）の薬学的配合物は、典型的には、０．０５〜９９％ｗ（重量パーセント）、例えば０．１０〜７０％ｗの範囲、または０．１０〜５０％ｗの範囲で、式（Ｉ）の化合物の総量を含み、ここで、すべての重量パーセントは、総配合物に基づく。
【００１７】
式（Ｉ）の化合物の適切な用量を開業医または他の当業者が決定してもよく、そしてこの用量は、状態の重症度、および治療しようとするヒト、ならびに使用している化合物（単数または複数）に応じるであろう。哺乳動物患者、特にヒト患者の療法的および／または予防的治療における活性化合物の適切な用量には、関連する状態の治療経過に渡って、最大１０μｍｏｌ／Ｌ、例えば０．００１〜１０μｍｏｌ／Ｌの範囲の平均血漿濃度を生じるものが含まれる。いずれにしても、医師または当業者は、個々のヒトに最も適切であろう実際の投薬量を決定可能であり、これは治療しようとする状態、ならびに治療しようとする特定のヒトの年齢、体重、性別および応答によって多様である可能性が高い。上述の投薬量は、平均的な症例の典型である。もちろん、より高いまたはより低い投薬量範囲が適当である個々の例もありうるし、そしてこうしたものが本発明の範囲内である。
【００１８】
誤解を避けるために、用語「治療」には、療法的および／または予防的治療が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】化合物（Ａ）治療による動脈瘤拡大の予防。動脈瘤誘導の１０日後（ａ）および４２日後（ｂ）の動脈瘤外径の測定値。外径は、１０日後（ａ）、対照（白抜きの正方形）および化合物（Ａ）治療（黒塗りの正方形）ラットで同様であったが、治療の４２日後（ｂ）、化合物（Ａ）群で有意に低かった。（ｃ）第１０日、動脈瘤直径増加は、２つの群に関して同様であったが、第４２日、化合物（Ａ）治療ラット（黒塗りのバー）で有意に減少した。実際、化合物（Ａ）治療ラットに関しては、第１０日〜第４２日の間に、動脈瘤直径増加はまったく観察されなかった。＊＊、Ｐ＜０．００１。
【図２−１】化合物（Ａ）治療による壁在血栓発展の阻害。（ａ）第４２日、対照（左）および化合物（Ａ）治療ラット（右）由来の代表的な動脈瘤のピクロシリウスレッド染色。化合物（Ａ）治療ラットに比較した際、対照由来の動脈瘤において、大動脈直径および血栓（Ｔ）面積が、より大きかった。血栓内のコラーゲン沈着（赤色染色）は、化合物（Ａ）群でのみ観察されることに注目されたい。（ｂ）血栓面積／壁面積は、両群のラットにおいて、第１０日〜第４２日の間に増加したが、第１０日および第４２日の両方で、化合物（Ａ）治療（黒塗りのバー）によって有意に減少した。（ｃ）群内分析によって、第４２日のより大きい動脈瘤直径は、より大きい血栓面積と関連することが示された（対照（白抜きの円）および化合物（Ａ）治療ラット（黒塗りの円）に関して、それぞれ、Ｒ２＝０．１３およびＲ２＝０．４０、Ｐ＜０．０５）。
【図２−２】（ｄ）第４２日、対照（左）および化合物（Ａ）治療ラット（右）由来の動脈瘤の壁在血栓内のＣＤ４１（インテグリンαＩｉｂ、血小板マーカー）の免疫染色。Ｌ：大動脈管腔。染色定量化によって、化合物（Ａ）での４２日間の治療が、対照群で見られるものに比較した際、壁在血栓内のＣＤ４１陽性面積の相対サイズを有意に減少させたことが示される。元来の倍率、ｘ２００。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１。
【図３−１】化合物（Ａ）治療による炎症性浸潤の阻害。（ａ）第４２日、対照（左）および化合物（Ａ）治療ラット（右）由来の動脈瘤の壁在血栓内のＰＭＮの免疫染色。第１０日（中央のパネル）および第４２日（下部のパネル）、壁在血栓内および壁内のＰＭＮ浸潤の定量化。１０日後および４２日後、ＰＭＮは、大部分、対照動脈瘤の壁在血栓（白抜きのバー）内に見られた。化合物（Ａ）治療（黒塗りのバー）は、どちらの時点でも、血栓内部へのＰＭＮの浸潤を阻害した。
【図３−２】（ｂ）第４２日、対照（左）および化合物（Ａ）治療ラット（右）由来の動脈瘤の壁在血栓内のマクロファージの免疫染色。第１０日（中央のパネル）および第４２日（下部のパネル）の壁在血栓内および壁内へのマクロファージ浸潤の定量化。マクロファージは、対照動脈瘤の壁在血栓内ならびに壁中に見られた（白抜きのバー）。４２日後、より多くのマクロファージが、血栓中よりも壁内に存在した。化合物（Ａ）治療（黒塗りのバー）は、どちらの時点でも、血栓内へのマクロファージの浸潤を阻害した。化合物（Ａ）治療の１０日後または４２日後の壁内のマクロファージ含量の減少は、統計的有意性には到達しなかった。Ｌ：大動脈管腔。元来の倍率、ｘ２００。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１。
【図４】化合物（Ａ）治療でのＭＭＰ−９発現減少。（ａ）第４２日、対照（左）および化合物（Ａ）治療ラット（右）由来の動脈瘤の壁在血栓内のＭＭＰ−９免疫染色。第４２日のＭＭＰ−９染色の定量化によって、対照動脈瘤において、壁面積に比較した、ＭＭＰ−９染色によって占められる面積が、壁内よりも血栓内でより大きいことが示された（白抜きのバー）。化合物（Ａ）治療は、血栓内および壁内の両方で、ＭＭＰ−９陽性面積のサイズを非常に減少させた（黒塗りのバー）。Ｌ：大動脈管腔。元来の倍率、ｘ２００。＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。（ｂ）第４２日、すべてのラットを考慮した際、血栓内のＭＭＰ−９陽性面積および総血栓面積のサイズの間に正の相関があった（対照、白抜きの円；化合物（Ａ）治療、黒塗りの円、Ｒ２＝０．７９、Ｐ＜０．０００１）。
【図５−１】化合物（Ａ）治療での動脈瘤壁内の壁在血栓のＳＭＣコロニー形成および弾性層板の保持。（ａ）第４２日、対照（左）および化合物（Ａ）治療ラット（右）由来の動脈瘤のオルセイン染色。矢印は、弾性層板を示す。弾性層板面積の定量化によって、第１０日および第４２日の両方で、化合物（Ａ）治療（黒塗りのバー）の有益な効果が示された。
【図５−２】（ｂ）第４２日、対照（左）および化合物（Ａ）治療ラット（右）由来の動脈瘤の壁在血栓内のＳＭＣ免疫染色。矢印は、血栓内のＳＭＣを示す。第１０日（中央のパネル）および第４２日（下部のパネル）の壁在血栓内および壁内のＳＭＣの密度は、どちらの群でも、第１０日〜第４２日の間に増加した。化合物（Ａ）治療（黒塗りのバー）は、対照（白抜きのバー）に比較した際、４２日後、ＳＭＣによる血栓コロニー形成を改善する一方、壁内では化合物（Ａ）の効果はまったく観察不能であった。Ｌ：管腔；Ｍ：中膜；Ａ：外膜。元来の倍率、ｘ１００。＊＊、Ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
生物学的評価
血小板凝集
健康な雄Ｌｅｗｉｓラット（Ｉｆｆａ Ｃｒｅｄｏ、フランス・リヨン）に、化合物（Ａ）（１０ｍｇ／ｋｇ体重）の単回経口用量を投与した。２匹のラットから新鮮な静脈血を、化合物（Ａ）投与前、ならびに投与２時間後、１０時間後、および２４時間後に試料採取し、そして周囲温度で、２５０ｇで３分間遠心分離した。先に記載されるように（Ｅｃｋｌｙら、２００１）、血小板リッチ血漿を調製した。４５０μｌの血小板懸濁物を１１００ｒｐｍで攪拌し、そして最終体積５００μｌ中、５μＭ ＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ、フランス・サンカンタンファラビエ）の添加によって活性化した。二重チャネル血小板凝集計（Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ、米国ペンシルバニア州ウェストハーバータウン）中、比濁法によって、周囲温度で凝集を測定した。ベースラインを超える最大曲線高を測定することによって、凝集の度合いを概算した。
【００２１】
ＡＡＡモデル
ラット大動脈において、ドデシル硫酸ナトリウム脱細胞化モルモット大動脈（異種マトリックス）のセグメントを移植することによって、実験的大動脈瘤を誘導した（Ａｌｌａｉｒｅ Ｅ．ら（１９９４）， Ｊ Ｖａｓｃ Ｓｕｒｇ １９：４４６−４５６）。このＡＡＡモデルは、異種細胞外マトリックスの免疫炎症性損傷によって特徴付けられる（Ａｌｌａｉｒｅ Ｅら（１９９７）， Ｓｕｒｇｅｒｙ １２２：７３−８１； Ａｌｌａｉｒｅ Ｅら（１９９６）， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６２：７９４−８０３）。簡潔には、欧州連合によって策定された実験動物管理方針にしたがって、４６匹の雄Ｌｅｗｉｓラット（２５０ｇ）および４６匹のモルモット（２８０ｇ）（Ｉｆｆａ Ｃｒｅｄｏ、フランス・リヨン）を飼育した。ベントバルビタール（５ｍｇ／１００ｇ体重）の腹腔内注射によって、動物を麻酔した。モルモット腎臓下大動脈（１．５ｃｍ）を試料採取し、そしてドデシル硫酸ナトリウム処理によって脱細胞化して、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）細胞外マトリックスの管を得て、これを、１０／０ナイロン結節縫合で、Ｌｅｗｉｓラットの大動脈内に同所性に移植した（異種移植）（Ａｌｌａｉｒｅら、１９９７； Ａｌｌａｉｒｅら、１９９６）。クランプを外した直後、双眼顕微鏡下で、移植片の最初の直径をｉｎ ｓｉｔｕで測定した。２４時間後、ラットをランダムに２つの等しい群に分け、化合物（Ａ）（１０ｍｇ／ｋｇ体重、経口投与によって１日２回）または化合物（Ａ）の希釈液（水中の１％カルボキシメチルセルロース／０．１％Ｔｗｅｅｎ−８０）を１０日間（第１０日、各群に関してｎ＝９）または６週間（第４２日、各群に関してｎ＝１４）治療した。屠殺時、ラットを深く麻酔し、移植片直径を再び測定し、そして大動脈を切り出して、そして４％パラホルムアルデヒド中で固定した。大動脈試料をパラフィン中に包埋し、そして５μｍでカットした。
【００２２】
組織学的および免疫組織化学的分析
切片をピクロシリウスレッドで染色してコラーゲンおよびフィブリンを視覚化し、そしてオルセインで染色してエラスチンを視覚化した。一次抗体として、抗ヒトα−アクチン（希釈１：５００、Ｄａｋｏ、フランス・トラップ）、抗ＣＤ６８（マクロファージ、希釈１：１０００、Ｓｅｒｏｔｅｃ、フランス・セルジーサンクリストフ）、抗ラット多核白血球（希釈１：３０００、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、カナダ・オンタリオ）、抗ＣＤ４１（インテグリンαＩＩｂ、血小板、希釈１：５０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および抗ＭＭＰ−９（希釈１：５０、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ドイツ・ダルムシュタット）を、そして検出のため、ペルオキシダーゼＶｅｃｔｏｒ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、米国カリフォルニア州バーリンゲーム）を用いて、免疫組織化学を行った。顕微鏡接眼レンズ中のグリッドを用いて細胞を計数し、そして同じスライド上の４つの対称視野において平均した。Ｈｉｓｔｏｌａｂソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、フランス・エブリー）を用いた形態計測的分析によって、血栓、弾性線維、ＡＡＡ壁、ならびにＭＭＰ−９およびＣＤ４１陽性染色に相当する面積サイズを測定した。シリウスレッドスライド上で、血栓面積を決定した。内部血栓および外部壁において、コンピュータプログラムの色検出モードによって、陽性染色によって占められる面積を定量化した。
【００２３】
統計分析
結果を平均±Ｓ．Ｄ．で表す。直径増加パーセントを以下のように計算する：（回収時の直径−移植時の直径）ｘ１００／移植時の直径。ノンパラメトリックＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定（Ｓｔａｔｖｉｅｗ、バージョン４．５）を用いて、２つの群間の比較を行った。異なる群において直径が大きい動脈瘤の頻度を、Χ２検定によって分析した。単純回帰分析を用いて、多様なパラメータ間の相関に関して検定した。Ｐ＜０．０５を有意と見なした。
【００２４】
結果
動脈瘤直径
移植１０日後（２０４．６±７１．２％、ｎ＝９）および４２日後（３５９．１±１１３．３％、ｎ＝１４）、未治療対照ラットで観察される動脈瘤外径の増加によって示されるように、脱細胞化細胞外マトリックス異種移植片は動脈瘤に発展した（図１）。１０日間の化合物（Ａ）治療は、未治療ラットに比較した際、動脈瘤外径の増加を修飾しなかった（１９７．３±５２．８％、ｎ＝９）；平均動脈瘤外径は、２つの群間で同様であった（化合物（Ａ）治療および対照ラットにおいて、それぞれ、２．２２±０．５６ｍｍ対２．２２±０．７０ｍｍ）（図１ａ、ｃ）。しかし、治療４２日後、平均動脈瘤外径は、化合物（Ａ）治療群において、有意により低く（化合物（Ａ）治療および対照ラットにおいて、それぞれ、３．６１±１．４６ｍｍ、ｎ＝１４対５．２１±１．２２ｍｍ、ｎ＝１４）、そして外径のパーセント増加は有意に減少した（図１ｂ、ｃ）。したがって、第１０日〜第４２日の間で、対照ラットにおいて動脈直径パーセント増加が観察されるが、化合物（Ａ）群では減少しているような相違によって示されるように、化合物（Ａ）治療は動脈瘤拡大を予防した（図１ｃ）。さらに、化合物（Ａ）治療群に比較した際に、第４２日のより大きい動脈瘤（直径＞４ｍｍ）の発生率は、対照群で優位であった（Χ２＝１１．６、Ｐ＜０．００１）。
【００２５】
壁在血栓形成
脱細胞化細胞外マトリックス異種移植片から発展する実験的動脈瘤は、先に記載されるように（Ｔｏｕａｔら、２００６）、壁在血栓の存在によって特徴付けられる（図２ａ）。対照群において、血栓面積／壁面積の率は、第１０日で０．２２±０．１４によって示され、そして第４２日には０．７８±０．８９に増加した（図２ｂ）。化合物（Ａ）での治療は、第１０日および第４２日の両方で、血栓／壁面積を有意に減少させた（それぞれ、０．０７±０．０５および０．３５±０．４４）（図２ｂ）。血栓面積中のこの相対的減少は、第４２日の血栓内のＣＤ４１陽性面積（インテグリンαＩＩｂ、血小板マーカー）の有意な減少と関連した（化合物（Ａ）治療および対照群ラットに関して、それぞれ、０．１３±０．１６および０．６８±１．３６、Ｐ＝０．００５）（図２ｃ）。最後に、第４２日、すべてのラットを考慮した際、血栓面積および動脈瘤直径間には有意な相関があった（Ｒ２＝０．２５、Ｐ＝０．０００３）。群内分析によって、化合物（Ａ）治療は、対照群と比較した際、相関の傾斜を有意に減少させることが示された（化合物（Ａ）：ｓ＝０．１７、Ｒ２＝０．４０；対照ｓ＝０．３０、Ｒ２＝０．１３）（図２ｃ）ことから、化合物（Ａ）による血小板活性化の阻害が実験的ＡＡＡ進行を制限する証拠が提供された。
【００２６】
炎症性浸潤
動脈瘤発展は、多核白血球（ＰＭＮ）およびマクロファージを伴う炎症プロセスに関連する。どちらの炎症細胞も、壁在血栓内および動脈瘤壁内に存在した（図３）。しかし、ＰＭＮは壁在血栓内で見られるものがほとんどであり、ここではこれらが主な炎症細胞タイプであった。対照的に、マクロファージは壁内で優位であった。ＰＭＮ密度は第１０日〜第４２日の間で減少したが、マクロファージ密度は増加した（図３）。化合物（Ａ）治療は、第１０日および第４２日、壁在血栓内へのＰＭＮおよびマクロファージの浸潤を有意に阻害した（図３）。動脈瘤壁内へのマクロファージ浸潤には変化はまったくなかった。
【００２７】
動脈瘤におけるＭＭＰ−９発現および中膜において保持される弾性線維
ＭＭＰ−９発現は、免疫染色によって明らかになり、血栓および動脈瘤壁両方において、対照ラットで検出された（図４ａ）。第４２日、ＭＭＰ−９陽性面積は、壁におけるよりも血栓内でより大きかった。化合物（Ａ）治療は、血栓および壁両方において、ＭＭＰ−９陽性面積を顕著に減少させた（図４ａ）。さらに、第４２日、すべてのラットを考慮した際、血栓面積および血栓内のＭＭＰ−９発現間には有意な正の相関があった（Ｒ２＝０．７９、Ｐ＜０．０００１）（図４ｂ）。どちらの時点でも、化合物（Ａ）治療に伴って、ＭＭＰ−９発現減少を反映して、中膜の弾性線維の有意な保持が観察された（図５ａ）。第１０日〜第４２日の間、対照ラットにおいて、弾性線維によって占められる相対面積は一定のままであったが、化合物（Ａ）治療ラットにおいては、弾性線維面積が非常に増加した（図５ａ）。
【００２８】
壁在血栓のＶＳＭＣコロニー形成
ＳＭＣは、壁内および血栓内のα−アクチン陽性染色によって明らかになるように、脱細胞化移植片および壁に近接して発展する壁在血栓の部分にコロニー形成した（図５ｂ）。さらに、ＳＭＣの密度は、壁内および血栓内の両方で、第１０日から第４２日に増加し、このモデルが、経時的な自発的治癒プロセスを開始する傾向がある証拠を提供した。１０日間の化合物（Ａ）治療では、対照に比較して、血栓内のＳＭＣ密度は修飾されなかったが、４２日間の治療は、血栓のＳＭＣコロニー形成を有意に改善した（図５ｂ）。これは、シリウスレッド染色によって示されるように、コラーゲンの沈着と関連した（図２ａ）。対照的に、化合物（Ａ）での治療は、１０日後または４２日後のいずれでも、壁のＳＭＣコロニー形成に影響を及ぼさなかった（図５ｂ）。
【００２９】
結論
化合物（Ａ）による血小板活性化の阻害を通じたＡＡＡ壁在血栓形成の予防によって、実験的ＡＡＡ進行が制限された。血小板活性化を遮断し、そして壁在血栓形成を減少させることによって、化合物（Ａ）は、血栓における白血球の補充およびそれに続くプロテアーゼの濃縮を減少させ、壁完全性の保持、および間葉細胞コロニー形成の増進によって明らかになるような治癒の開始を導いた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腹部大動脈瘤の治療方法または予防方法であって、薬学的および薬理学的に有効な量の式（Ｉ）
【化１】
（Ｉ）
［式中：
Ｒは、ＣＨ２ＯＨまたはＯ（ＣＨ２）２ＯＨであり；
Ｒ１は、３つのハロゲン原子により置換されていてもよいＣ３−４アルキルであり；
Ｒ２は、フェニルまたは３，４−ジフルオロフェニルである］
の化合物、
またはその薬学的に許容されうる誘導体、
またはその薬学的に許容されうる塩もしくは光学異性体
を前記治療または予防が必要な対象に投与する、前記方法。
【請求項２】
Ｒ１が、ｎ−プロピル、３，３，３−トリフルオロプロピルまたはｎ−ブチルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ２が、３，４−ジフルオロフェニルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
式（Ｉ）の化合物が、｛１Ｓ−［１α，２α，３β（１Ｓ＊，２Ｒ＊），５β］｝−３−（７−｛［２−（３，４−ジフルオロフェニル）シクロプロピル］アミノ｝−５−（プロピルチオ）−３Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル）−５−（２−ヒドロキシエトキシ）シクロペンタン−１，２−ジオールである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
腹部大動脈瘤の治療または予防のための薬剤製造のための、式（Ｉ）
【化２】
（Ｉ）
［式中：
Ｒは、ＣＨ２ＯＨまたはＯ（ＣＨ２）２ＯＨであり；
Ｒ１は、３つのハロゲン原子により置換されていてもよいＣ３−４アルキルであり；
Ｒ２は、フェニルまたは３，４−ジフルオロフェニルである］
の化合物、またはその薬学的に許容されうる誘導体の使用。
【請求項６】
Ｒ１が、ｎ−プロピル、３，３，３−トリフルオロプロピルまたはｎ−ブチルである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
Ｒ２が、３，４−ジフルオロフェニルである、請求項５または６に記載の使用。
【請求項８】
式（Ｉ）の化合物が、｛１Ｓ−［１α，２α，３β（１Ｓ＊，２Ｒ＊），５β］｝−３−（７−｛［２−（３，４−ジフルオロフェニル）シクロプロピル］アミノ｝−５−（プロピルチオ）−３Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル）−５−（２−ヒドロキシエトキシ）シクロペンタン−１，２−ジオールである、請求項５に記載の使用。
【請求項１】
腹部大動脈瘤の治療方法または予防方法であって、薬学的および薬理学的に有効な量の式（Ｉ）
【化１】
（Ｉ）
［式中：
Ｒは、ＣＨ２ＯＨまたはＯ（ＣＨ２）２ＯＨであり；
Ｒ１は、３つのハロゲン原子により置換されていてもよいＣ３−４アルキルであり；
Ｒ２は、フェニルまたは３，４−ジフルオロフェニルである］
の化合物、
またはその薬学的に許容されうる誘導体、
またはその薬学的に許容されうる塩もしくは光学異性体
を前記治療または予防が必要な対象に投与する、前記方法。
【請求項２】
Ｒ１が、ｎ−プロピル、３，３，３−トリフルオロプロピルまたはｎ−ブチルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ２が、３，４−ジフルオロフェニルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
式（Ｉ）の化合物が、｛１Ｓ−［１α，２α，３β（１Ｓ＊，２Ｒ＊），５β］｝−３−（７−｛［２−（３，４−ジフルオロフェニル）シクロプロピル］アミノ｝−５−（プロピルチオ）−３Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル）−５−（２−ヒドロキシエトキシ）シクロペンタン−１，２−ジオールである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
腹部大動脈瘤の治療または予防のための薬剤製造のための、式（Ｉ）
【化２】
（Ｉ）
［式中：
Ｒは、ＣＨ２ＯＨまたはＯ（ＣＨ２）２ＯＨであり；
Ｒ１は、３つのハロゲン原子により置換されていてもよいＣ３−４アルキルであり；
Ｒ２は、フェニルまたは３，４−ジフルオロフェニルである］
の化合物、またはその薬学的に許容されうる誘導体の使用。
【請求項６】
Ｒ１が、ｎ−プロピル、３，３，３−トリフルオロプロピルまたはｎ−ブチルである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
Ｒ２が、３，４−ジフルオロフェニルである、請求項５または６に記載の使用。
【請求項８】
式（Ｉ）の化合物が、｛１Ｓ−［１α，２α，３β（１Ｓ＊，２Ｒ＊），５β］｝−３−（７−｛［２−（３，４−ジフルオロフェニル）シクロプロピル］アミノ｝−５−（プロピルチオ）−３Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル）−５−（２−ヒドロキシエトキシ）シクロペンタン−１，２−ジオールである、請求項５に記載の使用。
【図１】
【図２−１】
【図２−２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図２−１】
【図２−２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【公表番号】特表２０１１−５０５４１７（Ｐ２０１１−５０５４１７Ａ）
【公表日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３６８８８（Ｐ２０１０−５３６８８８）
【出願日】平成２０年１２月２日（２００８．１２．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００８／０５１３８６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７２９６７
【国際公開日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【出願人】（３０００２２６４１）アストラゼネカ アクチボラグ (581)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月２日（２００８．１２．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００８／０５１３８６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７２９６７
【国際公開日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【出願人】（３０００２２６４１）アストラゼネカ アクチボラグ (581)
【Ｆターム（参考）】
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